効力あるＣＯＸ−２阻害薬としてのフリー−Ｂ−環フラボノイドの同定
【課題】変形性関節症治療のため、シクロオキシゲナーゼ酵素ＣＯＸ−２を阻害する新規方法を提供する。
【解決手段】キク科タツナミソウ属（ｇｅｎｕｓ Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａ）の植物からの抽出物を含む組成物であって、当該抽出物が、バイカリンを含むフリー−Ｂ−環フラボノイドの混合物を含む組成物。組成物は０．０１から２００ｍｇ／体重ｋｇから成る群より選択される用量で経口、局所、座剤、静脈内、および経皮等より選択される経路により投与される。
【解決手段】キク科タツナミソウ属（ｇｅｎｕｓ Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａ）の植物からの抽出物を含む組成物であって、当該抽出物が、バイカリンを含むフリー−Ｂ−環フラボノイドの混合物を含む組成物。組成物は０．０１から２００ｍｇ／体重ｋｇから成る群より選択される用量で経口、局所、座剤、静脈内、および経皮等より選択される経路により投与される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般的に、ＣＯＸ−２仲介疾患および状態の予防および処置のための方法に関する。具体的には、本発明は、本明細書においてフリー（Ｆｒｅｅ）−Ｂ−環フラボノイドと称される化合物の投与による、ＣＯＸ−２仲介疾患および状態の予防および処置のための方法に関する。本発明には、植物源から標準化フリー−Ｂ−環フラボノイド抽出物を発生させるための改良法も包含される。
【背景技術】
【０００２】
細胞膜からのアラキドン酸（ＡＡ）の遊離および代謝は、いくつかの異なった経路により、炎症誘発性代謝物の発生を生じる。論証できることだが、炎症への二つの最も重要な経路は、酵素５−リポキシゲナーゼ（５−ＬＯ）およびシクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）により仲介される。これらは、各々、炎症性応答の開始および進行に重要な役割を果たすロイコトリエンおよびプロスタグランジンの発生を生じる平行した経路である。これらの血管作動性化合物は、両方とも組織内への炎症性細胞の浸潤を促進し、そして炎症性応答の持続に働く化学走性剤（ｃｈｅｍｏｔａｘｉｎ）である。それゆえに、炎症のこれらのメディエイター（ｍｅｄｉａｔｏｒ）を発生する原因となる酵素は多くの新規抗炎症薬の標的とされてきた。
【０００３】
酵素シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）の阻害は、ほとんどの非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）にあるとされる作用機構である。ＣＯＸ酵素には二つの性質が異なるアイソフォーム（ｉｓｏｆｏｒｍ）（ＣＯＸ−１およびＣＯＸ−２）が存在し、それらは約６０％の配列相同性を共有しているが、発現プロファイルおよび機能が異なっている。ＣＯＸ−１は、生理学的に重要なプロスタグランジンの産生に連結された酵素の構成形であり、血小板凝集、胃における細胞機能の保護および正常腎機能の維持のごとき正常な生理学的機能の制御を助けている。（ＤａｎｎｈａｒｄｔおよびＫｉｅｆｅｒ （２００１） Ｅｕｒ． Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．３６：１０９−２６）。第二のアイソフォーム、ＣＯＸ−２、はインターロイキン−１β（ＩＬ−１β）および他の増殖因子のごとき炎症誘発性サイトカインにより誘導可能である酵素の形である。（Ｈｅｒｓｃｈｍａｎｎ （１９９４） Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖ． １３４： ２４１−５６；Ｘｉｅら，（１９９２） Ｄｒｕｇｓ Ｄｅｖ． Ｒｅｓ． ２５： ２４９−６５）。このアイソフォームは、アラキドン酸（ＡＡ）からのプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）産生を触媒する。ＣＯＸ−２の阻害は、従来のＮＳＡＩＤによる抗炎症活性の原因である。
【０００４】
ＣＯＸ−２阻害薬の作用機構は従来のＮＳＡＩＤの機構と重なっているため、ＣＯＸ−２阻害薬は、炎症が決定的な役割を果たす一過性状態および慢性疾患での炎症に関連した痛みおよび膨潤を含む多くの同一症状を処置するために使用される。一過性状態は、小擦過傷、日焼けまたは接触性皮膚炎に関連した炎症の処置、ならびに、緊張性頭痛および偏頭痛および月経痙攣に関連した痛みの軽減を含んでいる。慢性状態への応用は、慢性関節リュウマチおよび変形性関節炎のごとき関節炎疾患を含んでいる。慢性関節リュウマチは主として自己免疫疾患であり、および変形性関節炎は関節中の軟骨の分解により引き起こされるが、それぞれに関連する炎症を減少させることは、これらの疾患を患っている患者における生活の質の著しい上昇を提供する。（Ｗｉｅｎｂｅｒｇ （２００１） Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｒｅｓ． ２２： ３１９−４１；Ｗｏｌｌｈｉｅｍ （２０００） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｒｈｅｕｍ． １３： １９３−２０１）。慢性関節リウマチに加え、炎症は一般にリウマチ性疾患の構成要素である。それ故に、ＣＯＸ阻害薬の使用は、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）（Ｇｏｅｂｅｌら、 （１９９９） Ｃｈｅｍ． Ｒｅｓ．
Ｔｏｘ． １２： ４８８−５００； Ｐａｔｒｏｎｏら、（１９８５） Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ７６： １０１１−１０１８）のごとき疾患、ならびに、強皮症のごときリウマチ性皮膚状態を含ませるように拡大されてきた。ＣＯＸ阻害薬はまた、乾癬のごときリウマチ起源ではない炎症性皮膚状態のためにも使用され、ここにおいて、プロスタグランジンの過剰産生から生じる炎症を軽減させることは、直接的利益を提供することができる。（Ｆｏｇｈら、（１９９３） Ａｃｔａ Ｄｅｒｍ Ｖｅｎｅｒｏｌｏｇｉｃａ ７３： １９１−３）。簡単に述べると、ＣＯＸ阻害薬は慢性炎症性疾患ならびに一過性炎症から生じる不定期的疼痛および痛みの症状の処置に有用である。
【０００５】
抗炎症薬としてのそれらの使用に加え、ＣＯＸ阻害薬の役割における別の可能性は、癌
の処置に存在する。ＣＯＸ−２の過剰発現が多様なヒト悪性腫瘍で示されており、そしてＣＯＸ−２阻害薬は、皮膚、乳腺および膀胱腫瘍を有する動物の処置において有効であることが示されている。作用機構は完全には明確にされていないとはいえ、ＣＯＸ−２の過剰発現はアポトーシスを阻害し、および腫瘍発生性細胞型の侵襲性を増加させることが示されている。（Ｄｅｍｐｋｅら、（２００１） Ｊ． Ｃａｎ． Ｒｅｓ． Ｃｌｉｎ．
Ｏｎｃｏｌ． １２７： ４１１−１７；ＭｏｏｒｅおよびＳｉｍｍｏｎｓ （２０００） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ７： １１３１−４４）。ＣＯＸ−２の過剰発現により生じるプロスタグランジンの促進された産生は、細胞増殖を促進し、その結果として血管形成を増加させることが可能である。（ＭｏｏｒｅおよびＳｉｍｍｏｎｓ
（２０００） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ７： １１３１−４４；Ｆｅｎｔｏｎら、（２００１） Ａｍ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｏｎｃｏｌ． ２４： ４５３−５７）。
【０００６】
異なった型の癌の予防および処置におけるＣＯＸ−２阻害薬の可能性を評価している多くの臨床研究が存在する。例えば、非特異的ＮＡＳＩＤであるアスピリンは、結腸直腸癌の発生率を４０−５０％（Ｇｉｏｖａｎｎｕｃｃｉら、（１９９５） Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ． ３３３：６０９−６１４）、および死亡率を５０％（Ｓｍａｌｌｅｙら、（１９９９） Ａｒｃｈ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ． １５９： １６１−１６６）減少させることが見いだされている。１９９９年に、ＦＤＡは結腸直腸癌死亡率を減少させるため、ＦＡＰ（家族性腺腫性ポリポージス）におけるＣＯＸ−２阻害薬セレコキシブ（ＣｅｌｅＣＯＸｉｂ）の使用を承認した。ＣＯＸ−２関与の証拠がある他の癌は、ＣＯＸ−２阻害薬により成功裏に予防および／または処置することができると信じられており、食道癌、頭部および頚部癌、乳癌、膀胱癌、子宮頚癌、前立腺癌、肝細胞性癌腫および非小細胞肺癌が含まれるが、それらに限定されるわけではない。（Ｊａｅｃｈｅｌら、（２００１） Ａｒｃｈ． Ｏｔｏｌａｒｎｙｇｏｌ． １２７：１２５３−５９ ； Ｋｉｒｓｃｈｅｎｂａｕｍら、（２００１） Ｕｒｏｌｏｇｙ ５８： １２７−３１；ＤａｎｎｈａｒｄｔおよびＫｉｅｆｅｒ （２００１） Ｅｕｒ． Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．
３６： １０９−２６）。ＣＯＸ−２阻害薬はまた、ハイリスク患者において結腸癌を予防することに成功したことも証明できる。また、ＣＯＸ−２阻害薬は重篤な癌のいくつかの型を予防または逆転さえもさせることができるという証拠も存在する。現在まで、５０もの多くの研究が、ＣＯＸ−２阻害薬は動物における前悪性および悪性腫瘍を予防でき、および同様に膀胱、食道および皮膚癌を予防できる可能性があることを示している。
【０００７】
最近の科学の進歩は、ＣＯＸ−２発現、一般的炎症およびアルツハイマー病（ＡＤ）の病因間の相関を同定した。（Ｈｏら、（２００１） Ａｒｃｈ． Ｎｅｕｒｏｌ． ５８： ４８７−９２）。動物モデルにおいて、ＣＯＸ−２酵素を過剰発現するトランスジェニックマウスは、損傷に対してより感受性があるニューロンを有している。アメリカ国立老化研究所（ＮＩＡ）は、ＮＳＡＩＤがアルツハイマー病の進行を遅らすことができるがどうかを決定するための臨床試行に乗り出している。ナプロキセン（非選択的ＮＳＡＩＤ）およびロフェコキシブ（ｒｏｆｅＣＯＸｉｂ）（ヴィオックス（Ｖｉｏｘｘ）、ＣＯＸ−２特異的選択的ＮＳＡＩＤ）が評価されるであろう。従来の証拠は、炎症がアルツハイマー病に寄与していることを示している。アルツハイマー協会およびＮＩＡによると、米国において約４００万人がＡＤを患っており；世紀半ばまでには１４００万に増加すると予測されている。
【０００８】
ＣＯＸ酵素（プロスタグランジンＨ２シンターゼとしても知られている）は、二つの別々の反応を触媒する。第一の反応において、アラキドン酸が代謝されて不安定なプロスタグランジンＧ２（ＰＧＧ２）を形成する（シクロオキシゲナーゼ反応）。第二の反応において、ＰＧＧ２はエンドペルオキシドＰＧＨ２へ変換される（ペルオキシダーゼ反応）。本明細書に記載した化合物は、ＣＯＸ−１およびＣＯＸ−２ペルオキシダーゼ活性の阻害
に焦点を当てたアッセイ、そしてＣＯＸ酵素の新規阻害薬を同定するための化学的既知物質同定（ｄｅｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）プロセスを組み合わせた発見戦略の結果である。
【０００９】
フラボノイドは広範囲に分布している天然産物の群である。フラボノイドの摂取は、発生事象痴呆の危険率と逆相関していることが示されている。作用機構は知られていないが、フラボノイドの抗酸化効果によるものであると推測されている。（Ｃｏｍｍｅｎｇｅｓら、（２０００） Ｅｕｒ． Ｊ． Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ １６： ３５７−３６３）。ポリフェノールフラボンは、ＣＯＸ−２、ＮｆカッパＢおよびｂｃｌ−Ｘ（Ｌ）を含む遺伝子にＲＮＡレベルで作用することにより、形質転換された結腸細胞においてプログラムされた細胞死、分化および増殖阻害を誘導する。（Ｗｅｎｚｅｌら、（２０００） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ６０： ３８２３−３８３１）。Ｂ環上のヒドロキシル基の数がＣＯＸ−２転写活性の抑制において重要であることが報告されている。（Ｍｕｔｏｈら、（２０００） Ｊｎｐ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ９１： ６８６−６９１）。
【００１０】
下記の一般構造により図示されているように、芳香族Ｂ環上に置換基を有しないフリー−Ｂ−環フラボンおよびフラボノールはフラボノイドの特定の部類である：
【００１１】
【化１】
【００１２】
式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、―Ｈ、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＯＲ、−ＳＲ、−ＮＨ２、−ＮＨＲ、−ＮＲ２、−ＮＲ３＋Ｘ−、限定されるわけではないが、アルドペントース、メチル−アルドペントース、アルドヘキソース、ケトヘキソースおよびそれらの化学誘導体を含む、単一のまたは多数の糖の組合わせの、炭素、酸素、窒素または硫黄グリコシドからなる群より独立して選択され；
式中、
Ｒは１−１０の間の炭素原子を有するアルキル基であり；および
Ｘは、限定されるわけではないが、ヒドロキシル、クロリド、ヨージド、スルフェート、ホスフェート、アセテート、フルオリド、カーボネートなどを含んでいる、医薬として受容可能なカウンターアニオンの群より選択される。フリー−Ｂ−環フラボノイドは比較的に稀である。合成されたまたは天然源から単離された全９３９６のフラボノイドの内、２３１のフリー−Ｂ−環フラボノイドのみしか知られていない。（Ｔｈｅ Ｃｏｍｂｉｎｅｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ， Ｃｈａｐｍａｎ ＆ Ｈａｌｌ／ＣＲＣ， 第５版：２００１年６月１日）。
【００１３】
中国薬用植物、コガネバナ（Ｓｃｕｌｔｅｌｌａｒｉａ Ｂａｉｃａｌｅｎｓｉｓ）はバイカレイン（ｂａｉｃａｌｅｉｎ）、バイカリン（ｂａｉｃａｌｉｎ）、オウゴニン（ｗｏｇｏｎｉｎ）およびバイカレノシド（ｂａｉｃａｌｅｎｏｓｉｄｅ）を含むかなりの量のフリー−Ｂ−環フラボノイドを含んでいる。伝統的にこの植物は、解熱、消炎、湿気−温暖および夏季熱症候群；高熱により生じる多渇症；カルブンケル、潰瘍および他の化膿性皮膚感染；急性扁桃炎、咽頭喉頭炎および猩紅熱のごとき上気道感染；ウイルス性肝炎；腎炎；腎盂炎；赤痢；吐血および鼻血を含む、多くの状態を処置するために使用され
てきた。この植物はまた伝統的に、流産を防止するためにも使用されてきた。（Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ＳｈａｎｇＨａｉ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｒｅｓｓ，上海，中国，１９９８、を参照）。臨床的には、コガネバナは現在、肺炎、小児細菌性下痢症、ウイルス性肝炎、急性胆嚢炎症、高血圧、切断および手術により生じる局所性急性炎症、気管支喘息および上気道感染のごとき状態を処置するために使用する。（Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ＳｈａｎｇＨａｉ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｒｅｓｓ，上海，中国，１９９８）。気管支喘息に対するオウゴンの薬学的効能は、伝える所によれば, フリー−Ｂ−環フラボノイドの存在、およびエオタキシン関与好酸球動員のそれらの抑制に相関している。（Ｎａｋａｊｉｍａら、（２００１） Ｐｌａｎｔａ Ｍｅｄ． ６７（２） ： １３２−１３５）。
【００１４】
フリー−Ｂ−環フラボノイドは多様な生物活性を持っていると報告されている。例えば、ガランギン（３，５，７−トリヒドロキシフラボン）は抗酸化剤およびフリーラジカル捕捉剤として働き、そして抗遺伝毒性および癌化学的予防のための将来有望な候補であると信じられている。（Ｈｅｏら、（２００１） Ｍｕｔａｔ． Ｒｅｓ． ４８８（２）
： １３５−１５０）。それはチロシナーゼ モノフェノラーゼの阻害剤（Ｋｕｂｏら、（２０００） Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ８（７）： １７４９−１７５５）、ウサギ心臓カルボニルレダクターゼの阻害剤（Ｉｍａｍｕｒａら、（２０００）
Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １２７（４）： ６５３−６５８）であり、抗菌活性（ＡｆｏｌａｙａｎおよびＭｅｙｅｒ （１９９７） Ｅｔｈｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ． ５７（３）： １７７−１８１）および抗ウイルス活性（Ｍｅｙｅｒら、（１９９７） Ｊ．
Ｅｔｈｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ． ５６（２）： １６５−１６９）を有する。バイカレインおよびガランギン（二つの別のフリー−Ｂ−環フラボノイド）は、ヒト乳癌細胞に対する抗増殖活性を有している（Ｓｏら、（１９９７） Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ． １１２（２）： １２７−１３３）。
【００１５】
典型的には、フラボノイドはそれらの有効性に基づいて手当たりしだいに活性が試験されてきた。時折、Ｂ−環上の置換の必要性が、ｐ−糖蛋白質への高親和性結合（Ｂｏｕｍｅｎｄｊｅｌら、（２００１） Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔ． １１（１）： ７５−７７）、強心薬効果（Ｉｔｏｉｇａｗａら、（１９９９） Ｊ． Ｅｔｈｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ． ６５（３）： ２６７−２７２）、リノレン酸ヒドロペルオキシド−誘導毒性に対する上皮細胞における保護効果（ＫａｎｅｋｏおよびＢａｂａ （１９９９） Ｂｉｏｓｃｉ Ｂｉｏｔｈｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ ６３（２）： ３２３−３２８）ＣＯＸ−１阻害活性（Ｗａｎｇ （２０００） Ｐｈｙｔｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ７： １５−１９）およびプロスタグランジンエンドペルオキシダーゼシンターゼ（Ｋａｌｋｂｒｅｎｎｅｒら、（１９９２） Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ４４（１）： １−１２）に必要とされるＢ環置換のごとく、特定の生物学的活性について力説されてきた。ほんの少数の論文しかフリー−Ｂ−環フラボノイドの非置換Ｂ環の重要性を言及していない。一つの例は、抗凝血薬の可能性としての、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈキノンアクセプターオキシドレダクターゼを阻害する２−フェニルフラボンの使用である。（Ｃｈｅｎら、（２００１） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ６１（１１）： １４１７−１４２７）。
【００１６】
種々のフリー−Ｂ−環フラボノイドの抗炎症活性に関連して報告された作用機構は議論のあるところである。フリー−Ｂ−環フラボノイド、クリシン（Ｌｉａｎｇら、（２００１） ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ４９６（１）： １２−１８）、オウゴニン（Ｃｈｉら、（２００１） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ６１： １１９５−１２０３）およびハランギン（Ｒａｓｏら、（２００１） Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ． ６８（８）：
９２１−９３１）の抗炎症活性は、ペルオキシソーム−増殖因子活性化レセプターガンマの活性化および脱顆粒およびＡＡ放出に対する影響を経た、誘導可能シクロオキシゲナーゼおよび酸化窒素シンターゼの誘導に関与していた。（Ｔｏｒｄｅｒａら、（１９９４）
Ｚ． Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ［Ｃ］ ４９： ２３５−２４０）。オロキシリン、バイカレインおよびオウゴニンは、シクロオキシゲナーゼに影響することなく１２−リポキシゲナーゼを阻害することが報告されている。（Ｙｏｕら、（１９９９） Ａｒｃｈ． Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｓ． ２２（１）： １８−２４）。より最近、オウゴニン、バイカリンおよびバイカレインの抗炎症活性は、酸化窒素阻害薬およびリポポリサッカリドにより誘導された、誘導可能酸化窒素シンターゼおよびＣＯＸ−２遺伝子発現の阻害を通して生じると報告されている。（Ｃｈｅｎら、（２００１） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ６１（１１）： １４１７−１４２７）。また、オロキシリンは核因子−カッパＢ活性化の抑制を経て作用することも報告されている。（Ｃｈｅｎら、（２００１）
Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ６１（１１）： １４１７−１４２７）。最後に、伝える所によれば、オウゴニンはマクロファージにおいて誘導可能ＰＧＥ２産生を阻害する。（ＷａｋａｂａｙａｓｈｉおよびＹａｓｕｉ （２０００） Ｅｕｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ４０６（３）： ４７７−４８１）。バイカレインによる、有糸分裂促進剤−活性化プロテインキナーゼリン酸化の阻害およびＣａ２＋イオノフォアＡ２３１８７誘導プロスタグランジンＥ２放出の阻害は、オウゴンの抗炎症活性機構として報告されている。（Ｎａｋａｈａｔａら、（１９９９） Ｎｉｐｐｏｎ Ｙａｋｕｒｉｇａｋｕ Ｚａｓｓｈｉ， １１４， Ｓｕｐｐ． １１： ２１５Ｐ−２１９Ｐ；Ｎａｋａｈａｔａら、（１９９８） Ａｍ． Ｊ． Ｃｈｉｎ Ｍｅｄ． ２６： ３１１−３２３）。伝える所によれば、コガネバナからのバイカリンは、超抗原ブドウ球菌細胞外毒素刺激Ｔ細胞増殖およびＩＬ−１β、インターロイキン６（ＩＬ−６）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）およびインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）の産生を阻害する。（Ｋｒａｋａｕｅｒら、（２００１） ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ５００： ５２−５５）。それ故、バイカリンの抗炎症活性は、超抗原により活性化される炎症誘発性サイトカイン仲介シグナル伝達経路を阻害することと結び付けられてきた。しかしながら、バイカリンの抗炎症活性は、種々のケモカイン結合のためであり、それがケモカインの生物学的活性を制限することも提案されている。（Ｌｉら、（２０００） Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ４９： ２９５−３０６）。最近、トロンビンおよびトロンビンレセプターアゴニストペプチドにより誘導される接着分子発現（Ｋｉｍｕｒａら、（２００１） Ｐｌａｎｔａ Ｍｅｄ． ６７： ３３１−３３４）、ならびに有糸分裂促進剤−活性化プロテインキナーゼカスケード（ＭＡＰＫ）の阻害（Ｎａｋａｈａｔａら、（１９９９） Ｎｉｐｐｏｎ Ｙａｋｕｒｉｇａｋｕ Ｚａｓｓｈｉ， １１４， Ｓｕｐｐ １１： ２１５Ｐ−２１９Ｐ；Ｎａｋａｈａｔａら、（１９９８） Ａｍ． Ｊ． Ｃｈｉｎ Ｍｅｄ． ２６： ３１１−３２３）に対するバイカリンの効果が報告された。現在まで、フリー−Ｂ−環フラボノイドとＣＯＸ−２阻害活性を連結する報告は存在しない。
【００１７】
現在まで、多くの天然に存在するフリー−Ｂ−環フラボノイドが色々な使用のために市販されてきた。例えば、コガネバナ抽出物のリポソーム処方がスキンケアのために利用されてきた（米国特許第５，６４３，５９８号；５，４４３，９８３号）。バイカリンは、発癌遺伝子に対するその阻害効果のため、癌の予防に使用されてきた（米国特許第６，２９０，９９５号）。バイカリンおよびその他の化合物が、抗ウイルス、抗菌および免疫調節剤として（米国特許第６，０８３，９２１号）、および天然の抗酸化剤として（ポーランド公開番号第９，８４９，２５６号）使用されてきた。クリシンはその不安軽減特性により使用されてきた（米国特許第５，７５６，５３８号）。抗炎症性フラボノイドは肛門直腸および結腸疾患の制御および処置に（米国特許第５，８５８，３７１号）、およびリポキシゲナーゼの阻害に（米国特許第６，２１７，８７５号）使用されている。フラボノイドエステルは化粧用組成物の活性成分を構成している（米国特許第６，２３５，２９４号）。
【００１８】
日本特許第６３０２７４３５号はバイカリンの抽出および濃縮を記載し、日本特許第６１０５０９２１号はバイカリンの精製を記載している。
発明の要約
本発明はシクロオキシゲナーゼ酵素ＣＯＸ−２の阻害に有効である方法を含んでいる。シクロオキシゲナーゼ酵素ＣＯＸ−２を阻害するための方法は、フリー−Ｂ−環フラボノイドから成っている組成物あるいは、フリー−Ｂ−環フラボノイドの混合物を含んでいる組成物を、それらを必要としている宿主に投与することを包含する。
【００１９】
本発明はまた、ＣＯＸ−２仲介疾患および状態の予防および処置のための方法も含んでいる。ＣＯＸ−２仲介疾患および状態の予防および処置するための方法は、フリー−Ｂ−環フラボノイド含んでいる組成物、あるいはフリー−Ｂ−環フラボノイドおよび医薬として受容可能な担体を含んでいる組成物を、それらを必要としている宿主に投与することを包含する。
【００２０】
以下に従って使用できるフリー−Ｂ−環フラボノイドは下記の一般構造により図示される化合物を含んでいる：
【００２１】
【化２】
【００２２】
式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、―Ｈ、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＯＲ、−ＳＲ、−ＮＨ２、−ＮＨＲ、−ＮＲ２、−ＮＲ３＋Ｘ−、限定されるわけではないが、アルドペントース、メチル−アルドペントース、アルドヘキソース、ケトヘキソースおよびそれらの化学誘導体を含む、単一のまたは多数の糖の組合わせの、炭素、酸素、窒素または硫黄グリコシドからなる群より独立して選択され；
式中、
Ｒは１−１０の間の炭素原子を有するアルキル基であり；および
Ｘは、限定されるわけではないが、ヒドロキシル、クロリド、ヨージド、スルフェート、ホスフェート、アセテート、フルオリド、カーボネートなどを含んでいる、医薬として受容可能なカウンターアニオンの群より選択される。
【００２３】
本発明の方法は、限定されるわけではないが、変形性関節炎、慢性関節リウマチ、月経痙攣、全身性紅斑性狼瘡、乾癬、慢性緊張性頭痛、偏頭痛、局所的創傷および小炎症状態、炎症性腸疾患および固形癌を含む多くのＣＯＸ−２仲介疾患および状態に使用できる。
【００２４】
本発明のフリー−Ｂ−環フラボノイドは、合成法、または限定されるわけではないが、バンレイシ科、キク科（Ａｓｔｅｒａｃｅａｅ）、ノウゼンカズラ科、シクンシ科、キク科（Ｃｏｍｐｏｓｉｔａｅ）、トウダイグサ科、シソ科、クスノキ科、マメ科、クワ科、マツ科、ワラビ科、中国ワラビ科、ニレ科およびショウガ科を含む植物の科から抽出することにより得ることができる。フリー−Ｂ−環フラボノイドは、高等植物の以下の属から抽出、濃縮および精製でき、限定されるわけではないが、デスモス（Ｄｅｓｍｏｓ）属、
アキロクリネ（Ａｃｈｙｒｏｃｌｉｎｅ）属、オロキシルム（Ｏｒｏｘｙｌｕｍ）属、ブケナヴィア（Ｂｕｃｈｅｎａｖｉａ）属、ヤマハハコ属、コツラ（Ｃｏｔｕｌａ）属、ハハコグサ属、ムギワラギク属、ヤグルマギク属、ヒヨドリバナ属、バッカリス（Ｂａｃｃｈａｒｉｓ）属、シラキ属、タツナミソウ属、モルサ（Ｍｏｌｓａ）属、コレブルッケア（Ｃｏｌｅｂｒｏｏｋｅａ）属、イヌゴマ属、オリガヌム（Ｏｒｉｇａｎｕｍ）属、ジジフォラ（Ｚｉｚｉｐｈｏｒａ）属、クロモジ属、カゴノキ属、アカシア属、デリス（Ｄｅｒｒｉｓ）属、カンゾウ属、ナツフジ属、ポンガミア（Ｐｏｎｇａｍｉａ）属、テフロシア（Ｔｅｐｈｒｏｓｉａ）属、アルトカルプス（Ａｒｔｏｃａｒｐｕｓ）属、イチジク属、ピチログラマ（Ｐｉｔｙｒｏｇｒａｍｍａ）属、ノトラエナ（Ｎｏｔｈｏｌａｅｎａ）属、マツ属、ニレ属およびハナミョウガ属が含まれる。
【００２５】
本発明の組成物は当業者には既知である任意の方法により投与できる。投与様式には、限定されるわけではないが、経腸（経口）投与、非経口（静脈内、皮下および筋肉内）投与そして局所適用が含まれる。本発明に従った処置の方法は、限定されるわけではないが、合成的に得られた、天然に存在する、あるいはそれらの任意の組み合わせを含む単一起源または多起源の、個々のおよび／または多数のフリー−Ｂ−環フラボノイド混合物の治療的に有効量を、それらを必要としている患者へ内用であるいは局所的に投与することを含んでいる。
【００２６】
本発明は、フリー−Ｂ−環フラボノイドを含んでいる植物から、これらの化合物を単離および精製するための改良法を含んでいる。本発明の方法は：ａ）フリー−Ｂ−環フラボノイドを含んでいる植物のすり砕いたバイオマスを抽出し；ｂ）該抽出物を中和および濃縮し；およびｃ）該中和および濃縮された抽出物を精製することから成る。本発明の好適な態様において、抽出物は再結晶、沈殿、溶媒分配および／またはクロマトグラフィー的分離からなる群より選択される方法を使用して精製する。本発明は、望ましい生理学的活性を有しているフリー−Ｂ−環フラボノイドの単離および精製のための商業的に実行可能なプロセスを提供する。
【００２７】
本発明は、一連の生物分子スクリーンと、活性植物抽出物およびＣＯＸ−２酵素活性および炎症を特異的に阻害する、これらの抽出物内の特定の化合物を同定するための、化学的既知物質同定プロセスを組み合わせた戦略を与える。全体で１２３０の植物抽出物を、組換えＣＯＸ−２に付随するペルオキシダーゼ活性を阻害する能力でスクリーンした。この一次スクリーンで２２の植物抽出物が同定され、それらはインビトロで、細胞に基づいたおよび全血アッセイの両方において、ＣＯＸ−２を特異的におよび選択的に阻害するそれらの能力がさらに研究された。インビトロで効能があった抽出物は、次に、複数の経路（ＩＰおよび経口）により投与された場合の空気嚢（ａｉｒ ｐｏｕｃｈ）および炎症の局所的耳−膨潤モデルの両方を使用し、炎症を阻害する能力についてインビボで試験した。これらの研究はまた、これらの抽出物の各々で、ＣＯＸ−２阻害に関与する特定のフリー−Ｂ−環フラボノイドの同定をもたらした。出願者は、本出願がフリー−Ｂ−環フラボノイド構造とＣＯＸ−２阻害活性間の相関についての最初の報告であると信じている。
【００２８】
前記の一般的説明および以下の詳細な説明の両方とも、例示のためおよび説明のためのみのものであり、特許請求されているように、本発明を制限するものでないことを理解するべきである。
発明の詳細な説明
本発明の側面に言及するため、種々の用語が本明細書で使用される。本発明の成分の説明を明らかにするのを助けるため、以下の定義を提供する。
【００２９】
本明細書で使用されるような“フリー−Ｂ−環フラボノイド”とは、芳香族Ｂ環上に置換基を有しないフラボノイドの特定の部類であり、下記の一般構造により表される：
【００３０】
【化３】
【００３１】
式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、―Ｈ、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＯＲ、−ＳＲ、−ＮＨ２、−ＮＨＲ、−ＮＲ２、−ＮＲ３＋Ｘ−、限定されるわけではないが、アルドペントース、メチル−アルドペントース、アルドヘキソース、ケトヘキソースおよびそれらの化学誘導体を含む、単一のまたは多数の糖の組合わせの、炭素、酸素、窒素または硫黄グリコシドからなる群より独立して選択され；
式中、
Ｒは１−１０の間の炭素原子を有するアルキル基であり；および
Ｘは、限定されるわけではないが、ヒドロキシル、クロリド、ヨージド、スルフェート、ホスフェート、アセテート、フルオリド、カーボネートなどを含んでいる、医薬として受容可能なカウンターアニオンの群より選択される。
【００３２】
本明細書で使用されるような“療法”とは、処置および／または予防を含んでいる。使用される場合、療法はヒトならびに他の動物に適用する。
“医薬としてあるいは療法的に有効な用量または量”とは、所望の生物学的結果を誘導するために十分な用量レベルを意味している。そのような結果とは、疾患の徴候、症状または原因の軽減、あるいは生体系の任意の他の望ましい変化であることができる。
【００３３】
“宿主”とは、本明細書で説明した組成物が投与される、生きている被験者（ヒトまたは動物）である。
本出願を通じて、いろいろな引用が提供されることに注意されたい。各々の引用は、本明細書において参考文献として、その全体が特別に援用される。
【００３４】
本発明はシクロオキシゲナーゼ酵素ＣＯＸ−２の阻害に有効である方法を含んでいる。シクロオキシゲナーゼ酵素ＣＯＸ−２を阻害するための方法は、フリー−Ｂ−環フラボノイドから成っている組成物あるいは、フリー−Ｂ−環フラボノイドの混合物を含んでいる組成物を、それらを必要としている宿主に投与することを包含する。
【００３５】
本発明はまた、ＣＯＸ−２仲介疾患および状態の予防および処置のための方法も含んでいる。ＣＯＸ−２仲介疾患および状態の予防および処置するための方法は、フリー−Ｂ−環フラボノイド含んでいる組成物、あるいはフリー−Ｂ−環フラボノイドおよび医薬として受容可能な担体を含んでいる組成物を、それらを必要としている宿主に投与することを包含する。
【００３６】
以下に従って使用できるフリー−Ｂ−環フラボノイドは、上に示した一般式により図示された化合物を含んでいる。本発明のフリー−Ｂ−環フラボノイドは、合成法、または限定されるわけではないが、バンレイシ科、キク科（Ａｓｔｅｒａｃｅａｅ）、ノウゼンカズラ科、シクンシ科、キク科（Ｃｏｍｐｏｓｉｔａｅ）、トウダイグサ科、シソ科、クスノキ科、マメ科、クワ科、マツ科、ワラビ科、中国ワラビ科、ニレ科およびショウガ科を
含む植物の科から単離することにより得ることができる。フリー−Ｂ−環フラボノイドは、高等植物の以下の属から抽出、濃縮および精製でき、限定されるわけではないが、デスモス（Ｄｅｓｍｏｓ）属、アキロクリネ（Ａｃｈｙｒｏｃｌｉｎｅ）属、オロキシルム（Ｏｒｏｘｙｌｕｍ）属、ブケナヴィア（Ｂｕｃｈｅｎａｖｉａ）属、ヤマハハコ属、コツラ（Ｃｏｔｕｌａ）属、ハハコグサ属、ムギワラギク属、ヤグルマギク属、ヒヨドリバナ属、バッカリス（Ｂａｃｃｈａｒｉｓ）属、シラキ属、タツナミソウ属、モルサ（Ｍｏｌｓａ）属、コレブルッケア（Ｃｏｌｅｂｒｏｏｋｅａ）属、イヌゴマ属、オリガヌム（Ｏｒｉｇａｎｕｍ）属、ジジフォラ（Ｚｉｚｉｐｈｏｒａ）属、クロモジ属、カゴノキ属、アカシア属、デリス（Ｄｅｒｒｉｓ）属、カンゾウ属、ナツフジ属、ポンガミア（Ｐｏｎｇａｍｉａ）属、テフロシア（Ｔｅｐｈｒｏｓｉａ）属、アルトカルプス（Ａｒｔｏｃａｒｐｕｓ）属、イチジク属、ピチログラマ（Ｐｉｔｙｒｏｇｒａｍｍａ）属、ノトラエナ（Ｎｏｔｈｏｌａｅｎａ）属、マツ属、ニレ属およびハナミョウガ属が含まれる。
【００３７】
フラボノイドは、限定されるわけではないが、幹、幹樹皮、小枝、塊茎、根、根樹皮、若芽、種、根茎、花および他の再生性器官、葉および他の空中部分を含む、植物の異なった部分に見いだすことができる。
【００３８】
ＣＯＸ酵素を阻害できる化合物を同定するため、中国、インドおよび他の国から集めた６１５の薬用植物から抽出された１２３０抽出物から成る抽出物ライブラリーを創造した。抽出物を調製するための一般法は実施例１に記載されており、そこでは例示の目的で、タツナミソウ（ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａ）属の種を使用した。抽出プロセスから、試験された各々の種について有機および水性抽出物を得る。種々のタツナミソウ属の種からの抽出の結果を表１に示した。これらの一次抽出物は、前に詳細に説明したように、シクロオキシゲナーゼの主たる機能的活性の一つであり、そしてＰＧＧ２をＰＧＨ２への、最終的にはＰＧＥ２への変換に関与する、シクロオキシゲナーゼ酵素のペルオキシダーゼ活性の阻害剤を同定するための一次アッセイに使用される材料源である。このアッセイは実施例２に説明されており、結果は表２に示されている。表２を参照すると、二つのタツナミソウ属の種および三つの他の植物種（これらのすべてが共通の成分としてフリー−Ｂ−環フラボノイドを含んでいる）が、異なった程度ではあったが、ＣＯＸ−２のペルオキシダーゼ活性に対する一次スクリーンにおいて阻害活性を示したことが観察された。ＣＯＸ−２阻害活性は、中間的極性のフリー−Ｂ−環フラボノイドのほとんどを含む、有機抽出物中に主として観察される。
【００３９】
粗抽出物の一次アッセイからのＣＯＸ−２阻害活性は、用量応答およびＩＣ５０（酵素活性の５０％を阻害するために必要とされる濃度）の測定により確認された。ＩＣ５０値は表３に示されている。表３に観察できるように、スクテラリア オルトカリックス（Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａ ｏｒｔｈｏｃａｌｙｘ）根抽出物およびムリカ ナナ（Ｍｕｒｉｃａ ｎａｎａ）葉抽出物が最も有効であった（ＩＣ５０＝６−１０ｍｇ／ｍＬ）。ＣＯＸ−２に対する最も高い選択性を示したタツナミソウ属の種からの抽出物はスクテラリア ラテリフローラ（Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａ ｌａｔｅｒｉｆｌｏｒａ）であった（ＣＯＸ−２ ＩＣ５０：３０ｍｇ／ｍＬ；ＣＯＸ−１ ＩＣ５０：８０ｍｇ／ｍＬ）。それ故、ＣＯＸ酵素阻害薬のための一次スクリーンは、インビトロで効力のあった、フリー−Ｂ−環フラボノイドを含んでいる５つの抽出物を同定し、そしてそのいくつかはＣＯＸ−２酵素に特異性を示した。
【００４０】
植物抽出物の活性化合物を効率よく同定するため、実施例３に説明したような高スループット分画化プロセスを使用した。簡単には、活性有機および水性抽出物を、各々２つの異なった方法論を使用して分画した。分画は９６の深いウェルプレートに集めた。分画の各々は、実施例４に説明したように、一次アッセイのようにＣＯＸ活性を阻害するその能力で試験した。結果は図１に示されており、コガネバナの根に由来する種々のＨＴＰ分
画によるＣＯＸ−１およびＣＯＸ−２阻害のプロフィールが描かれている。図１に観察できるように、最も効力あるＣＯＸ阻害活性は２つの重要な分画、Ｅ１１およびＦ１１に観察された。３つの離れたＨＴＰ分画が実際に阻害活性を示していることに注目しなければならず、全抽出物の観察された阻害効果に寄与している、多数の化合物が存在していることを示唆している。
【００４１】
スクテラリア オルトカリックスの有機抽出物中に存在する活性フリー−Ｂ−環フラボノイドの分離、精製および同定を実施例５に説明した。実施例５に説明した方法論を使用し、スクテラリア オルトカリックス根からの有機抽出物の主活性成分としてバイカレインを同定した。実施例６に示したように、いくつかの他のフリー−Ｂ−環フラボノイドが単離され、ＣＯＸ−１およびＣＯＸ−２酵素活性の阻害を試験した。結果を表４に示した。
【００４２】
実施例７および表５は、３つの異なった植物種からの、５つの活性植物抽出物中のフリー−Ｂ−環フラボノイド含有量および分量を示している。フリー−Ｂ−環フラボノイドは水性抽出物に対して、有機抽出物中により多くの量が存在している。このことは、なぜＣＯＸ−２阻害活性が通常、水性抽出物よりもむしろ有機抽出物中に現れるかを説明している。
【００４３】
活性抽出物を同定するために実施例２で説明した一次アッセイは、組換え体酵素を利用する無細胞系である。活性抽出物および化合物の生物学的活性をさらに示すため、細胞に基づいたインビトロ有効性および動物に基づいたインビボ有効性を表す、２つのモデルを用いた。インビトロ有効性および選択性を評価するために使用した方法は、実施例８で説明されている。各々、主としてＣＯＸ−１（ＴＨＰ−１細胞）およびＣＯＸ−２（ＨＯＳＣ細胞）を発現するように誘導できる２つの細胞株を選択した。各々の細胞型は、ＣＯＸ酵素の主生成物であるＰＧＥ２の産生で試験した。結果は表６に示されており、３つの異なったタツナミソウ属の種からの３つの有機抽出物が、ＣＯＸ−１酵素を優先して、ＣＯＸ−１およびＣＯＸ−２酵素両方の阻害を示したことを示している。ＴＨＰ−１細胞株の使用は重要であり、および細胞膜を横切る活性化合物の能力を示しているが、それは不死化された細胞株であり、それ故、より適切なモデル系に基づいたフリー−Ｂ−環フラボノイドの有効性の評価が望まれる。そのため、ＣＯＸ−１およびＣＯＸ−２両方の活性の主起源として全血を使用し、抽出物をまた評価した。この系は、ＣＯＸ−２およびＣＯＸ−１阻害活性を区別するため、各々、ＰＧＥ２ ｖｓ ＴＸＢ２の産生の阻害を測定する。表６に示された結果は、ＣＯＸ−２およびＣＯＸ−１酵素の両方が、３つすべてのスクテラリア根抽出物からのフリー−Ｂ−環フラボノイドにより阻害されることを示している。ＩＣ５０値は、この系内において、コガネバナからのものを除いたすべてのフリー−Ｂ−環フラボノイドがＣＯＸ−２に対してより効力があることを示唆している。全体としてみると、これらの抽出物内に存在する活性化合物の阻害効果は、インビトロでの無細胞および細胞に基づいた系の両方で有意でありおよび有効である。また、試験過程において細胞毒性は観察されなかった。
【００４４】
２つの別々のインビボモデルを、フリー−Ｂ−環フラボノイドで観察されたインビトロ有効性がインビボ炎症応答を阻害する能力へ転換されるかどうかを決定するために用いた。２つのモデルは実施例９に説明されている。これらの系の第一は、アラキドン酸代謝経路から直接的に生じる炎症を測定するように設計した。この実施例においては、炎症性応答を誘発するためのＡＡの局所適用に先立って、３つのタツナミソウ属の種からのフリー−Ｂ−環フラボノイドでマウスを処理した。動物の前処理の効果は、次に、測微計を使用した耳膨潤の抑制により測定された。これらの３つのタツナミソウ属種からのフリー−Ｂ−環フラボノイド含有抽出物は様々な程度の有効性を示した。例えば、コガネバナの根から抽出されたフリー−Ｂ−環フラボノイドは、図３ＡおよびＢに図示したように、経口お
よびＩＰ経路の両方で送達された場合、対照と比較して６０％まで耳膨潤を抑制した。これは、５ｍｇ／ｋｇの濃度でＩＰ送達された場合の陽性対照インドメタシンで観察された抑制の程度に類似している。スクテラリア オルトカリックスから抽出されたフリー−Ｂ−環フラボノイドは、ＩＰ経路投与で送達された場合は効力があったが、経口経路により送達された場合は効果を有せず、そして最後に、スクテラリア ラテリフローラから抽出されたフリー−Ｂ−環フラボノイドは、投与経路にかかわらず、効果を示さなかった（データは示されていない）。
【００４５】
コガネバナから単離されたフリー−Ｂ−環フラボノイドは、アラキドン酸により直接的に誘発された炎症に対して最も有効であることが明瞭に示された。それ故、これらのフリー−Ｂ−環フラボノイドの有効性を、炎症の多数の機構が最終効果の最後の原因になる、第二のモデルを使用して試験した。この系はそれ故、天然に存在する炎症応答により一層関連している。このモデルを使用し、Ｂａｌｂ／Ｃマウスの背中に作られた空気嚢内へ、補足システムの非常に強力な活性化薬を注入した。これにより、炎症性細胞の浸潤、ＣＯＸ酵素の活性化（ＰＧＥ２の放出を生じる）、酵素ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）、およびＴＮＦ−αを含む炎症誘発性サイトカインの非常に特異的なプロフィールの産生、を含む炎症性事象のカスケードが生じる。これらの研究は、コガネバナから単離されたフリー−Ｂ−環フラボノイドが空気嚢内への炎症性細胞の初期浸潤（化学走性応答）は阻害しなかったけれども、これらの細胞の活性化を阻止したことを示した。このことは、嚢の細胞外液内へ排出されたＭＰＯの欠損およびＴＮＦ−α産生の顕著な欠損により証明される。結果は図４に示されている。このデータは、多数の炎症性経路が活性であるモデル系において、フリー−Ｂ−環フラボノイドが有効であることを示している。
【００４６】
医薬製剤で投与するための生成物の調製は、当業者にはよく知られた種々の方法により実行することができる。フリー−Ｂ−環フラボノイドはその天然に存在する形でのハーブ粉末として；異なった濃度の溶剤および／または超臨界流体として；再結晶、カラム分離、溶媒分配、沈殿および他の手段を経た濃縮および精製化合物として；合成法により製造された、実質的に精製されたフリー−Ｂ−環フラボノイドを含んでいる純粋物および／または混合物として処方することができる。
【００４７】
多様な送達系が本分野で知られており、本発明の治療組成物を投与するために使用できる、例えば、水性溶液、リポソーム、微粒子およびマイクロカプセル内へのカプセル化。
本発明の治療組成物は注射により非経口的に投与してもよいが、動脈内注射、吸入ミスト、経口的に活性な処方、経皮イオン導入法または座薬のごとき他の有効な投与形もまた想像される。一つの好適な坦体は生理学的食塩水であるが、他の医薬として受容可能な坦体もまた使用できることも企図される。一つの好適な態様において、坦体およびフリー−Ｂ−環フラボノイドが生理学的に適合した、徐放性処方が想像される。そのような坦体での一次溶剤は、性質が水性でも非水性でもよい。加えて、坦体は処方のｐＨ、浸透圧モル濃度、粘度、透明度、色、無菌性、安定性、溶解速度または香りを修飾または維持するために、他の医薬として受容可能な添加剤を含んでいてもよい。同様に、坦体は、リガンドの安定性、溶解速度、放出または吸収を修飾または維持するために、他の医薬として受容可能な添加剤をさらに含んでいてもよい。そのような添加剤は、１回服用量かまたは多回服用量形での非経口投与のための剤形を処方するために、通常および慣例上用いられる物質である。
【００４８】
一度治療組成物が処方されたら、溶液、懸濁液、ゲル、エマルジョン、固形物、または脱水されたまたは凍結乾燥された粉末として無菌バイアル中で保存してもよいし；または直接カプセル化してもよいし、および／または経口投与のための他の不活性坦体で錠剤化してもよい。そのような製剤は、すぐに使用できる形かまたは投与の直前に再構築を必要とするように保存することができる。全身性送達のための組成物を含んでいる製剤の投与
様式は、経腸、皮下、筋肉内、静脈内、鼻孔内、または膣または直腸座剤であることができる。
【００４９】
特定の障害または状態の処置に有効であろう組成物の量は、障害または状態の性質に依存するだろうし、それは標準臨床技術により決定できる。加えて、最適用量範囲の同定を助けるために、インビトロまたはインビボアッセイを随意に使用することができる。製剤中に使用されるべき正確な用量もまた、投与経路および疾患または状態の重度または進行に依存するだろうが、開業医および各々の患者の情況に従って決定すべきである。有効用量は、インビトロまたは動物モデル試験系から導かれた用量−応答曲線から外挿することができる。例えば、本発明の組成物の有効量は、本発明の組成物を段階的用量で投与し、所望の効果を観察することにより容易に決定される。
【００５０】
本発明に従った処置法は、単一起源または多数の起源からの、個々のおよび／または多数のフリー−Ｂ−環フラボノイド混合物の治療的に有効量を、それらを必要としている患者へ内用であるいは局所的に投与することを含んでいる。個々のおよび／または多数のフリー−Ｂ−環フラボノイド混合物の純度は、化合物を得るために使用された方法論に依存して、限定されるわけではないが、０．０１％から１００％である。好適な態様において、フリー−Ｂ−環フラボノイドおよびそれを含んでいる医薬組成物の用量は、有効で無毒な量であり、一般的に０．０１から２００ｍｇ／体重ｋｇの範囲から選択される。日常の臨床試験を使用している当業者は、処置されている特定の疾患のための最適用量を決定することができる。
【００５１】
本発明は植物からフリー−Ｂ−環フラボノイドを単離および精製するための改良法を含んでおり、それは実施例１０に説明されている。実施例１０において、二つのタツナミソウ属種からのフリー−Ｂ−環フラボノイドを、異なった溶媒系で抽出した。結果は表７および８に示されている。本発明の改良法は：フリー−Ｂ−環フラボノイドを含んでいる植物のすり砕いたバイオマスを単一溶剤または有機溶剤および／または水の組合わせでの抽出、中和および中和された抽出物の濃縮；および再結晶および／またはクロマトグラフィーによる該抽出物の精製から成る。上に提供したように、これらのフリー−Ｂ−環フラボノイドは、２０の植物系統群より多くの属から単離できる。本発明の方法は、これらの化合物を含んでいる任意の植物源からの、これらの化合物の単離へ拡大できる。
【００５２】
さらに、フリー−Ｂ−環フラボノイドは、限定されるわけではないが、全植物、幹、幹樹皮、小枝、塊茎、花、果実、根、根樹皮、若芽、種、根茎、および空中部分を含む、植物の多様な部分から単離できる。好適な態様において、フリー−Ｂ−環フラボノイドは根、再生性器官または全植物から単離される。
【００５３】
植物のすり砕いたバイオマスの抽出に使用する溶媒には、限定されるわけではないが、水、酸性にした水、限定されるわけではないが、メタノールまたはエタノール、およびアルコール類とＴＨＦ、アセトン、酢酸エチルのごとき他の有機溶剤との混合物を含む、混和可能なヒドロキシル化有機溶媒と組み合わされた水が含まれる。一つの態様において、抽出物は４．５−５．５のｐＨまで中和し、次に濃縮および乾燥すると粉末を得る。フリー−Ｂ−環フラボノイドは、限定されるわけではないが、再結晶、溶媒分配、沈殿、昇華、および／または、限定されるわけではないが、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、限外濾過またはこれらの組合わせを含むクロマトグラフィー法、を含む種々の方法により精製できる。
【００５４】
実施例１１は膝関節部および／または股関節部の慢性関節リウマチまたは変形性関節症により起こされる痛みの軽減に対するフリー−Ｂ−環フラボノイドの有効性を評価するた
めに実施された臨床研究を説明している。本研究は単一中心、無作為化、二重盲検、プラシーボ−対照研究であった。膝関節部および／または股関節部の慢性関節リウマチまたは変形性関節症を患った６０の被験者（ｎ＝６０）を４つの群に分け、プラシーボ、ウニベスチン（２５０ｍｇ／日または５００ｍｇ／日）またはセレブレックス（２００ｍｇ／日）で６０日間処置した。ウニベスチンは、６２．５％（ｗ／ｗ）のバイカリン含率および＞７５％（ｗ／ｗ）の総フリー−Ｂ−環フラボノイドを有する、オウゴン標準化抽出物の特許薬品比から成っている。セレブレックスはＣＯＸ−２選択的阻害薬である処方箋薬剤の商標名である。表９は処置前のＷＯＭＡＣ指標スコア（ベースラインスコア）を示しており、表１０は処置後のＷＯＭＡＣ指標スコアにおける変化を示している。図５から８は、研究の結果を図によって説明している。
【００５５】
図５から８で示されているように、痛み、硬直、および身体機能化に関連したＷＯＭＡＣ複合スコアおよび個々のサブスコアは、プラシーボ群と比較すると、フリー−Ｂ−環フラボノイドの投与後に著しい改良を示した。さらに、フリー−Ｂ−環フラボノイドは、痛み軽減および身体機能の改良において、処方箋薬剤セレブレックスと同じ有効性を示した。最後に、投与された２つの異なった用量で、フリー−Ｂ−環フラボノイドでは有効性の相違が観察されなかった。
【００５６】
以下の実施例は例示の目的でのみ提供されており、本発明の範囲を限定することは意図されていない。
（実施例１）タツナミソウ属植物からの有機および水性抽出物の調製
スクテラリア オルトカリックス根、コガネバナ根またはスクテラリア ラテリフローラ全植物からの植物材料を２ｍｍより小さな粒子サイズにまですり砕いた。乾燥し、粉にした植物材料（６０ｇ）は次に三角フラスコに移し、そしてメタノール：ジクロロメタン（１：１）（６００ｍＬ）を加えた。混合物を１時間振盪し、濾過し、そしてバイオマスを再びメタノール：ジクロロメタン（１：１）（６００ｍＬ）で抽出した。有機抽出物を合わせ、真空下で蒸発させると有機抽出物を得た（下記表１参照）。有機抽出後、バイオマスを風乾し、一度超純水（６００ｍＬ）で抽出した。水性溶液を濾過し、凍結乾燥すると水性抽出物を得た（下記表１参照）。
【００５７】
【表１】
【００５８】
（実施例２）種々のタツナミソウ属種からの植物抽出物によるＣＯＸ−２およびＣＯＸ−１ペルオキシダーゼ活性の阻害
特異的ＣＯＸ−２阻害薬の同定のためのスクリーニングプロセスを指向するバイオアッセイは、以下に記載するように、酵素のペルオキシダーゼ活性をアッセイするように設計した。
【００５９】
ペルオキシダーゼアッセイ ＣＯＸ−２阻害薬を検出するためのアッセイを高スループットプラットフォームのために改変した（Ｒａｚ）。簡単には、組換え体ヒツジＣＯＸ−２（Ｃａｙｍａｎ）をペルオキシダーゼ緩衝液（１００ｍＭ ＴＢＳ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１μＭヘム、０．０１ｍｇエピネフリン、０．０９４％フェノール）に溶解し、抽出物（１：５００希釈）と１５分インキュベートした。クワンタブル（Ｑｕａｎｔａｂｌｕ）
（Ｐｉｅｒｃｅ）基質を加え、２５℃で４５分間、発色させた。次に、Ｗａｌｌａｃ Ｖｉｃｔｏｒ ２プレートリーダーを使用してルミネセンスを読みとった。結果は表２に示されている。
【００６０】
表２は、構造的に類似したフリー−Ｂ−環フラボノイドを包含する、５つの植物種（２つのタツナミソウ属種の根、および３つの他の植物種からの抽出物を含む）から得られた有機および水性抽出物による酵素の阻害を示している。データは、組換え体ヒツジＣＯＸ−２酵素および基質単独と比較したペルオキシダーゼ活性のパーセントとして示されている。有機抽出物による阻害は、３０％から９０％の範囲であった。
【００６１】
【表２】
【００６２】
ＣＯＸ−１およびＣＯＸ−２アイソフォームの相対阻害の比較は、これらの酵素各々に対するＩＣ５０値の算出を必要とする。ＩＣ５０とは、対照に関して酵素活性の５０％阻害が特定の阻害剤により達成される濃度として定義される。この場合、表３に示したように、ＩＣ５０値はＣＯＸ−１およびＣＯＸ−２酵素に対して、各々、６から５０μｇ／ｍＬおよび７から８０μｇ／ｍＬの範囲であることが観察された。ＣＯＸ−２およびＣＯＸ−１のＩＣ５０値の比較は、これらの酵素各々に対する、種々の植物からの有機抽出物の特異性を示している。スクテラリア ラテリフローラの有機抽出物は、例えば、ＣＯＸ−１よりもＣＯＸ−２の優先的阻害を示し、各々、ＩＣ５０値は８０および３０μｇ／ｍＬである。いくつかの抽出物がＣＯＸ−２の優先的阻害を示しているが、その他は示していない。ＨＴＰ分画およびこれらの分画から精製された化合物の試験が、これらの抽出物および化合物の真の特異的阻害を決定するために必要である。
【００６３】
【表３】
【００６４】
（実施例３）活性抽出物のＨＴＰ分画化
コガネバナ根からの有機抽出物（４００ｍｇ）をプレパックフラッシュカラム（２ｃｍ
ＩＤｘ８．２ｃｍ、１０ｇのシリカゲル）にロードした。カラムは、Ｈｉｔａｃｈｉ高スループット精製（ＨＴＰ）システムを使用し、（Ａ）５０：５０ ＥｔＯＡｃ：ヘキサンおよび（Ｂ）メタノール、３０分で１００％Ａから１００％Ｂの濃度勾配の移動相により、５ｍＬ／分の流速で溶離した。分離は広帯域波長ＵＶ検出器を使用してモニターし、Ｇｉｌｓｏｎフラクションコレクターを使用して、深い９６ウェルプレート内に、１．９ｍＬ／ウェルで集めた。試料プレートを低真空および遠心分離下で乾燥した。各々のセル内の試料を溶解するためにＤＭＳＯ（１．５ｍＬ）を使用し、一部（１００μＬ）をＣＯＸ阻害アッセイ用に取り出した。
【００６５】
コガネバナ根からの水性抽出物（７５０ｍｇ）を水（５ｍＬ）に溶解し、１μｍシリンジフィルターを通して濾過し、４ｍＬ ＨＰＬＣバイアルへ移した。溶液は次ぎに、オートサンプラーにより、プレパック逆相カラム（Ｃ−１８、１５μｍ粒子サイズ、２．５ｃｍ ＩＤｘ１０ｃｍ、プレカラムを挿入）へ注入した。カラムは、Ｈｉｔａｃｈｉ高スループット精製（ＨＴＰ）システムを使用し、（Ａ）水および（Ｂ）メタノール、２０分で１００％Ａから１００％Ｂの濃度勾配の移動相で、続いて１００％メタノールで５分間、１０ｍＬ／分の流速で溶離した。分離は広帯域波長ＵＶ検出器を使用してモニターし、Ｇｉｌｓｏｎフラクションコレクターを使用して、深い９６ウェルプレート内に、１．９ｍＬ／ウェルで集めた。試料プレートは凍結乾燥した。各々のセル内の試料を溶解するために超純水（１．５ｍＬ）を使用し、一部（１００μＬ）をＣＯＸ阻害アッセイ用に取り出した。
（実施例４）種々のタツナミソウ属種からのＨＴＰ分画によるＣＯＸペルオキシダーゼ活性の阻害
個々の生物活性有機抽出物は、各々の分画の、ＣＯＸ−１およびＣＯＸ−２組換え体酵素両方のペルオキシダーゼ活性を阻害する能力を試験することによりさらに特徴付けられた。結果は図１に描かれており、それは実施例１および３に説明したごとく単離された、コガネバナからのＨＴＰ分画による、ＣＯＸ−２およびＣＯＸ−１活性の阻害を描いている。図１に描かれたプロフィールは、ＣＯＸ−２に対して非常に選択的である阻害のピークを示している。スクテラリア オルトカリックスおよびスクテラリア ラテリフローラを含む他のタツナミソウ属種は、類似の阻害ピークを示した（データは示されていない）。しかしながら、ＣＯＸ−１およびＣＯＸ−２酵素両方が多数の阻害ピークを示しており、最初の阻害プロフィールへ寄与している一つより多くの分子が存在していることを示唆している。
（実施例５）スクテラリア オルトカリックスの有機抽出物からの活性フリー−Ｂ−環フラボノイドの単離および精製
実施例１に説明したように単離された、スクテラリア オルトカリックスの根からの有機抽出物（５ｇ）を、プレパックフレッシュカラム（１２０ｇ シリカゲル、４０μｍ粒子サイズ ３２−６０μｍ、２５ｃｍｘ４ｃｍ）へロードし、（Ａ）５０：５０ ＥｔＯＡｃ：ヘキサンおよび（Ｂ）メタノール、６０分で１００％Ａから１００％Ｂの濃度勾配の移動相により、１５ｍＬ／分の流速で溶離した。１０ｍＬ／分画で、分画を試験管に集めた。溶媒を真空下で蒸発させ、各々の分画中の試料を１ｍＬのＤＭＳＯに溶解し、一部、２０μＬを９６ウェル浅皿プレートへ移し、ＣＯＸ阻害活性を試験した。ＣＯＸアッセイ結果に基づき、活性分画＃３１から＃３９を合併し、蒸発させた。ＨＰＬＣ／ＰＤＡおよびＬＣ／ＭＳによる分析は、８．９分の保持時間および２７２ｍ／ｅにＭＳピークを有する主化合物を示した。生成物はさらに、（Ａ）水および（Ｂ）メタノール、４５分の濃度勾配の移動相で、５ｍＬ／分の流速で溶離する、Ｃ１８セミ分取カラム（２５ｃｍｘ１ｃｍ）により精製した。８８の分画を集め、５．６ｍｇの淡黄色固形物が得られた。純度はＨＰＬＣ／ＰＤＡおよびＬＣ／ＭＳにより決定し、そして基準品およびＮＭＲデータと比較した。１Ｈ ＮＭＲ：δｐｐｍ．（ＤＭＳＯ−ｄ６）８．０８８（２Ｈ，ｍ，Ｈ−３
’，５’），７．５７７（３Ｈ，ｍ，Ｈ−２’，４’，６’），６．９３２（１Ｈ，ｓ，Ｈ−８），６．６１３（１Ｈ，ｓ，Ｈ−３）。 ＭＳ：［Ｍ＋１］＋＝２７１ｍ／ｅ。化合物をバイカレインと同定した。ＣＯＸ−２酵素に対するバイカレインのＩＣ５０は１０μｇ／ｍＬである。
（実施例６）精製フリー−Ｂ−環フラボノイドのＣＯＸ阻害
いくつかの他のフリー−Ｂ−環フラボノイドが得られており、上で説明した方法を使用し、２０μｇ／ｍＬの濃度でのＣＯＸ−２阻害活性を試験した。結果は表４に要約されている。
【００６６】
【表４】
【００６７】
（実施例７）スクテラリア オルトカリックス根、コガネバナ根およびオロキシラム インディカム種子からの活性抽出物中のフリー−Ｂ−環フラボノイドのＨＰＬＣ定量
３つの異なった植物種からの５つの活性抽出物におけるフリー−Ｂ−環フラボノイドの存在および量が確認され、表５に示されている。フリー−Ｂ−環フラボノイドはＬｕｎａ
Ｃ−１８カラム（２５０ｘ４．５ｍｍ、５μｍ）を使用し、０．１％リン酸および２２分で８０％から２０％へのアセトニトリル濃度勾配を使用するＨＰＬＣにより定量分析した。フリー−Ｂ−環フラボノイドは，２５４ｎｍでＵＶ検出器を使用して検出し、フリー−Ｂ−環フラボノイド基準品との比較により、保持時間に基づいて同定した。ＨＰＬＣクロマトグラムは図２に描かれている。
【００６８】
【表５】
【００６９】
（実施例８）種々のタツナミソウ属種からのフリー−Ｂ−環フラボノイドのＣＯＸ阻害活性のインビトロ研究
種々のタツナミソウ属種から単離されたフリー−Ｂ−環フラボノイドのインビトロ有効性およびＣＯＸ−２特異性は、細胞に基づいた系において、アラキドン酸代謝物の発生を阻害するそれらの能力で試験した。構成的にＣＯＸ−２を発現するＨＯＳＣ、およびＣＯＸ−１を発現するＴＨＰ−１細胞株を、アラキドン酸の存在下でプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）を発生するそれらの能力で試験した。
【００７０】
ＣＯＸ−２細胞に基づいたアッセイ。 ＨＯＳＣ（ＡＴＣＣ＃８３０４−ＣＲＬ）細胞を８０−９０％コンフルエントまで培養した。細胞をトリプシン処理し、洗浄し、そして１ｘ１０６細胞／ｍＬの濃度で１０ｍＬの組織培養培地（ＭＥＭ）に再懸濁した。細胞懸濁液（２００μＬ）を９６ウェル組織培養プレートに播き、３７℃および５％ＣＯ２で２時間インキュベートした。次ぎに培地を、ＩＬ−１ｂ（１ｍｇ／ｍＬ）を含んでいる新鮮なＨＯＳＣ培地で置き換え、一夜インキュベートした。再び培地を除去し、１９０ｍＬのＨＯＳＣ培地で置き換えた。次ぎに、１０μＬのＨＯＳＣ培地に溶解した試験化合物を加え、３７℃で１５分インキュベートした。ＨＯＳＣ培地に溶解したアラキドン酸（２０ｍＬ、１００μＭ）を加え、混合物を振盪器上、１０分間室温でインキュベートした。１００μＭインドメタシン含有ＥＬＩＳＡ緩衝液を１９０μＬ／ウェルで含んでいる新しいプレートへ、上清液（２０μＬ）を移した。上清液を、以下に説明するようにＥＬＩＳＡにより分析した。
【００７１】
ＣＯＸ−１細胞に基づいたアッセイ。 ＴＨＰ−１細胞は３０ｍＬの容量に懸濁した（５ｘ１０５細胞／ｍＬ）。ＴＰＡを１０ｎＭ ＴＰＡの最終濃度まで加え、４８時間培養してマクロファージへ分化させた（接着性）。細胞をＨＢＳＳ（２５ｍＬ）に再懸濁し、２００ｍＬ容量、５ｘ１０５細胞／ウェルで、９６ウェルプレートへ加えた。次ぎに、ＲＰＭＩ１６４０（１０μＬ）に溶解した試験化合物を加え、３７℃で１５分インキュベートした。続いて、ＲＰＭＩ（２０μＬ）に溶解したアラキドン酸を加え、混合物を振盪器上、１０分間室温でインキュベートした。上清液（２０μＬ）をインドメタシン含有（１００μＭ）ＥＬＩＳＡ緩衝液（１９０μＬ）へ加えた。次ぎに、上清液を以下に説明するようにＥＬＩＳＡにより分析した。
【００７２】
ＣＯＸ−２全血アッセイ。 正常、健康ドナーからの末梢血は、静脈穿刺により集めた。全血（５００μＬ）を試験化合物および抽出物と３７℃で１５分インキュベートした。リポポリサッカリド（大腸菌血清型０１１１：Ｂ４から）を１００μｇ／ｍＬの最終濃度まで加え、３７℃で一夜培養した。血液を遠心分離し（１２，０００ｘｇ）、血漿を集めた。血漿（１００μＬ）をメタノール（４００μＬ）へ加えてタンパク質を沈殿させた。ＰＧＥ２産生について上清をＥＬＩＳＡにより測定した。この方法は、Ｂｒｉｄｅａｕら、（１９９６） Ｉｎｆｌａｍｍ． Ｒｅｓ． ４５： ６８−７４、に記載されている方法の改良法である。
【００７３】
ＣＯＸ−１全血アッセイ。 新鮮な血液は凝固阻止薬を含んでいないチューブに集め、直ちに、シリコン処理微量遠心チューブに５００μＬの一定量で等分した。試験試料を加え、３７℃で１時間、ボルテックスして凝固させた。次ぎに、試料を遠心分離し（１２，０００ｘｇ）、血漿を集めた。血漿（１００μＬ）をメタノール（４００μＬ）へ加えてタンパク質を沈殿させた。ＴＸＢ２産生について上清をＥＬＩＳＡにより測定した。この方法は、Ｂｒｉｄｅａｕら、（１９９６） Ｉｎｆｌａｍｍ． Ｒｅｓ． ４５： ６８−７４、に記載されている方法の改良法である。
【００７４】
ＥＬＩＳＡアッセイ。 Ｉｍｍｕｎｏｌｏｎ−４ ＥＬＩＳＡプレートを、炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．２）中の捕捉抗体０．５−４μｇ／ｍＬを用い、４℃で一夜被覆した。プレ
ートを洗浄し、遮断緩衝液（ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ）と２時間、室温でインキュベートした。再びプレートを洗浄し、そして試験試料（１００μＬ）を加え、振盪しながら室温で１時間インキュベートした。ペルオキシダーゼ結合第二抗体を５０μＬ容量で加え（０．５−４ｍｇ／ｍＬ含有）、振盪しながら室温で１時間インキュベートした。プレートを次ぎに３回洗浄し、そしてＴＭＢ基質を加えた（１００μＬ）。プレートを３０分間発色させ、その後１Ｍリン酸（１００μＬ）の添加により反応を停止させた。次ぎに、Ｗａｌｌａｃ Ｖｉｃｔｏｒ ２プレートリーダーを使用し、４５０ｎｍで読みとった。
【００７５】
細胞毒性。 細胞毒性は、損傷細胞における乳酸脱水素酵素の放出を測定する比色法キット（Ｏｘｆｏｒｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して評価した。アッセイは使用説明書に従って企図した。試験された化合物はどれも細胞毒性が観察されなかった。
【００７６】
アッセイの結果は表６に示されている。データは、直接比較のため、ＩＣ５０値で表されている。表６を参照すると、ＩＣ５０値は一般的にＣＯＸ−２よりもＣＯＸ−１がより低い。全血もまた、ＰＧＥ２発生（この系におけるＣＯＸ−２の尺度）またはトロンボキサンＢ２（ＴＸＢ２）（ＣＯＸ−１活性化の尺度）の分化抑制について測定した。表６を参照すると、これらの研究は、試験された３種の内の２種に含まれる有機抽出物からのＣＯＸ−２阻害に対する特異性を示している。この矛盾についての可能性のある理由は、構成的に各々の酵素を発現する不死化細胞株と、ＣＯＸ酵素を発現するように誘導される全血由来の初代細胞間の基本的相違である。初代細胞は、インビボ炎症過程を研究するための、より適切なモデルである。
【００７７】
【表６】
【００７８】
（実施例９）種々のタツナミソウ属種からのフリー−Ｂ−環フラボノイドのＣＯＸ阻害活性のインビボ研究
炎症のインビボ抑制を、２つのモデル系を使用して測定した。第一の系（耳膨潤モデル）は、アラキドン酸により直接的に誘発される炎症を測定する。このモデルはＣＯＸ阻害の優れた尺度であるが、ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）による細胞膜リン脂質からのアラキドン酸遊離の上流で起こっているであろうどんな細胞事象を測定していない。それ故、どのように阻害薬がより生物学的に関連した応答に機能しているかどうかを決定するため、空気嚢モデルを使用した。このモデルは、強い細胞浸潤、およびサイトカインならびにアラキドン酸代謝物を含む炎症性メディエーター産生により特徴付けられる炎症性応答を誘発するために補足となる強力な活性化剤を利用する。
【００７９】
耳膨潤モデル。 耳膨潤モデルはアラキドン酸代謝阻害の直接測定である。アラキドン酸のアセトン溶液をマウスの耳に局所的に適用する。アラキドン酸代謝物は、ＣＯＸ−２のごとき酵素の作用により産生される炎症誘発性ディエーターの産生を生じる。膨潤の抑制は、この経路に含まれる酵素の阻害の直接尺度である。結果は図３に示されており、そ
れは２つの時間点（２４時間および１時間）において、強制栄養により経口でまたは腹腔内のどちらかで送達された３つの抽出物の効果を示している。コガネバナから単離されたフリー−Ｂ−環フラボノイドは、ＩＰがより有効であったけれども、ＩＰおよび強制栄養の両方で送達された場合に膨潤を抑制した（図３ＡおよびＢ）。Ｓ．オルトカリックスから抽出されたフリー−Ｂ−環フラボノイドは、ＩＰで与えられた場合にこれらの代謝物の発生を抑制したが、経口では抑制せず、一方、Ｓ．ラテリフローラから単離された抽出物は、インビトロでは有効であったが、インビボでは効果を示さなかった（データは示されていない）。
【００８０】
空気嚢モデル。 コガネバナから単離されたフリー−Ｂ−環フラボノイドが、耳膨潤モデルにおいてより有効であったため、それらをまた炎症の空気嚢モデルを使用して試験した。簡単には、３ｍＬの無菌空気を注入することにより、マウスの背中に空気嚢を作り出した。空気嚢は、１週間の期間、１日おきの１ｍＬの無菌空気追加注入により維持した。動物には耳膨潤モデルで記載したものと同一の方法および濃度を使用して投与し、炎症性応答を開始させるため、ザイモサンを注入した（空気嚢内へ）。４時間後、嚢内の液を集め、炎症性細胞の浸潤、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）活性（細胞活性化、脱顆粒の尺度）、および腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）産生（活性化の尺度）を測定した。結果は図４に示されている。
【００８１】
図４Ａは、空気嚢液から集められた細胞総数を示している。対照（インドメタシン）により抑制された強い応答があったけれども、コガネバナから単離されたフリー−Ｂ−環フラボノイドは炎症性細胞の浸潤（化学走性）を抑制しなかった。化学走性応答は減弱されなかったが、ＭＰＯ活性およびＴＮＦ−α産生を測定することにより、浸潤した細胞が活性化されたかどうかを決定するために液体を試験した。図４Ｂおよび４Ｃは、抽出物がＩＰ投与された場合にＭＰＯ活性およびＴＮＦ−α産生の両方が著しく減少したが、強制栄養では減少しなかったことを示している。これらのデータは、フリー−Ｂ−環フラボノイドは補足活性化により誘発される化学走性応答を抑制しなかったけれども、それらは炎症誘発性ディエーターの放出および産生の防止により、炎症を減少させることに効果的であることを示している。
アラキドン酸誘発耳膨潤。 インビボで炎症を直接的に抑制するフリー−Ｂ−環フラボノイドの能力を以前に記載されているように測定した（Ｇｒｅｅｎｓｐａｎら、（１９９９） Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ４２： １６４−１７２；Ｙｏｕｎｇら、（１９８４） Ｊ． Ｉｎｖｅｓｔ． Ｄｅｒｍａｔ． ８２： ３６７−３７１）。簡単には、５つのＢａｌｂ／Ｃマウス群に、アラキドン酸（ＡＡ）の適用に先立った２４時間および１時間前、腹腔内（Ｉ．Ｐ．）かまたは強制栄養による経口で、図４に示したような試験化合物の３つの用量を与えた。ＡＡのアセトン溶液（２ｍｇ／１５μＬ）を左耳に適用し、陰性対照としてのアセトン（１５μＬ）を右耳に適用した。１時間後、動物をＣＯ２吸入により殺し、そして技術者用測微計を使用して、耳の厚さを測定した。対照は、ＡＡを与えたが、抗炎症薬で処理していない動物、およびＡＡおよび５ｍｇ／ｋｇのインドメタシンで処理された動物を含んでいた。
炎症の空気嚢モデル。 空気嚢モデルは、Ｒｉｏｊａら、（２０００） Ｅｕｒ． Ｊ．
Ｐｈａｒｍ． ３９７： ２０７−２１７、の方法を適応させた。３ｍＬの無菌空気の注入、そして６日間、２日ごとの１ｍＬの追加注入により維持することにより、空気嚢を５つのＢａｌｂ／Ｃ群において確立した。１％ザイモサン（１ｍＬ）の嚢内への注入に先立った２４時間および１時間前、Ｉ．Ｐ．かまたは強制栄養による経口で、図４に示したような試験化合物の３つの用量を動物に与えた。４時間後、動物をＣＯ２吸入により殺し、空気嚢を無菌生理学的食塩水（３ｍＬ）で洗浄した。洗浄液を遠心分離し、浸潤細胞の総数を決定した。また、上清液は確保し、活性化の尺度として、ＥＬＩＳＡによりミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）活性およびＴＮＦ−αの存在を分析した。
（実施例１０）タツナミソウ属種からの標準化フリー−Ｂ−環フラボノイド抽出物の開発
スクテラリア オルトカリックス（５００ｍｇのすり砕いた根）を２５ｍＬの以下の溶剤系で２回抽出した。（１）１００％水、（２）８０：２０ 水：メタノール、（３）６０：４０ 水：メタノール、（４）４０：６０ 水：メタノール、（５）２０：８０ 水：メタノール、（６）１００％メタノール、（７）８０：２０ メタノール：ＴＨＦ、（８）６０：４０ メタノール：ＴＨＦ。抽出溶液を合併し、低真空下で濃縮および乾燥した。化学成分の同定は、フォトダイオードアレイ検出器を使用した高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ／ＰＤＡ）、および２５０ｍｍｘ４．６ｍｍ Ｃ１８カラムにより実施した。化学成分は、バイカレイン、バイカリン、スクテラレインおよびオウゴニン基準品を使用した保持時間およびＰＤＡデータに基づいて定量した。結果は表７に示されている。
【００８２】
【表７】
【００８３】
コガネバナ（１０００ｍｇのすり砕いた根）は、以下のメタノールおよび水の混合物を５０ｍＬ使用して２回抽出した：（１）１００％水、（２）７０：３０ 水：メタノール、（３）５０：５０ 水：メタノール、（４）３０：７０ 水：メタノール、（５）１００％メタノール。抽出溶液を合併し、低真空下で濃縮および乾燥した。化学成分の同定は、フォトダイオードアレイ検出器を使用したＨＰＬＣ（ＨＰＬＣ／ＰＤＡ）、および２５０ｍｍｘ４．６ｍｍ Ｃ１８カラムにより実施した。化学成分は、バイカレイン、バイカリン、スクテラレインおよびオウゴニン基準品を使用した保持時間およびＰＤＡデータに基づいて定量した。結果は表８に示されている。
【００８４】
【表８】
【００８５】
（実施例１１）膝関節部および／または股関節部の慢性関節リウマチまたは変形性関節症の痛み軽減におけるフリー−Ｂ−環フラボノイドの有効性の臨床評価
この臨床研究は単一中心、無作為化、二重盲検、プラシーボ−対照研究であった。膝関節部および／または股関節部の慢性関節リウマチまたは変形性関節症を患った６０の被験者（ｎ＝６０）を以下の４つの群の一つへ無作為においた：Ａ０ プラシーボ ｎ＝１５
プラシーボ；Ａ１ 用量１ ｎ＝１５ ２５０ｍｇ／日（１２５ｍｇ ｂ．ｉ．ｄ．）；Ａ２ 用量２ ｎ＝１５ ウニベスチン ５００ｍｇ／日（２５０ｍｇ ｂ．ｉ．ｄ．）；Ａ３ 活性対照 ｎ＝１５ ２００ｍｇ／日（１００ｍｇ ｂ．ｉ．ｄ．）。ウニベスチンは、６２．５％（ｗ／ｗ）のバイカリン含率および＞７５％（ｗ／ｗ）の総フリー−Ｂ−環フラボノイドを有する、オウゴン標準化抽出物の特許薬品比から成っている。セレブレックスはＣＯＸ−２選択的阻害薬である処方箋薬剤の商標名である。
【００８６】
被験者は性を一致させ、および４０から７５の年齢で募集した。処置は、前記の用量スケジュールに従った、プラシーボまたは活性化合物（ウニベスチンまたはセレブレックス）の６０日間の投与から成っている。ＮＳＡＩＤを服用している被験者は、研究の開始の前に、２週間の洗い出し期間に参加させた。身体的活動は制限しなかった。被験者は、いつでもどんな理由でも、試験を自由にやめることができた。処置の有効性は、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｏｎｔａｒｉｏ ａｎｄ ＭｃＭａｓｔｅｒ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｉｅｓ（ＷＯＭＡＣ）骨−関節症指標を使用し、医者による経口投与後、６０日間評価した。（Ｌｉｎｇａｒｄら、（２００１） Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｏｎｅ ＆ Ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｇｅｒｙ ８３（１２）： １８５６−１８６４；Ｓｏｄｅｎｎａｎ ＆ Ｍａｌｃｈａｕ （２０００） Ａｃｔａ Ｏｒｔｈｏｐ Ｓｃａｎｄ． ７１（１）： ３９−４６参照）。このプロトコールはモントリオール大学ＩＲＢ委員会により論評され、承認されている。表９は処置前のＷＯＭＡＣ指標スコア（ベースラインスコア）を示しており、および表１０は６０日の処置後のＷＯＭＡＣ指標スコアにおける変化を示している。図５から８は研究の結果を図示している。
【００８７】
【表９】
【００８８】
【表１０】
【００８９】
以下に、出願時の特許請求の範囲を記載する。
［請求項１］
シクロオキシゲナーゼ酵素ＣＯＸ−２を阻害するための方法であって、フリー−Ｂ−環フラボノイドから成っている組成物またはフリー−Ｂ−環フラボノイドの混合物を含んでいる組成物を投与することから成っている方法。
【００９０】
［請求項２］
該フリー−Ｂ−環フラボノイドが下記の構造を有している化合物の群より選択される、請求項１に記載の方法：
【化４】
式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、―Ｈ、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＯＲ、−ＳＲ、−ＮＨ２、−ＮＨＲ、−ＮＲ２、−ＮＲ３＋Ｘ−、アルドペントース、メチル−アルドペントース、アルドヘキソース、ケトヘキソースおよびそれらの化学誘導体を包含する単一のまたは多数の糖の組合わせの、炭素、酸素、窒素または硫黄グリコシドからなる群より独立して選択され；
式中、
Ｒは１−１０の間の炭素原子を有するアルキル基であり；および
Ｘは、ヒドロキシル、クロリド、ヨージド、スルフェート、ホスフェート、アセテート、フルオリド、およびカーボネートを包含する、医薬として受容可能なカウンターアニオンの群より選択される。
【００９１】
［請求項３］
該フリー−Ｂ−環フラボノイドが有機合成により得られる、請求項１に記載の方法。
【００９２】
［請求項４］
該フリー−Ｂ−環フラボノイドが植物の一部分から単離される、請求項１に記載の方法。
【００９３】
［請求項５］
該植物が、バンレイシ科、キク科（Ａｓｔｅｒａｃｅａｅ）、ノウゼンカズラ科、シクンシ科、キク科（Ｃｏｍｐｏｓｉｔａｅ）、トウダイグサ科、シソ科、クスノキ科、マメ科、クワ科、マツ科、ワラビ科、中国ワラビ科、ニレ科およびショウガ科から成る科より選択される、請求項４に記載の方法。
【００９４】
［請求項６］
該植物が、デスモス（Ｄｅｓｍｏｓ）属、アキロクリネ（Ａｃｈｙｒｏｃｌｉｎｅ）属、オロキシルム（Ｏｒｏｘｙｌｕｍ）属、ブケナヴィア（Ｂｕｃｈｅｎａｖｉａ）属、ヤマハハコ属、コツラ（Ｃｏｔｕｌａ）属、ハハコグサ属、ムギワラギク属、ヤグルマギク属、ヒヨドリバナ属、バッカリス（Ｂａｃｃｈａｒｉｓ）属、シラキ属、タツナミソウ属、モルサ（Ｍｏｌｓａ）属、コレブルッケア（Ｃｏｌｅｂｒｏｏｋｅａ）属、イヌゴマ属、オリガヌム（Ｏｒｉｇａｎｕｍ）属、ジジフォラ（Ｚｉｚｉｐｈｏｒａ）属、クロモジ属、カゴノキ属、アカシア属、デリス（Ｄｅｒｒｉｓ）属、カンゾウ属、ナツフジ属、ポンガミア（Ｐｏｎｇａｍｉａ）属、テフロシア（Ｔｅｐｈｒｏｓｉａ）属、アルトカルプス（Ａｒｔｏｃａｒｐｕｓ）属、イチジク属、ピチログラマ（Ｐｉｔｙｒｏｇｒａｍｍａ）属、ノトラエナ（Ｎｏｔｈｏｌａｅｎａ）属、マツ属、ニレ属およびハナミョウガ属から成る属より選択される、請求項４に記載の方法。
【００９５】
［請求項７］
フリー−Ｂ−環フラボノイドが、幹、幹樹皮、小枝、塊茎、根、根樹皮、若芽、種、根茎、花および他の再生性器官、葉および他の空中部分から成る群より選択される植物の一部
分から単離される、請求項４に記載の方法。
【００９６】
［請求項８］
ＣＯＸ−２仲介疾患又は状態を予防又は処置するための方法であって、フリー−Ｂ−環フラボノイドから成っている組成物またはフリー−Ｂ−環フラボノイドおよび医薬として受容可能な坦体の混合物を含んでいる組成物の有効量を、それらを必要としている宿主に投与することから成っている方法。
【００９７】
［請求項９］
該フリー−Ｂ−環フラボノイドが下記の構造を有している化合物の群より選択される、請求項８に記載の方法：
【化５】
式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、―Ｈ、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＯＲ、−ＳＲ、−ＮＨ２、−ＮＨＲ、−ＮＲ２、−ＮＲ３＋Ｘ−、アルドペントース、メチル−アルドペントース、アルドヘキソース、ケトヘキソースおよびそれらの化学誘導体を包含する単一のまたは多数の糖の組合わせの、炭素、酸素、窒素または硫黄グリコシドからなる群より独立して選択され；
式中、
Ｒは１−１０の間の炭素原子を有するアルキル基であり；および
Ｘは、ヒドロキシル、クロリド、ヨージド、スルフェート、ホスフェート、アセテート、フルオリド、およびカーボネートを包含する、医薬として受容可能なカウンターアニオンの群より選択される。
【００９８】
［請求項１０］
該フリー−Ｂ−環フラボノイドが有機合成により得られる、請求項８に記載の方法。
【００９９】
［請求項１１］
該フリー−Ｂ−環フラボノイドが植物の一部分から単離される、請求項８に記載の方法。
【０１００】
［請求項１２］
該植物が、バンレイシ科、キク科（Ａｓｔｅｒａｃｅａｅ）、ノウゼンカズラ科、シクンシ科、キク科（Ｃｏｍｐｏｓｉｔａｅ）、トウダイグサ科、シソ科、クスノキ科、マメ科、クワ科、マツ科、ワラビ科、中国ワラビ科、ニレ科およびショウガ科から成る科より選択される、請求項１１に記載の方法。
【０１０１】
［請求項１３］
該植物が、デスモス（Ｄｅｓｍｏｓ）属、アキロクリネ（Ａｃｈｙｒｏｃｌｉｎｅ）属、オロキシルム（Ｏｒｏｘｙｌｕｍ）属、ブケナヴィア（Ｂｕｃｈｅｎａｖｉａ）属、ヤマハハコ属、コツラ（Ｃｏｔｕｌａ）属、ハハコグサ属、ムギワラギク属、ヤグルマギク属、ヒヨドリバナ属、バッカリス（Ｂａｃｃｈａｒｉｓ）属、シラキ属、タツナミソウ属、
モルサ（Ｍｏｌｓａ）属、コレブルッケア（Ｃｏｌｅｂｒｏｏｋｅａ）属、イヌゴマ属、オリガヌム（Ｏｒｉｇａｎｕｍ）属、ジジフォラ（Ｚｉｚｉｐｈｏｒａ）属、クロモジ属、カゴノキ属、アカシア属、デリス（Ｄｅｒｒｉｓ）属、カンゾウ属、ナツフジ属、ポンガミア（Ｐｏｎｇａｍｉａ）属、テフロシア（Ｔｅｐｈｒｏｓｉａ）属、アルトカルプス（Ａｒｔｏｃａｒｐｕｓ）属、イチジク属、ピチログラマ（Ｐｉｔｙｒｏｇｒａｍｍａ）属、ノトラエナ（Ｎｏｔｈｏｌａｅｎａ）属、マツ属、ニレ属およびハナミョウガ属から成る属より選択される、請求項１１に記載の方法。
【０１０２】
［請求項１４］
フリー−Ｂ−環フラボノイドが、幹、幹樹皮、小枝、塊茎、根、根樹皮、若芽、種、根茎、花および他の再生性器官、葉および他の空中部分から成る群より選択される植物の一部分から単離される、請求項１１に記載の方法。
【０１０３】
［請求項１５］
ＣＯＸ−２仲介疾患又は状態が、変形性関節炎、慢性関節リウマチ、月経痙攣、全身性紅斑性狼瘡、乾癬、慢性緊張性頭痛、偏頭痛、炎症性腸疾患と関連する炎症；小擦過傷、日焼けおよび接触性皮膚炎からなる群より選択される局所的創傷および小炎症状態；および固形癌から成る群より選択される、請求項８に記載の方法。
【０１０４】
［請求項１６］
フリー−Ｂ−環フラボノイド組成物が、０．０１％から１００％のフリー−Ｂ−環フラボノイドから成る、請求項８に記載の方法。
【０１０５】
［請求項１７］
組成物が、０．０１から２００ｍｇ／体重ｋｇから成る群より選択される用量で投与される、請求項８に記載の方法。
【０１０６】
［請求項１８］
投与の経路が、適切な医薬処方での経口、局所、座剤、静脈内、および経皮、胃内、筋肉内、腹腔内、および静脈内投与から成る群より選択される、請求項８に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【０１０７】
【図１】図１は、コガネバナからのＨＴＰ分画によるＣＯＸ−１およびＣＯＸ−２の阻害を、図を用いて描いている。抽出物は実施例１および３に説明したように調製および分画した。抽出物は、組換え体ヒツジＣＯＸ−１（■）またはヒツジＣＯＸ−２（◆）のペルオキシダーゼ活性の阻害で試験した。データは非処置対照のパーセントとして表されている。
【図２Ａ】図２Ａはスクテラリア ラテリフローラ根からの有機抽出物中のフリー−Ｂ−環フラボノイドの高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）クロマトグラムを描いている。
【図２Ｂ】図２Ｂはスクテラリア オルトカリックス根からの有機抽出物中のフリー−Ｂ−環フラボノイドの高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）クロマトグラムを描いている。
【図２Ｃ】図２Ｃはコガネバナ根からの有機抽出物中のフリー−Ｂ−環フラボノイドの高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）クロマトグラムを描いている。
【図３】図３は、アラキドン酸誘発炎症に対する、コガネバナからのフリー−Ｂ−環フラボノイドのインビボ有効性を示している。インビボ有効性は、実施例９に説明したように、アラキドン酸の直接適用により誘発される膨潤を抑制する能力に基づいて評価した。処置耳および対照耳間の、膨潤における平均差異が図３Ａに示されている。図３Ｂはアラキドン酸処置対照と比較した、各々の群のパーセント阻害を示している。
【図４Ａ】図４Ａは、ザイモサンにより誘発された炎症に対する、コガネバナから単離されたフリー−Ｂ−環フラボノイドのインビボ有効性を図で説明している。ザイモサンは、実施例９で説明したように、空気嚢中の炎症誘発性応答を惹起するために使用した。炎症誘発性細胞の浸潤を含む炎症マーカーを、コガネバナからのフリー−Ｂ−環フラボノイドの有効性および抗炎症活性作用機構を評価するために使用した。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ザイモサンにより誘発された炎症に対する、コガネバナから単離されたフリー−Ｂ−環フラボノイドのインビボ有効性を図で説明している。ザイモサンは、実施例９で説明したように、空気嚢中の炎症誘発性応答を惹起するために使用した。空気嚢液中のＭＰＯ活性のパーセント阻害を含む炎症マーカーを、コガネバナからのフリー−Ｂ−環フラボノイドの有効性および抗炎症活性作用機構を評価するために使用した。
【図４Ｃ】図４Ｃは、ザイモサンにより誘発された炎症に対する、コガネバナから単離されたフリー−Ｂ−環フラボノイドのインビボ有効性を図で説明している。ザイモサンは、実施例９で説明したように、空気嚢中の炎症誘発性応答を惹起するために使用した。ＴＮＦ−α産生のパーセント阻害を含む炎症マーカーを、コガネバナからのフリー−Ｂ−環フラボノイドの有効性および抗炎症活性作用機構を評価するために使用した。
【図５】図５は、実施例１１で説明したように、プラシーボ、２００ｍｇ／日の用量でのセレブレックス、２５０ｍｇ／日の用量でのウニベスチン、および５００ｍｇ／日の用量でのウニベスチンにより６０日処置した後での、複合ＷＯＭＡＣ指標スコアの％変化を図で説明している。
【図６】図６は、実施例１１で説明したように、プラシーボ、２００ｍｇ／日の用量でのセレブレックス、２５０ｍｇ／日の用量でのウニベスチン、および５００ｍｇ／日の用量でのウニベスチンにより６０日処置した後での、硬直のＷＯＭＡＣ指標スコアの％変化を図で説明している。
【図７】図７は、実施例１１で説明したように、プラシーボ、２００ｍｇ／日の用量でのセレブレックス、２５０ｍｇ／日の用量でのウニベスチン、および５００ｍｇ／日の用量でのウニベスチンにより６０日処置した後での、身体機能化に関連するＷＯＭＡＣ指標スコアの％変化を図で説明している。
【図８】図８は、実施例１１で説明したように、プラシーボ、２００ｍｇ／日の用量でのセレブレックス、２５０ｍｇ／日の用量でのウニベスチン、および５００ｍｇ／日の用量でのウニベスチンにより６０日処置した後での、痛みに関するＷＯＭＡＣ指標スコアの％変化を図で説明している。
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般的に、ＣＯＸ−２仲介疾患および状態の予防および処置のための方法に関する。具体的には、本発明は、本明細書においてフリー（Ｆｒｅｅ）−Ｂ−環フラボノイドと称される化合物の投与による、ＣＯＸ−２仲介疾患および状態の予防および処置のための方法に関する。本発明には、植物源から標準化フリー−Ｂ−環フラボノイド抽出物を発生させるための改良法も包含される。
【背景技術】
【０００２】
細胞膜からのアラキドン酸（ＡＡ）の遊離および代謝は、いくつかの異なった経路により、炎症誘発性代謝物の発生を生じる。論証できることだが、炎症への二つの最も重要な経路は、酵素５−リポキシゲナーゼ（５−ＬＯ）およびシクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）により仲介される。これらは、各々、炎症性応答の開始および進行に重要な役割を果たすロイコトリエンおよびプロスタグランジンの発生を生じる平行した経路である。これらの血管作動性化合物は、両方とも組織内への炎症性細胞の浸潤を促進し、そして炎症性応答の持続に働く化学走性剤（ｃｈｅｍｏｔａｘｉｎ）である。それゆえに、炎症のこれらのメディエイター（ｍｅｄｉａｔｏｒ）を発生する原因となる酵素は多くの新規抗炎症薬の標的とされてきた。
【０００３】
酵素シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）の阻害は、ほとんどの非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）にあるとされる作用機構である。ＣＯＸ酵素には二つの性質が異なるアイソフォーム（ｉｓｏｆｏｒｍ）（ＣＯＸ−１およびＣＯＸ−２）が存在し、それらは約６０％の配列相同性を共有しているが、発現プロファイルおよび機能が異なっている。ＣＯＸ−１は、生理学的に重要なプロスタグランジンの産生に連結された酵素の構成形であり、血小板凝集、胃における細胞機能の保護および正常腎機能の維持のごとき正常な生理学的機能の制御を助けている。（ＤａｎｎｈａｒｄｔおよびＫｉｅｆｅｒ （２００１） Ｅｕｒ． Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．３６：１０９−２６）。第二のアイソフォーム、ＣＯＸ−２、はインターロイキン−１β（ＩＬ−１β）および他の増殖因子のごとき炎症誘発性サイトカインにより誘導可能である酵素の形である。（Ｈｅｒｓｃｈｍａｎｎ （１９９４） Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖ． １３４： ２４１−５６；Ｘｉｅら，（１９９２） Ｄｒｕｇｓ Ｄｅｖ． Ｒｅｓ． ２５： ２４９−６５）。このアイソフォームは、アラキドン酸（ＡＡ）からのプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）産生を触媒する。ＣＯＸ−２の阻害は、従来のＮＳＡＩＤによる抗炎症活性の原因である。
【０００４】
ＣＯＸ−２阻害薬の作用機構は従来のＮＳＡＩＤの機構と重なっているため、ＣＯＸ−２阻害薬は、炎症が決定的な役割を果たす一過性状態および慢性疾患での炎症に関連した痛みおよび膨潤を含む多くの同一症状を処置するために使用される。一過性状態は、小擦過傷、日焼けまたは接触性皮膚炎に関連した炎症の処置、ならびに、緊張性頭痛および偏頭痛および月経痙攣に関連した痛みの軽減を含んでいる。慢性状態への応用は、慢性関節リュウマチおよび変形性関節炎のごとき関節炎疾患を含んでいる。慢性関節リュウマチは主として自己免疫疾患であり、および変形性関節炎は関節中の軟骨の分解により引き起こされるが、それぞれに関連する炎症を減少させることは、これらの疾患を患っている患者における生活の質の著しい上昇を提供する。（Ｗｉｅｎｂｅｒｇ （２００１） Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｒｅｓ． ２２： ３１９−４１；Ｗｏｌｌｈｉｅｍ （２０００） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｒｈｅｕｍ． １３： １９３−２０１）。慢性関節リウマチに加え、炎症は一般にリウマチ性疾患の構成要素である。それ故に、ＣＯＸ阻害薬の使用は、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）（Ｇｏｅｂｅｌら、 （１９９９） Ｃｈｅｍ． Ｒｅｓ．
Ｔｏｘ． １２： ４８８−５００； Ｐａｔｒｏｎｏら、（１９８５） Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ７６： １０１１−１０１８）のごとき疾患、ならびに、強皮症のごときリウマチ性皮膚状態を含ませるように拡大されてきた。ＣＯＸ阻害薬はまた、乾癬のごときリウマチ起源ではない炎症性皮膚状態のためにも使用され、ここにおいて、プロスタグランジンの過剰産生から生じる炎症を軽減させることは、直接的利益を提供することができる。（Ｆｏｇｈら、（１９９３） Ａｃｔａ Ｄｅｒｍ Ｖｅｎｅｒｏｌｏｇｉｃａ ７３： １９１−３）。簡単に述べると、ＣＯＸ阻害薬は慢性炎症性疾患ならびに一過性炎症から生じる不定期的疼痛および痛みの症状の処置に有用である。
【０００５】
抗炎症薬としてのそれらの使用に加え、ＣＯＸ阻害薬の役割における別の可能性は、癌
の処置に存在する。ＣＯＸ−２の過剰発現が多様なヒト悪性腫瘍で示されており、そしてＣＯＸ−２阻害薬は、皮膚、乳腺および膀胱腫瘍を有する動物の処置において有効であることが示されている。作用機構は完全には明確にされていないとはいえ、ＣＯＸ−２の過剰発現はアポトーシスを阻害し、および腫瘍発生性細胞型の侵襲性を増加させることが示されている。（Ｄｅｍｐｋｅら、（２００１） Ｊ． Ｃａｎ． Ｒｅｓ． Ｃｌｉｎ．
Ｏｎｃｏｌ． １２７： ４１１−１７；ＭｏｏｒｅおよびＳｉｍｍｏｎｓ （２０００） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ７： １１３１−４４）。ＣＯＸ−２の過剰発現により生じるプロスタグランジンの促進された産生は、細胞増殖を促進し、その結果として血管形成を増加させることが可能である。（ＭｏｏｒｅおよびＳｉｍｍｏｎｓ
（２０００） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ７： １１３１−４４；Ｆｅｎｔｏｎら、（２００１） Ａｍ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｏｎｃｏｌ． ２４： ４５３−５７）。
【０００６】
異なった型の癌の予防および処置におけるＣＯＸ−２阻害薬の可能性を評価している多くの臨床研究が存在する。例えば、非特異的ＮＡＳＩＤであるアスピリンは、結腸直腸癌の発生率を４０−５０％（Ｇｉｏｖａｎｎｕｃｃｉら、（１９９５） Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ． ３３３：６０９−６１４）、および死亡率を５０％（Ｓｍａｌｌｅｙら、（１９９９） Ａｒｃｈ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ． １５９： １６１−１６６）減少させることが見いだされている。１９９９年に、ＦＤＡは結腸直腸癌死亡率を減少させるため、ＦＡＰ（家族性腺腫性ポリポージス）におけるＣＯＸ−２阻害薬セレコキシブ（ＣｅｌｅＣＯＸｉｂ）の使用を承認した。ＣＯＸ−２関与の証拠がある他の癌は、ＣＯＸ−２阻害薬により成功裏に予防および／または処置することができると信じられており、食道癌、頭部および頚部癌、乳癌、膀胱癌、子宮頚癌、前立腺癌、肝細胞性癌腫および非小細胞肺癌が含まれるが、それらに限定されるわけではない。（Ｊａｅｃｈｅｌら、（２００１） Ａｒｃｈ． Ｏｔｏｌａｒｎｙｇｏｌ． １２７：１２５３−５９ ； Ｋｉｒｓｃｈｅｎｂａｕｍら、（２００１） Ｕｒｏｌｏｇｙ ５８： １２７−３１；ＤａｎｎｈａｒｄｔおよびＫｉｅｆｅｒ （２００１） Ｅｕｒ． Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．
３６： １０９−２６）。ＣＯＸ−２阻害薬はまた、ハイリスク患者において結腸癌を予防することに成功したことも証明できる。また、ＣＯＸ−２阻害薬は重篤な癌のいくつかの型を予防または逆転さえもさせることができるという証拠も存在する。現在まで、５０もの多くの研究が、ＣＯＸ−２阻害薬は動物における前悪性および悪性腫瘍を予防でき、および同様に膀胱、食道および皮膚癌を予防できる可能性があることを示している。
【０００７】
最近の科学の進歩は、ＣＯＸ−２発現、一般的炎症およびアルツハイマー病（ＡＤ）の病因間の相関を同定した。（Ｈｏら、（２００１） Ａｒｃｈ． Ｎｅｕｒｏｌ． ５８： ４８７−９２）。動物モデルにおいて、ＣＯＸ−２酵素を過剰発現するトランスジェニックマウスは、損傷に対してより感受性があるニューロンを有している。アメリカ国立老化研究所（ＮＩＡ）は、ＮＳＡＩＤがアルツハイマー病の進行を遅らすことができるがどうかを決定するための臨床試行に乗り出している。ナプロキセン（非選択的ＮＳＡＩＤ）およびロフェコキシブ（ｒｏｆｅＣＯＸｉｂ）（ヴィオックス（Ｖｉｏｘｘ）、ＣＯＸ−２特異的選択的ＮＳＡＩＤ）が評価されるであろう。従来の証拠は、炎症がアルツハイマー病に寄与していることを示している。アルツハイマー協会およびＮＩＡによると、米国において約４００万人がＡＤを患っており；世紀半ばまでには１４００万に増加すると予測されている。
【０００８】
ＣＯＸ酵素（プロスタグランジンＨ２シンターゼとしても知られている）は、二つの別々の反応を触媒する。第一の反応において、アラキドン酸が代謝されて不安定なプロスタグランジンＧ２（ＰＧＧ２）を形成する（シクロオキシゲナーゼ反応）。第二の反応において、ＰＧＧ２はエンドペルオキシドＰＧＨ２へ変換される（ペルオキシダーゼ反応）。本明細書に記載した化合物は、ＣＯＸ−１およびＣＯＸ−２ペルオキシダーゼ活性の阻害
に焦点を当てたアッセイ、そしてＣＯＸ酵素の新規阻害薬を同定するための化学的既知物質同定（ｄｅｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）プロセスを組み合わせた発見戦略の結果である。
【０００９】
フラボノイドは広範囲に分布している天然産物の群である。フラボノイドの摂取は、発生事象痴呆の危険率と逆相関していることが示されている。作用機構は知られていないが、フラボノイドの抗酸化効果によるものであると推測されている。（Ｃｏｍｍｅｎｇｅｓら、（２０００） Ｅｕｒ． Ｊ． Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ １６： ３５７−３６３）。ポリフェノールフラボンは、ＣＯＸ−２、ＮｆカッパＢおよびｂｃｌ−Ｘ（Ｌ）を含む遺伝子にＲＮＡレベルで作用することにより、形質転換された結腸細胞においてプログラムされた細胞死、分化および増殖阻害を誘導する。（Ｗｅｎｚｅｌら、（２０００） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ６０： ３８２３−３８３１）。Ｂ環上のヒドロキシル基の数がＣＯＸ−２転写活性の抑制において重要であることが報告されている。（Ｍｕｔｏｈら、（２０００） Ｊｎｐ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ９１： ６８６−６９１）。
【００１０】
下記の一般構造により図示されているように、芳香族Ｂ環上に置換基を有しないフリー−Ｂ−環フラボンおよびフラボノールはフラボノイドの特定の部類である：
【００１１】
【化１】
【００１２】
式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、―Ｈ、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＯＲ、−ＳＲ、−ＮＨ２、−ＮＨＲ、−ＮＲ２、−ＮＲ３＋Ｘ−、限定されるわけではないが、アルドペントース、メチル−アルドペントース、アルドヘキソース、ケトヘキソースおよびそれらの化学誘導体を含む、単一のまたは多数の糖の組合わせの、炭素、酸素、窒素または硫黄グリコシドからなる群より独立して選択され；
式中、
Ｒは１−１０の間の炭素原子を有するアルキル基であり；および
Ｘは、限定されるわけではないが、ヒドロキシル、クロリド、ヨージド、スルフェート、ホスフェート、アセテート、フルオリド、カーボネートなどを含んでいる、医薬として受容可能なカウンターアニオンの群より選択される。フリー−Ｂ−環フラボノイドは比較的に稀である。合成されたまたは天然源から単離された全９３９６のフラボノイドの内、２３１のフリー−Ｂ−環フラボノイドのみしか知られていない。（Ｔｈｅ Ｃｏｍｂｉｎｅｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ， Ｃｈａｐｍａｎ ＆ Ｈａｌｌ／ＣＲＣ， 第５版：２００１年６月１日）。
【００１３】
中国薬用植物、コガネバナ（Ｓｃｕｌｔｅｌｌａｒｉａ Ｂａｉｃａｌｅｎｓｉｓ）はバイカレイン（ｂａｉｃａｌｅｉｎ）、バイカリン（ｂａｉｃａｌｉｎ）、オウゴニン（ｗｏｇｏｎｉｎ）およびバイカレノシド（ｂａｉｃａｌｅｎｏｓｉｄｅ）を含むかなりの量のフリー−Ｂ−環フラボノイドを含んでいる。伝統的にこの植物は、解熱、消炎、湿気−温暖および夏季熱症候群；高熱により生じる多渇症；カルブンケル、潰瘍および他の化膿性皮膚感染；急性扁桃炎、咽頭喉頭炎および猩紅熱のごとき上気道感染；ウイルス性肝炎；腎炎；腎盂炎；赤痢；吐血および鼻血を含む、多くの状態を処置するために使用され
てきた。この植物はまた伝統的に、流産を防止するためにも使用されてきた。（Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ＳｈａｎｇＨａｉ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｒｅｓｓ，上海，中国，１９９８、を参照）。臨床的には、コガネバナは現在、肺炎、小児細菌性下痢症、ウイルス性肝炎、急性胆嚢炎症、高血圧、切断および手術により生じる局所性急性炎症、気管支喘息および上気道感染のごとき状態を処置するために使用する。（Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ＳｈａｎｇＨａｉ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｒｅｓｓ，上海，中国，１９９８）。気管支喘息に対するオウゴンの薬学的効能は、伝える所によれば, フリー−Ｂ−環フラボノイドの存在、およびエオタキシン関与好酸球動員のそれらの抑制に相関している。（Ｎａｋａｊｉｍａら、（２００１） Ｐｌａｎｔａ Ｍｅｄ． ６７（２） ： １３２−１３５）。
【００１４】
フリー−Ｂ−環フラボノイドは多様な生物活性を持っていると報告されている。例えば、ガランギン（３，５，７−トリヒドロキシフラボン）は抗酸化剤およびフリーラジカル捕捉剤として働き、そして抗遺伝毒性および癌化学的予防のための将来有望な候補であると信じられている。（Ｈｅｏら、（２００１） Ｍｕｔａｔ． Ｒｅｓ． ４８８（２）
： １３５−１５０）。それはチロシナーゼ モノフェノラーゼの阻害剤（Ｋｕｂｏら、（２０００） Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ８（７）： １７４９−１７５５）、ウサギ心臓カルボニルレダクターゼの阻害剤（Ｉｍａｍｕｒａら、（２０００）
Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １２７（４）： ６５３−６５８）であり、抗菌活性（ＡｆｏｌａｙａｎおよびＭｅｙｅｒ （１９９７） Ｅｔｈｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ． ５７（３）： １７７−１８１）および抗ウイルス活性（Ｍｅｙｅｒら、（１９９７） Ｊ．
Ｅｔｈｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ． ５６（２）： １６５−１６９）を有する。バイカレインおよびガランギン（二つの別のフリー−Ｂ−環フラボノイド）は、ヒト乳癌細胞に対する抗増殖活性を有している（Ｓｏら、（１９９７） Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ． １１２（２）： １２７−１３３）。
【００１５】
典型的には、フラボノイドはそれらの有効性に基づいて手当たりしだいに活性が試験されてきた。時折、Ｂ−環上の置換の必要性が、ｐ−糖蛋白質への高親和性結合（Ｂｏｕｍｅｎｄｊｅｌら、（２００１） Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔ． １１（１）： ７５−７７）、強心薬効果（Ｉｔｏｉｇａｗａら、（１９９９） Ｊ． Ｅｔｈｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ． ６５（３）： ２６７−２７２）、リノレン酸ヒドロペルオキシド−誘導毒性に対する上皮細胞における保護効果（ＫａｎｅｋｏおよびＢａｂａ （１９９９） Ｂｉｏｓｃｉ Ｂｉｏｔｈｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ ６３（２）： ３２３−３２８）ＣＯＸ−１阻害活性（Ｗａｎｇ （２０００） Ｐｈｙｔｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ７： １５−１９）およびプロスタグランジンエンドペルオキシダーゼシンターゼ（Ｋａｌｋｂｒｅｎｎｅｒら、（１９９２） Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ４４（１）： １−１２）に必要とされるＢ環置換のごとく、特定の生物学的活性について力説されてきた。ほんの少数の論文しかフリー−Ｂ−環フラボノイドの非置換Ｂ環の重要性を言及していない。一つの例は、抗凝血薬の可能性としての、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈキノンアクセプターオキシドレダクターゼを阻害する２−フェニルフラボンの使用である。（Ｃｈｅｎら、（２００１） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ６１（１１）： １４１７−１４２７）。
【００１６】
種々のフリー−Ｂ−環フラボノイドの抗炎症活性に関連して報告された作用機構は議論のあるところである。フリー−Ｂ−環フラボノイド、クリシン（Ｌｉａｎｇら、（２００１） ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ４９６（１）： １２−１８）、オウゴニン（Ｃｈｉら、（２００１） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ６１： １１９５−１２０３）およびハランギン（Ｒａｓｏら、（２００１） Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ． ６８（８）：
９２１−９３１）の抗炎症活性は、ペルオキシソーム−増殖因子活性化レセプターガンマの活性化および脱顆粒およびＡＡ放出に対する影響を経た、誘導可能シクロオキシゲナーゼおよび酸化窒素シンターゼの誘導に関与していた。（Ｔｏｒｄｅｒａら、（１９９４）
Ｚ． Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ［Ｃ］ ４９： ２３５−２４０）。オロキシリン、バイカレインおよびオウゴニンは、シクロオキシゲナーゼに影響することなく１２−リポキシゲナーゼを阻害することが報告されている。（Ｙｏｕら、（１９９９） Ａｒｃｈ． Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｓ． ２２（１）： １８−２４）。より最近、オウゴニン、バイカリンおよびバイカレインの抗炎症活性は、酸化窒素阻害薬およびリポポリサッカリドにより誘導された、誘導可能酸化窒素シンターゼおよびＣＯＸ−２遺伝子発現の阻害を通して生じると報告されている。（Ｃｈｅｎら、（２００１） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ６１（１１）： １４１７−１４２７）。また、オロキシリンは核因子−カッパＢ活性化の抑制を経て作用することも報告されている。（Ｃｈｅｎら、（２００１）
Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ６１（１１）： １４１７−１４２７）。最後に、伝える所によれば、オウゴニンはマクロファージにおいて誘導可能ＰＧＥ２産生を阻害する。（ＷａｋａｂａｙａｓｈｉおよびＹａｓｕｉ （２０００） Ｅｕｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ４０６（３）： ４７７−４８１）。バイカレインによる、有糸分裂促進剤−活性化プロテインキナーゼリン酸化の阻害およびＣａ２＋イオノフォアＡ２３１８７誘導プロスタグランジンＥ２放出の阻害は、オウゴンの抗炎症活性機構として報告されている。（Ｎａｋａｈａｔａら、（１９９９） Ｎｉｐｐｏｎ Ｙａｋｕｒｉｇａｋｕ Ｚａｓｓｈｉ， １１４， Ｓｕｐｐ． １１： ２１５Ｐ−２１９Ｐ；Ｎａｋａｈａｔａら、（１９９８） Ａｍ． Ｊ． Ｃｈｉｎ Ｍｅｄ． ２６： ３１１−３２３）。伝える所によれば、コガネバナからのバイカリンは、超抗原ブドウ球菌細胞外毒素刺激Ｔ細胞増殖およびＩＬ−１β、インターロイキン６（ＩＬ−６）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）およびインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）の産生を阻害する。（Ｋｒａｋａｕｅｒら、（２００１） ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ５００： ５２−５５）。それ故、バイカリンの抗炎症活性は、超抗原により活性化される炎症誘発性サイトカイン仲介シグナル伝達経路を阻害することと結び付けられてきた。しかしながら、バイカリンの抗炎症活性は、種々のケモカイン結合のためであり、それがケモカインの生物学的活性を制限することも提案されている。（Ｌｉら、（２０００） Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ４９： ２９５−３０６）。最近、トロンビンおよびトロンビンレセプターアゴニストペプチドにより誘導される接着分子発現（Ｋｉｍｕｒａら、（２００１） Ｐｌａｎｔａ Ｍｅｄ． ６７： ３３１−３３４）、ならびに有糸分裂促進剤−活性化プロテインキナーゼカスケード（ＭＡＰＫ）の阻害（Ｎａｋａｈａｔａら、（１９９９） Ｎｉｐｐｏｎ Ｙａｋｕｒｉｇａｋｕ Ｚａｓｓｈｉ， １１４， Ｓｕｐｐ １１： ２１５Ｐ−２１９Ｐ；Ｎａｋａｈａｔａら、（１９９８） Ａｍ． Ｊ． Ｃｈｉｎ Ｍｅｄ． ２６： ３１１−３２３）に対するバイカリンの効果が報告された。現在まで、フリー−Ｂ−環フラボノイドとＣＯＸ−２阻害活性を連結する報告は存在しない。
【００１７】
現在まで、多くの天然に存在するフリー−Ｂ−環フラボノイドが色々な使用のために市販されてきた。例えば、コガネバナ抽出物のリポソーム処方がスキンケアのために利用されてきた（米国特許第５，６４３，５９８号；５，４４３，９８３号）。バイカリンは、発癌遺伝子に対するその阻害効果のため、癌の予防に使用されてきた（米国特許第６，２９０，９９５号）。バイカリンおよびその他の化合物が、抗ウイルス、抗菌および免疫調節剤として（米国特許第６，０８３，９２１号）、および天然の抗酸化剤として（ポーランド公開番号第９，８４９，２５６号）使用されてきた。クリシンはその不安軽減特性により使用されてきた（米国特許第５，７５６，５３８号）。抗炎症性フラボノイドは肛門直腸および結腸疾患の制御および処置に（米国特許第５，８５８，３７１号）、およびリポキシゲナーゼの阻害に（米国特許第６，２１７，８７５号）使用されている。フラボノイドエステルは化粧用組成物の活性成分を構成している（米国特許第６，２３５，２９４号）。
【００１８】
日本特許第６３０２７４３５号はバイカリンの抽出および濃縮を記載し、日本特許第６１０５０９２１号はバイカリンの精製を記載している。
発明の要約
本発明はシクロオキシゲナーゼ酵素ＣＯＸ−２の阻害に有効である方法を含んでいる。シクロオキシゲナーゼ酵素ＣＯＸ−２を阻害するための方法は、フリー−Ｂ−環フラボノイドから成っている組成物あるいは、フリー−Ｂ−環フラボノイドの混合物を含んでいる組成物を、それらを必要としている宿主に投与することを包含する。
【００１９】
本発明はまた、ＣＯＸ−２仲介疾患および状態の予防および処置のための方法も含んでいる。ＣＯＸ−２仲介疾患および状態の予防および処置するための方法は、フリー−Ｂ−環フラボノイド含んでいる組成物、あるいはフリー−Ｂ−環フラボノイドおよび医薬として受容可能な担体を含んでいる組成物を、それらを必要としている宿主に投与することを包含する。
【００２０】
以下に従って使用できるフリー−Ｂ−環フラボノイドは下記の一般構造により図示される化合物を含んでいる：
【００２１】
【化２】
【００２２】
式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、―Ｈ、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＯＲ、−ＳＲ、−ＮＨ２、−ＮＨＲ、−ＮＲ２、−ＮＲ３＋Ｘ−、限定されるわけではないが、アルドペントース、メチル−アルドペントース、アルドヘキソース、ケトヘキソースおよびそれらの化学誘導体を含む、単一のまたは多数の糖の組合わせの、炭素、酸素、窒素または硫黄グリコシドからなる群より独立して選択され；
式中、
Ｒは１−１０の間の炭素原子を有するアルキル基であり；および
Ｘは、限定されるわけではないが、ヒドロキシル、クロリド、ヨージド、スルフェート、ホスフェート、アセテート、フルオリド、カーボネートなどを含んでいる、医薬として受容可能なカウンターアニオンの群より選択される。
【００２３】
本発明の方法は、限定されるわけではないが、変形性関節炎、慢性関節リウマチ、月経痙攣、全身性紅斑性狼瘡、乾癬、慢性緊張性頭痛、偏頭痛、局所的創傷および小炎症状態、炎症性腸疾患および固形癌を含む多くのＣＯＸ−２仲介疾患および状態に使用できる。
【００２４】
本発明のフリー−Ｂ−環フラボノイドは、合成法、または限定されるわけではないが、バンレイシ科、キク科（Ａｓｔｅｒａｃｅａｅ）、ノウゼンカズラ科、シクンシ科、キク科（Ｃｏｍｐｏｓｉｔａｅ）、トウダイグサ科、シソ科、クスノキ科、マメ科、クワ科、マツ科、ワラビ科、中国ワラビ科、ニレ科およびショウガ科を含む植物の科から抽出することにより得ることができる。フリー−Ｂ−環フラボノイドは、高等植物の以下の属から抽出、濃縮および精製でき、限定されるわけではないが、デスモス（Ｄｅｓｍｏｓ）属、
アキロクリネ（Ａｃｈｙｒｏｃｌｉｎｅ）属、オロキシルム（Ｏｒｏｘｙｌｕｍ）属、ブケナヴィア（Ｂｕｃｈｅｎａｖｉａ）属、ヤマハハコ属、コツラ（Ｃｏｔｕｌａ）属、ハハコグサ属、ムギワラギク属、ヤグルマギク属、ヒヨドリバナ属、バッカリス（Ｂａｃｃｈａｒｉｓ）属、シラキ属、タツナミソウ属、モルサ（Ｍｏｌｓａ）属、コレブルッケア（Ｃｏｌｅｂｒｏｏｋｅａ）属、イヌゴマ属、オリガヌム（Ｏｒｉｇａｎｕｍ）属、ジジフォラ（Ｚｉｚｉｐｈｏｒａ）属、クロモジ属、カゴノキ属、アカシア属、デリス（Ｄｅｒｒｉｓ）属、カンゾウ属、ナツフジ属、ポンガミア（Ｐｏｎｇａｍｉａ）属、テフロシア（Ｔｅｐｈｒｏｓｉａ）属、アルトカルプス（Ａｒｔｏｃａｒｐｕｓ）属、イチジク属、ピチログラマ（Ｐｉｔｙｒｏｇｒａｍｍａ）属、ノトラエナ（Ｎｏｔｈｏｌａｅｎａ）属、マツ属、ニレ属およびハナミョウガ属が含まれる。
【００２５】
本発明の組成物は当業者には既知である任意の方法により投与できる。投与様式には、限定されるわけではないが、経腸（経口）投与、非経口（静脈内、皮下および筋肉内）投与そして局所適用が含まれる。本発明に従った処置の方法は、限定されるわけではないが、合成的に得られた、天然に存在する、あるいはそれらの任意の組み合わせを含む単一起源または多起源の、個々のおよび／または多数のフリー−Ｂ−環フラボノイド混合物の治療的に有効量を、それらを必要としている患者へ内用であるいは局所的に投与することを含んでいる。
【００２６】
本発明は、フリー−Ｂ−環フラボノイドを含んでいる植物から、これらの化合物を単離および精製するための改良法を含んでいる。本発明の方法は：ａ）フリー−Ｂ−環フラボノイドを含んでいる植物のすり砕いたバイオマスを抽出し；ｂ）該抽出物を中和および濃縮し；およびｃ）該中和および濃縮された抽出物を精製することから成る。本発明の好適な態様において、抽出物は再結晶、沈殿、溶媒分配および／またはクロマトグラフィー的分離からなる群より選択される方法を使用して精製する。本発明は、望ましい生理学的活性を有しているフリー−Ｂ−環フラボノイドの単離および精製のための商業的に実行可能なプロセスを提供する。
【００２７】
本発明は、一連の生物分子スクリーンと、活性植物抽出物およびＣＯＸ−２酵素活性および炎症を特異的に阻害する、これらの抽出物内の特定の化合物を同定するための、化学的既知物質同定プロセスを組み合わせた戦略を与える。全体で１２３０の植物抽出物を、組換えＣＯＸ−２に付随するペルオキシダーゼ活性を阻害する能力でスクリーンした。この一次スクリーンで２２の植物抽出物が同定され、それらはインビトロで、細胞に基づいたおよび全血アッセイの両方において、ＣＯＸ−２を特異的におよび選択的に阻害するそれらの能力がさらに研究された。インビトロで効能があった抽出物は、次に、複数の経路（ＩＰおよび経口）により投与された場合の空気嚢（ａｉｒ ｐｏｕｃｈ）および炎症の局所的耳−膨潤モデルの両方を使用し、炎症を阻害する能力についてインビボで試験した。これらの研究はまた、これらの抽出物の各々で、ＣＯＸ−２阻害に関与する特定のフリー−Ｂ−環フラボノイドの同定をもたらした。出願者は、本出願がフリー−Ｂ−環フラボノイド構造とＣＯＸ−２阻害活性間の相関についての最初の報告であると信じている。
【００２８】
前記の一般的説明および以下の詳細な説明の両方とも、例示のためおよび説明のためのみのものであり、特許請求されているように、本発明を制限するものでないことを理解するべきである。
発明の詳細な説明
本発明の側面に言及するため、種々の用語が本明細書で使用される。本発明の成分の説明を明らかにするのを助けるため、以下の定義を提供する。
【００２９】
本明細書で使用されるような“フリー−Ｂ−環フラボノイド”とは、芳香族Ｂ環上に置換基を有しないフラボノイドの特定の部類であり、下記の一般構造により表される：
【００３０】
【化３】
【００３１】
式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、―Ｈ、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＯＲ、−ＳＲ、−ＮＨ２、−ＮＨＲ、−ＮＲ２、−ＮＲ３＋Ｘ−、限定されるわけではないが、アルドペントース、メチル−アルドペントース、アルドヘキソース、ケトヘキソースおよびそれらの化学誘導体を含む、単一のまたは多数の糖の組合わせの、炭素、酸素、窒素または硫黄グリコシドからなる群より独立して選択され；
式中、
Ｒは１−１０の間の炭素原子を有するアルキル基であり；および
Ｘは、限定されるわけではないが、ヒドロキシル、クロリド、ヨージド、スルフェート、ホスフェート、アセテート、フルオリド、カーボネートなどを含んでいる、医薬として受容可能なカウンターアニオンの群より選択される。
【００３２】
本明細書で使用されるような“療法”とは、処置および／または予防を含んでいる。使用される場合、療法はヒトならびに他の動物に適用する。
“医薬としてあるいは療法的に有効な用量または量”とは、所望の生物学的結果を誘導するために十分な用量レベルを意味している。そのような結果とは、疾患の徴候、症状または原因の軽減、あるいは生体系の任意の他の望ましい変化であることができる。
【００３３】
“宿主”とは、本明細書で説明した組成物が投与される、生きている被験者（ヒトまたは動物）である。
本出願を通じて、いろいろな引用が提供されることに注意されたい。各々の引用は、本明細書において参考文献として、その全体が特別に援用される。
【００３４】
本発明はシクロオキシゲナーゼ酵素ＣＯＸ−２の阻害に有効である方法を含んでいる。シクロオキシゲナーゼ酵素ＣＯＸ−２を阻害するための方法は、フリー−Ｂ−環フラボノイドから成っている組成物あるいは、フリー−Ｂ−環フラボノイドの混合物を含んでいる組成物を、それらを必要としている宿主に投与することを包含する。
【００３５】
本発明はまた、ＣＯＸ−２仲介疾患および状態の予防および処置のための方法も含んでいる。ＣＯＸ−２仲介疾患および状態の予防および処置するための方法は、フリー−Ｂ−環フラボノイド含んでいる組成物、あるいはフリー−Ｂ−環フラボノイドおよび医薬として受容可能な担体を含んでいる組成物を、それらを必要としている宿主に投与することを包含する。
【００３６】
以下に従って使用できるフリー−Ｂ−環フラボノイドは、上に示した一般式により図示された化合物を含んでいる。本発明のフリー−Ｂ−環フラボノイドは、合成法、または限定されるわけではないが、バンレイシ科、キク科（Ａｓｔｅｒａｃｅａｅ）、ノウゼンカズラ科、シクンシ科、キク科（Ｃｏｍｐｏｓｉｔａｅ）、トウダイグサ科、シソ科、クスノキ科、マメ科、クワ科、マツ科、ワラビ科、中国ワラビ科、ニレ科およびショウガ科を
含む植物の科から単離することにより得ることができる。フリー−Ｂ−環フラボノイドは、高等植物の以下の属から抽出、濃縮および精製でき、限定されるわけではないが、デスモス（Ｄｅｓｍｏｓ）属、アキロクリネ（Ａｃｈｙｒｏｃｌｉｎｅ）属、オロキシルム（Ｏｒｏｘｙｌｕｍ）属、ブケナヴィア（Ｂｕｃｈｅｎａｖｉａ）属、ヤマハハコ属、コツラ（Ｃｏｔｕｌａ）属、ハハコグサ属、ムギワラギク属、ヤグルマギク属、ヒヨドリバナ属、バッカリス（Ｂａｃｃｈａｒｉｓ）属、シラキ属、タツナミソウ属、モルサ（Ｍｏｌｓａ）属、コレブルッケア（Ｃｏｌｅｂｒｏｏｋｅａ）属、イヌゴマ属、オリガヌム（Ｏｒｉｇａｎｕｍ）属、ジジフォラ（Ｚｉｚｉｐｈｏｒａ）属、クロモジ属、カゴノキ属、アカシア属、デリス（Ｄｅｒｒｉｓ）属、カンゾウ属、ナツフジ属、ポンガミア（Ｐｏｎｇａｍｉａ）属、テフロシア（Ｔｅｐｈｒｏｓｉａ）属、アルトカルプス（Ａｒｔｏｃａｒｐｕｓ）属、イチジク属、ピチログラマ（Ｐｉｔｙｒｏｇｒａｍｍａ）属、ノトラエナ（Ｎｏｔｈｏｌａｅｎａ）属、マツ属、ニレ属およびハナミョウガ属が含まれる。
【００３７】
フラボノイドは、限定されるわけではないが、幹、幹樹皮、小枝、塊茎、根、根樹皮、若芽、種、根茎、花および他の再生性器官、葉および他の空中部分を含む、植物の異なった部分に見いだすことができる。
【００３８】
ＣＯＸ酵素を阻害できる化合物を同定するため、中国、インドおよび他の国から集めた６１５の薬用植物から抽出された１２３０抽出物から成る抽出物ライブラリーを創造した。抽出物を調製するための一般法は実施例１に記載されており、そこでは例示の目的で、タツナミソウ（ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａ）属の種を使用した。抽出プロセスから、試験された各々の種について有機および水性抽出物を得る。種々のタツナミソウ属の種からの抽出の結果を表１に示した。これらの一次抽出物は、前に詳細に説明したように、シクロオキシゲナーゼの主たる機能的活性の一つであり、そしてＰＧＧ２をＰＧＨ２への、最終的にはＰＧＥ２への変換に関与する、シクロオキシゲナーゼ酵素のペルオキシダーゼ活性の阻害剤を同定するための一次アッセイに使用される材料源である。このアッセイは実施例２に説明されており、結果は表２に示されている。表２を参照すると、二つのタツナミソウ属の種および三つの他の植物種（これらのすべてが共通の成分としてフリー−Ｂ−環フラボノイドを含んでいる）が、異なった程度ではあったが、ＣＯＸ−２のペルオキシダーゼ活性に対する一次スクリーンにおいて阻害活性を示したことが観察された。ＣＯＸ−２阻害活性は、中間的極性のフリー−Ｂ−環フラボノイドのほとんどを含む、有機抽出物中に主として観察される。
【００３９】
粗抽出物の一次アッセイからのＣＯＸ−２阻害活性は、用量応答およびＩＣ５０（酵素活性の５０％を阻害するために必要とされる濃度）の測定により確認された。ＩＣ５０値は表３に示されている。表３に観察できるように、スクテラリア オルトカリックス（Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａ ｏｒｔｈｏｃａｌｙｘ）根抽出物およびムリカ ナナ（Ｍｕｒｉｃａ ｎａｎａ）葉抽出物が最も有効であった（ＩＣ５０＝６−１０ｍｇ／ｍＬ）。ＣＯＸ−２に対する最も高い選択性を示したタツナミソウ属の種からの抽出物はスクテラリア ラテリフローラ（Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａ ｌａｔｅｒｉｆｌｏｒａ）であった（ＣＯＸ−２ ＩＣ５０：３０ｍｇ／ｍＬ；ＣＯＸ−１ ＩＣ５０：８０ｍｇ／ｍＬ）。それ故、ＣＯＸ酵素阻害薬のための一次スクリーンは、インビトロで効力のあった、フリー−Ｂ−環フラボノイドを含んでいる５つの抽出物を同定し、そしてそのいくつかはＣＯＸ−２酵素に特異性を示した。
【００４０】
植物抽出物の活性化合物を効率よく同定するため、実施例３に説明したような高スループット分画化プロセスを使用した。簡単には、活性有機および水性抽出物を、各々２つの異なった方法論を使用して分画した。分画は９６の深いウェルプレートに集めた。分画の各々は、実施例４に説明したように、一次アッセイのようにＣＯＸ活性を阻害するその能力で試験した。結果は図１に示されており、コガネバナの根に由来する種々のＨＴＰ分
画によるＣＯＸ−１およびＣＯＸ−２阻害のプロフィールが描かれている。図１に観察できるように、最も効力あるＣＯＸ阻害活性は２つの重要な分画、Ｅ１１およびＦ１１に観察された。３つの離れたＨＴＰ分画が実際に阻害活性を示していることに注目しなければならず、全抽出物の観察された阻害効果に寄与している、多数の化合物が存在していることを示唆している。
【００４１】
スクテラリア オルトカリックスの有機抽出物中に存在する活性フリー−Ｂ−環フラボノイドの分離、精製および同定を実施例５に説明した。実施例５に説明した方法論を使用し、スクテラリア オルトカリックス根からの有機抽出物の主活性成分としてバイカレインを同定した。実施例６に示したように、いくつかの他のフリー−Ｂ−環フラボノイドが単離され、ＣＯＸ−１およびＣＯＸ−２酵素活性の阻害を試験した。結果を表４に示した。
【００４２】
実施例７および表５は、３つの異なった植物種からの、５つの活性植物抽出物中のフリー−Ｂ−環フラボノイド含有量および分量を示している。フリー−Ｂ−環フラボノイドは水性抽出物に対して、有機抽出物中により多くの量が存在している。このことは、なぜＣＯＸ−２阻害活性が通常、水性抽出物よりもむしろ有機抽出物中に現れるかを説明している。
【００４３】
活性抽出物を同定するために実施例２で説明した一次アッセイは、組換え体酵素を利用する無細胞系である。活性抽出物および化合物の生物学的活性をさらに示すため、細胞に基づいたインビトロ有効性および動物に基づいたインビボ有効性を表す、２つのモデルを用いた。インビトロ有効性および選択性を評価するために使用した方法は、実施例８で説明されている。各々、主としてＣＯＸ−１（ＴＨＰ−１細胞）およびＣＯＸ−２（ＨＯＳＣ細胞）を発現するように誘導できる２つの細胞株を選択した。各々の細胞型は、ＣＯＸ酵素の主生成物であるＰＧＥ２の産生で試験した。結果は表６に示されており、３つの異なったタツナミソウ属の種からの３つの有機抽出物が、ＣＯＸ−１酵素を優先して、ＣＯＸ−１およびＣＯＸ−２酵素両方の阻害を示したことを示している。ＴＨＰ−１細胞株の使用は重要であり、および細胞膜を横切る活性化合物の能力を示しているが、それは不死化された細胞株であり、それ故、より適切なモデル系に基づいたフリー−Ｂ−環フラボノイドの有効性の評価が望まれる。そのため、ＣＯＸ−１およびＣＯＸ−２両方の活性の主起源として全血を使用し、抽出物をまた評価した。この系は、ＣＯＸ−２およびＣＯＸ−１阻害活性を区別するため、各々、ＰＧＥ２ ｖｓ ＴＸＢ２の産生の阻害を測定する。表６に示された結果は、ＣＯＸ−２およびＣＯＸ−１酵素の両方が、３つすべてのスクテラリア根抽出物からのフリー−Ｂ−環フラボノイドにより阻害されることを示している。ＩＣ５０値は、この系内において、コガネバナからのものを除いたすべてのフリー−Ｂ−環フラボノイドがＣＯＸ−２に対してより効力があることを示唆している。全体としてみると、これらの抽出物内に存在する活性化合物の阻害効果は、インビトロでの無細胞および細胞に基づいた系の両方で有意でありおよび有効である。また、試験過程において細胞毒性は観察されなかった。
【００４４】
２つの別々のインビボモデルを、フリー−Ｂ−環フラボノイドで観察されたインビトロ有効性がインビボ炎症応答を阻害する能力へ転換されるかどうかを決定するために用いた。２つのモデルは実施例９に説明されている。これらの系の第一は、アラキドン酸代謝経路から直接的に生じる炎症を測定するように設計した。この実施例においては、炎症性応答を誘発するためのＡＡの局所適用に先立って、３つのタツナミソウ属の種からのフリー−Ｂ−環フラボノイドでマウスを処理した。動物の前処理の効果は、次に、測微計を使用した耳膨潤の抑制により測定された。これらの３つのタツナミソウ属種からのフリー−Ｂ−環フラボノイド含有抽出物は様々な程度の有効性を示した。例えば、コガネバナの根から抽出されたフリー−Ｂ−環フラボノイドは、図３ＡおよびＢに図示したように、経口お
よびＩＰ経路の両方で送達された場合、対照と比較して６０％まで耳膨潤を抑制した。これは、５ｍｇ／ｋｇの濃度でＩＰ送達された場合の陽性対照インドメタシンで観察された抑制の程度に類似している。スクテラリア オルトカリックスから抽出されたフリー−Ｂ−環フラボノイドは、ＩＰ経路投与で送達された場合は効力があったが、経口経路により送達された場合は効果を有せず、そして最後に、スクテラリア ラテリフローラから抽出されたフリー−Ｂ−環フラボノイドは、投与経路にかかわらず、効果を示さなかった（データは示されていない）。
【００４５】
コガネバナから単離されたフリー−Ｂ−環フラボノイドは、アラキドン酸により直接的に誘発された炎症に対して最も有効であることが明瞭に示された。それ故、これらのフリー−Ｂ−環フラボノイドの有効性を、炎症の多数の機構が最終効果の最後の原因になる、第二のモデルを使用して試験した。この系はそれ故、天然に存在する炎症応答により一層関連している。このモデルを使用し、Ｂａｌｂ／Ｃマウスの背中に作られた空気嚢内へ、補足システムの非常に強力な活性化薬を注入した。これにより、炎症性細胞の浸潤、ＣＯＸ酵素の活性化（ＰＧＥ２の放出を生じる）、酵素ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）、およびＴＮＦ−αを含む炎症誘発性サイトカインの非常に特異的なプロフィールの産生、を含む炎症性事象のカスケードが生じる。これらの研究は、コガネバナから単離されたフリー−Ｂ−環フラボノイドが空気嚢内への炎症性細胞の初期浸潤（化学走性応答）は阻害しなかったけれども、これらの細胞の活性化を阻止したことを示した。このことは、嚢の細胞外液内へ排出されたＭＰＯの欠損およびＴＮＦ−α産生の顕著な欠損により証明される。結果は図４に示されている。このデータは、多数の炎症性経路が活性であるモデル系において、フリー−Ｂ−環フラボノイドが有効であることを示している。
【００４６】
医薬製剤で投与するための生成物の調製は、当業者にはよく知られた種々の方法により実行することができる。フリー−Ｂ−環フラボノイドはその天然に存在する形でのハーブ粉末として；異なった濃度の溶剤および／または超臨界流体として；再結晶、カラム分離、溶媒分配、沈殿および他の手段を経た濃縮および精製化合物として；合成法により製造された、実質的に精製されたフリー−Ｂ−環フラボノイドを含んでいる純粋物および／または混合物として処方することができる。
【００４７】
多様な送達系が本分野で知られており、本発明の治療組成物を投与するために使用できる、例えば、水性溶液、リポソーム、微粒子およびマイクロカプセル内へのカプセル化。
本発明の治療組成物は注射により非経口的に投与してもよいが、動脈内注射、吸入ミスト、経口的に活性な処方、経皮イオン導入法または座薬のごとき他の有効な投与形もまた想像される。一つの好適な坦体は生理学的食塩水であるが、他の医薬として受容可能な坦体もまた使用できることも企図される。一つの好適な態様において、坦体およびフリー−Ｂ−環フラボノイドが生理学的に適合した、徐放性処方が想像される。そのような坦体での一次溶剤は、性質が水性でも非水性でもよい。加えて、坦体は処方のｐＨ、浸透圧モル濃度、粘度、透明度、色、無菌性、安定性、溶解速度または香りを修飾または維持するために、他の医薬として受容可能な添加剤を含んでいてもよい。同様に、坦体は、リガンドの安定性、溶解速度、放出または吸収を修飾または維持するために、他の医薬として受容可能な添加剤をさらに含んでいてもよい。そのような添加剤は、１回服用量かまたは多回服用量形での非経口投与のための剤形を処方するために、通常および慣例上用いられる物質である。
【００４８】
一度治療組成物が処方されたら、溶液、懸濁液、ゲル、エマルジョン、固形物、または脱水されたまたは凍結乾燥された粉末として無菌バイアル中で保存してもよいし；または直接カプセル化してもよいし、および／または経口投与のための他の不活性坦体で錠剤化してもよい。そのような製剤は、すぐに使用できる形かまたは投与の直前に再構築を必要とするように保存することができる。全身性送達のための組成物を含んでいる製剤の投与
様式は、経腸、皮下、筋肉内、静脈内、鼻孔内、または膣または直腸座剤であることができる。
【００４９】
特定の障害または状態の処置に有効であろう組成物の量は、障害または状態の性質に依存するだろうし、それは標準臨床技術により決定できる。加えて、最適用量範囲の同定を助けるために、インビトロまたはインビボアッセイを随意に使用することができる。製剤中に使用されるべき正確な用量もまた、投与経路および疾患または状態の重度または進行に依存するだろうが、開業医および各々の患者の情況に従って決定すべきである。有効用量は、インビトロまたは動物モデル試験系から導かれた用量−応答曲線から外挿することができる。例えば、本発明の組成物の有効量は、本発明の組成物を段階的用量で投与し、所望の効果を観察することにより容易に決定される。
【００５０】
本発明に従った処置法は、単一起源または多数の起源からの、個々のおよび／または多数のフリー−Ｂ−環フラボノイド混合物の治療的に有効量を、それらを必要としている患者へ内用であるいは局所的に投与することを含んでいる。個々のおよび／または多数のフリー−Ｂ−環フラボノイド混合物の純度は、化合物を得るために使用された方法論に依存して、限定されるわけではないが、０．０１％から１００％である。好適な態様において、フリー−Ｂ−環フラボノイドおよびそれを含んでいる医薬組成物の用量は、有効で無毒な量であり、一般的に０．０１から２００ｍｇ／体重ｋｇの範囲から選択される。日常の臨床試験を使用している当業者は、処置されている特定の疾患のための最適用量を決定することができる。
【００５１】
本発明は植物からフリー−Ｂ−環フラボノイドを単離および精製するための改良法を含んでおり、それは実施例１０に説明されている。実施例１０において、二つのタツナミソウ属種からのフリー−Ｂ−環フラボノイドを、異なった溶媒系で抽出した。結果は表７および８に示されている。本発明の改良法は：フリー−Ｂ−環フラボノイドを含んでいる植物のすり砕いたバイオマスを単一溶剤または有機溶剤および／または水の組合わせでの抽出、中和および中和された抽出物の濃縮；および再結晶および／またはクロマトグラフィーによる該抽出物の精製から成る。上に提供したように、これらのフリー−Ｂ−環フラボノイドは、２０の植物系統群より多くの属から単離できる。本発明の方法は、これらの化合物を含んでいる任意の植物源からの、これらの化合物の単離へ拡大できる。
【００５２】
さらに、フリー−Ｂ−環フラボノイドは、限定されるわけではないが、全植物、幹、幹樹皮、小枝、塊茎、花、果実、根、根樹皮、若芽、種、根茎、および空中部分を含む、植物の多様な部分から単離できる。好適な態様において、フリー−Ｂ−環フラボノイドは根、再生性器官または全植物から単離される。
【００５３】
植物のすり砕いたバイオマスの抽出に使用する溶媒には、限定されるわけではないが、水、酸性にした水、限定されるわけではないが、メタノールまたはエタノール、およびアルコール類とＴＨＦ、アセトン、酢酸エチルのごとき他の有機溶剤との混合物を含む、混和可能なヒドロキシル化有機溶媒と組み合わされた水が含まれる。一つの態様において、抽出物は４．５−５．５のｐＨまで中和し、次に濃縮および乾燥すると粉末を得る。フリー−Ｂ−環フラボノイドは、限定されるわけではないが、再結晶、溶媒分配、沈殿、昇華、および／または、限定されるわけではないが、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、限外濾過またはこれらの組合わせを含むクロマトグラフィー法、を含む種々の方法により精製できる。
【００５４】
実施例１１は膝関節部および／または股関節部の慢性関節リウマチまたは変形性関節症により起こされる痛みの軽減に対するフリー−Ｂ−環フラボノイドの有効性を評価するた
めに実施された臨床研究を説明している。本研究は単一中心、無作為化、二重盲検、プラシーボ−対照研究であった。膝関節部および／または股関節部の慢性関節リウマチまたは変形性関節症を患った６０の被験者（ｎ＝６０）を４つの群に分け、プラシーボ、ウニベスチン（２５０ｍｇ／日または５００ｍｇ／日）またはセレブレックス（２００ｍｇ／日）で６０日間処置した。ウニベスチンは、６２．５％（ｗ／ｗ）のバイカリン含率および＞７５％（ｗ／ｗ）の総フリー−Ｂ−環フラボノイドを有する、オウゴン標準化抽出物の特許薬品比から成っている。セレブレックスはＣＯＸ−２選択的阻害薬である処方箋薬剤の商標名である。表９は処置前のＷＯＭＡＣ指標スコア（ベースラインスコア）を示しており、表１０は処置後のＷＯＭＡＣ指標スコアにおける変化を示している。図５から８は、研究の結果を図によって説明している。
【００５５】
図５から８で示されているように、痛み、硬直、および身体機能化に関連したＷＯＭＡＣ複合スコアおよび個々のサブスコアは、プラシーボ群と比較すると、フリー−Ｂ−環フラボノイドの投与後に著しい改良を示した。さらに、フリー−Ｂ−環フラボノイドは、痛み軽減および身体機能の改良において、処方箋薬剤セレブレックスと同じ有効性を示した。最後に、投与された２つの異なった用量で、フリー−Ｂ−環フラボノイドでは有効性の相違が観察されなかった。
【００５６】
以下の実施例は例示の目的でのみ提供されており、本発明の範囲を限定することは意図されていない。
（実施例１）タツナミソウ属植物からの有機および水性抽出物の調製
スクテラリア オルトカリックス根、コガネバナ根またはスクテラリア ラテリフローラ全植物からの植物材料を２ｍｍより小さな粒子サイズにまですり砕いた。乾燥し、粉にした植物材料（６０ｇ）は次に三角フラスコに移し、そしてメタノール：ジクロロメタン（１：１）（６００ｍＬ）を加えた。混合物を１時間振盪し、濾過し、そしてバイオマスを再びメタノール：ジクロロメタン（１：１）（６００ｍＬ）で抽出した。有機抽出物を合わせ、真空下で蒸発させると有機抽出物を得た（下記表１参照）。有機抽出後、バイオマスを風乾し、一度超純水（６００ｍＬ）で抽出した。水性溶液を濾過し、凍結乾燥すると水性抽出物を得た（下記表１参照）。
【００５７】
【表１】
【００５８】
（実施例２）種々のタツナミソウ属種からの植物抽出物によるＣＯＸ−２およびＣＯＸ−１ペルオキシダーゼ活性の阻害
特異的ＣＯＸ−２阻害薬の同定のためのスクリーニングプロセスを指向するバイオアッセイは、以下に記載するように、酵素のペルオキシダーゼ活性をアッセイするように設計した。
【００５９】
ペルオキシダーゼアッセイ ＣＯＸ−２阻害薬を検出するためのアッセイを高スループットプラットフォームのために改変した（Ｒａｚ）。簡単には、組換え体ヒツジＣＯＸ−２（Ｃａｙｍａｎ）をペルオキシダーゼ緩衝液（１００ｍＭ ＴＢＳ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１μＭヘム、０．０１ｍｇエピネフリン、０．０９４％フェノール）に溶解し、抽出物（１：５００希釈）と１５分インキュベートした。クワンタブル（Ｑｕａｎｔａｂｌｕ）
（Ｐｉｅｒｃｅ）基質を加え、２５℃で４５分間、発色させた。次に、Ｗａｌｌａｃ Ｖｉｃｔｏｒ ２プレートリーダーを使用してルミネセンスを読みとった。結果は表２に示されている。
【００６０】
表２は、構造的に類似したフリー−Ｂ−環フラボノイドを包含する、５つの植物種（２つのタツナミソウ属種の根、および３つの他の植物種からの抽出物を含む）から得られた有機および水性抽出物による酵素の阻害を示している。データは、組換え体ヒツジＣＯＸ−２酵素および基質単独と比較したペルオキシダーゼ活性のパーセントとして示されている。有機抽出物による阻害は、３０％から９０％の範囲であった。
【００６１】
【表２】
【００６２】
ＣＯＸ−１およびＣＯＸ−２アイソフォームの相対阻害の比較は、これらの酵素各々に対するＩＣ５０値の算出を必要とする。ＩＣ５０とは、対照に関して酵素活性の５０％阻害が特定の阻害剤により達成される濃度として定義される。この場合、表３に示したように、ＩＣ５０値はＣＯＸ−１およびＣＯＸ−２酵素に対して、各々、６から５０μｇ／ｍＬおよび７から８０μｇ／ｍＬの範囲であることが観察された。ＣＯＸ−２およびＣＯＸ−１のＩＣ５０値の比較は、これらの酵素各々に対する、種々の植物からの有機抽出物の特異性を示している。スクテラリア ラテリフローラの有機抽出物は、例えば、ＣＯＸ−１よりもＣＯＸ−２の優先的阻害を示し、各々、ＩＣ５０値は８０および３０μｇ／ｍＬである。いくつかの抽出物がＣＯＸ−２の優先的阻害を示しているが、その他は示していない。ＨＴＰ分画およびこれらの分画から精製された化合物の試験が、これらの抽出物および化合物の真の特異的阻害を決定するために必要である。
【００６３】
【表３】
【００６４】
（実施例３）活性抽出物のＨＴＰ分画化
コガネバナ根からの有機抽出物（４００ｍｇ）をプレパックフラッシュカラム（２ｃｍ
ＩＤｘ８．２ｃｍ、１０ｇのシリカゲル）にロードした。カラムは、Ｈｉｔａｃｈｉ高スループット精製（ＨＴＰ）システムを使用し、（Ａ）５０：５０ ＥｔＯＡｃ：ヘキサンおよび（Ｂ）メタノール、３０分で１００％Ａから１００％Ｂの濃度勾配の移動相により、５ｍＬ／分の流速で溶離した。分離は広帯域波長ＵＶ検出器を使用してモニターし、Ｇｉｌｓｏｎフラクションコレクターを使用して、深い９６ウェルプレート内に、１．９ｍＬ／ウェルで集めた。試料プレートを低真空および遠心分離下で乾燥した。各々のセル内の試料を溶解するためにＤＭＳＯ（１．５ｍＬ）を使用し、一部（１００μＬ）をＣＯＸ阻害アッセイ用に取り出した。
【００６５】
コガネバナ根からの水性抽出物（７５０ｍｇ）を水（５ｍＬ）に溶解し、１μｍシリンジフィルターを通して濾過し、４ｍＬ ＨＰＬＣバイアルへ移した。溶液は次ぎに、オートサンプラーにより、プレパック逆相カラム（Ｃ−１８、１５μｍ粒子サイズ、２．５ｃｍ ＩＤｘ１０ｃｍ、プレカラムを挿入）へ注入した。カラムは、Ｈｉｔａｃｈｉ高スループット精製（ＨＴＰ）システムを使用し、（Ａ）水および（Ｂ）メタノール、２０分で１００％Ａから１００％Ｂの濃度勾配の移動相で、続いて１００％メタノールで５分間、１０ｍＬ／分の流速で溶離した。分離は広帯域波長ＵＶ検出器を使用してモニターし、Ｇｉｌｓｏｎフラクションコレクターを使用して、深い９６ウェルプレート内に、１．９ｍＬ／ウェルで集めた。試料プレートは凍結乾燥した。各々のセル内の試料を溶解するために超純水（１．５ｍＬ）を使用し、一部（１００μＬ）をＣＯＸ阻害アッセイ用に取り出した。
（実施例４）種々のタツナミソウ属種からのＨＴＰ分画によるＣＯＸペルオキシダーゼ活性の阻害
個々の生物活性有機抽出物は、各々の分画の、ＣＯＸ−１およびＣＯＸ−２組換え体酵素両方のペルオキシダーゼ活性を阻害する能力を試験することによりさらに特徴付けられた。結果は図１に描かれており、それは実施例１および３に説明したごとく単離された、コガネバナからのＨＴＰ分画による、ＣＯＸ−２およびＣＯＸ−１活性の阻害を描いている。図１に描かれたプロフィールは、ＣＯＸ−２に対して非常に選択的である阻害のピークを示している。スクテラリア オルトカリックスおよびスクテラリア ラテリフローラを含む他のタツナミソウ属種は、類似の阻害ピークを示した（データは示されていない）。しかしながら、ＣＯＸ−１およびＣＯＸ−２酵素両方が多数の阻害ピークを示しており、最初の阻害プロフィールへ寄与している一つより多くの分子が存在していることを示唆している。
（実施例５）スクテラリア オルトカリックスの有機抽出物からの活性フリー−Ｂ−環フラボノイドの単離および精製
実施例１に説明したように単離された、スクテラリア オルトカリックスの根からの有機抽出物（５ｇ）を、プレパックフレッシュカラム（１２０ｇ シリカゲル、４０μｍ粒子サイズ ３２−６０μｍ、２５ｃｍｘ４ｃｍ）へロードし、（Ａ）５０：５０ ＥｔＯＡｃ：ヘキサンおよび（Ｂ）メタノール、６０分で１００％Ａから１００％Ｂの濃度勾配の移動相により、１５ｍＬ／分の流速で溶離した。１０ｍＬ／分画で、分画を試験管に集めた。溶媒を真空下で蒸発させ、各々の分画中の試料を１ｍＬのＤＭＳＯに溶解し、一部、２０μＬを９６ウェル浅皿プレートへ移し、ＣＯＸ阻害活性を試験した。ＣＯＸアッセイ結果に基づき、活性分画＃３１から＃３９を合併し、蒸発させた。ＨＰＬＣ／ＰＤＡおよびＬＣ／ＭＳによる分析は、８．９分の保持時間および２７２ｍ／ｅにＭＳピークを有する主化合物を示した。生成物はさらに、（Ａ）水および（Ｂ）メタノール、４５分の濃度勾配の移動相で、５ｍＬ／分の流速で溶離する、Ｃ１８セミ分取カラム（２５ｃｍｘ１ｃｍ）により精製した。８８の分画を集め、５．６ｍｇの淡黄色固形物が得られた。純度はＨＰＬＣ／ＰＤＡおよびＬＣ／ＭＳにより決定し、そして基準品およびＮＭＲデータと比較した。１Ｈ ＮＭＲ：δｐｐｍ．（ＤＭＳＯ−ｄ６）８．０８８（２Ｈ，ｍ，Ｈ−３
’，５’），７．５７７（３Ｈ，ｍ，Ｈ−２’，４’，６’），６．９３２（１Ｈ，ｓ，Ｈ−８），６．６１３（１Ｈ，ｓ，Ｈ−３）。 ＭＳ：［Ｍ＋１］＋＝２７１ｍ／ｅ。化合物をバイカレインと同定した。ＣＯＸ−２酵素に対するバイカレインのＩＣ５０は１０μｇ／ｍＬである。
（実施例６）精製フリー−Ｂ−環フラボノイドのＣＯＸ阻害
いくつかの他のフリー−Ｂ−環フラボノイドが得られており、上で説明した方法を使用し、２０μｇ／ｍＬの濃度でのＣＯＸ−２阻害活性を試験した。結果は表４に要約されている。
【００６６】
【表４】
【００６７】
（実施例７）スクテラリア オルトカリックス根、コガネバナ根およびオロキシラム インディカム種子からの活性抽出物中のフリー−Ｂ−環フラボノイドのＨＰＬＣ定量
３つの異なった植物種からの５つの活性抽出物におけるフリー−Ｂ−環フラボノイドの存在および量が確認され、表５に示されている。フリー−Ｂ−環フラボノイドはＬｕｎａ
Ｃ−１８カラム（２５０ｘ４．５ｍｍ、５μｍ）を使用し、０．１％リン酸および２２分で８０％から２０％へのアセトニトリル濃度勾配を使用するＨＰＬＣにより定量分析した。フリー−Ｂ−環フラボノイドは，２５４ｎｍでＵＶ検出器を使用して検出し、フリー−Ｂ−環フラボノイド基準品との比較により、保持時間に基づいて同定した。ＨＰＬＣクロマトグラムは図２に描かれている。
【００６８】
【表５】
【００６９】
（実施例８）種々のタツナミソウ属種からのフリー−Ｂ−環フラボノイドのＣＯＸ阻害活性のインビトロ研究
種々のタツナミソウ属種から単離されたフリー−Ｂ−環フラボノイドのインビトロ有効性およびＣＯＸ−２特異性は、細胞に基づいた系において、アラキドン酸代謝物の発生を阻害するそれらの能力で試験した。構成的にＣＯＸ−２を発現するＨＯＳＣ、およびＣＯＸ−１を発現するＴＨＰ−１細胞株を、アラキドン酸の存在下でプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）を発生するそれらの能力で試験した。
【００７０】
ＣＯＸ−２細胞に基づいたアッセイ。 ＨＯＳＣ（ＡＴＣＣ＃８３０４−ＣＲＬ）細胞を８０−９０％コンフルエントまで培養した。細胞をトリプシン処理し、洗浄し、そして１ｘ１０６細胞／ｍＬの濃度で１０ｍＬの組織培養培地（ＭＥＭ）に再懸濁した。細胞懸濁液（２００μＬ）を９６ウェル組織培養プレートに播き、３７℃および５％ＣＯ２で２時間インキュベートした。次ぎに培地を、ＩＬ−１ｂ（１ｍｇ／ｍＬ）を含んでいる新鮮なＨＯＳＣ培地で置き換え、一夜インキュベートした。再び培地を除去し、１９０ｍＬのＨＯＳＣ培地で置き換えた。次ぎに、１０μＬのＨＯＳＣ培地に溶解した試験化合物を加え、３７℃で１５分インキュベートした。ＨＯＳＣ培地に溶解したアラキドン酸（２０ｍＬ、１００μＭ）を加え、混合物を振盪器上、１０分間室温でインキュベートした。１００μＭインドメタシン含有ＥＬＩＳＡ緩衝液を１９０μＬ／ウェルで含んでいる新しいプレートへ、上清液（２０μＬ）を移した。上清液を、以下に説明するようにＥＬＩＳＡにより分析した。
【００７１】
ＣＯＸ−１細胞に基づいたアッセイ。 ＴＨＰ−１細胞は３０ｍＬの容量に懸濁した（５ｘ１０５細胞／ｍＬ）。ＴＰＡを１０ｎＭ ＴＰＡの最終濃度まで加え、４８時間培養してマクロファージへ分化させた（接着性）。細胞をＨＢＳＳ（２５ｍＬ）に再懸濁し、２００ｍＬ容量、５ｘ１０５細胞／ウェルで、９６ウェルプレートへ加えた。次ぎに、ＲＰＭＩ１６４０（１０μＬ）に溶解した試験化合物を加え、３７℃で１５分インキュベートした。続いて、ＲＰＭＩ（２０μＬ）に溶解したアラキドン酸を加え、混合物を振盪器上、１０分間室温でインキュベートした。上清液（２０μＬ）をインドメタシン含有（１００μＭ）ＥＬＩＳＡ緩衝液（１９０μＬ）へ加えた。次ぎに、上清液を以下に説明するようにＥＬＩＳＡにより分析した。
【００７２】
ＣＯＸ−２全血アッセイ。 正常、健康ドナーからの末梢血は、静脈穿刺により集めた。全血（５００μＬ）を試験化合物および抽出物と３７℃で１５分インキュベートした。リポポリサッカリド（大腸菌血清型０１１１：Ｂ４から）を１００μｇ／ｍＬの最終濃度まで加え、３７℃で一夜培養した。血液を遠心分離し（１２，０００ｘｇ）、血漿を集めた。血漿（１００μＬ）をメタノール（４００μＬ）へ加えてタンパク質を沈殿させた。ＰＧＥ２産生について上清をＥＬＩＳＡにより測定した。この方法は、Ｂｒｉｄｅａｕら、（１９９６） Ｉｎｆｌａｍｍ． Ｒｅｓ． ４５： ６８−７４、に記載されている方法の改良法である。
【００７３】
ＣＯＸ−１全血アッセイ。 新鮮な血液は凝固阻止薬を含んでいないチューブに集め、直ちに、シリコン処理微量遠心チューブに５００μＬの一定量で等分した。試験試料を加え、３７℃で１時間、ボルテックスして凝固させた。次ぎに、試料を遠心分離し（１２，０００ｘｇ）、血漿を集めた。血漿（１００μＬ）をメタノール（４００μＬ）へ加えてタンパク質を沈殿させた。ＴＸＢ２産生について上清をＥＬＩＳＡにより測定した。この方法は、Ｂｒｉｄｅａｕら、（１９９６） Ｉｎｆｌａｍｍ． Ｒｅｓ． ４５： ６８−７４、に記載されている方法の改良法である。
【００７４】
ＥＬＩＳＡアッセイ。 Ｉｍｍｕｎｏｌｏｎ−４ ＥＬＩＳＡプレートを、炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．２）中の捕捉抗体０．５−４μｇ／ｍＬを用い、４℃で一夜被覆した。プレ
ートを洗浄し、遮断緩衝液（ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ）と２時間、室温でインキュベートした。再びプレートを洗浄し、そして試験試料（１００μＬ）を加え、振盪しながら室温で１時間インキュベートした。ペルオキシダーゼ結合第二抗体を５０μＬ容量で加え（０．５−４ｍｇ／ｍＬ含有）、振盪しながら室温で１時間インキュベートした。プレートを次ぎに３回洗浄し、そしてＴＭＢ基質を加えた（１００μＬ）。プレートを３０分間発色させ、その後１Ｍリン酸（１００μＬ）の添加により反応を停止させた。次ぎに、Ｗａｌｌａｃ Ｖｉｃｔｏｒ ２プレートリーダーを使用し、４５０ｎｍで読みとった。
【００７５】
細胞毒性。 細胞毒性は、損傷細胞における乳酸脱水素酵素の放出を測定する比色法キット（Ｏｘｆｏｒｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して評価した。アッセイは使用説明書に従って企図した。試験された化合物はどれも細胞毒性が観察されなかった。
【００７６】
アッセイの結果は表６に示されている。データは、直接比較のため、ＩＣ５０値で表されている。表６を参照すると、ＩＣ５０値は一般的にＣＯＸ−２よりもＣＯＸ−１がより低い。全血もまた、ＰＧＥ２発生（この系におけるＣＯＸ−２の尺度）またはトロンボキサンＢ２（ＴＸＢ２）（ＣＯＸ−１活性化の尺度）の分化抑制について測定した。表６を参照すると、これらの研究は、試験された３種の内の２種に含まれる有機抽出物からのＣＯＸ−２阻害に対する特異性を示している。この矛盾についての可能性のある理由は、構成的に各々の酵素を発現する不死化細胞株と、ＣＯＸ酵素を発現するように誘導される全血由来の初代細胞間の基本的相違である。初代細胞は、インビボ炎症過程を研究するための、より適切なモデルである。
【００７７】
【表６】
【００７８】
（実施例９）種々のタツナミソウ属種からのフリー−Ｂ−環フラボノイドのＣＯＸ阻害活性のインビボ研究
炎症のインビボ抑制を、２つのモデル系を使用して測定した。第一の系（耳膨潤モデル）は、アラキドン酸により直接的に誘発される炎症を測定する。このモデルはＣＯＸ阻害の優れた尺度であるが、ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）による細胞膜リン脂質からのアラキドン酸遊離の上流で起こっているであろうどんな細胞事象を測定していない。それ故、どのように阻害薬がより生物学的に関連した応答に機能しているかどうかを決定するため、空気嚢モデルを使用した。このモデルは、強い細胞浸潤、およびサイトカインならびにアラキドン酸代謝物を含む炎症性メディエーター産生により特徴付けられる炎症性応答を誘発するために補足となる強力な活性化剤を利用する。
【００７９】
耳膨潤モデル。 耳膨潤モデルはアラキドン酸代謝阻害の直接測定である。アラキドン酸のアセトン溶液をマウスの耳に局所的に適用する。アラキドン酸代謝物は、ＣＯＸ−２のごとき酵素の作用により産生される炎症誘発性ディエーターの産生を生じる。膨潤の抑制は、この経路に含まれる酵素の阻害の直接尺度である。結果は図３に示されており、そ
れは２つの時間点（２４時間および１時間）において、強制栄養により経口でまたは腹腔内のどちらかで送達された３つの抽出物の効果を示している。コガネバナから単離されたフリー−Ｂ−環フラボノイドは、ＩＰがより有効であったけれども、ＩＰおよび強制栄養の両方で送達された場合に膨潤を抑制した（図３ＡおよびＢ）。Ｓ．オルトカリックスから抽出されたフリー−Ｂ−環フラボノイドは、ＩＰで与えられた場合にこれらの代謝物の発生を抑制したが、経口では抑制せず、一方、Ｓ．ラテリフローラから単離された抽出物は、インビトロでは有効であったが、インビボでは効果を示さなかった（データは示されていない）。
【００８０】
空気嚢モデル。 コガネバナから単離されたフリー−Ｂ−環フラボノイドが、耳膨潤モデルにおいてより有効であったため、それらをまた炎症の空気嚢モデルを使用して試験した。簡単には、３ｍＬの無菌空気を注入することにより、マウスの背中に空気嚢を作り出した。空気嚢は、１週間の期間、１日おきの１ｍＬの無菌空気追加注入により維持した。動物には耳膨潤モデルで記載したものと同一の方法および濃度を使用して投与し、炎症性応答を開始させるため、ザイモサンを注入した（空気嚢内へ）。４時間後、嚢内の液を集め、炎症性細胞の浸潤、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）活性（細胞活性化、脱顆粒の尺度）、および腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）産生（活性化の尺度）を測定した。結果は図４に示されている。
【００８１】
図４Ａは、空気嚢液から集められた細胞総数を示している。対照（インドメタシン）により抑制された強い応答があったけれども、コガネバナから単離されたフリー−Ｂ−環フラボノイドは炎症性細胞の浸潤（化学走性）を抑制しなかった。化学走性応答は減弱されなかったが、ＭＰＯ活性およびＴＮＦ−α産生を測定することにより、浸潤した細胞が活性化されたかどうかを決定するために液体を試験した。図４Ｂおよび４Ｃは、抽出物がＩＰ投与された場合にＭＰＯ活性およびＴＮＦ−α産生の両方が著しく減少したが、強制栄養では減少しなかったことを示している。これらのデータは、フリー−Ｂ−環フラボノイドは補足活性化により誘発される化学走性応答を抑制しなかったけれども、それらは炎症誘発性ディエーターの放出および産生の防止により、炎症を減少させることに効果的であることを示している。
アラキドン酸誘発耳膨潤。 インビボで炎症を直接的に抑制するフリー−Ｂ−環フラボノイドの能力を以前に記載されているように測定した（Ｇｒｅｅｎｓｐａｎら、（１９９９） Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ４２： １６４−１７２；Ｙｏｕｎｇら、（１９８４） Ｊ． Ｉｎｖｅｓｔ． Ｄｅｒｍａｔ． ８２： ３６７−３７１）。簡単には、５つのＢａｌｂ／Ｃマウス群に、アラキドン酸（ＡＡ）の適用に先立った２４時間および１時間前、腹腔内（Ｉ．Ｐ．）かまたは強制栄養による経口で、図４に示したような試験化合物の３つの用量を与えた。ＡＡのアセトン溶液（２ｍｇ／１５μＬ）を左耳に適用し、陰性対照としてのアセトン（１５μＬ）を右耳に適用した。１時間後、動物をＣＯ２吸入により殺し、そして技術者用測微計を使用して、耳の厚さを測定した。対照は、ＡＡを与えたが、抗炎症薬で処理していない動物、およびＡＡおよび５ｍｇ／ｋｇのインドメタシンで処理された動物を含んでいた。
炎症の空気嚢モデル。 空気嚢モデルは、Ｒｉｏｊａら、（２０００） Ｅｕｒ． Ｊ．
Ｐｈａｒｍ． ３９７： ２０７−２１７、の方法を適応させた。３ｍＬの無菌空気の注入、そして６日間、２日ごとの１ｍＬの追加注入により維持することにより、空気嚢を５つのＢａｌｂ／Ｃ群において確立した。１％ザイモサン（１ｍＬ）の嚢内への注入に先立った２４時間および１時間前、Ｉ．Ｐ．かまたは強制栄養による経口で、図４に示したような試験化合物の３つの用量を動物に与えた。４時間後、動物をＣＯ２吸入により殺し、空気嚢を無菌生理学的食塩水（３ｍＬ）で洗浄した。洗浄液を遠心分離し、浸潤細胞の総数を決定した。また、上清液は確保し、活性化の尺度として、ＥＬＩＳＡによりミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）活性およびＴＮＦ−αの存在を分析した。
（実施例１０）タツナミソウ属種からの標準化フリー−Ｂ−環フラボノイド抽出物の開発
スクテラリア オルトカリックス（５００ｍｇのすり砕いた根）を２５ｍＬの以下の溶剤系で２回抽出した。（１）１００％水、（２）８０：２０ 水：メタノール、（３）６０：４０ 水：メタノール、（４）４０：６０ 水：メタノール、（５）２０：８０ 水：メタノール、（６）１００％メタノール、（７）８０：２０ メタノール：ＴＨＦ、（８）６０：４０ メタノール：ＴＨＦ。抽出溶液を合併し、低真空下で濃縮および乾燥した。化学成分の同定は、フォトダイオードアレイ検出器を使用した高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ／ＰＤＡ）、および２５０ｍｍｘ４．６ｍｍ Ｃ１８カラムにより実施した。化学成分は、バイカレイン、バイカリン、スクテラレインおよびオウゴニン基準品を使用した保持時間およびＰＤＡデータに基づいて定量した。結果は表７に示されている。
【００８２】
【表７】
【００８３】
コガネバナ（１０００ｍｇのすり砕いた根）は、以下のメタノールおよび水の混合物を５０ｍＬ使用して２回抽出した：（１）１００％水、（２）７０：３０ 水：メタノール、（３）５０：５０ 水：メタノール、（４）３０：７０ 水：メタノール、（５）１００％メタノール。抽出溶液を合併し、低真空下で濃縮および乾燥した。化学成分の同定は、フォトダイオードアレイ検出器を使用したＨＰＬＣ（ＨＰＬＣ／ＰＤＡ）、および２５０ｍｍｘ４．６ｍｍ Ｃ１８カラムにより実施した。化学成分は、バイカレイン、バイカリン、スクテラレインおよびオウゴニン基準品を使用した保持時間およびＰＤＡデータに基づいて定量した。結果は表８に示されている。
【００８４】
【表８】
【００８５】
（実施例１１）膝関節部および／または股関節部の慢性関節リウマチまたは変形性関節症の痛み軽減におけるフリー−Ｂ−環フラボノイドの有効性の臨床評価
この臨床研究は単一中心、無作為化、二重盲検、プラシーボ−対照研究であった。膝関節部および／または股関節部の慢性関節リウマチまたは変形性関節症を患った６０の被験者（ｎ＝６０）を以下の４つの群の一つへ無作為においた：Ａ０ プラシーボ ｎ＝１５
プラシーボ；Ａ１ 用量１ ｎ＝１５ ２５０ｍｇ／日（１２５ｍｇ ｂ．ｉ．ｄ．）；Ａ２ 用量２ ｎ＝１５ ウニベスチン ５００ｍｇ／日（２５０ｍｇ ｂ．ｉ．ｄ．）；Ａ３ 活性対照 ｎ＝１５ ２００ｍｇ／日（１００ｍｇ ｂ．ｉ．ｄ．）。ウニベスチンは、６２．５％（ｗ／ｗ）のバイカリン含率および＞７５％（ｗ／ｗ）の総フリー−Ｂ−環フラボノイドを有する、オウゴン標準化抽出物の特許薬品比から成っている。セレブレックスはＣＯＸ−２選択的阻害薬である処方箋薬剤の商標名である。
【００８６】
被験者は性を一致させ、および４０から７５の年齢で募集した。処置は、前記の用量スケジュールに従った、プラシーボまたは活性化合物（ウニベスチンまたはセレブレックス）の６０日間の投与から成っている。ＮＳＡＩＤを服用している被験者は、研究の開始の前に、２週間の洗い出し期間に参加させた。身体的活動は制限しなかった。被験者は、いつでもどんな理由でも、試験を自由にやめることができた。処置の有効性は、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｏｎｔａｒｉｏ ａｎｄ ＭｃＭａｓｔｅｒ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｉｅｓ（ＷＯＭＡＣ）骨−関節症指標を使用し、医者による経口投与後、６０日間評価した。（Ｌｉｎｇａｒｄら、（２００１） Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｏｎｅ ＆ Ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｇｅｒｙ ８３（１２）： １８５６−１８６４；Ｓｏｄｅｎｎａｎ ＆ Ｍａｌｃｈａｕ （２０００） Ａｃｔａ Ｏｒｔｈｏｐ Ｓｃａｎｄ． ７１（１）： ３９−４６参照）。このプロトコールはモントリオール大学ＩＲＢ委員会により論評され、承認されている。表９は処置前のＷＯＭＡＣ指標スコア（ベースラインスコア）を示しており、および表１０は６０日の処置後のＷＯＭＡＣ指標スコアにおける変化を示している。図５から８は研究の結果を図示している。
【００８７】
【表９】
【００８８】
【表１０】
【００８９】
以下に、出願時の特許請求の範囲を記載する。
［請求項１］
シクロオキシゲナーゼ酵素ＣＯＸ−２を阻害するための方法であって、フリー−Ｂ−環フラボノイドから成っている組成物またはフリー−Ｂ−環フラボノイドの混合物を含んでいる組成物を投与することから成っている方法。
【００９０】
［請求項２］
該フリー−Ｂ−環フラボノイドが下記の構造を有している化合物の群より選択される、請求項１に記載の方法：
【化４】
式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、―Ｈ、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＯＲ、−ＳＲ、−ＮＨ２、−ＮＨＲ、−ＮＲ２、−ＮＲ３＋Ｘ−、アルドペントース、メチル−アルドペントース、アルドヘキソース、ケトヘキソースおよびそれらの化学誘導体を包含する単一のまたは多数の糖の組合わせの、炭素、酸素、窒素または硫黄グリコシドからなる群より独立して選択され；
式中、
Ｒは１−１０の間の炭素原子を有するアルキル基であり；および
Ｘは、ヒドロキシル、クロリド、ヨージド、スルフェート、ホスフェート、アセテート、フルオリド、およびカーボネートを包含する、医薬として受容可能なカウンターアニオンの群より選択される。
【００９１】
［請求項３］
該フリー−Ｂ−環フラボノイドが有機合成により得られる、請求項１に記載の方法。
【００９２】
［請求項４］
該フリー−Ｂ−環フラボノイドが植物の一部分から単離される、請求項１に記載の方法。
【００９３】
［請求項５］
該植物が、バンレイシ科、キク科（Ａｓｔｅｒａｃｅａｅ）、ノウゼンカズラ科、シクンシ科、キク科（Ｃｏｍｐｏｓｉｔａｅ）、トウダイグサ科、シソ科、クスノキ科、マメ科、クワ科、マツ科、ワラビ科、中国ワラビ科、ニレ科およびショウガ科から成る科より選択される、請求項４に記載の方法。
【００９４】
［請求項６］
該植物が、デスモス（Ｄｅｓｍｏｓ）属、アキロクリネ（Ａｃｈｙｒｏｃｌｉｎｅ）属、オロキシルム（Ｏｒｏｘｙｌｕｍ）属、ブケナヴィア（Ｂｕｃｈｅｎａｖｉａ）属、ヤマハハコ属、コツラ（Ｃｏｔｕｌａ）属、ハハコグサ属、ムギワラギク属、ヤグルマギク属、ヒヨドリバナ属、バッカリス（Ｂａｃｃｈａｒｉｓ）属、シラキ属、タツナミソウ属、モルサ（Ｍｏｌｓａ）属、コレブルッケア（Ｃｏｌｅｂｒｏｏｋｅａ）属、イヌゴマ属、オリガヌム（Ｏｒｉｇａｎｕｍ）属、ジジフォラ（Ｚｉｚｉｐｈｏｒａ）属、クロモジ属、カゴノキ属、アカシア属、デリス（Ｄｅｒｒｉｓ）属、カンゾウ属、ナツフジ属、ポンガミア（Ｐｏｎｇａｍｉａ）属、テフロシア（Ｔｅｐｈｒｏｓｉａ）属、アルトカルプス（Ａｒｔｏｃａｒｐｕｓ）属、イチジク属、ピチログラマ（Ｐｉｔｙｒｏｇｒａｍｍａ）属、ノトラエナ（Ｎｏｔｈｏｌａｅｎａ）属、マツ属、ニレ属およびハナミョウガ属から成る属より選択される、請求項４に記載の方法。
【００９５】
［請求項７］
フリー−Ｂ−環フラボノイドが、幹、幹樹皮、小枝、塊茎、根、根樹皮、若芽、種、根茎、花および他の再生性器官、葉および他の空中部分から成る群より選択される植物の一部
分から単離される、請求項４に記載の方法。
【００９６】
［請求項８］
ＣＯＸ−２仲介疾患又は状態を予防又は処置するための方法であって、フリー−Ｂ−環フラボノイドから成っている組成物またはフリー−Ｂ−環フラボノイドおよび医薬として受容可能な坦体の混合物を含んでいる組成物の有効量を、それらを必要としている宿主に投与することから成っている方法。
【００９７】
［請求項９］
該フリー−Ｂ−環フラボノイドが下記の構造を有している化合物の群より選択される、請求項８に記載の方法：
【化５】
式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、―Ｈ、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＯＲ、−ＳＲ、−ＮＨ２、−ＮＨＲ、−ＮＲ２、−ＮＲ３＋Ｘ−、アルドペントース、メチル−アルドペントース、アルドヘキソース、ケトヘキソースおよびそれらの化学誘導体を包含する単一のまたは多数の糖の組合わせの、炭素、酸素、窒素または硫黄グリコシドからなる群より独立して選択され；
式中、
Ｒは１−１０の間の炭素原子を有するアルキル基であり；および
Ｘは、ヒドロキシル、クロリド、ヨージド、スルフェート、ホスフェート、アセテート、フルオリド、およびカーボネートを包含する、医薬として受容可能なカウンターアニオンの群より選択される。
【００９８】
［請求項１０］
該フリー−Ｂ−環フラボノイドが有機合成により得られる、請求項８に記載の方法。
【００９９】
［請求項１１］
該フリー−Ｂ−環フラボノイドが植物の一部分から単離される、請求項８に記載の方法。
【０１００】
［請求項１２］
該植物が、バンレイシ科、キク科（Ａｓｔｅｒａｃｅａｅ）、ノウゼンカズラ科、シクンシ科、キク科（Ｃｏｍｐｏｓｉｔａｅ）、トウダイグサ科、シソ科、クスノキ科、マメ科、クワ科、マツ科、ワラビ科、中国ワラビ科、ニレ科およびショウガ科から成る科より選択される、請求項１１に記載の方法。
【０１０１】
［請求項１３］
該植物が、デスモス（Ｄｅｓｍｏｓ）属、アキロクリネ（Ａｃｈｙｒｏｃｌｉｎｅ）属、オロキシルム（Ｏｒｏｘｙｌｕｍ）属、ブケナヴィア（Ｂｕｃｈｅｎａｖｉａ）属、ヤマハハコ属、コツラ（Ｃｏｔｕｌａ）属、ハハコグサ属、ムギワラギク属、ヤグルマギク属、ヒヨドリバナ属、バッカリス（Ｂａｃｃｈａｒｉｓ）属、シラキ属、タツナミソウ属、
モルサ（Ｍｏｌｓａ）属、コレブルッケア（Ｃｏｌｅｂｒｏｏｋｅａ）属、イヌゴマ属、オリガヌム（Ｏｒｉｇａｎｕｍ）属、ジジフォラ（Ｚｉｚｉｐｈｏｒａ）属、クロモジ属、カゴノキ属、アカシア属、デリス（Ｄｅｒｒｉｓ）属、カンゾウ属、ナツフジ属、ポンガミア（Ｐｏｎｇａｍｉａ）属、テフロシア（Ｔｅｐｈｒｏｓｉａ）属、アルトカルプス（Ａｒｔｏｃａｒｐｕｓ）属、イチジク属、ピチログラマ（Ｐｉｔｙｒｏｇｒａｍｍａ）属、ノトラエナ（Ｎｏｔｈｏｌａｅｎａ）属、マツ属、ニレ属およびハナミョウガ属から成る属より選択される、請求項１１に記載の方法。
【０１０２】
［請求項１４］
フリー−Ｂ−環フラボノイドが、幹、幹樹皮、小枝、塊茎、根、根樹皮、若芽、種、根茎、花および他の再生性器官、葉および他の空中部分から成る群より選択される植物の一部分から単離される、請求項１１に記載の方法。
【０１０３】
［請求項１５］
ＣＯＸ−２仲介疾患又は状態が、変形性関節炎、慢性関節リウマチ、月経痙攣、全身性紅斑性狼瘡、乾癬、慢性緊張性頭痛、偏頭痛、炎症性腸疾患と関連する炎症；小擦過傷、日焼けおよび接触性皮膚炎からなる群より選択される局所的創傷および小炎症状態；および固形癌から成る群より選択される、請求項８に記載の方法。
【０１０４】
［請求項１６］
フリー−Ｂ−環フラボノイド組成物が、０．０１％から１００％のフリー−Ｂ−環フラボノイドから成る、請求項８に記載の方法。
【０１０５】
［請求項１７］
組成物が、０．０１から２００ｍｇ／体重ｋｇから成る群より選択される用量で投与される、請求項８に記載の方法。
【０１０６】
［請求項１８］
投与の経路が、適切な医薬処方での経口、局所、座剤、静脈内、および経皮、胃内、筋肉内、腹腔内、および静脈内投与から成る群より選択される、請求項８に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【０１０７】
【図１】図１は、コガネバナからのＨＴＰ分画によるＣＯＸ−１およびＣＯＸ−２の阻害を、図を用いて描いている。抽出物は実施例１および３に説明したように調製および分画した。抽出物は、組換え体ヒツジＣＯＸ−１（■）またはヒツジＣＯＸ−２（◆）のペルオキシダーゼ活性の阻害で試験した。データは非処置対照のパーセントとして表されている。
【図２Ａ】図２Ａはスクテラリア ラテリフローラ根からの有機抽出物中のフリー−Ｂ−環フラボノイドの高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）クロマトグラムを描いている。
【図２Ｂ】図２Ｂはスクテラリア オルトカリックス根からの有機抽出物中のフリー−Ｂ−環フラボノイドの高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）クロマトグラムを描いている。
【図２Ｃ】図２Ｃはコガネバナ根からの有機抽出物中のフリー−Ｂ−環フラボノイドの高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）クロマトグラムを描いている。
【図３】図３は、アラキドン酸誘発炎症に対する、コガネバナからのフリー−Ｂ−環フラボノイドのインビボ有効性を示している。インビボ有効性は、実施例９に説明したように、アラキドン酸の直接適用により誘発される膨潤を抑制する能力に基づいて評価した。処置耳および対照耳間の、膨潤における平均差異が図３Ａに示されている。図３Ｂはアラキドン酸処置対照と比較した、各々の群のパーセント阻害を示している。
【図４Ａ】図４Ａは、ザイモサンにより誘発された炎症に対する、コガネバナから単離されたフリー−Ｂ−環フラボノイドのインビボ有効性を図で説明している。ザイモサンは、実施例９で説明したように、空気嚢中の炎症誘発性応答を惹起するために使用した。炎症誘発性細胞の浸潤を含む炎症マーカーを、コガネバナからのフリー−Ｂ−環フラボノイドの有効性および抗炎症活性作用機構を評価するために使用した。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ザイモサンにより誘発された炎症に対する、コガネバナから単離されたフリー−Ｂ−環フラボノイドのインビボ有効性を図で説明している。ザイモサンは、実施例９で説明したように、空気嚢中の炎症誘発性応答を惹起するために使用した。空気嚢液中のＭＰＯ活性のパーセント阻害を含む炎症マーカーを、コガネバナからのフリー−Ｂ−環フラボノイドの有効性および抗炎症活性作用機構を評価するために使用した。
【図４Ｃ】図４Ｃは、ザイモサンにより誘発された炎症に対する、コガネバナから単離されたフリー−Ｂ−環フラボノイドのインビボ有効性を図で説明している。ザイモサンは、実施例９で説明したように、空気嚢中の炎症誘発性応答を惹起するために使用した。ＴＮＦ−α産生のパーセント阻害を含む炎症マーカーを、コガネバナからのフリー−Ｂ−環フラボノイドの有効性および抗炎症活性作用機構を評価するために使用した。
【図５】図５は、実施例１１で説明したように、プラシーボ、２００ｍｇ／日の用量でのセレブレックス、２５０ｍｇ／日の用量でのウニベスチン、および５００ｍｇ／日の用量でのウニベスチンにより６０日処置した後での、複合ＷＯＭＡＣ指標スコアの％変化を図で説明している。
【図６】図６は、実施例１１で説明したように、プラシーボ、２００ｍｇ／日の用量でのセレブレックス、２５０ｍｇ／日の用量でのウニベスチン、および５００ｍｇ／日の用量でのウニベスチンにより６０日処置した後での、硬直のＷＯＭＡＣ指標スコアの％変化を図で説明している。
【図７】図７は、実施例１１で説明したように、プラシーボ、２００ｍｇ／日の用量でのセレブレックス、２５０ｍｇ／日の用量でのウニベスチン、および５００ｍｇ／日の用量でのウニベスチンにより６０日処置した後での、身体機能化に関連するＷＯＭＡＣ指標スコアの％変化を図で説明している。
【図８】図８は、実施例１１で説明したように、プラシーボ、２００ｍｇ／日の用量でのセレブレックス、２５０ｍｇ／日の用量でのウニベスチン、および５００ｍｇ／日の用量でのウニベスチンにより６０日処置した後での、痛みに関するＷＯＭＡＣ指標スコアの％変化を図で説明している。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
変形性関節炎を有する患者における身体機能、柔軟性又は可動性の改良における使用のための、有効量のタツナミソウ属（ｇｅｎｕｓ Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａ）の植物からの抽出物を含む組成物であって、当該抽出物が、バイカリンを含むフリー−Ｂ−環フラボノイドの混合物を含む、組成物。
【請求項２】
変形性関節炎を有する患者における身体機能、柔軟性又は可動性の改良のための療法的組成物の製剤化における組成物の使用であって、当該組成物が、有効量のタツナミソウ属（ｇｅｎｕｓ Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａ）の植物からの抽出物を含み、当該抽出物が、バイカリンを含むフリー−Ｂ−環フラボノイドの混合物を含む、使用。
【請求項３】
前記フリー−Ｂ−環フラボノイドの混合物中の各フリー−Ｂ−環フラボノイドが下記の構造を有している化合物の群より選択される、請求項１又は２に記載の組成物又は使用：
【化１】
式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、―Ｈ、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＯＲ、−ＳＲ、−ＮＨ２、−ＮＨＲ、−ＮＲ２、−ＮＲ３＋Ｘ−、アルドペントース、メチル−アルドペントース、アルドヘキソース及びケトヘキソースを包含する単一のまたは多数の糖の組合わせの、炭素、酸素、窒素または硫黄グリコシドからなる群より独立して選択され；
式中、
Ｒは１−１０の間の炭素原子を有するアルキル基であり；および
Ｘは、ヒドロキシル、クロリド、ヨージド、スルフェート、ホスフェート、アセテート、フルオリド、およびカーボネートを包含する、医薬として受容可能なカウンターアニオンの群より選択される。
【請求項４】
フリー−Ｂ−環フラボノイドの混合物が、幹、幹樹皮、小枝、塊茎、根、根樹皮、若芽、種、根茎、花および他の再生性器官、葉および他の空中部分から成る群より選択されるタツナミソウ属植物の一部分から単離される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物又は使用。
【請求項５】
前記組成物が０．０１％から１００％のフリー−Ｂ−環フラボノイドの混合物を含む、請求項１又は２に記載の組成物又は使用。
【請求項６】
前記組成物が０．０１から２００ｍｇ／体重ｋｇから成る群より選択される用量で投与される、請求項１又は２に記載の組成物又は使用。
【請求項７】
投与の経路が、適切な医薬処方での経口、局所、座剤、静脈内、および経皮、胃内、筋肉内、腹腔内、および静脈内投与から成る群より選択される、請求項１又は２に記載の組成物又は使用。
【請求項１】
変形性関節炎を有する患者における身体機能、柔軟性又は可動性の改良における使用のための、有効量のタツナミソウ属（ｇｅｎｕｓ Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａ）の植物からの抽出物を含む組成物であって、当該抽出物が、バイカリンを含むフリー−Ｂ−環フラボノイドの混合物を含む、組成物。
【請求項２】
変形性関節炎を有する患者における身体機能、柔軟性又は可動性の改良のための療法的組成物の製剤化における組成物の使用であって、当該組成物が、有効量のタツナミソウ属（ｇｅｎｕｓ Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａ）の植物からの抽出物を含み、当該抽出物が、バイカリンを含むフリー−Ｂ−環フラボノイドの混合物を含む、使用。
【請求項３】
前記フリー−Ｂ−環フラボノイドの混合物中の各フリー−Ｂ−環フラボノイドが下記の構造を有している化合物の群より選択される、請求項１又は２に記載の組成物又は使用：
【化１】
式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、―Ｈ、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＯＲ、−ＳＲ、−ＮＨ２、−ＮＨＲ、−ＮＲ２、−ＮＲ３＋Ｘ−、アルドペントース、メチル−アルドペントース、アルドヘキソース及びケトヘキソースを包含する単一のまたは多数の糖の組合わせの、炭素、酸素、窒素または硫黄グリコシドからなる群より独立して選択され；
式中、
Ｒは１−１０の間の炭素原子を有するアルキル基であり；および
Ｘは、ヒドロキシル、クロリド、ヨージド、スルフェート、ホスフェート、アセテート、フルオリド、およびカーボネートを包含する、医薬として受容可能なカウンターアニオンの群より選択される。
【請求項４】
フリー−Ｂ−環フラボノイドの混合物が、幹、幹樹皮、小枝、塊茎、根、根樹皮、若芽、種、根茎、花および他の再生性器官、葉および他の空中部分から成る群より選択されるタツナミソウ属植物の一部分から単離される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物又は使用。
【請求項５】
前記組成物が０．０１％から１００％のフリー−Ｂ−環フラボノイドの混合物を含む、請求項１又は２に記載の組成物又は使用。
【請求項６】
前記組成物が０．０１から２００ｍｇ／体重ｋｇから成る群より選択される用量で投与される、請求項１又は２に記載の組成物又は使用。
【請求項７】
投与の経路が、適切な医薬処方での経口、局所、座剤、静脈内、および経皮、胃内、筋肉内、腹腔内、および静脈内投与から成る群より選択される、請求項１又は２に記載の組成物又は使用。
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２０１０−２８０６８６（Ｐ２０１０−２８０６８６Ａ）
【公開日】平成２２年１２月１６日（２０１０．１２．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１６８９７３（Ｐ２０１０−１６８９７３）
【出願日】平成２２年７月２８日（２０１０．７．２８）
【分割の表示】特願２００３−５７２５８１（Ｐ２００３−５７２５８１）の分割
【原出願日】平成１５年２月２８日（２００３．２．２８）
【出願人】（５０４０００５６８）ユニゲン・ファーマシューティカルス・インコーポレーテッド (12)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１２月１６日（２０１０．１２．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年７月２８日（２０１０．７．２８）
【分割の表示】特願２００３−５７２５８１（Ｐ２００３−５７２５８１）の分割
【原出願日】平成１５年２月２８日（２００３．２．２８）
【出願人】（５０４０００５６８）ユニゲン・ファーマシューティカルス・インコーポレーテッド (12)
【Ｆターム（参考）】
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