呼気粒子の捕集及び測定
粒子が動物の呼気の息の中に吐出される。この粒子の性質と量は一定の医学的状態の指標になり得る。したがって，これらの粒子を捕集し，サイズ又は質量によって分類することで，一以上の医学的状態の診断に利用できる。本発明は，呼気粒子を捕集し分類する方法とシステム，並びに前記呼気粒子を利用する診断のための方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は動物，特に哺乳類，好ましくはヒトの息の中に吐出される粒子に関する。当該粒子の性質と量は，一定の医学的状態についての指標となり得る。したがって，それらを捕集し，サイズや質量によって分類することで，一以上の医学的状態の診断に利用することができる。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの気道は日々，少なくとも７〜８立方メートルの空気を通しており，吸気中の各種粒子やガスを無毒化するための高度な生物学的システムが存在する。吸い込んだ物質に対する最初の防御線は，幾つかの重要な抗酸化系を有するものの中でも特に気道全体を覆う気道被覆液（ＲＴＬＦ）である。ＲＴＬＦの重要成分としては他にサーファクタントがあり，これは表面張力を低下させる一方，先天性免疫に関与する化合物を含むものである。
【０００３】
ＲＴＬＦの組成は気道の炎症状態によって異なることが示されている。ＲＴＬＦ中の抗酸化物質と吸い込んだ酸化物質との間のバランスが乱れると，酸化ストレスによって炎症プロセスが始まる。この炎症プロセスは非常に変化に富むものであるが，喘息から肺癌まで，殆ど呼吸器疾患の進行において共通する主要な初期事象である。
【０００４】
あらゆる気道疾患へと至らしめる病態生理学的プロセスは，これまでの所，完全には理解されていない。その理由の一つとして，これらのプロセスをヒトにおいてモニターすることが難しいということが挙げられる。例えば各種曝露状況の影響を評価するために利用できる方法は，肺機能や呼気一酸化窒素の測定，誘発採痰又は気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）の分析，又は気管支鏡検査からのバイオプシーに限られる。
【０００５】
これら既存の方法は，気管支鏡検査の場合のように侵襲的過ぎ，様々な曝露状況への感受性が非常に変わりやすいことにより，保証された大規模の研究には適応できない。その上，気管支鏡検査と誘発採痰のどちらも，とりわけ既存の心肺疾患や喘息を有する患者等，敏感な集団で一定のリスクを伴う。呼気中の一酸化窒素は多くの場合，単独でアレルギー性炎症を反映していることが伺われ，よって他の形態の気道疾患を調べる際には利用価値が限定されている。一方，肺機能検査は研究対象の患者にとってはむしろ無害といえるが，疾患の裏にあるメカニズムについては何ら情報を与えるものではない。
【０００６】
利用されているその他の方法としてはインビトロ検査があるが，ヒトの気道という複雑な環境への一般化が可能かどうかということになると，かなり限定されたものであると言わざるを得ない。同じことが多くの場合，動物での研究についても言える。すなわち，動物は，遺伝子レベルではヒトと同一性が高くても，動物とヒトでは各種遺伝子の発現は相当異なったものとなる。
【０００７】
最近，呼気凝縮液（ＥＢＣ）の採取という新しい方法が導入されている。これは，蒸気状の呼気水(exhaled water vapour)を低温で凝縮させたもので，揮発性，非揮発性の両化合物が共に同定されてきた。ＥＢＣ中に見出された非揮発性化合物は，気道内で形成された粒子に起因していると考えられている。これら粒子は息をしたり話や咳をしたりする際に呼吸器系で生成されるものと考えられ，それら粒子が感染性物質を伝搬させる媒体として働くのではないかという主な理由から，今日まで研究されてきた。これら粒子がどのようにして形成されるかについては未だにわかっていないが，考えられるメカニズムとして，気管支の断面積が大幅に減少している気道中央における呼気空気の乱流が挙げられる。第二の仮説は，気道が肺の縁部に開く際にＲＴＬＦから粒子が形成される，というものである。疾病においては，乱流の増大及び／又はＲＴＬＦ物性の変化によって粒子形成が亢進する。この一例が国際特許公開ＷＯ０２／０８２９７７号公報に記載されている。
【０００８】
呼気凝縮液（ＥＢＣ）の採取は，簡単には解決できない方法論上の困難を多く伴っている。例えば，水分で希釈されることで目的物質の濃度が非常に薄くなること，口腔由来の物質によってかなり汚染されてしまうこと，個人内の変動係数が高いこと，ＥＢＣ中に見出される非揮発物質の採取が非常に非効率的であること等である。
【０００９】
よって，呼吸器系における健康上好ましくない影響を検出しモニターすることができる，より優れた非侵襲的方法に対するニーズが存在する。ＥＢＣの分析における，方法論上の各種困難性を克服するための一方法としてこれまで試されなかったものに，呼気粒子の直接的な採取及び分析がある。この方法では捕集した粒子の量とサイズを決定できるので，気道の状態に関する具体的情報も得られる。
【００１０】
各種サイズの粒子フラクション分布の測定
呼気液滴（すなわち粒子）を検査する研究で発表されたものは極少数しかない。パピネニ（Papineni）とロゼンサル（Rosenthal）（Ｊ．エアロゾル Med 10(2):105-16）及びエドワーズ(Edwards)他（Proc.Natl.Acad.Sci.USA101(50):17383-8）は，ヒトにおける呼気粒子の濃度を多数測定し，被験体間で大きな差があるとはいえ，通常の室内空気中の濃度よりは一般に大幅に低い値であることを開示している。また，呼気粒子のサイズ分布に関する情報も示されている。液滴の主成分は水なので，粒子サイズは周辺空気中の相対湿度（ＲＨ）の変化に素早く呼応して変化するに相違ないと考えるのが妥当である。相対湿度の影響を調べるためにパピネニとロゼンサルが用いた手続きは，赤外ランプを利用して空気を暖めて相対湿度を変化させたものであるので疑問が残る。エドワーズ他は彼ら自身の研究においては相対湿度を重要視していない。粒子サイズは，液滴乾燥物の顕微鏡検査等の間接的方法やサイズ分解能の低い光散乱法によって求められたものである。よってこのような技術水準は，呼気エアロゾルのサイズ分布と濃度変化の更なる探求を保証するものである。
【００１１】
近年，ヒトにおけるエアロゾル形成への関心が高まりつつあるが，その主たる理由はエアロゾルが感染力を検出する能力を有する点にある。米国特許公開第２００５／００７３６８３号公報及びAnal.Chem.2005,77,4734-4741は，予め形成されたエアロゾル粒子を特定するためのリアルタイム検出方法及びシステムを開示している。そこに記載された方法は，正と負のマススペクトルをこれもまた開発される参照用スペクトルと比較することで感染性物質或いは「脅威物質(threat agents)」を含有するエアロゾルをオンラインで検出することを目的としたものである。この方法は診断目的或いはヒトの気道の状態をモニターする目的で開発されたものではなく，非常に低感度であるため，呼気粒子等の場合のように極低濃度で存在する物質の検出を可能にするものではない。
【００１２】
このように，気道を簡単にモニターするための方法が見出されていないのが現状である。気管支肺胞洗浄や採痰誘発等の侵襲的手続きは患者に害を与える可能性があるので頻回に試料採取できない。
【００１３】
発明の概要
呼気中のバイオマーカーの測定は非侵襲的であり，繰返し採取を可能とするので，病状進行や治療応答のモニタリングの他，疾病の早期発見に有用である。本技法は揮発性物質，中でも特に重要なアレルギー性喘息のマーカーとして利用される呼気ＮＯに関して成功を収めている。
【００１４】
非揮発性化合物は，気道被覆液に由来すると考えられるエアロゾル粒子によって運ばれる。このことは本発明者らの予備研究データでも確認されている。これら化合物は，気道における病態生理学的プロセスに関する基本的かつ具体的な情報を提供するであろう。呼気の中の内因性粒子に関する研究は殆どなされていない。気道での粒子形成のメカニズムと正確な場所はよく分かっておらず，粒子の化学組成についての具体的分析はこれまでなされていない。
【００１５】
呼気の中の粒子の捕集と分析のために新しい技法が開発された。被験体の医学的状態を決定するための本方法は，
ａ．当該被験体が呼気で吐出した粒子を捕集する工程と，
ｂ．これら粒子を質量又はサイズによって分類する工程と，
ｇ．前記粒子の化学物質含量(chemical content)を分析する工程と
を含み，これにより前記被験体の医学的状態を決定できるようにしたものである。
【００１６】
更に，本方法は次の工程：
ｃ．前記粒子を質量又はサイズによって分類し，前記粒子の粒子分布プロファイルを得る工程と，
ｄ．前記被験体が呼気で吐出した粒子の粒子分布プロファイルを参照用粒子分布プロファイルと比較する工程と，
ｅ．被験体の粒子分布プロファイルと参照用粒子分布プロファイルとの間の類似性及び／又は乖離性を指示する工程と，
ｆ．被験体の粒子分布プロファイルと参照用粒子分布プロファイルの間との乖離性又は類似性を，被験体の一以上の医学的状態に帰属させる工程と，選択的に，
ｇ．前記粒子の化学物質含量を分析する工程と
を含むこともできる。
【００１７】
医学的状態は，気管支喘息，嚢胞性繊維症，慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ），間質性肺疾患，サルコイドーシス，全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）等の全身性疾患における肺症状，肺炎等の肺感染症，細菌コロニー形成又はウイルス感染からなる群から選択される。
【００１８】
参照用粒子分布プロファイルは所定の医学的状態を有しない被験体から得ることができ，その場合，工程ｅは被験体の粒子分布プロファイルと参照用粒子分布プロファイルとの間の乖離性を指示することを含む。或いは，参照用粒子分布プロファイルを，所定の医学的状態を有する患者から得ることもでき，その場合，工程ｅは被験体と患者の粒子分布プロファイルの類似性を指示することを含む。このようにして，被験体における前記所定の医学的状態の診断を下すことができる。
【００１９】
本発明はまた，呼気息の粒子の粒子分布プロファイルを提供する方法を提供するものであって，前記方法は，
ａ．被験体が呼気で吐出した粒子を捕集する工程と，
ｂ．前記粒子をサイズ又は質量によって分類して前記粒子の粒子分布プロファイルを得る工程と
を含む。
【００２０】
いずれの方法においても，粒子は慣性インパクタを利用して質量によって分類するか，粒子カウンタを利用してサイズによって分類することができる。
【００２１】
インパクタは好適には入口と出口を有し，粒子Ｐを含むガス流Ａが，前記入口からインパクタに入り，各段を順に通過して前記出口からインパクタを出るように配置された複数の段を含み，各段は，ガス流Ａを捕集プレートに向かわせるオリフィスを有する仕切りによって隣接する段から分離され，各捕集プレートの主面はガス流Ａの流れ方向と実質的に直角に配置されており，これによって，呼気粒子はガス流Ａ中にあって前記慣性インパクタを通過するが，その際，主ガス流Ａを各段の各捕集プレートに順に向かわせるように，また，第一の段に設けられた少なくとも第一の捕集プレートが第一の質量を有する粒子を捕集し，第二の段に設けられた少なくとも第二の捕集プレートが第二の質量を有する粒子を捕集するように，呼気粒子は前記慣性インパクタを通過する。
【００２２】
サイズ又は質量によって分類された後に粒子は分析される。それらは飛行時間型二次イオン質量分析法（ＴＯＦ−ＳＩＭＳ），マトリックス支援レーザ脱離イオン化質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ），標識抗体に基づく生化学アッセイやプロトコル，定量ＰＣＲ分析，走査電子顕微鏡法（ＳＥＭ），ガスクロマトグラフィー質量分析（ＧＣ−ＭＳ），液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ），表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ），蛍光分光法，ＴＯＣ（全有機物含有量）分析，元素分析，及び誘導結合プラズマ質量分析法（ＩＣＰ−ＭＳ）からなる群から選択される少なくとも一種の分析技法によって分析され，その際，捕集プレートの洗浄を最初に行っても行わなくてもよい。
【００２３】
本発明はまた，呼気粒子を捕集し分類するシステムにも関し，このシステムは，
ａ．第一開口と第二開口を有するリザーバと，
ｂ．リザーバの第一開口に接続された双方向マウスピースと，
ｃ．入口と出口を有するインパクタと
を含み，
前記インパクタは，粒子Ｐを含むガス流Ａが，前記入口からインパクタに入り，各段を順に通過して前記出口からインパクタを出るように配置された複数の段を含み，ここにおいて各段は，ガス流Ａを捕集プレートに向かわせるオリフィスを有する仕切りによって隣接する段から分離され，各捕集プレートの主面はガス流Ａの流れ方向と実質的に直角に配置されており，慣性インパクタの入口はリザーバの第一開口に接続されている。
【００２４】
本発明による呼気粒子の測定と分析は次の要求を満たすものである。
・ 非侵襲
・ ヒトにおいて繰返し測定が可能
・ 抗酸化系，蛋白発現，脂質パターンの変化，並びに，粒子サイズ及び濃度の相違を含む，肺における様々な病態生理学的プロセスのキネティクスを追従
・ 下記ａ），ｂ）の診断及びモニタリングのための新規のバイオマーカーを非侵襲的に特定するための基盤
ａ）次のような呼吸器疾患，すなわち
− 喘息
− 慢性閉塞性肺疾患
− 間質性肺疾患
− 肺癌
− 呼吸器感染症
− ＳＬＥ，強皮症及び関節リウマチ等の全身性疾患における肺症状の関与（Pulmonary engagement）
ｂ）次のような全身性疾患システム，すなわち
− 心血管疾病
− 糖尿病
− メタボリック症候群
− 高コレステロール血症
・ 挿管患者のモニタリング
・ 曝露のモニタリング
・ 薬物治療のための新規のターゲットを特定すること
・ ある種の曝露や疾患に対し高い遺伝的感受性を有する個体を特定すること。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】本発明に係る慣性インパクタを示す。
【図２】呼気粒子捕集のためのシステムを示す。
【図３】一対照被験体からの粒子スポットについての正（図３Ａ）と負（図３Ｂ）のＴＯＦ−ＳＩＭＳスペクトルを示す。
【図４】一対照被験体から得た呼気粒子の一スポットのＴＯＦ−ＳＩＭＳ像である。
【図５】呼気粒子（０．５〜２．０μｍ）の濃度と時間の関係を示す。
【図６】健康な被験体と喘息又は嚢胞性繊維症を有する被験体について行ったパイロットスタディで得た比（ＣＮ＋ＣＮＯ）／ＰＯ３−である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明の第一の実施態様は，被験体の医学的状態を決定する方法に関する。「決定する」という語は最も広義に，すなわち，ある医学的状態の存在（定性）及び／又は程度（定量）の評価と理解されるべきである。更に「決定する」とは，被験体が有する所定の医学的状態に至らしめる可能性のある何らかの素因を決定することをも言う。
【００２７】
「医学的状態」という語は，疾病及び障害に限定されたものと理解されるべきではない。健常者の例えば次のような医学的状態を非診断的方法によって調べる場合も対象とされ得る。
− 投薬や薬物（例：ドーピングテスト）の影響下に置かれている可能性のある，或いは，化学物質（例：汚染物質や職業上の危険物質）に曝されている被験体，
− 肉体的活動又は健康プログラム（例：被験体の体調や健康を決定するもの）に参加している被験体，
− 一定の疾病又は障害を発症させる疾病素因を有する可能性を持ち得る健常者，
− 特定の疾病若しくは障害を発症させる又は特定の曝露に対する低い耐性をもたらす遺伝的感受性を有する可能性を持ち得る健常者。
【００２８】
本発明の方法を適用し得る被験体は動物，特に哺乳類，好ましくはヒトである。本発明は以下，主としてヒトについて記載する。
【００２９】
本発明の第二の実施態様は，呼気中の粒子の粒子分布プロファイルを得るための方法を提供するものである。
【００３０】
本発明の上記両方法において，その最初の工程は，被験体に呼気吐出された粒子を捕集することを含む。一回の呼気で十分な数の粒子が提供されるかもしれないが，通常は呼気を繰り返して粒子を捕集する。ヒトの医学的状態の診断には，例えば，単一回の呼気は数十分迄（例：１秒〜１００分，例えば，１秒〜５０分，５秒〜２０分，或いは１０秒〜５分等）の時間に亘り吸気／呼気を連続的に行うことで粒子を捕集することができる。
【００３１】
呼気パターンを変化させることで，気道の様々な部位を代表する粒子を捕集することもできる。気道が狭くなると，強制的呼気は乱流を増大させ，したがって，粒子の生成は通常の呼吸時と比較すると，気道中央付近で増える。尚，気道の最遠位部からの気道開口でより多くの粒子が形成されることが推測される。
【００３２】
捕集後，粒子は質量又はサイズによって分類される。粒子カウンタを利用して個々の粒子をカウントすることで粒子の数−サイズ分布を得ることもできる。質量分布は粒子が球状であることと或る密度を有することを仮定して計算できる。その後，捕集された非揮発性物質についての高度な化学分析を行うことができる（下述）。
【００３３】
質量又はサイズによって粒子を分類することで前記粒子の粒子分布プロファイルも提供することができる。粒子分布プロファイルは，特定の質量又はサイズ（或いは質量又はサイズの範囲）を有する粒子がどれだけ呼気中に存在するかについての測定値であって，被験体の医学的状態を決定するために利用することもできる。この文脈において粒子という語は，固体，液体及び液体でコーティングされた固体物体を意味し，これらは気体（通常は空気であるが必ずしも空気とは限らない）中に浮遊していることが多い。物体のサイズは通常０．００５マイクロメーターより大きいが必ずしもこれに限られるものではなく，また通常１５マイクロメーターより小さいが必ずしもこれに限られるものではない。サイズという語は空力学的直径又は電気移動度粒径を意味するが，空力学的直径が適切である。
【００３４】
図１は呼気粒子（図１中，Ｐで示す）を捕集するのに用いる慣性インパクタ１０である。インパクタ１０は，ガスと呼気粒子がそこを通って該インパクタ１０に入る入口１２と，ガスと呼気粒子がそこを通って該インパクタ１０から出る出口１４とを有する容器である。図１のインパクタ１０は，入口１２と出口１４を円筒の対向する円形面に備えた円筒状のものとして示されているが，入口と出口１２，１４の形状や配置については他の態様も可能である。
【００３５】
インパクタ１０は複数の段２０，３０，４０，５０を含む。図１は４段の段２０，３０，４０，５０を示しているが，２〜１５段を有するインパクタは公知である。粒子Ｐを含む主ガス流Ａは入口１２からインパクタ１０に入り，各段２０，３０，４０，５０を順に通過して出口１４からインパクタ１０を出る。主ガス流Ａは，被験体により呼気吐出された空気と粒子を含む。流れはインパクタの出口に接続されたポンプにより生じる。本発明においては通常，呼気空気と粒子が被験体から出てインパクタに入るまで，何らの変化を及ぼす操作をこれらに対して行わない。
【００３６】
各段２０，３０，４０，５０は，隣接する段と仕切り２１，３１，４１，５１によって分離されている。各仕切りは少なくとも一個のオリフィス２２，３２，４２，５２（実地では，各仕切りには複数のオリフィスが存在する）を有し，これによってガス流Ａを捕集プレート３３，４３，５３に向わせる。各捕集プレート３３，４３，５３の主面は，ガス流Ａの流れの方向と実質的に直角に配置されている。
【００３７】
用いられる捕集プレート３３，４３，５３は厚さ約１ｍｍ，一辺１０〜１２ｍｍの矩形である。プレートは，ノズルを通る空気流の出口側で，基板ホルダの所定位置に両面テープで保持される。プレートは，分析を確実に行える点で好ましいため，元素シリコンで作製される。微量の不純物でも粒子の分析を妨げるため，プレートは高度に清潔でなければならない。シリコンプレートの浄化は各種方法によって行うことができるが，有機溶媒中での超音波洗浄の後にＵＶ−オゾン処理を行う方法や，１〜１０％の硝酸又は過酸化水素に浸漬する方法が好ましい。
【００３８】
洗浄後，捕集プレート表面を調製する際，捕集及びその後の化学分析に関して該表面を更に最適化することができる。捕集プレートの親水性やその他の表面化学特性を変化させることで粒子と上記表面の相互作用を好ましく制御することが出来る。好ましくは捕集プレートの全表面を改変する。疎水性の捕集表面は，親水性表面に比べ，脂質分子の炭化水素鎖等の疎水性部分とより強力に結合する。通常は親水性であるシリコン表面は，メチルシラン等の疎水性物質の薄層でコーティングしたり，シリコン基板を金でコーティングしてからメチル末端チオールの単層を金コーティングの上に適用したりすることで疎水性にすることができる。同様に，捕集表面は，一定の分子に特異結合するようにすることもできる。捕集プレート表面を特定の蛋白質に対する抗体でコーティングすることにより，この特定の蛋白質を該プレート表面に結合させることができる。適切な試薬を用いることで，分析物の結合から色変化や蛍光発光を起こすことができ，これらは原位置で（in situ），かつ，リアルタイムで検出できる。原位置での検出は，分析物が捕集プレート表面に結合することで生じる電流やキャパシタンスの変化を電気的に測定することでも可能である。この場合には，捕集プレートもまた，そのような測定を可能にするのに必要な電気的接続部を有する。インパクタは必要な電気的接続部を含むことができ，これにより捕集プレートと適切に接続できる。
【００３９】
慣性を有する粒子は，気流が第一捕集プレート３３の回りで偏向された場合に該気流に追従できないので，捕集プレート３３に衝突し，一方，慣性の小さい粒子は次の段４０へと進む。粒子の慣性はその質量に依存し，それはまたサイズに依存するということでもある。このようにして，粒子を質量又はサイズで分別することが可能である。
【００４０】
このように，オリフィスの数，直径，各段におけるオリフィスから捕集プレートまでの距離を選択することで，質量又はサイズによるエアロゾル内の粒子の分別が達成できる。高慣性の粒子（すなわち大きな質量／サイズ）は初めの方の段で分離され，一方，低慣性の粒子（すなわち小さな質量／サイズ）は後の方の段に衝突する。オリフィスの形状を選択することにより，化学分析を行うのに好適な形となるよう，捕集物質の濃度を上げることができる。捕集プレート上に捕集した物質の濃度は，呼気空気や息の濃縮物に比べ，非常に高い。
【００４１】
この場合，改変した３段のDekati PM10を用いた。改変は，第三段のノズル数を１／２に減らしたこととインパクタの設計流量を１．５倍に増加させることであった。
【００４２】
改変前のインパクタは毎分１０リットルのものであるが，毎分１５リットルの流量で操作した。最終段の２０のオリフィスは１０に減らし，これにより各ノズルのガス流速を２倍にした。５０％カットオフサイズ（すなわち，そのサイズの粒子の数の半分が捕集され，残る半分は捕集されないで通過する。これは階段状の捕集特性を示さず「Ｓ字状」特性を示す）は前記三段のそれぞれについて各７，１．５，０．５μｍであった。
【００４３】
上述のように，捕集プレートの表面官能化を縮小して各ノズルで異なる官能化を達成することができ，その結果様々な分析物を最適に並行捕集することが容易になる。同様に，特定物質の原位置での光学的或いは電気的な並行検出も捕集プレートチップによって行うことができ，該チップにおいては，捕集プレートのノズル出口の位置に適切な表面官能化及び／又は電気的接続部が提供される。
【００４４】
このインパクタは，呼気粒子をできるだけ効率的に捕集できるように設計される。このことは，呼気空気に存在する殆ど全ての粒子を所定の質量／サイズ間隔で分析目的で捕集することを意味する。粒子は，高度な化学分析に供するのに適切な濃縮形態で回収される。
【００４５】
本発明はまた，呼気粒子を捕集し分類するためのシステム１００を提供するものであって，
ａ．第一開口１１２と第二開口１１３を有するリザーバ１１４と，
ｂ．リザーバ１１４の第一開口１１２に接続された双方向マウスピース１１０と，
ｃ．入口１２と出口１４を有する慣性インパクタ１０と
を含み，
前記インパクタ１０は，粒子Ｐを含むガス流Ａが入口１２からインパクタ１０に入り，各段２０，３０，４０，５０…を順に通過して前記出口１４からインパクタ１０を出るように配置された複数の段２０，３０，４０，５０…を含み，
各段２０，３０，４０，５０…は，主ガス流Ａを捕集プレート３３，４３，５３…に向わせるオリフィス２２，３２，４２，５２…を有する仕切り２１，３１，４１，５１…によって隣接する段から分離され，各捕集プレート３３，４３，５３…の主面はガス流Ａの流れ方向と実質的に直角に配置されており，慣性インパクタの入口１２はリザーバ１１４の第一開口１１２に接続されている。
【００４６】
捕集システムは図２に示すように構築することができる。該システムの大部分はサーモスタット付きコンパートメント１２０内に置かれる。呼気粒子の捕集対象である個体は，双方向マウスピース１１０を通して室内の空気を吸う。吸うときに吸気Ａは，マウスピースの前に置かれた高効率粒子フィルタ１２５を通過する。
【００４７】
マウスピース１１０は，呼気エアロゾルのサイズ分布が水蒸気の蒸発，凝結のどちらによっても変化しないよう，或る温度に維持される。呼気空気Ａはマウスピース１１０を通り，エアロゾルサイズ分布を維持する目的で，サーモスタット付きコンパートメント１２０に置かれたシステムに入る。このコンパートメントには，呼気空気のためのリザーバ１１４が設けられている。更に，粒子カウンタ１１６が，計数と粒子サイズ測定のためにリザーバ１１４の第一開口１１２に接続されている。粒子Ｐを捕集するための慣性インパクタ１０もまたリザーバの第一開口１１２に接続されている。
【００４８】
インパクタ１０を通る流れは，典型的にはサーモスタット付きコンパートメントの外部に置かれたポンプ１１５によって維持される。図２にはまた，排気１３０と，粒子を含まない加湿空気１３５も示されている。
【００４９】
粒子カウンタ１１６は，数−サイズ分布の測定を可能にするものであって，付加的な重要情報を提供する。ここで用いられる粒子カウンタは，Grimm1.108光学粒子カウンタ（グリム・エアロゾル・テクニーク（Grimm Aerosol Technik），アインリング，ドイツ）であって，０．３〜２０マイクロメーターの１５サイズ間隔で粒子を計数しサイズ分けすることができる。この装置は，測定されたエアロゾルの数−サイズ分布，又は測定された数−サイズ分布から計算される質量分布を提供することができる。この装置においては，粒子を含んだ空気は，一時に一個の粒子だけに光が当てられるよう，輪郭が明確で強く照明された小さな立体領域を通される。照明された粒子は散乱光パルスを生じ，その強度が測定される。散乱光の強度は粒子サイズに依存するので，気流中の粒子を計数し，サイズ分けすることができる。
【００５０】
リザーバ１１４はバッファとして働き，呼気空気の流れがインパクタ１０と粒子カウンタ１１６の流れの合算より大きいとき，そこに呼気空気が蓄えられる。リザーバ１１４は，呼気が無いときには空気をインパクタ１０と粒子カウンタ１１６に供給する。粒子を含まない加湿空気がリザーバ１１４の第二開口１１３に添加され，常に正の排気流が存在するようにされる。流れはリザーバ１１４の排気末端に設けられた流量計１１９で測定される。リアルタイムで流れをグラフィック表示することで，被験体は，指示どおりに呼吸の頻度や強さを制御することが可能になる。
【００５１】
試料は次のようにして採取される。尚，インパクタには清潔な捕集プレートが搭載されていること，及び本システム，特にインパクタは，所望の温度に達していることが前提である。まず，流量計をゼロ点に調整し，流れを正しく測定できるようにし，次いで加湿清浄空気流を所定の値に設定して，測定の間中，システムから正の流れが維持されるようにする。次にインパクタの流れを清浄空気流の値より低い値に設定する。この手続きの間，本システムには粒子を含有しない清浄空気が供給されているため，プレートには一切，付着物が捕集されることはない。次いで光学粒子カウンタが始動し，例えばシステムの漏出を示唆する偽の粒子が存在しないことをチェックする。次にシステムへの呼気が開始され，粒子カウンタは連続的に試料を取り込んで，６秒ごとにサイズ分布を出力し，一方，インパクタは後の分析のために試料を捕集する。必要な量の試料が得られたら捕集を終了し，試料採取の時刻と呼気量が記録される。インパクタを通る流れが止められ，インパクタは測定システムからはずされて，搭載されていたプレートが回収される。
【００５２】
本システムの２種のコンポーネントが「接続」されているので，空気と呼気粒子は両コンポーネント間を流れることができると理解されるべきである。通常，接続は管によってなされ，これにはガス／粒子の流れを方向付けるために適切な交差部やバルブ又はシールが設けられる。
【００５３】
本システムで可能となることとして，様々なフラクションにおける様々な吐出速度での粒子形成の定量化がある。これは，例えば喘息等での乱流を検出する非常に簡単な方法であり，疾病のマーカーとして利用できるであろう。
【００５４】
分析
捕集プレート２３，３３，４３，５３及びこれらに捕集された粒子Ｐはインパクタ１０から取り出され，粒子の化学物質含量が測定される。粒子Ｐの化学物質含量は，被験体の医学的状態（「医学的状態」という表題で後出のセクションに記述される）に関する知見を提供する。
【００５５】
一分析戦略では，粒子は，まだ捕集プレート上にあるうちに分析される。これは，粒子内に存在する特定の物質に関する補足的情報を提供する，次のような化学分析技法と共に行われる。飛行時間二次イオン質量分析法（ＴＯＦ−ＳＩＭＳ）は，質量範囲が１０００ｕまでの物質，特に，疾病の種々状態においてそのプロファイルが変化する各種タイプの脂質の分析に特に有用である。マトリックス支援レーザ遊離イオン化質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）は，炎症反応に関連する，ペプチドや更に大きいマクロ分子（各種蛋白質）を分析するために有用な方法である。蛋白質のＭＡＬＤＩ−ＭＳ同定は，蛋白質分解酵素，好ましくはトリプシンを適用することで更に容易に行えるが，これは蛋白質をセグメントに分解して決定し，それを一般に利用可能なデータベースと比較することで，確定的に蛋白質を同定できる。特異的蛋白質やその他の生体分子（例えばＤＮＡ）の分析も，標識抗体に基づく各種生化学アッセイやプロトコルを，捕集プレートに直接適用することで実施できる。走査電子顕微鏡法（ＳＥＭ）も，捕集された粒子凝集体の形状を分析するために利用できる。そのような分析は，非生物由来の粒子，例えば，被験体が粒子に曝露された場合の粒子を明らかにすることができる。
【００５６】
別の分析戦略では，捕集された物質を捕集プレートから取り除く（洗い落とす）。捕集粒子を含む洗液は各種化学又は生化学分析技法で更に処理される。最も単純な分析では，捕集された粒子中の有機物の全量をＴＯＣ（全有機物含有量）分析器で分析することができる。各種元素分析器を用いて，捕集された物質中の炭素，窒素，酸素，硫黄の量を得ることができるが，これには更に様々な種類の生体分子（脂質，炭水化物，蛋白質）の相対量が反映される。微量の無機元素，特に金属は，誘導結合型プラズマ質量分析法（ＩＣＰ−ＭＳ）で決定できる。そのような分析は，非生物学的起源の物質についての情報を提供するものであるのみならず，例えば鉄応答性蛋白（ＩＲＰ）等，特定の疾病状態において重要な金属含有生体分子（蛋白質）を検出するためにも利用可能である。ＣｕとＺｎは，肺腫瘍組織中で増加することも示されており，両者とも気道における炎症反応を調節するのに重要であると思われる。生体分子に特異的なその他の分析として，ガスクロマトグラフィー質量分析（ＧＣ−ＭＳ），液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ），及び直接ＭＡＬＤＩ−ＭＳの３種の技法で補完的な情報を得ることができる。ＧＣ−ＭＳは約５００ｕまでの質量範囲の半揮発性物質について，情報を提供するであろう。ＬＣ−ＭＳは脂質，ペプチド，蛋白質等，各種生体分子及びそれらの改変物について定性的及び定量的な情報を与えるであろう。最後に，直接ＭＡＬＤＩ−ＭＳを利用することで，数万ｕまでの生体分子のパターンを検出でき，脂質と蛋白質の両プロファイルについて一回で検出及び同定することが可能である。捕集され洗浄された物質もまた生化学的分析，特に対象特異蛋白質のための標識抗体や遺伝子材料分析のための定量ＰＣＲ分析に付することができる。
【００５７】
試料の取扱いを容易にすると共に本方法の感度を上げる幾つかの技法がある。本方法において既に見られた一利点は，表面脱離質量分析技法を利用してインパクタから取り出した捕集プレートを直接分析できるという可能性である。更なる利点は，例えば上述の酵素を使う，すなわち，いわゆるオンプレート消化の場合のように，試料の浄化及び／又は改変を直接プレート上で行えることである。また，捕集プレート上に異なる種類の表面，すなわち，粒子試料中の特定の分析物に対する直接結合又は改変のためにレセプター分子或いは酵素で共有結合的に改変された表面を作り出すことも可能である。これらの方法は周知であり，有機化学実験室で容易に利用できる。その結果，分析プロセスを大幅にスピードアップでき，大きな患者グループの調査にも実行性をより向上できる。
【００５８】
質量分析法により新しいバイオマーカーが同定できれば，表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）及び蛍光分光法等の新しい分析機器を導入して，分析を個体数の大きいグループへ簡単にスケールアップすることが出来る。これら２方法は専門家でない者によってもより簡単に利用できるので，本粒子捕集方法を病院やヘルスケアセンターでより利用しやすくなり，また，大きな患者グループでの研究をより時間効率よくできる。捕集プレートをインパクタから直接使用できることは非常に有利である。
【００５９】
上述した様々な質量分析（ＭＳ）技法は，捕集された粒子の組成について包括的情報を与えるという顕著な利点を有する。このことは，異なるＭＳ技法を組み合わせることで，予め定められていない方法で，大半の生体分子を検出できることを意味する。これは，予め選択され標識された物質しか検出できない他の多くの生化学分析技法と対照的である。様々な疾病に対する新しい特異的バイオマーカーを同定するに当たって，本方法とＭＳ技法との適合性は重要な利点である。
【００６０】
粒子の分析は参照用化学分析と比較され，参照用化学分析からの乖離性及び／又は類似性が特定される。これを用いて被験体の一以上の医学的状態を決定できる。参照用化学分析は，或る医学的状態を有する被験体（その場合，化学分析における類似性が訴求される）のもの，或る医学的状態を有しない被験体のもの（その場合，化学分析における乖離性が求められる），或いは被験体自身のものであるが異なる状況で得たもの（例えば，後の時点でのもの，又は一定の治療コースや運動コースを経た後のもの）であることができる。
【００６１】
粒子分布プロファイルは，各捕集プレート上の粒子を分類することによって決定できる。得られた粒子分布プロファイルを利用して被験体における一以上の医学的状態を決定することができる。もし診断目的に利用するのであれば，被験体が呼気で吐出した粒子の粒子分布プロファイルを参照用粒子分布プロファイルと比較する。被験体粒子分布プロファイルと参照用粒子分布プロファイルとの間の類似性及び／又は乖離性に注目し，被験体粒子分布プロファイルと参照用粒子分布プロファイルとの間の乖離性又は類似性を被験体における一以上の医学的状態に帰属させる。
【００６２】
参照用粒子分布プロファイルは，所定の医学的状態を有しない被験体からの粒子分布プロファイルであり得る。この場合，被験体粒子分布プロファイルと参照用粒子分布プロファイルとの間の乖離性に注目して医学的状態を提示し得る。
【００６３】
或いは，参照用粒子分布プロファイルを所定の医学的状態を有する被験体から得たものとすることもできる。その場合，被験体の粒子分布プロファイルとその患者との間で類似性を指示することができ，これにより被験体における前記所定の医学的状態の診断を下すことが出来る。
【００６４】
参照用粒子分布プロファイルはまた，被験体自身のものであるが異なる状況で得たもの（例えば，後の時点でのもの，又は一定の治療コースや運動コースを経た後のもの）であることができる。これにより本発明方法による医学的状態のモニタリングが可能となる。
【００６５】
医学的状態
本発明によって決定又はモニタリングが可能な医学的状態として次のものが挙げられる。
− 気管支喘息
− 嚢胞性繊維症
− 慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）
− 肺癌
− 間質性肺疾患
− サルコイドーシス
− 全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）等の全身性疾患における肺症状
− 肺感染症
・肺炎
・細菌コロニー形成
・ウイルス感染
【００６６】
次のような全身性医学的状態もまたモニタリングできるであろう。
− 心不全（例えばエンドセリン−１による）
− 高コレステロール血症（コレステロールが呼気粒子中に見出される）
− 糖尿病（インスリンが粒子中に見出される）
− メタボリック症候群
− 疾患や曝露に対する高い遺伝的感受性
【００６７】
粒子は特定の医学的状態の指標となるバイオマーカーを含むか，或いはこのようなバイオマーカーから構成されるものであり得る。本発明に係る方法はそのようなバイオマーカーの検出を可能にする。
【００６８】
呼気粒子は，気道上皮全体を覆う気道被覆液（ＲＴＬＦ）に由来すると考えられており（Pediatr.Allergy Immunol,15(1):4-19），これは多量の抗酸化物質とサーファクタントを含有している。尚，ＲＴＬＦの組成は気道の近位から遠位へと変化するものである点にも注意が必要である。
【００６９】
ＲＴＬＦに豊富に存在する一物質として，クララ細胞によって産生されるクララ細胞蛋白質１６（ＣＣ１６）があり，これは抗炎症蛋白質としても機能する。今日までＣＣ１６はＢＡＬと血液でのみ測定されてきた。これまで注目されてきたその他の物質としては，サーファクタント蛋白質Ａ−Ｄがあるが，これもこれまでは気管支肺胞洗浄，すなわちＢＡＬでしか測定されていなかった。
【００７０】
特に注目されるのは，粒子中の抗酸化物質の濃度の検出とモニタリングである。バイオマーカーとしての可能性を有するものとして，気道に豊富に存在するグルタチオンがある。呼気液滴中のものでバイオマーカーとしての可能性を有するその他の抗酸化物質としては，マトリックス支援レーザ遊離／イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）で検出し得るであろう，金属結合蛋白質であるセルロプラスミンやトランスフェリンが挙げられる。可能性を有するその他の抗酸化物質で低分子量のものとして，例えばアスコルビン酸塩，αトコフェロール，尿酸塩，Ｌ−システインもまた各種質量分析法で検出される可能性があり，これらの分子もまた酸化ストレスに対するバイオマーカーである。
【００７１】
抗酸化物質として酸化ストレスに直接関与する，バイオマーカーとしての可能性のあるものとしては，グルタチオン，セルロプラスミン，トランスフェリン，アスコルビン酸塩，αトコフェロール，尿酸塩，Ｌ−システインが挙げられる。とりわけグルタチオンに注目されるが，これは気道に非常に豊富に存在するためである。これら抗酸化物質を検出する分析方法としては質量分析が利用されるであろう。
【００７２】
ａ．脂質
ＲＴＬＦにおけるリン脂質のプロファイルは，疾病のバイオマーカーとして利用できる。リン脂質組成（ＰＣ）における変化は，急性呼吸困難症候群（ＡＲＤＳ），肺炎，嚢胞性繊維症，喘息等，殆どの気道疾患で見られる。喘息においてはＢＡＬでＰＣが減少したことに加え，アレルゲン攻撃後にＰＣ／ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）の関係の変化が認められた。
【００７３】
脂質の機能を変化させるニトロ化と酸化も呼吸器疾患における新しい研究領域である。
【００７４】
ＲＴＬＦ中のリン脂質と蛋白質とを含むサーファクタントは，先天性免疫系において重要な役割を担っていると考えられる。リン脂質は，プロスタグランディン，トロンボキサン，エオタキシン，リポキシン，レゾルビン等，先天性免疫において活躍する多様なサイトカインの前駆体である。サーファクタント蛋白質もまた先天性免疫において重要な役割を果たしていることが示されており，とりわけ，抗原提示細胞及び細胞死の制御に関与している。サーファクタントの代謝に関してはこれまで非常に限定的にしか知られていないが，呼吸器疾患の病因の理解に重要であると考えられる。
【００７５】
ＴＯＦ−ＳＩＭＳでシリコン捕集プレートの表面を分析することで，呼気粒子中に多岐に亘るリン脂質が存在することが判明した。粒子中に検出されたリン脂質は，ＢＡＬでの検討でＲＴＬＦ中に見出されたリン脂質と整合している。リン脂質の相対量もＢＡＬの場合と整合している。リン脂質の相対量もＢＡＬの場合と整合している。ＰＯ３−に対するＣＮ−＋ＣＮＯ−（恐らく主に蛋白質とペプチドから来ているフラグメント）の比は，喘息患者と嚢胞性繊維症の患者で上昇した。この比は気道疾患によって空間スペースに血漿蛋白質が漏出したことを反映しているものであろう。
【００７６】
ｂ．蛋白質とペプチド
気管支肺胞洗浄のプロテオーム解析によって，多くの蛋白質が試料に存在することが判明した。この解析は２Ｄゲルと質量分析を利用して行った。この蛋白質並びに機能が未判明の蛋白質は特に，免疫炎症プロセス，細胞増殖，酸化物質−抗酸化物質系やプロテアーゼ−抗プロテアーゼ系に関与する。例えば，アレルギー性の喘息患者についてＢＡＬのプロテオーム解析を行った。この研究では，１５９２の蛋白質が同定され，その内の１６０は対照群と比べ患者によって異なる発現を示した。最も多く存在した蛋白質は，恐らく血液空気関門からの拡散に由来していると思われる血漿蛋白質であった。血漿蛋白質の増加は恐らく滲出又は損傷によるものであろう。ＢＡＬ中に検出されたペプチドと蛋白質の内の幾種かは，呼気粒子中にも存在する可能性が高い。
【００７７】
気道疾患のバイオマーカーであるペプチドや蛋白質としては，エンドセリン−１，インターロイキン−４，インターフェロン−ｇ，サーファクタント蛋白質Ａ〜Ｄ，クララ細胞蛋白質１６等が挙げられる。これらの分子はＥＳＩ−ＭＳやＭＡＬＤＩ−ＭＳ，或いは各種イムノアッセイで検出できる。より多くのタイプのバイオマーカーが本発明によって見出される可能性は非常に高いと思われる。なぜなら粒子の捕集は，より少数の粒子しか捕集できない呼気凝縮液を利用するよりもずっと効率的であるからである。捕集された試料中の蛋白質をトリプシン等の蛋白質分解酵素で処理すると幾つかのペプチドフラグメントが得られるが，これらは特定の蛋白質のセットに特有のパターンを提供する。
【００７８】
蛋白質のリン酸化やグリコシル化等，翻訳後修飾を調べることもバイオマーカーの潜在的ターゲットである。誤ったリン酸化パターンは幾つかの疾病の一部として知られている。
【００７９】
気道における別の重要なバイオマーカーの範疇はムチン糖蛋白質で，これは気道を病原体や環境トキシンから守る粘膜毛様体の防御に寄与している。喘息やＣＯＰＤの患者，及び嚢胞性繊維症患者ではムチン糖蛋白質の過剰生産が見られる。糖蛋白質の分析には，グリコシル化パターンが変りやすいという理由から困難が伴うが，様々な呼吸器疾患に関与していることから，このグループの化合物を追及していくことは有意義である。糖蛋白質分析の一利点は，アフィニティークロマトグラフィーで簡単に糖蛋白の精製ができることである。更に，蛋白質のグリコシル化パターンに変化が観察されれば，疾病と関連し得るので，バイオマーカーとして考えられる。
【００８０】
ｃ．細胞材料と遺伝子発現
呼気粒子は遺伝子情報，特にＤＮＡとＲＮＡの情報を有する物質を含有する細胞や細胞構造体を含んでいる可能性がある。このような細胞材料は，細菌やウイルス，或いは気道の細胞に起因する。そのような材料の遺伝子発現解析を行えば，特定の疾病の症状に関する新たな情報を提供したり，特定の疾病の診断のための高特異性かつ高感度の手段として利用することができる。よって本方法は肺炎等，各種疾患における病原物質の特定やＣＯＰＤの悪化の把握に利用できるばかりでなく，例えば臨床的に問題となることの多い嚢胞性繊維症における緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）のコロニー形成の早期検出にも利用できる。
【００８１】
ｄ．金属
ＥＢＣにおいて，鉄やカドミウム，鉛，アルミニウム，銅等の金属への曝露を追跡することができる。金属は呼気粒子に結合してＥＢＣに移行している可能性が最も高い。このことは，空気汚染における，鉄，亜鉛，カドミウム，アルミニウム等の各種成分への曝露をモニタリングするために本方法を利用できる可能性を示唆している。周囲環境のナノ粒子における金属への曝露もまた呼吸器疾患の発症に関連している。
【００８２】
実施例
４人の健常者からの呼気粒子をシリカウェーハ上に捕集した。粒子の濃度を光学粒子カウンタ（Grimm 1.108）で記録した。粒子の発生を高めるために，強制的に呼気吐出を行わせた（鼻クリップを使用）。被験体は，各個人の１秒当りの最大強制呼気吐出量（maximal forced expired volume in one second;ＦＥＶ１）の８０％に相当する量の呼気吐出を繰り返して連続的に行えるように訓練した。目標とする流量から１０％のずれは許容範囲と考えた。第１日目の朝に１５分に亘って試料採取を行い，第２日目も同様に繰り返した。
【００８３】
シリカウェーハ上の呼気粒子の化学組成を飛行時間二次イオン質量分析法（ＴＯＦ−ＳＩＭＳ ＩＶ ＩＯＮＴＯＦ ＧｍｂＨ）を使用して分析した。２５ｋｅＶのＢｉ３＋一次イオンを，粒子のスポット近傍を中心として５００×５００μｍ２の領域に照射した。正及び負の二次イオンの質量スペクトルを，分解能が最大になるように最適化した装置によって記録した。装置のソフトウエアを使用し，全分析領域又は関心のある選択された領域のスペクトル並びに選択したイオンについての画像を，記録した生データファイルから抽出した。純粋な物質からの基準スペクトル，及び他の質量分析法による公表されたデータからの基準スペクトルと比較することによって，スペクトル中のピークを帰属させた。また，この帰属は，理論的な同位体パターンとの比較により制御した。識別されたピークの相対強度を，各スペクトルの総イオン強度に対して正常化して計算した。
【００８４】
図３は，一対照被験体からの粒子スポットの正（図３Ａ）及び負（図３Ｂ）のＴＯＦ−ＳＩＭＳスペクトルを示す。
【００８５】
図４は，一対照被験体からの呼気粒子による１個のスポットのＴＯＦ−ＳＩＭＳ画像である。
【００８６】
図５は，呼気粒子（０．５〜２．０μｍ）の濃度と時間の関係を示す。
【００８７】
図６は，健常者と喘息又は嚢胞性繊維症に罹患している被験体とに対して行ったパイロットスタディにおける（ＣＮ＋ＣＮＯ）／ＰＯ３−比を示す。
【００８８】
（表１）
呼気粒子のＴＯＦ−ＳＩＭＳスペクトルのピークのｍ／ｚ比の帰属
リン脂質の分子種をｘ：ａで表している（ｘは炭素数で，ａは二重結合の数）。
正イオン 負イオン
帰属 ｍ／ｚ 帰属 ｍ／ｚ
ホスホコリンイオン １８４ Ｃ１６：１ ２５３
コレステロール−ＯＨ ３６９ Ｃ１６：０ ２５５
ＰＣフラグメント ４７６ Ｃ１８：１ ２８１
ＰＣフラグメント ４７８ Ｃ１８：０ ２８３
ＰＣフラグメント ４９４ ＰＡ３２：１ ６４５
ＰＣフラグメント ５２２ ＰＡ３２：０ ６４７
ＰＣフラグメント ５２４ ＰＧ２８：１ ６６３
ＰＣフラグメント ６５０ ＰＧ２８：０ ６６５
ＰＣ２８：０＋Ｈ ６７８ ＰＧ３４：２ ６７１
ＰＣフラグメント ６８０ ＰＡ３４：１ ６７３
ＰＣ３０：０＋Ｈ ７０６ ＰＧ３２：０ ７２１
ＰＣ３２：１＋Ｈ ７３２ ＰＧ３４：１ ７４７
ＰＣ３２：０＋Ｈ ７３４ ＰＧ３６：２ ７７３
ＰＣ３４：１＋Ｈ ７６０ ＰＧ３６：１ ７７５
ＰＣ３４：０＋Ｈ ７６２ ＰＩ３４：２ ８３３
ＰＩ３４：１ ８３５
ＰＩ３６：２ ８６１
ＰＩ３６：１ ８６３
【００８９】
（表２）
１５分の試料採取期間での総呼気量と呼気粒子（０．５〜２．０μｍ）の平均濃度
被験体１ 被験体２ 被験体３ 被験体４
FEV1 4.1 FEV1 2.8 FEV1 3.2 FEV1 3.2
１日目 ２日目 １日目 ２日目 １日目 ２日目 １日目 ２日目
量（リットル）１５３ １２８ １７６ １８１ １４２ １４４ ２０１ １６６
粒子／リットル２１０ １２３ １４９ ５５ ９５６ ３４３ ２３９ １８０
【００９０】
全ての粒子サンプルはリン脂質からの強い信号を出した（図２，図４及び表１）。ホスファチジルコリン（ＰＣ）の様々な種が，正モードにおいてプロトン化した又はアルカリ金属でカチオン化した分子イオンとして検出され，ホスファチジルグリセロール（ＰＧ），ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）及びホスファチジン酸（ＰＡ）が負モードにおいて脱プロトン化したイオンとして検出された（表１）。リン脂質の組成は，呼気粒子は気道下部から生じている可能性が最も高いことを示す気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液での以前の発見における組成と一致していた。
【００９１】
実施例２
被験体は，各個人の１秒当りの最大強制呼気吐出量（ＦＥＶ１）の８０％に相当する量の呼気吐出を繰り返して連続的に行えるように訓練した。４人の健康なボランティア，４人の喘息患者，及び４人の嚢胞性繊維症患者の各々が強制呼気吐出を１０回行った。粒径が０．５〜２．０μｍの呼気粒子をシリカウェーハ上に捕集した。粒子の濃度を光学粒子カウンタを用いてリアルタイムで測定した。試料採取の前に，３分間のウォッシュアウトの間，粒子を含まない空気で呼吸した。シリカウェーハを飛行時間二次イオン質量分析法（ＴＯＦ−ＳＩＭＳ）を使用して分析した。粒子中に何種類かのリン脂質を検出した。すなわち，ホスファチジルコリン（ＰＣ），ホスファチジルグリセロール（ＰＧ），ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）及びホスファチジン酸（ＰＡ）を検出した。グループ間で幾つかの相違が観察された。ＰＣの信号の合計とＰＧの信号の合計との比は，対照と比較して，喘息患者と嚢胞性繊維症患者において上昇する傾向があった。また，対照と比べ，喘息患者と嚢胞性繊維症患者のサンプルでは，タンパク質とペプチド（ＣＮＯ−）の特徴として知られている信号がリン脂質に比べて増加した（図６）。
【００９２】
実施例３
被験体は強制呼気吐出を２０分間行った。粒径が０．５〜２．０μｍの呼気粒子をシリカウェーハ上に捕集した。ＤＮＡとＲＮＡに強く結合する蛍光試薬ＤＡＰＩ（４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）でシリカウェーハを染色した。呼気粒子が核酸を含むことを示す強い信号が粒子スポットで得られた。
【００９３】
実施例４
二人の被験体が１５０Ｌの空気を２回呼気吐出した（１回は粒子の捕集のためであり，１回は呼吸濃縮物の捕集のため）。ＥＬＩＺＡによるサーファクタント蛋白質Ａの分析の前に，呼気粒子をシリカウェーハから離脱させ，呼吸濃縮物を濃縮させた。呼気粒子中のサーファクタント蛋白質Ａ（ＳｐＡ）は，呼気で吐出された呼吸濃縮物のＳｐＡの６倍であり，１００μＬの血清中のＳｐＡの４倍であった。ＳｐＡの分析の結果，試験時においては各個人において高い再現性があることが分かった（異なる３時点で試験した二被験体についてはＣＶ５．４）。
【００９４】
開発した試料採取方法は，呼気空気中の新しいバイオマーカーの検出及び呼吸器疾患のモニタリングに対して高い可能性を有する。
【技術分野】
【０００１】
本発明は動物，特に哺乳類，好ましくはヒトの息の中に吐出される粒子に関する。当該粒子の性質と量は，一定の医学的状態についての指標となり得る。したがって，それらを捕集し，サイズや質量によって分類することで，一以上の医学的状態の診断に利用することができる。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの気道は日々，少なくとも７〜８立方メートルの空気を通しており，吸気中の各種粒子やガスを無毒化するための高度な生物学的システムが存在する。吸い込んだ物質に対する最初の防御線は，幾つかの重要な抗酸化系を有するものの中でも特に気道全体を覆う気道被覆液（ＲＴＬＦ）である。ＲＴＬＦの重要成分としては他にサーファクタントがあり，これは表面張力を低下させる一方，先天性免疫に関与する化合物を含むものである。
【０００３】
ＲＴＬＦの組成は気道の炎症状態によって異なることが示されている。ＲＴＬＦ中の抗酸化物質と吸い込んだ酸化物質との間のバランスが乱れると，酸化ストレスによって炎症プロセスが始まる。この炎症プロセスは非常に変化に富むものであるが，喘息から肺癌まで，殆ど呼吸器疾患の進行において共通する主要な初期事象である。
【０００４】
あらゆる気道疾患へと至らしめる病態生理学的プロセスは，これまでの所，完全には理解されていない。その理由の一つとして，これらのプロセスをヒトにおいてモニターすることが難しいということが挙げられる。例えば各種曝露状況の影響を評価するために利用できる方法は，肺機能や呼気一酸化窒素の測定，誘発採痰又は気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）の分析，又は気管支鏡検査からのバイオプシーに限られる。
【０００５】
これら既存の方法は，気管支鏡検査の場合のように侵襲的過ぎ，様々な曝露状況への感受性が非常に変わりやすいことにより，保証された大規模の研究には適応できない。その上，気管支鏡検査と誘発採痰のどちらも，とりわけ既存の心肺疾患や喘息を有する患者等，敏感な集団で一定のリスクを伴う。呼気中の一酸化窒素は多くの場合，単独でアレルギー性炎症を反映していることが伺われ，よって他の形態の気道疾患を調べる際には利用価値が限定されている。一方，肺機能検査は研究対象の患者にとってはむしろ無害といえるが，疾患の裏にあるメカニズムについては何ら情報を与えるものではない。
【０００６】
利用されているその他の方法としてはインビトロ検査があるが，ヒトの気道という複雑な環境への一般化が可能かどうかということになると，かなり限定されたものであると言わざるを得ない。同じことが多くの場合，動物での研究についても言える。すなわち，動物は，遺伝子レベルではヒトと同一性が高くても，動物とヒトでは各種遺伝子の発現は相当異なったものとなる。
【０００７】
最近，呼気凝縮液（ＥＢＣ）の採取という新しい方法が導入されている。これは，蒸気状の呼気水(exhaled water vapour)を低温で凝縮させたもので，揮発性，非揮発性の両化合物が共に同定されてきた。ＥＢＣ中に見出された非揮発性化合物は，気道内で形成された粒子に起因していると考えられている。これら粒子は息をしたり話や咳をしたりする際に呼吸器系で生成されるものと考えられ，それら粒子が感染性物質を伝搬させる媒体として働くのではないかという主な理由から，今日まで研究されてきた。これら粒子がどのようにして形成されるかについては未だにわかっていないが，考えられるメカニズムとして，気管支の断面積が大幅に減少している気道中央における呼気空気の乱流が挙げられる。第二の仮説は，気道が肺の縁部に開く際にＲＴＬＦから粒子が形成される，というものである。疾病においては，乱流の増大及び／又はＲＴＬＦ物性の変化によって粒子形成が亢進する。この一例が国際特許公開ＷＯ０２／０８２９７７号公報に記載されている。
【０００８】
呼気凝縮液（ＥＢＣ）の採取は，簡単には解決できない方法論上の困難を多く伴っている。例えば，水分で希釈されることで目的物質の濃度が非常に薄くなること，口腔由来の物質によってかなり汚染されてしまうこと，個人内の変動係数が高いこと，ＥＢＣ中に見出される非揮発物質の採取が非常に非効率的であること等である。
【０００９】
よって，呼吸器系における健康上好ましくない影響を検出しモニターすることができる，より優れた非侵襲的方法に対するニーズが存在する。ＥＢＣの分析における，方法論上の各種困難性を克服するための一方法としてこれまで試されなかったものに，呼気粒子の直接的な採取及び分析がある。この方法では捕集した粒子の量とサイズを決定できるので，気道の状態に関する具体的情報も得られる。
【００１０】
各種サイズの粒子フラクション分布の測定
呼気液滴（すなわち粒子）を検査する研究で発表されたものは極少数しかない。パピネニ（Papineni）とロゼンサル（Rosenthal）（Ｊ．エアロゾル Med 10(2):105-16）及びエドワーズ(Edwards)他（Proc.Natl.Acad.Sci.USA101(50):17383-8）は，ヒトにおける呼気粒子の濃度を多数測定し，被験体間で大きな差があるとはいえ，通常の室内空気中の濃度よりは一般に大幅に低い値であることを開示している。また，呼気粒子のサイズ分布に関する情報も示されている。液滴の主成分は水なので，粒子サイズは周辺空気中の相対湿度（ＲＨ）の変化に素早く呼応して変化するに相違ないと考えるのが妥当である。相対湿度の影響を調べるためにパピネニとロゼンサルが用いた手続きは，赤外ランプを利用して空気を暖めて相対湿度を変化させたものであるので疑問が残る。エドワーズ他は彼ら自身の研究においては相対湿度を重要視していない。粒子サイズは，液滴乾燥物の顕微鏡検査等の間接的方法やサイズ分解能の低い光散乱法によって求められたものである。よってこのような技術水準は，呼気エアロゾルのサイズ分布と濃度変化の更なる探求を保証するものである。
【００１１】
近年，ヒトにおけるエアロゾル形成への関心が高まりつつあるが，その主たる理由はエアロゾルが感染力を検出する能力を有する点にある。米国特許公開第２００５／００７３６８３号公報及びAnal.Chem.2005,77,4734-4741は，予め形成されたエアロゾル粒子を特定するためのリアルタイム検出方法及びシステムを開示している。そこに記載された方法は，正と負のマススペクトルをこれもまた開発される参照用スペクトルと比較することで感染性物質或いは「脅威物質(threat agents)」を含有するエアロゾルをオンラインで検出することを目的としたものである。この方法は診断目的或いはヒトの気道の状態をモニターする目的で開発されたものではなく，非常に低感度であるため，呼気粒子等の場合のように極低濃度で存在する物質の検出を可能にするものではない。
【００１２】
このように，気道を簡単にモニターするための方法が見出されていないのが現状である。気管支肺胞洗浄や採痰誘発等の侵襲的手続きは患者に害を与える可能性があるので頻回に試料採取できない。
【００１３】
発明の概要
呼気中のバイオマーカーの測定は非侵襲的であり，繰返し採取を可能とするので，病状進行や治療応答のモニタリングの他，疾病の早期発見に有用である。本技法は揮発性物質，中でも特に重要なアレルギー性喘息のマーカーとして利用される呼気ＮＯに関して成功を収めている。
【００１４】
非揮発性化合物は，気道被覆液に由来すると考えられるエアロゾル粒子によって運ばれる。このことは本発明者らの予備研究データでも確認されている。これら化合物は，気道における病態生理学的プロセスに関する基本的かつ具体的な情報を提供するであろう。呼気の中の内因性粒子に関する研究は殆どなされていない。気道での粒子形成のメカニズムと正確な場所はよく分かっておらず，粒子の化学組成についての具体的分析はこれまでなされていない。
【００１５】
呼気の中の粒子の捕集と分析のために新しい技法が開発された。被験体の医学的状態を決定するための本方法は，
ａ．当該被験体が呼気で吐出した粒子を捕集する工程と，
ｂ．これら粒子を質量又はサイズによって分類する工程と，
ｇ．前記粒子の化学物質含量(chemical content)を分析する工程と
を含み，これにより前記被験体の医学的状態を決定できるようにしたものである。
【００１６】
更に，本方法は次の工程：
ｃ．前記粒子を質量又はサイズによって分類し，前記粒子の粒子分布プロファイルを得る工程と，
ｄ．前記被験体が呼気で吐出した粒子の粒子分布プロファイルを参照用粒子分布プロファイルと比較する工程と，
ｅ．被験体の粒子分布プロファイルと参照用粒子分布プロファイルとの間の類似性及び／又は乖離性を指示する工程と，
ｆ．被験体の粒子分布プロファイルと参照用粒子分布プロファイルの間との乖離性又は類似性を，被験体の一以上の医学的状態に帰属させる工程と，選択的に，
ｇ．前記粒子の化学物質含量を分析する工程と
を含むこともできる。
【００１７】
医学的状態は，気管支喘息，嚢胞性繊維症，慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ），間質性肺疾患，サルコイドーシス，全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）等の全身性疾患における肺症状，肺炎等の肺感染症，細菌コロニー形成又はウイルス感染からなる群から選択される。
【００１８】
参照用粒子分布プロファイルは所定の医学的状態を有しない被験体から得ることができ，その場合，工程ｅは被験体の粒子分布プロファイルと参照用粒子分布プロファイルとの間の乖離性を指示することを含む。或いは，参照用粒子分布プロファイルを，所定の医学的状態を有する患者から得ることもでき，その場合，工程ｅは被験体と患者の粒子分布プロファイルの類似性を指示することを含む。このようにして，被験体における前記所定の医学的状態の診断を下すことができる。
【００１９】
本発明はまた，呼気息の粒子の粒子分布プロファイルを提供する方法を提供するものであって，前記方法は，
ａ．被験体が呼気で吐出した粒子を捕集する工程と，
ｂ．前記粒子をサイズ又は質量によって分類して前記粒子の粒子分布プロファイルを得る工程と
を含む。
【００２０】
いずれの方法においても，粒子は慣性インパクタを利用して質量によって分類するか，粒子カウンタを利用してサイズによって分類することができる。
【００２１】
インパクタは好適には入口と出口を有し，粒子Ｐを含むガス流Ａが，前記入口からインパクタに入り，各段を順に通過して前記出口からインパクタを出るように配置された複数の段を含み，各段は，ガス流Ａを捕集プレートに向かわせるオリフィスを有する仕切りによって隣接する段から分離され，各捕集プレートの主面はガス流Ａの流れ方向と実質的に直角に配置されており，これによって，呼気粒子はガス流Ａ中にあって前記慣性インパクタを通過するが，その際，主ガス流Ａを各段の各捕集プレートに順に向かわせるように，また，第一の段に設けられた少なくとも第一の捕集プレートが第一の質量を有する粒子を捕集し，第二の段に設けられた少なくとも第二の捕集プレートが第二の質量を有する粒子を捕集するように，呼気粒子は前記慣性インパクタを通過する。
【００２２】
サイズ又は質量によって分類された後に粒子は分析される。それらは飛行時間型二次イオン質量分析法（ＴＯＦ−ＳＩＭＳ），マトリックス支援レーザ脱離イオン化質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ），標識抗体に基づく生化学アッセイやプロトコル，定量ＰＣＲ分析，走査電子顕微鏡法（ＳＥＭ），ガスクロマトグラフィー質量分析（ＧＣ−ＭＳ），液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ），表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ），蛍光分光法，ＴＯＣ（全有機物含有量）分析，元素分析，及び誘導結合プラズマ質量分析法（ＩＣＰ−ＭＳ）からなる群から選択される少なくとも一種の分析技法によって分析され，その際，捕集プレートの洗浄を最初に行っても行わなくてもよい。
【００２３】
本発明はまた，呼気粒子を捕集し分類するシステムにも関し，このシステムは，
ａ．第一開口と第二開口を有するリザーバと，
ｂ．リザーバの第一開口に接続された双方向マウスピースと，
ｃ．入口と出口を有するインパクタと
を含み，
前記インパクタは，粒子Ｐを含むガス流Ａが，前記入口からインパクタに入り，各段を順に通過して前記出口からインパクタを出るように配置された複数の段を含み，ここにおいて各段は，ガス流Ａを捕集プレートに向かわせるオリフィスを有する仕切りによって隣接する段から分離され，各捕集プレートの主面はガス流Ａの流れ方向と実質的に直角に配置されており，慣性インパクタの入口はリザーバの第一開口に接続されている。
【００２４】
本発明による呼気粒子の測定と分析は次の要求を満たすものである。
・ 非侵襲
・ ヒトにおいて繰返し測定が可能
・ 抗酸化系，蛋白発現，脂質パターンの変化，並びに，粒子サイズ及び濃度の相違を含む，肺における様々な病態生理学的プロセスのキネティクスを追従
・ 下記ａ），ｂ）の診断及びモニタリングのための新規のバイオマーカーを非侵襲的に特定するための基盤
ａ）次のような呼吸器疾患，すなわち
− 喘息
− 慢性閉塞性肺疾患
− 間質性肺疾患
− 肺癌
− 呼吸器感染症
− ＳＬＥ，強皮症及び関節リウマチ等の全身性疾患における肺症状の関与（Pulmonary engagement）
ｂ）次のような全身性疾患システム，すなわち
− 心血管疾病
− 糖尿病
− メタボリック症候群
− 高コレステロール血症
・ 挿管患者のモニタリング
・ 曝露のモニタリング
・ 薬物治療のための新規のターゲットを特定すること
・ ある種の曝露や疾患に対し高い遺伝的感受性を有する個体を特定すること。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】本発明に係る慣性インパクタを示す。
【図２】呼気粒子捕集のためのシステムを示す。
【図３】一対照被験体からの粒子スポットについての正（図３Ａ）と負（図３Ｂ）のＴＯＦ−ＳＩＭＳスペクトルを示す。
【図４】一対照被験体から得た呼気粒子の一スポットのＴＯＦ−ＳＩＭＳ像である。
【図５】呼気粒子（０．５〜２．０μｍ）の濃度と時間の関係を示す。
【図６】健康な被験体と喘息又は嚢胞性繊維症を有する被験体について行ったパイロットスタディで得た比（ＣＮ＋ＣＮＯ）／ＰＯ３−である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明の第一の実施態様は，被験体の医学的状態を決定する方法に関する。「決定する」という語は最も広義に，すなわち，ある医学的状態の存在（定性）及び／又は程度（定量）の評価と理解されるべきである。更に「決定する」とは，被験体が有する所定の医学的状態に至らしめる可能性のある何らかの素因を決定することをも言う。
【００２７】
「医学的状態」という語は，疾病及び障害に限定されたものと理解されるべきではない。健常者の例えば次のような医学的状態を非診断的方法によって調べる場合も対象とされ得る。
− 投薬や薬物（例：ドーピングテスト）の影響下に置かれている可能性のある，或いは，化学物質（例：汚染物質や職業上の危険物質）に曝されている被験体，
− 肉体的活動又は健康プログラム（例：被験体の体調や健康を決定するもの）に参加している被験体，
− 一定の疾病又は障害を発症させる疾病素因を有する可能性を持ち得る健常者，
− 特定の疾病若しくは障害を発症させる又は特定の曝露に対する低い耐性をもたらす遺伝的感受性を有する可能性を持ち得る健常者。
【００２８】
本発明の方法を適用し得る被験体は動物，特に哺乳類，好ましくはヒトである。本発明は以下，主としてヒトについて記載する。
【００２９】
本発明の第二の実施態様は，呼気中の粒子の粒子分布プロファイルを得るための方法を提供するものである。
【００３０】
本発明の上記両方法において，その最初の工程は，被験体に呼気吐出された粒子を捕集することを含む。一回の呼気で十分な数の粒子が提供されるかもしれないが，通常は呼気を繰り返して粒子を捕集する。ヒトの医学的状態の診断には，例えば，単一回の呼気は数十分迄（例：１秒〜１００分，例えば，１秒〜５０分，５秒〜２０分，或いは１０秒〜５分等）の時間に亘り吸気／呼気を連続的に行うことで粒子を捕集することができる。
【００３１】
呼気パターンを変化させることで，気道の様々な部位を代表する粒子を捕集することもできる。気道が狭くなると，強制的呼気は乱流を増大させ，したがって，粒子の生成は通常の呼吸時と比較すると，気道中央付近で増える。尚，気道の最遠位部からの気道開口でより多くの粒子が形成されることが推測される。
【００３２】
捕集後，粒子は質量又はサイズによって分類される。粒子カウンタを利用して個々の粒子をカウントすることで粒子の数−サイズ分布を得ることもできる。質量分布は粒子が球状であることと或る密度を有することを仮定して計算できる。その後，捕集された非揮発性物質についての高度な化学分析を行うことができる（下述）。
【００３３】
質量又はサイズによって粒子を分類することで前記粒子の粒子分布プロファイルも提供することができる。粒子分布プロファイルは，特定の質量又はサイズ（或いは質量又はサイズの範囲）を有する粒子がどれだけ呼気中に存在するかについての測定値であって，被験体の医学的状態を決定するために利用することもできる。この文脈において粒子という語は，固体，液体及び液体でコーティングされた固体物体を意味し，これらは気体（通常は空気であるが必ずしも空気とは限らない）中に浮遊していることが多い。物体のサイズは通常０．００５マイクロメーターより大きいが必ずしもこれに限られるものではなく，また通常１５マイクロメーターより小さいが必ずしもこれに限られるものではない。サイズという語は空力学的直径又は電気移動度粒径を意味するが，空力学的直径が適切である。
【００３４】
図１は呼気粒子（図１中，Ｐで示す）を捕集するのに用いる慣性インパクタ１０である。インパクタ１０は，ガスと呼気粒子がそこを通って該インパクタ１０に入る入口１２と，ガスと呼気粒子がそこを通って該インパクタ１０から出る出口１４とを有する容器である。図１のインパクタ１０は，入口１２と出口１４を円筒の対向する円形面に備えた円筒状のものとして示されているが，入口と出口１２，１４の形状や配置については他の態様も可能である。
【００３５】
インパクタ１０は複数の段２０，３０，４０，５０を含む。図１は４段の段２０，３０，４０，５０を示しているが，２〜１５段を有するインパクタは公知である。粒子Ｐを含む主ガス流Ａは入口１２からインパクタ１０に入り，各段２０，３０，４０，５０を順に通過して出口１４からインパクタ１０を出る。主ガス流Ａは，被験体により呼気吐出された空気と粒子を含む。流れはインパクタの出口に接続されたポンプにより生じる。本発明においては通常，呼気空気と粒子が被験体から出てインパクタに入るまで，何らの変化を及ぼす操作をこれらに対して行わない。
【００３６】
各段２０，３０，４０，５０は，隣接する段と仕切り２１，３１，４１，５１によって分離されている。各仕切りは少なくとも一個のオリフィス２２，３２，４２，５２（実地では，各仕切りには複数のオリフィスが存在する）を有し，これによってガス流Ａを捕集プレート３３，４３，５３に向わせる。各捕集プレート３３，４３，５３の主面は，ガス流Ａの流れの方向と実質的に直角に配置されている。
【００３７】
用いられる捕集プレート３３，４３，５３は厚さ約１ｍｍ，一辺１０〜１２ｍｍの矩形である。プレートは，ノズルを通る空気流の出口側で，基板ホルダの所定位置に両面テープで保持される。プレートは，分析を確実に行える点で好ましいため，元素シリコンで作製される。微量の不純物でも粒子の分析を妨げるため，プレートは高度に清潔でなければならない。シリコンプレートの浄化は各種方法によって行うことができるが，有機溶媒中での超音波洗浄の後にＵＶ−オゾン処理を行う方法や，１〜１０％の硝酸又は過酸化水素に浸漬する方法が好ましい。
【００３８】
洗浄後，捕集プレート表面を調製する際，捕集及びその後の化学分析に関して該表面を更に最適化することができる。捕集プレートの親水性やその他の表面化学特性を変化させることで粒子と上記表面の相互作用を好ましく制御することが出来る。好ましくは捕集プレートの全表面を改変する。疎水性の捕集表面は，親水性表面に比べ，脂質分子の炭化水素鎖等の疎水性部分とより強力に結合する。通常は親水性であるシリコン表面は，メチルシラン等の疎水性物質の薄層でコーティングしたり，シリコン基板を金でコーティングしてからメチル末端チオールの単層を金コーティングの上に適用したりすることで疎水性にすることができる。同様に，捕集表面は，一定の分子に特異結合するようにすることもできる。捕集プレート表面を特定の蛋白質に対する抗体でコーティングすることにより，この特定の蛋白質を該プレート表面に結合させることができる。適切な試薬を用いることで，分析物の結合から色変化や蛍光発光を起こすことができ，これらは原位置で（in situ），かつ，リアルタイムで検出できる。原位置での検出は，分析物が捕集プレート表面に結合することで生じる電流やキャパシタンスの変化を電気的に測定することでも可能である。この場合には，捕集プレートもまた，そのような測定を可能にするのに必要な電気的接続部を有する。インパクタは必要な電気的接続部を含むことができ，これにより捕集プレートと適切に接続できる。
【００３９】
慣性を有する粒子は，気流が第一捕集プレート３３の回りで偏向された場合に該気流に追従できないので，捕集プレート３３に衝突し，一方，慣性の小さい粒子は次の段４０へと進む。粒子の慣性はその質量に依存し，それはまたサイズに依存するということでもある。このようにして，粒子を質量又はサイズで分別することが可能である。
【００４０】
このように，オリフィスの数，直径，各段におけるオリフィスから捕集プレートまでの距離を選択することで，質量又はサイズによるエアロゾル内の粒子の分別が達成できる。高慣性の粒子（すなわち大きな質量／サイズ）は初めの方の段で分離され，一方，低慣性の粒子（すなわち小さな質量／サイズ）は後の方の段に衝突する。オリフィスの形状を選択することにより，化学分析を行うのに好適な形となるよう，捕集物質の濃度を上げることができる。捕集プレート上に捕集した物質の濃度は，呼気空気や息の濃縮物に比べ，非常に高い。
【００４１】
この場合，改変した３段のDekati PM10を用いた。改変は，第三段のノズル数を１／２に減らしたこととインパクタの設計流量を１．５倍に増加させることであった。
【００４２】
改変前のインパクタは毎分１０リットルのものであるが，毎分１５リットルの流量で操作した。最終段の２０のオリフィスは１０に減らし，これにより各ノズルのガス流速を２倍にした。５０％カットオフサイズ（すなわち，そのサイズの粒子の数の半分が捕集され，残る半分は捕集されないで通過する。これは階段状の捕集特性を示さず「Ｓ字状」特性を示す）は前記三段のそれぞれについて各７，１．５，０．５μｍであった。
【００４３】
上述のように，捕集プレートの表面官能化を縮小して各ノズルで異なる官能化を達成することができ，その結果様々な分析物を最適に並行捕集することが容易になる。同様に，特定物質の原位置での光学的或いは電気的な並行検出も捕集プレートチップによって行うことができ，該チップにおいては，捕集プレートのノズル出口の位置に適切な表面官能化及び／又は電気的接続部が提供される。
【００４４】
このインパクタは，呼気粒子をできるだけ効率的に捕集できるように設計される。このことは，呼気空気に存在する殆ど全ての粒子を所定の質量／サイズ間隔で分析目的で捕集することを意味する。粒子は，高度な化学分析に供するのに適切な濃縮形態で回収される。
【００４５】
本発明はまた，呼気粒子を捕集し分類するためのシステム１００を提供するものであって，
ａ．第一開口１１２と第二開口１１３を有するリザーバ１１４と，
ｂ．リザーバ１１４の第一開口１１２に接続された双方向マウスピース１１０と，
ｃ．入口１２と出口１４を有する慣性インパクタ１０と
を含み，
前記インパクタ１０は，粒子Ｐを含むガス流Ａが入口１２からインパクタ１０に入り，各段２０，３０，４０，５０…を順に通過して前記出口１４からインパクタ１０を出るように配置された複数の段２０，３０，４０，５０…を含み，
各段２０，３０，４０，５０…は，主ガス流Ａを捕集プレート３３，４３，５３…に向わせるオリフィス２２，３２，４２，５２…を有する仕切り２１，３１，４１，５１…によって隣接する段から分離され，各捕集プレート３３，４３，５３…の主面はガス流Ａの流れ方向と実質的に直角に配置されており，慣性インパクタの入口１２はリザーバ１１４の第一開口１１２に接続されている。
【００４６】
捕集システムは図２に示すように構築することができる。該システムの大部分はサーモスタット付きコンパートメント１２０内に置かれる。呼気粒子の捕集対象である個体は，双方向マウスピース１１０を通して室内の空気を吸う。吸うときに吸気Ａは，マウスピースの前に置かれた高効率粒子フィルタ１２５を通過する。
【００４７】
マウスピース１１０は，呼気エアロゾルのサイズ分布が水蒸気の蒸発，凝結のどちらによっても変化しないよう，或る温度に維持される。呼気空気Ａはマウスピース１１０を通り，エアロゾルサイズ分布を維持する目的で，サーモスタット付きコンパートメント１２０に置かれたシステムに入る。このコンパートメントには，呼気空気のためのリザーバ１１４が設けられている。更に，粒子カウンタ１１６が，計数と粒子サイズ測定のためにリザーバ１１４の第一開口１１２に接続されている。粒子Ｐを捕集するための慣性インパクタ１０もまたリザーバの第一開口１１２に接続されている。
【００４８】
インパクタ１０を通る流れは，典型的にはサーモスタット付きコンパートメントの外部に置かれたポンプ１１５によって維持される。図２にはまた，排気１３０と，粒子を含まない加湿空気１３５も示されている。
【００４９】
粒子カウンタ１１６は，数−サイズ分布の測定を可能にするものであって，付加的な重要情報を提供する。ここで用いられる粒子カウンタは，Grimm1.108光学粒子カウンタ（グリム・エアロゾル・テクニーク（Grimm Aerosol Technik），アインリング，ドイツ）であって，０．３〜２０マイクロメーターの１５サイズ間隔で粒子を計数しサイズ分けすることができる。この装置は，測定されたエアロゾルの数−サイズ分布，又は測定された数−サイズ分布から計算される質量分布を提供することができる。この装置においては，粒子を含んだ空気は，一時に一個の粒子だけに光が当てられるよう，輪郭が明確で強く照明された小さな立体領域を通される。照明された粒子は散乱光パルスを生じ，その強度が測定される。散乱光の強度は粒子サイズに依存するので，気流中の粒子を計数し，サイズ分けすることができる。
【００５０】
リザーバ１１４はバッファとして働き，呼気空気の流れがインパクタ１０と粒子カウンタ１１６の流れの合算より大きいとき，そこに呼気空気が蓄えられる。リザーバ１１４は，呼気が無いときには空気をインパクタ１０と粒子カウンタ１１６に供給する。粒子を含まない加湿空気がリザーバ１１４の第二開口１１３に添加され，常に正の排気流が存在するようにされる。流れはリザーバ１１４の排気末端に設けられた流量計１１９で測定される。リアルタイムで流れをグラフィック表示することで，被験体は，指示どおりに呼吸の頻度や強さを制御することが可能になる。
【００５１】
試料は次のようにして採取される。尚，インパクタには清潔な捕集プレートが搭載されていること，及び本システム，特にインパクタは，所望の温度に達していることが前提である。まず，流量計をゼロ点に調整し，流れを正しく測定できるようにし，次いで加湿清浄空気流を所定の値に設定して，測定の間中，システムから正の流れが維持されるようにする。次にインパクタの流れを清浄空気流の値より低い値に設定する。この手続きの間，本システムには粒子を含有しない清浄空気が供給されているため，プレートには一切，付着物が捕集されることはない。次いで光学粒子カウンタが始動し，例えばシステムの漏出を示唆する偽の粒子が存在しないことをチェックする。次にシステムへの呼気が開始され，粒子カウンタは連続的に試料を取り込んで，６秒ごとにサイズ分布を出力し，一方，インパクタは後の分析のために試料を捕集する。必要な量の試料が得られたら捕集を終了し，試料採取の時刻と呼気量が記録される。インパクタを通る流れが止められ，インパクタは測定システムからはずされて，搭載されていたプレートが回収される。
【００５２】
本システムの２種のコンポーネントが「接続」されているので，空気と呼気粒子は両コンポーネント間を流れることができると理解されるべきである。通常，接続は管によってなされ，これにはガス／粒子の流れを方向付けるために適切な交差部やバルブ又はシールが設けられる。
【００５３】
本システムで可能となることとして，様々なフラクションにおける様々な吐出速度での粒子形成の定量化がある。これは，例えば喘息等での乱流を検出する非常に簡単な方法であり，疾病のマーカーとして利用できるであろう。
【００５４】
分析
捕集プレート２３，３３，４３，５３及びこれらに捕集された粒子Ｐはインパクタ１０から取り出され，粒子の化学物質含量が測定される。粒子Ｐの化学物質含量は，被験体の医学的状態（「医学的状態」という表題で後出のセクションに記述される）に関する知見を提供する。
【００５５】
一分析戦略では，粒子は，まだ捕集プレート上にあるうちに分析される。これは，粒子内に存在する特定の物質に関する補足的情報を提供する，次のような化学分析技法と共に行われる。飛行時間二次イオン質量分析法（ＴＯＦ−ＳＩＭＳ）は，質量範囲が１０００ｕまでの物質，特に，疾病の種々状態においてそのプロファイルが変化する各種タイプの脂質の分析に特に有用である。マトリックス支援レーザ遊離イオン化質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）は，炎症反応に関連する，ペプチドや更に大きいマクロ分子（各種蛋白質）を分析するために有用な方法である。蛋白質のＭＡＬＤＩ−ＭＳ同定は，蛋白質分解酵素，好ましくはトリプシンを適用することで更に容易に行えるが，これは蛋白質をセグメントに分解して決定し，それを一般に利用可能なデータベースと比較することで，確定的に蛋白質を同定できる。特異的蛋白質やその他の生体分子（例えばＤＮＡ）の分析も，標識抗体に基づく各種生化学アッセイやプロトコルを，捕集プレートに直接適用することで実施できる。走査電子顕微鏡法（ＳＥＭ）も，捕集された粒子凝集体の形状を分析するために利用できる。そのような分析は，非生物由来の粒子，例えば，被験体が粒子に曝露された場合の粒子を明らかにすることができる。
【００５６】
別の分析戦略では，捕集された物質を捕集プレートから取り除く（洗い落とす）。捕集粒子を含む洗液は各種化学又は生化学分析技法で更に処理される。最も単純な分析では，捕集された粒子中の有機物の全量をＴＯＣ（全有機物含有量）分析器で分析することができる。各種元素分析器を用いて，捕集された物質中の炭素，窒素，酸素，硫黄の量を得ることができるが，これには更に様々な種類の生体分子（脂質，炭水化物，蛋白質）の相対量が反映される。微量の無機元素，特に金属は，誘導結合型プラズマ質量分析法（ＩＣＰ−ＭＳ）で決定できる。そのような分析は，非生物学的起源の物質についての情報を提供するものであるのみならず，例えば鉄応答性蛋白（ＩＲＰ）等，特定の疾病状態において重要な金属含有生体分子（蛋白質）を検出するためにも利用可能である。ＣｕとＺｎは，肺腫瘍組織中で増加することも示されており，両者とも気道における炎症反応を調節するのに重要であると思われる。生体分子に特異的なその他の分析として，ガスクロマトグラフィー質量分析（ＧＣ−ＭＳ），液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ），及び直接ＭＡＬＤＩ−ＭＳの３種の技法で補完的な情報を得ることができる。ＧＣ−ＭＳは約５００ｕまでの質量範囲の半揮発性物質について，情報を提供するであろう。ＬＣ−ＭＳは脂質，ペプチド，蛋白質等，各種生体分子及びそれらの改変物について定性的及び定量的な情報を与えるであろう。最後に，直接ＭＡＬＤＩ−ＭＳを利用することで，数万ｕまでの生体分子のパターンを検出でき，脂質と蛋白質の両プロファイルについて一回で検出及び同定することが可能である。捕集され洗浄された物質もまた生化学的分析，特に対象特異蛋白質のための標識抗体や遺伝子材料分析のための定量ＰＣＲ分析に付することができる。
【００５７】
試料の取扱いを容易にすると共に本方法の感度を上げる幾つかの技法がある。本方法において既に見られた一利点は，表面脱離質量分析技法を利用してインパクタから取り出した捕集プレートを直接分析できるという可能性である。更なる利点は，例えば上述の酵素を使う，すなわち，いわゆるオンプレート消化の場合のように，試料の浄化及び／又は改変を直接プレート上で行えることである。また，捕集プレート上に異なる種類の表面，すなわち，粒子試料中の特定の分析物に対する直接結合又は改変のためにレセプター分子或いは酵素で共有結合的に改変された表面を作り出すことも可能である。これらの方法は周知であり，有機化学実験室で容易に利用できる。その結果，分析プロセスを大幅にスピードアップでき，大きな患者グループの調査にも実行性をより向上できる。
【００５８】
質量分析法により新しいバイオマーカーが同定できれば，表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）及び蛍光分光法等の新しい分析機器を導入して，分析を個体数の大きいグループへ簡単にスケールアップすることが出来る。これら２方法は専門家でない者によってもより簡単に利用できるので，本粒子捕集方法を病院やヘルスケアセンターでより利用しやすくなり，また，大きな患者グループでの研究をより時間効率よくできる。捕集プレートをインパクタから直接使用できることは非常に有利である。
【００５９】
上述した様々な質量分析（ＭＳ）技法は，捕集された粒子の組成について包括的情報を与えるという顕著な利点を有する。このことは，異なるＭＳ技法を組み合わせることで，予め定められていない方法で，大半の生体分子を検出できることを意味する。これは，予め選択され標識された物質しか検出できない他の多くの生化学分析技法と対照的である。様々な疾病に対する新しい特異的バイオマーカーを同定するに当たって，本方法とＭＳ技法との適合性は重要な利点である。
【００６０】
粒子の分析は参照用化学分析と比較され，参照用化学分析からの乖離性及び／又は類似性が特定される。これを用いて被験体の一以上の医学的状態を決定できる。参照用化学分析は，或る医学的状態を有する被験体（その場合，化学分析における類似性が訴求される）のもの，或る医学的状態を有しない被験体のもの（その場合，化学分析における乖離性が求められる），或いは被験体自身のものであるが異なる状況で得たもの（例えば，後の時点でのもの，又は一定の治療コースや運動コースを経た後のもの）であることができる。
【００６１】
粒子分布プロファイルは，各捕集プレート上の粒子を分類することによって決定できる。得られた粒子分布プロファイルを利用して被験体における一以上の医学的状態を決定することができる。もし診断目的に利用するのであれば，被験体が呼気で吐出した粒子の粒子分布プロファイルを参照用粒子分布プロファイルと比較する。被験体粒子分布プロファイルと参照用粒子分布プロファイルとの間の類似性及び／又は乖離性に注目し，被験体粒子分布プロファイルと参照用粒子分布プロファイルとの間の乖離性又は類似性を被験体における一以上の医学的状態に帰属させる。
【００６２】
参照用粒子分布プロファイルは，所定の医学的状態を有しない被験体からの粒子分布プロファイルであり得る。この場合，被験体粒子分布プロファイルと参照用粒子分布プロファイルとの間の乖離性に注目して医学的状態を提示し得る。
【００６３】
或いは，参照用粒子分布プロファイルを所定の医学的状態を有する被験体から得たものとすることもできる。その場合，被験体の粒子分布プロファイルとその患者との間で類似性を指示することができ，これにより被験体における前記所定の医学的状態の診断を下すことが出来る。
【００６４】
参照用粒子分布プロファイルはまた，被験体自身のものであるが異なる状況で得たもの（例えば，後の時点でのもの，又は一定の治療コースや運動コースを経た後のもの）であることができる。これにより本発明方法による医学的状態のモニタリングが可能となる。
【００６５】
医学的状態
本発明によって決定又はモニタリングが可能な医学的状態として次のものが挙げられる。
− 気管支喘息
− 嚢胞性繊維症
− 慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）
− 肺癌
− 間質性肺疾患
− サルコイドーシス
− 全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）等の全身性疾患における肺症状
− 肺感染症
・肺炎
・細菌コロニー形成
・ウイルス感染
【００６６】
次のような全身性医学的状態もまたモニタリングできるであろう。
− 心不全（例えばエンドセリン−１による）
− 高コレステロール血症（コレステロールが呼気粒子中に見出される）
− 糖尿病（インスリンが粒子中に見出される）
− メタボリック症候群
− 疾患や曝露に対する高い遺伝的感受性
【００６７】
粒子は特定の医学的状態の指標となるバイオマーカーを含むか，或いはこのようなバイオマーカーから構成されるものであり得る。本発明に係る方法はそのようなバイオマーカーの検出を可能にする。
【００６８】
呼気粒子は，気道上皮全体を覆う気道被覆液（ＲＴＬＦ）に由来すると考えられており（Pediatr.Allergy Immunol,15(1):4-19），これは多量の抗酸化物質とサーファクタントを含有している。尚，ＲＴＬＦの組成は気道の近位から遠位へと変化するものである点にも注意が必要である。
【００６９】
ＲＴＬＦに豊富に存在する一物質として，クララ細胞によって産生されるクララ細胞蛋白質１６（ＣＣ１６）があり，これは抗炎症蛋白質としても機能する。今日までＣＣ１６はＢＡＬと血液でのみ測定されてきた。これまで注目されてきたその他の物質としては，サーファクタント蛋白質Ａ−Ｄがあるが，これもこれまでは気管支肺胞洗浄，すなわちＢＡＬでしか測定されていなかった。
【００７０】
特に注目されるのは，粒子中の抗酸化物質の濃度の検出とモニタリングである。バイオマーカーとしての可能性を有するものとして，気道に豊富に存在するグルタチオンがある。呼気液滴中のものでバイオマーカーとしての可能性を有するその他の抗酸化物質としては，マトリックス支援レーザ遊離／イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）で検出し得るであろう，金属結合蛋白質であるセルロプラスミンやトランスフェリンが挙げられる。可能性を有するその他の抗酸化物質で低分子量のものとして，例えばアスコルビン酸塩，αトコフェロール，尿酸塩，Ｌ−システインもまた各種質量分析法で検出される可能性があり，これらの分子もまた酸化ストレスに対するバイオマーカーである。
【００７１】
抗酸化物質として酸化ストレスに直接関与する，バイオマーカーとしての可能性のあるものとしては，グルタチオン，セルロプラスミン，トランスフェリン，アスコルビン酸塩，αトコフェロール，尿酸塩，Ｌ−システインが挙げられる。とりわけグルタチオンに注目されるが，これは気道に非常に豊富に存在するためである。これら抗酸化物質を検出する分析方法としては質量分析が利用されるであろう。
【００７２】
ａ．脂質
ＲＴＬＦにおけるリン脂質のプロファイルは，疾病のバイオマーカーとして利用できる。リン脂質組成（ＰＣ）における変化は，急性呼吸困難症候群（ＡＲＤＳ），肺炎，嚢胞性繊維症，喘息等，殆どの気道疾患で見られる。喘息においてはＢＡＬでＰＣが減少したことに加え，アレルゲン攻撃後にＰＣ／ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）の関係の変化が認められた。
【００７３】
脂質の機能を変化させるニトロ化と酸化も呼吸器疾患における新しい研究領域である。
【００７４】
ＲＴＬＦ中のリン脂質と蛋白質とを含むサーファクタントは，先天性免疫系において重要な役割を担っていると考えられる。リン脂質は，プロスタグランディン，トロンボキサン，エオタキシン，リポキシン，レゾルビン等，先天性免疫において活躍する多様なサイトカインの前駆体である。サーファクタント蛋白質もまた先天性免疫において重要な役割を果たしていることが示されており，とりわけ，抗原提示細胞及び細胞死の制御に関与している。サーファクタントの代謝に関してはこれまで非常に限定的にしか知られていないが，呼吸器疾患の病因の理解に重要であると考えられる。
【００７５】
ＴＯＦ−ＳＩＭＳでシリコン捕集プレートの表面を分析することで，呼気粒子中に多岐に亘るリン脂質が存在することが判明した。粒子中に検出されたリン脂質は，ＢＡＬでの検討でＲＴＬＦ中に見出されたリン脂質と整合している。リン脂質の相対量もＢＡＬの場合と整合している。リン脂質の相対量もＢＡＬの場合と整合している。ＰＯ３−に対するＣＮ−＋ＣＮＯ−（恐らく主に蛋白質とペプチドから来ているフラグメント）の比は，喘息患者と嚢胞性繊維症の患者で上昇した。この比は気道疾患によって空間スペースに血漿蛋白質が漏出したことを反映しているものであろう。
【００７６】
ｂ．蛋白質とペプチド
気管支肺胞洗浄のプロテオーム解析によって，多くの蛋白質が試料に存在することが判明した。この解析は２Ｄゲルと質量分析を利用して行った。この蛋白質並びに機能が未判明の蛋白質は特に，免疫炎症プロセス，細胞増殖，酸化物質−抗酸化物質系やプロテアーゼ−抗プロテアーゼ系に関与する。例えば，アレルギー性の喘息患者についてＢＡＬのプロテオーム解析を行った。この研究では，１５９２の蛋白質が同定され，その内の１６０は対照群と比べ患者によって異なる発現を示した。最も多く存在した蛋白質は，恐らく血液空気関門からの拡散に由来していると思われる血漿蛋白質であった。血漿蛋白質の増加は恐らく滲出又は損傷によるものであろう。ＢＡＬ中に検出されたペプチドと蛋白質の内の幾種かは，呼気粒子中にも存在する可能性が高い。
【００７７】
気道疾患のバイオマーカーであるペプチドや蛋白質としては，エンドセリン−１，インターロイキン−４，インターフェロン−ｇ，サーファクタント蛋白質Ａ〜Ｄ，クララ細胞蛋白質１６等が挙げられる。これらの分子はＥＳＩ−ＭＳやＭＡＬＤＩ−ＭＳ，或いは各種イムノアッセイで検出できる。より多くのタイプのバイオマーカーが本発明によって見出される可能性は非常に高いと思われる。なぜなら粒子の捕集は，より少数の粒子しか捕集できない呼気凝縮液を利用するよりもずっと効率的であるからである。捕集された試料中の蛋白質をトリプシン等の蛋白質分解酵素で処理すると幾つかのペプチドフラグメントが得られるが，これらは特定の蛋白質のセットに特有のパターンを提供する。
【００７８】
蛋白質のリン酸化やグリコシル化等，翻訳後修飾を調べることもバイオマーカーの潜在的ターゲットである。誤ったリン酸化パターンは幾つかの疾病の一部として知られている。
【００７９】
気道における別の重要なバイオマーカーの範疇はムチン糖蛋白質で，これは気道を病原体や環境トキシンから守る粘膜毛様体の防御に寄与している。喘息やＣＯＰＤの患者，及び嚢胞性繊維症患者ではムチン糖蛋白質の過剰生産が見られる。糖蛋白質の分析には，グリコシル化パターンが変りやすいという理由から困難が伴うが，様々な呼吸器疾患に関与していることから，このグループの化合物を追及していくことは有意義である。糖蛋白質分析の一利点は，アフィニティークロマトグラフィーで簡単に糖蛋白の精製ができることである。更に，蛋白質のグリコシル化パターンに変化が観察されれば，疾病と関連し得るので，バイオマーカーとして考えられる。
【００８０】
ｃ．細胞材料と遺伝子発現
呼気粒子は遺伝子情報，特にＤＮＡとＲＮＡの情報を有する物質を含有する細胞や細胞構造体を含んでいる可能性がある。このような細胞材料は，細菌やウイルス，或いは気道の細胞に起因する。そのような材料の遺伝子発現解析を行えば，特定の疾病の症状に関する新たな情報を提供したり，特定の疾病の診断のための高特異性かつ高感度の手段として利用することができる。よって本方法は肺炎等，各種疾患における病原物質の特定やＣＯＰＤの悪化の把握に利用できるばかりでなく，例えば臨床的に問題となることの多い嚢胞性繊維症における緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）のコロニー形成の早期検出にも利用できる。
【００８１】
ｄ．金属
ＥＢＣにおいて，鉄やカドミウム，鉛，アルミニウム，銅等の金属への曝露を追跡することができる。金属は呼気粒子に結合してＥＢＣに移行している可能性が最も高い。このことは，空気汚染における，鉄，亜鉛，カドミウム，アルミニウム等の各種成分への曝露をモニタリングするために本方法を利用できる可能性を示唆している。周囲環境のナノ粒子における金属への曝露もまた呼吸器疾患の発症に関連している。
【００８２】
実施例
４人の健常者からの呼気粒子をシリカウェーハ上に捕集した。粒子の濃度を光学粒子カウンタ（Grimm 1.108）で記録した。粒子の発生を高めるために，強制的に呼気吐出を行わせた（鼻クリップを使用）。被験体は，各個人の１秒当りの最大強制呼気吐出量（maximal forced expired volume in one second;ＦＥＶ１）の８０％に相当する量の呼気吐出を繰り返して連続的に行えるように訓練した。目標とする流量から１０％のずれは許容範囲と考えた。第１日目の朝に１５分に亘って試料採取を行い，第２日目も同様に繰り返した。
【００８３】
シリカウェーハ上の呼気粒子の化学組成を飛行時間二次イオン質量分析法（ＴＯＦ−ＳＩＭＳ ＩＶ ＩＯＮＴＯＦ ＧｍｂＨ）を使用して分析した。２５ｋｅＶのＢｉ３＋一次イオンを，粒子のスポット近傍を中心として５００×５００μｍ２の領域に照射した。正及び負の二次イオンの質量スペクトルを，分解能が最大になるように最適化した装置によって記録した。装置のソフトウエアを使用し，全分析領域又は関心のある選択された領域のスペクトル並びに選択したイオンについての画像を，記録した生データファイルから抽出した。純粋な物質からの基準スペクトル，及び他の質量分析法による公表されたデータからの基準スペクトルと比較することによって，スペクトル中のピークを帰属させた。また，この帰属は，理論的な同位体パターンとの比較により制御した。識別されたピークの相対強度を，各スペクトルの総イオン強度に対して正常化して計算した。
【００８４】
図３は，一対照被験体からの粒子スポットの正（図３Ａ）及び負（図３Ｂ）のＴＯＦ−ＳＩＭＳスペクトルを示す。
【００８５】
図４は，一対照被験体からの呼気粒子による１個のスポットのＴＯＦ−ＳＩＭＳ画像である。
【００８６】
図５は，呼気粒子（０．５〜２．０μｍ）の濃度と時間の関係を示す。
【００８７】
図６は，健常者と喘息又は嚢胞性繊維症に罹患している被験体とに対して行ったパイロットスタディにおける（ＣＮ＋ＣＮＯ）／ＰＯ３−比を示す。
【００８８】
（表１）
呼気粒子のＴＯＦ−ＳＩＭＳスペクトルのピークのｍ／ｚ比の帰属
リン脂質の分子種をｘ：ａで表している（ｘは炭素数で，ａは二重結合の数）。
正イオン 負イオン
帰属 ｍ／ｚ 帰属 ｍ／ｚ
ホスホコリンイオン １８４ Ｃ１６：１ ２５３
コレステロール−ＯＨ ３６９ Ｃ１６：０ ２５５
ＰＣフラグメント ４７６ Ｃ１８：１ ２８１
ＰＣフラグメント ４７８ Ｃ１８：０ ２８３
ＰＣフラグメント ４９４ ＰＡ３２：１ ６４５
ＰＣフラグメント ５２２ ＰＡ３２：０ ６４７
ＰＣフラグメント ５２４ ＰＧ２８：１ ６６３
ＰＣフラグメント ６５０ ＰＧ２８：０ ６６５
ＰＣ２８：０＋Ｈ ６７８ ＰＧ３４：２ ６７１
ＰＣフラグメント ６８０ ＰＡ３４：１ ６７３
ＰＣ３０：０＋Ｈ ７０６ ＰＧ３２：０ ７２１
ＰＣ３２：１＋Ｈ ７３２ ＰＧ３４：１ ７４７
ＰＣ３２：０＋Ｈ ７３４ ＰＧ３６：２ ７７３
ＰＣ３４：１＋Ｈ ７６０ ＰＧ３６：１ ７７５
ＰＣ３４：０＋Ｈ ７６２ ＰＩ３４：２ ８３３
ＰＩ３４：１ ８３５
ＰＩ３６：２ ８６１
ＰＩ３６：１ ８６３
【００８９】
（表２）
１５分の試料採取期間での総呼気量と呼気粒子（０．５〜２．０μｍ）の平均濃度
被験体１ 被験体２ 被験体３ 被験体４
FEV1 4.1 FEV1 2.8 FEV1 3.2 FEV1 3.2
１日目 ２日目 １日目 ２日目 １日目 ２日目 １日目 ２日目
量（リットル）１５３ １２８ １７６ １８１ １４２ １４４ ２０１ １６６
粒子／リットル２１０ １２３ １４９ ５５ ９５６ ３４３ ２３９ １８０
【００９０】
全ての粒子サンプルはリン脂質からの強い信号を出した（図２，図４及び表１）。ホスファチジルコリン（ＰＣ）の様々な種が，正モードにおいてプロトン化した又はアルカリ金属でカチオン化した分子イオンとして検出され，ホスファチジルグリセロール（ＰＧ），ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）及びホスファチジン酸（ＰＡ）が負モードにおいて脱プロトン化したイオンとして検出された（表１）。リン脂質の組成は，呼気粒子は気道下部から生じている可能性が最も高いことを示す気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液での以前の発見における組成と一致していた。
【００９１】
実施例２
被験体は，各個人の１秒当りの最大強制呼気吐出量（ＦＥＶ１）の８０％に相当する量の呼気吐出を繰り返して連続的に行えるように訓練した。４人の健康なボランティア，４人の喘息患者，及び４人の嚢胞性繊維症患者の各々が強制呼気吐出を１０回行った。粒径が０．５〜２．０μｍの呼気粒子をシリカウェーハ上に捕集した。粒子の濃度を光学粒子カウンタを用いてリアルタイムで測定した。試料採取の前に，３分間のウォッシュアウトの間，粒子を含まない空気で呼吸した。シリカウェーハを飛行時間二次イオン質量分析法（ＴＯＦ−ＳＩＭＳ）を使用して分析した。粒子中に何種類かのリン脂質を検出した。すなわち，ホスファチジルコリン（ＰＣ），ホスファチジルグリセロール（ＰＧ），ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）及びホスファチジン酸（ＰＡ）を検出した。グループ間で幾つかの相違が観察された。ＰＣの信号の合計とＰＧの信号の合計との比は，対照と比較して，喘息患者と嚢胞性繊維症患者において上昇する傾向があった。また，対照と比べ，喘息患者と嚢胞性繊維症患者のサンプルでは，タンパク質とペプチド（ＣＮＯ−）の特徴として知られている信号がリン脂質に比べて増加した（図６）。
【００９２】
実施例３
被験体は強制呼気吐出を２０分間行った。粒径が０．５〜２．０μｍの呼気粒子をシリカウェーハ上に捕集した。ＤＮＡとＲＮＡに強く結合する蛍光試薬ＤＡＰＩ（４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）でシリカウェーハを染色した。呼気粒子が核酸を含むことを示す強い信号が粒子スポットで得られた。
【００９３】
実施例４
二人の被験体が１５０Ｌの空気を２回呼気吐出した（１回は粒子の捕集のためであり，１回は呼吸濃縮物の捕集のため）。ＥＬＩＺＡによるサーファクタント蛋白質Ａの分析の前に，呼気粒子をシリカウェーハから離脱させ，呼吸濃縮物を濃縮させた。呼気粒子中のサーファクタント蛋白質Ａ（ＳｐＡ）は，呼気で吐出された呼吸濃縮物のＳｐＡの６倍であり，１００μＬの血清中のＳｐＡの４倍であった。ＳｐＡの分析の結果，試験時においては各個人において高い再現性があることが分かった（異なる３時点で試験した二被験体についてはＣＶ５．４）。
【００９４】
開発した試料採取方法は，呼気空気中の新しいバイオマーカーの検出及び呼吸器疾患のモニタリングに対して高い可能性を有する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体の医学的状態を決定するための方法であって，
ａ．前記被験体が呼気で吐出した粒子を捕集する工程と，
ｂ．前記粒子を質量又はサイズによって分類する工程と，
ｇ．前記粒子の化学物質含量を分析する工程と
を含み，これにより前記被験体の医学的状態を決定する方法。
【請求項２】
更に次の工程：
ｃ．前記粒子をその質量又はサイズによって分類し，前記粒子の粒子分布プロファイルを得る工程と，
ｄ．前記被験体が呼気で吐出した前記粒子の粒子分布プロファイルを参照用粒子分布プロファイルと比較する工程と，
ｅ．前記被験体の前記粒子分布プロファイルと前記参照用粒子分布プロファイルとの間の類似性及び／又は乖離性を指示する工程と，
ｆ．前記被験体の粒子分布プロファイルと前記参照用粒子分布プロファイルとの間の乖離性又は類似性を，前記被験体の一以上の医学的状態に帰属させる工程と，選択的に，
ｇ．前記粒子の前記化学物質含量を分析する工程と
を含む請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記医学的状態が，気管支喘息，嚢胞性繊維症，慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ），間質性肺疾患，サルコイドーシス，全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）等の全身性疾患における肺症状，肺炎等の肺感染症，細菌コロニー形成，ウイルス感染，心不全（例えばエンドセリン−１），高コレステロール血症（コレステロールが呼気粒子に見出される），糖尿病（インスリンが粒子中に見出される），メタボリック症候群，疾患又は曝露に対する高い遺伝的感受性からなる群から選択される請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記医学的状態が，気管支喘息，嚢胞性繊維症，慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ），間質性肺疾患，サルコイドーシス，全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）等の全身性疾患における肺症状，肺炎等の肺感染症，細菌コロニー形成，又はウイルス感染からなる群から選択される請求項２記載の方法。
【請求項５】
前記参照用粒子分布プロファイルを所定の医学的状態を有しない被験体から得ると共に，前記工程ｅが，前記被験体の前記粒子分布プロファイルと前記参照用粒子分布プロファイルとの間の乖離性を指示することを含む請求項２又は４記載の方法。
【請求項６】
前記参照用粒子分布プロファイルを所定の医学的状態を有する患者から得ると共に，前記工程ｅが，前記被験体と前記患者の粒子分布プロファイルの類似性を指示することを含むことにより，前記被験体における前記所定の医学的状態を決定する請求項２，４又は５いずれか１項記載の方法。
【請求項７】
ａ．被験体が呼気で吐出した粒子を捕集する工程と，
ｂ．前記粒子をサイズ又は質量によって分類して前記粒子の粒子分布プロファイルを得る工程と
を含む，呼気息の粒子の粒子分布プロファイルを提供する方法。
【請求項８】
慣性インパクタ（１０）を利用して質量によって粒子を分類する請求項１〜７いずれか１項記載の方法。
【請求項９】
前記インパクタ（１０）は，入口（１２）と出口（１４）を有し，前記インパクタ（１０）は，粒子（Ｐ）を含む主ガス流（Ａ）が前記入口（１２）から前記インパクタ（１０）に入り，各段（２０，３０，４０，５０…）を順に通過して前記出口（１４）から前記インパクタ（１０）を出るように設けられた複数の段（２０，３０，４０，５０…）を有し，
各段（２０，３０，４０，５０…）は隣接する段と，前記ガス流（Ａ）を捕集プレート（３３，４３，５３…）に向わせるオリフィス（２２，３２，４２，５２…）を有する仕切り（２１，３１，４１，５１…）によって分離されており，各捕集プレート（３３，４３，５３…）の主面は，前記ガス流（Ａ）の流れの方向と実質的に直角に配置されており，
これによって呼気粒子はガス流（Ａ）にあって前記慣性インパクタ（１０）を通過し，その際，前記主ガス流（Ａ）は各段（２０，３０，４０，５０…）で順に捕集プレート（２３，３３，４３，５３…）に向けられ，第一段（３０）に置かれた少なくとも第一の捕集プレート（３３）が第一の質量の粒子を捕集し，第二段（４０）に置かれた少なくとも第二の捕集プレート（４３）が第二の質量の粒子を捕集する請求項８記載の方法。
【請求項１０】
粒子カウンタ（１１６）を利用してサイズによって前記粒子を分類する請求項１〜９いずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
サイズ又は質量によって分類された後，前記捕集プレートを最初に洗浄して或いは洗浄せずに，粒子は飛行時間二次イオン質量分析法（ＴＯＦ−ＳＩＭＳ），マトリックス支援レーザ遊離イオン化質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ），標識抗体に基づく生化学アッセイ又はプロトコル，定量ＰＣＲ分析，走査電子顕微鏡法（ＳＥＭ），ガスクロマトグラフィー質量分析（ＧＣ−ＭＳ），液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ），表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ），蛍光分光法，ＴＯＣ（全有機物含有量）分析，元素分析，及び誘導結合プラズマ質量分析法（ＩＣＰ−ＭＳ）からなる群から選択される少なくとも一種の分析技法によって分析される請求項１〜１０いずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
呼気粒子を捕集し分類するシステム（１００）であって，
ａ．第一開口（１１２）と第二開口（１１３）を有するリザーバ（１１４）と，
ｂ．前記リザーバ（１１４）の前記第一開口（１１２）に接続された双方向マウスピース（１１０）と，
ｃ．入口（１２）と出口（１４）を有する慣性インパクタ（１０）と
を含み，
前記インパクタ（１０）は，粒子（Ｐ）を含む主ガス流（Ａ）が，前記入口（１２）から前記インパクタ（１０）に入り各段（２０，３０，４０，５０…）を順に通過して前記出口（１４）から前記インパクタ（１０）を出るように配置された複数の段（２０，３０，４０，５０…）を含み，
各段（２０，３０，４０，５０…）は，前記主ガス流（Ａ）を捕集プレート（３３，４３，５３…）に向かわせるオリフィス（２２，３２，４２，５２…）を有する仕切り（２１，３１，４１，５１…）によって隣接する段から分離され，各捕集プレート（３３，４３，５３…）の主面は前記ガス流（Ａ）の流れ方向と実質的に直角に配置されており，前記慣性インパクタ（１０）の前記入口（１２）は前記リザーバ（１１４）の前記第一開口（１１２）に接続されているシステム。
【請求項１３】
各段（２０，３０，４０，５０…）は，捕集プレート（３３，４３，５３…）を備え，別の段（２０，３０，４０，５０…）の捕集プレート（３３，４３，５３…）での分析物と異なる分析物を検出できるよう適応された請求項１２記載のシステム（１００）。
【請求項１４】
請求項１２又は１３記載のシステム（１００）に使用できるよう適応された捕集プレート（３３，４３，５３…）。
【請求項１５】
少なくとも一面が疎水性物質又は抗体等の物質によるコーティングで改変された請求項１４記載の捕集プレート（３３，４３，５３…）。
【請求項１６】
前記捕集プレートへの粒子の結合に呼応して前記捕集プレート（３３，４３，５３…）における電流又はキャパシタンスの変化を検出できる電気的接続部を含む請求項１４又は１５記載の捕集プレート（３３，４３，５３…）。
【請求項１】
被験体の医学的状態を決定するための方法であって，
ａ．前記被験体が呼気で吐出した粒子を捕集する工程と，
ｂ．前記粒子を質量又はサイズによって分類する工程と，
ｇ．前記粒子の化学物質含量を分析する工程と
を含み，これにより前記被験体の医学的状態を決定する方法。
【請求項２】
更に次の工程：
ｃ．前記粒子をその質量又はサイズによって分類し，前記粒子の粒子分布プロファイルを得る工程と，
ｄ．前記被験体が呼気で吐出した前記粒子の粒子分布プロファイルを参照用粒子分布プロファイルと比較する工程と，
ｅ．前記被験体の前記粒子分布プロファイルと前記参照用粒子分布プロファイルとの間の類似性及び／又は乖離性を指示する工程と，
ｆ．前記被験体の粒子分布プロファイルと前記参照用粒子分布プロファイルとの間の乖離性又は類似性を，前記被験体の一以上の医学的状態に帰属させる工程と，選択的に，
ｇ．前記粒子の前記化学物質含量を分析する工程と
を含む請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記医学的状態が，気管支喘息，嚢胞性繊維症，慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ），間質性肺疾患，サルコイドーシス，全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）等の全身性疾患における肺症状，肺炎等の肺感染症，細菌コロニー形成，ウイルス感染，心不全（例えばエンドセリン−１），高コレステロール血症（コレステロールが呼気粒子に見出される），糖尿病（インスリンが粒子中に見出される），メタボリック症候群，疾患又は曝露に対する高い遺伝的感受性からなる群から選択される請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記医学的状態が，気管支喘息，嚢胞性繊維症，慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ），間質性肺疾患，サルコイドーシス，全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）等の全身性疾患における肺症状，肺炎等の肺感染症，細菌コロニー形成，又はウイルス感染からなる群から選択される請求項２記載の方法。
【請求項５】
前記参照用粒子分布プロファイルを所定の医学的状態を有しない被験体から得ると共に，前記工程ｅが，前記被験体の前記粒子分布プロファイルと前記参照用粒子分布プロファイルとの間の乖離性を指示することを含む請求項２又は４記載の方法。
【請求項６】
前記参照用粒子分布プロファイルを所定の医学的状態を有する患者から得ると共に，前記工程ｅが，前記被験体と前記患者の粒子分布プロファイルの類似性を指示することを含むことにより，前記被験体における前記所定の医学的状態を決定する請求項２，４又は５いずれか１項記載の方法。
【請求項７】
ａ．被験体が呼気で吐出した粒子を捕集する工程と，
ｂ．前記粒子をサイズ又は質量によって分類して前記粒子の粒子分布プロファイルを得る工程と
を含む，呼気息の粒子の粒子分布プロファイルを提供する方法。
【請求項８】
慣性インパクタ（１０）を利用して質量によって粒子を分類する請求項１〜７いずれか１項記載の方法。
【請求項９】
前記インパクタ（１０）は，入口（１２）と出口（１４）を有し，前記インパクタ（１０）は，粒子（Ｐ）を含む主ガス流（Ａ）が前記入口（１２）から前記インパクタ（１０）に入り，各段（２０，３０，４０，５０…）を順に通過して前記出口（１４）から前記インパクタ（１０）を出るように設けられた複数の段（２０，３０，４０，５０…）を有し，
各段（２０，３０，４０，５０…）は隣接する段と，前記ガス流（Ａ）を捕集プレート（３３，４３，５３…）に向わせるオリフィス（２２，３２，４２，５２…）を有する仕切り（２１，３１，４１，５１…）によって分離されており，各捕集プレート（３３，４３，５３…）の主面は，前記ガス流（Ａ）の流れの方向と実質的に直角に配置されており，
これによって呼気粒子はガス流（Ａ）にあって前記慣性インパクタ（１０）を通過し，その際，前記主ガス流（Ａ）は各段（２０，３０，４０，５０…）で順に捕集プレート（２３，３３，４３，５３…）に向けられ，第一段（３０）に置かれた少なくとも第一の捕集プレート（３３）が第一の質量の粒子を捕集し，第二段（４０）に置かれた少なくとも第二の捕集プレート（４３）が第二の質量の粒子を捕集する請求項８記載の方法。
【請求項１０】
粒子カウンタ（１１６）を利用してサイズによって前記粒子を分類する請求項１〜９いずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
サイズ又は質量によって分類された後，前記捕集プレートを最初に洗浄して或いは洗浄せずに，粒子は飛行時間二次イオン質量分析法（ＴＯＦ−ＳＩＭＳ），マトリックス支援レーザ遊離イオン化質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ），標識抗体に基づく生化学アッセイ又はプロトコル，定量ＰＣＲ分析，走査電子顕微鏡法（ＳＥＭ），ガスクロマトグラフィー質量分析（ＧＣ−ＭＳ），液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ），表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ），蛍光分光法，ＴＯＣ（全有機物含有量）分析，元素分析，及び誘導結合プラズマ質量分析法（ＩＣＰ−ＭＳ）からなる群から選択される少なくとも一種の分析技法によって分析される請求項１〜１０いずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
呼気粒子を捕集し分類するシステム（１００）であって，
ａ．第一開口（１１２）と第二開口（１１３）を有するリザーバ（１１４）と，
ｂ．前記リザーバ（１１４）の前記第一開口（１１２）に接続された双方向マウスピース（１１０）と，
ｃ．入口（１２）と出口（１４）を有する慣性インパクタ（１０）と
を含み，
前記インパクタ（１０）は，粒子（Ｐ）を含む主ガス流（Ａ）が，前記入口（１２）から前記インパクタ（１０）に入り各段（２０，３０，４０，５０…）を順に通過して前記出口（１４）から前記インパクタ（１０）を出るように配置された複数の段（２０，３０，４０，５０…）を含み，
各段（２０，３０，４０，５０…）は，前記主ガス流（Ａ）を捕集プレート（３３，４３，５３…）に向かわせるオリフィス（２２，３２，４２，５２…）を有する仕切り（２１，３１，４１，５１…）によって隣接する段から分離され，各捕集プレート（３３，４３，５３…）の主面は前記ガス流（Ａ）の流れ方向と実質的に直角に配置されており，前記慣性インパクタ（１０）の前記入口（１２）は前記リザーバ（１１４）の前記第一開口（１１２）に接続されているシステム。
【請求項１３】
各段（２０，３０，４０，５０…）は，捕集プレート（３３，４３，５３…）を備え，別の段（２０，３０，４０，５０…）の捕集プレート（３３，４３，５３…）での分析物と異なる分析物を検出できるよう適応された請求項１２記載のシステム（１００）。
【請求項１４】
請求項１２又は１３記載のシステム（１００）に使用できるよう適応された捕集プレート（３３，４３，５３…）。
【請求項１５】
少なくとも一面が疎水性物質又は抗体等の物質によるコーティングで改変された請求項１４記載の捕集プレート（３３，４３，５３…）。
【請求項１６】
前記捕集プレートへの粒子の結合に呼応して前記捕集プレート（３３，４３，５３…）における電流又はキャパシタンスの変化を検出できる電気的接続部を含む請求項１４又は１５記載の捕集プレート（３３，４３，５３…）。
【図１】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５】
【図６】
【公表番号】特表２０１０−５４０９５９（Ｐ２０１０−５４０９５９Ａ）
【公表日】平成２２年１２月２４日（２０１０．１２．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５２７９１３（Ｐ２０１０−５２７９１３）
【出願日】平成２０年１０月１日（２００８．１０．１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＳＥ２００８／０５１１１０
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０４５１６３
【国際公開日】平成２１年４月９日（２００９．４．９）
【出願人】（５１００９１４９１）
【出願人】（５１００９１５０５）
【出願人】（５１００９１５１６）
【出願人】（５１００９１５２７）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年１２月２４日（２０１０．１２．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１０月１日（２００８．１０．１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＳＥ２００８／０５１１１０
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０４５１６３
【国際公開日】平成２１年４月９日（２００９．４．９）
【出願人】（５１００９１４９１）
【出願人】（５１００９１５０５）
【出願人】（５１００９１５１６）
【出願人】（５１００９１５２７）
【Ｆターム（参考）】
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