哺乳動物の発現系
本発明は、産生率が改善された哺乳動物発現系およびこれらの系を用いて所望のタンパク質を産生する方法を特徴とする。一実施形態では、本発明の発現系は、有効量のヘパリンまたはヘパリン様分子を含む培地において培養された遺伝子組換え哺乳動物宿主細胞を含む。ヘパリンまたはヘパリン様分子が存在することで、培養細胞によるタンパク質産生が大幅に増加する。本発明はまた、培養哺乳動物細胞によるタンパク質産生を改善するためのＦＧＦＲ−１媒介性シグナル伝達経路の構成的に活性な成分の使用を特徴とする。このような成分の、対象のタンパク質との同時発現により、対象のタンパク質の産生率が著しく高まる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は哺乳動物発現系および所望のタンパク質を製造するためにそれを用いる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
ゲノムおよびプロテオミクスにおける最近の進歩とともに、多量の組換えタンパク質をクローニングし、発現する能力がますます重要になってきた。高レベルのタンパク質を精製する能力は、ヒト薬剤学およびバイオテクノロジーの設定において、インスリンなどのタンパク質製剤を製造するために、ならびに、基礎研究の設定において、例えば、タンパク質を結晶化してその三次元構造の決定を可能にするために重要である。そうでなければ多量に得ることが困難であるタンパク質を、宿主細胞において過剰発現させ、続いて、単離および精製することができる。
【０００３】
細菌発現系は、組換えタンパク質を発現および精製するための１つのアプローチであった。しかし、細菌細胞における多数の真核細胞のポリペプチド、特に、哺乳動物のタンパク質の発現は、宿主細胞における状態および環境が、真核細胞のタンパク質の正しいフォールディングおよび修飾をもたらさなかったために、期待はずれの、不満足な結果が生じることが多かった。
【０００４】
酵母発現系は、分泌経路を有し、いくつかの限定された翻訳後修飾を実施する能力を有するので、いくつかの真核細胞のタンパク質の製造にとって特定の利点を提供する。しかし、酵母系は、ジスルフィド結合しているタンパク質の不適切なフォールディングをもたらすことが多く、低グリコシル化をもたらす場合もある。
【０００５】
タンパク質の製造のための哺乳動物細胞の使用は、正しいタンパク質フォールディングならびに適当な翻訳後修飾、例えば、グリコシル化を提供するという重要な利点を提供する。しかし、多数の哺乳動物発現系は、多量の所望のタンパク質を産生しない。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の要旨）
本発明は、哺乳動物宿主細胞によるタンパク質産生を増加させるためのヘパリン、ヘパリン様分子または線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）アゴニストの使用を特徴とする。本発明はまた、哺乳動物宿主細胞によるタンパク質産生を刺激するための構成的に活性なＦＧＦＲまたはその下流のエフェクターの使用を特徴とする。
【０００７】
一態様では、本発明は、タンパク質産生率が改善された哺乳動物発現系を提供する。これらの発現系は、有効量のヘパリンまたはヘパラン硫酸グリコサミノグリカンを含む培地において培養された遺伝子組換え哺乳動物細胞を含む。各遺伝子組換え宿主細胞は、対象のタンパク質をコードする組換え発現カセットを含む。培養培地中にヘパリンまたはヘパラン硫酸グリコサミノグリカンが存在することで、対象のタンパク質の収率が大幅に高まる。
【０００８】
本発明において用いられるヘパリンまたはヘパラン硫酸グリコサミノグリカンの量は、培養宿主細胞によるタンパク質産生を促進するのに有効ないずれの量であってもよい。一実施形態では、本発明に用いられる培養培地は、約１〜約１，０００μｇ／ｍｌのヘパリンまたはヘパラン硫酸グリコサミノグリカンを含む。別の実施形態では、本発明に用いられる培養培地は、約１０〜約２００μｇ／ｍｌ（例えば、約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００μｇ／ｍｌ）のヘパリンまたはヘパラン硫酸グリコサミノグリカンを含む。
【０００９】
さらに別の実施形態では、本発明に用いられる培養培地は、培養宿主細胞によるタンパク質産生を増加させるために、有効量の線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ−２）またはその他のＦＧＦを、ヘパリンまたはヘパラン硫酸グリコサミノグリカンと組み合わせて含む血清不含培地である。多数の実施例において、培養培地は、それだけには限らないが、約１０〜約５００ｎｇ／ｍｌ（例えば、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００または５００ｎｇ／ｍｌ）のＦＧＦ−２を含む。
【００１０】
別の態様では、本発明の哺乳動物発現系は、有効量のＦＧＦＲ−１活性化剤を含む培地において培養された遺伝子組換え哺乳動物細胞を含む。これらの遺伝子組換え細胞の各々は、対象のタンパク質をコードする組換え発現カセットを含む。培養培地中にＦＧＦＲ−１活性化剤が存在することで、対象のタンパク質の収率が著しく高まる。本発明に適したＦＧＦＲ−１活性化剤の例として、それだけには限らないが、ＦＧＦ、ヘパリン、ヘパラン硫酸グリコサミノグリカンまたはその他のヘパリン様分子が挙げられる。その他のＦＧＦＲを活性化できる物質も使用できる。一実施形態では、本発明に用いられるＦＧＦＲ−１活性化剤として、ヘパリンまたはヘパラン硫酸グリコサミノグリカンおよびＦＧＦ−２の双方が挙げられる。
【００１１】
さらに別の態様では、本発明の哺乳動物発現系として、各々が、対象のタンパク質と、ＦＧＦＲ−１媒介性シグナル伝達経路の構成的に活性な成分とをコードする１種または複数の組換え発現カセットを含む、遺伝子組換え哺乳動物細胞が挙げられる。一実施例では、ＦＧＦＲ−１媒介性シグナル伝達経路の構成的に活性な成分は、構成的に活性なＦＧＦＲ−１タンパク質である。
【００１２】
本発明はまた、哺乳動物細胞によるタンパク質産生を改善するための、β−キシロシドまたはその他のグリコサミノグリカン生合成インデューサーの使用を特徴とする。この目的に適したβ−キシロシドの限定されない例として、４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−キシロシド、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−キシロシドおよびベンジル−β−Ｄ−キシロシドが挙げられる。一実施例では、哺乳動物宿主細胞を、約５０または約１００μｇ／ｍｌの４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−キシロシドを含む培地で培養する。β−キシロシドの使用により、哺乳動物宿主細胞のタンパク質産生率が大幅に高まる。
【００１３】
いずれの対象のタンパク質も、本発明の哺乳動物発現系を用いて製造できる。これらのタンパク質の限定されない例として、インスリン、成長ホルモン、増殖因子、エリスロポエチンタンパク質、卵胞刺激ホルモン、インターフェロン、インターロイキン、サイトカイン、コロニー刺激因子、凝固因子、組織プラスミノーゲンアクチベーター、副甲状腺ホルモン、骨形成タンパク質、ケラチノサイト増殖因子、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、グルカゴン、トロンビン、トロンボポエチン、プロテインＣ、分泌型ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質、セレクチン、抗体またはウイルスタンパク質が挙げられる。これらのタンパク質は分泌型、細胞質性または膜結合型タンパク質であり得る。それらは治療、予防、診断またはその他の医療目的のために使用できる。多数の実施例では、本発明によって産生されたタンパク質は、細胞表面ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用して、これらのタンパク質の細胞内部移行を誘導することができない。
【００１４】
本発明はさらに、本発明の哺乳動物発現系によって産生されたタンパク質を含む薬剤組成物を特徴とする。
【００１５】
さらに、本発明は、所望のタンパク質を産生する方法を特徴とする。一態様では、本発明の方法は、宿主細胞による対象のタンパク質の産生を増加させるための有効量のヘパリン、ヘパラン硫酸グリコサミノグリカン、またはＦＧＦＲ−１活性化剤を含む培養培地において、各々が、対象のタンパク質をコードする組換え発現カセットを含む哺乳動物宿主細胞を培養することと、対象のタンパク質を宿主細胞または培養培地から単離することとを含む。
【００１６】
一実施形態では、組換え発現カセットは、宿主細胞中に一過性に導入される発現ベクターによって保持される。発現ベクターを宿主細胞中に一過性に導入した少なくとも２４時間後、培養培地にヘパリンまたはヘパラン硫酸グリコサミノグリカンを加える。別の実施形態では、発現ベクターを宿主細胞中に一過性に導入した少なくとも４８時間後、培養培地にヘパリンまたはヘパラン硫酸グリコサミノグリカンを加える。
【００１７】
別の態様では、本発明の方法は、培地において、各々が、対象のタンパク質と、ＦＧＦＲ−１媒介性シグナル伝達経路の構成的に活性な成分とをコードする１種または複数の組換え発現カセットを含む哺乳動物宿主細胞を培養することと、宿主細胞において対象のタンパク質および成分を発現させることと、宿主細胞または培養培地から対象のタンパク質を単離することとを含む。
【００１８】
一実施形態では、構成的に活性な成分は、構成的に活性なＦＧＦＲ−１タンパク質である。多数の例では、本発明の方法を用いて産生されたタンパク質は細胞表面ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用してこれらのタンパク質の細胞内部移行を誘導できない。
【００１９】
本発明のその他の特徴、目的および利点は、以下の詳細な説明において明らかである。しかし、詳細な説明は、本発明の好ましい実施形態を示すものの、単に例示のために示されるのであって制限するものではないということは理解されなければならない。詳細な説明から当業者には本発明の範囲内の種々の変法および改変が明らかとなる。
【００２０】
図は限定ではなく例示のために提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
（詳細な説明）
本発明は、分泌型、細胞質性または膜結合型タンパク質の産生率が改善された哺乳動物発現系を特徴とする。一態様では、本発明の発現系は、有効量のヘパリンまたはヘパリン様分子を含む培地において培養された遺伝子組換え哺乳動物宿主細胞を含む。各遺伝子組換え哺乳動物宿主細胞は、対象のタンパク質をコードする組換え発現カセットを含む。培養培地中にヘパリンまたはヘパリン様分子が存在することで、対象のタンパク質の収率が大幅に高まる。別の態様では、本発明の発現系は、対象のタンパク質をコードする１種または複数の組換え発現カセットと、構成的に活性なＦＧＦＲ−１またはＦＧＦＲ−１エフェクターとを含む遺伝子組換え哺乳動物宿主細胞を用いる。ＦＧＦＲ−１またはそのエフェクターとの同時発現により、対象のタンパク質の収率が大幅に改善される。
【００２２】
本発明の種々の態様を、以下の小区分においてさらに詳細に説明する。小区分の使用は本発明の制限を意味するものではない。各小区分は本発明の態様のいずれにも当てはまり得る。
【００２３】
Ａ．遺伝子組換え哺乳動物宿主細胞によるタンパク質産生を増加させるためのヘパリンの使用
ヘパリンは、遺伝子組換え哺乳動物宿主細胞によるタンパク質産生を増強するために使用できる。ヘパリンは硫酸化グリコサミノグリカンの不均一な混合物である。ヘパリン中の主な糖単位としては、α−Ｌ−イズロン酸２−スルフェート、２−デオキシ−２−スルファミノ−α−Ｄ−グルコース６−スルフェート、α−Ｄ−グルクロン酸、２−アセトアミド−２−デオキシ−α−Ｄ−グルコースおよびα−Ｌ−イズロン酸が挙げられる。これらの糖はグリコシド結合によって結合しており、種々の大きさのポリマーを形成している。多数のヘパリン分子が、多量の二糖類単位ＩｄｏＡ（２−ＯＳＯ３）−ＧｌｃＮＳＯ３（６−ＯＳＯ３）を含み、これが高いイズロン酸（ＩｄｏＡ）対グルクロン酸（ＧｌｃＡ）比を有する、多量にＯ−硫酸化されたポリサッカライドをもたらす。ヘパリンは、その高度に酸性のスルフェート基のために、通常、生理学的ｐＨでアニオンとして存在する。
【００２４】
本発明は、それだけには限らないが、未分画ヘパリン、分画ヘパリンまたは低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）をはじめ、あらゆる種類のヘパリン使用を考慮する。未分画ヘパリンの分子量は、制限するものではないが、約３，０００〜約４，０００Ｄａの範囲であり、平均分子量は約１５，０００Ｄａ（約４０〜５０単糖類単位）であり得る。多数の市販のヘパリン製剤の平均分子量は、約１２，０００〜約１５，０００Ｄａの範囲にある。未分画ヘパリンは、種々の脊椎動物の組織、例えば、ブタ腸管粘膜、ウシ腸組織またはウシ肺組織から調製できる。調製方法は、通常、組織のタンパク質分解処理と、それに続く抽出およびイオン対形成試薬との錯化とを含む。非分画粗ヘパリンをさらに、分別沈殿、精製または化学処理に付して細胞培養等級の、または製薬上許容されるヘパリンを製造することができる。
【００２５】
ＬＭＷＨは、通常、未分画ヘパリンから化学的または酵素的加水分解によって製造される。多数の市販のＬＭＷＨ製剤の分子量は、例えば、約２，０００〜９，０００Ｄａの範囲であり、平均分子量は約４，０００〜５，０００Ｄａであり得る。
【００２６】
本発明をいずれか１つの理論または作用様式に制限するものではないが、ヘパリンはＦＧＦ（例えば、ＦＧＦ−２）とＦＧＦＲ（例えば、ＦＧＦＲ−１）との間の相互作用を媒介し、それによってＦＧＦＲを活性化するか、ＦＧＦＲの活性化を促進し、タンパク質合成および／または分泌の増加をもたらす下流シグナルのカスケードを開始する。ヘパリン単独でもＦＧＦＲを活性化できる。
【００２７】
さらに、ヘパリンはその他の増殖因子、サイトカインまたはケモカインと結合できる。これらの増殖因子、サイトカインまたはケモカインの限定されない例として、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、プレイオトロフィン、胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）、血小板因子−４（ＰＦ−４）、ヘパリン結合性ＥＧＦ様増殖因子インターロイキン−８（ＩＬ−８）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、マクロファージ炎症性タンパク質−１（ＭＩＰ−１）、トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）、インターフェロン−ｇ誘導性タンパク質−１０（ＩＰ−１０）、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）およびＨＩＶ−Ｔａｔトランス活性化因子が挙げられる。ヘパリンの、これらの因子またはその受容体との相互作用もまた、培養宿主細胞によるタンパク質合成を促進し得る。
【００２８】
ＦＧＦおよびＦＧＦＲとの相互作用に預かる、ヘパリンの構造上の必要条件は、種々の実験モデルを用いて調べられている。結果から、硫酸化の大きさおよび程度が、ヘパリンの、ＦＧＦ−２−ＦＧＦＲ相互作用を誘導する能力にとって重要であるということが示されている。例えば、Ｉｓｈｉｈａｒａら、（１９９３年）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６８、４６７５〜４６８３頁； Ｔｙｒｒｅｌｌら、（１９９３年） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６８、４６８４〜４６８９頁； Ｇｕｉｍｏｎｄら（１９９３年） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６８、２３９０６〜２３９１４頁； Ａｖｅｚｉｅｒら（１９９４年） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９、１１４〜１２１頁およびＷａｌｋｅｒら（１９９４年） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９、９３１〜９３５頁を参照のこと。ヘパリンまたはヘパラン硫酸中の最小ＦＧＦ−２結合配列は、二糖類単位ＩｄｏＡ（２−ＯＳＯ３）−ＧｌｃＮＳＯ３またはＩｄｏＡ（２−ＯＳＯ３）−ＧｌｃＮＳＯ３（６−ＯＳＯ３）を含む五糖類と同定されている。例えば、Ｍａｃｃａｒａｎａら（１９９３年） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６８、２３８９８〜２３９０５頁を参照のこと。ヘパリンに由来する高度に硫酸化された八糖類または十糖類断片が、ＦＧＦとその受容体との間の相互作用を媒介することもわかっている。例えば、Ｋｌａｇｓｂｒｕｎら（１９９１年） Ｃｅｌｌ ６７、２２９〜２３１頁およびＩｓｈｉｈａｒａら前掲を参照のこと。さらに、ヘパリン由来四糖類から八糖類は、ＦＧＦ−２と結合するが、細胞増殖の刺激においては、ヘパリン由来十糖類およびそれより長いものよりは強力でないことがわかっている。Ｄｅｌｅｈｅｄｄｅら（２００２年） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ３６５、２３５〜２４４頁を参照のこと。化学修飾されたヘパリンまたはヘパラン硫酸製剤に関する結合研究により、２−Ｏ−およびＮ−スルフェート基はＦＧＦ−２とのヘパリン／ヘパラン硫酸相互作用にとって重要であるということが示されている。さらに、ヘパリンには、ＦＧＦＲ−１とのＦＧＦ−２の結合を促進するには、２−Ｏ−およびＮ−スルフェート基、ならびに６−Ｏ−スルフェート基の両方が必要であると考えられる。例えば、Ｇｕｉｍｏｎｄら前掲を参照のこと。
【００２９】
ＦＧＦ上のヘパリン結合領域（単数または複数）は、タンパク質のＮＨ２末端およびＣＯＯＨ末端の双方で暫定的に同定されており、ここでは、塩基性アミノ酸残基がヘパリンのスルフェート基と相互作用し得る。ヘパリンとの結合は、ヘパリン−ＦＧＲ−ＦＧＦＲ複合体の形成の促進に加え、ＦＧＦを安定化し、ＦＧＦをタンパク質分解から保護できる。さらに、ＦＧＦ（例えば、ＦＧＦ−２）は、ＦＧＦＲとの何らかの相互作用とは関係なく、細胞表面ヘパラン硫酸との直接結合に続いて、内部移行され得る。これにより、ＨＳ−ＦＧＦ複合体中のＨＳは、ＦＧＦを核へ輸送するためのシャトルとして働く可能性があるという推測に至る。
【００３０】
本発明に用いられる培養培地は、培養細胞によるタンパク質産生を促進するのに有効であるあらゆる量のヘパリンを含み得る。ヘパリン塩は、酸性スルフェート基のために、通常、細胞培養に用いられる。適したヘパリン塩の限定されない例として、ヘパリンナトリウム塩、ヘパリンカルシウム塩またはヘパリンリチウム塩が挙げられる。培養培地中のヘパリンの濃度は、例えば、１〜１，０００μｇ／ｍｌ、５〜５００μｇ／ｍｌ、１０〜２００μｇ／ｍｌ、１５〜１００μｇ／ｍｌまたは２０〜３０μｇ／ｍｌの範囲であり得る。一実施形態では、培養培地中のヘパリンの濃度は約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０μｇ／ｍｌである。本発明に用いられるヘパリンは、未分画ヘパリン、分画ヘパリンまたはＬＭＷＨなど、いずれの種類のものであってもよい。
【００３１】
多数の種類の培養培地を本発明に使用できる。一実施形態では、本発明に用いられる培養培地は、ウシ胎児血清および有効量のヘパリンまたはヘパリン様分子（例えば、ヘパラン硫酸グリコサミノグリカン）を補給した基本培地を含む。多数の実施例では、培養培地は、少なくとも０．５％、１％、５％または１０％のウシ胎児血清を含む。その他の動物血清または組織抽出物も使用できる。適した基本培地の例として、それだけには限らないが、ＭＥＭ、ＭＥＭ−α、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ、ＩＳＣＯＶＥ、Ｈａｍ Ｆ１２、ＨＡＭ Ｆ１０、Ｍ１９９、Ｌ１５、６Ｍ、ＩＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０、ＮＣＴＣ１０９、Ｆｉｓｃｈｅｒ培地、Ｗａｙｍｏｕｔｈ培地、Ｗｉｌｌｉａｍｓ培地、Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙウシ腎臓培地、Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ腎臓培地またはそれらの混合物が挙げられる。これらの基本培地を、宿主細胞の要求に従って、さらなる栄養素、例えば、糖（例えば、グルコース）、アミノ酸（例えば、グルタミン）、非必須アミノ酸のカクテル、必須アミノ酸のカクテル、ペプチド、酸性塩（例えば、ピルビン酸ナトリウム）、ＥＤＴＡ塩、クエン酸誘導体、アルコール（例えば、エタノール）、アミノアルコール（例えば、エタノールアミン）、ビタミン（例えば、ビタミンＣまたはビタミンＥ）、抗酸化剤（例えば、グルタチオンまたはセレン）、飽和または不飽和鎖を含む脂肪酸（例えば、リノール酸、アラキドン酸、オレイン酸、ステアリン酸またはパルミチン酸）、脂質、リポペプチドまたはリン脂質（例えば、レシチン）などを用いて栄養強化することができる。バッファー溶液、例えば、ＨＥＰＥＳまたは重炭酸塩に基づくものを、特定の脆弱な細胞培養物に、または多量のＣＯ２を生じる培養物に使用できる。多くの場合、培養培地のｐＨが、確実に細胞増殖またはタンパク質産生にとって最適のまま（例えば、６〜８の間、７〜８の間または７．２〜７．５の間）であるよう、また、培養培地が確実に等張性のままであるよう注意される。
【００３２】
本発明はまた、血清不含培地または既知組成培地の使用を特徴とする。一実施形態では、本発明に用いられる血清不含培地は、有効量のヘパリンまたはヘパリン様分子と、有効量のＦＧＦ（類）とを含む。用いられるＦＧＦ（類）の濃度は、例えば、１〜１，０００ｎｇ、１０〜１００ｎｇまたは２５〜７５ｎｇの範囲であり得る。ＦＧＦファミリーは、少なくとも２３種の別個のメンバーを含む。これらのタンパク質は広い分裂促進活性および細胞生存活性を有し、種々の生物学的プロセス、例えば、胚発生、細胞増殖、形態形成、組織修復、腫瘍増殖および浸潤に関与している。同種の種々のＦＧＦメンバーの間での配列相同性は比較的低い。しかし、ＦＧＦについては相当な種交差反応性がある。
【００３３】
一実施形態では、ＦＧＦ−２をヘパリンまたはヘパリン様分子と併用して、哺乳動物宿主細胞によるタンパク質産生を刺激する。一実施例では、用いられるヘパリンまたはヘパリン様分子の濃度は５〜２００μｇ／ｍｌの範囲（例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０または２００μｇ／ｍｌ）であり、用いられるＦＧＦ−２の濃度は１０〜５００ｎｇ／ｍｌの範囲（例えば、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００または５００ｎｇ／ｍｌ）である。ＦＧＦ−２は、種々のＦＧＦ受容体、例えば、それだけには限らないが、ＦＧＦＲ−１、ＦＧＦＲ−２、ＦＧＦＲ−３、ＦＧＦＲ−４およびＦＧＦＲ−５と結合すると報告されている。また、ヘパリンまたはヘパリン様分子は、ＦＧＦ−２シグナル伝達にとって絶対に必要であるわけではないが、これらの分子はシグナル伝達を、その不在において可能であるものよりもかなり低いＦＧＦ−２濃度で促進するということも報告されている。Ｐａｄｅｒａら、ＦＡＳＥＢ Ｊ．、１３、１６７７〜１６８７頁（１９９９年）を参照のこと。
【００３４】
本発明はさらに、哺乳動物宿主細胞によるタンパク質産生を促進するための、ＦＧＦ−２の生物学的に活性な断片または変異体の使用を考慮する。これらの生物学的に活性な断片または変異体は、元のＦＧＦ−２タンパク質のタンパク質産生増強活性の少なくとも相当部分を保持する。これらの断片または変異体は天然に存在する場合もあるし、計画的に設計される場合もある。所望のＦＧＦ−２断片または変異体は、アミノ酸置換、欠失、挿入またはその他の改変によって容易に調製できる。ヘパリンまたはヘパリン様分子と併用した場合の、このような断片または変異体のタンパク質産生増強活性は、以下に示される実施例に記載される方法を用いて容易に評価できる。
【００３５】
本発明に適した哺乳動物宿主細胞としては、それだけには限らないが、ヘパラン硫酸グリコサミノグリカン（ＨＳＧＡＧ）合成に欠陥のある細胞または細胞表面ＨＳＧＡＧのレベルが低下している細胞が挙げられる。適した哺乳動物宿主細胞の限定されない例として、ＨＥＫ２９３−ＦＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｒ７００−０７）、ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｒ６２００７）、ＣＨＯ ｐｇｓＡ−７４５（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎすなわちＡＴＣＣ）、ＣＨＯ ｐｇｓＢ−６５０（ＡＴＣＣ）、ＣＨＯ ｐｇｓＤ−６７７（ＡＴＣＣ）、ＣＨＯ ｐｇｓＢ−６１８（ＡＴＣＣ）およびその他のヘパラン硫酸に欠陥のあるＣＨＯ突然変異細胞、例えば、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる、Ｌｉｄｈｏｌｔら、ＰＲＯＣ． ＮＡＴＬ． ＡＣＡＤ． ＳＣＩ． Ｕ．Ｓ．Ａ．、８９：２２６７−２２７１ （１９９２年）に記載されるものが挙げられる。その他の哺乳動物宿主細胞、例えば、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ−１細胞、骨髄腫ＮＳＯ細胞、ＨＫＢ細胞、ＣＶ−１細胞、Ｃ１２７細胞、Ｖｅｒｏ細胞、Ｓｐ−２細胞、Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙ腎臓細胞、Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ腎臓細胞およびＡＴＣＣまたはその他の商業的供給源から入手できるその他の細胞株も使用できる。さらに、本発明は、対象のタンパク質の産生のための初代細胞培養物、組織培養物、器官培養物またはトランスジェニック哺乳動物の使用を考慮する。ヘパリンまたはヘパリン様分子は、静脈内注入、皮下注射またはその他の適した経路によってトランスジェニック哺乳動物に送達できる。一実施例では、移植片またはカテーテルを用いてヘパリンまたはヘパリン様分子を特定の組織部位に送達する。
【００３６】
さらに、本発明は、対象のタンパク質の産生のための、ハイブリッドまたは融合細胞の使用を特徴とする。ハイブリッド細胞は哺乳動物細胞と癌細胞／不死化細胞（例えば、骨髄腫または芽細胞腫細胞）を融合することによって作製できる。この目的に適した方法として、それだけには限らないが、電気融合および化学的融合（例えば、ポリエチレングリコール融合）が挙げられる。哺乳動物細胞および癌細胞／不死化細胞は、同一種由来であっても異なる種由来であってもよい。多数の実施形態では、癌細胞／不死化細胞は、１種または複数の選択物質に対して感受性である。例えば、癌細胞／不死化細胞は、「ＨＡＴ培地」として知られる、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含有する培養培地に対して感受性であり得る。ＨＡＴ感受性癌細胞／不死化細胞は、ＨＡＴ培地に対して非感受性である哺乳動物細胞と融合できる。ハイブリッド細胞を、融合していない細胞を死滅させるＨＡＴに対して選択する。次いで、融合細胞を所望の特徴についてスクリーニングできる。
【００３７】
一実施形態では、本発明に用いられるハイブリッド細胞は、対象のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞である。ハイブリドーマ細胞を、有効量のヘパリンまたはヘパリン様分子を含む培地において培養することにより、モノクローナル抗体の収率が大幅に高まる。別の実施形態では、本発明に用いられるハイブリッド細胞は、対象のタンパク質をコードする組換え発現カセットを含む。組換え発現カセットは、融合事象の前にハイブリッド細胞中に導入してもよいし、後に導入してもよい。多くの場合、ハイブリッド細胞の調製に用いられる哺乳動物細胞または癌細胞／不死化細胞は、ＨＳＧＡＧ合成に欠陥があるか、または細胞表面ＨＳＧＡＧのレベルが低下している。
【００３８】
本発明に用いられる各哺乳動物宿主細胞（例えば、ハイブリッド細胞）は、対象のタンパク質をコードする組換え発現カセットを含む。組換え発現カセットは、通常、発現制御配列と機能し得る形で連結されたタンパク質コード配列を含む。対象のタンパク質をコードするタンパク質コード配列は、ゲノム配列、ｃＤＮＡまたはそれらの組合せなど、あらゆる種類のものであってよい。対象のタンパク質の発現を指示する適した発現制御配列の選択は、当業者のレベル内の日常的な設計の問題である。適した発現制御配列の限定されない例として、プロモーター、エンハンサー、Ｋｏｚａｋ配列、ポリアデニル化配列またはその他の転写／翻訳調節配列が挙げられる。これらの配列の多数は文献に記載されており、商業的供給業者を介して入手できる。組換え発現カセットに用いられるプロモーター（単数または複数）は構成的であっても誘導性であってもよい。
【００３９】
組換え発現カセットは、種々の手段によって哺乳動物宿主細胞に導入できる。一実施形態では、組換え発現カセットを含む発現ベクターをトランスフェクションまたは形質導入によって哺乳動物宿主細胞に導入する。例示的トランスフェクション技術としては、それだけには限らないが、リン酸カルシウム媒介性トランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、陽イオン性脂質媒介性およびエレクトロポレーションが挙げられる。形質導入は、通常、組換えウイルスベクターによって媒介される。この目的に適したウイルスベクターの限定されない例として、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、アルファウイルス、アストロウイルス、コロナウイルス、オルソミクソウイルス、パポーバウイルス、パラミクソウイルス、パルボウイルス、ピコルナウイルス、ポックスウイルスまたはトガウイルスベクターが挙げられる。リポソームカプセル化発現ベクターも、組換え発現カセットを哺乳動物宿主細胞に導入するために使用できる。発現ベクターは、宿主細胞に一過性に導入することもできるし、または安定に導入することもできる。多くの場合、用いられる発現ベクターは、ベクターでトランスフェクトされているか、形質導入されている宿主細胞の選択を可能にする選択マーカーを含む。適した選択マーカーの限定されない例として、ネオマイシン（Ｇ４１８）、ハイグロマイシン、ピューロマイシン、ゼオシン、コルチン（ｃｏｌｃｈｉｎｅ）、メトトレキサートおよびメチオニンスルホキシミンが挙げられる。
【００４０】
組換え発現カセットはまた、細胞の内因性遺伝子を改変することによって宿主細胞中に組み込むことができる。これらの内因性遺伝子は、対象のタンパク質をコードする。所望の発現または調節作用を達成するために内因性遺伝子のいずれの部分を改変してもよい。例えば、内因性遺伝子のプロモーターをウイルスプロモーターと置換し宿主細胞における遺伝子の発現レベルを高めることができる。
【００４１】
本発明に従って、対象のいずれのタンパク質も製造できる。これらのタンパク質の限定されない例として、治療用、予防用または診断用タンパク質、例えば、ホルモン、増殖因子、インターロイキン、サイトカイン、インターフェロン、コロニー刺激因子、血液因子、抗体、ワクチン、コラーゲン、フィブリノーゲン、ヒト血清アルブミン、組織プラスミノーゲンアクチベーター、抗凝血剤または先天性疾患のための置換酵素が挙げられる。これらのタンパク質の特別な例として、それだけには限らないが、インスリン、ヒト成長ホルモン、エリスロポエチン、ヒト卵胞刺激ホルモン、絨毛性性腺刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、骨形成タンパク質２、副甲状腺ホルモン、αインターフェロン、βインターフェロン、γインターフェロン、インターロイキン−１、インターロイキン−１アンタゴニスト、インターロイキン−２、インターロイキン−１０、インターロイキン−１１、インターロイキン−１２、ケラチノサイト増殖因子、ケラチノサイト増殖因子−２、ヒト顆粒球コロニー刺激因子、ヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、ネシリチド、抗トロンビンＩＩＩ、凝固因子ＩＸ、凝固因子ＶＩＩＩ、凝固因子ＶＩＩａ、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、グルコセレブロシダーゼ、α−Ｄ−ガラクトシダーゼ、αＬ−イズロニダーゼ、α−１，４−グルコシダーゼ、アリールスルファターゼＢ、イズロネート−２−スルファターゼ、アデノシンデアミナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、アルテプラーゼ、ミエリン塩基性タンパク質、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、チロシンヒドロキシラーゼ、ドーパ脱炭酸酵素、グルカゴン、白血球受容体を標的とするモノクローナル抗体（例えば、α４インテグリンアンタゴニスト、抗胸腺細胞グロブリン、ＣＤ２アンタゴニスト、ＣＤ３アンタゴニスト、ＣＤ４アンタゴニスト、ＣＤ２０アンタゴニスト、ＣＤ２２アンタゴニスト、ＣＤ３３アンタゴニストおよびＣＤ５２アンタゴニスト）、サイトカインを標的とするモノクローナル抗体（例えば、ケモカインアンタゴニスト、ＩＬ−２アンタゴニスト、ＩＬ−４アンタゴニスト、ＩＬ−５アンタゴニスト、ＩＬ−６アンタゴニスト、ＩＬ−１２アンタゴニスト、セレクチンアンタゴニストおよびＴＮＦ−αアンタゴニスト）、癌細胞マーカーまたは受容体を標的とするモノクローナル抗体（例えば、上皮増殖因子アンタゴニスト、ヒト上皮成長因子受容体２アンタゴニスト、ＭＵＣ−１アンタゴニストおよび血管内皮増殖因子アンタゴニスト）およびその他のモノクローナル抗体（例えば、補体アンタゴニスト、Ｃ５阻害剤、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニスト、ＩｇＥアンタゴニストおよび呼吸器合胞体ウイルスＦ−タンパク質アンタゴニスト）が挙げられる。
【００４２】
その他の種類の抗体または抗体フラグメントも、本発明に従って製造できる。これらの抗体または抗体フラグメントの例として、それだけには限らないが、ヒト化抗体、ヒト抗体、一本鎖抗体、キメラ抗体、合成抗体、組換え抗体、ハイブリッド抗体、単一特異性抗体、多特異性抗体、非特異的抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ＦｄまたはｄＡｂが挙げられる。ｉｎ ｖｉｔｒｏディスプレイ技術または進化的戦略を用いることによって選択された高親和性結合剤も本発明に従って製造できる。これらの高親和性結合剤として、それだけには限らないが、ペプチド、抗体または抗体模倣体、例えば、Ｂｉｎｚら（２００４年） Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２２、５７５〜５８２頁またはＬｉｐｏｖｓｅｋら（２００４年） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ２９０、５１〜６７頁に記載されるものが挙げられる。
【００４３】
本発明に従って製造できるその他の対象のタンパク質として、それだけには限らないが、キナーゼ、ホスファターゼ、Ｇタンパク質共役受容体、増殖因子受容体、サイトカイン受容体、ケモカイン受容体、細胞表面抗体（膜結合型免疫グロブリン）、ＢＭＰ／ＧＤＦ受容体、ニューロン受容体、イオンチャンネル、プロテアーゼ、転写因子、ポリメラーゼ、プロトロンビン、トロンビン、α−１抗トリプシン、アルグルセラーゼ、イミグルセラーゼ、トロンボポエチン、α−１プロテイナーゼ阻害剤、カルシトニン、エルカトニン、ゴセレリン、ナファレリン、ブセレリン、プロインスリン、インスリン類似体、アミリン、Ｃ−ペプチド、ソマトスタチン、オクトレオトリド（ｏｃｔｒｅｏｔｒｉｄｅ）、バソプレシン、インスリントロピン（ｉｎｓｕｌｉｎｏｔｒｏｐｈｉｎ）、ヒトプロテインＣ、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子、インスリン様成長因子、神経成長因子、分泌型ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質（例えば、ｓＦＲＰ−１〜５）またはセレクチン（例えば、セレクチンＰ、セレクチンＥまたはセレクチンＬ）が挙げられる。
【００４４】
本発明はまた、ウイルスタンパク質またはその免疫原性断片の製造を特徴とする。これらのウイルスタンパク質または断片を用いて、対応するウイルスに対する免疫防御反応を誘発するためのワクチンを調製できる。これらのウイルスタンパク質の限定されない例として、ヒト免疫不全ウイルス（例えば、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２）、インフルエンザウイルス（例えば、インフルエンザＡ、ＢおよびＣウイルス）、コロナウイルス（例えば、ヒト呼吸器コロナウイルス）、肝炎ウイルス（例えば、肝炎ウイルスＡ〜Ｇ）またはヘルペスウイルス（例えば、ＨＳＶ１〜９）のタンパク質が挙げられる。その他のウイルスのタンパク質も製造できる。これらのウイルスとしては、それだけには限らないが、ニューモウイルス、モルビリウイルス、ルブラウイルス、アデノウイルス、アレナウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、フレボウイルス、ハンタウイルス、トロウイルス、エボラ様ウイルス、ヘパシウイルス、フラビウイルス、シンプレックスウイルス、バリセロウイルス、サイトメガロウイルス、ロゼオロウイルス、リンホクリプトウイルス、トゴトウイルス、オルソポックスウイルス、アビポックスウイルス、レポリポックスウイルス、レンチウイルス、スプーマウイルス、リッサウイルス、ノビラブドウイルス、ベシクロウイルス、アルファウイルス、ブビウイルス（ｂｕｂｉｖｉｒｕｓ）、ライノウイルス、アフトウイルス（ａｐｈｔｏｖｉｒｕｓ）、灰白髄炎ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、ウシヘルペスウイルス、パラミクソウイルス、ニューカッスル病ウイルス、レスピラトリーシンシチオウイルス（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｉｔｉｏ ｖｉｒｕｓ）、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、パルボウイルス、パポーバウイルス、ロタウイルス、胃腸炎ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス、風疹ウイルス、ブタコレラウイルスまたは狂犬病ウイルスが挙げられる。
【００４５】
本発明によって製造される対象のタンパク質は、それだけには限らないが、分泌型タンパク質、細胞質性タンパク質または膜結合型タンパク質であり得る。対象のタンパク質の配列は、天然に存在するものであるか、または遺伝子操作されたものであり得る。一実施形態では、対象のタンパク質は、対象のタンパク質の単離、精製、検出、固定化、安定化、フォールディングまたは標的化を容易にするポリペプチドタグを含む融合タンパク質である。適したポリペプチドタグの限定されない例として、ストレプトアビジンタグ、ＦＬＡＧタグ、ｃ−ｍｙｃタグ、ポリヒスチジンタグ、インフルエンザＨＡタグ、ＶＳＶ糖タンパク質タグ、Ｖ５タグ、単純ヘルペスウイルスタグ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼまたはＦｃ断片が挙げられる。いくつかの場合では、ポリペプチドタグは、選択されたプロテアーゼによって対象のタンパク質から切断除去できる。
【００４６】
別の実施形態では、対象のタンパク質は、哺乳動物宿主細胞によるタンパク質の分泌を促進するシグナルペプチドを含む。シグナルペプチドは、対象のタンパク質にとって内因性である場合も、異種性である場合もある。シグナルペプチドは、シグナル認識粒子と相互作用してリボソームをＥＲに向けることができ、ここで翻訳と同時の挿入が起こる。多数のシグナルペプチドは高度に疎水性であり、正に帯電した残基を有する。シグナル配列は、ＥＲの槽面上に位置するシグナルペプチダーゼ、プロテアーゼによって成長中のペプチド鎖から除去され得る。したがって、多くの場合、培養培地から単離される分泌型タンパク質は、元のシグナルペプチドを有していない。
【００４７】
多数の実施形態では、本発明によって製造される分泌型または膜結合型タンパク質は、細胞表面ＨＳＧＡＧと結合しないか、相互作用しない。これによって、哺乳動物宿主細胞によるタンパク質の取り込みまたは内部移行が妨げされるか、減少する。一実施例では、本発明によって製造される対象のタンパク質はヘパラナーゼすなわち、その基質がヘパラン硫酸（ＨＳ）である酵素ではない。
【００４８】
本発明によって製造される対象のタンパク質は、種々の手段によって単離または精製できる。タンパク質単離／精製に適している初期物質の限定されない例として、培養培地または細胞溶解物が挙げられる。例示的単離法として、それだけには限らないが、アフィニティークロマトグラフィー（例えば、イムノアフィニティークロマトグラフィー）、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、タンパク質沈殿（例えば、免疫沈降）、差示的可溶化、電気泳動、遠心分離、結晶化またはそれらの組合せが挙げられる。
【００４９】
多数の実施形態において、単離された対象のタンパク質は、その他のタンパク質または夾雑物を実質的に含まない。例えば、単離された対象のタンパク質は、その他のタンパク質から少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％または１００％純粋であり得る。一実施例では、単離されたタンパク質は、意図される用途を干渉する夾雑物をわずかな量しか含まない。本発明に従って単離された対象のタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥまたはイムノアッセイなどの標準技術を用いて確認または評価できる。この目的に適したイムノアッセイとして、それだけには限らないが、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、サンドイッチもしくはイムノメトリックアッセイ、ラテックスもしくはその他の粒子凝集、またはプロテオミクスチップが挙げられる。単離された対象のタンパク質を確認または分析するために、タンパク質配列決定および質量分析も使用できる。
【００５０】
さらに、本発明は、哺乳動物宿主細胞による弱毒化ウイルスの産生を増加させるためのヘパリンまたはヘパリン様分子の使用を考慮する。これらの弱毒化ウイルスは、ワクチン製剤の調製のために使用できる。この目的に適した哺乳動物宿主細胞として、それだけには限らないが、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙ腎臓細胞またはＭａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ腎臓細胞が挙げられる。この目的のために用いられるヘパリンまたはヘパリン様分子の量は、弱毒化ウイルスの収率を向上させるのに有効であればいずれの量でもあり得る（例えば、約１０〜１，０００μｇ／ｍｌ、例えば、約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００μｇ／ｍｌ）。培養培地が血清不含培地である場合は、ＦＧＦ−２またはその他のＦＧＦＲアゴニストを、ヘパリンまたはヘパリン様分子と併用することもできる。有効量のＦＧＦ−２またはその他のＦＧＦは、それだけには限らないが、１０〜５００ｎｇ／ｍｌの範囲（例えば、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００または５００ｎｇ／ｍｌ）であり得る。さらに、ＦＧＦを、動物血清を含む培養培地に添加して、弱毒化ウイルスまたはその他の対象のタンパク質の収率をさらに改善することができる。
【００５１】
Ｂ．遺伝子組換え哺乳動物宿主細胞によるタンパク質産生を増加させるための、ヘパリン様分子またはその他のＦＧＦＲアゴニストの使用
本発明はまた、哺乳動物宿主細胞によるタンパク質産生を刺激するための、ヘパリン様分子またはその他のＦＧＦＲアゴニストの使用を特徴とする。ヘパリン様分子の限定されない例として、硫酸化グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）、例えば、ヘパラン硫酸グリコサミノグリカン（ＨＳＧＡＧ）；硫酸化プロテオグリカン、例えば、ヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）；またはその断片が挙げられる。本発明に適したその他のヘパリン様分子として、それだけには限らないが、ヘパリンオリゴ糖、合成硫酸化ポリマー、種々の硫酸化分子、種々のスルホン化分子、合成多環芳香族化合物、芳香環の重合によって合成された多環芳香族化合物またはそれらの組合せもしくは断片が挙げられる。参照により本明細書に組み込まれるＣａｓｕ （１９８５年） Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４３、５１〜１３４頁に記載されるヘパリン様分子も使用できる。これらのヘパリン様分子のすべてが、哺乳動物宿主細胞（例えば、ヘパラン硫酸欠損哺乳動物宿主細胞）によるタンパク質産生を刺激できる。多くの場合、本発明に用いられるヘパリン様分子は、高度に硫酸化されており、培養細胞におけるＦＧＦＲシグナル伝達の活性化を促進できる。
【００５２】
少なくとも４種の別個のＦＧＦＲファミリーメンバー、すなわち、ＦＧＦＲ−１、ＦＧＦＲ−２、ＦＧＦＲ−３およびＦＧＦＲ−４が同定されている。ＦＧＦＲは、そのリガンド親和性および組織分布において互いに異なる。全長の代表的なＦＧＦＲは、複数の免疫グロブリン様ドメインと、単一の疎水性膜貫通セグメントと細胞質チロシンキナーゼドメインとからなる細胞外領域を含む。一実施形態では、本発明に用いられるヘパリン様分子は、培養細胞においてＦＧＦＲ−１を活性化またはＦＧＦＲ−１の活性化を促進できる。
【００５３】
細胞表面ＦＧＦＲの活性化は、ＦＧＦ、ＦＧＦＲおよび細胞表面ＨＳＧＡＧ間の相互作用を含むと考えられている。ＦＧＦおよび細胞表面ＨＳＧＡＧがどのように協力してＦＧＦＲの活性化を誘導するかを説明するために、少なくとも３種の別個のモデルが提案されている。「成長ホルモン」モデルでは、単一のＦＧＦが２つのＦＧＦＲを二量体化し、ＨＳＧＡＧはＦＧＦおよびＦＧＦＲの細胞外ドメインの双方と結合する。「ＨＳ依存性二量体化」モデルでは、ＨＳ鎖が２つのＦＧＦと結合し、ここで二量体リガンドがＦＧＦＲを二量体化する。「二量体の二量体」モデルでは、ＦＧＦとＨＳＧＡＧの２つの独立した複合体が、ＦＧＦＲの二量体化を引き起こし、それによってその細胞内キナーゼドメインを活性化する。
【００５４】
細胞表面ＧＡＧ鎖は、小さいタンパク質コアと結合して、ＨＳＰＧを形成することが多い。ＨＳＰＧは、コアタンパク質の疎水性膜貫通ドメインによって、またはコアタンパク質と共有結合しているグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーによって細胞表面に固定され得る（膜貫通ＨＳＰＧ）。膜貫通ＨＳＰＧの限定されない例として、それだけには限らないが、グリピカン、セレブログリカン、βグリカン、パールカン、ＣＤ４４およびシンデカンファミリーの種々のメンバー、例えば、シンデカン１、シンデカン２（フィブログリカン）、シンデカン３（Ｎ−シンデカン）およびシンデカン４（リュードカン）が挙げられる。グリピカンおよびセレブログリカンはまた、共有結合ＧＰＩアンカーを介して細胞膜と結合している場合もある。さらに、ＨＳＰＧは細胞表面高分子との相互作用を介して細胞表面と、非共有結合によって結合する場合もある（末梢膜ＨＳＰＧ）。
【００５５】
一実施形態では、本発明は、培養哺乳動物細胞によるタンパク質産生を増強するための可溶性ＨＳＧＡＧまたはＨＳＰＧまたはその断片の使用を特徴とする。可溶性ＨＳＧＡＧまたはＨＳＰＧまたはその断片は、固定されたまたは大きなＨＳＧＡＧまたはＨＳＰＧ分子の化学的または酵素的消化によって調製できる。例えば、膜貫通またはＧＰＩによって固定されたＨＳＰＧは、そのコアタンパク質のタンパク質分解による消化によって、または内因性ホスホリパーゼの作用によって細胞膜から放出され得る。同様に、ＨＳＧＡＧ鎖または断片は、多糖骨格の化学的または酵素的消化によって調製できる。有効量の可溶性ＨＳＧＡＧまたはＨＳＰＧ（またはその断片）を培養培地に添加し、培養細胞によるタンパク質産生を刺激できる。多くの場合、用いられる可溶性ＨＳＧＡＧまたはＨＳＰＧ（またはその断片）の量は、タンパク質産生増強作用が生じるためには、約１０〜２００μｇ／ｍｌのヘパリン（例えば、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００μｇ／ｍｌのヘパリン）に相当する。
【００５６】
一実施例では、本発明に用いられる可溶性ＨＳＧＡＧまたはＨＳＰＧ（またはその断片）は、少なくとも１つの二糖類単位ＩｄｏＡ（２−ＯＳＯ３）−ＧｌｃＮＳＯ３またはＩｄｏＡ（２−ＯＳＯ３）−ＧｌｃＮＳＯ３（６−ＯＳＯ３）を含む。別の実施例では、本発明に用いられる可溶性ＨＳＧＡＧまたはＨＳＰＧ（その断片）は、二糖類単位ＩｄｏＡ（２−ＯＳＯ３）−ＧｌｃＮＳＯ３またはＩｄｏＡ（２−ＯＳＯ３）−ＧｌｃＮＳＯ３（６−ＯＳＯ３）を含む五糖類、八糖類または十糖類を含む。さらに別の実施例では、本発明に用いられる可溶性ＨＳＧＡＧまたはＨＳＰＧ（またはその断片）は、複数の二糖類単位ＩｄｏＡ（２−ＯＳＯ３）−ＧｌｃＮＳＯ３またはＩｄｏＡ（２−ＯＳＯ３）−ＧｌｃＮＳＯ３（６−ＯＳＯ３）を含む。
【００５７】
ヘパリンまたはヘパリン様分子は、可溶性型の他に、基質上に固定され、哺乳動物宿主細胞によるタンパク質産生を刺激することができる。一実施例では、基質は培養宿主細胞のための物理的支持体を提供する（例えば、ヘパリンまたはヘパリン様分子によってコートされた培養プレート）。
【００５８】
さらに、哺乳動物宿主細胞によるタンパク質産生は、細胞におけるＨＳＧＡＧまたはＨＳＰＧの内因性合成を増強することによって増加させることができる。ヘパラン硫酸鎖の骨格は、グルクロノシルトランスフェラーゼおよびＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ活性の双方を有するヘパラン硫酸シンターゼによって合成されるようである。この骨格はさらに、一連のスルホトランスフェラーゼおよび炭水化物修飾酵素、例えば、Ｎ−脱アセチル化酵素／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ、Ｃ−５エピメラーゼ、２−Ｏスルホトランスフェラーゼ、６−Ｏスルホトランスフェラーゼおよび３−Ｏスルホトランスフェラーゼによって修飾することができる。したがって、これらの酵素の発現または活性を増大させることによって、細胞表面ＨＳＧＡＧまたはＨＳＰＧを増加させ、その結果、細胞によるタンパク質産生を改善することができる。これを達成するために、上記の酵素をコードする発現ベクターを哺乳動物宿主細胞に導入し、対象のタンパク質と同時発現させることができる。
【００５９】
Ｃ．遺伝子組換え哺乳動物宿主細胞によるタンパク質産生を増加させるための構成的に活性なＦＧＦＲまたはＦＧＦＲエフェクターの同時発現
構成的に活性なＦＧＦＲまたはＦＧＦＲ下流エフェクターを用いて培養哺乳動物宿主細胞によるタンパク質産生を促進できる。突然変異、遺伝子融合またはその他の遺伝子変更によって生じた構成的に活性なＦＧＦＲが、多数のヒト癌において観察されている。構成的に活性なＦＧＦＲ突然変異体の例として、それだけには限らないが、致死性骨異形成症Ｉ型突然変異を含むＦＧＦＲ（例えば、ＦＧＦＲ１または配列番号１中のＡｒｇ２５０→Ｃｙｓ突然変異およびＦＧＦＲ３または配列番号２中のＡｒｇ２４８→Ｃｙｓ突然変異）およびキナーゼドメインの活性化ループ中のミスセンス突然変異を含むＦＧＦＲ（例えば、ＦＧＦＲ１または配列番号１中のＬｙｓ６５６→Ｇｌｕ突然変異およびＦＧＦＲ３または配列番号２中のＬｙｓ６５０→Ｇｌｕ突然変異）が挙げられる。その他の構成的に活性なＦＧＦＲ突然変異体、例えば、すべて参照により本明細書に組み込まれる、Ｄｅ Ｍｏｅｒｌｏｏｚｅら（１９９７年） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｇｅｎｅｔ． Ｄｅｖ． ７、３７８〜３８５頁、Ｗａｎｇら（２００２年） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ６２、１８９８〜１９０３頁またはＷａｎｇら（２００４年） Ｐｒｏｓｔａｔｅ ５８、１〜１２頁に記載されるものも使用できる。さらに、本発明は、構成的に活性なキメラＦＧＦＲ、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｋｕｄｌａら （１９９８年） Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １４２、２４１〜２５０頁に記載されるものの使用を考慮する。これらの構成的に活性なＦＧＦＲをコードする組換え発現カセットは容易に構築し、哺乳動物宿主細胞に導入することができる。このような構成的に活性なＦＧＦＲとの同時発現により、対象のタンパク質の収率を大幅に高めることができる。
【００６０】
本発明はまた、哺乳動物宿主細胞によるタンパク質産生を改善するためのＦＧＦＲ下流エフェクターの使用を特徴とする。ＦＧＦＲエフェクターの限定されない例として、Ｃｒｋ（ｖ−ｃｒｋ肉腫ウイルスＣＴ１０癌遺伝子相同体）、ホスホリパーゼＣγ、線維芽細胞増殖因子受容体基質２およびＳＨＣ（Ｓｒｃ相同性２ドメイン含有）トランスフォーミングタンパク質が挙げられる。これらのタンパク質のすべてが、その活性化の際にＦＧＦＲのホスホチロシン残基と結合できるので、ＳＨ２−ドメインタンパク質である。本発明に使用できるその他のＦＧＦＲエフェクターとして、ＭＡＰＫシグナル伝達経路中の種々の成分、例えば、ＧＲＢ２（増殖因子受容体結合型タンパク質２）、ＳＯＳ１（セブンレス相同体１の息子）、ＲＲＡＳ２（関連ＲＡＳウイルス（ｒ−ｒａｓ）癌遺伝子相同体２）、ＲＡＦ１（ｖ−ｒａｆ−１ネズミ白血病ウイルス癌遺伝子相同体１）、ＭＡＰ２Ｋ１（マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ１）、ＭＡＰ２Ｋ２（マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ２）、ＭＡＰＫ１（マイトジェン活性化プロテインキナーゼ１）、ＳＲＦ（血清応答因子またはｃ−ｆｏｓ血清応答エレメント結合性転写因子）、ＦＯＳ（ｖ−ｆｏｓ ＦＢＪネズミ骨肉腫ウイルス癌遺伝子相同体）、ＥＬＫ１（ＥＬＫ１、ＥＴＳ癌遺伝子ファミリーのメンバー）、ＥＬＫ４（ＥＬＫ４、ＥＴＳ−ドメインタンパク質またはＳＲＦアクセサリータンパク質１）およびｃ−ＭＹＣ（ｖ−ｍｙｃ骨髄球腫症ウイルス癌遺伝子相同体）が挙げられる。構成的に活性なＦＧＦＲ同様、ＦＧＦＲ下流エフェクターをコードする組換え発現カセットは、容易に構築し、哺乳動物宿主細胞に導入し、対象のタンパク質とともに同時発現させることができる。
【００６１】
Ｄ．グリコサミノグリカン生合成インデューサー
本発明はさらに、哺乳動物細胞によるタンパク質産生を改善するための、β−キシロシドまたはその他のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）生合成インデューサーの使用を特徴とする。ヘパラン硫酸はヘパラン硫酸プロテオグリカンのグリコサミノグリカン成分としてｉｎ ｖｉｖｏで合成される。ＧＡＧ生合成は、ＵＤＰ−Ｘｙｌからコアタンパク質のセリン残基のヒドロキシル基へのキシロース残基の移動によって開始され、それに続いて２つのＧａｌ残基および１つのＧｌｃＡ残基を付加して結合四糖類ＧｌｃＡβ１−３Ｇｌａβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｘｙｌβ１を形成することがわかっている。次いで、この結合四糖類上でヘパラン硫酸が合成される。β−キシロシドの細胞培養培地への添加がＧＡＧ鎖の伸長を誘導するということも報告されている。
【００６２】
本発明は、β−キシロシドの、培養培地への添加は、培養哺乳動物宿主細胞によるタンパク質産生を大幅に増加させるということを実証する。適したβ−キシロシドの限定されない例として、それだけには限らないが、４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−キシロシド、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−キシロシドおよびベンジル−β−Ｄ−キシロシドが挙げられる。培養培地中のβ−キシロシドの濃度は、例えば、１０〜５００μｇ／ｍｌ、２０〜２００μｇ／ｍｌまたは５０〜１００μｇ／ｍｌの範囲であり得る。培養培地は、動物血清（例えば、１％、５％または１０％のウシ胎児血清）をさらに含んでもよく、または血清不含であってもよい。血清不含培地を用いる場合には、培養哺乳動物宿主細胞の産生率をさらに向上させるために、ＦＧＦ−２またはその他のＦＧＦ因子を補給してもよい。一実施例では、本発明に用いられる培養培地は、約２０〜約２００μｇ／ｍｌの４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−キシロシドを含む。別の実施例では、培養培地は約５０〜約１００μｇ／ｍｌの４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−キシロシドを含む。本明細書に記載される対象のタンパク質はいずれも、β−キシロシドまたはその他のＧＡＧ生合成インデューサーによって増強された哺乳動物発現系によって製造できる。
【００６３】
Ｅ．薬剤組成物
本発明によって製造される治療用または予防用タンパク質を用いて、ヒト疾患を治療または予防するための薬剤組成物を調製できる。本発明の薬剤組成物は、通常、治療有効量または予防有効量の対象のタンパク質と、薬理学上許容される担体とを含む。本明細書において「製薬上許容される担体」とは、いずれかの溶媒、分散媒、被膜、抗菌剤または抗真菌剤、等張剤または吸収遅延剤などであり得る。製薬上活性な物質のためのこのような媒体および物質の使用は当技術分野ではよく知られている。補助的有効成分も、本発明の薬剤組成物に組み込むことができる。
【００６４】
本発明の薬剤組成物の投与は、標的組織がその経路によって利用可能である限り、一般的な経路のいずれよってであってもよい。これとしては、経口、鼻腔、口内、直腸、経膣または局所が挙げられる。あるいは、投与は同所、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、腫瘍内、周囲、カテーテル法または静脈内注射によってであり得る。
【００６５】
本発明の薬剤組成物はまた、非経口的に、または腹膜内に投与できる。対象のタンパク質の溶液は、界面活性剤、例えば、ヒドロキシプロピルセルロースと適当に混合した水中で調製できる。また、分散物は、グリセロール、液体ポリエチレングリコールまたはその混合物中で、あるいはオイル中で調製できる。通常の保存および使用条件下では、これらの製剤は、微生物の増殖を防ぐための防腐剤を含み得る。
【００６６】
注射用用途に適した薬剤の形として、滅菌水溶液もしくは分散物または滅菌注射用溶液または分散物の即時調製のための滅菌粉末が挙げられる。多くの場合、薬剤の形は無菌であり、容易な注射針通過性が存在する程度に流動体である。薬剤の形はまた、製造および貯蔵条件下で安定であり、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に抗して保存できる。適した薬剤担体としては、それだけには限らないが、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）または植物油を含有する溶媒または分散媒が挙げられる。適切な流動性は、例えば、被膜、例えば、レシチンの使用によって、分散物の場合には必要とされる粒径の維持によって、または界面活性剤の使用によって維持できる。微生物の作用の阻止は、種々の抗菌剤または抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされ得る。多くの場合、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射用組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させる物質、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用によってもたらされ得る。
【００６７】
滅菌注射用溶液は、必要な量の治療用または予防用タンパク質を、上記で列挙した種々のその他の成分を含む適当な溶媒に組み込むこと、必要に応じて、続いて濾過滅菌することによって調製できる。通常、分散物は、種々の滅菌有効成分を、基礎分散媒と必要なその他の成分とを含む滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製する。滅菌注射用溶液を調製するための滅菌粉末の場合には、好ましい調製方法は、予め滅菌濾過した、有効成分およびいずれかのさらなる所望の成分の溶液から、有効成分およびいずれかのさらなる所望の成分の粉末が得られる真空乾燥または凍結乾燥技術である。
【００６８】
経口投与用に、本発明によって製造される治療用または予防用タンパク質を賦形剤と組合せ、摂取可能でないマウスウォッシュおよび歯磨剤の形で使用できる。マウスウォッシュは、必要な量の治療用または予防用タンパク質を、適当な溶媒、例えば、ホウ酸ナトリウム溶液（ドーベル液）に組み込んで調製できる。あるいは、治療用または予防用タンパク質を、ホウ酸ナトリウム、グリセリンおよび重炭酸カリウムを含有する殺菌洗浄液に組み込むことができる。治療用または予防用タンパク質はまた、歯磨剤、ゲル、ペースト、粉末またはスラリーに分散することができる。
【００６９】
製剤すると、組成物または溶液を、投与製剤と適合する方法で、治療上または予防上有効であるような量で投与できる。投与計画は、タンパク質の作用、病変部位、疾患の重篤度、患者の年齢、性別および食事、いずれかの炎症の重篤度、投与時間およびその他の臨床因子などの種々の因子に基づいて主治医によって決定され得る。一実施例では、全身投与または注射投与を、最小で有効な用量で開始し、事前選択した時間経過にわたって陽性作用が観察されるまで用量を増加させる。続いて、現れ得る何らかの悪影響を考慮しながら、対応する作用の増大が得られるレベルを制限しながら、投与量の漸増を行う。
【００７０】
治療用または予防用タンパク質の毒性および治療効力は、細胞培養物または実験動物モデルにおいて標準製薬手順によって調べることができる。例えば、対象のタンパク質のＬＤ５０（集団の５０％にとって致命的である用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療上有効な用量）は、従来の手段を用いて求めることができる。毒性作用と治療作用との間の用量比が治療指数であり、比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表すことができる。多くの場合、大きな治療指数を示す治療用タンパク質が選択される。
【００７１】
上記実施形態および以下の実施例は、制限するものではなく例示のために示されるということは理解されなくてはならない。本発明の範囲内の種々の変法および改変は、本説明から当業者に明らかとなるであろう。
【実施例】
【００７２】
（実施例１）
細胞培養およびＤＮＡ構築物
哺乳動物細胞株（ＨＥＫ２９３−ＦＴ、ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ、ＣＨＯ−ＤＵＫＸおよびＬｅｃ．３．２．８．１）を加湿したインキュベーター中で、５％ＣＯ２を用い、３７℃で増殖させ、維持した。ＨＥＫ２９３細胞は、５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補給したフリースタイル２９３培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で培養した。ＣＨＯ−ＤＵＫＸ安定株は、１０％ＦＢＳおよび２００ｎＭメトトレキサート（ＭＴＸ）を含有するα培地で増殖させた。ＨＥＫ２９３安定株は、１０％ＦＢＳおよび１００ｎＭ ＭＴＸを含有するα培地で培養した。
【００７３】
一過性発現は、５０ｍｌスピナまたは１Ｌスピナのいずれかで実施した。５０ｍｌ培養容積については、２．５ｍｌの血清不含２９３培地中で、２５μｇのプラスミドＤＮＡを４００μｇのポリエチレンイミン（ＰＥＩ、２５ｋＤａ、直鎖、ＨＣｌによってｐＨ７．０に中和、１ｍｇ／ｍｌ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、ペンシルベニア州Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ、ＰＡ）と混合した。１リットルの培養容積については、５０ｍｌの血清不含２９３培地中で、５００μｇのＤＮＡを４ｍｇのＰＥＩと混合した。次いで、スピナにおいて、混合物を、０．５×１０６個細胞／ｍｌの密度の、５％ＦＢＳを含む２９３培地中の５０ｍｌまたは１リットルのいずれかのＨＥＫ２９３細胞と混合した。スピナを３７℃で、Ｐ２００５スターラー（Ｂｅｌｌｃｏ）上、回転速度１７０ｒｐｍで７２〜１４４時間インキュベートし、その後回収した。
【００７４】
ＤＮＡ構築物には２種のベクター（ｐＳＭＥＤ２およびｐＳＭＥＤＡ）を用いた。ｐＳＭＥＤＡ、ｐＳＭＥＤ２由来の誘導体は図１に記載されている。ベクターが、ＥＢＮＡ−１ウイルス抗原を含む細胞において増幅され得るようにＯｒｉＰエレメントをｐＳＭＥＤＡに挿入した。このベクターは、ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞におけるタンパク質産生の数倍の増加を可能にする。ｓＦＲＰ−１（分泌型ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質１）構築物には、Ｃ末端Ｈｉｓ６タグおよび突然変異ＶＦＫ３１２−３１４ＬＥをＰＣＲプライマー中、停止コドンの前に組み込んだ。ＰＣＲ産物をＳａｌＩおよびＥｃｏＲＩで消化した。ゲル精製したＤＮＡ断片をｐＳＭＥＤ２（ｐＷＺ１０２８を作製）またはｐＳＭＥＤＡ（ｐＷＺ１０４９を作製）にサブクローニングした。
【００７５】
ＣＨＯ−ＤＵＫＸ ｓＦＲＰ−１安定株の確立のために、構築物ｐＷＺ１０２８をＣＨＯ−ＤＵＫＸ細胞にトランスフェクトし、トランスフェクトーマを５０ｎＭ、１００ｎＭまたは２００ｎＭのメトトレキサート（ＭＴＸ）に対して３週間選択した。７２コロニーをスクリーニングした後、２００ｎＭ ＭＴＸに対して耐性であり、ｓＦＲＰ−１の最高発現レベルを有する３コロニー（２００−１０、２００−１１および２００−１２と名づけた）を単離した。また、ＨＥＫ２９３細胞は、２コピーのジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子を有しているにもかかわらず、１００ｎＭ以上の濃度のＭＴＸに対して感受性であることがわかった。ｓＦＲＰ−１についてＨＥＫ２９３安定株を構築するために、ｐＷＺ１０２８をＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡにトランスフェクトし、トランスフェクトーマを１００ｎＭまたは２５０ｎＭのＭＴＸに対して３週間選択した。次いで、最良のクローンのうちの２つ、１００−５および１００−２０を単離した。
【００７６】
（実施例２）
ヘパリンはトランスフェクトされた細胞によるｓＦＲＰ−１産生を増強する
Ｃ末端ｈｉｓ６タグをつけたｓＦＲＰ−１を、実施例１に記載の通り、ＨＥＫ２９３−ＦＴ細胞において一過性に発現させた。５０μｇ／ｍｌのヘパリン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）をＤＮＡトランスフェクションの間またはその後（図２における「トランスフェクション後誘導時間」）に細胞培養物に添加した。コンディショニング培地を種々の時点（図２中「増殖時間」）で回収した。タンパク質サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、０．２μｇ／ｍｌのマウスモノクローナル抗ｈｉｓ４抗体（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてイムノブロッティングした（図２）。イムノブロッティングは、Ｚｈｏｎｇら（２００４年） ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ５６２、１１１〜１１７頁に記載されるとおり実施した。図２に示されるように、ヘパリンはトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞によるｓＦＲＰ−１産生を大幅に増加させた。最大の増加は、ＤＮＡトランスフェクションの４８時間後に培養培地にヘパリンを添加した場合に観察された。その他の実験では、組換えによって発現されたアグレカナーゼ−１またはアグレカナーゼ−２タンパク質について、このような増加は観察されなかった（データは示していない）。
【００７７】
Ｃ末端Ｈｉｓ６タグをつけたｓＦＲＰ−１も、ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞において一過性に発現させた。ＤＮＡトランスフェクションの４８時間後、種々の濃度のヘパリンを細胞培養物に添加した（図３中「μｇ／ｍｌヘパリン」）。ＤＮＡトランスフェクションの１２０時間または１４４時間後にコンディショニングされた培地を回収した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってタンパク質サンプルを分離し、マウスモノクローナル抗ｈｉｓ４抗体を用いてイムノブロッティングした（図３）。図３はタンパク質産生増強にとっての最適ヘパリン濃度は約２５μｇ／ｍｌであるということを示す。
【００７８】
一過性にトランスフェクトされた細胞に加え、ｓＦＲＰ−１について安定ＨＥＫ２９３細胞株（クローン１００−５および１００−２０）も用いて、タンパク質産生に対するヘパリンの刺激作用を評価した。クローン１００−５および１００−２０細胞を、種々の濃度のウシ胎児血清（図４中「ＦＢＳ」）の存在下で増殖させた。５０μｇ／ｍｌのヘパリンを新鮮培地とともに添加した。ヘパリン処理の７２時間後にコンディショニング培地を回収した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってタンパク質サンプルを分離し、マウスモノクローナル抗ｈｉｓ４抗体を用いて免疫染色した（図４）。ヘパリンは、クローン１００−５および１００−２０細胞によるｓＦＲＰ−１産生を大幅に増強した。また、ｓＦＲＰ−１産生は、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）の濃度が高まるにつれて増加し、このことは、ＦＢＳが哺乳動物細胞においてタンパク質産生を刺激できる因子（単数または複数）を誘導するということを示す。
【００７９】
ｍＲＮＡレベルに対するヘパリンの作用を、ノーザンブロット分析によって調べた。ＲＮＡｑｕｅｏｕｓ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて２９３細胞から全ＲＮＡを調製した。１．１％アガロース／２％ホルムアルデヒドＭＯＰＳゲル電気泳動によって１０μｇのＲＮＡを分離し、８×ＳＳＣを用いてＮｙｔｒａｎ Ｓｕｐｅｒｃｈａｒｇｅメンブラン（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ）上にブロッティングし、ＤＩＧイージーＨｙｂ溶液（Ｒｏｃｈｅ）中でジゴキシゲニン標識ＤＮＡプローブを用いて５０℃で一晩ハイブリダイズした。０．５×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳおよび０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳを用いて６０℃で洗浄した後（ＧＡＰＤＨ）、メンブランをブロッキング試薬（Ｒｏｃｈｅ）中で３０分間ブロッキングし、アルカリホスファターゼ標識抗ジゴキシゲニン抗体（Ｒｏｃｈｅ）を用い、Ｔｒｉｓ生理食塩水バッファー／０．３％ Ｔｗｅｅｎ２０を用いて３０分間プローブした。Ｓｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてシグナルを可視化した。プローブは、ジゴキシゲニン標識ヌクレオチド（Ｒｏｃｈｅ）を用いてＰＣＲによって作製した。図５に示されるように、ヘパリン処理細胞および偽処理細胞との間にｍＲＮＡ量に有意差がないので、ヘパリンはｓＦＲＰ−１のｍＲＮＡレベルを増加させない（レーン１対２、３対４、５対６）。したがって、ヘパリンはｓＦＲＰ−１のＤＮＡ転写またはｍＲＮＡ安定性に影響を及ぼさない。ｓＦＲＰ−１のタンパク質合成の際に、そのｍＲＮＡ後プロセスに影響を及ぼすと思われる。
【００８０】
細胞内タンパク質合成に対するヘパリンの作用を評価するために、上記のように、ｓＦＲＰ−１をＨＥＫ２９３−ＦＴ細胞において一過性に発現させた。５０μｇ／ｍｌのヘパリンをＤＮＡトランスフェクションの４８時間後に添加した。コンディショニング培地および細胞ペレットを、１２０または１４４時間で回収した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって各タンパク質サンプルを分離し、マウスモノクローナル抗Ｈｉｓ４抗体を用いてイムノブロッティングした（図６）。ヘパリンは、細胞内および細胞外ｓＦＲＰ−１の双方を増加させ、このことは、ヘパリンは細胞内タンパク質合成を刺激することによって哺乳動物細胞タンパク質産生を増強できるということを示唆する。さらに、分泌型ｓＦＲＰ−１の細胞取り込みは観察されなかった。このことは、培養培地中のｓＦＲＰ−１の蓄積は、培地に添加されたヘパリンによるＨＳＰＧ媒介性エンドサイトーシスの阻害の結果ではないということを示す。
【００８１】
ｓＦＲＰ−１に対するヘパリンの増強作用が、タンパク質安定化によるものであるかどうかを調べるために、ＨＥＫ２９３細胞によって産生されたｓＦＲＰ−１を精製した。実施例１に記載されるように、一過性発現から１リットルのコンディショニング培地を調製した。４℃で約１時間、ｓＦＲＰ−１−ｈｉｓ６含有培地をニッケル−ＮＴＡ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて平衡化した。樹脂を３０００ｒｐｍで遠心分離し（ＳＯＲＶＡＬＬ Ｈ−６０００Ａ／ＨＢＢ−６）、カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）に詰め、その後、ＨＰＬＣに取り付けた。１Ｍ ＮａＣｌ、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５および１５ｍＭ イミダゾールを用いて十分に洗浄した後、１Ｍ ＮａＣｌ、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５および２００ｍＭイミダゾール用いてｓＦＲＰ−１−ｈｉｓ６タンパク質を溶出した。溶出液を１０Ｋ ＭＷＣＯ濃縮器（Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて濃縮して２ｍｌに減らした。サンプルをさらに、１Ｍ ＮａＣｌ、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５中でＳｕｐｅｒｄｅｘ（商標）２００サイズ排除カラム（ＳＥＣ）カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）に通した。タンパク質は、ニッケル−ＮＴＡ後に実質的に精製され（図７Ａ、左パネル、および図７Ｂ、レーン１＆２）、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００後にはほぼ均質であった（図７Ａ、右パネル、および図７Ｂ、レーン３＆４）。
【００８２】
タンパク質濃度は２８０ｎｍでの吸光度によって調べた。ニッケル−ＮＴＡ後に得られたタンパク質は約２．５ｍｇ／Ｌであり、ＳＥＣ後は約１ｍｇ／Ｌである。ＳＥＣ分析では、ｓＦＲＰ−１−ｈｉｓ６はモノマーとして流れ（図７Ａ、右パネル）、これは、非還元条件下での３８ｋＤａポリペプチドとしてのｓＦＲＰ−１の移動と一致する（図７Ｂ、レーン４）。Ｎ末端配列決定およびマススペクトロメトリー分析によって、ｓＦＲＰ−１の同一性が確認され、タンパク質が多量にグリコシル化されていることが示された（データは示していない）。室温でインキュベートした場合は、精製ｓＦＲＰ−１タンパク質は、ヘパリンの不在下で極めて安定である（データは示していない）。精製ｓＦＲＰ−１タンパク質が活性であるかどうかを調べるために、ｓＦＲＰ−１のＷｎｔ３アンタゴニスト活性を測定した。図７Ｃに示されるように、トランスフェクトされたＵ２ＯＳ細胞では、Ｗｎｔ３はＴＣＦルシフェラーゼリポーター遺伝子発現を増加させた（Ｂｈａｔら（２００４年） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ． Ｐｕｒｉｆ． ３７、３２７〜３３５頁）。ニッケル−ＮＴＡ精製されたｓＦＲＰ−１またはＳＥＣ精製されたｓＦＲＰ−１のいずれかの添加により、Ｗｎｔ媒介性応答が用量依存的に減少したのに対し、バッファーは、Ｗｎｔ媒介性ＴＣＦルシフェラーゼリポーター活性化に対して影響を及ぼさなかった。これらのデータは、ヘパリンの不在下では、精製ｓＦＲＰ−１は安定であり、機能的であるということを明確に実証する。
【００８３】
タンパク質産生に対するヘパリンの刺激作用はまた、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞においても観察された。野生型ＣＨＯ細胞は、内因性ヘパリン様分子、ヘパリン硫酸グリコサミノグリカン（ＨＳＧＡＧ）を合成できる。しかし、野生型ＣＨＯ細胞を３０ｍＭ塩素酸塩（ヘパラン硫酸合成の阻害剤）を用いて４８時間前処理した場合には、細胞はヘパリン感受性となった。実験により、ヘパリンは、一過性発現条件および安定発現条件の双方の下で、塩素酸塩処理ＣＨＯ細胞においてタンパク質産生を増強することが示された。ｓＦＲＰ−１分泌のためヘパリンの必要条件をさらに特性決定するために、４つのグリコシル化突然変異を保持するグリコシル化欠損ＣＨＯ細胞株Ｌｅｃ３．２．８．１（Ｓｔａｎｌｅｙ （１９８９年） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ９、３７７〜３８３頁）を用いた。この細胞株は、大きく末端切断されたＮ結合型およびＯ結合型炭水化物を含む最も大幅に改変された炭水化物構造を発現する。図８にで示されるように、ヘパリンは突然変異ＣＨＯ株においてｓＦＲＰ−１分泌を刺激した（レーン１〜６）。
【００８４】
ヘパリン結合性タンパク質のＨＳとの相互作用は、配列およびＨＳの糖部分の硫酸化レベルによって定まる（Ｅｓｋｏら（２００２年） Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ７１、４３５〜４７１頁）。ｓＦＲＰ−１分泌におけるヘパリン活性にとってＯ硫酸化およびＮ硫酸化が必要であるかどうかを調べるために、ｓＦＲＰ−１によってトランスフェクトされた２９３細胞を、全体的にＮ−脱硫酸化、続いて、Ｎ−アセチル化された化学修飾されたヘパリン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）とともにインキュベートした。２−Ｏ−硫酸化を欠く修飾ヘパリン（Ｓｉｇｍａ）も、そのｓＦＲＰ−１分泌を刺激する能力について調べた。図９に示されるように、２−Ｏ−脱硫酸化ヘパリンは、そのｓＦＲＰ−１分泌を刺激する能力を完全に失った（レーン４）。対照的に、Ｎ−脱硫酸化ヘパリンは修飾されていないヘパリンと同程度に有効であり（レーン３）、このことは、Ｎ−硫酸化ではなくＯ−硫酸化がｓＦＲＰ−１の刺激に必要であることを示す。さらに、４−メチルウンベリフェリル７−β−Ｄ−キシロシド（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）、プロテオグリカンコアタンパク質の直鎖部分の代わりになり、したがって、グリコサミノグリカン生合成のための可溶性プライマーとして機能するキシロシドの添加により、５０および１００μｇ／ｍｌという濃度でｓＦＲＰ−１分泌が刺激され（レーン５＆６）、ヘパリンの作用が模倣された。
【００８５】
（実施例３）
ＦＧＦ−２はトランスフェクトされた細胞によるタンパク質産生を増強する
ｓＦＲＰ−１を安定に過剰発現するＨＥＫ２９３株由来の細胞（クローン１００−５）を、６ウェルプレートにおいてコンフルエンスに増殖させた。次いで、培地を、５０μｇ／ｍｌのヘパリンを含有する新鮮な血清不含培地で置換した。対応するウェルの培地に、５０ｎｇ／ｍｌの線維芽細胞増殖因子−１（ＦＧＦ−１、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）または線維芽細胞増殖因子−２（ＦＧＦ−２、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）を添加した。培地置換の４８時間後コンディショニング培地を回収した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってタンパク質サンプルを分離し、マウスモノクローナル抗Ｈｉｓ４抗体を用いてイムノブロッティングした（図１０）。図１０において実証されるように、ＦＧＦ−２とヘパリンの組合せが、安定にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞によるｓＦＲＰ−１産生を著しく増加させた。
【００８６】
したがって、ＦＧＦ−２およびヘパリンは、ノーザン分析がｓＦＲＰ−１のｍＲＮＡレベルはヘパリンの存在によって影響を受けないということを示すように（図５）、転写後タンパク質合成を調節すると思われる。理論に拘束されようとは思わないが、ヘパリンは、ＦＧＦがその標的タンパク質の翻訳に影響を及ぼすことがわかっているように（Ｓｚｅｂｅｎｙｉら（１９９９年） Ｉｎｔ． Ｒｅｖ． Ｃｙｔｏｌ．）、タンパク質翻訳プロセスに影響を及ぼし得る。ＦＧＦはまた、その産物が翻訳プロセスをアップレギュレートできるいくつかの標的遺伝子を活性化できる。別の可能性は、ＦＧＦ経路は分泌経路に沿ったタンパク質輸送を促進できるということである。ますます多くの証拠が、タンパク質分泌および表面局在化は一連のシグナル伝達経路、例えば、フォールディングされていないタンパク質反応によって厳重に調節されるということを示している（Ｓｃｈｒｏｄｅｒら（２００５年） Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ７４、７３９〜７８９頁）。いくつかのＥＲシャペロンが、種々のクライアントタンパク質の細胞表面局在化および分泌を促進することがわかっている。ヘパリンおよびＦＧＦ−２は、これらの機構を活性化し、組換えタンパク質の分泌を促進できる。
【００８７】
（実施例４）
ＦＧＦＲ−１の刺激はトランスフェクトされた細胞におけるタンパク質産生を増強する
ｓＦＲＰ−１を安定に過剰発現するＨＥＫ２９３細胞株由来の細胞（１００−５）を、６ウェルプレートにおいてコンフルエンスに増殖させ、次いで、ウサギポリクローナル抗ＦＧＦＲ−１または抗ＦＧＦＲ−２抗体（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）を用いて６時間前処理または偽処理した。続いて、細胞を５０μｇ／ｍｌのヘパリンを用いて処理した。ヘパリン処理の４８時間後コンディショニング培地を回収した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってタンパク質サンプルを分離し、マウスモノクローナル抗Ｈｉｓ４抗体を用いてイムノブロッティングした（図１１）。データは、抗ＦＧＦＲ−２を用いてではなく、抗ＦＧＦＲ−１を用いた前処理により、ヘパリン誘導性タンパク質増強が大幅に減少したということを示す。
【００８８】
（実施例５）
ヘパリンはトランスフェクトされた細胞におけるＭＭＰ−２３およびＤＫＫ−１タンパク質産生を増強する
ｐＳＭＥＤＡ中にＣ末端Ｈｉｓ６タグを含むメタロプロテイナーゼＭＭＰ−２３を、５％ＦＢＳを補給した培地において、ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞中で一過性に発現させた。トランスフェクションの２４時間後、トランスフェクトされた細胞を、種々の濃度のＦＢＳを含む新鮮培地に切り替えた。いくつかの反応物に５０μｇ／ｍｌのヘパリンを添加した。９６時間後コンディショニング培地を回収した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってタンパク質サンプルを分離し、マウスモノクローナル抗Ｈｉｓ４抗体を用いてイムノブロッティングした。図１２に示されるように、ヘパリンは、ＭＭＰ２３−ｈｉｓ６タンパク質の観察レベルを大幅に高めた。
【００８９】
ｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にＣ末端ｍｙｃタグを含むヒトＤｉｃｋｋｏｐｆ−１（ＤＫＫ−１）を、５％ＦＢＳを補給した培地においてＨＥＫ２９３−ＦＴ細胞中で一過性に発現させた。ＤＮＡトランスフェクションの２４時間後、細胞培養物に５０μｇ／ｍｌのヘパリンを添加した。９６時間後コンディショニング培地（Ｓ）および細胞ペレット（Ｐ）を回収した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってタンパク質サンプルを分離し、マウスモノクローナル抗ｍｙｃ抗体を用いてイムノブロッティングした。図１３に示されるように、ヘパリンは、ＤＫＫ１−ｍｙｓタンパク質のレベルを大幅に高めた。
【００９０】
本発明の前述の記載は、例示および説明を提供するものであって、包括的であることまたは本発明を開示される明確なものに制限することを意図するものではない。上記の教示と一致する改変および変法が考えられ、または本発明の実施から獲得され得る。したがって、本発明の範囲は特許請求の範囲およびその等価物によって定義されるということは留意される。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】図１は、本発明に用いられる発現ベクターの制限マップを表す。
【図２】図２は、培養ＨＥＫ２９３細胞における、タンパク質産生に対するヘパリンの増強作用を示す。
【図３】図３は、培養ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞においてタンパク質産生を増加させるためのヘパリンの最適濃度が約２５μｇ／ｍｌであることを実証する。
【図４】図４は、安定ＨＥＫ２９３細胞株において、ヘパリンが分泌型ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質１（ｓＦＲＰ−１）の産生を増加させることを示す。
【図５】図５は、ヘパリンがｓＦＲＰ−１ ｍＲＮＡレベルを高めないことを示すノーザンブロットである。
【図６】図６は、細胞内タンパク質合成に対するヘパリンの刺激効果を実証するウエスタンブロットである。
【図７】図７は、ヘパリンを用いない精製ｓＦＲＰ−１が活性であり、安定であることを実証する。パネルＡは、ニッケルＮＴＡカラム後にトランスフェクトされた２９３細胞から得たコンディショニング培地から得た１対のタンパク質溶出プロフィールである。ニッケル精製物質をサイズ排除カラムＳｕｐｅｒｄｅｘ２００を用いてさらに精製した。パネルＢは、精製ｓＦＲＰ−１−ｈｉｓ６のクーマシーブルー染色ゲルである。ニッケルＮＴＡまたはＳｕｐｅｒｄｅｘ２００後のタンパク質サンプルを、還元条件下（レーン１＆３）または非還元条件下（レーン２＆４）で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。パネルＣは、ＴＣＦ−ルシフェラーゼでトランスフェクトされたＵ２ＯＳ細胞を用いる、精製ｓＦＲＰ−１のＷｎｔ−３アンタゴニスト活性についてのルシフェラーゼアッセイを表す。
【図８】図８は、ヘパリンが、グリコシル化欠損ＣＨＯ細胞株Ｌｅｃ．３．２．８．１において、ｓＦＲＰ−１産生を刺激することを実証するウエスタンブロットである。ｓＦＲＰ−１でトランスフェクトされたＬｅｃ．３．２．８．１細胞を、ＤＮＡトランスフェクションの４８時間後、５０μｇ／ｍｌのヘパリンで偽処理または処理した。種々の時点でコンディショニング培地を回収し、抗ｈｉｓ４抗体を用いてイムノブロッティングによって分析した。
【図９】図９は、修飾ヘパリンの作用を示すウエスタンブロットである。ｓＦＲＰ−１でトランスフェクトされた２９３細胞を未処理のまま（−）またはすべて５０μｇ／ｍｌで、ヘパリン、Ｎ−脱硫酸化、Ｎ−アセチル化ヘパリン（ｄＮ−ヘパリン）、または２−Ｏ−脱硫酸化ヘパリン（ｄＯ−ヘパリン）とともに７２時間インキュベートした。また、細胞を、示した濃度の４−メチルウンベリフェリル７−β−Ｄ−キシロシド（キシロシド）で処理した。培地サンプルを回収し、抗ｈｉｓ４抗体を用いるイムノブロッティングについて分析した。
【図１０】図１０は、線維芽細胞増殖因子−２（ＦＧＦ−２）が、血清不含培地におけるヘパリンの作用を大幅に改善することを実証する。
【図１１】図１１は、線維芽細胞増殖因子受容体−１（ＦＧＦＲ−１）をブロックすることによって、ヘパリンのタンパク質産生増強効果が著しく低下することを示す。
【図１２】図１２は、ヘパリンが、ＨＥＫ２９３一過性発現においてヒトマトリックスメタロプロテイナーゼ２３（ＭＭＰ−２３）の産生を増強することを実証するウエスタンブロットである。
【図１３】図１３は、ヘパリンが、ＨＥＫ２９３一過性発現においてヒトＤｉｃｋｋｏｐｆ−１（ＤＫＫ−１）の産生を増強することを実証するウエスタンブロットである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は哺乳動物発現系および所望のタンパク質を製造するためにそれを用いる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
ゲノムおよびプロテオミクスにおける最近の進歩とともに、多量の組換えタンパク質をクローニングし、発現する能力がますます重要になってきた。高レベルのタンパク質を精製する能力は、ヒト薬剤学およびバイオテクノロジーの設定において、インスリンなどのタンパク質製剤を製造するために、ならびに、基礎研究の設定において、例えば、タンパク質を結晶化してその三次元構造の決定を可能にするために重要である。そうでなければ多量に得ることが困難であるタンパク質を、宿主細胞において過剰発現させ、続いて、単離および精製することができる。
【０００３】
細菌発現系は、組換えタンパク質を発現および精製するための１つのアプローチであった。しかし、細菌細胞における多数の真核細胞のポリペプチド、特に、哺乳動物のタンパク質の発現は、宿主細胞における状態および環境が、真核細胞のタンパク質の正しいフォールディングおよび修飾をもたらさなかったために、期待はずれの、不満足な結果が生じることが多かった。
【０００４】
酵母発現系は、分泌経路を有し、いくつかの限定された翻訳後修飾を実施する能力を有するので、いくつかの真核細胞のタンパク質の製造にとって特定の利点を提供する。しかし、酵母系は、ジスルフィド結合しているタンパク質の不適切なフォールディングをもたらすことが多く、低グリコシル化をもたらす場合もある。
【０００５】
タンパク質の製造のための哺乳動物細胞の使用は、正しいタンパク質フォールディングならびに適当な翻訳後修飾、例えば、グリコシル化を提供するという重要な利点を提供する。しかし、多数の哺乳動物発現系は、多量の所望のタンパク質を産生しない。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の要旨）
本発明は、哺乳動物宿主細胞によるタンパク質産生を増加させるためのヘパリン、ヘパリン様分子または線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）アゴニストの使用を特徴とする。本発明はまた、哺乳動物宿主細胞によるタンパク質産生を刺激するための構成的に活性なＦＧＦＲまたはその下流のエフェクターの使用を特徴とする。
【０００７】
一態様では、本発明は、タンパク質産生率が改善された哺乳動物発現系を提供する。これらの発現系は、有効量のヘパリンまたはヘパラン硫酸グリコサミノグリカンを含む培地において培養された遺伝子組換え哺乳動物細胞を含む。各遺伝子組換え宿主細胞は、対象のタンパク質をコードする組換え発現カセットを含む。培養培地中にヘパリンまたはヘパラン硫酸グリコサミノグリカンが存在することで、対象のタンパク質の収率が大幅に高まる。
【０００８】
本発明において用いられるヘパリンまたはヘパラン硫酸グリコサミノグリカンの量は、培養宿主細胞によるタンパク質産生を促進するのに有効ないずれの量であってもよい。一実施形態では、本発明に用いられる培養培地は、約１〜約１，０００μｇ／ｍｌのヘパリンまたはヘパラン硫酸グリコサミノグリカンを含む。別の実施形態では、本発明に用いられる培養培地は、約１０〜約２００μｇ／ｍｌ（例えば、約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００μｇ／ｍｌ）のヘパリンまたはヘパラン硫酸グリコサミノグリカンを含む。
【０００９】
さらに別の実施形態では、本発明に用いられる培養培地は、培養宿主細胞によるタンパク質産生を増加させるために、有効量の線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ−２）またはその他のＦＧＦを、ヘパリンまたはヘパラン硫酸グリコサミノグリカンと組み合わせて含む血清不含培地である。多数の実施例において、培養培地は、それだけには限らないが、約１０〜約５００ｎｇ／ｍｌ（例えば、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００または５００ｎｇ／ｍｌ）のＦＧＦ−２を含む。
【００１０】
別の態様では、本発明の哺乳動物発現系は、有効量のＦＧＦＲ−１活性化剤を含む培地において培養された遺伝子組換え哺乳動物細胞を含む。これらの遺伝子組換え細胞の各々は、対象のタンパク質をコードする組換え発現カセットを含む。培養培地中にＦＧＦＲ−１活性化剤が存在することで、対象のタンパク質の収率が著しく高まる。本発明に適したＦＧＦＲ−１活性化剤の例として、それだけには限らないが、ＦＧＦ、ヘパリン、ヘパラン硫酸グリコサミノグリカンまたはその他のヘパリン様分子が挙げられる。その他のＦＧＦＲを活性化できる物質も使用できる。一実施形態では、本発明に用いられるＦＧＦＲ−１活性化剤として、ヘパリンまたはヘパラン硫酸グリコサミノグリカンおよびＦＧＦ−２の双方が挙げられる。
【００１１】
さらに別の態様では、本発明の哺乳動物発現系として、各々が、対象のタンパク質と、ＦＧＦＲ−１媒介性シグナル伝達経路の構成的に活性な成分とをコードする１種または複数の組換え発現カセットを含む、遺伝子組換え哺乳動物細胞が挙げられる。一実施例では、ＦＧＦＲ−１媒介性シグナル伝達経路の構成的に活性な成分は、構成的に活性なＦＧＦＲ−１タンパク質である。
【００１２】
本発明はまた、哺乳動物細胞によるタンパク質産生を改善するための、β−キシロシドまたはその他のグリコサミノグリカン生合成インデューサーの使用を特徴とする。この目的に適したβ−キシロシドの限定されない例として、４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−キシロシド、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−キシロシドおよびベンジル−β−Ｄ−キシロシドが挙げられる。一実施例では、哺乳動物宿主細胞を、約５０または約１００μｇ／ｍｌの４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−キシロシドを含む培地で培養する。β−キシロシドの使用により、哺乳動物宿主細胞のタンパク質産生率が大幅に高まる。
【００１３】
いずれの対象のタンパク質も、本発明の哺乳動物発現系を用いて製造できる。これらのタンパク質の限定されない例として、インスリン、成長ホルモン、増殖因子、エリスロポエチンタンパク質、卵胞刺激ホルモン、インターフェロン、インターロイキン、サイトカイン、コロニー刺激因子、凝固因子、組織プラスミノーゲンアクチベーター、副甲状腺ホルモン、骨形成タンパク質、ケラチノサイト増殖因子、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、グルカゴン、トロンビン、トロンボポエチン、プロテインＣ、分泌型ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質、セレクチン、抗体またはウイルスタンパク質が挙げられる。これらのタンパク質は分泌型、細胞質性または膜結合型タンパク質であり得る。それらは治療、予防、診断またはその他の医療目的のために使用できる。多数の実施例では、本発明によって産生されたタンパク質は、細胞表面ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用して、これらのタンパク質の細胞内部移行を誘導することができない。
【００１４】
本発明はさらに、本発明の哺乳動物発現系によって産生されたタンパク質を含む薬剤組成物を特徴とする。
【００１５】
さらに、本発明は、所望のタンパク質を産生する方法を特徴とする。一態様では、本発明の方法は、宿主細胞による対象のタンパク質の産生を増加させるための有効量のヘパリン、ヘパラン硫酸グリコサミノグリカン、またはＦＧＦＲ−１活性化剤を含む培養培地において、各々が、対象のタンパク質をコードする組換え発現カセットを含む哺乳動物宿主細胞を培養することと、対象のタンパク質を宿主細胞または培養培地から単離することとを含む。
【００１６】
一実施形態では、組換え発現カセットは、宿主細胞中に一過性に導入される発現ベクターによって保持される。発現ベクターを宿主細胞中に一過性に導入した少なくとも２４時間後、培養培地にヘパリンまたはヘパラン硫酸グリコサミノグリカンを加える。別の実施形態では、発現ベクターを宿主細胞中に一過性に導入した少なくとも４８時間後、培養培地にヘパリンまたはヘパラン硫酸グリコサミノグリカンを加える。
【００１７】
別の態様では、本発明の方法は、培地において、各々が、対象のタンパク質と、ＦＧＦＲ−１媒介性シグナル伝達経路の構成的に活性な成分とをコードする１種または複数の組換え発現カセットを含む哺乳動物宿主細胞を培養することと、宿主細胞において対象のタンパク質および成分を発現させることと、宿主細胞または培養培地から対象のタンパク質を単離することとを含む。
【００１８】
一実施形態では、構成的に活性な成分は、構成的に活性なＦＧＦＲ−１タンパク質である。多数の例では、本発明の方法を用いて産生されたタンパク質は細胞表面ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用してこれらのタンパク質の細胞内部移行を誘導できない。
【００１９】
本発明のその他の特徴、目的および利点は、以下の詳細な説明において明らかである。しかし、詳細な説明は、本発明の好ましい実施形態を示すものの、単に例示のために示されるのであって制限するものではないということは理解されなければならない。詳細な説明から当業者には本発明の範囲内の種々の変法および改変が明らかとなる。
【００２０】
図は限定ではなく例示のために提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
（詳細な説明）
本発明は、分泌型、細胞質性または膜結合型タンパク質の産生率が改善された哺乳動物発現系を特徴とする。一態様では、本発明の発現系は、有効量のヘパリンまたはヘパリン様分子を含む培地において培養された遺伝子組換え哺乳動物宿主細胞を含む。各遺伝子組換え哺乳動物宿主細胞は、対象のタンパク質をコードする組換え発現カセットを含む。培養培地中にヘパリンまたはヘパリン様分子が存在することで、対象のタンパク質の収率が大幅に高まる。別の態様では、本発明の発現系は、対象のタンパク質をコードする１種または複数の組換え発現カセットと、構成的に活性なＦＧＦＲ−１またはＦＧＦＲ−１エフェクターとを含む遺伝子組換え哺乳動物宿主細胞を用いる。ＦＧＦＲ−１またはそのエフェクターとの同時発現により、対象のタンパク質の収率が大幅に改善される。
【００２２】
本発明の種々の態様を、以下の小区分においてさらに詳細に説明する。小区分の使用は本発明の制限を意味するものではない。各小区分は本発明の態様のいずれにも当てはまり得る。
【００２３】
Ａ．遺伝子組換え哺乳動物宿主細胞によるタンパク質産生を増加させるためのヘパリンの使用
ヘパリンは、遺伝子組換え哺乳動物宿主細胞によるタンパク質産生を増強するために使用できる。ヘパリンは硫酸化グリコサミノグリカンの不均一な混合物である。ヘパリン中の主な糖単位としては、α−Ｌ−イズロン酸２−スルフェート、２−デオキシ−２−スルファミノ−α−Ｄ−グルコース６−スルフェート、α−Ｄ−グルクロン酸、２−アセトアミド−２−デオキシ−α−Ｄ−グルコースおよびα−Ｌ−イズロン酸が挙げられる。これらの糖はグリコシド結合によって結合しており、種々の大きさのポリマーを形成している。多数のヘパリン分子が、多量の二糖類単位ＩｄｏＡ（２−ＯＳＯ３）−ＧｌｃＮＳＯ３（６−ＯＳＯ３）を含み、これが高いイズロン酸（ＩｄｏＡ）対グルクロン酸（ＧｌｃＡ）比を有する、多量にＯ−硫酸化されたポリサッカライドをもたらす。ヘパリンは、その高度に酸性のスルフェート基のために、通常、生理学的ｐＨでアニオンとして存在する。
【００２４】
本発明は、それだけには限らないが、未分画ヘパリン、分画ヘパリンまたは低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）をはじめ、あらゆる種類のヘパリン使用を考慮する。未分画ヘパリンの分子量は、制限するものではないが、約３，０００〜約４，０００Ｄａの範囲であり、平均分子量は約１５，０００Ｄａ（約４０〜５０単糖類単位）であり得る。多数の市販のヘパリン製剤の平均分子量は、約１２，０００〜約１５，０００Ｄａの範囲にある。未分画ヘパリンは、種々の脊椎動物の組織、例えば、ブタ腸管粘膜、ウシ腸組織またはウシ肺組織から調製できる。調製方法は、通常、組織のタンパク質分解処理と、それに続く抽出およびイオン対形成試薬との錯化とを含む。非分画粗ヘパリンをさらに、分別沈殿、精製または化学処理に付して細胞培養等級の、または製薬上許容されるヘパリンを製造することができる。
【００２５】
ＬＭＷＨは、通常、未分画ヘパリンから化学的または酵素的加水分解によって製造される。多数の市販のＬＭＷＨ製剤の分子量は、例えば、約２，０００〜９，０００Ｄａの範囲であり、平均分子量は約４，０００〜５，０００Ｄａであり得る。
【００２６】
本発明をいずれか１つの理論または作用様式に制限するものではないが、ヘパリンはＦＧＦ（例えば、ＦＧＦ−２）とＦＧＦＲ（例えば、ＦＧＦＲ−１）との間の相互作用を媒介し、それによってＦＧＦＲを活性化するか、ＦＧＦＲの活性化を促進し、タンパク質合成および／または分泌の増加をもたらす下流シグナルのカスケードを開始する。ヘパリン単独でもＦＧＦＲを活性化できる。
【００２７】
さらに、ヘパリンはその他の増殖因子、サイトカインまたはケモカインと結合できる。これらの増殖因子、サイトカインまたはケモカインの限定されない例として、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、プレイオトロフィン、胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）、血小板因子−４（ＰＦ−４）、ヘパリン結合性ＥＧＦ様増殖因子インターロイキン−８（ＩＬ−８）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、マクロファージ炎症性タンパク質−１（ＭＩＰ−１）、トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）、インターフェロン−ｇ誘導性タンパク質−１０（ＩＰ−１０）、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）およびＨＩＶ−Ｔａｔトランス活性化因子が挙げられる。ヘパリンの、これらの因子またはその受容体との相互作用もまた、培養宿主細胞によるタンパク質合成を促進し得る。
【００２８】
ＦＧＦおよびＦＧＦＲとの相互作用に預かる、ヘパリンの構造上の必要条件は、種々の実験モデルを用いて調べられている。結果から、硫酸化の大きさおよび程度が、ヘパリンの、ＦＧＦ−２−ＦＧＦＲ相互作用を誘導する能力にとって重要であるということが示されている。例えば、Ｉｓｈｉｈａｒａら、（１９９３年）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６８、４６７５〜４６８３頁； Ｔｙｒｒｅｌｌら、（１９９３年） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６８、４６８４〜４６８９頁； Ｇｕｉｍｏｎｄら（１９９３年） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６８、２３９０６〜２３９１４頁； Ａｖｅｚｉｅｒら（１９９４年） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９、１１４〜１２１頁およびＷａｌｋｅｒら（１９９４年） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９、９３１〜９３５頁を参照のこと。ヘパリンまたはヘパラン硫酸中の最小ＦＧＦ−２結合配列は、二糖類単位ＩｄｏＡ（２−ＯＳＯ３）−ＧｌｃＮＳＯ３またはＩｄｏＡ（２−ＯＳＯ３）−ＧｌｃＮＳＯ３（６−ＯＳＯ３）を含む五糖類と同定されている。例えば、Ｍａｃｃａｒａｎａら（１９９３年） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６８、２３８９８〜２３９０５頁を参照のこと。ヘパリンに由来する高度に硫酸化された八糖類または十糖類断片が、ＦＧＦとその受容体との間の相互作用を媒介することもわかっている。例えば、Ｋｌａｇｓｂｒｕｎら（１９９１年） Ｃｅｌｌ ６７、２２９〜２３１頁およびＩｓｈｉｈａｒａら前掲を参照のこと。さらに、ヘパリン由来四糖類から八糖類は、ＦＧＦ−２と結合するが、細胞増殖の刺激においては、ヘパリン由来十糖類およびそれより長いものよりは強力でないことがわかっている。Ｄｅｌｅｈｅｄｄｅら（２００２年） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ３６５、２３５〜２４４頁を参照のこと。化学修飾されたヘパリンまたはヘパラン硫酸製剤に関する結合研究により、２−Ｏ−およびＮ−スルフェート基はＦＧＦ−２とのヘパリン／ヘパラン硫酸相互作用にとって重要であるということが示されている。さらに、ヘパリンには、ＦＧＦＲ−１とのＦＧＦ−２の結合を促進するには、２−Ｏ−およびＮ−スルフェート基、ならびに６−Ｏ−スルフェート基の両方が必要であると考えられる。例えば、Ｇｕｉｍｏｎｄら前掲を参照のこと。
【００２９】
ＦＧＦ上のヘパリン結合領域（単数または複数）は、タンパク質のＮＨ２末端およびＣＯＯＨ末端の双方で暫定的に同定されており、ここでは、塩基性アミノ酸残基がヘパリンのスルフェート基と相互作用し得る。ヘパリンとの結合は、ヘパリン−ＦＧＲ−ＦＧＦＲ複合体の形成の促進に加え、ＦＧＦを安定化し、ＦＧＦをタンパク質分解から保護できる。さらに、ＦＧＦ（例えば、ＦＧＦ−２）は、ＦＧＦＲとの何らかの相互作用とは関係なく、細胞表面ヘパラン硫酸との直接結合に続いて、内部移行され得る。これにより、ＨＳ−ＦＧＦ複合体中のＨＳは、ＦＧＦを核へ輸送するためのシャトルとして働く可能性があるという推測に至る。
【００３０】
本発明に用いられる培養培地は、培養細胞によるタンパク質産生を促進するのに有効であるあらゆる量のヘパリンを含み得る。ヘパリン塩は、酸性スルフェート基のために、通常、細胞培養に用いられる。適したヘパリン塩の限定されない例として、ヘパリンナトリウム塩、ヘパリンカルシウム塩またはヘパリンリチウム塩が挙げられる。培養培地中のヘパリンの濃度は、例えば、１〜１，０００μｇ／ｍｌ、５〜５００μｇ／ｍｌ、１０〜２００μｇ／ｍｌ、１５〜１００μｇ／ｍｌまたは２０〜３０μｇ／ｍｌの範囲であり得る。一実施形態では、培養培地中のヘパリンの濃度は約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０μｇ／ｍｌである。本発明に用いられるヘパリンは、未分画ヘパリン、分画ヘパリンまたはＬＭＷＨなど、いずれの種類のものであってもよい。
【００３１】
多数の種類の培養培地を本発明に使用できる。一実施形態では、本発明に用いられる培養培地は、ウシ胎児血清および有効量のヘパリンまたはヘパリン様分子（例えば、ヘパラン硫酸グリコサミノグリカン）を補給した基本培地を含む。多数の実施例では、培養培地は、少なくとも０．５％、１％、５％または１０％のウシ胎児血清を含む。その他の動物血清または組織抽出物も使用できる。適した基本培地の例として、それだけには限らないが、ＭＥＭ、ＭＥＭ−α、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ、ＩＳＣＯＶＥ、Ｈａｍ Ｆ１２、ＨＡＭ Ｆ１０、Ｍ１９９、Ｌ１５、６Ｍ、ＩＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０、ＮＣＴＣ１０９、Ｆｉｓｃｈｅｒ培地、Ｗａｙｍｏｕｔｈ培地、Ｗｉｌｌｉａｍｓ培地、Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙウシ腎臓培地、Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ腎臓培地またはそれらの混合物が挙げられる。これらの基本培地を、宿主細胞の要求に従って、さらなる栄養素、例えば、糖（例えば、グルコース）、アミノ酸（例えば、グルタミン）、非必須アミノ酸のカクテル、必須アミノ酸のカクテル、ペプチド、酸性塩（例えば、ピルビン酸ナトリウム）、ＥＤＴＡ塩、クエン酸誘導体、アルコール（例えば、エタノール）、アミノアルコール（例えば、エタノールアミン）、ビタミン（例えば、ビタミンＣまたはビタミンＥ）、抗酸化剤（例えば、グルタチオンまたはセレン）、飽和または不飽和鎖を含む脂肪酸（例えば、リノール酸、アラキドン酸、オレイン酸、ステアリン酸またはパルミチン酸）、脂質、リポペプチドまたはリン脂質（例えば、レシチン）などを用いて栄養強化することができる。バッファー溶液、例えば、ＨＥＰＥＳまたは重炭酸塩に基づくものを、特定の脆弱な細胞培養物に、または多量のＣＯ２を生じる培養物に使用できる。多くの場合、培養培地のｐＨが、確実に細胞増殖またはタンパク質産生にとって最適のまま（例えば、６〜８の間、７〜８の間または７．２〜７．５の間）であるよう、また、培養培地が確実に等張性のままであるよう注意される。
【００３２】
本発明はまた、血清不含培地または既知組成培地の使用を特徴とする。一実施形態では、本発明に用いられる血清不含培地は、有効量のヘパリンまたはヘパリン様分子と、有効量のＦＧＦ（類）とを含む。用いられるＦＧＦ（類）の濃度は、例えば、１〜１，０００ｎｇ、１０〜１００ｎｇまたは２５〜７５ｎｇの範囲であり得る。ＦＧＦファミリーは、少なくとも２３種の別個のメンバーを含む。これらのタンパク質は広い分裂促進活性および細胞生存活性を有し、種々の生物学的プロセス、例えば、胚発生、細胞増殖、形態形成、組織修復、腫瘍増殖および浸潤に関与している。同種の種々のＦＧＦメンバーの間での配列相同性は比較的低い。しかし、ＦＧＦについては相当な種交差反応性がある。
【００３３】
一実施形態では、ＦＧＦ−２をヘパリンまたはヘパリン様分子と併用して、哺乳動物宿主細胞によるタンパク質産生を刺激する。一実施例では、用いられるヘパリンまたはヘパリン様分子の濃度は５〜２００μｇ／ｍｌの範囲（例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０または２００μｇ／ｍｌ）であり、用いられるＦＧＦ−２の濃度は１０〜５００ｎｇ／ｍｌの範囲（例えば、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００または５００ｎｇ／ｍｌ）である。ＦＧＦ−２は、種々のＦＧＦ受容体、例えば、それだけには限らないが、ＦＧＦＲ−１、ＦＧＦＲ−２、ＦＧＦＲ−３、ＦＧＦＲ−４およびＦＧＦＲ−５と結合すると報告されている。また、ヘパリンまたはヘパリン様分子は、ＦＧＦ−２シグナル伝達にとって絶対に必要であるわけではないが、これらの分子はシグナル伝達を、その不在において可能であるものよりもかなり低いＦＧＦ−２濃度で促進するということも報告されている。Ｐａｄｅｒａら、ＦＡＳＥＢ Ｊ．、１３、１６７７〜１６８７頁（１９９９年）を参照のこと。
【００３４】
本発明はさらに、哺乳動物宿主細胞によるタンパク質産生を促進するための、ＦＧＦ−２の生物学的に活性な断片または変異体の使用を考慮する。これらの生物学的に活性な断片または変異体は、元のＦＧＦ−２タンパク質のタンパク質産生増強活性の少なくとも相当部分を保持する。これらの断片または変異体は天然に存在する場合もあるし、計画的に設計される場合もある。所望のＦＧＦ−２断片または変異体は、アミノ酸置換、欠失、挿入またはその他の改変によって容易に調製できる。ヘパリンまたはヘパリン様分子と併用した場合の、このような断片または変異体のタンパク質産生増強活性は、以下に示される実施例に記載される方法を用いて容易に評価できる。
【００３５】
本発明に適した哺乳動物宿主細胞としては、それだけには限らないが、ヘパラン硫酸グリコサミノグリカン（ＨＳＧＡＧ）合成に欠陥のある細胞または細胞表面ＨＳＧＡＧのレベルが低下している細胞が挙げられる。適した哺乳動物宿主細胞の限定されない例として、ＨＥＫ２９３−ＦＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｒ７００−０７）、ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｒ６２００７）、ＣＨＯ ｐｇｓＡ−７４５（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎすなわちＡＴＣＣ）、ＣＨＯ ｐｇｓＢ−６５０（ＡＴＣＣ）、ＣＨＯ ｐｇｓＤ−６７７（ＡＴＣＣ）、ＣＨＯ ｐｇｓＢ−６１８（ＡＴＣＣ）およびその他のヘパラン硫酸に欠陥のあるＣＨＯ突然変異細胞、例えば、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる、Ｌｉｄｈｏｌｔら、ＰＲＯＣ． ＮＡＴＬ． ＡＣＡＤ． ＳＣＩ． Ｕ．Ｓ．Ａ．、８９：２２６７−２２７１ （１９９２年）に記載されるものが挙げられる。その他の哺乳動物宿主細胞、例えば、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ−１細胞、骨髄腫ＮＳＯ細胞、ＨＫＢ細胞、ＣＶ−１細胞、Ｃ１２７細胞、Ｖｅｒｏ細胞、Ｓｐ−２細胞、Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙ腎臓細胞、Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ腎臓細胞およびＡＴＣＣまたはその他の商業的供給源から入手できるその他の細胞株も使用できる。さらに、本発明は、対象のタンパク質の産生のための初代細胞培養物、組織培養物、器官培養物またはトランスジェニック哺乳動物の使用を考慮する。ヘパリンまたはヘパリン様分子は、静脈内注入、皮下注射またはその他の適した経路によってトランスジェニック哺乳動物に送達できる。一実施例では、移植片またはカテーテルを用いてヘパリンまたはヘパリン様分子を特定の組織部位に送達する。
【００３６】
さらに、本発明は、対象のタンパク質の産生のための、ハイブリッドまたは融合細胞の使用を特徴とする。ハイブリッド細胞は哺乳動物細胞と癌細胞／不死化細胞（例えば、骨髄腫または芽細胞腫細胞）を融合することによって作製できる。この目的に適した方法として、それだけには限らないが、電気融合および化学的融合（例えば、ポリエチレングリコール融合）が挙げられる。哺乳動物細胞および癌細胞／不死化細胞は、同一種由来であっても異なる種由来であってもよい。多数の実施形態では、癌細胞／不死化細胞は、１種または複数の選択物質に対して感受性である。例えば、癌細胞／不死化細胞は、「ＨＡＴ培地」として知られる、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含有する培養培地に対して感受性であり得る。ＨＡＴ感受性癌細胞／不死化細胞は、ＨＡＴ培地に対して非感受性である哺乳動物細胞と融合できる。ハイブリッド細胞を、融合していない細胞を死滅させるＨＡＴに対して選択する。次いで、融合細胞を所望の特徴についてスクリーニングできる。
【００３７】
一実施形態では、本発明に用いられるハイブリッド細胞は、対象のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞である。ハイブリドーマ細胞を、有効量のヘパリンまたはヘパリン様分子を含む培地において培養することにより、モノクローナル抗体の収率が大幅に高まる。別の実施形態では、本発明に用いられるハイブリッド細胞は、対象のタンパク質をコードする組換え発現カセットを含む。組換え発現カセットは、融合事象の前にハイブリッド細胞中に導入してもよいし、後に導入してもよい。多くの場合、ハイブリッド細胞の調製に用いられる哺乳動物細胞または癌細胞／不死化細胞は、ＨＳＧＡＧ合成に欠陥があるか、または細胞表面ＨＳＧＡＧのレベルが低下している。
【００３８】
本発明に用いられる各哺乳動物宿主細胞（例えば、ハイブリッド細胞）は、対象のタンパク質をコードする組換え発現カセットを含む。組換え発現カセットは、通常、発現制御配列と機能し得る形で連結されたタンパク質コード配列を含む。対象のタンパク質をコードするタンパク質コード配列は、ゲノム配列、ｃＤＮＡまたはそれらの組合せなど、あらゆる種類のものであってよい。対象のタンパク質の発現を指示する適した発現制御配列の選択は、当業者のレベル内の日常的な設計の問題である。適した発現制御配列の限定されない例として、プロモーター、エンハンサー、Ｋｏｚａｋ配列、ポリアデニル化配列またはその他の転写／翻訳調節配列が挙げられる。これらの配列の多数は文献に記載されており、商業的供給業者を介して入手できる。組換え発現カセットに用いられるプロモーター（単数または複数）は構成的であっても誘導性であってもよい。
【００３９】
組換え発現カセットは、種々の手段によって哺乳動物宿主細胞に導入できる。一実施形態では、組換え発現カセットを含む発現ベクターをトランスフェクションまたは形質導入によって哺乳動物宿主細胞に導入する。例示的トランスフェクション技術としては、それだけには限らないが、リン酸カルシウム媒介性トランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、陽イオン性脂質媒介性およびエレクトロポレーションが挙げられる。形質導入は、通常、組換えウイルスベクターによって媒介される。この目的に適したウイルスベクターの限定されない例として、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、アルファウイルス、アストロウイルス、コロナウイルス、オルソミクソウイルス、パポーバウイルス、パラミクソウイルス、パルボウイルス、ピコルナウイルス、ポックスウイルスまたはトガウイルスベクターが挙げられる。リポソームカプセル化発現ベクターも、組換え発現カセットを哺乳動物宿主細胞に導入するために使用できる。発現ベクターは、宿主細胞に一過性に導入することもできるし、または安定に導入することもできる。多くの場合、用いられる発現ベクターは、ベクターでトランスフェクトされているか、形質導入されている宿主細胞の選択を可能にする選択マーカーを含む。適した選択マーカーの限定されない例として、ネオマイシン（Ｇ４１８）、ハイグロマイシン、ピューロマイシン、ゼオシン、コルチン（ｃｏｌｃｈｉｎｅ）、メトトレキサートおよびメチオニンスルホキシミンが挙げられる。
【００４０】
組換え発現カセットはまた、細胞の内因性遺伝子を改変することによって宿主細胞中に組み込むことができる。これらの内因性遺伝子は、対象のタンパク質をコードする。所望の発現または調節作用を達成するために内因性遺伝子のいずれの部分を改変してもよい。例えば、内因性遺伝子のプロモーターをウイルスプロモーターと置換し宿主細胞における遺伝子の発現レベルを高めることができる。
【００４１】
本発明に従って、対象のいずれのタンパク質も製造できる。これらのタンパク質の限定されない例として、治療用、予防用または診断用タンパク質、例えば、ホルモン、増殖因子、インターロイキン、サイトカイン、インターフェロン、コロニー刺激因子、血液因子、抗体、ワクチン、コラーゲン、フィブリノーゲン、ヒト血清アルブミン、組織プラスミノーゲンアクチベーター、抗凝血剤または先天性疾患のための置換酵素が挙げられる。これらのタンパク質の特別な例として、それだけには限らないが、インスリン、ヒト成長ホルモン、エリスロポエチン、ヒト卵胞刺激ホルモン、絨毛性性腺刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、骨形成タンパク質２、副甲状腺ホルモン、αインターフェロン、βインターフェロン、γインターフェロン、インターロイキン−１、インターロイキン−１アンタゴニスト、インターロイキン−２、インターロイキン−１０、インターロイキン−１１、インターロイキン−１２、ケラチノサイト増殖因子、ケラチノサイト増殖因子−２、ヒト顆粒球コロニー刺激因子、ヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、ネシリチド、抗トロンビンＩＩＩ、凝固因子ＩＸ、凝固因子ＶＩＩＩ、凝固因子ＶＩＩａ、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、グルコセレブロシダーゼ、α−Ｄ−ガラクトシダーゼ、αＬ−イズロニダーゼ、α−１，４−グルコシダーゼ、アリールスルファターゼＢ、イズロネート−２−スルファターゼ、アデノシンデアミナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、アルテプラーゼ、ミエリン塩基性タンパク質、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、チロシンヒドロキシラーゼ、ドーパ脱炭酸酵素、グルカゴン、白血球受容体を標的とするモノクローナル抗体（例えば、α４インテグリンアンタゴニスト、抗胸腺細胞グロブリン、ＣＤ２アンタゴニスト、ＣＤ３アンタゴニスト、ＣＤ４アンタゴニスト、ＣＤ２０アンタゴニスト、ＣＤ２２アンタゴニスト、ＣＤ３３アンタゴニストおよびＣＤ５２アンタゴニスト）、サイトカインを標的とするモノクローナル抗体（例えば、ケモカインアンタゴニスト、ＩＬ−２アンタゴニスト、ＩＬ−４アンタゴニスト、ＩＬ−５アンタゴニスト、ＩＬ−６アンタゴニスト、ＩＬ−１２アンタゴニスト、セレクチンアンタゴニストおよびＴＮＦ−αアンタゴニスト）、癌細胞マーカーまたは受容体を標的とするモノクローナル抗体（例えば、上皮増殖因子アンタゴニスト、ヒト上皮成長因子受容体２アンタゴニスト、ＭＵＣ−１アンタゴニストおよび血管内皮増殖因子アンタゴニスト）およびその他のモノクローナル抗体（例えば、補体アンタゴニスト、Ｃ５阻害剤、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニスト、ＩｇＥアンタゴニストおよび呼吸器合胞体ウイルスＦ−タンパク質アンタゴニスト）が挙げられる。
【００４２】
その他の種類の抗体または抗体フラグメントも、本発明に従って製造できる。これらの抗体または抗体フラグメントの例として、それだけには限らないが、ヒト化抗体、ヒト抗体、一本鎖抗体、キメラ抗体、合成抗体、組換え抗体、ハイブリッド抗体、単一特異性抗体、多特異性抗体、非特異的抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ＦｄまたはｄＡｂが挙げられる。ｉｎ ｖｉｔｒｏディスプレイ技術または進化的戦略を用いることによって選択された高親和性結合剤も本発明に従って製造できる。これらの高親和性結合剤として、それだけには限らないが、ペプチド、抗体または抗体模倣体、例えば、Ｂｉｎｚら（２００４年） Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２２、５７５〜５８２頁またはＬｉｐｏｖｓｅｋら（２００４年） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ２９０、５１〜６７頁に記載されるものが挙げられる。
【００４３】
本発明に従って製造できるその他の対象のタンパク質として、それだけには限らないが、キナーゼ、ホスファターゼ、Ｇタンパク質共役受容体、増殖因子受容体、サイトカイン受容体、ケモカイン受容体、細胞表面抗体（膜結合型免疫グロブリン）、ＢＭＰ／ＧＤＦ受容体、ニューロン受容体、イオンチャンネル、プロテアーゼ、転写因子、ポリメラーゼ、プロトロンビン、トロンビン、α−１抗トリプシン、アルグルセラーゼ、イミグルセラーゼ、トロンボポエチン、α−１プロテイナーゼ阻害剤、カルシトニン、エルカトニン、ゴセレリン、ナファレリン、ブセレリン、プロインスリン、インスリン類似体、アミリン、Ｃ−ペプチド、ソマトスタチン、オクトレオトリド（ｏｃｔｒｅｏｔｒｉｄｅ）、バソプレシン、インスリントロピン（ｉｎｓｕｌｉｎｏｔｒｏｐｈｉｎ）、ヒトプロテインＣ、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子、インスリン様成長因子、神経成長因子、分泌型ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質（例えば、ｓＦＲＰ−１〜５）またはセレクチン（例えば、セレクチンＰ、セレクチンＥまたはセレクチンＬ）が挙げられる。
【００４４】
本発明はまた、ウイルスタンパク質またはその免疫原性断片の製造を特徴とする。これらのウイルスタンパク質または断片を用いて、対応するウイルスに対する免疫防御反応を誘発するためのワクチンを調製できる。これらのウイルスタンパク質の限定されない例として、ヒト免疫不全ウイルス（例えば、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２）、インフルエンザウイルス（例えば、インフルエンザＡ、ＢおよびＣウイルス）、コロナウイルス（例えば、ヒト呼吸器コロナウイルス）、肝炎ウイルス（例えば、肝炎ウイルスＡ〜Ｇ）またはヘルペスウイルス（例えば、ＨＳＶ１〜９）のタンパク質が挙げられる。その他のウイルスのタンパク質も製造できる。これらのウイルスとしては、それだけには限らないが、ニューモウイルス、モルビリウイルス、ルブラウイルス、アデノウイルス、アレナウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、フレボウイルス、ハンタウイルス、トロウイルス、エボラ様ウイルス、ヘパシウイルス、フラビウイルス、シンプレックスウイルス、バリセロウイルス、サイトメガロウイルス、ロゼオロウイルス、リンホクリプトウイルス、トゴトウイルス、オルソポックスウイルス、アビポックスウイルス、レポリポックスウイルス、レンチウイルス、スプーマウイルス、リッサウイルス、ノビラブドウイルス、ベシクロウイルス、アルファウイルス、ブビウイルス（ｂｕｂｉｖｉｒｕｓ）、ライノウイルス、アフトウイルス（ａｐｈｔｏｖｉｒｕｓ）、灰白髄炎ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、ウシヘルペスウイルス、パラミクソウイルス、ニューカッスル病ウイルス、レスピラトリーシンシチオウイルス（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｉｔｉｏ ｖｉｒｕｓ）、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、パルボウイルス、パポーバウイルス、ロタウイルス、胃腸炎ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス、風疹ウイルス、ブタコレラウイルスまたは狂犬病ウイルスが挙げられる。
【００４５】
本発明によって製造される対象のタンパク質は、それだけには限らないが、分泌型タンパク質、細胞質性タンパク質または膜結合型タンパク質であり得る。対象のタンパク質の配列は、天然に存在するものであるか、または遺伝子操作されたものであり得る。一実施形態では、対象のタンパク質は、対象のタンパク質の単離、精製、検出、固定化、安定化、フォールディングまたは標的化を容易にするポリペプチドタグを含む融合タンパク質である。適したポリペプチドタグの限定されない例として、ストレプトアビジンタグ、ＦＬＡＧタグ、ｃ−ｍｙｃタグ、ポリヒスチジンタグ、インフルエンザＨＡタグ、ＶＳＶ糖タンパク質タグ、Ｖ５タグ、単純ヘルペスウイルスタグ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼまたはＦｃ断片が挙げられる。いくつかの場合では、ポリペプチドタグは、選択されたプロテアーゼによって対象のタンパク質から切断除去できる。
【００４６】
別の実施形態では、対象のタンパク質は、哺乳動物宿主細胞によるタンパク質の分泌を促進するシグナルペプチドを含む。シグナルペプチドは、対象のタンパク質にとって内因性である場合も、異種性である場合もある。シグナルペプチドは、シグナル認識粒子と相互作用してリボソームをＥＲに向けることができ、ここで翻訳と同時の挿入が起こる。多数のシグナルペプチドは高度に疎水性であり、正に帯電した残基を有する。シグナル配列は、ＥＲの槽面上に位置するシグナルペプチダーゼ、プロテアーゼによって成長中のペプチド鎖から除去され得る。したがって、多くの場合、培養培地から単離される分泌型タンパク質は、元のシグナルペプチドを有していない。
【００４７】
多数の実施形態では、本発明によって製造される分泌型または膜結合型タンパク質は、細胞表面ＨＳＧＡＧと結合しないか、相互作用しない。これによって、哺乳動物宿主細胞によるタンパク質の取り込みまたは内部移行が妨げされるか、減少する。一実施例では、本発明によって製造される対象のタンパク質はヘパラナーゼすなわち、その基質がヘパラン硫酸（ＨＳ）である酵素ではない。
【００４８】
本発明によって製造される対象のタンパク質は、種々の手段によって単離または精製できる。タンパク質単離／精製に適している初期物質の限定されない例として、培養培地または細胞溶解物が挙げられる。例示的単離法として、それだけには限らないが、アフィニティークロマトグラフィー（例えば、イムノアフィニティークロマトグラフィー）、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、タンパク質沈殿（例えば、免疫沈降）、差示的可溶化、電気泳動、遠心分離、結晶化またはそれらの組合せが挙げられる。
【００４９】
多数の実施形態において、単離された対象のタンパク質は、その他のタンパク質または夾雑物を実質的に含まない。例えば、単離された対象のタンパク質は、その他のタンパク質から少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％または１００％純粋であり得る。一実施例では、単離されたタンパク質は、意図される用途を干渉する夾雑物をわずかな量しか含まない。本発明に従って単離された対象のタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥまたはイムノアッセイなどの標準技術を用いて確認または評価できる。この目的に適したイムノアッセイとして、それだけには限らないが、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、サンドイッチもしくはイムノメトリックアッセイ、ラテックスもしくはその他の粒子凝集、またはプロテオミクスチップが挙げられる。単離された対象のタンパク質を確認または分析するために、タンパク質配列決定および質量分析も使用できる。
【００５０】
さらに、本発明は、哺乳動物宿主細胞による弱毒化ウイルスの産生を増加させるためのヘパリンまたはヘパリン様分子の使用を考慮する。これらの弱毒化ウイルスは、ワクチン製剤の調製のために使用できる。この目的に適した哺乳動物宿主細胞として、それだけには限らないが、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙ腎臓細胞またはＭａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ腎臓細胞が挙げられる。この目的のために用いられるヘパリンまたはヘパリン様分子の量は、弱毒化ウイルスの収率を向上させるのに有効であればいずれの量でもあり得る（例えば、約１０〜１，０００μｇ／ｍｌ、例えば、約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００μｇ／ｍｌ）。培養培地が血清不含培地である場合は、ＦＧＦ−２またはその他のＦＧＦＲアゴニストを、ヘパリンまたはヘパリン様分子と併用することもできる。有効量のＦＧＦ−２またはその他のＦＧＦは、それだけには限らないが、１０〜５００ｎｇ／ｍｌの範囲（例えば、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００または５００ｎｇ／ｍｌ）であり得る。さらに、ＦＧＦを、動物血清を含む培養培地に添加して、弱毒化ウイルスまたはその他の対象のタンパク質の収率をさらに改善することができる。
【００５１】
Ｂ．遺伝子組換え哺乳動物宿主細胞によるタンパク質産生を増加させるための、ヘパリン様分子またはその他のＦＧＦＲアゴニストの使用
本発明はまた、哺乳動物宿主細胞によるタンパク質産生を刺激するための、ヘパリン様分子またはその他のＦＧＦＲアゴニストの使用を特徴とする。ヘパリン様分子の限定されない例として、硫酸化グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）、例えば、ヘパラン硫酸グリコサミノグリカン（ＨＳＧＡＧ）；硫酸化プロテオグリカン、例えば、ヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）；またはその断片が挙げられる。本発明に適したその他のヘパリン様分子として、それだけには限らないが、ヘパリンオリゴ糖、合成硫酸化ポリマー、種々の硫酸化分子、種々のスルホン化分子、合成多環芳香族化合物、芳香環の重合によって合成された多環芳香族化合物またはそれらの組合せもしくは断片が挙げられる。参照により本明細書に組み込まれるＣａｓｕ （１９８５年） Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４３、５１〜１３４頁に記載されるヘパリン様分子も使用できる。これらのヘパリン様分子のすべてが、哺乳動物宿主細胞（例えば、ヘパラン硫酸欠損哺乳動物宿主細胞）によるタンパク質産生を刺激できる。多くの場合、本発明に用いられるヘパリン様分子は、高度に硫酸化されており、培養細胞におけるＦＧＦＲシグナル伝達の活性化を促進できる。
【００５２】
少なくとも４種の別個のＦＧＦＲファミリーメンバー、すなわち、ＦＧＦＲ−１、ＦＧＦＲ−２、ＦＧＦＲ−３およびＦＧＦＲ−４が同定されている。ＦＧＦＲは、そのリガンド親和性および組織分布において互いに異なる。全長の代表的なＦＧＦＲは、複数の免疫グロブリン様ドメインと、単一の疎水性膜貫通セグメントと細胞質チロシンキナーゼドメインとからなる細胞外領域を含む。一実施形態では、本発明に用いられるヘパリン様分子は、培養細胞においてＦＧＦＲ−１を活性化またはＦＧＦＲ−１の活性化を促進できる。
【００５３】
細胞表面ＦＧＦＲの活性化は、ＦＧＦ、ＦＧＦＲおよび細胞表面ＨＳＧＡＧ間の相互作用を含むと考えられている。ＦＧＦおよび細胞表面ＨＳＧＡＧがどのように協力してＦＧＦＲの活性化を誘導するかを説明するために、少なくとも３種の別個のモデルが提案されている。「成長ホルモン」モデルでは、単一のＦＧＦが２つのＦＧＦＲを二量体化し、ＨＳＧＡＧはＦＧＦおよびＦＧＦＲの細胞外ドメインの双方と結合する。「ＨＳ依存性二量体化」モデルでは、ＨＳ鎖が２つのＦＧＦと結合し、ここで二量体リガンドがＦＧＦＲを二量体化する。「二量体の二量体」モデルでは、ＦＧＦとＨＳＧＡＧの２つの独立した複合体が、ＦＧＦＲの二量体化を引き起こし、それによってその細胞内キナーゼドメインを活性化する。
【００５４】
細胞表面ＧＡＧ鎖は、小さいタンパク質コアと結合して、ＨＳＰＧを形成することが多い。ＨＳＰＧは、コアタンパク質の疎水性膜貫通ドメインによって、またはコアタンパク質と共有結合しているグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーによって細胞表面に固定され得る（膜貫通ＨＳＰＧ）。膜貫通ＨＳＰＧの限定されない例として、それだけには限らないが、グリピカン、セレブログリカン、βグリカン、パールカン、ＣＤ４４およびシンデカンファミリーの種々のメンバー、例えば、シンデカン１、シンデカン２（フィブログリカン）、シンデカン３（Ｎ−シンデカン）およびシンデカン４（リュードカン）が挙げられる。グリピカンおよびセレブログリカンはまた、共有結合ＧＰＩアンカーを介して細胞膜と結合している場合もある。さらに、ＨＳＰＧは細胞表面高分子との相互作用を介して細胞表面と、非共有結合によって結合する場合もある（末梢膜ＨＳＰＧ）。
【００５５】
一実施形態では、本発明は、培養哺乳動物細胞によるタンパク質産生を増強するための可溶性ＨＳＧＡＧまたはＨＳＰＧまたはその断片の使用を特徴とする。可溶性ＨＳＧＡＧまたはＨＳＰＧまたはその断片は、固定されたまたは大きなＨＳＧＡＧまたはＨＳＰＧ分子の化学的または酵素的消化によって調製できる。例えば、膜貫通またはＧＰＩによって固定されたＨＳＰＧは、そのコアタンパク質のタンパク質分解による消化によって、または内因性ホスホリパーゼの作用によって細胞膜から放出され得る。同様に、ＨＳＧＡＧ鎖または断片は、多糖骨格の化学的または酵素的消化によって調製できる。有効量の可溶性ＨＳＧＡＧまたはＨＳＰＧ（またはその断片）を培養培地に添加し、培養細胞によるタンパク質産生を刺激できる。多くの場合、用いられる可溶性ＨＳＧＡＧまたはＨＳＰＧ（またはその断片）の量は、タンパク質産生増強作用が生じるためには、約１０〜２００μｇ／ｍｌのヘパリン（例えば、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００μｇ／ｍｌのヘパリン）に相当する。
【００５６】
一実施例では、本発明に用いられる可溶性ＨＳＧＡＧまたはＨＳＰＧ（またはその断片）は、少なくとも１つの二糖類単位ＩｄｏＡ（２−ＯＳＯ３）−ＧｌｃＮＳＯ３またはＩｄｏＡ（２−ＯＳＯ３）−ＧｌｃＮＳＯ３（６−ＯＳＯ３）を含む。別の実施例では、本発明に用いられる可溶性ＨＳＧＡＧまたはＨＳＰＧ（その断片）は、二糖類単位ＩｄｏＡ（２−ＯＳＯ３）−ＧｌｃＮＳＯ３またはＩｄｏＡ（２−ＯＳＯ３）−ＧｌｃＮＳＯ３（６−ＯＳＯ３）を含む五糖類、八糖類または十糖類を含む。さらに別の実施例では、本発明に用いられる可溶性ＨＳＧＡＧまたはＨＳＰＧ（またはその断片）は、複数の二糖類単位ＩｄｏＡ（２−ＯＳＯ３）−ＧｌｃＮＳＯ３またはＩｄｏＡ（２−ＯＳＯ３）−ＧｌｃＮＳＯ３（６−ＯＳＯ３）を含む。
【００５７】
ヘパリンまたはヘパリン様分子は、可溶性型の他に、基質上に固定され、哺乳動物宿主細胞によるタンパク質産生を刺激することができる。一実施例では、基質は培養宿主細胞のための物理的支持体を提供する（例えば、ヘパリンまたはヘパリン様分子によってコートされた培養プレート）。
【００５８】
さらに、哺乳動物宿主細胞によるタンパク質産生は、細胞におけるＨＳＧＡＧまたはＨＳＰＧの内因性合成を増強することによって増加させることができる。ヘパラン硫酸鎖の骨格は、グルクロノシルトランスフェラーゼおよびＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ活性の双方を有するヘパラン硫酸シンターゼによって合成されるようである。この骨格はさらに、一連のスルホトランスフェラーゼおよび炭水化物修飾酵素、例えば、Ｎ−脱アセチル化酵素／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ、Ｃ−５エピメラーゼ、２−Ｏスルホトランスフェラーゼ、６−Ｏスルホトランスフェラーゼおよび３−Ｏスルホトランスフェラーゼによって修飾することができる。したがって、これらの酵素の発現または活性を増大させることによって、細胞表面ＨＳＧＡＧまたはＨＳＰＧを増加させ、その結果、細胞によるタンパク質産生を改善することができる。これを達成するために、上記の酵素をコードする発現ベクターを哺乳動物宿主細胞に導入し、対象のタンパク質と同時発現させることができる。
【００５９】
Ｃ．遺伝子組換え哺乳動物宿主細胞によるタンパク質産生を増加させるための構成的に活性なＦＧＦＲまたはＦＧＦＲエフェクターの同時発現
構成的に活性なＦＧＦＲまたはＦＧＦＲ下流エフェクターを用いて培養哺乳動物宿主細胞によるタンパク質産生を促進できる。突然変異、遺伝子融合またはその他の遺伝子変更によって生じた構成的に活性なＦＧＦＲが、多数のヒト癌において観察されている。構成的に活性なＦＧＦＲ突然変異体の例として、それだけには限らないが、致死性骨異形成症Ｉ型突然変異を含むＦＧＦＲ（例えば、ＦＧＦＲ１または配列番号１中のＡｒｇ２５０→Ｃｙｓ突然変異およびＦＧＦＲ３または配列番号２中のＡｒｇ２４８→Ｃｙｓ突然変異）およびキナーゼドメインの活性化ループ中のミスセンス突然変異を含むＦＧＦＲ（例えば、ＦＧＦＲ１または配列番号１中のＬｙｓ６５６→Ｇｌｕ突然変異およびＦＧＦＲ３または配列番号２中のＬｙｓ６５０→Ｇｌｕ突然変異）が挙げられる。その他の構成的に活性なＦＧＦＲ突然変異体、例えば、すべて参照により本明細書に組み込まれる、Ｄｅ Ｍｏｅｒｌｏｏｚｅら（１９９７年） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｇｅｎｅｔ． Ｄｅｖ． ７、３７８〜３８５頁、Ｗａｎｇら（２００２年） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ６２、１８９８〜１９０３頁またはＷａｎｇら（２００４年） Ｐｒｏｓｔａｔｅ ５８、１〜１２頁に記載されるものも使用できる。さらに、本発明は、構成的に活性なキメラＦＧＦＲ、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｋｕｄｌａら （１９９８年） Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １４２、２４１〜２５０頁に記載されるものの使用を考慮する。これらの構成的に活性なＦＧＦＲをコードする組換え発現カセットは容易に構築し、哺乳動物宿主細胞に導入することができる。このような構成的に活性なＦＧＦＲとの同時発現により、対象のタンパク質の収率を大幅に高めることができる。
【００６０】
本発明はまた、哺乳動物宿主細胞によるタンパク質産生を改善するためのＦＧＦＲ下流エフェクターの使用を特徴とする。ＦＧＦＲエフェクターの限定されない例として、Ｃｒｋ（ｖ−ｃｒｋ肉腫ウイルスＣＴ１０癌遺伝子相同体）、ホスホリパーゼＣγ、線維芽細胞増殖因子受容体基質２およびＳＨＣ（Ｓｒｃ相同性２ドメイン含有）トランスフォーミングタンパク質が挙げられる。これらのタンパク質のすべてが、その活性化の際にＦＧＦＲのホスホチロシン残基と結合できるので、ＳＨ２−ドメインタンパク質である。本発明に使用できるその他のＦＧＦＲエフェクターとして、ＭＡＰＫシグナル伝達経路中の種々の成分、例えば、ＧＲＢ２（増殖因子受容体結合型タンパク質２）、ＳＯＳ１（セブンレス相同体１の息子）、ＲＲＡＳ２（関連ＲＡＳウイルス（ｒ−ｒａｓ）癌遺伝子相同体２）、ＲＡＦ１（ｖ−ｒａｆ−１ネズミ白血病ウイルス癌遺伝子相同体１）、ＭＡＰ２Ｋ１（マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ１）、ＭＡＰ２Ｋ２（マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ２）、ＭＡＰＫ１（マイトジェン活性化プロテインキナーゼ１）、ＳＲＦ（血清応答因子またはｃ−ｆｏｓ血清応答エレメント結合性転写因子）、ＦＯＳ（ｖ−ｆｏｓ ＦＢＪネズミ骨肉腫ウイルス癌遺伝子相同体）、ＥＬＫ１（ＥＬＫ１、ＥＴＳ癌遺伝子ファミリーのメンバー）、ＥＬＫ４（ＥＬＫ４、ＥＴＳ−ドメインタンパク質またはＳＲＦアクセサリータンパク質１）およびｃ−ＭＹＣ（ｖ−ｍｙｃ骨髄球腫症ウイルス癌遺伝子相同体）が挙げられる。構成的に活性なＦＧＦＲ同様、ＦＧＦＲ下流エフェクターをコードする組換え発現カセットは、容易に構築し、哺乳動物宿主細胞に導入し、対象のタンパク質とともに同時発現させることができる。
【００６１】
Ｄ．グリコサミノグリカン生合成インデューサー
本発明はさらに、哺乳動物細胞によるタンパク質産生を改善するための、β−キシロシドまたはその他のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）生合成インデューサーの使用を特徴とする。ヘパラン硫酸はヘパラン硫酸プロテオグリカンのグリコサミノグリカン成分としてｉｎ ｖｉｖｏで合成される。ＧＡＧ生合成は、ＵＤＰ−Ｘｙｌからコアタンパク質のセリン残基のヒドロキシル基へのキシロース残基の移動によって開始され、それに続いて２つのＧａｌ残基および１つのＧｌｃＡ残基を付加して結合四糖類ＧｌｃＡβ１−３Ｇｌａβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｘｙｌβ１を形成することがわかっている。次いで、この結合四糖類上でヘパラン硫酸が合成される。β−キシロシドの細胞培養培地への添加がＧＡＧ鎖の伸長を誘導するということも報告されている。
【００６２】
本発明は、β−キシロシドの、培養培地への添加は、培養哺乳動物宿主細胞によるタンパク質産生を大幅に増加させるということを実証する。適したβ−キシロシドの限定されない例として、それだけには限らないが、４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−キシロシド、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−キシロシドおよびベンジル−β−Ｄ−キシロシドが挙げられる。培養培地中のβ−キシロシドの濃度は、例えば、１０〜５００μｇ／ｍｌ、２０〜２００μｇ／ｍｌまたは５０〜１００μｇ／ｍｌの範囲であり得る。培養培地は、動物血清（例えば、１％、５％または１０％のウシ胎児血清）をさらに含んでもよく、または血清不含であってもよい。血清不含培地を用いる場合には、培養哺乳動物宿主細胞の産生率をさらに向上させるために、ＦＧＦ−２またはその他のＦＧＦ因子を補給してもよい。一実施例では、本発明に用いられる培養培地は、約２０〜約２００μｇ／ｍｌの４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−キシロシドを含む。別の実施例では、培養培地は約５０〜約１００μｇ／ｍｌの４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−キシロシドを含む。本明細書に記載される対象のタンパク質はいずれも、β−キシロシドまたはその他のＧＡＧ生合成インデューサーによって増強された哺乳動物発現系によって製造できる。
【００６３】
Ｅ．薬剤組成物
本発明によって製造される治療用または予防用タンパク質を用いて、ヒト疾患を治療または予防するための薬剤組成物を調製できる。本発明の薬剤組成物は、通常、治療有効量または予防有効量の対象のタンパク質と、薬理学上許容される担体とを含む。本明細書において「製薬上許容される担体」とは、いずれかの溶媒、分散媒、被膜、抗菌剤または抗真菌剤、等張剤または吸収遅延剤などであり得る。製薬上活性な物質のためのこのような媒体および物質の使用は当技術分野ではよく知られている。補助的有効成分も、本発明の薬剤組成物に組み込むことができる。
【００６４】
本発明の薬剤組成物の投与は、標的組織がその経路によって利用可能である限り、一般的な経路のいずれよってであってもよい。これとしては、経口、鼻腔、口内、直腸、経膣または局所が挙げられる。あるいは、投与は同所、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、腫瘍内、周囲、カテーテル法または静脈内注射によってであり得る。
【００６５】
本発明の薬剤組成物はまた、非経口的に、または腹膜内に投与できる。対象のタンパク質の溶液は、界面活性剤、例えば、ヒドロキシプロピルセルロースと適当に混合した水中で調製できる。また、分散物は、グリセロール、液体ポリエチレングリコールまたはその混合物中で、あるいはオイル中で調製できる。通常の保存および使用条件下では、これらの製剤は、微生物の増殖を防ぐための防腐剤を含み得る。
【００６６】
注射用用途に適した薬剤の形として、滅菌水溶液もしくは分散物または滅菌注射用溶液または分散物の即時調製のための滅菌粉末が挙げられる。多くの場合、薬剤の形は無菌であり、容易な注射針通過性が存在する程度に流動体である。薬剤の形はまた、製造および貯蔵条件下で安定であり、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に抗して保存できる。適した薬剤担体としては、それだけには限らないが、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）または植物油を含有する溶媒または分散媒が挙げられる。適切な流動性は、例えば、被膜、例えば、レシチンの使用によって、分散物の場合には必要とされる粒径の維持によって、または界面活性剤の使用によって維持できる。微生物の作用の阻止は、種々の抗菌剤または抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされ得る。多くの場合、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射用組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させる物質、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用によってもたらされ得る。
【００６７】
滅菌注射用溶液は、必要な量の治療用または予防用タンパク質を、上記で列挙した種々のその他の成分を含む適当な溶媒に組み込むこと、必要に応じて、続いて濾過滅菌することによって調製できる。通常、分散物は、種々の滅菌有効成分を、基礎分散媒と必要なその他の成分とを含む滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製する。滅菌注射用溶液を調製するための滅菌粉末の場合には、好ましい調製方法は、予め滅菌濾過した、有効成分およびいずれかのさらなる所望の成分の溶液から、有効成分およびいずれかのさらなる所望の成分の粉末が得られる真空乾燥または凍結乾燥技術である。
【００６８】
経口投与用に、本発明によって製造される治療用または予防用タンパク質を賦形剤と組合せ、摂取可能でないマウスウォッシュおよび歯磨剤の形で使用できる。マウスウォッシュは、必要な量の治療用または予防用タンパク質を、適当な溶媒、例えば、ホウ酸ナトリウム溶液（ドーベル液）に組み込んで調製できる。あるいは、治療用または予防用タンパク質を、ホウ酸ナトリウム、グリセリンおよび重炭酸カリウムを含有する殺菌洗浄液に組み込むことができる。治療用または予防用タンパク質はまた、歯磨剤、ゲル、ペースト、粉末またはスラリーに分散することができる。
【００６９】
製剤すると、組成物または溶液を、投与製剤と適合する方法で、治療上または予防上有効であるような量で投与できる。投与計画は、タンパク質の作用、病変部位、疾患の重篤度、患者の年齢、性別および食事、いずれかの炎症の重篤度、投与時間およびその他の臨床因子などの種々の因子に基づいて主治医によって決定され得る。一実施例では、全身投与または注射投与を、最小で有効な用量で開始し、事前選択した時間経過にわたって陽性作用が観察されるまで用量を増加させる。続いて、現れ得る何らかの悪影響を考慮しながら、対応する作用の増大が得られるレベルを制限しながら、投与量の漸増を行う。
【００７０】
治療用または予防用タンパク質の毒性および治療効力は、細胞培養物または実験動物モデルにおいて標準製薬手順によって調べることができる。例えば、対象のタンパク質のＬＤ５０（集団の５０％にとって致命的である用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療上有効な用量）は、従来の手段を用いて求めることができる。毒性作用と治療作用との間の用量比が治療指数であり、比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表すことができる。多くの場合、大きな治療指数を示す治療用タンパク質が選択される。
【００７１】
上記実施形態および以下の実施例は、制限するものではなく例示のために示されるということは理解されなくてはならない。本発明の範囲内の種々の変法および改変は、本説明から当業者に明らかとなるであろう。
【実施例】
【００７２】
（実施例１）
細胞培養およびＤＮＡ構築物
哺乳動物細胞株（ＨＥＫ２９３−ＦＴ、ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ、ＣＨＯ−ＤＵＫＸおよびＬｅｃ．３．２．８．１）を加湿したインキュベーター中で、５％ＣＯ２を用い、３７℃で増殖させ、維持した。ＨＥＫ２９３細胞は、５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補給したフリースタイル２９３培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で培養した。ＣＨＯ−ＤＵＫＸ安定株は、１０％ＦＢＳおよび２００ｎＭメトトレキサート（ＭＴＸ）を含有するα培地で増殖させた。ＨＥＫ２９３安定株は、１０％ＦＢＳおよび１００ｎＭ ＭＴＸを含有するα培地で培養した。
【００７３】
一過性発現は、５０ｍｌスピナまたは１Ｌスピナのいずれかで実施した。５０ｍｌ培養容積については、２．５ｍｌの血清不含２９３培地中で、２５μｇのプラスミドＤＮＡを４００μｇのポリエチレンイミン（ＰＥＩ、２５ｋＤａ、直鎖、ＨＣｌによってｐＨ７．０に中和、１ｍｇ／ｍｌ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、ペンシルベニア州Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ、ＰＡ）と混合した。１リットルの培養容積については、５０ｍｌの血清不含２９３培地中で、５００μｇのＤＮＡを４ｍｇのＰＥＩと混合した。次いで、スピナにおいて、混合物を、０．５×１０６個細胞／ｍｌの密度の、５％ＦＢＳを含む２９３培地中の５０ｍｌまたは１リットルのいずれかのＨＥＫ２９３細胞と混合した。スピナを３７℃で、Ｐ２００５スターラー（Ｂｅｌｌｃｏ）上、回転速度１７０ｒｐｍで７２〜１４４時間インキュベートし、その後回収した。
【００７４】
ＤＮＡ構築物には２種のベクター（ｐＳＭＥＤ２およびｐＳＭＥＤＡ）を用いた。ｐＳＭＥＤＡ、ｐＳＭＥＤ２由来の誘導体は図１に記載されている。ベクターが、ＥＢＮＡ−１ウイルス抗原を含む細胞において増幅され得るようにＯｒｉＰエレメントをｐＳＭＥＤＡに挿入した。このベクターは、ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞におけるタンパク質産生の数倍の増加を可能にする。ｓＦＲＰ−１（分泌型ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質１）構築物には、Ｃ末端Ｈｉｓ６タグおよび突然変異ＶＦＫ３１２−３１４ＬＥをＰＣＲプライマー中、停止コドンの前に組み込んだ。ＰＣＲ産物をＳａｌＩおよびＥｃｏＲＩで消化した。ゲル精製したＤＮＡ断片をｐＳＭＥＤ２（ｐＷＺ１０２８を作製）またはｐＳＭＥＤＡ（ｐＷＺ１０４９を作製）にサブクローニングした。
【００７５】
ＣＨＯ−ＤＵＫＸ ｓＦＲＰ−１安定株の確立のために、構築物ｐＷＺ１０２８をＣＨＯ−ＤＵＫＸ細胞にトランスフェクトし、トランスフェクトーマを５０ｎＭ、１００ｎＭまたは２００ｎＭのメトトレキサート（ＭＴＸ）に対して３週間選択した。７２コロニーをスクリーニングした後、２００ｎＭ ＭＴＸに対して耐性であり、ｓＦＲＰ−１の最高発現レベルを有する３コロニー（２００−１０、２００−１１および２００−１２と名づけた）を単離した。また、ＨＥＫ２９３細胞は、２コピーのジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子を有しているにもかかわらず、１００ｎＭ以上の濃度のＭＴＸに対して感受性であることがわかった。ｓＦＲＰ−１についてＨＥＫ２９３安定株を構築するために、ｐＷＺ１０２８をＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡにトランスフェクトし、トランスフェクトーマを１００ｎＭまたは２５０ｎＭのＭＴＸに対して３週間選択した。次いで、最良のクローンのうちの２つ、１００−５および１００−２０を単離した。
【００７６】
（実施例２）
ヘパリンはトランスフェクトされた細胞によるｓＦＲＰ−１産生を増強する
Ｃ末端ｈｉｓ６タグをつけたｓＦＲＰ−１を、実施例１に記載の通り、ＨＥＫ２９３−ＦＴ細胞において一過性に発現させた。５０μｇ／ｍｌのヘパリン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）をＤＮＡトランスフェクションの間またはその後（図２における「トランスフェクション後誘導時間」）に細胞培養物に添加した。コンディショニング培地を種々の時点（図２中「増殖時間」）で回収した。タンパク質サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、０．２μｇ／ｍｌのマウスモノクローナル抗ｈｉｓ４抗体（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてイムノブロッティングした（図２）。イムノブロッティングは、Ｚｈｏｎｇら（２００４年） ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ５６２、１１１〜１１７頁に記載されるとおり実施した。図２に示されるように、ヘパリンはトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞によるｓＦＲＰ−１産生を大幅に増加させた。最大の増加は、ＤＮＡトランスフェクションの４８時間後に培養培地にヘパリンを添加した場合に観察された。その他の実験では、組換えによって発現されたアグレカナーゼ−１またはアグレカナーゼ−２タンパク質について、このような増加は観察されなかった（データは示していない）。
【００７７】
Ｃ末端Ｈｉｓ６タグをつけたｓＦＲＰ−１も、ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞において一過性に発現させた。ＤＮＡトランスフェクションの４８時間後、種々の濃度のヘパリンを細胞培養物に添加した（図３中「μｇ／ｍｌヘパリン」）。ＤＮＡトランスフェクションの１２０時間または１４４時間後にコンディショニングされた培地を回収した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってタンパク質サンプルを分離し、マウスモノクローナル抗ｈｉｓ４抗体を用いてイムノブロッティングした（図３）。図３はタンパク質産生増強にとっての最適ヘパリン濃度は約２５μｇ／ｍｌであるということを示す。
【００７８】
一過性にトランスフェクトされた細胞に加え、ｓＦＲＰ−１について安定ＨＥＫ２９３細胞株（クローン１００−５および１００−２０）も用いて、タンパク質産生に対するヘパリンの刺激作用を評価した。クローン１００−５および１００−２０細胞を、種々の濃度のウシ胎児血清（図４中「ＦＢＳ」）の存在下で増殖させた。５０μｇ／ｍｌのヘパリンを新鮮培地とともに添加した。ヘパリン処理の７２時間後にコンディショニング培地を回収した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってタンパク質サンプルを分離し、マウスモノクローナル抗ｈｉｓ４抗体を用いて免疫染色した（図４）。ヘパリンは、クローン１００−５および１００−２０細胞によるｓＦＲＰ−１産生を大幅に増強した。また、ｓＦＲＰ−１産生は、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）の濃度が高まるにつれて増加し、このことは、ＦＢＳが哺乳動物細胞においてタンパク質産生を刺激できる因子（単数または複数）を誘導するということを示す。
【００７９】
ｍＲＮＡレベルに対するヘパリンの作用を、ノーザンブロット分析によって調べた。ＲＮＡｑｕｅｏｕｓ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて２９３細胞から全ＲＮＡを調製した。１．１％アガロース／２％ホルムアルデヒドＭＯＰＳゲル電気泳動によって１０μｇのＲＮＡを分離し、８×ＳＳＣを用いてＮｙｔｒａｎ Ｓｕｐｅｒｃｈａｒｇｅメンブラン（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ）上にブロッティングし、ＤＩＧイージーＨｙｂ溶液（Ｒｏｃｈｅ）中でジゴキシゲニン標識ＤＮＡプローブを用いて５０℃で一晩ハイブリダイズした。０．５×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳおよび０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳを用いて６０℃で洗浄した後（ＧＡＰＤＨ）、メンブランをブロッキング試薬（Ｒｏｃｈｅ）中で３０分間ブロッキングし、アルカリホスファターゼ標識抗ジゴキシゲニン抗体（Ｒｏｃｈｅ）を用い、Ｔｒｉｓ生理食塩水バッファー／０．３％ Ｔｗｅｅｎ２０を用いて３０分間プローブした。Ｓｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてシグナルを可視化した。プローブは、ジゴキシゲニン標識ヌクレオチド（Ｒｏｃｈｅ）を用いてＰＣＲによって作製した。図５に示されるように、ヘパリン処理細胞および偽処理細胞との間にｍＲＮＡ量に有意差がないので、ヘパリンはｓＦＲＰ−１のｍＲＮＡレベルを増加させない（レーン１対２、３対４、５対６）。したがって、ヘパリンはｓＦＲＰ−１のＤＮＡ転写またはｍＲＮＡ安定性に影響を及ぼさない。ｓＦＲＰ−１のタンパク質合成の際に、そのｍＲＮＡ後プロセスに影響を及ぼすと思われる。
【００８０】
細胞内タンパク質合成に対するヘパリンの作用を評価するために、上記のように、ｓＦＲＰ−１をＨＥＫ２９３−ＦＴ細胞において一過性に発現させた。５０μｇ／ｍｌのヘパリンをＤＮＡトランスフェクションの４８時間後に添加した。コンディショニング培地および細胞ペレットを、１２０または１４４時間で回収した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって各タンパク質サンプルを分離し、マウスモノクローナル抗Ｈｉｓ４抗体を用いてイムノブロッティングした（図６）。ヘパリンは、細胞内および細胞外ｓＦＲＰ−１の双方を増加させ、このことは、ヘパリンは細胞内タンパク質合成を刺激することによって哺乳動物細胞タンパク質産生を増強できるということを示唆する。さらに、分泌型ｓＦＲＰ−１の細胞取り込みは観察されなかった。このことは、培養培地中のｓＦＲＰ−１の蓄積は、培地に添加されたヘパリンによるＨＳＰＧ媒介性エンドサイトーシスの阻害の結果ではないということを示す。
【００８１】
ｓＦＲＰ−１に対するヘパリンの増強作用が、タンパク質安定化によるものであるかどうかを調べるために、ＨＥＫ２９３細胞によって産生されたｓＦＲＰ−１を精製した。実施例１に記載されるように、一過性発現から１リットルのコンディショニング培地を調製した。４℃で約１時間、ｓＦＲＰ−１−ｈｉｓ６含有培地をニッケル−ＮＴＡ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて平衡化した。樹脂を３０００ｒｐｍで遠心分離し（ＳＯＲＶＡＬＬ Ｈ−６０００Ａ／ＨＢＢ−６）、カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）に詰め、その後、ＨＰＬＣに取り付けた。１Ｍ ＮａＣｌ、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５および１５ｍＭ イミダゾールを用いて十分に洗浄した後、１Ｍ ＮａＣｌ、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５および２００ｍＭイミダゾール用いてｓＦＲＰ−１−ｈｉｓ６タンパク質を溶出した。溶出液を１０Ｋ ＭＷＣＯ濃縮器（Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて濃縮して２ｍｌに減らした。サンプルをさらに、１Ｍ ＮａＣｌ、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５中でＳｕｐｅｒｄｅｘ（商標）２００サイズ排除カラム（ＳＥＣ）カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）に通した。タンパク質は、ニッケル−ＮＴＡ後に実質的に精製され（図７Ａ、左パネル、および図７Ｂ、レーン１＆２）、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００後にはほぼ均質であった（図７Ａ、右パネル、および図７Ｂ、レーン３＆４）。
【００８２】
タンパク質濃度は２８０ｎｍでの吸光度によって調べた。ニッケル−ＮＴＡ後に得られたタンパク質は約２．５ｍｇ／Ｌであり、ＳＥＣ後は約１ｍｇ／Ｌである。ＳＥＣ分析では、ｓＦＲＰ−１−ｈｉｓ６はモノマーとして流れ（図７Ａ、右パネル）、これは、非還元条件下での３８ｋＤａポリペプチドとしてのｓＦＲＰ−１の移動と一致する（図７Ｂ、レーン４）。Ｎ末端配列決定およびマススペクトロメトリー分析によって、ｓＦＲＰ−１の同一性が確認され、タンパク質が多量にグリコシル化されていることが示された（データは示していない）。室温でインキュベートした場合は、精製ｓＦＲＰ−１タンパク質は、ヘパリンの不在下で極めて安定である（データは示していない）。精製ｓＦＲＰ−１タンパク質が活性であるかどうかを調べるために、ｓＦＲＰ−１のＷｎｔ３アンタゴニスト活性を測定した。図７Ｃに示されるように、トランスフェクトされたＵ２ＯＳ細胞では、Ｗｎｔ３はＴＣＦルシフェラーゼリポーター遺伝子発現を増加させた（Ｂｈａｔら（２００４年） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ． Ｐｕｒｉｆ． ３７、３２７〜３３５頁）。ニッケル−ＮＴＡ精製されたｓＦＲＰ−１またはＳＥＣ精製されたｓＦＲＰ−１のいずれかの添加により、Ｗｎｔ媒介性応答が用量依存的に減少したのに対し、バッファーは、Ｗｎｔ媒介性ＴＣＦルシフェラーゼリポーター活性化に対して影響を及ぼさなかった。これらのデータは、ヘパリンの不在下では、精製ｓＦＲＰ−１は安定であり、機能的であるということを明確に実証する。
【００８３】
タンパク質産生に対するヘパリンの刺激作用はまた、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞においても観察された。野生型ＣＨＯ細胞は、内因性ヘパリン様分子、ヘパリン硫酸グリコサミノグリカン（ＨＳＧＡＧ）を合成できる。しかし、野生型ＣＨＯ細胞を３０ｍＭ塩素酸塩（ヘパラン硫酸合成の阻害剤）を用いて４８時間前処理した場合には、細胞はヘパリン感受性となった。実験により、ヘパリンは、一過性発現条件および安定発現条件の双方の下で、塩素酸塩処理ＣＨＯ細胞においてタンパク質産生を増強することが示された。ｓＦＲＰ−１分泌のためヘパリンの必要条件をさらに特性決定するために、４つのグリコシル化突然変異を保持するグリコシル化欠損ＣＨＯ細胞株Ｌｅｃ３．２．８．１（Ｓｔａｎｌｅｙ （１９８９年） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ９、３７７〜３８３頁）を用いた。この細胞株は、大きく末端切断されたＮ結合型およびＯ結合型炭水化物を含む最も大幅に改変された炭水化物構造を発現する。図８にで示されるように、ヘパリンは突然変異ＣＨＯ株においてｓＦＲＰ−１分泌を刺激した（レーン１〜６）。
【００８４】
ヘパリン結合性タンパク質のＨＳとの相互作用は、配列およびＨＳの糖部分の硫酸化レベルによって定まる（Ｅｓｋｏら（２００２年） Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ７１、４３５〜４７１頁）。ｓＦＲＰ−１分泌におけるヘパリン活性にとってＯ硫酸化およびＮ硫酸化が必要であるかどうかを調べるために、ｓＦＲＰ−１によってトランスフェクトされた２９３細胞を、全体的にＮ−脱硫酸化、続いて、Ｎ−アセチル化された化学修飾されたヘパリン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）とともにインキュベートした。２−Ｏ−硫酸化を欠く修飾ヘパリン（Ｓｉｇｍａ）も、そのｓＦＲＰ−１分泌を刺激する能力について調べた。図９に示されるように、２−Ｏ−脱硫酸化ヘパリンは、そのｓＦＲＰ−１分泌を刺激する能力を完全に失った（レーン４）。対照的に、Ｎ−脱硫酸化ヘパリンは修飾されていないヘパリンと同程度に有効であり（レーン３）、このことは、Ｎ−硫酸化ではなくＯ−硫酸化がｓＦＲＰ−１の刺激に必要であることを示す。さらに、４−メチルウンベリフェリル７−β−Ｄ−キシロシド（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）、プロテオグリカンコアタンパク質の直鎖部分の代わりになり、したがって、グリコサミノグリカン生合成のための可溶性プライマーとして機能するキシロシドの添加により、５０および１００μｇ／ｍｌという濃度でｓＦＲＰ−１分泌が刺激され（レーン５＆６）、ヘパリンの作用が模倣された。
【００８５】
（実施例３）
ＦＧＦ−２はトランスフェクトされた細胞によるタンパク質産生を増強する
ｓＦＲＰ−１を安定に過剰発現するＨＥＫ２９３株由来の細胞（クローン１００−５）を、６ウェルプレートにおいてコンフルエンスに増殖させた。次いで、培地を、５０μｇ／ｍｌのヘパリンを含有する新鮮な血清不含培地で置換した。対応するウェルの培地に、５０ｎｇ／ｍｌの線維芽細胞増殖因子−１（ＦＧＦ−１、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）または線維芽細胞増殖因子−２（ＦＧＦ−２、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）を添加した。培地置換の４８時間後コンディショニング培地を回収した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってタンパク質サンプルを分離し、マウスモノクローナル抗Ｈｉｓ４抗体を用いてイムノブロッティングした（図１０）。図１０において実証されるように、ＦＧＦ−２とヘパリンの組合せが、安定にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞によるｓＦＲＰ−１産生を著しく増加させた。
【００８６】
したがって、ＦＧＦ−２およびヘパリンは、ノーザン分析がｓＦＲＰ−１のｍＲＮＡレベルはヘパリンの存在によって影響を受けないということを示すように（図５）、転写後タンパク質合成を調節すると思われる。理論に拘束されようとは思わないが、ヘパリンは、ＦＧＦがその標的タンパク質の翻訳に影響を及ぼすことがわかっているように（Ｓｚｅｂｅｎｙｉら（１９９９年） Ｉｎｔ． Ｒｅｖ． Ｃｙｔｏｌ．）、タンパク質翻訳プロセスに影響を及ぼし得る。ＦＧＦはまた、その産物が翻訳プロセスをアップレギュレートできるいくつかの標的遺伝子を活性化できる。別の可能性は、ＦＧＦ経路は分泌経路に沿ったタンパク質輸送を促進できるということである。ますます多くの証拠が、タンパク質分泌および表面局在化は一連のシグナル伝達経路、例えば、フォールディングされていないタンパク質反応によって厳重に調節されるということを示している（Ｓｃｈｒｏｄｅｒら（２００５年） Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ７４、７３９〜７８９頁）。いくつかのＥＲシャペロンが、種々のクライアントタンパク質の細胞表面局在化および分泌を促進することがわかっている。ヘパリンおよびＦＧＦ−２は、これらの機構を活性化し、組換えタンパク質の分泌を促進できる。
【００８７】
（実施例４）
ＦＧＦＲ−１の刺激はトランスフェクトされた細胞におけるタンパク質産生を増強する
ｓＦＲＰ−１を安定に過剰発現するＨＥＫ２９３細胞株由来の細胞（１００−５）を、６ウェルプレートにおいてコンフルエンスに増殖させ、次いで、ウサギポリクローナル抗ＦＧＦＲ−１または抗ＦＧＦＲ−２抗体（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）を用いて６時間前処理または偽処理した。続いて、細胞を５０μｇ／ｍｌのヘパリンを用いて処理した。ヘパリン処理の４８時間後コンディショニング培地を回収した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってタンパク質サンプルを分離し、マウスモノクローナル抗Ｈｉｓ４抗体を用いてイムノブロッティングした（図１１）。データは、抗ＦＧＦＲ−２を用いてではなく、抗ＦＧＦＲ−１を用いた前処理により、ヘパリン誘導性タンパク質増強が大幅に減少したということを示す。
【００８８】
（実施例５）
ヘパリンはトランスフェクトされた細胞におけるＭＭＰ−２３およびＤＫＫ−１タンパク質産生を増強する
ｐＳＭＥＤＡ中にＣ末端Ｈｉｓ６タグを含むメタロプロテイナーゼＭＭＰ−２３を、５％ＦＢＳを補給した培地において、ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞中で一過性に発現させた。トランスフェクションの２４時間後、トランスフェクトされた細胞を、種々の濃度のＦＢＳを含む新鮮培地に切り替えた。いくつかの反応物に５０μｇ／ｍｌのヘパリンを添加した。９６時間後コンディショニング培地を回収した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってタンパク質サンプルを分離し、マウスモノクローナル抗Ｈｉｓ４抗体を用いてイムノブロッティングした。図１２に示されるように、ヘパリンは、ＭＭＰ２３−ｈｉｓ６タンパク質の観察レベルを大幅に高めた。
【００８９】
ｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にＣ末端ｍｙｃタグを含むヒトＤｉｃｋｋｏｐｆ−１（ＤＫＫ−１）を、５％ＦＢＳを補給した培地においてＨＥＫ２９３−ＦＴ細胞中で一過性に発現させた。ＤＮＡトランスフェクションの２４時間後、細胞培養物に５０μｇ／ｍｌのヘパリンを添加した。９６時間後コンディショニング培地（Ｓ）および細胞ペレット（Ｐ）を回収した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってタンパク質サンプルを分離し、マウスモノクローナル抗ｍｙｃ抗体を用いてイムノブロッティングした。図１３に示されるように、ヘパリンは、ＤＫＫ１−ｍｙｓタンパク質のレベルを大幅に高めた。
【００９０】
本発明の前述の記載は、例示および説明を提供するものであって、包括的であることまたは本発明を開示される明確なものに制限することを意図するものではない。上記の教示と一致する改変および変法が考えられ、または本発明の実施から獲得され得る。したがって、本発明の範囲は特許請求の範囲およびその等価物によって定義されるということは留意される。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】図１は、本発明に用いられる発現ベクターの制限マップを表す。
【図２】図２は、培養ＨＥＫ２９３細胞における、タンパク質産生に対するヘパリンの増強作用を示す。
【図３】図３は、培養ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞においてタンパク質産生を増加させるためのヘパリンの最適濃度が約２５μｇ／ｍｌであることを実証する。
【図４】図４は、安定ＨＥＫ２９３細胞株において、ヘパリンが分泌型ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質１（ｓＦＲＰ−１）の産生を増加させることを示す。
【図５】図５は、ヘパリンがｓＦＲＰ−１ ｍＲＮＡレベルを高めないことを示すノーザンブロットである。
【図６】図６は、細胞内タンパク質合成に対するヘパリンの刺激効果を実証するウエスタンブロットである。
【図７】図７は、ヘパリンを用いない精製ｓＦＲＰ−１が活性であり、安定であることを実証する。パネルＡは、ニッケルＮＴＡカラム後にトランスフェクトされた２９３細胞から得たコンディショニング培地から得た１対のタンパク質溶出プロフィールである。ニッケル精製物質をサイズ排除カラムＳｕｐｅｒｄｅｘ２００を用いてさらに精製した。パネルＢは、精製ｓＦＲＰ−１−ｈｉｓ６のクーマシーブルー染色ゲルである。ニッケルＮＴＡまたはＳｕｐｅｒｄｅｘ２００後のタンパク質サンプルを、還元条件下（レーン１＆３）または非還元条件下（レーン２＆４）で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。パネルＣは、ＴＣＦ−ルシフェラーゼでトランスフェクトされたＵ２ＯＳ細胞を用いる、精製ｓＦＲＰ−１のＷｎｔ−３アンタゴニスト活性についてのルシフェラーゼアッセイを表す。
【図８】図８は、ヘパリンが、グリコシル化欠損ＣＨＯ細胞株Ｌｅｃ．３．２．８．１において、ｓＦＲＰ−１産生を刺激することを実証するウエスタンブロットである。ｓＦＲＰ−１でトランスフェクトされたＬｅｃ．３．２．８．１細胞を、ＤＮＡトランスフェクションの４８時間後、５０μｇ／ｍｌのヘパリンで偽処理または処理した。種々の時点でコンディショニング培地を回収し、抗ｈｉｓ４抗体を用いてイムノブロッティングによって分析した。
【図９】図９は、修飾ヘパリンの作用を示すウエスタンブロットである。ｓＦＲＰ−１でトランスフェクトされた２９３細胞を未処理のまま（−）またはすべて５０μｇ／ｍｌで、ヘパリン、Ｎ−脱硫酸化、Ｎ−アセチル化ヘパリン（ｄＮ−ヘパリン）、または２−Ｏ−脱硫酸化ヘパリン（ｄＯ−ヘパリン）とともに７２時間インキュベートした。また、細胞を、示した濃度の４−メチルウンベリフェリル７−β−Ｄ−キシロシド（キシロシド）で処理した。培地サンプルを回収し、抗ｈｉｓ４抗体を用いるイムノブロッティングについて分析した。
【図１０】図１０は、線維芽細胞増殖因子−２（ＦＧＦ−２）が、血清不含培地におけるヘパリンの作用を大幅に改善することを実証する。
【図１１】図１１は、線維芽細胞増殖因子受容体−１（ＦＧＦＲ−１）をブロックすることによって、ヘパリンのタンパク質産生増強効果が著しく低下することを示す。
【図１２】図１２は、ヘパリンが、ＨＥＫ２９３一過性発現においてヒトマトリックスメタロプロテイナーゼ２３（ＭＭＰ−２３）の産生を増強することを実証するウエスタンブロットである。
【図１３】図１３は、ヘパリンが、ＨＥＫ２９３一過性発現においてヒトＤｉｃｋｋｏｐｆ−１（ＤＫＫ−１）の産生を増強することを実証するウエスタンブロットである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
培地において培養された哺乳動物宿主細胞を含む発現系であって、該各細胞が対象のタンパク質をコードする組換え発現カセットを含み、該対象のタンパク質が細胞表面ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用して該タンパク質の細胞内部移行を誘導できず、該培地が該細胞による該タンパク質の産生を増加させるために有効量のヘパリンまたはヘパラン硫酸グリコサミノグリカンを含む、発現系。
【請求項２】
前記対象のタンパク質が、インスリン、成長ホルモン、増殖因子、エリスロポエチンタンパク質、卵胞刺激ホルモン、インターフェロン、インターロイキン、サイトカイン、コロニー刺激因子、凝固因子、組織プラスミノーゲンアクチベーター、副甲状腺ホルモン、骨形成タンパク質、ケラチノサイト増殖因子、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、グルカゴン、トロンビン、トロンボポエチン、プロテインＣ、分泌型ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質、セレクチン、メタロプロテイナーゼ、ｄｉｃｋｋｏｐｆタンパク質および抗体からなる群から選択される、請求項１に記載の発現系。
【請求項３】
前記培地が約１〜約１，０００μｇ／ｍｌのヘパリンを含む、請求項１に記載の発現系。
【請求項４】
前記培地が約１０〜約２００μｇ／ｍｌのヘパリンを含む、請求項１に記載の発現系。
【請求項５】
前記培地が、前記細胞による前記タンパク質の産生を増加させるために有効量のＦＧＦ−２を含む血清不含培地である、請求項１に記載の発現系。
【請求項６】
前記対象のタンパク質が骨の発達に関与するタンパク質である、請求項１に記載の発現系。
【請求項７】
前記対象のタンパク質が、骨形成タンパク質、分泌型ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質、メタロプロテイナーゼおよびｄｉｃｋｋｏｐｆタンパク質からなる群から選択される、請求項６に記載の発現系。
【請求項８】
請求項１に記載の発現系によって産生された対象のタンパク質を含む薬剤組成物。
【請求項９】
遺伝子組換え哺乳動物細胞を含み、その各々が対象のタンパク質とＦＧＦＲ−１媒介性シグナル伝達経路の構成的に活性な成分とをコードする１種または複数の組換え発現カセットを含む発現系。
【請求項１０】
前記成分が構成的に活性なＦＧＦＲ−１タンパク質である、請求項９に記載の発現系。
【請求項１１】
前記対象のタンパク質が、インスリン、成長ホルモン、増殖因子、エリスロポエチンタンパク質、卵胞刺激ホルモン、インターフェロン、インターロイキン、サイトカイン、コロニー刺激因子、凝固因子、組織プラスミノーゲンアクチベーター、副甲状腺ホルモン、骨形成タンパク質、ケラチノサイト増殖因子、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、グルカゴン、トロンビン、トロンボポエチン、プロテインＣ、分泌型ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質、セレクチン、メタロプロテイナーゼ、ｄｉｃｋｋｏｐｆタンパク質および抗体からなる群から選択される、請求項１０に記載の発現系。
【請求項１２】
前記対象のタンパク質が骨の発達に関与するタンパク質である、請求項１０に記載の発現系。
【請求項１３】
前記対象のタンパク質が、骨形成タンパク質、分泌型ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質、メタロプロテイナーゼおよびｄｉｃｋｋｏｐｆタンパク質からなる群から選択される、請求項１０に記載の発現系。
【請求項１４】
培地において培養された哺乳動物宿主細胞を含む発現系であって、該各細胞が対象のタンパク質をコードする組換え発現カセットを含み、該対象のタンパク質が細胞表面ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用して該タンパク質の細胞内部移行を誘導できず、該培地が該細胞による該タンパク質の産生を増加させるために有効量のＦＧＦＲ−１活性化剤を含む、発現系。
【請求項１５】
前記培地が血清不含培地であり、前記ＦＧＦＲ−１活性化剤が、
ヘパリンまたはヘパラン硫酸グリコサミノグリカンと
線維芽細胞増殖因子−２と
を含む、請求項１４に記載の発現系。
【請求項１６】
培地において培養された哺乳動物宿主細胞を含む発現系であって、該各細胞が対象のタンパク質をコードする組換え発現カセットを含み、該培地が該細胞による該タンパク質の産生を増加させるために有効量のβ−キシロシドを含む、発現系。
【請求項１７】
前記培地が約５０μｇ／ｍｌ〜約１００μｇ／ｍｌの４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−キシロシドを含む、請求項１６に記載の発現系。
【請求項１８】
組換えによって発現されるタンパク質の発現を増強するための方法であって、
該タンパク質をコードするメッセンジャーＲＮＡを含む哺乳動物細胞を培養するステップと、
ＦＧＦＲ−１を活性化するステップと、
を含み、ＦＧＦＲ−１の活性化が該タンパク質の翻訳を増強し、該タンパク質自体はＦＧＦＲ−１のアクチベーターではない、方法。
【請求項１９】
前記タンパク質がウイルスタンパク質ではない、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ＦＧＦＲ−１を活性化するステップが、前記タンパク質の翻訳を増強するために有効量のヘパリンまたはヘパラン硫酸グリコサミノグリカンを含む培地において前記細胞を培養するステップを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記培地が１０〜２００μｇ／ｍｌのヘパリンを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
各細胞が、メッセンジャーＲＮＡのための組換え発現カセットを含む一過性に導入される発現ベクターを含み、前記ヘパリンが、該発現ベクターが該細胞に一過性に導入された少なくとも２４時間後に前記培地に加えられる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記培地が前記タンパク質の翻訳を増強するために有効量のＦＧＦ−２をさらに含む血清不含培地である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記培地が血清をさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
ＦＧＦＲ−１を活性化するステップが、有効量のβ−キシロシドを含む培地において前記細胞を培養するステップを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２６】
前記培地が、ＦＧＦ−２をさらに含む血清不含培地である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記培地が血清をさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記哺乳動物細胞がヒト細胞である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２９】
前記タンパク質が細胞表面ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用して該タンパク質の細胞内部移行を誘導できない、請求項１８に記載の方法。
【請求項３０】
前記細胞または前記培地から前記タンパク質を単離するステップをさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項３１】
前記タンパク質が、インスリン、成長ホルモン、増殖因子、エリスロポエチンタンパク質、卵胞刺激ホルモン、インターフェロン、インターロイキン、サイトカイン、コロニー刺激因子、凝固因子、組織プラスミノーゲンアクチベーター、副甲状腺ホルモン、骨形成タンパク質、ケラチノサイト増殖因子、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、グルカゴン、トロンビン、トロンボポエチン、プロテインＣ、分泌型ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質、セレクチン、メタロプロテイナーゼ、ｄｉｃｋｋｏｐｆタンパク質および抗体からなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項３２】
請求項１８に記載の方法に従って産生された対象のタンパク質を含む薬剤組成物。
【請求項３３】
タンパク質を産生するための方法であって、
培地において哺乳動物細胞を培養するステップであって、該各細胞が、該タンパク質と、ＦＧＦＲ−１媒介性シグナル伝達経路の構成的に活性な成分とをコードする１種または複数の組換え発現カセットを含む、ステップと、
該細胞において該タンパク質および該成分を発現させるステップと、
該細胞または培地から該タンパク質を単離するステップと
を含む、方法。
【請求項１】
培地において培養された哺乳動物宿主細胞を含む発現系であって、該各細胞が対象のタンパク質をコードする組換え発現カセットを含み、該対象のタンパク質が細胞表面ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用して該タンパク質の細胞内部移行を誘導できず、該培地が該細胞による該タンパク質の産生を増加させるために有効量のヘパリンまたはヘパラン硫酸グリコサミノグリカンを含む、発現系。
【請求項２】
前記対象のタンパク質が、インスリン、成長ホルモン、増殖因子、エリスロポエチンタンパク質、卵胞刺激ホルモン、インターフェロン、インターロイキン、サイトカイン、コロニー刺激因子、凝固因子、組織プラスミノーゲンアクチベーター、副甲状腺ホルモン、骨形成タンパク質、ケラチノサイト増殖因子、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、グルカゴン、トロンビン、トロンボポエチン、プロテインＣ、分泌型ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質、セレクチン、メタロプロテイナーゼ、ｄｉｃｋｋｏｐｆタンパク質および抗体からなる群から選択される、請求項１に記載の発現系。
【請求項３】
前記培地が約１〜約１，０００μｇ／ｍｌのヘパリンを含む、請求項１に記載の発現系。
【請求項４】
前記培地が約１０〜約２００μｇ／ｍｌのヘパリンを含む、請求項１に記載の発現系。
【請求項５】
前記培地が、前記細胞による前記タンパク質の産生を増加させるために有効量のＦＧＦ−２を含む血清不含培地である、請求項１に記載の発現系。
【請求項６】
前記対象のタンパク質が骨の発達に関与するタンパク質である、請求項１に記載の発現系。
【請求項７】
前記対象のタンパク質が、骨形成タンパク質、分泌型ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質、メタロプロテイナーゼおよびｄｉｃｋｋｏｐｆタンパク質からなる群から選択される、請求項６に記載の発現系。
【請求項８】
請求項１に記載の発現系によって産生された対象のタンパク質を含む薬剤組成物。
【請求項９】
遺伝子組換え哺乳動物細胞を含み、その各々が対象のタンパク質とＦＧＦＲ−１媒介性シグナル伝達経路の構成的に活性な成分とをコードする１種または複数の組換え発現カセットを含む発現系。
【請求項１０】
前記成分が構成的に活性なＦＧＦＲ−１タンパク質である、請求項９に記載の発現系。
【請求項１１】
前記対象のタンパク質が、インスリン、成長ホルモン、増殖因子、エリスロポエチンタンパク質、卵胞刺激ホルモン、インターフェロン、インターロイキン、サイトカイン、コロニー刺激因子、凝固因子、組織プラスミノーゲンアクチベーター、副甲状腺ホルモン、骨形成タンパク質、ケラチノサイト増殖因子、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、グルカゴン、トロンビン、トロンボポエチン、プロテインＣ、分泌型ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質、セレクチン、メタロプロテイナーゼ、ｄｉｃｋｋｏｐｆタンパク質および抗体からなる群から選択される、請求項１０に記載の発現系。
【請求項１２】
前記対象のタンパク質が骨の発達に関与するタンパク質である、請求項１０に記載の発現系。
【請求項１３】
前記対象のタンパク質が、骨形成タンパク質、分泌型ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質、メタロプロテイナーゼおよびｄｉｃｋｋｏｐｆタンパク質からなる群から選択される、請求項１０に記載の発現系。
【請求項１４】
培地において培養された哺乳動物宿主細胞を含む発現系であって、該各細胞が対象のタンパク質をコードする組換え発現カセットを含み、該対象のタンパク質が細胞表面ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用して該タンパク質の細胞内部移行を誘導できず、該培地が該細胞による該タンパク質の産生を増加させるために有効量のＦＧＦＲ−１活性化剤を含む、発現系。
【請求項１５】
前記培地が血清不含培地であり、前記ＦＧＦＲ−１活性化剤が、
ヘパリンまたはヘパラン硫酸グリコサミノグリカンと
線維芽細胞増殖因子−２と
を含む、請求項１４に記載の発現系。
【請求項１６】
培地において培養された哺乳動物宿主細胞を含む発現系であって、該各細胞が対象のタンパク質をコードする組換え発現カセットを含み、該培地が該細胞による該タンパク質の産生を増加させるために有効量のβ−キシロシドを含む、発現系。
【請求項１７】
前記培地が約５０μｇ／ｍｌ〜約１００μｇ／ｍｌの４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−キシロシドを含む、請求項１６に記載の発現系。
【請求項１８】
組換えによって発現されるタンパク質の発現を増強するための方法であって、
該タンパク質をコードするメッセンジャーＲＮＡを含む哺乳動物細胞を培養するステップと、
ＦＧＦＲ−１を活性化するステップと、
を含み、ＦＧＦＲ−１の活性化が該タンパク質の翻訳を増強し、該タンパク質自体はＦＧＦＲ−１のアクチベーターではない、方法。
【請求項１９】
前記タンパク質がウイルスタンパク質ではない、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ＦＧＦＲ−１を活性化するステップが、前記タンパク質の翻訳を増強するために有効量のヘパリンまたはヘパラン硫酸グリコサミノグリカンを含む培地において前記細胞を培養するステップを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記培地が１０〜２００μｇ／ｍｌのヘパリンを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
各細胞が、メッセンジャーＲＮＡのための組換え発現カセットを含む一過性に導入される発現ベクターを含み、前記ヘパリンが、該発現ベクターが該細胞に一過性に導入された少なくとも２４時間後に前記培地に加えられる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記培地が前記タンパク質の翻訳を増強するために有効量のＦＧＦ−２をさらに含む血清不含培地である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記培地が血清をさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
ＦＧＦＲ−１を活性化するステップが、有効量のβ−キシロシドを含む培地において前記細胞を培養するステップを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２６】
前記培地が、ＦＧＦ−２をさらに含む血清不含培地である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記培地が血清をさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記哺乳動物細胞がヒト細胞である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２９】
前記タンパク質が細胞表面ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用して該タンパク質の細胞内部移行を誘導できない、請求項１８に記載の方法。
【請求項３０】
前記細胞または前記培地から前記タンパク質を単離するステップをさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項３１】
前記タンパク質が、インスリン、成長ホルモン、増殖因子、エリスロポエチンタンパク質、卵胞刺激ホルモン、インターフェロン、インターロイキン、サイトカイン、コロニー刺激因子、凝固因子、組織プラスミノーゲンアクチベーター、副甲状腺ホルモン、骨形成タンパク質、ケラチノサイト増殖因子、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、グルカゴン、トロンビン、トロンボポエチン、プロテインＣ、分泌型ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質、セレクチン、メタロプロテイナーゼ、ｄｉｃｋｋｏｐｆタンパク質および抗体からなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項３２】
請求項１８に記載の方法に従って産生された対象のタンパク質を含む薬剤組成物。
【請求項３３】
タンパク質を産生するための方法であって、
培地において哺乳動物細胞を培養するステップであって、該各細胞が、該タンパク質と、ＦＧＦＲ−１媒介性シグナル伝達経路の構成的に活性な成分とをコードする１種または複数の組換え発現カセットを含む、ステップと、
該細胞において該タンパク質および該成分を発現させるステップと、
該細胞または培地から該タンパク質を単離するステップと
を含む、方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【公表番号】特表２００８−５３８５０３（Ｐ２００８−５３８５０３Ａ）
【公表日】平成２０年１０月３０日（２００８．１０．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５０７８６３（Ｐ２００８−５０７８６３）
【出願日】平成１８年４月２０日（２００６．４．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０１４８５９
【国際公開番号】ＷＯ２００６／１１３８６１
【国際公開日】平成１８年１０月２６日（２００６．１０．２６）
【出願人】（５９１０１１５０２）ワイス (573)
【氏名又は名称原語表記】Ｗｙｅｔｈ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年１０月３０日（２００８．１０．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年４月２０日（２００６．４．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０１４８５９
【国際公開番号】ＷＯ２００６／１１３８６１
【国際公開日】平成１８年１０月２６日（２００６．１０．２６）
【出願人】（５９１０１１５０２）ワイス (573)
【氏名又は名称原語表記】Ｗｙｅｔｈ
【Ｆターム（参考）】
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