外来タンパク質を保持する酵母及びその利用
【課題】酵母細胞表層において、外来タンパク質を活性発現に好ましい形態で保持する技術を提供する。
【解決手段】外来タンパク質を細胞表層に保持するための酵母において、セルロソームのタイプＩスキャホールディンタンパク質のタイプＩコヘシンドメイン、タイプIIドックリンドメイン及び特定のアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と９０％以上の同一性のアミノ酸配列からなるドメインを含む第１の骨格タンパク質と、セルロソームのタイプIIスキャホールディンタンパク質のタイプIIコヘシンドメイン由来の第１の骨格タンパク質結合ドメインを含む第２の骨格タンパク質と、を備えるようにする。
【解決手段】外来タンパク質を細胞表層に保持するための酵母において、セルロソームのタイプＩスキャホールディンタンパク質のタイプＩコヘシンドメイン、タイプIIドックリンドメイン及び特定のアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と９０％以上の同一性のアミノ酸配列からなるドメインを含む第１の骨格タンパク質と、セルロソームのタイプIIスキャホールディンタンパク質のタイプIIコヘシンドメイン由来の第１の骨格タンパク質結合ドメインを含む第２の骨格タンパク質と、を備えるようにする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、外来タンパク質を高い活性を発揮可能に酵母の細胞表層に保持するための技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に、複数の酵素の協同的又は段階的な反応により一連の反応を進行させるためには、関連する酵素が一定の順序で配列されていることが好ましいと考えられている。
【０００３】
例えば、セルロースなどの生体高次構造物を分解利用するには、複数の酵素の協同的でかつ段階的な反応が必要とされている。セルロースを分解するある種の微生物は、細胞表面にセルロースを分解するための多種類の酵素の複合体（セルロソーム）を備えている。セルロソームは、複数のセルロース分解酵素が結合するセルロース結合タンパク質を備えることで、難分解性の結晶セルロースを効率的に分解すると考えられている。
【０００４】
このことから、セルロソームの構造を模倣して、酵素を機能的に配列させて反応効率に優れた酵素系列を人工的に構築する試みもなされている。例えば、複数の酵素がクロストリジウム・ジョスィ（Clostridum josui）等の由来の複数の酵素結合用ドメインを有するセルロース結合タンパク質を利用するものがある（特許文献１、２）。
【０００５】
また、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）においてミニセルロソームを分泌させるものも開示されている（非特許文献１）。さらに、クロストリジウム・セルロヴォランス（Clostridium cellulovorans）由来のコヘシン（cohesin）とスタフィロコッカス・オーレウス（Staphylococcus aureus）由来のZZドメインとをリンカーで連結したタンパク質を酵母細胞表層に連結する試みもある（非特許文献２）。
【０００６】
【特許文献１】特開２０００−１５７２８２号公報
【特許文献２】特開２００４−２３６５０４号公報
【非特許文献１】S. Perret et al., J. Bacterol., 186(1), 253-257(2004)
【非特許文献２】伊藤ら、C106、第71回化学工学会予稿集（2006）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、上記した文献の方法は、酵母の細胞表層において保持したエンドグルカナーゼなどのセルラーゼの良好な活性を実現するものではなかった。理由としては、線状の足場タンパク質の保持量が少ない、足場タンパク質への酵素の結合量が少ない、結合した状態での酵素活性が低い等、種々想定されるものの明らかではなかった。セルロース系バイオマスを循環利用可能な資源として活用するには、酵母の細胞表層に保持したセルラーゼによるセルロースの効率的な分解が必須であった。
【０００８】
以上説明したように、現状において、酵母の細胞表層においてセルラーゼを発現させる場合において、より効率的なセルラーゼ活性、すなわち、より高いセルロースの分解活性を得るための技術が求められている。
【０００９】
そこで、本発明は、酵母細胞表層において、外来タンパク質を活性発現に好ましい形態で保持する技術を提供することを一つの目的とする。より具体的には、外来タンパク質を活性発現に好ましい形態で細胞表層に備える酵母を、当該酵母を得るための発現ベクター及びセット、当該酵母の作製方法、及び当該酵母を用いた有用物質生産方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記した課題を解決するべく、酵母の細胞表層において保持させる線状の足場タンパク質の構造につき種々検討したところ、セルロソームを産生する細菌のセルロソームのスキャホールディンタンパク(以下、本明細書において骨格タンパク質という。)に含まれる親水性アミノ酸に富むドメイン（Ｘモジュールと称される。）を足場タンパク質に含めることによって、外来タンパク質を細胞表層に保持し、しかも外来タンパク質による高い活性を発揮する酵母が得られるという知見を得た。本発明によれば以下の手段が提供される。
【００１１】
本発明によれば、外来タンパク質を細胞表層に保持するための酵母であって、
以下の３つのドメイン；
（ａ）セルロソームのタイプＩスキャホールディンタンパク質のタイプIコヘシンドメイン由来の外来タンパク質結合ドメイン、
（ｂ）前記タイプＩスキャホールディンタンパク質のタイプIIドックリンドメイン由来の第２の骨格タンパク質結合ドメイン、及び
（ｃ）前記タイプＩスキャホールディンタンパク質の前記タイプIIドックリンドメインに隣接する配列番号１に記載のアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と９０％以上の同一性のアミノ酸配列からなるドメイン、
を含む第１の骨格タンパク質と、
セルロソームのタイプIIスキャホールディンタンパク質のタイプIIコヘシンドメイン由来の第１の骨格タンパク質結合ドメインを含む第２の骨格タンパク質と、
を備え、
前記第２の骨格タンパク質は、前記酵母の細胞表層に保持され、
前記第１の骨格タンパク質は、前記第２の骨格タンパク質を介して前記酵母表層に結合されている、酵母が提供される。
【００１２】
本発明の酵母において、前記骨第１の骨格タンパク質は、さらに、セルロース結合ドメインを含むことができる。また、前記第１の骨格タンパク質の前記（ａ）のドメイン、前記（ｂ）のドメイン及び前記（ｃ）のドメインは、それぞれ、クロストリジウム・サーモセラム（Clostridium thermocellum）のセルロソームのタイプIスキャホールディンタンパク質に由来していてもよく、前記第１の骨格タンパク質は、３個以上の前記（ａ）のドメインを備えていてもよい。さらに、前記第１の骨格タンパク質は、４個以上７個以下の前記（ａ）のドメインを備えることができる。さらにまた、前記第１の骨格タンパク質を細胞外に分泌するものであってもよい。
【００１３】
前記第２の骨格タンパク質は、前記第１の骨格タンパク質結合ドメインを複数個タンデムに有していてもよく、クロストリジウム・サーモセラム（Clostridium thermocellum）のセルロソームのタイプIIスキャホールディンタンパク質に由来するものであってもよい。また、前記第２の骨格タンパク質を細胞表層提示するものであってもよい。
【００１４】
前記（ａ）のドメインは、セルロースを分解する酵素群から選択される１腫又は２種以上を結合可能とすることができる。
【００１５】
本発明によれば、また、細胞表層に外来タンパク質を保持する酵母であって、
上記（ａ）〜（ｃ）のドメインを備える第１の骨格タンパク質と、セルロソームのタイプIIスキャホールディンタンパク質由来のタイプIIコヘシンドメイン由来の第１の骨格タンパク質結合ドメインを含む第２の骨格タンパク質と、を備え、前記第２の骨格タンパク質は、前記酵母の細胞表層に保持され、前記第１の骨格タンパク質は、前記第２の骨格タンパク質を介して前記酵母表層に結合されている、酵母が提供される。
【００１６】
上記酵母においては、前記外来タンパク質は、セルロースを分解する酵素群から選択される１種又は２種以上とすることができ、好ましくは、前記外来タンパク質は、少なくともβ−グルコシダーゼ、エンドグルカナーゼ及びセロビオヒドロラーゼからなる群から選択される２種以上を含んでいる。さらに、前記酵母は、外来タンパク質の生産能を有していないことが好ましい。
【００１７】
本発明によれば、上記記載の外来タンパク質を細胞表層に保持するための酵母の作製方法であって、上記のいずれかに記載の酵母であって、前記外来タンパク質を結合可能な前記（ａ）のドメインを備える酵母を準備する工程と、前記外来タンパク質を前記酵母の外部から供給して、前記酵母の細胞表層側に前記外来タンパク質を保持させる工程と、を備える、作製方法が提供される。
【００１８】
前記タンパク質は、セルロースを分解する酵素群から選択される１又は２種以上とすることができる。
【００１９】
本発明によれば、セルロースの分解方法であって、セルロース系材料中のセルロースと、
細胞表層に外来タンパク質を保持する酵母であって、上記（ａ）〜（ｃ）の３つのドメインを含む第１の骨格タンパク質と、セルロソームのタイプIIスキャホールディンタンパク質由来のタイプIIコヘシンドメイン由来の第１の骨格タンパク質結合ドメインを含む第２の骨格タンパク質と、を備え、前記第２の骨格タンパク質は、前記酵母の細胞表層に保持され、前記第１の骨格タンパク質は、前記第２の骨格タンパク質を介して前記酵母表層に結合されており、前記外来タンパク質は、セルロースを分解する酵素群から選択される１種又は２種以上の酵素である酵母と、を接触させて、前記酵素によりセルロースを分解する工程、を備える、分解方法が提供される。
【００２０】
本発明によれば、セルロースを利用する有用物質の生産方法であって、セルロース系材料中のセルロースと、細胞表層に外来タンパク質を保持する酵母であって、上記（ａ）〜（ｃ）の３つのドメインを含む第１の骨格タンパク質と、セルロソームのタイプIIスキャホールディンタンパク質由来のタイプIIコヘシンドメイン由来の第１の骨格タンパク質結合ドメインを含む第２の骨格タンパク質と、を備え、前記第２の骨格タンパク質は、前記酵母の細胞表層に保持され、前記第１の骨格タンパク質は、前記第２の骨格タンパク質を介して前記酵母表層に結合されており、前記外来タンパク質は、セルロースを分解する酵素群から選択される１種又は２種以上の酵素である酵母と、を接触させて、前記酵素によりセルロースを分解する工程と、前記酵素によって得られるセルロース分解産物を前記酵母によって資化し有用物質に変換する工程と、を備える生産方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明は、外来タンパク質を保持する酵母及びその利用に関している。本発明の酵母の細胞表層の一例を図１に示す。本発明の酵母は、足場タンパク質である第１の骨格タンパク質が、上記（ａ）〜（ｃ）の３つのドメインを有し、第２の骨格タンパク質が、タイプIIスキャホールディンタンパク質のタイプIIコヘシンドメイン由来の第１の骨格タンパク質結合ドメインを備えていることにより、外来タンパク質の高い活性を発揮する酵母を得ることができる。
【００２２】
このような効果が得られる理由は必ずしも明らかではないが、このような骨格タンパク質の組み合わせ及び３つのドメインの組み合わせによると、結果として外来タンパク質をその機能を発揮しやすい状態で保持されたか、あるいは、多数個の外来タンパク質が細胞表層に保持されたことが推測される。
【００２３】
以下、本発明の各種実施形態に関し、外来タンパク質を保持のための酵母、外来タンパク質を保持した酵母及びその作製方法、セルロースの分解方法並びに有用物質の生産方法について順次説明する。
【００２４】
（外来タンパク質を保持するための酵母）
本発明の外来タンパク質を保持するための酵母（以下、外来タンパク質保持用酵母という。）は、特定の３つのドメインを含む第１の骨格タンパク質と、当該第１の骨格タンパク質を結合するドメインを含む第２の骨格タンパク質と、を備えている。この外来タンパク質保持用酵母は、外来タンパク質を細胞表層に保持し、当該外来タンパク質の高い活性を発揮することができる。かかる酵母は、酵母が本来的には資化できない材料を、細胞表層で分解して酵母が資化可能な栄養源に変換するのに用いることができる。この結果、酵母が従来資化できないセルロースなどの材料をあたかも酵母自身が資化するかのように効率的に利用することができるようになる。
【００２５】
（酵母）
外来タンパク質保持用酵母に用いる酵母としては、特に限定されない。例えば、ピキア属、サッカロマイセス属及びカンジダ属から選択されるいずれかであることが好ましい。ピキア属としては、例えば、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）等が挙げられ、サッカロマイセス属としては、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）等が挙げられる。また、カンジダ属としては、カンジダ・クルゼイ（Candida krusei）等が挙げられる。また、天然にある酵母のほか遺伝子工学的に改変した酵母であってもよいし、化学的な手法により変異させた酵母であってもよい。
【００２６】
（外来タンパク質）
外来タンパク質保持用酵母において保持しようとする外来タンパク質は特に限定されない。外来タンパク質としては１種類のみならず２種類以上を同時に保持することができる。好ましくは、協同的又は段階的に機能する多数個又は複数種類のタンパク質である。こうしたタンパク質としては、その構造の観点からは、ペプチド鎖を有していれば足り、糖タンパク質、脂質タンパク質などのタンパク質と他の生体成分等とのタンパク質複合体であってもよい。また、その機能の観点からは、特に限定されないが、例えば、酵素、抗体、受容体、抗原として機能するものが挙げられる。
【００２７】
外来タンパク質保持用酵母が保持するタンパク質としては、酵素が好ましい。特に、複数種類の酵素が協同的又は段階的に作用する酵素反応系を構成する当該複数酵素群の少なくとも一部であることが好ましい。本発明の外来タンパク質保持用酵母によれば、多数個又は複数種類の酵素を近接配置することができるため、複数の酵素反応が必要とされる酵素反応系における全体の反応速度を高めることができる。こうした酵素群の一つとしては、セルロースを分解する酵素であるセルラーゼやデンプンを分解する酵素群が挙げられる。セルラーゼについては、後段にて詳述する。
【００２８】
（第１の骨格タンパク質）
本発明のタンパク質保持用酵母は、第１の骨格タンパク質をその表層側に備えることができる。換言すれば、酵母の細胞表層において露出された状態で第１の骨格タンパク質を備えている。また、タンパク質保持用酵母は、細胞表層に保持された第２の骨格タンパク質を介して第１の骨格タンパク質を備えている。
【００２９】
第１の骨格タンパク質は、基本的に単鎖のポリペプチド鎖から構成されるタンパク質であり、少なくとも以下の３つの異なるドメインを備えている。以下、各ドメインについて説明する。
【００３０】
（セルロソームのタイプＩスキャホールディンタンパク質のタイプIコヘシンドメイン由来の外来タンパク質結合ドメイン）
外来タンパク質結合ドメインは、酵母にとっての外来タンパク質を結合保持するためのドメインである。このドメインは、セルロソームのタイプＩスキャホールディンタンパク質のタイプＩコヘシンドメインに由来している。スキャホールディンタンパク質のタイプＩコヘシンドメインは、以下の表１に示す各種のセルロソーム生産微生物の形成するセルロソーム（セルラーゼ複合体）のタイプＩのスキャホールディンタンパク質において触媒活性のあるセルラーゼを非共有結合にて結合するドメインとして知られている（粟冠ら、蛋白質核酸酵素、Vol.44、No.10（1999）、p41-p50、Demain, A. L., et al., Microbiol Mol. Biol Rev., 69(1), 124-54(2005), Doi, R. H., et al., J. Bacterol., 185(20), 5907-5914(2003)等）。こうしたタイプIコヘシンドメインとしては、各種セルロソーム生産微生物において多数その配列が決定されている。これらの各種のタイプIコヘシンのアミノ酸配列及びＤＮＡ配列は、NCBIのHP（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）等を介してアクセス可能な各種のタンパク質データベースやDNA配列のデータベースにより容易に取得することができる。
【表１】
【００３１】
セルロソームは、嫌気性細菌や嫌気性糸状菌によって菌体外に形成され、通常、微生物表面に結合して又は培養液中に存在している。セルロソームとしては、表１に示すセルロソームを形成する微生物を含む嫌気性微生物等、公知のセルロソーム生産微生物が生産するセルロソーム及び将来的に明らかにされるセルロソーム並びにこれらの改変体のいずれであっても本発明の第１の骨格タンパク質や後述する第２の骨格タンパク質に用いることができる。セルロース分解能力の高さ等を考慮すると、クロストリジウム・サーモセラム等の好熱嫌気性微生物やクロストリジウム・セルロリティカム等のクロストリジウム属菌の生産するセルロソーム又はその改変体を本発明において用いることができる。
【００３２】
第１の骨格タンパク質の外来タンパク質結合ドメインとしては、例えば、クロストリジウム・サーモセラム（Clostridium thermocellum）のタイプIスキャホールディンタンパク質、クロストリジウム・ジョスィ（Clostridium josui）のタイプＩスキャホールディンタンパク質等のタイプＩコヘシンドメインを用いることができる。また、C.cellulolyticum(NCBIのホームページhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/)、アクセッション番号：U40345）、C.cellulovorans（同ホームページ、アクセッション番号：M73817）、C.acetobutylicum(同ホームページ、アクセッション番号：AE001437)に開示されるタイプＩコヘシンドメインも挙げられる。
【００３３】
なお、本明細書において、タンパク質の所定のドメインに由来している、とは、天然に存在する当該所定のドメインのアミノ酸配列又はその改変配列からなることを意味している。改変配列は、当該所定のドメインと同一の作用を発揮する範囲でアミノ酸配列が改変された配列である。こうしたアミノ酸配列は、例えば、当該所定のドメインのアミノ酸配列と好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９９％以上の同一性を有するものである。
【００３４】
なお、本明細書において同一性及び類似性とは、当業者において知られているとおり、配列を比較することにより決定される、２以上のタンパク質あるいは２以上のポリヌクレオチドの間の関係である。当該技術分野で“同一性 ”とは、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間のアラインメントによって、あるいは場合によっては、一続きのそのような配列間のアラインメントによって決定されるような、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間の配列不変性の程度を意味する。また、類似性とは、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間のアラインメントによって、あるいは場合によっては、一続きのそのような配列間のアラインメントによって決定されるような、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間の相関性の程度を意味する。より具体的には、配列の同一性と保存性（配列中の特定アミノ酸又は配列における物理化学特性を維持する置換）によって決定される。類似性は、後述するＢＬＡＳＴの配列相同性検索結果においてSimilarity と称される。同一性及び類似性を決定する好ましい方法は、対比する配列間で最も長くアラインメントするように設計される。同一性及び類似性を決定するための方法は、公に利用可能なプログラムにコードされている。例えば、AltschulらによるBLAST (Basic Local Alignment Search Tool) プログラム（たとえば、Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ., J. Mol. Biol., 215: p403-410 (1990), Altschyl SF, Madden TL, Schaffer AA, Zhang J, Miller W, Lipman DJ., Nucleic Acids Res. 25: p3389-3402 (1997))を利用し決定することができる。BLASTのようなソフトウェアを用いる場合の条件は、特に限定するものではないが、デフォルト値を用いるのが好ましい。
【００３５】
第１の骨格タンパク質は、こうした外来タンパク質結合ドメインを複数個タンデムに有することが好ましい。「タンデムに有する」とは、アミノ酸配列において、複数個の当ドメインが並んだ状態であればよく、並んだタンパク質結合ドメイン間における離間配列の存在の有無、離間間隔が一定であること及び異種のドメインの存在を問わない。好ましくは、ドメイン間に離間配列を有している。複数個の外来タンパク質結合ドメインは、１種類のアミノ酸配列からなる同一種類のドメインであってもよいし、２種類以上の異なるアミノ酸配列からなるドメインであってもよい。異なる種類の外来タンパク質結合ドメインを用いることで、異なる外来タンパク質を第１の骨格タンパク質上に配列させることができる。
【００３６】
第１の骨格タンパク質は、酵母が凝集性を獲得する程度に外来タンパク質結合ドメインを有していることが好ましい。酵母に酵素等のタンパク質を保持させて利用するとき、こうした酵母が凝集可能であれば、凝集された酵母上において酵素等を集約させることができるほか、酵母を効率的に回収して繰り返し利用することができる。
【００３７】
第１の骨格タンパク質により酵母に凝集性を付与するのにあたり、３個以上の外来タンパク質結合ドメインを有していることが好ましい。３個以上であると、酵母に凝集性を付与しやすくなる傾向があるからである。好ましくは４個以上である。４個以上であると明らかに酵母に凝集性を付与しやすくなるからである。凝集性の観点からは外来タンパク質結合ドメイン数の上限は特に限定されない。なお、発現量を容易に確保するという観点からは、７個程度以下であることが好ましい場合がある。
【００３８】
外来タンパク質結合ドメインは、タイプＩコヘシンドメインに基づく結合性で外来タンパク質を結合保持することができる。すなわち、タイプＩコヘシンドメインは、タイプＩドックリンドメインを有する外来タンパク質と結合することができる。タイプＩドックリンドメインは、タイプＩスキャホールディンタンパク質のタイプＩコヘシンと非共有結合で結合する部位であり、セルロソームを構成するセルラーゼが備えるドメインである。例えば、外来タンパク質結合ドメインが、クロストリジウム・サーモセラム由来のタイプＩコヘシンに由来するとき、タイプＩドックリンドメインとしては、配列番号２で表されるアミノ酸配列が挙げられ、クロストリジウム・セルロリティカム、クロストリジウム・サーモセルロボランス、クロストリジウム・ジョスイ、クロストリジウム・アセトブチリカム、ルミノコッカス・フレイブファシエンス（R. fravefaciens）、アシドサーモス・セルロリティカス（A. cellulolyticus）、バクテロイデス・セルロソルベンス（B.cellulosolvens）由来のタイプＩコヘシンに由来するとき、それぞれ、配列番号３〜配列番号９で表されるアミノ酸配列が挙げられる。
【００３９】
外来タンパク質結合ドメインは、第１の骨格タンパク質において、第２の骨格タンパク質との結合を妨げない箇所に備えられていればよい。典型的には、Ｎ末端以外の部位に備えられている。
【００４０】
（タイプＩスキャホールディンタンパク質のタイプIIドックリンドメイン由来の第２の骨格タンパク質結合ドメイン）
第２の骨格タンパク質結合ドメインは、後述する第２の骨格タンパク質を結合するためのドメインである。このドメインは、セルロソームにおいて、タイプI骨格タンパク質を非共有結合でタイプII骨格タンパク質上に保持するためのドメインとして知られている（粟冠ら、蛋白質核酸酵素、Vol.44、No.10（1999）、p41-p50等）。こうしたタイプIIドックリンドメインとしては、各種セルロソーム生産微生物において多数その配列が決定されている。これらの各種のタイプIIドックリンドメインのアミノ酸配列及びＤＮＡ配列は、NCBIのHP（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）等を介してアクセス可能な各種のタンパク質データベースやDNA配列のデータベースにより容易に取得することができる。例えば、クロストリジウム・サーモセラムのタイプIIドックリンドメインとしては、配列番号１０に記載されるアミノ酸配列が挙げられ、アシドサーモス・セルロリィカス及びルミノコッカス・フレイブファシエンスの同ドメインとしては、それぞれ配列番号１１及び１２に記載されるアミノ酸配列が挙げられる。
【００４１】
第２の骨格タンパク質結合ドメインは、第２の骨格タンパク質結合ドメインを結合するドメインであることから、第１の骨格タンパク質のＣ末端若しくはＮ末端又はこれらの近傍に第２の骨格タンパク質を結合可能に備えられる。典型的には、第１の骨格タンパク質のＣ末端又はその近傍に備えられる。
【００４２】
（配列番号１で表されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と９０％以上の同一性のアミノ酸配列からなるドメイン）
このドメイン（以下、本明細書において第３のドメインという。）を備えることで、第３のドメインを備えない酵母よりも、結果として、外来タンパク質の活性を増強することができる。第３のドメインが結果として外来タンパク質の活性を増強することへの作用は既に説明したように必ずしも明らかではない。配列番号１で表されるアミノ酸配列は、クロストリジウム・サーモセラムのタイプＩスキャホールディンタンパク質のタイプIIドックリンに隣接するＸモジュールと呼ばれる配列である。Ｘモジュールの機能は必ずしも明らかでなく、また、クロストリジウム・サーモセラム又はクロストリジウム属でもなく、しかも真菌である酵母細胞表層に保持させる第１の骨格タンパク質に用いるときにどのように作用するかは全く知られていない。
【００４３】
このような第３のドメインとしては、配列番号１で表されるアミノ酸配列のほか、当該アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を用いることができる。より好ましくは９５％以上である。すなわち、配列番号１で表されるアミノ酸配列において１個又は数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入及び付加から選択される１種又は２種以上の変異を有するアミノ酸配列からなっていてもよい。好ましくは、１個以上１０個以下、より好ましくは１個以上５個以下の変異であり、さらに好ましくは、１個以上３個以下である。
【００４４】
なお、本明細書の開示によれば、本発明に用いることのできる第３のドメインは、上記のように配列番号１で表されるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列に限定されるものではなく、第２の骨格タンパク質結合ドメインが由来するセルロソーム産生微生物と同一の株又は種のタイプＩスキャホールディンタンパク質のＸモジュールに由来する必要はなく、同一種の異なる株や他の種のセルロソーム産生微生物に由来していてもよいが、同一種又は株のＸモジュールに由来していることが好ましい。
【００４５】
配列番号１で表されるアミノ酸配列の起源であるクロストリジウム・サーモセラム以外に由来する第３のドメインのアミノ酸配列としては、例えば、アシドサーモス・セルロリィティカス由来のＸモジュールである配列番号１３で表されるアミノ酸配列（配列番号１との同一性が６２％である。）、ルミノコッカス・フレイブファシエンス由来のＸモジュールである配列番号１４で表されるアミノ酸配列（配列番号１との同一性が２１％である。）が挙げられる。
【００４６】
第１の骨格タンパク質は、第３のドメインを第２の骨格タンパク質結合ドメインの近傍、好ましくは第２の骨格タンパク質結合ドメインに隣接して、第２の骨格タンパク質結合ドメインが存在する末端よりも中央よりの部位に備える。第２の骨格タンパク質結合ドメインは、Ｃ末端側にある場合には、第２の骨格タンパク質結合ドメインのＮ末端側に隣接して備えられることが好ましい。
【００４７】
（セルロース結合ドメイン）
外来タンパク質保持用酵母が、セルロースの分解に用いる場合には、第１の骨格タンパク質は、セルロソームのタイプＩスキャホールディンタンパク質のセルロース結合ドメイン（CBD）由来のセルロース結合ドメインを有していることが好ましい。セルロース結合ドメインは、タイプＩのスキャホールディンタンパク質において基質であるセルロースに結合するドメインとして知られている（前述粟冠ら）。セルロース結合ドメインは、１個又は２個以上備えられていてもよい。なお、酵母が備える第１の骨格タンパク質の全てにおいてセルロース結合ドメインを要するものではない。
【００４８】
各種のセルロソーム生産微生物のセルロソームにおけるCBDのアミノ酸配列及びDNA配列の多くが決定されており、これらの各種のCBDのアミノ酸配列及びＤＮＡ配列は、NCBIのHP（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）等を介してアクセス可能な各種のタンパク質データベースやDNA配列のデータベースにより容易に取得することができる。例えば、クロストリジウム・サーモセラムのセルロース結合ドメインとしては、配列番号１５で表されるアミノ酸配列が挙げられる。また、クロストリジウム・セルロリティカス、クロストリジウム・セルロボランス、クロストリジウム・アセトブチリカム、クロストリジウム・ジョスイ、アシドサーモス・セルロリティカス、バクテロイデス・セルロボランスのセルロース結合ドメインとしては、ぞれぞれ配列番号１６〜２１で表されるアミノ酸配列を有するドメインが挙げられる。
【００４９】
セルロース結合ドメインは、第１の骨格タンパク質においては、好ましくはＮ末端若しくはその近傍又はその全長においてＮ末端よりに備えられている。
【００５０】
以上説明した第１の骨格タンパク質は、各要素を人工的に組み合わせた人工タンパク質であってもよいし、セルロソーム生産微生物のタイプＩスキャホールディンタンパク質に由来するものであってもよい。すなわち、タイプＩスキャホールディンタンパク質の全体若しくはその一部又はこれらの改変体であってもよい。改変体とは、セルロソーム生産微生物のセルロソームから取得されるタイプIスキャホールディンタンパク質の塩基配列及び／又はアミノ酸配列の全体又はその一部において少なくとも部分的に改変したものをいう。第１の骨格タンパク質は、クロストリジウム・サーモセラム（Clostridium thermocellum）のタイプIスキャホールディンタンパク質、クロストリジウム・ジョスィ（Clostridum josui）のタイプＩスキャホールディンタンパク質の全体若しくはその一部又はその改変体を利用することができる。
【００５１】
（第２の骨格タンパク質）
第１の骨格タンパク質が細胞の表層に備える他の一つの形態は、第１の骨格タンパク質が細胞の表層に結合した第２の骨格タンパク質と非共有結合により結合した結果、細胞の表層側に保持される形態である。第２の骨格タンパク質は、第１の骨格タンパク質を非共有結合で結合可能な第１の骨格タンパク質結合ドメインを有して細胞の表層側に配置されている。
【００５２】
第２の骨格タンパク質は、基本的に単鎖のポリペプチド鎖から構成されるタンパク質である。第１の骨格タンパク質結合ドメインとは、そのアミノ酸配列に基づき、非共有結合で第１の骨格タンパク質を結合できるドメインである。第２の骨格タンパク質に対して非共有結合で第１の骨格タンパク質を結合させることができるため、第１の骨格タンパク質を第２の骨格タンパク質に対して容易に結合させたり第２の骨格タンパク質から容易に分離・回収したりすることができる。
【００５３】
こうした第１の骨格タンパク質結合ドメインとしては、セルロソームのタイプIIスキャホールディンタンパク質（アンカータンパク質とも言われる。）のタイプIIコヘシンドメイン由来のドメインを用いることができる。タイプIIコヘシンドメインは、セルロソームにおいて、タイプIスキャホールディンタンパク質を非共有結合でタイプIIスキャホールディンタンパク質上に保持するためのドメインとして知られている（粟冠ら、蛋白質核酸酵素、Vol.44、No.10（1999）、p41-p50等）。タイプIIスキャホールディンタンパク質のタイプIIコヘシンドメインには、タイプIスキャホールディンタンパク質のタイプIIドックリンドメインが結合することが知られている。
【００５４】
こうしたタイプIIドックリンドメインとしては、各種セルロソーム生産微生物において多数その配列が決定されている。これらの各種のタイプIIコヘシンのアミノ酸配列及びＤＮＡ配列は、NCBIのHP（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）等を介してアクセス可能な各種のタンパク質データベースやDNA配列のデータベースにより容易に取得することができる。
【００５５】
第１の骨格タンパク質結合ドメインとしては、例えば、クロストリジウム・サーモセラムのタイプIIコヘシンであるSdbA,Orf2,OlpBのタイプIIコヘシンドメインを用いることができる。また、アシドサーモス・セルロリティカスのScaD,ScaBのタイプIIコヘシンドメイン、バクテロイデス・セルロソルベンスのScaAのタイプIIコヘシンドメイン等が挙げられる。
【００５６】
第２の骨格タンパク質は、第１の骨格タンパク質結合ドメインを１個のみ有していてもよいが、複数個タンデムに備えていてもよい。複数個備えることで、外来タンパク質をより高密度に酵母表層上に保持しやすくなる。
【００５７】
複数個の第１の骨格タンパク質結合ドメインは、１種類のアミノ酸配列からなる同一種類のドメインであってもよいし、２種類以上の異なるアミノ酸配列からなるドメインであってもよい。異なる種類の骨格タンパク質結合ドメインを用いることで、異なる第１の骨格タンパク質を第２の骨格タンパク質上に配列させることができる。
【００５８】
第２の骨格タンパク質は細胞の表層側に結合される必要がある。第２の骨格タンパク質は、細胞の表層と共有結合又は非共有結合により結合される。共有結合にて第２の骨格タンパク質を細胞の表層に結合している場合には、洗浄等によっても第２の結合タンパク質が細胞から分離されないで保持されるというメリットがあり、非共有結合による場合には、逆に洗浄等により細胞から第２の骨格タンパク質及び第１の骨格タンパク質を分離できるというメリットがある。いずれにしても、第２の骨格タンパク質は、酵母表層と結合するための酵母表層結合ドメインを有している。
【００５９】
第２の骨格タンパク質を酵母表層側に結合させるシステムとしては、公知の各種の酵母表層提示システムを用いることができる。第２の骨格タンパク質は、直接細胞表層に結合するためにこれらの各種システムにおいて必要とされる細胞表層結合ドメインを有することができる。酵母表層提示システムとしては、例えば、表層タンパク質であるα−アグルチニン又はそのレセプターを利用することができる。アグルチニンを利用したタンパク質の細胞表層提示システムは、例えば、インビトロジェン社からpYD1ベクター及びEBY100サッカロマイセス・セレビジエを含む酵母用ディスプレイキットとして入手することができる。また、細胞表層提示システムとしては、このほか、SAG1、FLO1〜FLO11などの細胞表層タンパク質を用いるシステム等を用いることができる。
【００６０】
このような第２の骨格タンパク質としては、上記した第１の骨格タンパク質結合ドメインと酵母細胞表層結合ドメインとを人工的に組み合わせた融合タンパク質として構築してもよいし、セルロソーム生産微生物のタイプII骨格タンパク質由来としてもよい。すなわち、当該骨格タンパク質の一部又は全部あるいはこれらの改変体であってもよい。こうしたタイプII骨格タンパク質としては、クロストリジウム・サーモセラムのタイプII骨格タンパク質、クロストリジウム・ジョスィのタイプII骨格タンパク質又はその改変体を利用することができる。
【００６１】
（外来タンパク質保持用酵母の作製方法）
このような酵母は、第１の骨格タンパク質を第２の骨格タンパク質を介して細胞表層に結合させて外来タンパク質保持用酵母を作製するには、第２の骨格タンパク質を酵母において発現させて、細胞表層に結合させ、外部から第１の骨格タンパク質を供給して、第２の骨格タンパク質に第１の骨格タンパク質を結合保持させる形態が挙げられる。このような製造方法によれば、第１の骨格タンパク質を酵母に合成させなくてもよいため、酵母の増殖能やアルコール発酵能への影響を少なくすることができる。
【００６２】
当業者であれば、タイプIIのスキャホールディンタンパク質のアミノ酸配列、第１の骨格タンパク質結合ドメインのアミノ酸配列を取得し、公知の細胞表層提示システムを利用することで、酵母を遺伝子工学的に改変して第２の骨格タンパク質を細胞表層に結合した状態で発現させることができる。酵母を含む各種細胞に対するこうした遺伝子導入による外来タンパク質の発現のための各種操作は、例えば、Molecular Cloning A Laboratory Manual second edition（Maniatis et al.,Cold Spring Harbor Laboratory press.1989）等のプロトコールに従うことができる。
【００６３】
また、第１の骨格タンパク質を準備するには、タイプIのスキャホールディンタンパク質のアミノ酸配列、外来タンパク質結合ドメイン、第３のドメイン及びセルロース結合ドメイン等のアミノ酸配列を取得し、大腸菌を利用したタンパク質発現システムや無細胞合成系等を利用することができる。第１の骨格タンパク質を利用することで、酵母を遺伝子工学的に改変して第２の骨格タンパク質を細胞表層に結合した状態で発現させることができる。大腸菌等を用いた外来タンパク質の発現のための各種操作については、上記プロトコール等に従うことができる。
【００６４】
外来タンパク質保持用酵母の作製方法の他の形態としては、第１の骨格タンパク質及び第２の骨格タンパク質をそれぞれ酵母において遺伝子組換え等により発現させ、第２の骨格タンパク質を細胞表層に結合させ、細胞外に分泌させた第１の骨格タンパク質を第２の骨格タンパク質に結合保持させてもよい。本発明者らによれば、第１の骨格タンパク質をシグナルペプチド等を付与して分泌発現させるとともに、第２の骨格タンパク質を細胞表層提示システムを用いて酵母細胞表層に提示させるように改変した酵母を取得し、培養することで、第１の骨格タンパク質を細胞表層に保持する酵母を得られることがわかっている。
【００６５】
このほか、第１の骨格タンパク質を酵母で分泌発現させるとともに、第２の骨格タンパク質を酵母外で準備し外部から供給するようにしてもよい。この場合、第２の骨格タンパク質は、前述のアグルチニン等の細胞表層提示システムに基づく細胞表層結合ドメインを備えるようにするのが好ましい。さらに、他の形態として、第１の骨格タンパク質及び第２の骨格タンパク質を、いずれも酵母外で準備して、酵母に供給するようにしてもよい。この場合、第２の骨格タンパク質は、アグルチニン等の細胞表層提示システムに基づく細胞表層結合ドメインを備えるようにすることが好ましい。
【００６６】
本発明の外来タンパク質保持用酵母の製造方法によれば、容易に細胞表層で外来タンパク質を保持し、当該外来タンパク質に基づく高い活性を発揮する酵母を得ることができる。また、特別な処理なく、第２の骨格タンパク質に対して第１の骨格タンパク質を結合保持させることができるため、容易に酵母の細胞表層に二次元骨格を付与することができる。
【００６７】
（外来タンパク質を細胞表層に保持した酵母）
本発明の外来タンパク質を細胞表層に保持した酵母（以下、外来タンパク質表層保持酵母）は、その細胞表層に外来タンパク質を保持することができ、当該外来タンパク質の高い活性を発現することができる。
【００６８】
外来タンパク質表層保持酵母が保持する外来タンパク質は、既に説明したように各種の態様とすることができる。例えば、酵母が直接利用できないかあるいは利用が困難なタンパク質、リグニン、デンプン、セルロース等などの高分子を分解する酵素とすることが好ましい。より好ましくは、酵母が直接利用できないが有用な未利用炭素源であるセルロースを分解するセルラーゼが挙げられる。
【００６９】
セルロースは複数の酵素が協同的及び段階的に作用することで初めて効率的に分解される。特に不溶性セルロース及び結晶性セルロースにおいてその傾向がある。本発明の外来タンパク質表層保持酵母は、複数種類のセルラーゼを近接して備えることができるため、セルロースを効率的に分解することができる。特に、本発明酵母は、タイプIコヘシン由来の外来タンパク質結合ドメインを有しているため、セルラーゼの結合に有利である。また、第１の骨格タンパク質がセルロース結合ドメインを備えている場合には、さらに有利である。
【００７０】
セルラーゼは、Ｄ−グルコースがβ−１，４結合で結合したセルロースを加水分解してＤ−グルコースまで分解する過程において作用する酵素からなる酵素群から選択されるものであればよく、その由来も特に限定されない。したがって、セルラーゼとしては、例えば、国際生化学・分子生物学連合酵素委員会においてＥＣ３．２．１．Ｘの番号が与えられるセルロース分解酵素が挙げられる。この番号が与えられる酵素としては、エンドグルカナーゼ（１，４−β−Ｄ−グルカングルカノヒドラーゼ、ＥＣ３．２．１．４）、β−グルコシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２１）、１，４−β−グルコシダーゼ（ＥＣ３．２．１．７４）及びエキソセロビオヒドロラーゼ（セルロース１，４−β−セロビオシダーゼ、ＥＣ３．２．１．９１）が挙げられる。本発明において用いるセルラーゼは、こうしたセルラーゼから選択される１種のみであってもよいし２種以上が組み合わされていてもよい。なお、セルラーゼとしては、これらの作用以外であっても上記分解過程に寄与する酵素も含めることができる。
【００７１】
本複合材料は、２種類以上のセルラーゼを備えていることが好ましい。より好ましくは、エンドグルカナーゼ及びエキソセロビオヒドロラーゼから選択される１種類又は２種類を含むことが好ましい。これらの酵素を備えることにより結晶性又は不溶性セルロースを分解することができる。これらの酵素を備えることにより一層効果的に結晶性又は不溶性セルロースを分解することができる。これらのセルラーゼは、セルロースに対して相乗的に作用し効果的に分解できると考えられるからである。さらに、これらのセルラーゼによるセルロースの分解産物である新たな低分子セルロースやセロビオースに作用するβ−グルコシダーゼや１，４−β−グルコシダーゼのいずれか又は双方を備えることが好ましい。一層好ましくは、β-グルコシダーゼ、エンドグルカナーゼ及びエキソセロビオヒドロラーゼを備える。
【００７２】
セルラーゼの由来は特に限定されないが、セルラーゼは表１に示すようなセルロソーム生産微生物のセルロソームを構成するセルラーゼや以下の表２に示すセルロース分解性微生物の生産するセルラーゼ及びこれらの改変体を使用できる。改変体とは、天然のセルラーゼ又はセルロソームから取得されるセルラーゼの塩基配列及び／又はアミノ酸配列において少なくとも部分的に改変したものをいう。なお、改変には、アミノ酸の挿入、置換、欠失及び付加のいずれかあるいは２種類以上のほか、アミノ酸配列に影響しない改変も含む。
【００７３】
セルラーゼは、以下の表に示すような各種の天然のセルラーゼ生産微生物又はセルラーゼ又はその改変体若しくはその一部を形成するように人工的に改変した微生物から取得できる。こうした改変微生物は、以下の表に由来する微生物を親株又は宿主とするものであってもよいし、酵母等の工業的利用に適した微生物を親株又は宿主とするものであってもよい。セルラーゼはこれら微生物の菌体外に分泌されるのが通常であり、これらの微生物の培養液からセルラーゼ活性画分を回収することでセルラーゼを容易に取得できる。さらに、タンパク質の無細胞合成系によって取得することもできる。
【表２】
【００７４】
本発明の酵母がセルラーゼを結合保持するものであるとき、セルラーゼ以外の酵素を結合保持していてもよい。例えば、キシラナーゼ、ヘミセルラーゼ等のリグノセルロース系材料中のヘミセルロースを分解する酵素を備えることで、リグノセルロース系材料中のヘミセルロースを分解できるようになる。例えば、クロストリジウム・サーモセラムのセルロソームは、キシラナーゼ、リケナーゼ及びマンナナーゼ等の活性も見出されている。また、リグニンを分解するリグニンペルオキシダーゼやマンガンペルオキシダーゼを備えていてもよい。リグニン分解酵素を備えている場合、セルロース系材料の分解のみならずリグノセルロース系材料の分解に本複合材料を用いることができる。なお、リグニン分解酵素を結合保持してリグニンを分解する複合材料を併用することでリグノセルロース系材料を分解することもできるし、別途リグニン分解酵素単体を併用してリグノセルロース系材料を分解することもできる。
【００７５】
外来タンパク質としてセルラーゼを保持する酵母は、セルラーゼによるセルロースの分解産物であるグルコース等を酵母自体が備える能力に基づき資化して有用物質を生産することができる。酵母は、アルコール発酵によりアルコールを産生することができる。また、公知の乳酸などの有機酸生産酵母は乳酸などを製造でき、その他有用物質生産能力を変異によりあるいは遺伝子工学的に取得した酵母は、当該有用物質を生産できる。セルラーゼを保持する本発明の酵母は、セルロースの分解産物を炭素源としてこうした有用物質を生産することができる。
【００７６】
なお、酵母としては、既に説明したほか、遺伝子組換えにより酸や塩に対して耐性が強化された酵母が挙げられる。こうした酵母の一例として、特開２００４−３４４０８４に記載されるＭＦ−１２１株が挙げられる。なお、これらの公報に記載の内容の全ては引用により本明細書の一部に組み込まれる。
【００７７】
有機酸を生産する酵母としては、酵母などの微生物を宿主として遺伝子改変により乳酸などの有機酸を生産可能とした公知の形質転換体を用いることができる。こうした乳酸生産酵母などの形質転換酵母は、例えば、特開２００３−３３４０９２、特開２００４−１８７６４３、特開２００５−１３７３０６、特開２００６−６２７１、特開２００６−２０６０２、特開２００６−４２７１９、特開２００６−７５１３３、特開２００６−２９６３７７等に開示されており、本発明においてはこれらの形質転換酵母を用いることができる。これらの公報に記載の内容の全ては引用により本明細書の一部に組み込まれる。
【００７８】
なお、分解対象であるセルロースは、いかなる形態であってもよい。通常、セルロースは、セルロース系のバイオマス材料(以下、セルロース系材料)に含まれている。セルロース系材料としては、セルロースを含有していればよく、どのような由来や形態であってもよい。したがって、セルロース系材料としては、例えば、リグノセルロース系材料、結晶性セルロース材料、不溶性セルロース材料などの各種セルロース系材料等が含まれる。リグノセルロース系材料としては、例えば、木本植物の木質部や葉部及び草本植物の葉、茎、根等においてリグニン等を複合した状態のリグノセルロース系材料が挙げられる。こうしたリグノセルロース系材料としては、例えば、稲ワラ、麦ワラ、トウモロコシの茎葉、バガス等の農業廃棄物、収集された木、枝、枯葉等又はこれらを解繊して得られるチップ、おがくず、チップなどの製材工場廃材、間伐材や被害木などの林地残材、建設廃材等の廃棄物であってもよい。結晶性セルロース系材料及び不溶性セルロース系材料としては、リグノセルロース系材料からリグニン等を分離後の結晶性セルロース及び不溶性セルロースを含む結晶性又は不溶性セルロース系材料が挙げられる。セルロース材料としては、また、使用済み紙製容器、古紙、使用済みの衣服などの使用済み繊維製品、パルプ廃液を由来としてもよい。さらに、アセトバクター・キシリナム（Acetobacter xylinum）等のセルロース生産微生物が生産するセルロースを由来としてもよい。
【００７９】
さらに、セルロース系材料は、本複合材料による分解に先だってセルラーゼによる分解を容易化するために適当な前処理等がなされていてもよい。例えば、セルロースが非晶質化されたものであってもよい。セルロースの非晶質化は同時に低分子化を伴うことが多い。
例えば、硫酸、塩酸、リン酸、硝酸などの無機酸による酸性条件下等で、セルロースを部分加水分解することにより、セルロースを非晶質化あるいは低分子化できる。この他、超臨界水、アルカリ、加圧熱水などの処理によってもセルロースの非晶質化又は低分子化を行うことができる。
【００８０】
なお、セルラーゼを保持する本発明の酵母によって得られる分解産物は、分解するセルロース系材料、結合保持するセルラーゼの種類等によって相違する。したがって、必ずしもＤ−グルコースを最終産物とするものではなく、セロビオースやオリゴ糖を主体とする分解産物組成を有していてもよい。
【００８１】
以上説明したように、本発明の外来タンパク質保持用酵母は、外来タンパク質の作用を高度に発揮できる酵母であるため、外来タンパク質の作用と酵母本来との作用との相乗効果が期待することができる。しかも、複数種類及び／又は高密度に外来タンパク質を保持できる人工骨格を細胞表層に形成できるため、複数の外来タンパク質による相乗効果を発揮させることができる。
【００８２】
（外来タンパク質表層保持酵母の作製方法）
本発明の外来タンパク質表層保持酵母の作製方法は、本発明の外来タンパク質保持用酵母に、第１の骨格タンパク質上の外来タンパク質結合ドメインに結合可能な相互作用ドメインを有する１種又は２種以上のタンパク質を前記酵母内から分泌させて又は酵母外部から供給する工程を備えている。これにより、外来タンパク質結合ドメインに１種又は２種以上の外来タンパク質を結合させて、外来タンパク質表層保持酵母を得ることができる。
【００８３】
外来タンパク質を酵母で分泌発現させる場合には、適当なシグナルペプチドと外来タンパク質との融合タンパク質をコードするＤＮＡを用いて酵母を形質転換させるなどすればよい。
【００８４】
外来タンパク質は、酵母外部から酵母に対して供給してもよい。外来タンパク質が外来タンパク質保持用酵母の第１の骨格タンパク質の外来タンパク質結合ドメインと相互作用可能なドメイン（タイプＩドックリンドメインなど）を有している場合には、当該外来タンパク質をそのまま酵母に対して供給することができる。外来タンパク質が、そのようなドメインを備えていない場合には、遺伝子工学的にそのようなドメインを融合した融合タンパク質を準備する。当業者であれば、既に記載したプロトコール集に基づきこのような融合タンパク質を適宜準備することができる。細胞外から外来タンパク質を供給して保持させることで、酵母における骨格タンパク質の産生能を低下させたり増殖能を低下させたりすることがなく、保持させようとする外来タンパク質を所望の量だけ供給することができる。
【００８５】
本発明の外来タンパク質保持用酵母に酵母外から外来タンパク質を供給して細胞表層に結合保持させるには、本保持用酵母と外来タンパク質とを適当な水性媒体下に接触させればよい。本保持用酵母を含む水性媒体に対して外来タンパク質を供給してもよいし、タンパク質を含有する水性媒体中に本保持用酵母を供給してもよい。
【００８６】
供給工程で用いる水性媒体は、本保持用酵母と外来タンパク質との生理活性が維持される限りに特に限定されない。これらの生理活性が維持される条件は、タンパク質と酵母とについてその生理活性が吸着工程後も維持される条件である。例えば、これらについて適切なｐＨ、浸透圧及び温度が確保されていればよい。ｐＨは、タンパク質及び細胞によっても異なるが、通常は、ｐＨ６以上９以下の範囲である。また、浸透圧も微生物などの細胞に対しておおよそ等張性であることが好ましい。なお、浸透圧は緩衝液や等張化剤のほか適当な塩類を使用して調節することができる。また、温度は、タンパク質の変性等を考慮すると１℃以上１０℃以下であることが好ましく、より好ましくは２℃以上５℃以下である。こうした水性媒体としては、塩類溶液等とすることができる。例えば、２０ｍＭ〜５０ｍＭ程度のトリス塩酸バッファーとしてもよい。また、０ｍＭ超２０ｍＭ以下、より好ましくは５ｍＭ以上１５ｍＭ以下のＣａＣｌ２溶液などのカルシウムイオンが存在する水性媒体としてもよい。さらに好ましくは、約１０ｍＭのカルシウムイオンが存在する水性媒体とする。こうしたカルシウムイオン含有水性媒体は、典型的にはＣａＣｌ2水溶液が挙げられる。こうしたイオン環境において本保持用酵母への外来タンパク質の結合保持傾向が強くなる傾向がある。
【００８７】
水性媒体の攪拌にあたっては、その強度を適宜調節すればよい。適切な攪拌強度等の攪拌条件は、所望の外来タンパク質と本保持用酵母とを適切な水性媒体下で各種の攪拌条件で攪拌して、その結果得られた細胞画分のタンパク質量や酵素活性等を測定することで決定することができる。なお、接触回数を増加させるには、供給するタンパク質濃度を増加させるのも有効である。
【００８８】
本複合材料を製造するにあたっては、複数種類のタンパク質を本人工骨格材料に同時に供給してもよいし、順次供給してもよい。結合保持させようとするタンパク質が有する相互作用ドメインによって結合すべきタンパク質結合ドメインを予め決めておくことができるため、結合させようとするタンパク質結合ドメインが互いに相違している場合には同時供給することができる。一方、例えば、結合させるべきタンパク質結合ドメインが共有の場合、同時に複数種類のタンパク質を供給すると、タンパク質の結合量を制御することが困難な場合がある。したがって、このような場合において、タンパク質の結合量を調整したい場合には、異なるタンパク質を順次供給するようにする。
【００８９】
こうした供給工程によって、外来タンパク質を第１の骨格タンパク質の外来タンパク質結合ドメインに結合保持させるには、上記水性媒体を攪拌することが好ましい。攪拌により、両者の接触確率が向上するからである。
【００９０】
（回収工程）
外来タンパク質が細胞表層に結合された酵母を回収するには、水性媒体を公知の固液分離手段により固液分離して菌体画分を回収すればよい。例えば、遠心分離によりペレットとしてセルラーゼ等が保持された微生物を回収することができる。
【００９１】
本発明の外来タンパク質表層保持酵母の作製方法は、以上のとおりの形態で実施することができる。このため、上記したとおり、新たなセルラーゼを備える固相担体を提供するとともに、微生物のセルロース分解能を容易に調節することができる。
【００９２】
なお、本発明の外来タンパク質表層保持酵母の作製方法に関し、既に説明した、外来タンパク質保持用酵母、外来タンパク質表層保持酵母、外来タンパク質について既に説明した各種の態様を、適用することができる。
【００９３】
（セルロースの分解方法）
本発明のセルロースの分解方法は、セルロース系材料のセルロースと、セルラーゼを外来タンパク質として表層保持する本発明の外来タンパク質表層保持酵母と、を接触させて、前記セルラーゼにより前記セルロースを分解する工程、を備えることができる。この分解方法によれば、セルラーゼの高い活性を発揮できる酵母が効率的にセルロースを分解できる。さらに、セルロースの分解産物を酵母が利用して増殖や発酵が可能である。
【００９４】
セルロース系材料とセルラーゼを保持する酵母とを接触させる方法は、特に限定しない。酵母及びセルラーゼの活性が維持できる状態であればよい。したがって、酵母の増殖又は発酵条件及びセルラーゼの至適ｐＨ、至適温度等を考慮して適宜決定される。また、分解対象であるセルロース系材料の形態は特に限定しないが、分解しようとするセルロース系材料の形態に応じて、酵母が保持するセルラーゼ及びその組み合わせが適宜選択される。なお、本発明の分解方法に関し、既に説明した、外来タンパク質保持用酵母、外来タンパク質表層保持酵母、セルロース系材料及びセルラーゼについて既に説明した各種の態様を、適用することができる。
【００９５】
（セルロースを利用する有用物質の生産方法）
本発明のセルロースを利用する有用物質を生産方法は、セルロース系材料中のセルロースとセルラーゼを保持する本発明の外来タンパク質表層保持酵母とを接触させて、前記セルロースを分解する工程と、前記セルラーゼによって分解されたセルロース分解産物を前記酵母によって資化し有用物質に変換する工程と、を備えることができる。
【００９６】
この生産方法によれば、セルロース系材料中のセルロースを酵母の表層に結合保持されたセルラーゼが分解するとともに、その分解産物をその酵母が資化して有用物質に変換することができる。このため、効率的にセルロースを利用することができる。特に、従来セルロースを直接利用困難であった酵母が、セルロースを利用して有用物質に変換することができるようになる。なお、本発明の生産方法に関し、既に説明した、外来タンパク質保持用酵母、外来タンパク質表層保持酵母、セルロース系材料及びセルラーゼ並びにセルロースの分解について既に説明した各種の態様を、適用することができる。
【００９７】
本発明の生産方法においては、前記細胞として、エタノール生産微生物とすることが好ましい。エタノール生産微生物であれば、セルロース系材料から燃料としても有用であるエタノールを直接生産することができる。また、前記細胞として乳酸などの有機酸生産微生物としてもよい。
【００９８】
なお、分解工程〜変換工程は、利用するセルロース系材料及び細胞や変換する有用物質の種類に応じて実施すればよい。すなわち、当該有用物質を生産する微生物等の細胞及び当該有用物質に応じて実施すればよい。例えば、エタノール等の有用物質への変換等のための発酵工程は、以下のようにして実施できる。培地としては、炭素源として上記セルロース系材料のほか、炭素源の一部としてセルロース又はセルロースから分解酵素により生成されるオリゴ糖類又は単糖類を添加することができる。こうすることで、特に培養開始時から培養初期において微生物に効果的に資化可能な単糖類を供給できる。なお、糖類は、分解酵素を抑制しない程度に添加され、好ましくは培養開始時から培養初期（培養開始から２〜１０時間以内程度）まで一定期間にのみ糖類を添加するようにする。窒素源及び無機塩類としては、公知のものを適宜選択して利用することができる。
【００９９】
なお、培養は、静置培養、振とう培養または通気攪拌培養等を用いることができる。通気条件は、嫌気条件下、微好気条件下及び好気条件等、適宜選択することができる。培養温度も、特に限定しないが、２５℃〜５５℃等の範囲とすることができる。また、培養時間も必要に応じて設定されるが、６〜１５０時間程度とすることができる。また、ｐＨの調整は、無機あるいは有機酸、アルカリ溶液等を用いて行うことができる。培養中は、必要に応じてアンピシリン、テトラサイクリンなどの抗生物質を培地に添加することができる。なお、変換工程終了後、培養液から微生物を除去してエタノール等の有用物質含有画分を回収する工程、さらにこれを濃縮する工程を実施してもよい。
【０１００】
有用物質としては特に限定しないが、グルコースを利用して微生物が生成可能なものが好ましい。例えば、エタノールなどの低級アルコール、イソプレノド合成経路の追加によるファインケミカル（コエンザイムＱ１０、ビタミン及びその原料等）、解糖系の改変によるグリセリン、プラスチック・化成品原料など、バイオリファイナリー技術が対象とする材料が挙げられる。なお、グルコースを利用する微生物としては、特に限定しないが、例えば、グルコースからの代謝系の１種又は２種以上の酵素を遺伝子組換えにより置換、追加等して本来の代謝物でない化合物を産生可能に改変したものであってもよい。
【０１０１】
以下、本発明を、実施例を挙げて具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲内において、種々なる形態で実施することができる。
【実施例１】
【０１０２】
（タイプIIコヘシンを含む第２の骨格タンパク質発現用ベクターの構築及び当該ベクターによる形質転換）
本実施例では、図２に示すベクター構成図に基づいて、タイプIIコヘシンを含む第２の骨格タンパク質を細胞表層提示させるための染色体導入型ベクターを構築し、酵母を形質転換した。なお、Ｎ末端側にはＨｉｓタグを備えた第２のタンパク質が発現されるようになっている。
【０１０３】
C.thermocellum由来のSdb遺伝子の塩基配列に基づいて、ＰＣＲ法によりTypeIIコヘシン領域1個を含むＤＮＡ断片（配列番号２２）を増幅断片として取得した。また、同様にＰＣＲ法により、Orf2遺伝子の塩基配列に基づいてTypeIIコヘシン領域2個を含むＤＮＡ断片（配列番号２３）を、それぞれ増幅断片として取得した。それぞれの増幅断片を、制限酵素BglII-XhoI部位を用いて表層提示を行うためのSAG1、Rhizopus Oryzae由来グルコアミラーゼのシグナルペプチドと融合化し、HOR7プロモーター、SAG１ターミネーターを持つプラスミドに導入しpDL-HOR7p-T2Coh, pDL-HOR7p-T2Coh2とした。これらのプラスミドからそれぞれ取得される、ＨＯＲ７プロモーター以下ＳＡＧ１ターミネーターまでの断片（Ｓｄｂ由来及びＯｒｆ２由来）を、相同組み換え領域Leu2U,Leu2D、マーカーとしてTrpを持つプラスミドに導入した。Ｓｄｂ由来断片を保持するプラスミドを、Sse8387Iで切断して断片化した後、サッカロマイセス・セレビジエＢＪ５４６５株に常法により導入して形質転換体ＢＪ０１０株を得た。また、Ｏｒｆ２由来断片を保持するプラスミドを、Sse8387Iで切断して断片化した後、サッカロマイセス・セレビジエＥＢＹ１００株に常法により導入して形質転換体ＥＢＹ０２０株を得た。
【実施例２】
【０１０４】
（形質転換体における第２の骨格タンパク質発現）
本実施例では、第２の骨格タンパク質を発現するためのベクターを構築するとともに実施例１で取得した形質転換体をＹＮＢ＋０．５％カザミノ酸＋２％グルコース培地を用いて３０℃で培養し、ＯＤ６００＝２を超えたところで集菌後、ＯＤ６００＝０．５となるようにＹＮＢ＋０．５％カザミノ酸＋２％ガラクトース培地に植菌し、３０℃、４８時間誘導発現を行った。その後、ＯＤ６００＝１の１ｍｌの菌体を、ＰＢＳ１ｍｌで洗浄し、１２５μｌのＰＢＳに懸濁した。この懸濁液に、一次抗体として抗Ｈｉｓ−ｔａｇ抗体０．５μｇとＢＳＡ最終濃度１ｍｇ／ｍｌとを添加し、氷中３０分静置し、時々懸濁を行った。次に遠心後、ＰＢＳ１ｍｌで洗浄を行い１２５μｌのＰＢＳに懸濁し、二次抗体としてＣｙ５標識の抗ＩｇＧ抗体０．５μｇとＢＳＡ最終濃度１ｍｇ／ｍｌとを添加し、氷中３０分静置し、時々懸濁を行った。その後、遠心し、ＰＢＳ１ｍｌで洗浄して５０μｌのＰＢＳで懸濁後、蛍光顕微鏡にてＣｙ５の蛍光を測定した。その結果を図３に示す。
【０１０５】
図３に示すように、いずれの形質転換体にも、蛍光が認められた。このことから、各遺伝子断片がコードする第２の骨格タンパク質はそれぞれ形質転換体において細胞表層で発現していることを確認できた。
【実施例３】
【０１０６】
（第１の骨格タンパク質発現ベクターの構築）
（ＣＢＤとコヘシン４個の発現ベクター（ｐＹＤ−４Ｃｏｈベクター）の構築）
まず、ガラクトース誘導下に第１の骨格タンパク質を発現するｐＹＤ５ベクター（図４）を構築した。Ｃｔ ＡＴＣＣ２７４０５からゲノムを抽出した。タイプＩスキャホールディンタンパク質であるＣｉｐＡタンパク質をコードするＣｉｐＡ遺伝子（ＮＣＢＩのホームページ、アクセッション番号：Ｌ０８６６５）（図５参照）の塩基配列に基づき、ＣＢＤ（セルロース結合ドメイン）＋タイプＩコヘシン４個を含む断片（配列番号２４）を化学合成した。このＤＮＡ断片を、ｐＹＤ１のＫｐｎＩ−ＸｈｏＩ部位に導入した。これを鋳型として、ＮｈｅＩ、Ｘｈｏ１を両端に保持するように以下のプライマー（配列番号２５、２６）で増幅し、ｐＹＤ５ベクターの同部位に導入しｐＹＤ−４Ｃｏｈベクターを得た（図４参照）。
Coh4-Nhe:acgtagctagcgttttagcagctggtgcaaatacaccggtatcaggcaatttgaaggttg（配列番号２５）
Coh4-Xho:cttaccttcgaagggccctctagactcg（配列番号２６）
【０１０７】
（ＣＢＤ＋コヘシン４個＋リンカー部＋タイプIIドックリン）の発現ベクター（ｐＹＤ５−ＬＤｏｃIベクター）の構築
次に、Ｃｔ ＡＴＣＣ２７４０５のＣｉｐＡ遺伝子のＣＢＤからＣ末端までの領域（タイプIIドックリンを含む）を以下のプライマーでゲノムからＰＣＲ法で増幅断片として取得し、ＴＯＰＯ ＢｕｎｔＩＩベクター（Invitorogen）にクローニングし、ＴＯＰＯ−ＣｉｐＡベクターを得た。
CBD-AGA:acgtaggtaccagcaaatacaccggtatcaggcaatttgaaggttgaattct（配列番号２７）
CT-cipA-R:acgtactcgagctgtgcgtcgtaatcacttgatgtagctcc（配列番号２８）
【０１０８】
ｐＹＤ−４Ｃｏｈを鋳型として、以下のプライマー(配列番号２９、３０)を用いてＰＣＲ法によりリンカー部（Ｇ４Ｓ３）を含むＤＮＡ断片を得た。また、ＴＯＰＯ−ＣｉｐＡを鋳型として、以下のプライマー（配列番号３１、３２）を用いてＰＣＲ法により、増幅断片としてタイプIIドックリン領域を含むＤＮＡ断片を得た。これらの各増幅断片を、それぞれ配列番号２９及び配列番号３２のプライマーで増幅して、リンカー部とタイプIIドックリンとを含むＤＮＡ断片を増幅断片として得た。この増幅断片をＸｈｏＩ及びＰｍｅＩで処理して得られたＤＮＡ断片を、ｐＹＤ−４Ｃｏｈを同一制限酵素で処理して得られたＸｈｏＩ−ＰｍｅＩ部位に導入して、ｐＹＤ５−ＬＤｏｃIIベクターを得た（図６参照）。
pYD5-D2-1:tttgacggtggagtaaatgttggagatctc（配列番号２９）
pYD5-D2-2:
tagaattgtctttcactatgtctccagaaccaccaccaccagatccaccaccaccagaaccaccaccacccgtagaatcgag
（配列番号３０）
pYD5-D2-3: ggagacatagtgaaagacaattcta（配列番号３１）
pYD5-D2-4: gggacgtagggtttaaacttactgtgcgtcgtaatcacttgat（配列番号３２）
【０１０９】
（ＣＢＤ＋コヘシン４個＋Ｘドメイン＋タイプIIドックリン）の発現ベクター（ｐＹＤ５−ＸＤｏｃIベクター）の構築
ＴＯＰＯ−ＣｉｐＡベクターを鋳型として、配列番号３２のプライマー及び以下のプライマー（配列番号３３）を用いて、ＰＣＲ法により増幅断片として、ＸドメインとタイプIIドックリンを含むＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片をＸｈｏＩ及びＰｍｅＩで処理して得られた断片を、ｐＹＤ−４Ｃｏｈを同一制限酵素で処理して得られたＸｈｏＩ−ＰｍｅＩ部位に導入して、ｐＹＤ５−ＸＤｏｃIIベクターとした（図７参照）。
XDoc-Xho:acgtactcgagcctgtaatagaaggatataaagtatccgga(配列番号３３)
【実施例４】
【０１１０】
（第１の骨格タンパク質及び第２の骨格タンパク質を発現する酵母の作製及びセルロースの分解）
実施例３で作製した第１の骨格タンパク質発現ベクターを実施例１で作製した２種類の第２の骨格タンパク質提示酵母に導入して、Ｘドメインを含む第２の骨格タンパク質を発現する酵母（Ｓｄｂ＋ＸＤＯＣII、Ｏｒｆ２＋XＤｏｃII）と、Ｘドメインを含まない第２の骨格タンパク質を発現する酵母（Ｓｄｂ＋ＬＤＯＣII、Ｏｒｆ２＋ＬＤｏｃII）とを作製した。ＹＮＢ＋０．５％カザミノ酸＋２％ガラクトース培地に植菌し、３０℃、４８時間培養して誘導発現を行った。
【０１１１】
第１の骨格タンパク質及び第２の骨格タンパク質が発現された酵母に対し、無細胞系で合成したＣｔ由来のエンドグルカナーゼであるＣｅｌＡを添加することにより取得した酵母のセルラーゼ活性を測定した。セルラーゼ活性は次のようにして測定した。
【０１１２】
エンドグルカナーゼＣｅｌＡを供給して骨格タンパク質の機能を確認した。ＣＢＤ＋タイプＩコヘシン１個提示酵母ＯＤ６００＝５，１ｍｌを用いて２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０，１０ｍＭ ＣａＣｌ２で洗浄後、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０，０．１５Ｍ ＮａＣｌ，１０ｍＭ ＣａＣｌ2，１０ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ溶液で４℃，１ｈｒブロッキング操作を行い、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０，０．１Ｍ ＮａＣｌ，１０ｍＭＣａＣｌ２，０．０５％ｔｗｅｅｎ２０ 溶液で３回洗浄後、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０，０．１５Ｍ ＮａＣｌ，１０ｍＭ ＣａＣｌ２，１０ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ溶液中でＣｅｌＡ無細胞合成液５０μｌと混合、４℃，１時間反応を行った。次に２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０，０．１Ｍ ＮａＣｌ，１０ｍＭＣａＣｌ２，０．０５％ｔｗｅｅｎ２０溶液で４回洗浄を行い、ＣｅｌＡが結合した酵母を１％ＣＭＣ，２０ｍＭ 酢酸緩衝液ｐＨ６．０，１０ｍＭ ＣａＣｌ２溶液に混合し、６０℃で反応を行った。この反応液につき、ＴＺ−アッセイ法にてＣＭＣ分解活性を測定した。これらの結果を図８に示す。
【０１１３】
図８に示すように、コヘシンとＸドメインとタイプIIドックリンを含む第１の骨格タンパク質を発現する酵母（Ｓｄｂ＋ＸＤｏｃII及びＯｒｆ２＋ＸＤｏｃII）は、そうでない酵母に対して優れたＣＭＣ分解活性を呈した。また、第２の骨格タンパク質が備えるタイプIIコヘシン数を１個から２個に増加することでもＣＭＣ活性が向上したが、Ｘドメインを含むことにより増大したＣＭＣ活性より少ない上昇量であった。
【０１１４】
以上のことから、第１の骨格タンパク質及び第２の骨格タンパク質を酵母表層に発現させて足場を形成して、外来タンパク質を酵母表層に保持することにより、表層において外来タンパク質の高い活性を発揮する酵母を提供できることがわかった。
【配列表フリーテキスト】
【０１１５】
配列番号２５〜３３：プライマー
【図面の簡単な説明】
【０１１６】
【図１】本発明の酵母の一例の概要を示す図である。
【図２】第２の骨格タンパク質の表層提示用の染色体導入型ベクターを示す図である。
【図３】第２の骨格タンパク質の表層提示用の染色体導入型ベクターを用いて形質転換した酵母の蛍光染色結果を示す図である。
【図４】タンパク質結合ドメインを有する第１の骨格タンパク質を発現するベクターを示す図である。
【図５】ＣｉｐＡ遺伝子の構造を示す図である。
【図６】タンパク質結合ドメインとタイプIIドックリンドメインとを有する第１の骨格タンパク質を発現するベクターを示す図である。
【図７】タンパク質結合ドメインとタイプIIドックリンドメインとＸドメインとを有する第１の骨格タンパク質を発現するベクターを示す図である。
【図８】4種類の酵母によるグルコース分解活性を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、外来タンパク質を高い活性を発揮可能に酵母の細胞表層に保持するための技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に、複数の酵素の協同的又は段階的な反応により一連の反応を進行させるためには、関連する酵素が一定の順序で配列されていることが好ましいと考えられている。
【０００３】
例えば、セルロースなどの生体高次構造物を分解利用するには、複数の酵素の協同的でかつ段階的な反応が必要とされている。セルロースを分解するある種の微生物は、細胞表面にセルロースを分解するための多種類の酵素の複合体（セルロソーム）を備えている。セルロソームは、複数のセルロース分解酵素が結合するセルロース結合タンパク質を備えることで、難分解性の結晶セルロースを効率的に分解すると考えられている。
【０００４】
このことから、セルロソームの構造を模倣して、酵素を機能的に配列させて反応効率に優れた酵素系列を人工的に構築する試みもなされている。例えば、複数の酵素がクロストリジウム・ジョスィ（Clostridum josui）等の由来の複数の酵素結合用ドメインを有するセルロース結合タンパク質を利用するものがある（特許文献１、２）。
【０００５】
また、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）においてミニセルロソームを分泌させるものも開示されている（非特許文献１）。さらに、クロストリジウム・セルロヴォランス（Clostridium cellulovorans）由来のコヘシン（cohesin）とスタフィロコッカス・オーレウス（Staphylococcus aureus）由来のZZドメインとをリンカーで連結したタンパク質を酵母細胞表層に連結する試みもある（非特許文献２）。
【０００６】
【特許文献１】特開２０００−１５７２８２号公報
【特許文献２】特開２００４−２３６５０４号公報
【非特許文献１】S. Perret et al., J. Bacterol., 186(1), 253-257(2004)
【非特許文献２】伊藤ら、C106、第71回化学工学会予稿集（2006）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、上記した文献の方法は、酵母の細胞表層において保持したエンドグルカナーゼなどのセルラーゼの良好な活性を実現するものではなかった。理由としては、線状の足場タンパク質の保持量が少ない、足場タンパク質への酵素の結合量が少ない、結合した状態での酵素活性が低い等、種々想定されるものの明らかではなかった。セルロース系バイオマスを循環利用可能な資源として活用するには、酵母の細胞表層に保持したセルラーゼによるセルロースの効率的な分解が必須であった。
【０００８】
以上説明したように、現状において、酵母の細胞表層においてセルラーゼを発現させる場合において、より効率的なセルラーゼ活性、すなわち、より高いセルロースの分解活性を得るための技術が求められている。
【０００９】
そこで、本発明は、酵母細胞表層において、外来タンパク質を活性発現に好ましい形態で保持する技術を提供することを一つの目的とする。より具体的には、外来タンパク質を活性発現に好ましい形態で細胞表層に備える酵母を、当該酵母を得るための発現ベクター及びセット、当該酵母の作製方法、及び当該酵母を用いた有用物質生産方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記した課題を解決するべく、酵母の細胞表層において保持させる線状の足場タンパク質の構造につき種々検討したところ、セルロソームを産生する細菌のセルロソームのスキャホールディンタンパク(以下、本明細書において骨格タンパク質という。)に含まれる親水性アミノ酸に富むドメイン（Ｘモジュールと称される。）を足場タンパク質に含めることによって、外来タンパク質を細胞表層に保持し、しかも外来タンパク質による高い活性を発揮する酵母が得られるという知見を得た。本発明によれば以下の手段が提供される。
【００１１】
本発明によれば、外来タンパク質を細胞表層に保持するための酵母であって、
以下の３つのドメイン；
（ａ）セルロソームのタイプＩスキャホールディンタンパク質のタイプIコヘシンドメイン由来の外来タンパク質結合ドメイン、
（ｂ）前記タイプＩスキャホールディンタンパク質のタイプIIドックリンドメイン由来の第２の骨格タンパク質結合ドメイン、及び
（ｃ）前記タイプＩスキャホールディンタンパク質の前記タイプIIドックリンドメインに隣接する配列番号１に記載のアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と９０％以上の同一性のアミノ酸配列からなるドメイン、
を含む第１の骨格タンパク質と、
セルロソームのタイプIIスキャホールディンタンパク質のタイプIIコヘシンドメイン由来の第１の骨格タンパク質結合ドメインを含む第２の骨格タンパク質と、
を備え、
前記第２の骨格タンパク質は、前記酵母の細胞表層に保持され、
前記第１の骨格タンパク質は、前記第２の骨格タンパク質を介して前記酵母表層に結合されている、酵母が提供される。
【００１２】
本発明の酵母において、前記骨第１の骨格タンパク質は、さらに、セルロース結合ドメインを含むことができる。また、前記第１の骨格タンパク質の前記（ａ）のドメイン、前記（ｂ）のドメイン及び前記（ｃ）のドメインは、それぞれ、クロストリジウム・サーモセラム（Clostridium thermocellum）のセルロソームのタイプIスキャホールディンタンパク質に由来していてもよく、前記第１の骨格タンパク質は、３個以上の前記（ａ）のドメインを備えていてもよい。さらに、前記第１の骨格タンパク質は、４個以上７個以下の前記（ａ）のドメインを備えることができる。さらにまた、前記第１の骨格タンパク質を細胞外に分泌するものであってもよい。
【００１３】
前記第２の骨格タンパク質は、前記第１の骨格タンパク質結合ドメインを複数個タンデムに有していてもよく、クロストリジウム・サーモセラム（Clostridium thermocellum）のセルロソームのタイプIIスキャホールディンタンパク質に由来するものであってもよい。また、前記第２の骨格タンパク質を細胞表層提示するものであってもよい。
【００１４】
前記（ａ）のドメインは、セルロースを分解する酵素群から選択される１腫又は２種以上を結合可能とすることができる。
【００１５】
本発明によれば、また、細胞表層に外来タンパク質を保持する酵母であって、
上記（ａ）〜（ｃ）のドメインを備える第１の骨格タンパク質と、セルロソームのタイプIIスキャホールディンタンパク質由来のタイプIIコヘシンドメイン由来の第１の骨格タンパク質結合ドメインを含む第２の骨格タンパク質と、を備え、前記第２の骨格タンパク質は、前記酵母の細胞表層に保持され、前記第１の骨格タンパク質は、前記第２の骨格タンパク質を介して前記酵母表層に結合されている、酵母が提供される。
【００１６】
上記酵母においては、前記外来タンパク質は、セルロースを分解する酵素群から選択される１種又は２種以上とすることができ、好ましくは、前記外来タンパク質は、少なくともβ−グルコシダーゼ、エンドグルカナーゼ及びセロビオヒドロラーゼからなる群から選択される２種以上を含んでいる。さらに、前記酵母は、外来タンパク質の生産能を有していないことが好ましい。
【００１７】
本発明によれば、上記記載の外来タンパク質を細胞表層に保持するための酵母の作製方法であって、上記のいずれかに記載の酵母であって、前記外来タンパク質を結合可能な前記（ａ）のドメインを備える酵母を準備する工程と、前記外来タンパク質を前記酵母の外部から供給して、前記酵母の細胞表層側に前記外来タンパク質を保持させる工程と、を備える、作製方法が提供される。
【００１８】
前記タンパク質は、セルロースを分解する酵素群から選択される１又は２種以上とすることができる。
【００１９】
本発明によれば、セルロースの分解方法であって、セルロース系材料中のセルロースと、
細胞表層に外来タンパク質を保持する酵母であって、上記（ａ）〜（ｃ）の３つのドメインを含む第１の骨格タンパク質と、セルロソームのタイプIIスキャホールディンタンパク質由来のタイプIIコヘシンドメイン由来の第１の骨格タンパク質結合ドメインを含む第２の骨格タンパク質と、を備え、前記第２の骨格タンパク質は、前記酵母の細胞表層に保持され、前記第１の骨格タンパク質は、前記第２の骨格タンパク質を介して前記酵母表層に結合されており、前記外来タンパク質は、セルロースを分解する酵素群から選択される１種又は２種以上の酵素である酵母と、を接触させて、前記酵素によりセルロースを分解する工程、を備える、分解方法が提供される。
【００２０】
本発明によれば、セルロースを利用する有用物質の生産方法であって、セルロース系材料中のセルロースと、細胞表層に外来タンパク質を保持する酵母であって、上記（ａ）〜（ｃ）の３つのドメインを含む第１の骨格タンパク質と、セルロソームのタイプIIスキャホールディンタンパク質由来のタイプIIコヘシンドメイン由来の第１の骨格タンパク質結合ドメインを含む第２の骨格タンパク質と、を備え、前記第２の骨格タンパク質は、前記酵母の細胞表層に保持され、前記第１の骨格タンパク質は、前記第２の骨格タンパク質を介して前記酵母表層に結合されており、前記外来タンパク質は、セルロースを分解する酵素群から選択される１種又は２種以上の酵素である酵母と、を接触させて、前記酵素によりセルロースを分解する工程と、前記酵素によって得られるセルロース分解産物を前記酵母によって資化し有用物質に変換する工程と、を備える生産方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明は、外来タンパク質を保持する酵母及びその利用に関している。本発明の酵母の細胞表層の一例を図１に示す。本発明の酵母は、足場タンパク質である第１の骨格タンパク質が、上記（ａ）〜（ｃ）の３つのドメインを有し、第２の骨格タンパク質が、タイプIIスキャホールディンタンパク質のタイプIIコヘシンドメイン由来の第１の骨格タンパク質結合ドメインを備えていることにより、外来タンパク質の高い活性を発揮する酵母を得ることができる。
【００２２】
このような効果が得られる理由は必ずしも明らかではないが、このような骨格タンパク質の組み合わせ及び３つのドメインの組み合わせによると、結果として外来タンパク質をその機能を発揮しやすい状態で保持されたか、あるいは、多数個の外来タンパク質が細胞表層に保持されたことが推測される。
【００２３】
以下、本発明の各種実施形態に関し、外来タンパク質を保持のための酵母、外来タンパク質を保持した酵母及びその作製方法、セルロースの分解方法並びに有用物質の生産方法について順次説明する。
【００２４】
（外来タンパク質を保持するための酵母）
本発明の外来タンパク質を保持するための酵母（以下、外来タンパク質保持用酵母という。）は、特定の３つのドメインを含む第１の骨格タンパク質と、当該第１の骨格タンパク質を結合するドメインを含む第２の骨格タンパク質と、を備えている。この外来タンパク質保持用酵母は、外来タンパク質を細胞表層に保持し、当該外来タンパク質の高い活性を発揮することができる。かかる酵母は、酵母が本来的には資化できない材料を、細胞表層で分解して酵母が資化可能な栄養源に変換するのに用いることができる。この結果、酵母が従来資化できないセルロースなどの材料をあたかも酵母自身が資化するかのように効率的に利用することができるようになる。
【００２５】
（酵母）
外来タンパク質保持用酵母に用いる酵母としては、特に限定されない。例えば、ピキア属、サッカロマイセス属及びカンジダ属から選択されるいずれかであることが好ましい。ピキア属としては、例えば、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）等が挙げられ、サッカロマイセス属としては、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）等が挙げられる。また、カンジダ属としては、カンジダ・クルゼイ（Candida krusei）等が挙げられる。また、天然にある酵母のほか遺伝子工学的に改変した酵母であってもよいし、化学的な手法により変異させた酵母であってもよい。
【００２６】
（外来タンパク質）
外来タンパク質保持用酵母において保持しようとする外来タンパク質は特に限定されない。外来タンパク質としては１種類のみならず２種類以上を同時に保持することができる。好ましくは、協同的又は段階的に機能する多数個又は複数種類のタンパク質である。こうしたタンパク質としては、その構造の観点からは、ペプチド鎖を有していれば足り、糖タンパク質、脂質タンパク質などのタンパク質と他の生体成分等とのタンパク質複合体であってもよい。また、その機能の観点からは、特に限定されないが、例えば、酵素、抗体、受容体、抗原として機能するものが挙げられる。
【００２７】
外来タンパク質保持用酵母が保持するタンパク質としては、酵素が好ましい。特に、複数種類の酵素が協同的又は段階的に作用する酵素反応系を構成する当該複数酵素群の少なくとも一部であることが好ましい。本発明の外来タンパク質保持用酵母によれば、多数個又は複数種類の酵素を近接配置することができるため、複数の酵素反応が必要とされる酵素反応系における全体の反応速度を高めることができる。こうした酵素群の一つとしては、セルロースを分解する酵素であるセルラーゼやデンプンを分解する酵素群が挙げられる。セルラーゼについては、後段にて詳述する。
【００２８】
（第１の骨格タンパク質）
本発明のタンパク質保持用酵母は、第１の骨格タンパク質をその表層側に備えることができる。換言すれば、酵母の細胞表層において露出された状態で第１の骨格タンパク質を備えている。また、タンパク質保持用酵母は、細胞表層に保持された第２の骨格タンパク質を介して第１の骨格タンパク質を備えている。
【００２９】
第１の骨格タンパク質は、基本的に単鎖のポリペプチド鎖から構成されるタンパク質であり、少なくとも以下の３つの異なるドメインを備えている。以下、各ドメインについて説明する。
【００３０】
（セルロソームのタイプＩスキャホールディンタンパク質のタイプIコヘシンドメイン由来の外来タンパク質結合ドメイン）
外来タンパク質結合ドメインは、酵母にとっての外来タンパク質を結合保持するためのドメインである。このドメインは、セルロソームのタイプＩスキャホールディンタンパク質のタイプＩコヘシンドメインに由来している。スキャホールディンタンパク質のタイプＩコヘシンドメインは、以下の表１に示す各種のセルロソーム生産微生物の形成するセルロソーム（セルラーゼ複合体）のタイプＩのスキャホールディンタンパク質において触媒活性のあるセルラーゼを非共有結合にて結合するドメインとして知られている（粟冠ら、蛋白質核酸酵素、Vol.44、No.10（1999）、p41-p50、Demain, A. L., et al., Microbiol Mol. Biol Rev., 69(1), 124-54(2005), Doi, R. H., et al., J. Bacterol., 185(20), 5907-5914(2003)等）。こうしたタイプIコヘシンドメインとしては、各種セルロソーム生産微生物において多数その配列が決定されている。これらの各種のタイプIコヘシンのアミノ酸配列及びＤＮＡ配列は、NCBIのHP（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）等を介してアクセス可能な各種のタンパク質データベースやDNA配列のデータベースにより容易に取得することができる。
【表１】
【００３１】
セルロソームは、嫌気性細菌や嫌気性糸状菌によって菌体外に形成され、通常、微生物表面に結合して又は培養液中に存在している。セルロソームとしては、表１に示すセルロソームを形成する微生物を含む嫌気性微生物等、公知のセルロソーム生産微生物が生産するセルロソーム及び将来的に明らかにされるセルロソーム並びにこれらの改変体のいずれであっても本発明の第１の骨格タンパク質や後述する第２の骨格タンパク質に用いることができる。セルロース分解能力の高さ等を考慮すると、クロストリジウム・サーモセラム等の好熱嫌気性微生物やクロストリジウム・セルロリティカム等のクロストリジウム属菌の生産するセルロソーム又はその改変体を本発明において用いることができる。
【００３２】
第１の骨格タンパク質の外来タンパク質結合ドメインとしては、例えば、クロストリジウム・サーモセラム（Clostridium thermocellum）のタイプIスキャホールディンタンパク質、クロストリジウム・ジョスィ（Clostridium josui）のタイプＩスキャホールディンタンパク質等のタイプＩコヘシンドメインを用いることができる。また、C.cellulolyticum(NCBIのホームページhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/)、アクセッション番号：U40345）、C.cellulovorans（同ホームページ、アクセッション番号：M73817）、C.acetobutylicum(同ホームページ、アクセッション番号：AE001437)に開示されるタイプＩコヘシンドメインも挙げられる。
【００３３】
なお、本明細書において、タンパク質の所定のドメインに由来している、とは、天然に存在する当該所定のドメインのアミノ酸配列又はその改変配列からなることを意味している。改変配列は、当該所定のドメインと同一の作用を発揮する範囲でアミノ酸配列が改変された配列である。こうしたアミノ酸配列は、例えば、当該所定のドメインのアミノ酸配列と好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９９％以上の同一性を有するものである。
【００３４】
なお、本明細書において同一性及び類似性とは、当業者において知られているとおり、配列を比較することにより決定される、２以上のタンパク質あるいは２以上のポリヌクレオチドの間の関係である。当該技術分野で“同一性 ”とは、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間のアラインメントによって、あるいは場合によっては、一続きのそのような配列間のアラインメントによって決定されるような、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間の配列不変性の程度を意味する。また、類似性とは、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間のアラインメントによって、あるいは場合によっては、一続きのそのような配列間のアラインメントによって決定されるような、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間の相関性の程度を意味する。より具体的には、配列の同一性と保存性（配列中の特定アミノ酸又は配列における物理化学特性を維持する置換）によって決定される。類似性は、後述するＢＬＡＳＴの配列相同性検索結果においてSimilarity と称される。同一性及び類似性を決定する好ましい方法は、対比する配列間で最も長くアラインメントするように設計される。同一性及び類似性を決定するための方法は、公に利用可能なプログラムにコードされている。例えば、AltschulらによるBLAST (Basic Local Alignment Search Tool) プログラム（たとえば、Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ., J. Mol. Biol., 215: p403-410 (1990), Altschyl SF, Madden TL, Schaffer AA, Zhang J, Miller W, Lipman DJ., Nucleic Acids Res. 25: p3389-3402 (1997))を利用し決定することができる。BLASTのようなソフトウェアを用いる場合の条件は、特に限定するものではないが、デフォルト値を用いるのが好ましい。
【００３５】
第１の骨格タンパク質は、こうした外来タンパク質結合ドメインを複数個タンデムに有することが好ましい。「タンデムに有する」とは、アミノ酸配列において、複数個の当ドメインが並んだ状態であればよく、並んだタンパク質結合ドメイン間における離間配列の存在の有無、離間間隔が一定であること及び異種のドメインの存在を問わない。好ましくは、ドメイン間に離間配列を有している。複数個の外来タンパク質結合ドメインは、１種類のアミノ酸配列からなる同一種類のドメインであってもよいし、２種類以上の異なるアミノ酸配列からなるドメインであってもよい。異なる種類の外来タンパク質結合ドメインを用いることで、異なる外来タンパク質を第１の骨格タンパク質上に配列させることができる。
【００３６】
第１の骨格タンパク質は、酵母が凝集性を獲得する程度に外来タンパク質結合ドメインを有していることが好ましい。酵母に酵素等のタンパク質を保持させて利用するとき、こうした酵母が凝集可能であれば、凝集された酵母上において酵素等を集約させることができるほか、酵母を効率的に回収して繰り返し利用することができる。
【００３７】
第１の骨格タンパク質により酵母に凝集性を付与するのにあたり、３個以上の外来タンパク質結合ドメインを有していることが好ましい。３個以上であると、酵母に凝集性を付与しやすくなる傾向があるからである。好ましくは４個以上である。４個以上であると明らかに酵母に凝集性を付与しやすくなるからである。凝集性の観点からは外来タンパク質結合ドメイン数の上限は特に限定されない。なお、発現量を容易に確保するという観点からは、７個程度以下であることが好ましい場合がある。
【００３８】
外来タンパク質結合ドメインは、タイプＩコヘシンドメインに基づく結合性で外来タンパク質を結合保持することができる。すなわち、タイプＩコヘシンドメインは、タイプＩドックリンドメインを有する外来タンパク質と結合することができる。タイプＩドックリンドメインは、タイプＩスキャホールディンタンパク質のタイプＩコヘシンと非共有結合で結合する部位であり、セルロソームを構成するセルラーゼが備えるドメインである。例えば、外来タンパク質結合ドメインが、クロストリジウム・サーモセラム由来のタイプＩコヘシンに由来するとき、タイプＩドックリンドメインとしては、配列番号２で表されるアミノ酸配列が挙げられ、クロストリジウム・セルロリティカム、クロストリジウム・サーモセルロボランス、クロストリジウム・ジョスイ、クロストリジウム・アセトブチリカム、ルミノコッカス・フレイブファシエンス（R. fravefaciens）、アシドサーモス・セルロリティカス（A. cellulolyticus）、バクテロイデス・セルロソルベンス（B.cellulosolvens）由来のタイプＩコヘシンに由来するとき、それぞれ、配列番号３〜配列番号９で表されるアミノ酸配列が挙げられる。
【００３９】
外来タンパク質結合ドメインは、第１の骨格タンパク質において、第２の骨格タンパク質との結合を妨げない箇所に備えられていればよい。典型的には、Ｎ末端以外の部位に備えられている。
【００４０】
（タイプＩスキャホールディンタンパク質のタイプIIドックリンドメイン由来の第２の骨格タンパク質結合ドメイン）
第２の骨格タンパク質結合ドメインは、後述する第２の骨格タンパク質を結合するためのドメインである。このドメインは、セルロソームにおいて、タイプI骨格タンパク質を非共有結合でタイプII骨格タンパク質上に保持するためのドメインとして知られている（粟冠ら、蛋白質核酸酵素、Vol.44、No.10（1999）、p41-p50等）。こうしたタイプIIドックリンドメインとしては、各種セルロソーム生産微生物において多数その配列が決定されている。これらの各種のタイプIIドックリンドメインのアミノ酸配列及びＤＮＡ配列は、NCBIのHP（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）等を介してアクセス可能な各種のタンパク質データベースやDNA配列のデータベースにより容易に取得することができる。例えば、クロストリジウム・サーモセラムのタイプIIドックリンドメインとしては、配列番号１０に記載されるアミノ酸配列が挙げられ、アシドサーモス・セルロリィカス及びルミノコッカス・フレイブファシエンスの同ドメインとしては、それぞれ配列番号１１及び１２に記載されるアミノ酸配列が挙げられる。
【００４１】
第２の骨格タンパク質結合ドメインは、第２の骨格タンパク質結合ドメインを結合するドメインであることから、第１の骨格タンパク質のＣ末端若しくはＮ末端又はこれらの近傍に第２の骨格タンパク質を結合可能に備えられる。典型的には、第１の骨格タンパク質のＣ末端又はその近傍に備えられる。
【００４２】
（配列番号１で表されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と９０％以上の同一性のアミノ酸配列からなるドメイン）
このドメイン（以下、本明細書において第３のドメインという。）を備えることで、第３のドメインを備えない酵母よりも、結果として、外来タンパク質の活性を増強することができる。第３のドメインが結果として外来タンパク質の活性を増強することへの作用は既に説明したように必ずしも明らかではない。配列番号１で表されるアミノ酸配列は、クロストリジウム・サーモセラムのタイプＩスキャホールディンタンパク質のタイプIIドックリンに隣接するＸモジュールと呼ばれる配列である。Ｘモジュールの機能は必ずしも明らかでなく、また、クロストリジウム・サーモセラム又はクロストリジウム属でもなく、しかも真菌である酵母細胞表層に保持させる第１の骨格タンパク質に用いるときにどのように作用するかは全く知られていない。
【００４３】
このような第３のドメインとしては、配列番号１で表されるアミノ酸配列のほか、当該アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を用いることができる。より好ましくは９５％以上である。すなわち、配列番号１で表されるアミノ酸配列において１個又は数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入及び付加から選択される１種又は２種以上の変異を有するアミノ酸配列からなっていてもよい。好ましくは、１個以上１０個以下、より好ましくは１個以上５個以下の変異であり、さらに好ましくは、１個以上３個以下である。
【００４４】
なお、本明細書の開示によれば、本発明に用いることのできる第３のドメインは、上記のように配列番号１で表されるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列に限定されるものではなく、第２の骨格タンパク質結合ドメインが由来するセルロソーム産生微生物と同一の株又は種のタイプＩスキャホールディンタンパク質のＸモジュールに由来する必要はなく、同一種の異なる株や他の種のセルロソーム産生微生物に由来していてもよいが、同一種又は株のＸモジュールに由来していることが好ましい。
【００４５】
配列番号１で表されるアミノ酸配列の起源であるクロストリジウム・サーモセラム以外に由来する第３のドメインのアミノ酸配列としては、例えば、アシドサーモス・セルロリィティカス由来のＸモジュールである配列番号１３で表されるアミノ酸配列（配列番号１との同一性が６２％である。）、ルミノコッカス・フレイブファシエンス由来のＸモジュールである配列番号１４で表されるアミノ酸配列（配列番号１との同一性が２１％である。）が挙げられる。
【００４６】
第１の骨格タンパク質は、第３のドメインを第２の骨格タンパク質結合ドメインの近傍、好ましくは第２の骨格タンパク質結合ドメインに隣接して、第２の骨格タンパク質結合ドメインが存在する末端よりも中央よりの部位に備える。第２の骨格タンパク質結合ドメインは、Ｃ末端側にある場合には、第２の骨格タンパク質結合ドメインのＮ末端側に隣接して備えられることが好ましい。
【００４７】
（セルロース結合ドメイン）
外来タンパク質保持用酵母が、セルロースの分解に用いる場合には、第１の骨格タンパク質は、セルロソームのタイプＩスキャホールディンタンパク質のセルロース結合ドメイン（CBD）由来のセルロース結合ドメインを有していることが好ましい。セルロース結合ドメインは、タイプＩのスキャホールディンタンパク質において基質であるセルロースに結合するドメインとして知られている（前述粟冠ら）。セルロース結合ドメインは、１個又は２個以上備えられていてもよい。なお、酵母が備える第１の骨格タンパク質の全てにおいてセルロース結合ドメインを要するものではない。
【００４８】
各種のセルロソーム生産微生物のセルロソームにおけるCBDのアミノ酸配列及びDNA配列の多くが決定されており、これらの各種のCBDのアミノ酸配列及びＤＮＡ配列は、NCBIのHP（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）等を介してアクセス可能な各種のタンパク質データベースやDNA配列のデータベースにより容易に取得することができる。例えば、クロストリジウム・サーモセラムのセルロース結合ドメインとしては、配列番号１５で表されるアミノ酸配列が挙げられる。また、クロストリジウム・セルロリティカス、クロストリジウム・セルロボランス、クロストリジウム・アセトブチリカム、クロストリジウム・ジョスイ、アシドサーモス・セルロリティカス、バクテロイデス・セルロボランスのセルロース結合ドメインとしては、ぞれぞれ配列番号１６〜２１で表されるアミノ酸配列を有するドメインが挙げられる。
【００４９】
セルロース結合ドメインは、第１の骨格タンパク質においては、好ましくはＮ末端若しくはその近傍又はその全長においてＮ末端よりに備えられている。
【００５０】
以上説明した第１の骨格タンパク質は、各要素を人工的に組み合わせた人工タンパク質であってもよいし、セルロソーム生産微生物のタイプＩスキャホールディンタンパク質に由来するものであってもよい。すなわち、タイプＩスキャホールディンタンパク質の全体若しくはその一部又はこれらの改変体であってもよい。改変体とは、セルロソーム生産微生物のセルロソームから取得されるタイプIスキャホールディンタンパク質の塩基配列及び／又はアミノ酸配列の全体又はその一部において少なくとも部分的に改変したものをいう。第１の骨格タンパク質は、クロストリジウム・サーモセラム（Clostridium thermocellum）のタイプIスキャホールディンタンパク質、クロストリジウム・ジョスィ（Clostridum josui）のタイプＩスキャホールディンタンパク質の全体若しくはその一部又はその改変体を利用することができる。
【００５１】
（第２の骨格タンパク質）
第１の骨格タンパク質が細胞の表層に備える他の一つの形態は、第１の骨格タンパク質が細胞の表層に結合した第２の骨格タンパク質と非共有結合により結合した結果、細胞の表層側に保持される形態である。第２の骨格タンパク質は、第１の骨格タンパク質を非共有結合で結合可能な第１の骨格タンパク質結合ドメインを有して細胞の表層側に配置されている。
【００５２】
第２の骨格タンパク質は、基本的に単鎖のポリペプチド鎖から構成されるタンパク質である。第１の骨格タンパク質結合ドメインとは、そのアミノ酸配列に基づき、非共有結合で第１の骨格タンパク質を結合できるドメインである。第２の骨格タンパク質に対して非共有結合で第１の骨格タンパク質を結合させることができるため、第１の骨格タンパク質を第２の骨格タンパク質に対して容易に結合させたり第２の骨格タンパク質から容易に分離・回収したりすることができる。
【００５３】
こうした第１の骨格タンパク質結合ドメインとしては、セルロソームのタイプIIスキャホールディンタンパク質（アンカータンパク質とも言われる。）のタイプIIコヘシンドメイン由来のドメインを用いることができる。タイプIIコヘシンドメインは、セルロソームにおいて、タイプIスキャホールディンタンパク質を非共有結合でタイプIIスキャホールディンタンパク質上に保持するためのドメインとして知られている（粟冠ら、蛋白質核酸酵素、Vol.44、No.10（1999）、p41-p50等）。タイプIIスキャホールディンタンパク質のタイプIIコヘシンドメインには、タイプIスキャホールディンタンパク質のタイプIIドックリンドメインが結合することが知られている。
【００５４】
こうしたタイプIIドックリンドメインとしては、各種セルロソーム生産微生物において多数その配列が決定されている。これらの各種のタイプIIコヘシンのアミノ酸配列及びＤＮＡ配列は、NCBIのHP（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）等を介してアクセス可能な各種のタンパク質データベースやDNA配列のデータベースにより容易に取得することができる。
【００５５】
第１の骨格タンパク質結合ドメインとしては、例えば、クロストリジウム・サーモセラムのタイプIIコヘシンであるSdbA,Orf2,OlpBのタイプIIコヘシンドメインを用いることができる。また、アシドサーモス・セルロリティカスのScaD,ScaBのタイプIIコヘシンドメイン、バクテロイデス・セルロソルベンスのScaAのタイプIIコヘシンドメイン等が挙げられる。
【００５６】
第２の骨格タンパク質は、第１の骨格タンパク質結合ドメインを１個のみ有していてもよいが、複数個タンデムに備えていてもよい。複数個備えることで、外来タンパク質をより高密度に酵母表層上に保持しやすくなる。
【００５７】
複数個の第１の骨格タンパク質結合ドメインは、１種類のアミノ酸配列からなる同一種類のドメインであってもよいし、２種類以上の異なるアミノ酸配列からなるドメインであってもよい。異なる種類の骨格タンパク質結合ドメインを用いることで、異なる第１の骨格タンパク質を第２の骨格タンパク質上に配列させることができる。
【００５８】
第２の骨格タンパク質は細胞の表層側に結合される必要がある。第２の骨格タンパク質は、細胞の表層と共有結合又は非共有結合により結合される。共有結合にて第２の骨格タンパク質を細胞の表層に結合している場合には、洗浄等によっても第２の結合タンパク質が細胞から分離されないで保持されるというメリットがあり、非共有結合による場合には、逆に洗浄等により細胞から第２の骨格タンパク質及び第１の骨格タンパク質を分離できるというメリットがある。いずれにしても、第２の骨格タンパク質は、酵母表層と結合するための酵母表層結合ドメインを有している。
【００５９】
第２の骨格タンパク質を酵母表層側に結合させるシステムとしては、公知の各種の酵母表層提示システムを用いることができる。第２の骨格タンパク質は、直接細胞表層に結合するためにこれらの各種システムにおいて必要とされる細胞表層結合ドメインを有することができる。酵母表層提示システムとしては、例えば、表層タンパク質であるα−アグルチニン又はそのレセプターを利用することができる。アグルチニンを利用したタンパク質の細胞表層提示システムは、例えば、インビトロジェン社からpYD1ベクター及びEBY100サッカロマイセス・セレビジエを含む酵母用ディスプレイキットとして入手することができる。また、細胞表層提示システムとしては、このほか、SAG1、FLO1〜FLO11などの細胞表層タンパク質を用いるシステム等を用いることができる。
【００６０】
このような第２の骨格タンパク質としては、上記した第１の骨格タンパク質結合ドメインと酵母細胞表層結合ドメインとを人工的に組み合わせた融合タンパク質として構築してもよいし、セルロソーム生産微生物のタイプII骨格タンパク質由来としてもよい。すなわち、当該骨格タンパク質の一部又は全部あるいはこれらの改変体であってもよい。こうしたタイプII骨格タンパク質としては、クロストリジウム・サーモセラムのタイプII骨格タンパク質、クロストリジウム・ジョスィのタイプII骨格タンパク質又はその改変体を利用することができる。
【００６１】
（外来タンパク質保持用酵母の作製方法）
このような酵母は、第１の骨格タンパク質を第２の骨格タンパク質を介して細胞表層に結合させて外来タンパク質保持用酵母を作製するには、第２の骨格タンパク質を酵母において発現させて、細胞表層に結合させ、外部から第１の骨格タンパク質を供給して、第２の骨格タンパク質に第１の骨格タンパク質を結合保持させる形態が挙げられる。このような製造方法によれば、第１の骨格タンパク質を酵母に合成させなくてもよいため、酵母の増殖能やアルコール発酵能への影響を少なくすることができる。
【００６２】
当業者であれば、タイプIIのスキャホールディンタンパク質のアミノ酸配列、第１の骨格タンパク質結合ドメインのアミノ酸配列を取得し、公知の細胞表層提示システムを利用することで、酵母を遺伝子工学的に改変して第２の骨格タンパク質を細胞表層に結合した状態で発現させることができる。酵母を含む各種細胞に対するこうした遺伝子導入による外来タンパク質の発現のための各種操作は、例えば、Molecular Cloning A Laboratory Manual second edition（Maniatis et al.,Cold Spring Harbor Laboratory press.1989）等のプロトコールに従うことができる。
【００６３】
また、第１の骨格タンパク質を準備するには、タイプIのスキャホールディンタンパク質のアミノ酸配列、外来タンパク質結合ドメイン、第３のドメイン及びセルロース結合ドメイン等のアミノ酸配列を取得し、大腸菌を利用したタンパク質発現システムや無細胞合成系等を利用することができる。第１の骨格タンパク質を利用することで、酵母を遺伝子工学的に改変して第２の骨格タンパク質を細胞表層に結合した状態で発現させることができる。大腸菌等を用いた外来タンパク質の発現のための各種操作については、上記プロトコール等に従うことができる。
【００６４】
外来タンパク質保持用酵母の作製方法の他の形態としては、第１の骨格タンパク質及び第２の骨格タンパク質をそれぞれ酵母において遺伝子組換え等により発現させ、第２の骨格タンパク質を細胞表層に結合させ、細胞外に分泌させた第１の骨格タンパク質を第２の骨格タンパク質に結合保持させてもよい。本発明者らによれば、第１の骨格タンパク質をシグナルペプチド等を付与して分泌発現させるとともに、第２の骨格タンパク質を細胞表層提示システムを用いて酵母細胞表層に提示させるように改変した酵母を取得し、培養することで、第１の骨格タンパク質を細胞表層に保持する酵母を得られることがわかっている。
【００６５】
このほか、第１の骨格タンパク質を酵母で分泌発現させるとともに、第２の骨格タンパク質を酵母外で準備し外部から供給するようにしてもよい。この場合、第２の骨格タンパク質は、前述のアグルチニン等の細胞表層提示システムに基づく細胞表層結合ドメインを備えるようにするのが好ましい。さらに、他の形態として、第１の骨格タンパク質及び第２の骨格タンパク質を、いずれも酵母外で準備して、酵母に供給するようにしてもよい。この場合、第２の骨格タンパク質は、アグルチニン等の細胞表層提示システムに基づく細胞表層結合ドメインを備えるようにすることが好ましい。
【００６６】
本発明の外来タンパク質保持用酵母の製造方法によれば、容易に細胞表層で外来タンパク質を保持し、当該外来タンパク質に基づく高い活性を発揮する酵母を得ることができる。また、特別な処理なく、第２の骨格タンパク質に対して第１の骨格タンパク質を結合保持させることができるため、容易に酵母の細胞表層に二次元骨格を付与することができる。
【００６７】
（外来タンパク質を細胞表層に保持した酵母）
本発明の外来タンパク質を細胞表層に保持した酵母（以下、外来タンパク質表層保持酵母）は、その細胞表層に外来タンパク質を保持することができ、当該外来タンパク質の高い活性を発現することができる。
【００６８】
外来タンパク質表層保持酵母が保持する外来タンパク質は、既に説明したように各種の態様とすることができる。例えば、酵母が直接利用できないかあるいは利用が困難なタンパク質、リグニン、デンプン、セルロース等などの高分子を分解する酵素とすることが好ましい。より好ましくは、酵母が直接利用できないが有用な未利用炭素源であるセルロースを分解するセルラーゼが挙げられる。
【００６９】
セルロースは複数の酵素が協同的及び段階的に作用することで初めて効率的に分解される。特に不溶性セルロース及び結晶性セルロースにおいてその傾向がある。本発明の外来タンパク質表層保持酵母は、複数種類のセルラーゼを近接して備えることができるため、セルロースを効率的に分解することができる。特に、本発明酵母は、タイプIコヘシン由来の外来タンパク質結合ドメインを有しているため、セルラーゼの結合に有利である。また、第１の骨格タンパク質がセルロース結合ドメインを備えている場合には、さらに有利である。
【００７０】
セルラーゼは、Ｄ−グルコースがβ−１，４結合で結合したセルロースを加水分解してＤ−グルコースまで分解する過程において作用する酵素からなる酵素群から選択されるものであればよく、その由来も特に限定されない。したがって、セルラーゼとしては、例えば、国際生化学・分子生物学連合酵素委員会においてＥＣ３．２．１．Ｘの番号が与えられるセルロース分解酵素が挙げられる。この番号が与えられる酵素としては、エンドグルカナーゼ（１，４−β−Ｄ−グルカングルカノヒドラーゼ、ＥＣ３．２．１．４）、β−グルコシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２１）、１，４−β−グルコシダーゼ（ＥＣ３．２．１．７４）及びエキソセロビオヒドロラーゼ（セルロース１，４−β−セロビオシダーゼ、ＥＣ３．２．１．９１）が挙げられる。本発明において用いるセルラーゼは、こうしたセルラーゼから選択される１種のみであってもよいし２種以上が組み合わされていてもよい。なお、セルラーゼとしては、これらの作用以外であっても上記分解過程に寄与する酵素も含めることができる。
【００７１】
本複合材料は、２種類以上のセルラーゼを備えていることが好ましい。より好ましくは、エンドグルカナーゼ及びエキソセロビオヒドロラーゼから選択される１種類又は２種類を含むことが好ましい。これらの酵素を備えることにより結晶性又は不溶性セルロースを分解することができる。これらの酵素を備えることにより一層効果的に結晶性又は不溶性セルロースを分解することができる。これらのセルラーゼは、セルロースに対して相乗的に作用し効果的に分解できると考えられるからである。さらに、これらのセルラーゼによるセルロースの分解産物である新たな低分子セルロースやセロビオースに作用するβ−グルコシダーゼや１，４−β−グルコシダーゼのいずれか又は双方を備えることが好ましい。一層好ましくは、β-グルコシダーゼ、エンドグルカナーゼ及びエキソセロビオヒドロラーゼを備える。
【００７２】
セルラーゼの由来は特に限定されないが、セルラーゼは表１に示すようなセルロソーム生産微生物のセルロソームを構成するセルラーゼや以下の表２に示すセルロース分解性微生物の生産するセルラーゼ及びこれらの改変体を使用できる。改変体とは、天然のセルラーゼ又はセルロソームから取得されるセルラーゼの塩基配列及び／又はアミノ酸配列において少なくとも部分的に改変したものをいう。なお、改変には、アミノ酸の挿入、置換、欠失及び付加のいずれかあるいは２種類以上のほか、アミノ酸配列に影響しない改変も含む。
【００７３】
セルラーゼは、以下の表に示すような各種の天然のセルラーゼ生産微生物又はセルラーゼ又はその改変体若しくはその一部を形成するように人工的に改変した微生物から取得できる。こうした改変微生物は、以下の表に由来する微生物を親株又は宿主とするものであってもよいし、酵母等の工業的利用に適した微生物を親株又は宿主とするものであってもよい。セルラーゼはこれら微生物の菌体外に分泌されるのが通常であり、これらの微生物の培養液からセルラーゼ活性画分を回収することでセルラーゼを容易に取得できる。さらに、タンパク質の無細胞合成系によって取得することもできる。
【表２】
【００７４】
本発明の酵母がセルラーゼを結合保持するものであるとき、セルラーゼ以外の酵素を結合保持していてもよい。例えば、キシラナーゼ、ヘミセルラーゼ等のリグノセルロース系材料中のヘミセルロースを分解する酵素を備えることで、リグノセルロース系材料中のヘミセルロースを分解できるようになる。例えば、クロストリジウム・サーモセラムのセルロソームは、キシラナーゼ、リケナーゼ及びマンナナーゼ等の活性も見出されている。また、リグニンを分解するリグニンペルオキシダーゼやマンガンペルオキシダーゼを備えていてもよい。リグニン分解酵素を備えている場合、セルロース系材料の分解のみならずリグノセルロース系材料の分解に本複合材料を用いることができる。なお、リグニン分解酵素を結合保持してリグニンを分解する複合材料を併用することでリグノセルロース系材料を分解することもできるし、別途リグニン分解酵素単体を併用してリグノセルロース系材料を分解することもできる。
【００７５】
外来タンパク質としてセルラーゼを保持する酵母は、セルラーゼによるセルロースの分解産物であるグルコース等を酵母自体が備える能力に基づき資化して有用物質を生産することができる。酵母は、アルコール発酵によりアルコールを産生することができる。また、公知の乳酸などの有機酸生産酵母は乳酸などを製造でき、その他有用物質生産能力を変異によりあるいは遺伝子工学的に取得した酵母は、当該有用物質を生産できる。セルラーゼを保持する本発明の酵母は、セルロースの分解産物を炭素源としてこうした有用物質を生産することができる。
【００７６】
なお、酵母としては、既に説明したほか、遺伝子組換えにより酸や塩に対して耐性が強化された酵母が挙げられる。こうした酵母の一例として、特開２００４−３４４０８４に記載されるＭＦ−１２１株が挙げられる。なお、これらの公報に記載の内容の全ては引用により本明細書の一部に組み込まれる。
【００７７】
有機酸を生産する酵母としては、酵母などの微生物を宿主として遺伝子改変により乳酸などの有機酸を生産可能とした公知の形質転換体を用いることができる。こうした乳酸生産酵母などの形質転換酵母は、例えば、特開２００３−３３４０９２、特開２００４−１８７６４３、特開２００５−１３７３０６、特開２００６−６２７１、特開２００６−２０６０２、特開２００６−４２７１９、特開２００６−７５１３３、特開２００６−２９６３７７等に開示されており、本発明においてはこれらの形質転換酵母を用いることができる。これらの公報に記載の内容の全ては引用により本明細書の一部に組み込まれる。
【００７８】
なお、分解対象であるセルロースは、いかなる形態であってもよい。通常、セルロースは、セルロース系のバイオマス材料(以下、セルロース系材料)に含まれている。セルロース系材料としては、セルロースを含有していればよく、どのような由来や形態であってもよい。したがって、セルロース系材料としては、例えば、リグノセルロース系材料、結晶性セルロース材料、不溶性セルロース材料などの各種セルロース系材料等が含まれる。リグノセルロース系材料としては、例えば、木本植物の木質部や葉部及び草本植物の葉、茎、根等においてリグニン等を複合した状態のリグノセルロース系材料が挙げられる。こうしたリグノセルロース系材料としては、例えば、稲ワラ、麦ワラ、トウモロコシの茎葉、バガス等の農業廃棄物、収集された木、枝、枯葉等又はこれらを解繊して得られるチップ、おがくず、チップなどの製材工場廃材、間伐材や被害木などの林地残材、建設廃材等の廃棄物であってもよい。結晶性セルロース系材料及び不溶性セルロース系材料としては、リグノセルロース系材料からリグニン等を分離後の結晶性セルロース及び不溶性セルロースを含む結晶性又は不溶性セルロース系材料が挙げられる。セルロース材料としては、また、使用済み紙製容器、古紙、使用済みの衣服などの使用済み繊維製品、パルプ廃液を由来としてもよい。さらに、アセトバクター・キシリナム（Acetobacter xylinum）等のセルロース生産微生物が生産するセルロースを由来としてもよい。
【００７９】
さらに、セルロース系材料は、本複合材料による分解に先だってセルラーゼによる分解を容易化するために適当な前処理等がなされていてもよい。例えば、セルロースが非晶質化されたものであってもよい。セルロースの非晶質化は同時に低分子化を伴うことが多い。
例えば、硫酸、塩酸、リン酸、硝酸などの無機酸による酸性条件下等で、セルロースを部分加水分解することにより、セルロースを非晶質化あるいは低分子化できる。この他、超臨界水、アルカリ、加圧熱水などの処理によってもセルロースの非晶質化又は低分子化を行うことができる。
【００８０】
なお、セルラーゼを保持する本発明の酵母によって得られる分解産物は、分解するセルロース系材料、結合保持するセルラーゼの種類等によって相違する。したがって、必ずしもＤ−グルコースを最終産物とするものではなく、セロビオースやオリゴ糖を主体とする分解産物組成を有していてもよい。
【００８１】
以上説明したように、本発明の外来タンパク質保持用酵母は、外来タンパク質の作用を高度に発揮できる酵母であるため、外来タンパク質の作用と酵母本来との作用との相乗効果が期待することができる。しかも、複数種類及び／又は高密度に外来タンパク質を保持できる人工骨格を細胞表層に形成できるため、複数の外来タンパク質による相乗効果を発揮させることができる。
【００８２】
（外来タンパク質表層保持酵母の作製方法）
本発明の外来タンパク質表層保持酵母の作製方法は、本発明の外来タンパク質保持用酵母に、第１の骨格タンパク質上の外来タンパク質結合ドメインに結合可能な相互作用ドメインを有する１種又は２種以上のタンパク質を前記酵母内から分泌させて又は酵母外部から供給する工程を備えている。これにより、外来タンパク質結合ドメインに１種又は２種以上の外来タンパク質を結合させて、外来タンパク質表層保持酵母を得ることができる。
【００８３】
外来タンパク質を酵母で分泌発現させる場合には、適当なシグナルペプチドと外来タンパク質との融合タンパク質をコードするＤＮＡを用いて酵母を形質転換させるなどすればよい。
【００８４】
外来タンパク質は、酵母外部から酵母に対して供給してもよい。外来タンパク質が外来タンパク質保持用酵母の第１の骨格タンパク質の外来タンパク質結合ドメインと相互作用可能なドメイン（タイプＩドックリンドメインなど）を有している場合には、当該外来タンパク質をそのまま酵母に対して供給することができる。外来タンパク質が、そのようなドメインを備えていない場合には、遺伝子工学的にそのようなドメインを融合した融合タンパク質を準備する。当業者であれば、既に記載したプロトコール集に基づきこのような融合タンパク質を適宜準備することができる。細胞外から外来タンパク質を供給して保持させることで、酵母における骨格タンパク質の産生能を低下させたり増殖能を低下させたりすることがなく、保持させようとする外来タンパク質を所望の量だけ供給することができる。
【００８５】
本発明の外来タンパク質保持用酵母に酵母外から外来タンパク質を供給して細胞表層に結合保持させるには、本保持用酵母と外来タンパク質とを適当な水性媒体下に接触させればよい。本保持用酵母を含む水性媒体に対して外来タンパク質を供給してもよいし、タンパク質を含有する水性媒体中に本保持用酵母を供給してもよい。
【００８６】
供給工程で用いる水性媒体は、本保持用酵母と外来タンパク質との生理活性が維持される限りに特に限定されない。これらの生理活性が維持される条件は、タンパク質と酵母とについてその生理活性が吸着工程後も維持される条件である。例えば、これらについて適切なｐＨ、浸透圧及び温度が確保されていればよい。ｐＨは、タンパク質及び細胞によっても異なるが、通常は、ｐＨ６以上９以下の範囲である。また、浸透圧も微生物などの細胞に対しておおよそ等張性であることが好ましい。なお、浸透圧は緩衝液や等張化剤のほか適当な塩類を使用して調節することができる。また、温度は、タンパク質の変性等を考慮すると１℃以上１０℃以下であることが好ましく、より好ましくは２℃以上５℃以下である。こうした水性媒体としては、塩類溶液等とすることができる。例えば、２０ｍＭ〜５０ｍＭ程度のトリス塩酸バッファーとしてもよい。また、０ｍＭ超２０ｍＭ以下、より好ましくは５ｍＭ以上１５ｍＭ以下のＣａＣｌ２溶液などのカルシウムイオンが存在する水性媒体としてもよい。さらに好ましくは、約１０ｍＭのカルシウムイオンが存在する水性媒体とする。こうしたカルシウムイオン含有水性媒体は、典型的にはＣａＣｌ2水溶液が挙げられる。こうしたイオン環境において本保持用酵母への外来タンパク質の結合保持傾向が強くなる傾向がある。
【００８７】
水性媒体の攪拌にあたっては、その強度を適宜調節すればよい。適切な攪拌強度等の攪拌条件は、所望の外来タンパク質と本保持用酵母とを適切な水性媒体下で各種の攪拌条件で攪拌して、その結果得られた細胞画分のタンパク質量や酵素活性等を測定することで決定することができる。なお、接触回数を増加させるには、供給するタンパク質濃度を増加させるのも有効である。
【００８８】
本複合材料を製造するにあたっては、複数種類のタンパク質を本人工骨格材料に同時に供給してもよいし、順次供給してもよい。結合保持させようとするタンパク質が有する相互作用ドメインによって結合すべきタンパク質結合ドメインを予め決めておくことができるため、結合させようとするタンパク質結合ドメインが互いに相違している場合には同時供給することができる。一方、例えば、結合させるべきタンパク質結合ドメインが共有の場合、同時に複数種類のタンパク質を供給すると、タンパク質の結合量を制御することが困難な場合がある。したがって、このような場合において、タンパク質の結合量を調整したい場合には、異なるタンパク質を順次供給するようにする。
【００８９】
こうした供給工程によって、外来タンパク質を第１の骨格タンパク質の外来タンパク質結合ドメインに結合保持させるには、上記水性媒体を攪拌することが好ましい。攪拌により、両者の接触確率が向上するからである。
【００９０】
（回収工程）
外来タンパク質が細胞表層に結合された酵母を回収するには、水性媒体を公知の固液分離手段により固液分離して菌体画分を回収すればよい。例えば、遠心分離によりペレットとしてセルラーゼ等が保持された微生物を回収することができる。
【００９１】
本発明の外来タンパク質表層保持酵母の作製方法は、以上のとおりの形態で実施することができる。このため、上記したとおり、新たなセルラーゼを備える固相担体を提供するとともに、微生物のセルロース分解能を容易に調節することができる。
【００９２】
なお、本発明の外来タンパク質表層保持酵母の作製方法に関し、既に説明した、外来タンパク質保持用酵母、外来タンパク質表層保持酵母、外来タンパク質について既に説明した各種の態様を、適用することができる。
【００９３】
（セルロースの分解方法）
本発明のセルロースの分解方法は、セルロース系材料のセルロースと、セルラーゼを外来タンパク質として表層保持する本発明の外来タンパク質表層保持酵母と、を接触させて、前記セルラーゼにより前記セルロースを分解する工程、を備えることができる。この分解方法によれば、セルラーゼの高い活性を発揮できる酵母が効率的にセルロースを分解できる。さらに、セルロースの分解産物を酵母が利用して増殖や発酵が可能である。
【００９４】
セルロース系材料とセルラーゼを保持する酵母とを接触させる方法は、特に限定しない。酵母及びセルラーゼの活性が維持できる状態であればよい。したがって、酵母の増殖又は発酵条件及びセルラーゼの至適ｐＨ、至適温度等を考慮して適宜決定される。また、分解対象であるセルロース系材料の形態は特に限定しないが、分解しようとするセルロース系材料の形態に応じて、酵母が保持するセルラーゼ及びその組み合わせが適宜選択される。なお、本発明の分解方法に関し、既に説明した、外来タンパク質保持用酵母、外来タンパク質表層保持酵母、セルロース系材料及びセルラーゼについて既に説明した各種の態様を、適用することができる。
【００９５】
（セルロースを利用する有用物質の生産方法）
本発明のセルロースを利用する有用物質を生産方法は、セルロース系材料中のセルロースとセルラーゼを保持する本発明の外来タンパク質表層保持酵母とを接触させて、前記セルロースを分解する工程と、前記セルラーゼによって分解されたセルロース分解産物を前記酵母によって資化し有用物質に変換する工程と、を備えることができる。
【００９６】
この生産方法によれば、セルロース系材料中のセルロースを酵母の表層に結合保持されたセルラーゼが分解するとともに、その分解産物をその酵母が資化して有用物質に変換することができる。このため、効率的にセルロースを利用することができる。特に、従来セルロースを直接利用困難であった酵母が、セルロースを利用して有用物質に変換することができるようになる。なお、本発明の生産方法に関し、既に説明した、外来タンパク質保持用酵母、外来タンパク質表層保持酵母、セルロース系材料及びセルラーゼ並びにセルロースの分解について既に説明した各種の態様を、適用することができる。
【００９７】
本発明の生産方法においては、前記細胞として、エタノール生産微生物とすることが好ましい。エタノール生産微生物であれば、セルロース系材料から燃料としても有用であるエタノールを直接生産することができる。また、前記細胞として乳酸などの有機酸生産微生物としてもよい。
【００９８】
なお、分解工程〜変換工程は、利用するセルロース系材料及び細胞や変換する有用物質の種類に応じて実施すればよい。すなわち、当該有用物質を生産する微生物等の細胞及び当該有用物質に応じて実施すればよい。例えば、エタノール等の有用物質への変換等のための発酵工程は、以下のようにして実施できる。培地としては、炭素源として上記セルロース系材料のほか、炭素源の一部としてセルロース又はセルロースから分解酵素により生成されるオリゴ糖類又は単糖類を添加することができる。こうすることで、特に培養開始時から培養初期において微生物に効果的に資化可能な単糖類を供給できる。なお、糖類は、分解酵素を抑制しない程度に添加され、好ましくは培養開始時から培養初期（培養開始から２〜１０時間以内程度）まで一定期間にのみ糖類を添加するようにする。窒素源及び無機塩類としては、公知のものを適宜選択して利用することができる。
【００９９】
なお、培養は、静置培養、振とう培養または通気攪拌培養等を用いることができる。通気条件は、嫌気条件下、微好気条件下及び好気条件等、適宜選択することができる。培養温度も、特に限定しないが、２５℃〜５５℃等の範囲とすることができる。また、培養時間も必要に応じて設定されるが、６〜１５０時間程度とすることができる。また、ｐＨの調整は、無機あるいは有機酸、アルカリ溶液等を用いて行うことができる。培養中は、必要に応じてアンピシリン、テトラサイクリンなどの抗生物質を培地に添加することができる。なお、変換工程終了後、培養液から微生物を除去してエタノール等の有用物質含有画分を回収する工程、さらにこれを濃縮する工程を実施してもよい。
【０１００】
有用物質としては特に限定しないが、グルコースを利用して微生物が生成可能なものが好ましい。例えば、エタノールなどの低級アルコール、イソプレノド合成経路の追加によるファインケミカル（コエンザイムＱ１０、ビタミン及びその原料等）、解糖系の改変によるグリセリン、プラスチック・化成品原料など、バイオリファイナリー技術が対象とする材料が挙げられる。なお、グルコースを利用する微生物としては、特に限定しないが、例えば、グルコースからの代謝系の１種又は２種以上の酵素を遺伝子組換えにより置換、追加等して本来の代謝物でない化合物を産生可能に改変したものであってもよい。
【０１０１】
以下、本発明を、実施例を挙げて具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲内において、種々なる形態で実施することができる。
【実施例１】
【０１０２】
（タイプIIコヘシンを含む第２の骨格タンパク質発現用ベクターの構築及び当該ベクターによる形質転換）
本実施例では、図２に示すベクター構成図に基づいて、タイプIIコヘシンを含む第２の骨格タンパク質を細胞表層提示させるための染色体導入型ベクターを構築し、酵母を形質転換した。なお、Ｎ末端側にはＨｉｓタグを備えた第２のタンパク質が発現されるようになっている。
【０１０３】
C.thermocellum由来のSdb遺伝子の塩基配列に基づいて、ＰＣＲ法によりTypeIIコヘシン領域1個を含むＤＮＡ断片（配列番号２２）を増幅断片として取得した。また、同様にＰＣＲ法により、Orf2遺伝子の塩基配列に基づいてTypeIIコヘシン領域2個を含むＤＮＡ断片（配列番号２３）を、それぞれ増幅断片として取得した。それぞれの増幅断片を、制限酵素BglII-XhoI部位を用いて表層提示を行うためのSAG1、Rhizopus Oryzae由来グルコアミラーゼのシグナルペプチドと融合化し、HOR7プロモーター、SAG１ターミネーターを持つプラスミドに導入しpDL-HOR7p-T2Coh, pDL-HOR7p-T2Coh2とした。これらのプラスミドからそれぞれ取得される、ＨＯＲ７プロモーター以下ＳＡＧ１ターミネーターまでの断片（Ｓｄｂ由来及びＯｒｆ２由来）を、相同組み換え領域Leu2U,Leu2D、マーカーとしてTrpを持つプラスミドに導入した。Ｓｄｂ由来断片を保持するプラスミドを、Sse8387Iで切断して断片化した後、サッカロマイセス・セレビジエＢＪ５４６５株に常法により導入して形質転換体ＢＪ０１０株を得た。また、Ｏｒｆ２由来断片を保持するプラスミドを、Sse8387Iで切断して断片化した後、サッカロマイセス・セレビジエＥＢＹ１００株に常法により導入して形質転換体ＥＢＹ０２０株を得た。
【実施例２】
【０１０４】
（形質転換体における第２の骨格タンパク質発現）
本実施例では、第２の骨格タンパク質を発現するためのベクターを構築するとともに実施例１で取得した形質転換体をＹＮＢ＋０．５％カザミノ酸＋２％グルコース培地を用いて３０℃で培養し、ＯＤ６００＝２を超えたところで集菌後、ＯＤ６００＝０．５となるようにＹＮＢ＋０．５％カザミノ酸＋２％ガラクトース培地に植菌し、３０℃、４８時間誘導発現を行った。その後、ＯＤ６００＝１の１ｍｌの菌体を、ＰＢＳ１ｍｌで洗浄し、１２５μｌのＰＢＳに懸濁した。この懸濁液に、一次抗体として抗Ｈｉｓ−ｔａｇ抗体０．５μｇとＢＳＡ最終濃度１ｍｇ／ｍｌとを添加し、氷中３０分静置し、時々懸濁を行った。次に遠心後、ＰＢＳ１ｍｌで洗浄を行い１２５μｌのＰＢＳに懸濁し、二次抗体としてＣｙ５標識の抗ＩｇＧ抗体０．５μｇとＢＳＡ最終濃度１ｍｇ／ｍｌとを添加し、氷中３０分静置し、時々懸濁を行った。その後、遠心し、ＰＢＳ１ｍｌで洗浄して５０μｌのＰＢＳで懸濁後、蛍光顕微鏡にてＣｙ５の蛍光を測定した。その結果を図３に示す。
【０１０５】
図３に示すように、いずれの形質転換体にも、蛍光が認められた。このことから、各遺伝子断片がコードする第２の骨格タンパク質はそれぞれ形質転換体において細胞表層で発現していることを確認できた。
【実施例３】
【０１０６】
（第１の骨格タンパク質発現ベクターの構築）
（ＣＢＤとコヘシン４個の発現ベクター（ｐＹＤ−４Ｃｏｈベクター）の構築）
まず、ガラクトース誘導下に第１の骨格タンパク質を発現するｐＹＤ５ベクター（図４）を構築した。Ｃｔ ＡＴＣＣ２７４０５からゲノムを抽出した。タイプＩスキャホールディンタンパク質であるＣｉｐＡタンパク質をコードするＣｉｐＡ遺伝子（ＮＣＢＩのホームページ、アクセッション番号：Ｌ０８６６５）（図５参照）の塩基配列に基づき、ＣＢＤ（セルロース結合ドメイン）＋タイプＩコヘシン４個を含む断片（配列番号２４）を化学合成した。このＤＮＡ断片を、ｐＹＤ１のＫｐｎＩ−ＸｈｏＩ部位に導入した。これを鋳型として、ＮｈｅＩ、Ｘｈｏ１を両端に保持するように以下のプライマー（配列番号２５、２６）で増幅し、ｐＹＤ５ベクターの同部位に導入しｐＹＤ−４Ｃｏｈベクターを得た（図４参照）。
Coh4-Nhe:acgtagctagcgttttagcagctggtgcaaatacaccggtatcaggcaatttgaaggttg（配列番号２５）
Coh4-Xho:cttaccttcgaagggccctctagactcg（配列番号２６）
【０１０７】
（ＣＢＤ＋コヘシン４個＋リンカー部＋タイプIIドックリン）の発現ベクター（ｐＹＤ５−ＬＤｏｃIベクター）の構築
次に、Ｃｔ ＡＴＣＣ２７４０５のＣｉｐＡ遺伝子のＣＢＤからＣ末端までの領域（タイプIIドックリンを含む）を以下のプライマーでゲノムからＰＣＲ法で増幅断片として取得し、ＴＯＰＯ ＢｕｎｔＩＩベクター（Invitorogen）にクローニングし、ＴＯＰＯ−ＣｉｐＡベクターを得た。
CBD-AGA:acgtaggtaccagcaaatacaccggtatcaggcaatttgaaggttgaattct（配列番号２７）
CT-cipA-R:acgtactcgagctgtgcgtcgtaatcacttgatgtagctcc（配列番号２８）
【０１０８】
ｐＹＤ−４Ｃｏｈを鋳型として、以下のプライマー(配列番号２９、３０)を用いてＰＣＲ法によりリンカー部（Ｇ４Ｓ３）を含むＤＮＡ断片を得た。また、ＴＯＰＯ−ＣｉｐＡを鋳型として、以下のプライマー（配列番号３１、３２）を用いてＰＣＲ法により、増幅断片としてタイプIIドックリン領域を含むＤＮＡ断片を得た。これらの各増幅断片を、それぞれ配列番号２９及び配列番号３２のプライマーで増幅して、リンカー部とタイプIIドックリンとを含むＤＮＡ断片を増幅断片として得た。この増幅断片をＸｈｏＩ及びＰｍｅＩで処理して得られたＤＮＡ断片を、ｐＹＤ−４Ｃｏｈを同一制限酵素で処理して得られたＸｈｏＩ−ＰｍｅＩ部位に導入して、ｐＹＤ５−ＬＤｏｃIIベクターを得た（図６参照）。
pYD5-D2-1:tttgacggtggagtaaatgttggagatctc（配列番号２９）
pYD5-D2-2:
tagaattgtctttcactatgtctccagaaccaccaccaccagatccaccaccaccagaaccaccaccacccgtagaatcgag
（配列番号３０）
pYD5-D2-3: ggagacatagtgaaagacaattcta（配列番号３１）
pYD5-D2-4: gggacgtagggtttaaacttactgtgcgtcgtaatcacttgat（配列番号３２）
【０１０９】
（ＣＢＤ＋コヘシン４個＋Ｘドメイン＋タイプIIドックリン）の発現ベクター（ｐＹＤ５−ＸＤｏｃIベクター）の構築
ＴＯＰＯ−ＣｉｐＡベクターを鋳型として、配列番号３２のプライマー及び以下のプライマー（配列番号３３）を用いて、ＰＣＲ法により増幅断片として、ＸドメインとタイプIIドックリンを含むＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片をＸｈｏＩ及びＰｍｅＩで処理して得られた断片を、ｐＹＤ−４Ｃｏｈを同一制限酵素で処理して得られたＸｈｏＩ−ＰｍｅＩ部位に導入して、ｐＹＤ５−ＸＤｏｃIIベクターとした（図７参照）。
XDoc-Xho:acgtactcgagcctgtaatagaaggatataaagtatccgga(配列番号３３)
【実施例４】
【０１１０】
（第１の骨格タンパク質及び第２の骨格タンパク質を発現する酵母の作製及びセルロースの分解）
実施例３で作製した第１の骨格タンパク質発現ベクターを実施例１で作製した２種類の第２の骨格タンパク質提示酵母に導入して、Ｘドメインを含む第２の骨格タンパク質を発現する酵母（Ｓｄｂ＋ＸＤＯＣII、Ｏｒｆ２＋XＤｏｃII）と、Ｘドメインを含まない第２の骨格タンパク質を発現する酵母（Ｓｄｂ＋ＬＤＯＣII、Ｏｒｆ２＋ＬＤｏｃII）とを作製した。ＹＮＢ＋０．５％カザミノ酸＋２％ガラクトース培地に植菌し、３０℃、４８時間培養して誘導発現を行った。
【０１１１】
第１の骨格タンパク質及び第２の骨格タンパク質が発現された酵母に対し、無細胞系で合成したＣｔ由来のエンドグルカナーゼであるＣｅｌＡを添加することにより取得した酵母のセルラーゼ活性を測定した。セルラーゼ活性は次のようにして測定した。
【０１１２】
エンドグルカナーゼＣｅｌＡを供給して骨格タンパク質の機能を確認した。ＣＢＤ＋タイプＩコヘシン１個提示酵母ＯＤ６００＝５，１ｍｌを用いて２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０，１０ｍＭ ＣａＣｌ２で洗浄後、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０，０．１５Ｍ ＮａＣｌ，１０ｍＭ ＣａＣｌ2，１０ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ溶液で４℃，１ｈｒブロッキング操作を行い、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０，０．１Ｍ ＮａＣｌ，１０ｍＭＣａＣｌ２，０．０５％ｔｗｅｅｎ２０ 溶液で３回洗浄後、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０，０．１５Ｍ ＮａＣｌ，１０ｍＭ ＣａＣｌ２，１０ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ溶液中でＣｅｌＡ無細胞合成液５０μｌと混合、４℃，１時間反応を行った。次に２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０，０．１Ｍ ＮａＣｌ，１０ｍＭＣａＣｌ２，０．０５％ｔｗｅｅｎ２０溶液で４回洗浄を行い、ＣｅｌＡが結合した酵母を１％ＣＭＣ，２０ｍＭ 酢酸緩衝液ｐＨ６．０，１０ｍＭ ＣａＣｌ２溶液に混合し、６０℃で反応を行った。この反応液につき、ＴＺ−アッセイ法にてＣＭＣ分解活性を測定した。これらの結果を図８に示す。
【０１１３】
図８に示すように、コヘシンとＸドメインとタイプIIドックリンを含む第１の骨格タンパク質を発現する酵母（Ｓｄｂ＋ＸＤｏｃII及びＯｒｆ２＋ＸＤｏｃII）は、そうでない酵母に対して優れたＣＭＣ分解活性を呈した。また、第２の骨格タンパク質が備えるタイプIIコヘシン数を１個から２個に増加することでもＣＭＣ活性が向上したが、Ｘドメインを含むことにより増大したＣＭＣ活性より少ない上昇量であった。
【０１１４】
以上のことから、第１の骨格タンパク質及び第２の骨格タンパク質を酵母表層に発現させて足場を形成して、外来タンパク質を酵母表層に保持することにより、表層において外来タンパク質の高い活性を発揮する酵母を提供できることがわかった。
【配列表フリーテキスト】
【０１１５】
配列番号２５〜３３：プライマー
【図面の簡単な説明】
【０１１６】
【図１】本発明の酵母の一例の概要を示す図である。
【図２】第２の骨格タンパク質の表層提示用の染色体導入型ベクターを示す図である。
【図３】第２の骨格タンパク質の表層提示用の染色体導入型ベクターを用いて形質転換した酵母の蛍光染色結果を示す図である。
【図４】タンパク質結合ドメインを有する第１の骨格タンパク質を発現するベクターを示す図である。
【図５】ＣｉｐＡ遺伝子の構造を示す図である。
【図６】タンパク質結合ドメインとタイプIIドックリンドメインとを有する第１の骨格タンパク質を発現するベクターを示す図である。
【図７】タンパク質結合ドメインとタイプIIドックリンドメインとＸドメインとを有する第１の骨格タンパク質を発現するベクターを示す図である。
【図８】4種類の酵母によるグルコース分解活性を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
外来タンパク質を細胞表層に保持するための酵母であって、
以下の３つのドメイン；
（ａ）セルロソームのタイプＩスキャホールディンタンパク質のタイプIコヘシンドメイン由来の外来タンパク質結合ドメイン、
（ｂ）前記タイプＩスキャホールディンタンパク質のタイプIIドックリンドメイン由来の第２の骨格タンパク質結合ドメイン、及び
（ｃ）前記タイプＩスキャホールディンタンパク質の前記タイプIIドックリンドメインに隣接する配列番号１に記載のアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と９０％以上の同一性のアミノ酸配列からなるドメイン、
を含む第１の骨格タンパク質と、
セルロソームのタイプIIスキャホールディンタンパク質のタイプIIコヘシンドメイン由来の第１の骨格タンパク質結合ドメインを含む第２の骨格タンパク質と、
を備え、
前記第２の骨格タンパク質は、前記酵母の細胞表層に保持され、
前記第１の骨格タンパク質は、前記第２の骨格タンパク質を介して前記酵母表層に結合されている、酵母。
【請求項２】
前記骨１の骨格タンパク質は、さらに、セルロース結合ドメインを含む、請求項１に記載の酵母。
【請求項３】
前記第１の骨格タンパク質の前記（ａ）のドメイン、前記（ｂ）のドメイン及び前記（ｃ）のドメインは、それぞれ、クロストリジウム・サーモセラム（Clostridium thermocellum）のセルロソームのタイプIスキャホールディンタンパク質に由来する、請求項１又は２に記載の酵母。
【請求項４】
前記第１の骨格タンパク質は、３個以上の前記（ａ）のドメインを備える、請求項１〜３のいずれかに記載の酵母。
【請求項５】
前記第１の骨格タンパク質は、４個以上７個以下の前記（ａ）のドメインを備える、請求項１〜４のいずれかに記載の酵母。
【請求項６】
前記第１の骨格タンパク質を細胞外に分泌する、請求項１〜５のいずれかに記載の酵母。
【請求項７】
前記第２の骨格タンパク質は、前記第１の骨格タンパク質結合ドメインを複数個タンデムに有している、請求項１〜６のいずれかに記載の酵母。
【請求項８】
前記第２の骨格タンパク質は、クロストリジウム・サーモセラム（Clostridium thermocellum）のセルロソームのタイプIIスキャホールディンタンパク質に由来する、請求項７に記載の酵母。
【請求項９】
前記第２の骨格タンパク質を細胞表層提示する、請求項１〜８のいずれかに記載の酵母。
【請求項１０】
前記（ａ）のドメインは、セルロースを分解する酵素群から選択される１腫又は２種以上を結合可能である、請求項１〜９のいずれかに記載の酵母。
【請求項１１】
細胞表層に外来タンパク質を保持する酵母であって、
以下の３つのドメイン；
（ａ）セルロソームのタイプＩスキャホールディンタンパク質のタイプIコヘシンドメイン由来の前記外来タンパク質結合ドメイン、
（ｂ）前記タイプＩスキャホールディンタンパク質のタイプIIドックリンドメイン由来の第２の骨格タンパク質結合ドメイン、及び
（ｃ）前記タイプＩスキャホールディンタンパク質の前記タイプIIドックリンドメインに隣接する配列番号１に記載のアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と９０％以上の同一性のアミノ酸配列からなるドメイン、
を含む第１の骨格タンパク質と、
セルロソームのタイプIIスキャホールディンタンパク質由来のタイプIIコヘシンドメイン由来の第１の骨格タンパク質結合ドメインを含む第２の骨格タンパク質と、
を備え、
前記第２の骨格タンパク質は、前記酵母の細胞表層に保持され、
前記第１の骨格タンパク質は、前記第２の骨格タンパク質を介して前記酵母表層に結合されている、酵母。
【請求項１２】
前記外来タンパク質は、セルロースを分解する酵素群から選択される１種又は２種以上である、請求１１に記載の酵母。
【請求項１３】
前記外来タンパク質は、少なくともβ−グルコシダーゼ、エンドグルカナーゼ及びセロビオヒドロラーゼからなる群から選択される２種以上を含む、請求項１２に記載の酵母。
【請求項１４】
前記外来タンパク質の生産能を有していない、請求項１１〜１３のいずれかに記載の酵母。
【請求項１５】
請求項１１〜１４のいずれかに記載の外来タンパク質を細胞表層に保持するための酵母の作製方法であって、
請求項１〜１３のいずれかに記載の酵母であって、前記外来タンパク質を結合可能な前記（ａ）のドメインを備える酵母を準備する工程と、
前記外来タンパク質を前記酵母の外部から供給して、前記酵母の細胞表層側に前記外来タンパク質を保持させる工程と、
を備える、作製方法。
【請求項１６】
前記外来タンパク質は、セルロースを分解する酵素群から選択される１又は２種以上である、請求項１５に記載の製造方法。
【請求項１７】
セルロースの分解方法であって、
セルロース系材料中のセルロースと、
細胞表層に外来タンパク質を保持する酵母であって、
以下の３つのドメイン；
（ａ）セルロソームのタイプＩスキャホールディンタンパク質のタイプIコヘシンドメイン由来の前記外来タンパク質結合ドメイン、
（ｂ）前記タイプＩスキャホールディンタンパク質のタイプIIドックリンドメイン由来の第２の骨格タンパク質結合ドメイン、及び
（ｃ）前記タイプＩスキャホールディンタンパク質の前記タイプIIドックリンドメインに隣接する配列番号１に記載のアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と９０％以上の同一性のアミノ酸配列からなるドメイン、
を含む第１の骨格タンパク質と、
セルロソームのタイプIIスキャホールディンタンパク質由来のタイプIIコヘシンドメイン由来の第１の骨格タンパク質結合ドメインを含む第２の骨格タンパク質と、
を備え、
前記第２の骨格タンパク質は、前記酵母の細胞表層に保持され、
前記第１の骨格タンパク質は、前記第２の骨格タンパク質を介して前記酵母表層に結合されており、
前記外来タンパク質は、セルロースを分解する酵素群から選択される１種又は２種以上の酵素である酵母と、
を接触させて、前記酵素によりセルロースを分解する工程、
を備える、分解方法。
【請求項１８】
セルロースを利用する有用物質の生産方法であって
セルロース系材料中のセルロースと、
細胞表層に外来タンパク質を保持する酵母であって、
以下の３つのドメイン；
（ａ）セルロソームのタイプＩスキャホールディンタンパク質のタイプIコヘシンドメイン由来の前記外来タンパク質結合ドメイン、
（ｂ）前記タイプＩスキャホールディンタンパク質のタイプIIドックリンドメイン由来の第２の骨格タンパク質結合ドメイン、及び
（ｃ）前記タイプＩスキャホールディンタンパク質の前記タイプIIドックリンドメインに隣接する配列番号１に記載のアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と９０％以上の同一性のアミノ酸配列からなるドメイン、
を含む第１の骨格タンパク質と、
セルロソームのタイプIIスキャホールディンタンパク質由来のタイプIIコヘシンドメイン由来の第１の骨格タンパク質結合ドメインを含む第２の骨格タンパク質と、
を備え、
前記第２の骨格タンパク質は、前記酵母の細胞表層に保持され、
前記第１の骨格タンパク質は、前記第２の骨格タンパク質を介して前記酵母表層に結合されており、
前記外来タンパク質は、セルロースを分解する酵素群から選択される１種又は２種以上の酵素である酵母と、
を接触させて、前記酵素によりセルロースを分解する工程と、
前記酵素によって得られるセルロース分解産物を前記酵母によって資化し有用物質に変換する工程と、
を備える、生産方法。
【請求項１】
外来タンパク質を細胞表層に保持するための酵母であって、
以下の３つのドメイン；
（ａ）セルロソームのタイプＩスキャホールディンタンパク質のタイプIコヘシンドメイン由来の外来タンパク質結合ドメイン、
（ｂ）前記タイプＩスキャホールディンタンパク質のタイプIIドックリンドメイン由来の第２の骨格タンパク質結合ドメイン、及び
（ｃ）前記タイプＩスキャホールディンタンパク質の前記タイプIIドックリンドメインに隣接する配列番号１に記載のアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と９０％以上の同一性のアミノ酸配列からなるドメイン、
を含む第１の骨格タンパク質と、
セルロソームのタイプIIスキャホールディンタンパク質のタイプIIコヘシンドメイン由来の第１の骨格タンパク質結合ドメインを含む第２の骨格タンパク質と、
を備え、
前記第２の骨格タンパク質は、前記酵母の細胞表層に保持され、
前記第１の骨格タンパク質は、前記第２の骨格タンパク質を介して前記酵母表層に結合されている、酵母。
【請求項２】
前記骨１の骨格タンパク質は、さらに、セルロース結合ドメインを含む、請求項１に記載の酵母。
【請求項３】
前記第１の骨格タンパク質の前記（ａ）のドメイン、前記（ｂ）のドメイン及び前記（ｃ）のドメインは、それぞれ、クロストリジウム・サーモセラム（Clostridium thermocellum）のセルロソームのタイプIスキャホールディンタンパク質に由来する、請求項１又は２に記載の酵母。
【請求項４】
前記第１の骨格タンパク質は、３個以上の前記（ａ）のドメインを備える、請求項１〜３のいずれかに記載の酵母。
【請求項５】
前記第１の骨格タンパク質は、４個以上７個以下の前記（ａ）のドメインを備える、請求項１〜４のいずれかに記載の酵母。
【請求項６】
前記第１の骨格タンパク質を細胞外に分泌する、請求項１〜５のいずれかに記載の酵母。
【請求項７】
前記第２の骨格タンパク質は、前記第１の骨格タンパク質結合ドメインを複数個タンデムに有している、請求項１〜６のいずれかに記載の酵母。
【請求項８】
前記第２の骨格タンパク質は、クロストリジウム・サーモセラム（Clostridium thermocellum）のセルロソームのタイプIIスキャホールディンタンパク質に由来する、請求項７に記載の酵母。
【請求項９】
前記第２の骨格タンパク質を細胞表層提示する、請求項１〜８のいずれかに記載の酵母。
【請求項１０】
前記（ａ）のドメインは、セルロースを分解する酵素群から選択される１腫又は２種以上を結合可能である、請求項１〜９のいずれかに記載の酵母。
【請求項１１】
細胞表層に外来タンパク質を保持する酵母であって、
以下の３つのドメイン；
（ａ）セルロソームのタイプＩスキャホールディンタンパク質のタイプIコヘシンドメイン由来の前記外来タンパク質結合ドメイン、
（ｂ）前記タイプＩスキャホールディンタンパク質のタイプIIドックリンドメイン由来の第２の骨格タンパク質結合ドメイン、及び
（ｃ）前記タイプＩスキャホールディンタンパク質の前記タイプIIドックリンドメインに隣接する配列番号１に記載のアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と９０％以上の同一性のアミノ酸配列からなるドメイン、
を含む第１の骨格タンパク質と、
セルロソームのタイプIIスキャホールディンタンパク質由来のタイプIIコヘシンドメイン由来の第１の骨格タンパク質結合ドメインを含む第２の骨格タンパク質と、
を備え、
前記第２の骨格タンパク質は、前記酵母の細胞表層に保持され、
前記第１の骨格タンパク質は、前記第２の骨格タンパク質を介して前記酵母表層に結合されている、酵母。
【請求項１２】
前記外来タンパク質は、セルロースを分解する酵素群から選択される１種又は２種以上である、請求１１に記載の酵母。
【請求項１３】
前記外来タンパク質は、少なくともβ−グルコシダーゼ、エンドグルカナーゼ及びセロビオヒドロラーゼからなる群から選択される２種以上を含む、請求項１２に記載の酵母。
【請求項１４】
前記外来タンパク質の生産能を有していない、請求項１１〜１３のいずれかに記載の酵母。
【請求項１５】
請求項１１〜１４のいずれかに記載の外来タンパク質を細胞表層に保持するための酵母の作製方法であって、
請求項１〜１３のいずれかに記載の酵母であって、前記外来タンパク質を結合可能な前記（ａ）のドメインを備える酵母を準備する工程と、
前記外来タンパク質を前記酵母の外部から供給して、前記酵母の細胞表層側に前記外来タンパク質を保持させる工程と、
を備える、作製方法。
【請求項１６】
前記外来タンパク質は、セルロースを分解する酵素群から選択される１又は２種以上である、請求項１５に記載の製造方法。
【請求項１７】
セルロースの分解方法であって、
セルロース系材料中のセルロースと、
細胞表層に外来タンパク質を保持する酵母であって、
以下の３つのドメイン；
（ａ）セルロソームのタイプＩスキャホールディンタンパク質のタイプIコヘシンドメイン由来の前記外来タンパク質結合ドメイン、
（ｂ）前記タイプＩスキャホールディンタンパク質のタイプIIドックリンドメイン由来の第２の骨格タンパク質結合ドメイン、及び
（ｃ）前記タイプＩスキャホールディンタンパク質の前記タイプIIドックリンドメインに隣接する配列番号１に記載のアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と９０％以上の同一性のアミノ酸配列からなるドメイン、
を含む第１の骨格タンパク質と、
セルロソームのタイプIIスキャホールディンタンパク質由来のタイプIIコヘシンドメイン由来の第１の骨格タンパク質結合ドメインを含む第２の骨格タンパク質と、
を備え、
前記第２の骨格タンパク質は、前記酵母の細胞表層に保持され、
前記第１の骨格タンパク質は、前記第２の骨格タンパク質を介して前記酵母表層に結合されており、
前記外来タンパク質は、セルロースを分解する酵素群から選択される１種又は２種以上の酵素である酵母と、
を接触させて、前記酵素によりセルロースを分解する工程、
を備える、分解方法。
【請求項１８】
セルロースを利用する有用物質の生産方法であって
セルロース系材料中のセルロースと、
細胞表層に外来タンパク質を保持する酵母であって、
以下の３つのドメイン；
（ａ）セルロソームのタイプＩスキャホールディンタンパク質のタイプIコヘシンドメイン由来の前記外来タンパク質結合ドメイン、
（ｂ）前記タイプＩスキャホールディンタンパク質のタイプIIドックリンドメイン由来の第２の骨格タンパク質結合ドメイン、及び
（ｃ）前記タイプＩスキャホールディンタンパク質の前記タイプIIドックリンドメインに隣接する配列番号１に記載のアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と９０％以上の同一性のアミノ酸配列からなるドメイン、
を含む第１の骨格タンパク質と、
セルロソームのタイプIIスキャホールディンタンパク質由来のタイプIIコヘシンドメイン由来の第１の骨格タンパク質結合ドメインを含む第２の骨格タンパク質と、
を備え、
前記第２の骨格タンパク質は、前記酵母の細胞表層に保持され、
前記第１の骨格タンパク質は、前記第２の骨格タンパク質を介して前記酵母表層に結合されており、
前記外来タンパク質は、セルロースを分解する酵素群から選択される１種又は２種以上の酵素である酵母と、
を接触させて、前記酵素によりセルロースを分解する工程と、
前記酵素によって得られるセルロース分解産物を前記酵母によって資化し有用物質に変換する工程と、
を備える、生産方法。
【図２】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図１】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図１】
【図３】
【公開番号】特開２０１０−１４２１２５（Ｐ２０１０−１４２１２５Ａ）
【公開日】平成２２年７月１日（２０１０．７．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−３１９３７７（Ｐ２００８−３１９３７７）
【出願日】平成２０年１２月１６日（２００８．１２．１６）
【出願人】（０００００３６０９）株式会社豊田中央研究所 (4,200)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年７月１日（２０１０．７．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１２月１６日（２００８．１２．１６）
【出願人】（０００００３６０９）株式会社豊田中央研究所 (4,200)
【Ｆターム（参考）】
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