多光子レーザ顕微鏡法
【課題】共焦点レーザ走査顕微鏡によりもたらされるものに匹敵する視野分解能の深度を与え、更に、光漂白及び光の有毒性を減少させる。
【解決手段】レーザ走査顕微鏡は、３つ又はそれ以上の光子の同時吸収により、目的物における分子励起を生じさせて、内在的な３次元分解能をもたらす。短い波長領域における単一光子の吸収を有する蛍光体は、比較的長い波長領域のレーザ光による、強く結像されたサブピコ秒のパルスのビームにより励起させられる。蛍光体は、生きた細胞及び他の極微的な対象物の蛍光画像を作成するために、レーザ波長の約３分の１，４分の１又はそれより小さい分数でさえも吸収する。蛍光体からの蛍光放射は、励起強度とともに、３次的に，４次的に又はそれより大きな冪乗の法則で増大し、その結果、レーザ光を結像させることにより、光漂白のみならず、蛍光が焦点面の近傍に限定される。
【解決手段】レーザ走査顕微鏡は、３つ又はそれ以上の光子の同時吸収により、目的物における分子励起を生じさせて、内在的な３次元分解能をもたらす。短い波長領域における単一光子の吸収を有する蛍光体は、比較的長い波長領域のレーザ光による、強く結像されたサブピコ秒のパルスのビームにより励起させられる。蛍光体は、生きた細胞及び他の極微的な対象物の蛍光画像を作成するために、レーザ波長の約３分の１，４分の１又はそれより小さい分数でさえも吸収する。蛍光体からの蛍光放射は、励起強度とともに、３次的に，４次的に又はそれより大きな冪乗の法則で増大し、その結果、レーザ光を結像させることにより、光漂白のみならず、蛍光が焦点面の近傍に限定される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、３つ又はそれ以上の光子の同時吸収により、目的物における分子の励起をもたらすレーザ顕微鏡検査技術に関する。本発明は、デンク（Ｄｅｎｋ）等により米国特許第５，０３４，６１３号（以下、’６１３号特許という）に開示された２光子レーザ顕微鏡における改良であり、また、この特許は、引用することにより、ここに組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
上記’６１３号特許は、内在的な３次元分解能をもたらすべく、２光子の同時吸収により目的物における分子の励起を生じさせるレーザ走査顕微鏡を開示している。短い（紫外線の又は可視の）波長帯域における単一光子吸収を有する蛍光体（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅｓ）は、強く結像されたサブピコ秒の比較的長い（赤色の又は赤外線の）波長帯域のレーザ光の流れにより励起させられる。上記蛍光体は、生きた細胞及び他の極微的な対象物の蛍光像をつくるために、約２分の１のレーザ波長を吸収する。上記蛍光体からの蛍光放射は、レーザ光を結像させることにより、蛍光及び光漂白が焦点面近傍に限定されるように、励起強度とともに２次的に増える。この特徴は、共焦点のレーザ走査顕微鏡により生じさせられたものに匹敵する視野分解能の深度を与え、その上、光漂白を減少させるものである。レーザ走査顕微鏡によるレーザビームの走査は、レーザビームを結像させることにより、また、そのビームをパルス時間で圧縮することにより得られる非常に高い励起強度についての必要条件を満たしながら、走査された対象物における各ポイントからの２光子の励起による蛍光を集めることにより、像の形成を可能とする。結像されたパルスは、また、かご閉じ込めエフェクタ分子（ｃａｇｅｄ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）の光分解の放出（ｐｈｏｔｏｌｙｔｉｃ ｒｅｌｅａｓｅ）において特に有用である、３次元空間的に解像される光化学をもたらす。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
上記’６１３号特許に開示された２光子レーザ顕微鏡検査技術についての欠点は、その適用が、有用なレーザ技術に限定されることである。特に、２光子技術は、その適用に従って、２光子のエネルギーレベルの合計が所望の蛍光放射を生じるのに必要とされる特定のエネルギーレベルをもたらすように、特定の波長におけるレーザの利用を要する。あいにく、幾らかのレーザ顕微鏡の適用は、現時点では技術的に実現不可能である波長を有するレーザの利用を要するであろう。例えば、アミノ酸及び核酸のような、非常に短い波長の吸収を有する発色団（ｃｈｒｏｍｏｐｈｏｒｅｓ）の励起は、上記２光子技術を用いて、５４０ｎｍの波長を有するレーザを要することとなるが、現時点では、かかるレーザは存在しない。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、レーザ走査蛍光顕微鏡検査に、また、マイクロ薬理学（ｍｉｃｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ）についてのかご閉じ込め試薬の活性化、及び、光学的な３次元情報保存についてのポリマー架橋のような空間的に解像される光化学的な処理に、３つ又はそれ以上の光子の励起を適用することにより、前述した問題に対する解決法をもたらすことができる。
【０００５】
３光子に誘導される蛍光が、励起強度に対する三次的な依存性に従う一方、４光子による励起が、四次的な依存性に従うため、両方はレーザ走査顕微鏡において内在的な３次元分解能をもたらす。たとえ、かかる３次元分解能が、上記’６１３号特許に開示された２光子レーザ顕微鏡に基づく非線形の顕微鏡検査技術により既に実現されるものでも、３つの光子の励起が、通常では紫外帯域（２３０〜３５０ｎｍ）において励起可能である分子を近赤外光（７００〜１１００ｎｍ）で励起させることは稀である。アミノ酸トリプトファン（ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ）及びチロシン（ｔｙｒｏｓｉｎｅ）、神経伝達物質であるセロトニン（ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ）及び核酸のような興味あるバイオ分子は、約２６０〜２８０ｎｍにおける１光子吸収ピークを有しており、これらのバイオ分子では、３つ及び４つの光子の励起により、蛍光が励起され得る。赤外光に近い長波長を用いる利点は、生きた細胞への光によるダメージがおそらく少ないことや深い紫外線吸収体について好都合に適用し得る固体状態のフェムト秒のレーザ源である。実際には、３光子レーザ走査顕微鏡の構成は、既存する２光子システムと同様である。しかしながら、３光子及び２光子の吸収スペクトルは、全体として、まったく異なるので、２光子及び３光子が励起される蛍光顕微鏡検査法の組み合わせは、２光子顕微鏡において一般に採用されているレーザシステムの有効範囲を拡張する。
【０００６】
３つ若しくはそれ以上の光子の励起の特に有効な適用は、２００ｎｍ程度の波長の吸収を要するある適用について、エキシマレーザを取り替えることである。よりずっと長い波長（つまり５５０〜９００ｎｍ）を発するレーザによる３つ及び４つの光子の励起は、同様のエネルギー吸収をもたらし、その上、３次元空間分解能をもたらすものである。エキシマレーザは、極めて高価であり、ユーザに身近なものでないため、幾つかの光子の励起が、非常に望ましいかも知れない。
【０００７】
提案される３光子顕微鏡検査の実用性は、種々の蛍光体及びバイオ分子（ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅ）の３光子の蛍光励起断面積に極めて重大に依存する。しかしながら、３光子の吸収断面積が報告されたことはほとんどない。摂動論に基づく簡単な計算は、３光子の励起が、匹敵する励起のレベルを実現するために、典型的には、２光子励起技術で一般に用いられるピーク強度の＜１０倍を要することをあらわしている。この必要とされる強度レベルが、モードロック式のＴｉ：サファイアレーザのようなフェムト秒のレーザ源により容易に手に入れることができる。モデロック式のＴｉ：サファイアレーザを用いて、トリプトファン（ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ）及びセロトニン（ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ）の３光子に導かれる蛍光は、約８００と９００ｎｍとの間にある励起波長において観察される。測定される蛍光は、期待された励起強度に対する３次的な法則の依存性に従う。カルシウム指示薬（ｉｎｄｃａｔｏｒ）の蛍光パワーの測定法は、期待された３光子励起の最適条件よりもかなり下の励起波長（約９１１ｎｍ）でのフラ−２（Ｆｕｒａ−ＩＩ）を着色し、満足な蛍光画像が、最適な励起波長（約７３０ｎｍ）でのフラ−２の２光子励起に必要とされるレーザパワーのわずか〜５倍で取得し得るべきであることが示されている。これらの予備結果から概算される３光子蛍光励起断面積は、３光子レーザ走査顕微鏡検査法が、適度なレベルの励起パワーを用いて行われることを示している。このアプローチがどれほど広く適用可能であるかは、決定されなければならない。４光子励起は、約１０００ｎｍより上の水（ｗａｔｅｒ）による強い１光子吸収のオンセット（ｏｎｓｅｔ）によって制限され得る。
【０００８】
３つ又はそれ以上の光子のプロセスによる蛍光の分子励起の研究は、その励起断面積が相当小さいものであると予期されるので、稀である。その結果、励起の有効なレートは、通常、非常に高い瞬間照明強度を要する。多光子断面積の簡単な補外（ｅｘｔｒａｐｏｌａｔｉｏｎ）としては、放射電磁界による分子励起に関した双極子遷移確率の量子力学の摂動論の解における、マトリックス素子のパターンの積が考えられる。基本的には、多光子プロセスは、分子と相互作用するために、（分子の断面領域、Ａ〜１０−１６ｃｍ２の範囲内で、また同時に、中間状態の寿命により決定される時間間隔、δτ〜１０−１６ｓの範囲内で）３つ又はそれ以上の光子を要する。この短い一致時間は、摂動論のエネルギー分母から導出される大きなエネルギーの不確定性により制限される。
【０００９】
幾つかの光子による蛍光励起は、（与えられた蛍光体についての）長い方の励起波長が、１光子ポイント拡張関数を複数の光子のプロセスに関するパワーｎに引き上げることにより増大させられるのと同じ程度で、分解能を減少させるので、レーザ顕微鏡検査法の分解能を著しく増大させることはない。それは、波長の因子に関するものでなく、３光子励起の分解能における増大は、本質的には、２光子顕微鏡に対して理想的な共焦点空間フィルタを付加することにより招来されるものと同様のものであろう。
【００１０】
意外にも大きな３光子の断面積についての近年のリポートは、（過度に明るい閃光から人間の視界を保護するための調節可能な遮光物を付与することを目的とした）光学的に制限のある吸収を向上させるための研究のうちに見い出される。最近では、約１０−７５ｃｍ６ｓ２の光子吸収断面積が、テトラヒドロフラン（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｕｒａｎ）における２，５−ベンゾチアゾ（ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏ）３，４−ジデシロキシ（ｄｉｄｅｃｙｌｏｘｙ）の吸収及び蛍光に関して報告されている。近年のまた別の実験は、共役有機ポリマーからの蛍光の３光子励起を示している。しかしながら、このプロセスは、ほとんどの蛍光励起とは異なった２つの励起状態を含むようにみえる。これらの実験の条件は、レーザ走査蛍光顕微鏡検査に若しくは大抵のマイクロ光化学にまったく適さないが、大きな断面積は約束される。しかしながら、かかる大きな断面積は、３つ又はそれ以上の光子の顕微鏡検査に不可欠ではないことに注意すべきである。
【００１１】
蛍光顕微鏡検査及びフォトマイクロ薬理学における生きた細胞への光によるダメージのレートの励起波長の依存性は、広くには知られておらず、異なる適用については大きく変化し得る。経験では、２光子励起が、匹敵する蛍光画像の認識についての１光子励起よりもはるかに少ないダメージを導くことが分かっている。励起に関して３つ又は４つの光子に増加することによって、改良が更に為され得るかどうかは明らかでない。このような知識及び非線形吸収スペクトルの知識の助けによって、将来、最良の励起モードが、個々のシステムについて決定され、利用されることが可能である。特に魅力のある可能性は、３光子励起及びそれに伴う蛍光信号の２光子励起による光化学を導き出すために、１つのレーザ波長を用いることである。３光子励起は、それを元に戻しそうにないことを除いて、まったく好ましいことに、既存の２光子励起技術を有効に向上させるように思われる。
【００１２】
代わりとして、極微的な光化学の活性，光切除及び光学的な手術（ｏｐｔｉｃａｌ ｓｕｒｇｅｒｙ）に関し、光の励起は、アミノ酸及び核酸のような非常に短い波長吸収体を有する内在的な発色団、若しくは同等の付加された発色団の多光子励起により、好適に実現され得る。多光子励起は、長波長でのサブピコ秒のパルスをもたらすより有用なレーザの選択、及び、光の励起が望まれる極微的な焦点体積への長波長光の伝達を可能とする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
さて、本発明の好適な実施の形態の詳細な説明については、図１は、３通りの検出方式を有する従来の走査顕微鏡を模式的に示している。サブピコ秒のパルス化されたレーザ源１２は、可動式ステージ又は他の適切な支持部材１５上に置かれた試料又は目的物の必然的な励起をもたらすものである。上記レーザ１２は、例えば、約８０ＭＨｚの繰り返し率で、１００ｆｓｅｃより短い持続期間を有するパルスとともに、約６３０ｎｍの、スペクトルの赤領域における波長を有する光のパルスを生じ得る、コライディング・パルス（ｃｏｌｌｉｄｉｎｇ ｐｕｌｓｅ）の、モード・ロック式の色素レーザ若しくは固体レーザであってよい。他の明るいパルスレーザもまた、例えば、その合計が試料における蛍光に必要とされる適切な吸収エネルギー帯域に匹敵するであろう必然的な励起の光子エネルギーを生じるように、赤外線の、若しくは赤色の領域における比較的長い異なる波長の光をもたらすために使用されてもよい。単一光子励起技術において、これらは３つ又は４つの光子励起について、それぞれ、入射光の波長の約３分の１、若しくは４分の１の波長を有するスペクトル領域における単一光子の吸収により励起されることになる。その結果、例えば、９４５ｎｍでの可視の赤色領域における３つの光子が、通常３１５ｎｍでの紫外線領域における光を吸収する蛍光を励起させるように協力する一方、１０７０ｎｍでの３つの光子が、可視光領域において、３５７ｎｍで吸収する分子を励起させることになる。
【００１４】
本発明の改良された態様では、単一波長レーザ１２が、入射光ビームが、高い瞬間パワーの、また、異なる波長の、２つ又はそれ以上の重ね合わせパルス光ビームからなるように、２つ又はそれ以上の異なる長波長のレーザ源に交換され得る。入射ビームの波長は、
１／λａｂｓ＝１／λ１＋１／λ２＋１／λ３
と表記され得る短い波長で吸収性のある蛍光を励起させるように選択される。ここで、λａｂｓは吸収体の短い波長であり、λ１，λ２及びλ３は、３つの波長のケースに場合についての、レーザの入射ビームの波長である。
【００１５】
上記レーザ１２は、１組みの発振ミラーを有するＸ−Ｙスキャナ１８により走査され、その後、接眼レンズ２０及び２２並びに対物レンズ２４により、焦点つまり焦点体積１９で試料１４上に結像される、パルス化された出力ビーム１６を生じる。対物レンズの背面口径（ｂａｃｋ ａｐｅｒｔｕｒｅ）は、走査されるビームについてのピボットポイントであり、その結果、収差を無視し、ラスターパターンにおける全ての点は、同等の画像形成条件を経験する。上記スキャナ１８は、試料１４を通じて、焦点つまり焦点体積１９の走査を行い、それによって、焦点つまり焦点体積１９での若しくはその近傍における試料１４の蛍光励起をもたらす。
【００１６】
上記出力ビーム１６は、上記Ｘ−Ｙスキャナ１８に指向させられる前に、分散補正及びパルス診断器の両方にかけられる。フェムト秒のパルス化された照明の問題の１つは分散である。短いパルスは、光学材料を通過する場合に、パルス化された帯域幅の互いに異なる周波数成分が、材料内で異なる速さで進むため、広がる傾向にある。光学材料についての分散補正は、約１２０ｆｓｅｃよりも大きいパルスにとって不可欠でない。なぜなら、これらのパルスが小さな周波数帯域幅（約４ｎｍ）を有し、その結果、広がりがほとんどないからである。しかしながら、７００ｎｍで、７０ｆｓｅｃのパルスは、良好な対物レンズにより約１．５倍に、ビーム変調及びシャッタに用いられ得る標準的な音響光学変調器によりそれ以上に広げられることが分かっている。パルスの広がりは、観察される蛍光の均整を減少させる。顕微鏡１０では、光学材料についての分散補正が、より高い（全体としてより遅い）周波数がより少ないガラスを通過して、その結果、固有の位相遅れに戻されるように、光を指向させる一対のガラスプリズム２６及び２８を二重に通過することにより達せられる。上記プリズム２６及び２８を通過してリターンさせるためには、全反射ミラー３０が用いられる。
【００１７】
量的な測定のために、励起ビームの波長及びパルス持続時間を知る必要があり、そのため、パルス化された出力ビーム１６を分析すべく、種々の態様のパルス診断器３２が提供される。波長及び持続時間の両方の大まかなモニタのためには、波長の測定値をもたらす、標準的な形態にある単一のモノクロメータが十分である。もし、出力のスリットが取り除かれ、その結果得られるスペクトルが、スクリーン又は１次元検出器へ送られれば、パルス波長帯域がモニタされ得る。より正確なパルス分析のために、上記パルス診断器３２は、直接的で詳細なパルス幅の測定及びその位相干渉の輪郭の指示を可能とする自己相関器（ａｕｔｏｃｏｒｒｅｌａｔｏｒ）を有してもよい。
【００１８】
レーザ顕微鏡１０は、また、３つの検出方式の各々について、蛍光通路を分離するために用いられる、第１，第２及び第３のダイクロックミラー３４，３６及び３８を有している。これらの方式の第１のものは、分離スキャンされた（ｄｅｓｃａｎｎｅｄ）共焦点検出方式として知られている。共焦点検出では、蛍光ビームが、共焦点光電子増倍管（ＰＭＴ）４２の前に配置されたピンホール絞り４０で静止画像面を形成するように、分離スキャンされる。走査におけるすべての位置で、標本において照射されるポイントは、検出器の面における開口部に対して結像する、若しくは共焦である。上記ピンホール絞り４０と第１のダイクロックミラー３４との間には、検出された信号から望ましくない周波数を除去するために、帯域放射フィルタ４４が配置されている。
【００１９】
第２の検出技術は、対物レンズの背面口径が、分離スキャンなしに、レンズ４６及び帯域放射フィルタ４８を介して、フーリエＰＭＴ５０上に結像されるフーリエ面検出方式として知られている。上記背面口径が走査においてピボットポイントであるため、蛍光のパターンは、光電陰極において定常である。
【００２０】
最後に、第３の検出技術は、試料１４における完全な焦点面が、上記帯域放射フィルタ５２及び結像レンズ５４を通じて、その認識速度がフレームの走査時間に同調させられるＣＣＤカメラのような画像形成検出器５６上に結像される、走査された画像形成検出方式として知られている。
【００２１】
検出方法の最初の選択は、既存の顕微鏡の構成により、若しくは設計された特定の実験に必要な顕微鏡検査方法により決められる。各検出方式の概要は、それ自身特有の長所及び短所を呈している。これら全ての検出方式の概要では、集光された蛍光が、適切に被覆されたダイクロックミラーにより抽出される。典型的には、励起波長と放射波長との間の差がストークスシフト（Ｓｔｏｋｅｓ ｓｈｉｆｔ）よりもずっと大きいため、２色性の被覆が、反射透過帯域間の通常のシャープなカットオン（ｃｕｔ−ｏｎ）を有する必要はない。放射フィルタ４４，４８及び５２は、多光子励起波長での特有の阻止のために点検される必要があるが、通常、標準的である。蛍光パワーに対する平均励起パワーの比は、線形顕微鏡検査における場合よりも多光子レーザ顕微鏡検査における場合の方が高いため、より高い阻止の比が得られる。それ故、赤色に鈍感な光電子エミッタについての光電子増倍管の選択は、有益である。
【００２２】
２光子より多い多光子の励起について、例えば、Ｎ個の光子では、１蛍光体につき１パルス当たりに吸収される光子の数は、一般に、
【００２３】
【数１】
【００２４】
と表記される。ここで、前に肩付けされた文字Ｎは、前述したＮ＝２である２光子励起の場合の類推（ａｎａｌｏｇｙ）において同時に吸収される光子の数をあらわしている。多光子吸収プロセスに関した連続的な比である比Ｎｎａ／（Ｎ−１）ｎａは、
【００２５】
【数２】
【００２６】
の形の有用な比較パラメータを提供する。
予期される吸収断面積の好適な値を下の表に記す。
【００２７】
【表１】
【００２８】
これら上記２光子励起について記述された多光子断面積及び計器パラメータの典型的な値を用いた場合、約３Ｗレーザーパワーで、吸収の比は１（ｕｎｉｔｙ）である。しかしながら、この等しい放射パワーは、特に、波長に依存する断面積に従うものである。より高い比Ｎδ／Ｎ−１δは、既知の好適な蛍光体について存在し、それ以上のものは、この発明、また、他の多光子吸収の適用がきっかけとなる研究において見い出されるかもしれない。生物の細胞及び組織に対して適用する場合、より高いオーダの多光子励起プロセスの選択及び励起波長の最適化は、閉じ込められた化合物の蛍光顕微鏡検査及び極微的な活性化の間における、生物の光によるダメージを最小限に抑制するのに適した状態を選択するための手段を提供する。多光子レーザーパワー顕微鏡法又は光化学に関して、より高いオーダの多光子プロセスは、有効なレーザー波長の選択を調節する。
【００２９】
Ｎ＞２である多光子励起を用いれば、分解能を規定する顕微鏡のポイント拡張関数が、それ自身で、パワーＮに増えるため、画像形成分解能は、２光子の励起に相対して改良される。その結果、３光子励起に関して、分解能は、波長が増大するにつれて分解能を小さくする波長の因子を無視して、極微の共焦点アパーチャの挿入（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ）とほぼ同じ因子により更に改良される。
【００３０】
図２及び３は、それぞれ、１．０μｍでのＦｕｒａ−２及び１．０μｍでのＣａを備えたＩｎｄｏ−１の３光子励起に関する入射光子の光束密度の関数としての蛍光強度を示している。両方の場合において、試料における３光子の励起が明らかにあらわされ、蛍光強度は、入射光子の光束密度の３乗に比例して増大する。
【００３１】
３つ又はそれ以上の光子による多光子励起の他の長所は、焦点励起外の依存性が、増大する光子オーダＮの値とともに、強度のパワーＮが連続的に高くなるにつれて小さくなるので、２光子励起の好適な特性が、より高いオーダのプロセスにおいて、更に高められることである。
【００３２】
本発明による３つ又はそれ以上の光子の励起は、可視又は赤外光による、単一紫外線光子の励起に対応する励起エネルギーへのアクセスをもたらすので、全く新しいクラスの蛍光体及び蛍光指示薬が、３次元的に解像されるレーザ走査顕微鏡検査に受入れ可能となる。たとえ３つ又はそれ以上の光子の断面積は、多くの化合物について未だ知られておらず、また、３つ又はそれ以上の光子の吸収には、異なる選択則が適用されるが、分子の非対称性は、しばしば、同じ励起状態への奇数及び偶数の光子の遷移の両方を可能とする。励起状態の対称性の効果が、奇数の光子及び偶数の光子の断面積ピークの相対値をシフトするようにあらわれることが分かっている。その結果、２光子吸収についての吸収ピークは、時折、１光子プロセスについての優勢な吸収ピークの２倍よりも著しく短い波長であらわれ、そして、３光子吸収の波長依存性は、１光子の場合の３倍に近い波長依存性にたよることができる。多光子励起は、非干渉性の複数のステップの励起のケースにおいて特に強力であるかも知れない。この場合には、（例えば２光子の吸収による）あるエネルギーの吸収が、それに伴う付加的な光子が蛍光又は光化学的な活性が生じ得る状態に達するためのエネルギーをもたらす中間状態に到達する。
【００３３】
さて、前述した蛍光体の全てが、２光子の励起で、生きた細胞において蛍光性のラベル（ｌａｂｅｌ）分布をイメージ化するために、決まって用いられる。匹敵する蛍光強度の３光子の励起は、Ｉｎｄｏ−１，ＦＵＲＡ−２，ＤＡＰＩ及びダルニル（ｄａｒｎｙｌ）とともに得られるものである。３光子の吸収断面積は、約３δ〜２×１０−８２ｃｍ６（ｓ／光子）２である。セロトニン（ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ），ノレピネフェリン（ｎｏｒｅｐｉｎｅｐｈｅｒｉｎｅ）及びトリプトファン（ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ）における蛍光性のアミノ酸の３つ及び４つの光子の励起は、３００ｎｍ以下で生じる１光子の吸収を用いた赤色光の励起で測定される。有用なレーザによる３つ及び４つの光子の使用は、稀な神経伝達物質及びホルモンを極微的に検出しイメージ化する上で都合が良い。
【００３４】
本発明の他の適用は、組織又は組織の小器官の微視的な局部除去を、それらの破壊若しくは外科的な切除のために行う方法としてのものである。これは、内在的な発色団により、あるいは、外部から与えられた発色団により、３つ又はそれ以上の光子の吸収の利用を通じて達せられる。上記発色団は、組織を分類し、サブピコ秒のレーザ光のパルス吸収のための第１の特性エネルギーをもたらすもので、そのレーザ光のパルスが、例えば３分の１，４分の１等のほぼ整数分数である、若しくは第１の特性エネルギーよりも小さい第２の特性エネルギーをもたらすことになる。代わりとして、必要な蛍光をもたらす分子が、内在的な組織蛍光体であってもよい。
【００３５】
本発明は、好適な実施の形態に関して開示されているが、以下の請求の範囲に規定される発明の要旨を逸脱することなく、様々な改良や変更が可能であることは理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】本発明の好適な実施態様に従って、レーザ走査顕微鏡の模式的な図解である。
【図２】Ｆｕｒａ−２の３光子励起を用いて得られ適用されたピークレーザ光束密度に対する平均的な蛍光強度のグラフである。
【図３】Ｉｎｄｏ−１の３光子励起を用いて得られ適用されたピークレーザ光束密度に対する平均的な蛍光強度のグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、３つ又はそれ以上の光子の同時吸収により、目的物における分子の励起をもたらすレーザ顕微鏡検査技術に関する。本発明は、デンク（Ｄｅｎｋ）等により米国特許第５，０３４，６１３号（以下、’６１３号特許という）に開示された２光子レーザ顕微鏡における改良であり、また、この特許は、引用することにより、ここに組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
上記’６１３号特許は、内在的な３次元分解能をもたらすべく、２光子の同時吸収により目的物における分子の励起を生じさせるレーザ走査顕微鏡を開示している。短い（紫外線の又は可視の）波長帯域における単一光子吸収を有する蛍光体（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅｓ）は、強く結像されたサブピコ秒の比較的長い（赤色の又は赤外線の）波長帯域のレーザ光の流れにより励起させられる。上記蛍光体は、生きた細胞及び他の極微的な対象物の蛍光像をつくるために、約２分の１のレーザ波長を吸収する。上記蛍光体からの蛍光放射は、レーザ光を結像させることにより、蛍光及び光漂白が焦点面近傍に限定されるように、励起強度とともに２次的に増える。この特徴は、共焦点のレーザ走査顕微鏡により生じさせられたものに匹敵する視野分解能の深度を与え、その上、光漂白を減少させるものである。レーザ走査顕微鏡によるレーザビームの走査は、レーザビームを結像させることにより、また、そのビームをパルス時間で圧縮することにより得られる非常に高い励起強度についての必要条件を満たしながら、走査された対象物における各ポイントからの２光子の励起による蛍光を集めることにより、像の形成を可能とする。結像されたパルスは、また、かご閉じ込めエフェクタ分子（ｃａｇｅｄ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）の光分解の放出（ｐｈｏｔｏｌｙｔｉｃ ｒｅｌｅａｓｅ）において特に有用である、３次元空間的に解像される光化学をもたらす。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
上記’６１３号特許に開示された２光子レーザ顕微鏡検査技術についての欠点は、その適用が、有用なレーザ技術に限定されることである。特に、２光子技術は、その適用に従って、２光子のエネルギーレベルの合計が所望の蛍光放射を生じるのに必要とされる特定のエネルギーレベルをもたらすように、特定の波長におけるレーザの利用を要する。あいにく、幾らかのレーザ顕微鏡の適用は、現時点では技術的に実現不可能である波長を有するレーザの利用を要するであろう。例えば、アミノ酸及び核酸のような、非常に短い波長の吸収を有する発色団（ｃｈｒｏｍｏｐｈｏｒｅｓ）の励起は、上記２光子技術を用いて、５４０ｎｍの波長を有するレーザを要することとなるが、現時点では、かかるレーザは存在しない。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、レーザ走査蛍光顕微鏡検査に、また、マイクロ薬理学（ｍｉｃｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ）についてのかご閉じ込め試薬の活性化、及び、光学的な３次元情報保存についてのポリマー架橋のような空間的に解像される光化学的な処理に、３つ又はそれ以上の光子の励起を適用することにより、前述した問題に対する解決法をもたらすことができる。
【０００５】
３光子に誘導される蛍光が、励起強度に対する三次的な依存性に従う一方、４光子による励起が、四次的な依存性に従うため、両方はレーザ走査顕微鏡において内在的な３次元分解能をもたらす。たとえ、かかる３次元分解能が、上記’６１３号特許に開示された２光子レーザ顕微鏡に基づく非線形の顕微鏡検査技術により既に実現されるものでも、３つの光子の励起が、通常では紫外帯域（２３０〜３５０ｎｍ）において励起可能である分子を近赤外光（７００〜１１００ｎｍ）で励起させることは稀である。アミノ酸トリプトファン（ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ）及びチロシン（ｔｙｒｏｓｉｎｅ）、神経伝達物質であるセロトニン（ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ）及び核酸のような興味あるバイオ分子は、約２６０〜２８０ｎｍにおける１光子吸収ピークを有しており、これらのバイオ分子では、３つ及び４つの光子の励起により、蛍光が励起され得る。赤外光に近い長波長を用いる利点は、生きた細胞への光によるダメージがおそらく少ないことや深い紫外線吸収体について好都合に適用し得る固体状態のフェムト秒のレーザ源である。実際には、３光子レーザ走査顕微鏡の構成は、既存する２光子システムと同様である。しかしながら、３光子及び２光子の吸収スペクトルは、全体として、まったく異なるので、２光子及び３光子が励起される蛍光顕微鏡検査法の組み合わせは、２光子顕微鏡において一般に採用されているレーザシステムの有効範囲を拡張する。
【０００６】
３つ若しくはそれ以上の光子の励起の特に有効な適用は、２００ｎｍ程度の波長の吸収を要するある適用について、エキシマレーザを取り替えることである。よりずっと長い波長（つまり５５０〜９００ｎｍ）を発するレーザによる３つ及び４つの光子の励起は、同様のエネルギー吸収をもたらし、その上、３次元空間分解能をもたらすものである。エキシマレーザは、極めて高価であり、ユーザに身近なものでないため、幾つかの光子の励起が、非常に望ましいかも知れない。
【０００７】
提案される３光子顕微鏡検査の実用性は、種々の蛍光体及びバイオ分子（ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅ）の３光子の蛍光励起断面積に極めて重大に依存する。しかしながら、３光子の吸収断面積が報告されたことはほとんどない。摂動論に基づく簡単な計算は、３光子の励起が、匹敵する励起のレベルを実現するために、典型的には、２光子励起技術で一般に用いられるピーク強度の＜１０倍を要することをあらわしている。この必要とされる強度レベルが、モードロック式のＴｉ：サファイアレーザのようなフェムト秒のレーザ源により容易に手に入れることができる。モデロック式のＴｉ：サファイアレーザを用いて、トリプトファン（ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ）及びセロトニン（ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ）の３光子に導かれる蛍光は、約８００と９００ｎｍとの間にある励起波長において観察される。測定される蛍光は、期待された励起強度に対する３次的な法則の依存性に従う。カルシウム指示薬（ｉｎｄｃａｔｏｒ）の蛍光パワーの測定法は、期待された３光子励起の最適条件よりもかなり下の励起波長（約９１１ｎｍ）でのフラ−２（Ｆｕｒａ−ＩＩ）を着色し、満足な蛍光画像が、最適な励起波長（約７３０ｎｍ）でのフラ−２の２光子励起に必要とされるレーザパワーのわずか〜５倍で取得し得るべきであることが示されている。これらの予備結果から概算される３光子蛍光励起断面積は、３光子レーザ走査顕微鏡検査法が、適度なレベルの励起パワーを用いて行われることを示している。このアプローチがどれほど広く適用可能であるかは、決定されなければならない。４光子励起は、約１０００ｎｍより上の水（ｗａｔｅｒ）による強い１光子吸収のオンセット（ｏｎｓｅｔ）によって制限され得る。
【０００８】
３つ又はそれ以上の光子のプロセスによる蛍光の分子励起の研究は、その励起断面積が相当小さいものであると予期されるので、稀である。その結果、励起の有効なレートは、通常、非常に高い瞬間照明強度を要する。多光子断面積の簡単な補外（ｅｘｔｒａｐｏｌａｔｉｏｎ）としては、放射電磁界による分子励起に関した双極子遷移確率の量子力学の摂動論の解における、マトリックス素子のパターンの積が考えられる。基本的には、多光子プロセスは、分子と相互作用するために、（分子の断面領域、Ａ〜１０−１６ｃｍ２の範囲内で、また同時に、中間状態の寿命により決定される時間間隔、δτ〜１０−１６ｓの範囲内で）３つ又はそれ以上の光子を要する。この短い一致時間は、摂動論のエネルギー分母から導出される大きなエネルギーの不確定性により制限される。
【０００９】
幾つかの光子による蛍光励起は、（与えられた蛍光体についての）長い方の励起波長が、１光子ポイント拡張関数を複数の光子のプロセスに関するパワーｎに引き上げることにより増大させられるのと同じ程度で、分解能を減少させるので、レーザ顕微鏡検査法の分解能を著しく増大させることはない。それは、波長の因子に関するものでなく、３光子励起の分解能における増大は、本質的には、２光子顕微鏡に対して理想的な共焦点空間フィルタを付加することにより招来されるものと同様のものであろう。
【００１０】
意外にも大きな３光子の断面積についての近年のリポートは、（過度に明るい閃光から人間の視界を保護するための調節可能な遮光物を付与することを目的とした）光学的に制限のある吸収を向上させるための研究のうちに見い出される。最近では、約１０−７５ｃｍ６ｓ２の光子吸収断面積が、テトラヒドロフラン（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｕｒａｎ）における２，５−ベンゾチアゾ（ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏ）３，４−ジデシロキシ（ｄｉｄｅｃｙｌｏｘｙ）の吸収及び蛍光に関して報告されている。近年のまた別の実験は、共役有機ポリマーからの蛍光の３光子励起を示している。しかしながら、このプロセスは、ほとんどの蛍光励起とは異なった２つの励起状態を含むようにみえる。これらの実験の条件は、レーザ走査蛍光顕微鏡検査に若しくは大抵のマイクロ光化学にまったく適さないが、大きな断面積は約束される。しかしながら、かかる大きな断面積は、３つ又はそれ以上の光子の顕微鏡検査に不可欠ではないことに注意すべきである。
【００１１】
蛍光顕微鏡検査及びフォトマイクロ薬理学における生きた細胞への光によるダメージのレートの励起波長の依存性は、広くには知られておらず、異なる適用については大きく変化し得る。経験では、２光子励起が、匹敵する蛍光画像の認識についての１光子励起よりもはるかに少ないダメージを導くことが分かっている。励起に関して３つ又は４つの光子に増加することによって、改良が更に為され得るかどうかは明らかでない。このような知識及び非線形吸収スペクトルの知識の助けによって、将来、最良の励起モードが、個々のシステムについて決定され、利用されることが可能である。特に魅力のある可能性は、３光子励起及びそれに伴う蛍光信号の２光子励起による光化学を導き出すために、１つのレーザ波長を用いることである。３光子励起は、それを元に戻しそうにないことを除いて、まったく好ましいことに、既存の２光子励起技術を有効に向上させるように思われる。
【００１２】
代わりとして、極微的な光化学の活性，光切除及び光学的な手術（ｏｐｔｉｃａｌ ｓｕｒｇｅｒｙ）に関し、光の励起は、アミノ酸及び核酸のような非常に短い波長吸収体を有する内在的な発色団、若しくは同等の付加された発色団の多光子励起により、好適に実現され得る。多光子励起は、長波長でのサブピコ秒のパルスをもたらすより有用なレーザの選択、及び、光の励起が望まれる極微的な焦点体積への長波長光の伝達を可能とする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
さて、本発明の好適な実施の形態の詳細な説明については、図１は、３通りの検出方式を有する従来の走査顕微鏡を模式的に示している。サブピコ秒のパルス化されたレーザ源１２は、可動式ステージ又は他の適切な支持部材１５上に置かれた試料又は目的物の必然的な励起をもたらすものである。上記レーザ１２は、例えば、約８０ＭＨｚの繰り返し率で、１００ｆｓｅｃより短い持続期間を有するパルスとともに、約６３０ｎｍの、スペクトルの赤領域における波長を有する光のパルスを生じ得る、コライディング・パルス（ｃｏｌｌｉｄｉｎｇ ｐｕｌｓｅ）の、モード・ロック式の色素レーザ若しくは固体レーザであってよい。他の明るいパルスレーザもまた、例えば、その合計が試料における蛍光に必要とされる適切な吸収エネルギー帯域に匹敵するであろう必然的な励起の光子エネルギーを生じるように、赤外線の、若しくは赤色の領域における比較的長い異なる波長の光をもたらすために使用されてもよい。単一光子励起技術において、これらは３つ又は４つの光子励起について、それぞれ、入射光の波長の約３分の１、若しくは４分の１の波長を有するスペクトル領域における単一光子の吸収により励起されることになる。その結果、例えば、９４５ｎｍでの可視の赤色領域における３つの光子が、通常３１５ｎｍでの紫外線領域における光を吸収する蛍光を励起させるように協力する一方、１０７０ｎｍでの３つの光子が、可視光領域において、３５７ｎｍで吸収する分子を励起させることになる。
【００１４】
本発明の改良された態様では、単一波長レーザ１２が、入射光ビームが、高い瞬間パワーの、また、異なる波長の、２つ又はそれ以上の重ね合わせパルス光ビームからなるように、２つ又はそれ以上の異なる長波長のレーザ源に交換され得る。入射ビームの波長は、
１／λａｂｓ＝１／λ１＋１／λ２＋１／λ３
と表記され得る短い波長で吸収性のある蛍光を励起させるように選択される。ここで、λａｂｓは吸収体の短い波長であり、λ１，λ２及びλ３は、３つの波長のケースに場合についての、レーザの入射ビームの波長である。
【００１５】
上記レーザ１２は、１組みの発振ミラーを有するＸ−Ｙスキャナ１８により走査され、その後、接眼レンズ２０及び２２並びに対物レンズ２４により、焦点つまり焦点体積１９で試料１４上に結像される、パルス化された出力ビーム１６を生じる。対物レンズの背面口径（ｂａｃｋ ａｐｅｒｔｕｒｅ）は、走査されるビームについてのピボットポイントであり、その結果、収差を無視し、ラスターパターンにおける全ての点は、同等の画像形成条件を経験する。上記スキャナ１８は、試料１４を通じて、焦点つまり焦点体積１９の走査を行い、それによって、焦点つまり焦点体積１９での若しくはその近傍における試料１４の蛍光励起をもたらす。
【００１６】
上記出力ビーム１６は、上記Ｘ−Ｙスキャナ１８に指向させられる前に、分散補正及びパルス診断器の両方にかけられる。フェムト秒のパルス化された照明の問題の１つは分散である。短いパルスは、光学材料を通過する場合に、パルス化された帯域幅の互いに異なる周波数成分が、材料内で異なる速さで進むため、広がる傾向にある。光学材料についての分散補正は、約１２０ｆｓｅｃよりも大きいパルスにとって不可欠でない。なぜなら、これらのパルスが小さな周波数帯域幅（約４ｎｍ）を有し、その結果、広がりがほとんどないからである。しかしながら、７００ｎｍで、７０ｆｓｅｃのパルスは、良好な対物レンズにより約１．５倍に、ビーム変調及びシャッタに用いられ得る標準的な音響光学変調器によりそれ以上に広げられることが分かっている。パルスの広がりは、観察される蛍光の均整を減少させる。顕微鏡１０では、光学材料についての分散補正が、より高い（全体としてより遅い）周波数がより少ないガラスを通過して、その結果、固有の位相遅れに戻されるように、光を指向させる一対のガラスプリズム２６及び２８を二重に通過することにより達せられる。上記プリズム２６及び２８を通過してリターンさせるためには、全反射ミラー３０が用いられる。
【００１７】
量的な測定のために、励起ビームの波長及びパルス持続時間を知る必要があり、そのため、パルス化された出力ビーム１６を分析すべく、種々の態様のパルス診断器３２が提供される。波長及び持続時間の両方の大まかなモニタのためには、波長の測定値をもたらす、標準的な形態にある単一のモノクロメータが十分である。もし、出力のスリットが取り除かれ、その結果得られるスペクトルが、スクリーン又は１次元検出器へ送られれば、パルス波長帯域がモニタされ得る。より正確なパルス分析のために、上記パルス診断器３２は、直接的で詳細なパルス幅の測定及びその位相干渉の輪郭の指示を可能とする自己相関器（ａｕｔｏｃｏｒｒｅｌａｔｏｒ）を有してもよい。
【００１８】
レーザ顕微鏡１０は、また、３つの検出方式の各々について、蛍光通路を分離するために用いられる、第１，第２及び第３のダイクロックミラー３４，３６及び３８を有している。これらの方式の第１のものは、分離スキャンされた（ｄｅｓｃａｎｎｅｄ）共焦点検出方式として知られている。共焦点検出では、蛍光ビームが、共焦点光電子増倍管（ＰＭＴ）４２の前に配置されたピンホール絞り４０で静止画像面を形成するように、分離スキャンされる。走査におけるすべての位置で、標本において照射されるポイントは、検出器の面における開口部に対して結像する、若しくは共焦である。上記ピンホール絞り４０と第１のダイクロックミラー３４との間には、検出された信号から望ましくない周波数を除去するために、帯域放射フィルタ４４が配置されている。
【００１９】
第２の検出技術は、対物レンズの背面口径が、分離スキャンなしに、レンズ４６及び帯域放射フィルタ４８を介して、フーリエＰＭＴ５０上に結像されるフーリエ面検出方式として知られている。上記背面口径が走査においてピボットポイントであるため、蛍光のパターンは、光電陰極において定常である。
【００２０】
最後に、第３の検出技術は、試料１４における完全な焦点面が、上記帯域放射フィルタ５２及び結像レンズ５４を通じて、その認識速度がフレームの走査時間に同調させられるＣＣＤカメラのような画像形成検出器５６上に結像される、走査された画像形成検出方式として知られている。
【００２１】
検出方法の最初の選択は、既存の顕微鏡の構成により、若しくは設計された特定の実験に必要な顕微鏡検査方法により決められる。各検出方式の概要は、それ自身特有の長所及び短所を呈している。これら全ての検出方式の概要では、集光された蛍光が、適切に被覆されたダイクロックミラーにより抽出される。典型的には、励起波長と放射波長との間の差がストークスシフト（Ｓｔｏｋｅｓ ｓｈｉｆｔ）よりもずっと大きいため、２色性の被覆が、反射透過帯域間の通常のシャープなカットオン（ｃｕｔ−ｏｎ）を有する必要はない。放射フィルタ４４，４８及び５２は、多光子励起波長での特有の阻止のために点検される必要があるが、通常、標準的である。蛍光パワーに対する平均励起パワーの比は、線形顕微鏡検査における場合よりも多光子レーザ顕微鏡検査における場合の方が高いため、より高い阻止の比が得られる。それ故、赤色に鈍感な光電子エミッタについての光電子増倍管の選択は、有益である。
【００２２】
２光子より多い多光子の励起について、例えば、Ｎ個の光子では、１蛍光体につき１パルス当たりに吸収される光子の数は、一般に、
【００２３】
【数１】
【００２４】
と表記される。ここで、前に肩付けされた文字Ｎは、前述したＮ＝２である２光子励起の場合の類推（ａｎａｌｏｇｙ）において同時に吸収される光子の数をあらわしている。多光子吸収プロセスに関した連続的な比である比Ｎｎａ／（Ｎ−１）ｎａは、
【００２５】
【数２】
【００２６】
の形の有用な比較パラメータを提供する。
予期される吸収断面積の好適な値を下の表に記す。
【００２７】
【表１】
【００２８】
これら上記２光子励起について記述された多光子断面積及び計器パラメータの典型的な値を用いた場合、約３Ｗレーザーパワーで、吸収の比は１（ｕｎｉｔｙ）である。しかしながら、この等しい放射パワーは、特に、波長に依存する断面積に従うものである。より高い比Ｎδ／Ｎ−１δは、既知の好適な蛍光体について存在し、それ以上のものは、この発明、また、他の多光子吸収の適用がきっかけとなる研究において見い出されるかもしれない。生物の細胞及び組織に対して適用する場合、より高いオーダの多光子励起プロセスの選択及び励起波長の最適化は、閉じ込められた化合物の蛍光顕微鏡検査及び極微的な活性化の間における、生物の光によるダメージを最小限に抑制するのに適した状態を選択するための手段を提供する。多光子レーザーパワー顕微鏡法又は光化学に関して、より高いオーダの多光子プロセスは、有効なレーザー波長の選択を調節する。
【００２９】
Ｎ＞２である多光子励起を用いれば、分解能を規定する顕微鏡のポイント拡張関数が、それ自身で、パワーＮに増えるため、画像形成分解能は、２光子の励起に相対して改良される。その結果、３光子励起に関して、分解能は、波長が増大するにつれて分解能を小さくする波長の因子を無視して、極微の共焦点アパーチャの挿入（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ）とほぼ同じ因子により更に改良される。
【００３０】
図２及び３は、それぞれ、１．０μｍでのＦｕｒａ−２及び１．０μｍでのＣａを備えたＩｎｄｏ−１の３光子励起に関する入射光子の光束密度の関数としての蛍光強度を示している。両方の場合において、試料における３光子の励起が明らかにあらわされ、蛍光強度は、入射光子の光束密度の３乗に比例して増大する。
【００３１】
３つ又はそれ以上の光子による多光子励起の他の長所は、焦点励起外の依存性が、増大する光子オーダＮの値とともに、強度のパワーＮが連続的に高くなるにつれて小さくなるので、２光子励起の好適な特性が、より高いオーダのプロセスにおいて、更に高められることである。
【００３２】
本発明による３つ又はそれ以上の光子の励起は、可視又は赤外光による、単一紫外線光子の励起に対応する励起エネルギーへのアクセスをもたらすので、全く新しいクラスの蛍光体及び蛍光指示薬が、３次元的に解像されるレーザ走査顕微鏡検査に受入れ可能となる。たとえ３つ又はそれ以上の光子の断面積は、多くの化合物について未だ知られておらず、また、３つ又はそれ以上の光子の吸収には、異なる選択則が適用されるが、分子の非対称性は、しばしば、同じ励起状態への奇数及び偶数の光子の遷移の両方を可能とする。励起状態の対称性の効果が、奇数の光子及び偶数の光子の断面積ピークの相対値をシフトするようにあらわれることが分かっている。その結果、２光子吸収についての吸収ピークは、時折、１光子プロセスについての優勢な吸収ピークの２倍よりも著しく短い波長であらわれ、そして、３光子吸収の波長依存性は、１光子の場合の３倍に近い波長依存性にたよることができる。多光子励起は、非干渉性の複数のステップの励起のケースにおいて特に強力であるかも知れない。この場合には、（例えば２光子の吸収による）あるエネルギーの吸収が、それに伴う付加的な光子が蛍光又は光化学的な活性が生じ得る状態に達するためのエネルギーをもたらす中間状態に到達する。
【００３３】
さて、前述した蛍光体の全てが、２光子の励起で、生きた細胞において蛍光性のラベル（ｌａｂｅｌ）分布をイメージ化するために、決まって用いられる。匹敵する蛍光強度の３光子の励起は、Ｉｎｄｏ−１，ＦＵＲＡ−２，ＤＡＰＩ及びダルニル（ｄａｒｎｙｌ）とともに得られるものである。３光子の吸収断面積は、約３δ〜２×１０−８２ｃｍ６（ｓ／光子）２である。セロトニン（ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ），ノレピネフェリン（ｎｏｒｅｐｉｎｅｐｈｅｒｉｎｅ）及びトリプトファン（ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ）における蛍光性のアミノ酸の３つ及び４つの光子の励起は、３００ｎｍ以下で生じる１光子の吸収を用いた赤色光の励起で測定される。有用なレーザによる３つ及び４つの光子の使用は、稀な神経伝達物質及びホルモンを極微的に検出しイメージ化する上で都合が良い。
【００３４】
本発明の他の適用は、組織又は組織の小器官の微視的な局部除去を、それらの破壊若しくは外科的な切除のために行う方法としてのものである。これは、内在的な発色団により、あるいは、外部から与えられた発色団により、３つ又はそれ以上の光子の吸収の利用を通じて達せられる。上記発色団は、組織を分類し、サブピコ秒のレーザ光のパルス吸収のための第１の特性エネルギーをもたらすもので、そのレーザ光のパルスが、例えば３分の１，４分の１等のほぼ整数分数である、若しくは第１の特性エネルギーよりも小さい第２の特性エネルギーをもたらすことになる。代わりとして、必要な蛍光をもたらす分子が、内在的な組織蛍光体であってもよい。
【００３５】
本発明は、好適な実施の形態に関して開示されているが、以下の請求の範囲に規定される発明の要旨を逸脱することなく、様々な改良や変更が可能であることは理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】本発明の好適な実施態様に従って、レーザ走査顕微鏡の模式的な図解である。
【図２】Ｆｕｒａ−２の３光子励起を用いて得られ適用されたピークレーザ光束密度に対する平均的な蛍光強度のグラフである。
【図３】Ｉｎｄｏ−１の３光子励起を用いて得られ適用されたピークレーザ光束密度に対する平均的な蛍光強度のグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
特性エネルギーの光子により励起可能な分子を含む目的物の３つ又はそれ以上の光子の励起技術による顕微鏡検査法であって、
ｎが上記目的物により吸収されるべき光子の数に等しく、３より大きい若しくはそれに等しい場合に、上記目的物に、上記特性エネルギーの約１／ｎのエネルギーの光子を有するレーザ光の強いサブピコ秒のパルスのビームを照射し、
少なくとも３つの入射光子の同時吸収により分子励起を生じさせるべく、十分に高い照射強度をもたらすように、上記目的物の範囲内に照射光を結像させるステップを有する方法。
【請求項２】
上記目的物が、かご閉じ込めの生物学的に活性な分子を含み、上記照射強度が、ｎ個の入射光子の同時吸収により、かご閉じ込めされた生物学的に活性な化合物を解放するのに十分であり、各エネルギーが、上記特性エネルギーの約１／ｎに等しい請求項１の方法。
【請求項３】
上記目的物が、蛍光性の分子を含み、上記照射強度が、ｎ個の入射光子７の同時吸収により、上記目的物の蛍光を生じさせるのに十分であり、各エネルギーが、上記特性エネルギーの約１／ｎに等しい請求項１の方法。
【請求項４】
上記照射光を結像させるステップが、上記ｎ個の入射光子の同時吸収により分子励起を生じさせるべく、上記目的物の範囲内における小さな焦点体積へ照射光を結像させ、該焦点体積においてのみ十分に高い照射強度をもたらすことを有している請求項３の方法。
【請求項５】
上記目的物を通じて、上記焦点体積を走査すべく、上記ビームを走査し、上記目的物により生じさせられた蛍光を検出するステップを更に含む請求項４の方法。
【請求項６】
上記目的物が組織であり、また、上記分子励起が、内在的な発色団，外部から与えられた発色団、若しくは上記組織内の内在的な蛍光体による少なくとも３つの照射光子の同時吸収により発生する請求項１の方法。
【請求項１】
特性エネルギーの光子により励起可能な分子を含む目的物の３つ又はそれ以上の光子の励起技術による顕微鏡検査法であって、
ｎが上記目的物により吸収されるべき光子の数に等しく、３より大きい若しくはそれに等しい場合に、上記目的物に、上記特性エネルギーの約１／ｎのエネルギーの光子を有するレーザ光の強いサブピコ秒のパルスのビームを照射し、
少なくとも３つの入射光子の同時吸収により分子励起を生じさせるべく、十分に高い照射強度をもたらすように、上記目的物の範囲内に照射光を結像させるステップを有する方法。
【請求項２】
上記目的物が、かご閉じ込めの生物学的に活性な分子を含み、上記照射強度が、ｎ個の入射光子の同時吸収により、かご閉じ込めされた生物学的に活性な化合物を解放するのに十分であり、各エネルギーが、上記特性エネルギーの約１／ｎに等しい請求項１の方法。
【請求項３】
上記目的物が、蛍光性の分子を含み、上記照射強度が、ｎ個の入射光子７の同時吸収により、上記目的物の蛍光を生じさせるのに十分であり、各エネルギーが、上記特性エネルギーの約１／ｎに等しい請求項１の方法。
【請求項４】
上記照射光を結像させるステップが、上記ｎ個の入射光子の同時吸収により分子励起を生じさせるべく、上記目的物の範囲内における小さな焦点体積へ照射光を結像させ、該焦点体積においてのみ十分に高い照射強度をもたらすことを有している請求項３の方法。
【請求項５】
上記目的物を通じて、上記焦点体積を走査すべく、上記ビームを走査し、上記目的物により生じさせられた蛍光を検出するステップを更に含む請求項４の方法。
【請求項６】
上記目的物が組織であり、また、上記分子励起が、内在的な発色団，外部から与えられた発色団、若しくは上記組織内の内在的な蛍光体による少なくとも３つの照射光子の同時吸収により発生する請求項１の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２００６−１０６００４（Ｐ２００６−１０６００４Ａ）
【公開日】平成１８年４月２０日（２００６．４．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−３２２０２７（Ｐ２００５−３２２０２７）
【出願日】平成１７年１１月７日（２００５．１１．７）
【分割の表示】特願２００１−２２９５１１（Ｐ２００１−２２９５１１）の分割
【原出願日】平成８年９月１８日（１９９６．９．１８）
【出願人】（５９２０３５４５３）コーネル・リサーチ・ファンデーション・インコーポレイテッド (39)
【氏名又は名称原語表記】ＣＯＲＮＥＬＬ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ， ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＥＤ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年４月２０日（２００６．４．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１１月７日（２００５．１１．７）
【分割の表示】特願２００１−２２９５１１（Ｐ２００１−２２９５１１）の分割
【原出願日】平成８年９月１８日（１９９６．９．１８）
【出願人】（５９２０３５４５３）コーネル・リサーチ・ファンデーション・インコーポレイテッド (39)
【氏名又は名称原語表記】ＣＯＲＮＥＬＬ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ， ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＥＤ
【Ｆターム（参考）】
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