多糖体、その製造方法及びその用途
【課題】新規な構造及び物性を有する多糖体を発掘し、産業上有用な新規素材として開発していくこと、特に微生物由来で多機能の効果を有する多糖体の提供。
【解決手段】海洋性微生物の一種であるハロモナス属細菌を用いることにより生産される、Ｄ−リボース、Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｄ−Ｎ−アセチルガラクトサミン及びＤ−ガラクツロン酸の４種を本質的に構成糖とし、ゲルろ過クロマトグラフィーにて測定した重量平均分子量が１００万〜６００万である多糖体。さらには上記多糖体を用いた化粧品の提供。
【解決手段】海洋性微生物の一種であるハロモナス属細菌を用いることにより生産される、Ｄ−リボース、Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｄ−Ｎ−アセチルガラクトサミン及びＤ−ガラクツロン酸の４種を本質的に構成糖とし、ゲルろ過クロマトグラフィーにて測定した重量平均分子量が１００万〜６００万である多糖体。さらには上記多糖体を用いた化粧品の提供。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、構成糖がＤ−リボース、Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｄ−Ｎ−アセチルガラクトサミン及びＤ−ガラクツロン酸の４種から本質的になる多糖体、その製造方法及びその用途に関する。本発明の多糖体は、化粧品、医薬品及び食品の添加剤などとして利用できる。
【背景技術】
【０００２】
微生物が生産する多糖類は、多様な構造と多彩な機能を有していることから、食品、医薬品及び化粧品などの幅広い分野で利用しようという試みがなされている。多糖類を生産する微生物は数多く知られている。例えば、特開平５−２７６９７２号公報（特許文献１）においてストレプトコッカス属微生物、特開平７−３３０８０５号公報（特許文献２）においてアグロバクテリウム属微生物、特開平１０−２３７１０５号公報（特許文献３）においてエンテロバクター属微生物、特開２００３−１２７０１号公報（特許文献４）においてキャンディダ属微生物が知られている。
【０００３】
海洋性細菌の一種であるハロモナス（Halomonas）属細菌は、菌体外多糖を生産することが知られている。例えば、ジャーナル・オブ・インダストリアル・マイクロバイオロジー・アンド・バイオテクノロジー（Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology）, ２０００年，第２４巻，ｐ．３７４−３７８（非特許文献１）では、ハロモナス属細菌が、２．８ｇ／Ｌ、１．５ｇ／Ｌ、１．７ｇ／Ｌの生産性で、１％溶液（ｗ／ｖ）の粘度が２３．４８Ｐａ・ｓ、１０．９８Ｐａ・ｓ、６．１８Ｐａ・ｓである多糖を生産することが知られている。また、エクストリーモファイル（Extremophiles），２００３年，第７巻，ｐ．３１９−３２６（非特許文献２）では、ハロモナス・マウラ・ストレインＳ−３０（Halomonas maura strain S-30）が、３．８ｇ／Ｌの生産性で、０．５％溶液（ｗ／ｖ）の粘度が７０ｍＰａ・ｓであり、構成糖がＤ−ガラクトース：Ｄ−マンノース：Ｄ−グルコース：Ｄ−グルクロン酸の４種からなり、構成糖のモル比がＤ−ガラクトース：Ｄ−マンノース：Ｄ−グルコース：Ｄ−グルクロン酸＝１４：３４．８：２９．３：２１．９であり、分子量が４７０万であり、硫黄含量が６．５重量％である多糖体を生産することが知られている。
しかし、これらの報告事例は物理的な特徴の記載が中心であり、生産された多糖の産業上の利用価値についての記載は乏しく、特に化粧品や医薬品素材としての機能や効果については未知である。
【０００４】
ところで、乳酸菌の一種が生産するヒアルロン酸は優れた保湿効果を有することから、代表的な化粧品用の高機能素材として認知され、その需要を増してきた。さらに、ヒアルロン酸の他にも、例えば、特開平８−５３５０１号公報（特許文献５）では、ヒアルロン酸にアセチル基を導入して保湿力を高めた修飾ヒアルロン酸や、特開２０００−１７８１９６号公報（特許文献６）では、硫酸基を導入してヒアルロニダーゼ阻害能を付与させた硫酸化ヒアルロン酸及び硫酸化デキストランなどが化粧品開発に使用されている多糖として知られている。
【０００５】
化粧品分野において、微生物発酵により生産される化粧品素材は、原料の安定供給や原料トレサビリティーの点で好都合である。近年、生活習慣の多様化が進むに連れ、化粧品は生活の質向上や改善の手段の一つとして利用されるようになり、そのため化粧品素材の開発においても、より一層の高機能化が求められている。特に、機能性化粧品の開発において、一つの素材で多機能の効果を有する素材の開発は製剤設計の簡略化のためにも都合がよい。
【特許文献１】特開平５−２７６９７２号公報
【特許文献２】特開平７−３３０８０５号公報
【特許文献３】特開平１０−２３７１０５号公報
【特許文献４】特開２００３−１２７０１号公報
【特許文献５】特開平８−５３５０１号公報
【特許文献６】特開２０００−１７８１９６号公報
【非特許文献１】ジャーナル・オブ・インダストリアル・マイクロバイオロジー・アンド・バイオテクノロジー（Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology）， ２０００年，第２４巻，ｐ．３７４−３７８
【非特許文献２】エクストリーモファイル（Extremophiles），２００３年，第７巻，ｐ．３１９−３２６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
このような背景のもと、新規な構造及び物性を有する多糖体を発掘し、産業上有用な新規素材として開発していくこと、特に微生物由来で多機能の効果を有する多糖体の探索が強く望まれている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記の課題を解決するため鋭意研究を重ねた結果、海洋性微生物の一種であるハロモナス属細菌が、Ｄ−リボース、Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｄ−Ｎ−アセチルガラクトサミン及びＤ−ガラクツロン酸の４種を構成糖とする新規な多糖体を生産することを知見した。さらに、この多糖体が、保湿効果及びメラニン生産抑制効果を奏することができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、下記に示す多糖体、その製造方法及びその用途を提供するものである。
［１］構成糖がＤ−リボース、Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｄ−Ｎ−アセチルガラクトサミン及びＤ−ガラクツロン酸の４種から本質的になり、ゲルろ過クロマトグラフィーにて測定した重量平均分子量が１００万〜６００万であることを特徴とする多糖体。
［２］構成糖のモル比がＤ−リボース：Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミン：Ｄ−Ｎ−アセチルガラクトサミン：Ｄ−ガラクツロン酸＝５５〜８５：１〜３０：１〜２５：１〜２５である、［１］記載の多糖体。
［３］構成糖がＤ−リボース、Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｄ−Ｎ−アセチルガラクトサミン及びＤ−ガラクツロン酸の４種から本質的になり、ゲルろ過クロマトグラフィーにて測定した重量平均分子量が２５０万〜４５０万であり、構成糖のモル比がＤ−リボース：Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミン：Ｄ−Ｎ−アセチルガラクトサミン：Ｄ−ガラクツロン酸＝６５〜７５：８〜１８：３〜１３：３〜１３であることを特徴とする多糖体。
［４］ハロモナス属細菌を培養することによって得られる、［１］〜［３］のいずれか１項に記載の多糖体。
［５］ハロモナス属細菌がハロモナス・マリナ（Halomonas marina）である、［４］記載の多糖体。
［６］ハロモナス・マリナ（Halomonas marina）がハロモナス・マリナＡＴＣＣ２５３７４株またはその変異株である、［５］記載の多糖体。
【０００９】
［７］ハロモナス属細菌を培養し、その培養物より多糖体を分離精製することを特徴とする、［１］〜［６］のいずれか１項に記載の多糖体の製造方法。
［８］ハロモナス属細菌がハロモナス・マリナ（Halomonas marina）である、［７］記載の製造方法。
［９］ハロモナス・マリナ（Halomonas marina）がハロモナス・マリナＡＴＣＣ２５３７４株またはその変異株である、［８］記載の製造方法。
【００１０】
［１０］［１］〜［６］のいずれか１項に記載の多糖体を含む保湿剤。
［１１］［１］〜［６］のいずれか１項に記載の多糖体を含むメラニン生産抑制剤。
［１２］［１］〜［６］のいずれか１項に記載の多糖体を含む化粧品。
［１３］［１］〜［６］のいずれか１項に記載の多糖体を含む皮膚外用剤。
【発明の効果】
【００１１】
本発明は、構成糖がＤ−リボース、Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｄ−Ｎ−アセチルガラクトサミン及びＤ−ガラクツロン酸の４種から本質的になる新規な多糖体及びその製造方法を提供することができる。
本発明の好ましい態様によれば、本発明の多糖体は保湿効果及びメラニン生産抑制効果を有していることから、保湿成分あるいは美白成分として、化粧品、医薬品及び食品などに配合することができる。
本発明の好ましい態様によれば、本発明の多糖体は、微生物発酵により生産されるものであるので、原料の安定供給や原料トレサビリティーの点で好都合である。
また、本発明は、上記多糖体を含む化粧品及び皮膚外用剤を提供する。本発明の好ましい態様によれば、本発明の化粧品及び皮膚外用剤は、肌荒れの防止または改善、保湿及び美白など種々の効果を奏することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明の多糖体、その製造方法及びその用途等について詳細に説明する。
【００１３】
本発明の多糖体は、構成糖がＤ−リボース、Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｄ−Ｎ−アセチルガラクトサミン及びＤ−ガラクツロン酸の４種から本質的になり、ゲルろ過クロマトグラフィーにて測定した重量平均分子量１００万〜６００万を有している。ここで、「構成糖がＤ−リボース、Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｄ−Ｎ−アセチルガラクトサミン及びＤ−ガラクツロン酸の４種から本質的になる」とは、本発明の多糖体が、Ｄ−リボース、Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｄ−Ｎ−アセチルガラクトサミン及びＤ−ガラクツロン酸の４種の単糖がグリコシド結合で結合してなる複合多糖であって、Ｄ−リボース、Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｄ−Ｎ−アセチルガラクトサミン及びＤ−ガラクツロン酸以外の構成糖を実質的に含まないことを意味する。ここで、「Ｄ−リボース、Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｄ−Ｎ−アセチルガラクトサミン及びＤ−ガラクツロン酸以外の構成糖を実質的に含まない」とは、本発明の多糖体を構成する全構成糖のうち、モル比にして、９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上がＤ−リボース、Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｄ−Ｎ−アセチルガラクトサミン及びＤ−ガラクツロン酸の４種であることを意味する。
【００１４】
本発明の多糖体において、Ｄ−リボース、Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｄ−Ｎ−アセチルガラクトサミン及びＤ−ガラクツロン酸の構成糖のモル比は特に制限されるものではないが、Ｄ−リボース：Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミン：Ｄ−Ｎ−アセチルガラクトサミン：Ｄ−ガラクツロン酸＝５５〜８５：１〜３０：１〜２５：１〜２５であることが好ましく、６０〜８０：５〜２５：２〜２０：２〜２０であることがより好ましく、６５〜７５：８〜１８：３〜１３：３〜１３であることがさらに好ましい。
【００１５】
本発明において、多糖体の構成糖の定性定量分析には、高速液体クロマトグラフィーを用いることができる。高速液体クロマトグラフィーは、常法に従って行えばよく、装置や測定条件等は通常当分野で用いられているものを用いることができる。測定条件は特に制限されるものではないが、例えば、本発明の多糖体を４Ｍのトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を使用し、１００℃、８時間の条件下で酸加水分解を行った後、４−アミノ安息香酸エチルで標識を施したものを検体とし、同条件下で４−アミノ安息香酸エチル標識した１２種類の単糖を標品として、分析することができる。標品となる１２種類の単糖は、実施例１に記載したものを挙げることができる。カラムは、Ｗａｔｅｒｓ社製のＸｔｅｒｒａ（登録商標）ＲＰ１８カラムを使用し、０．２Ｍホウ酸ナトリウム：アセトニトリル＝９５：５の混合液を移動相として用いることができる。
【００１６】
本発明の多糖体のゲルろ過クロマトグラフィーにて測定した重量平均分子量は１００万〜６００万である。該分子量は、１５０万〜５００万であることが好ましく、２５０万〜４５０万であることがさらに好ましい。
【００１７】
本発明において、多糖体の分子量は、ゲルろ過クロマトグラフィー法を用いて測定する。ゲルろ過クロマトグラフィー法による測定は常法に従って行えばよく、特に制限されるものではないが、例えば、東ソー株式会社製の「ＴＳＫ−ＧＥＬ（登録商標）ＧＭＰＷＸＬ」を使用し、０．２ＭＮａＣｌ／０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）を移動相とし、分子量既知のプルラン（昭和電工株式会社製）、デキストランＴ２０００（アマシャム バイオサイエンス株式会社製）を標準サンプルとして作成した分子量−保持時間標準曲線を使用して分子量を測定することができる。
ゲルろ過クロマトグラフィー法による分子量の測定については、例えば、特開平７−３０９９０２号公報、特開平５−３９３０６号公報、エクストリーモファイル（Extremophiles），２００３年，第７巻，ｐ．３１９−３２６などを参照することができる。
【００１８】
本発明の多糖体の粘度は、特に制限されるものではないが、本発明の多糖体の０．０５％水溶液（ｗ／ｖ）の粘度が１０〜４０Ｐａ・ｓであることが好ましく、１５〜３５Ｐａ・ｓであることがより好ましく、２０〜３０Ｐａ・ｓであることがさらに好ましい。
本発明の多糖体の粘度は、特に制限されるものではないが、例えばＢ型粘度計を用いて測定することができる。例えば、２５℃に調整したスリープに本発明の多糖体の水溶液（濃度０．０５％（ｗ／ｖ））を３０ｍＬ充填し、５分間静置する。その後、適当な回転数（例えば、６ｒｐｍ）で２０秒間測定を行うことにより粘度を測定することができる。
【００１９】
次に、本発明の多糖体の製造方法について説明する。本発明の製造方法は、ハロモナス（Halomonas）属に属し、本発明の多糖体を生産しうる微生物を培養し、その培養物から得られた多糖体を分離精製することを含む。
【００２０】
本発明の製造方法に用いられる好ましい微生物としては、ハロモナス・マリナ（Halomonas marina）が挙げられる。中でも、ハロモナス・マリナＡＴＣＣ２５３７４株またはその変異株であることが好ましい。ここで「変異株」とは、種々の変異処理を繰り返すことにより、本発明の多糖体の生産能が天然のハロモナス・マリナＡＴＣＣ２５３７４株よりも増強した菌株をいう。このような変異株は、紫外線、Ｘ線等の放射線、エチルメタンスルホン酸、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン等の化学的突然変異誘発物質などを用いた公知の突然変異誘発手段により発生させることができる。
【００２１】
本発明の製造方法において、前記微生物を培養するための培地としては、ハロモナス（Halomonas）属に属する微生物が生育でき、本発明の多糖体を生産する炭素源、窒素源、無機塩類及び微量栄養源を適量含有するものであれば特に制限されない。合成培地または天然培地のいずれも使用可能である。
炭素源としては、グルコース、フルクトース、ガラクトース、スクロース、グリセロールなどの糖質類、ヘミセルロース、でん粉、コーンスターチ等の天然高分子等が利用できる。中でも、グルコース、フルクトース、ガラクトース、スクロース、グリセロールなどの糖質類が好ましく用いられる。窒素源としては、硝酸塩、アンモニウム塩などの化合物；ペプトン、酵母エキス、コーンスティープリカー、ペプチド、アミノ酸、肉エキス、コーングルーテンミール、綿実油、脱脂大豆などの天然物が利用できる。無機塩類としては、例えば、ナトリウム塩、リン酸塩、マグネシウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、硫酸塩などが利用できる。微量栄養源としては、酵母エキス、各種ビタミン類などが利用できる。
【００２２】
培地中の炭素源の含有量は、通常１〜５重量％が適当であり、２〜４重量％が好ましい。窒素源の含有量は、通常は０．１〜３重量％が適当であり、０．５〜１重量％が好ましい。無機塩類の含有量は、通常は１〜５重量％が適当であり、２〜４重量％が好ましい。微量栄養源の含有量は、通常は０．０５〜１重量％が適当であり、０．１〜０．５重量％が好ましい。
【００２３】
培地の状態は、固体でも液体でもよい。液体培地を使用する場合には、静置培養でもよいが、振とう培養、通気攪拌培養の方がより高収量で多糖体を得ることができるので好ましい。
【００２４】
培養時のｐＨは、微生物が生育できて本発明の多糖体を生産しうるｐＨであれば特に制限されないが、通常はｐＨ５〜７．５が適当であり、ｐＨ５．５〜７．２が好ましい。培養温度は、特に制限されないが、通常は２０〜２５℃が適当であり、２１〜２３℃が好ましい。培養期間は、本発明の多糖体の生産量が最大に達する期間が選ばれる。通常は１〜５日が適当であり、２〜４日が好ましい。
【００２５】
上記の培養方法で得られた培養物から本発明の多糖体を採取する方法は、特に制限されるものではなく、当分野において一般に公知の方法を用いることができる。例えば、遠心分離やろ過などを用いて、培養物から菌体を除去した後、得られた培養液に２〜３倍量のメタノール、エタノール、イソプロパノール、アセトン等の有機溶媒を加えて沈殿を生じさせる。この沈殿物を遠心分離やろ過などを用いて採取し、水または１〜１０％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウム溶液に溶解させた後、アルコール等の有機溶媒を加えて沈殿を生じさせる。この操作を何回か繰り返すことによって、本発明の多糖体を得ることができる。あるいは、水または１〜１０％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウム溶液に溶解させた後、透析を行い、通風乾燥、熱風乾燥、噴霧乾燥、ドラム乾燥、減圧乾燥、凍結乾燥などの方法により、本発明の多糖体を得ることができる。あるいはまた、培養物にＳＤＳ、Ｔｗｅｅｎ、Ｔｒｉｔｏｎなどの界面活性剤を添加してあらかじめ菌体表面から多糖体を遊離させた後に、上記の方法により培養液を回収し、本発明の多糖体を得ることも好ましい。
【００２６】
上記採取方法の他に、限外ろ過を用いて、上記の培養液から本発明の多糖体以外の成分を除去し、得られた濃縮液を上述した乾燥工程に供する方法を採用しても良い。さらに、必要に応じて通常の多糖体の精製法に従って精製することにより、高純度精製品を得ることもできる。精製法としては、イオン交換、ゲルろ過等の各種のカラムクロマトグラフィー、４級アンモニウム塩による沈殿、塩析などを採用することができる。
【００２７】
本発明の多糖体は、上記のようにして培養物から採取することができる。得られた多糖体はそのまま用いることもできるが、高粘調である場合、例えば化粧品などの製剤設計のために、低分子化させて用いることもできる。低分子化の方法としては、温度による加水分解、酸による加水分解、酵素による加水分解などが挙げられる。これらの加水分解法は、多糖類の低分子化に通常用いられる公知の方法を用いることができる。これらの中でも、酸による硫酸基の脱離、残留酵素の除去処理の観点から、温度による加水分解が好ましく、特に１００℃で２時間程度の熱処理が好ましい。
【００２８】
本発明の多糖体は、上記のような方法で得られた多糖体をも包含するものである。
【００２９】
本発明の好ましい態様によれば、本発明の多糖体は、保湿効果、メラニン生産抑制効果またはその両方を奏することができる。このため、本発明の多糖体は、保湿剤またはメラニン生産抑制剤などの有効成分として用いることができる。以下、本発明の多糖体の用途について述べる。
【００３０】
本発明の好ましい態様によれば、本発明の多糖体は保湿効果を有しており、ヒアルロン酸と同等の保湿効果を奏することもできる。このため、本発明の多糖体は、化粧品や皮膚外用剤などの医薬品に配合される保湿剤として有用である。
【００３１】
本発明の保湿剤は、本発明の多糖体をそのまま、あるいは、ロウ類、ラノリン、界面活性剤、セタノール等の公知の医薬用または化粧用担体を用いて常法により製剤化すればよい。本発明の保湿剤における本発明の多糖体の含有量は特に制限されないが、０．０１〜５重量％が好ましく、０．０３〜２重量％がより好ましく、０．０５〜１重量％がさらに好ましく、０．1〜０．５重量％が特に好ましい。
【００３２】
本発明の保湿剤は、医薬品として、注射剤、座剤、外用剤等の非経口剤として使用できる。前記医薬用担体としては、これらの剤形に応じた通常用いられているものを特に制限なく使用することができる。例えば、本発明の保湿剤を軟膏、クリーム剤、液剤、貼付剤等の皮膚外用剤として用いることにより、皮膚の乾燥、かさつきなどの肌荒れを防止または改善することができる。本発明の保湿剤を、薬剤として用いる場合、本発明の多糖体の投与量は、多糖体の分子量や、製剤設計、患者の年齢、症状等に応じて適宜決定すればよい。
【００３３】
本発明の保湿剤はまた、化粧品素材として、化粧水、乳液、クリーム、パック等のフェーシャル化粧料；ファンデーション、口紅、アイシャドー等のメーキャップ化粧料；日焼け止め化粧料（サンスクリーン剤）；ボディー化粧料；芳香化粧料；メーク落とし、ボディーシャンプーなどの皮膚洗浄料；ヘアリキッド、ヘアトニック、ヘアコンディショナー、シャンプー、リンス、育毛料等の毛髪化粧料など、種々の形態の化粧品に配合することができる。前記化粧用担体は、これらの形態に応じた通常用いられているものを特に制限なく使用することができる。
【００３４】
また、本発明の好ましい態様によれば、本発明の多糖体はメラニン生産抑制効果を有する。このため、本発明の多糖体はメラニン生産抑制剤の有効成分として有用である。一般に、皮膚の色黒やシミ・ソバカスは、紫外線による刺激等によりメラノサイトが刺激され、そこで生合成されたメラニン色素が皮膚に沈着して発生するものと考えられている。本発明の多糖体は、このメラニンの生産を抑制することができるので、皮膚の色黒やシミ・ソバカスを予防または改善することができる。本発明のメラニン生産抑制剤における本発明の多糖体の含有量は特に制限されないが、０．０５〜１重量％が好ましく、０．１〜０．９重量％がより好ましく、０．２〜０．８重量％がさらに好ましく、０．３〜０．７重量％が特に好ましい。
【００３５】
本発明のメラニン生産抑制剤の調製方法は、特に制限されるものではなく、保湿剤と同様の方法で製剤化することができる。本発明のメラニン生産抑制剤は、美白用化粧品、医薬品あるいは食品などの素材として好適に用いることができる。なお、本発明のメラニン生産抑制剤を、薬剤として用いる場合、本発明の多糖体の投与量は、多糖体の分子量や、製剤設計、患者の年齢、症状等に応じて適宜決定すればよい。
【００３６】
上述のとおり、本発明の好ましい態様によれば、本発明の多糖体は、保湿効果、メラニン生産抑制効果またはその両方を奏することができるので、保湿成分あるいは美白成分として、化粧品、医薬品及び食品に好適に配合することができる。特に化粧品及び皮膚外用剤は皮膚に直接適用するものであるので、これらに配合すると、より効果的に保湿効果及びメラニン生産抑制効果を得ることができるという利点がある。以下、本発明の多糖体を配合した化粧品及び皮膚外用剤の具体例について述べる。
【００３７】
まず、本発明の化粧品について説明する。本発明の化粧品は、本発明の多糖体を含むものであれば特に制限されない。本発明の化粧品は、本発明の多糖体を含むものであるので、保湿効果を有し、皮膚の乾燥、かさつきなどの肌荒れを防止または改善すると共に、美白効果を奏することができる。
【００３８】
本発明の化粧品としては、本発明の多糖体の他に、例えば植物油等の油脂類、ラノリンやミツロウ等のロウ類、炭化水素類、脂肪酸、高級アルコール類、エステル類、種々の界面活性剤、色素、香料、ビタミン類、植物・動物抽出成分、紫外線吸収剤、抗酸化剤、防腐・殺菌剤等、通常の化粧品原料として使用されているものを適宜配合して製造することができる。また、抗炎症性の化粧品原料、例えば、甘草抽出成分（特にグリチルレチン酸）、塩酸ジフェンヒドラミン、アズレン、ｄｌ−α−トコフェロール及びその誘導体、ビタミンＢ2及びＢ6などと共に用いることにより、更にその効果を高めることもできる。
【００３９】
本発明の化粧品の形態は特に制限されず、化粧水、乳液、クリーム、パック等のフェーシャル化粧料；ファンデーション、口紅、アイシャドー等のメーキャップ化粧料；日焼け止め化粧料；ボディー化粧料；芳香化粧料；メーク落とし、ボディーシャンプーなどの皮膚洗浄料；ヘアリキッド、ヘアトニック、ヘアコンディショナー、シャンプー、リンス、育毛料等の毛髪化粧料などが挙げられる。
【００４０】
本発明の化粧品において、本発明の多糖体の配合量は形態によって適宜選択すればよいが、本発明の化粧品の全重量に対し、乾燥重量にして０．０１〜２重量％であることが好ましく、０．０２〜１重量％であることがより好ましく、０．０５〜０．５重量％であることがさらに好ましい。その他の添加剤の配合量は、各種形態の化粧品に通常用いられる範囲であれば特に制限されない。
【００４１】
各種形態の化粧品は、公知の方法に準じて製造すればよい。これらの化粧品の組成は、例えば、特許第３０２０３５３号公報、特開平８−４０８６８号公報などを参照することができる。
【００４２】
次に、本発明の皮膚外用剤について説明する。本発明の皮膚外用剤は、本発明の多糖体を含むものであるので、保湿効果を有し、皮膚の乾燥、かさつきなどの肌荒れを治療または予防すると共に、美白効果を奏することができる。
【００４３】
本発明の皮膚外用剤の剤形は任意であり、溶液系、可溶化系、乳化系、粉末分散系、水-油二層系、水-油-粉末三層系、ジェル、ミスト、スプレー、ムース、ロールオン、スティック等、いかなる剤形であってもよい。不織布等のシートに含浸あるいは塗布した製剤などとすることも可能である。
また、本発明の皮膚外用剤の製品形態も任意であり、例えば、軟膏、クリーム剤、液剤、貼付剤等が挙げられる。
【００４４】
本発明の皮膚外用剤において、本発明の多糖体の配合量は、剤形や製品形態に応じて適宜選択すればよく、特に制限されないが、皮膚外用剤の全重量に対し、乾燥重量にして０．０１〜２重量％であることが好ましく、０．０２〜１重量％であることがより好ましく、０．０５〜０．５重量％であることがさらに好ましい。
【００４５】
例えば、本発明の皮膚外用剤としては、本発明の多糖体の他に、例えば植物油等の油脂類、ラノリンやミツロウ等のロウ類、炭化水素類、脂肪酸、高級アルコール類、エステル類、種々の界面活性剤、色素、香料、ビタミン類、植物・動物抽出成分、紫外線吸収剤、抗酸化剤、防腐・殺菌剤等、通常の皮膚外用剤の原料として使用されているものを適宜配合して製造することができる。また、抗炎症性の皮膚外用剤原料、例えば、甘草抽出成分（特にグリチルレチン酸）、塩酸ジフェンヒドラミン、アズレン、ｄｌ−α−トコフェロール及びその誘導体、ビタミンＢ２及びＢ６などと共に用いることにより、更にその効果を高めることもできる。
【００４６】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００４７】
多糖体の製造
５００ｍＬの坂口フラスコに次の組成の培地を５０ｍＬ入れ、１２１℃で２０分間滅菌した後、平板培養していたハロモナス・マウラ（Halomonas marina）ＡＴＣＣ２５３７４を１白金耳分植菌し、振とう数毎分１５０ストローク、２２℃で１日間前培養を行った。
＜培地組成（ｐＨ７．０）＞
スクロース ３重量％
ペプトン ０．５重量％
酵母エキス ０．１重量％
（酵母エキス（Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ, Ｂａｃｔｏ）（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製））
人工海水 ３．６重量％
（ダイゴ人工海水ＳＰ（日本製薬株式会社製））
純水 残量
【００４８】
次に、３Ｌのジャーファーメンターに、前記組成の培地１．５Ｌを入れ、１２１℃で２０分間滅菌した。これに、前記で得られた培養液１５ｍＬを接種して添加し、培養温度２２℃、通気量１．０ｖｖｍ、攪拌数４００ｒｐｍにて４８時間培養した。
【００４９】
得られた培養物から遠心分離により菌体を除去した。得られた培養上清に２〜３倍量のエタノールを添加して沈殿を生じさせ、得られた沈殿物を遠心分離により回収した。この沈殿物を１０％（ｗ／ｖ）の塩化ナトリウム水溶液に溶解させて、再度２〜３倍量のエタノールを添加し、沈殿を生じさせ、得られた沈殿物を遠心分離により回収した。この操作（溶解、沈殿、回収）を数回繰り返した後、白色沈殿物を得た。得られた白色沈殿物を純水に溶解させて、透析により塩などを除去した後、凍結乾燥して白色の精製した多糖体を得た。
【００５０】
上記のようにして多糖体の製造を３回行った（実施例１−１、１−２及び１−３）。得られた多糖体の性状、紫外線吸収スペクトル及び赤外線吸収スペクトルは以下のとおりであった。
（１）性状：白色粉末
（２）紫外線吸収スペクトル：島津製作所製「ＵＶｍｉｎｉ−１２４０」を用いて測定した。代表例として実施例１−３の測定結果を図１に示す。図１に示されるように、２８０ｎｍおよび２６０ｎｍに吸収が認められないことから、たんぱく質、核酸は含まれていないことが確認できた。また、実施例１−１および１−２においても同様にたんぱく質、核酸が含まれていないことが確認できた。
（３）赤外線吸収スペクトル：日本分光株式会社製「ＦＴ／ＩＲ−６６０ｐｌｕｓ」を用いて測定した。代表例として実施例１−３の測定結果を図２に示す。図２に示されるように、３４００ｃｍ-1付近に炭水化物由来の水酸基の吸収が、２９５０ｃｍ-1付近には炭水化物由来のＣＨ、ＣＨ2の吸収が、１７３０ｃｍ-1及び１６２０ｃｍ-1付近にウロン酸特有の吸収がそれぞれ認められた。また、実施例１−１および１−２においても同様のスペクトルが検出された。
【００５１】
さらに、得られた多糖体について液体クロマトグラフィー分析及び分子量測定を行った。
【００５２】
（４）液体クロマトグラフィー分析
実施例１で得られた多糖体に対し、液体クロマトグラフィー分析を行った。カラムは、「Ｘｔｅｒｒａ ＲＰ１８」（Ｗａｔｅｒｓ社製）を使用し、移動相は０．２Ｍホウ酸ナトリウム：アセトニトリル＝９５：５（ｖ／ｖ）の混合液を使用した。検体及び標品は以下のようにして作製した。
【００５３】
実施例１で得られた多糖体を、４Ｍのトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）に溶解し、１００℃、３時間の条件下で酸加水分解を行った。空冷後、減圧乾固した後、充分に酸を除くため２−プロパノールを添加して再度、減圧乾固した。これにピリジン：メタノール＝５：９５（ｖ／ｖ）（４０μＬ）と無水酢酸（１０μＬ）を添加し、３０分間放置してＮ−アセチル化を行い、減圧乾固した。
次に、減圧乾固した多糖体の酸加水分解物に、純水（１０μＬ）とＡＢＥＥ標識化試薬（生化学工業製）（４０μＬ）とを加え、８０℃、１時間で保温し、４−アミノ安息香酸エチル（ＡＢＥＥ）で標識した。さらに、これに純水（２００μＬ）とクロロホルム（２００μＬ）とを加えて、遠心後、上清を検体とした。
【００５４】
同条件下で４−アミノ安息香酸エチル（ＡＢＥＥ）標識した１２種類の単糖（ガラクツロン酸、ガラクトース、マンノース、グルコース、アラビオース、リボース、Ｎ−アセチルマンノサミン、キシリトール、Ｎ−アセチルグルコサミン、フコース、ラムノース、Ｎ−アセチルガラクトサミン）を標品とした。実施例１−１〜１−３で得られたＨＰＬＣチャートをそれぞれ図３〜５に示した。
【００５５】
各々予め作製した検量線と各構成糖のピーク面積から求めた結果、各構成糖のモル比は表１のとおりであった。
【表１】
【００５６】
（５）分子量測定
得られた多糖体の分子量（重量平均分子量）を、東ソー株式会社製の「ＴＳＫ−ＧＥＬ（登録商標）ＧＭＰＷＸＬ」を使用し、０．２ＭＮａＣｌ／０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）を移動相とし、分子量既知のプルラン（昭和電工株式会社製）、デキストランＴ２０００（アマシャム バイオサイエンス株式会社製）を標準サンプルとして作成した分子量−保持時間標準曲線を使用して測定した。流速は０．５ｍＬ／分とし、サンプル濃度は０．１％（ｗ／ｖ）とした。その結果、多糖体の分子量は表２のとおりであった。なお、測定は３回行い、その平均値を多糖体の分子量とした。
【表２】
【実施例２】
【００５７】
多糖体の粘性および保湿性の評価
実施例１−１で得られた多糖体を純水に溶解し、多糖体の濃度が０．０５％（ｗ／ｖ）の水溶液を調製した。Ｂ型粘度計を使用し、回転数６ｒｐｍの条件で各水溶液の２５℃での粘度を測定した。また、比較のため、ヒアルロン酸（チッソ社製：Ｌｏｔ Ｎｏ．０６５９１０、分子量１１２万）についても粘度を測定した。その結果、実施例１−１で得られた多糖体の粘度は２３ｍＰａ・ｓであり、十分に実用的な粘性を有していることが示された。
【００５８】
次に、実施例１−１で得られた多糖体を３％（ｗ／ｖ）グリセロールに溶解し、濃度０．３％（ｗ／ｖ）の水溶液を調製した。コントロールには精製水を用い、陽性対照としてヒアルロン酸（チッソ社製：Ｌｏｔ Ｎｏ．０６５９１０、分子量１１２万）０．３％水溶液を用いた。
【００５９】
被験者には室温２２℃、湿度４０％の部屋にて２０分間安静にしてもらった後、前腕部内側に各水溶液を塗布（２×２ｃｍ）した。３分後、コットンで水溶液を軽くふき取り、この時点を開始時として、経時的に１５分後まで、皮膚の伝導度（コンダクタンス）を測定し、皮膚水分量を評価した。測定には、皮表角層水分量測定装置「ＳＫＩＣＯＮ−２００」（アイ・ビイ・エス株式会社製）を使用した。結果を表３に示す。
【００６０】
【表３】
【００６１】
表３に示されたとおり、本発明の多糖体は、ヒアルロン酸と同等の保湿効果を奏することが認められた。
【００６２】
次に、表４に示した組成の化粧水１００ｇに実施例１−１で得られた多糖体０．３ｇを添加したものと、無添加のものとを用い、５名の女性に対してモニタリングを行い、伸びとしっとり感について次の５段階（５：非常に優れている、４：優れている、３：良い、２：あまり良くない、１：悪い）で評価してもらった。その結果、伸びについては、５が３名、４が１名、３が１名、しっとり感については、５が０名、４が４名、３が１名であり、無添加の化粧水と比べて、実施例１で得られた多糖体を添加したものは伸びもよく、しっとり感があるという多数の意見が得られた。この結果から、本発明の多糖体を添加した化粧水の保湿性の高さが示された。
【００６３】
【表４】
【実施例３】
【００６４】
メラニン生産抑制試験
実施例１−１で得られた多糖類を純水に溶解し、被験物質とした。多糖類の濃度は表５に示した。１０ｖｏｌ％牛胎児血清、１００μ／ｍＬペニシリン及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製「ＧＩＢＣＯ０１１０５４」）を用い、５×１０4個／ｍＬに調製したＢ１６−Ｆ１０メラノーマ細胞浮遊液１．３５ｍＬを２４穴マイクロプレートの各ウェルに播種し、３７℃、５％ＣＯ2の条件下で２４時間培養した。２４時間培養後、被験物質１５０μＬを添加してさらに３日間培養した。培養終了後、培養液全量を抜き取り、１ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ溶液を２００μＬ添加して細胞を溶解し、そのうち、１００μＬを９６穴マイクロプレートに移し、４０５ｎｍにおける吸光度をマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ製「Ｅｍａｘ」）で測定した。被験物質のメラニン生産抑制率は以下の式を用いて算出した。なお、コントロール群としては、被検物質を添加しないこと以外は上記と同様にして調製した培養液を用いた。その結果を表５に示した。
メラニン生産抑制率（％）＝（１−（被験物質群の吸光度／コントロール群の吸光度））×１００
【００６５】
【表５】
【００６６】
表５から明らかなように、本発明の多糖体は、濃度依存的にメラニン生産抑制効果を奏することが示された。
【産業上の利用可能性】
【００６７】
本発明の多糖体は、化粧品、医薬品及び食品などに配合する保湿成分または美白成分として有用である。本発明の多糖体を配合することにより、肌荒れの防止または改善、保湿効果及び美白効果を付与することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】実施例１−１で得られた多糖体の紫外線吸収スペクトルを示したグラフである。
【図２】実施例１−１で得られた多糖体の赤外線吸収スペクトルを示したグラフである。
【図３】実施例１−１で得られた多糖体の構成単糖を示すＨＰＬＣ分析で得られたチャートである。
【図４】実施例１−２で得られた多糖体の構成単糖を示すＨＰＬＣ分析で得られたチャートである。
【図５】実施例１−３で得られた多糖体の構成単糖を示すＨＰＬＣ分析で得られたチャートである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、構成糖がＤ−リボース、Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｄ−Ｎ−アセチルガラクトサミン及びＤ−ガラクツロン酸の４種から本質的になる多糖体、その製造方法及びその用途に関する。本発明の多糖体は、化粧品、医薬品及び食品の添加剤などとして利用できる。
【背景技術】
【０００２】
微生物が生産する多糖類は、多様な構造と多彩な機能を有していることから、食品、医薬品及び化粧品などの幅広い分野で利用しようという試みがなされている。多糖類を生産する微生物は数多く知られている。例えば、特開平５−２７６９７２号公報（特許文献１）においてストレプトコッカス属微生物、特開平７−３３０８０５号公報（特許文献２）においてアグロバクテリウム属微生物、特開平１０−２３７１０５号公報（特許文献３）においてエンテロバクター属微生物、特開２００３−１２７０１号公報（特許文献４）においてキャンディダ属微生物が知られている。
【０００３】
海洋性細菌の一種であるハロモナス（Halomonas）属細菌は、菌体外多糖を生産することが知られている。例えば、ジャーナル・オブ・インダストリアル・マイクロバイオロジー・アンド・バイオテクノロジー（Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology）, ２０００年，第２４巻，ｐ．３７４−３７８（非特許文献１）では、ハロモナス属細菌が、２．８ｇ／Ｌ、１．５ｇ／Ｌ、１．７ｇ／Ｌの生産性で、１％溶液（ｗ／ｖ）の粘度が２３．４８Ｐａ・ｓ、１０．９８Ｐａ・ｓ、６．１８Ｐａ・ｓである多糖を生産することが知られている。また、エクストリーモファイル（Extremophiles），２００３年，第７巻，ｐ．３１９−３２６（非特許文献２）では、ハロモナス・マウラ・ストレインＳ−３０（Halomonas maura strain S-30）が、３．８ｇ／Ｌの生産性で、０．５％溶液（ｗ／ｖ）の粘度が７０ｍＰａ・ｓであり、構成糖がＤ−ガラクトース：Ｄ−マンノース：Ｄ−グルコース：Ｄ−グルクロン酸の４種からなり、構成糖のモル比がＤ−ガラクトース：Ｄ−マンノース：Ｄ−グルコース：Ｄ−グルクロン酸＝１４：３４．８：２９．３：２１．９であり、分子量が４７０万であり、硫黄含量が６．５重量％である多糖体を生産することが知られている。
しかし、これらの報告事例は物理的な特徴の記載が中心であり、生産された多糖の産業上の利用価値についての記載は乏しく、特に化粧品や医薬品素材としての機能や効果については未知である。
【０００４】
ところで、乳酸菌の一種が生産するヒアルロン酸は優れた保湿効果を有することから、代表的な化粧品用の高機能素材として認知され、その需要を増してきた。さらに、ヒアルロン酸の他にも、例えば、特開平８−５３５０１号公報（特許文献５）では、ヒアルロン酸にアセチル基を導入して保湿力を高めた修飾ヒアルロン酸や、特開２０００−１７８１９６号公報（特許文献６）では、硫酸基を導入してヒアルロニダーゼ阻害能を付与させた硫酸化ヒアルロン酸及び硫酸化デキストランなどが化粧品開発に使用されている多糖として知られている。
【０００５】
化粧品分野において、微生物発酵により生産される化粧品素材は、原料の安定供給や原料トレサビリティーの点で好都合である。近年、生活習慣の多様化が進むに連れ、化粧品は生活の質向上や改善の手段の一つとして利用されるようになり、そのため化粧品素材の開発においても、より一層の高機能化が求められている。特に、機能性化粧品の開発において、一つの素材で多機能の効果を有する素材の開発は製剤設計の簡略化のためにも都合がよい。
【特許文献１】特開平５−２７６９７２号公報
【特許文献２】特開平７−３３０８０５号公報
【特許文献３】特開平１０−２３７１０５号公報
【特許文献４】特開２００３−１２７０１号公報
【特許文献５】特開平８−５３５０１号公報
【特許文献６】特開２０００−１７８１９６号公報
【非特許文献１】ジャーナル・オブ・インダストリアル・マイクロバイオロジー・アンド・バイオテクノロジー（Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology）， ２０００年，第２４巻，ｐ．３７４−３７８
【非特許文献２】エクストリーモファイル（Extremophiles），２００３年，第７巻，ｐ．３１９−３２６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
このような背景のもと、新規な構造及び物性を有する多糖体を発掘し、産業上有用な新規素材として開発していくこと、特に微生物由来で多機能の効果を有する多糖体の探索が強く望まれている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記の課題を解決するため鋭意研究を重ねた結果、海洋性微生物の一種であるハロモナス属細菌が、Ｄ−リボース、Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｄ−Ｎ−アセチルガラクトサミン及びＤ−ガラクツロン酸の４種を構成糖とする新規な多糖体を生産することを知見した。さらに、この多糖体が、保湿効果及びメラニン生産抑制効果を奏することができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、下記に示す多糖体、その製造方法及びその用途を提供するものである。
［１］構成糖がＤ−リボース、Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｄ−Ｎ−アセチルガラクトサミン及びＤ−ガラクツロン酸の４種から本質的になり、ゲルろ過クロマトグラフィーにて測定した重量平均分子量が１００万〜６００万であることを特徴とする多糖体。
［２］構成糖のモル比がＤ−リボース：Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミン：Ｄ−Ｎ−アセチルガラクトサミン：Ｄ−ガラクツロン酸＝５５〜８５：１〜３０：１〜２５：１〜２５である、［１］記載の多糖体。
［３］構成糖がＤ−リボース、Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｄ−Ｎ−アセチルガラクトサミン及びＤ−ガラクツロン酸の４種から本質的になり、ゲルろ過クロマトグラフィーにて測定した重量平均分子量が２５０万〜４５０万であり、構成糖のモル比がＤ−リボース：Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミン：Ｄ−Ｎ−アセチルガラクトサミン：Ｄ−ガラクツロン酸＝６５〜７５：８〜１８：３〜１３：３〜１３であることを特徴とする多糖体。
［４］ハロモナス属細菌を培養することによって得られる、［１］〜［３］のいずれか１項に記載の多糖体。
［５］ハロモナス属細菌がハロモナス・マリナ（Halomonas marina）である、［４］記載の多糖体。
［６］ハロモナス・マリナ（Halomonas marina）がハロモナス・マリナＡＴＣＣ２５３７４株またはその変異株である、［５］記載の多糖体。
【０００９】
［７］ハロモナス属細菌を培養し、その培養物より多糖体を分離精製することを特徴とする、［１］〜［６］のいずれか１項に記載の多糖体の製造方法。
［８］ハロモナス属細菌がハロモナス・マリナ（Halomonas marina）である、［７］記載の製造方法。
［９］ハロモナス・マリナ（Halomonas marina）がハロモナス・マリナＡＴＣＣ２５３７４株またはその変異株である、［８］記載の製造方法。
【００１０】
［１０］［１］〜［６］のいずれか１項に記載の多糖体を含む保湿剤。
［１１］［１］〜［６］のいずれか１項に記載の多糖体を含むメラニン生産抑制剤。
［１２］［１］〜［６］のいずれか１項に記載の多糖体を含む化粧品。
［１３］［１］〜［６］のいずれか１項に記載の多糖体を含む皮膚外用剤。
【発明の効果】
【００１１】
本発明は、構成糖がＤ−リボース、Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｄ−Ｎ−アセチルガラクトサミン及びＤ−ガラクツロン酸の４種から本質的になる新規な多糖体及びその製造方法を提供することができる。
本発明の好ましい態様によれば、本発明の多糖体は保湿効果及びメラニン生産抑制効果を有していることから、保湿成分あるいは美白成分として、化粧品、医薬品及び食品などに配合することができる。
本発明の好ましい態様によれば、本発明の多糖体は、微生物発酵により生産されるものであるので、原料の安定供給や原料トレサビリティーの点で好都合である。
また、本発明は、上記多糖体を含む化粧品及び皮膚外用剤を提供する。本発明の好ましい態様によれば、本発明の化粧品及び皮膚外用剤は、肌荒れの防止または改善、保湿及び美白など種々の効果を奏することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明の多糖体、その製造方法及びその用途等について詳細に説明する。
【００１３】
本発明の多糖体は、構成糖がＤ−リボース、Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｄ−Ｎ−アセチルガラクトサミン及びＤ−ガラクツロン酸の４種から本質的になり、ゲルろ過クロマトグラフィーにて測定した重量平均分子量１００万〜６００万を有している。ここで、「構成糖がＤ−リボース、Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｄ−Ｎ−アセチルガラクトサミン及びＤ−ガラクツロン酸の４種から本質的になる」とは、本発明の多糖体が、Ｄ−リボース、Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｄ−Ｎ−アセチルガラクトサミン及びＤ−ガラクツロン酸の４種の単糖がグリコシド結合で結合してなる複合多糖であって、Ｄ−リボース、Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｄ−Ｎ−アセチルガラクトサミン及びＤ−ガラクツロン酸以外の構成糖を実質的に含まないことを意味する。ここで、「Ｄ−リボース、Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｄ−Ｎ−アセチルガラクトサミン及びＤ−ガラクツロン酸以外の構成糖を実質的に含まない」とは、本発明の多糖体を構成する全構成糖のうち、モル比にして、９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上がＤ−リボース、Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｄ−Ｎ−アセチルガラクトサミン及びＤ−ガラクツロン酸の４種であることを意味する。
【００１４】
本発明の多糖体において、Ｄ−リボース、Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｄ−Ｎ−アセチルガラクトサミン及びＤ−ガラクツロン酸の構成糖のモル比は特に制限されるものではないが、Ｄ−リボース：Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミン：Ｄ−Ｎ−アセチルガラクトサミン：Ｄ−ガラクツロン酸＝５５〜８５：１〜３０：１〜２５：１〜２５であることが好ましく、６０〜８０：５〜２５：２〜２０：２〜２０であることがより好ましく、６５〜７５：８〜１８：３〜１３：３〜１３であることがさらに好ましい。
【００１５】
本発明において、多糖体の構成糖の定性定量分析には、高速液体クロマトグラフィーを用いることができる。高速液体クロマトグラフィーは、常法に従って行えばよく、装置や測定条件等は通常当分野で用いられているものを用いることができる。測定条件は特に制限されるものではないが、例えば、本発明の多糖体を４Ｍのトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を使用し、１００℃、８時間の条件下で酸加水分解を行った後、４−アミノ安息香酸エチルで標識を施したものを検体とし、同条件下で４−アミノ安息香酸エチル標識した１２種類の単糖を標品として、分析することができる。標品となる１２種類の単糖は、実施例１に記載したものを挙げることができる。カラムは、Ｗａｔｅｒｓ社製のＸｔｅｒｒａ（登録商標）ＲＰ１８カラムを使用し、０．２Ｍホウ酸ナトリウム：アセトニトリル＝９５：５の混合液を移動相として用いることができる。
【００１６】
本発明の多糖体のゲルろ過クロマトグラフィーにて測定した重量平均分子量は１００万〜６００万である。該分子量は、１５０万〜５００万であることが好ましく、２５０万〜４５０万であることがさらに好ましい。
【００１７】
本発明において、多糖体の分子量は、ゲルろ過クロマトグラフィー法を用いて測定する。ゲルろ過クロマトグラフィー法による測定は常法に従って行えばよく、特に制限されるものではないが、例えば、東ソー株式会社製の「ＴＳＫ−ＧＥＬ（登録商標）ＧＭＰＷＸＬ」を使用し、０．２ＭＮａＣｌ／０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）を移動相とし、分子量既知のプルラン（昭和電工株式会社製）、デキストランＴ２０００（アマシャム バイオサイエンス株式会社製）を標準サンプルとして作成した分子量−保持時間標準曲線を使用して分子量を測定することができる。
ゲルろ過クロマトグラフィー法による分子量の測定については、例えば、特開平７−３０９９０２号公報、特開平５−３９３０６号公報、エクストリーモファイル（Extremophiles），２００３年，第７巻，ｐ．３１９−３２６などを参照することができる。
【００１８】
本発明の多糖体の粘度は、特に制限されるものではないが、本発明の多糖体の０．０５％水溶液（ｗ／ｖ）の粘度が１０〜４０Ｐａ・ｓであることが好ましく、１５〜３５Ｐａ・ｓであることがより好ましく、２０〜３０Ｐａ・ｓであることがさらに好ましい。
本発明の多糖体の粘度は、特に制限されるものではないが、例えばＢ型粘度計を用いて測定することができる。例えば、２５℃に調整したスリープに本発明の多糖体の水溶液（濃度０．０５％（ｗ／ｖ））を３０ｍＬ充填し、５分間静置する。その後、適当な回転数（例えば、６ｒｐｍ）で２０秒間測定を行うことにより粘度を測定することができる。
【００１９】
次に、本発明の多糖体の製造方法について説明する。本発明の製造方法は、ハロモナス（Halomonas）属に属し、本発明の多糖体を生産しうる微生物を培養し、その培養物から得られた多糖体を分離精製することを含む。
【００２０】
本発明の製造方法に用いられる好ましい微生物としては、ハロモナス・マリナ（Halomonas marina）が挙げられる。中でも、ハロモナス・マリナＡＴＣＣ２５３７４株またはその変異株であることが好ましい。ここで「変異株」とは、種々の変異処理を繰り返すことにより、本発明の多糖体の生産能が天然のハロモナス・マリナＡＴＣＣ２５３７４株よりも増強した菌株をいう。このような変異株は、紫外線、Ｘ線等の放射線、エチルメタンスルホン酸、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン等の化学的突然変異誘発物質などを用いた公知の突然変異誘発手段により発生させることができる。
【００２１】
本発明の製造方法において、前記微生物を培養するための培地としては、ハロモナス（Halomonas）属に属する微生物が生育でき、本発明の多糖体を生産する炭素源、窒素源、無機塩類及び微量栄養源を適量含有するものであれば特に制限されない。合成培地または天然培地のいずれも使用可能である。
炭素源としては、グルコース、フルクトース、ガラクトース、スクロース、グリセロールなどの糖質類、ヘミセルロース、でん粉、コーンスターチ等の天然高分子等が利用できる。中でも、グルコース、フルクトース、ガラクトース、スクロース、グリセロールなどの糖質類が好ましく用いられる。窒素源としては、硝酸塩、アンモニウム塩などの化合物；ペプトン、酵母エキス、コーンスティープリカー、ペプチド、アミノ酸、肉エキス、コーングルーテンミール、綿実油、脱脂大豆などの天然物が利用できる。無機塩類としては、例えば、ナトリウム塩、リン酸塩、マグネシウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、硫酸塩などが利用できる。微量栄養源としては、酵母エキス、各種ビタミン類などが利用できる。
【００２２】
培地中の炭素源の含有量は、通常１〜５重量％が適当であり、２〜４重量％が好ましい。窒素源の含有量は、通常は０．１〜３重量％が適当であり、０．５〜１重量％が好ましい。無機塩類の含有量は、通常は１〜５重量％が適当であり、２〜４重量％が好ましい。微量栄養源の含有量は、通常は０．０５〜１重量％が適当であり、０．１〜０．５重量％が好ましい。
【００２３】
培地の状態は、固体でも液体でもよい。液体培地を使用する場合には、静置培養でもよいが、振とう培養、通気攪拌培養の方がより高収量で多糖体を得ることができるので好ましい。
【００２４】
培養時のｐＨは、微生物が生育できて本発明の多糖体を生産しうるｐＨであれば特に制限されないが、通常はｐＨ５〜７．５が適当であり、ｐＨ５．５〜７．２が好ましい。培養温度は、特に制限されないが、通常は２０〜２５℃が適当であり、２１〜２３℃が好ましい。培養期間は、本発明の多糖体の生産量が最大に達する期間が選ばれる。通常は１〜５日が適当であり、２〜４日が好ましい。
【００２５】
上記の培養方法で得られた培養物から本発明の多糖体を採取する方法は、特に制限されるものではなく、当分野において一般に公知の方法を用いることができる。例えば、遠心分離やろ過などを用いて、培養物から菌体を除去した後、得られた培養液に２〜３倍量のメタノール、エタノール、イソプロパノール、アセトン等の有機溶媒を加えて沈殿を生じさせる。この沈殿物を遠心分離やろ過などを用いて採取し、水または１〜１０％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウム溶液に溶解させた後、アルコール等の有機溶媒を加えて沈殿を生じさせる。この操作を何回か繰り返すことによって、本発明の多糖体を得ることができる。あるいは、水または１〜１０％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウム溶液に溶解させた後、透析を行い、通風乾燥、熱風乾燥、噴霧乾燥、ドラム乾燥、減圧乾燥、凍結乾燥などの方法により、本発明の多糖体を得ることができる。あるいはまた、培養物にＳＤＳ、Ｔｗｅｅｎ、Ｔｒｉｔｏｎなどの界面活性剤を添加してあらかじめ菌体表面から多糖体を遊離させた後に、上記の方法により培養液を回収し、本発明の多糖体を得ることも好ましい。
【００２６】
上記採取方法の他に、限外ろ過を用いて、上記の培養液から本発明の多糖体以外の成分を除去し、得られた濃縮液を上述した乾燥工程に供する方法を採用しても良い。さらに、必要に応じて通常の多糖体の精製法に従って精製することにより、高純度精製品を得ることもできる。精製法としては、イオン交換、ゲルろ過等の各種のカラムクロマトグラフィー、４級アンモニウム塩による沈殿、塩析などを採用することができる。
【００２７】
本発明の多糖体は、上記のようにして培養物から採取することができる。得られた多糖体はそのまま用いることもできるが、高粘調である場合、例えば化粧品などの製剤設計のために、低分子化させて用いることもできる。低分子化の方法としては、温度による加水分解、酸による加水分解、酵素による加水分解などが挙げられる。これらの加水分解法は、多糖類の低分子化に通常用いられる公知の方法を用いることができる。これらの中でも、酸による硫酸基の脱離、残留酵素の除去処理の観点から、温度による加水分解が好ましく、特に１００℃で２時間程度の熱処理が好ましい。
【００２８】
本発明の多糖体は、上記のような方法で得られた多糖体をも包含するものである。
【００２９】
本発明の好ましい態様によれば、本発明の多糖体は、保湿効果、メラニン生産抑制効果またはその両方を奏することができる。このため、本発明の多糖体は、保湿剤またはメラニン生産抑制剤などの有効成分として用いることができる。以下、本発明の多糖体の用途について述べる。
【００３０】
本発明の好ましい態様によれば、本発明の多糖体は保湿効果を有しており、ヒアルロン酸と同等の保湿効果を奏することもできる。このため、本発明の多糖体は、化粧品や皮膚外用剤などの医薬品に配合される保湿剤として有用である。
【００３１】
本発明の保湿剤は、本発明の多糖体をそのまま、あるいは、ロウ類、ラノリン、界面活性剤、セタノール等の公知の医薬用または化粧用担体を用いて常法により製剤化すればよい。本発明の保湿剤における本発明の多糖体の含有量は特に制限されないが、０．０１〜５重量％が好ましく、０．０３〜２重量％がより好ましく、０．０５〜１重量％がさらに好ましく、０．1〜０．５重量％が特に好ましい。
【００３２】
本発明の保湿剤は、医薬品として、注射剤、座剤、外用剤等の非経口剤として使用できる。前記医薬用担体としては、これらの剤形に応じた通常用いられているものを特に制限なく使用することができる。例えば、本発明の保湿剤を軟膏、クリーム剤、液剤、貼付剤等の皮膚外用剤として用いることにより、皮膚の乾燥、かさつきなどの肌荒れを防止または改善することができる。本発明の保湿剤を、薬剤として用いる場合、本発明の多糖体の投与量は、多糖体の分子量や、製剤設計、患者の年齢、症状等に応じて適宜決定すればよい。
【００３３】
本発明の保湿剤はまた、化粧品素材として、化粧水、乳液、クリーム、パック等のフェーシャル化粧料；ファンデーション、口紅、アイシャドー等のメーキャップ化粧料；日焼け止め化粧料（サンスクリーン剤）；ボディー化粧料；芳香化粧料；メーク落とし、ボディーシャンプーなどの皮膚洗浄料；ヘアリキッド、ヘアトニック、ヘアコンディショナー、シャンプー、リンス、育毛料等の毛髪化粧料など、種々の形態の化粧品に配合することができる。前記化粧用担体は、これらの形態に応じた通常用いられているものを特に制限なく使用することができる。
【００３４】
また、本発明の好ましい態様によれば、本発明の多糖体はメラニン生産抑制効果を有する。このため、本発明の多糖体はメラニン生産抑制剤の有効成分として有用である。一般に、皮膚の色黒やシミ・ソバカスは、紫外線による刺激等によりメラノサイトが刺激され、そこで生合成されたメラニン色素が皮膚に沈着して発生するものと考えられている。本発明の多糖体は、このメラニンの生産を抑制することができるので、皮膚の色黒やシミ・ソバカスを予防または改善することができる。本発明のメラニン生産抑制剤における本発明の多糖体の含有量は特に制限されないが、０．０５〜１重量％が好ましく、０．１〜０．９重量％がより好ましく、０．２〜０．８重量％がさらに好ましく、０．３〜０．７重量％が特に好ましい。
【００３５】
本発明のメラニン生産抑制剤の調製方法は、特に制限されるものではなく、保湿剤と同様の方法で製剤化することができる。本発明のメラニン生産抑制剤は、美白用化粧品、医薬品あるいは食品などの素材として好適に用いることができる。なお、本発明のメラニン生産抑制剤を、薬剤として用いる場合、本発明の多糖体の投与量は、多糖体の分子量や、製剤設計、患者の年齢、症状等に応じて適宜決定すればよい。
【００３６】
上述のとおり、本発明の好ましい態様によれば、本発明の多糖体は、保湿効果、メラニン生産抑制効果またはその両方を奏することができるので、保湿成分あるいは美白成分として、化粧品、医薬品及び食品に好適に配合することができる。特に化粧品及び皮膚外用剤は皮膚に直接適用するものであるので、これらに配合すると、より効果的に保湿効果及びメラニン生産抑制効果を得ることができるという利点がある。以下、本発明の多糖体を配合した化粧品及び皮膚外用剤の具体例について述べる。
【００３７】
まず、本発明の化粧品について説明する。本発明の化粧品は、本発明の多糖体を含むものであれば特に制限されない。本発明の化粧品は、本発明の多糖体を含むものであるので、保湿効果を有し、皮膚の乾燥、かさつきなどの肌荒れを防止または改善すると共に、美白効果を奏することができる。
【００３８】
本発明の化粧品としては、本発明の多糖体の他に、例えば植物油等の油脂類、ラノリンやミツロウ等のロウ類、炭化水素類、脂肪酸、高級アルコール類、エステル類、種々の界面活性剤、色素、香料、ビタミン類、植物・動物抽出成分、紫外線吸収剤、抗酸化剤、防腐・殺菌剤等、通常の化粧品原料として使用されているものを適宜配合して製造することができる。また、抗炎症性の化粧品原料、例えば、甘草抽出成分（特にグリチルレチン酸）、塩酸ジフェンヒドラミン、アズレン、ｄｌ−α−トコフェロール及びその誘導体、ビタミンＢ2及びＢ6などと共に用いることにより、更にその効果を高めることもできる。
【００３９】
本発明の化粧品の形態は特に制限されず、化粧水、乳液、クリーム、パック等のフェーシャル化粧料；ファンデーション、口紅、アイシャドー等のメーキャップ化粧料；日焼け止め化粧料；ボディー化粧料；芳香化粧料；メーク落とし、ボディーシャンプーなどの皮膚洗浄料；ヘアリキッド、ヘアトニック、ヘアコンディショナー、シャンプー、リンス、育毛料等の毛髪化粧料などが挙げられる。
【００４０】
本発明の化粧品において、本発明の多糖体の配合量は形態によって適宜選択すればよいが、本発明の化粧品の全重量に対し、乾燥重量にして０．０１〜２重量％であることが好ましく、０．０２〜１重量％であることがより好ましく、０．０５〜０．５重量％であることがさらに好ましい。その他の添加剤の配合量は、各種形態の化粧品に通常用いられる範囲であれば特に制限されない。
【００４１】
各種形態の化粧品は、公知の方法に準じて製造すればよい。これらの化粧品の組成は、例えば、特許第３０２０３５３号公報、特開平８−４０８６８号公報などを参照することができる。
【００４２】
次に、本発明の皮膚外用剤について説明する。本発明の皮膚外用剤は、本発明の多糖体を含むものであるので、保湿効果を有し、皮膚の乾燥、かさつきなどの肌荒れを治療または予防すると共に、美白効果を奏することができる。
【００４３】
本発明の皮膚外用剤の剤形は任意であり、溶液系、可溶化系、乳化系、粉末分散系、水-油二層系、水-油-粉末三層系、ジェル、ミスト、スプレー、ムース、ロールオン、スティック等、いかなる剤形であってもよい。不織布等のシートに含浸あるいは塗布した製剤などとすることも可能である。
また、本発明の皮膚外用剤の製品形態も任意であり、例えば、軟膏、クリーム剤、液剤、貼付剤等が挙げられる。
【００４４】
本発明の皮膚外用剤において、本発明の多糖体の配合量は、剤形や製品形態に応じて適宜選択すればよく、特に制限されないが、皮膚外用剤の全重量に対し、乾燥重量にして０．０１〜２重量％であることが好ましく、０．０２〜１重量％であることがより好ましく、０．０５〜０．５重量％であることがさらに好ましい。
【００４５】
例えば、本発明の皮膚外用剤としては、本発明の多糖体の他に、例えば植物油等の油脂類、ラノリンやミツロウ等のロウ類、炭化水素類、脂肪酸、高級アルコール類、エステル類、種々の界面活性剤、色素、香料、ビタミン類、植物・動物抽出成分、紫外線吸収剤、抗酸化剤、防腐・殺菌剤等、通常の皮膚外用剤の原料として使用されているものを適宜配合して製造することができる。また、抗炎症性の皮膚外用剤原料、例えば、甘草抽出成分（特にグリチルレチン酸）、塩酸ジフェンヒドラミン、アズレン、ｄｌ−α−トコフェロール及びその誘導体、ビタミンＢ２及びＢ６などと共に用いることにより、更にその効果を高めることもできる。
【００４６】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００４７】
多糖体の製造
５００ｍＬの坂口フラスコに次の組成の培地を５０ｍＬ入れ、１２１℃で２０分間滅菌した後、平板培養していたハロモナス・マウラ（Halomonas marina）ＡＴＣＣ２５３７４を１白金耳分植菌し、振とう数毎分１５０ストローク、２２℃で１日間前培養を行った。
＜培地組成（ｐＨ７．０）＞
スクロース ３重量％
ペプトン ０．５重量％
酵母エキス ０．１重量％
（酵母エキス（Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ, Ｂａｃｔｏ）（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製））
人工海水 ３．６重量％
（ダイゴ人工海水ＳＰ（日本製薬株式会社製））
純水 残量
【００４８】
次に、３Ｌのジャーファーメンターに、前記組成の培地１．５Ｌを入れ、１２１℃で２０分間滅菌した。これに、前記で得られた培養液１５ｍＬを接種して添加し、培養温度２２℃、通気量１．０ｖｖｍ、攪拌数４００ｒｐｍにて４８時間培養した。
【００４９】
得られた培養物から遠心分離により菌体を除去した。得られた培養上清に２〜３倍量のエタノールを添加して沈殿を生じさせ、得られた沈殿物を遠心分離により回収した。この沈殿物を１０％（ｗ／ｖ）の塩化ナトリウム水溶液に溶解させて、再度２〜３倍量のエタノールを添加し、沈殿を生じさせ、得られた沈殿物を遠心分離により回収した。この操作（溶解、沈殿、回収）を数回繰り返した後、白色沈殿物を得た。得られた白色沈殿物を純水に溶解させて、透析により塩などを除去した後、凍結乾燥して白色の精製した多糖体を得た。
【００５０】
上記のようにして多糖体の製造を３回行った（実施例１−１、１−２及び１−３）。得られた多糖体の性状、紫外線吸収スペクトル及び赤外線吸収スペクトルは以下のとおりであった。
（１）性状：白色粉末
（２）紫外線吸収スペクトル：島津製作所製「ＵＶｍｉｎｉ−１２４０」を用いて測定した。代表例として実施例１−３の測定結果を図１に示す。図１に示されるように、２８０ｎｍおよび２６０ｎｍに吸収が認められないことから、たんぱく質、核酸は含まれていないことが確認できた。また、実施例１−１および１−２においても同様にたんぱく質、核酸が含まれていないことが確認できた。
（３）赤外線吸収スペクトル：日本分光株式会社製「ＦＴ／ＩＲ−６６０ｐｌｕｓ」を用いて測定した。代表例として実施例１−３の測定結果を図２に示す。図２に示されるように、３４００ｃｍ-1付近に炭水化物由来の水酸基の吸収が、２９５０ｃｍ-1付近には炭水化物由来のＣＨ、ＣＨ2の吸収が、１７３０ｃｍ-1及び１６２０ｃｍ-1付近にウロン酸特有の吸収がそれぞれ認められた。また、実施例１−１および１−２においても同様のスペクトルが検出された。
【００５１】
さらに、得られた多糖体について液体クロマトグラフィー分析及び分子量測定を行った。
【００５２】
（４）液体クロマトグラフィー分析
実施例１で得られた多糖体に対し、液体クロマトグラフィー分析を行った。カラムは、「Ｘｔｅｒｒａ ＲＰ１８」（Ｗａｔｅｒｓ社製）を使用し、移動相は０．２Ｍホウ酸ナトリウム：アセトニトリル＝９５：５（ｖ／ｖ）の混合液を使用した。検体及び標品は以下のようにして作製した。
【００５３】
実施例１で得られた多糖体を、４Ｍのトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）に溶解し、１００℃、３時間の条件下で酸加水分解を行った。空冷後、減圧乾固した後、充分に酸を除くため２−プロパノールを添加して再度、減圧乾固した。これにピリジン：メタノール＝５：９５（ｖ／ｖ）（４０μＬ）と無水酢酸（１０μＬ）を添加し、３０分間放置してＮ−アセチル化を行い、減圧乾固した。
次に、減圧乾固した多糖体の酸加水分解物に、純水（１０μＬ）とＡＢＥＥ標識化試薬（生化学工業製）（４０μＬ）とを加え、８０℃、１時間で保温し、４−アミノ安息香酸エチル（ＡＢＥＥ）で標識した。さらに、これに純水（２００μＬ）とクロロホルム（２００μＬ）とを加えて、遠心後、上清を検体とした。
【００５４】
同条件下で４−アミノ安息香酸エチル（ＡＢＥＥ）標識した１２種類の単糖（ガラクツロン酸、ガラクトース、マンノース、グルコース、アラビオース、リボース、Ｎ−アセチルマンノサミン、キシリトール、Ｎ−アセチルグルコサミン、フコース、ラムノース、Ｎ−アセチルガラクトサミン）を標品とした。実施例１−１〜１−３で得られたＨＰＬＣチャートをそれぞれ図３〜５に示した。
【００５５】
各々予め作製した検量線と各構成糖のピーク面積から求めた結果、各構成糖のモル比は表１のとおりであった。
【表１】
【００５６】
（５）分子量測定
得られた多糖体の分子量（重量平均分子量）を、東ソー株式会社製の「ＴＳＫ−ＧＥＬ（登録商標）ＧＭＰＷＸＬ」を使用し、０．２ＭＮａＣｌ／０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）を移動相とし、分子量既知のプルラン（昭和電工株式会社製）、デキストランＴ２０００（アマシャム バイオサイエンス株式会社製）を標準サンプルとして作成した分子量−保持時間標準曲線を使用して測定した。流速は０．５ｍＬ／分とし、サンプル濃度は０．１％（ｗ／ｖ）とした。その結果、多糖体の分子量は表２のとおりであった。なお、測定は３回行い、その平均値を多糖体の分子量とした。
【表２】
【実施例２】
【００５７】
多糖体の粘性および保湿性の評価
実施例１−１で得られた多糖体を純水に溶解し、多糖体の濃度が０．０５％（ｗ／ｖ）の水溶液を調製した。Ｂ型粘度計を使用し、回転数６ｒｐｍの条件で各水溶液の２５℃での粘度を測定した。また、比較のため、ヒアルロン酸（チッソ社製：Ｌｏｔ Ｎｏ．０６５９１０、分子量１１２万）についても粘度を測定した。その結果、実施例１−１で得られた多糖体の粘度は２３ｍＰａ・ｓであり、十分に実用的な粘性を有していることが示された。
【００５８】
次に、実施例１−１で得られた多糖体を３％（ｗ／ｖ）グリセロールに溶解し、濃度０．３％（ｗ／ｖ）の水溶液を調製した。コントロールには精製水を用い、陽性対照としてヒアルロン酸（チッソ社製：Ｌｏｔ Ｎｏ．０６５９１０、分子量１１２万）０．３％水溶液を用いた。
【００５９】
被験者には室温２２℃、湿度４０％の部屋にて２０分間安静にしてもらった後、前腕部内側に各水溶液を塗布（２×２ｃｍ）した。３分後、コットンで水溶液を軽くふき取り、この時点を開始時として、経時的に１５分後まで、皮膚の伝導度（コンダクタンス）を測定し、皮膚水分量を評価した。測定には、皮表角層水分量測定装置「ＳＫＩＣＯＮ−２００」（アイ・ビイ・エス株式会社製）を使用した。結果を表３に示す。
【００６０】
【表３】
【００６１】
表３に示されたとおり、本発明の多糖体は、ヒアルロン酸と同等の保湿効果を奏することが認められた。
【００６２】
次に、表４に示した組成の化粧水１００ｇに実施例１−１で得られた多糖体０．３ｇを添加したものと、無添加のものとを用い、５名の女性に対してモニタリングを行い、伸びとしっとり感について次の５段階（５：非常に優れている、４：優れている、３：良い、２：あまり良くない、１：悪い）で評価してもらった。その結果、伸びについては、５が３名、４が１名、３が１名、しっとり感については、５が０名、４が４名、３が１名であり、無添加の化粧水と比べて、実施例１で得られた多糖体を添加したものは伸びもよく、しっとり感があるという多数の意見が得られた。この結果から、本発明の多糖体を添加した化粧水の保湿性の高さが示された。
【００６３】
【表４】
【実施例３】
【００６４】
メラニン生産抑制試験
実施例１−１で得られた多糖類を純水に溶解し、被験物質とした。多糖類の濃度は表５に示した。１０ｖｏｌ％牛胎児血清、１００μ／ｍＬペニシリン及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製「ＧＩＢＣＯ０１１０５４」）を用い、５×１０4個／ｍＬに調製したＢ１６−Ｆ１０メラノーマ細胞浮遊液１．３５ｍＬを２４穴マイクロプレートの各ウェルに播種し、３７℃、５％ＣＯ2の条件下で２４時間培養した。２４時間培養後、被験物質１５０μＬを添加してさらに３日間培養した。培養終了後、培養液全量を抜き取り、１ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ溶液を２００μＬ添加して細胞を溶解し、そのうち、１００μＬを９６穴マイクロプレートに移し、４０５ｎｍにおける吸光度をマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ製「Ｅｍａｘ」）で測定した。被験物質のメラニン生産抑制率は以下の式を用いて算出した。なお、コントロール群としては、被検物質を添加しないこと以外は上記と同様にして調製した培養液を用いた。その結果を表５に示した。
メラニン生産抑制率（％）＝（１−（被験物質群の吸光度／コントロール群の吸光度））×１００
【００６５】
【表５】
【００６６】
表５から明らかなように、本発明の多糖体は、濃度依存的にメラニン生産抑制効果を奏することが示された。
【産業上の利用可能性】
【００６７】
本発明の多糖体は、化粧品、医薬品及び食品などに配合する保湿成分または美白成分として有用である。本発明の多糖体を配合することにより、肌荒れの防止または改善、保湿効果及び美白効果を付与することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】実施例１−１で得られた多糖体の紫外線吸収スペクトルを示したグラフである。
【図２】実施例１−１で得られた多糖体の赤外線吸収スペクトルを示したグラフである。
【図３】実施例１−１で得られた多糖体の構成単糖を示すＨＰＬＣ分析で得られたチャートである。
【図４】実施例１−２で得られた多糖体の構成単糖を示すＨＰＬＣ分析で得られたチャートである。
【図５】実施例１−３で得られた多糖体の構成単糖を示すＨＰＬＣ分析で得られたチャートである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
構成糖がＤ−リボース、Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｄ−Ｎ−アセチルガラクトサミン及びＤ−ガラクツロン酸の４種から本質的になり、ゲルろ過クロマトグラフィーにて測定した重量平均分子量が１００万〜６００万であることを特徴とする多糖体。
【請求項２】
構成糖のモル比がＤ−リボース：Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミン：Ｄ−Ｎ−アセチルガラクトサミン：Ｄ−ガラクツロン酸＝５５〜８５：１〜３０：１〜２５：１〜２５である、請求項１記載の多糖体。
【請求項３】
構成糖がＤ−リボース、Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｄ−Ｎ−アセチルガラクトサミン及びＤ−ガラクツロン酸の４種から本質的になり、ゲルろ過クロマトグラフィーにて測定した重量平均分子量が２５０万〜４５０万であり、構成糖のモル比がＤ−リボース：Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミン：Ｄ−Ｎ−アセチルガラクトサミン：Ｄ−ガラクツロン酸＝６５〜７５：８〜１８：３〜１３：３〜１３であることを特徴とする多糖体。
【請求項４】
ハロモナス属細菌を培養することによって得られる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の多糖体。
【請求項５】
ハロモナス属細菌がハロモナス・マリナ（Halomonas marina）である、請求項４記載の多糖体。
【請求項６】
ハロモナス・マリナ（Halomonas marina）がハロモナス・マリナＡＴＣＣ２５３７４株またはその変異株である、請求項５記載の多糖体。
【請求項７】
ハロモナス属細菌を培養し、その培養物より多糖体を分離精製することを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の多糖体の製造方法。
【請求項８】
ハロモナス属細菌がハロモナス・マリナ（Halomonas marina）である、請求項７記載の製造方法。
【請求項９】
ハロモナス・マリナ（Halomonas marina）がハロモナス・マリナＡＴＣＣ２５３７４株またはその変異株である、請求項８記載の製造方法。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の多糖体を含む保湿剤。
【請求項１１】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の多糖体を含むメラニン生産抑制剤。
【請求項１２】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の多糖体を含む化粧品。
【請求項１３】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の多糖体を含む皮膚外用剤。
【請求項１】
構成糖がＤ−リボース、Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｄ−Ｎ−アセチルガラクトサミン及びＤ−ガラクツロン酸の４種から本質的になり、ゲルろ過クロマトグラフィーにて測定した重量平均分子量が１００万〜６００万であることを特徴とする多糖体。
【請求項２】
構成糖のモル比がＤ−リボース：Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミン：Ｄ−Ｎ−アセチルガラクトサミン：Ｄ−ガラクツロン酸＝５５〜８５：１〜３０：１〜２５：１〜２５である、請求項１記載の多糖体。
【請求項３】
構成糖がＤ−リボース、Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｄ−Ｎ−アセチルガラクトサミン及びＤ−ガラクツロン酸の４種から本質的になり、ゲルろ過クロマトグラフィーにて測定した重量平均分子量が２５０万〜４５０万であり、構成糖のモル比がＤ−リボース：Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミン：Ｄ−Ｎ−アセチルガラクトサミン：Ｄ−ガラクツロン酸＝６５〜７５：８〜１８：３〜１３：３〜１３であることを特徴とする多糖体。
【請求項４】
ハロモナス属細菌を培養することによって得られる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の多糖体。
【請求項５】
ハロモナス属細菌がハロモナス・マリナ（Halomonas marina）である、請求項４記載の多糖体。
【請求項６】
ハロモナス・マリナ（Halomonas marina）がハロモナス・マリナＡＴＣＣ２５３７４株またはその変異株である、請求項５記載の多糖体。
【請求項７】
ハロモナス属細菌を培養し、その培養物より多糖体を分離精製することを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の多糖体の製造方法。
【請求項８】
ハロモナス属細菌がハロモナス・マリナ（Halomonas marina）である、請求項７記載の製造方法。
【請求項９】
ハロモナス・マリナ（Halomonas marina）がハロモナス・マリナＡＴＣＣ２５３７４株またはその変異株である、請求項８記載の製造方法。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の多糖体を含む保湿剤。
【請求項１１】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の多糖体を含むメラニン生産抑制剤。
【請求項１２】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の多糖体を含む化粧品。
【請求項１３】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の多糖体を含む皮膚外用剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２００９−２４０７５（Ｐ２００９−２４０７５Ａ）
【公開日】平成２１年２月５日（２００９．２．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−１８８１１３（Ｐ２００７−１８８１１３）
【出願日】平成１９年７月１９日（２００７．７．１９）
【出願人】（０００００２０７１）チッソ株式会社 (658)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年２月５日（２００９．２．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年７月１９日（２００７．７．１９）
【出願人】（０００００２０７１）チッソ株式会社 (658)
【Ｆターム（参考）】
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