天然抽出物より得られた脱顆粒抑制剤、β−ヘキソサミニダーゼ遊離抑制剤、抗アレルギー用または抗炎症用の食品、医薬、動物飼料用組成物および化粧品原料用組成物
【課題】高い抗アレルギー作用または抗炎症作用が期待され、鎮静・催眠作用等の副作用がなく高い安全性を有し、また原料の入手や製造が容易であり、しかも風味が穏やかな好塩基球細胞脱顆粒抑制剤、肥満細胞脱顆粒抑制剤およびβ−ヘキソサミニダーゼ遊離抑制剤を提供する。
【解決手段】ガラナ（Paullinia cupana Kunth.）植物の果実または種子の極性溶媒抽出物を有効成分とする好塩基球細胞脱顆粒抑制剤、肥満細胞脱顆粒抑制剤およびβ−ヘキソサミニダーゼ遊離抑制剤であり、抗アレルギー用または抗炎症用の食品、医薬品、動物飼料用組成物、化粧品原料用組成物としての用途を有する。
【解決手段】ガラナ（Paullinia cupana Kunth.）植物の果実または種子の極性溶媒抽出物を有効成分とする好塩基球細胞脱顆粒抑制剤、肥満細胞脱顆粒抑制剤およびβ−ヘキソサミニダーゼ遊離抑制剤であり、抗アレルギー用または抗炎症用の食品、医薬品、動物飼料用組成物、化粧品原料用組成物としての用途を有する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脱顆粒抑制効果またはβ−ヘキソサミニダーゼ遊離抑制効果を有する、花粉症等のアレルギー性疾患の各種炎症に有効な、脱顆粒抑制剤またはβ−ヘキソサミニダーゼ遊離抑制剤に係り、さらに詳しくは、少量で抗炎症作用を発揮し、鎮静・催眠作用等の副作用がなく、食品等に添加しても風味が損なわれず、長期間にわたって連続的に摂取できる、脱顆粒抑制剤またはβ−ヘキソサミニダーゼ遊離抑制剤及びそれらの新規な用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体には本来、外部からの異質なものを排除し恒常性を保つための免疫機能が備わっている。ところが、この免疫機能が体を障害するように働く場合があり、この過度の免疫機能による障害反応の一種を特にアレルギーと呼ぶ。アレルギーは微生物、植物、動物、薬物、化学物質、食物等に由来する原因物質に対して免疫担当細胞が過剰反応し、活性化された好塩基球、肥満細胞、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球などから放出される生理活性物質により体内の組織が障害されるものである。アレルギーは反応してから発症するまでの時間により、数分〜数十分の比較的短時間で障害反応が現れる即時型アレルギーと、数時間後から障害反応が見られその後数日にわたってゆっくり進行する遅延型アレルギーとに分けられる。
【０００３】
血液中に存在する好塩基球や、血管周辺や結合組織に存在する肥満細胞はヒスタミン、トロンボキサンＡ２、ロイコトリエン等ケミカルメディエーターを含む顆粒を持ち、これらの細胞が脱顆粒することによってヒスタミン等と共にβ−ヘキソサミニダーゼ等の酵素を遊離し、喘息、アトピー性湿疹などの即時型アレルギー反応を誘起することが知られている。
【０００４】
なお、アレルギー疾患はアトピー性疾患と同一ではない。アトピー性疾患の一部はアレルギーが関与しているが、アトピー性皮膚炎に代表されるように、アトピー性疾患は他に微生物感染や遺伝的要素等がその発症に複合的な役割を果たしている。
【０００５】
また、好塩基球や肥満細胞の脱顆粒により放出される物質（ケミカルメディエーター）は、炎症を起こす物質としてもよく知られている。
【０００６】
このように、肥満細胞や好塩基球は即時型アレルギーへの関与が強く、これら細胞の脱顆粒を抑制することによってアレルギーを軽減することができるものと考えられる。したがって、効果的な好塩基球細胞脱顆粒抑制剤あるいは肥満細胞脱顆粒抑制剤を開発して、有用な抗アレルギー剤を提供することが望まれている。
【０００７】
抗アレルギー剤としては、これまでに、即時型アレルギーであるＩ型アレルギー反応における肥満細胞からの脱顆粒やケミカルメディエーター遊離を抑制する薬剤、ヒスタミンとＨ１受容体の結合を抑制する薬剤、脂質型ケミカルメディエーターであるトロンボキサンＡ２を抑制する薬剤、ロイコトリエンを抑制する薬剤などが開発されているが、眠気や鎮静など中枢神経抑制作用、血尿など膀胱炎様症状等の副作用があり、それらの使用には医師による厳密な指導を必要とし、使用者には運転時には服用しない等、細心の注意が求められる。
【０００８】
近年、生薬を用いた漢方療法の研究が注目されている。漢方療法は、天然物由来の生薬を用いて治療するものであり、若干遅効性ではあるものの、局所症状の改善だけでなく、体質改善も合わせて行うことができるので薬効が全身にわたるという利点がある。薬物に比べ副作用が少なく長期にわたって服用しても安全性が高いものが多い。上記漢方療法に用いられる漢方薬としては、葛根湯、小青竜湯、越婢加求湯等が知られている。これら漢方薬は数種の生薬で構成されており、例えば葛根湯の場合は、葛根、麻黄、桂皮、芍薬、大棗、甘草、生姜等の生薬が含まれている。
【０００９】
これらの漢方薬は、顆粒、錠剤等の形態で用いられているが、特有の苦みがある、後味が悪い等風味上の問題を有することが多く、服用しづらいという欠点があった。そこで、漢方薬中の構成生薬成分を加工食品、飲料のような食品の形態で提供すれば、服用しやすくなるのではないかと考えられるが、これらの生薬の中には、食品として認可されていないものもある。また、食品に用いることができても、特有の臭いや味を有するために、食品本来の風味を損なうものが多い。また、一般に市販されている抗アレルギー剤や食品は、炎症全般に効果を発揮するものではなく、対症療法であることが多い。従って、花粉症のような各種の炎症が組合わさった症状を呈する場合には、十分効果を発揮しないことが多い。
【００１０】
また、漢方薬は、化粧料として皮膚の炎症の改善に用いる場合でも、製品に褐変が生じたり、感作性がある等の問題が起こるものが多い。
【００１１】
ところで、ガラナ（学名：Paullinia cupana Kunth.）はムクロジ科に属する植物であり、その種子はカフェインのほか、ガラニン、キサンチン類等カフェインの類縁物質を含み、中南米では疲労回復や興奮作用に茶等の飲料として利用されてきた。ガラナに含まれるカフェインとその類縁物質はカフェイン単独より代謝が遅いので、穏やかで持続する作用が得られ、習慣性もなく、適切に摂取すれば安全であるといわれている（非特許文献１、非特許文献２）。近年はコーラ飲料、チョコレート等にも広く用いられている。
【００１２】
ガラナの薬理効果として、神経強壮、偏頭痛の改善、肥満の改善、低血圧時の血圧上昇等が報告されており、神経強壮薬、興奮性飲料（アスリートのダイエタリーサプリメント等）のほか、各種保健薬にも用いられている。
【００１３】
しかしながら、ガラナの脱顆粒抑制作用、β−ヘキソサミニダーゼ遊離抑制作用、抗アレルギー作用、抗炎症作用に関して、これまでに報告はまったくない。
【００１４】
【非特許文献１】独立行政法人国立健康・栄養研究所、『「健康食品」の安全性・有効性情報』、[２００８年９月９日検索]、インターネット＜http://hfnet.nih.go.jp/contents/detail498.html＞
【非特許文献２】清水俊雄ら、『機能性食品素材便覧』、薬事日報社（２００４）、ｐ．２７３−２７４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明の課題は、このような事情に鑑み行われたものであって、高い抗アレルギー作用または抗炎症作用が期待され、鎮静・催眠作用等の副作用がなく高い安全性を有し、また原料の入手や製造が容易であり、しかも風味が穏やかな好塩基球細胞脱顆粒抑制剤、肥満細胞脱顆粒抑制剤またはβ−ヘキソサミニダーゼ遊離抑制剤、および抗アレルギー用または抗炎症用の食品、医薬品、動物飼料用組成物、化粧品原料用組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、ガラナ（Paullinia cupana Kunth.）の果実または種子を原料に、極性溶媒を用いて抽出して得られる極性溶媒抽出物(以下、単に抽出物と略称する)が、好塩基球細胞脱顆粒抑制作用、肥満細胞脱顆粒抑制作用ならびにβ−ヘキソサミニダーゼ遊離抑制作用を有し、優れた抗アレルギー作用または抗炎症作用を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１７】
すなわち本発明の好塩基球細胞脱顆粒抑制剤は、ガラナ（Paullinia cupana Kunth.）植物の果実または種子の抽出物を有効成分とすることを特徴とする。
【００１８】
また本発明の肥満細胞脱顆粒抑制剤は、ガラナ（Paullinia cupana Kunth.）植物の果実または種子の抽出物を有効成分とすることを特徴とする。
【００１９】
また本発明のβ−ヘキソサミニダーゼ遊離抑制剤は、ガラナ（Paullinia cupana Kunth.）植物の果実または種子の抽出物を有効成分とすることを特徴とする。
【００２０】
本発明に係る抗アレルギー作用または抗炎症作用を有する食品、医薬品、動物飼料用組成物、化粧品原料用組成物は、上記好塩基球細胞脱顆粒抑制剤、肥満細胞脱顆粒抑制剤およびβ−ヘキソサミニダーゼ遊離抑制剤のうちいずれか１つ以上を含有することを特徴とする。
【００２１】
なお、本発明の上記好塩基球細胞脱顆粒抑制剤、肥満細胞脱顆粒抑制剤およびβ−ヘキソサミニダーゼ遊離抑制剤は、アレルギー作用または炎症作用の予防剤あるいは改善剤のいずれであっても良く、もちろん両者を兼ねるものであっても良い。
【発明の効果】
【００２２】
本発明におけるガラナ植物の果実または種子の抽出物（以下、「ガラナ抽出物」ということがある）は、抗アレルギー剤、抗炎症剤として有用である。本発明のガラナ抽出物は、既存の抗アレルギー剤、抗炎症剤によくみられる鎮静・催眠作用等の副作用がなく、むしろ中枢神経を刺激し覚醒作用・神経強壮作用を有するので、鎮静・催眠作用等を気にすることなく用いることができる。また、本発明のガラナ抽出物は簡単な方法で調製することができ、風味も穏やかであるため、医薬品、飲食品、化粧品、浴用剤、動物用飼料等への利用性が高く、その応用範囲はきわめて広いものと期待される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
以下、本発明の一実施形態について詳細に説明する。
本発明におけるガラナ抽出物は、ガラナ（Paullinia cupana Kunth.）植物の果実または種子を原料に用いて製造する。
【００２４】
本発明で使用するガラナ植物の生産方法は特に限定されず、自生したもののみならず、人工的に栽培したものであっても構わない。また、本発明で使用するガラナ植物の採取時期や生育年数、栽培方法、栽培期間についても特に制限されない。
【００２５】
ガラナ抽出物の製造方法は特に制限されるものではなく、通常用いられる方法により製造することができる。また、抽出条件も特に制約はなく、例えば、種子および／または果実をそのまま、または裁断、粉砕もしくは細紛した後、水、アルコール等の極性溶媒で抽出することにより製造される。
【００２６】
極性溶媒を用いた抽出は、一般に使用する溶媒に合わせて常圧〜加圧下で常温〜溶媒の沸点の温度条件下で１０分〜１週間程度行えばよい。抽出に使用する極性溶媒としては、植物種や処理工程にあわせて適宜選択して用いればよく、例えば、水のほか、アルコール類（例えば、メタノール、無水エタノール、エタノール等の低級アルコール、又はプロピレングリコール、１,３−ブチレングリコール等の多価アルコール）、アセトン等のケトン類、酢酸等の有機酸、等の有機溶媒が挙げられる。これらの溶媒は単独で用いることもできるが、２種類以上を任意に組み合わせて使用することもできる。なお、食品として用いる場合のように、有機溶媒の残留が好ましくない場合は、特に水、エタノール、含水エタノール等を使用することが好ましい。抽出方法としては、特に制限はなく、常温ホモジナイズ抽出、遠赤外線抽出、超音波照射抽出、還流抽出、超臨界流体抽出等が使用可能である。
【００２７】
具体的には、例えば以下の方法が使用できる。すなわち、収穫後のガラナ種子、果実をそのまま、あるいは乾燥・熟成したものを細砕し、抽出溶媒を５〜２０倍量加え、常圧下、室温で１週間程度静置、又は抽出溶媒の沸点付近で１０〜３０分程抽出してから濾過して得られた濾液をそのまま液状として用いるか、該濾液を減圧乾固あるいは凍結乾燥してガラナ抽出物を得る。
【００２８】
上記のようにして得られたガラナ抽出物は、そのままの状態で使用することもできるが、必要に応じ、その効力に影響のない範囲で更に脱臭、脱色等の精製処理を加えても良い。このような精製処理としては、通常の手段を任意に選択して行えば良く、例えば濾過、イオン交換樹脂、活性炭カラム等を用い、吸着・脱色・精製等を行なえば良い。さらに、凍結乾燥、濃縮処理等により溶液状、ペースト状、ゲル状、または粉末状の精製物を得ることができる。
【００２９】
また、ガラナ抽出物の性状を改善するため、タンナーゼ、グルコシダーゼ、ラッカーゼ、ペルオキシダーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ等の酵素を用いて適宜改質してもよい。
【００３０】
本発明におけるガラナ抽出物の形態としては、特に限定されず、製造して得られた抽出物をそのまま用いてもかまわないが、例えば前記抽出物と必要に応じて加えられる他の成分とからなる組成物の形態で用いてもよい。このような組成物としては、例えば前記抽出物と適当な担体（食品または医薬品、化粧料に使用されているデキストリン等）とからなる組成物が挙げられる。これらの組成物の具体例としては、例えば摂取に適した食品（飲食物等）、医薬品、化粧品原料、動物飼料、動物飼料用添加剤等の形態が挙げられる。このような形態で上記ガラナ抽出物を摂取する際における該抽出物の人または哺乳動物への投与量は、通常、１日当たり０．０１〜２０００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲であるのがよく、望ましくは１日当たり０．１〜２００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲であるが、この範囲に限定されるものではない。
【００３１】
食品あるいは動物飼料に利用するには、上記抽出物をその他の各種成分と混合し、例えば固形の食品または動物飼料、クリーム状ないしジャム状の半流動食品または動物飼料、ゲル状の食品または動物飼料、飲料等の形態に調製する。また、抽出物はそのまま食品や動物飼料に配合してもよく、あるいは、必要に応じて適当な担体と組み合わせて製造した粉状、顆粒状、カプセル状、タブレット状、液状等の形態で配合してもよい。
【００３２】
上記抽出物と共に食品や動物飼料に配合されるその他の成分は、特に制限がなく、通常使用される各種成分がいずれも使用可能である。このような成分としては、例えばブドウ糖、マルトース、ソルビトール、ステビオサイド、コーンシロップ、乳糖、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸、乳酸、Ｌ−アスコルビン酸、ｄｌ−α−トコフェロール、グリセリン、プロピレングリコール、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、アラビアガム、カラギーナン、カゼイン、ゼラチン、ペクチン、寒天、ビタミンＢ群、ニコチン酸アミド、パントテン酸カルシウム、アミノ酸類、カルシウム塩類、色素、香料、保存剤等が挙げられ、これらを食品または動物飼料の種類に応じて適宜配合すればよい。
【００３３】
前記食品の具体例としては、清涼飲料、ジュース、コーヒー、紅茶、リキュール、牛乳、乳清飲料、乳酸菌飲料、キャンデー、チューインガム、チョコレート、グミ、ヨーグルト、アイスクリーム、プディング等が挙げられる。動物飼料の具体例としては、ドッグフード、キャットフード、家畜用混合飼料等が挙げられる。ガラナ抽出物の食品または動物飼料への含有量は０．０１〜１００ｍｇ／ｇの範囲が適当であるが、この範囲に限定されるものではない。
【００３４】
医薬製剤の形態で使用するには、上記抽出物に通常の製薬上許容される担体を加えて、固体、半固体または液体の形態に調製する。具体的な形態としては、例えば錠剤、カプセル、丸剤、顆粒剤、散剤、乳濁液、懸濁剤、シロップ剤、ペレット剤等の経口投与剤、軟膏剤等の外用剤、注射剤等の非経口投与剤が挙げられる。
【００３５】
上記医薬製剤の投与量としては、剤形や疾患等に合わせて適宜調整すればよいが、内服剤であれば、製剤全量中、ガラナ抽出物を固形分換算で、０.５〜９９質量％、好ましくは５〜９０質量％の範囲で配合すればよい。外用薬としては、ガラナ抽出物の医薬製剤への含有量は０．０１〜５０ｍｇ／ｇの範囲が適当であるが、この範囲に限定されるものではない。
【００３６】
化粧品としては、例えば化粧水、乳液、ローション、トニック、化粧クリーム、スプレー剤、口紅、ファンデーション、シャンプー、リンス、入浴剤等があげられる。これらの化粧品は、ガラナ抽出物を、通常使用される化粧料基剤と混合して製造される。また、外用剤としては、例えば軟膏、クリーム、液剤、貼付剤等があげられ、従来より製薬上使用されている担体と組み合わせて製造できる。これらの化粧品および外用剤におけるガラナ抽出物の含有量は、０．００１〜１００ｍｇ／ｇの範囲が適当であるが、この範囲に限定されるものではない。
【００３７】
製剤化に際しては、剤形に応じて従来から使用されている界面活性剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤等の担体を使用することができる。好ましくは、例えばデンプン、乳糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩等の固形担体、蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、エタノール等のアルコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等の液体担体、さらに各種の動植物油、白色ワセリン、パラフィン、ロウ等の油性担体等が挙げられる。
【００３８】
これらガラナ抽出物を含有する食品、医薬品、動物飼料用組成物、化粧品原料用組成物は、好塩基球細胞脱顆粒抑制作用、肥満細胞脱顆粒抑制作用ならびにβ−ヘキソサミニダーゼ遊離抑制作用を有し、それによって抗アレルギー作用および抗炎症作用を有する。そのため、生体内に存在する好塩基球細胞や肥満細胞が放出するケミカルメディエーターによって生じる種々の障害や疾病の予防、改善、治療に有効である。
【００３９】
本発明において好塩基球細胞脱顆粒抑制作用あるいは肥満細胞脱顆粒抑制作用は、脱顆粒により細胞から遊離したβ−ヘキソサミニダーゼの酵素活性を測定することにより評価される。
【００４０】
β−ヘキソサミニダーゼは、白血球が放出する化学伝達物質の一つで、アレルギーの原因物質であるヒスタミンとほぼ同時に放出されることが知られている。ラット白血病細胞（ＲＢＬ−２Ｈ３）は、人の好塩基球や肥満細胞と同様の機能を持つことが知られており、ＲＢＬ−２Ｈ３からのβ−ヘキソサミニダーゼ遊離抑制効果がＩ型アレルギー抑制効果の一つの指標と考えられている。従って、ＲＢＬ−２Ｈ３からのβ−ヘキソサミニダーゼ遊離抑制を測定することにより、抗炎症効果を評価することができる。従来、抗炎症効果の指標としては、ヒアルロニダーゼ阻害活性や、３−α−ＨＳＤ阻害活性が知られているが、炎症によっては、この指標のみでは充分判断できないことがあり、特に即時型アレルギーに対しては、これらの指標のみでは判断できないことがある。また、β−ヘキソサミニダーゼ遊離抑制効果を評価することは、他の評価方法より、ｉｎ ｖｉｖｏの評価との相関性が高いものである。
【実施例】
【００４１】
以下に製造例および実施例を記載して、本発明をさらに具体的に説明する。ただし、これらの実施例によって、本発明の範囲は限定的に解釈されるものではない。
【００４２】
＜ガラナ抽出物の調製方法＞
原料として乾燥後粉砕したガラナ（Paullinia cupana Kunth.）の種子１００ ｇを５０ %エタノール（エタノール：水＝ 50：50(重量比)）０．９ Ｌに加え、２時間還流を行い、室温冷却後、濾過し、濾液を一晩冷蔵放置した。ついで、濾液をさらに濾過し、得られた濾液を減圧濃縮し、さらに凍結乾燥してガラナ抽出物を得た。
【００４３】
試験例１＜β−ヘキソサミニダーゼ遊離試験＞
ラット白血病細胞（RBL-2H3）を24ウェルプレートに９．６×１０4 個/ウェル（４００μｌウェル）播種し、３７℃で24時間培養した。培養後、RBL-2H3細胞をTyrode buffer(+)（137 mM NaCl, 5.6 mM Glucose, 11.9 mM NaHCO3, 2.7 mM KCl, 41.7 mM NaH2PO4, 1 mM CaCl2, 0.5 mM MgCl2）で洗浄した。脱顆粒を促すカルシウムイオノフォアA23187（SIGMA社，終濃度１０μＭ）を加えて37 ℃下30 分間反応した。各サンプル液は、A23187を加える前に添加した。なお、各サンプル液は、ガラナ抽出物を含む表１に示す各抽出物およびカフェインの所定量をそれぞれ30 % エタノールに加えて調製した。
24 ウェルプレートを3 分間、1500 rpmで遠心して各上清１００μｌを96ウェルプレートへいれた。1 mM p-nitrophenyl-N-acetyl β-D-glucosaminide（PNAG）を加えて混和後、CO2インキュベーターにて37 ℃、90 分間反応し、反応溶液に、１００μｌ ｓｔｏｐ ｂｕｆｆｅｒ（０．２Ｍ グリシン，ｐＨ 11.0)を加えた。マイクロプレートリーダーModel550（BIO-RAD社）にて吸光度を測定し、以下の式によって竈−ヘキソサミニダーゼ遊離率を求めた（測定波長405 nm、参照波長610 nm）。また被験物質のみの吸光度も併せて測定し、補正した。それぞれ3ウェルずつ測定を行い、平均値を求めた。
【数１】
細胞内全β−ヘキソサミニダーゼの測定には、2 ％ Triton X-100を加えて溶解した細胞を遠心分離した上清を用いた。
ガラナ抽出物等のサンプル添加によるβ−ヘキソサミニダーゼ遊離阻害率は以下の式によって求めた。
【数２】
さらに、細胞のβ−ヘキソサミニダーゼ遊離を50%抑制するのに必要なサンプル量（IC50）を求め、IC50にて活性の強さを評価した。
【００４４】
また、陽性対照として、すでに抗アレルギー作用または抗炎症作用が報告されているカリン、クコ葉、サマーセイボリー、桃の葉、よもぎ、ローズヒップ、ローズマリーの各抽出物のβ−ヘキソサミニダーゼ遊離抑制作用を測定しガラナ抽出物と比較した。なお、これらサンプルの抽出物は、30〜50 % エタノールを溶媒としガラナ抽出物と同じ操作により抽出したものである。また、ガラナの主要成分の１つであるカフェインも同様にしてIC50を測定した。それらの結果を表１に示す。
【表１】
【００４５】
IC50は、細胞のβ−ヘキソサミニダーゼ遊離を50％抑制するのに必要なサンプル量を表すので、数値が低いほど強い活性を有することを表す。測定の結果、本発明のガラナ抽出物は抗アレルギー作用、抗炎症作用の指標である細胞のβ−ヘキソサミニダーゼ遊離を抑制し、すでに報告があるカリン抽出物や、ローズマリー抽出物よりも強いものであった。
【００４６】
ガラナにはカフェインが多く含まれている。カフェインは抗アレルギー作用を有することが記述されている（塩崎哲也ほか，「Ｉ型アレルギーに対する茶抽出物、カテキン、カフェインの効果」，薬学雑誌（1997）117，p448-457）。しかし、カフェインのβ−ヘキソサミニダーゼ遊離抑制作用を検討したところ、表１に示すようにβ−ヘキソサミニダーゼ遊離抑制作用は認められず、したがって好塩基球細胞脱顆粒抑制作用および肥満細胞脱顆粒抑制作用も有さないことから、ガラナ抽出物のβ−ヘキソサミニダーゼ遊離抑制作用はカフェイン以外の他の成分に起因するものであると推測される。
【００４７】
試験例２＜マウスＩｇＥ刺激β−ヘキソサミニダーゼ遊離試験＞
ラット白血病細胞（RBL-2H3）を24ウェルプレートに4.8×１０4 個/ウェル（４００μl/ウェル）播種し、37 ℃で24時間培養した。培養後、終濃度が1 μg/mlになるように抗ジニトロフェニルIgE抗体（SIGMA社）を培養液に加えた。37 ℃下1 時間さらに培養し、RBL-2H3細胞をTyrode bufferで洗浄した。ガラナ抽出物を含有したサンプル液を加え、ついで終濃度が1 μg/mlになるようDNP-HSA（SIGMA社）を添加した。37 ℃下2 時間培養した。ついで、試験例１と同じ方法を用いて培養上清のβ−ヘキソサミニダーゼ遊離率とガラナ抽出物のIC50を測定した。
【００４８】
その結果、ガラナ抽出物のIC50は16.0 μg/mlであった。ガラナ抽出物はヒトＩｇＥ刺激による細胞のβ−ヘキソサミニダーゼ遊離をも抑制した。
【００４９】
試験例３＜ＲＢＬ−２Ｈ３細胞の生細胞数測定＞
ラット白血病細胞（RBL-2H3）を24ウェルプレートに3.6×105 個/ウェル（５００μｌウェル）ずつ播種した。ガラナ抽出物を含有したサンプル液（終濃度200，100，50，０μｇ／ｍｌ）を添加し、CO2インキュベーターで２４時間培養した。細胞を回収した後に、PBSに懸濁し、0.5 ％トリパンブルー（和光純薬工業）と１:１の割合で懸濁した。それらの生細胞数を血球計算板でカウントした。
コントロールに対する各サンプル濃度での生細胞数の割合（％）は次式で計算した。結果を生存率として表２に示す。
【数３】
【表２】
【００５０】
表２を見ると、ガラナ抽出物は100μg/mlでRBL-2H3細胞の生存に影響はなく、200μg/mlの高用量でも生存率は90 ％とほとんど影響がなかった。この実験から、ガラナ抽出物はRBL-2H3細胞の増殖を抑制して脱顆粒を抑えたのではない、すなわちガラナ抽出物はRBL-2H3細胞を死滅させずに脱顆粒を抑制したことがわかる。また、２４時間共存下であっても細胞に与えるダメージは少なく、細胞毒性は少ないと考えられる。
【００５１】
試験例４＜ＲＢＬ−２Ｈ３細胞の生細胞数測定＞
さらに、ガラナ抽出物がRBL-2H3細胞の生育に与える影響を調べるため、試験例３と同じ方法でガラナ抽出物濃度が400μg/mlであるときの生細胞数を測定した。ただし、ガラナ抽出物添加後の細胞の培養時間を試験例１と同様に３０分とした。
【００５２】
測定の結果、ガラナ抽出物濃度400 μg/mlに30分間暴露されたときのRBL-2H3細胞の生存率は97 ％であり、ガラナ抽出物はRBL-2H3細胞の生存にほとんど影響を与えなかった。一方表１をみると、ガラナ抽出物は30分の培養でRBL-2H3細胞のβ−ヘキソサミニダーゼ遊離を強く抑制した。この実験からも、ガラナ抽出物はRBL-2H3細胞の増殖を抑制して脱顆粒を抑えたのではないことがわかる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脱顆粒抑制効果またはβ−ヘキソサミニダーゼ遊離抑制効果を有する、花粉症等のアレルギー性疾患の各種炎症に有効な、脱顆粒抑制剤またはβ−ヘキソサミニダーゼ遊離抑制剤に係り、さらに詳しくは、少量で抗炎症作用を発揮し、鎮静・催眠作用等の副作用がなく、食品等に添加しても風味が損なわれず、長期間にわたって連続的に摂取できる、脱顆粒抑制剤またはβ−ヘキソサミニダーゼ遊離抑制剤及びそれらの新規な用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体には本来、外部からの異質なものを排除し恒常性を保つための免疫機能が備わっている。ところが、この免疫機能が体を障害するように働く場合があり、この過度の免疫機能による障害反応の一種を特にアレルギーと呼ぶ。アレルギーは微生物、植物、動物、薬物、化学物質、食物等に由来する原因物質に対して免疫担当細胞が過剰反応し、活性化された好塩基球、肥満細胞、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球などから放出される生理活性物質により体内の組織が障害されるものである。アレルギーは反応してから発症するまでの時間により、数分〜数十分の比較的短時間で障害反応が現れる即時型アレルギーと、数時間後から障害反応が見られその後数日にわたってゆっくり進行する遅延型アレルギーとに分けられる。
【０００３】
血液中に存在する好塩基球や、血管周辺や結合組織に存在する肥満細胞はヒスタミン、トロンボキサンＡ２、ロイコトリエン等ケミカルメディエーターを含む顆粒を持ち、これらの細胞が脱顆粒することによってヒスタミン等と共にβ−ヘキソサミニダーゼ等の酵素を遊離し、喘息、アトピー性湿疹などの即時型アレルギー反応を誘起することが知られている。
【０００４】
なお、アレルギー疾患はアトピー性疾患と同一ではない。アトピー性疾患の一部はアレルギーが関与しているが、アトピー性皮膚炎に代表されるように、アトピー性疾患は他に微生物感染や遺伝的要素等がその発症に複合的な役割を果たしている。
【０００５】
また、好塩基球や肥満細胞の脱顆粒により放出される物質（ケミカルメディエーター）は、炎症を起こす物質としてもよく知られている。
【０００６】
このように、肥満細胞や好塩基球は即時型アレルギーへの関与が強く、これら細胞の脱顆粒を抑制することによってアレルギーを軽減することができるものと考えられる。したがって、効果的な好塩基球細胞脱顆粒抑制剤あるいは肥満細胞脱顆粒抑制剤を開発して、有用な抗アレルギー剤を提供することが望まれている。
【０００７】
抗アレルギー剤としては、これまでに、即時型アレルギーであるＩ型アレルギー反応における肥満細胞からの脱顆粒やケミカルメディエーター遊離を抑制する薬剤、ヒスタミンとＨ１受容体の結合を抑制する薬剤、脂質型ケミカルメディエーターであるトロンボキサンＡ２を抑制する薬剤、ロイコトリエンを抑制する薬剤などが開発されているが、眠気や鎮静など中枢神経抑制作用、血尿など膀胱炎様症状等の副作用があり、それらの使用には医師による厳密な指導を必要とし、使用者には運転時には服用しない等、細心の注意が求められる。
【０００８】
近年、生薬を用いた漢方療法の研究が注目されている。漢方療法は、天然物由来の生薬を用いて治療するものであり、若干遅効性ではあるものの、局所症状の改善だけでなく、体質改善も合わせて行うことができるので薬効が全身にわたるという利点がある。薬物に比べ副作用が少なく長期にわたって服用しても安全性が高いものが多い。上記漢方療法に用いられる漢方薬としては、葛根湯、小青竜湯、越婢加求湯等が知られている。これら漢方薬は数種の生薬で構成されており、例えば葛根湯の場合は、葛根、麻黄、桂皮、芍薬、大棗、甘草、生姜等の生薬が含まれている。
【０００９】
これらの漢方薬は、顆粒、錠剤等の形態で用いられているが、特有の苦みがある、後味が悪い等風味上の問題を有することが多く、服用しづらいという欠点があった。そこで、漢方薬中の構成生薬成分を加工食品、飲料のような食品の形態で提供すれば、服用しやすくなるのではないかと考えられるが、これらの生薬の中には、食品として認可されていないものもある。また、食品に用いることができても、特有の臭いや味を有するために、食品本来の風味を損なうものが多い。また、一般に市販されている抗アレルギー剤や食品は、炎症全般に効果を発揮するものではなく、対症療法であることが多い。従って、花粉症のような各種の炎症が組合わさった症状を呈する場合には、十分効果を発揮しないことが多い。
【００１０】
また、漢方薬は、化粧料として皮膚の炎症の改善に用いる場合でも、製品に褐変が生じたり、感作性がある等の問題が起こるものが多い。
【００１１】
ところで、ガラナ（学名：Paullinia cupana Kunth.）はムクロジ科に属する植物であり、その種子はカフェインのほか、ガラニン、キサンチン類等カフェインの類縁物質を含み、中南米では疲労回復や興奮作用に茶等の飲料として利用されてきた。ガラナに含まれるカフェインとその類縁物質はカフェイン単独より代謝が遅いので、穏やかで持続する作用が得られ、習慣性もなく、適切に摂取すれば安全であるといわれている（非特許文献１、非特許文献２）。近年はコーラ飲料、チョコレート等にも広く用いられている。
【００１２】
ガラナの薬理効果として、神経強壮、偏頭痛の改善、肥満の改善、低血圧時の血圧上昇等が報告されており、神経強壮薬、興奮性飲料（アスリートのダイエタリーサプリメント等）のほか、各種保健薬にも用いられている。
【００１３】
しかしながら、ガラナの脱顆粒抑制作用、β−ヘキソサミニダーゼ遊離抑制作用、抗アレルギー作用、抗炎症作用に関して、これまでに報告はまったくない。
【００１４】
【非特許文献１】独立行政法人国立健康・栄養研究所、『「健康食品」の安全性・有効性情報』、[２００８年９月９日検索]、インターネット＜http://hfnet.nih.go.jp/contents/detail498.html＞
【非特許文献２】清水俊雄ら、『機能性食品素材便覧』、薬事日報社（２００４）、ｐ．２７３−２７４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明の課題は、このような事情に鑑み行われたものであって、高い抗アレルギー作用または抗炎症作用が期待され、鎮静・催眠作用等の副作用がなく高い安全性を有し、また原料の入手や製造が容易であり、しかも風味が穏やかな好塩基球細胞脱顆粒抑制剤、肥満細胞脱顆粒抑制剤またはβ−ヘキソサミニダーゼ遊離抑制剤、および抗アレルギー用または抗炎症用の食品、医薬品、動物飼料用組成物、化粧品原料用組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、ガラナ（Paullinia cupana Kunth.）の果実または種子を原料に、極性溶媒を用いて抽出して得られる極性溶媒抽出物(以下、単に抽出物と略称する)が、好塩基球細胞脱顆粒抑制作用、肥満細胞脱顆粒抑制作用ならびにβ−ヘキソサミニダーゼ遊離抑制作用を有し、優れた抗アレルギー作用または抗炎症作用を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１７】
すなわち本発明の好塩基球細胞脱顆粒抑制剤は、ガラナ（Paullinia cupana Kunth.）植物の果実または種子の抽出物を有効成分とすることを特徴とする。
【００１８】
また本発明の肥満細胞脱顆粒抑制剤は、ガラナ（Paullinia cupana Kunth.）植物の果実または種子の抽出物を有効成分とすることを特徴とする。
【００１９】
また本発明のβ−ヘキソサミニダーゼ遊離抑制剤は、ガラナ（Paullinia cupana Kunth.）植物の果実または種子の抽出物を有効成分とすることを特徴とする。
【００２０】
本発明に係る抗アレルギー作用または抗炎症作用を有する食品、医薬品、動物飼料用組成物、化粧品原料用組成物は、上記好塩基球細胞脱顆粒抑制剤、肥満細胞脱顆粒抑制剤およびβ−ヘキソサミニダーゼ遊離抑制剤のうちいずれか１つ以上を含有することを特徴とする。
【００２１】
なお、本発明の上記好塩基球細胞脱顆粒抑制剤、肥満細胞脱顆粒抑制剤およびβ−ヘキソサミニダーゼ遊離抑制剤は、アレルギー作用または炎症作用の予防剤あるいは改善剤のいずれであっても良く、もちろん両者を兼ねるものであっても良い。
【発明の効果】
【００２２】
本発明におけるガラナ植物の果実または種子の抽出物（以下、「ガラナ抽出物」ということがある）は、抗アレルギー剤、抗炎症剤として有用である。本発明のガラナ抽出物は、既存の抗アレルギー剤、抗炎症剤によくみられる鎮静・催眠作用等の副作用がなく、むしろ中枢神経を刺激し覚醒作用・神経強壮作用を有するので、鎮静・催眠作用等を気にすることなく用いることができる。また、本発明のガラナ抽出物は簡単な方法で調製することができ、風味も穏やかであるため、医薬品、飲食品、化粧品、浴用剤、動物用飼料等への利用性が高く、その応用範囲はきわめて広いものと期待される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
以下、本発明の一実施形態について詳細に説明する。
本発明におけるガラナ抽出物は、ガラナ（Paullinia cupana Kunth.）植物の果実または種子を原料に用いて製造する。
【００２４】
本発明で使用するガラナ植物の生産方法は特に限定されず、自生したもののみならず、人工的に栽培したものであっても構わない。また、本発明で使用するガラナ植物の採取時期や生育年数、栽培方法、栽培期間についても特に制限されない。
【００２５】
ガラナ抽出物の製造方法は特に制限されるものではなく、通常用いられる方法により製造することができる。また、抽出条件も特に制約はなく、例えば、種子および／または果実をそのまま、または裁断、粉砕もしくは細紛した後、水、アルコール等の極性溶媒で抽出することにより製造される。
【００２６】
極性溶媒を用いた抽出は、一般に使用する溶媒に合わせて常圧〜加圧下で常温〜溶媒の沸点の温度条件下で１０分〜１週間程度行えばよい。抽出に使用する極性溶媒としては、植物種や処理工程にあわせて適宜選択して用いればよく、例えば、水のほか、アルコール類（例えば、メタノール、無水エタノール、エタノール等の低級アルコール、又はプロピレングリコール、１,３−ブチレングリコール等の多価アルコール）、アセトン等のケトン類、酢酸等の有機酸、等の有機溶媒が挙げられる。これらの溶媒は単独で用いることもできるが、２種類以上を任意に組み合わせて使用することもできる。なお、食品として用いる場合のように、有機溶媒の残留が好ましくない場合は、特に水、エタノール、含水エタノール等を使用することが好ましい。抽出方法としては、特に制限はなく、常温ホモジナイズ抽出、遠赤外線抽出、超音波照射抽出、還流抽出、超臨界流体抽出等が使用可能である。
【００２７】
具体的には、例えば以下の方法が使用できる。すなわち、収穫後のガラナ種子、果実をそのまま、あるいは乾燥・熟成したものを細砕し、抽出溶媒を５〜２０倍量加え、常圧下、室温で１週間程度静置、又は抽出溶媒の沸点付近で１０〜３０分程抽出してから濾過して得られた濾液をそのまま液状として用いるか、該濾液を減圧乾固あるいは凍結乾燥してガラナ抽出物を得る。
【００２８】
上記のようにして得られたガラナ抽出物は、そのままの状態で使用することもできるが、必要に応じ、その効力に影響のない範囲で更に脱臭、脱色等の精製処理を加えても良い。このような精製処理としては、通常の手段を任意に選択して行えば良く、例えば濾過、イオン交換樹脂、活性炭カラム等を用い、吸着・脱色・精製等を行なえば良い。さらに、凍結乾燥、濃縮処理等により溶液状、ペースト状、ゲル状、または粉末状の精製物を得ることができる。
【００２９】
また、ガラナ抽出物の性状を改善するため、タンナーゼ、グルコシダーゼ、ラッカーゼ、ペルオキシダーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ等の酵素を用いて適宜改質してもよい。
【００３０】
本発明におけるガラナ抽出物の形態としては、特に限定されず、製造して得られた抽出物をそのまま用いてもかまわないが、例えば前記抽出物と必要に応じて加えられる他の成分とからなる組成物の形態で用いてもよい。このような組成物としては、例えば前記抽出物と適当な担体（食品または医薬品、化粧料に使用されているデキストリン等）とからなる組成物が挙げられる。これらの組成物の具体例としては、例えば摂取に適した食品（飲食物等）、医薬品、化粧品原料、動物飼料、動物飼料用添加剤等の形態が挙げられる。このような形態で上記ガラナ抽出物を摂取する際における該抽出物の人または哺乳動物への投与量は、通常、１日当たり０．０１〜２０００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲であるのがよく、望ましくは１日当たり０．１〜２００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲であるが、この範囲に限定されるものではない。
【００３１】
食品あるいは動物飼料に利用するには、上記抽出物をその他の各種成分と混合し、例えば固形の食品または動物飼料、クリーム状ないしジャム状の半流動食品または動物飼料、ゲル状の食品または動物飼料、飲料等の形態に調製する。また、抽出物はそのまま食品や動物飼料に配合してもよく、あるいは、必要に応じて適当な担体と組み合わせて製造した粉状、顆粒状、カプセル状、タブレット状、液状等の形態で配合してもよい。
【００３２】
上記抽出物と共に食品や動物飼料に配合されるその他の成分は、特に制限がなく、通常使用される各種成分がいずれも使用可能である。このような成分としては、例えばブドウ糖、マルトース、ソルビトール、ステビオサイド、コーンシロップ、乳糖、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸、乳酸、Ｌ−アスコルビン酸、ｄｌ−α−トコフェロール、グリセリン、プロピレングリコール、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、アラビアガム、カラギーナン、カゼイン、ゼラチン、ペクチン、寒天、ビタミンＢ群、ニコチン酸アミド、パントテン酸カルシウム、アミノ酸類、カルシウム塩類、色素、香料、保存剤等が挙げられ、これらを食品または動物飼料の種類に応じて適宜配合すればよい。
【００３３】
前記食品の具体例としては、清涼飲料、ジュース、コーヒー、紅茶、リキュール、牛乳、乳清飲料、乳酸菌飲料、キャンデー、チューインガム、チョコレート、グミ、ヨーグルト、アイスクリーム、プディング等が挙げられる。動物飼料の具体例としては、ドッグフード、キャットフード、家畜用混合飼料等が挙げられる。ガラナ抽出物の食品または動物飼料への含有量は０．０１〜１００ｍｇ／ｇの範囲が適当であるが、この範囲に限定されるものではない。
【００３４】
医薬製剤の形態で使用するには、上記抽出物に通常の製薬上許容される担体を加えて、固体、半固体または液体の形態に調製する。具体的な形態としては、例えば錠剤、カプセル、丸剤、顆粒剤、散剤、乳濁液、懸濁剤、シロップ剤、ペレット剤等の経口投与剤、軟膏剤等の外用剤、注射剤等の非経口投与剤が挙げられる。
【００３５】
上記医薬製剤の投与量としては、剤形や疾患等に合わせて適宜調整すればよいが、内服剤であれば、製剤全量中、ガラナ抽出物を固形分換算で、０.５〜９９質量％、好ましくは５〜９０質量％の範囲で配合すればよい。外用薬としては、ガラナ抽出物の医薬製剤への含有量は０．０１〜５０ｍｇ／ｇの範囲が適当であるが、この範囲に限定されるものではない。
【００３６】
化粧品としては、例えば化粧水、乳液、ローション、トニック、化粧クリーム、スプレー剤、口紅、ファンデーション、シャンプー、リンス、入浴剤等があげられる。これらの化粧品は、ガラナ抽出物を、通常使用される化粧料基剤と混合して製造される。また、外用剤としては、例えば軟膏、クリーム、液剤、貼付剤等があげられ、従来より製薬上使用されている担体と組み合わせて製造できる。これらの化粧品および外用剤におけるガラナ抽出物の含有量は、０．００１〜１００ｍｇ／ｇの範囲が適当であるが、この範囲に限定されるものではない。
【００３７】
製剤化に際しては、剤形に応じて従来から使用されている界面活性剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤等の担体を使用することができる。好ましくは、例えばデンプン、乳糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩等の固形担体、蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、エタノール等のアルコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等の液体担体、さらに各種の動植物油、白色ワセリン、パラフィン、ロウ等の油性担体等が挙げられる。
【００３８】
これらガラナ抽出物を含有する食品、医薬品、動物飼料用組成物、化粧品原料用組成物は、好塩基球細胞脱顆粒抑制作用、肥満細胞脱顆粒抑制作用ならびにβ−ヘキソサミニダーゼ遊離抑制作用を有し、それによって抗アレルギー作用および抗炎症作用を有する。そのため、生体内に存在する好塩基球細胞や肥満細胞が放出するケミカルメディエーターによって生じる種々の障害や疾病の予防、改善、治療に有効である。
【００３９】
本発明において好塩基球細胞脱顆粒抑制作用あるいは肥満細胞脱顆粒抑制作用は、脱顆粒により細胞から遊離したβ−ヘキソサミニダーゼの酵素活性を測定することにより評価される。
【００４０】
β−ヘキソサミニダーゼは、白血球が放出する化学伝達物質の一つで、アレルギーの原因物質であるヒスタミンとほぼ同時に放出されることが知られている。ラット白血病細胞（ＲＢＬ−２Ｈ３）は、人の好塩基球や肥満細胞と同様の機能を持つことが知られており、ＲＢＬ−２Ｈ３からのβ−ヘキソサミニダーゼ遊離抑制効果がＩ型アレルギー抑制効果の一つの指標と考えられている。従って、ＲＢＬ−２Ｈ３からのβ−ヘキソサミニダーゼ遊離抑制を測定することにより、抗炎症効果を評価することができる。従来、抗炎症効果の指標としては、ヒアルロニダーゼ阻害活性や、３−α−ＨＳＤ阻害活性が知られているが、炎症によっては、この指標のみでは充分判断できないことがあり、特に即時型アレルギーに対しては、これらの指標のみでは判断できないことがある。また、β−ヘキソサミニダーゼ遊離抑制効果を評価することは、他の評価方法より、ｉｎ ｖｉｖｏの評価との相関性が高いものである。
【実施例】
【００４１】
以下に製造例および実施例を記載して、本発明をさらに具体的に説明する。ただし、これらの実施例によって、本発明の範囲は限定的に解釈されるものではない。
【００４２】
＜ガラナ抽出物の調製方法＞
原料として乾燥後粉砕したガラナ（Paullinia cupana Kunth.）の種子１００ ｇを５０ %エタノール（エタノール：水＝ 50：50(重量比)）０．９ Ｌに加え、２時間還流を行い、室温冷却後、濾過し、濾液を一晩冷蔵放置した。ついで、濾液をさらに濾過し、得られた濾液を減圧濃縮し、さらに凍結乾燥してガラナ抽出物を得た。
【００４３】
試験例１＜β−ヘキソサミニダーゼ遊離試験＞
ラット白血病細胞（RBL-2H3）を24ウェルプレートに９．６×１０4 個/ウェル（４００μｌウェル）播種し、３７℃で24時間培養した。培養後、RBL-2H3細胞をTyrode buffer(+)（137 mM NaCl, 5.6 mM Glucose, 11.9 mM NaHCO3, 2.7 mM KCl, 41.7 mM NaH2PO4, 1 mM CaCl2, 0.5 mM MgCl2）で洗浄した。脱顆粒を促すカルシウムイオノフォアA23187（SIGMA社，終濃度１０μＭ）を加えて37 ℃下30 分間反応した。各サンプル液は、A23187を加える前に添加した。なお、各サンプル液は、ガラナ抽出物を含む表１に示す各抽出物およびカフェインの所定量をそれぞれ30 % エタノールに加えて調製した。
24 ウェルプレートを3 分間、1500 rpmで遠心して各上清１００μｌを96ウェルプレートへいれた。1 mM p-nitrophenyl-N-acetyl β-D-glucosaminide（PNAG）を加えて混和後、CO2インキュベーターにて37 ℃、90 分間反応し、反応溶液に、１００μｌ ｓｔｏｐ ｂｕｆｆｅｒ（０．２Ｍ グリシン，ｐＨ 11.0)を加えた。マイクロプレートリーダーModel550（BIO-RAD社）にて吸光度を測定し、以下の式によって竈−ヘキソサミニダーゼ遊離率を求めた（測定波長405 nm、参照波長610 nm）。また被験物質のみの吸光度も併せて測定し、補正した。それぞれ3ウェルずつ測定を行い、平均値を求めた。
【数１】
細胞内全β−ヘキソサミニダーゼの測定には、2 ％ Triton X-100を加えて溶解した細胞を遠心分離した上清を用いた。
ガラナ抽出物等のサンプル添加によるβ−ヘキソサミニダーゼ遊離阻害率は以下の式によって求めた。
【数２】
さらに、細胞のβ−ヘキソサミニダーゼ遊離を50%抑制するのに必要なサンプル量（IC50）を求め、IC50にて活性の強さを評価した。
【００４４】
また、陽性対照として、すでに抗アレルギー作用または抗炎症作用が報告されているカリン、クコ葉、サマーセイボリー、桃の葉、よもぎ、ローズヒップ、ローズマリーの各抽出物のβ−ヘキソサミニダーゼ遊離抑制作用を測定しガラナ抽出物と比較した。なお、これらサンプルの抽出物は、30〜50 % エタノールを溶媒としガラナ抽出物と同じ操作により抽出したものである。また、ガラナの主要成分の１つであるカフェインも同様にしてIC50を測定した。それらの結果を表１に示す。
【表１】
【００４５】
IC50は、細胞のβ−ヘキソサミニダーゼ遊離を50％抑制するのに必要なサンプル量を表すので、数値が低いほど強い活性を有することを表す。測定の結果、本発明のガラナ抽出物は抗アレルギー作用、抗炎症作用の指標である細胞のβ−ヘキソサミニダーゼ遊離を抑制し、すでに報告があるカリン抽出物や、ローズマリー抽出物よりも強いものであった。
【００４６】
ガラナにはカフェインが多く含まれている。カフェインは抗アレルギー作用を有することが記述されている（塩崎哲也ほか，「Ｉ型アレルギーに対する茶抽出物、カテキン、カフェインの効果」，薬学雑誌（1997）117，p448-457）。しかし、カフェインのβ−ヘキソサミニダーゼ遊離抑制作用を検討したところ、表１に示すようにβ−ヘキソサミニダーゼ遊離抑制作用は認められず、したがって好塩基球細胞脱顆粒抑制作用および肥満細胞脱顆粒抑制作用も有さないことから、ガラナ抽出物のβ−ヘキソサミニダーゼ遊離抑制作用はカフェイン以外の他の成分に起因するものであると推測される。
【００４７】
試験例２＜マウスＩｇＥ刺激β−ヘキソサミニダーゼ遊離試験＞
ラット白血病細胞（RBL-2H3）を24ウェルプレートに4.8×１０4 個/ウェル（４００μl/ウェル）播種し、37 ℃で24時間培養した。培養後、終濃度が1 μg/mlになるように抗ジニトロフェニルIgE抗体（SIGMA社）を培養液に加えた。37 ℃下1 時間さらに培養し、RBL-2H3細胞をTyrode bufferで洗浄した。ガラナ抽出物を含有したサンプル液を加え、ついで終濃度が1 μg/mlになるようDNP-HSA（SIGMA社）を添加した。37 ℃下2 時間培養した。ついで、試験例１と同じ方法を用いて培養上清のβ−ヘキソサミニダーゼ遊離率とガラナ抽出物のIC50を測定した。
【００４８】
その結果、ガラナ抽出物のIC50は16.0 μg/mlであった。ガラナ抽出物はヒトＩｇＥ刺激による細胞のβ−ヘキソサミニダーゼ遊離をも抑制した。
【００４９】
試験例３＜ＲＢＬ−２Ｈ３細胞の生細胞数測定＞
ラット白血病細胞（RBL-2H3）を24ウェルプレートに3.6×105 個/ウェル（５００μｌウェル）ずつ播種した。ガラナ抽出物を含有したサンプル液（終濃度200，100，50，０μｇ／ｍｌ）を添加し、CO2インキュベーターで２４時間培養した。細胞を回収した後に、PBSに懸濁し、0.5 ％トリパンブルー（和光純薬工業）と１:１の割合で懸濁した。それらの生細胞数を血球計算板でカウントした。
コントロールに対する各サンプル濃度での生細胞数の割合（％）は次式で計算した。結果を生存率として表２に示す。
【数３】
【表２】
【００５０】
表２を見ると、ガラナ抽出物は100μg/mlでRBL-2H3細胞の生存に影響はなく、200μg/mlの高用量でも生存率は90 ％とほとんど影響がなかった。この実験から、ガラナ抽出物はRBL-2H3細胞の増殖を抑制して脱顆粒を抑えたのではない、すなわちガラナ抽出物はRBL-2H3細胞を死滅させずに脱顆粒を抑制したことがわかる。また、２４時間共存下であっても細胞に与えるダメージは少なく、細胞毒性は少ないと考えられる。
【００５１】
試験例４＜ＲＢＬ−２Ｈ３細胞の生細胞数測定＞
さらに、ガラナ抽出物がRBL-2H3細胞の生育に与える影響を調べるため、試験例３と同じ方法でガラナ抽出物濃度が400μg/mlであるときの生細胞数を測定した。ただし、ガラナ抽出物添加後の細胞の培養時間を試験例１と同様に３０分とした。
【００５２】
測定の結果、ガラナ抽出物濃度400 μg/mlに30分間暴露されたときのRBL-2H3細胞の生存率は97 ％であり、ガラナ抽出物はRBL-2H3細胞の生存にほとんど影響を与えなかった。一方表１をみると、ガラナ抽出物は30分の培養でRBL-2H3細胞のβ−ヘキソサミニダーゼ遊離を強く抑制した。この実験からも、ガラナ抽出物はRBL-2H3細胞の増殖を抑制して脱顆粒を抑えたのではないことがわかる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ガラナ（Paullinia cupana Kunth.）植物の果実または種子の極性溶媒抽出物を有効成分とする好塩基球細胞脱顆粒抑制剤。
【請求項２】
ガラナ（Paullinia cupana Kunth.）植物の果実または種子の極性溶媒抽出物を有効成分とする肥満細胞脱顆粒抑制剤。
【請求項３】
ガラナ（Paullinia cupana Kunth.）植物の果実または種子の極性溶媒抽出物を有効成分とするβ−ヘキソサミニダーゼ遊離抑制剤。
【請求項４】
ガラナ（Paullinia cupana Kunth.）植物の果実または種子の極性溶媒抽出物を含有する、抗アレルギー作用または抗炎症作用を有する食品。
【請求項５】
ガラナ（Paullinia cupana Kunth.）植物の果実または種子の極性溶媒抽出物を有効成分とする、抗アレルギー作用または抗炎症作用を有する医薬品。
【請求項６】
ガラナ（Paullinia cupana Kunth.）植物の果実または種子の極性溶媒抽出物を含有する、抗アレルギー作用または抗炎症作用を有する動物飼料。
【請求項７】
ガラナ（Paullinia cupana Kunth.）植物の果実または種子の極性溶媒抽出物を含有する、抗アレルギー作用または抗炎症作用を有する化粧品。
【請求項１】
ガラナ（Paullinia cupana Kunth.）植物の果実または種子の極性溶媒抽出物を有効成分とする好塩基球細胞脱顆粒抑制剤。
【請求項２】
ガラナ（Paullinia cupana Kunth.）植物の果実または種子の極性溶媒抽出物を有効成分とする肥満細胞脱顆粒抑制剤。
【請求項３】
ガラナ（Paullinia cupana Kunth.）植物の果実または種子の極性溶媒抽出物を有効成分とするβ−ヘキソサミニダーゼ遊離抑制剤。
【請求項４】
ガラナ（Paullinia cupana Kunth.）植物の果実または種子の極性溶媒抽出物を含有する、抗アレルギー作用または抗炎症作用を有する食品。
【請求項５】
ガラナ（Paullinia cupana Kunth.）植物の果実または種子の極性溶媒抽出物を有効成分とする、抗アレルギー作用または抗炎症作用を有する医薬品。
【請求項６】
ガラナ（Paullinia cupana Kunth.）植物の果実または種子の極性溶媒抽出物を含有する、抗アレルギー作用または抗炎症作用を有する動物飼料。
【請求項７】
ガラナ（Paullinia cupana Kunth.）植物の果実または種子の極性溶媒抽出物を含有する、抗アレルギー作用または抗炎症作用を有する化粧品。
【公開番号】特開２０１０−７０５３１（Ｐ２０１０−７０５３１Ａ）
【公開日】平成２２年４月２日（２０１０．４．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２４３０６３（Ｐ２００８−２４３０６３）
【出願日】平成２０年９月２２日（２００８．９．２２）
【出願人】（５９１０１６８３９）長岡香料株式会社 (20)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年４月２日（２０１０．４．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年９月２２日（２００８．９．２２）
【出願人】（５９１０１６８３９）長岡香料株式会社 (20)
【Ｆターム（参考）】
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