幅広い温度におけるプロテアーゼ変異体の活性
本発明は、特に食器洗浄用製品に有用なプロテアーゼ組成物を提供する。
図１Ａ
図１Ａ
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特に、食器洗剤用製品に好適なプロテアーゼ組成物を提供する。
【背景施術】
【０００２】
通常、従来の国内の及び工業的に生産されている食器洗剤用組成物は、食器の洗浄及び消毒のために高いアルカリ性洗剤及び塩素系漂白剤を含む。しかしながら、これらは、家庭、病院、カフェテリア、ケイタリング等における食器にしばしば存在するタンパク質含有汚れを除去することに欠点を有する。更に、非常に高いアルカリ洗剤及び塩素系漂白剤は、消費者又は環境にやさしくないと考えられている。
【０００３】
タンパク質精製の汚れを除去することに効果的な洗浄用組成物を提供するために数多くの試みがなされてきた。これらの組成物はアルカリ条件下で（例えば、少なくともｐＨ９．５）で活性を有するプロテアーゼを含む。しかしながら、そのような組成物は、消費者に食器用洗剤として好ましいと従来考えられている液体又はゲル形態に製剤化することが難しい。更に、アルカリ性食器洗剤用組成物は、しばしは、刺激物であると考えられている。
【０００４】
低ｐＨ（例えば、ｐＨ９．５未満のｐＨ）の食器用洗剤を製造するための試みがなされてきた。これらの組成物は、安全で、環境にやさしく、ゲル及び液体に製剤化することが可能であった。しかしながら。低ｐＨの近年の食器洗浄用組成物は、該組成物中に高濃度の酵素（例えば、プロテアーゼ）が配合ざれているにも関わらず、汚れを除去するには、あまり効果的ではなかった。
【０００５】
従って、食器からタンパク質性の汚れを効果的に除去する食器洗浄用組成物に対する需要が本分野において存在する。更に、環境及び使用者に対してやさしく、使用が容易な形態に製剤化することができ、経済的な食器洗浄組用成物に対する需要も存在する。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は食器用洗剤製品に用いるのに改良された性質を有する変異体プロテアーゼを提供する。幾つかの好適な態様において、該変異体プロテアーゼは少なくとも以下のアミノ酸配列を有するｐＢ９２セリンプロテアーゼのアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列相同性を有する。
Ｈ２Ｎ−
【化１】
更なる態様において、変異体プロテアーゼは配列番号２に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも、９９％の配列相同性を有している。本明細書における各種態様において、変異体プロテアーゼは、野生型ＰＢ９２プロテアーゼと比較した場合、改良された相同性を有している。
【０００７】
幾つかの好適な態様において、本発明は開始プロテアーゼと比較して改良された洗浄性能を有する変異体プロテアーゼを提供する。幾つかの好適な態様において、この酵素は、本明細書の表１で規定する置換を有し、０４９、０４５、０４６、０４７／０４８、０５０、０５１／０５２、０５３、０５４、０５５／０５６、０５７、０５８、０５９、及び０６０として設計されたものを含む。更なる態様において、本発明は追加的な変異体（例えば、置換、挿入、及び／又は欠失）を有するこれらの酵素を提供する。
【０００８】
幾つか特に好適な態様において、以下のアミノ酸配列を有する０４９として設計された酵素を提供する。
【化２】
【０００９】
本発明は、本発明で説明する変異体プロテアーゼの少なくとも１つを含む、タンパク質分解酵素製品を含む新しい酵素の食器用洗剤も提供する。
【００１０】
更なる態様において、本発明は修飾されたスブチリシンを含む食器洗浄用組成物を提供する。前記スブチリシンは配列番号２で定義される配列に少なくとも１つの置換を含む。スブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の位置に各位置は対応しており、置換はＧ１１８、Ｓ１２８、Ｐ１２９、Ｓ１３０、及びＳ１６６から選択される。
【００１１】
幾つかの好適な態様において、修飾されたスブチリシンはＧ１１８、Ｓ１２８、Ｐ１２９、及びＰ１３０における置換を含む。幾つかの特に好適な態様において、修飾されたスブチリシンはＧ１１８Ｖにおける置換と少なくとも１つの追加的な置換とを含む。幾つかの特に好適な態様において、修飾されたスブチリシンはＳ１２８Ｃ、Ｓ１２８Ｒ、Ｐ１２９Ｑ、Ｐ１２９Ｒ、Ｓ１３０Ｐ、及びＳ１３０Ｇからなる群から選択される。幾つかの態様において、修飾されたスブチリシンのアミノ酸配列は配列番号３で定義される。
【００１２】
本発明は修飾されたスブチリシンを含む食器洗浄用組成物を含む態様も提供する。各位置はスブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の位置に対応しており、スブチリシンは配列番号２で定義される配列中に１つの置換を含み、該置換はＳ１３０Ｔである。
【００１３】
本発明は修飾されたスブチリシンをコードする単離核酸も提供する。前記スブチリシンは配列番号２で定義される配列中に少なくとも２つの置換を含む。各位置は、スブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の位置に対応する。位置はＧ１１８、Ｓ１２８、Ｐ１２９、Ｓ１３０、及びＳ１６６から選択される。幾つかの態様において、この核酸はＧ１１８、Ｓ１２８、Ｐ１２９、及びＳ１３０の位置における置換を含む修飾スブチリシンである。幾つかの態様において、この核酸はＧ１１８、Ｓ１２８、Ｐ１２９、及びＳ１３０の位置における置換を含む。幾つかの好適な態様において、この核酸はＧ１１８及び少なくとも１つの追加的な変異を含む修飾されたスブチリシンをコードする。幾つかの特に好適な態様において、この核酸は更に、Ｓ１２８Ｆ、Ｓ１２８Ｌ、Ｓ１２８Ｎ、Ｓ１２８Ｒ、Ｓ１２８Ｖ、Ｐ１２９Ｅ、Ｐ１２９Ｌ、Ｐ１２９Ｍ、Ｐ１２９Ｎ、Ｐ１２９Ｌ、Ｐ１２９Ｑ、Ｐ１２９Ｓ、Ｓ１３０Ａ、Ｓ１３０Ｋ、Ｓ１３０Ｐ、Ｓ１３０Ｔ、Ｓ１３０Ｖ、及びＳ１６６Ｄからなる群より選択される追加的な変異を含む。更なる好適な態様において、この核酸はＳ１２９、Ｓ１３０、及びＳ１３０の位置における変異を含む修飾されたスブチリシンをコードする。更なる好適な態様において、この核酸は、Ｓ１２８Ｃ、Ｓ１２８Ｒ、Ｐ１２９Ｑ，Ｓ１３０Ｄ、及びＳ１３０Ｇから選択される置換を含む。
【００１４】
幾つかの好適な態様において、修飾されたスブチリシンのアミノ酸配列は配列番号３で定義される。幾つかの追加的な態様において、本発明は配列番号３で定義するアミノ酸配列をコードする単離核酸を提供する。
【００１５】
更なる追加的な態様において、本発明は前述の少なくとも１つのアミノ酸を含むベクターを提供する。更なる態様において、本発明は前で定義された単離核酸の少なくとも１つを含むベクターを提供する。更なる態様において、本発明は上で説明した少なくとも１つのベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００１６】
本発明は食器の洗浄方法も提供する。該方法は、上で定義される少なくとも１つの修飾されたスブチリシンと食器とを提供する工程、並びに食器の洗浄に効果的な条件下で、食器を修飾されたスブチリシンに接触せる工程とを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１Ａ】はＰＢ９２プロテアーゼ遺伝子を含む変異誘発ベクターの構築を説明する。
【００１８】
【図１Ｂ】は本発明の幾つかの態様における変異誘発手順を示す。
【００１９】
【図１Ｃ】はＰＢ９２プロテアーゼ遺伝子を含む発現ベクターの構築を説明する。
【００２０】
【図２Ａ】はＰＢ９２プロテアーゼ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１）及びコードされたタンパク質、プロタンパク質、及び成熟タンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【００２１】
【図２Ｂ】はＰＢ９２プロテアーゼ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１）及びコードされたタンパク質、プロタンパク質、及び成熟タンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明は、食器洗浄用製品のための少なくとも１つの変異プロテアーゼを含む方法及び組成物を提供する。
【００２３】
特に定義しない限り、本発明の実施は、分子生物学、微生物学、タンパク質精製、タンパク質エンジニアリング、タンパク質及びＤＮＡ配列決定、組換えＤＮＡ分野、工業的な酵素の使用及び開発の分野において、当業者の知識の範囲内である技術を用いて行う。本明細書に記載されている全ての特許、特許出願、文献、及び刊行物は参照により本明細書に援用される。
【００２４】
更に、ここに記載されている標題は本発明を限定するために用いるものではない。本発明は明細書全体を参照することにより理解されなければならない。従って、以下で説明する各種用語の定義は、明細書全体を参照することによりより深く理解される。しかしながら、発明の理解を促進するために以下で多くの用語を説明する。
【００２５】
別途定義しない限り、本明細書で用いる化学的及び技術的用語は本発明の属する技術分野における当業者により通常理解されているものと同じ意味を有する。例えば、Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ ａｎｄ Ｓａｉｎｓｂｕｒｙ, Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ, ２ｄ Ｅｄ., Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ, ＮＹ (１９９４)；及びＨａｌｅ ａｎｄ Ｍａｒｋｈａｍ, ＴＨＥ Ｈａｒｐｅｒ Ｃｏｌｌｉｎｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ, Ｈａｒｐｅｒ Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ, ＮＹ (１９９１)は本発明で用いる数多くの用語についての辞書であり、当業者はこれを参照することができる。本明細書で定義する方法及び材料と類似の又はこれらに等しいものを本発明の実施にもちいることができるけれども、好適な方法及び材料を本明細書で説明する。従って、以下で定義されている用語は明細書全体を参照することによりより深く理解されるであろう。本明細書において、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」の単数について用いる冠詞は、別途定義しない限り、複数も含む。別途定義しない限り、核酸は左から右に向かって、５’末端から３’末端を表し、アミノ酸配列は、左から右に向かって、アミノ末端からカルボキシ末端方向に標記する。当業者が本発明の実施に用いるものにより、本明細書で説明する方法、手順、試薬は変化し得るので、本発明に用いるこれらのものを、開示されている特定のものに限定されることがないことは理解されるであろう。
【００２６】
本明細書に記載の全ての数値の上限値は全てのより低い数値の限定を含み、そのような低い数値限定は本明細書に記載されているものとする。本明細書における各最小の数値限定はより高い数値限定を含み、そのようなより高い数値限定は本明細書に記載されているものとする。本明細書に記載の全ての数値範囲はその範囲内のより低い数値範囲を含み、そのようなより狭い数値範囲は本明細書に記載されるものとする。
【００２７】
本明細書において、「相性のよい」の語は洗浄組成物が、本明細書で提供されるプロテアーゼ酵素の酵素活性を、通常の使用条件の間に効果的ではなくなるほどに低減させないことを意味する。特定の洗浄組成物物質は以下で詳述する。
【００２８】
本明細書において、「効果的な量の酵素」の語は特定の製品において必要とされる酵素活性を達成するために必要とされる酵素の量を意味する。そのような効果的な量は当業者が容易に決定することができ、用いる特定の酵素変異体、洗浄用製品、洗浄組成物の特定の成分、及び組成物生物が液状か又は乾燥物（例えば、顆粒）が必要であるか否か等の多くの因子に基づいている。
【００２９】
本明細書において、「変異タンパク質分解酵素」についても用いる「改善された性質を有する」の語は、改善された性能及び／又は野生型プロテアーゼの対応してその性能を維持しつつ改善された安定性を有するタンパク質分解酵素を意味する。幾つかの特に好適な態様において、この改善された性質は改善された食器洗浄能力と改善された安定性の組合せのほか、改善された食器洗浄能力と改善された安定性ならなる群より選択される。
【００３０】
本明細書において、「洗剤安定性」の語は洗浄組成物の安定性を意味する、幾つかの態様において、この安定性は洗剤の使用の間に評価される。他の態様において、この語は貯蔵の間の洗浄組成物の安定性を意味する。
【００３１】
「改善された安定性」の語は、貯蔵の間及び／又は泡の中における変異プロテアーゼのよりよい安定性を意味する。好適な態様において、この変異体プロテアーゼは、食器用洗剤の貯蔵の間及び／又は泡の中において、改善された食器用洗剤中の安定性を有しており、対応する野生型酵素に対して、酸化安定剤、金属イオン封鎖剤、自己消化、界面活性剤、及び高いアルカリ性に対する安定性を有している。
【００３２】
本明細書において、「タンパク質分解に対する安定性」の語は、タンパク質分解に抵抗するタンパク質（例えば、酵素）の能力を意味する。この語をタンパク質安定性を評価する特定のプロテアーゼの使用に限定することを意図するものではない。
【００３３】
本明細書において「酸化安定性」の語は酸化条件下で機能のするタンパク質の脳路y区を意味する。特に、この語は、Ｈ２Ｏ２、過酸、及び他の酸化物の各種濃度の下で機能するタンパク質の能力を意味する。各種酸化条件下での安定性は当業者に既知の方法により、及び／又は本明細書で説明する方法により評価することができる。酸化安定性が大きく変化したということは、酸化化合物が存在しないときの酵素活性と比較してその酵素活性の半減期が少なくとも５％以上増加したか、又は減少したかにより明らかとなる。
【００３４】
本明細書において「ｐＨ安定性」の語は、特定のｐＨで機能することができるタンパク質の能力を意味する。通常、大部分の酵素は、それらが機能する明確なｐＨ範囲を有する。中性範囲のｐＨ（即ち、ｐＨ７付近）で機能する酵素に加えて、非常に高い又は非常に低いｐＨ条件下で作用することができる酵素もある。各種ｐＨ条件下での安定性は当業者に既知の方法及び／又は本明細書で説明する方法で評価することができる。ｐＨ安定性が大きく変化したということは、最適ｐＨで酵素活性と比較した場合、酵素活性の半減期が少なくとも５％以上増加又は減少（大部分の態様において、増加することが好ましい）していることにより裏付けられる。しかしながら、本発明を特定のｐＨ安定性レベル又はｐＨ範囲に限定することは意図しない。
【００３５】
本明細書において、「熱安定性」の語は特定の温度で機能するタンパク質の能力を意味する。通常、大部分の酵素はそれらが機能する温度の限界配位を有している。中程度の温度（例えば、室温）で機能する酵素のほかに、非常に高い又は低い温度で機能することができる酵素も存在する。熱安定性は当業者に既知の方法及び本明細書で説明する方法で評価することができる。熱安定性が相当変化したということは所与の温度に曝された変異体の酵素活性の半減期が少なくとも５％以上増加又は減少（大部分の態様において、増加することが好ましい）しているこことにより裏付けられる。しかしながら、本発明を特定の熱安定性レベル、又は特定の温度範囲に限定することは意図しない。
【００３６】
本明細書において、「化学安定性」の語はタンパク質の活性に有害な化学薬品に対するタンパク質（例えば、酵素）の能力を意味する。幾つかの態様において、そのような化学薬品は過酸化水素、過酸、アニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤、非イオン性界面活性剤、キレート剤等を含むがこれらに限定されない。しかしながら、本発明を特定の化学薬品安定性又は特定の安定性の範囲に限定することは意図しない。
【００３７】
本明細書において、「精製された又は単離された」の語はサンプルから不純物を除去することを意味する。例えば、所望の酵素は、他の不純物タンパク質及び溶液又は調製物の中から所望の酵素ではない、他の成分を除去することにより精製される。幾つかの態様において、所望の組換え酵素がバクテリア又は糸状菌宿主細胞内で発現され、これらの所望の組換え酵素は他の宿主細胞の成分を除去して精製される。所望の組換え酵素のパーセンテージはこのサンプル中で増加する。
【００３８】
本明細書において、「所望のタンパク質」の語は、解析、同定、及び／又は修飾されるタンパク質（例えば、酵素又は所望の酵素）を意味する。組換え（例えば、変異）タンパク質のほか自然発生タンパク質も本発明に用いることができる。
【００３９】
本明細書において「タンパク質」の語はアミノ酸からなる任意の組成物及びタンパク質であると当業者に理解されているものを含む。「タンパク質」、「ペプチド」、及び「ポリペプチド」の語は互換的に使用される。ペプチドがタンパク質の一部分である場合、当業者はこのことを文脈上より理解することができる。
【００４０】
本明細書において、機能的に及び構造的に類似のタンパク質は「関連タンパク質」であると理解されている。幾つかの態様において、これらのタンパク質は異なる遺伝子及び／又は異なる有機体のクラスを含む属由来である（例えば、バクテリアタンパク質及び／又は糸状菌タンパク質）。追加的な態様において、関連タンパク質は同じ属から提供される。すなわち、本発明を任意の特定の源に限定することは意図しない。更に、「関連タンパク質」の語は三次構想の類似体及び一次配列の類似体（例えば、本発明の酵素）を含む。更なる態様において、この語は免疫化学的交差反応を起こすタンパク質も包含する。
【００４１】
本明細書において「誘導体」の語は幾つかの態様において、Ｃ末端及びＮ末端のいずれか又は両方に１つ以上のアミノ酸を付加すること、アミノ酸配列中の１つ以上の異なる部位に１つ以上のアミノ酸で置換すること、タンパク質の両方又は一方の末端、あるいはアミノ酸配列中の１つ以上の部位での１つ以上のアミノ酸を欠失させること、アミノ酸配列中の１つ以上の部位で１つ以上のアミノ酸を挿入すること、により生成されたタンパク質を意味する。タンパク質誘導体は天然タンパク質をコードするＤＮＡ配列の修飾、ＤＮＡ配列を好適な宿主内で形質転換、及び修飾ＤＮＡ配列を発現させて、変異タンパク質を形成する。
【００４２】
関連する（及び誘導体）タンパク質は「変異タンパク質」を含む。幾つかの好適な態様において、変異タンパク質は親タンパク質とは異なる。これらのうちの一方は、アミノ酸残基が少ない。異なるアミノ酸残基の数は１つ以上であり、好ましくは、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０又は、これより多くのアミノ酸残基が異なる。幾つかの好適な態様において、変異体の間で異なるアミノ酸の数は１乃至１０の間である。幾つかの好適な態様において、関連タンパク質及び特に変異タンパク質は少なくとも約３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％のアミノ酸配列相同性を有している。更に、本明細書で用いる関連タンパク質又は変異タンパク質はプロミネント領域に数において、他の関連タンパク質又は親タンパク質とは異なる。例えば、幾つかの態様において、変異体タンパク質は親タンパク質と異なる１、２、３、４、５、又は１０の対応するプロミネント領域を有する。
【００４３】
本発明の変異体を生成するために好適である、各種組換え方法のほか、部位飽和変異誘発、スキャニング変異誘発、挿入変異誘発、ランダム変異誘発、部位指定変異誘発、及び指定進化を含むがこれらに限定されない幾つかの方法が当業者に知られている。
【００４４】
本明細書において、「発現ベクター」の語は好適な宿主細胞において、ＤＮＡの発現を影響させることができる好適な制御配列に作動可能に結合しているＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物を意味する。そのような制御配列は、転写に影響を及ぼすプロモーター、そのような転写を制御する任意のオペレーター配列、転写及び翻訳の停止を制御する好適なｍＲＮＡリボゾーム結合部位及び配列をコードする配列を含む。このベクターは、プラスミド、ファージ粒子、又は単に可能性のある遺伝子挿入でもよい。一旦好適な宿主細胞に形質転換されると、ベクターは複製して、独立的に宿主細胞ゲノムの機能を果たす、又は幾つかのケースにおいて、ゲノム自信に取り込まれる。このプラスミドが現在最も一般的なベクターの形態であることから、本明細書において、「プラスミド」、「発現プラスミド」、及び「ベクター」の語は同じ意味に用いる。しかしながら、当業者において、等しい機能を提供する、及び等しい機能である、又は等しい機能となりうる他の発現ベクターの形態も含むことを意図する。
【００４５】
幾つかの好適な態様において、プロテアーゼ遺伝子は適切な発現プラスミドに結合される。クローン化されたプロテアーゼ遺伝子を融合し、宿主細胞を形質転換又は形質変換して、プロテアーゼ遺伝子を発現させる。このプラスミドは、プラスミドの複製に必要なよく知られた要素を含でいるか、又はこのプラスミドは宿主染色体に取り込まれるように設計されているので、宿主細胞内で複製することができる。必要なエレメントは効率的な遺伝子発現（例えば、所望の遺伝子に作動可能に結合しているプロモーター）のために提供される。幾つかの態様において、これらの必要なエレメントは、認識されるならば（すなわち、宿主細胞による転写）遺伝子自身の相同プロモーターとして、及び外来性転写ターミネーターとして供給されるか、あるいはプロテアーゼ遺伝子の内因性転写領域により供給される。幾つかの態様において、抗生物質含有培地中での育成によるプラスミド感染宿主細胞の連続的な培養を維持することができる抗生物質耐性遺伝子等の遺伝子選択も含む。
【００４６】
幾つかの態様において、他の方法も用いることができるが、以下で説明するカセット変異誘発方法は、本発明のプロテアーゼ変異体を構築するのに用いられる。
【００４７】
第一に、タンパク質をコードしている自然発生遺伝子を入手し、全体あるいは一部の配列を決定する。それから、コードされているタンパク質中に1以上のアミノ酸の変異（欠失、挿入または置換）を作成するために適した場所をスキャンする。この場所にフランキングしている配列は、発現したときに各種変異体をコードするオリゴヌクレオチドプールを用いて、遺伝子短断片を置換するための制限部位があるかどうか評価される。そのような制限部位は、好ましくは、遺伝子セグメントの置換を促進するためのタンパク遺伝子内の特徴的な部位である。しかしながら、アミラーゼ遺伝子中にあまり多く存在しない任意の制限部位を用いることもできる。制限消化によって、生成する遺伝子断片は、所望の配列中で再構築することもできる。もし、制限部位が、選択されたポイントから便利な距離（10から15ヌクレオチド）に存在しないときは、最終的な構築物中のリーディングフレームまたはアミノ酸のいずれも変化させずに、遺伝子中の核酸配列のヌクレオチドの置換によって、そのような部位を生成することができる。対象とする配列を確認するために、その配列を変化させるための遺伝子の変異は、既知の方法であるM13プライマーを伸長させることによって行うことができる。適切なフランキング領域の位置決め、及び、2の簡便な制限部位配列で必要な変異を発現させるための評価の作業は、遺伝子コードの余剰量（ｒｅｄｕｎｄａｎｃｙ）、遺伝子の制限酵素マップ、及び、多くの異なる制限酵素を用いた、ルーチン作業で行うことができる。もし、簡便な制限フランキング部位が使用可能であるならば、上記方法は、サイトを含まないフランキング領域の結合にのみ用いる。
【００４８】
一旦自然発生ＤＮＡ又は、合成ＤＮＡがクローン化されると、変異位置に隣接している制限部位が同じ起源の制限酵素を用いて消化され、エンド末端に相補的なオリゴヌクレオチドの複数のカセットが、遺伝子の中に結合される。変異誘発はこの方法によって簡素化される、なぜならば、オリゴヌクレオチドの全ては、同じ制限部位を有するように合成することができ、該制限部位をつくるための合成リンカーが必要ないからである。
【００４９】
本明細書で用いている「対応する」とは、タンパク質またはペプチド内に列挙された位置にある各残基、あるいはタンパク質またはペプチド内に列挙された各残基と類似、相同もしくは同等である残基を意味する。
【００５０】
本明細書で用いる「対応する領域」の語は、通常、関連タンパク質又は親タンパク質中の類似する位置を言う。
【００５１】
「コードしている核酸分子」、「コードしている核酸配列」、「コードしているＤＮＡ配列」、及び「コードしているＤＮＡ」の語は、デオキシリボ核酸の鎖に沿ったデオキシリボブクレオチドの配置又は配列を意味する。これらのデオキシリボヌクレオチオドの配置はポリペプチド（タンパク質）に沿ったアミノ酸の配列を決定する。従って、ＤＮＡ配列はアミノ酸配列をコードする。
【００５２】
本明細書で用いる「類似の（アナロガス）配列」は所望のタンパク質と、（すなわち、対象とするタンパク質と同じ起源の）、同じ機能、三次構造及び/又は、保存残基を有するタンパク質内の配列を言う。具体的な好ましい態様において、類似の配列は、エピトープ又はエピトープの近くにある配列を含む。例えば、アルファヘリックス又はベータシート構造を含むエピトープ領域内で、類似配列内で置換されたアミノ酸は、同じ特定の構造を維持していることが好ましい。この語は、アミノ酸配列の他に核酸配列についても用いる。いくつかの態様において、アナログ配列は、置換アミノ酸が、エピトープ又はエピトープに近いところのタンパク質中のアミノ酸と、同じ機能、三次構造及び/又保存される残基を示すように、構築される。従って、例えば、アルファヘリックス又はベータシート構造のようなエピトープ領域を含むところでは、アミノ酸の置換は、特定の構造を維持していることが、好ましい。
【００５３】
本明細書で用いる「相同（ホモログ）タンパク質」とは、所望のタンパク質と同様な作用、構造、抗原性反応/または免疫原性反応を有するタンパク質を意味する。相同タンパク質と対象タンパク質とは、必ずしも進化の上で関係がなくてもよい。従って、この用語は、異なる種から得られる機能的に同じタンパク質（例えば、プロテアーゼ）を含むと考えられる。好ましい実施態様としては、所望のタンパク質内のエピトープを相同タンパク質からの類似のセグメントで置換すれば、変化による混乱を少なくすることができるので、所望のタンパク質と同様な三次および/または一次構造を有する相同タンパク質を用いることが望ましい。幾つかの態様において、ホモロガスタンパク質は所望のタンパク質として、低減された同様の免疫反応を有する。
【００５４】
ここで用いる「相同遺伝子」とは、異なる種由来の、または通常は関連種由来の一組の遺伝子対をいい、それぞれが対応し、それぞれ同一または非常に類似しているものをいう。当該用語は種形成（すなわち、新しい種の進化）により分離した遺伝子（例えばオーソロガス遺伝子）、及び遺伝子重複により分離した遺伝子（例えばパラロガス遺伝子）を包含する。
【００５５】
ここで用いる「オーソログ」及び「オーソロガス遺伝子」とは種形成により共通祖先の遺伝子（すなわち相同遺伝子）から進化した、異なる種の遺伝子をいう。通常、オーソロガスは進化の過程において同じ機能を保持する。新しく配列決定されたゲノムのオーソロガスを同定することで、信頼性の高い遺伝子機能の推測ができる。
【００５６】
ここで用いる「パラログ」及び「パラロガス遺伝子」とはゲノム内で重複していることにより関連した遺伝子をいう。オーソログは進化の過程を通して同じ機能を維持するが、パラログはいくつかの機能は最初の機能に関連するが、それに加えて新しい機能も有している。パラログ遺伝子の例としては、限定されないが、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ及びトロンビンをコードする遺伝子が挙げられ、これらは全てセリンプロテイナーゼであり、同じ種内で一緒に発生する。
【００５７】
本明細書で用いる「野生型」及び「天然の」タンパク質は、自然界において通常見られるタンパク質である。本明細書にて、互換的に用いる、「野生型配列」及び「野生型遺伝子」の語は、宿主細胞内で、天然に、または、自然発生的に生じる配列を言う。いくつかの態様において、野生型配列は、タンパク質工学的手法により利用されるタンパク質の開始点となる所望の配列を言う。この自然発生（すなわち、前駆体）タンパク質をエンコードしている遺伝子は、当該技術分野の当業者に既知の方法に従って得ることができる。この方法は、通常、所望のタンパク質の領域をエンコードする成熟配列を有するラベルプローブの合成、該タンパク質を発現している有機体の遺伝子ライブラリーの作成、及び、対象とする遺伝子に対するライブラリーのスクリーニングを含む。陽性ハイブリダイズクローンはその後、マッピングされ、配列決定される。
【００５８】
本明細書で用いる「組換えＤＮＡ分子」の語は、分子生物学的手法によって、互いに結合されたDNAセグメントを含むＤＮＡ分子を言う。
【００５９】
「組換えオリゴヌクレオチド」の語は、ポリヌクレオチド配列の制限酵素消化により生成された２つ以上のオリゴヌクレオチドのリゲーション、オリゴヌクレオチドの合成（例えば、プライマー又はオリゴヌクレオチドの合成）等を含むがこれらに限定されない分子生物学的手法を用いて生成されたオリゴヌクレオチドを意味する。
【００６０】
配列間の相同性の程度は、本発明の技術分野で知られている適切な方法で決定することができる（Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ, Ａｄｖ. Ａｐｐｌ. Ｍａｔｈ.,２：４８２[１９８１]； Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ, Ｊ. Ｍｏｌ.Ｂｉｏｌ., ４８： ４４３[１９７０]； Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ, Ｐｒｏｃ. Ｎａｔｌ. Ａｃａｄ. Ｓｃｉ. ＵＳＡ ８５：２４４４ [１９８８]；Ｔｈｅ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ (Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ, Ｍａｄｉｓｏｎ, ＷＩ)のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ等のプログラム；及びＤｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ. Ａｃｉｄ Ｒｅｓ., １２：３８７−３９５ [１９８４]参照のこと）。
【００６１】
例えば、ＰＩＬＥＵＰは、配列のホモロジーのレベルを決定するのに有用なプログラムである。ＰＩＬＥＵＰは、累進的で対合的な配列法を用いて関係する配列の群から多重配列アラインメントを作り出す。アラインメントを作るための関係性の集積を示す系統樹（ｔｒｅｅ）もプロットすることができる。ＰＩＬＥＵＰは、Ｆｅｎｇ及びＤｏｏｌｉｔｔｌｅの累進的アラインメント方法を簡素化したものである（Ｆｅｎｇ ａｎｄ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ, Ｊ. Ｍｏｌ. Ｅｖｏｌ., ３５： ３５１−３６０ [１９８７]）。この方法は、Ｈｉｇｇｉｎｓ及びＳｈａｒｐによって述べられた方法と同じである（Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ, ＣＡＢＩＯＳ ５： １５１−１５３ [１９８９]）。有用なＰＩＬＥＵＰパラメーターは、３．００のデフォルトギャップウエイト、０．１０のデフォルトギャップレングス、及び、ウエイトエンドギャップを含んでいる。他の有用なアルゴリズムの例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌらによって述べられたブラストアルゴリズムである（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ. Ｍｏｌ.Ｂｉｏｌ., ２１５： ４０３−４１０, [１９９０]； 及びＫａｒｌｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０： ５８７３−５７８７ ［１９９３］）。ある具体的なＢＬＡＳＴプログラムは、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２プログラムである（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２６６ ： ４６０−４８０ ［１９９６］参照のこと）。「Ｗ」、「Ｔ」及び「Ｘ」のパラメーターは、アラインメントの速度及び感度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムは、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）１１、ＢＬＯＳＵＭ６２得点マトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ、Ｐｒｏｃ. Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，８９：ｐ１０９１５（１９８９）参照）アラインメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ’５、Ｎ’−４、および両ストランドの比較を用いる。
【００６２】
本明細書で用いる「ヌクレオチド配列の相同性の割合（％）」は、候補配列中にある、配列のヌクレオチド配列と同一であるヌクレオチド残基の割合として定義される。
【００６３】
本明細書で用いる、「ハイブリダイゼーション」の語は、本発明の技術分野で知られているように、塩基のペアリングを通じて、核酸のストランドに相補的なストランドが結合するプロセスであると定義される。
【００６４】
本明細書で用いる「ハイブリダイゼーション条件」の語は、ハイブリダイゼーションが行われる条件を言う。これらのコンディションは、ハイブリダイゼーションが測定される条件下の「ストリンジェンシー」の程度によって通常分類される。ストリンジェンシーの程度は例えば、複合体またはプローブに結合する核酸の融解温度（Ｔｍ）を基準とする。ハイブリダイゼーション条件は核酸結合複合体またはプローブの融点（Ｔｍ）に基づく。例えば、「最大ストリンジェンシー」は通常約Ｔｍ−５℃（プローブのＴｍより５℃低い）で起こり、「高ストリンジェンシー」はＴｍより約５〜１０℃低く；「中間ストリンジェンシー」はプローブのＴｍより約１０〜２０℃低く；及び「低ストリンジェンシー」はＴｍより約２０〜２５℃低い。例えば、６ＸＳＳＣ＝とても低いストリンジェンシー；３ＸＳＳＣ＝低〜中ストリンジェンシー；及び０.５ｘＳＳＣ＝高ストリンジェンシーである。機能上、最大ストリンジェンシー条件はハイブリダイゼーションプローブと厳密な同一性または実質的に厳密な同一性を有する配列を同定するために用いることができ、一方、中間または低ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、プローブと約８０％以上の配列同一性を有する核酸配列を同定するために用いることができる。
【００６５】
高度の選択性を必要とする用途に対しては、通常、ハイブリッド形成に比較的高ストリンジェンシー条件が用いられる（例えば、比較的低い塩および／または高温の条件が用いられる）。
【００６６】
少なくとも２の核酸分子またはペプチドについての文脈中における、「実質的に似ている」及び「実質的に同一な」の語は、参照される配列（すなわち野生型配列）と比較して、少なくとも６０％の同一性、好ましくは、少なくとも７５％の同一性、より好ましくは少なくとも８０％の同一性、更に、より好ましくは、少なくとも９０％の同一性、更により好ましくは少なくとも９５％の同一性、より好ましくは９７％の同一性、時には、９８％及び９９％の同一性を有する配列を含む。配列同等性は、標準パラメーターを使用した、BLAST、ALIGEN及びCLUSTAL等の既知のプログラムを用いて決定される（Ａｌｔｓｃｈｕｌｅｔ ａｌ., Ｊ. Ｍｏｌ.Ｂｉｏｌ. ２１５: ４０３-４１０ ［１９９０］； Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ｅｔａｌ., Ｐｒｏｃ. Ｎａｔｌ. Ａｃａｄ Ｓｃｉ. ＵＳＡ ８９: １０９１５ ［１９８９］； Ｋａｒｉｎ ｅｔａＬ, Ｐｒｏｃ. Ｎａｔｌ Ａｃａｄ. Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０: ５８７３ ［１９９３］； 及び Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｔａｌ., Ｇｅｎｅ ７３: ２３７-２４４ ［１９８８］参照のこと）。ＢＬＡＳＴ解析を行うソフトウエアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを通じて利用可能である。また、データベースもＦＡＳＴＡを用いてサーチされる（Ｐｅａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ., Ｐｒｏｃ.Ｎａｔｌ. Ａｃａｄ. Ｓｃｉ. ＵＳＡ ８５: ２４４４-２４４８ ［１９８８］）。２つのポリペプチドが実質的に同一であるという、ある示唆は、第一のポリペプチドが、免疫学的に第二のポリペプチドと交差反応性であるということと等しい。ペプチド内の置換されているアミノ酸が保存されているアミノ酸である場合、このペプチドは、免疫学的に交差反応性でもある。この場合、一のポリペプチドは実質的に第二のポリペプチドと同一である。例えば、二のペプチドが保存的な置換においてのみしか異ならない場合である。二のポリペプチドが実質的に同一であるという他の教示は、二の分子がお互いに、ストリンジェンシーなコンディション（例えば、高ストリンジェンシーな培地の幅ないで）でハイブリダイスするということである。
【００６７】
本明細書で用いる「等しい残基」の語は、特定のアミノ酸残基を共有するタンパク質を言う。例えば、等しい残基は、Ｘ線結晶化学によって同定される三次構造を有するあるタンパク質（例えばＩＮＦ−β）の三次構造のホモロジーレベルを検出することによって同定される。等しい残基は、前駆体タンパク質の特定のアミノ酸残基の２個以上の主鎖原子の原子座標（Ｎ対Ｎ、ＣＡ対ＣＡ、Ｃ対ＣおよびＯ対Ｏ）が位置合わせ後に０．１３ｎｍ、好ましくは０．１ｎｍ以内であるものと定義される。位置合わせは、対象とする非水素タンパク質原子の原子座標について最大の重複を生じるように最良のモデルが配向、配置された後に達成される。この最良のモデルは、結晶学及びタンパク質の特徴付け/解析の分野において当業者に知られている方法を用いて検出され、利用できる最高の解像度において回折実験データの最低のＲファクターが得られる結晶学的なモデルである。
【００６８】
本明細書で用いる「調節エレメント」の語は、核酸配列の発現のいくつかの側面を調節する遺伝的エレメントを言う。例えば、プロモーターは、作動可能に結合しているコード領域の転写の開始を促進する調節エレメントである。更なる調節エレメントは、スプライシングシグナル、ポリアデニレーションシグナル及びターミネーションシグナルを含む。
【００６９】
本発明で用いる「宿主細胞」の語は、発現ベクター又は所望の遺伝子を含む原核又は真核宿主細胞である。宿主細胞は組換えＤＮＡ技術を用いて構築されたベクターで形質転換、又は、トランスフェクションされる。そのような形質転換された宿主細胞はタンパク質変異体をコードする複製ベクター又は所望のタンパク質を発現する複製ベクターのいずれかである。このような変異タンパク質のプレ-又はプレプロ−型をエンコードするベクターの場合、発現したときに宿主細胞培地の中で選択される。
【００７０】
目的の核酸配列を細胞内へ挿入するという文脈上用いられる「導入する」の語は、形質転換、形質導入、又は、形質感染の意味を有する。形質転換の意味は、プロトプラスト形質転換、塩化カルシウム沈降法、電気穿孔法、及び本技術分野で既知の方法を含む（Ｃｈａｎｇ ａｎｄ Ｃｏｈｅｎ （１９７９） Ｍｏｌ. Ｇｅｎ. Ｇｅｎｅｔ. １６８: １１１-１１５； Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ., （１９８６） Ａｐｐｌ. ａｎｄ Ｅｎｖ. Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ. ５１: ６３４；及びｔｈｅ ｒｅｖｉｅｗ ａｒｔｉｃｌｅ ｂｙ Ｆｅｒｒａｒｉｅｔ ａｌ., （１９８９） Ｇｅｎｅｔｉｃｓ, ｐａｇｅｓ ５７-７２ ｉｎ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｅｄ. Ｃ. Ｈａｒｗｏｏｄ, Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ参照のこと）。
【００７１】
「プロモーター／エンハンサー」とは、プロモーターとエンハンサーの両方の機能を提供することができる配列を含むＤＮＡセグメントを言う（例えば、レトロウイルスの長い末端反復配列はプロモーターとエンハンサーの機能を含んでいる）。エンハンサー／プロモーターは、「内性」または、「外因性」あるいは、「非相同」である。内性エンハンサー／プロモーターは、染色体内で与えられた遺伝子と自然に結合している。外因性（非相同の）エンハンサー／プロモーターは、遺伝子操作の手段（すなわち、分子生物学的技術）によって、遺伝子に並列配置されたものである。
【００７２】
発現ベクター上の「スプライシングシグナル」の存在は、組み替えられた転写の発現のレベルを高める。スプライシングシグナルは、一次RNA転写からイントロンの除去を仲介するものであり、スプライスドナー及びアクセプター部位を含む（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ［１９８９］, ｐｐ．１６．７−１６．８）。通常用いられるスプライスドナー及びアクセプター部位はSV40の16SRNA由来のスプライスジャンクションである。
【００７３】
「安定な形質感染」又は「安定な形質導入」の語は、形質転換させる細胞の遺伝子に、外来ＤＮＡを導入し、組み込むことを言う。「安定した形質感染体」の語は、形質転換される細胞の染色体内へ、安定して組み込まれた外来あるいは外因性のＤＮＡを有する細胞を言う。
【００７４】
本明細書で用いる「選択マーカー」または、「選択遺伝子プロダクト」の語は、選択マーカーが発現されたところで、細胞の抗生物質または薬物体制を確定する酵素活性をエンコードしている遺伝子の使用を言う。
【００７５】
「増幅」はテンプレート特異性に関する核酸複製の特殊なケースである。これは非特異性テンプレート複製（すなわち、テンプレート依存性であるが特定テンプレートに依存しない複製）と対比される。テンプレート特異性は複製の正確さ（すなわち、適正なポリヌクレオチド配列の合成）及びヌクレオチド（リボ−またはデオキシリボ−）特異性とはここでは区別される。テンプレート特異性は「標的」配列に対する特異性に関して説明されることが多い。標的配列は、それらがその他の核酸から選別するために探されるという意味において「標的」である。増幅技術はこの選別を第一に考えて発達してきた。
【００７６】
「増幅」はテンプレート特異性に関する核酸複製の特殊なケースである。これは非特異性テンプレート複製（すなわち、テンプレート依存性であるが特定テンプレートに依存しない複製）と対比される。テンプレート特異性は複製の忠実度（すなわち、適正なポリヌクレオチド配列の合成）及びヌクレオチド（リボ−またはデオキシリボ−）特異性とはここでは区別される。テンプレート特異性は「標的「特異性に関して説明されることが多い。標的配列は、それらがその他の核酸から選別するために探されるという意味において「標的」である。増幅技術はこの選別を第一に考えて設計されてきた。
【００７７】
ここで用いる「共増幅」の語は、その他の遺伝子配列が一緒に導入される増幅マーカーの１の細胞内への導入（すなわち、発現ベクター内に含まれる遺伝子のような１以上の非選択遺伝子を含む）及び細胞が増幅マーカーとその他の非選択遺伝子配列の両方を増幅するような適当な選択圧の増幅をいう。増幅マーカーはその他の遺伝子配列に物理的に結合していてもよく、またはＤＮＡが２つの別個の断片、すなわち一方が増幅マーカーを含み、及びもう一方が非選択マーカーを含むものが同じ細胞内に導入されてもよい。
【００７８】
ここで用いる、「増幅マーカー」、「増幅遺伝子」及び「増幅ベクター」の語は適当な増殖条件下で遺伝子の増幅を可能にする遺伝子をエンコードする遺伝子またはベクターをいう。
【００７９】
本明細書で用いる「増幅可能な核酸」の語は、任意の増幅方法で増幅された核酸を言う。「増幅可能な核酸」は通常「サンプルテンプレート」を含む。
【００８０】
本明細書で用いる「サンプルテンプレート」の語は、「標的」（下記に定義）の存在について分析されるサンプルから生じる核酸をいう。一方、「バックグラウンドテンプレート」はサンプルテンプレート以外の核酸に関して用いられ、サンプル内に存在していてもいなくてもよい。バックグラウンドテンプレートはほとんどの場合、不慮もものである。前駆体からの影響を受けているか、または、サンプルから精製すべき核酸汚染物質の存在によるものである。例えば、検出すべき微生物以外の生物由来の核酸は試験サンプル内でバックグラウンドとして存在し得る。
【００８１】
「テンプレート特異性」はほとんどの増幅技術において酵素の選択により達成される。増幅酵素は使用される条件下において、核酸の外来混合物において核酸の特定配列のみ処理する酵素である。例えば、Ｑβレプリカーゼの場合、ＭＤＶ−１ ＲＮＡはレプリカーゼの特異テンプレートである（例えば、Ｋａｃｉａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ６９：３０３８［１９７２］を参照）。その他の核酸はこの増幅酵素によっては複製されない。同様に、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼの場合、この増幅酵素はそれ自身のプロモーターにストリンジェントな特異性を有する（Ｃｈａｍｂｅｒｌｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ２２８：２２７[１９７０]を参照）。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼの場合、当該酵素は2つのオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを連結せず、ここで連結接合部分にオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド基質とテンプレート間の不整合が存在する（Ｗｕ ａｎｄ Ｗａｌｌａｃｅ， Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４：５６０［１９８９］を参照）。最後に、Ｔａｑ及びＰｆｕポリメラーゼは、高温で機能する能力を有するため、配列結合の高い特異性を示し、従って、プライマーにより確定され、高温が標的配列とのプライマーハイブリダイゼーションに有利に働き、非標的配列とのハイブリダイゼーションには有利でない熱力学的条件を生じる。
【００８２】
本明細書で用いる、「プライマー」の語は、精製制限消化などにおいて自然に生じるまたは合成的に生成されるオリゴヌクレオチドをいい、核酸鎖に相補的なプライマー伸長生成物の合成が導入される条件下に置かれた場合（すなわち、ヌクレオチド及びＤＮＡポリメラーゼなどの誘発剤の存在下、及び適した温度及びpHで）、合成開始点として作用するものを言う。当該プライマーは好ましくは増幅効率を最大にする1本鎖であるが、２本鎖であってもよい。２本鎖の場合、プライマーは伸長生成物の準備のために用いる前にそのストランドを分離処理する。好ましくは、プライマーはオリゴデオキシリボヌクレオチドである。プライマーは誘発剤の存在下、伸長生成物の合成開始のため十分に長くなければならない。プライマーの正確な長さは、誘発温度、プライマーの供給源及び使用する方法など多くの因子に左右される。
【００８３】
本明細書で用いる「プローブ」の語は、精製制限消化などにおいて自然に生じる、または合成、組換えまたはPCR増幅により生成されるオリゴヌクレオチド（すなわちヌクレオチド配列）をいい、別の目的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズできるものである。プローブは1本鎖または２本鎖である。プローブは特定遺伝子配列の検出、同定及び単離に有用である。本発明で使用されるいかなるプローブも任意の「リポーター分子」で標識するので、任意の検出システムにおいて検出可能であり、限定されないが、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡ及び酵素ベースの組織化学的分析）、蛍光、放射性及び発光性システムなどがある。本発明はいかなる特定の検出システムまたは標識にも限定されない。
【００８４】
本明細書で用いる「標的」の語はポリメラーゼ連鎖反応に関して用いる場合、ポリメラーゼ連鎖反応に用いるプライマーが結合する核酸領域をいう。従って、「標的」は他の核酸配列から選別された所定の核酸を言う。「断片」は標的配列内の核酸領域として定義される。
【００８５】
本明細書で用いる「ポリメラーゼ連鎖反応」（「ＰＣＲ」）の語はここに引用する米国特許Ｎｏｓ．４，６８３，１９、４，６８３，２０２、及び４，９６５，１８８の方法を言い、クローニングまたは精製することなくゲノムＤＮＡの混合物における標的配列の断片濃度を増加させる方法を含む。標的配列を増幅するこの方法は、対象とする標的配列を含むＤＮＡ混合物に過剰量の２つのオリゴヌクレオチドプライマーを導入し、ＤＮＡポリメラーゼの存在下、サーモサイクルの正確な配列を行うことからなる。２つのプライマーは２本鎖標的配列のそれぞれの鎖に相補的である。増幅をもたらすために、混合物を変性させ、それからプライマーを標的分子内のそれらの相補配列にアニールする。アニーリングに続いて、プライマーは新しい相補鎖ペアを形成するためにポリメラーゼを用いて伸長する。変性、プライマーアニーリング及びポリメラーゼ伸長工程は何回も繰り返すことができ（すなわち変性、アニーリング、及び伸長は１「サイクル」を構成し、多数の「サイクル」を行うことができる）、対象とする標的配列の増幅断片を高濃度で得ることができる。対象とする標的配列の増幅断片の長さはお互いのプライマーの相対位置により決定され、従って、この長さは制御可能なパラメーターである。当該プロセスの繰返し側面のため、当該方法は「ポリメラーゼ連鎖反応」（以下「ＰＣＲ」とする）と呼ばれる。標的配列の対象とする増幅断片は混合物中で主要な配列（濃度に関して）となるので、それらは「ＰＣＲ増幅された」という。
【００８６】
本明細書で用いる「増幅試薬」の語は、プライマー、核酸テンプレート及び増幅酵素以外の増幅に必要な試薬をいう（デオキシリボヌクレオチド３リン酸、バッファー等）。通常、増幅試薬はその他の反応成分と一緒に反応容器（試験管、マイクロウェル等）内に加えて含まれる。
【００８７】
ＰＣＲを用いて、ゲノムＤＮＡ中の特異標的配列の１のコピーをいくつかの異なる方法で検出可能なレベルまで増幅することが可能である（例えば、標識プローブを用いるハイブリダイゼーション；ビオチン化プライマーの混合、続いてアビジン−酵素結合検出；ｄＣＴＰまたはｄＡＴＰなどの３２Ｐ標識デオキシヌクレオチド３リン酸の増幅断片への混合）。ゲノムＤＮＡに加えて、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列が適当なプライマー分子のセットを用いて増幅できる。特に、ＰＣＲプロセスにより作成された増幅断片はそれ自身、続くＰＣＲ増幅の効率的なテンプレートである。
【００８８】
本明細書で用いる「ＰＣＲ生成物」「ＰＣＲ断片」及び「増幅生成物」の語は変性、アニーリング及び伸長が完結する２以上のサイクルのＰＣＲ工程後の化合物の最終混合物をいう。これらの語は１以上の標的配列の１以上の断片の増幅が行われる場合を含む。
【００８９】
本明細書で用いる「制限エンドヌクレアーゼ」及び「制限酵素」の語はそれぞれ特定ヌクレオチド配列で、またはその近くで２本鎖ＤＮＡを切断する、細菌性酵素をいう。
【００９０】
本明細書で用いる「表面性質」の語はタンパク質の表面に提示される親水性及び／又は疎水性等の性質の他、電荷についても意味する。
【００９１】
本明細書において、「洗浄組成物」及び「洗剤」の語は、固形物質の洗浄のために洗浄媒体に用いることを意図した混合物を意味する。好適な板用において、この語は、食器、カトラリー等（例えば、食器用洗剤）の洗浄に用いる洗剤を意味する。本発明を任意の特定の洗剤製剤又は組成物に限定することは意図しない。すなわち、本発明の少なくとも１つの酵素を含む洗剤をも意味し、この語は、界面活性剤、移動剤、加水分解酵素、酸化還元剤、抑制剤、マスキング剤、酵素活性剤、抗酸化剤、及び可溶化剤を含むものをも包含する。
【００９２】
本明細書において、「洗浄組成物」の語は顆粒及び液体形態を含むがこれらに限定されない、食器を洗浄するための全ての形態の組成物を意味する。本発明を特定の食器用洗浄組成物に限定することを意図しない。即ち、本発明はセラミック、プラスチック、金属、トチャイナ、ガラス、アクリル等を含むがこれらに限定されない任意物質からできた、食器（例えば、皿、カップ、グラス、ボウル等を含むがこれらに限定されない食器）及びカトラリー（スプーン、ナイフ、フォーク、サービング用具等を含むがこれらに限定されない道具）の洗浄に用いることができる。「食器」の語は本明細書において食器及びカトラリーの両方を含む。
【００９３】
本明細書において、変異体の「洗浄性能」の語は変異体プロテアーゼ洗浄組成物に添加した場合と比較して、変異体プロテアーゼを添加した洗剤が提供する追加的な洗浄性能の寄与を意味する。洗浄性能は関連する洗浄条件下で比較される。
【００９４】
「関連する洗浄条件」の語は、食器用洗剤の市場で意図される家庭で実際に用いられる、特定の洗浄温度、時間、洗浄機器、泡の状態、洗剤のタイプ、及び水の高度の条件を意味する。
【００９５】
「改善された洗浄性能」の語は、関連する洗浄条件において食器及び／又はカトラリーからの汚れの除去において好ましい結果が得られること、又は対応する野生型酵素と比較して同じ結果が、重量ベースでより少ない変異体プロテアーゼで得られることを意味する。
【００９６】
「維持された洗浄性能」の語は、関連する洗浄条件下で、対応する野生型酵素の少なくとも８０％に当たる変異体プロテアーゼ酵素の性能を意味する。
【００９７】
プロテアーゼの洗浄性能は適切な条件下で、特定の代表的な汚れを除去する能力により測定される。これらのシステムにおいて、洗浄組成物、泡抑制剤、水の高度、洗浄機器、時間、ｐＨ、及び／又は温度等の因子を特定のマーケットセグメントにおける課程用製品のための条件に限定されるように、制御することができる。本明細書で説明する試験的な製品試験システムはＤＮＡ変異誘発を通じて修飾されたタンパク質分解酵素を用いる家庭用製品の代表的例である。従って、本明細書で提供される方法は大量の異なる酵素の試験及び特定の製品に特に好適な酵素の選択を促進する。
【００９８】
本明細書において、「殺菌」の語は、物の表面上の微生物を抑制又は殺すとこのほかに、表面から不純物を除去することも意味する。本発明を特定の表面、物、又は不純物に限定することは意図しない。
【００９９】
バクテリアセリンプロテアーゼのいくつかは、「スブチリシン」といわれている。スブチリシンはバチルススブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルスアミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）（「スブチリシンＢＰＮ」）、及び／又はバチルスリケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（「スブチリシンカールスバーグ」（ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ））を含む（例えば、Ｍａｒｋｌａｎｄ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ， ｉｎ Ｂｏｙｅｒ (ｅｄ．), Ｅｎｚｙｍｅｓ． ＴＨＥ (Ｂｏｙｅｒ， ｅｄ．) ｖｏｌ． ３， ｐｐ．５６１−６０８， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ［１９７１］参照）。アルカリ性バチルス株は他のプロテアーゼを生成する。後者のカテゴリーの例としては、ＭＡＸＡＣＡＬ（商標）プロテアーゼ（本明細書において、バチルスの新たな株ＰＢ９２から単離されたＰＢ９２プロテアーゼと言う）、及びＳＡＶＩＮＡＳＥ（商標）プロテアーゼを含む。追加的なプロテアーゼはＰＲＯＰＥＲＡＳＷ（商標）プロテアーゼを含むがこれらに限定されない。
【０１００】
ＰＢ９２プロテアーゼのアミノ酸（配列番号２）及びＤＮＡ配列（配列番号１）を表２に示す。成熟プロテアーゼは２６９のアミノ酸からなり、２７，０００ダルトンの分子量、高アルカリ範囲に等電点を有する。ＰＢ９２のタンパク質基質への活性はアルカリデルフト単位（Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｄｅｌｆｔ Ｕｎｉｔ （ＡＤＵ））であらわす。ＡＤＵでの活性はｐＨを８．５から１０．０に変更した以外は、英国特許Ｎｏ．１，３５３，３１７に記載の方法で測定する。精製ＰＢ９２プロテアーゼは１ｍｇ当たり２１，０００ＡＤＵの活性を有する。カゼイン上で測定される代謝回転数（ｋｃａｔ）は９０秒−１モル−１である。
【０１０１】
スブチリシンカールスバーグの精製された調整物の特定の活性は１０，０００ＡＤＵ／ｍｇであり（Ｄｅｌａｎｇｅ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２４３：２１８４ ［１９６８］参照）、スブチリシンＢＰＮ’の活性は７，０００ＡＤＵ／ｍｇである（Ｍａｔｓｕｂａｒａ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２４０：１１２５ ［１９６５］参照）。特定の活性及び代謝回転数（ｋｃａｔ）は別にして、ＰＢ９２プロテアーゼはカールスバーグスブチリシン、スブチリシンＢＰＮ’及び高い正電荷を有する製剤化された他の酵素（例えば、ＭＡＸＡＴＡＳＥ（商標）及びＡＬＣＡＬＡＳＥ（商標））のようなプロテアーゼから、本来タンパク質の電気泳動により視認で区別することができる。
【０１０２】
ＰＢ９２プロテアーゼはアルカリｐＨの値で汚れの除去において活性を有しているので、従来の洗剤の添加剤に、界面活性剤、ビルダー、及び酸化剤等の洗剤の成分と一緒に用いられている。後者は大部分において粉末形態で用いられている。ＰＢ９２プロテアーゼは前述のスブチリシン等の他のプロテアーゼに比べて汚れを除去する能力が高い。このことは同じ洗浄能力を提供するためにより少ないＰＢ９２プロテアーゼでよいことを意味している。酸化に対する感受性は、洗剤に適用されるＰＢ９２及び他のセリンプロテアーゼに重要な欠点である（例えば、Ｓｔａｕｆｆｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２４４：５３３３−５３３８ ［１９６９］； 及びＥｓｔｅｌｌ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６３：６５１８−６５２１ ［１９８５］参照）。酸化されていないＰＢ９２プロテアーゼと比較して、過ホウ酸三水和物及びＴＡＥＤを含む活性剤システムにより生成されるＨ２Ｏ２又は過酸によるＰＢ９２プロテアーゼの酸化は、ＡＤＵ／ｍｇにより、それぞれ５０％及び１０％に相当する。
【０１０３】
本発明は、天然のバクテリアセリンプロテアーゼ由来の変異体タンパク質分解酵素の生成、スクリーニング、及び選択のための方法及び組成物を提供する。そのような変異体は、例えば、アルカリ性バチルス株の野性型遺伝子由来の遺伝子によりコードされたものである。最も好適な態様において、この株はＰＢ９２である。
【０１０４】
しかしながら、アルカリ性バチルス株ＳＡＶＩＮＡＳＥ（商標）由来の変異タンパク質が好適である。本発明はアルカリ性バチルス株ＰＢ９２由来のセリンプロテアーゼ以外のプロテアーゼ由来の修飾プロテアーゼの選択に用いることができる。例えば、バチルススブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｌｓ）、バチルスアミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、及びバチルスリケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のセリンプロテアーゼをコードする遺伝子が知られており、変異誘発の標的に用いることができる。しかしながら、オリゴヌクレオチドを用いた部位指定変異誘発、又は領域指定ランダム変異誘発を含むがこれらに限定されない他の好適原意誘発修飾が本発明に用いられることから、本発明を特定の方法に限定することは意図しない。
【０１０５】
幾つかの好ましい態様において、生成及びスクリーニングを含む本発明により提供される変異タンパク質酵素の選択のための方法は、所望のタンパク質分解酵素をコードするクローン化された遺伝子又はそれらのフラグメントを変異させる工程、１つ又は複数の得られた変異プロテアーゼ遺伝子を単離する工程、この変異プロテアーゼ遺伝子を、発現及び生成に好適な宿主細胞株、好ましくは、好適なベクターに導入する工程、及び洗剤に適用するのに改善された性質を有するこれらの変異プロテアーゼを同定する工程を含む。
【０１０６】
変異プロテアーゼの生成のために好適な宿主細胞株はプロテアーゼを発現することができる改質転換可能な微生物を含む。特に、実質的に同じ性質を有するプロテアーゼの由来と同じ種又は属の、バチルス株、特にアルカリ性バチルス株、最も好ましくは新規なバチルス株であるＰＢ９２又はこれらの変異体である宿主株が好ましい。バチルススブチリス、バチルスリケニフォルミス、及びバチルスアミロリケファシエンス株が好適な株である。他の好適な宿主株は変異遺伝子で形質転換する前に細胞外タンパク質分解酵素の生成を行わない他の株を含む。特に好適なものは、新規なバチルスＰＢ９２の不完全誘導体等のバチルス株であると定義されたものである。プロテアーゼの発現は選択された宿主有機体で昨日するシグナルの発現を用いて得ることができる。シグナルの発現はプロテアーゼ遺伝子の転写及び翻訳を調節しているＤＮＡの配列を含む。好適なベクターは染選択された宿主株において有意に高いコピー数を複製し、色体取り込みにより、宿主系統内において、プロテアーゼ遺伝子を維持することができるものである。
【０１０７】
本発明の変異タンパク質分解酵素は適した発酵条件下における培養、１つ以上の所望の変異タンパク質分解遺伝子、及び生成された酵素の回収により調製することができる。
【０１０８】
好ましくは、この発現されるプロテアーゼは培地内で、グラム陰性バクテリア宿主株の場合、ペルプラスム種で選択され、それらの回収を促進する。選択のためには、好適なアミノ停止シグナル配列が用いられる。好ましくはこのシグナル配列は、選択された宿主株内で機能するならば、オリジナル遺伝子によりコードされるシグナル配列である。
【０１０９】
幾つかの態様において、自然発生、又は自然に変異した洗浄用プロテアーゼの性質がこの酵素の変異を変えることにより、高められる。大部分において、変異は保存的又は非保存的置換であるが、幾つかの態様において、欠失及び挿入も用いることができる。
【０１１０】
保存的置換において以下の表を用いる
脂肪族
天然
非極性（Ｇ、Ａ、Ｐ、Ｌ、Ｉ、Ｖ）
極性（Ｃ、Ｍ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ）
電荷
負電荷（Ｄ、Ｅ）
正電荷（Ｋ、Ｒ）
芳香族
（Ｆ、Ｈ、Ｗ、Ｙ）
任意のアミノ酸は同じカテゴリー、特に同じラインの他のアミノ酸で置換される。更に、極性アミノ酸、Ｎ、Ｑは電荷アミノ酸に置換するか、又はこれらにより置換される。本発明の目的のために、プロテアーゼのアニオン性質を高めることとなる、特に活性部位に直接含まれない置換が特に好ましい。
【０１１１】
変異のために特に好適な領域は、Ｅｇｌｉｎ Ｃが活性部位に結合している場合は、Ｅｌｉｎ Ｃ抑制分子から４Å離れたアミノ酸である。
【０１１２】
以下の番号はＰＢ９２プロテアーゼに基づいているが、実質的に類似の構造、特に約７０％より高い配列相同性、特に約９０％より高い配列相同性を有する、他のセリンプロテアーゼについても当てはまるであろう。特に好適な位置は、タンパク質に関係する基質と相互作用することから、３２、３３、４８−５４、９４−１０７、１１６、１２３−１３３、１５０、１５２−１５６、１５８−１６１、１６４、１６９、１７５−１８６、１９７、１９８、２３０−２１６（ＰＢ９２の番号）を含む。幾つかの最も好適な態様において、変異位置は、１１６、１２６、１２７、及び１２８（ＰＢ９２番号）である。代替的な態様において、追加的な変異は１６０の位置で起こる。
【０１１３】
更なる態様において、特に意図する置換位置は６０、９４、９７−１０２、１０５、１１６、１２３−１２８、１５０、１５２、１６０、１８３、２１１、２１２、２１３、２１４、及び２１６（ＰＢ９２の番号）を含む。幾つかの位置において、不安定なアミノ酸（例えば、メチオニン）をより酸化安定性のあるアミノ酸（例えば、スレオニン）で置換して、この部位におけるアミノ酸の通常の形態及び容量を維持する。幾つかの他の態様において、天然アミノ酸を大部分他のアミノ酸で置換して改良された結果を得る。特にヒドロキシル化されたアミノ酸Ｓ及び／又はＴを、極性又は非極性アミノ酸、又は更には芳香族アミノ酸で置換する。
【０１１４】
幾つかの最も好適な態様において、置換は以下を含む（ＰＢ９２の番号）、
Ｇ１１６ Ｉ、Ｖ、Ｌ
Ｓ１２６を任意のアミノ酸、Ｐ１２７を任意のアミノ酸、Ｓ１２８を任意のアミノ酸、
Ｓ１６０を芳香族又は中性脂肪族アミノ酸、
Ａ１６６を電荷のある、特定のアミノ酸
Ｍ１６９を天然の脂肪族、好ましくは非極性のアミノ酸
Ｎ２１２ アニオンアミノ酸
Ｍ２１６脂肪族、極性、特に、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ
【０１１５】
驚くべきことに、共通の基質を有するプロテアーゼの低い特定の活性が多くの変異体において得られたが、洗浄性能は天然の酵素に匹敵するか又は高められていて、多くの場合貯蔵安定性が改善されていた。更に、幾つかのＰＢ９２変異プロテアーゼの洗浄性能を天然のＰＢ９２プロテアーゼと比較すると、約１２０乃至約１８０パーセントになっていた。従って、本発明は天然プロテアーゼと比較して改善された性能を有するプロテアーゼを提供する。
【０１１６】
幾つかの態様において、幾つかの変異を組み合わせて洗浄組成物中のプロテアーゼの安定性を高めることができる。同じプロテアーゼの洗浄に有利に影響する幾つかの変異を組み合わせて更に改善されたプロテアーゼを提供することができる（例えば、Ｓ１２６Ｍ、Ｐ１２７Ａ、Ｓ１２８Ｇ、Ｓ１６０Ｄ、及びＧ１１６Ｖ、Ｓ１２６Ｖ、Ｐ１２７Ｓ、Ｓ１２８Ａ，Ｓ１２８Ａ、Ｓ１６０Ｄ；ＰＢ９２の番号）。
【０１１７】
有用な変異タンパク質インデックスは本明細書の変異又は変異のセットを組み合わせて提供することもできる。更なる態様において、本明細書で提供する特に有用な変異は他の部位の変異と組み合わせられる。幾つかの態様において、これらの組合せは酵素の性質において相当の変化をもたらす。他の態様において、これらの変更はそれほど変化をもたらさない。
【０１１８】
本明細書で定義するように、本発明は洗剤組成物及び／又は洗浄工程において１つ以上の変異体タンパク質分解酵素の使用も含む。ＰＢ９２プロテアーゼに対して相同なプロテアーゼにおいて起こる変異誘発又は自然発生のいずれかにより、プロテアーゼのポリペプチド鎖においてアミノ酸の欠失又は置換が起こると、最終的にアミノ酸の番号が変更することは理解されている。しかしながら、ＰＢ９２プロテアーゼのアミノ酸の位置に相同な位置は特許請求の範囲内であることも理解されるであろう。
【実施例】
【０１１９】
以下の実施例は特定の好適な態様を説明する目的で提供されるものであり、本発明をこれらの範囲に限定することを意図するものではない。
【０１２０】
以下に示す実験において、以下の略語を用いる；℃（摂氏温度）；ｒｐｍ（１分当たりの回転数）；Ｈ２Ｏ（水）；ＨＣｌ（塩酸）；ａａ（アミノ酸）；ｂｐ（ベースペア）；ｋｂ（キロベースペア）；ｋＤ（キロダルトン）；ｇｍ（グラム）；μｇ及びuｇ（ミクログラム）；ｍｇ（ミリグラム）；ｎｇ（ナノグラム）；μｌ及びｕｌ（ミクロリットル）；ｍｌ（ミリリットル）；ｍｍ（ミリメートル）；ｎｍ（ナノメートル）；μｍ及びｕｍ（マイクロメートル）；Ｍ（モル）；ｍＭ（ミリモル）；μＭ及びｕＭ（マイクロモル）；Ｕ（単位）；Ｖ（ボルト）；ＭＷ（分子量）；sec（秒）；ｍｉｎ(ｓ)（分）；ｈｒ(ｓ)（時間）；ＭｇＣｌ（塩化マグネシウム）；ＮａＣｌ（塩化ナトリウム）；ＯＤ２８Ｏ（２８０ｎｍにおける光学密度）；ＯＤ６ＯＯ（６００ｎｍにおける光学密度）；ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミド電気泳動）；ＥｔＯＨ（エタノール）；ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水［１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２］）；ＳＤＳ（硫酸ドデシルナトリウム）；トリス（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）；ＴＡＥＤ（Ｎ，Ｎ，Ｎ’Ｎ’−tテトラアセチルエチレンジアミン）；ｗ／ｖ（重量対容量）；ｖ／ｖ（容量対容量）；ＭＳ（マススペクトロコピー）；ＴＩＧＲ（ＴＨＥ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ）；ＡＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｅｘｔｉｌｅ ａｎｄ Ｃｏｌｏｒｉｎｇ Ｃｈｅｍｉｓｔｓ）；ＳＲ（シミ又は汚れの除去）；ＷＦＫ（ｗｆｋ Ｔｅｓｔｇｅｗｅｂｅ ＧｍｂＨ， Ｂｒｕｇｇｅｎ−Ｂｒａｃｈｔ， Ｇｅｒｍａｎｙ）；Ａｍｅｒｓｈａｍ （Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ． Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ， ＩＬ）；ＩＣＮ（ＩＣＮ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ．， Ｃｏｓｔａ Ｍｅｓａ， ＣＡ）； Ｐｉｅｒｃｅ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＬ）；Ａｍｉｃｏｎ（Ａｍｉｃｏｎ， Ｉｎｃ．， Ｂｅｖｅｒｌｙ， ＭＡ）；ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）；Ａｍｅｒｓｈａｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ）；Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ （Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｌａｂｗａｒｅ， Ｌｉｎｃｏｌｎ Ｐａｒｋ， ＮＪ）； ＢｉｏＲａｄ（ＢｉｏＲａｄ， Ｒｉｃｈｍｏｎｄ， ＣＡ）；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）；Ｄｉｆｃｏ（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｄｅｔｒｏｉｔ， ＭＩ）； ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ 又は Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）；Ｎｏｖａｇｅｎ（Ｎｏｖａｇｅｎ， Ｉｎｃ．， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）；Ｑｉａｇｅｎ（Ｑｉａｇｅｎ， Ｉｎｃ．， Ｖａｌｅｎｃｉａ， ＣＡ）；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）；Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ Ｏｙ，Ｅｓｐｏｏ，Ｆｉｎｌａｎｄ）；Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ，Ｅａｓｔｏｎ， ＰＡ）；Ｍｅｒｉｅｕｘ（Ｉｎｓｔｉｒｕｔ Ｍｅｒｉｅｕｘ，Ｃｏｄｅｘ，ＦＲ）；Ｋｅｌｃｏ（ＣＰ Ｋｅｌｃｏ， Ａｔｌａｎｔａ， ＧＡ）；Ｇｅｎａｉｓｓａｎｃｅ（Ｇｅｎａｉｓｓａｎｃｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ， ＣＴ）；ＤＮＡ ２．０（ＤＮＡ ２．０， Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ， ＣＡ）；ＭＩＤＩ（ＭＩＤＩ Ｌａｂｓ，Ｎｅｗａｒｋ， ＤＥ） ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ （ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）；Ｓｉｇｍａ（Ｓｉｇｍａ ＣＨＥＭＩＣＡＬ Ｃｏ．， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）；Ｓｏｒｖａｌｌ（Ｓｏｒｖａｌｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ａ ｓｕｂｓｉｄｉａｒｙ ｏｆ ＤｕＰｏｎｔ Ｃｏ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ， ＤＥ）；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ）；Ｒｏｃｈｅ（Ｈｏｆｆｍａｎｎ Ｌａ Ｒｏｃｈｅ， Ｉｎｃ．， Ｎｕｔｌｅｙ， ＮＪ）；Ａｇｉｌｅｎｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）；Ｍｉｎｏｌｔａ（Ｋｏｎｉｃａ Ｍｉｎｏｌｔａ， Ｒａｍｓｅｙ， ＮＪ）；Ｚｅｉｓｓ（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ， Ｉｎｃ．， Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ， ＮＹ）；Ｈｅｎｋｅｌ（Ｈｅｎｋｅｌ，ＧｍｂＨ， Ｄｕｓｓｅｌｄｏｒｆ， Ｇｅｒｍａｎｙ）；Ｃｏｇｎｉｓ（Ｃｏｇｎｉｓ Ｃｏｒｐ，ＵＳＡ， Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ， ＯＨ）；Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ Ｏｙ， Ｅｓｐｏｏ， Ｆｉｎｌａｎｄ）；Ｒｅｃｋｉｔｔ Ｂｅｎｃｋｉｓｅｒ， Ｂｅｒｋｓ， Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）；ＢＡＳＦ（ＢＡＳＦ Ｃｏｒｐ．， Ｆｌｏｒｈａｍ Ｐａｒｋ， ＮＪ）；ＩＫＷ（Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｖｅｒｂａｎｄ Ｋｏｒｐｅｒｆｌｅｇｅ ｕｎｄ Ｗａｓｃｈｍｉｔｔｅｌ， Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ， Ｇｅｒｍａｎｙ）；及び ＷＦＫ（Ｔｅｓｔｇｅｗｅｂｅ ＧｍｂＨ， Ｂｒｕｇｇｅｎ−Ｂｒａｃｈｔ， Ｇｅｒｍａｎｙ）。
【０１２１】
３．００ｍｍｏｌＣａ＋Ｍｇ（１６．８ｏｄ）を含む幾つかの食器洗浄試験に用いた合成水を以下のように調製した。第一に、１つのストック溶液を調製した。溶液１は８００ｍｍｏｌ／ｌ ＮａＨＣＯ３（６７．２ｇ／ｌ）であり、溶液２は１５４．２ｍｍｏｌ／ｌＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（３８．０ｇ／ｌ）であり、溶液３は４４６．１ｍｍｏｌ／ｌＣａＣｌ２＊２Ｈ２Ｏ（６５．６ｇ／ｌ）であった。各溶液を調製した後、５０ｍｌの各ストック溶液、１、２、及び３を７Ｌの脱イオン水を含む管に入れ、この環に水を入れ全体を１０Ｌにした。使用の前にこの合成水のｐＨの値をＨＣＬ又はＮａＯＨで７．５に調節した。
【０１２２】
以下の表１は本発明の開発の環に製造され試験された変異体を示す。この表において、ＢＰＮ’及びＰＢ９２の番号を参照のために示す。
【表１】
【０１２３】
表１において、全ての株を製造し、実施例で説明する方法を用いて特徴付けた。アスタリスク（＊）で示す下部はＥＰ０５７１０４９に記載のものである（実施例１Ａ乃至Ｃ）を参照のこと。他の全ての変異体は実施例１Ｄに記載のように調製した。
実施例１
ＰＢ９２プロテアーゼ変異体の構築
【０１２４】
この実施例において、本明細書で提供されるＰＢ９２への幾つかを構築するための方法を説明する。変異誘発からの基礎となる構築体を「ｐＭ５８」と呼び、ＥＰ０２８３０７５及びＥＰ０５７１０４９に記載されている。以下の３つの手順を含む。
Ａ．変異誘発ベクター１３Ｍ１の構築、
Ｂ．変異手順
Ｃ．ｐＭ５８Ｅｃｏの構築及びベクター内での変異ＤＮＡフラグメントのサブクローニング
【０１２５】
更に、パートＤ（「ＰＢ９２変異体の構築」）は本発明に有用なＰＢ９２変異体の構築の説明を含む。
Ａ. 変異誘発ベクター１３Ｍ１の構築
【０１２６】
基礎構築物ｐＭ５８は制限酵素ＨｐａＩ及び／又はＢａｌＩを用いて消化した。ＰＢ１９２プロテアーゼ遺伝子を含む１４０ｂｐフラグメントを本分野で知られている低融点アガロース上で精製した。ベクターＭ１３ＭＰ１１（Ｍｅｓｓｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ９：３０３−３２１ ［１９８１］参照）をＳｍａＩで消化した。所望の１４００ｂｐＤＮＡフラグメントをベクターに結合し、既知の方法（Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ６９：２１１０−２１１４ ［１９７２］参照）でＥ．ｃｏｌｉＪＭ１０１に形質転換した。
【０１２７】
Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０１内のファージプロパゲーションの後、ｓｓＤＮＡを既知の方法（Ｈｅｉｄｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， ｇｅｎｅ １０：６９−７３ ［１９８０］）で単離し、Ｓａｎｇｅｒ ＤＮＡ配列決定（Ｓａｎｇｅｒ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７４：６４６３ ［１９７７］を用いて挿入及び伸長をチェックした。変異誘発に適したベクターが得られ「Ｍ１３Ｍ１」と名づけた。図１Ａにおいてこの手順の概要を示す。
変異誘発手順
【０１２８】
変異誘発はＭ１３Ｍ１のｓｓＤＮＡとＭ１３ｍｐ１９（Ｍｅｓｓｉｎｇ ｅｔ ａｌ． Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ９：３０３−３２１ ［１９８８］）のｄｓＤＮＡを用いて、Ｍ１３Ｍ１において行った。後者はＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩの制限酵素で消化して、低融点アガロースで状ラージフラグメントの精製により得られたものである。
【０１２９】
変異誘発は変異体の選択にＥ．ｃｏｌｉＬＭ１０５ではなくＥ．ｃｏｌｉＷＫ３０−３を用いた以外は既知の方法（Ｋｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． ＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１２：９４４１−９４５６ ［１９８４］）で行った。
【０１３０】
特定の変異を生成するために用いるオリゴヌクレオチドの長さは２２分子である。特定のＤＮＡ配列において同時に幾つかの変異を生成するために用いる領域特定変異誘発は、変異されるアミノ酸に対応する部位にランダムに取り込まれた４つのヌクレオチドを含む４０分子の長さを用いてオリゴヌクレオチドプレパレーションを用いて行われた。
【０１３１】
変異誘発の後、ポテンシャル変異誘発をＳａｎｇｅｒジデオキシ法（Ｓａｎｇｅｒら、上記）を用いて配列回折により関連する変異についてチェックした。完全な一本鎖ギャップ（図１Ｂ参照）を配列決定して、第二の変異の欠失を確認した。この手順を図１Ｂに示す。
【０１３２】
説明した手順はプロテアーゼ遺伝子の３’部分に変異を有するＤＮＡフラグメントについて有用であった（アミノ酸１５４−２６９）。
【０１３３】
しかしながら、本分野において好適な任意の方法を用いることができるので、本発明をこれらの特定の方法に限定することは意図しない。すなわち、バチルスベクターにおいて、プロテアーゼ遺伝子の５’部分における変異を有するＤＮＡフラグメントを生成するために、代替的な制限酵素及び／又は修飾されたＰＢ９２プロテアーゼ遺伝子を、図１Ａに図示された方法と類似の方法で構築することができる。
Ｃ．ｐＭ５８Ｅｃｏの構築及びベクター内での変異ＤＮＡフラグメントのサブクローニング
【０１３４】
ｐＭ５８Ｅｃｏを構築するために、ｐＭ５８を制限酵素ＥｃｏＲＩで消化して、本分野で知られているように、希釈条件下で、Ｔ４リガーゼを用いてリゲートした。リゲーション混合物は本発明の分野で既知の方法を用いてバチルススブチリス１−Ａ４０（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｒｅ， Ｏｈｉｏ）を形質転換した （Ｓｐｉｚｉｚｅｎ ｅｔ ａｈ， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｄ．， ８１ ：７４１−７４６ ［１９６１］参照）。
【０１３５】
形質転換混合物からの細胞を、本分野で既知の方法で、２０ｍｇ／ｍｌネオマイシンを含む最小平板培地で平板培養した（ＥＰ０２８３０７５の実施例１を参照）。
【０１３６】
形質転換体のプラスミドＤＮＡを本分野で既知の方法（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ ａｎｄ ＤｏＩｙ， Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ７：１５１３−１５２３ ［１９７９］参照）で単離し、制限酵素解析で特徴付けた。従って、この方法により、ｐＭ５８Ｅｃｏを単離した（図１ｃ参照）。
【０１３７】
変異酵素を生成するために、上で説明したパートＢにおいて生成された所望の変異を含むＭ１３Ｍ１のＤＮＡフラグメントをｐＭ５８Ｅｃｏにサブクローニングした。その後、Ｍ１３Ｍ１の２本鎖（ｄｓＤＮＡ）をＥｃｏＲＩで消化し、ｐＭ５８ＥｃｏのＥｃｏＲＩにリゲートした。本分野で既知の方法（Ｓｐｉｚｉｚｅｎ ｅｔ ａｌ．， 上記）を用いてこのリゲート混合物を用いてバチルススブチリスＤＢ１０４（Ｄｏｉ， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １６０：４４２−４４４ ［１９８４］）を形質転換した。
【０１３８】
形質転換混合物からの細胞を２０ｍｇ／ｍｌのネオマイシン及び０．４％カゼインを含む最小平板培地で、本分野で既知の方法（ＥＰ０２８３０７５参照）を用いて平板培養した。プロテアーゼを生産している形質転換体のＤＮＡを本分野で既知の方法（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ ａｎｄ ＤｏＩｙ 上記）で単離し、制限酵素解析により特徴付けを行った。
Ｄ．ＰＢ９２変異体の生成
【０１３９】
本分野で知られているように（米国特許出願Ｎｏ．０１／５４１，７３７、参照により本明細書に援用する）、０５３乃至０６０と定義されたＰＢ９２変異体を融合ＰＣＲで調製した。以下の表に本明細書で述べる融合ＰＣＲに用いたプライマーを示す。
【表２】
【０１４０】
Ｐｎｕｓｉｏｎ（商標）ポリメラーゼ（フィンザイム）をＰＣＲ反応に用いた。これらの実験において、２μｌの１０ｍＭ前方向及び後ろ方向プライマー、１μｌの１０ｍＭｄＮＴＰｓ、５μｌの１０×ＨＦ融合緩衝液、１．５μｌのＤＭＳＯ、並びに１μｌのテンプレートを５０μｌの容量に添加した。９５℃での変性を３分間、６５℃のアニーリングを１分、７２℃での伸長反応を１分１５秒、これらを３０サイクル繰り返し、続いて７２℃を７分のプログラムを用いた。反応が終了したら、反応生成物を室温で貯蔵した。
【０１４１】
変異体「０４７／０４８」をテンプレートとして用いて、変異体０５３乃至０５８を生成した。ＢｇｌＩＩ−Ｆｗプライマーを１１８Ｖ−Ｒｖｄｔｏ組み合わせて、第二フラグメントをＢｇｌＩＩ−Ｒｖと１２８−１３０−Ｆｗプライマーと組み合わせて調製した。０５７の場合、ＢｇｌＩＩ−Ｆｗ／Ｓ１６６Ｄ−Ｒｖを組み合わせた。
【０１４２】
更に、変異体「０５１／０５２」をテンプレートとして用いて、変異体０５９乃至０６０を生成した。プライマー１２６−ｕｐ−ＲｖをＢｇｌＩＩ−Ｆｗと組み合わせて、ＢｇｌＩＩ−Ｒｖを１２８−１３０−Ｆｗプライマーと組み合わせた。
【０１４３】
予期したサイズのフラグメントをＭａｃｈｅｒｅｙ−ＮａｇｅｌからのＰＣＲ生成カラムを用いてアガロースゲルから生成した。正確なフラグメントを融合し、Ｐｎｕｓｉｏｎ（商標）ポリメラーゼを用いてＢｇｌＩＩプライマーで増幅した。９５℃での変性を３分、６５℃でのアニーリングを１分、７２℃での伸長反応を２分行い、これを２５サイクル繰り返し、その後、７２℃で７分のプログラムで行った。プログラムが終了したら、反応生成物を室温で貯蔵した。
【０１４４】
フラグメントをＢｌＩＩで消化して、アガロースゲルで精製し、本分野において既知の方法を用いて、４０μｌ容量中、１μｌのＴ４ＤＮＡリガーゼ、８μｌの５×Ｔ４リゲーション緩衝液をもちいて、１４℃で一晩リゲーションを行った。
【０１４５】
高度形質転換可能な株であるバチルススブチリスＢＧ３５９４ｃｏｍＫを用いて、プロテアーゼ陽性形質転換体を得た。上で説明するように得られた発現ベクターを１０μｌのリゲーション生成物を用いて形質転換を行った。好適なバチルススブチリスであるバチルススブチリスＢＧ３５９４ｃｏｍＫを実施例１で生成した発現プラスミドで形質転換した。キシロースを誘導可能なプロモーターの制御下のｃｏｍＫ遺伝子を導入してこのバクテリアをコンピテントにした（Ｈａｈｎ ｅｔ ａｌ， ＭｏＩ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ２１：７６３−７７５ ［１９９６］参照）。プロテアーゼ陽性クローンを選択し、単離し、配列決定し、実施例２で説明するようにバチルスクラウシ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）ＰＢＴ１２５に形質転換した。
実施例２
バチルスクラウシ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）における変異体の発現
【０１４６】
この実施例では、実施例１で説明した発現ベクターを用いてバチルスクラウシ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）ＰＢＴ１２５中で発現された変異体プロテアーゼの開発に用いた方法を提供する。この株はＰＢＴ１１０のプロテアーゼ陰性誘導体であり、従来の株を改良する方法を用いて得られたものであり、アスポジェニティー（ａｓｐｏｒｏｇｅｎｉｔｙ）及び改善されたプロテアーゼ生産についてスクリーニングをおこなっている。
ＰＢ９２プロテアーゼ陰性融合体：ＰＢＴ１２５の形質転換手順
【０１４７】
本分野で既知の、Ｃｈａｎｇ及びＣｏｈｅｎのポリエチレングリコール誘導プロトプラスト形質転換方法（Ｈａｈｎ ｅｔ ａｌ， ＭｏＩ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ２１：７６３−７７５ ［１９９６］））を、以下で説明する変更を行い、実施例１で説明する発現ベクターを用いて、バチルスクラウシ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）ＰＢＴ１２５を形質転換するために用いた。第一に、プロトプラストを０．５Ｍスクロース、０．０２ＭＭｇＣｌ２、及び０．０２Ｍトリスマレイン酸緩衝液（ｐＨ８．０）を含むアルカリホールディング培地に１ｍｌ当たり０．４ｍｇのリゾザイムを添加して調製した。その後、このプロトプラストを平板培養し、３．５％（ｗｔ／ｖｏｌ）のＢａｃｔｏ−Ｐｈｅｎａｓｓａｙ（ディフコ）ブロスと０．０４％アルブミン（メリエックス）を添加したアルカリホールディング培地５ｍｌ中に懸濁した。形質転換されたプロトプラストを７５０ｍｌＨ２Ｏ中、８．０ｇのＧＥＬＲＩＴＥ（商標）ｇｅｌｌａｍ Ｇｕｍ（Ｋｅｌｃｏ）、０．３ｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、４．０６ｇのＭｇＣｌ２・Ｈ２Ｏ、５．０ｇのＮ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸緩衝液（シグマ）、５．０ｇのカザミノ酸、５ｇの酵母抽出物、１．５ｍｌの４Ｍ ＮａＯＨを含む変更されたＤＭ３（５）プレート上で再生成し、２５０ｍｌの２Ｍスクロース及び１０ｍｌの５０％（ｗｔ／ｖｏｌ）グルコース、１ｍｌのアルブミン（Ｍｅｒｉｅｕｘ）、１０ｍｇのチアミン、５ｍｇのビオチン、及び５０ｍｇのネオマイシンで滅菌した後に混合した。プレートを約７０℃で注いだ。コンピテントバチルスクラウシ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）の形質転換を既知の方法で行った（Ｔａｎａｋａ， “Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｐｌａｓｍｉｄ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｉｎ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ，” Ｉｎ Ｄ． Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ (ｅｄ．)， Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ． Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｄ．Ｃ．， ｐｐ．１５−１８， ［１９８２］参照）。
発酵条件及びプロテアーゼ生成
【０１４８】
１リットル当たり（乾燥重量に基づき）２２ｇの酵母、１リットル当たり５ｇのＫ２ＨＰＯ４・３Ｈ２Ｏ、１リットル当たり０．０５ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１リットル当たり０．０５ｇのＣａＣｌ２、１リットル当たり０．００５ｇのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、及び１リットル当たり０．０５ｇのＭｎＳＯ４を含む培地を用いて、６又は３リットルの発酵槽中で、バチルスクラウシ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）ＰＢＴ１２５を形質転換した。最終容量の９０％の培地成分を溶解しｐＨ７．０で１２０℃で、１時間滅菌した。滅菌の後、４ｍｌの１Ｍカルボン酸ナトリウム溶液をスラントチューブから添加して、バチルスクラウシ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）ＰＢＴ１２５を１００ｍｌのＴＳＢへ植菌することにより植菌培地を生成した。この植菌培地を振とう装置で、３７℃で２４時間インキュベーションした。培地を培地１００容量当たり１容量の植菌培地で、ｐＨ８．０で３７℃で植菌した。ｐＨ、温度、発泡の制御、並びに溶解酸素濃度及び酸素取り込み速度を連続的に測定することができる装置を備えた攪拌式発酵装置において行った。植菌の１７時間後、１２０℃で１時間滅菌された３０％のグルコース溶液を、培地１リットル当たり３０グラムの最終濃度となるように添加した。
【０１４９】
ブロスを１１，８００ｘｇで３０分間遠心分離した。この上清をＷｈａｔｍａｎガラス繊維フィルター及びブフナー漏斗中の０．８ｕｍフィルターでろ過をして、その後にセルロースパッドを用いてろ過をした。得られた物質を使用するまで４℃で保存した。次に、この物質を１０ｋＤａの分子量を取り除くＰａｌｌＵＦ−ろ過ユニットを用いて濃縮した。得られたＵＦ濃縮物をプロピレングリコール及びギ酸ナトリウムを添加して製剤化した。ギ酸を添加してｐＨを６．０にした。
実施例３
精製されたプロテアーゼの精製度を確認するための解析技術
【０１５０】
この実施例では、精製されたプロテアーゼの精製度を確認するための方法を説明する。プロテアーゼは電気泳動及び高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により、それぞれ、１つのバンド及び１つのピークが見られた場合に精製されたと考えられる。
【０１５１】
ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含まないポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を本分野で既知の方法を用いて行った（Ｌａｅｍｍｌｉ， Ｎａｔｕｒｅ， ２２７：６８０−６８５ ［１９７０］参照）。しかしながら、自己分解を避けるために、１００℃でＳＤＳでタンパク質サンプルを変性させる前に、プロテアーゼ活性を失活させることが必要となる。フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）（１ｍＭ、３０分、室温）でインキュベーション、又は、トリクロロ酢酸で沈殿（ＴＣＡ、８％、３０分、氷上）することによりプロテアーゼの失活を行った。ＰＡＧＥはｐＨ７．４５で行った（ゲル緩衝液は、５％ポリアクリルアミドゲル中、２０ｍＭのヒスチジン（Ｈｉｓ）及び５０ｍＭの３−［Ｎ−モルフォリノ］プロパンスルホン酸を含む（アクリルアミド：ビスアクリルアミドは２０：１））。タンパク質サンプルをスラブゲルのトップにロードして、陰極に向かって電気泳動を行った。５Ｈｉｓ・ＭＯＰＳ緩衝液を電気泳動（タンク）緩衝液として用いた。ｐＨは６．３であった。電気泳動（１−２時間で３５０ｖ）の後、ゲルを８％の酢酸に浸して、タンパク質をゲル中に固定し、続いて、本分野で既知の方法で、クマシーブルーで染色し、脱色した。
【０１５２】
ＨＰＬＣによる精製度のチェックはカチオン交換カラム（ＭｏｎｏＳ；ファルマシア）及びゲルろ過カラム（ＴＳＫ２０００；ＳＷ−ＬＫＢ）を用いた。前者は１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．５中で行った。１０乃至１３３ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ５．５の勾配を用いて結合したプロテアーゼの溶出を行った。ゲルろ過カラムは０．２５ｍＭの酢酸ナトリウム中で行った。
実施例４
プロテアーゼ濃度の決定
【０１５３】
この実施例では、プロテアーゼ濃度を決定にするための方法を説明する。いくつかの実験において、２８０ｎｍで吸光度の測定を行い、計算された減衰係数（Ｍ）を用いて、以下で述べるように活性部位のタイトレーションを用いて精製されたタンパク溶液の濃度を決定した。追加的な実験において、米国特許出願Ｎｏ．１１／０１１，６６６に定義されている方法も用いた。
【０１５４】
２８０ｎｍにおける吸光度の測定は酵素分子当たりのトリプトファン（Ｍ＝５，６００Ｍ−１・ｃｍ−１）及びチロシン（Ｍ＝１，３３０Ｍ−１．ｃｍ−１）の数から計算された。ＰＢ９２プロテアーゼについて、Ｍは２６，１００Ｍ−１．ｃｍ−１（３ Ｔｒｐ、７Ｔｒｙ残基）であり、Ｅ１ １％ｃｍに等しく、２８０ｎｍ＝９．７（Ｍｒ＝２６，７２９Ｄａ）であった。Ｔｒｐ残基及びＴｒｙ残基の変更された数を有する変異体の場合、係数がそれに応じて作成される。
【０１５５】
活性酵素分子の数の評価は活性部位滴定を用いて行った。広く行われているＮ−トランスシナモイルイミダゾールを用いる方法（Ｂｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ， ８８：５８９０−５９３１ ［１９６６］）は、ＰＢ９２プロテアーゼについて効果的ではないので、ＰＭＳＦを用いる方法をかわりに用いた。
【０１５６】
この方法において、（２８０ｎｍの吸光度で）評価される濃度の酵素を含むプロテアーゼ溶液を０．２５、０．５０、０．７５、１．００及び１．２５に等しいＰＭＳＦと混合し、ｐＨ６．５の１０ｍＭリン酸ナトリウム中で室温で１時間反応させた。酵素濃度は少なくとも５０Ｍであった。
【０１５７】
残余活性は、スクシニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−プロリル−Ｌ−フェニルアラニル−パラ−ニトロアニリル（ｓＡＡＰＦｐＮＡ）を基質として用いた分光高度により測定した。ＰＭＳＦの精製度（及び濃度）をＮＭＲスペクトロコピーを用いて決定し、ストック溶液をイソプロパノール中に作成した。活性部位滴定から得られたはＨＰＬＣをもちいた精製度チェックに一致していた。
実施例５
野生型変異プロテアーゼの動的パラメーターの決定
【０１５８】
この実施例において、野生型及び変異プロテアーゼの動的パラメーターを決定するための方法を説明する。
【０１５９】
タンパク質基質（カゼイン）上の活性を英国特許Ｎｏ．１，３５３，３１７に記載の方法でｐＨ１０で測定した、
【０１６０】
基質としてカゼインを用いてあらゆるｐＨにおいて（ｐＨ−ｓｔａｔ）転換数を測定した。あらゆるｐＨの反応チャンバーは１０ｍｌの０．１ＭＫＣｌと５０ｍｇのカゼイン（Ｈａｍｍｅｒｓｔｅｉｎ、メルク）を含んでいた。ＰＢ９２プロテアーゼによりカゼインを加水分解して遊離されたプロトンを、ｐＨを１０．０に維持しながら、１０ｍＭのＮａＯＨで滴定した（窒素ガス流れ中、４０℃）。
【０１６１】
合成ペプチドの活性はｓＡＡＰＦｐＮＦを用いて測定した。形成された（黄色い）パラニトロアニリン（ｐＮＡ）をＵＶＩＫＯＮ８６０（ＫＯＮＴＲＯＮ）を用いる既知の方法（Ｄｅｌｍａｒ ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ９４：３１６−３２０ ［１９７９］）を用いて、サーモスタッド制御された６つの位置のセルチャンバーを有する分光高度計により、４１０ｎｍ；Ｍ＝８，４８０Ｍ−１・ｃｍ−１で測定した。動的パラメーター、ｋｃａｔ及びｋｍは（プロテアーゼ濃度で０．１乃至６．０ｍＭの）各種濃度で、初期速度からデータを得て、このデータを多変数曲線反復方法（ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ ｓｅｃａｎｔ ｉｔｅｒａｔｉｖｅ ｍｅｔｈｏｄ）を用いて、非直線回帰による双曲線関数に当てはめることにより計算した。特定の係数、ｋｃａｔ／ｋｍをその後計算した。測定は、２５℃で、最終容量１ｍｌ中０．１ＭトリスＨＣｌと０．１ＭのＮａＯＨ、ｐＨ８．６とを含む溶液を用いて行った。塩化ナトリウムが存在しないと、ＰＢ９２プロテアーゼは基質抑制が起き、非直線ラインウェーバー−バークプロットを示すので、この添加が必要である。基質を最初にＤＮＳＯに溶解し、２００ｍＭの濃度にして、その後、トリスＨＣｌ、ｐＨ８．６で希釈して、２０ｍＭ（３１５ｎｍ；Ｍ＝１４，０００Ｍ−１・ｃｍ−１で分光光度計を用いて測定）のストック溶液を調製した。ＤＭＳＯの変更のための補正は行わなかった（０．０５−３．０％、ｖ／ｖ）。
実施例６
洗浄性能試験
【０１６２】
この実施例では、市販の食器用洗剤を用いたＰＢ９２プロテアーゼ変異体と市販のＰＲＯＰＥＲＡＳＥ（商標）セリンプロテアーゼの食器洗浄に適用した場合の洗浄性能を決定するための試験を説明する。
【０１６３】
この試験において、ＰＢ９２変異体（０４９：Ｇ１１６Ｖ，Ｓ１２６Ｖ、Ｐ１２７Ｑ、Ｓ１２８Ａ、並びに０４６：Ｇ１１６Ｖ、Ｓ１２６Ｉ、Ｐ１２７Ｑ、Ｓ１２８Ａ、Ｓ１６０Ｄ（ＰＢ９２番号）を各種条件下で試験を行った。食器用洗剤の成分を以下で説明する。これらの洗剤はＷＦＫから入手可能であり、以下に表示する。各汚れタイプ（ひき肉、黄身、黄身とミルク）についての手順は以下で説明する。それぞれの汚れを試験に用いる食器に適用する前に、食器は徹底的に洗浄する。このことは、特定の汚れが、洗浄後の食器に残っていることがあるので、必ず行う。新しい食器を試験に最初試験に用いる前に３回徹底的に洗浄した。
ステンレススチール上の黄身の汚れ
【０１６４】
試験に用いたステンレススチールシート（１０×１５ｃｍ；片面がつや消しされている）を市販の高アルカリ洗剤（ＥＣＯＬＢＡ（商標）洗剤；Ｈｅｎｋｅｌ）を用いて実験室用の食器洗浄器中、９５℃で徹底的に洗浄し、きれいで油が残っていないスチールを用意した。これらのスチールを使用する前に、デバリングした。このシートを黄身の汚れをつける前に加熱キャビネット中で８０℃で３０分間乾かした。つや消しされた表面を汚れをつける前に触れないようにした。水のシミもほこりも表面上にあってはならない。冷却したシートを汚れを付着させる前に重さを量った。
【０１６５】
１０乃至１１のタマゴ（２００ｇのタマゴの黄身）の黄身を分離して汚れを付着させるための黄身を調製した。この黄身をガラスビーカーの中でフォークを用いて攪拌して黄身の懸濁液を調製した。この黄身をその後、洗い粒子及び殻の破片を取り除くために（約０．５ｍｍメッシュ）で裏ごしした。
【０１６６】
平らな刷毛（２．５”）を用いて、約１．０±０．１ｇの黄身を出来るだけ均一に１４０ｃｍ２のつや消しされた表面に塗り、（必要に応じて粘着テープを用いて）約１ｃｍの汚れを塗布しない縁を作った。汚れが付着したシートを（シートの縁に液滴が形成しないように）室温で４時間（最大２４時間）平らに置いて乾燥させた。
【０１６７】
変性剤について、（必要に応じて、固定装置を用いて）これらのシートを３０秒間沸騰している脱イオン水中に置いた。その後、このシートを８０℃で３０分間乾燥させた。乾燥及び／又は冷却の後、シートの重さを量った。重量測定の後、試験に用いる前に、シートを少なくとも２４時間放置した（２０℃、４０乃至６０％の相対湿度）。試験の必要に応じて、（変性後の黄身が）５００±１００ｍｇ／１４０ｃｍ２のシートのスチール板のみを試験に用いた。洗浄試験の後、洗浄試験を行った後、このシートを加熱キャビネット内で８０℃で３０分乾燥させ、重量を量り、再度冷却した。洗浄性能のパーセンテージは洗浄により放出された黄身のｍｇ×１００をスチールに適用して変性された黄身のｍｇで割って計算した。
【０１６８】
磁器プレート上のひき肉
これらの実験について、欧州規格（ＥＮ）５０２４２、フォーム１４９５、Ｎｏ．０２１９、直径１９ｃｍデザートプレート（Ａｒｚｂｅｒｇ， ｗｈｉｔｅ， ｇｌａｚｅｄ ｐｏｒｃｅｌａｉｎ）を用いた。トータル２２５ｇの赤みのブタ及びビーフ（当量の混合物）を目視可能な脂肪を取り除き、細かく刻み、冷却した。この混合物を２回、ひき肉器にかけた。３５℃以上の温度を避けた。その後、この２２５ｇのひき肉を７５ｇのタマゴと混ぜた（黄身と白身の混合物）。調製後、用いる前に３ヶ月間―１８℃で保存した。これらは互換的に使用可能であるので、ブタ肉が使用できない場合、牛肉を用いた。
【０１６９】
ひき肉とタマゴの混合物（３００ｇ）を室温に戻して、８０ｍｌの合成水と混合した。この混合物を家庭用のブレンダーを用いて２分間ホモジナイズした。その後、フォークを用いて、このひき肉／タマゴ／水の混合物の３ｇを各白い磁器プレートに、塗り、約２ｃｍの塗布していない幅広い縁を残しておいた。適用された量は１１．８±０．５ｍｇ／ｃｍ２であった。このプレートを１２０℃で２時間、予備加熱しておいた加熱チャンバー内に置いた。プレートを冷却するとすぐに試験に用いる準備をした。各プレートの間にペーパータオルを挟み、プレートを積み上げた。
【０１７０】
洗浄の後、このプレートにニンヒドリン溶液（１％エタノール）を吹きつけ、ひき肉の残りがよくわかるようにした。呈色反応を促進するために、このプレートを加熱チャンバー内で１０分間８０℃で加熱した。洗浄性能の評価はＩＫＷフォトグラフカタログ（ＩＫＷ）を参照して、ひき肉の呈色反応を目視により評価した。
ステンレススチール上のタマゴ／ミルクの汚れ
【０１７１】
これらの試験に用いたステンレススチール（１０×１５ｃｍ；片面がつや消しされている）を市販の高アルカリ洗剤を用いて実験室用の食器洗浄器で９５℃で洗浄した。このシートをセルロースクロスで磨いた。磨いた面を汚れをつけるまで、触らないでいた。水のシミもホコリもこの面には付着していなかった。汚れをつける前、これらのシートを８０℃の加熱キャビネットで３０分間加熱した。冷却したシートを汚れをつける前に重さを量った。
【０１７２】
黄身と白身（３−４個のタマゴ、１６０ｇ／タマゴ）をボウルの中に置き、泡だて器でかきまぜた。その後、５０ｍｌのセミスキムＵＨＴ（１．５％の脂肪、高温ホモジナイズ）ミルクをこの混合物に加えた。このミルクとタマゴを泡をたてないようにかき混ぜた。平らな刷毛で、ステンレススチールの磨かれた面に、分散を均一にするように、１．０±０．１ｇのタマゴ／ミルク混合物を均一に分散させた。最大値が約１．０ｃｍになるように、シートの短い方に余白を残しておいた。この固形シートを（シートの端に液滴が形成しないように）室温で、４時間（最大約２４時間）平らにおいて乾燥させた。
【０１７３】
このシートをその後、（必要に応じて、固定装置を用いて）沸騰している脱イオン水に３０秒浸した。その後、このシートを再度、８０℃で３０分間乾燥させた。乾燥及び冷却の後、このシートの重量を測定した。重量を測定した後、洗浄試験に用いる前にこのシートを少なくとも２４時間放置した（２０℃、４０−６０％相対湿度）。試験の必要に応じて、１９０±１０ｍｇの黄身を含むシートのみを試験に用いた。
【０１７４】
洗浄試験を行った後、これらのシートを加熱チャンバー内で８０℃で３０分間乾燥させ、冷却の後、重量を測定した。洗浄性能のパーゼンテージは洗浄により放出されたタマゴ／ミルクのｍｇ×１００を適用したタマゴ／ミルクのｍｇで割って計算した。
洗浄装置及び条件
【０１７５】
洗浄試験は、上で説明した汚れを付着させた面及びステンレススチールを入れた食器洗浄器（Ｍｉｅｌｅ：Ｇ６９０ＳＣ）で行った。決められた量の洗剤を用いて、以下の表の結果を得た。試験に用いた温度は、４５℃、５５℃、及び６５℃であった。水の高度は９ｏ又は１２ｏＨＧ（Ｇｅｒｍａｎ Ｈａｒｄｎｅｓｓ）（３７４ｐｐｍ Ｃａ）であった。
【０１７６】
上で説明したように、洗浄後、ひき肉の汚れを付着させたプレートを０−１０にランクわけされた見本を用いて、目視により評価した。０は完全に汚れた皿を意味し、１０はきれいな皿を意味する。これらの値は酵素含有洗浄のシミ又は汚れ除去（ＳＲ）能力に対応する。
【０１７７】
黄身及び／又は黄身とミルクの汚れを付着させた、洗浄したステンレススチールプレートの重さを測定して、洗浄後に残っている汚れの量を決定した。ＰＢ９２変異体プロテアーゼ及び／又はＰＲＯＰＥＲＡＳＥ（商標）プロテアーゼ及び他の変異タンパク質インデックスを洗浄１回当たり、０と２０．７５ｍｇ／活性タンパク質のレベルで試験を行った。
【０１７８】
これらの試験に用いて洗浄で説明する。これらの洗浄は試験に用いて酵素の解析を行うため酵素を含んでいない。
【表３】
【表４】
【０１７９】
各試験の結果を以下の表に示す。これらの結果において、指標は１００である。従って、ＰＲＯＰＥＲＡＳＥ（商標）酵素の結果を「１００」としており、変異体について得られた結果をこれらの値と比較している。例えば、ＰＲＯＰＥＲＡＳＥ（商標）が４５％のＳＲ（これを１００とする）を示し、変異体が５２％のＳＲを示したならば、変異体の結果は５２／４５×１００＝１１６（指標として）となる。
【表５】
【表６】
【表７】
【表８】
【表９】
【表１０】
【０１８０】
本明細書で言及した特許及び刊行物は、本発明が属する技術分野における当業者のレベルを示すために用いる。全ての特許及び刊行物が、特定していること、及び示していることは、それぞれ参照により本明細書に援用される。
【０１８１】
好適な態様をもって本発明を説明してきたが、開示された態様における各種変更を
行う事ができることは、当業者に理解されており、そのような変更は本発明の範囲内である。
【０１８２】
本発明はここに含まれるもののほかに、本発明の目的を実行するための、及び／又は言及された結果及び利益を得るために、適していることは当業者が容易に理解するだろう。本明細書で述べた組成物及び方法は、例示的なものであり、本発明の範囲をこれらの限定することを意図するものではない。
【０１８３】
本明細書に開示されている発明は、本明細書において言及されていない任意の要素、限定がなくても行うことができるだろう。本明細書において用いる用語及び表現は説明のために用いているのであり、限定を付すために用いているのではない。更に、それらの用語及び／又は表現に示されている又は言及されている特徴又はそれらの一部の任意の均等物を排除することを意図するものではない。しかしながら、そのような変更は本発明の範囲内にあることが理解されるであろう。従って、好適な態様及び任意の特徴を開示して本発明を説明しているが、本明細書に開始されているコンセプトの変更及び変法も本発明に包含されることが当業者により理解され、そのような変更及び変法は添付の特許請求の範囲により定義される本発明の範囲内である。
【０１８４】
発明はここに広く、総称的に説明されている。一般的な開示に入っているより狭い種と亜属のグループのそれぞれはまた発明の一部となる。これは、記載されていない事項がここに特に言及されるかどうかを問わず、削除されている条件または除く記載をも発明の一般的な記載に含まれることを意味する。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特に、食器洗剤用製品に好適なプロテアーゼ組成物を提供する。
【背景施術】
【０００２】
通常、従来の国内の及び工業的に生産されている食器洗剤用組成物は、食器の洗浄及び消毒のために高いアルカリ性洗剤及び塩素系漂白剤を含む。しかしながら、これらは、家庭、病院、カフェテリア、ケイタリング等における食器にしばしば存在するタンパク質含有汚れを除去することに欠点を有する。更に、非常に高いアルカリ洗剤及び塩素系漂白剤は、消費者又は環境にやさしくないと考えられている。
【０００３】
タンパク質精製の汚れを除去することに効果的な洗浄用組成物を提供するために数多くの試みがなされてきた。これらの組成物はアルカリ条件下で（例えば、少なくともｐＨ９．５）で活性を有するプロテアーゼを含む。しかしながら、そのような組成物は、消費者に食器用洗剤として好ましいと従来考えられている液体又はゲル形態に製剤化することが難しい。更に、アルカリ性食器洗剤用組成物は、しばしは、刺激物であると考えられている。
【０００４】
低ｐＨ（例えば、ｐＨ９．５未満のｐＨ）の食器用洗剤を製造するための試みがなされてきた。これらの組成物は、安全で、環境にやさしく、ゲル及び液体に製剤化することが可能であった。しかしながら。低ｐＨの近年の食器洗浄用組成物は、該組成物中に高濃度の酵素（例えば、プロテアーゼ）が配合ざれているにも関わらず、汚れを除去するには、あまり効果的ではなかった。
【０００５】
従って、食器からタンパク質性の汚れを効果的に除去する食器洗浄用組成物に対する需要が本分野において存在する。更に、環境及び使用者に対してやさしく、使用が容易な形態に製剤化することができ、経済的な食器洗浄組用成物に対する需要も存在する。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は食器用洗剤製品に用いるのに改良された性質を有する変異体プロテアーゼを提供する。幾つかの好適な態様において、該変異体プロテアーゼは少なくとも以下のアミノ酸配列を有するｐＢ９２セリンプロテアーゼのアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列相同性を有する。
Ｈ２Ｎ−
【化１】
更なる態様において、変異体プロテアーゼは配列番号２に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも、９９％の配列相同性を有している。本明細書における各種態様において、変異体プロテアーゼは、野生型ＰＢ９２プロテアーゼと比較した場合、改良された相同性を有している。
【０００７】
幾つかの好適な態様において、本発明は開始プロテアーゼと比較して改良された洗浄性能を有する変異体プロテアーゼを提供する。幾つかの好適な態様において、この酵素は、本明細書の表１で規定する置換を有し、０４９、０４５、０４６、０４７／０４８、０５０、０５１／０５２、０５３、０５４、０５５／０５６、０５７、０５８、０５９、及び０６０として設計されたものを含む。更なる態様において、本発明は追加的な変異体（例えば、置換、挿入、及び／又は欠失）を有するこれらの酵素を提供する。
【０００８】
幾つか特に好適な態様において、以下のアミノ酸配列を有する０４９として設計された酵素を提供する。
【化２】
【０００９】
本発明は、本発明で説明する変異体プロテアーゼの少なくとも１つを含む、タンパク質分解酵素製品を含む新しい酵素の食器用洗剤も提供する。
【００１０】
更なる態様において、本発明は修飾されたスブチリシンを含む食器洗浄用組成物を提供する。前記スブチリシンは配列番号２で定義される配列に少なくとも１つの置換を含む。スブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の位置に各位置は対応しており、置換はＧ１１８、Ｓ１２８、Ｐ１２９、Ｓ１３０、及びＳ１６６から選択される。
【００１１】
幾つかの好適な態様において、修飾されたスブチリシンはＧ１１８、Ｓ１２８、Ｐ１２９、及びＰ１３０における置換を含む。幾つかの特に好適な態様において、修飾されたスブチリシンはＧ１１８Ｖにおける置換と少なくとも１つの追加的な置換とを含む。幾つかの特に好適な態様において、修飾されたスブチリシンはＳ１２８Ｃ、Ｓ１２８Ｒ、Ｐ１２９Ｑ、Ｐ１２９Ｒ、Ｓ１３０Ｐ、及びＳ１３０Ｇからなる群から選択される。幾つかの態様において、修飾されたスブチリシンのアミノ酸配列は配列番号３で定義される。
【００１２】
本発明は修飾されたスブチリシンを含む食器洗浄用組成物を含む態様も提供する。各位置はスブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の位置に対応しており、スブチリシンは配列番号２で定義される配列中に１つの置換を含み、該置換はＳ１３０Ｔである。
【００１３】
本発明は修飾されたスブチリシンをコードする単離核酸も提供する。前記スブチリシンは配列番号２で定義される配列中に少なくとも２つの置換を含む。各位置は、スブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の位置に対応する。位置はＧ１１８、Ｓ１２８、Ｐ１２９、Ｓ１３０、及びＳ１６６から選択される。幾つかの態様において、この核酸はＧ１１８、Ｓ１２８、Ｐ１２９、及びＳ１３０の位置における置換を含む修飾スブチリシンである。幾つかの態様において、この核酸はＧ１１８、Ｓ１２８、Ｐ１２９、及びＳ１３０の位置における置換を含む。幾つかの好適な態様において、この核酸はＧ１１８及び少なくとも１つの追加的な変異を含む修飾されたスブチリシンをコードする。幾つかの特に好適な態様において、この核酸は更に、Ｓ１２８Ｆ、Ｓ１２８Ｌ、Ｓ１２８Ｎ、Ｓ１２８Ｒ、Ｓ１２８Ｖ、Ｐ１２９Ｅ、Ｐ１２９Ｌ、Ｐ１２９Ｍ、Ｐ１２９Ｎ、Ｐ１２９Ｌ、Ｐ１２９Ｑ、Ｐ１２９Ｓ、Ｓ１３０Ａ、Ｓ１３０Ｋ、Ｓ１３０Ｐ、Ｓ１３０Ｔ、Ｓ１３０Ｖ、及びＳ１６６Ｄからなる群より選択される追加的な変異を含む。更なる好適な態様において、この核酸はＳ１２９、Ｓ１３０、及びＳ１３０の位置における変異を含む修飾されたスブチリシンをコードする。更なる好適な態様において、この核酸は、Ｓ１２８Ｃ、Ｓ１２８Ｒ、Ｐ１２９Ｑ，Ｓ１３０Ｄ、及びＳ１３０Ｇから選択される置換を含む。
【００１４】
幾つかの好適な態様において、修飾されたスブチリシンのアミノ酸配列は配列番号３で定義される。幾つかの追加的な態様において、本発明は配列番号３で定義するアミノ酸配列をコードする単離核酸を提供する。
【００１５】
更なる追加的な態様において、本発明は前述の少なくとも１つのアミノ酸を含むベクターを提供する。更なる態様において、本発明は前で定義された単離核酸の少なくとも１つを含むベクターを提供する。更なる態様において、本発明は上で説明した少なくとも１つのベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００１６】
本発明は食器の洗浄方法も提供する。該方法は、上で定義される少なくとも１つの修飾されたスブチリシンと食器とを提供する工程、並びに食器の洗浄に効果的な条件下で、食器を修飾されたスブチリシンに接触せる工程とを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１Ａ】はＰＢ９２プロテアーゼ遺伝子を含む変異誘発ベクターの構築を説明する。
【００１８】
【図１Ｂ】は本発明の幾つかの態様における変異誘発手順を示す。
【００１９】
【図１Ｃ】はＰＢ９２プロテアーゼ遺伝子を含む発現ベクターの構築を説明する。
【００２０】
【図２Ａ】はＰＢ９２プロテアーゼ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１）及びコードされたタンパク質、プロタンパク質、及び成熟タンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【００２１】
【図２Ｂ】はＰＢ９２プロテアーゼ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１）及びコードされたタンパク質、プロタンパク質、及び成熟タンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明は、食器洗浄用製品のための少なくとも１つの変異プロテアーゼを含む方法及び組成物を提供する。
【００２３】
特に定義しない限り、本発明の実施は、分子生物学、微生物学、タンパク質精製、タンパク質エンジニアリング、タンパク質及びＤＮＡ配列決定、組換えＤＮＡ分野、工業的な酵素の使用及び開発の分野において、当業者の知識の範囲内である技術を用いて行う。本明細書に記載されている全ての特許、特許出願、文献、及び刊行物は参照により本明細書に援用される。
【００２４】
更に、ここに記載されている標題は本発明を限定するために用いるものではない。本発明は明細書全体を参照することにより理解されなければならない。従って、以下で説明する各種用語の定義は、明細書全体を参照することによりより深く理解される。しかしながら、発明の理解を促進するために以下で多くの用語を説明する。
【００２５】
別途定義しない限り、本明細書で用いる化学的及び技術的用語は本発明の属する技術分野における当業者により通常理解されているものと同じ意味を有する。例えば、Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ ａｎｄ Ｓａｉｎｓｂｕｒｙ, Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ, ２ｄ Ｅｄ., Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ, ＮＹ (１９９４)；及びＨａｌｅ ａｎｄ Ｍａｒｋｈａｍ, ＴＨＥ Ｈａｒｐｅｒ Ｃｏｌｌｉｎｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ, Ｈａｒｐｅｒ Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ, ＮＹ (１９９１)は本発明で用いる数多くの用語についての辞書であり、当業者はこれを参照することができる。本明細書で定義する方法及び材料と類似の又はこれらに等しいものを本発明の実施にもちいることができるけれども、好適な方法及び材料を本明細書で説明する。従って、以下で定義されている用語は明細書全体を参照することによりより深く理解されるであろう。本明細書において、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」の単数について用いる冠詞は、別途定義しない限り、複数も含む。別途定義しない限り、核酸は左から右に向かって、５’末端から３’末端を表し、アミノ酸配列は、左から右に向かって、アミノ末端からカルボキシ末端方向に標記する。当業者が本発明の実施に用いるものにより、本明細書で説明する方法、手順、試薬は変化し得るので、本発明に用いるこれらのものを、開示されている特定のものに限定されることがないことは理解されるであろう。
【００２６】
本明細書に記載の全ての数値の上限値は全てのより低い数値の限定を含み、そのような低い数値限定は本明細書に記載されているものとする。本明細書における各最小の数値限定はより高い数値限定を含み、そのようなより高い数値限定は本明細書に記載されているものとする。本明細書に記載の全ての数値範囲はその範囲内のより低い数値範囲を含み、そのようなより狭い数値範囲は本明細書に記載されるものとする。
【００２７】
本明細書において、「相性のよい」の語は洗浄組成物が、本明細書で提供されるプロテアーゼ酵素の酵素活性を、通常の使用条件の間に効果的ではなくなるほどに低減させないことを意味する。特定の洗浄組成物物質は以下で詳述する。
【００２８】
本明細書において、「効果的な量の酵素」の語は特定の製品において必要とされる酵素活性を達成するために必要とされる酵素の量を意味する。そのような効果的な量は当業者が容易に決定することができ、用いる特定の酵素変異体、洗浄用製品、洗浄組成物の特定の成分、及び組成物生物が液状か又は乾燥物（例えば、顆粒）が必要であるか否か等の多くの因子に基づいている。
【００２９】
本明細書において、「変異タンパク質分解酵素」についても用いる「改善された性質を有する」の語は、改善された性能及び／又は野生型プロテアーゼの対応してその性能を維持しつつ改善された安定性を有するタンパク質分解酵素を意味する。幾つかの特に好適な態様において、この改善された性質は改善された食器洗浄能力と改善された安定性の組合せのほか、改善された食器洗浄能力と改善された安定性ならなる群より選択される。
【００３０】
本明細書において、「洗剤安定性」の語は洗浄組成物の安定性を意味する、幾つかの態様において、この安定性は洗剤の使用の間に評価される。他の態様において、この語は貯蔵の間の洗浄組成物の安定性を意味する。
【００３１】
「改善された安定性」の語は、貯蔵の間及び／又は泡の中における変異プロテアーゼのよりよい安定性を意味する。好適な態様において、この変異体プロテアーゼは、食器用洗剤の貯蔵の間及び／又は泡の中において、改善された食器用洗剤中の安定性を有しており、対応する野生型酵素に対して、酸化安定剤、金属イオン封鎖剤、自己消化、界面活性剤、及び高いアルカリ性に対する安定性を有している。
【００３２】
本明細書において、「タンパク質分解に対する安定性」の語は、タンパク質分解に抵抗するタンパク質（例えば、酵素）の能力を意味する。この語をタンパク質安定性を評価する特定のプロテアーゼの使用に限定することを意図するものではない。
【００３３】
本明細書において「酸化安定性」の語は酸化条件下で機能のするタンパク質の脳路y区を意味する。特に、この語は、Ｈ２Ｏ２、過酸、及び他の酸化物の各種濃度の下で機能するタンパク質の能力を意味する。各種酸化条件下での安定性は当業者に既知の方法により、及び／又は本明細書で説明する方法により評価することができる。酸化安定性が大きく変化したということは、酸化化合物が存在しないときの酵素活性と比較してその酵素活性の半減期が少なくとも５％以上増加したか、又は減少したかにより明らかとなる。
【００３４】
本明細書において「ｐＨ安定性」の語は、特定のｐＨで機能することができるタンパク質の能力を意味する。通常、大部分の酵素は、それらが機能する明確なｐＨ範囲を有する。中性範囲のｐＨ（即ち、ｐＨ７付近）で機能する酵素に加えて、非常に高い又は非常に低いｐＨ条件下で作用することができる酵素もある。各種ｐＨ条件下での安定性は当業者に既知の方法及び／又は本明細書で説明する方法で評価することができる。ｐＨ安定性が大きく変化したということは、最適ｐＨで酵素活性と比較した場合、酵素活性の半減期が少なくとも５％以上増加又は減少（大部分の態様において、増加することが好ましい）していることにより裏付けられる。しかしながら、本発明を特定のｐＨ安定性レベル又はｐＨ範囲に限定することは意図しない。
【００３５】
本明細書において、「熱安定性」の語は特定の温度で機能するタンパク質の能力を意味する。通常、大部分の酵素はそれらが機能する温度の限界配位を有している。中程度の温度（例えば、室温）で機能する酵素のほかに、非常に高い又は低い温度で機能することができる酵素も存在する。熱安定性は当業者に既知の方法及び本明細書で説明する方法で評価することができる。熱安定性が相当変化したということは所与の温度に曝された変異体の酵素活性の半減期が少なくとも５％以上増加又は減少（大部分の態様において、増加することが好ましい）しているこことにより裏付けられる。しかしながら、本発明を特定の熱安定性レベル、又は特定の温度範囲に限定することは意図しない。
【００３６】
本明細書において、「化学安定性」の語はタンパク質の活性に有害な化学薬品に対するタンパク質（例えば、酵素）の能力を意味する。幾つかの態様において、そのような化学薬品は過酸化水素、過酸、アニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤、非イオン性界面活性剤、キレート剤等を含むがこれらに限定されない。しかしながら、本発明を特定の化学薬品安定性又は特定の安定性の範囲に限定することは意図しない。
【００３７】
本明細書において、「精製された又は単離された」の語はサンプルから不純物を除去することを意味する。例えば、所望の酵素は、他の不純物タンパク質及び溶液又は調製物の中から所望の酵素ではない、他の成分を除去することにより精製される。幾つかの態様において、所望の組換え酵素がバクテリア又は糸状菌宿主細胞内で発現され、これらの所望の組換え酵素は他の宿主細胞の成分を除去して精製される。所望の組換え酵素のパーセンテージはこのサンプル中で増加する。
【００３８】
本明細書において、「所望のタンパク質」の語は、解析、同定、及び／又は修飾されるタンパク質（例えば、酵素又は所望の酵素）を意味する。組換え（例えば、変異）タンパク質のほか自然発生タンパク質も本発明に用いることができる。
【００３９】
本明細書において「タンパク質」の語はアミノ酸からなる任意の組成物及びタンパク質であると当業者に理解されているものを含む。「タンパク質」、「ペプチド」、及び「ポリペプチド」の語は互換的に使用される。ペプチドがタンパク質の一部分である場合、当業者はこのことを文脈上より理解することができる。
【００４０】
本明細書において、機能的に及び構造的に類似のタンパク質は「関連タンパク質」であると理解されている。幾つかの態様において、これらのタンパク質は異なる遺伝子及び／又は異なる有機体のクラスを含む属由来である（例えば、バクテリアタンパク質及び／又は糸状菌タンパク質）。追加的な態様において、関連タンパク質は同じ属から提供される。すなわち、本発明を任意の特定の源に限定することは意図しない。更に、「関連タンパク質」の語は三次構想の類似体及び一次配列の類似体（例えば、本発明の酵素）を含む。更なる態様において、この語は免疫化学的交差反応を起こすタンパク質も包含する。
【００４１】
本明細書において「誘導体」の語は幾つかの態様において、Ｃ末端及びＮ末端のいずれか又は両方に１つ以上のアミノ酸を付加すること、アミノ酸配列中の１つ以上の異なる部位に１つ以上のアミノ酸で置換すること、タンパク質の両方又は一方の末端、あるいはアミノ酸配列中の１つ以上の部位での１つ以上のアミノ酸を欠失させること、アミノ酸配列中の１つ以上の部位で１つ以上のアミノ酸を挿入すること、により生成されたタンパク質を意味する。タンパク質誘導体は天然タンパク質をコードするＤＮＡ配列の修飾、ＤＮＡ配列を好適な宿主内で形質転換、及び修飾ＤＮＡ配列を発現させて、変異タンパク質を形成する。
【００４２】
関連する（及び誘導体）タンパク質は「変異タンパク質」を含む。幾つかの好適な態様において、変異タンパク質は親タンパク質とは異なる。これらのうちの一方は、アミノ酸残基が少ない。異なるアミノ酸残基の数は１つ以上であり、好ましくは、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０又は、これより多くのアミノ酸残基が異なる。幾つかの好適な態様において、変異体の間で異なるアミノ酸の数は１乃至１０の間である。幾つかの好適な態様において、関連タンパク質及び特に変異タンパク質は少なくとも約３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％のアミノ酸配列相同性を有している。更に、本明細書で用いる関連タンパク質又は変異タンパク質はプロミネント領域に数において、他の関連タンパク質又は親タンパク質とは異なる。例えば、幾つかの態様において、変異体タンパク質は親タンパク質と異なる１、２、３、４、５、又は１０の対応するプロミネント領域を有する。
【００４３】
本発明の変異体を生成するために好適である、各種組換え方法のほか、部位飽和変異誘発、スキャニング変異誘発、挿入変異誘発、ランダム変異誘発、部位指定変異誘発、及び指定進化を含むがこれらに限定されない幾つかの方法が当業者に知られている。
【００４４】
本明細書において、「発現ベクター」の語は好適な宿主細胞において、ＤＮＡの発現を影響させることができる好適な制御配列に作動可能に結合しているＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物を意味する。そのような制御配列は、転写に影響を及ぼすプロモーター、そのような転写を制御する任意のオペレーター配列、転写及び翻訳の停止を制御する好適なｍＲＮＡリボゾーム結合部位及び配列をコードする配列を含む。このベクターは、プラスミド、ファージ粒子、又は単に可能性のある遺伝子挿入でもよい。一旦好適な宿主細胞に形質転換されると、ベクターは複製して、独立的に宿主細胞ゲノムの機能を果たす、又は幾つかのケースにおいて、ゲノム自信に取り込まれる。このプラスミドが現在最も一般的なベクターの形態であることから、本明細書において、「プラスミド」、「発現プラスミド」、及び「ベクター」の語は同じ意味に用いる。しかしながら、当業者において、等しい機能を提供する、及び等しい機能である、又は等しい機能となりうる他の発現ベクターの形態も含むことを意図する。
【００４５】
幾つかの好適な態様において、プロテアーゼ遺伝子は適切な発現プラスミドに結合される。クローン化されたプロテアーゼ遺伝子を融合し、宿主細胞を形質転換又は形質変換して、プロテアーゼ遺伝子を発現させる。このプラスミドは、プラスミドの複製に必要なよく知られた要素を含でいるか、又はこのプラスミドは宿主染色体に取り込まれるように設計されているので、宿主細胞内で複製することができる。必要なエレメントは効率的な遺伝子発現（例えば、所望の遺伝子に作動可能に結合しているプロモーター）のために提供される。幾つかの態様において、これらの必要なエレメントは、認識されるならば（すなわち、宿主細胞による転写）遺伝子自身の相同プロモーターとして、及び外来性転写ターミネーターとして供給されるか、あるいはプロテアーゼ遺伝子の内因性転写領域により供給される。幾つかの態様において、抗生物質含有培地中での育成によるプラスミド感染宿主細胞の連続的な培養を維持することができる抗生物質耐性遺伝子等の遺伝子選択も含む。
【００４６】
幾つかの態様において、他の方法も用いることができるが、以下で説明するカセット変異誘発方法は、本発明のプロテアーゼ変異体を構築するのに用いられる。
【００４７】
第一に、タンパク質をコードしている自然発生遺伝子を入手し、全体あるいは一部の配列を決定する。それから、コードされているタンパク質中に1以上のアミノ酸の変異（欠失、挿入または置換）を作成するために適した場所をスキャンする。この場所にフランキングしている配列は、発現したときに各種変異体をコードするオリゴヌクレオチドプールを用いて、遺伝子短断片を置換するための制限部位があるかどうか評価される。そのような制限部位は、好ましくは、遺伝子セグメントの置換を促進するためのタンパク遺伝子内の特徴的な部位である。しかしながら、アミラーゼ遺伝子中にあまり多く存在しない任意の制限部位を用いることもできる。制限消化によって、生成する遺伝子断片は、所望の配列中で再構築することもできる。もし、制限部位が、選択されたポイントから便利な距離（10から15ヌクレオチド）に存在しないときは、最終的な構築物中のリーディングフレームまたはアミノ酸のいずれも変化させずに、遺伝子中の核酸配列のヌクレオチドの置換によって、そのような部位を生成することができる。対象とする配列を確認するために、その配列を変化させるための遺伝子の変異は、既知の方法であるM13プライマーを伸長させることによって行うことができる。適切なフランキング領域の位置決め、及び、2の簡便な制限部位配列で必要な変異を発現させるための評価の作業は、遺伝子コードの余剰量（ｒｅｄｕｎｄａｎｃｙ）、遺伝子の制限酵素マップ、及び、多くの異なる制限酵素を用いた、ルーチン作業で行うことができる。もし、簡便な制限フランキング部位が使用可能であるならば、上記方法は、サイトを含まないフランキング領域の結合にのみ用いる。
【００４８】
一旦自然発生ＤＮＡ又は、合成ＤＮＡがクローン化されると、変異位置に隣接している制限部位が同じ起源の制限酵素を用いて消化され、エンド末端に相補的なオリゴヌクレオチドの複数のカセットが、遺伝子の中に結合される。変異誘発はこの方法によって簡素化される、なぜならば、オリゴヌクレオチドの全ては、同じ制限部位を有するように合成することができ、該制限部位をつくるための合成リンカーが必要ないからである。
【００４９】
本明細書で用いている「対応する」とは、タンパク質またはペプチド内に列挙された位置にある各残基、あるいはタンパク質またはペプチド内に列挙された各残基と類似、相同もしくは同等である残基を意味する。
【００５０】
本明細書で用いる「対応する領域」の語は、通常、関連タンパク質又は親タンパク質中の類似する位置を言う。
【００５１】
「コードしている核酸分子」、「コードしている核酸配列」、「コードしているＤＮＡ配列」、及び「コードしているＤＮＡ」の語は、デオキシリボ核酸の鎖に沿ったデオキシリボブクレオチドの配置又は配列を意味する。これらのデオキシリボヌクレオチオドの配置はポリペプチド（タンパク質）に沿ったアミノ酸の配列を決定する。従って、ＤＮＡ配列はアミノ酸配列をコードする。
【００５２】
本明細書で用いる「類似の（アナロガス）配列」は所望のタンパク質と、（すなわち、対象とするタンパク質と同じ起源の）、同じ機能、三次構造及び/又は、保存残基を有するタンパク質内の配列を言う。具体的な好ましい態様において、類似の配列は、エピトープ又はエピトープの近くにある配列を含む。例えば、アルファヘリックス又はベータシート構造を含むエピトープ領域内で、類似配列内で置換されたアミノ酸は、同じ特定の構造を維持していることが好ましい。この語は、アミノ酸配列の他に核酸配列についても用いる。いくつかの態様において、アナログ配列は、置換アミノ酸が、エピトープ又はエピトープに近いところのタンパク質中のアミノ酸と、同じ機能、三次構造及び/又保存される残基を示すように、構築される。従って、例えば、アルファヘリックス又はベータシート構造のようなエピトープ領域を含むところでは、アミノ酸の置換は、特定の構造を維持していることが、好ましい。
【００５３】
本明細書で用いる「相同（ホモログ）タンパク質」とは、所望のタンパク質と同様な作用、構造、抗原性反応/または免疫原性反応を有するタンパク質を意味する。相同タンパク質と対象タンパク質とは、必ずしも進化の上で関係がなくてもよい。従って、この用語は、異なる種から得られる機能的に同じタンパク質（例えば、プロテアーゼ）を含むと考えられる。好ましい実施態様としては、所望のタンパク質内のエピトープを相同タンパク質からの類似のセグメントで置換すれば、変化による混乱を少なくすることができるので、所望のタンパク質と同様な三次および/または一次構造を有する相同タンパク質を用いることが望ましい。幾つかの態様において、ホモロガスタンパク質は所望のタンパク質として、低減された同様の免疫反応を有する。
【００５４】
ここで用いる「相同遺伝子」とは、異なる種由来の、または通常は関連種由来の一組の遺伝子対をいい、それぞれが対応し、それぞれ同一または非常に類似しているものをいう。当該用語は種形成（すなわち、新しい種の進化）により分離した遺伝子（例えばオーソロガス遺伝子）、及び遺伝子重複により分離した遺伝子（例えばパラロガス遺伝子）を包含する。
【００５５】
ここで用いる「オーソログ」及び「オーソロガス遺伝子」とは種形成により共通祖先の遺伝子（すなわち相同遺伝子）から進化した、異なる種の遺伝子をいう。通常、オーソロガスは進化の過程において同じ機能を保持する。新しく配列決定されたゲノムのオーソロガスを同定することで、信頼性の高い遺伝子機能の推測ができる。
【００５６】
ここで用いる「パラログ」及び「パラロガス遺伝子」とはゲノム内で重複していることにより関連した遺伝子をいう。オーソログは進化の過程を通して同じ機能を維持するが、パラログはいくつかの機能は最初の機能に関連するが、それに加えて新しい機能も有している。パラログ遺伝子の例としては、限定されないが、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ及びトロンビンをコードする遺伝子が挙げられ、これらは全てセリンプロテイナーゼであり、同じ種内で一緒に発生する。
【００５７】
本明細書で用いる「野生型」及び「天然の」タンパク質は、自然界において通常見られるタンパク質である。本明細書にて、互換的に用いる、「野生型配列」及び「野生型遺伝子」の語は、宿主細胞内で、天然に、または、自然発生的に生じる配列を言う。いくつかの態様において、野生型配列は、タンパク質工学的手法により利用されるタンパク質の開始点となる所望の配列を言う。この自然発生（すなわち、前駆体）タンパク質をエンコードしている遺伝子は、当該技術分野の当業者に既知の方法に従って得ることができる。この方法は、通常、所望のタンパク質の領域をエンコードする成熟配列を有するラベルプローブの合成、該タンパク質を発現している有機体の遺伝子ライブラリーの作成、及び、対象とする遺伝子に対するライブラリーのスクリーニングを含む。陽性ハイブリダイズクローンはその後、マッピングされ、配列決定される。
【００５８】
本明細書で用いる「組換えＤＮＡ分子」の語は、分子生物学的手法によって、互いに結合されたDNAセグメントを含むＤＮＡ分子を言う。
【００５９】
「組換えオリゴヌクレオチド」の語は、ポリヌクレオチド配列の制限酵素消化により生成された２つ以上のオリゴヌクレオチドのリゲーション、オリゴヌクレオチドの合成（例えば、プライマー又はオリゴヌクレオチドの合成）等を含むがこれらに限定されない分子生物学的手法を用いて生成されたオリゴヌクレオチドを意味する。
【００６０】
配列間の相同性の程度は、本発明の技術分野で知られている適切な方法で決定することができる（Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ, Ａｄｖ. Ａｐｐｌ. Ｍａｔｈ.,２：４８２[１９８１]； Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ, Ｊ. Ｍｏｌ.Ｂｉｏｌ., ４８： ４４３[１９７０]； Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ, Ｐｒｏｃ. Ｎａｔｌ. Ａｃａｄ. Ｓｃｉ. ＵＳＡ ８５：２４４４ [１９８８]；Ｔｈｅ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ (Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ, Ｍａｄｉｓｏｎ, ＷＩ)のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ等のプログラム；及びＤｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ. Ａｃｉｄ Ｒｅｓ., １２：３８７−３９５ [１９８４]参照のこと）。
【００６１】
例えば、ＰＩＬＥＵＰは、配列のホモロジーのレベルを決定するのに有用なプログラムである。ＰＩＬＥＵＰは、累進的で対合的な配列法を用いて関係する配列の群から多重配列アラインメントを作り出す。アラインメントを作るための関係性の集積を示す系統樹（ｔｒｅｅ）もプロットすることができる。ＰＩＬＥＵＰは、Ｆｅｎｇ及びＤｏｏｌｉｔｔｌｅの累進的アラインメント方法を簡素化したものである（Ｆｅｎｇ ａｎｄ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ, Ｊ. Ｍｏｌ. Ｅｖｏｌ., ３５： ３５１−３６０ [１９８７]）。この方法は、Ｈｉｇｇｉｎｓ及びＳｈａｒｐによって述べられた方法と同じである（Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ, ＣＡＢＩＯＳ ５： １５１−１５３ [１９８９]）。有用なＰＩＬＥＵＰパラメーターは、３．００のデフォルトギャップウエイト、０．１０のデフォルトギャップレングス、及び、ウエイトエンドギャップを含んでいる。他の有用なアルゴリズムの例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌらによって述べられたブラストアルゴリズムである（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ. Ｍｏｌ.Ｂｉｏｌ., ２１５： ４０３−４１０, [１９９０]； 及びＫａｒｌｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０： ５８７３−５７８７ ［１９９３］）。ある具体的なＢＬＡＳＴプログラムは、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２プログラムである（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２６６ ： ４６０−４８０ ［１９９６］参照のこと）。「Ｗ」、「Ｔ」及び「Ｘ」のパラメーターは、アラインメントの速度及び感度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムは、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）１１、ＢＬＯＳＵＭ６２得点マトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ、Ｐｒｏｃ. Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，８９：ｐ１０９１５（１９８９）参照）アラインメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ’５、Ｎ’−４、および両ストランドの比較を用いる。
【００６２】
本明細書で用いる「ヌクレオチド配列の相同性の割合（％）」は、候補配列中にある、配列のヌクレオチド配列と同一であるヌクレオチド残基の割合として定義される。
【００６３】
本明細書で用いる、「ハイブリダイゼーション」の語は、本発明の技術分野で知られているように、塩基のペアリングを通じて、核酸のストランドに相補的なストランドが結合するプロセスであると定義される。
【００６４】
本明細書で用いる「ハイブリダイゼーション条件」の語は、ハイブリダイゼーションが行われる条件を言う。これらのコンディションは、ハイブリダイゼーションが測定される条件下の「ストリンジェンシー」の程度によって通常分類される。ストリンジェンシーの程度は例えば、複合体またはプローブに結合する核酸の融解温度（Ｔｍ）を基準とする。ハイブリダイゼーション条件は核酸結合複合体またはプローブの融点（Ｔｍ）に基づく。例えば、「最大ストリンジェンシー」は通常約Ｔｍ−５℃（プローブのＴｍより５℃低い）で起こり、「高ストリンジェンシー」はＴｍより約５〜１０℃低く；「中間ストリンジェンシー」はプローブのＴｍより約１０〜２０℃低く；及び「低ストリンジェンシー」はＴｍより約２０〜２５℃低い。例えば、６ＸＳＳＣ＝とても低いストリンジェンシー；３ＸＳＳＣ＝低〜中ストリンジェンシー；及び０.５ｘＳＳＣ＝高ストリンジェンシーである。機能上、最大ストリンジェンシー条件はハイブリダイゼーションプローブと厳密な同一性または実質的に厳密な同一性を有する配列を同定するために用いることができ、一方、中間または低ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、プローブと約８０％以上の配列同一性を有する核酸配列を同定するために用いることができる。
【００６５】
高度の選択性を必要とする用途に対しては、通常、ハイブリッド形成に比較的高ストリンジェンシー条件が用いられる（例えば、比較的低い塩および／または高温の条件が用いられる）。
【００６６】
少なくとも２の核酸分子またはペプチドについての文脈中における、「実質的に似ている」及び「実質的に同一な」の語は、参照される配列（すなわち野生型配列）と比較して、少なくとも６０％の同一性、好ましくは、少なくとも７５％の同一性、より好ましくは少なくとも８０％の同一性、更に、より好ましくは、少なくとも９０％の同一性、更により好ましくは少なくとも９５％の同一性、より好ましくは９７％の同一性、時には、９８％及び９９％の同一性を有する配列を含む。配列同等性は、標準パラメーターを使用した、BLAST、ALIGEN及びCLUSTAL等の既知のプログラムを用いて決定される（Ａｌｔｓｃｈｕｌｅｔ ａｌ., Ｊ. Ｍｏｌ.Ｂｉｏｌ. ２１５: ４０３-４１０ ［１９９０］； Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ｅｔａｌ., Ｐｒｏｃ. Ｎａｔｌ. Ａｃａｄ Ｓｃｉ. ＵＳＡ ８９: １０９１５ ［１９８９］； Ｋａｒｉｎ ｅｔａＬ, Ｐｒｏｃ. Ｎａｔｌ Ａｃａｄ. Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０: ５８７３ ［１９９３］； 及び Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｔａｌ., Ｇｅｎｅ ７３: ２３７-２４４ ［１９８８］参照のこと）。ＢＬＡＳＴ解析を行うソフトウエアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを通じて利用可能である。また、データベースもＦＡＳＴＡを用いてサーチされる（Ｐｅａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ., Ｐｒｏｃ.Ｎａｔｌ. Ａｃａｄ. Ｓｃｉ. ＵＳＡ ８５: ２４４４-２４４８ ［１９８８］）。２つのポリペプチドが実質的に同一であるという、ある示唆は、第一のポリペプチドが、免疫学的に第二のポリペプチドと交差反応性であるということと等しい。ペプチド内の置換されているアミノ酸が保存されているアミノ酸である場合、このペプチドは、免疫学的に交差反応性でもある。この場合、一のポリペプチドは実質的に第二のポリペプチドと同一である。例えば、二のペプチドが保存的な置換においてのみしか異ならない場合である。二のポリペプチドが実質的に同一であるという他の教示は、二の分子がお互いに、ストリンジェンシーなコンディション（例えば、高ストリンジェンシーな培地の幅ないで）でハイブリダイスするということである。
【００６７】
本明細書で用いる「等しい残基」の語は、特定のアミノ酸残基を共有するタンパク質を言う。例えば、等しい残基は、Ｘ線結晶化学によって同定される三次構造を有するあるタンパク質（例えばＩＮＦ−β）の三次構造のホモロジーレベルを検出することによって同定される。等しい残基は、前駆体タンパク質の特定のアミノ酸残基の２個以上の主鎖原子の原子座標（Ｎ対Ｎ、ＣＡ対ＣＡ、Ｃ対ＣおよびＯ対Ｏ）が位置合わせ後に０．１３ｎｍ、好ましくは０．１ｎｍ以内であるものと定義される。位置合わせは、対象とする非水素タンパク質原子の原子座標について最大の重複を生じるように最良のモデルが配向、配置された後に達成される。この最良のモデルは、結晶学及びタンパク質の特徴付け/解析の分野において当業者に知られている方法を用いて検出され、利用できる最高の解像度において回折実験データの最低のＲファクターが得られる結晶学的なモデルである。
【００６８】
本明細書で用いる「調節エレメント」の語は、核酸配列の発現のいくつかの側面を調節する遺伝的エレメントを言う。例えば、プロモーターは、作動可能に結合しているコード領域の転写の開始を促進する調節エレメントである。更なる調節エレメントは、スプライシングシグナル、ポリアデニレーションシグナル及びターミネーションシグナルを含む。
【００６９】
本発明で用いる「宿主細胞」の語は、発現ベクター又は所望の遺伝子を含む原核又は真核宿主細胞である。宿主細胞は組換えＤＮＡ技術を用いて構築されたベクターで形質転換、又は、トランスフェクションされる。そのような形質転換された宿主細胞はタンパク質変異体をコードする複製ベクター又は所望のタンパク質を発現する複製ベクターのいずれかである。このような変異タンパク質のプレ-又はプレプロ−型をエンコードするベクターの場合、発現したときに宿主細胞培地の中で選択される。
【００７０】
目的の核酸配列を細胞内へ挿入するという文脈上用いられる「導入する」の語は、形質転換、形質導入、又は、形質感染の意味を有する。形質転換の意味は、プロトプラスト形質転換、塩化カルシウム沈降法、電気穿孔法、及び本技術分野で既知の方法を含む（Ｃｈａｎｇ ａｎｄ Ｃｏｈｅｎ （１９７９） Ｍｏｌ. Ｇｅｎ. Ｇｅｎｅｔ. １６８: １１１-１１５； Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ., （１９８６） Ａｐｐｌ. ａｎｄ Ｅｎｖ. Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ. ５１: ６３４；及びｔｈｅ ｒｅｖｉｅｗ ａｒｔｉｃｌｅ ｂｙ Ｆｅｒｒａｒｉｅｔ ａｌ., （１９８９） Ｇｅｎｅｔｉｃｓ, ｐａｇｅｓ ５７-７２ ｉｎ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｅｄ. Ｃ. Ｈａｒｗｏｏｄ, Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ参照のこと）。
【００７１】
「プロモーター／エンハンサー」とは、プロモーターとエンハンサーの両方の機能を提供することができる配列を含むＤＮＡセグメントを言う（例えば、レトロウイルスの長い末端反復配列はプロモーターとエンハンサーの機能を含んでいる）。エンハンサー／プロモーターは、「内性」または、「外因性」あるいは、「非相同」である。内性エンハンサー／プロモーターは、染色体内で与えられた遺伝子と自然に結合している。外因性（非相同の）エンハンサー／プロモーターは、遺伝子操作の手段（すなわち、分子生物学的技術）によって、遺伝子に並列配置されたものである。
【００７２】
発現ベクター上の「スプライシングシグナル」の存在は、組み替えられた転写の発現のレベルを高める。スプライシングシグナルは、一次RNA転写からイントロンの除去を仲介するものであり、スプライスドナー及びアクセプター部位を含む（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ［１９８９］, ｐｐ．１６．７−１６．８）。通常用いられるスプライスドナー及びアクセプター部位はSV40の16SRNA由来のスプライスジャンクションである。
【００７３】
「安定な形質感染」又は「安定な形質導入」の語は、形質転換させる細胞の遺伝子に、外来ＤＮＡを導入し、組み込むことを言う。「安定した形質感染体」の語は、形質転換される細胞の染色体内へ、安定して組み込まれた外来あるいは外因性のＤＮＡを有する細胞を言う。
【００７４】
本明細書で用いる「選択マーカー」または、「選択遺伝子プロダクト」の語は、選択マーカーが発現されたところで、細胞の抗生物質または薬物体制を確定する酵素活性をエンコードしている遺伝子の使用を言う。
【００７５】
「増幅」はテンプレート特異性に関する核酸複製の特殊なケースである。これは非特異性テンプレート複製（すなわち、テンプレート依存性であるが特定テンプレートに依存しない複製）と対比される。テンプレート特異性は複製の正確さ（すなわち、適正なポリヌクレオチド配列の合成）及びヌクレオチド（リボ−またはデオキシリボ−）特異性とはここでは区別される。テンプレート特異性は「標的」配列に対する特異性に関して説明されることが多い。標的配列は、それらがその他の核酸から選別するために探されるという意味において「標的」である。増幅技術はこの選別を第一に考えて発達してきた。
【００７６】
「増幅」はテンプレート特異性に関する核酸複製の特殊なケースである。これは非特異性テンプレート複製（すなわち、テンプレート依存性であるが特定テンプレートに依存しない複製）と対比される。テンプレート特異性は複製の忠実度（すなわち、適正なポリヌクレオチド配列の合成）及びヌクレオチド（リボ−またはデオキシリボ−）特異性とはここでは区別される。テンプレート特異性は「標的「特異性に関して説明されることが多い。標的配列は、それらがその他の核酸から選別するために探されるという意味において「標的」である。増幅技術はこの選別を第一に考えて設計されてきた。
【００７７】
ここで用いる「共増幅」の語は、その他の遺伝子配列が一緒に導入される増幅マーカーの１の細胞内への導入（すなわち、発現ベクター内に含まれる遺伝子のような１以上の非選択遺伝子を含む）及び細胞が増幅マーカーとその他の非選択遺伝子配列の両方を増幅するような適当な選択圧の増幅をいう。増幅マーカーはその他の遺伝子配列に物理的に結合していてもよく、またはＤＮＡが２つの別個の断片、すなわち一方が増幅マーカーを含み、及びもう一方が非選択マーカーを含むものが同じ細胞内に導入されてもよい。
【００７８】
ここで用いる、「増幅マーカー」、「増幅遺伝子」及び「増幅ベクター」の語は適当な増殖条件下で遺伝子の増幅を可能にする遺伝子をエンコードする遺伝子またはベクターをいう。
【００７９】
本明細書で用いる「増幅可能な核酸」の語は、任意の増幅方法で増幅された核酸を言う。「増幅可能な核酸」は通常「サンプルテンプレート」を含む。
【００８０】
本明細書で用いる「サンプルテンプレート」の語は、「標的」（下記に定義）の存在について分析されるサンプルから生じる核酸をいう。一方、「バックグラウンドテンプレート」はサンプルテンプレート以外の核酸に関して用いられ、サンプル内に存在していてもいなくてもよい。バックグラウンドテンプレートはほとんどの場合、不慮もものである。前駆体からの影響を受けているか、または、サンプルから精製すべき核酸汚染物質の存在によるものである。例えば、検出すべき微生物以外の生物由来の核酸は試験サンプル内でバックグラウンドとして存在し得る。
【００８１】
「テンプレート特異性」はほとんどの増幅技術において酵素の選択により達成される。増幅酵素は使用される条件下において、核酸の外来混合物において核酸の特定配列のみ処理する酵素である。例えば、Ｑβレプリカーゼの場合、ＭＤＶ−１ ＲＮＡはレプリカーゼの特異テンプレートである（例えば、Ｋａｃｉａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ６９：３０３８［１９７２］を参照）。その他の核酸はこの増幅酵素によっては複製されない。同様に、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼの場合、この増幅酵素はそれ自身のプロモーターにストリンジェントな特異性を有する（Ｃｈａｍｂｅｒｌｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ２２８：２２７[１９７０]を参照）。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼの場合、当該酵素は2つのオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを連結せず、ここで連結接合部分にオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド基質とテンプレート間の不整合が存在する（Ｗｕ ａｎｄ Ｗａｌｌａｃｅ， Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４：５６０［１９８９］を参照）。最後に、Ｔａｑ及びＰｆｕポリメラーゼは、高温で機能する能力を有するため、配列結合の高い特異性を示し、従って、プライマーにより確定され、高温が標的配列とのプライマーハイブリダイゼーションに有利に働き、非標的配列とのハイブリダイゼーションには有利でない熱力学的条件を生じる。
【００８２】
本明細書で用いる、「プライマー」の語は、精製制限消化などにおいて自然に生じるまたは合成的に生成されるオリゴヌクレオチドをいい、核酸鎖に相補的なプライマー伸長生成物の合成が導入される条件下に置かれた場合（すなわち、ヌクレオチド及びＤＮＡポリメラーゼなどの誘発剤の存在下、及び適した温度及びpHで）、合成開始点として作用するものを言う。当該プライマーは好ましくは増幅効率を最大にする1本鎖であるが、２本鎖であってもよい。２本鎖の場合、プライマーは伸長生成物の準備のために用いる前にそのストランドを分離処理する。好ましくは、プライマーはオリゴデオキシリボヌクレオチドである。プライマーは誘発剤の存在下、伸長生成物の合成開始のため十分に長くなければならない。プライマーの正確な長さは、誘発温度、プライマーの供給源及び使用する方法など多くの因子に左右される。
【００８３】
本明細書で用いる「プローブ」の語は、精製制限消化などにおいて自然に生じる、または合成、組換えまたはPCR増幅により生成されるオリゴヌクレオチド（すなわちヌクレオチド配列）をいい、別の目的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズできるものである。プローブは1本鎖または２本鎖である。プローブは特定遺伝子配列の検出、同定及び単離に有用である。本発明で使用されるいかなるプローブも任意の「リポーター分子」で標識するので、任意の検出システムにおいて検出可能であり、限定されないが、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡ及び酵素ベースの組織化学的分析）、蛍光、放射性及び発光性システムなどがある。本発明はいかなる特定の検出システムまたは標識にも限定されない。
【００８４】
本明細書で用いる「標的」の語はポリメラーゼ連鎖反応に関して用いる場合、ポリメラーゼ連鎖反応に用いるプライマーが結合する核酸領域をいう。従って、「標的」は他の核酸配列から選別された所定の核酸を言う。「断片」は標的配列内の核酸領域として定義される。
【００８５】
本明細書で用いる「ポリメラーゼ連鎖反応」（「ＰＣＲ」）の語はここに引用する米国特許Ｎｏｓ．４，６８３，１９、４，６８３，２０２、及び４，９６５，１８８の方法を言い、クローニングまたは精製することなくゲノムＤＮＡの混合物における標的配列の断片濃度を増加させる方法を含む。標的配列を増幅するこの方法は、対象とする標的配列を含むＤＮＡ混合物に過剰量の２つのオリゴヌクレオチドプライマーを導入し、ＤＮＡポリメラーゼの存在下、サーモサイクルの正確な配列を行うことからなる。２つのプライマーは２本鎖標的配列のそれぞれの鎖に相補的である。増幅をもたらすために、混合物を変性させ、それからプライマーを標的分子内のそれらの相補配列にアニールする。アニーリングに続いて、プライマーは新しい相補鎖ペアを形成するためにポリメラーゼを用いて伸長する。変性、プライマーアニーリング及びポリメラーゼ伸長工程は何回も繰り返すことができ（すなわち変性、アニーリング、及び伸長は１「サイクル」を構成し、多数の「サイクル」を行うことができる）、対象とする標的配列の増幅断片を高濃度で得ることができる。対象とする標的配列の増幅断片の長さはお互いのプライマーの相対位置により決定され、従って、この長さは制御可能なパラメーターである。当該プロセスの繰返し側面のため、当該方法は「ポリメラーゼ連鎖反応」（以下「ＰＣＲ」とする）と呼ばれる。標的配列の対象とする増幅断片は混合物中で主要な配列（濃度に関して）となるので、それらは「ＰＣＲ増幅された」という。
【００８６】
本明細書で用いる「増幅試薬」の語は、プライマー、核酸テンプレート及び増幅酵素以外の増幅に必要な試薬をいう（デオキシリボヌクレオチド３リン酸、バッファー等）。通常、増幅試薬はその他の反応成分と一緒に反応容器（試験管、マイクロウェル等）内に加えて含まれる。
【００８７】
ＰＣＲを用いて、ゲノムＤＮＡ中の特異標的配列の１のコピーをいくつかの異なる方法で検出可能なレベルまで増幅することが可能である（例えば、標識プローブを用いるハイブリダイゼーション；ビオチン化プライマーの混合、続いてアビジン−酵素結合検出；ｄＣＴＰまたはｄＡＴＰなどの３２Ｐ標識デオキシヌクレオチド３リン酸の増幅断片への混合）。ゲノムＤＮＡに加えて、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列が適当なプライマー分子のセットを用いて増幅できる。特に、ＰＣＲプロセスにより作成された増幅断片はそれ自身、続くＰＣＲ増幅の効率的なテンプレートである。
【００８８】
本明細書で用いる「ＰＣＲ生成物」「ＰＣＲ断片」及び「増幅生成物」の語は変性、アニーリング及び伸長が完結する２以上のサイクルのＰＣＲ工程後の化合物の最終混合物をいう。これらの語は１以上の標的配列の１以上の断片の増幅が行われる場合を含む。
【００８９】
本明細書で用いる「制限エンドヌクレアーゼ」及び「制限酵素」の語はそれぞれ特定ヌクレオチド配列で、またはその近くで２本鎖ＤＮＡを切断する、細菌性酵素をいう。
【００９０】
本明細書で用いる「表面性質」の語はタンパク質の表面に提示される親水性及び／又は疎水性等の性質の他、電荷についても意味する。
【００９１】
本明細書において、「洗浄組成物」及び「洗剤」の語は、固形物質の洗浄のために洗浄媒体に用いることを意図した混合物を意味する。好適な板用において、この語は、食器、カトラリー等（例えば、食器用洗剤）の洗浄に用いる洗剤を意味する。本発明を任意の特定の洗剤製剤又は組成物に限定することは意図しない。すなわち、本発明の少なくとも１つの酵素を含む洗剤をも意味し、この語は、界面活性剤、移動剤、加水分解酵素、酸化還元剤、抑制剤、マスキング剤、酵素活性剤、抗酸化剤、及び可溶化剤を含むものをも包含する。
【００９２】
本明細書において、「洗浄組成物」の語は顆粒及び液体形態を含むがこれらに限定されない、食器を洗浄するための全ての形態の組成物を意味する。本発明を特定の食器用洗浄組成物に限定することを意図しない。即ち、本発明はセラミック、プラスチック、金属、トチャイナ、ガラス、アクリル等を含むがこれらに限定されない任意物質からできた、食器（例えば、皿、カップ、グラス、ボウル等を含むがこれらに限定されない食器）及びカトラリー（スプーン、ナイフ、フォーク、サービング用具等を含むがこれらに限定されない道具）の洗浄に用いることができる。「食器」の語は本明細書において食器及びカトラリーの両方を含む。
【００９３】
本明細書において、変異体の「洗浄性能」の語は変異体プロテアーゼ洗浄組成物に添加した場合と比較して、変異体プロテアーゼを添加した洗剤が提供する追加的な洗浄性能の寄与を意味する。洗浄性能は関連する洗浄条件下で比較される。
【００９４】
「関連する洗浄条件」の語は、食器用洗剤の市場で意図される家庭で実際に用いられる、特定の洗浄温度、時間、洗浄機器、泡の状態、洗剤のタイプ、及び水の高度の条件を意味する。
【００９５】
「改善された洗浄性能」の語は、関連する洗浄条件において食器及び／又はカトラリーからの汚れの除去において好ましい結果が得られること、又は対応する野生型酵素と比較して同じ結果が、重量ベースでより少ない変異体プロテアーゼで得られることを意味する。
【００９６】
「維持された洗浄性能」の語は、関連する洗浄条件下で、対応する野生型酵素の少なくとも８０％に当たる変異体プロテアーゼ酵素の性能を意味する。
【００９７】
プロテアーゼの洗浄性能は適切な条件下で、特定の代表的な汚れを除去する能力により測定される。これらのシステムにおいて、洗浄組成物、泡抑制剤、水の高度、洗浄機器、時間、ｐＨ、及び／又は温度等の因子を特定のマーケットセグメントにおける課程用製品のための条件に限定されるように、制御することができる。本明細書で説明する試験的な製品試験システムはＤＮＡ変異誘発を通じて修飾されたタンパク質分解酵素を用いる家庭用製品の代表的例である。従って、本明細書で提供される方法は大量の異なる酵素の試験及び特定の製品に特に好適な酵素の選択を促進する。
【００９８】
本明細書において、「殺菌」の語は、物の表面上の微生物を抑制又は殺すとこのほかに、表面から不純物を除去することも意味する。本発明を特定の表面、物、又は不純物に限定することは意図しない。
【００９９】
バクテリアセリンプロテアーゼのいくつかは、「スブチリシン」といわれている。スブチリシンはバチルススブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルスアミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）（「スブチリシンＢＰＮ」）、及び／又はバチルスリケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（「スブチリシンカールスバーグ」（ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ））を含む（例えば、Ｍａｒｋｌａｎｄ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ， ｉｎ Ｂｏｙｅｒ (ｅｄ．), Ｅｎｚｙｍｅｓ． ＴＨＥ (Ｂｏｙｅｒ， ｅｄ．) ｖｏｌ． ３， ｐｐ．５６１−６０８， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ［１９７１］参照）。アルカリ性バチルス株は他のプロテアーゼを生成する。後者のカテゴリーの例としては、ＭＡＸＡＣＡＬ（商標）プロテアーゼ（本明細書において、バチルスの新たな株ＰＢ９２から単離されたＰＢ９２プロテアーゼと言う）、及びＳＡＶＩＮＡＳＥ（商標）プロテアーゼを含む。追加的なプロテアーゼはＰＲＯＰＥＲＡＳＷ（商標）プロテアーゼを含むがこれらに限定されない。
【０１００】
ＰＢ９２プロテアーゼのアミノ酸（配列番号２）及びＤＮＡ配列（配列番号１）を表２に示す。成熟プロテアーゼは２６９のアミノ酸からなり、２７，０００ダルトンの分子量、高アルカリ範囲に等電点を有する。ＰＢ９２のタンパク質基質への活性はアルカリデルフト単位（Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｄｅｌｆｔ Ｕｎｉｔ （ＡＤＵ））であらわす。ＡＤＵでの活性はｐＨを８．５から１０．０に変更した以外は、英国特許Ｎｏ．１，３５３，３１７に記載の方法で測定する。精製ＰＢ９２プロテアーゼは１ｍｇ当たり２１，０００ＡＤＵの活性を有する。カゼイン上で測定される代謝回転数（ｋｃａｔ）は９０秒−１モル−１である。
【０１０１】
スブチリシンカールスバーグの精製された調整物の特定の活性は１０，０００ＡＤＵ／ｍｇであり（Ｄｅｌａｎｇｅ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２４３：２１８４ ［１９６８］参照）、スブチリシンＢＰＮ’の活性は７，０００ＡＤＵ／ｍｇである（Ｍａｔｓｕｂａｒａ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２４０：１１２５ ［１９６５］参照）。特定の活性及び代謝回転数（ｋｃａｔ）は別にして、ＰＢ９２プロテアーゼはカールスバーグスブチリシン、スブチリシンＢＰＮ’及び高い正電荷を有する製剤化された他の酵素（例えば、ＭＡＸＡＴＡＳＥ（商標）及びＡＬＣＡＬＡＳＥ（商標））のようなプロテアーゼから、本来タンパク質の電気泳動により視認で区別することができる。
【０１０２】
ＰＢ９２プロテアーゼはアルカリｐＨの値で汚れの除去において活性を有しているので、従来の洗剤の添加剤に、界面活性剤、ビルダー、及び酸化剤等の洗剤の成分と一緒に用いられている。後者は大部分において粉末形態で用いられている。ＰＢ９２プロテアーゼは前述のスブチリシン等の他のプロテアーゼに比べて汚れを除去する能力が高い。このことは同じ洗浄能力を提供するためにより少ないＰＢ９２プロテアーゼでよいことを意味している。酸化に対する感受性は、洗剤に適用されるＰＢ９２及び他のセリンプロテアーゼに重要な欠点である（例えば、Ｓｔａｕｆｆｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２４４：５３３３−５３３８ ［１９６９］； 及びＥｓｔｅｌｌ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６３：６５１８−６５２１ ［１９８５］参照）。酸化されていないＰＢ９２プロテアーゼと比較して、過ホウ酸三水和物及びＴＡＥＤを含む活性剤システムにより生成されるＨ２Ｏ２又は過酸によるＰＢ９２プロテアーゼの酸化は、ＡＤＵ／ｍｇにより、それぞれ５０％及び１０％に相当する。
【０１０３】
本発明は、天然のバクテリアセリンプロテアーゼ由来の変異体タンパク質分解酵素の生成、スクリーニング、及び選択のための方法及び組成物を提供する。そのような変異体は、例えば、アルカリ性バチルス株の野性型遺伝子由来の遺伝子によりコードされたものである。最も好適な態様において、この株はＰＢ９２である。
【０１０４】
しかしながら、アルカリ性バチルス株ＳＡＶＩＮＡＳＥ（商標）由来の変異タンパク質が好適である。本発明はアルカリ性バチルス株ＰＢ９２由来のセリンプロテアーゼ以外のプロテアーゼ由来の修飾プロテアーゼの選択に用いることができる。例えば、バチルススブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｌｓ）、バチルスアミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、及びバチルスリケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のセリンプロテアーゼをコードする遺伝子が知られており、変異誘発の標的に用いることができる。しかしながら、オリゴヌクレオチドを用いた部位指定変異誘発、又は領域指定ランダム変異誘発を含むがこれらに限定されない他の好適原意誘発修飾が本発明に用いられることから、本発明を特定の方法に限定することは意図しない。
【０１０５】
幾つかの好ましい態様において、生成及びスクリーニングを含む本発明により提供される変異タンパク質酵素の選択のための方法は、所望のタンパク質分解酵素をコードするクローン化された遺伝子又はそれらのフラグメントを変異させる工程、１つ又は複数の得られた変異プロテアーゼ遺伝子を単離する工程、この変異プロテアーゼ遺伝子を、発現及び生成に好適な宿主細胞株、好ましくは、好適なベクターに導入する工程、及び洗剤に適用するのに改善された性質を有するこれらの変異プロテアーゼを同定する工程を含む。
【０１０６】
変異プロテアーゼの生成のために好適な宿主細胞株はプロテアーゼを発現することができる改質転換可能な微生物を含む。特に、実質的に同じ性質を有するプロテアーゼの由来と同じ種又は属の、バチルス株、特にアルカリ性バチルス株、最も好ましくは新規なバチルス株であるＰＢ９２又はこれらの変異体である宿主株が好ましい。バチルススブチリス、バチルスリケニフォルミス、及びバチルスアミロリケファシエンス株が好適な株である。他の好適な宿主株は変異遺伝子で形質転換する前に細胞外タンパク質分解酵素の生成を行わない他の株を含む。特に好適なものは、新規なバチルスＰＢ９２の不完全誘導体等のバチルス株であると定義されたものである。プロテアーゼの発現は選択された宿主有機体で昨日するシグナルの発現を用いて得ることができる。シグナルの発現はプロテアーゼ遺伝子の転写及び翻訳を調節しているＤＮＡの配列を含む。好適なベクターは染選択された宿主株において有意に高いコピー数を複製し、色体取り込みにより、宿主系統内において、プロテアーゼ遺伝子を維持することができるものである。
【０１０７】
本発明の変異タンパク質分解酵素は適した発酵条件下における培養、１つ以上の所望の変異タンパク質分解遺伝子、及び生成された酵素の回収により調製することができる。
【０１０８】
好ましくは、この発現されるプロテアーゼは培地内で、グラム陰性バクテリア宿主株の場合、ペルプラスム種で選択され、それらの回収を促進する。選択のためには、好適なアミノ停止シグナル配列が用いられる。好ましくはこのシグナル配列は、選択された宿主株内で機能するならば、オリジナル遺伝子によりコードされるシグナル配列である。
【０１０９】
幾つかの態様において、自然発生、又は自然に変異した洗浄用プロテアーゼの性質がこの酵素の変異を変えることにより、高められる。大部分において、変異は保存的又は非保存的置換であるが、幾つかの態様において、欠失及び挿入も用いることができる。
【０１１０】
保存的置換において以下の表を用いる
脂肪族
天然
非極性（Ｇ、Ａ、Ｐ、Ｌ、Ｉ、Ｖ）
極性（Ｃ、Ｍ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ）
電荷
負電荷（Ｄ、Ｅ）
正電荷（Ｋ、Ｒ）
芳香族
（Ｆ、Ｈ、Ｗ、Ｙ）
任意のアミノ酸は同じカテゴリー、特に同じラインの他のアミノ酸で置換される。更に、極性アミノ酸、Ｎ、Ｑは電荷アミノ酸に置換するか、又はこれらにより置換される。本発明の目的のために、プロテアーゼのアニオン性質を高めることとなる、特に活性部位に直接含まれない置換が特に好ましい。
【０１１１】
変異のために特に好適な領域は、Ｅｇｌｉｎ Ｃが活性部位に結合している場合は、Ｅｌｉｎ Ｃ抑制分子から４Å離れたアミノ酸である。
【０１１２】
以下の番号はＰＢ９２プロテアーゼに基づいているが、実質的に類似の構造、特に約７０％より高い配列相同性、特に約９０％より高い配列相同性を有する、他のセリンプロテアーゼについても当てはまるであろう。特に好適な位置は、タンパク質に関係する基質と相互作用することから、３２、３３、４８−５４、９４−１０７、１１６、１２３−１３３、１５０、１５２−１５６、１５８−１６１、１６４、１６９、１７５−１８６、１９７、１９８、２３０−２１６（ＰＢ９２の番号）を含む。幾つかの最も好適な態様において、変異位置は、１１６、１２６、１２７、及び１２８（ＰＢ９２番号）である。代替的な態様において、追加的な変異は１６０の位置で起こる。
【０１１３】
更なる態様において、特に意図する置換位置は６０、９４、９７−１０２、１０５、１１６、１２３−１２８、１５０、１５２、１６０、１８３、２１１、２１２、２１３、２１４、及び２１６（ＰＢ９２の番号）を含む。幾つかの位置において、不安定なアミノ酸（例えば、メチオニン）をより酸化安定性のあるアミノ酸（例えば、スレオニン）で置換して、この部位におけるアミノ酸の通常の形態及び容量を維持する。幾つかの他の態様において、天然アミノ酸を大部分他のアミノ酸で置換して改良された結果を得る。特にヒドロキシル化されたアミノ酸Ｓ及び／又はＴを、極性又は非極性アミノ酸、又は更には芳香族アミノ酸で置換する。
【０１１４】
幾つかの最も好適な態様において、置換は以下を含む（ＰＢ９２の番号）、
Ｇ１１６ Ｉ、Ｖ、Ｌ
Ｓ１２６を任意のアミノ酸、Ｐ１２７を任意のアミノ酸、Ｓ１２８を任意のアミノ酸、
Ｓ１６０を芳香族又は中性脂肪族アミノ酸、
Ａ１６６を電荷のある、特定のアミノ酸
Ｍ１６９を天然の脂肪族、好ましくは非極性のアミノ酸
Ｎ２１２ アニオンアミノ酸
Ｍ２１６脂肪族、極性、特に、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ
【０１１５】
驚くべきことに、共通の基質を有するプロテアーゼの低い特定の活性が多くの変異体において得られたが、洗浄性能は天然の酵素に匹敵するか又は高められていて、多くの場合貯蔵安定性が改善されていた。更に、幾つかのＰＢ９２変異プロテアーゼの洗浄性能を天然のＰＢ９２プロテアーゼと比較すると、約１２０乃至約１８０パーセントになっていた。従って、本発明は天然プロテアーゼと比較して改善された性能を有するプロテアーゼを提供する。
【０１１６】
幾つかの態様において、幾つかの変異を組み合わせて洗浄組成物中のプロテアーゼの安定性を高めることができる。同じプロテアーゼの洗浄に有利に影響する幾つかの変異を組み合わせて更に改善されたプロテアーゼを提供することができる（例えば、Ｓ１２６Ｍ、Ｐ１２７Ａ、Ｓ１２８Ｇ、Ｓ１６０Ｄ、及びＧ１１６Ｖ、Ｓ１２６Ｖ、Ｐ１２７Ｓ、Ｓ１２８Ａ，Ｓ１２８Ａ、Ｓ１６０Ｄ；ＰＢ９２の番号）。
【０１１７】
有用な変異タンパク質インデックスは本明細書の変異又は変異のセットを組み合わせて提供することもできる。更なる態様において、本明細書で提供する特に有用な変異は他の部位の変異と組み合わせられる。幾つかの態様において、これらの組合せは酵素の性質において相当の変化をもたらす。他の態様において、これらの変更はそれほど変化をもたらさない。
【０１１８】
本明細書で定義するように、本発明は洗剤組成物及び／又は洗浄工程において１つ以上の変異体タンパク質分解酵素の使用も含む。ＰＢ９２プロテアーゼに対して相同なプロテアーゼにおいて起こる変異誘発又は自然発生のいずれかにより、プロテアーゼのポリペプチド鎖においてアミノ酸の欠失又は置換が起こると、最終的にアミノ酸の番号が変更することは理解されている。しかしながら、ＰＢ９２プロテアーゼのアミノ酸の位置に相同な位置は特許請求の範囲内であることも理解されるであろう。
【実施例】
【０１１９】
以下の実施例は特定の好適な態様を説明する目的で提供されるものであり、本発明をこれらの範囲に限定することを意図するものではない。
【０１２０】
以下に示す実験において、以下の略語を用いる；℃（摂氏温度）；ｒｐｍ（１分当たりの回転数）；Ｈ２Ｏ（水）；ＨＣｌ（塩酸）；ａａ（アミノ酸）；ｂｐ（ベースペア）；ｋｂ（キロベースペア）；ｋＤ（キロダルトン）；ｇｍ（グラム）；μｇ及びuｇ（ミクログラム）；ｍｇ（ミリグラム）；ｎｇ（ナノグラム）；μｌ及びｕｌ（ミクロリットル）；ｍｌ（ミリリットル）；ｍｍ（ミリメートル）；ｎｍ（ナノメートル）；μｍ及びｕｍ（マイクロメートル）；Ｍ（モル）；ｍＭ（ミリモル）；μＭ及びｕＭ（マイクロモル）；Ｕ（単位）；Ｖ（ボルト）；ＭＷ（分子量）；sec（秒）；ｍｉｎ(ｓ)（分）；ｈｒ(ｓ)（時間）；ＭｇＣｌ（塩化マグネシウム）；ＮａＣｌ（塩化ナトリウム）；ＯＤ２８Ｏ（２８０ｎｍにおける光学密度）；ＯＤ６ＯＯ（６００ｎｍにおける光学密度）；ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミド電気泳動）；ＥｔＯＨ（エタノール）；ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水［１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２］）；ＳＤＳ（硫酸ドデシルナトリウム）；トリス（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）；ＴＡＥＤ（Ｎ，Ｎ，Ｎ’Ｎ’−tテトラアセチルエチレンジアミン）；ｗ／ｖ（重量対容量）；ｖ／ｖ（容量対容量）；ＭＳ（マススペクトロコピー）；ＴＩＧＲ（ＴＨＥ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ）；ＡＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｅｘｔｉｌｅ ａｎｄ Ｃｏｌｏｒｉｎｇ Ｃｈｅｍｉｓｔｓ）；ＳＲ（シミ又は汚れの除去）；ＷＦＫ（ｗｆｋ Ｔｅｓｔｇｅｗｅｂｅ ＧｍｂＨ， Ｂｒｕｇｇｅｎ−Ｂｒａｃｈｔ， Ｇｅｒｍａｎｙ）；Ａｍｅｒｓｈａｍ （Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ． Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ， ＩＬ）；ＩＣＮ（ＩＣＮ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ．， Ｃｏｓｔａ Ｍｅｓａ， ＣＡ）； Ｐｉｅｒｃｅ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＬ）；Ａｍｉｃｏｎ（Ａｍｉｃｏｎ， Ｉｎｃ．， Ｂｅｖｅｒｌｙ， ＭＡ）；ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）；Ａｍｅｒｓｈａｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ）；Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ （Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｌａｂｗａｒｅ， Ｌｉｎｃｏｌｎ Ｐａｒｋ， ＮＪ）； ＢｉｏＲａｄ（ＢｉｏＲａｄ， Ｒｉｃｈｍｏｎｄ， ＣＡ）；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）；Ｄｉｆｃｏ（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｄｅｔｒｏｉｔ， ＭＩ）； ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ 又は Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）；Ｎｏｖａｇｅｎ（Ｎｏｖａｇｅｎ， Ｉｎｃ．， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）；Ｑｉａｇｅｎ（Ｑｉａｇｅｎ， Ｉｎｃ．， Ｖａｌｅｎｃｉａ， ＣＡ）；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）；Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ Ｏｙ，Ｅｓｐｏｏ，Ｆｉｎｌａｎｄ）；Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ，Ｅａｓｔｏｎ， ＰＡ）；Ｍｅｒｉｅｕｘ（Ｉｎｓｔｉｒｕｔ Ｍｅｒｉｅｕｘ，Ｃｏｄｅｘ，ＦＲ）；Ｋｅｌｃｏ（ＣＰ Ｋｅｌｃｏ， Ａｔｌａｎｔａ， ＧＡ）；Ｇｅｎａｉｓｓａｎｃｅ（Ｇｅｎａｉｓｓａｎｃｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ， ＣＴ）；ＤＮＡ ２．０（ＤＮＡ ２．０， Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ， ＣＡ）；ＭＩＤＩ（ＭＩＤＩ Ｌａｂｓ，Ｎｅｗａｒｋ， ＤＥ） ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ （ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）；Ｓｉｇｍａ（Ｓｉｇｍａ ＣＨＥＭＩＣＡＬ Ｃｏ．， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）；Ｓｏｒｖａｌｌ（Ｓｏｒｖａｌｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ａ ｓｕｂｓｉｄｉａｒｙ ｏｆ ＤｕＰｏｎｔ Ｃｏ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ， ＤＥ）；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ）；Ｒｏｃｈｅ（Ｈｏｆｆｍａｎｎ Ｌａ Ｒｏｃｈｅ， Ｉｎｃ．， Ｎｕｔｌｅｙ， ＮＪ）；Ａｇｉｌｅｎｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）；Ｍｉｎｏｌｔａ（Ｋｏｎｉｃａ Ｍｉｎｏｌｔａ， Ｒａｍｓｅｙ， ＮＪ）；Ｚｅｉｓｓ（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ， Ｉｎｃ．， Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ， ＮＹ）；Ｈｅｎｋｅｌ（Ｈｅｎｋｅｌ，ＧｍｂＨ， Ｄｕｓｓｅｌｄｏｒｆ， Ｇｅｒｍａｎｙ）；Ｃｏｇｎｉｓ（Ｃｏｇｎｉｓ Ｃｏｒｐ，ＵＳＡ， Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ， ＯＨ）；Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ Ｏｙ， Ｅｓｐｏｏ， Ｆｉｎｌａｎｄ）；Ｒｅｃｋｉｔｔ Ｂｅｎｃｋｉｓｅｒ， Ｂｅｒｋｓ， Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）；ＢＡＳＦ（ＢＡＳＦ Ｃｏｒｐ．， Ｆｌｏｒｈａｍ Ｐａｒｋ， ＮＪ）；ＩＫＷ（Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｖｅｒｂａｎｄ Ｋｏｒｐｅｒｆｌｅｇｅ ｕｎｄ Ｗａｓｃｈｍｉｔｔｅｌ， Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ， Ｇｅｒｍａｎｙ）；及び ＷＦＫ（Ｔｅｓｔｇｅｗｅｂｅ ＧｍｂＨ， Ｂｒｕｇｇｅｎ−Ｂｒａｃｈｔ， Ｇｅｒｍａｎｙ）。
【０１２１】
３．００ｍｍｏｌＣａ＋Ｍｇ（１６．８ｏｄ）を含む幾つかの食器洗浄試験に用いた合成水を以下のように調製した。第一に、１つのストック溶液を調製した。溶液１は８００ｍｍｏｌ／ｌ ＮａＨＣＯ３（６７．２ｇ／ｌ）であり、溶液２は１５４．２ｍｍｏｌ／ｌＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（３８．０ｇ／ｌ）であり、溶液３は４４６．１ｍｍｏｌ／ｌＣａＣｌ２＊２Ｈ２Ｏ（６５．６ｇ／ｌ）であった。各溶液を調製した後、５０ｍｌの各ストック溶液、１、２、及び３を７Ｌの脱イオン水を含む管に入れ、この環に水を入れ全体を１０Ｌにした。使用の前にこの合成水のｐＨの値をＨＣＬ又はＮａＯＨで７．５に調節した。
【０１２２】
以下の表１は本発明の開発の環に製造され試験された変異体を示す。この表において、ＢＰＮ’及びＰＢ９２の番号を参照のために示す。
【表１】
【０１２３】
表１において、全ての株を製造し、実施例で説明する方法を用いて特徴付けた。アスタリスク（＊）で示す下部はＥＰ０５７１０４９に記載のものである（実施例１Ａ乃至Ｃ）を参照のこと。他の全ての変異体は実施例１Ｄに記載のように調製した。
実施例１
ＰＢ９２プロテアーゼ変異体の構築
【０１２４】
この実施例において、本明細書で提供されるＰＢ９２への幾つかを構築するための方法を説明する。変異誘発からの基礎となる構築体を「ｐＭ５８」と呼び、ＥＰ０２８３０７５及びＥＰ０５７１０４９に記載されている。以下の３つの手順を含む。
Ａ．変異誘発ベクター１３Ｍ１の構築、
Ｂ．変異手順
Ｃ．ｐＭ５８Ｅｃｏの構築及びベクター内での変異ＤＮＡフラグメントのサブクローニング
【０１２５】
更に、パートＤ（「ＰＢ９２変異体の構築」）は本発明に有用なＰＢ９２変異体の構築の説明を含む。
Ａ. 変異誘発ベクター１３Ｍ１の構築
【０１２６】
基礎構築物ｐＭ５８は制限酵素ＨｐａＩ及び／又はＢａｌＩを用いて消化した。ＰＢ１９２プロテアーゼ遺伝子を含む１４０ｂｐフラグメントを本分野で知られている低融点アガロース上で精製した。ベクターＭ１３ＭＰ１１（Ｍｅｓｓｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ９：３０３−３２１ ［１９８１］参照）をＳｍａＩで消化した。所望の１４００ｂｐＤＮＡフラグメントをベクターに結合し、既知の方法（Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ６９：２１１０−２１１４ ［１９７２］参照）でＥ．ｃｏｌｉＪＭ１０１に形質転換した。
【０１２７】
Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０１内のファージプロパゲーションの後、ｓｓＤＮＡを既知の方法（Ｈｅｉｄｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， ｇｅｎｅ １０：６９−７３ ［１９８０］）で単離し、Ｓａｎｇｅｒ ＤＮＡ配列決定（Ｓａｎｇｅｒ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７４：６４６３ ［１９７７］を用いて挿入及び伸長をチェックした。変異誘発に適したベクターが得られ「Ｍ１３Ｍ１」と名づけた。図１Ａにおいてこの手順の概要を示す。
変異誘発手順
【０１２８】
変異誘発はＭ１３Ｍ１のｓｓＤＮＡとＭ１３ｍｐ１９（Ｍｅｓｓｉｎｇ ｅｔ ａｌ． Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ９：３０３−３２１ ［１９８８］）のｄｓＤＮＡを用いて、Ｍ１３Ｍ１において行った。後者はＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩの制限酵素で消化して、低融点アガロースで状ラージフラグメントの精製により得られたものである。
【０１２９】
変異誘発は変異体の選択にＥ．ｃｏｌｉＬＭ１０５ではなくＥ．ｃｏｌｉＷＫ３０−３を用いた以外は既知の方法（Ｋｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． ＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１２：９４４１−９４５６ ［１９８４］）で行った。
【０１３０】
特定の変異を生成するために用いるオリゴヌクレオチドの長さは２２分子である。特定のＤＮＡ配列において同時に幾つかの変異を生成するために用いる領域特定変異誘発は、変異されるアミノ酸に対応する部位にランダムに取り込まれた４つのヌクレオチドを含む４０分子の長さを用いてオリゴヌクレオチドプレパレーションを用いて行われた。
【０１３１】
変異誘発の後、ポテンシャル変異誘発をＳａｎｇｅｒジデオキシ法（Ｓａｎｇｅｒら、上記）を用いて配列回折により関連する変異についてチェックした。完全な一本鎖ギャップ（図１Ｂ参照）を配列決定して、第二の変異の欠失を確認した。この手順を図１Ｂに示す。
【０１３２】
説明した手順はプロテアーゼ遺伝子の３’部分に変異を有するＤＮＡフラグメントについて有用であった（アミノ酸１５４−２６９）。
【０１３３】
しかしながら、本分野において好適な任意の方法を用いることができるので、本発明をこれらの特定の方法に限定することは意図しない。すなわち、バチルスベクターにおいて、プロテアーゼ遺伝子の５’部分における変異を有するＤＮＡフラグメントを生成するために、代替的な制限酵素及び／又は修飾されたＰＢ９２プロテアーゼ遺伝子を、図１Ａに図示された方法と類似の方法で構築することができる。
Ｃ．ｐＭ５８Ｅｃｏの構築及びベクター内での変異ＤＮＡフラグメントのサブクローニング
【０１３４】
ｐＭ５８Ｅｃｏを構築するために、ｐＭ５８を制限酵素ＥｃｏＲＩで消化して、本分野で知られているように、希釈条件下で、Ｔ４リガーゼを用いてリゲートした。リゲーション混合物は本発明の分野で既知の方法を用いてバチルススブチリス１−Ａ４０（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｒｅ， Ｏｈｉｏ）を形質転換した （Ｓｐｉｚｉｚｅｎ ｅｔ ａｈ， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｄ．， ８１ ：７４１−７４６ ［１９６１］参照）。
【０１３５】
形質転換混合物からの細胞を、本分野で既知の方法で、２０ｍｇ／ｍｌネオマイシンを含む最小平板培地で平板培養した（ＥＰ０２８３０７５の実施例１を参照）。
【０１３６】
形質転換体のプラスミドＤＮＡを本分野で既知の方法（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ ａｎｄ ＤｏＩｙ， Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ７：１５１３−１５２３ ［１９７９］参照）で単離し、制限酵素解析で特徴付けた。従って、この方法により、ｐＭ５８Ｅｃｏを単離した（図１ｃ参照）。
【０１３７】
変異酵素を生成するために、上で説明したパートＢにおいて生成された所望の変異を含むＭ１３Ｍ１のＤＮＡフラグメントをｐＭ５８Ｅｃｏにサブクローニングした。その後、Ｍ１３Ｍ１の２本鎖（ｄｓＤＮＡ）をＥｃｏＲＩで消化し、ｐＭ５８ＥｃｏのＥｃｏＲＩにリゲートした。本分野で既知の方法（Ｓｐｉｚｉｚｅｎ ｅｔ ａｌ．， 上記）を用いてこのリゲート混合物を用いてバチルススブチリスＤＢ１０４（Ｄｏｉ， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １６０：４４２−４４４ ［１９８４］）を形質転換した。
【０１３８】
形質転換混合物からの細胞を２０ｍｇ／ｍｌのネオマイシン及び０．４％カゼインを含む最小平板培地で、本分野で既知の方法（ＥＰ０２８３０７５参照）を用いて平板培養した。プロテアーゼを生産している形質転換体のＤＮＡを本分野で既知の方法（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ ａｎｄ ＤｏＩｙ 上記）で単離し、制限酵素解析により特徴付けを行った。
Ｄ．ＰＢ９２変異体の生成
【０１３９】
本分野で知られているように（米国特許出願Ｎｏ．０１／５４１，７３７、参照により本明細書に援用する）、０５３乃至０６０と定義されたＰＢ９２変異体を融合ＰＣＲで調製した。以下の表に本明細書で述べる融合ＰＣＲに用いたプライマーを示す。
【表２】
【０１４０】
Ｐｎｕｓｉｏｎ（商標）ポリメラーゼ（フィンザイム）をＰＣＲ反応に用いた。これらの実験において、２μｌの１０ｍＭ前方向及び後ろ方向プライマー、１μｌの１０ｍＭｄＮＴＰｓ、５μｌの１０×ＨＦ融合緩衝液、１．５μｌのＤＭＳＯ、並びに１μｌのテンプレートを５０μｌの容量に添加した。９５℃での変性を３分間、６５℃のアニーリングを１分、７２℃での伸長反応を１分１５秒、これらを３０サイクル繰り返し、続いて７２℃を７分のプログラムを用いた。反応が終了したら、反応生成物を室温で貯蔵した。
【０１４１】
変異体「０４７／０４８」をテンプレートとして用いて、変異体０５３乃至０５８を生成した。ＢｇｌＩＩ−Ｆｗプライマーを１１８Ｖ−Ｒｖｄｔｏ組み合わせて、第二フラグメントをＢｇｌＩＩ−Ｒｖと１２８−１３０−Ｆｗプライマーと組み合わせて調製した。０５７の場合、ＢｇｌＩＩ−Ｆｗ／Ｓ１６６Ｄ−Ｒｖを組み合わせた。
【０１４２】
更に、変異体「０５１／０５２」をテンプレートとして用いて、変異体０５９乃至０６０を生成した。プライマー１２６−ｕｐ−ＲｖをＢｇｌＩＩ−Ｆｗと組み合わせて、ＢｇｌＩＩ−Ｒｖを１２８−１３０−Ｆｗプライマーと組み合わせた。
【０１４３】
予期したサイズのフラグメントをＭａｃｈｅｒｅｙ−ＮａｇｅｌからのＰＣＲ生成カラムを用いてアガロースゲルから生成した。正確なフラグメントを融合し、Ｐｎｕｓｉｏｎ（商標）ポリメラーゼを用いてＢｇｌＩＩプライマーで増幅した。９５℃での変性を３分、６５℃でのアニーリングを１分、７２℃での伸長反応を２分行い、これを２５サイクル繰り返し、その後、７２℃で７分のプログラムで行った。プログラムが終了したら、反応生成物を室温で貯蔵した。
【０１４４】
フラグメントをＢｌＩＩで消化して、アガロースゲルで精製し、本分野において既知の方法を用いて、４０μｌ容量中、１μｌのＴ４ＤＮＡリガーゼ、８μｌの５×Ｔ４リゲーション緩衝液をもちいて、１４℃で一晩リゲーションを行った。
【０１４５】
高度形質転換可能な株であるバチルススブチリスＢＧ３５９４ｃｏｍＫを用いて、プロテアーゼ陽性形質転換体を得た。上で説明するように得られた発現ベクターを１０μｌのリゲーション生成物を用いて形質転換を行った。好適なバチルススブチリスであるバチルススブチリスＢＧ３５９４ｃｏｍＫを実施例１で生成した発現プラスミドで形質転換した。キシロースを誘導可能なプロモーターの制御下のｃｏｍＫ遺伝子を導入してこのバクテリアをコンピテントにした（Ｈａｈｎ ｅｔ ａｌ， ＭｏＩ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ２１：７６３−７７５ ［１９９６］参照）。プロテアーゼ陽性クローンを選択し、単離し、配列決定し、実施例２で説明するようにバチルスクラウシ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）ＰＢＴ１２５に形質転換した。
実施例２
バチルスクラウシ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）における変異体の発現
【０１４６】
この実施例では、実施例１で説明した発現ベクターを用いてバチルスクラウシ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）ＰＢＴ１２５中で発現された変異体プロテアーゼの開発に用いた方法を提供する。この株はＰＢＴ１１０のプロテアーゼ陰性誘導体であり、従来の株を改良する方法を用いて得られたものであり、アスポジェニティー（ａｓｐｏｒｏｇｅｎｉｔｙ）及び改善されたプロテアーゼ生産についてスクリーニングをおこなっている。
ＰＢ９２プロテアーゼ陰性融合体：ＰＢＴ１２５の形質転換手順
【０１４７】
本分野で既知の、Ｃｈａｎｇ及びＣｏｈｅｎのポリエチレングリコール誘導プロトプラスト形質転換方法（Ｈａｈｎ ｅｔ ａｌ， ＭｏＩ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ２１：７６３−７７５ ［１９９６］））を、以下で説明する変更を行い、実施例１で説明する発現ベクターを用いて、バチルスクラウシ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）ＰＢＴ１２５を形質転換するために用いた。第一に、プロトプラストを０．５Ｍスクロース、０．０２ＭＭｇＣｌ２、及び０．０２Ｍトリスマレイン酸緩衝液（ｐＨ８．０）を含むアルカリホールディング培地に１ｍｌ当たり０．４ｍｇのリゾザイムを添加して調製した。その後、このプロトプラストを平板培養し、３．５％（ｗｔ／ｖｏｌ）のＢａｃｔｏ−Ｐｈｅｎａｓｓａｙ（ディフコ）ブロスと０．０４％アルブミン（メリエックス）を添加したアルカリホールディング培地５ｍｌ中に懸濁した。形質転換されたプロトプラストを７５０ｍｌＨ２Ｏ中、８．０ｇのＧＥＬＲＩＴＥ（商標）ｇｅｌｌａｍ Ｇｕｍ（Ｋｅｌｃｏ）、０．３ｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、４．０６ｇのＭｇＣｌ２・Ｈ２Ｏ、５．０ｇのＮ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸緩衝液（シグマ）、５．０ｇのカザミノ酸、５ｇの酵母抽出物、１．５ｍｌの４Ｍ ＮａＯＨを含む変更されたＤＭ３（５）プレート上で再生成し、２５０ｍｌの２Ｍスクロース及び１０ｍｌの５０％（ｗｔ／ｖｏｌ）グルコース、１ｍｌのアルブミン（Ｍｅｒｉｅｕｘ）、１０ｍｇのチアミン、５ｍｇのビオチン、及び５０ｍｇのネオマイシンで滅菌した後に混合した。プレートを約７０℃で注いだ。コンピテントバチルスクラウシ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）の形質転換を既知の方法で行った（Ｔａｎａｋａ， “Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｐｌａｓｍｉｄ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｉｎ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ，” Ｉｎ Ｄ． Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ (ｅｄ．)， Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ． Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｄ．Ｃ．， ｐｐ．１５−１８， ［１９８２］参照）。
発酵条件及びプロテアーゼ生成
【０１４８】
１リットル当たり（乾燥重量に基づき）２２ｇの酵母、１リットル当たり５ｇのＫ２ＨＰＯ４・３Ｈ２Ｏ、１リットル当たり０．０５ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１リットル当たり０．０５ｇのＣａＣｌ２、１リットル当たり０．００５ｇのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、及び１リットル当たり０．０５ｇのＭｎＳＯ４を含む培地を用いて、６又は３リットルの発酵槽中で、バチルスクラウシ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）ＰＢＴ１２５を形質転換した。最終容量の９０％の培地成分を溶解しｐＨ７．０で１２０℃で、１時間滅菌した。滅菌の後、４ｍｌの１Ｍカルボン酸ナトリウム溶液をスラントチューブから添加して、バチルスクラウシ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）ＰＢＴ１２５を１００ｍｌのＴＳＢへ植菌することにより植菌培地を生成した。この植菌培地を振とう装置で、３７℃で２４時間インキュベーションした。培地を培地１００容量当たり１容量の植菌培地で、ｐＨ８．０で３７℃で植菌した。ｐＨ、温度、発泡の制御、並びに溶解酸素濃度及び酸素取り込み速度を連続的に測定することができる装置を備えた攪拌式発酵装置において行った。植菌の１７時間後、１２０℃で１時間滅菌された３０％のグルコース溶液を、培地１リットル当たり３０グラムの最終濃度となるように添加した。
【０１４９】
ブロスを１１，８００ｘｇで３０分間遠心分離した。この上清をＷｈａｔｍａｎガラス繊維フィルター及びブフナー漏斗中の０．８ｕｍフィルターでろ過をして、その後にセルロースパッドを用いてろ過をした。得られた物質を使用するまで４℃で保存した。次に、この物質を１０ｋＤａの分子量を取り除くＰａｌｌＵＦ−ろ過ユニットを用いて濃縮した。得られたＵＦ濃縮物をプロピレングリコール及びギ酸ナトリウムを添加して製剤化した。ギ酸を添加してｐＨを６．０にした。
実施例３
精製されたプロテアーゼの精製度を確認するための解析技術
【０１５０】
この実施例では、精製されたプロテアーゼの精製度を確認するための方法を説明する。プロテアーゼは電気泳動及び高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により、それぞれ、１つのバンド及び１つのピークが見られた場合に精製されたと考えられる。
【０１５１】
ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含まないポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を本分野で既知の方法を用いて行った（Ｌａｅｍｍｌｉ， Ｎａｔｕｒｅ， ２２７：６８０−６８５ ［１９７０］参照）。しかしながら、自己分解を避けるために、１００℃でＳＤＳでタンパク質サンプルを変性させる前に、プロテアーゼ活性を失活させることが必要となる。フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）（１ｍＭ、３０分、室温）でインキュベーション、又は、トリクロロ酢酸で沈殿（ＴＣＡ、８％、３０分、氷上）することによりプロテアーゼの失活を行った。ＰＡＧＥはｐＨ７．４５で行った（ゲル緩衝液は、５％ポリアクリルアミドゲル中、２０ｍＭのヒスチジン（Ｈｉｓ）及び５０ｍＭの３−［Ｎ−モルフォリノ］プロパンスルホン酸を含む（アクリルアミド：ビスアクリルアミドは２０：１））。タンパク質サンプルをスラブゲルのトップにロードして、陰極に向かって電気泳動を行った。５Ｈｉｓ・ＭＯＰＳ緩衝液を電気泳動（タンク）緩衝液として用いた。ｐＨは６．３であった。電気泳動（１−２時間で３５０ｖ）の後、ゲルを８％の酢酸に浸して、タンパク質をゲル中に固定し、続いて、本分野で既知の方法で、クマシーブルーで染色し、脱色した。
【０１５２】
ＨＰＬＣによる精製度のチェックはカチオン交換カラム（ＭｏｎｏＳ；ファルマシア）及びゲルろ過カラム（ＴＳＫ２０００；ＳＷ−ＬＫＢ）を用いた。前者は１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．５中で行った。１０乃至１３３ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ５．５の勾配を用いて結合したプロテアーゼの溶出を行った。ゲルろ過カラムは０．２５ｍＭの酢酸ナトリウム中で行った。
実施例４
プロテアーゼ濃度の決定
【０１５３】
この実施例では、プロテアーゼ濃度を決定にするための方法を説明する。いくつかの実験において、２８０ｎｍで吸光度の測定を行い、計算された減衰係数（Ｍ）を用いて、以下で述べるように活性部位のタイトレーションを用いて精製されたタンパク溶液の濃度を決定した。追加的な実験において、米国特許出願Ｎｏ．１１／０１１，６６６に定義されている方法も用いた。
【０１５４】
２８０ｎｍにおける吸光度の測定は酵素分子当たりのトリプトファン（Ｍ＝５，６００Ｍ−１・ｃｍ−１）及びチロシン（Ｍ＝１，３３０Ｍ−１．ｃｍ−１）の数から計算された。ＰＢ９２プロテアーゼについて、Ｍは２６，１００Ｍ−１．ｃｍ−１（３ Ｔｒｐ、７Ｔｒｙ残基）であり、Ｅ１ １％ｃｍに等しく、２８０ｎｍ＝９．７（Ｍｒ＝２６，７２９Ｄａ）であった。Ｔｒｐ残基及びＴｒｙ残基の変更された数を有する変異体の場合、係数がそれに応じて作成される。
【０１５５】
活性酵素分子の数の評価は活性部位滴定を用いて行った。広く行われているＮ−トランスシナモイルイミダゾールを用いる方法（Ｂｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ， ８８：５８９０−５９３１ ［１９６６］）は、ＰＢ９２プロテアーゼについて効果的ではないので、ＰＭＳＦを用いる方法をかわりに用いた。
【０１５６】
この方法において、（２８０ｎｍの吸光度で）評価される濃度の酵素を含むプロテアーゼ溶液を０．２５、０．５０、０．７５、１．００及び１．２５に等しいＰＭＳＦと混合し、ｐＨ６．５の１０ｍＭリン酸ナトリウム中で室温で１時間反応させた。酵素濃度は少なくとも５０Ｍであった。
【０１５７】
残余活性は、スクシニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−プロリル−Ｌ−フェニルアラニル−パラ−ニトロアニリル（ｓＡＡＰＦｐＮＡ）を基質として用いた分光高度により測定した。ＰＭＳＦの精製度（及び濃度）をＮＭＲスペクトロコピーを用いて決定し、ストック溶液をイソプロパノール中に作成した。活性部位滴定から得られたはＨＰＬＣをもちいた精製度チェックに一致していた。
実施例５
野生型変異プロテアーゼの動的パラメーターの決定
【０１５８】
この実施例において、野生型及び変異プロテアーゼの動的パラメーターを決定するための方法を説明する。
【０１５９】
タンパク質基質（カゼイン）上の活性を英国特許Ｎｏ．１，３５３，３１７に記載の方法でｐＨ１０で測定した、
【０１６０】
基質としてカゼインを用いてあらゆるｐＨにおいて（ｐＨ−ｓｔａｔ）転換数を測定した。あらゆるｐＨの反応チャンバーは１０ｍｌの０．１ＭＫＣｌと５０ｍｇのカゼイン（Ｈａｍｍｅｒｓｔｅｉｎ、メルク）を含んでいた。ＰＢ９２プロテアーゼによりカゼインを加水分解して遊離されたプロトンを、ｐＨを１０．０に維持しながら、１０ｍＭのＮａＯＨで滴定した（窒素ガス流れ中、４０℃）。
【０１６１】
合成ペプチドの活性はｓＡＡＰＦｐＮＦを用いて測定した。形成された（黄色い）パラニトロアニリン（ｐＮＡ）をＵＶＩＫＯＮ８６０（ＫＯＮＴＲＯＮ）を用いる既知の方法（Ｄｅｌｍａｒ ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ９４：３１６−３２０ ［１９７９］）を用いて、サーモスタッド制御された６つの位置のセルチャンバーを有する分光高度計により、４１０ｎｍ；Ｍ＝８，４８０Ｍ−１・ｃｍ−１で測定した。動的パラメーター、ｋｃａｔ及びｋｍは（プロテアーゼ濃度で０．１乃至６．０ｍＭの）各種濃度で、初期速度からデータを得て、このデータを多変数曲線反復方法（ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ ｓｅｃａｎｔ ｉｔｅｒａｔｉｖｅ ｍｅｔｈｏｄ）を用いて、非直線回帰による双曲線関数に当てはめることにより計算した。特定の係数、ｋｃａｔ／ｋｍをその後計算した。測定は、２５℃で、最終容量１ｍｌ中０．１ＭトリスＨＣｌと０．１ＭのＮａＯＨ、ｐＨ８．６とを含む溶液を用いて行った。塩化ナトリウムが存在しないと、ＰＢ９２プロテアーゼは基質抑制が起き、非直線ラインウェーバー−バークプロットを示すので、この添加が必要である。基質を最初にＤＮＳＯに溶解し、２００ｍＭの濃度にして、その後、トリスＨＣｌ、ｐＨ８．６で希釈して、２０ｍＭ（３１５ｎｍ；Ｍ＝１４，０００Ｍ−１・ｃｍ−１で分光光度計を用いて測定）のストック溶液を調製した。ＤＭＳＯの変更のための補正は行わなかった（０．０５−３．０％、ｖ／ｖ）。
実施例６
洗浄性能試験
【０１６２】
この実施例では、市販の食器用洗剤を用いたＰＢ９２プロテアーゼ変異体と市販のＰＲＯＰＥＲＡＳＥ（商標）セリンプロテアーゼの食器洗浄に適用した場合の洗浄性能を決定するための試験を説明する。
【０１６３】
この試験において、ＰＢ９２変異体（０４９：Ｇ１１６Ｖ，Ｓ１２６Ｖ、Ｐ１２７Ｑ、Ｓ１２８Ａ、並びに０４６：Ｇ１１６Ｖ、Ｓ１２６Ｉ、Ｐ１２７Ｑ、Ｓ１２８Ａ、Ｓ１６０Ｄ（ＰＢ９２番号）を各種条件下で試験を行った。食器用洗剤の成分を以下で説明する。これらの洗剤はＷＦＫから入手可能であり、以下に表示する。各汚れタイプ（ひき肉、黄身、黄身とミルク）についての手順は以下で説明する。それぞれの汚れを試験に用いる食器に適用する前に、食器は徹底的に洗浄する。このことは、特定の汚れが、洗浄後の食器に残っていることがあるので、必ず行う。新しい食器を試験に最初試験に用いる前に３回徹底的に洗浄した。
ステンレススチール上の黄身の汚れ
【０１６４】
試験に用いたステンレススチールシート（１０×１５ｃｍ；片面がつや消しされている）を市販の高アルカリ洗剤（ＥＣＯＬＢＡ（商標）洗剤；Ｈｅｎｋｅｌ）を用いて実験室用の食器洗浄器中、９５℃で徹底的に洗浄し、きれいで油が残っていないスチールを用意した。これらのスチールを使用する前に、デバリングした。このシートを黄身の汚れをつける前に加熱キャビネット中で８０℃で３０分間乾かした。つや消しされた表面を汚れをつける前に触れないようにした。水のシミもほこりも表面上にあってはならない。冷却したシートを汚れを付着させる前に重さを量った。
【０１６５】
１０乃至１１のタマゴ（２００ｇのタマゴの黄身）の黄身を分離して汚れを付着させるための黄身を調製した。この黄身をガラスビーカーの中でフォークを用いて攪拌して黄身の懸濁液を調製した。この黄身をその後、洗い粒子及び殻の破片を取り除くために（約０．５ｍｍメッシュ）で裏ごしした。
【０１６６】
平らな刷毛（２．５”）を用いて、約１．０±０．１ｇの黄身を出来るだけ均一に１４０ｃｍ２のつや消しされた表面に塗り、（必要に応じて粘着テープを用いて）約１ｃｍの汚れを塗布しない縁を作った。汚れが付着したシートを（シートの縁に液滴が形成しないように）室温で４時間（最大２４時間）平らに置いて乾燥させた。
【０１６７】
変性剤について、（必要に応じて、固定装置を用いて）これらのシートを３０秒間沸騰している脱イオン水中に置いた。その後、このシートを８０℃で３０分間乾燥させた。乾燥及び／又は冷却の後、シートの重さを量った。重量測定の後、試験に用いる前に、シートを少なくとも２４時間放置した（２０℃、４０乃至６０％の相対湿度）。試験の必要に応じて、（変性後の黄身が）５００±１００ｍｇ／１４０ｃｍ２のシートのスチール板のみを試験に用いた。洗浄試験の後、洗浄試験を行った後、このシートを加熱キャビネット内で８０℃で３０分乾燥させ、重量を量り、再度冷却した。洗浄性能のパーセンテージは洗浄により放出された黄身のｍｇ×１００をスチールに適用して変性された黄身のｍｇで割って計算した。
【０１６８】
磁器プレート上のひき肉
これらの実験について、欧州規格（ＥＮ）５０２４２、フォーム１４９５、Ｎｏ．０２１９、直径１９ｃｍデザートプレート（Ａｒｚｂｅｒｇ， ｗｈｉｔｅ， ｇｌａｚｅｄ ｐｏｒｃｅｌａｉｎ）を用いた。トータル２２５ｇの赤みのブタ及びビーフ（当量の混合物）を目視可能な脂肪を取り除き、細かく刻み、冷却した。この混合物を２回、ひき肉器にかけた。３５℃以上の温度を避けた。その後、この２２５ｇのひき肉を７５ｇのタマゴと混ぜた（黄身と白身の混合物）。調製後、用いる前に３ヶ月間―１８℃で保存した。これらは互換的に使用可能であるので、ブタ肉が使用できない場合、牛肉を用いた。
【０１６９】
ひき肉とタマゴの混合物（３００ｇ）を室温に戻して、８０ｍｌの合成水と混合した。この混合物を家庭用のブレンダーを用いて２分間ホモジナイズした。その後、フォークを用いて、このひき肉／タマゴ／水の混合物の３ｇを各白い磁器プレートに、塗り、約２ｃｍの塗布していない幅広い縁を残しておいた。適用された量は１１．８±０．５ｍｇ／ｃｍ２であった。このプレートを１２０℃で２時間、予備加熱しておいた加熱チャンバー内に置いた。プレートを冷却するとすぐに試験に用いる準備をした。各プレートの間にペーパータオルを挟み、プレートを積み上げた。
【０１７０】
洗浄の後、このプレートにニンヒドリン溶液（１％エタノール）を吹きつけ、ひき肉の残りがよくわかるようにした。呈色反応を促進するために、このプレートを加熱チャンバー内で１０分間８０℃で加熱した。洗浄性能の評価はＩＫＷフォトグラフカタログ（ＩＫＷ）を参照して、ひき肉の呈色反応を目視により評価した。
ステンレススチール上のタマゴ／ミルクの汚れ
【０１７１】
これらの試験に用いたステンレススチール（１０×１５ｃｍ；片面がつや消しされている）を市販の高アルカリ洗剤を用いて実験室用の食器洗浄器で９５℃で洗浄した。このシートをセルロースクロスで磨いた。磨いた面を汚れをつけるまで、触らないでいた。水のシミもホコリもこの面には付着していなかった。汚れをつける前、これらのシートを８０℃の加熱キャビネットで３０分間加熱した。冷却したシートを汚れをつける前に重さを量った。
【０１７２】
黄身と白身（３−４個のタマゴ、１６０ｇ／タマゴ）をボウルの中に置き、泡だて器でかきまぜた。その後、５０ｍｌのセミスキムＵＨＴ（１．５％の脂肪、高温ホモジナイズ）ミルクをこの混合物に加えた。このミルクとタマゴを泡をたてないようにかき混ぜた。平らな刷毛で、ステンレススチールの磨かれた面に、分散を均一にするように、１．０±０．１ｇのタマゴ／ミルク混合物を均一に分散させた。最大値が約１．０ｃｍになるように、シートの短い方に余白を残しておいた。この固形シートを（シートの端に液滴が形成しないように）室温で、４時間（最大約２４時間）平らにおいて乾燥させた。
【０１７３】
このシートをその後、（必要に応じて、固定装置を用いて）沸騰している脱イオン水に３０秒浸した。その後、このシートを再度、８０℃で３０分間乾燥させた。乾燥及び冷却の後、このシートの重量を測定した。重量を測定した後、洗浄試験に用いる前にこのシートを少なくとも２４時間放置した（２０℃、４０−６０％相対湿度）。試験の必要に応じて、１９０±１０ｍｇの黄身を含むシートのみを試験に用いた。
【０１７４】
洗浄試験を行った後、これらのシートを加熱チャンバー内で８０℃で３０分間乾燥させ、冷却の後、重量を測定した。洗浄性能のパーゼンテージは洗浄により放出されたタマゴ／ミルクのｍｇ×１００を適用したタマゴ／ミルクのｍｇで割って計算した。
洗浄装置及び条件
【０１７５】
洗浄試験は、上で説明した汚れを付着させた面及びステンレススチールを入れた食器洗浄器（Ｍｉｅｌｅ：Ｇ６９０ＳＣ）で行った。決められた量の洗剤を用いて、以下の表の結果を得た。試験に用いた温度は、４５℃、５５℃、及び６５℃であった。水の高度は９ｏ又は１２ｏＨＧ（Ｇｅｒｍａｎ Ｈａｒｄｎｅｓｓ）（３７４ｐｐｍ Ｃａ）であった。
【０１７６】
上で説明したように、洗浄後、ひき肉の汚れを付着させたプレートを０−１０にランクわけされた見本を用いて、目視により評価した。０は完全に汚れた皿を意味し、１０はきれいな皿を意味する。これらの値は酵素含有洗浄のシミ又は汚れ除去（ＳＲ）能力に対応する。
【０１７７】
黄身及び／又は黄身とミルクの汚れを付着させた、洗浄したステンレススチールプレートの重さを測定して、洗浄後に残っている汚れの量を決定した。ＰＢ９２変異体プロテアーゼ及び／又はＰＲＯＰＥＲＡＳＥ（商標）プロテアーゼ及び他の変異タンパク質インデックスを洗浄１回当たり、０と２０．７５ｍｇ／活性タンパク質のレベルで試験を行った。
【０１７８】
これらの試験に用いて洗浄で説明する。これらの洗浄は試験に用いて酵素の解析を行うため酵素を含んでいない。
【表３】
【表４】
【０１７９】
各試験の結果を以下の表に示す。これらの結果において、指標は１００である。従って、ＰＲＯＰＥＲＡＳＥ（商標）酵素の結果を「１００」としており、変異体について得られた結果をこれらの値と比較している。例えば、ＰＲＯＰＥＲＡＳＥ（商標）が４５％のＳＲ（これを１００とする）を示し、変異体が５２％のＳＲを示したならば、変異体の結果は５２／４５×１００＝１１６（指標として）となる。
【表５】
【表６】
【表７】
【表８】
【表９】
【表１０】
【０１８０】
本明細書で言及した特許及び刊行物は、本発明が属する技術分野における当業者のレベルを示すために用いる。全ての特許及び刊行物が、特定していること、及び示していることは、それぞれ参照により本明細書に援用される。
【０１８１】
好適な態様をもって本発明を説明してきたが、開示された態様における各種変更を
行う事ができることは、当業者に理解されており、そのような変更は本発明の範囲内である。
【０１８２】
本発明はここに含まれるもののほかに、本発明の目的を実行するための、及び／又は言及された結果及び利益を得るために、適していることは当業者が容易に理解するだろう。本明細書で述べた組成物及び方法は、例示的なものであり、本発明の範囲をこれらの限定することを意図するものではない。
【０１８３】
本明細書に開示されている発明は、本明細書において言及されていない任意の要素、限定がなくても行うことができるだろう。本明細書において用いる用語及び表現は説明のために用いているのであり、限定を付すために用いているのではない。更に、それらの用語及び／又は表現に示されている又は言及されている特徴又はそれらの一部の任意の均等物を排除することを意図するものではない。しかしながら、そのような変更は本発明の範囲内にあることが理解されるであろう。従って、好適な態様及び任意の特徴を開示して本発明を説明しているが、本明細書に開始されているコンセプトの変更及び変法も本発明に包含されることが当業者により理解され、そのような変更及び変法は添付の特許請求の範囲により定義される本発明の範囲内である。
【０１８４】
発明はここに広く、総称的に説明されている。一般的な開示に入っているより狭い種と亜属のグループのそれぞれはまた発明の一部となる。これは、記載されていない事項がここに特に言及されるかどうかを問わず、削除されている条件または除く記載をも発明の一般的な記載に含まれることを意味する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
修飾されたスブチリシンを含む、食器洗浄用組成物であって、
前記スブチリシンが配列番号２で定義する配列において、少なくとも１つの置換を含み、各置換位置はスブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の位置に対応し、これらの置換がＧ１１８、Ｓ１２８、Ｐ１２９、及びＳ１６６の位置から選択される、組成物。
【請求項２】
前記修飾されたスブチリシンがＧ１１８、Ｓ１２８、Ｐ１２９、及びＳ１３０の位置における置換を含む請求項１の組成物。
【請求項３】
前記修飾されたスブチリシンがＧ１１８Ｖと他の１つの追加的な変異を含む請求項１の食器洗浄用組成物。
【請求項４】
前記追加的な変異が、Ｓ１２８Ｆ、Ｓ１２８Ｌ、Ｓ１２８Ｎ、Ｓ１２８Ｒ、Ｓ１２８Ｖ、Ｐ１２９Ｅ、Ｐ１２９Ｌ、Ｐ１２９Ｍ、Ｐ１２９Ｎ、Ｐ１２９Ｌ、Ｐ１２９Ｑ、Ｐ１２９Ｓ、Ｓ１３０Ａ、Ｓ１３０Ｋ、Ｓ１３０Ｐ、Ｓ１３０Ｔ、Ｓ１３０Ｖ、及びＳ１６６Ｄからなる群より選択される請求項３の食器洗浄用組成物。
【請求項５】
前記修飾されたスブチリシンがＳ１２８、Ｐ１２９、及びＳ１３０の置換位置を含む、請求項１の食器洗浄用組成物。
【請求項６】
前記置換がＳ１２８Ｃ、Ｓ１２８Ｒ、Ｐ１２９Ｑ、Ｐ１２９Ｒ，Ｓ１３０Ｄ、及びＳ１３０Ｇから選択される、請求項５の食器洗浄用組成物。
【請求項７】
前記修飾されたスブチリシンのアミノ酸配列が配列番号３で定義される、請求項１の食器洗浄用組成物。
【請求項８】
修飾されたスブチリシンを含む、食器洗浄用組成物であって、
前記スブチリシンが配列番号２で定義する配列において、１つの置換を含み、各置換位置はスブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の位置に対応し、前記置換がＳ１３０Ｔである、食器洗浄用組成物。
【請求項９】
請求項１で定義される修飾されたスブチリシンをコードする単離アミノ酸。
【請求項１０】
請求項９の単離された核酸を含むベクター。
【請求項１１】
請求項１０のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１２】
請求項１で定義される少なくとも１つの修飾されたスブチリシンと食器とを提供する工程、並びに前記食器を洗浄に効果的な条件下で、前記食器を前記修飾されたスブチリシンに接触せる工程とを含む、食器洗浄方法。
【請求項１】
修飾されたスブチリシンを含む、食器洗浄用組成物であって、
前記スブチリシンが配列番号２で定義する配列において、少なくとも１つの置換を含み、各置換位置はスブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の位置に対応し、これらの置換がＧ１１８、Ｓ１２８、Ｐ１２９、及びＳ１６６の位置から選択される、組成物。
【請求項２】
前記修飾されたスブチリシンがＧ１１８、Ｓ１２８、Ｐ１２９、及びＳ１３０の位置における置換を含む請求項１の組成物。
【請求項３】
前記修飾されたスブチリシンがＧ１１８Ｖと他の１つの追加的な変異を含む請求項１の食器洗浄用組成物。
【請求項４】
前記追加的な変異が、Ｓ１２８Ｆ、Ｓ１２８Ｌ、Ｓ１２８Ｎ、Ｓ１２８Ｒ、Ｓ１２８Ｖ、Ｐ１２９Ｅ、Ｐ１２９Ｌ、Ｐ１２９Ｍ、Ｐ１２９Ｎ、Ｐ１２９Ｌ、Ｐ１２９Ｑ、Ｐ１２９Ｓ、Ｓ１３０Ａ、Ｓ１３０Ｋ、Ｓ１３０Ｐ、Ｓ１３０Ｔ、Ｓ１３０Ｖ、及びＳ１６６Ｄからなる群より選択される請求項３の食器洗浄用組成物。
【請求項５】
前記修飾されたスブチリシンがＳ１２８、Ｐ１２９、及びＳ１３０の置換位置を含む、請求項１の食器洗浄用組成物。
【請求項６】
前記置換がＳ１２８Ｃ、Ｓ１２８Ｒ、Ｐ１２９Ｑ、Ｐ１２９Ｒ，Ｓ１３０Ｄ、及びＳ１３０Ｇから選択される、請求項５の食器洗浄用組成物。
【請求項７】
前記修飾されたスブチリシンのアミノ酸配列が配列番号３で定義される、請求項１の食器洗浄用組成物。
【請求項８】
修飾されたスブチリシンを含む、食器洗浄用組成物であって、
前記スブチリシンが配列番号２で定義する配列において、１つの置換を含み、各置換位置はスブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の位置に対応し、前記置換がＳ１３０Ｔである、食器洗浄用組成物。
【請求項９】
請求項１で定義される修飾されたスブチリシンをコードする単離アミノ酸。
【請求項１０】
請求項９の単離された核酸を含むベクター。
【請求項１１】
請求項１０のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１２】
請求項１で定義される少なくとも１つの修飾されたスブチリシンと食器とを提供する工程、並びに前記食器を洗浄に効果的な条件下で、前記食器を前記修飾されたスブチリシンに接触せる工程とを含む、食器洗浄方法。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【公表番号】特表２００９−５４３５７７（Ｐ２００９−５４３５７７Ａ）
【公表日】平成２１年１２月１０日（２００９．１２．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５２０７５４（Ｐ２００９−５２０７５４）
【出願日】平成１９年７月９日（２００７．７．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０１５６４２
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０１０９２５
【国際公開日】平成２０年１月２４日（２００８．１．２４）
【出願人】（５０８３７７０１５）ダニスコ・ユーエス・インク、ジェネンコー・ディビジョン (31)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年１２月１０日（２００９．１２．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年７月９日（２００７．７．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０１５６４２
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０１０９２５
【国際公開日】平成２０年１月２４日（２００８．１．２４）
【出願人】（５０８３７７０１５）ダニスコ・ユーエス・インク、ジェネンコー・ディビジョン (31)
【Ｆターム（参考）】
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