微粒子検出装置
【課題】使用環境の変化や励起光源の劣化等の影響を受けることなく、所望微粒子の検出を安定的に実施することができる微粒子検出装置を提供すること。
【解決手段】微粒子を含む試料を蛍光染色するとともに、泳動液を用いて微細管電気泳動することにより微粒子を検出する微粒子検出装置において、蛍光染色された微粒子に対する励起光としてパルス発光するＬＥＤ等の励起光発光器２と、パルス発光に同期する蛍光発光を計測する蛍光検出器５と、蛍光検出器５にて測定した蛍光光束量に基づいて、励起光発光器２の光束量を調整する光束量調整手段とを備える。
【解決手段】微粒子を含む試料を蛍光染色するとともに、泳動液を用いて微細管電気泳動することにより微粒子を検出する微粒子検出装置において、蛍光染色された微粒子に対する励起光としてパルス発光するＬＥＤ等の励起光発光器２と、パルス発光に同期する蛍光発光を計測する蛍光検出器５と、蛍光検出器５にて測定した蛍光光束量に基づいて、励起光発光器２の光束量を調整する光束量調整手段とを備える。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微細管電気泳動を用いて、検体試料中に存在する細胞等の各種微粒子を検出する微粒子検出装置に関し、特に人体に有害なレジオネラ属菌等の微生物を迅速かつ高感度に分離検出することができる微粒子検出装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、試料中に細胞等の各種微粒子が存在するか否かを調べたり、また試料中に含まれる微生物の種類や量を迅速に調べるための分離・検出手法として、微細管内で予め蛍光染色した微生物を電気泳動させ、励起光を照射してその時発生する蛍光から検出する電気泳動技術が提案されている（例えば、特許文献１参照）。
【０００３】
一方、微細管内で微生物を泳動分離する際には、微生物細胞と細管内壁、あるいは細胞と細胞との相互作用が大きいため、迅速かつ高感度に微細管内で微生物を分離するために、泳動液にアルギン酸塩を含有させることが有効であることが知られている（例えば、特許文献２参照）。
この方法において、微生物の分離効率を向上させる添加剤として用いられるアルギン酸塩は、すべての微生物に対して同様に機能するものではなく、多種多様な微生物種に対応できるより多くのタイプの分離効率向上剤の導入が期待されている。
しかしながら、上記従来の微粒子検出装置では、励起光を常時点灯としているため、励起光や蛍光発光以外の光が蛍光検出装置に入らないように、計測部分を周囲の光から隔離する必要があった。
【０００４】
また、蛍光発光は励起光に対し一般的に少なく、周囲の光に対し十分な蛍光発光の光束が得られるように、励起光源を高輝度（高発光）のものを使用する必要があった。
例えば、励起光源として安価なＬＥＤ等を使用した場合、高輝度で常時点灯させると発熱が大きくなり、また寿命が短くなる等の問題があった。
したがって、従来の微粒子検出装置では、励起光源の劣化による光束量の低下等があるため、励起光源の光束量調整や、励起光源の光束量変動にともなう蛍光検出器における受光感度調整等が必要であった。
【特許文献１】特開２００２−３４５４５１号公報
【特許文献２】特開２００２−１８１７８１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、上記従来の微粒子検出装置が有する問題点に鑑み、使用環境の変化や励起光源の劣化等の影響を受けることなく、所望微粒子の検出を安定的に実施することができる微粒子検出装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成するため、本発明の微粒子検出装置は、微粒子を含む試料を蛍光染色し、泳動液を用いて微細管電気泳動することにより微粒子を検出する微粒子検出装置において、蛍光染色の励起光として間欠的に発光する励起光発光器と、励起光発光に同期して蛍光を計測する蛍光検出器とを備えたことを特徴とする。
【０００７】
この場合において、蛍光検出器にて測定した蛍光光束量に基づいて、励起光発光器の光束量を調整する光束量調整手段を備えることができる。
【０００８】
また、光束量調整手段が、蛍光検出器にて測定した励起光発光器の点灯時と不点灯時の差に基づいて、励起光発光器の光束量を調整するようにすることができる。
【０００９】
また、蛍光検出器にて測定した蛍光光束量に基づいて、励起光発光器のＯＮ、ＯＦＦ時間比率を調整するパルス幅調整手段を備えることができる。
【００１０】
また、パルス幅調整手段が、蛍光検出器にて測定した励起光発光器の点灯時と不点灯時の差に基づいて、励起光発光器のＯＮ、ＯＦＦ時間比率を調整することができる。
【００１１】
さらに、励起光発光器における励起光源として、間欠的に発光するＬＥＤを使用することができる。
【００１２】
また、検出対象物である微粒子が微生物、例えば、レジオネラ属菌等の人体に有害な微生物とすることができる。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の微粒子検出装置によれば、微粒子を含む試料を蛍光染色し、泳動液を用いて微細管電気泳動することにより微粒子を検出する微粒子検出装置において、蛍光染色の励起光として間欠的に発光する励起光発光器と、励起光発光に同期して蛍光を計測する蛍光検出器とを備えることにより、励起光や蛍光発光以外の周囲の光及びパルス発光する励起光発光器の劣化等の影響を受けることなく、安定的に所望微粒子の検出を実施することができる。
【００１４】
また、蛍光検出器にて測定した蛍光光束量に基づいて、励起光発光器の光束量を調整する光束量調整手段を備えることにより、パルス発光する励起光発光器の光束量を常時発光時の１０〜３００％程度に可変調整し、分析に適当な励起光の光束量とすることができ、これにより、一層安定的に所望微粒子の検出を実施することができる。
【００１５】
また、光束量調整手段が、蛍光検出器にて測定した励起光発光器の点灯時と不点灯時の差に基づいて励起光発光器の光束量を調整することにより、光束を前もって調整する光束調整期間を不要にすることができる。
【００１６】
また、蛍光検出器にて測定した蛍光光束量に基づいて、励起光発光器のＯＮ、ＯＦＦ時間比率を調整するパルス幅調整手段を備えることにより、パルス発光する励起光発光器のパルス幅を可変調整し、分析に適当な励起光のパルス幅とすることができ、これにより、一層安定的に所望微粒子の検出を実施することができる。
【００１７】
また、パルス幅調整手段が、蛍光検出器にて測定した励起光発光器の点灯時と不点灯時の差に基づいて、励起光発光器のＯＮ、ＯＦＦ時間比率を調整することにより、光束を前もって調整する光束調整期間を不要にすることができる。
【００１８】
また、励起光発光器における励起光源として、間欠的に発光するＬＥＤを使用することにより、安価な装置を実現することができる。
【００１９】
また、検出対象物である微粒子が微生物、例えば、レジオネラ属菌等の人体に有害な微生物とすることにより、微生物、例えば、温泉やプール等で生息し易いレジオネラ属菌等の人体に有害な微生物の検出を行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下、本発明の微粒子検出装置の実施の形態を、図面に基づいて説明する。
なお、本発明でいう分析とは、試料中に含まれる所望微粒子の濃縮、分離、検出（定性的分析）、同定、定量、スクリーニング、生死判別を包含するものである。
【実施例１】
【００２１】
図１に、本発明の微粒子検出装置の基本的構成を一例として示す。
図において、１は電気泳動装置本体であり、ＬＥＤやレーザー等の励起光発光器２、対物レンズ４、ＣＣＤカメラ等の蛍光検出器５等から構成されている。
【００２２】
検出対象物である有害菌等の微粒子は、予め当該微粒子とのみ選択的に結合する蛍光抗体等を用いて蛍光染色しておき、例えば、キャピラリー等の微細管６の内部に、その両端に設置した溶液９ａ又は溶液９ｂより注入するようにする。
溶液９ａ又は溶液９ｂを検出の段階に応じて変更し、電極７ａ、７ｂにより微細管６の両端に高圧電源を印加する。高電圧は高圧電源７より供給し、その電圧の大きさ、印加時間等は、例えば、パソコン等の微粒子検出制御装置８より制御する。
なお、蛍光検出器５としては、上記のようなＣＣＤカメラ等の画像入力装置のほかに、光電子倍増管（フォトマル）等の光束量センサを用いることができる。
【００２３】
励起光２ａは、励起光発光器２から発した光であり、微細管６の検出窓６ａより、蛍光染色された微粒子に照射される。
ここで、励起光発光器２の発光電力は、励起光発光器２用のパルス発生器２ｃより供給し、その電流やパルス間隔等は、微粒子検出制御装置８により制御する。
蛍光染色された微粒子は、蛍光２ｂを発光し、対物レンズ４より装置本体内に入射し、例えば、ＣＣＤカメラ等で構成される蛍光検出器５によりパルス発生器２ｃと同期して検出される。
蛍光検出器５により検出した検出画像信号は、画像信号記録装置５ａに記録されるととともに、微粒子検出制御装置８に接続される。微粒子検出制御装置８では、この画像信号から微粒子の検出を行い、その結果を記録し表示する。
【００２４】
検出対象としての微粒子を含む試料である検水溶液を、例えば、溶液９ａとして準備し、溶液９ｂの側から吸引することにより、微細管６内に対象とする検水溶液２０として注入する。
次に、電極７ａ、７ｂはそれぞれ高圧電源７に接続されており、微粒子検出制御装置８により、例えば、電極７ａには陽極、電極７ｂには陰極の電圧を印加するように接続する。
次いで、高圧電源７を作動させることにより、既知の電気泳動技術により、微粒子を微粒子塊２５として濃縮し、さらには陰極の方向２２に泳動させることができる。
【００２５】
このとき、微粒子塊２５は、検出窓６ａを通過する。
この微粒子塊２５は、蛍光抗体等を用いて蛍光染色されており、図１で示したように、励起光２ａが照射されると、蛍光２ｂを発光するため、ＣＣＤカメラ等で構成される蛍光検出器５により微粒子を検出することができる。
【００２６】
微細管６内への検体試料の注入方法は、特に制限されず、従来使用される重力法、加圧法及び減圧法のいずれをも使用することができる。
注入量も特に制限されないが、通常用いる微細管全域に試料を満たすため、その微細管のサイズに依存し、０．１〜１００μＬ、好ましくは０．５〜１００μＬ、より好ましくは０．５〜１０μＬを例示することができる。
【００２７】
また、上記で例示した一対の電極７ａ、７ｂ及び高圧電源７は、微細管内に注入された微粒子が微細管内の泳動液中を泳動するのに必要な強さの電位勾配を、微細管中の泳動液に対して印加するための手段であり、かかる目的が達成できるものであれば、これらの電源及び一対の電極は何ら限定されることなく、その他の手段として任意の手段を使用することができる。
【００２８】
電極間にかけられる電圧としては、微細管長さに対して、一般に約１ｋＶ／ｍ〜約５００ｋＶ／ｍ、好ましくは約２ｋＶ／ｍ〜約１００ｋＶ／ｍ、より好ましくは約５ｋＶ／ｍ〜約２０ｋＶ／ｍを例示することができる。
微細管としては、内径１〜１５０μｍ、長さ０．１〜１００ｃｍ、好ましくは内径２０〜１００μｍ、長さ１〜５０ｃｍの中空管を例示することができる。
その材質としては特に制限されず、ガラス（フューズドシリカ）やフッ素樹脂等を任意に例示することができる。
【００２９】
図２は、検出対象とする微粒子２１としての微生物を拡大して示したもので、その外壁２１ａに選択的に結合する抗体３０、抗体３０を蛍光標識した蛍光色素３１等を示している。
なお、図示しないが、検出対象である微粒子２１に結合している抗体及び蛍光色素３１以外に、微粒子に結合しないままに溶液中を浮遊している抗体及び蛍光色素からも蛍光２ｂが発せられるが、泳動時間が検出対象微粒子とは異なるので、時間経過を見ることにより分離することが可能である。
【００３０】
図３に、図１に示す励起光発光器２の光束量とパルス幅、及び蛍光検出器５の検出フローの一例を示す。
励起光発光器２がＯＮ時の蛍光検出器５の蛍光光束量を測定する。
測定した蛍光光束量が予め決められた下限値以下であった場合、微粒子検出制御装置８が光束量調整手段及びパルス幅調整手段として、励起光束量を増大し、必要に応じてパルス幅を減少させる制御を行い、また、蛍光光束量が予め決められた上限値以上であった場合、励起光束量を減少し、必要に応じてパルス幅を増加させる制御を行い、適切な励起光発光量とする。
また、励起光にＬＥＤ等の半導体を利用した場合、常時点灯に比較して発熱量が押さえられるので、パルス点灯により励起光束量を増大することにより、常時点灯時の３００％程度までの光束出力が可能となることが一般的に知られており、パルス点灯を利用することにより、励起光の光束量を１０〜３００％と可変調整することができる。
【００３１】
図４に、図１に示す励起光発光器２の光束量とパルス幅、及び蛍光検出器５の検出フローの他の例を示す。
励起光発光器２がＯＦＦ時の蛍光検出器５の蛍光光束量を測定する。
また、励起光発光器２より適当な光束量とパルス幅を持つ励起光のＯＮ時に合わせて蛍光検出器５の蛍光光束量を測定し、前述の励起光ＯＮ、ＯＦＦ時の蛍光光束量の差から、次の励起光の光束量の大きさ、及び／又はパルス幅を制御し適切な励起光発光量とする。すなわち、励起光ＯＮ、ＯＦＦ時の蛍光光束量の差がいつも有意差となり、かつ励起光ＯＮ時の蛍光光束量の値が下限値から上限値の間の値となるように励起光束量の大きさ、及び／又はパルス幅を制御する。
このフローを用いれば、図３のフローと比べ、一定時間内に微粒子検出サイクルが長くなるが、図３に示した光束調整期間が不要となる。
【００３２】
図５は、前記した対象微粒子の検出過程をフロー図で示したものである。
まず、検体溶液を微細管に注入し（ステップ３２）、励起光の光束量調整（図３の光量調整期間）である光量調整を実施し（ステップ３３）、微粒子を電気泳動し、微粒子塊（濃縮）する（ステップ３４）。
次に、検出窓まで微粒子塊を電気泳動（微粒子塊の泳動）し（ステップ３５）、ＣＣＤカメラ等で微粒子検出する（ステップ３６）。
以上の過程で対象微粒子を検出する。
なお、図４の励起光調整方法の場合、ステップ３３の光量調整の工程は行わない。
【００３３】
かくして、本実施例の微粒子検出装置によれば、微粒子を含む試料を蛍光染色し、泳動液を用いて微細管電気泳動することにより微粒子を検出する微粒子検出装置において、蛍光染色の励起光として間欠的に発光する励起光発光器２と、励起光発光に同期して蛍光を計測する蛍光検出器５とを備えることにより、励起光や蛍光発光以外の周囲の光及びパルス発光する励起光発光器の劣化等の影響を受けることなく、安定的に所望微粒子の検出を実施することができる。
【００３４】
また、蛍光検出器５にて測定した蛍光光束量に基づいて、励起光発光器２の光束量を調整する光束量調整手段を備えることにより、パルス発光する励起光発光器の光束量を常時発光時の１０〜３００％程度に可変調整し、分析に適当な励起光の光束量とすることができ、これにより、一層安定的に所望微粒子の検出を実施することができる。
【００３５】
また、光束量調整手段が、蛍光検出器５にて測定した励起光発光器の点灯時と不点灯時の差に基づいて励起光発光器２の光束量を調整することにより、光束を前もって調整する光束調整期間を不要にすることができる。
【００３６】
また、蛍光検出器５にて測定した蛍光光束量に基づいて、励起光発光器のＯＮ、ＯＦＦ時間比率を調整するパルス幅調整手段を備えることにより、パルス発光する励起光発光器のパルス幅を可変調整し、分析に適当な励起光のパルス幅とすることができ、これにより、一層安定的に所望微粒子の検出を実施することができる。
【００３７】
また、パルス幅調整手段が、蛍光検出器５にて測定した励起光発光器２の点灯時と不点灯時の差に基づいて、励起光発光器２のＯＮ、ＯＦＦ時間比率を調整することにより、光束を前もって調整する光束調整期間を不要にすることができる。
【００３８】
また、励起光発光器２における励起光源として、間欠的に発光するＬＥＤを使用することにより、安価な装置を実現することができる。
【００３９】
また、励起光発光器２における励起光源として、安価なＬＥＤ又はレーザー発光器等を利用することにより、所望の微粒子を高感度かつ特異的に検出することができ、また、試料を培養する等の増殖処理を施すことなく、微量の微粒子を精度よく分離検出することができ、試料中に存在する菌体数を判別測定（定量検出）することも可能である。
さらに、本実施例の装置によれば、試料中の微粒子の検出が可能であるだけでなく、種々の微粒子に特有の特異的検出試薬（例えば、抗体等）を使用することにより菌種の同定も可能である。
【００４０】
そして、この微粒子検出装置は、検出対象物である微粒子として、微生物、例えば、レジオネラ属菌等の人体に有害な微生物とすることにより、微生物、例えば、温泉やプール等で生息し易いレジオネラ属菌等の人体に有害な微生物の検出（定性検出、定量検出）を行うのに適しているため、病原性微生物によって汚染された環境水や食品が早期に排除でき、病気の発生の防止に有用である。
また、病原性微生物による患者の早期診断が可能になることから、有害微生物による被害の蔓延防止並びに早期治療の一助となる。さらには、食品の品質管理期間が短縮でき、また衛生管理の厳格性から賞味期間も延長可能であり、食品流通の経済性に大きく貢献することができる効果がある。
【００４１】
以上、本発明の微粒子検出装置に関して、その実施例に基づいて説明したが、本発明は上記実施例に記載した構成に限定されるものではなく、その趣旨を逸脱しない範囲において適宜その構成を変更することができる。
【産業上の利用可能性】
【００４２】
本発明の微粒子検出装置は、各種微粒子を迅速かつ高感度に分離検出するという特性を有していることから、例えば、環境、食品及び医療分野等において、検体試料中の微粒子量を精度よく又は一斉分析する用途に好適に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】本発明の微粒子検出装置の一実施例を示す概略構成図である。
【図２】微粒子の詳細を示す拡大図である。
【図３】励起光の光束調整動作の実施例を示すフロー図である。
【図４】励起光の光束調整動作の他の実施例を示すフロー図である。
【図５】微粒子を検出する動作フロー図である。
【符号の説明】
【００４４】
１ 電気泳動装置本体
２ 励起光発光器
２ａ 励起光線
２ｂ 蛍光
２ｃ パルス発生器
４ 対物レンズ
５ 蛍光検出器
５ａ 画像信号記録装置
６ 微細管
６ａ 検出窓
７ 高圧電源
７ａ 電極
７ｂ 電極
８ 微粒子検出制御装置
９ａ 溶液
９ｂ 溶液
２０ 検水溶液
２１ 微粒子
２１ａ 微粒子の外壁
２５ 微粒子塊
３０ 抗体
３１ 蛍光色素
３２ 検体溶液の注入
３３ 光束調整（光束調整期間）
３４ 電気泳動（濃縮）
３５ 電気泳動（微粒子塊の移動）
３６ 微粒子検出
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微細管電気泳動を用いて、検体試料中に存在する細胞等の各種微粒子を検出する微粒子検出装置に関し、特に人体に有害なレジオネラ属菌等の微生物を迅速かつ高感度に分離検出することができる微粒子検出装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、試料中に細胞等の各種微粒子が存在するか否かを調べたり、また試料中に含まれる微生物の種類や量を迅速に調べるための分離・検出手法として、微細管内で予め蛍光染色した微生物を電気泳動させ、励起光を照射してその時発生する蛍光から検出する電気泳動技術が提案されている（例えば、特許文献１参照）。
【０００３】
一方、微細管内で微生物を泳動分離する際には、微生物細胞と細管内壁、あるいは細胞と細胞との相互作用が大きいため、迅速かつ高感度に微細管内で微生物を分離するために、泳動液にアルギン酸塩を含有させることが有効であることが知られている（例えば、特許文献２参照）。
この方法において、微生物の分離効率を向上させる添加剤として用いられるアルギン酸塩は、すべての微生物に対して同様に機能するものではなく、多種多様な微生物種に対応できるより多くのタイプの分離効率向上剤の導入が期待されている。
しかしながら、上記従来の微粒子検出装置では、励起光を常時点灯としているため、励起光や蛍光発光以外の光が蛍光検出装置に入らないように、計測部分を周囲の光から隔離する必要があった。
【０００４】
また、蛍光発光は励起光に対し一般的に少なく、周囲の光に対し十分な蛍光発光の光束が得られるように、励起光源を高輝度（高発光）のものを使用する必要があった。
例えば、励起光源として安価なＬＥＤ等を使用した場合、高輝度で常時点灯させると発熱が大きくなり、また寿命が短くなる等の問題があった。
したがって、従来の微粒子検出装置では、励起光源の劣化による光束量の低下等があるため、励起光源の光束量調整や、励起光源の光束量変動にともなう蛍光検出器における受光感度調整等が必要であった。
【特許文献１】特開２００２−３４５４５１号公報
【特許文献２】特開２００２−１８１７８１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、上記従来の微粒子検出装置が有する問題点に鑑み、使用環境の変化や励起光源の劣化等の影響を受けることなく、所望微粒子の検出を安定的に実施することができる微粒子検出装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成するため、本発明の微粒子検出装置は、微粒子を含む試料を蛍光染色し、泳動液を用いて微細管電気泳動することにより微粒子を検出する微粒子検出装置において、蛍光染色の励起光として間欠的に発光する励起光発光器と、励起光発光に同期して蛍光を計測する蛍光検出器とを備えたことを特徴とする。
【０００７】
この場合において、蛍光検出器にて測定した蛍光光束量に基づいて、励起光発光器の光束量を調整する光束量調整手段を備えることができる。
【０００８】
また、光束量調整手段が、蛍光検出器にて測定した励起光発光器の点灯時と不点灯時の差に基づいて、励起光発光器の光束量を調整するようにすることができる。
【０００９】
また、蛍光検出器にて測定した蛍光光束量に基づいて、励起光発光器のＯＮ、ＯＦＦ時間比率を調整するパルス幅調整手段を備えることができる。
【００１０】
また、パルス幅調整手段が、蛍光検出器にて測定した励起光発光器の点灯時と不点灯時の差に基づいて、励起光発光器のＯＮ、ＯＦＦ時間比率を調整することができる。
【００１１】
さらに、励起光発光器における励起光源として、間欠的に発光するＬＥＤを使用することができる。
【００１２】
また、検出対象物である微粒子が微生物、例えば、レジオネラ属菌等の人体に有害な微生物とすることができる。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の微粒子検出装置によれば、微粒子を含む試料を蛍光染色し、泳動液を用いて微細管電気泳動することにより微粒子を検出する微粒子検出装置において、蛍光染色の励起光として間欠的に発光する励起光発光器と、励起光発光に同期して蛍光を計測する蛍光検出器とを備えることにより、励起光や蛍光発光以外の周囲の光及びパルス発光する励起光発光器の劣化等の影響を受けることなく、安定的に所望微粒子の検出を実施することができる。
【００１４】
また、蛍光検出器にて測定した蛍光光束量に基づいて、励起光発光器の光束量を調整する光束量調整手段を備えることにより、パルス発光する励起光発光器の光束量を常時発光時の１０〜３００％程度に可変調整し、分析に適当な励起光の光束量とすることができ、これにより、一層安定的に所望微粒子の検出を実施することができる。
【００１５】
また、光束量調整手段が、蛍光検出器にて測定した励起光発光器の点灯時と不点灯時の差に基づいて励起光発光器の光束量を調整することにより、光束を前もって調整する光束調整期間を不要にすることができる。
【００１６】
また、蛍光検出器にて測定した蛍光光束量に基づいて、励起光発光器のＯＮ、ＯＦＦ時間比率を調整するパルス幅調整手段を備えることにより、パルス発光する励起光発光器のパルス幅を可変調整し、分析に適当な励起光のパルス幅とすることができ、これにより、一層安定的に所望微粒子の検出を実施することができる。
【００１７】
また、パルス幅調整手段が、蛍光検出器にて測定した励起光発光器の点灯時と不点灯時の差に基づいて、励起光発光器のＯＮ、ＯＦＦ時間比率を調整することにより、光束を前もって調整する光束調整期間を不要にすることができる。
【００１８】
また、励起光発光器における励起光源として、間欠的に発光するＬＥＤを使用することにより、安価な装置を実現することができる。
【００１９】
また、検出対象物である微粒子が微生物、例えば、レジオネラ属菌等の人体に有害な微生物とすることにより、微生物、例えば、温泉やプール等で生息し易いレジオネラ属菌等の人体に有害な微生物の検出を行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下、本発明の微粒子検出装置の実施の形態を、図面に基づいて説明する。
なお、本発明でいう分析とは、試料中に含まれる所望微粒子の濃縮、分離、検出（定性的分析）、同定、定量、スクリーニング、生死判別を包含するものである。
【実施例１】
【００２１】
図１に、本発明の微粒子検出装置の基本的構成を一例として示す。
図において、１は電気泳動装置本体であり、ＬＥＤやレーザー等の励起光発光器２、対物レンズ４、ＣＣＤカメラ等の蛍光検出器５等から構成されている。
【００２２】
検出対象物である有害菌等の微粒子は、予め当該微粒子とのみ選択的に結合する蛍光抗体等を用いて蛍光染色しておき、例えば、キャピラリー等の微細管６の内部に、その両端に設置した溶液９ａ又は溶液９ｂより注入するようにする。
溶液９ａ又は溶液９ｂを検出の段階に応じて変更し、電極７ａ、７ｂにより微細管６の両端に高圧電源を印加する。高電圧は高圧電源７より供給し、その電圧の大きさ、印加時間等は、例えば、パソコン等の微粒子検出制御装置８より制御する。
なお、蛍光検出器５としては、上記のようなＣＣＤカメラ等の画像入力装置のほかに、光電子倍増管（フォトマル）等の光束量センサを用いることができる。
【００２３】
励起光２ａは、励起光発光器２から発した光であり、微細管６の検出窓６ａより、蛍光染色された微粒子に照射される。
ここで、励起光発光器２の発光電力は、励起光発光器２用のパルス発生器２ｃより供給し、その電流やパルス間隔等は、微粒子検出制御装置８により制御する。
蛍光染色された微粒子は、蛍光２ｂを発光し、対物レンズ４より装置本体内に入射し、例えば、ＣＣＤカメラ等で構成される蛍光検出器５によりパルス発生器２ｃと同期して検出される。
蛍光検出器５により検出した検出画像信号は、画像信号記録装置５ａに記録されるととともに、微粒子検出制御装置８に接続される。微粒子検出制御装置８では、この画像信号から微粒子の検出を行い、その結果を記録し表示する。
【００２４】
検出対象としての微粒子を含む試料である検水溶液を、例えば、溶液９ａとして準備し、溶液９ｂの側から吸引することにより、微細管６内に対象とする検水溶液２０として注入する。
次に、電極７ａ、７ｂはそれぞれ高圧電源７に接続されており、微粒子検出制御装置８により、例えば、電極７ａには陽極、電極７ｂには陰極の電圧を印加するように接続する。
次いで、高圧電源７を作動させることにより、既知の電気泳動技術により、微粒子を微粒子塊２５として濃縮し、さらには陰極の方向２２に泳動させることができる。
【００２５】
このとき、微粒子塊２５は、検出窓６ａを通過する。
この微粒子塊２５は、蛍光抗体等を用いて蛍光染色されており、図１で示したように、励起光２ａが照射されると、蛍光２ｂを発光するため、ＣＣＤカメラ等で構成される蛍光検出器５により微粒子を検出することができる。
【００２６】
微細管６内への検体試料の注入方法は、特に制限されず、従来使用される重力法、加圧法及び減圧法のいずれをも使用することができる。
注入量も特に制限されないが、通常用いる微細管全域に試料を満たすため、その微細管のサイズに依存し、０．１〜１００μＬ、好ましくは０．５〜１００μＬ、より好ましくは０．５〜１０μＬを例示することができる。
【００２７】
また、上記で例示した一対の電極７ａ、７ｂ及び高圧電源７は、微細管内に注入された微粒子が微細管内の泳動液中を泳動するのに必要な強さの電位勾配を、微細管中の泳動液に対して印加するための手段であり、かかる目的が達成できるものであれば、これらの電源及び一対の電極は何ら限定されることなく、その他の手段として任意の手段を使用することができる。
【００２８】
電極間にかけられる電圧としては、微細管長さに対して、一般に約１ｋＶ／ｍ〜約５００ｋＶ／ｍ、好ましくは約２ｋＶ／ｍ〜約１００ｋＶ／ｍ、より好ましくは約５ｋＶ／ｍ〜約２０ｋＶ／ｍを例示することができる。
微細管としては、内径１〜１５０μｍ、長さ０．１〜１００ｃｍ、好ましくは内径２０〜１００μｍ、長さ１〜５０ｃｍの中空管を例示することができる。
その材質としては特に制限されず、ガラス（フューズドシリカ）やフッ素樹脂等を任意に例示することができる。
【００２９】
図２は、検出対象とする微粒子２１としての微生物を拡大して示したもので、その外壁２１ａに選択的に結合する抗体３０、抗体３０を蛍光標識した蛍光色素３１等を示している。
なお、図示しないが、検出対象である微粒子２１に結合している抗体及び蛍光色素３１以外に、微粒子に結合しないままに溶液中を浮遊している抗体及び蛍光色素からも蛍光２ｂが発せられるが、泳動時間が検出対象微粒子とは異なるので、時間経過を見ることにより分離することが可能である。
【００３０】
図３に、図１に示す励起光発光器２の光束量とパルス幅、及び蛍光検出器５の検出フローの一例を示す。
励起光発光器２がＯＮ時の蛍光検出器５の蛍光光束量を測定する。
測定した蛍光光束量が予め決められた下限値以下であった場合、微粒子検出制御装置８が光束量調整手段及びパルス幅調整手段として、励起光束量を増大し、必要に応じてパルス幅を減少させる制御を行い、また、蛍光光束量が予め決められた上限値以上であった場合、励起光束量を減少し、必要に応じてパルス幅を増加させる制御を行い、適切な励起光発光量とする。
また、励起光にＬＥＤ等の半導体を利用した場合、常時点灯に比較して発熱量が押さえられるので、パルス点灯により励起光束量を増大することにより、常時点灯時の３００％程度までの光束出力が可能となることが一般的に知られており、パルス点灯を利用することにより、励起光の光束量を１０〜３００％と可変調整することができる。
【００３１】
図４に、図１に示す励起光発光器２の光束量とパルス幅、及び蛍光検出器５の検出フローの他の例を示す。
励起光発光器２がＯＦＦ時の蛍光検出器５の蛍光光束量を測定する。
また、励起光発光器２より適当な光束量とパルス幅を持つ励起光のＯＮ時に合わせて蛍光検出器５の蛍光光束量を測定し、前述の励起光ＯＮ、ＯＦＦ時の蛍光光束量の差から、次の励起光の光束量の大きさ、及び／又はパルス幅を制御し適切な励起光発光量とする。すなわち、励起光ＯＮ、ＯＦＦ時の蛍光光束量の差がいつも有意差となり、かつ励起光ＯＮ時の蛍光光束量の値が下限値から上限値の間の値となるように励起光束量の大きさ、及び／又はパルス幅を制御する。
このフローを用いれば、図３のフローと比べ、一定時間内に微粒子検出サイクルが長くなるが、図３に示した光束調整期間が不要となる。
【００３２】
図５は、前記した対象微粒子の検出過程をフロー図で示したものである。
まず、検体溶液を微細管に注入し（ステップ３２）、励起光の光束量調整（図３の光量調整期間）である光量調整を実施し（ステップ３３）、微粒子を電気泳動し、微粒子塊（濃縮）する（ステップ３４）。
次に、検出窓まで微粒子塊を電気泳動（微粒子塊の泳動）し（ステップ３５）、ＣＣＤカメラ等で微粒子検出する（ステップ３６）。
以上の過程で対象微粒子を検出する。
なお、図４の励起光調整方法の場合、ステップ３３の光量調整の工程は行わない。
【００３３】
かくして、本実施例の微粒子検出装置によれば、微粒子を含む試料を蛍光染色し、泳動液を用いて微細管電気泳動することにより微粒子を検出する微粒子検出装置において、蛍光染色の励起光として間欠的に発光する励起光発光器２と、励起光発光に同期して蛍光を計測する蛍光検出器５とを備えることにより、励起光や蛍光発光以外の周囲の光及びパルス発光する励起光発光器の劣化等の影響を受けることなく、安定的に所望微粒子の検出を実施することができる。
【００３４】
また、蛍光検出器５にて測定した蛍光光束量に基づいて、励起光発光器２の光束量を調整する光束量調整手段を備えることにより、パルス発光する励起光発光器の光束量を常時発光時の１０〜３００％程度に可変調整し、分析に適当な励起光の光束量とすることができ、これにより、一層安定的に所望微粒子の検出を実施することができる。
【００３５】
また、光束量調整手段が、蛍光検出器５にて測定した励起光発光器の点灯時と不点灯時の差に基づいて励起光発光器２の光束量を調整することにより、光束を前もって調整する光束調整期間を不要にすることができる。
【００３６】
また、蛍光検出器５にて測定した蛍光光束量に基づいて、励起光発光器のＯＮ、ＯＦＦ時間比率を調整するパルス幅調整手段を備えることにより、パルス発光する励起光発光器のパルス幅を可変調整し、分析に適当な励起光のパルス幅とすることができ、これにより、一層安定的に所望微粒子の検出を実施することができる。
【００３７】
また、パルス幅調整手段が、蛍光検出器５にて測定した励起光発光器２の点灯時と不点灯時の差に基づいて、励起光発光器２のＯＮ、ＯＦＦ時間比率を調整することにより、光束を前もって調整する光束調整期間を不要にすることができる。
【００３８】
また、励起光発光器２における励起光源として、間欠的に発光するＬＥＤを使用することにより、安価な装置を実現することができる。
【００３９】
また、励起光発光器２における励起光源として、安価なＬＥＤ又はレーザー発光器等を利用することにより、所望の微粒子を高感度かつ特異的に検出することができ、また、試料を培養する等の増殖処理を施すことなく、微量の微粒子を精度よく分離検出することができ、試料中に存在する菌体数を判別測定（定量検出）することも可能である。
さらに、本実施例の装置によれば、試料中の微粒子の検出が可能であるだけでなく、種々の微粒子に特有の特異的検出試薬（例えば、抗体等）を使用することにより菌種の同定も可能である。
【００４０】
そして、この微粒子検出装置は、検出対象物である微粒子として、微生物、例えば、レジオネラ属菌等の人体に有害な微生物とすることにより、微生物、例えば、温泉やプール等で生息し易いレジオネラ属菌等の人体に有害な微生物の検出（定性検出、定量検出）を行うのに適しているため、病原性微生物によって汚染された環境水や食品が早期に排除でき、病気の発生の防止に有用である。
また、病原性微生物による患者の早期診断が可能になることから、有害微生物による被害の蔓延防止並びに早期治療の一助となる。さらには、食品の品質管理期間が短縮でき、また衛生管理の厳格性から賞味期間も延長可能であり、食品流通の経済性に大きく貢献することができる効果がある。
【００４１】
以上、本発明の微粒子検出装置に関して、その実施例に基づいて説明したが、本発明は上記実施例に記載した構成に限定されるものではなく、その趣旨を逸脱しない範囲において適宜その構成を変更することができる。
【産業上の利用可能性】
【００４２】
本発明の微粒子検出装置は、各種微粒子を迅速かつ高感度に分離検出するという特性を有していることから、例えば、環境、食品及び医療分野等において、検体試料中の微粒子量を精度よく又は一斉分析する用途に好適に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】本発明の微粒子検出装置の一実施例を示す概略構成図である。
【図２】微粒子の詳細を示す拡大図である。
【図３】励起光の光束調整動作の実施例を示すフロー図である。
【図４】励起光の光束調整動作の他の実施例を示すフロー図である。
【図５】微粒子を検出する動作フロー図である。
【符号の説明】
【００４４】
１ 電気泳動装置本体
２ 励起光発光器
２ａ 励起光線
２ｂ 蛍光
２ｃ パルス発生器
４ 対物レンズ
５ 蛍光検出器
５ａ 画像信号記録装置
６ 微細管
６ａ 検出窓
７ 高圧電源
７ａ 電極
７ｂ 電極
８ 微粒子検出制御装置
９ａ 溶液
９ｂ 溶液
２０ 検水溶液
２１ 微粒子
２１ａ 微粒子の外壁
２５ 微粒子塊
３０ 抗体
３１ 蛍光色素
３２ 検体溶液の注入
３３ 光束調整（光束調整期間）
３４ 電気泳動（濃縮）
３５ 電気泳動（微粒子塊の移動）
３６ 微粒子検出
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微粒子を含む試料を蛍光染色し、泳動液を用いて微細管電気泳動することにより微粒子を検出する微粒子検出装置において、蛍光染色の励起光として間欠的に発光する励起光発光器と、励起光発光に同期して蛍光を計測する蛍光検出器とを備えたことを特徴とする微粒子検出装置。
【請求項２】
蛍光検出器にて測定した蛍光光束量に基づいて、励起光発光器の光束量を調整する光束量調整手段を備えたことを特徴とする請求項１記載の微粒子検出装置。
【請求項３】
光束量調整手段が、蛍光検出器にて測定した励起光発光器の点灯時と不点灯時の差に基づいて、励起光発光器の光束量を調整することを特徴とする請求項２記載の微粒子検出装置。
【請求項４】
蛍光検出器にて測定した蛍光光束量に基づいて、励起光発光器のＯＮ、ＯＦＦ時間比率を調整するパルス幅調整手段を備えたことを特徴とする請求項１、２又は３記載の微粒子検出装置。
【請求項５】
パルス幅調整手段が、蛍光検出器にて測定した励起光発光器の点灯時と不点灯時の差に基づいて、励起光発光器のＯＮ、ＯＦＦ時間比率を調整することを特徴とする請求項４記載の微粒子検出装置。
【請求項６】
励起光発光器における励起光源として、間欠的に発光するＬＥＤを使用することを特徴とする請求項１、２、３、４又は５記載の微粒子検出装置。
【請求項７】
微粒子が微生物であることを特徴とする請求項１、２、３、４、５又は６記載の微粒子検出装置。
【請求項８】
微生物がレジオネラ属菌等の人体に有害な微生物であることを特徴とする請求項７記載の微粒子検出装置。
【請求項１】
微粒子を含む試料を蛍光染色し、泳動液を用いて微細管電気泳動することにより微粒子を検出する微粒子検出装置において、蛍光染色の励起光として間欠的に発光する励起光発光器と、励起光発光に同期して蛍光を計測する蛍光検出器とを備えたことを特徴とする微粒子検出装置。
【請求項２】
蛍光検出器にて測定した蛍光光束量に基づいて、励起光発光器の光束量を調整する光束量調整手段を備えたことを特徴とする請求項１記載の微粒子検出装置。
【請求項３】
光束量調整手段が、蛍光検出器にて測定した励起光発光器の点灯時と不点灯時の差に基づいて、励起光発光器の光束量を調整することを特徴とする請求項２記載の微粒子検出装置。
【請求項４】
蛍光検出器にて測定した蛍光光束量に基づいて、励起光発光器のＯＮ、ＯＦＦ時間比率を調整するパルス幅調整手段を備えたことを特徴とする請求項１、２又は３記載の微粒子検出装置。
【請求項５】
パルス幅調整手段が、蛍光検出器にて測定した励起光発光器の点灯時と不点灯時の差に基づいて、励起光発光器のＯＮ、ＯＦＦ時間比率を調整することを特徴とする請求項４記載の微粒子検出装置。
【請求項６】
励起光発光器における励起光源として、間欠的に発光するＬＥＤを使用することを特徴とする請求項１、２、３、４又は５記載の微粒子検出装置。
【請求項７】
微粒子が微生物であることを特徴とする請求項１、２、３、４、５又は６記載の微粒子検出装置。
【請求項８】
微生物がレジオネラ属菌等の人体に有害な微生物であることを特徴とする請求項７記載の微粒子検出装置。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２００８−９６１５４（Ｐ２００８−９６１５４Ａ）
【公開日】平成２０年４月２４日（２００８．４．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２７５４６２（Ｐ２００６−２７５４６２）
【出願日】平成１８年１０月６日（２００６．１０．６）
【出願人】（３０１０２１５３３）独立行政法人産業技術総合研究所 (6,529)
【出願人】（３９００００６８６）株式会社住化分析センター (72)
【出願人】（０００００５４５２）株式会社日立プラントテクノロジー (1,767)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年４月２４日（２００８．４．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１０月６日（２００６．１０．６）
【出願人】（３０１０２１５３３）独立行政法人産業技術総合研究所 (6,529)
【出願人】（３９００００６８６）株式会社住化分析センター (72)
【出願人】（０００００５４５２）株式会社日立プラントテクノロジー (1,767)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]