微粒子検出装置
【課題】複数の種類の微粒子や対象とする微生物の生菌、死菌の数等を、迅速かつ高感度に分離検出することができる微粒子検出装置を提供すること。
【解決手段】試料を微粒子の種類に応じて選択的に結合する蛍光染色で処理するとともに、この試料を泳動液を用いて微細管電気泳動することにより微粒子を検出する微粒子検出装置において、蛍光染色された微粒子に励起光照射する励起光発光器１と、励起光照射により発光した蛍光を検出する蛍光検出器１２と、この蛍光検出器１２の前方で並列配置され、特定の波長領域のみを透過させる複数種類のフィルタ１１ａ、１１ｂ、１１ｃとを備え、各フィルタ１１ａ、１１ｂ、１１ｃを通過した微粒子の蛍光を蛍光検出器１２の検出素子に並列して結像させるようにする。
【解決手段】試料を微粒子の種類に応じて選択的に結合する蛍光染色で処理するとともに、この試料を泳動液を用いて微細管電気泳動することにより微粒子を検出する微粒子検出装置において、蛍光染色された微粒子に励起光照射する励起光発光器１と、励起光照射により発光した蛍光を検出する蛍光検出器１２と、この蛍光検出器１２の前方で並列配置され、特定の波長領域のみを透過させる複数種類のフィルタ１１ａ、１１ｂ、１１ｃとを備え、各フィルタ１１ａ、１１ｂ、１１ｃを通過した微粒子の蛍光を蛍光検出器１２の検出素子に並列して結像させるようにする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微細管電気泳動を用いて、検体試料中に存在する細胞等の各種微粒子を検出する微粒子検出装置に関し、特に人体に有害なレジオネラ属菌等の微生物を含む各種微粒子を迅速かつ高感度に分離検出することができる微粒子検出装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
一般に、試料中に所望の微粒子が存在するか否かを調べたり、また試料中に含まれる微生物等の各種微粒子の種類や量、又は生菌や死菌の区別等を調べるためには、一旦これらの試料を適当な培地に接種して培養することによって目的の微生物である微粒子を増殖させる必要がある。
このため、従来では、微生物の検出には、その培養のために少なくとも数日間以上という長い時間が必要であり、結果が迅速に得られないという問題があった。
また、微生物培養は基本的に無菌的に行われるため、特殊な培養技術や設備が要求される問題もあった。
一方、微生物の遺伝子情報よりその種類を特定する方法等があるが、微生物の数や、生菌、死菌の区別までは特定できない問題があった。
【０００３】
これらのことから、微生物の培養並びに高度な技術や装置を要することなく、検体試料中に含まれ得る有害微生物の種類や性質等を迅速かつ簡便に検出し得る方法が望まれている。
多くの種類に分類される微生物の検出は、従来、選択分離培養で培養後、疑わしい集落を釣菌し、確認培地や同定キットあるいは抗血清により判定する必要があり、菌種・菌株を正確に同定するには多くの経験と熟練が必要であった。また、培養等の時間を合わせると判定結果には３〜５日間以上の長期間を要していた。
このため、環境・食品及び医療分野では、微生物、特に有害な微生物を菌種・菌株毎に特異的に検出するための迅速でかつ安全な方法の確立が求められているのが実情である。
【０００４】
ところで、近年、迅速な微生物の分離・検出手法として、微細管内で予め蛍光染色した微生物を電気泳動させ、励起光を照射してそのとき発生する蛍光から検出する電気泳動技術が提案されている（例えば、特許文献１参照）。
また、微細管等電点電気泳動技術に関する論文はあるが、その具体的検出手段の詳細は記述されていない（例えば、非特許文献１参照）。
一方、微細管内で微生物を泳動分離する際には、微生物細胞と細管内壁、あるいは細胞と細胞との相互作用が大きく、迅速かつ高感度に微細管内で微生物を分離するためには、泳動液にアルギン酸塩を含有させることが有効である（例えば、特許文献２参照）。
この方法において、微生物の分離効率を向上させる添加剤としてのアルギン酸塩はすべての微生物に対して同様に機能するものではなく、多種多様な微生物種に対応できるより多くのタイプの分離効率向上剤の導入が期待されている。
【０００５】
ところで、環境水や食品汚染及び感染症疾患に対して迅速に適切な処置を施したり、その汚染源や感染源を迅速に突きとめ対処したりするためには、汚染源や感染源となり得る微生物等の有害な微粒子の迅速でかつ特異的な検出方法が要求されている。
また、かかる微生物に対して、例えば、塩素殺菌等の処理を施した場合、すべての有害微生物が死滅したかどうかを確認することは重要である。
また、すべての有害菌の死滅が困難な場合には、殺菌後に生菌、死菌の数を確認することにより、塩素殺菌の状況や殺菌効率を把握したりする必要がある。
これら複数の種類の微生物を検出する方法として、複数の反射ミラーとフィルタを利用して所望の波長の光のみを分離して取り出し、解析する例が提案されているが、この方法の場合は、複数の反射ミラーを使用するため、検出する光量が減衰するという問題があった（特許文献３参照）。
【特許文献１】特開２００２−３４５４５１号公報
【特許文献２】特開２００２−１８１７８１号公報
【特許文献３】米国特許第５９８２４９７号
【非特許文献１】微細管電気泳動法による微生物の分離検出法（月刊フードケミカル２００５−２）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、上記従来の微粒子検出装置が有する問題点に鑑み、複数の種類の微粒子や対象とする微生物の生菌、死菌の数等を、迅速かつ高感度に分離検出することができる微粒子検出装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成するため、本発明の微粒子検出装置は、試料を微粒子の種類に応じて選択的に結合する蛍光染色で処理するとともに、該試料を泳動液を用いて微細管電気泳動することにより微粒子を検出する微粒子検出装置において、蛍光染色された微粒子に励起光照射する励起光発光器と、励起光照射により発光した蛍光を検出する蛍光検出器と、該蛍光検出器の前方で並列配置され、特定の波長領域のみを透過させる複数種類のフィルタとを備え、各フィルタを通過した微粒子の蛍光を蛍光検出器の検出素子に並列して結像させるようにしたことを特徴とする。
【０００８】
この場合において、蛍光検出器より得られる蛍光信号を、各フィルタ毎に区別して検出する微粒子検出制御装置と、該微粒子検出制御装置の検出信号を記録する画像信号記録装置とを備えることができる。
【０００９】
また、微粒子検出信号を、画像の輝度、画像の面積又は微粒子の数とすることができる。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の微粒子検出装置によれば、蛍光染色された微粒子に励起光照射する励起光発光器と、励起光照射により発光した蛍光を検出する蛍光検出器と、該蛍光検出器の前方で並列配置され、特定の波長領域のみを透過させる複数種類のフィルタとを備え、各フィルタを通過した微粒子の蛍光を蛍光検出器の検出素子に並列して結像させることから、微粒子の種類に応じて異なった波長の蛍光を発する場合や、同じ種類の微粒子であっても、生菌、死菌の区別により異なった波長の蛍光を発する場合等において、蛍光検出器における画像信号から複数のフィルタによる検出波長領域に応じた微粒子を同時に検出することができ、これにより、特殊な技術を必要とすることなく、試料中に種々含まれる微粒子をその種類や特性を高い分離能をもってかつ再現性よく分離するとともに、目的の微粒子を予め蛍光染色することにより、微量の微粒子であっても培養等の増殖処理することなく高感度に検出し、一層高い分離能でもって精度よく所望の微粒子を検出することができ、さらに、試料中に混在する微粒子が単に検出できるだけでなく、微粒子の種類毎に、また特性毎に分離して定量的に検出することができる。
【００１１】
この場合、蛍光検出器より得られる蛍光信号を、各フィルタ毎に区別して検出する微粒子検出制御装置と、該微粒子検出制御装置の検出信号を記録する画像信号記録装置とを備えることにより、複数種類のフィルタで複数種類の蛍光を同時に検出するとともに、その画像処理結果又は微粒子検出画像を同時に表示したり、パソコン等のメモリに保存、記録することができる。
【００１２】
また、微粒子検出信号を、画像の輝度、画像の面積又は微粒子の数とすることにより、その微粒子の検出結果の詳細データが明確となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明の微粒子検出装置の実施の形態を、図面に基づいて説明する。
【００１４】
本発明の微粒子検出装置は、泳動液を用いた微細管電気泳動法を利用することにより、試料中に種々含まれる複数種類の微粒子を高い分離能をもってかつ再現性よく分離する。
また、この微細管電気泳動法において、検出手段として蛍光検出器を利用することにより、目的の微粒子を予め蛍光染色することによって、微量の微粒子であっても培養等の増殖処理することなく高感度に検出できること、また、これにより、さらに一層高い分離能でもって精度よく所望の微粒子を検出することができる。
さらに、試料中に混在する微粒子が単に検出できるだけでなく、定量的に検出することができる。
なお、本発明でいう検出とは、試料中に含まれる所望微粒子の濃縮、他との分離、定性的検出、定量的検出、スクリーニング、生死判別等を包含するものである。
【００１５】
具体的には、例えば、下記の一部又は全部を構成要件として備えた微粒子検出装置である。
（１）微粒子を含む試料を、泳動液を用いて微細管電気泳動する。
（２）微粒子を含む試料を微粒子に選択的に結合するように蛍光染色し、これを微細管電気泳動に供して、蛍光染色された微粒子を蛍光検出する。
（３）微細管電気泳動を用いて微粒子を検出する装置であって、泳動液を含む水槽、泳動液に注入された微粒子を濃縮分離する微細管、又は濃縮された微粒子を検出するための検出手段を備えている。
（４）微細管電気泳動を用いて微粒子を検出する装置であって、微細管内に設けたｐＨ勾配により微粒子を濃縮する。
（５）検出手段として蛍光検出器を備えており、蛍光染色した微粒子に励起光照射し、蛍光染色された微粒子から発光された蛍光を光学系を用いて蛍光検出し、蛍光検出した画像信号から微粒子を検出する。
（６）特定の波長領域のみを透過させる複数種類のフィルタを、蛍光検出器の前方で同一平面上に並列配置し、各フィルタを通過した微粒子の蛍光を、蛍光検出器の検出素子に同時又は順次結像させるようにしている。
（７）また、光学系で蛍光検出した画像信号を記録する画像信号記録装置、画像信号から微粒子を検出した微粒子検出信号を記録する微粒子検出制御装置を有する。
（８）さらには、微粒子検出信号は、画像の輝度、規定した輝度以上の信号を有する画像の面積、画像を空間的、時間的に特徴付けて検出した微粒子の数等とする。
【実施例１】
【００１６】
図１に、本発明の微細管等電点電気泳動システムの基本的構成を一実施例として示す。
図１において、１はダイオード等の励起光発光器、２は微細管、３はその検出窓、４ａ、４ｂは電極、５ａ、５ｂは溶液、６は溶液中に含まれる微粒子、７は励起光発光器１より放射される励起光、８は対物レンズ、９は微粒子から発光される蛍光、１０はダイクロイックフィルタを示す。
また、１１ａ、１１ｂはそれぞれ特定の波長のみを通過させる２種類のフィルタ、１１ｃはノンフィルタ、すなわち、すべての波長の蛍光を通過するフィルタ、１２はＣＣＤカメラ等の蛍光検出器、１３は微粒子検出制御装置、１５は表示装置、１６は画像信号記録装置である。
【００１７】
検出対象物である有害菌等の微粒子、例えば、大腸菌やレジオネラ菌等の人体に有害な微生物は、予め所望の微生物とのみ選択的に結合するように蛍光染色しておき、例えば、キャピラリー等の微細管２の内部に、その両端に設置した溶液５ａ又は溶液５ｂより注入する。
溶液５ａ又は溶液５ｂは、検出の段階に応じて変更し、電極４ａ、４ｂにより微細管２の両端に高圧電源を印加する。
高電圧は図示しない電源より供給し、その電圧の大きさ、印加時間等は、例えば、パソコン等の微粒子検出制御装置１３より制御する。
【００１８】
励起光発光器１から発した励起光７は、ダイクロイックフィルタ１０で反射し、対物レンズ８より微細管の検出窓３より、蛍光染色された微粒子に照射される。
蛍光染色された微粒子は蛍光９を発光し、対物レンズ８より装置本体内に入射し、ダイクロイックフィルタ１０を透過する。
このとき、微粒子の種類に応じて結合する蛍光染色の特性に基づき、発する蛍光９は種々の波長を有する。例えば、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ試薬（Invitrogen社製）で蛍光染色した微生物に対して、青色の励起光を微生物に照射した場合、生菌の場合緑色の蛍光を発し、死菌の場合赤色の蛍光を発する。
これらの蛍光９は、ＣＣＤカメラ等で構成される蛍光検出器１２の直上部に設置したフィルタ１１ａ、１１ｂ及びノンフィルタ１１ｃを通過した後、蛍光検出器１２にそれぞれを並列して結像し、その画像信号は微粒子検出制御装置１３に送られ、検出処理される。
この検出画像信号は、画像信号記録装置１６に記録される。
蛍光染色された微粒子は後に述べる方法により濃縮され、検出窓３を通過させる。この通過時に微粒子の検出動作を行うことができる。
【００１９】
図２は、フィルタ１１ａ、１１ｂ、ノンフィルタ１１ｃの平面図であり、各フィルタ１１ａ、１１ｂ、１１ｃは、それぞれ矩形状に構成され、蛍光検出器１２のＣＣＤ受光素子の直上部で、微細管の長手方向に同一平面上で並列配置されている。
蛍光９を蛍光検出器１２に結像させるとき、各フィルタ１１ａ、１１ｂ、１１ｃをそれぞれ所望の波長の蛍光のみを通過させるような特性に構成すれば、所望の特性の蛍光のみを選択的に取得できる。取得した画像の処理内容に関しては、詳細を後述する。
【００２０】
図３は、微粒子の例として、微細管２内における有害菌である微生物の泳動状況を示したものであり、次に示す検出過程を踏む。
まず、検出対象としての微生物を含む試料である検水溶液を、例えば、溶液５ａとして準備し、溶液５ｂの側から吸引することにより、微細管２内に対象とする検水溶液２０として注入する。
次に、溶液５ａとして酸性溶液、例えば、リン酸等を用い、溶液５ｂとしてはアルカリ性（塩基性）溶液、例えば、苛性ソーダ等を用いる。電極４ａ、４ｂは、それぞれ図示しない高電圧電源に接続されており、微粒子検出制御装置１３により、電極４ａ（酸性の溶液５ａ側）には陽極、電極４ｂ（アルカリ性の溶液５ｂ側）には陰極の電圧を印加するように接続する。
ここで、微細管２の両端は、上記の酸性又はアルカリ性の溶液（泳動液と呼ぶ）にそれぞれ浸され、次いで高圧電源を作動すると、微細管２内の検水溶液２０に電位勾配が発生し、その結果、微細管内の泳動領域内（微細管内）の液全体は等電点現象により陰極方向と陽極方向の間にｐＨ勾配を発生する。
【００２１】
このとき、検水溶液２０内に存在し得る微粒子２１は、異なるｐＨ領域に拡散して存在するので、その電荷を持たない状態になる領域、すなわち、等電点位置２４又は２５に向かって泳動する。
すなわち、微粒子２１はそれが有する等電点と同じｐＨ条件の領域（等電点位置２４又は等電点位置２５）へと移動する。
例えば、等電点ｐＨがｐＨ（Ａ）である微粒子のｐＨレンジが等電点位置２４であるとすると、形成されたｐＨ勾配により、微粒子が等電点位置２４より電極（陰極）４ｂ側に存在する場合は移動方向２２に移動し、等電点位置２４より電極（陽極）４ａ側に存在する場合は移動方向２３に移動し、等電点位置２４に濃縮される。
同様に、等電点ｐＨがｐＨ（Ｂ）である微粒子のｐＨレンジが等電点位置２５であるとすると、形成されたｐＨ勾配により、微粒子が等電点位置２５より電極（陰極）４ｂ側に存在する場合は移動方向２２に移動し、等電点位置２５より電極（陽極）４ａ側に存在する場合は移動方向２３に移動し、等電点位置２５に濃縮される。
すなわち、微粒子はそれが有する等電点により微細管２内の等電点位置２４又は等電点位置２５に集積化され、濃縮された微粒子塊２４ａ又は微粒子塊２５ａを形成する。この等電点位置は、対象の微粒子の種類や生菌、死菌の状況により変化する。一般的には、微粒子の表面電荷成分は特定の等電点を持つので、上記微細管内ｐＨ勾配により、微粒子はそれぞれの特定箇所である等電点位置２４、２５等に濃縮される。
この状態になると、両電極４ａ、４ｂ間の泳動電流は定常状態になり、ほとんど流れなくなる。
【００２２】
次に、図４に示すように、溶液５ａはそのままの酸性溶液とし、溶液５ｂに、例えば、塩（モビライザ）を用いて、同様に電極４ａに陽極、電極４ｂに陰極の電圧を印可すると、図３の等電点位置２４又は等電点位置２５に濃縮された微粒子塊２４ａ又は微粒子塊２５ａは、再度発生した電位勾配により、例えば、モビライザで流される形で電極（陰極）４ｂに向かって移動方向２６に移動する。
このとき、微粒子塊２４ａ、２５ａは検出窓３を通過する。この微粒子塊は蛍光染色されており、図１で示したように、対物レンズ８より励起光が照射されると、蛍光染色の特性に応じた波長の蛍光色を発光する。
【００２３】
微細管２内への検体試料の注入方法は、特に制限されず、従来使用される重力法、加圧法及び減圧法のいずれをも使用することができる。
注入量も特に制限されないが、通常用いる微細管全域に試料を満たすため、その微細管のサイズに依存し、０．１〜１００μＬ、好ましくは０．５〜１００μＬ、より好ましくは０．５〜１０μＬを例示することができる。
【００２４】
また、上記で例示した一対の電極４ａ、４ｂ及び高圧電源は、微細管内に注入された微粒子が微細管内の泳動液中を泳動するのに必要な強さの電位勾配を、微細管中の泳動液に対して印加するための手段である。
かかる目的が達成できるものであれば、これらのもの（電源及び一対の電極）に何ら限定されることなく、任意の手段（電位勾配を印加するその他の手段）を使用することができる。
【００２５】
電極間にかけられる電圧としては、微細管長さに対して、一般に約１ｋＶ／ｍ〜約５００ｋＶ／ｍ、好ましくは約２ｋＶ／ｍ〜約１００ｋＶ／ｍ、より好ましくは約５ｋＶ／ｍ〜約２０ｋＶ／ｍを挙げることができる。
微細管としては、内径１〜１５０μｍ、長さ０．１〜１００ｃｍ、好ましくは内径２０〜１００μｍ、長さ１〜５０ｃｍの中空管を挙げることができる。その材質としては特に制限されず、ガラス（フューズドシリカ）製等を任意に選択することができる。
【００２６】
図５は、例えば、ここで検出対象とする微粒子２１として、微生物に適用した場合の微生物を拡大して示したもので、その外壁２１ａに選択的に結合する抗体３０、抗体３０を蛍光標識した蛍光色素３１等を示している。
なお、図示しないが、検出対象である微粒子２１に結合している抗体及び蛍光色素３１以外に、微粒子に結合しないままに溶液中を浮遊している抗体及び蛍光色素からも蛍光が発せられるが、濃縮位置が検出対象微粒子とは異なるので、時間経過を見ることにより分離することは可能である。
【００２７】
図６は、前述した対象微粒子の検出過程をフロー図で示したものである。
まず、検体溶液を微細管に注入し（ステップ３２）、ｐＨ勾配を設けることにより微粒子を等電点電気泳動し、微粒子塊（濃縮）とする（ステップ３３）。
次に、微粒子塊を微細管の中で泳動させ、微粒子塊の探索を行い（ステップ３４）、フィルタを通じてＣＣＤカメラ等で微粒子検出する（ステップ３５）。
以上の過程で、対象微粒子を検出する。
【００２８】
図７は、例えば、パソコン等の微粒子検出制御装置１３における微粒子の画像処理表示例を示した図である。
主なキーには、開始キー４０、中止キー４１、終了キー４２等がある。
開始キー４０をクリックして微粒子の検出動作を開始すると、状態表示４３は検出中となり、経過時間はコメント欄４４に表示し、コメント欄４５には異常の有無（ここでは正常）をそれぞれ表示する。
検出途中で検出動作を中止する場合は中止キー４１を、検出動作を終了する場合は終了キー４２をクリックする。
【００２９】
図７においては、フィルタ１１ａの直下におけるＣＣＤ素子から得られた画像を画面の左側の領域４６として示すとともに、フィルタ１１ｂの直下におけるＣＣＤ素子から得られた画像を画面の中央の領域４７として示し、また、ノンフィルタ１１ｃ直下におけるＣＣＤ素子から得られた画像を画面の右側の領域４８として示している。
ここで、５１ａ、５１ｂは微細管の管壁を示しており、蛍光染色された微粒子を検出すると、微粒子５２、５３、５４を画像に表示する。
これらの検出画像の輝度、形状、面積、空間的位置、その移動方向等から画像トラッキングを行い、その検出微粒子に固有の番号を付し、その数をカウントする。
この実施例では、領域４６に３個の微粒子５２を検出するとともに、領域４７に２個の微粒子５３を検出し、さらに領域４８に２個の微粒子５４を検出した場合を示している。
すなわち、微粒子５２は第１のフィルタ１１ａを通過したもの、微粒子５３は第２のフィルタ１１ｂを通過したもの、微粒子５４はノンフィルタ１１ｃ、すなわち、フィルタをかけなかった場合の微粒子をそれぞれ示している。これらは、時間とともに右方向に移動し、微粒子の波長条件とフィルタの組み合わせに基づき、消えたり現れたりすることとなる。
【００３０】
検出する微粒子の画像輝度やその面積等は、励起光７、蛍光９の強さ、対象とする微粒子の種類により変化する。
そこで、画像処理により検出する画像輝度値のレベル調整は、輝度値キー６０の▽（図においては黒塗り。以下、同じ。）をクリックすることにより変更する。
また、検出する画像面積の調整は、面積キー６１の▽をクリックすることにより変更する。
このような画像処理による微粒子検出技術は既存の技術であり、容易に実現可能である。
【００３１】
さらに、本実施例では、領域４６において検出した輝度の合計値６２、検出した微粒子の面積の総和６３、検出した微粒子数の瞬時値６４、及び検出動作開始後に検出した微粒子の総和６５を示しており、領域４７において検出した輝度の合計値６６、検出した微粒子の面積の総和６７、検出した微粒子数の瞬時値６８、及び検出動作開始後に検出した微粒子の総和６９をそれぞれ表示している。さらに領域４８において検出したデータを表示することも可能であるが、ここでは表示しない例を示した。
これにより、画像処理が正常に動作していることの確認ができる。また、得られたデータは、微粒子検出制御装置１３に内蔵するメモリ等の波形制御装置に保存する。
【００３２】
通常、微生物等の微粒子の検出に要する時間は数分から数十分と長時間に亘ることから、画像信号記録装置１６は多くの画像信号を記録できるＤＶＤデッキ等とすることが望ましい。
また、微粒子検出制御装置１３としては通常のパソコンで十分機能が発揮できるが、検出期間すべての画像の記録は困難なので、対象微粒子を検出した前後の画像のみを記録する、又は画像の記録は画像信号記録装置１６専用とし、微粒子検出制御装置１３には、本実施例で示したような画像処理結果、すなわち、対象微粒子に対する画像輝度、微粒子の数、その大きさ等、及び電気泳動のパラメータ等のみに限定してもよい。
【００３３】
また、微細管内にｐＨ勾配を設けることにより、微粒子を濃縮する方法の代りに、泳動領域で微細管内に電位勾配を発生させ、この電位勾配により微細管内液体全体の流れである電気浸透流が生じ、通常それは陽極から陰極方向への流れとなる。
微細管内に注入された微粒子は、上記発生した電位勾配に応答して、微粒子が有する表面電荷とは反対の極性を有する電極方向へ移動する。
結果として、微細管内での微粒子の泳動方向（陰極から陽極方向）及び速度は、上記電気浸透流速度と微粒子の移動度によって決まり、微細管の反対端の近く（陽極の近く）に濃縮する方式で微粒子を検出する方法等、適宜その方式を変更することができる。
【００３４】
また、微細管内で濃縮分離された微粒子を検出する手段としては、一般的には、分光学的、電気化学的、重量検出的方法のいずれもが使用できるが、好ましくは、ＵＶ−可視検出や蛍光検出、発光検出、光散乱検出等の光学検出法が挙げられる。
中でも、検出の特異性と感度に優れた蛍光検出法が好ましく、励起光として安価なＬＥＤで光量が不足の場合は、より高感度検出が可能なレーザー誘導蛍光検出法が望ましい。これらの蛍光に基づく検出は、特に有害な微生物等の検出において、免疫反応（抗原抗体反応）、細胞内酵素反応、及び核酸相補鎖形成反応等の反応を目的微生物に応じて適宜組み合わせることで、目的微生物をより特異的かつ高感度に検出することができる。
これらの方法の中でも免疫反応は、微生物試料に特別な前処理をする必要がなく、また特異性に優れている点で、好ましい方法の１つである。かかる免疫反応としては、具体的には蛍光色素標識抗体（単に蛍光抗体ともいう）、酵素標識抗体（単に酵素抗体ともいう）等を用いて目的の微生物を蛍光や酵素等で標識する方法を挙げることができる。
【００３５】
かくして、本実施例の微粒子検出装置は、蛍光染色された微粒子に励起光照射する励起光発光器１と、励起光照射により発光した蛍光を検出する蛍光検出器１２と、該蛍光検出器１２の前方で並列配置され、特定の波長領域のみを透過させる複数種類のフィルタ１１ａ、１１ｂ、１１ｃとを備え、各フィルタ１１ａ、１１ｂ、１１ｃを通過した微粒子の蛍光を蛍光検出器１２の検出素子に並列して結像させることから、検体試料中の微生物等の微粒子を短時間でかつ精度よく分離、検出、定量化することができる。すなわち、微生物の菌種・菌株を個々に分離することが可能となる。また、対象とする微生物に対して選択的に結合するように蛍光染色するので、特殊な技術を必要とすることなく、また培養操作なしに短時間にかつ容易にまた正確に検出できるため、高い精度の微生物検査とモニタリングシステムの確立が可能となる。
また、画像処理技術を用いて微生物を検出することにより、その画像処理結果、及び微生物検出画像をパソコン等のメモリに保存、記録することができる。したがって、その保存データを呼び出すことにより、検出結果の再確認、検体溶液供給者への詳細結果報告が可能となる。また、迅速な微生物対策、滅菌対策等に寄与することが可能となる。
また、蛍光検出手段として安価なＬＥＤ、又はレーザー誘導蛍光検出器等を利用することにより、所望の微生物を高感度かつ特異的に検出することができるので、試料を培養する等の増殖処理を施すことなく、微量の微生物を精度よく分離検出することができる。
また、本実施例の微粒子検出装置は、定量性を有するため、試料中に存在する菌体数を判別測定（定量検出）することも可能であり、また、試料中の微生物の検出が可能であるだけでなく、種々の微生物に特有の特異的検出試薬（例えば、抗体等）を使用することにより菌種の同定も可能である。
このように、本実施例の微粒子検出装置は、有害微粒子の検出（定性検出、定量検出）に適しているため、病原性微生物によって汚染された環境水や食品が早期に排除でき、病気の発生の防止に有用である。また、病原性微生物による患者の早期診断が可能になることから、有害微生物による被害の蔓延防止並びに早期治療の一助となる。さらには、食品の品質管理期間が短縮でき、また衛生管理の厳格性から賞味期間も延長可能であり、食品流通の経済性に大きく貢献することができる効果がある。
【００３６】
この場合、蛍光検出器１２より得られる蛍光信号を、各フィルタ１１毎に区別して検出する微粒子検出制御装置１３と、該微粒子検出制御装置１３の検出信号を記録する画像信号記録装置１６とを備えることにより、複数種類のフィルタ１１で複数種類の蛍光を同時に検出するとともに、その画像処理結果又は微粒子検出画像を同時に表示したり、パソコン等のメモリに保存、記録することができる。
また、微粒子検出信号を、画像の輝度、画像の面積又は微粒子の数とすることにより、その微粒子の検出結果の詳細データが明確となる。
【００３７】
以上、本発明の微粒子検出装置について、その実施例に基づいて説明したが、本発明は上記実施例に記載した構成に限定されるものではなく、その趣旨を逸脱しない範囲において適宜その構成を変更することができる。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
本発明の微粒子検出装置は、各種微粒子を迅速かつ高感度に分離検出するという特性を有していることから、例えば、浴槽水やプール、冷却塔の冷却水等の環境水、食品及び医療分野等において採取した検体試料中に混在する有害微生物等の微粒子を精度よく検出する用途に好適に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】本発明の微粒子検出装置の一実施例を示す概略構成図である。
【図２】フィルタの平面図である。
【図３】微細管電気泳動による微粒子の検出過程を示す説明図である。
【図４】微細管電気泳動による微粒子の検出過程の次段階の説明図である。
【図５】微粒子の詳細を示す拡大図である。
【図６】微粒子の検出動作を示すフロー図である。
【図７】微粒子検出制御装置における画像処理状況を表示した画面を示す図である。
【符号の説明】
【００４０】
１ 励起光発光器
２ 微細管
３ 検出窓
４ａ 電極（陽極）
４ｂ 電極（陰極）
５ａ 溶液
５ｂ 溶液
６ 微粒子
７ 励起光
８ 対物レンズ
９ 蛍光
１０ ダイクロイックフィルタ
１１ａ 第１のフィルタ
１１ｂ 第２のフィルタ
１１ｃ ノンフィルタ
１２ 蛍光検出器
１３ 微粒子検出制御装置
１５ 表示装置
１６ 画像信号記録装置
２０ 検水溶液
２１ 微粒子
２４ 等電点位置
２５ 等電点位置
３０ 抗体
３１ 蛍光色素
４０ 開始キー
４１ 中止キー
４２ 終了キー
４３ 状態表示
４４ 経過時間
４５ コメント欄
４６ 第１フィルタの画像領域
４７ 第２フィルタの画像領域
４８ ノンフィルタ領域
５１ａ 微細管の管壁
５１ｂ 微細管の管壁
５２ 第１フィルタ領域の微粒子画像
５３ 第２フィルタ領域の微粒子画像
５４ ノンフィルタ領域の微粒子画像
６０ 輝度値調整キー
６１ 面積調整キー
６２ 第１フィルタ領域の輝度合計値
６３ 第１フィルタ領域の微粒子の面積総和
６４ 第１フィルタ領域の微粒子数の瞬時値
６５ 第１フィルタ領域の微粒子の総和
６６ 第２フィルタ領域の輝度合計値
６７ 第２フィルタ領域の微粒子の面積総和
６８ 第２フィルタ領域の微粒子数の瞬時値
６９ 第２フィルタ領域の微粒子の総和
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微細管電気泳動を用いて、検体試料中に存在する細胞等の各種微粒子を検出する微粒子検出装置に関し、特に人体に有害なレジオネラ属菌等の微生物を含む各種微粒子を迅速かつ高感度に分離検出することができる微粒子検出装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
一般に、試料中に所望の微粒子が存在するか否かを調べたり、また試料中に含まれる微生物等の各種微粒子の種類や量、又は生菌や死菌の区別等を調べるためには、一旦これらの試料を適当な培地に接種して培養することによって目的の微生物である微粒子を増殖させる必要がある。
このため、従来では、微生物の検出には、その培養のために少なくとも数日間以上という長い時間が必要であり、結果が迅速に得られないという問題があった。
また、微生物培養は基本的に無菌的に行われるため、特殊な培養技術や設備が要求される問題もあった。
一方、微生物の遺伝子情報よりその種類を特定する方法等があるが、微生物の数や、生菌、死菌の区別までは特定できない問題があった。
【０００３】
これらのことから、微生物の培養並びに高度な技術や装置を要することなく、検体試料中に含まれ得る有害微生物の種類や性質等を迅速かつ簡便に検出し得る方法が望まれている。
多くの種類に分類される微生物の検出は、従来、選択分離培養で培養後、疑わしい集落を釣菌し、確認培地や同定キットあるいは抗血清により判定する必要があり、菌種・菌株を正確に同定するには多くの経験と熟練が必要であった。また、培養等の時間を合わせると判定結果には３〜５日間以上の長期間を要していた。
このため、環境・食品及び医療分野では、微生物、特に有害な微生物を菌種・菌株毎に特異的に検出するための迅速でかつ安全な方法の確立が求められているのが実情である。
【０００４】
ところで、近年、迅速な微生物の分離・検出手法として、微細管内で予め蛍光染色した微生物を電気泳動させ、励起光を照射してそのとき発生する蛍光から検出する電気泳動技術が提案されている（例えば、特許文献１参照）。
また、微細管等電点電気泳動技術に関する論文はあるが、その具体的検出手段の詳細は記述されていない（例えば、非特許文献１参照）。
一方、微細管内で微生物を泳動分離する際には、微生物細胞と細管内壁、あるいは細胞と細胞との相互作用が大きく、迅速かつ高感度に微細管内で微生物を分離するためには、泳動液にアルギン酸塩を含有させることが有効である（例えば、特許文献２参照）。
この方法において、微生物の分離効率を向上させる添加剤としてのアルギン酸塩はすべての微生物に対して同様に機能するものではなく、多種多様な微生物種に対応できるより多くのタイプの分離効率向上剤の導入が期待されている。
【０００５】
ところで、環境水や食品汚染及び感染症疾患に対して迅速に適切な処置を施したり、その汚染源や感染源を迅速に突きとめ対処したりするためには、汚染源や感染源となり得る微生物等の有害な微粒子の迅速でかつ特異的な検出方法が要求されている。
また、かかる微生物に対して、例えば、塩素殺菌等の処理を施した場合、すべての有害微生物が死滅したかどうかを確認することは重要である。
また、すべての有害菌の死滅が困難な場合には、殺菌後に生菌、死菌の数を確認することにより、塩素殺菌の状況や殺菌効率を把握したりする必要がある。
これら複数の種類の微生物を検出する方法として、複数の反射ミラーとフィルタを利用して所望の波長の光のみを分離して取り出し、解析する例が提案されているが、この方法の場合は、複数の反射ミラーを使用するため、検出する光量が減衰するという問題があった（特許文献３参照）。
【特許文献１】特開２００２−３４５４５１号公報
【特許文献２】特開２００２−１８１７８１号公報
【特許文献３】米国特許第５９８２４９７号
【非特許文献１】微細管電気泳動法による微生物の分離検出法（月刊フードケミカル２００５−２）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、上記従来の微粒子検出装置が有する問題点に鑑み、複数の種類の微粒子や対象とする微生物の生菌、死菌の数等を、迅速かつ高感度に分離検出することができる微粒子検出装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成するため、本発明の微粒子検出装置は、試料を微粒子の種類に応じて選択的に結合する蛍光染色で処理するとともに、該試料を泳動液を用いて微細管電気泳動することにより微粒子を検出する微粒子検出装置において、蛍光染色された微粒子に励起光照射する励起光発光器と、励起光照射により発光した蛍光を検出する蛍光検出器と、該蛍光検出器の前方で並列配置され、特定の波長領域のみを透過させる複数種類のフィルタとを備え、各フィルタを通過した微粒子の蛍光を蛍光検出器の検出素子に並列して結像させるようにしたことを特徴とする。
【０００８】
この場合において、蛍光検出器より得られる蛍光信号を、各フィルタ毎に区別して検出する微粒子検出制御装置と、該微粒子検出制御装置の検出信号を記録する画像信号記録装置とを備えることができる。
【０００９】
また、微粒子検出信号を、画像の輝度、画像の面積又は微粒子の数とすることができる。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の微粒子検出装置によれば、蛍光染色された微粒子に励起光照射する励起光発光器と、励起光照射により発光した蛍光を検出する蛍光検出器と、該蛍光検出器の前方で並列配置され、特定の波長領域のみを透過させる複数種類のフィルタとを備え、各フィルタを通過した微粒子の蛍光を蛍光検出器の検出素子に並列して結像させることから、微粒子の種類に応じて異なった波長の蛍光を発する場合や、同じ種類の微粒子であっても、生菌、死菌の区別により異なった波長の蛍光を発する場合等において、蛍光検出器における画像信号から複数のフィルタによる検出波長領域に応じた微粒子を同時に検出することができ、これにより、特殊な技術を必要とすることなく、試料中に種々含まれる微粒子をその種類や特性を高い分離能をもってかつ再現性よく分離するとともに、目的の微粒子を予め蛍光染色することにより、微量の微粒子であっても培養等の増殖処理することなく高感度に検出し、一層高い分離能でもって精度よく所望の微粒子を検出することができ、さらに、試料中に混在する微粒子が単に検出できるだけでなく、微粒子の種類毎に、また特性毎に分離して定量的に検出することができる。
【００１１】
この場合、蛍光検出器より得られる蛍光信号を、各フィルタ毎に区別して検出する微粒子検出制御装置と、該微粒子検出制御装置の検出信号を記録する画像信号記録装置とを備えることにより、複数種類のフィルタで複数種類の蛍光を同時に検出するとともに、その画像処理結果又は微粒子検出画像を同時に表示したり、パソコン等のメモリに保存、記録することができる。
【００１２】
また、微粒子検出信号を、画像の輝度、画像の面積又は微粒子の数とすることにより、その微粒子の検出結果の詳細データが明確となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明の微粒子検出装置の実施の形態を、図面に基づいて説明する。
【００１４】
本発明の微粒子検出装置は、泳動液を用いた微細管電気泳動法を利用することにより、試料中に種々含まれる複数種類の微粒子を高い分離能をもってかつ再現性よく分離する。
また、この微細管電気泳動法において、検出手段として蛍光検出器を利用することにより、目的の微粒子を予め蛍光染色することによって、微量の微粒子であっても培養等の増殖処理することなく高感度に検出できること、また、これにより、さらに一層高い分離能でもって精度よく所望の微粒子を検出することができる。
さらに、試料中に混在する微粒子が単に検出できるだけでなく、定量的に検出することができる。
なお、本発明でいう検出とは、試料中に含まれる所望微粒子の濃縮、他との分離、定性的検出、定量的検出、スクリーニング、生死判別等を包含するものである。
【００１５】
具体的には、例えば、下記の一部又は全部を構成要件として備えた微粒子検出装置である。
（１）微粒子を含む試料を、泳動液を用いて微細管電気泳動する。
（２）微粒子を含む試料を微粒子に選択的に結合するように蛍光染色し、これを微細管電気泳動に供して、蛍光染色された微粒子を蛍光検出する。
（３）微細管電気泳動を用いて微粒子を検出する装置であって、泳動液を含む水槽、泳動液に注入された微粒子を濃縮分離する微細管、又は濃縮された微粒子を検出するための検出手段を備えている。
（４）微細管電気泳動を用いて微粒子を検出する装置であって、微細管内に設けたｐＨ勾配により微粒子を濃縮する。
（５）検出手段として蛍光検出器を備えており、蛍光染色した微粒子に励起光照射し、蛍光染色された微粒子から発光された蛍光を光学系を用いて蛍光検出し、蛍光検出した画像信号から微粒子を検出する。
（６）特定の波長領域のみを透過させる複数種類のフィルタを、蛍光検出器の前方で同一平面上に並列配置し、各フィルタを通過した微粒子の蛍光を、蛍光検出器の検出素子に同時又は順次結像させるようにしている。
（７）また、光学系で蛍光検出した画像信号を記録する画像信号記録装置、画像信号から微粒子を検出した微粒子検出信号を記録する微粒子検出制御装置を有する。
（８）さらには、微粒子検出信号は、画像の輝度、規定した輝度以上の信号を有する画像の面積、画像を空間的、時間的に特徴付けて検出した微粒子の数等とする。
【実施例１】
【００１６】
図１に、本発明の微細管等電点電気泳動システムの基本的構成を一実施例として示す。
図１において、１はダイオード等の励起光発光器、２は微細管、３はその検出窓、４ａ、４ｂは電極、５ａ、５ｂは溶液、６は溶液中に含まれる微粒子、７は励起光発光器１より放射される励起光、８は対物レンズ、９は微粒子から発光される蛍光、１０はダイクロイックフィルタを示す。
また、１１ａ、１１ｂはそれぞれ特定の波長のみを通過させる２種類のフィルタ、１１ｃはノンフィルタ、すなわち、すべての波長の蛍光を通過するフィルタ、１２はＣＣＤカメラ等の蛍光検出器、１３は微粒子検出制御装置、１５は表示装置、１６は画像信号記録装置である。
【００１７】
検出対象物である有害菌等の微粒子、例えば、大腸菌やレジオネラ菌等の人体に有害な微生物は、予め所望の微生物とのみ選択的に結合するように蛍光染色しておき、例えば、キャピラリー等の微細管２の内部に、その両端に設置した溶液５ａ又は溶液５ｂより注入する。
溶液５ａ又は溶液５ｂは、検出の段階に応じて変更し、電極４ａ、４ｂにより微細管２の両端に高圧電源を印加する。
高電圧は図示しない電源より供給し、その電圧の大きさ、印加時間等は、例えば、パソコン等の微粒子検出制御装置１３より制御する。
【００１８】
励起光発光器１から発した励起光７は、ダイクロイックフィルタ１０で反射し、対物レンズ８より微細管の検出窓３より、蛍光染色された微粒子に照射される。
蛍光染色された微粒子は蛍光９を発光し、対物レンズ８より装置本体内に入射し、ダイクロイックフィルタ１０を透過する。
このとき、微粒子の種類に応じて結合する蛍光染色の特性に基づき、発する蛍光９は種々の波長を有する。例えば、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ試薬（Invitrogen社製）で蛍光染色した微生物に対して、青色の励起光を微生物に照射した場合、生菌の場合緑色の蛍光を発し、死菌の場合赤色の蛍光を発する。
これらの蛍光９は、ＣＣＤカメラ等で構成される蛍光検出器１２の直上部に設置したフィルタ１１ａ、１１ｂ及びノンフィルタ１１ｃを通過した後、蛍光検出器１２にそれぞれを並列して結像し、その画像信号は微粒子検出制御装置１３に送られ、検出処理される。
この検出画像信号は、画像信号記録装置１６に記録される。
蛍光染色された微粒子は後に述べる方法により濃縮され、検出窓３を通過させる。この通過時に微粒子の検出動作を行うことができる。
【００１９】
図２は、フィルタ１１ａ、１１ｂ、ノンフィルタ１１ｃの平面図であり、各フィルタ１１ａ、１１ｂ、１１ｃは、それぞれ矩形状に構成され、蛍光検出器１２のＣＣＤ受光素子の直上部で、微細管の長手方向に同一平面上で並列配置されている。
蛍光９を蛍光検出器１２に結像させるとき、各フィルタ１１ａ、１１ｂ、１１ｃをそれぞれ所望の波長の蛍光のみを通過させるような特性に構成すれば、所望の特性の蛍光のみを選択的に取得できる。取得した画像の処理内容に関しては、詳細を後述する。
【００２０】
図３は、微粒子の例として、微細管２内における有害菌である微生物の泳動状況を示したものであり、次に示す検出過程を踏む。
まず、検出対象としての微生物を含む試料である検水溶液を、例えば、溶液５ａとして準備し、溶液５ｂの側から吸引することにより、微細管２内に対象とする検水溶液２０として注入する。
次に、溶液５ａとして酸性溶液、例えば、リン酸等を用い、溶液５ｂとしてはアルカリ性（塩基性）溶液、例えば、苛性ソーダ等を用いる。電極４ａ、４ｂは、それぞれ図示しない高電圧電源に接続されており、微粒子検出制御装置１３により、電極４ａ（酸性の溶液５ａ側）には陽極、電極４ｂ（アルカリ性の溶液５ｂ側）には陰極の電圧を印加するように接続する。
ここで、微細管２の両端は、上記の酸性又はアルカリ性の溶液（泳動液と呼ぶ）にそれぞれ浸され、次いで高圧電源を作動すると、微細管２内の検水溶液２０に電位勾配が発生し、その結果、微細管内の泳動領域内（微細管内）の液全体は等電点現象により陰極方向と陽極方向の間にｐＨ勾配を発生する。
【００２１】
このとき、検水溶液２０内に存在し得る微粒子２１は、異なるｐＨ領域に拡散して存在するので、その電荷を持たない状態になる領域、すなわち、等電点位置２４又は２５に向かって泳動する。
すなわち、微粒子２１はそれが有する等電点と同じｐＨ条件の領域（等電点位置２４又は等電点位置２５）へと移動する。
例えば、等電点ｐＨがｐＨ（Ａ）である微粒子のｐＨレンジが等電点位置２４であるとすると、形成されたｐＨ勾配により、微粒子が等電点位置２４より電極（陰極）４ｂ側に存在する場合は移動方向２２に移動し、等電点位置２４より電極（陽極）４ａ側に存在する場合は移動方向２３に移動し、等電点位置２４に濃縮される。
同様に、等電点ｐＨがｐＨ（Ｂ）である微粒子のｐＨレンジが等電点位置２５であるとすると、形成されたｐＨ勾配により、微粒子が等電点位置２５より電極（陰極）４ｂ側に存在する場合は移動方向２２に移動し、等電点位置２５より電極（陽極）４ａ側に存在する場合は移動方向２３に移動し、等電点位置２５に濃縮される。
すなわち、微粒子はそれが有する等電点により微細管２内の等電点位置２４又は等電点位置２５に集積化され、濃縮された微粒子塊２４ａ又は微粒子塊２５ａを形成する。この等電点位置は、対象の微粒子の種類や生菌、死菌の状況により変化する。一般的には、微粒子の表面電荷成分は特定の等電点を持つので、上記微細管内ｐＨ勾配により、微粒子はそれぞれの特定箇所である等電点位置２４、２５等に濃縮される。
この状態になると、両電極４ａ、４ｂ間の泳動電流は定常状態になり、ほとんど流れなくなる。
【００２２】
次に、図４に示すように、溶液５ａはそのままの酸性溶液とし、溶液５ｂに、例えば、塩（モビライザ）を用いて、同様に電極４ａに陽極、電極４ｂに陰極の電圧を印可すると、図３の等電点位置２４又は等電点位置２５に濃縮された微粒子塊２４ａ又は微粒子塊２５ａは、再度発生した電位勾配により、例えば、モビライザで流される形で電極（陰極）４ｂに向かって移動方向２６に移動する。
このとき、微粒子塊２４ａ、２５ａは検出窓３を通過する。この微粒子塊は蛍光染色されており、図１で示したように、対物レンズ８より励起光が照射されると、蛍光染色の特性に応じた波長の蛍光色を発光する。
【００２３】
微細管２内への検体試料の注入方法は、特に制限されず、従来使用される重力法、加圧法及び減圧法のいずれをも使用することができる。
注入量も特に制限されないが、通常用いる微細管全域に試料を満たすため、その微細管のサイズに依存し、０．１〜１００μＬ、好ましくは０．５〜１００μＬ、より好ましくは０．５〜１０μＬを例示することができる。
【００２４】
また、上記で例示した一対の電極４ａ、４ｂ及び高圧電源は、微細管内に注入された微粒子が微細管内の泳動液中を泳動するのに必要な強さの電位勾配を、微細管中の泳動液に対して印加するための手段である。
かかる目的が達成できるものであれば、これらのもの（電源及び一対の電極）に何ら限定されることなく、任意の手段（電位勾配を印加するその他の手段）を使用することができる。
【００２５】
電極間にかけられる電圧としては、微細管長さに対して、一般に約１ｋＶ／ｍ〜約５００ｋＶ／ｍ、好ましくは約２ｋＶ／ｍ〜約１００ｋＶ／ｍ、より好ましくは約５ｋＶ／ｍ〜約２０ｋＶ／ｍを挙げることができる。
微細管としては、内径１〜１５０μｍ、長さ０．１〜１００ｃｍ、好ましくは内径２０〜１００μｍ、長さ１〜５０ｃｍの中空管を挙げることができる。その材質としては特に制限されず、ガラス（フューズドシリカ）製等を任意に選択することができる。
【００２６】
図５は、例えば、ここで検出対象とする微粒子２１として、微生物に適用した場合の微生物を拡大して示したもので、その外壁２１ａに選択的に結合する抗体３０、抗体３０を蛍光標識した蛍光色素３１等を示している。
なお、図示しないが、検出対象である微粒子２１に結合している抗体及び蛍光色素３１以外に、微粒子に結合しないままに溶液中を浮遊している抗体及び蛍光色素からも蛍光が発せられるが、濃縮位置が検出対象微粒子とは異なるので、時間経過を見ることにより分離することは可能である。
【００２７】
図６は、前述した対象微粒子の検出過程をフロー図で示したものである。
まず、検体溶液を微細管に注入し（ステップ３２）、ｐＨ勾配を設けることにより微粒子を等電点電気泳動し、微粒子塊（濃縮）とする（ステップ３３）。
次に、微粒子塊を微細管の中で泳動させ、微粒子塊の探索を行い（ステップ３４）、フィルタを通じてＣＣＤカメラ等で微粒子検出する（ステップ３５）。
以上の過程で、対象微粒子を検出する。
【００２８】
図７は、例えば、パソコン等の微粒子検出制御装置１３における微粒子の画像処理表示例を示した図である。
主なキーには、開始キー４０、中止キー４１、終了キー４２等がある。
開始キー４０をクリックして微粒子の検出動作を開始すると、状態表示４３は検出中となり、経過時間はコメント欄４４に表示し、コメント欄４５には異常の有無（ここでは正常）をそれぞれ表示する。
検出途中で検出動作を中止する場合は中止キー４１を、検出動作を終了する場合は終了キー４２をクリックする。
【００２９】
図７においては、フィルタ１１ａの直下におけるＣＣＤ素子から得られた画像を画面の左側の領域４６として示すとともに、フィルタ１１ｂの直下におけるＣＣＤ素子から得られた画像を画面の中央の領域４７として示し、また、ノンフィルタ１１ｃ直下におけるＣＣＤ素子から得られた画像を画面の右側の領域４８として示している。
ここで、５１ａ、５１ｂは微細管の管壁を示しており、蛍光染色された微粒子を検出すると、微粒子５２、５３、５４を画像に表示する。
これらの検出画像の輝度、形状、面積、空間的位置、その移動方向等から画像トラッキングを行い、その検出微粒子に固有の番号を付し、その数をカウントする。
この実施例では、領域４６に３個の微粒子５２を検出するとともに、領域４７に２個の微粒子５３を検出し、さらに領域４８に２個の微粒子５４を検出した場合を示している。
すなわち、微粒子５２は第１のフィルタ１１ａを通過したもの、微粒子５３は第２のフィルタ１１ｂを通過したもの、微粒子５４はノンフィルタ１１ｃ、すなわち、フィルタをかけなかった場合の微粒子をそれぞれ示している。これらは、時間とともに右方向に移動し、微粒子の波長条件とフィルタの組み合わせに基づき、消えたり現れたりすることとなる。
【００３０】
検出する微粒子の画像輝度やその面積等は、励起光７、蛍光９の強さ、対象とする微粒子の種類により変化する。
そこで、画像処理により検出する画像輝度値のレベル調整は、輝度値キー６０の▽（図においては黒塗り。以下、同じ。）をクリックすることにより変更する。
また、検出する画像面積の調整は、面積キー６１の▽をクリックすることにより変更する。
このような画像処理による微粒子検出技術は既存の技術であり、容易に実現可能である。
【００３１】
さらに、本実施例では、領域４６において検出した輝度の合計値６２、検出した微粒子の面積の総和６３、検出した微粒子数の瞬時値６４、及び検出動作開始後に検出した微粒子の総和６５を示しており、領域４７において検出した輝度の合計値６６、検出した微粒子の面積の総和６７、検出した微粒子数の瞬時値６８、及び検出動作開始後に検出した微粒子の総和６９をそれぞれ表示している。さらに領域４８において検出したデータを表示することも可能であるが、ここでは表示しない例を示した。
これにより、画像処理が正常に動作していることの確認ができる。また、得られたデータは、微粒子検出制御装置１３に内蔵するメモリ等の波形制御装置に保存する。
【００３２】
通常、微生物等の微粒子の検出に要する時間は数分から数十分と長時間に亘ることから、画像信号記録装置１６は多くの画像信号を記録できるＤＶＤデッキ等とすることが望ましい。
また、微粒子検出制御装置１３としては通常のパソコンで十分機能が発揮できるが、検出期間すべての画像の記録は困難なので、対象微粒子を検出した前後の画像のみを記録する、又は画像の記録は画像信号記録装置１６専用とし、微粒子検出制御装置１３には、本実施例で示したような画像処理結果、すなわち、対象微粒子に対する画像輝度、微粒子の数、その大きさ等、及び電気泳動のパラメータ等のみに限定してもよい。
【００３３】
また、微細管内にｐＨ勾配を設けることにより、微粒子を濃縮する方法の代りに、泳動領域で微細管内に電位勾配を発生させ、この電位勾配により微細管内液体全体の流れである電気浸透流が生じ、通常それは陽極から陰極方向への流れとなる。
微細管内に注入された微粒子は、上記発生した電位勾配に応答して、微粒子が有する表面電荷とは反対の極性を有する電極方向へ移動する。
結果として、微細管内での微粒子の泳動方向（陰極から陽極方向）及び速度は、上記電気浸透流速度と微粒子の移動度によって決まり、微細管の反対端の近く（陽極の近く）に濃縮する方式で微粒子を検出する方法等、適宜その方式を変更することができる。
【００３４】
また、微細管内で濃縮分離された微粒子を検出する手段としては、一般的には、分光学的、電気化学的、重量検出的方法のいずれもが使用できるが、好ましくは、ＵＶ−可視検出や蛍光検出、発光検出、光散乱検出等の光学検出法が挙げられる。
中でも、検出の特異性と感度に優れた蛍光検出法が好ましく、励起光として安価なＬＥＤで光量が不足の場合は、より高感度検出が可能なレーザー誘導蛍光検出法が望ましい。これらの蛍光に基づく検出は、特に有害な微生物等の検出において、免疫反応（抗原抗体反応）、細胞内酵素反応、及び核酸相補鎖形成反応等の反応を目的微生物に応じて適宜組み合わせることで、目的微生物をより特異的かつ高感度に検出することができる。
これらの方法の中でも免疫反応は、微生物試料に特別な前処理をする必要がなく、また特異性に優れている点で、好ましい方法の１つである。かかる免疫反応としては、具体的には蛍光色素標識抗体（単に蛍光抗体ともいう）、酵素標識抗体（単に酵素抗体ともいう）等を用いて目的の微生物を蛍光や酵素等で標識する方法を挙げることができる。
【００３５】
かくして、本実施例の微粒子検出装置は、蛍光染色された微粒子に励起光照射する励起光発光器１と、励起光照射により発光した蛍光を検出する蛍光検出器１２と、該蛍光検出器１２の前方で並列配置され、特定の波長領域のみを透過させる複数種類のフィルタ１１ａ、１１ｂ、１１ｃとを備え、各フィルタ１１ａ、１１ｂ、１１ｃを通過した微粒子の蛍光を蛍光検出器１２の検出素子に並列して結像させることから、検体試料中の微生物等の微粒子を短時間でかつ精度よく分離、検出、定量化することができる。すなわち、微生物の菌種・菌株を個々に分離することが可能となる。また、対象とする微生物に対して選択的に結合するように蛍光染色するので、特殊な技術を必要とすることなく、また培養操作なしに短時間にかつ容易にまた正確に検出できるため、高い精度の微生物検査とモニタリングシステムの確立が可能となる。
また、画像処理技術を用いて微生物を検出することにより、その画像処理結果、及び微生物検出画像をパソコン等のメモリに保存、記録することができる。したがって、その保存データを呼び出すことにより、検出結果の再確認、検体溶液供給者への詳細結果報告が可能となる。また、迅速な微生物対策、滅菌対策等に寄与することが可能となる。
また、蛍光検出手段として安価なＬＥＤ、又はレーザー誘導蛍光検出器等を利用することにより、所望の微生物を高感度かつ特異的に検出することができるので、試料を培養する等の増殖処理を施すことなく、微量の微生物を精度よく分離検出することができる。
また、本実施例の微粒子検出装置は、定量性を有するため、試料中に存在する菌体数を判別測定（定量検出）することも可能であり、また、試料中の微生物の検出が可能であるだけでなく、種々の微生物に特有の特異的検出試薬（例えば、抗体等）を使用することにより菌種の同定も可能である。
このように、本実施例の微粒子検出装置は、有害微粒子の検出（定性検出、定量検出）に適しているため、病原性微生物によって汚染された環境水や食品が早期に排除でき、病気の発生の防止に有用である。また、病原性微生物による患者の早期診断が可能になることから、有害微生物による被害の蔓延防止並びに早期治療の一助となる。さらには、食品の品質管理期間が短縮でき、また衛生管理の厳格性から賞味期間も延長可能であり、食品流通の経済性に大きく貢献することができる効果がある。
【００３６】
この場合、蛍光検出器１２より得られる蛍光信号を、各フィルタ１１毎に区別して検出する微粒子検出制御装置１３と、該微粒子検出制御装置１３の検出信号を記録する画像信号記録装置１６とを備えることにより、複数種類のフィルタ１１で複数種類の蛍光を同時に検出するとともに、その画像処理結果又は微粒子検出画像を同時に表示したり、パソコン等のメモリに保存、記録することができる。
また、微粒子検出信号を、画像の輝度、画像の面積又は微粒子の数とすることにより、その微粒子の検出結果の詳細データが明確となる。
【００３７】
以上、本発明の微粒子検出装置について、その実施例に基づいて説明したが、本発明は上記実施例に記載した構成に限定されるものではなく、その趣旨を逸脱しない範囲において適宜その構成を変更することができる。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
本発明の微粒子検出装置は、各種微粒子を迅速かつ高感度に分離検出するという特性を有していることから、例えば、浴槽水やプール、冷却塔の冷却水等の環境水、食品及び医療分野等において採取した検体試料中に混在する有害微生物等の微粒子を精度よく検出する用途に好適に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】本発明の微粒子検出装置の一実施例を示す概略構成図である。
【図２】フィルタの平面図である。
【図３】微細管電気泳動による微粒子の検出過程を示す説明図である。
【図４】微細管電気泳動による微粒子の検出過程の次段階の説明図である。
【図５】微粒子の詳細を示す拡大図である。
【図６】微粒子の検出動作を示すフロー図である。
【図７】微粒子検出制御装置における画像処理状況を表示した画面を示す図である。
【符号の説明】
【００４０】
１ 励起光発光器
２ 微細管
３ 検出窓
４ａ 電極（陽極）
４ｂ 電極（陰極）
５ａ 溶液
５ｂ 溶液
６ 微粒子
７ 励起光
８ 対物レンズ
９ 蛍光
１０ ダイクロイックフィルタ
１１ａ 第１のフィルタ
１１ｂ 第２のフィルタ
１１ｃ ノンフィルタ
１２ 蛍光検出器
１３ 微粒子検出制御装置
１５ 表示装置
１６ 画像信号記録装置
２０ 検水溶液
２１ 微粒子
２４ 等電点位置
２５ 等電点位置
３０ 抗体
３１ 蛍光色素
４０ 開始キー
４１ 中止キー
４２ 終了キー
４３ 状態表示
４４ 経過時間
４５ コメント欄
４６ 第１フィルタの画像領域
４７ 第２フィルタの画像領域
４８ ノンフィルタ領域
５１ａ 微細管の管壁
５１ｂ 微細管の管壁
５２ 第１フィルタ領域の微粒子画像
５３ 第２フィルタ領域の微粒子画像
５４ ノンフィルタ領域の微粒子画像
６０ 輝度値調整キー
６１ 面積調整キー
６２ 第１フィルタ領域の輝度合計値
６３ 第１フィルタ領域の微粒子の面積総和
６４ 第１フィルタ領域の微粒子数の瞬時値
６５ 第１フィルタ領域の微粒子の総和
６６ 第２フィルタ領域の輝度合計値
６７ 第２フィルタ領域の微粒子の面積総和
６８ 第２フィルタ領域の微粒子数の瞬時値
６９ 第２フィルタ領域の微粒子の総和
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料を微粒子の種類に応じて選択的に結合する蛍光染色で処理するとともに、該試料を泳動液を用いて微細管電気泳動することにより微粒子を検出する微粒子検出装置において、蛍光染色された微粒子に励起光照射する励起光発光器と、励起光照射により発光した蛍光を検出する蛍光検出器と、該蛍光検出器の前方で並列配置され、特定の波長領域のみを透過させる複数種類のフィルタとを備え、各フィルタを通過した微粒子の蛍光を蛍光検出器の検出素子に並列して結像させるようにしたことを特徴とする微粒子検出装置。
【請求項２】
蛍光検出器より得られる蛍光信号を、各フィルタ毎に区別して検出する微粒子検出制御装置と、該微粒子検出制御装置の検出信号を記録する画像信号記録装置とを備えたことを特徴とする請求項１記載の微粒子検出装置。
【請求項３】
微粒子検出信号を、画像の輝度、画像の面積又は微粒子の数としたことを特徴とする請求項１又は２記載の微粒子検出装置。
【請求項１】
試料を微粒子の種類に応じて選択的に結合する蛍光染色で処理するとともに、該試料を泳動液を用いて微細管電気泳動することにより微粒子を検出する微粒子検出装置において、蛍光染色された微粒子に励起光照射する励起光発光器と、励起光照射により発光した蛍光を検出する蛍光検出器と、該蛍光検出器の前方で並列配置され、特定の波長領域のみを透過させる複数種類のフィルタとを備え、各フィルタを通過した微粒子の蛍光を蛍光検出器の検出素子に並列して結像させるようにしたことを特徴とする微粒子検出装置。
【請求項２】
蛍光検出器より得られる蛍光信号を、各フィルタ毎に区別して検出する微粒子検出制御装置と、該微粒子検出制御装置の検出信号を記録する画像信号記録装置とを備えたことを特徴とする請求項１記載の微粒子検出装置。
【請求項３】
微粒子検出信号を、画像の輝度、画像の面積又は微粒子の数としたことを特徴とする請求項１又は２記載の微粒子検出装置。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２００８−９６１５６（Ｐ２００８−９６１５６Ａ）
【公開日】平成２０年４月２４日（２００８．４．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２７５４６４（Ｐ２００６−２７５４６４）
【出願日】平成１８年１０月６日（２００６．１０．６）
【出願人】（３０１０２１５３３）独立行政法人産業技術総合研究所 (6,529)
【出願人】（３９００００６８６）株式会社住化分析センター (72)
【出願人】（０００００５４５２）株式会社日立プラントテクノロジー (1,767)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年４月２４日（２００８．４．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１０月６日（２００６．１０．６）
【出願人】（３０１０２１５３３）独立行政法人産業技術総合研究所 (6,529)
【出願人】（３９００００６８６）株式会社住化分析センター (72)
【出願人】（０００００５４５２）株式会社日立プラントテクノロジー (1,767)
【Ｆターム（参考）】
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