生物または細胞の遺伝形質の変換速度を調節する方法であって、（ａ）該生物または細胞の遺伝子の複製におけるエラープローン頻度を調節する工程、を包含する、方法。本発明はまた、遺伝形質が調節された生物または細胞を生産する方法であって、（ａ）該生物または細胞の遺伝子の複製におけるエラープローン頻度を変化させる工程；および（ｂ）得られた該生物または細胞を再生産する工程、を包含する、方法をも提供する。エラープローン頻度に不均一性があることが好ましい。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞の遺伝形質の変換速度を調節する方法であって、
（ａ）該細胞の遺伝子の複製におけるエラープローン頻度を調節する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記遺伝子の複製を担う因子には、少なくとも２種類のエラープローン頻度の因子が存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記エラープローン頻度の因子は、エラープローン頻度が少ない因子が少なくとも約３０％存在することを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記遺伝子の複製を担う因子は、エラープローン頻度が不均一である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記エラープローン頻度が少ない因子は実質的にエラーフリーである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記エラープローン頻度の相違は、頻度が少なくとも１０^１異なることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記エラープローン頻度の相違は、頻度が少なくとも１０^２異なることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記エラープローン頻度の相違は、頻度が少なくとも１０^３異なることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
前記エラープローン頻度を調節する工程は、前記細胞の異常塩基の除去修復因子およびミスマッチ塩基対修復因子からなる群より選択される少なくとも１つの因子のエラープローン頻度を調節することを包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記エラープローン頻度を調節する工程は、前記細胞のゲノムＤＮＡ二本鎖の一方の鎖と他方の鎖とのエラーの発生数を異なるようにさせることを包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記エラープローン頻度を調節する工程は、前記細胞のＤＮＡポリメラーゼのエラープローン頻度を調節することを包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＤＮＡポリメラーゼは、校正機能を有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＤＮＡポリメラーゼは、真核細胞におけるＤＮＡポリメラーゼα、ＤＮＡポリメラーゼβ、ＤＮＡポリメラーゼγ、ＤＮＡポリメラーゼδおよびＤＮＡポリメラーゼεならびにそれらに対応するＤＮＡポリメラーゼからなる群より選択される少なくとも１つのポリメラーゼを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記エラープローン頻度の調節は、真核細胞におけるＤＮＡポリメラーゼδおよびＤＮＡポリメラーゼεならびにそれに対応するＤＮＡポリメラーゼからなる群より選択される少なくとも１つのポリメラーゼの校正活性を調節することを包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記エラープローン頻度の調節は、真核細胞におけるＤＮＡポリメラーゼδまたはそれに対応するＤＮＡポリメラーゼの校正活性を調節することを包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記エラープローン頻度の調節は、ＤＮＡポリメラーゼの改変体を前記細胞に導入することを包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＤＮＡポリメラーゼの改変体の導入は、相同組み換え、遺伝子導入またはプラスミドによる形質転換からなる群より選択される方法による、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記エラープローン頻度の調節は、真核細胞におけるＤＮＡポリメラーゼδまたはそれに対応するＤＮＡポリメラーゼの改変体を前記細胞に導入することを包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記真核細胞におけるＤＮＡポリメラーゼδまたはそれに対応するＤＮＡポリメラーゼの改変体は、校正機能のみを欠失するような変異を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記エラープローン頻度の調節は、エラープローン頻度を野生型よりも上げることを包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＤＮＡポリメラーゼの校正機能は、野生型のものよりも低い、請求項１２に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＤＮＡポリメラーゼの校正機能は、野生型ＤＮＡポリメラーゼが提供するよりも少なくとも１つ多い、塩基のミスマッチ変異が含まれるように校正する機能である、請求項１２に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＤＮＡポリメラーゼの校正機能は、少なくとも１つの塩基のミスマッチ変異が含まれるように校正する機能である、請求項１２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＤＮＡポリメラーゼの校正機能は、少なくとも２つの塩基のミスマッチ変異が含まれるように校正する機能である、請求項１２に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＤＮＡポリメラーゼの校正機能は、１０^−６の割合で塩基のミスマッチ変異が含まれるように校正する機能である、請求項１２に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＤＮＡポリメラーゼの校正機能は、１０^−３の割合で塩基のミスマッチ変異が含まれるように校正する機能である、請求項１２に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＤＮＡポリメラーゼの校正機能は、１０^−２の割合で塩基のミスマッチ変異が含まれるように校正する機能である、請求項１２に記載の方法。
【請求項２８】
前記細胞は、グラム陽性または真核生物の細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
前記細胞は、真核生物の細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
前記細胞は、単細胞細胞または多細胞細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
前記細胞は、動物、植物、真菌または酵母の細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
前記細胞は、哺乳動物の細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
前記細胞は、所望の形質の変換後も、野生型と実質的に同じ成長を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
前記細胞は、天然において少なくとも２種類のポリメラーゼを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３５】
前記細胞は、天然において少なくとも２種類のポリメラーゼを有し、そのエラープローン頻度が互いに異なる、請求項１に記載の方法。
【請求項３６】
前記細胞は、少なくとも２種類のポリメラーゼを有し、該２種類のポリメラーゼのうち一つは、ラギング鎖のエラープローン頻度に関与し、２つ目は、リーディング鎖のエラープローン頻度に関与する、請求項１に記載の方法。
【請求項３７】
前記細胞は、該細胞が前記変換前において耐性を有していなかった環境に対する耐性を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項３８】
前記環境は、温度、湿度、ｐＨ、塩濃度、栄養、金属、ガス、有機溶媒、圧力、気圧、粘性、流速、光度、光波長、電磁波、放射線、重力、張力、音波、前記細胞とは異なる他の細胞、化学薬品、抗生物質、天然物、精神的ストレスおよび物理的ストレスからなる群より選択される少なくとも１つの因子またはその組み合わせをパラメータとして包含する、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記細胞は、がん細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４０】
前記細胞は、組織を構成する、請求項１に記載の方法。
【請求項４１】
前記細胞は、生物を構成する、請求項１に記載の方法。
【請求項４２】
前記細胞の遺伝形質が変換された後に組織または生物体へと分化させる工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項４３】
前記エラープローン頻度の調節は、所定の条件下で生じる、請求項１に記載の方法。
【請求項４４】
前記エラープローン頻度の調節は、温度、湿度、ｐＨ、塩濃度、栄養、金属、ガス、有機溶媒、圧力、気圧、粘性、流速、光度、光波長、電磁波、放射線、重力、張力、音波、前記細胞とは異なる他の細胞、化学薬品、抗生物質、天然物、精神的ストレスおよび物理的ストレス、ならびにその組み合わせからなる群より選択される少なくとも１つの因子を調節することを包含する、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
遺伝形質が調節された細胞を生産する方法であって、
（ａ）該細胞の遺伝子の複製におけるエラープローン頻度を調節する工程；および
（ｂ）得られた細胞を再生産する工程、
を包含する、方法。
【請求項４６】
前記再生産した細胞のうち、所望の形質を有する個体を選択する工程をさらに包含する、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記遺伝子の複製を担う因子には、少なくとも２種類のエラープローン頻度の因子が存在する、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記エラープローン頻度の因子は、エラープローン頻度が少ない因子が少なくとも約３０％存在することを特徴とする、請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
前記遺伝子の複製を担う因子は、エラープローン頻度が不均一である、請求項４５に記載の方法。
【請求項５０】
前記エラープローン頻度が少ない因子は実質的にエラーフリーである、請求項４５に記載の方法。
【請求項５１】
前記エラープローン頻度の相違は、頻度が少なくとも１０^１異なることを特徴とする、請求項４５に記載の方法。
【請求項５２】
前記エラープローン頻度の相違は、頻度が少なくとも１０^２異なることを特徴とする、請求項４５に記載の方法。
【請求項５３】
前記エラープローン頻度の相違は、頻度が少なくとも１０^３異なることを特徴とする、請求項４５に記載の方法。
【請求項５４】
前記エラープローン頻度を調節する工程は、前記細胞の異常塩基の除去修復因子およびミスマッチ塩基対修復因子からなる群より選択される少なくとも１つの因子のエラープローン頻度を調節することを包含する、請求項４５に記載の方法。
【請求項５５】
前記エラープローン頻度を調節する工程は、前記細胞のゲノムＤＮＡ二本鎖の一方の鎖と他方の鎖とのエラーの発生数を異なるようにさせることを包含する、請求項４５に記載の方法。
【請求項５６】
前記エラープローン頻度を調節する工程は、前記細胞のＤＮＡポリメラーゼのエラープローン頻度を調節することを包含する、請求項４５に記載の方法。
【請求項５７】
前記ＤＮＡポリメラーゼは、校正機能を有する、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記ＤＮＡポリメラーゼは、真核細胞におけるＤＮＡポリメラーゼα、ＤＮＡポリメラーゼβ、ＤＮＡポリメラーゼγ、ＤＮＡポリメラーゼδおよびＤＮＡポリメラーゼεならびにそれらに対応するＤＮＡポリメラーゼからなる群より選択される少なくとも１つのポリメラーゼを含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
前記エラープローン頻度の調節は、真核細胞におけるＤＮＡポリメラーゼδおよびＤＮＡポリメラーゼεならびにそれに対応するＤＮＡポリメラーゼからなる群より選択される少なくとも１つのポリメラーゼの校正活性を調節することを包含する、請求項４５に記載の方法。
【請求項６０】
前記エラープローン頻度の調節は、真核細胞におけるＤＮＡポリメラーゼδまたはそれに対応するＤＮＡポリメラーゼの校正活性を調節することを包含する、請求項４５に記載の方法。
【請求項６１】
前記エラープローン頻度の調節は、ＤＮＡポリメラーゼの改変体を前記細胞に導入することを包含する、請求項４５に記載の方法。
【請求項６２】
前記ＤＮＡポリメラーゼの改変体の導入は、相同組み換え、遺伝子導入またはプラスミドによる形質転換からなる群より選択される方法による、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記エラープローン頻度の調節は、真核細胞におけるＤＮＡポリメラーゼδまたはそれに対応するＤＮＡポリメラーゼの改変体をコードする核酸分子を前記細胞に導入することを包含する、請求項４５に記載の方法。
【請求項６４】
前記真核細胞におけるＤＮＡポリメラーゼδまたはそれに対応するＤＮＡポリメラーゼの改変体は、校正機能のみを欠失するような変異を含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記エラープローン頻度の調節は、エラープローン頻度を野生型よりも上げることを包含する、請求項４５に記載の方法。
【請求項６６】
前記ＤＮＡポリメラーゼの校正機能は、野生型のものよりも低い、請求項５７に記載の方法。
【請求項６７】
前記ＤＮＡポリメラーゼの校正機能は、野生型ＤＮＡポリメラーゼが提供するよりも少なくとも１つ多い、塩基のミスマッチ変異が含まれるように校正する機能である、請求項５７に記載の方法。
【請求項６８】
前記ＤＮＡポリメラーゼの校正機能は、少なくとも１つの塩基のミスマッチ変異が含まれるように校正する機能である、請求項５７に記載の方法。
【請求項６９】
前記ＤＮＡポリメラーゼの校正機能は、少なくとも２つの塩基のミスマッチ変異が含まれるように校正する機能である、請求項５７に記載の方法。
【請求項７０】
前記ＤＮＡポリメラーゼの校正機能は、１０^−６の割合で塩基配列の変異が含まれるように校正する機能である、請求項５７に記載の方法。
【請求項７１】
前記ＤＮＡポリメラーゼの校正機能は、１０^−３の割合で塩基配列の変異が含まれるように校正する機能である、請求項５７に記載の方法。
【請求項７２】
前記ＤＮＡポリメラーゼの校正機能は、１０^−２の割合で塩基配列の変異が含まれるように校正する機能である、請求項５７に記載の方法。
【請求項７３】
前記細胞は、グラム陽性または真核生物の細胞である、請求項４５に記載の方法。
【請求項７４】
前記細胞は、真核生物の細胞である、請求項４５に記載の方法。
【請求項７５】
前記細胞は、単細胞細胞または多細胞細胞である、請求項４５に記載の方法。
【請求項７６】
前記細胞は、動物、植物、真菌または酵母の細胞である、請求項４５に記載の方法。
【請求項７７】
前記細胞は、哺乳動物の細胞である、請求項４５に記載の方法。
【請求項７８】
前記遺伝形質が調節された細胞は、野生型と実質的に同じ成長を示す、請求項４５に記載の方法。
【請求項７９】
前記細胞は、天然において少なくとも２種類のポリメラーゼを有する、請求項４５に記載の方法。
【請求項８０】
前記細胞は、天然において少なくとも２種類のポリメラーゼを有し、そのエラープローン頻度が互いに異なる、請求項４５に記載の方法。
【請求項８１】
前記細胞は、少なくとも２種類のポリメラーゼを有し、該２種類のポリメラーゼのうち一つは、ラギング鎖のエラープローン頻度に関与し、２つ目は、リーディング鎖のエラープローン頻度に関与する、請求項４５に記載の方法。
【請求項８２】
前記細胞は、該細胞が前記変換前において耐性を有していなかった環境に対する耐性を示す、請求項４５に記載の方法。
【請求項８３】
前記環境は、温度、湿度、ｐＨ、塩濃度、栄養、金属、ガス、有機溶媒、圧力、気圧、粘性、流速、光度、光波長、電磁波、放射線、重力、張力、音波、前記細胞とは異なる他の細胞、化学薬品、抗生物質、天然物、精神的ストレスおよび物理的ストレスからなる群より選択される少なくとも１つの因子またはその組み合わせをパラメータとして包含する、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
前記細胞は、がん細胞を有する、請求項４５に記載の方法。
【請求項８５】
前記細胞は、組織を構成する、請求項４５に記載の方法。
【請求項８６】
前記細胞は、生物を構成する、請求項４５に記載の方法。
【請求項８７】
前記細胞の遺伝形質が変換された後に組織または生物体へと分化させる工程をさらに包含する、請求項４５に記載の方法。
【請求項８８】
前記エラープローン頻度の調節は、所定の条件下で生じる、請求項４５に記載の方法。
【請求項８９】
前記エラープローン頻度の調節は、温度、湿度、ｐＨ、塩濃度、栄養、金属、ガス、有機溶媒、圧力、気圧、粘性、流速、光度、光波長、電磁波、放射線、重力、張力、音波、前記細胞とは異なる他の細胞、化学薬品、抗生物質、天然物、精神的ストレスおよび物理的ストレス、ならびにその組み合わせからなる群より選択される少なくとも１つの因子を調節することを包含する、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
遺伝形質が調節された生物を生産する方法であって、
（ａ）該生物の遺伝子の複製におけるエラープローン頻度を調節する工程；および
（ｂ）得られた生物を再生産する工程、
を包含する、方法。
【請求項９１】
請求項９０に記載の方法によって生産された、遺伝形質が調節された細胞。
【請求項９２】
前記生物は、野生型と実質的に同じ成長を示す、請求項９１に記載の細胞。
【請求項９３】
請求項９０に記載の方法によって生産された、遺伝形質が調節された生物。
【請求項９４】
前記生物は、野生型と実質的に同じ成長を示す、請求項９３に記載の生物。
【請求項９５】
遺伝形質が調節された遺伝子をコードする核酸分子を生産する方法であって、
（ａ）生物の遺伝子の複製におけるエラープローン頻度を変化させる工程；
（ｂ）得られた該生物を再生産する工程；
（ｃ）該生物において変異を同定する工程；および
（ｄ）同定された変異を含む遺伝子をコードする核酸分子を生産する工程、
を包含する、方法。
【請求項９６】
請求項９５に記載の方法によって生産された、核酸分子。
【請求項９７】
遺伝形質が調節された遺伝子がコードするポリペプチドを生産する方法であって、
（ａ）生物の遺伝子の複製におけるエラープローン頻度を変化させる工程；
（ｂ）得られた該生物を再生産する工程；
（ｃ）該生物において変異を同定する工程；および
（ｄ）同定された変異を含む遺伝子がコードするポリペプチドを生産する工程、
を包含する、方法。
【請求項９８】
請求項９７に記載の方法によって生産された、ポリペプチド。
【請求項９９】
遺伝形質が調節された生物の代謝物を生産する方法であって、
（ａ）生物の遺伝子の複製におけるエラープローン頻度を変化させる工程；
（ｂ）得られた該生物を再生産する工程；
（ｃ）該生物において変異を同定する工程；および
（ｄ）同定された変異を含む代謝物を生産する工程、
を包含する、方法。
【請求項１００】
請求項９９に記載の方法によって生産された、代謝物。
【請求項１０１】
生物の遺伝形質を調節するための核酸分子であって、該核酸分子は、エラープローン頻度を調節されたＤＮＡポリメラーゼをコードする核酸配列を含む、核酸分子。
【請求項１０２】
前記ＤＮＡポリメラーゼは、真核生物におけるＤＮＡポリメラーゼδまたはε、あるいはグラム陽性細菌における対応するＤＮＡポリメラーゼである、請求項１０１に記載の核酸分子。
【請求項１０３】
前記ＤＮＡポリメラーゼは、真核生物におけるＤＮＡポリメラーゼδまたはε、あるいはグラム陽性細菌における対応するＤＮＡポリメラーゼにおいて、校正機能のみを欠失するような変異において改変を有する、請求項１０１に記載の核酸分子。
【請求項１０４】
前記ＤＮＡポリメラーゼは、真核生物におけるＤＮＡポリメラーゼδ、あるいはグラム陽性細菌における対応するＤＮＡポリメラーゼにおいて、校正機能のみを欠失するような変異において改変を有する、請求項１０１に記載の核酸分子。
【請求項１０５】
請求項１０１に記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項１０６】
請求項１０１に記載の核酸分子を含む、細胞。
【請求項１０７】
真核生物細胞である、請求項１０６に記載の細胞。
【請求項１０８】
前記真核生物細胞は、植物、動物および酵母からなる群より選択される、請求項１０７に記載の細胞。
【請求項１０９】
グラム陽性細菌細胞である、請求項１０６に記載の細胞。
【請求項１１０】
遺伝形質の変換速度を調節するために使用される、請求項１０６に記載の細胞。
【請求項１１１】
請求項１０１に記載の核酸分子を含む、生物。
【請求項１１２】
請求項１０６に記載の細胞またはその一部が生産する、生産物質。
【請求項１１３】
請求項１０６に記載の細胞またはその一部に含まれる、核酸分子。
【請求項１１４】
前記調節された遺伝形質を担う遺伝子をコードする、請求項１１３に記載の核酸分子。
【請求項１１５】
請求項１０６に記載の細胞を病態モデルとして使用して薬剤の効果を試験する工程、コントロールとして野生型の細胞を使用して薬剤の効果を試験する工程、および該病態モデルと該コントロールとの対比を行う工程を包含する、薬剤の試験方法。
【請求項１１６】
請求項１１１に記載の生物を病態モデルとして使用して薬剤の効果を試験する工程、コントロールとして野生型の細胞を使用して薬剤の効果を試験する工程、および該病態モデルと該コントロールとの対比を行う工程を包含する、薬剤の試験方法。
【請求項１１７】
生物の遺伝形質の変換速度を調節するために使用される、少なくとも２つのポリメラーゼのセットであって、該ポリメラーゼのエラープローン頻度は互いに異なる、セット。
【請求項１１８】
前記少なくとも２つのポリメラーゼのうち少なくとも１つはラギング鎖のエラープローン頻度に関与し、少なくとも別の一つはリーディング鎖のエラープローン頻度に関与する、請求項１１７に記載のセット。
【請求項１１９】
前記ポリメラーゼのセットは、同一種生物由来である、請求項１１７に記載のセット。
【請求項１２０】
遺伝形質が調節された生物を生産するために使用される、少なくとも２つのポリメラーゼのセットであって、該ポリメラーゼのエラープローン頻度は互いに異なる、セット。
【請求項１２１】
前記少なくとも２つのポリメラーゼのうち少なくとも１つはラギング鎖のエラープローン頻度に関与し、少なくとも別の一つはリーディング鎖のエラープローン頻度に関与する、請求項１２０に記載のセット。
【請求項１２２】
前記ポリメラーゼのセットは、同一種生物由来である、請求項１２１に記載のセット。
【請求項１２３】
生物の遺伝形質の変換速度を調節するための、少なくとも２つのポリメラーゼのセットの使用であって、該ポリメラーゼのエラープローン頻度は互いに異なる、使用。
【請求項１２４】
遺伝形質が調節された生物を生産するための、少なくとも２つのポリメラーゼのセットの使用であって、該ポリメラーゼのエラープローン頻度は互いに異なる、使用。

【図１】

【図２】

【図３Ａ】

【図３Ｂ】

【図４Ａ】

【図４Ｂ】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【図１６】

【図１７】

【図１８】

【公表番号】特表２００６−５２１１１３（Ｐ２００６−５２１１１３Ａ）
【公表日】平成１８年９月２１日（２００６．９．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５０７６９６（Ｐ２００６−５０７６９６）
【出願日】平成１６年３月２６日（２００４．３．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００４３７８
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０８７９６０
【国際公開日】平成１６年１０月１４日（２００４．１０．１４）
【出願人】（５９１１８８４０２）
【出願人】（５０３１１６６９３）株式会社ネオ・モルガン研究所 (10)
【Ｆターム（参考）】