抗炎症剤
【課題】炎症を効率的に抑制でき、且つ副作用の少ない安全性の高い抗炎症剤を提供する。
【解決手段】４−アミノ−６−ハイドロキシピラゾロ（３，４−ｄ）ピリミジン、その薬学的に許容される塩、その誘導体、または４−アミノ−６−ハイドロキシピラゾロ（３，４−ｄ）ピリミジンを含有するミセル体を含有する抗炎症剤である。４−アミノ−６−ハイドロキシピラゾロ（３，４−ｄ）ピリミジンは、さらに、スチレンマレイン酸コポリマーやＰＥＧ、アクリル酸、ビニル酢酸等の高分子化合物と結合することで水溶性と血中滞留性が向上し、なお且つ、病巣により効率よく集積することにより、副作用が減少することも特徴とする。
【解決手段】４−アミノ−６−ハイドロキシピラゾロ（３，４−ｄ）ピリミジン、その薬学的に許容される塩、その誘導体、または４−アミノ−６−ハイドロキシピラゾロ（３，４−ｄ）ピリミジンを含有するミセル体を含有する抗炎症剤である。４−アミノ−６−ハイドロキシピラゾロ（３，４−ｄ）ピリミジンは、さらに、スチレンマレイン酸コポリマーやＰＥＧ、アクリル酸、ビニル酢酸等の高分子化合物と結合することで水溶性と血中滞留性が向上し、なお且つ、病巣により効率よく集積することにより、副作用が減少することも特徴とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、４−アミノ−６−ハイドロキシピラゾロ（３，４−ｄ）ピリミジンの水可溶性医薬製剤に係り、詳しくは、抗炎症剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
組織が損傷を受けると、損傷箇所の血管内皮細胞でプロスタグランジンや炎症性サイトカインが産生される。プロスタグランジンや炎症性サイトカインは、発熱、血管拡張、血管透過性の亢進、白血球の走化性亢進、白血球や血管内皮細胞の活性化、活性化白血球の血管内皮細胞への粘着や浸潤など、様々な生理作用を示す。そしてさらに、活性化した白血球からもプロスタグランジンやロイコトリエンなどが産生され、炎症反応は加速される。走化性の亢進した白血球は、血管内皮細胞の結合部から血管外の炎症部位へ浸潤し、そこで感染防御のために微生物、病原体や不要物質の貪食を行う。その結果、病原体や抗原など有害な不要物質が減少して組織細胞が増殖することで治癒に至る。しかし、白血球の浸潤が持続すると、逆に更なる組織損傷が起きてしまい、炎症が慢性化してしまう。
このような、炎症反応を抑える抗炎症剤としては、従来からステロイド系抗炎症剤や非ステロイド系抗炎症剤、例えばシクロオキシゲナーゼ（以下、ＣＯＸと記載することもある）阻害剤などが使用されている。非ステロイド系抗炎症剤としては、アスピリン、サリチル酸やインドメタシン等が挙げられる。これらの抗炎症剤は、プロスタグランジンの生合成につながるアラキドン酸カスケードでのＣＯＸとアラキドン酸との結合を阻害することにより、抗炎症活性を示す。このように、ステロイド系抗炎症剤や非ステロイド系抗炎症剤は、シクロオキシゲナーゼ活性を阻害することにより、患部での炎症や痛みは抑えることができる。しかし、反面、ＣＯＸ活性が阻害されることにより、胃や肝臓では血流が減少してしまい、胃潰瘍や腎機能に悪い影響を及ぼすことが指摘されている。
【０００３】
また、４−アミノ−６−ハイドロキシピラゾロ（３，４−ｄ）ピリミジン（以下、ＡＨＰＰと記載することもある）の活性に関しては、血圧降下作用を有することが当発明者らの特許文献１に開示されている。しかし、ＡＨＰＰは、水不溶性であるため、水可溶性とする必要があり、これまで、ＡＨＰＰを水可溶性にした血圧降下製剤は得られていない。
【特許文献１】特開平９−１１８６２２号公報
【非特許文献１】Ｔ． Ｏｄａ ｅｔ ａｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４４， ９７４−９７６（１９８９）
【非特許文献２】Ｔ． Ａｋａｉｋｅ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．， ８５，７３９−７４５ （１９９０）
【非特許文献３】Ｔ． Ａｋａｉｋｅ ｅｔ ａｌ， ＰＮＡＳ．， ９３， ２４４８−２４５３（１９９６）
【非特許文献４】Ｙ．Ｍａｔｓｕｍｕｒａ， ａｎｄ Ｈ．Ｍａｅｄａ， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ４６， ６３８７−６３９２， (１９８６）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、炎症を効率的に抑制でき、且つ副作用を示さず、安全性の高い抗炎症剤を提供することを目的とする。
さらに、また本発明は、水可溶性のキサンチンオキシダーゼ（以下、ＸＯと記載することもある）の阻害能を有するＡＨＰＰ製剤を提供することを目的とする。水可溶性のＡＨＰＰ製剤は、活性酸素であるスーパーオキサイド（以下、Ｏ２-と記載することもある）の生成を抑え、従ってそのＯ２-による一酸化窒素（以下、ＮＯと記載することもある）の消費を抑え、逆に消費されないＮＯによりその濃度が上昇することにより血圧降下製剤や、さらにまたＯ２-とＮＯより生じる起炎症性のパーオキシナイトライト（ＯＮＯＯ-）を抑え、従って抗炎症剤として使用することができる。
【０００５】
本発明者らは、これまでにインフルエンザの増悪化のメカニズムにＯ２-やＮＯが深く関与することを解明した（非特許文献１〜３）。
さらに、Ｏ２-がＸＯにより生成されていることも明らかにしている。Ｏ２-は、ＮＯ、即ち血管内皮由来弛緩因子（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｒｅｌａｘｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ；降圧物質ＥＤＲＦ）と反応しＯＮＯＯ-となり、ＮＯを消費することから、血圧降下作用を有するＮＯの欠乏により正常な血圧が困難となり、高血圧症を招来すると考えられる。本発明者らはそこで、ＡＨＰＰによりＯ２-を抑えることによりラットの血圧上昇抑制効果を有することを発見し、特許出願を行っている（特許文献１）。
【０００６】
また、本発明者らはＯ２-やＯＮＯＯ-となどの活性酸素分子種は、ウィルス感染や薬物、その他による炎症の原因に深く関わっていることを明らかにしている。そこで、Ｏ２-の生成を触媒する主要な酵素の一つであるＸＯに対する阻害剤を投与することにより、ＸＯより生成する活性酸素分子種が関わる炎症を抑制することができると考え、鋭意研究を進め、本発明を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、４−アミノ−６−ハイドロキシピラゾロ（３，４−ｄ）ピリミジン、その薬学的に許容される塩、その誘導体、または４−アミノ−６−ハイドロキシピラゾロ（３，４−ｄ）ピリミジンを含有するミセル体を活性本体とする抗炎症剤である。
本発明はまた、４−アミノ−６−ハイドロキシピラゾロ（３，４−ｄ）ピリミジンの誘導体、または４−アミノ−６−ハイドロキシピラゾロ（３，４−ｄ）ピリミジンを含有するミセル体を含有する医薬製剤である。本発明の医薬製剤は、抗炎症剤や血圧降下剤としＸＯの酵素活性を抑えることによって得られる薬効をめざして使用することができる。
４−アミノ−６−ハイドロキシピラゾロ（３，４−ｄ）ピリミジンは、式１で表わされる化合物である。そして、その誘導体は、式２で表される化合物である。式２中、Ｘは、式３〜式６で表わされる何れか１つの置換基である。
【０００８】
【化１】
【０００９】
【化２】
【００１０】
【化３】
なお、ここで、ｋは３〜２００の自然数を表わす。重合度の上限を２００としたのは、ミセルの形成がＳＭＡの３本鎖により成っていると考えると、１個の薬剤活性部位（ＡＨＰＰ）に対し、ＳＭＡは３倍となり、相対的にＡＨＰＰの濃度（含量）が希釈される。従って、高い比活性を維持するためにはＳＭＡの量を相対的に低く抑えた。
【００１１】
【化４】
なお、ここで、式中のｌ（エル）は１〜１０００の自然数を表わす。１０００以上の場合は、水系での溶解度が低下するため実用性に欠ける。
【００１２】
【化５】
【００１３】
【化６】
なお、ここで、ｍ、ｎは夫々１〜１０００の自然数を表わす。なお、ｍ＞ｎが好ましい。１０００以上の場合は、水系での溶解度が低下するため実用性に欠ける。
【００１４】
また、４−アミノ−６−ハイドロキシピラゾロ（３，４−ｄ）ピリミジンを含有するミセル体は、４−アミノ−６−ハイドロキシピラゾロ（３，４−ｄ）ピリミジンの、スチレンマレイン酸コポリマー（以下、ＳＭＡと記載することもある）を用いて非共有結合により形成されるミセル化した製剤である。具体的には、式７で表わされる。これはＡＨＰＰとＳＭＡは、非共有結合物（複合体）であることが特徴といえる。
【００１５】
【化７】
なお、ここで、ｐは３〜２００の自然数を表わす。その重合度の範囲が限られているのは、上記ｋと同じ理由である。
【発明の効果】
【００１６】
本発明により、炎症を効率的に抑制でき、且つ副作用の少ない安全性の高い抗炎症剤を提供することが可能となる。本発明の抗炎症剤は、ＡＨＰＰの水可溶性の誘導体ある。これらの誘導体（剤形）は、溶液中、血中、体内では高分子として挙動しているため、血中投与時の血中滞留性の向上と病巣、即ち、炎症部への指向性が一段と強くなっている。これは、その性状の特性である腫瘍部や炎症部におけるＥｎｈａｎｃｅｄ Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｅｆｆｅｃｔ （ＥＰＲ）効果（非特許文献４）による集積性の向上といえる。即ち、これらの手法により一段と優れた医薬品にすることが可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
ＡＨＰＰは、公知の化合物であり、３−アミノ−４−シアノピラゾールと尿素との反応により合成することができる。またＡＨＰＰの薬学的に許容される誘導体としては、特に、ここに例示するものだけに制限されるものではなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、アミノ酸（アスパラギン酸、グルタミン酸、コハク酸等）、クエン酸塩、グルコン酸塩、アスコルビン酸塩等の有機酸誘導体、グルコース、マルトース、フルクトース、ソルビトール、キシロース、マンノース等、ε‐カプロラクタム等が挙げられる。
また、ＡＨＰＰ誘導体は、ＡＨＰＰをＳＭＡ、ポリエチレングリコール（以下、ＰＥＧと記載することもある）、アクリル酸又はポリビニル酢酸（以下、ＰＶと記載することもある）等の水溶性の低〜高分子残基とアミド結合した化合物である。また、ＡＨＰＰをＳＭＡ、ＰＥＧ、アクリル酸又はＰＶ、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ヒドロキシプロピルメタアクリレート（ＨＰＭＡ）コポリマー、ジビニルマレイン酸（無水）コポリマー（ピランコポリマー）等を用い、非共有結合により形成されるミセル化した製剤である。
ＡＨＰＰは水不溶性物質であるが、水溶性高分子あるいは重合度の低いＰＥＧなどと結合あるいはミセル化することにより、水可溶性となるばかりでなく高分子化によって一段と優れた医薬品となる。
【００１８】
本発明の抗炎症剤の投与形態は、経口投与剤又は注射剤あるいは座薬のいずれでもよい。経口での投与量は患者の年齢、体重、疾患の程度に応じて調節すればよく、例えば、成人一人当たり１００〜９０００ｍｇを１日１回ないし数回に分けて投与するのが好ましい。注射剤は、静脈内投与とするのが好ましく、点滴等により静脈内へ投与してもよい。注射の場合、ＡＨＰＰ含有量は３〜５００ｍｇ／ｋｇの範囲が好ましい。
以下に実施例に基づき本発明を説明する。
【実施例１】
【００１９】
ＳＭＡ−ＡＨＰＰを図１に示すスキームで合成した。
３６．３ｍｇのＡＨＰＰ（分子量１５１．１、微粉末状、和光純薬、大阪）に５．０ｍｌの０．１Ｍ ＮａＯＨまたは０．１Ｍ ＫＯＨを加えて溶解させ、７．３ｍｇ／ｍｌ（４８ｍＭ）のアルカリ溶液を調製した。得られたＡＨＰＰ溶液に、撹拌下で約２倍のモル量（分子量を１２００と仮定）の５７６ｍｇ（９６ｍＭ）のＳＭＡ無水物（微粉末状）を約５０ｍｇずつ数時間にわたりゆっくり加え、反応させた。ＳＭＡ無水物を完全に加えた後、撹拌させながらさらに６時間反応させた。反応液を、０．１Ｍ ＨＣｌによりｐＨ９．０に調整し、さらに暗所で２４時間反応させた。２４時間後、０．１Ｍ ＨＣｌを添加し、ｐＨ６．０以下で沈澱させ分別取得した。ついで、冷却した０．０１Ｍ ＨＣｌと０．１Ｍ酢酸の弱酸性水溶液を加え懸濁液となし、遠心沈澱により洗浄した。次いで、得られた沈澱物を５ｍｌの０．１Ｍ Ｎａ２ＣＯ３で再溶解させ、１００ｍｌに希釈しｐＨ９．５付近の溶液となし、分子量３０００の分子ふるい膜を用い、Ｌａｂｏｓｃａｌｅ ＴＦＦ ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ, Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ, ＭＡ）により加圧下で、低分子を除きつつ濃縮・洗浄した。さらに、濃縮した溶液に０．０１Ｍ Ｎａ２ＣＯ３／ＮａＨＣＯ３（ｐＨ ９．０）を加え、希釈し、上記システムを用いて、濃縮・洗浄を再度繰り返した。濃縮した高分子分画の溶液を凍結乾燥した。凍結乾燥物を０．１Ｍ Ｎａ２ＣＯ３に溶かし、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１００ゲル（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ, Ｕｐｐｓａｌａ, Ｓｗｅｄｅｎ）カラムクロマトグラフィー［ｓｉｚｅ: ３５ｃｍ（ｈ）×２．５ｃｍ（ｄ）］により精製した。また、ＡＨＰＰは２６０ｎｍの吸収で検出した。
【００２０】
牛乳由来のＸＯによるＯ２−の生成に対するＳＭＡ−ＡＨＰＰの阻害活性は、１０μＭのルシゲニン、１０μＭのキサンチン、１０、１００μＭのＡＨＰＰまたは１０〜５０００μＭのＳＭＡ−ＡＨＰＰを含む１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に２０ｍＵ／ｍｌになるようにＸＯを添加し、化学発光を測定した（マルチプレートリーダーＭＴＰ−７００ＣＬ，ＣｏｒｏｎａＣｏ．Ｌｔｄ．，Ｉｂａｒａｋｉ，Ｊａｐａｎ）。また、ＸＯの酵素活性に対するＳＭＡ−ＡＨＰＰの阻害活性は、基質のキサンチンを２、５、１０、２０μＭの濃度に対し、ＳＭＡ−ＡＨＰＰを２２、４４及び１３２μＭの含む１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中で反応させた。酵素のＸＯは、３．３３ｍＵ/ｍｌになるように添加して撹拌し、生成する尿酸は２９０ｎｍの吸収で測定（可視紫外分光光度計ｍｏｄｅｌＵＶ/Ｖｉｓ−５５０，ＪＡＳＣＯＣｏｒｐ，Ｊａｐａｎ）して阻害活性定数（Ｋｉ）を求めた。
【００２１】
ＳＭＡ−ＡＨＰＰ結合物のＦＴ−ＩＲスペクトラムは図２に示すとおり、１３７５及び１３９７ｃｍ−１(カルボン酸のＣ−Ｏ−Ｈに由来)、１４７７及び１５７０ｃｍ−１（Ｎ−Ｈ）、１６３８ｃｍ−１（Ｃ＝Ｏ伸縮）、３３５０−３５００ｃｍ−１付近（Ｏ−Ｈ伸縮）の吸収ピークが観察された。
また、元素分析の結果から、ＳＭＡ−ＡＨＰＰには、ＳＭＡにはないＮ（ＡＨＰＰ由来）が２．８６％含まれていた。このことから、ＡＨＰＰは、ＳＭＡ鎖（重合度６）１本に対し、１個結合していると考えられた。
また、図３にＡＨＰＰとＳＭＡ−ＡＨＰＰのＸＯ酵素活性の阻害活性を示した。ＳＭＡ−ＡＨＰＰのＫｉは０．２５μＭであり、ＡＨＰＰは０．１７μＭとほぼ同様の強い阻害活性を示した。また、図４にＡＨＰＰとＳＭＡ−ＡＨＰＰのＸＯによるＯ２−の生成阻害活性を示した。図４に示すとおり、ＸＯによるＯ２−の生成の阻害も濃度依存的に抑制した。なお、測定は前述した方法に準じて行った。
【実施例２】
【００２２】
ＳＭＡ−ＡＨＰＰの虚血再灌流による肝障害に対する防御作用を調べた。
６週令の雄性Ｗｉｓｔｅｒラット（平均体重約２５０ｇで１群約５匹、九動、熊本）を１週間予備飼育後に実験に供した。ラットは試験を行う９時間前に絶食させた後、ＳＭＡ−ＡＨＰＰを各ラット当たり０．５ｍｌ中に６、１０及び２０ｍｇ／ｋｇになるように生理食塩水に溶かし尾静脈より投与した。２時間後、ラットを麻酔下で開腹し、門脈をクリップで３０分間結紮し阻血した後、クリップを門脈よりはずし、再灌流（Ｉｓｃｈｅｍｉａ ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ, Ｉ／Ｒ）させ開腹部を糸で縫合した。３時間後ラットをエーテル麻酔下に屠殺し、血液を採取し、肝障害の指標として血漿中の乳酸脱水素酵素（ｌａｃｔａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ, ＬＤＨ）、アラニンアミノ基転移酵素（aｌａｎｉｎｅ ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ, ＡＳＴ）及びアスパラギン酸基転移酵（aｓｐａｒｔａｔｅ ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ, ＡＬＴ）を測定した（Ｎ．Ｉｋｅｂｅ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２９５ ９０４−９１１（２０００））。また、肝臓は、病理組織学的観察を行うために、組織の一部を１０％ホルマリンで固定し、さらにそのパラフィンブロックを作りその５〜１０μｍ切片をヘマトキシリンエオシンで染色後、顕微鏡観察により肝臓傷害を観察した。さらに、肝臓の過酸化度は、肝ホモジネートを作成し、チオバルビツール（ＴＢＡ）法（Ｊ．Ｆｕｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６２ ３１３８−３１４３（２００２））により肝臓中の過酸化物の生成も測定した。
【００２３】
図５に示すように、Ｉ／Ｒ処置ラットにおける血中の肝障害の指標となる酵素ＬＤＨはＳＭＡ−ＡＨＰＰの投与により、コントロール（ＳＭＡ−ＡＨＰＰ投与なし）と比較して濃度依存的に有意に血清中のＬＤＨの増加を抑制した。
図６は、ＳＭＡ−ＡＨＰＰによるＡＬＴ及びＡＳＴの変化を示すグラフである。ＬＤＨと同様に、ＳＭＡ−ＡＨＰＰはＡＬＴ及びＡＳＴの増加を濃度依存的に有意に抑制した。また、図７にＩ／Ｒ処置ラット肝臓中の過酸化物の生成量を示す。Ｉ／Ｒ処置ラット肝臓中の過酸化物の生成もＳＭＡ−ＡＨＰＰの投与により有意に抑制されている。以上のように、ＳＭＡ−ＡＨＰＰはＩ／Ｒに起因するＸＯの活性化によるＯ２-の生成を抑え、肝障害を抑えることが明らかである。
【実施例３】
【００２４】
ＳＭＡ−ＡＨＰＰのデキストラン硫酸ナトリウム塩（ＤＳＳ、ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，ＬＬＣ、ＣＡ、ＵＳＡ）により惹起した大腸炎に対する治療効果を調査した。ＤＳＳは蒸留水に２％溶かして、一週間連日飲用水として与えた。
５週令の雄性ＩＣＲ（平均体重約２５ｇ）マウスを１週間予備飼育し、体重を測定し、
（ａ）正常群（ＤＳＳ投与なし）、
（ｂ）コントロール大腸炎群（ＤＳＳ投与し１日後からのＳＭＡ−ＡＨＰＰ投与なし）、
（ｃ）治療群（ＤＳＳ投与し１日後より、１００ｍｇ／ｋｇ ＳＭＡ−ＡＨＰＰの経口投与群）、及び
（ｄ）治療群（ＤＳＳ投与し１日後より、３０ｍｇ／ｋｇ ＳＭＡ−ＡＨＰＰの静脈投与群３日間連日）の４群を設けた。
正常群以外の（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）の３群に、７日間の２％ＤＳＳの飲水投与を開始した。ＤＳＳの投与開始から１日後に（ｃ）に１００ｍｇ／ｋｇでＳＭＡ−ＡＨＰＰをゾンデにより経口投与した。また、（ｄ）に３０ｍｇ／ｋｇでＳＭＡ−ＡＨＰＰを尾静脈より３日間連日で投与した。
７日後、すべてのマウスの体重を測定した後、エーテル麻酔により屠殺し、血液、肝臓及び大腸を摘出した。肝臓は重量を、大腸は長さを測定した。また、血清中の炎症性サイトカインであるインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）及び腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）をＭｏｕｓｅＴＮＦ−αＥＬＩＳＡ ｋｉｔ、Ｔｏｔａｌ ＩＬ−１２ Ｍｏｕｓｅ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ, ＩＬ）を用いてＥＬＩＳＡ法により測定した。
【００２５】
図８に、２％ＤＳＳ飲水投与の7日目における各群の体重、肝臓重量及び大腸の長さを示した。データは平均±ＳＤ（ｎ＝５）で表した。なお、ここで印＊:Ｐ＜０．０５、＊＊:Ｐ＜０．０１は、正常群あるいはＳＭＡ−ＡＨＰＰの投与群ｖｓ.コントロール大腸炎群を示す。
図８に示すように、（ｂ）コントロール大腸炎群（無治療）は（ａ）正常群（ＤＳＳ無処理）と比較して、さらに体重の減少を示した。一方、ＳＭＡ−ＡＨＰ投与の治療群の（ｃ）群及び（ｄ）群は（ａ）と同様に体重の減少は見られなかった。また、肝臓の重量も（ｃ）及び（ｄ）は、（ａ）と比較して同様に変化はなく、副作用はみとめられなかった。
また、（ｂ）コントロール大腸炎群（無治療）は、（ａ）正常群（ＤＳＳ無処理）と比較して有意に大腸の長さの減少を示し、萎縮していた。その際に、（ｂ）コントロール大腸炎群（無治療）は、下痢の発生が顕著に増加していた。一方で、ＳＭＡ−ＡＨＰＰの投与による治療群の（ｃ）及び（ｄ）は、（ｂ）と比較して有意な大腸の長さの減少を抑制していた。（ｃ）及び（ｄ）は（ａ）と比較しても有意な差はなく、大腸の長さの萎縮はなかった。
さらに、ＳＭＡ−ＡＨＰＰ投与の（ｃ）及び（ｄ）は、下痢の発生を抑制した。
炎症性サイトカインの抑制に関しては図９及び図１０に示すように、ＳＭＡ−ＡＨＰＰ投与群の（ｃ）及び（ｄ）においては、無治療群の（ｂ）と比較して血清中のＩＬ−１２及びＴＮＦ−αの産生を有意に抑制した。
【実施例４】
【００２６】
ＰＥＧ（２０００）−ＡＨＰＰを図１１に示すスキームにより合成した。
ＡＨＰＰの微粉末１００ｍｇ（０．７ｍｍｏｌ）を０．１Ｍ ＮａＯＨの１５ｍｌ中に溶かしたものと１．３ｇの活性化ＰＥＧ（分子量２０００、ＮＯＦ製サンブライトＭＥＣ−２０ＡＳ）を２０ｍｌのクロロホルムに溶かした溶液を氷上で撹拌下に滴下しながら４０分間懸濁状態で加え反応させた。ＰＥＧを完全に加えた後もさらに室温下で２時間反応した。二成分よりなる反応溶液に０．１Ｍ ＨＣｌを加えｐＨ１．０に調整した。反応溶液のクロロホルム相を分液ロートにより分取し、無水硫酸ナトリウムを加え乾燥した。その溶液をろ紙によりろ過し、ロータリーエバポレーターを用いて減圧下にクロロホルムを除去し乾燥標品を得た。ついで、この標品を５〜８ｍｌの蒸留水に溶かし上記Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１００にてゲルクロマトグラフィーを行った。その溶出画分を２６０ｎｍの吸収により検出し、そのピークを分取し凍結乾燥して純化物を得た。その標品について動的光散乱解析を行った。また、乾燥標品を元素分析、ＦＴ−ＩＲ、ＵＶ吸収スペクトル、動的散乱による粒子サイズの分布の測定及びＸＯによるＯ２-の産生に対する阻害効果を実施例１と同様に測定した。
【００２７】
次に、ＰＥＧ（３００）とＡＨＰＰとの合成を行った。例を示す。
縮合反応のための活性化エステルの合成は、まず、５．０ｇのＰＥＧ（分子量３００、和光純薬、１６４−０９０５５、Ｌｏｔ Ｎｏ．ＷＫＧ６６４２、大阪）と、０．６ｇのｐ−ニトロフェニールクロロフーメイトを、５０ｍｌのテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）に溶かし、さらに、トリエチルアミンを０．２９ｇ添加し、２４−３０時間室温で撹拌下に反応させた。次第にトリエチルアミン塩酸塩が析出し、これをろ過して除いた。この溶液に対し、３００ｍｌのエチルエーテルを加え、沈澱を生じさせて沈澱物を得た。このものをさらに冷エチルエーテルにより洗浄した。この沈澱物を再び約５０ｍｌのＴＨＦを加え、溶解させ、このＴＨＦ溶液にエチルエーテルを加え、両溶媒の混液より、活性化ＰＥＧ（ｐ−ニトロフェニールクロロフーメイト）の結晶化物を得た。収量はＰＥＧに対し〜８０ｗ/ｗ％）であった。この活性化ＰＥＧを１．０ｇとり、２０ｍｌのＴＨＦに溶かし、これに０．１Ｍ ＮａＯＨにより溶かしたＡＨＰＰ溶液（０．５ｇ／２５ｍｌのＮａＯＨ）を撹拌下で滴下しながら加え３０〜４０時間室温で反応させた。このときすべて可溶化している状態である。この反応溶液をロータリーエバポレーターにより濃縮乾固させ、乾燥物を得た。このものをＴＨＦでさらに溶かし、エチルエーテルで沈澱させ、ＷｈａｔｍａｎのＮｏ．１フィルターでろ過し、沈澱物を分別した。この沈澱物に１０ｍｌの蒸留水を加え、溶解し、凍結乾燥により、ＰＥＧ（３００）−ＡＨＰＰの標品を得た。このもののＵＶ吸収スペクトル及び光動的散乱法により粒子サイズの分布を測定した。
【００２８】
ＡＨＰＰの吸収スペクトラムを図１２に、ＰＥＧ（２０００）−ＡＨＰＰ、ＰＥＧ（３００）−ＡＨＰＰの吸収スペクトラムをそれぞれ図１３（Ａ）、（Ｂ）に示す。図１２に示すとおり、ＡＨＰＰは、２２２及び２７０ｎｍで最大吸収を示した。また、図１３（Ａ）に示すとおりＰＥＧ（２０００）−ＡＨＰＰは２３０及びＡＨＰＰの特徴的な２７０ｎｍに最大吸収を示した。図１３（Ｂ）に示すとおりＰＥＧ（３００）−ＡＨＰＰは２２２及びＡＨＰＰの特徴的な２７０ｎｍに最大吸収を示した。
【００２９】
ＡＨＰＰのＦＴ−ＩＲスペクトラムを図１４に、ＰＥＧ（２０００）−ＡＨＰＰのＦＴ−ＩＲスペクトラムを図１５に示す。図１４に示すとおり、ＰＥＧ（２０００）−ＡＨＰＰは、特徴的な１６３８ｃｍ−１（Ｃ＝Ｏ伸縮）、２８５０ｃｍ−１付近（−ＯＣＨ３）の吸収ピークが観察された。
図１６（Ａ）、（Ｂ）は、ＰＥＧ（２０００）−ＡＨＰＰおよびＰＥＧ（３００）−ＡＨＰＰの溶液中での動的散乱による粒子サイズの分布の測定の結果を示した。その結果、ＰＥＧ（２０００）−ＡＨＰＰおよびＰＥＧ（３００）−ＡＨＰＰの粒子サイズは、それぞれ平均約２８７ｎｍ、２３５．５ｎｍであった。このデータは、ＰＥＧ−ＡＨＰＰ分子が溶液中で会合体を形成していることを証明している。
また、図１７に、ＡＨＰＰとＰＥＧ（２０００）−ＡＨＰＰのＸＯの酵素活性に対する阻害活性を示した。図１７に示すとおり、ＸＯの酵素活性に対するＰＥＧ（２０００）−ＡＨＰＰの阻害もＡＨＰＰとほぼ同程度に抑制した。
【実施例５】
【００３０】
ＡＨＰＰ−アクリレートモノマー結合化合物を図１８に示すスキームで合成した。
ＡＨＰＰの微粉末５００ｍｇ（３．３ｍｍｏｌ）を１５ｍｌの０．０７５Ｍ ＮａＯＨに溶かしたものと、塩化アクリロイル（アクロイルクロリド）を２９９ｍｇ（３．３ｍｍｏｌ）を１０ｍｌのクロロホルムに溶かした溶液を、氷上で撹拌下に滴下しながら３０分間で加え反応させた。塩化アクリロイルを完全に加えた後もさらに撹拌しながら室温下で３０分間反応した。水相反応溶液のクロロホルム相を分液ロートにより除去し、この水溶液を０．１Ｍ ＨＣｌを用いて約ｐＨ３．０に調整することで沈澱物が生成する。その沈澱物をろ過により分取し、５０ｍｌの０．１Ｍ ＨＣｌで２回洗浄し、５０ｍｌのアセトンで２回洗浄し、乾燥した。ＡＨＰＰ−アクリレートモノマーの収量は０．６ｇ（９８％）であった。
【００３１】
ＡＨＰＰ−アクリレートモノマーの吸収スペクトラムを図１９に示した。サンプル溶液は１．５ｍｇ／ｍｌの０．１Ｍ ＮａＯＨ溶液として測定した。図１９に示すとおり、ＡＨＰＰ−アクリレートモノマーは２２４及び２７０ｎｍで最大吸収を示した。
【実施例６】
【００３２】
ＡＨＰＰ−オリゴエチレングリコール（ＯＥＧ）メタアクリレートコポリマーの合成は図２０のスキームのように反応させた。
１．０ｇ ４．０ｍｍｏｌ）のオリゴエチレングリコールエチルエステルメタアクリレート（３〜４のエチレングリコールが結合した状態なので、ポリではなくオリゴエチレングリコールとした。平均分子量２４６， ＯＥＧ−ＭＡ， ＣａｔＮｏ．４０９５４５、Ｂａｔｃｈ Ｎｏ−０２８２４ＡＨ、Ａｌｄｒｉｃｈ）を２０ｍｌのジメチルスルホキシド（以下、ＤＭＳＯと記載することもある）に溶かした溶液と、０．２ｇのＡＨＰＰ−アクリルレートモノマー結合化合物を１５ｍｌのＤＭＳＯに溶かした溶液を、重合開始剤である２，２’−ａｚｏｂｉｓ［２−ｍｅｔｈｙｌｐｒｏｐａｎｅｎｉｔｒｉｌｅ］を２．０ｍｇ加え６５℃で２４時間反応させた。その反応溶液をロータリーエバポレーターにより濃縮乾固し、乾燥物をジエチルエーテルで３回洗浄し精製した。この標品を上記と同様に蒸留水にとかしＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１００にてゲルクロマトグラフィーを行った。その溶出画分は２６０ｎｍの吸収により検出し、そのピークを分取して凍結乾燥し純化物を得た。ＡＨＰＰ−ＯＥＧメタアクリレートコポリマーの収量は０．９５ｇ（７９％）であった。
【００３３】
図２１にＡＨＰＰ−ＯＥＧメタアクリレートポリマーの吸収スペクトルを示す。
図２１に示すとおり、ＡＨＰＰ−ＯＥＧメタアクリレートポリマーは２３０及び２７０ｎｍの最大吸収を示した。また、ＡＨＰＰ−ＯＥＧメタアクリレートコポリマーのＦＴ−ＩＲスペクトラムを図２２に示した。図２２に示すとおり、ＡＨＰＰ−ＯＥＧメタアクリレートポリマーは１６５０ｃｍ−１付近にピーク（アミドのＣ＝Ｏ伸縮）が観察された。
【００３４】
ＡＨＰＰ−ＯＥＧメタアクリレートポリマーの分子量をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１００ゲル（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）クロマトグラフィー［ｓｉｚｅ：３５ｃｍ（ｈ） × ２．５ｃｍ （ｄ）］により、ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ＩｇＧ（１５５ｋＤａ）、ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ（６７ｋＤａ）、ｏｖａｌｂｕｍｉｎ（４３ｋＤａ）、ｌｙｓｏｚｙｍｅ（１４ｋＤａ）、ｐｈｅｎｏｌｒｅｄ（０．３ｋＤａ）を分子量マーカーとして用いて、見かけ上の溶液状態での分子量を推定した。結果を図２３に示した。ＡＨＰＰ−ＯＥＧメタアクリレートポリマーは見かけ上９９ｋＤａの分子量を示した。
得られたＡＨＰＰ−ＯＥＧメタアクリレートコポリマーはＸＯの酵素活性の阻害を実施例１と同様に測定したところ、ＡＨＰＰとほぼ同程度にＸＯの酵素活性を阻害した。結果を図２４に示す。
【実施例７】
【００３５】
ＡＨＰＰのＳＭＡによるミセル化物（ＳＭＡ−ＡＨＰＰミセル化包摂物ともいう）を調製した。
ＳＭＡ無水物（２００ｍｇ）を０．１Ｍ ＮａＯＨまたは０．１Ｍ ＫＯＨを加え、５０〜６０℃の保温下にスターラーにより撹拌させ、ＳＭＡ無水物の加水分解反応を約１２時間かけて進行させ、ついで、このＳＭＡ加水分解を行った。反応溶液に、撹拌下に０．１Ｍ ＨＣｌを滴下し、ＳＭＡ加水分解物を沈澱させた。得られた沈殿物をガラスろ過フィルター（２〜４μｍ）を通して分取し、さらに冷０．００１ＭＨＣｌで洗浄後凍結乾燥し、ＳＭＡ加水分解物を調製した。
ＳＭＡとは別に、ＡＨＰＰ（微粉末状）３７８ｍｇを５０ｍｌの０．１Ｍ ＮａＯＨに加え、３７〜４０℃撹拌下に一夜放置し、ＡＨＰＰの飽和溶液を調製した。このＡＨＰＰの飽和溶液をＰＴＦＥフィルター（０．４５μｍ、Ｔｏｙｏ Ｒｏｓｈｉ Ｋａｉｓｈａ, Ｌｔｄ, Ｔｏｋｙｏ, Ｊａｐａｎ）でろ過し、ＳＭＡ加水分解物５７６ｍｇを１０ｍｌの０．０１Ｍ Ｎａ２ＣＯ３／ＮａＨＣＯ３（ｐＨ９．０）で溶解したものを、ゆっくりと室温下にスターラーで撹拌しながら滴下した。ＳＭＡ加水分解溶液を完全に加えた後、さらに撹拌させながら、５時間反応させた。撹拌下、生成した水可溶性のミセルに０．０１Ｍ ＨＣｌを加えｐＨを４．０とし、生じた沈澱物を遠心分離し、もう一度、冷０．００１Ｍ ＨＣｌで洗浄した。次に０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３を加え再溶解させた後、分子量１０００〜１００００の分子ふるい膜を用いて実施例１に準じて濃縮し、凍結乾燥物を得た。この凍結乾燥物を０．１Ｍ Ｎａ２ＣＯ３に溶かしＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１００ゲル（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）クロマトグラフィー［ｓｉｚｅ：３５ｃｍ（ｈ） × ２．５ｃｍ （ｄ）］により単一ピークとして精製した。また、ＡＨＰＰは２６０ｎｍの吸収で検出した。推定されるミセル化会合／包摂物を図２５に示す。
【００３６】
ＳＭＡ−ＡＨＰＰを各ラット当たり０．５ｍｌ中に１５及び３０ｍｇ／ｋｇ（ＡＨＰＰ換算）になるように生理食塩水に溶解し、自然高血圧ラット（ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ ｒａｔ， ＳＨＲ、平均体重約３００ｇ、１群３−４匹）に尾静脈より投与した。また、もう１群には１００ｍｇ／ｋｇラット（ＡＨＰＰ換算）のＳＭＡ−ＡＨＰＰをＳＨＲにゾンデにより経口投与した。投与してから３時間後に無加温型非観血式血圧計（ＭｏｄｅｌＭＫ−２０００ＭＴ、室町機器）を用いて血圧の変動を測定した。
【００３７】
図２６にＳＭＡ−ＡＨＰＰの尾静脈投与の結果を示す。ＳＭＡ−ＡＨＰＰの１５及び３０ｍｇ／ｋｇを１回尾静脈投与後、２４時間にわたり観察したところ、ＳＭＡ−ＡＨＰＰ投与群はコントロール群と比較して血圧降下作用（抗高血圧作用）を示した。３０ｍｇ／ｋｇのＳＭＡ−ＡＨＰＰの静脈投与ではＳＨＲ高血圧ラットの無治療コントロール群の血圧の約７５％（−２５％低下）にまで有意に抑制した。この作用は、１回の投与により、２４時間以上にわたり降圧作用を持続した。図中◆プロットは、コントロール、■プロットは３０ｍｇ／ｋｇ、▲プロットは３０ｍｇ／ｋｇの投与量を示す。
さらに重要なことに、図２７に示すように、１００ｍｇ／ｋｇのＳＭＡ−ＡＨＰＰの経口投与では、投与２４時間後に血圧のもとの値より２０ｍｍＨｇ低値と有意に血圧を減少させ、さらに４８時間後まで有意に低い血圧を維持した。しかし、その後は緩やかな上昇を示しつつも、７２時間後に二回目の治療をした結果、２１６時間後までコントロール群と比較して、有意に降圧作用を示した（Ｐ＜０．０１）。図中▲プロットはコントロール、●プロットは１００ｍｇ／ｋｇのＳＭＡ−ＡＨＰＰ投与量を示す。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】本発明にかかるＳＭＡ−ＡＨＰＰの合成スキームを示す。
【図２】ＳＭＡとＳＭＡ−ＡＨＰＰのＦＴ−ＩＲスペクトラムを示す。
【図３】ＸＯ酵素の活性に対するＡＨＰＰとＳＭＡ−ＡＨＰＰの阻害活性を示す。
【図４】ＡＨＰＰとＳＭＡ−ＡＨＰＰのＸＯによるＯ２−生成の阻害活性を示す。
【図５】ラット肝臓中のＬＤＨ変化を示すグラフである。
【図６】ラット肝臓中のＡＬＴ及びＡＳＴの変化を示す。
【図７】ラット肝臓中の過酸化物量の変化を示す。
【図８】ＤＳＳ飲水投与によるマウスの体重、肝臓重量及び大腸の長さの変化を示す。
【図９】マウス血清中のＩＬ−１２の変化を示す。
【図１０】マウス血清中のＴＮＦ−αの変化を示す。
【図１１】本発明にかかるＰＥＧ−ＡＨＰＰの合成スキームを示す。
【図１２】ＡＨＰＰの吸収スペクトラムを示す。
【図１３】（Ａ）はＰＥＧ（２０００）−ＡＨＰＰ、（Ｂ）はＰＥＧ（３００）―ＡＨＰＰの吸収スペクトラムを示す。
【図１４】ＡＨＰＰのＦＴ−ＩＲスペクトラムを示す。
【図１５】ＰＥＧ−ＡＨＰＰのＦＴ−ＩＲスペクトラムを示す。
【図１６】（Ａ）はＰＥＧ（２０００）−ＡＨＰＰ、（Ｂ）はＰＥＧ（３００）−ＡＨＰＰの光動的散乱による溶液中の粒子分布を示す。
【図１７】ＰＥＧとＰＥＧ−ＡＨＰＰのＸＯによるＯ２−生成の阻害活性を示す。
【図１８】ＡＨＰＰ−アクリレートモノマー結合化合物の合成スキームを示す。
【図１９】ＡＨＰＰ−アクリレートモノマーの吸収スペクトラムを示す。
【図２０】ＡＨＰＰ−オリゴエチレングリコール（ＯＥＧ）メタアクリレートコポリマーの合成スキームを示す。
【図２１】ＡＨＰＰ−ＯＥＧメタアクリレートポリマーの吸収スペクトルを示す。
【図２２】ＡＨＰＰ−ＯＥＧメタアクリレートコポリマーのＦＴ−ＩＲスペクトラムを示す。
【図２３】ＡＨＰＰ−ＯＥＧメタアクリレートポリマーの分子量を示す。
【図２４】ＡＨＰＰ−ＯＥＧメタアクリレートポリマーのＸＯによるＯ２−生成の阻害活性を示す。
【図２５】ＡＨＰＰのＳＭＡミセル化物の会合体／包摂物の構造概念図である。
【図２６】ＡＨＰＰのＳＭＡ−ＡＨＰＰの注射投与による降血圧作用を示す。
【図２７】ＡＨＰＰのＳＭＡ−ＡＨＰＰの経口投与による降血圧作用を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、４−アミノ−６−ハイドロキシピラゾロ（３，４−ｄ）ピリミジンの水可溶性医薬製剤に係り、詳しくは、抗炎症剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
組織が損傷を受けると、損傷箇所の血管内皮細胞でプロスタグランジンや炎症性サイトカインが産生される。プロスタグランジンや炎症性サイトカインは、発熱、血管拡張、血管透過性の亢進、白血球の走化性亢進、白血球や血管内皮細胞の活性化、活性化白血球の血管内皮細胞への粘着や浸潤など、様々な生理作用を示す。そしてさらに、活性化した白血球からもプロスタグランジンやロイコトリエンなどが産生され、炎症反応は加速される。走化性の亢進した白血球は、血管内皮細胞の結合部から血管外の炎症部位へ浸潤し、そこで感染防御のために微生物、病原体や不要物質の貪食を行う。その結果、病原体や抗原など有害な不要物質が減少して組織細胞が増殖することで治癒に至る。しかし、白血球の浸潤が持続すると、逆に更なる組織損傷が起きてしまい、炎症が慢性化してしまう。
このような、炎症反応を抑える抗炎症剤としては、従来からステロイド系抗炎症剤や非ステロイド系抗炎症剤、例えばシクロオキシゲナーゼ（以下、ＣＯＸと記載することもある）阻害剤などが使用されている。非ステロイド系抗炎症剤としては、アスピリン、サリチル酸やインドメタシン等が挙げられる。これらの抗炎症剤は、プロスタグランジンの生合成につながるアラキドン酸カスケードでのＣＯＸとアラキドン酸との結合を阻害することにより、抗炎症活性を示す。このように、ステロイド系抗炎症剤や非ステロイド系抗炎症剤は、シクロオキシゲナーゼ活性を阻害することにより、患部での炎症や痛みは抑えることができる。しかし、反面、ＣＯＸ活性が阻害されることにより、胃や肝臓では血流が減少してしまい、胃潰瘍や腎機能に悪い影響を及ぼすことが指摘されている。
【０００３】
また、４−アミノ−６−ハイドロキシピラゾロ（３，４−ｄ）ピリミジン（以下、ＡＨＰＰと記載することもある）の活性に関しては、血圧降下作用を有することが当発明者らの特許文献１に開示されている。しかし、ＡＨＰＰは、水不溶性であるため、水可溶性とする必要があり、これまで、ＡＨＰＰを水可溶性にした血圧降下製剤は得られていない。
【特許文献１】特開平９−１１８６２２号公報
【非特許文献１】Ｔ． Ｏｄａ ｅｔ ａｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４４， ９７４−９７６（１９８９）
【非特許文献２】Ｔ． Ａｋａｉｋｅ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．， ８５，７３９−７４５ （１９９０）
【非特許文献３】Ｔ． Ａｋａｉｋｅ ｅｔ ａｌ， ＰＮＡＳ．， ９３， ２４４８−２４５３（１９９６）
【非特許文献４】Ｙ．Ｍａｔｓｕｍｕｒａ， ａｎｄ Ｈ．Ｍａｅｄａ， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ４６， ６３８７−６３９２， (１９８６）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、炎症を効率的に抑制でき、且つ副作用を示さず、安全性の高い抗炎症剤を提供することを目的とする。
さらに、また本発明は、水可溶性のキサンチンオキシダーゼ（以下、ＸＯと記載することもある）の阻害能を有するＡＨＰＰ製剤を提供することを目的とする。水可溶性のＡＨＰＰ製剤は、活性酸素であるスーパーオキサイド（以下、Ｏ２-と記載することもある）の生成を抑え、従ってそのＯ２-による一酸化窒素（以下、ＮＯと記載することもある）の消費を抑え、逆に消費されないＮＯによりその濃度が上昇することにより血圧降下製剤や、さらにまたＯ２-とＮＯより生じる起炎症性のパーオキシナイトライト（ＯＮＯＯ-）を抑え、従って抗炎症剤として使用することができる。
【０００５】
本発明者らは、これまでにインフルエンザの増悪化のメカニズムにＯ２-やＮＯが深く関与することを解明した（非特許文献１〜３）。
さらに、Ｏ２-がＸＯにより生成されていることも明らかにしている。Ｏ２-は、ＮＯ、即ち血管内皮由来弛緩因子（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｒｅｌａｘｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ；降圧物質ＥＤＲＦ）と反応しＯＮＯＯ-となり、ＮＯを消費することから、血圧降下作用を有するＮＯの欠乏により正常な血圧が困難となり、高血圧症を招来すると考えられる。本発明者らはそこで、ＡＨＰＰによりＯ２-を抑えることによりラットの血圧上昇抑制効果を有することを発見し、特許出願を行っている（特許文献１）。
【０００６】
また、本発明者らはＯ２-やＯＮＯＯ-となどの活性酸素分子種は、ウィルス感染や薬物、その他による炎症の原因に深く関わっていることを明らかにしている。そこで、Ｏ２-の生成を触媒する主要な酵素の一つであるＸＯに対する阻害剤を投与することにより、ＸＯより生成する活性酸素分子種が関わる炎症を抑制することができると考え、鋭意研究を進め、本発明を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、４−アミノ−６−ハイドロキシピラゾロ（３，４−ｄ）ピリミジン、その薬学的に許容される塩、その誘導体、または４−アミノ−６−ハイドロキシピラゾロ（３，４−ｄ）ピリミジンを含有するミセル体を活性本体とする抗炎症剤である。
本発明はまた、４−アミノ−６−ハイドロキシピラゾロ（３，４−ｄ）ピリミジンの誘導体、または４−アミノ−６−ハイドロキシピラゾロ（３，４−ｄ）ピリミジンを含有するミセル体を含有する医薬製剤である。本発明の医薬製剤は、抗炎症剤や血圧降下剤としＸＯの酵素活性を抑えることによって得られる薬効をめざして使用することができる。
４−アミノ−６−ハイドロキシピラゾロ（３，４−ｄ）ピリミジンは、式１で表わされる化合物である。そして、その誘導体は、式２で表される化合物である。式２中、Ｘは、式３〜式６で表わされる何れか１つの置換基である。
【０００８】
【化１】
【０００９】
【化２】
【００１０】
【化３】
なお、ここで、ｋは３〜２００の自然数を表わす。重合度の上限を２００としたのは、ミセルの形成がＳＭＡの３本鎖により成っていると考えると、１個の薬剤活性部位（ＡＨＰＰ）に対し、ＳＭＡは３倍となり、相対的にＡＨＰＰの濃度（含量）が希釈される。従って、高い比活性を維持するためにはＳＭＡの量を相対的に低く抑えた。
【００１１】
【化４】
なお、ここで、式中のｌ（エル）は１〜１０００の自然数を表わす。１０００以上の場合は、水系での溶解度が低下するため実用性に欠ける。
【００１２】
【化５】
【００１３】
【化６】
なお、ここで、ｍ、ｎは夫々１〜１０００の自然数を表わす。なお、ｍ＞ｎが好ましい。１０００以上の場合は、水系での溶解度が低下するため実用性に欠ける。
【００１４】
また、４−アミノ−６−ハイドロキシピラゾロ（３，４−ｄ）ピリミジンを含有するミセル体は、４−アミノ−６−ハイドロキシピラゾロ（３，４−ｄ）ピリミジンの、スチレンマレイン酸コポリマー（以下、ＳＭＡと記載することもある）を用いて非共有結合により形成されるミセル化した製剤である。具体的には、式７で表わされる。これはＡＨＰＰとＳＭＡは、非共有結合物（複合体）であることが特徴といえる。
【００１５】
【化７】
なお、ここで、ｐは３〜２００の自然数を表わす。その重合度の範囲が限られているのは、上記ｋと同じ理由である。
【発明の効果】
【００１６】
本発明により、炎症を効率的に抑制でき、且つ副作用の少ない安全性の高い抗炎症剤を提供することが可能となる。本発明の抗炎症剤は、ＡＨＰＰの水可溶性の誘導体ある。これらの誘導体（剤形）は、溶液中、血中、体内では高分子として挙動しているため、血中投与時の血中滞留性の向上と病巣、即ち、炎症部への指向性が一段と強くなっている。これは、その性状の特性である腫瘍部や炎症部におけるＥｎｈａｎｃｅｄ Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｅｆｆｅｃｔ （ＥＰＲ）効果（非特許文献４）による集積性の向上といえる。即ち、これらの手法により一段と優れた医薬品にすることが可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
ＡＨＰＰは、公知の化合物であり、３−アミノ−４−シアノピラゾールと尿素との反応により合成することができる。またＡＨＰＰの薬学的に許容される誘導体としては、特に、ここに例示するものだけに制限されるものではなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、アミノ酸（アスパラギン酸、グルタミン酸、コハク酸等）、クエン酸塩、グルコン酸塩、アスコルビン酸塩等の有機酸誘導体、グルコース、マルトース、フルクトース、ソルビトール、キシロース、マンノース等、ε‐カプロラクタム等が挙げられる。
また、ＡＨＰＰ誘導体は、ＡＨＰＰをＳＭＡ、ポリエチレングリコール（以下、ＰＥＧと記載することもある）、アクリル酸又はポリビニル酢酸（以下、ＰＶと記載することもある）等の水溶性の低〜高分子残基とアミド結合した化合物である。また、ＡＨＰＰをＳＭＡ、ＰＥＧ、アクリル酸又はＰＶ、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ヒドロキシプロピルメタアクリレート（ＨＰＭＡ）コポリマー、ジビニルマレイン酸（無水）コポリマー（ピランコポリマー）等を用い、非共有結合により形成されるミセル化した製剤である。
ＡＨＰＰは水不溶性物質であるが、水溶性高分子あるいは重合度の低いＰＥＧなどと結合あるいはミセル化することにより、水可溶性となるばかりでなく高分子化によって一段と優れた医薬品となる。
【００１８】
本発明の抗炎症剤の投与形態は、経口投与剤又は注射剤あるいは座薬のいずれでもよい。経口での投与量は患者の年齢、体重、疾患の程度に応じて調節すればよく、例えば、成人一人当たり１００〜９０００ｍｇを１日１回ないし数回に分けて投与するのが好ましい。注射剤は、静脈内投与とするのが好ましく、点滴等により静脈内へ投与してもよい。注射の場合、ＡＨＰＰ含有量は３〜５００ｍｇ／ｋｇの範囲が好ましい。
以下に実施例に基づき本発明を説明する。
【実施例１】
【００１９】
ＳＭＡ−ＡＨＰＰを図１に示すスキームで合成した。
３６．３ｍｇのＡＨＰＰ（分子量１５１．１、微粉末状、和光純薬、大阪）に５．０ｍｌの０．１Ｍ ＮａＯＨまたは０．１Ｍ ＫＯＨを加えて溶解させ、７．３ｍｇ／ｍｌ（４８ｍＭ）のアルカリ溶液を調製した。得られたＡＨＰＰ溶液に、撹拌下で約２倍のモル量（分子量を１２００と仮定）の５７６ｍｇ（９６ｍＭ）のＳＭＡ無水物（微粉末状）を約５０ｍｇずつ数時間にわたりゆっくり加え、反応させた。ＳＭＡ無水物を完全に加えた後、撹拌させながらさらに６時間反応させた。反応液を、０．１Ｍ ＨＣｌによりｐＨ９．０に調整し、さらに暗所で２４時間反応させた。２４時間後、０．１Ｍ ＨＣｌを添加し、ｐＨ６．０以下で沈澱させ分別取得した。ついで、冷却した０．０１Ｍ ＨＣｌと０．１Ｍ酢酸の弱酸性水溶液を加え懸濁液となし、遠心沈澱により洗浄した。次いで、得られた沈澱物を５ｍｌの０．１Ｍ Ｎａ２ＣＯ３で再溶解させ、１００ｍｌに希釈しｐＨ９．５付近の溶液となし、分子量３０００の分子ふるい膜を用い、Ｌａｂｏｓｃａｌｅ ＴＦＦ ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ, Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ, ＭＡ）により加圧下で、低分子を除きつつ濃縮・洗浄した。さらに、濃縮した溶液に０．０１Ｍ Ｎａ２ＣＯ３／ＮａＨＣＯ３（ｐＨ ９．０）を加え、希釈し、上記システムを用いて、濃縮・洗浄を再度繰り返した。濃縮した高分子分画の溶液を凍結乾燥した。凍結乾燥物を０．１Ｍ Ｎａ２ＣＯ３に溶かし、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１００ゲル（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ, Ｕｐｐｓａｌａ, Ｓｗｅｄｅｎ）カラムクロマトグラフィー［ｓｉｚｅ: ３５ｃｍ（ｈ）×２．５ｃｍ（ｄ）］により精製した。また、ＡＨＰＰは２６０ｎｍの吸収で検出した。
【００２０】
牛乳由来のＸＯによるＯ２−の生成に対するＳＭＡ−ＡＨＰＰの阻害活性は、１０μＭのルシゲニン、１０μＭのキサンチン、１０、１００μＭのＡＨＰＰまたは１０〜５０００μＭのＳＭＡ−ＡＨＰＰを含む１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に２０ｍＵ／ｍｌになるようにＸＯを添加し、化学発光を測定した（マルチプレートリーダーＭＴＰ−７００ＣＬ，ＣｏｒｏｎａＣｏ．Ｌｔｄ．，Ｉｂａｒａｋｉ，Ｊａｐａｎ）。また、ＸＯの酵素活性に対するＳＭＡ−ＡＨＰＰの阻害活性は、基質のキサンチンを２、５、１０、２０μＭの濃度に対し、ＳＭＡ−ＡＨＰＰを２２、４４及び１３２μＭの含む１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中で反応させた。酵素のＸＯは、３．３３ｍＵ/ｍｌになるように添加して撹拌し、生成する尿酸は２９０ｎｍの吸収で測定（可視紫外分光光度計ｍｏｄｅｌＵＶ/Ｖｉｓ−５５０，ＪＡＳＣＯＣｏｒｐ，Ｊａｐａｎ）して阻害活性定数（Ｋｉ）を求めた。
【００２１】
ＳＭＡ−ＡＨＰＰ結合物のＦＴ−ＩＲスペクトラムは図２に示すとおり、１３７５及び１３９７ｃｍ−１(カルボン酸のＣ−Ｏ−Ｈに由来)、１４７７及び１５７０ｃｍ−１（Ｎ−Ｈ）、１６３８ｃｍ−１（Ｃ＝Ｏ伸縮）、３３５０−３５００ｃｍ−１付近（Ｏ−Ｈ伸縮）の吸収ピークが観察された。
また、元素分析の結果から、ＳＭＡ−ＡＨＰＰには、ＳＭＡにはないＮ（ＡＨＰＰ由来）が２．８６％含まれていた。このことから、ＡＨＰＰは、ＳＭＡ鎖（重合度６）１本に対し、１個結合していると考えられた。
また、図３にＡＨＰＰとＳＭＡ−ＡＨＰＰのＸＯ酵素活性の阻害活性を示した。ＳＭＡ−ＡＨＰＰのＫｉは０．２５μＭであり、ＡＨＰＰは０．１７μＭとほぼ同様の強い阻害活性を示した。また、図４にＡＨＰＰとＳＭＡ−ＡＨＰＰのＸＯによるＯ２−の生成阻害活性を示した。図４に示すとおり、ＸＯによるＯ２−の生成の阻害も濃度依存的に抑制した。なお、測定は前述した方法に準じて行った。
【実施例２】
【００２２】
ＳＭＡ−ＡＨＰＰの虚血再灌流による肝障害に対する防御作用を調べた。
６週令の雄性Ｗｉｓｔｅｒラット（平均体重約２５０ｇで１群約５匹、九動、熊本）を１週間予備飼育後に実験に供した。ラットは試験を行う９時間前に絶食させた後、ＳＭＡ−ＡＨＰＰを各ラット当たり０．５ｍｌ中に６、１０及び２０ｍｇ／ｋｇになるように生理食塩水に溶かし尾静脈より投与した。２時間後、ラットを麻酔下で開腹し、門脈をクリップで３０分間結紮し阻血した後、クリップを門脈よりはずし、再灌流（Ｉｓｃｈｅｍｉａ ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ, Ｉ／Ｒ）させ開腹部を糸で縫合した。３時間後ラットをエーテル麻酔下に屠殺し、血液を採取し、肝障害の指標として血漿中の乳酸脱水素酵素（ｌａｃｔａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ, ＬＤＨ）、アラニンアミノ基転移酵素（aｌａｎｉｎｅ ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ, ＡＳＴ）及びアスパラギン酸基転移酵（aｓｐａｒｔａｔｅ ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ, ＡＬＴ）を測定した（Ｎ．Ｉｋｅｂｅ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２９５ ９０４−９１１（２０００））。また、肝臓は、病理組織学的観察を行うために、組織の一部を１０％ホルマリンで固定し、さらにそのパラフィンブロックを作りその５〜１０μｍ切片をヘマトキシリンエオシンで染色後、顕微鏡観察により肝臓傷害を観察した。さらに、肝臓の過酸化度は、肝ホモジネートを作成し、チオバルビツール（ＴＢＡ）法（Ｊ．Ｆｕｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６２ ３１３８−３１４３（２００２））により肝臓中の過酸化物の生成も測定した。
【００２３】
図５に示すように、Ｉ／Ｒ処置ラットにおける血中の肝障害の指標となる酵素ＬＤＨはＳＭＡ−ＡＨＰＰの投与により、コントロール（ＳＭＡ−ＡＨＰＰ投与なし）と比較して濃度依存的に有意に血清中のＬＤＨの増加を抑制した。
図６は、ＳＭＡ−ＡＨＰＰによるＡＬＴ及びＡＳＴの変化を示すグラフである。ＬＤＨと同様に、ＳＭＡ−ＡＨＰＰはＡＬＴ及びＡＳＴの増加を濃度依存的に有意に抑制した。また、図７にＩ／Ｒ処置ラット肝臓中の過酸化物の生成量を示す。Ｉ／Ｒ処置ラット肝臓中の過酸化物の生成もＳＭＡ−ＡＨＰＰの投与により有意に抑制されている。以上のように、ＳＭＡ−ＡＨＰＰはＩ／Ｒに起因するＸＯの活性化によるＯ２-の生成を抑え、肝障害を抑えることが明らかである。
【実施例３】
【００２４】
ＳＭＡ−ＡＨＰＰのデキストラン硫酸ナトリウム塩（ＤＳＳ、ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，ＬＬＣ、ＣＡ、ＵＳＡ）により惹起した大腸炎に対する治療効果を調査した。ＤＳＳは蒸留水に２％溶かして、一週間連日飲用水として与えた。
５週令の雄性ＩＣＲ（平均体重約２５ｇ）マウスを１週間予備飼育し、体重を測定し、
（ａ）正常群（ＤＳＳ投与なし）、
（ｂ）コントロール大腸炎群（ＤＳＳ投与し１日後からのＳＭＡ−ＡＨＰＰ投与なし）、
（ｃ）治療群（ＤＳＳ投与し１日後より、１００ｍｇ／ｋｇ ＳＭＡ−ＡＨＰＰの経口投与群）、及び
（ｄ）治療群（ＤＳＳ投与し１日後より、３０ｍｇ／ｋｇ ＳＭＡ−ＡＨＰＰの静脈投与群３日間連日）の４群を設けた。
正常群以外の（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）の３群に、７日間の２％ＤＳＳの飲水投与を開始した。ＤＳＳの投与開始から１日後に（ｃ）に１００ｍｇ／ｋｇでＳＭＡ−ＡＨＰＰをゾンデにより経口投与した。また、（ｄ）に３０ｍｇ／ｋｇでＳＭＡ−ＡＨＰＰを尾静脈より３日間連日で投与した。
７日後、すべてのマウスの体重を測定した後、エーテル麻酔により屠殺し、血液、肝臓及び大腸を摘出した。肝臓は重量を、大腸は長さを測定した。また、血清中の炎症性サイトカインであるインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）及び腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）をＭｏｕｓｅＴＮＦ−αＥＬＩＳＡ ｋｉｔ、Ｔｏｔａｌ ＩＬ−１２ Ｍｏｕｓｅ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ, ＩＬ）を用いてＥＬＩＳＡ法により測定した。
【００２５】
図８に、２％ＤＳＳ飲水投与の7日目における各群の体重、肝臓重量及び大腸の長さを示した。データは平均±ＳＤ（ｎ＝５）で表した。なお、ここで印＊:Ｐ＜０．０５、＊＊:Ｐ＜０．０１は、正常群あるいはＳＭＡ−ＡＨＰＰの投与群ｖｓ.コントロール大腸炎群を示す。
図８に示すように、（ｂ）コントロール大腸炎群（無治療）は（ａ）正常群（ＤＳＳ無処理）と比較して、さらに体重の減少を示した。一方、ＳＭＡ−ＡＨＰ投与の治療群の（ｃ）群及び（ｄ）群は（ａ）と同様に体重の減少は見られなかった。また、肝臓の重量も（ｃ）及び（ｄ）は、（ａ）と比較して同様に変化はなく、副作用はみとめられなかった。
また、（ｂ）コントロール大腸炎群（無治療）は、（ａ）正常群（ＤＳＳ無処理）と比較して有意に大腸の長さの減少を示し、萎縮していた。その際に、（ｂ）コントロール大腸炎群（無治療）は、下痢の発生が顕著に増加していた。一方で、ＳＭＡ−ＡＨＰＰの投与による治療群の（ｃ）及び（ｄ）は、（ｂ）と比較して有意な大腸の長さの減少を抑制していた。（ｃ）及び（ｄ）は（ａ）と比較しても有意な差はなく、大腸の長さの萎縮はなかった。
さらに、ＳＭＡ−ＡＨＰＰ投与の（ｃ）及び（ｄ）は、下痢の発生を抑制した。
炎症性サイトカインの抑制に関しては図９及び図１０に示すように、ＳＭＡ−ＡＨＰＰ投与群の（ｃ）及び（ｄ）においては、無治療群の（ｂ）と比較して血清中のＩＬ−１２及びＴＮＦ−αの産生を有意に抑制した。
【実施例４】
【００２６】
ＰＥＧ（２０００）−ＡＨＰＰを図１１に示すスキームにより合成した。
ＡＨＰＰの微粉末１００ｍｇ（０．７ｍｍｏｌ）を０．１Ｍ ＮａＯＨの１５ｍｌ中に溶かしたものと１．３ｇの活性化ＰＥＧ（分子量２０００、ＮＯＦ製サンブライトＭＥＣ−２０ＡＳ）を２０ｍｌのクロロホルムに溶かした溶液を氷上で撹拌下に滴下しながら４０分間懸濁状態で加え反応させた。ＰＥＧを完全に加えた後もさらに室温下で２時間反応した。二成分よりなる反応溶液に０．１Ｍ ＨＣｌを加えｐＨ１．０に調整した。反応溶液のクロロホルム相を分液ロートにより分取し、無水硫酸ナトリウムを加え乾燥した。その溶液をろ紙によりろ過し、ロータリーエバポレーターを用いて減圧下にクロロホルムを除去し乾燥標品を得た。ついで、この標品を５〜８ｍｌの蒸留水に溶かし上記Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１００にてゲルクロマトグラフィーを行った。その溶出画分を２６０ｎｍの吸収により検出し、そのピークを分取し凍結乾燥して純化物を得た。その標品について動的光散乱解析を行った。また、乾燥標品を元素分析、ＦＴ−ＩＲ、ＵＶ吸収スペクトル、動的散乱による粒子サイズの分布の測定及びＸＯによるＯ２-の産生に対する阻害効果を実施例１と同様に測定した。
【００２７】
次に、ＰＥＧ（３００）とＡＨＰＰとの合成を行った。例を示す。
縮合反応のための活性化エステルの合成は、まず、５．０ｇのＰＥＧ（分子量３００、和光純薬、１６４−０９０５５、Ｌｏｔ Ｎｏ．ＷＫＧ６６４２、大阪）と、０．６ｇのｐ−ニトロフェニールクロロフーメイトを、５０ｍｌのテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）に溶かし、さらに、トリエチルアミンを０．２９ｇ添加し、２４−３０時間室温で撹拌下に反応させた。次第にトリエチルアミン塩酸塩が析出し、これをろ過して除いた。この溶液に対し、３００ｍｌのエチルエーテルを加え、沈澱を生じさせて沈澱物を得た。このものをさらに冷エチルエーテルにより洗浄した。この沈澱物を再び約５０ｍｌのＴＨＦを加え、溶解させ、このＴＨＦ溶液にエチルエーテルを加え、両溶媒の混液より、活性化ＰＥＧ（ｐ−ニトロフェニールクロロフーメイト）の結晶化物を得た。収量はＰＥＧに対し〜８０ｗ/ｗ％）であった。この活性化ＰＥＧを１．０ｇとり、２０ｍｌのＴＨＦに溶かし、これに０．１Ｍ ＮａＯＨにより溶かしたＡＨＰＰ溶液（０．５ｇ／２５ｍｌのＮａＯＨ）を撹拌下で滴下しながら加え３０〜４０時間室温で反応させた。このときすべて可溶化している状態である。この反応溶液をロータリーエバポレーターにより濃縮乾固させ、乾燥物を得た。このものをＴＨＦでさらに溶かし、エチルエーテルで沈澱させ、ＷｈａｔｍａｎのＮｏ．１フィルターでろ過し、沈澱物を分別した。この沈澱物に１０ｍｌの蒸留水を加え、溶解し、凍結乾燥により、ＰＥＧ（３００）−ＡＨＰＰの標品を得た。このもののＵＶ吸収スペクトル及び光動的散乱法により粒子サイズの分布を測定した。
【００２８】
ＡＨＰＰの吸収スペクトラムを図１２に、ＰＥＧ（２０００）−ＡＨＰＰ、ＰＥＧ（３００）−ＡＨＰＰの吸収スペクトラムをそれぞれ図１３（Ａ）、（Ｂ）に示す。図１２に示すとおり、ＡＨＰＰは、２２２及び２７０ｎｍで最大吸収を示した。また、図１３（Ａ）に示すとおりＰＥＧ（２０００）−ＡＨＰＰは２３０及びＡＨＰＰの特徴的な２７０ｎｍに最大吸収を示した。図１３（Ｂ）に示すとおりＰＥＧ（３００）−ＡＨＰＰは２２２及びＡＨＰＰの特徴的な２７０ｎｍに最大吸収を示した。
【００２９】
ＡＨＰＰのＦＴ−ＩＲスペクトラムを図１４に、ＰＥＧ（２０００）−ＡＨＰＰのＦＴ−ＩＲスペクトラムを図１５に示す。図１４に示すとおり、ＰＥＧ（２０００）−ＡＨＰＰは、特徴的な１６３８ｃｍ−１（Ｃ＝Ｏ伸縮）、２８５０ｃｍ−１付近（−ＯＣＨ３）の吸収ピークが観察された。
図１６（Ａ）、（Ｂ）は、ＰＥＧ（２０００）−ＡＨＰＰおよびＰＥＧ（３００）−ＡＨＰＰの溶液中での動的散乱による粒子サイズの分布の測定の結果を示した。その結果、ＰＥＧ（２０００）−ＡＨＰＰおよびＰＥＧ（３００）−ＡＨＰＰの粒子サイズは、それぞれ平均約２８７ｎｍ、２３５．５ｎｍであった。このデータは、ＰＥＧ−ＡＨＰＰ分子が溶液中で会合体を形成していることを証明している。
また、図１７に、ＡＨＰＰとＰＥＧ（２０００）−ＡＨＰＰのＸＯの酵素活性に対する阻害活性を示した。図１７に示すとおり、ＸＯの酵素活性に対するＰＥＧ（２０００）−ＡＨＰＰの阻害もＡＨＰＰとほぼ同程度に抑制した。
【実施例５】
【００３０】
ＡＨＰＰ−アクリレートモノマー結合化合物を図１８に示すスキームで合成した。
ＡＨＰＰの微粉末５００ｍｇ（３．３ｍｍｏｌ）を１５ｍｌの０．０７５Ｍ ＮａＯＨに溶かしたものと、塩化アクリロイル（アクロイルクロリド）を２９９ｍｇ（３．３ｍｍｏｌ）を１０ｍｌのクロロホルムに溶かした溶液を、氷上で撹拌下に滴下しながら３０分間で加え反応させた。塩化アクリロイルを完全に加えた後もさらに撹拌しながら室温下で３０分間反応した。水相反応溶液のクロロホルム相を分液ロートにより除去し、この水溶液を０．１Ｍ ＨＣｌを用いて約ｐＨ３．０に調整することで沈澱物が生成する。その沈澱物をろ過により分取し、５０ｍｌの０．１Ｍ ＨＣｌで２回洗浄し、５０ｍｌのアセトンで２回洗浄し、乾燥した。ＡＨＰＰ−アクリレートモノマーの収量は０．６ｇ（９８％）であった。
【００３１】
ＡＨＰＰ−アクリレートモノマーの吸収スペクトラムを図１９に示した。サンプル溶液は１．５ｍｇ／ｍｌの０．１Ｍ ＮａＯＨ溶液として測定した。図１９に示すとおり、ＡＨＰＰ−アクリレートモノマーは２２４及び２７０ｎｍで最大吸収を示した。
【実施例６】
【００３２】
ＡＨＰＰ−オリゴエチレングリコール（ＯＥＧ）メタアクリレートコポリマーの合成は図２０のスキームのように反応させた。
１．０ｇ ４．０ｍｍｏｌ）のオリゴエチレングリコールエチルエステルメタアクリレート（３〜４のエチレングリコールが結合した状態なので、ポリではなくオリゴエチレングリコールとした。平均分子量２４６， ＯＥＧ−ＭＡ， ＣａｔＮｏ．４０９５４５、Ｂａｔｃｈ Ｎｏ−０２８２４ＡＨ、Ａｌｄｒｉｃｈ）を２０ｍｌのジメチルスルホキシド（以下、ＤＭＳＯと記載することもある）に溶かした溶液と、０．２ｇのＡＨＰＰ−アクリルレートモノマー結合化合物を１５ｍｌのＤＭＳＯに溶かした溶液を、重合開始剤である２，２’−ａｚｏｂｉｓ［２−ｍｅｔｈｙｌｐｒｏｐａｎｅｎｉｔｒｉｌｅ］を２．０ｍｇ加え６５℃で２４時間反応させた。その反応溶液をロータリーエバポレーターにより濃縮乾固し、乾燥物をジエチルエーテルで３回洗浄し精製した。この標品を上記と同様に蒸留水にとかしＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１００にてゲルクロマトグラフィーを行った。その溶出画分は２６０ｎｍの吸収により検出し、そのピークを分取して凍結乾燥し純化物を得た。ＡＨＰＰ−ＯＥＧメタアクリレートコポリマーの収量は０．９５ｇ（７９％）であった。
【００３３】
図２１にＡＨＰＰ−ＯＥＧメタアクリレートポリマーの吸収スペクトルを示す。
図２１に示すとおり、ＡＨＰＰ−ＯＥＧメタアクリレートポリマーは２３０及び２７０ｎｍの最大吸収を示した。また、ＡＨＰＰ−ＯＥＧメタアクリレートコポリマーのＦＴ−ＩＲスペクトラムを図２２に示した。図２２に示すとおり、ＡＨＰＰ−ＯＥＧメタアクリレートポリマーは１６５０ｃｍ−１付近にピーク（アミドのＣ＝Ｏ伸縮）が観察された。
【００３４】
ＡＨＰＰ−ＯＥＧメタアクリレートポリマーの分子量をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１００ゲル（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）クロマトグラフィー［ｓｉｚｅ：３５ｃｍ（ｈ） × ２．５ｃｍ （ｄ）］により、ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ＩｇＧ（１５５ｋＤａ）、ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ（６７ｋＤａ）、ｏｖａｌｂｕｍｉｎ（４３ｋＤａ）、ｌｙｓｏｚｙｍｅ（１４ｋＤａ）、ｐｈｅｎｏｌｒｅｄ（０．３ｋＤａ）を分子量マーカーとして用いて、見かけ上の溶液状態での分子量を推定した。結果を図２３に示した。ＡＨＰＰ−ＯＥＧメタアクリレートポリマーは見かけ上９９ｋＤａの分子量を示した。
得られたＡＨＰＰ−ＯＥＧメタアクリレートコポリマーはＸＯの酵素活性の阻害を実施例１と同様に測定したところ、ＡＨＰＰとほぼ同程度にＸＯの酵素活性を阻害した。結果を図２４に示す。
【実施例７】
【００３５】
ＡＨＰＰのＳＭＡによるミセル化物（ＳＭＡ−ＡＨＰＰミセル化包摂物ともいう）を調製した。
ＳＭＡ無水物（２００ｍｇ）を０．１Ｍ ＮａＯＨまたは０．１Ｍ ＫＯＨを加え、５０〜６０℃の保温下にスターラーにより撹拌させ、ＳＭＡ無水物の加水分解反応を約１２時間かけて進行させ、ついで、このＳＭＡ加水分解を行った。反応溶液に、撹拌下に０．１Ｍ ＨＣｌを滴下し、ＳＭＡ加水分解物を沈澱させた。得られた沈殿物をガラスろ過フィルター（２〜４μｍ）を通して分取し、さらに冷０．００１ＭＨＣｌで洗浄後凍結乾燥し、ＳＭＡ加水分解物を調製した。
ＳＭＡとは別に、ＡＨＰＰ（微粉末状）３７８ｍｇを５０ｍｌの０．１Ｍ ＮａＯＨに加え、３７〜４０℃撹拌下に一夜放置し、ＡＨＰＰの飽和溶液を調製した。このＡＨＰＰの飽和溶液をＰＴＦＥフィルター（０．４５μｍ、Ｔｏｙｏ Ｒｏｓｈｉ Ｋａｉｓｈａ, Ｌｔｄ, Ｔｏｋｙｏ, Ｊａｐａｎ）でろ過し、ＳＭＡ加水分解物５７６ｍｇを１０ｍｌの０．０１Ｍ Ｎａ２ＣＯ３／ＮａＨＣＯ３（ｐＨ９．０）で溶解したものを、ゆっくりと室温下にスターラーで撹拌しながら滴下した。ＳＭＡ加水分解溶液を完全に加えた後、さらに撹拌させながら、５時間反応させた。撹拌下、生成した水可溶性のミセルに０．０１Ｍ ＨＣｌを加えｐＨを４．０とし、生じた沈澱物を遠心分離し、もう一度、冷０．００１Ｍ ＨＣｌで洗浄した。次に０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３を加え再溶解させた後、分子量１０００〜１００００の分子ふるい膜を用いて実施例１に準じて濃縮し、凍結乾燥物を得た。この凍結乾燥物を０．１Ｍ Ｎａ２ＣＯ３に溶かしＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１００ゲル（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）クロマトグラフィー［ｓｉｚｅ：３５ｃｍ（ｈ） × ２．５ｃｍ （ｄ）］により単一ピークとして精製した。また、ＡＨＰＰは２６０ｎｍの吸収で検出した。推定されるミセル化会合／包摂物を図２５に示す。
【００３６】
ＳＭＡ−ＡＨＰＰを各ラット当たり０．５ｍｌ中に１５及び３０ｍｇ／ｋｇ（ＡＨＰＰ換算）になるように生理食塩水に溶解し、自然高血圧ラット（ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ ｒａｔ， ＳＨＲ、平均体重約３００ｇ、１群３−４匹）に尾静脈より投与した。また、もう１群には１００ｍｇ／ｋｇラット（ＡＨＰＰ換算）のＳＭＡ−ＡＨＰＰをＳＨＲにゾンデにより経口投与した。投与してから３時間後に無加温型非観血式血圧計（ＭｏｄｅｌＭＫ−２０００ＭＴ、室町機器）を用いて血圧の変動を測定した。
【００３７】
図２６にＳＭＡ−ＡＨＰＰの尾静脈投与の結果を示す。ＳＭＡ−ＡＨＰＰの１５及び３０ｍｇ／ｋｇを１回尾静脈投与後、２４時間にわたり観察したところ、ＳＭＡ−ＡＨＰＰ投与群はコントロール群と比較して血圧降下作用（抗高血圧作用）を示した。３０ｍｇ／ｋｇのＳＭＡ−ＡＨＰＰの静脈投与ではＳＨＲ高血圧ラットの無治療コントロール群の血圧の約７５％（−２５％低下）にまで有意に抑制した。この作用は、１回の投与により、２４時間以上にわたり降圧作用を持続した。図中◆プロットは、コントロール、■プロットは３０ｍｇ／ｋｇ、▲プロットは３０ｍｇ／ｋｇの投与量を示す。
さらに重要なことに、図２７に示すように、１００ｍｇ／ｋｇのＳＭＡ−ＡＨＰＰの経口投与では、投与２４時間後に血圧のもとの値より２０ｍｍＨｇ低値と有意に血圧を減少させ、さらに４８時間後まで有意に低い血圧を維持した。しかし、その後は緩やかな上昇を示しつつも、７２時間後に二回目の治療をした結果、２１６時間後までコントロール群と比較して、有意に降圧作用を示した（Ｐ＜０．０１）。図中▲プロットはコントロール、●プロットは１００ｍｇ／ｋｇのＳＭＡ−ＡＨＰＰ投与量を示す。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】本発明にかかるＳＭＡ−ＡＨＰＰの合成スキームを示す。
【図２】ＳＭＡとＳＭＡ−ＡＨＰＰのＦＴ−ＩＲスペクトラムを示す。
【図３】ＸＯ酵素の活性に対するＡＨＰＰとＳＭＡ−ＡＨＰＰの阻害活性を示す。
【図４】ＡＨＰＰとＳＭＡ−ＡＨＰＰのＸＯによるＯ２−生成の阻害活性を示す。
【図５】ラット肝臓中のＬＤＨ変化を示すグラフである。
【図６】ラット肝臓中のＡＬＴ及びＡＳＴの変化を示す。
【図７】ラット肝臓中の過酸化物量の変化を示す。
【図８】ＤＳＳ飲水投与によるマウスの体重、肝臓重量及び大腸の長さの変化を示す。
【図９】マウス血清中のＩＬ−１２の変化を示す。
【図１０】マウス血清中のＴＮＦ−αの変化を示す。
【図１１】本発明にかかるＰＥＧ−ＡＨＰＰの合成スキームを示す。
【図１２】ＡＨＰＰの吸収スペクトラムを示す。
【図１３】（Ａ）はＰＥＧ（２０００）−ＡＨＰＰ、（Ｂ）はＰＥＧ（３００）―ＡＨＰＰの吸収スペクトラムを示す。
【図１４】ＡＨＰＰのＦＴ−ＩＲスペクトラムを示す。
【図１５】ＰＥＧ−ＡＨＰＰのＦＴ−ＩＲスペクトラムを示す。
【図１６】（Ａ）はＰＥＧ（２０００）−ＡＨＰＰ、（Ｂ）はＰＥＧ（３００）−ＡＨＰＰの光動的散乱による溶液中の粒子分布を示す。
【図１７】ＰＥＧとＰＥＧ−ＡＨＰＰのＸＯによるＯ２−生成の阻害活性を示す。
【図１８】ＡＨＰＰ−アクリレートモノマー結合化合物の合成スキームを示す。
【図１９】ＡＨＰＰ−アクリレートモノマーの吸収スペクトラムを示す。
【図２０】ＡＨＰＰ−オリゴエチレングリコール（ＯＥＧ）メタアクリレートコポリマーの合成スキームを示す。
【図２１】ＡＨＰＰ−ＯＥＧメタアクリレートポリマーの吸収スペクトルを示す。
【図２２】ＡＨＰＰ−ＯＥＧメタアクリレートコポリマーのＦＴ−ＩＲスペクトラムを示す。
【図２３】ＡＨＰＰ−ＯＥＧメタアクリレートポリマーの分子量を示す。
【図２４】ＡＨＰＰ−ＯＥＧメタアクリレートポリマーのＸＯによるＯ２−生成の阻害活性を示す。
【図２５】ＡＨＰＰのＳＭＡミセル化物の会合体／包摂物の構造概念図である。
【図２６】ＡＨＰＰのＳＭＡ−ＡＨＰＰの注射投与による降血圧作用を示す。
【図２７】ＡＨＰＰのＳＭＡ−ＡＨＰＰの経口投与による降血圧作用を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
４−アミノ−６−ハイドロキシピラゾロ（３，４−ｄ）ピリミジン、その薬学的に許容される塩、その誘導体、または４−アミノ−６−ハイドロキシピラゾロ（３，４−ｄ）ピリミジンを含有するミセル体を有効成分として含有する、抗炎症剤。
【請求項２】
前記４−アミノ−６−ハイドロキシピラゾロ（３，４−ｄ）ピリミジンは、式１で表わされる化合物であり、その誘導体は式２で表わされる化合物である、請求項１記載の抗炎症剤。〔なお、式２中、Ｘは、式３〜式６で表わされる１つの置換基である。〕
【化１】
【化２】
【化３】
なお、式中のｋは２〜３００の自然数を表わす。
【化４】
なお、式中のｌは１〜１０００の自然数を表わす。
【化５】
【化６】
なお、式中、ｍ、ｎは１〜１０００の自然数を表わす。
【請求項３】
前記４−アミノ−６−ハイドロキシピラゾロ（３，４−ｄ）ピリミジン誘導体が、４−アミノ−６−ハイドロキシピラゾロ（３，４−ｄ）ピリミジンとスチレンマレイン酸コポリマーとのミセル化物（式７）である、請求項１記載の抗炎症剤。なお、
【化７】
なお、ここで、ｐは３〜２００の自然数を表わす。
【請求項４】
炎症反応が活性酸素により起因する炎症である、請求項１〜３の何れかに記載の抗炎症剤。
【請求項５】
前記炎症が虚血再還流由来の炎症である、請求項１〜３の何れかに記載の抗炎症剤。
【請求項６】
前記炎症が、肺炎、肝炎、胃炎、大腸炎、皮膚炎、口内炎、咽頭炎、気管支炎、膵炎等の各種炎症性疾患のいずれかである、請求項１〜３の何れかに記載の抗炎症剤。
【請求項１】
４−アミノ−６−ハイドロキシピラゾロ（３，４−ｄ）ピリミジン、その薬学的に許容される塩、その誘導体、または４−アミノ−６−ハイドロキシピラゾロ（３，４−ｄ）ピリミジンを含有するミセル体を有効成分として含有する、抗炎症剤。
【請求項２】
前記４−アミノ−６−ハイドロキシピラゾロ（３，４−ｄ）ピリミジンは、式１で表わされる化合物であり、その誘導体は式２で表わされる化合物である、請求項１記載の抗炎症剤。〔なお、式２中、Ｘは、式３〜式６で表わされる１つの置換基である。〕
【化１】
【化２】
【化３】
なお、式中のｋは２〜３００の自然数を表わす。
【化４】
なお、式中のｌは１〜１０００の自然数を表わす。
【化５】
【化６】
なお、式中、ｍ、ｎは１〜１０００の自然数を表わす。
【請求項３】
前記４−アミノ−６−ハイドロキシピラゾロ（３，４−ｄ）ピリミジン誘導体が、４−アミノ−６−ハイドロキシピラゾロ（３，４−ｄ）ピリミジンとスチレンマレイン酸コポリマーとのミセル化物（式７）である、請求項１記載の抗炎症剤。なお、
【化７】
なお、ここで、ｐは３〜２００の自然数を表わす。
【請求項４】
炎症反応が活性酸素により起因する炎症である、請求項１〜３の何れかに記載の抗炎症剤。
【請求項５】
前記炎症が虚血再還流由来の炎症である、請求項１〜３の何れかに記載の抗炎症剤。
【請求項６】
前記炎症が、肺炎、肝炎、胃炎、大腸炎、皮膚炎、口内炎、咽頭炎、気管支炎、膵炎等の各種炎症性疾患のいずれかである、請求項１〜３の何れかに記載の抗炎症剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１７】
【図１８】
【図２０】
【図２３】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図６】
【図７】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１９】
【図２１】
【図２２】
【図２４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１７】
【図１８】
【図２０】
【図２３】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図６】
【図７】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１９】
【図２１】
【図２２】
【図２４】
【公開番号】特開２０１０−１３４１１（Ｐ２０１０−１３４１１Ａ）
【公開日】平成２２年１月２１日（２０１０．１．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１７６３９７（Ｐ２００８−１７６３９７）
【出願日】平成２０年７月５日（２００８．７．５）
【出願人】（０００２０１３２０）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１月２１日（２０１０．１．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年７月５日（２００８．７．５）
【出願人】（０００２０１３２０）
【Ｆターム（参考）】
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