抗癌化合物の使用
本発明は、式（Ｉ）で表わされる化合物、その製造方法、前記化合物を含む医薬製剤、及び子宮頸部及び卵巣の癌細胞の増殖を阻害することによる癌の予防と治療のための医薬製剤の製造に於ける前記化合物の使用に関する。
【化１】
【化１】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、天然の治療用化合物及びその医療上の使用に関する。より詳細には、本発明は、子宮頚癌及び卵巣癌の治療用の医薬製剤の製造に用いる活性薬剤、ゼルンボン（ｚｅｒｕｍｂｏｎｅ）として知られる天然化合物に関する。また、本発明は、前記化合物の抽出方法及び前記化合物を含有する医薬組成物にも関する。
【背景技術】
【０００２】
癌とは、主に細胞増殖の非制御から始まり、隣接する正常な組織又は器官に浸潤し、その場所で新たな増殖の基盤を確立し、最終的には死を招く恐れのある疾患の種類の総称である。近年において、細胞周期若しくはアポトーシスの制御並びに癌遺伝子及び腫瘍抑制遺伝子を含む新たな標的の開発において著しい進歩が得られた。しかしながら、これらの尽力にもかかわらず、癌の発症率は増加し続けている。
【０００３】
最も典型的な３種類の抗癌治療は、外科手術、放射線療法及び化学療法である。治療は、薬物又は他の因子を用いて体内の癌細胞を除去するか又は破壊することを目的とする。
【０００４】
外科手術は、癌の種類によっては非常に成功率の高い治療法となりうるが、全ての者がこの治療法を選択できるわけではない。癌が悪性の腫瘍の状態にあるか、腫瘍が一ヶ所に存在する（局在する）場合、腫瘍と周辺の患部組織を安全に「切り取る」ことは可能であろう。癌が身体の他の領域に広がってしまっている場合又は肝臓又は脳等の生命維持に不可欠な器官を損傷することなく腫瘍を取り出せない場合には、外科手術は不可能になるであろう。
【０００５】
癌治療は、特別な種類のＸ線、γ線又は電子の形態にある放射線を用いて、癌細胞が増殖できなくなるようにこれらを破壊する。通常は、治療において痛みを感じることはない。放射線治療は、場合によっては、この治療法のみで有用な場合もあれば、外科手術等の他の治療法と共に用いられる場合もある。外科手術と放射線療法両方の組合せは、一ヶ所で増殖する腫瘍の治療に用いられる場合がある。
【０００６】
化学療法では薬物を用いて癌細胞を攻撃する。単に「化学療法」という文字を見ただけでも、副作用の負担が大きな場合もあることから、大変な不安を引き起こす場合がある。しかしながら、全ての者が激しい副作用を被るわけではない。化学療法による副作用は、しばしば他の薬物を用いることで軽減できる。通常、化学療法は、癌が身体の他の領域に広がってしまっている場合に用いられる。化学療法は、外科手術及び放射線療法との組み合わせで用いられる場合もある。場合によっては、外科手術で腫瘍を取り除いて、その後に化学療法により全ての癌細胞を確実に死滅させることになる。化学療法の欠点の一つとしては、乳癌、大腸癌及び肺癌等の一般的な上皮由来腫瘍の治療において効果を奏しない場合があることが挙げられる。これは、主に、複数種類の抗癌剤に対する癌細胞の耐性によるものであり、抗ガン剤の適用が非常に限定されることになる。
【０００７】
最新の抗癌剤は、癌細胞が正常細胞よりも速く分裂するという事実に基づいて開発されており、ＤＮＡ複製又は合成を阻害する化合物、代謝阻害剤、細胞分裂阻害剤、ヌクレオチド類似体及びトポイソメラーゼ阻害剤に代表される。従って、抗ガン剤は、典型的に癌細胞の分裂と生存に対する効果を有する。従来の抗癌剤は、癌細胞の迅速な分裂に焦点を当てていたことから、これらの抗癌剤は、毒性を有していたり（例えば、体毛が抜け落ちる）や通常の条件下でも分裂速度の速い正常細胞（例えば、骨髄細胞）にも作用するといった不都合を有している。
【０００８】
別の種類の治療法としては、生物療法が挙げられる。この治療法では、身体の免疫系を誘起させるタンパク質を用いてより多くの白血球（又はリンパ球）を生産する。癌細胞を攻撃して死滅させることのできる２種類のリンパ球は、Ｔ細胞及びＢ細胞である。タンパク質によりＴ細胞及びＢ細胞のリンパ球が癌を死滅させる能力が増大される。生物療法は、外科手術、放射線療法又は化学療法との組み合わせで用いることも可能である。
【０００９】
ホルモン療法を用いて乳癌又は前立腺癌を治療する場合もある。エストロゲンというホルモンは、乳癌の腫瘍の増殖を加速させることができる。同様に、テストステロンというホルモンは、前立腺内の癌性腫瘍の増殖を加速させることができる。別のホルモンを含有する薬物を用いてエストロゲンとテストステロンの作用を遮断することができる。別のケースでは、卵巣又は精巣を取り除く外科手術を採用する場合もある。これらの器官と取り除くことにより、体内のエストロゲン又はテストステロン量が減少する。ホルモン療法は、しばしば、化学療法又は放射線療法に追加して用いられる。
【００１０】
植物抽出物は、種々の疾患の治療及び予防において治療の潜在的能力を有すると信じられている。Ｚｉｎｇｉｂｅｒ ｚｅｒｕｍｂｅｔの根茎は、抗炎症性の民間医薬として使用される、よく知られた生薬である（Ｅｌｌｉｏｔ ｅｔ ａｌ., １９８７）。Ｚ. ｚｅｒｕｍｂｅｔは、Ｚｉｎｇｉｂｅｒａｃｅａｅ（ショウガ科）に属しており、パインコーンジンジャー（ｐｉｎｅｃｏｎｅ ｇｉｎｇｅｒ）、シャンプージンジャー（ｓｈａｍｐｏｏ ｇｉｎｇｅｒ）、アワプヒクアヒウィ（Ａｗａｐｕｈｉ ｋｕａｈｉｗｉ）（ハワイ名）及び「レンポヤン（ｌｅｍｐｏｙａｎｇ）」（マレーシア名）という一般的名称を有する。一般的に、東南アジア地域においては、複数種のＺｉｎｇｉｂｅｒａｃｅａｅが、スパイス、薬物、香料及び特定の色素の原料として用いられている（Ｂｕｒｋｉｌｌ, １９６６）。
【００１１】
野生種のショウガであるＺｉｎｇｉｂｅｒ ｚｅｒｕｍｂｅｔの精油の主成分であるゼルンボンは、架橋結合したジエノン系を含有する単環式セスキテルペンである（Ｋｉｔａｙａｍａ ｅｔ ａｌ., ２００２）（図１）。一部地域で抗炎症薬として用いられる根茎中に大量のアキラル性セスキテルペンであるゼルンボンが検出された（Ｄ'Ｏｄｏｒｉｃｏ ｅｔ ａｌ., ２００１）。この化合物は、この植物の食用部分、特に、伝統料理で用いられる若い茎と花序中に存在する（Ｋａｎｋｕｒｉ ｅｔ ａｌ., １９９９）。
【００１２】
Ｍａｔｔｈｅｓ ｅｔ ａｌ.（１９８０）では、ゼルンボンが細胞毒性を示すことが報告され、一方で、Ｍｕｒａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ.（１９９９）には、ゼルンボンが、１２-Ｏ-テトラデコニル-１３-アセテート誘導性のエプスタイン‐バーウイルスの活性化に対する有力な阻害剤であることが記載されている。興味深いことに、リポ多糖（ＬＰＳ）及びインターフェロン（ＩＦＮ）-□で処理したＲＡＷ２６４.７マクロファージ内での誘導性の一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）とＣＯＸ-２の発現、並びに白血球内での一酸化窒素（ＮＯ）/Ｏ2生成をゼルンボンが阻害することが判明した（Ｔａｎａｋａ ｅｔ ａｌ., ２００１）。また、ゼルンボンは、ＴＮＦ-□の放出を抑制し、種々のヒト由来大腸腺癌セルラインのアポトーシスを誘導することも示されている（Ｍｕｒａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ., ２００２）。Ｍｕｒａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ.（２００３ａ）では、ゼルンボンが、マウスのＤＳＳ誘導性大腸炎に対して顕著な抑制効果を示すことが実証されている。また、最近では、ゼルンボンが腫瘍プロモーターの１２-Ｏ-テトラデカノイルフォルボール-１３-アセテート（ＴＰＡ）に誘導されるエプスタイン‐バーウイルスの活性化を強力に抑制することも判明している。
【００１３】
大腸のクリプト細胞核内のＡｇＮＯＲ数がゼルンボンにより低下している。これらの知見から、発癌物質誘導性ＡＦＣの発達におけるＣＯＸ-２発現、大腸粘膜の細胞増殖活性及びフェーズＩＩ解毒酵素の誘起の抑制を通じた、ＺＩＩの潜在的な化学的予防能力が示唆されるであろう（Ｔａｎａｋａ ｅｔ ａｌ., ２００１）。
【００１４】
大部分の西側諸国における広範囲な集団スクリーニングにより、子宮頸癌の発症率と死亡率は大幅に低下したが、しかしながら、子宮頸癌は、依然として世界規模で女性に対して甚大な影響を有している（Ｓｅｇｎａｎ, １９９４）。毎年、約４００,０００名の女性が子宮頸癌を発症し、このうち２５０,０００名がこの癌由来の原因で死亡していることが報告されている（Ｐａｒｋｉｎ ｅｔ ａｌ., １９９９）。
【００１５】
一方で、卵巣癌は、西側諸国において婦人科関連死因の第１位となっており、女性では４番目に高頻度な悪性腫瘍である（Ｇｒｅｅｎｌｅｅ ｅｔ ａｌ, ２０００）。先進諸国では約７５人に１人が卵巣癌を患い、具体的な症状がなく、多くの場合診断が遅れることから、患者の少なくとも３分の２に当たる女性が末期症状を示す（Ｑｕｉｎｎ, ２００３）。
【００１６】
シスプラチンは、一貫して、進行した子宮頸癌又は再発した子宮頸癌の治療に最も有効な単一の細胞毒性薬剤としての能力を証明し続けている。しかしながら、この薬物に応答性を示す患者の比率は、２３％〜５０％であり、子宮頸癌を患う患者の転帰を向上させる新たな活性薬物が必要である（Ｓａｖａｒｅｓｅ ａｎｄ Ｃｏｇｎｅｔｔｉ, ２００３）。これに加え、白金系化学療法は、上皮性卵巣癌の最も効果的な治療法である（Ｐｉｃｃａｒｔ ｅｔ ａｌ. ２０００）。
【００１７】
先行技術では、ヒトの子宮頸部及び卵巣内の癌を阻害する天然の植物性化合物について未だ報告がなされていない。更にまた、先行技術では、病理/生理学的状態の効果的な治療方法が見つかっておらず、種々の有害な薬物反応を伴う。
【００１８】
上記及び種々の疾患を患う患者数の増加を鑑みるに、全ての者が、より副作用が少なく、より良好な薬物を望んでいる。従って、癌細胞のアポトーシスを誘導して癌の転移を阻害する効果を有し、加えて、癌細胞の増殖をより効果的に阻害する天然化合物を提供することは有益なこととなるであろう。また、前記化合物は毒性を有していないため、癌を予防して治療するための機能性食品として用いることも可能である。
【００１９】
癌、特に、子宮頸癌及び卵巣癌の治療用の新たな薬物を提供することが本発明の目的である。本発明は、現在の技術水準の癌の治療方法の不都合を克服する、強力な抗癌特性を有する天然化合物を提供する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明の第１の局面によれば、以下の式を有する化合物の、癌の予防及び治療用の医薬製剤の製造における使用が提供される。
【００２１】
【化１】
【００２２】
従って、本発明に係る化合物は、アポトーシス機構によって子宮頸部及び卵巣の癌細胞の増殖を阻害する所望の効果を提供する。
【００２３】
本発明の別の局面によれば、Ｚｉｎｇｉｂｅｒ属の植物から非極性抽出物を調製すること、前記非極性抽出物を、シリカゲルカラムを通して、１種類の有機溶媒及び複数の有機溶媒の混合物で順に溶離する分画化に付することで、Ｚｉｎｇｉｂｅｒ属の植物由来の非極性抽出物の分画を得ること、そして再結晶法、分配法及びクロマトグラフィー法により前記化合物を精製することを含む、上記化合物の抽出及び精製方法が提供される。
【００２４】
前記植物は、Ｚｉｎｇｉｂｅｒ ｚｅｒｕｍｂｅｔ及びＺｉｎｇｉｂｅｒ ａｒｏｍａｔｉｃｕｍからなる群から選択される。
【００２５】
前記有機溶媒は、ヘキサン及び/又は酢酸エチルからなる群から選択可能である。
【００２６】
本発明の更なる別の局面では、有効成分として上記化合物を強力な抗ガン特性を示すのに有効であり、それによって、子宮頸癌及び卵巣癌を伴う状態の予防及び治療に有用な量で含む医薬製剤が提供される。
【００２７】
前記化合物は、アポトーシス機構による癌細胞に対する選択的な細胞毒性を誘導する、化学療法剤として作用することができる。本発明の医薬製剤は、許容可能な担体に含まれて提供され、粉末、顆粒、錠剤、カプセル、水性薬物又は注射液等、当業者に知られるいずれの方法でも投与可能である。
【００２８】
Ｚｉｎｇｉｂｅｒ属の植物由来の非極性有機抽出物から得られる上記の化合物の分画は、標準的な方法により、ソフトゲルカプセルを含むカプセル、錠剤、ガレヌス製剤、粉末、顆粒、水性薬物、注射液等の臨床使用用の種々の医薬製剤へと製剤することが可能であり、この場合、前記化合物は、その効能及び毒性に基づく治療有効量で有効成分として、単体又は他の化学物質との組み合わせで存在し、そして経口、舌下、静脈内、筋肉内等の様々な投与経路を通じて投与される。有効量とは、アポトーシス機構によって、癌細胞、特に、子宮頸癌及び卵巣癌に対する細胞毒性を増大及び／又は誘導するのに十分な量である。
【００２９】
細胞毒性を増大及び/又は誘導する有効量は、以下に依存するであろう：治療する状態の重症度；年齢、生理条件、大きさ及び体重等の患者個人のパラメーター；併用される治療及び薬物との相互作用；治療頻度；及び投与方法。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図１には、本発明に係るゼルンボン抽出物の高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析が例示されている。
【図２】図２には、本発明に係るゼルンボン抽出物の液体カラム質量分析（Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｏｌｕｍｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：ＬＣＭＳ）分析が例示されている。
【図３】図３には、ゼルンボンの子宮頸癌細胞（ＨｅＬａ）に対する細胞毒性効果が例示されている。
【図４】図４には、シスプラチンの子宮頸癌細胞（ＨｅＬａ）に対する細胞毒性効果が例示されている。
【図５】図５には、ゼルンボン及びシスプラチンをＩＣ50値で用いて処理した７２時間後の卵巣癌細胞（Ｃａｏｖ-３）の形態変化が例示されている（倍率２０ｘ１０）。（Ａ）コントロール、（Ｂ）ゼルンボン及び（Ｃ）シスプラチン。
【図６】図６には、ゼルンボン及びシスプラチンをＩＣ50値で用いて処理した７２時間後の子宮頸癌細胞（ＨｅＬａ）の形態変化が例示されている（倍率２０ｘ１０）。（Ａ）コントロール、（Ｂ）ゼルンボン及び（Ｃ）シスプラチン。
【図７】図７には、未処理（コントロール）のヒト卵巣癌細胞（Ｃａｏｖ-３）の（Ａ）２４時間後；（Ｂ）７２時間後の共焦点形態試験が例示されている。
【図８】図８には、１８.５ ｍＭのゼルンボンによるヒト卵巣癌細胞（Ｃａｏｖ-３）の（Ａ）２４時間後；（Ｂ）４８時間後の形態試験が例示されている。
【図９】図９には、１８.５ ｍＭのゼルンボンによるヒト卵巣癌細胞（Ｃａｏｖ-３）の（Ａ）４８時間後；（Ｂ）７２時間後の形態試験が例示されている。
【図１０】図１０には、ゼルンボン及びシスプラチンでの治療の４８時間後にＡＯ/ＰＩで染色し、レーザー走査性共焦点顕微鏡で観察した子宮頸癌細胞（ＨｅＬａ）の形態変化が示されている。倍率は、１００ｘ１０：（Ａ）コントロール、（Ｂ）ゼルンボン及び（Ｃ）シスプラチン。矢印Ｂ：細胞膜の小疱形成、Ｎ：辺縁趨向及び核損傷を伴う核凝縮。
【図１１】図１１には、０〜４５ μｍの濃度範囲のゼルンボンで処置した後の子宮頸癌細胞（ＨｅＬａ細胞）の細胞周期の進行が例示されている。
【図１２】図１２には、ＩＣ50値でそれぞれ２４時間及び４８時間処理した卵巣癌細胞（Ｃａｏｖ-３細胞）のゼルンボン及びシスプラチン誘導性アポトーシスが例示されている。アポトーシス細胞は、ＴＵＮＥＬアッセイ後に手作業で定量した。データは、２つの重複するサンプルから得た平均値±標準偏差で示されている。シングルダガーは、コントロールと比較した場合にｐ＜０.０５であることを示す；ダブルダガーは、コントロールと比較した場合にｐ＜０.０１であることを示す（Ｏｎｅ-Ｗａｙ ＡＮＯＶＡにより解析）。
【図１３】図１３には、ＩＣ50値でそれぞれ２４時間及び４８時間処理した子宮頸癌細胞（ＨｅＬａ細胞）のゼルンボン及びシスプラチン誘導性アポトーシスが例示されている。アポトーシスは、ＴＵＮＥＬアッセイ後に手作業で定量した。データは、２つの重複するサンプルから得た平均値±標準偏差で示されている。ダブルダガーは、コントロールと比較した場合にｐ＜０.０１であることを示す（Ｏｎｅ-Ｗａｙ ＡＮＯＶＡにより解析）。
【図１４】図１４には、正常マウスの、明確な脈管形成が認められず、細胞質に対する核の比率が低い子宮頸部上皮細胞を示す顕微鏡写真である。
【図１５】図１５は、メスのｂａｌｂ/ｃマウスの誘導性子宮頸癌に対する１０ｍｇ/ｋｇのシスプラチンを用いた治療を示す顕微鏡写真である。上皮層の３分の１に限定される軽度の核異型を伴う軽度の形成異常（ＣＩＮ Ｉ）（倍率１０ｘ２０）。
【図１６】図１６は、メスのｂａｌｂ/ｃマウスの誘導性子宮頸癌に対する１６ｍｇ/ｋｇのゼルンボンを用いた治療を示す顕微鏡写真である。上皮層の３分の１（黒色矢印）に限定される軽度の形成異常（ＣＩＮ Ｉ）及び軽度の核異型、並びに脈管形成（青色矢印）（倍率１０ｘ２０）。
【図１７】図１７は、メスのｂａｌｂ/ｃマウスの誘導性子宮頸癌に対する通常の生理食塩水を用いた治療を示す顕微鏡写真である。上皮の全層に限定される重度の核異型を伴う重度の形成異常（ＣＩＮ ＩＩＩ）及び重度の脈管形成（倍率１０ｘ２０）。
【図１８】図１８は、マウスの治療群の血清ＩＬ-６濃度を示すヒストグラムである。各値は、Ｐ＜０.０１の有意性を有する（ＳＰＳＳバージョン１２を用いたＯｎｅ-Ｗａｙ ＡＮＯＶＡにより解析）。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
Ｚｉｎｇｉｂｅｒ ｚｅｒｕｍｂｅｔの植物は、茎に沿って反対に並ぶ長くて細い葉を特徴とし、約７フィートの高さにまで成長する。この植物種は、東南アジアが原産であるが、世界中の熱帯地方及び亜熱帯地方で広く栽培されており、いくつかの地方では帰化している。東南アジア地方では、一般的に、複数種のＺｉｎｇｉｂｅｒｃｅａｅが、スパイス、薬物、香料及び特定の色素の供給源として用いられる。
【００３２】
未加工の植物性材料の加工に関しては、有効成分又はセスキテルペンであるゼルンボンは、植物の１部分に局在していると判断された。有効成分が抽出される植物部分は、根茎であり、この部分は肉厚の茎として特徴付けられ、地面に沿って又は地中に伸び、根茎からは根と芽が伸びる。本発明の実施においては、前記植物の根茎部分が取り出され、その後に、個別に又はまとめて利用される。
【００３３】
本発明の種々の特徴及び局面は、以下の実施例に更に例示されている。これらの実施例は、本発明の範囲内で実施する方法を当業者に示すために提示されるものではあるが、本発明の範囲を限定するものではなく、本発明の範囲は、請求項のみによって定義される。
【実施例１】
【００３４】
（粗抽出物の調製）
５ ｋｇのＺｉｎｇｉｂｅｒ ｚｅｒｕｍｂｅｔを小片（１〜２ｍｍ）にカットし、３７℃のオーブンで３週間乾燥させた。乾燥したＺｉｎｇｉｂｅｒ ｚｅｒｕｍｂｅｔの小片を粉砕し、粉砕されたＺｉｎｇｉｂｅｒ ｚｅｒｕｍｂｅｔサンプル４３２ ｇを１００％メタノールに３日間浸漬した。次いで、ろ紙を用いてサンプルをろ過した。ゼルンボン等の複数種類の化合物を含むメタノールをコニカルフラスコに回収し、残ったサンプルについては、再度１００％メタノールで２回目の浸漬を行い、このメタノール及び抽出物は、ロータリー式蒸発装置を用いて４０℃で蒸発させた。この工程を２回繰り返し、最後にろ過した後のサンプルと抽出物を先のサンプル（メタノール＋抽出物）と混合して蒸発させると、濃褐色のゴム状に見える粗抽出物が４０.３ ｇ得られた。
【実施例２】
【００３５】
（非極性抽出物の調製）
粗抽出物をメタノール及び蒸留水と混合し、その後、分液漏斗に注いだ。１００％ヘキサンを分液漏斗に加え、漏斗を激しく振って確実に溶液を十分に混和させ、溶液を２層（上層が極性化合物を含有する水層であり、下層が非極性化合物、即ち、ゼルンボンを含有する非極性層）に分離させるために５分間放置した。次に、水層と非水層を別々のコニカルフラスコに回収して分離に付した。再度水層を分液漏斗に注いで１００％ヘキサンを添加し、この分離工程を再度３回繰り返した。次に、分離工程で得た非極性層の全てを一つにまとめて丸底フラスコに注ぎ、ロータリー式蒸発装置を用いた蒸発を行うと、ゼルンボンを含む非極性抽出物が２０.６グラム得られた。
【実施例３】
【００３６】
（非極性抽出物分画の調製）
分画工程は、カラムクロマトグラフィープロセスにより行った。２種類の主な充填剤が含まれ、これらは乾燥充填剤とカラム充填剤であった。乾燥充填剤では、ロータリー式蒸発で得た抽出物（２０.６ ｇ）をシリカゲルと共に加え、乾燥粉末（２０.Ｏｇ）が形成されるまで再度ロータリー式蒸発をおこなった。カラム充填物では、シリカゲルをヘキサンと混合し、クロマトグラフィー用カラムに注いだ。
【００３７】
次に、２０.０グラムの量の粉末化サンプルを吸着剤としての機能を有するシリカゲルカラム（３.５ｃｍ ｘ ３０.０ｃｍ）に注いだ。１００％ヘキサンをシリカゲルカラムに添加し、次に、溶離液として、ヘキサンと酢酸エチルの混合物を９：１及び最終的に８：２の比率で添加した。８：２の比率を維持し、ゼルンボンを含む非極性分画がカラムから単離されるまで繰り返した。カラムクロマトグラフィーで単離された分画を少量用（１０ｍｌ）のバイアルに回収した。
【実施例４】
【００３８】
（精製ゼルンボンの単離）
バイアルに回収した分画を乾燥させて結晶を得た。得られた結晶を再結晶させて精製ゼルンボン結晶を得た。次に、結晶をヘキサンで洗浄して不所望の化合物を除去してバイアル中に純粋なゼルンボン結晶を残した。再結晶は約３回繰り返した。再結晶の後、純粋ゼルンボン結晶を乾燥させ、清潔なバイアル中に回収した。５ｋｇの新しいＺｉｎｇｉｂｅｒ ｚｅｒｕｍｂｅｔから単離された純粋なゼルンボン結晶の量は、約３.１ｇであった。
【００３９】
上記分画に回収された成分は、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を用いて測定した。分画のＴＬＣを純粋なゼルンボンのＴＬＣと比較して、いずれの分画にゼルンボンが回収されたのかを決定した。得られたゼルンボンの収率を以下の表に示す。
【００４０】
オートサンプラー及び四連溶媒ポンプ（ｑｕａｔｅｒｎａｒｙ ｓｏｌｖｅｎｔ ｐｕｍｐ）を用いて高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を行った。分析用逆相カラム（Ｃ-１８カラム）を用いて分離を行った。４０％の水と６０％のアセトニトリルからなる混合物を移動相として用いて０.２ｍｌ/分の流速で化合物を分離した。
【００４１】
図１を参照するに、サンプル溶液のＨＰＬＣ分析では、１６分の保持時間を有する単一高ピークが１つだけ示された。この単一ピークにより、純粋な化合物が単離されたことが確認され、これによって、更に、粗植物抽出物から抽出及び単離された化合物が、主に１種類の単一の化合物から構成されていたことが例証される。ＨＰＬＣ分析で単一ピークが得られたが、単離された化合物の分子量を同定するために、液体クロマトグラフィー質量分析器（ＬＣＭＳ）を用いた更なる分析が必要であった。
【００４２】
オートサンプラー及び四連溶媒ポンプを用いて液体クロマトグラフィーＬＣＭＳを行った。分析逆相カラム（Ｃ-１８カラム）を用いて分離を行った。４０％（ｖ/ｖ）の１ＯｍＭ酢酸アンモニウムと６０％（ｖ/ｖ）のアセトニトリルからなる混合物を移動相として用いて０.２ｍｌ/分の流速で化合物を分離した。データ獲得/プロセッシングソフトウェアシステムを有するコンピューターに連結され、陽イオンモードでインターフェースした大気圧化学イオン化（ＡＣＰＩ）からなるイオントラップ型質量分析器に液体クロマトグラフィーシステムを連結した。
【００４３】
図２に示すＬＣＭＳ分析グラフでは、ゼルンボンのマススペクトルは、陽イオン化モードで試験した。全マススペクトルにおいて最も強度の強いイオンは、プロトン化（[Ｍ + Ｈ]+）分子である。図２を参照するに、ＬＣＭＳ分析では、ポジティブスキャンモード下で化合物がｍ/ｚ ２１９ の分子イオン[Ｍ + １]+を有する高フラグメントを生じたことが示された。このフラグメントの分子量は、陽イオンから導き出せる（陽イオン：２１９.０１ - １ = ２１８.０１）。この計算によれば、上記フラグメントの分子量は、２１８となり、これは化合物ゼルンボンの分子量である。このフラグメントが質量分析グラフ中に最も豊富に存在する。また、この化合物は、ｍ/ｚ ２５９でのポジティブプロダクトイオンスキャンモード（ＭＳ/ＭＳ）でフラグメントイオンを生じており、これは、前駆体イオンからの分子の喪失によるプロダクトイオンとして定めることができる。以下で行う分析では、スペクトル中に２５％を超える相対量で存在するプロダクトイオンだけを考慮する。ｍ/ｚ ２５９でのフラグメントは、相対量が２５％未満なので、考慮されない。この知見により、単離された化合物が実際に純粋なゼルンボン結晶であることが適切に確認される。
【００４４】
【表１】
【実施例５】
【００４５】
（ゼルンボン化合物の同定）
ゼルンボン化合物に対して1Ｈ-ＮＭＲ及び13Ｃ-ＮＭＲによる分光学的分析を行った。出願人の知る限り、ゼルンボンのスペクトルデータを報告する文献は未だに存在していない。
【００４６】
表２の1Ｈ-ＮＭＲスペクトルデータには、δ ５.９６８及び６.１０６でのメタ結合シグナルを示したダブルダブレット及びダブレットの２種類の遍在ピークが示されており、このうち一方は、トリプレットとして検出されたδ ２.４３のシグナルを有する０.９７ Ｈｚの長距離結合を示していた。δ ３.２２のメトキシ基、δ １.０８６-１.５７３の長鎖アルキル側鎖（ｍ, １６Ｈ, Ｈ-３'-Ｈ１０'）及びδ １.７７０（ｓ, １Ｈ, Ｈ-２')に起因するシグナルが認められた。
【００４７】
【表２】
【００４８】
ＩＲ: ｖｍａｘ ｃｍ-１ : １６５４.８ (共有結合Ｃ=Ｏ), １３８６.７及び１３４１.７ (ｇｅｍ-ジメチル). １Ｈ ＮＭＲ (ＣＤＣｌ３): １.０４ (３Ｈ, ｓ, Ｈ-１４), １.１７ (３Ｈ, ｓ, Ｈ-１５), １.５１ (３Ｈ, ｓ, Ｈ-１２), １.７７ (３Ｈ, ｓ, Ｈ-１３), １.８７ (１Ｈ, ｄ, Ｊ=１２.８ Ｈｚ, Ｈ-１１), ２.１９-２.４４ (５Ｈ, ｍ, Ｈ-１, Ｈ-４及びＨ-５), ５.２２ (１Ｈ, ｂｄ, Ｊ=１４.８ Ｈｚ), ５.８３ (１Ｈ, ｄ, Ｊ=１６.４ Ｈｚ), ５.９５ (１Ｈ, ｄ, Ｊ=１６.４ Ｈｚ), ５.９９ (１Ｈ, ｂｄ, Ｊ=１２.４ Ｈｚ, Ｈ-６)。
【００４９】
ゼルンボンの炭素配置を表３に示す。13Ｃ-ＮＭＲスペクトルでは、δ ３９.２１０ (ｓ, Ｃ-４), ４２.１４２ (ｓ, Ｃ-１), １２４.９０５ (ｓ, Ｃ-２), １４９.２７１ (ｓ, Ｃ-６), ２４.２６１ (ｓ, Ｃ-５) 及び１３６.４５７（ｓ, Ｃ-３）にメトキシル化１,４-ベンゾキノンを示すシグナルが示されている。
【００５０】
【表３】
【００５１】
１３Ｃ ＮＭＲ (ＣＤＣＩ３): １１.７６ (Ｃ１３), １５.１８ (Ｃ-１２), ２４.１６ (Ｃ-１４), ２４.３６ (Ｃ-５), ２９.３９ (Ｃ- １５), ３７.８３ (Ｃ-１１), ３９.４０ (Ｃ-４), ４２.３６ (Ｃ-１), １２４.９４ (Ｃ-２), １２７.１１ (Ｃ-９), １３６.２５ (Ｃ-３), １３７.９ (Ｃ-７), １４８.８４ (Ｃ-６), １６０.７５ (Ｃ-１０), ２０４.３７ (Ｃ-８)。
【００５２】
ゼルンボン化合物の化学構造
【００５３】
【化２】
【実施例６】
【００５４】
（子宮頸癌細胞（ＨｅＬａ）及び卵巣癌細胞（Ｃａｏｖ-３）に対するゼルンボンの作用の評価）
（ｉ）細胞培養
本試験で用いた癌セルラインは、ヒト由来の子宮頸癌セルラインのＨｅＬａ（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ-２）及び卵巣癌のＣａｏｖ-３（ＡＴＣＣ番号：ＨＴＢ-７５）であった。ＨｅＬａ及びＣａｏｖ-３セルラインは、１０％ ＦＣＳ、１％ペニシリン及び１％ストレプトマイシンが補充されたＲＰＭＩ １６４０並びにＤＭＥＭ（高濃度グルコース）でそれぞれ維持した。細胞は、３７℃で５％のＣＯ2を含む湿潤大気下において、２５ ｃｍ2及び７５ ｃｍ2組織培養フラスコ中で単層培養系として増殖させた。
【００５５】
（ｉｉ）細胞播種
血球計を用いてフラスコ内細胞密度を測定した。フラスコの表面から細胞を剥離するためコンフルエント状態の細胞をトリプシン処理した。１０ ｍＬの新しい培地をフラスコに加え、細胞を完全に懸濁した。次に、フラスコから１０μｌの培地をカバースリップを取り付けた血球計に移した。カウントは倒立顕微鏡下で行い、手作業でカウンターを用いて進めた。細胞密度（例えば、１ ｘ １０5 細胞/ｍＬ）を計算した。マルチチャンネルピペットを用いて１００μｌの細胞培養溶液を９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに移した。代わりに、６ウェルマイクロタイタープレートには、２ｍｌの細胞培養溶液をピペットで移した。プレートを５％ ＣＯ2下で３７℃で一晩インキュベートした。
【００５６】
（ｉｉｉ）細胞の処理
両方の種類のヒト由来癌細胞を一晩インキュベートした後、細胞をゼルンボンで処理した。各実験におけるゼルンボンの濃度は、実施した実験の最適化に応じて変化させた。コントロール又は非処理細胞には、いずれの化合物での処理を施すこともなく、培地だけを与えた。処理細胞は、次いで５％ ＣＯ2下で３７℃でインキュベートした。
【００５７】
（ｉｖ）マイクロテトラゾリウム細胞毒性アッセイ（ＭＴＴアッセイ）
本アッセイは、生存する癌細胞のミトコンドリアの酵素活性により、可溶性のＭＴＴが不溶性の色素を帯びたホルマザン生成物へと代謝還元されることに基づいており、この生成物は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解した後に分光学的分析によって測定できる（Ｃａｒｍｉｃｈａｌｅ ｅｔ ａｌ., １９８７）。ＭＴＴアッセイは、Ｋｕｍｉ-Ｄｉａｋａ ｅｔ ａｌ. (１９９８)に記載される方法に僅かな変更を加えて行った。使用したＭＭＴ溶液の濃度は、５ ｍｇ/ｍＬであった。ＭＴＴ溶液は、２５０ ｍｇのＭＴＴ粉末を５０ ｍＬのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に溶解させて調製した。０.２ミクロンのシリンジフィルターを用いて溶解したＭＴＴをろ過した。ろ過したＭＴＴ溶液を滅菌した５０ ｍＬの遠心用チューブに移してアルミホイルで包んだ。この溶液を４℃で保存したが、この時点で使用可能となる。ＭＴＴアッセイは以下の手順で行った。
【００５８】
細胞培養溶液が入った９６ウェルマイクロタイタープレートを７２時間のインキュベーションの後にインキュベーターから取り出した。コントロール用のウェルを含む各ウェルに２０ μｌの５ ｍｇ/ｍＬ ＭＴＴを添加した。次に、プレートをアルミホイルで包み、更に５％のＣＯ2下で３７℃にて４時間インキュベートした。インキュベーション終了後、余分なＭＴＴ試薬をアスピレートし、１００ μｌのＤＭＳＯを添加して残存する紫色のホルマザン結晶を溶解させた。プレートを、プレートシェーカー上で約４分間穏やかに混和させた。マイクロプレートリーダーを用いて４５０ ｎｍでのホルマザン溶液の吸光度を測定した。
【００５９】
マイクロ-テトラゾリウム（ＭＴＴ）細胞毒性アッセイを、ゼルンボン及びシスプラチンの化合物で処理したヒト子宮頸癌細胞のＨｅＬａに対して行った。Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｓｔａｎｄａｒｄ（アメリカ合衆国）(Ｇｅｒａｎ ｅｔ ａｌ., １９７２)に基づき、≦４ μｇ/ｍｌ（≦１８μＭ)のＩＣ50を非常に有意性が高いものとして考慮し、４〜３０ μｇ/ｍｌ（１８-１３７.６μＭ)のＩＣ50を有意性を有するものとして考慮する。
【００６０】
図３及び４には、ＨｅＬａ癌細胞に対するゼルンボンとシスプラチンによるそれぞれの細胞毒性作用が例示されている。図３には、５μＭ〜３５μＭの濃度のゼルンボンでヒト癌細胞ＨｅＬａ を７２時間処理した後の、ゼルンボンによる増殖阻害効果が示されている。図３を参照するに、ゼルンボンのＩＣ50値（±標準誤差）は、１１.３ μＭ（２.５ μｇ/ｍｌ）と決定された。
【００６１】
図４には、２.５μＭ 〜１００μＭの濃度のシスプラチンでヒト癌細胞ＨｅＬａ を７２時間処理した後の、シスプラチンによる増殖阻害効果が示されている。図４を参照するに、シスプラチンのＩＣ50値（±標準誤差）（Ｐ＜０.０１）は、７.５ μＭ ± ０.３（１.６ μｇ/ｍｌ）と決定された。
【００６２】
これらの結果は、ゼルンボンと比較した際に、シスプラチンは、より低濃度（７.５ μＭ）でＨｅＬａ癌細胞に対してより良好な細胞毒性作用を発揮しており、ゼルンボンは、同様の効果を発揮するためにより高濃度（１１.３ μＭ）を要していたことが示されている。しかしながら、独立サンプルのｔ検定により解析した結果、ＨｅＬａ癌細胞に対するゼルンボンとシスプラチンの両者のＩＣ50値には有意差（Ｐ＜０.０１）が認められる。シスプラチンはゼルンボンと比べてＩＣ50値が低かったが、ゼルンボンとシスプラチンの両ＩＣ50値は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｓｔａｎｄａｒｄ（アメリカ合衆国）（１９７２年）が確立した非常に有意性の高い細胞毒性の範囲（≦４ μｇ/ｍｌ）にある。
【００６３】
（ｖ）通常の倒立顕微鏡を用いた形態検査
９６ウェルプレート中のＨｅＬａ及びＣａｏｖ-３の処理した癌細胞について、２４、４８及び７２時間のインキュベーションの後に通常の倒立顕微鏡下で観察を行った。処理細胞のアポトーシスの特徴について検査し、同時に未処理細胞との比較観察を行った。細胞は、倒立顕微鏡下にて２０ｘ１０の倍率で観察した。
【００６４】
ゼルンボン及びシスプラチンでの処理過程において、添加から２４時間後、４８時間後及び７２時間後にＨｅＬａ癌細胞とＣａｏｖ-３癌細胞に顕著な形態変化が観察された。Ｃａｏｖ-３癌細胞の形態変化を図５に示すが、図中、細胞は、（Ａ）コントロール、（Ｂ）ゼルンボン及び（Ｃ）シスプラチンで処理されている。一方で、ＨｅＬａ癌細胞の形態変化は、図６に示されており、図中、細胞は、（Ａ）コントロール、（Ｂ）ゼルンボン及び（Ｃ）シスプラチンで処理されている。
【００６５】
早い細胞増殖が観察された未処理のコントロール細胞と比べて、ゼルンボン及びシスプラチンで処理した後のＣａｏｖ-３癌細胞（図５参照）及びＨｅＬａ癌細胞（図６参照）では、顕著な増殖低下が認められた。処理の２４時間後では、ゼルンボン処理後の場合には、円形の癌細胞（細胞の収縮）は殆ど観察されなかった一方で、シスプラチンで処理した癌細胞では、新生の細胞膜を有する円形の癌細胞がより多く認められた。ゼルンボンでも処理後４８時間の時点では円形癌細胞数の増加が観察された。しかしながら、同一の時刻においては、ＨｅＬａ癌細胞でもＣａｏｖ-３癌細胞でも、シスプラチン処理の場合の方が、ゼルンボンと比較してより多くの円形細胞が認められた。円形癌細胞の増加に伴う核収縮の進行は、ゼルンボン処理の７２時間後にＨｅＬａ癌細胞及びＣａｏｖ-３癌細胞でも認められたが、シスプラチン処理の７２時間後では、より多くの円形細胞の増加が認められた。
【００６６】
（ｖｉ）アクリジンオレンジ・ヨウ化プロピジウム（ＡＯ/ＰＩ）染色による共焦点顕微鏡検査
各癌細胞セルラインを６ウェル組織培養プレートに播種してゼルンボン又はシスプラチンのいずれかで処理した。プレートは、２４時間及び４８時間のインキュベーション時間の後にインキュベーターから取り出した。細胞を含有する培地を、氷上に静置してラベルしたエッペンドルフチューブ（各処理サンプルのラベル）に移した。ウェルに残った細胞は、全ての細胞が各ウェルの表面から剥離するまでトリプシン処理した。エッペンドルフチューブ中の細胞を含む培地は、次に、（同一のサンプルの）前記組織培養プレートのウェルに移してトリプシンを中和した。その後にウェル内の培地を（同一のサンプルの）エッペンドルフチューブに戻し、４℃で３０００ ｒｐｍにて５分間遠心した。上清を捨てて、７０％の冷却アルコールを１ ｍＬ添加した。ペレットを再懸濁して、細胞固定のため氷上に１５分間静置した。次に、サンプルを４℃で３０００ ｒｐｍにて５分間遠心した。アルコールを含む上清を捨てた。次に、ペレットを１ ｍＬのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁して氷上に１０分間静置した。サンプルを再度遠心して、１ ｍＬのＰＢＳに再懸濁して氷上に１０分間静置した。この工程を再度繰り返した後に上清を捨てた。
【００６７】
細胞を含むペレットを１５ μｌの１０ μｇ/ｍＬ ＡＯ/ＰＩ混合物で再懸濁した。約１０ μｌの細胞懸濁液をガラススライド上に置き、フェーディング防止剤を細胞上に添加した。このスライドをカバースリップでカバーして、マニキュア液を用いてカバースリップの末端部分を密封した。スライドは、レーザー走査性共焦点顕微鏡の油浸レンズ下で１００ｘ１０の倍率で観察した。漏出性の細胞膜を有する非生存（死滅）細胞の核は、ヨウ化プロピジウムで標識されていた。ヨウ化プロピジウムは、細胞膜が破壊された非完全細胞のみに進入する。
【００６８】
図７、８及び９には、ゼルンボン及びシスプラチン処理の４８時間後にＡＯ/ＰＩ染色してレーザー走査性共焦点顕微鏡で観察したＣａｏｖ-３癌細胞の形態変化が示されており、図１０にはＨｅＬａ癌細胞の形態変化が示されている。１００ｘ１０の倍率で、（Ａ）コントロール、（Ｂ）ゼルンボン及び（Ｃ）シスプラチンである。（Ｂ）ゼルンボン及び（Ｃ）シスプラチンでは、細胞膜の小疱形成、辺縁趨向を伴う核凝縮及び核損傷が示されている。
【００６９】
（ｖｉｉ）フローサイトメトリーによる細胞周期試験
１５、２５、３５及び４５ μＭの濃度のゼルンボン及び１５、２５及び３５ μＭの濃度のシスプラチンと２４時間インキュベーションした後に、ＨｅＬａ細胞のフローサイトメトリー解析を行った。細胞を、０.５ ｘ １０5細胞/ｍＬの細胞密度で２５ ｃｍ2組織培養フラスコに播種した。一晩インキュベーションした後、細胞を上記に示した濃度のゼルンボンンの存在下で２４時間培養した。細胞をトリプシン-ＥＤＴＡを用いて回収した後、３０００ ｒｐｍで５分間遠心した。細胞ペレットを２ ｍＬのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁した。再懸濁した細胞を３０００ ｒｐｍで５分間遠心し、得られた細胞ペレットを１ ｍＬの冷却ＰＢＳで再懸濁した。４ ｍＬの冷却無水エタノール（使用時まで-２０℃で維持）を添加して細胞を固定した。固定した細胞を-２０℃で一晩保存した後に染色工程を再開した。
【００７０】
ＨｅＬａ細胞の観察
図１１、１２及び１３を参照するに、細胞周期解析により、Ｇ２/Ｍ期にあるＨｅＬａ癌細胞とＣａｏｖ-３癌細胞の数が増加し、Ｇ１ 期とＳ期にある細胞が減少したことが示されている。データは、２つの別々の実験から得られた中央値±標準偏差で示されている。アスタリスク１つは、コントロールとの比較においてＰ＜０.０５を表す；アスタリスク２つは、コントロールとの比較においてＰ＜０.０１を表す；アスタリスク３つは、コントロールとの比較においてＰ＜０.００１を表す（ｏｎｅｗａｙ ＡＮＯＶＡにより解析）。
【００７１】
（ｖｉｉｉ）マウスにおける子宮頸癌の誘導
実験開始前に１匹の雄マウスを３匹の雌マウスと共生させて、雌マウスの排卵を刺激した。４８時間後、１匹の雄マウスを１匹の雌マウスと共生させた。翌朝、雌マウスの膣栓をチェックした。雌マウスの膣に膣栓を検出した時点を妊娠初日（Ｇ=０）として考慮した。雌マウスが妊娠したら、相手の雄マウスをケージから離した。各ケージには妊娠雌マウスを１匹だけ入れてマウス間のストレスを軽減させ、また、母親による子孫の共食いの機会を減らした。妊娠マウスには妊娠１３日目から１８日目にかけて、ゴマ油に溶解したジエチルスチルべストロール（ＤＥＳ）（ＤＥＳ調製の付属解説を参照）を体重１ｋｇ当たり６７ μｇで皮下注射した。生殖器官は上記の期間に発生することから、あまりにも早期のＤＥＳ注射では、死産を生じる可能性がある。これらのマウスは、約妊娠１９日目ないし２２日目に出産した。子孫は、生後２２日目に離乳させた。１匹の雌の子孫は、生後４１日目に子宮頸部の形成異常の確認を行った。他の子孫については、シスプラチン、ゼルンボン及び生理食塩水による処理を行った。
【００７２】
子宮内でＤＥＳに曝露された全ての雌の子孫をまとめて、各グループが３匹のマウスからなる４つのグループに分配した。５番目のグループは、ＤＥＳに暴露されていない３匹のマウスからなる。マウスには、生後４６日目から開始して５２日目まで処置を行った。処置は２日に１回（４６日目、４８日目、５０日目、５２日目）行い、投与を４回行った。処置は、腹腔内注射により行った。グループ１のマウスは、０.９％の生理食塩水で処置し、このグループをポジティブコントロールグループとして用いた。グループ２のマウスには、８ｍｇ/ｋｇのゼルンボンを与え、グループ３のマウスには、１６ｍｇ/ｋｇのゼルンボンを与えた。１０ｍｇ/ｋｇのシスプラチンをグループ４のマウスに与えた。最後に、グループ５のマウスについては、本試験でネガティブコントロール（正常マウス）として用いるので、何の処置も行わなかった。処置の後、生後５４日目に全てのマウスを屠殺した。血液サンプルは心穿刺法により通常の試験管に回収して３０００ｒｐｍで１５分間遠心した。上清（血清）をエッペンドルフチューブに回収し、直ちに氷中に保存した（０℃‐一時的保存）。全てのサンプルから血清を回収した後、血清を‐２０℃に保存した。次に、マウスを解剖した。マウスの生殖器官を回収して０.９％生理食塩水で洗浄した。洗浄した器官を１０％ホルマリンに浸して室温で保存した。
【００７３】
マウスを生後５４日目に屠殺して子宮頸部組織を回収した。子宮頸部組織は１０％ホルマリン中で４週間かけて固定した。子宮頸部組織は、組織加工装置（Ｌｅｉｃａ社 ＴＰ １０２０-１-１）を用いて加工した。次に、包埋用装置（Ｌｅｉｃａ社 ＥＧ１１６０ ＴＰ １０２０）を用いて加工した組織をパラフィンワックス中に包埋した。ミクロトーム（Ｌｅｉｃａ社 ＲＭ ２１４５）を用いて包埋した組織ブロックを切片化した。ヘマトキシリン・エオジン染色法により切片を染色した。
【００７４】
図１４を参照するに、正常組織の組織切片では、細胞質に対する核の比率が低く、血管形成の兆候のない正常な上皮配置が示されている。生理食塩水で処置した雌マウスとは対照的に、図１７に示すように、雌のｂａｌｂ/ｃマウスの誘導した子宮頸癌の子宮頸部組織では、重度の異形成変化（ＣＩＮ ＩＩＩ）が認められる。これに加え、子宮頸部組織は、方向秩序の欠如した上皮細胞の配列（層全体に限定）、細胞質に対する高い核の比率（過染色性（ｈｙｐｅｒｃｈｒｏｍａｔｉｓｍ））並びに著しい血管形成を伴う細胞質の膨張及び透明化を示していた。子宮頸癌誘導した雌ｂａｌｂ/ｃマウスの１６ ｍｇ/ｋｇのゼルンボン及び１０ ｍｇ/ｋｇのシスプラチンを用いた処置（それぞれ図１６及び図１５に示す）では、軽度の細胞質の透明化を伴う軽度の異形成変化（ＣＩＮ Ｉ）、方向秩序の欠如した上皮細胞の配列及び子宮頸部切片に向かう軽度の脈管形成が示されていた。
【００７５】
シスプラチン及びゼルンボンの両方について、軽度の異形成（ＣＩＮ Ｉ）が増殖により、重症度の高い異形成（ＣＩＮ ＩＩＩ）に進行することを阻害する能力を有することが実証された。化合物ゼルンボンは、参照薬物シスプラチンと同様に、子宮頸部組織の異形成進行を軽減させることができる。
【００７６】
（ｉｘ）マウスの子宮頸癌における抗癌剤としてのゼルンボンの評価
血清インターロイキン-６（ＩＬ-６）の測定及び定量
子宮頸癌誘導した雌マウス由来の血清血液ＩＬ-６濃度については、化合物ゼルンボン、シスプラチン及び生理食塩水（ポジティブコントロール）で処置した後に、市販の抗マウスＩＬ-６ ＥＬＩＳＡイムノアッセイキットを用いて測定と定量を行った。正常マウスの血清ＩＬ-６濃度をネガティブコントロールとして用いた。
【００７７】
図１８を参照するに、子宮頸癌誘導してゼルンボン及びシスプラチンで処置した雌マウスの血清ＩＬ-６濃度は、子宮頸癌誘導して生理食塩水で処置したマウスと比べて低かった（Ｐ＜０.０１、Ｏｎｅ-Ｗａｙ ＡＮＯＶＡで解析）。結果では、１６ ｍｇ/ｋｇのゼルンボンン及び１０ ｍｇ/ｋｇのシスプラチンで処置したマウスの血清ＩＬ-６レベルが、正常マウス（ネガティブコントロール）の血清レベルと最も近似していたことが示された。Ｐｏｓｔ Ｈｏｃ比較検定（Ｏｎｅ-Ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）により、生理食塩水で処置したマウスと他の４種類の処置グループの血清ＩＬ-６濃度の平均値が有意に異なっていることが示されている（Ｐ＜０.０１）。ゼルンボン及びシスプラチンで処置したマウスの血清ＩＬ-６濃度では、有意な低下が認められた（Ｐ＜０.０１）。結果は、ゼルンボンとシスプラチンが、殆ど同程度にＩＬ-６の分泌を低下又は阻害できたことを示している。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、天然の治療用化合物及びその医療上の使用に関する。より詳細には、本発明は、子宮頚癌及び卵巣癌の治療用の医薬製剤の製造に用いる活性薬剤、ゼルンボン（ｚｅｒｕｍｂｏｎｅ）として知られる天然化合物に関する。また、本発明は、前記化合物の抽出方法及び前記化合物を含有する医薬組成物にも関する。
【背景技術】
【０００２】
癌とは、主に細胞増殖の非制御から始まり、隣接する正常な組織又は器官に浸潤し、その場所で新たな増殖の基盤を確立し、最終的には死を招く恐れのある疾患の種類の総称である。近年において、細胞周期若しくはアポトーシスの制御並びに癌遺伝子及び腫瘍抑制遺伝子を含む新たな標的の開発において著しい進歩が得られた。しかしながら、これらの尽力にもかかわらず、癌の発症率は増加し続けている。
【０００３】
最も典型的な３種類の抗癌治療は、外科手術、放射線療法及び化学療法である。治療は、薬物又は他の因子を用いて体内の癌細胞を除去するか又は破壊することを目的とする。
【０００４】
外科手術は、癌の種類によっては非常に成功率の高い治療法となりうるが、全ての者がこの治療法を選択できるわけではない。癌が悪性の腫瘍の状態にあるか、腫瘍が一ヶ所に存在する（局在する）場合、腫瘍と周辺の患部組織を安全に「切り取る」ことは可能であろう。癌が身体の他の領域に広がってしまっている場合又は肝臓又は脳等の生命維持に不可欠な器官を損傷することなく腫瘍を取り出せない場合には、外科手術は不可能になるであろう。
【０００５】
癌治療は、特別な種類のＸ線、γ線又は電子の形態にある放射線を用いて、癌細胞が増殖できなくなるようにこれらを破壊する。通常は、治療において痛みを感じることはない。放射線治療は、場合によっては、この治療法のみで有用な場合もあれば、外科手術等の他の治療法と共に用いられる場合もある。外科手術と放射線療法両方の組合せは、一ヶ所で増殖する腫瘍の治療に用いられる場合がある。
【０００６】
化学療法では薬物を用いて癌細胞を攻撃する。単に「化学療法」という文字を見ただけでも、副作用の負担が大きな場合もあることから、大変な不安を引き起こす場合がある。しかしながら、全ての者が激しい副作用を被るわけではない。化学療法による副作用は、しばしば他の薬物を用いることで軽減できる。通常、化学療法は、癌が身体の他の領域に広がってしまっている場合に用いられる。化学療法は、外科手術及び放射線療法との組み合わせで用いられる場合もある。場合によっては、外科手術で腫瘍を取り除いて、その後に化学療法により全ての癌細胞を確実に死滅させることになる。化学療法の欠点の一つとしては、乳癌、大腸癌及び肺癌等の一般的な上皮由来腫瘍の治療において効果を奏しない場合があることが挙げられる。これは、主に、複数種類の抗癌剤に対する癌細胞の耐性によるものであり、抗ガン剤の適用が非常に限定されることになる。
【０００７】
最新の抗癌剤は、癌細胞が正常細胞よりも速く分裂するという事実に基づいて開発されており、ＤＮＡ複製又は合成を阻害する化合物、代謝阻害剤、細胞分裂阻害剤、ヌクレオチド類似体及びトポイソメラーゼ阻害剤に代表される。従って、抗ガン剤は、典型的に癌細胞の分裂と生存に対する効果を有する。従来の抗癌剤は、癌細胞の迅速な分裂に焦点を当てていたことから、これらの抗癌剤は、毒性を有していたり（例えば、体毛が抜け落ちる）や通常の条件下でも分裂速度の速い正常細胞（例えば、骨髄細胞）にも作用するといった不都合を有している。
【０００８】
別の種類の治療法としては、生物療法が挙げられる。この治療法では、身体の免疫系を誘起させるタンパク質を用いてより多くの白血球（又はリンパ球）を生産する。癌細胞を攻撃して死滅させることのできる２種類のリンパ球は、Ｔ細胞及びＢ細胞である。タンパク質によりＴ細胞及びＢ細胞のリンパ球が癌を死滅させる能力が増大される。生物療法は、外科手術、放射線療法又は化学療法との組み合わせで用いることも可能である。
【０００９】
ホルモン療法を用いて乳癌又は前立腺癌を治療する場合もある。エストロゲンというホルモンは、乳癌の腫瘍の増殖を加速させることができる。同様に、テストステロンというホルモンは、前立腺内の癌性腫瘍の増殖を加速させることができる。別のホルモンを含有する薬物を用いてエストロゲンとテストステロンの作用を遮断することができる。別のケースでは、卵巣又は精巣を取り除く外科手術を採用する場合もある。これらの器官と取り除くことにより、体内のエストロゲン又はテストステロン量が減少する。ホルモン療法は、しばしば、化学療法又は放射線療法に追加して用いられる。
【００１０】
植物抽出物は、種々の疾患の治療及び予防において治療の潜在的能力を有すると信じられている。Ｚｉｎｇｉｂｅｒ ｚｅｒｕｍｂｅｔの根茎は、抗炎症性の民間医薬として使用される、よく知られた生薬である（Ｅｌｌｉｏｔ ｅｔ ａｌ., １９８７）。Ｚ. ｚｅｒｕｍｂｅｔは、Ｚｉｎｇｉｂｅｒａｃｅａｅ（ショウガ科）に属しており、パインコーンジンジャー（ｐｉｎｅｃｏｎｅ ｇｉｎｇｅｒ）、シャンプージンジャー（ｓｈａｍｐｏｏ ｇｉｎｇｅｒ）、アワプヒクアヒウィ（Ａｗａｐｕｈｉ ｋｕａｈｉｗｉ）（ハワイ名）及び「レンポヤン（ｌｅｍｐｏｙａｎｇ）」（マレーシア名）という一般的名称を有する。一般的に、東南アジア地域においては、複数種のＺｉｎｇｉｂｅｒａｃｅａｅが、スパイス、薬物、香料及び特定の色素の原料として用いられている（Ｂｕｒｋｉｌｌ, １９６６）。
【００１１】
野生種のショウガであるＺｉｎｇｉｂｅｒ ｚｅｒｕｍｂｅｔの精油の主成分であるゼルンボンは、架橋結合したジエノン系を含有する単環式セスキテルペンである（Ｋｉｔａｙａｍａ ｅｔ ａｌ., ２００２）（図１）。一部地域で抗炎症薬として用いられる根茎中に大量のアキラル性セスキテルペンであるゼルンボンが検出された（Ｄ'Ｏｄｏｒｉｃｏ ｅｔ ａｌ., ２００１）。この化合物は、この植物の食用部分、特に、伝統料理で用いられる若い茎と花序中に存在する（Ｋａｎｋｕｒｉ ｅｔ ａｌ., １９９９）。
【００１２】
Ｍａｔｔｈｅｓ ｅｔ ａｌ.（１９８０）では、ゼルンボンが細胞毒性を示すことが報告され、一方で、Ｍｕｒａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ.（１９９９）には、ゼルンボンが、１２-Ｏ-テトラデコニル-１３-アセテート誘導性のエプスタイン‐バーウイルスの活性化に対する有力な阻害剤であることが記載されている。興味深いことに、リポ多糖（ＬＰＳ）及びインターフェロン（ＩＦＮ）-□で処理したＲＡＷ２６４.７マクロファージ内での誘導性の一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）とＣＯＸ-２の発現、並びに白血球内での一酸化窒素（ＮＯ）/Ｏ2生成をゼルンボンが阻害することが判明した（Ｔａｎａｋａ ｅｔ ａｌ., ２００１）。また、ゼルンボンは、ＴＮＦ-□の放出を抑制し、種々のヒト由来大腸腺癌セルラインのアポトーシスを誘導することも示されている（Ｍｕｒａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ., ２００２）。Ｍｕｒａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ.（２００３ａ）では、ゼルンボンが、マウスのＤＳＳ誘導性大腸炎に対して顕著な抑制効果を示すことが実証されている。また、最近では、ゼルンボンが腫瘍プロモーターの１２-Ｏ-テトラデカノイルフォルボール-１３-アセテート（ＴＰＡ）に誘導されるエプスタイン‐バーウイルスの活性化を強力に抑制することも判明している。
【００１３】
大腸のクリプト細胞核内のＡｇＮＯＲ数がゼルンボンにより低下している。これらの知見から、発癌物質誘導性ＡＦＣの発達におけるＣＯＸ-２発現、大腸粘膜の細胞増殖活性及びフェーズＩＩ解毒酵素の誘起の抑制を通じた、ＺＩＩの潜在的な化学的予防能力が示唆されるであろう（Ｔａｎａｋａ ｅｔ ａｌ., ２００１）。
【００１４】
大部分の西側諸国における広範囲な集団スクリーニングにより、子宮頸癌の発症率と死亡率は大幅に低下したが、しかしながら、子宮頸癌は、依然として世界規模で女性に対して甚大な影響を有している（Ｓｅｇｎａｎ, １９９４）。毎年、約４００,０００名の女性が子宮頸癌を発症し、このうち２５０,０００名がこの癌由来の原因で死亡していることが報告されている（Ｐａｒｋｉｎ ｅｔ ａｌ., １９９９）。
【００１５】
一方で、卵巣癌は、西側諸国において婦人科関連死因の第１位となっており、女性では４番目に高頻度な悪性腫瘍である（Ｇｒｅｅｎｌｅｅ ｅｔ ａｌ, ２０００）。先進諸国では約７５人に１人が卵巣癌を患い、具体的な症状がなく、多くの場合診断が遅れることから、患者の少なくとも３分の２に当たる女性が末期症状を示す（Ｑｕｉｎｎ, ２００３）。
【００１６】
シスプラチンは、一貫して、進行した子宮頸癌又は再発した子宮頸癌の治療に最も有効な単一の細胞毒性薬剤としての能力を証明し続けている。しかしながら、この薬物に応答性を示す患者の比率は、２３％〜５０％であり、子宮頸癌を患う患者の転帰を向上させる新たな活性薬物が必要である（Ｓａｖａｒｅｓｅ ａｎｄ Ｃｏｇｎｅｔｔｉ, ２００３）。これに加え、白金系化学療法は、上皮性卵巣癌の最も効果的な治療法である（Ｐｉｃｃａｒｔ ｅｔ ａｌ. ２０００）。
【００１７】
先行技術では、ヒトの子宮頸部及び卵巣内の癌を阻害する天然の植物性化合物について未だ報告がなされていない。更にまた、先行技術では、病理/生理学的状態の効果的な治療方法が見つかっておらず、種々の有害な薬物反応を伴う。
【００１８】
上記及び種々の疾患を患う患者数の増加を鑑みるに、全ての者が、より副作用が少なく、より良好な薬物を望んでいる。従って、癌細胞のアポトーシスを誘導して癌の転移を阻害する効果を有し、加えて、癌細胞の増殖をより効果的に阻害する天然化合物を提供することは有益なこととなるであろう。また、前記化合物は毒性を有していないため、癌を予防して治療するための機能性食品として用いることも可能である。
【００１９】
癌、特に、子宮頸癌及び卵巣癌の治療用の新たな薬物を提供することが本発明の目的である。本発明は、現在の技術水準の癌の治療方法の不都合を克服する、強力な抗癌特性を有する天然化合物を提供する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明の第１の局面によれば、以下の式を有する化合物の、癌の予防及び治療用の医薬製剤の製造における使用が提供される。
【００２１】
【化１】
【００２２】
従って、本発明に係る化合物は、アポトーシス機構によって子宮頸部及び卵巣の癌細胞の増殖を阻害する所望の効果を提供する。
【００２３】
本発明の別の局面によれば、Ｚｉｎｇｉｂｅｒ属の植物から非極性抽出物を調製すること、前記非極性抽出物を、シリカゲルカラムを通して、１種類の有機溶媒及び複数の有機溶媒の混合物で順に溶離する分画化に付することで、Ｚｉｎｇｉｂｅｒ属の植物由来の非極性抽出物の分画を得ること、そして再結晶法、分配法及びクロマトグラフィー法により前記化合物を精製することを含む、上記化合物の抽出及び精製方法が提供される。
【００２４】
前記植物は、Ｚｉｎｇｉｂｅｒ ｚｅｒｕｍｂｅｔ及びＺｉｎｇｉｂｅｒ ａｒｏｍａｔｉｃｕｍからなる群から選択される。
【００２５】
前記有機溶媒は、ヘキサン及び/又は酢酸エチルからなる群から選択可能である。
【００２６】
本発明の更なる別の局面では、有効成分として上記化合物を強力な抗ガン特性を示すのに有効であり、それによって、子宮頸癌及び卵巣癌を伴う状態の予防及び治療に有用な量で含む医薬製剤が提供される。
【００２７】
前記化合物は、アポトーシス機構による癌細胞に対する選択的な細胞毒性を誘導する、化学療法剤として作用することができる。本発明の医薬製剤は、許容可能な担体に含まれて提供され、粉末、顆粒、錠剤、カプセル、水性薬物又は注射液等、当業者に知られるいずれの方法でも投与可能である。
【００２８】
Ｚｉｎｇｉｂｅｒ属の植物由来の非極性有機抽出物から得られる上記の化合物の分画は、標準的な方法により、ソフトゲルカプセルを含むカプセル、錠剤、ガレヌス製剤、粉末、顆粒、水性薬物、注射液等の臨床使用用の種々の医薬製剤へと製剤することが可能であり、この場合、前記化合物は、その効能及び毒性に基づく治療有効量で有効成分として、単体又は他の化学物質との組み合わせで存在し、そして経口、舌下、静脈内、筋肉内等の様々な投与経路を通じて投与される。有効量とは、アポトーシス機構によって、癌細胞、特に、子宮頸癌及び卵巣癌に対する細胞毒性を増大及び／又は誘導するのに十分な量である。
【００２９】
細胞毒性を増大及び/又は誘導する有効量は、以下に依存するであろう：治療する状態の重症度；年齢、生理条件、大きさ及び体重等の患者個人のパラメーター；併用される治療及び薬物との相互作用；治療頻度；及び投与方法。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図１には、本発明に係るゼルンボン抽出物の高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析が例示されている。
【図２】図２には、本発明に係るゼルンボン抽出物の液体カラム質量分析（Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｏｌｕｍｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：ＬＣＭＳ）分析が例示されている。
【図３】図３には、ゼルンボンの子宮頸癌細胞（ＨｅＬａ）に対する細胞毒性効果が例示されている。
【図４】図４には、シスプラチンの子宮頸癌細胞（ＨｅＬａ）に対する細胞毒性効果が例示されている。
【図５】図５には、ゼルンボン及びシスプラチンをＩＣ50値で用いて処理した７２時間後の卵巣癌細胞（Ｃａｏｖ-３）の形態変化が例示されている（倍率２０ｘ１０）。（Ａ）コントロール、（Ｂ）ゼルンボン及び（Ｃ）シスプラチン。
【図６】図６には、ゼルンボン及びシスプラチンをＩＣ50値で用いて処理した７２時間後の子宮頸癌細胞（ＨｅＬａ）の形態変化が例示されている（倍率２０ｘ１０）。（Ａ）コントロール、（Ｂ）ゼルンボン及び（Ｃ）シスプラチン。
【図７】図７には、未処理（コントロール）のヒト卵巣癌細胞（Ｃａｏｖ-３）の（Ａ）２４時間後；（Ｂ）７２時間後の共焦点形態試験が例示されている。
【図８】図８には、１８.５ ｍＭのゼルンボンによるヒト卵巣癌細胞（Ｃａｏｖ-３）の（Ａ）２４時間後；（Ｂ）４８時間後の形態試験が例示されている。
【図９】図９には、１８.５ ｍＭのゼルンボンによるヒト卵巣癌細胞（Ｃａｏｖ-３）の（Ａ）４８時間後；（Ｂ）７２時間後の形態試験が例示されている。
【図１０】図１０には、ゼルンボン及びシスプラチンでの治療の４８時間後にＡＯ/ＰＩで染色し、レーザー走査性共焦点顕微鏡で観察した子宮頸癌細胞（ＨｅＬａ）の形態変化が示されている。倍率は、１００ｘ１０：（Ａ）コントロール、（Ｂ）ゼルンボン及び（Ｃ）シスプラチン。矢印Ｂ：細胞膜の小疱形成、Ｎ：辺縁趨向及び核損傷を伴う核凝縮。
【図１１】図１１には、０〜４５ μｍの濃度範囲のゼルンボンで処置した後の子宮頸癌細胞（ＨｅＬａ細胞）の細胞周期の進行が例示されている。
【図１２】図１２には、ＩＣ50値でそれぞれ２４時間及び４８時間処理した卵巣癌細胞（Ｃａｏｖ-３細胞）のゼルンボン及びシスプラチン誘導性アポトーシスが例示されている。アポトーシス細胞は、ＴＵＮＥＬアッセイ後に手作業で定量した。データは、２つの重複するサンプルから得た平均値±標準偏差で示されている。シングルダガーは、コントロールと比較した場合にｐ＜０.０５であることを示す；ダブルダガーは、コントロールと比較した場合にｐ＜０.０１であることを示す（Ｏｎｅ-Ｗａｙ ＡＮＯＶＡにより解析）。
【図１３】図１３には、ＩＣ50値でそれぞれ２４時間及び４８時間処理した子宮頸癌細胞（ＨｅＬａ細胞）のゼルンボン及びシスプラチン誘導性アポトーシスが例示されている。アポトーシスは、ＴＵＮＥＬアッセイ後に手作業で定量した。データは、２つの重複するサンプルから得た平均値±標準偏差で示されている。ダブルダガーは、コントロールと比較した場合にｐ＜０.０１であることを示す（Ｏｎｅ-Ｗａｙ ＡＮＯＶＡにより解析）。
【図１４】図１４には、正常マウスの、明確な脈管形成が認められず、細胞質に対する核の比率が低い子宮頸部上皮細胞を示す顕微鏡写真である。
【図１５】図１５は、メスのｂａｌｂ/ｃマウスの誘導性子宮頸癌に対する１０ｍｇ/ｋｇのシスプラチンを用いた治療を示す顕微鏡写真である。上皮層の３分の１に限定される軽度の核異型を伴う軽度の形成異常（ＣＩＮ Ｉ）（倍率１０ｘ２０）。
【図１６】図１６は、メスのｂａｌｂ/ｃマウスの誘導性子宮頸癌に対する１６ｍｇ/ｋｇのゼルンボンを用いた治療を示す顕微鏡写真である。上皮層の３分の１（黒色矢印）に限定される軽度の形成異常（ＣＩＮ Ｉ）及び軽度の核異型、並びに脈管形成（青色矢印）（倍率１０ｘ２０）。
【図１７】図１７は、メスのｂａｌｂ/ｃマウスの誘導性子宮頸癌に対する通常の生理食塩水を用いた治療を示す顕微鏡写真である。上皮の全層に限定される重度の核異型を伴う重度の形成異常（ＣＩＮ ＩＩＩ）及び重度の脈管形成（倍率１０ｘ２０）。
【図１８】図１８は、マウスの治療群の血清ＩＬ-６濃度を示すヒストグラムである。各値は、Ｐ＜０.０１の有意性を有する（ＳＰＳＳバージョン１２を用いたＯｎｅ-Ｗａｙ ＡＮＯＶＡにより解析）。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
Ｚｉｎｇｉｂｅｒ ｚｅｒｕｍｂｅｔの植物は、茎に沿って反対に並ぶ長くて細い葉を特徴とし、約７フィートの高さにまで成長する。この植物種は、東南アジアが原産であるが、世界中の熱帯地方及び亜熱帯地方で広く栽培されており、いくつかの地方では帰化している。東南アジア地方では、一般的に、複数種のＺｉｎｇｉｂｅｒｃｅａｅが、スパイス、薬物、香料及び特定の色素の供給源として用いられる。
【００３２】
未加工の植物性材料の加工に関しては、有効成分又はセスキテルペンであるゼルンボンは、植物の１部分に局在していると判断された。有効成分が抽出される植物部分は、根茎であり、この部分は肉厚の茎として特徴付けられ、地面に沿って又は地中に伸び、根茎からは根と芽が伸びる。本発明の実施においては、前記植物の根茎部分が取り出され、その後に、個別に又はまとめて利用される。
【００３３】
本発明の種々の特徴及び局面は、以下の実施例に更に例示されている。これらの実施例は、本発明の範囲内で実施する方法を当業者に示すために提示されるものではあるが、本発明の範囲を限定するものではなく、本発明の範囲は、請求項のみによって定義される。
【実施例１】
【００３４】
（粗抽出物の調製）
５ ｋｇのＺｉｎｇｉｂｅｒ ｚｅｒｕｍｂｅｔを小片（１〜２ｍｍ）にカットし、３７℃のオーブンで３週間乾燥させた。乾燥したＺｉｎｇｉｂｅｒ ｚｅｒｕｍｂｅｔの小片を粉砕し、粉砕されたＺｉｎｇｉｂｅｒ ｚｅｒｕｍｂｅｔサンプル４３２ ｇを１００％メタノールに３日間浸漬した。次いで、ろ紙を用いてサンプルをろ過した。ゼルンボン等の複数種類の化合物を含むメタノールをコニカルフラスコに回収し、残ったサンプルについては、再度１００％メタノールで２回目の浸漬を行い、このメタノール及び抽出物は、ロータリー式蒸発装置を用いて４０℃で蒸発させた。この工程を２回繰り返し、最後にろ過した後のサンプルと抽出物を先のサンプル（メタノール＋抽出物）と混合して蒸発させると、濃褐色のゴム状に見える粗抽出物が４０.３ ｇ得られた。
【実施例２】
【００３５】
（非極性抽出物の調製）
粗抽出物をメタノール及び蒸留水と混合し、その後、分液漏斗に注いだ。１００％ヘキサンを分液漏斗に加え、漏斗を激しく振って確実に溶液を十分に混和させ、溶液を２層（上層が極性化合物を含有する水層であり、下層が非極性化合物、即ち、ゼルンボンを含有する非極性層）に分離させるために５分間放置した。次に、水層と非水層を別々のコニカルフラスコに回収して分離に付した。再度水層を分液漏斗に注いで１００％ヘキサンを添加し、この分離工程を再度３回繰り返した。次に、分離工程で得た非極性層の全てを一つにまとめて丸底フラスコに注ぎ、ロータリー式蒸発装置を用いた蒸発を行うと、ゼルンボンを含む非極性抽出物が２０.６グラム得られた。
【実施例３】
【００３６】
（非極性抽出物分画の調製）
分画工程は、カラムクロマトグラフィープロセスにより行った。２種類の主な充填剤が含まれ、これらは乾燥充填剤とカラム充填剤であった。乾燥充填剤では、ロータリー式蒸発で得た抽出物（２０.６ ｇ）をシリカゲルと共に加え、乾燥粉末（２０.Ｏｇ）が形成されるまで再度ロータリー式蒸発をおこなった。カラム充填物では、シリカゲルをヘキサンと混合し、クロマトグラフィー用カラムに注いだ。
【００３７】
次に、２０.０グラムの量の粉末化サンプルを吸着剤としての機能を有するシリカゲルカラム（３.５ｃｍ ｘ ３０.０ｃｍ）に注いだ。１００％ヘキサンをシリカゲルカラムに添加し、次に、溶離液として、ヘキサンと酢酸エチルの混合物を９：１及び最終的に８：２の比率で添加した。８：２の比率を維持し、ゼルンボンを含む非極性分画がカラムから単離されるまで繰り返した。カラムクロマトグラフィーで単離された分画を少量用（１０ｍｌ）のバイアルに回収した。
【実施例４】
【００３８】
（精製ゼルンボンの単離）
バイアルに回収した分画を乾燥させて結晶を得た。得られた結晶を再結晶させて精製ゼルンボン結晶を得た。次に、結晶をヘキサンで洗浄して不所望の化合物を除去してバイアル中に純粋なゼルンボン結晶を残した。再結晶は約３回繰り返した。再結晶の後、純粋ゼルンボン結晶を乾燥させ、清潔なバイアル中に回収した。５ｋｇの新しいＺｉｎｇｉｂｅｒ ｚｅｒｕｍｂｅｔから単離された純粋なゼルンボン結晶の量は、約３.１ｇであった。
【００３９】
上記分画に回収された成分は、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を用いて測定した。分画のＴＬＣを純粋なゼルンボンのＴＬＣと比較して、いずれの分画にゼルンボンが回収されたのかを決定した。得られたゼルンボンの収率を以下の表に示す。
【００４０】
オートサンプラー及び四連溶媒ポンプ（ｑｕａｔｅｒｎａｒｙ ｓｏｌｖｅｎｔ ｐｕｍｐ）を用いて高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を行った。分析用逆相カラム（Ｃ-１８カラム）を用いて分離を行った。４０％の水と６０％のアセトニトリルからなる混合物を移動相として用いて０.２ｍｌ/分の流速で化合物を分離した。
【００４１】
図１を参照するに、サンプル溶液のＨＰＬＣ分析では、１６分の保持時間を有する単一高ピークが１つだけ示された。この単一ピークにより、純粋な化合物が単離されたことが確認され、これによって、更に、粗植物抽出物から抽出及び単離された化合物が、主に１種類の単一の化合物から構成されていたことが例証される。ＨＰＬＣ分析で単一ピークが得られたが、単離された化合物の分子量を同定するために、液体クロマトグラフィー質量分析器（ＬＣＭＳ）を用いた更なる分析が必要であった。
【００４２】
オートサンプラー及び四連溶媒ポンプを用いて液体クロマトグラフィーＬＣＭＳを行った。分析逆相カラム（Ｃ-１８カラム）を用いて分離を行った。４０％（ｖ/ｖ）の１ＯｍＭ酢酸アンモニウムと６０％（ｖ/ｖ）のアセトニトリルからなる混合物を移動相として用いて０.２ｍｌ/分の流速で化合物を分離した。データ獲得/プロセッシングソフトウェアシステムを有するコンピューターに連結され、陽イオンモードでインターフェースした大気圧化学イオン化（ＡＣＰＩ）からなるイオントラップ型質量分析器に液体クロマトグラフィーシステムを連結した。
【００４３】
図２に示すＬＣＭＳ分析グラフでは、ゼルンボンのマススペクトルは、陽イオン化モードで試験した。全マススペクトルにおいて最も強度の強いイオンは、プロトン化（[Ｍ + Ｈ]+）分子である。図２を参照するに、ＬＣＭＳ分析では、ポジティブスキャンモード下で化合物がｍ/ｚ ２１９ の分子イオン[Ｍ + １]+を有する高フラグメントを生じたことが示された。このフラグメントの分子量は、陽イオンから導き出せる（陽イオン：２１９.０１ - １ = ２１８.０１）。この計算によれば、上記フラグメントの分子量は、２１８となり、これは化合物ゼルンボンの分子量である。このフラグメントが質量分析グラフ中に最も豊富に存在する。また、この化合物は、ｍ/ｚ ２５９でのポジティブプロダクトイオンスキャンモード（ＭＳ/ＭＳ）でフラグメントイオンを生じており、これは、前駆体イオンからの分子の喪失によるプロダクトイオンとして定めることができる。以下で行う分析では、スペクトル中に２５％を超える相対量で存在するプロダクトイオンだけを考慮する。ｍ/ｚ ２５９でのフラグメントは、相対量が２５％未満なので、考慮されない。この知見により、単離された化合物が実際に純粋なゼルンボン結晶であることが適切に確認される。
【００４４】
【表１】
【実施例５】
【００４５】
（ゼルンボン化合物の同定）
ゼルンボン化合物に対して1Ｈ-ＮＭＲ及び13Ｃ-ＮＭＲによる分光学的分析を行った。出願人の知る限り、ゼルンボンのスペクトルデータを報告する文献は未だに存在していない。
【００４６】
表２の1Ｈ-ＮＭＲスペクトルデータには、δ ５.９６８及び６.１０６でのメタ結合シグナルを示したダブルダブレット及びダブレットの２種類の遍在ピークが示されており、このうち一方は、トリプレットとして検出されたδ ２.４３のシグナルを有する０.９７ Ｈｚの長距離結合を示していた。δ ３.２２のメトキシ基、δ １.０８６-１.５７３の長鎖アルキル側鎖（ｍ, １６Ｈ, Ｈ-３'-Ｈ１０'）及びδ １.７７０（ｓ, １Ｈ, Ｈ-２')に起因するシグナルが認められた。
【００４７】
【表２】
【００４８】
ＩＲ: ｖｍａｘ ｃｍ-１ : １６５４.８ (共有結合Ｃ=Ｏ), １３８６.７及び１３４１.７ (ｇｅｍ-ジメチル). １Ｈ ＮＭＲ (ＣＤＣｌ３): １.０４ (３Ｈ, ｓ, Ｈ-１４), １.１７ (３Ｈ, ｓ, Ｈ-１５), １.５１ (３Ｈ, ｓ, Ｈ-１２), １.７７ (３Ｈ, ｓ, Ｈ-１３), １.８７ (１Ｈ, ｄ, Ｊ=１２.８ Ｈｚ, Ｈ-１１), ２.１９-２.４４ (５Ｈ, ｍ, Ｈ-１, Ｈ-４及びＨ-５), ５.２２ (１Ｈ, ｂｄ, Ｊ=１４.８ Ｈｚ), ５.８３ (１Ｈ, ｄ, Ｊ=１６.４ Ｈｚ), ５.９５ (１Ｈ, ｄ, Ｊ=１６.４ Ｈｚ), ５.９９ (１Ｈ, ｂｄ, Ｊ=１２.４ Ｈｚ, Ｈ-６)。
【００４９】
ゼルンボンの炭素配置を表３に示す。13Ｃ-ＮＭＲスペクトルでは、δ ３９.２１０ (ｓ, Ｃ-４), ４２.１４２ (ｓ, Ｃ-１), １２４.９０５ (ｓ, Ｃ-２), １４９.２７１ (ｓ, Ｃ-６), ２４.２６１ (ｓ, Ｃ-５) 及び１３６.４５７（ｓ, Ｃ-３）にメトキシル化１,４-ベンゾキノンを示すシグナルが示されている。
【００５０】
【表３】
【００５１】
１３Ｃ ＮＭＲ (ＣＤＣＩ３): １１.７６ (Ｃ１３), １５.１８ (Ｃ-１２), ２４.１６ (Ｃ-１４), ２４.３６ (Ｃ-５), ２９.３９ (Ｃ- １５), ３７.８３ (Ｃ-１１), ３９.４０ (Ｃ-４), ４２.３６ (Ｃ-１), １２４.９４ (Ｃ-２), １２７.１１ (Ｃ-９), １３６.２５ (Ｃ-３), １３７.９ (Ｃ-７), １４８.８４ (Ｃ-６), １６０.７５ (Ｃ-１０), ２０４.３７ (Ｃ-８)。
【００５２】
ゼルンボン化合物の化学構造
【００５３】
【化２】
【実施例６】
【００５４】
（子宮頸癌細胞（ＨｅＬａ）及び卵巣癌細胞（Ｃａｏｖ-３）に対するゼルンボンの作用の評価）
（ｉ）細胞培養
本試験で用いた癌セルラインは、ヒト由来の子宮頸癌セルラインのＨｅＬａ（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ-２）及び卵巣癌のＣａｏｖ-３（ＡＴＣＣ番号：ＨＴＢ-７５）であった。ＨｅＬａ及びＣａｏｖ-３セルラインは、１０％ ＦＣＳ、１％ペニシリン及び１％ストレプトマイシンが補充されたＲＰＭＩ １６４０並びにＤＭＥＭ（高濃度グルコース）でそれぞれ維持した。細胞は、３７℃で５％のＣＯ2を含む湿潤大気下において、２５ ｃｍ2及び７５ ｃｍ2組織培養フラスコ中で単層培養系として増殖させた。
【００５５】
（ｉｉ）細胞播種
血球計を用いてフラスコ内細胞密度を測定した。フラスコの表面から細胞を剥離するためコンフルエント状態の細胞をトリプシン処理した。１０ ｍＬの新しい培地をフラスコに加え、細胞を完全に懸濁した。次に、フラスコから１０μｌの培地をカバースリップを取り付けた血球計に移した。カウントは倒立顕微鏡下で行い、手作業でカウンターを用いて進めた。細胞密度（例えば、１ ｘ １０5 細胞/ｍＬ）を計算した。マルチチャンネルピペットを用いて１００μｌの細胞培養溶液を９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに移した。代わりに、６ウェルマイクロタイタープレートには、２ｍｌの細胞培養溶液をピペットで移した。プレートを５％ ＣＯ2下で３７℃で一晩インキュベートした。
【００５６】
（ｉｉｉ）細胞の処理
両方の種類のヒト由来癌細胞を一晩インキュベートした後、細胞をゼルンボンで処理した。各実験におけるゼルンボンの濃度は、実施した実験の最適化に応じて変化させた。コントロール又は非処理細胞には、いずれの化合物での処理を施すこともなく、培地だけを与えた。処理細胞は、次いで５％ ＣＯ2下で３７℃でインキュベートした。
【００５７】
（ｉｖ）マイクロテトラゾリウム細胞毒性アッセイ（ＭＴＴアッセイ）
本アッセイは、生存する癌細胞のミトコンドリアの酵素活性により、可溶性のＭＴＴが不溶性の色素を帯びたホルマザン生成物へと代謝還元されることに基づいており、この生成物は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解した後に分光学的分析によって測定できる（Ｃａｒｍｉｃｈａｌｅ ｅｔ ａｌ., １９８７）。ＭＴＴアッセイは、Ｋｕｍｉ-Ｄｉａｋａ ｅｔ ａｌ. (１９９８)に記載される方法に僅かな変更を加えて行った。使用したＭＭＴ溶液の濃度は、５ ｍｇ/ｍＬであった。ＭＴＴ溶液は、２５０ ｍｇのＭＴＴ粉末を５０ ｍＬのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に溶解させて調製した。０.２ミクロンのシリンジフィルターを用いて溶解したＭＴＴをろ過した。ろ過したＭＴＴ溶液を滅菌した５０ ｍＬの遠心用チューブに移してアルミホイルで包んだ。この溶液を４℃で保存したが、この時点で使用可能となる。ＭＴＴアッセイは以下の手順で行った。
【００５８】
細胞培養溶液が入った９６ウェルマイクロタイタープレートを７２時間のインキュベーションの後にインキュベーターから取り出した。コントロール用のウェルを含む各ウェルに２０ μｌの５ ｍｇ/ｍＬ ＭＴＴを添加した。次に、プレートをアルミホイルで包み、更に５％のＣＯ2下で３７℃にて４時間インキュベートした。インキュベーション終了後、余分なＭＴＴ試薬をアスピレートし、１００ μｌのＤＭＳＯを添加して残存する紫色のホルマザン結晶を溶解させた。プレートを、プレートシェーカー上で約４分間穏やかに混和させた。マイクロプレートリーダーを用いて４５０ ｎｍでのホルマザン溶液の吸光度を測定した。
【００５９】
マイクロ-テトラゾリウム（ＭＴＴ）細胞毒性アッセイを、ゼルンボン及びシスプラチンの化合物で処理したヒト子宮頸癌細胞のＨｅＬａに対して行った。Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｓｔａｎｄａｒｄ（アメリカ合衆国）(Ｇｅｒａｎ ｅｔ ａｌ., １９７２)に基づき、≦４ μｇ/ｍｌ（≦１８μＭ)のＩＣ50を非常に有意性が高いものとして考慮し、４〜３０ μｇ/ｍｌ（１８-１３７.６μＭ)のＩＣ50を有意性を有するものとして考慮する。
【００６０】
図３及び４には、ＨｅＬａ癌細胞に対するゼルンボンとシスプラチンによるそれぞれの細胞毒性作用が例示されている。図３には、５μＭ〜３５μＭの濃度のゼルンボンでヒト癌細胞ＨｅＬａ を７２時間処理した後の、ゼルンボンによる増殖阻害効果が示されている。図３を参照するに、ゼルンボンのＩＣ50値（±標準誤差）は、１１.３ μＭ（２.５ μｇ/ｍｌ）と決定された。
【００６１】
図４には、２.５μＭ 〜１００μＭの濃度のシスプラチンでヒト癌細胞ＨｅＬａ を７２時間処理した後の、シスプラチンによる増殖阻害効果が示されている。図４を参照するに、シスプラチンのＩＣ50値（±標準誤差）（Ｐ＜０.０１）は、７.５ μＭ ± ０.３（１.６ μｇ/ｍｌ）と決定された。
【００６２】
これらの結果は、ゼルンボンと比較した際に、シスプラチンは、より低濃度（７.５ μＭ）でＨｅＬａ癌細胞に対してより良好な細胞毒性作用を発揮しており、ゼルンボンは、同様の効果を発揮するためにより高濃度（１１.３ μＭ）を要していたことが示されている。しかしながら、独立サンプルのｔ検定により解析した結果、ＨｅＬａ癌細胞に対するゼルンボンとシスプラチンの両者のＩＣ50値には有意差（Ｐ＜０.０１）が認められる。シスプラチンはゼルンボンと比べてＩＣ50値が低かったが、ゼルンボンとシスプラチンの両ＩＣ50値は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｓｔａｎｄａｒｄ（アメリカ合衆国）（１９７２年）が確立した非常に有意性の高い細胞毒性の範囲（≦４ μｇ/ｍｌ）にある。
【００６３】
（ｖ）通常の倒立顕微鏡を用いた形態検査
９６ウェルプレート中のＨｅＬａ及びＣａｏｖ-３の処理した癌細胞について、２４、４８及び７２時間のインキュベーションの後に通常の倒立顕微鏡下で観察を行った。処理細胞のアポトーシスの特徴について検査し、同時に未処理細胞との比較観察を行った。細胞は、倒立顕微鏡下にて２０ｘ１０の倍率で観察した。
【００６４】
ゼルンボン及びシスプラチンでの処理過程において、添加から２４時間後、４８時間後及び７２時間後にＨｅＬａ癌細胞とＣａｏｖ-３癌細胞に顕著な形態変化が観察された。Ｃａｏｖ-３癌細胞の形態変化を図５に示すが、図中、細胞は、（Ａ）コントロール、（Ｂ）ゼルンボン及び（Ｃ）シスプラチンで処理されている。一方で、ＨｅＬａ癌細胞の形態変化は、図６に示されており、図中、細胞は、（Ａ）コントロール、（Ｂ）ゼルンボン及び（Ｃ）シスプラチンで処理されている。
【００６５】
早い細胞増殖が観察された未処理のコントロール細胞と比べて、ゼルンボン及びシスプラチンで処理した後のＣａｏｖ-３癌細胞（図５参照）及びＨｅＬａ癌細胞（図６参照）では、顕著な増殖低下が認められた。処理の２４時間後では、ゼルンボン処理後の場合には、円形の癌細胞（細胞の収縮）は殆ど観察されなかった一方で、シスプラチンで処理した癌細胞では、新生の細胞膜を有する円形の癌細胞がより多く認められた。ゼルンボンでも処理後４８時間の時点では円形癌細胞数の増加が観察された。しかしながら、同一の時刻においては、ＨｅＬａ癌細胞でもＣａｏｖ-３癌細胞でも、シスプラチン処理の場合の方が、ゼルンボンと比較してより多くの円形細胞が認められた。円形癌細胞の増加に伴う核収縮の進行は、ゼルンボン処理の７２時間後にＨｅＬａ癌細胞及びＣａｏｖ-３癌細胞でも認められたが、シスプラチン処理の７２時間後では、より多くの円形細胞の増加が認められた。
【００６６】
（ｖｉ）アクリジンオレンジ・ヨウ化プロピジウム（ＡＯ/ＰＩ）染色による共焦点顕微鏡検査
各癌細胞セルラインを６ウェル組織培養プレートに播種してゼルンボン又はシスプラチンのいずれかで処理した。プレートは、２４時間及び４８時間のインキュベーション時間の後にインキュベーターから取り出した。細胞を含有する培地を、氷上に静置してラベルしたエッペンドルフチューブ（各処理サンプルのラベル）に移した。ウェルに残った細胞は、全ての細胞が各ウェルの表面から剥離するまでトリプシン処理した。エッペンドルフチューブ中の細胞を含む培地は、次に、（同一のサンプルの）前記組織培養プレートのウェルに移してトリプシンを中和した。その後にウェル内の培地を（同一のサンプルの）エッペンドルフチューブに戻し、４℃で３０００ ｒｐｍにて５分間遠心した。上清を捨てて、７０％の冷却アルコールを１ ｍＬ添加した。ペレットを再懸濁して、細胞固定のため氷上に１５分間静置した。次に、サンプルを４℃で３０００ ｒｐｍにて５分間遠心した。アルコールを含む上清を捨てた。次に、ペレットを１ ｍＬのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁して氷上に１０分間静置した。サンプルを再度遠心して、１ ｍＬのＰＢＳに再懸濁して氷上に１０分間静置した。この工程を再度繰り返した後に上清を捨てた。
【００６７】
細胞を含むペレットを１５ μｌの１０ μｇ/ｍＬ ＡＯ/ＰＩ混合物で再懸濁した。約１０ μｌの細胞懸濁液をガラススライド上に置き、フェーディング防止剤を細胞上に添加した。このスライドをカバースリップでカバーして、マニキュア液を用いてカバースリップの末端部分を密封した。スライドは、レーザー走査性共焦点顕微鏡の油浸レンズ下で１００ｘ１０の倍率で観察した。漏出性の細胞膜を有する非生存（死滅）細胞の核は、ヨウ化プロピジウムで標識されていた。ヨウ化プロピジウムは、細胞膜が破壊された非完全細胞のみに進入する。
【００６８】
図７、８及び９には、ゼルンボン及びシスプラチン処理の４８時間後にＡＯ/ＰＩ染色してレーザー走査性共焦点顕微鏡で観察したＣａｏｖ-３癌細胞の形態変化が示されており、図１０にはＨｅＬａ癌細胞の形態変化が示されている。１００ｘ１０の倍率で、（Ａ）コントロール、（Ｂ）ゼルンボン及び（Ｃ）シスプラチンである。（Ｂ）ゼルンボン及び（Ｃ）シスプラチンでは、細胞膜の小疱形成、辺縁趨向を伴う核凝縮及び核損傷が示されている。
【００６９】
（ｖｉｉ）フローサイトメトリーによる細胞周期試験
１５、２５、３５及び４５ μＭの濃度のゼルンボン及び１５、２５及び３５ μＭの濃度のシスプラチンと２４時間インキュベーションした後に、ＨｅＬａ細胞のフローサイトメトリー解析を行った。細胞を、０.５ ｘ １０5細胞/ｍＬの細胞密度で２５ ｃｍ2組織培養フラスコに播種した。一晩インキュベーションした後、細胞を上記に示した濃度のゼルンボンンの存在下で２４時間培養した。細胞をトリプシン-ＥＤＴＡを用いて回収した後、３０００ ｒｐｍで５分間遠心した。細胞ペレットを２ ｍＬのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁した。再懸濁した細胞を３０００ ｒｐｍで５分間遠心し、得られた細胞ペレットを１ ｍＬの冷却ＰＢＳで再懸濁した。４ ｍＬの冷却無水エタノール（使用時まで-２０℃で維持）を添加して細胞を固定した。固定した細胞を-２０℃で一晩保存した後に染色工程を再開した。
【００７０】
ＨｅＬａ細胞の観察
図１１、１２及び１３を参照するに、細胞周期解析により、Ｇ２/Ｍ期にあるＨｅＬａ癌細胞とＣａｏｖ-３癌細胞の数が増加し、Ｇ１ 期とＳ期にある細胞が減少したことが示されている。データは、２つの別々の実験から得られた中央値±標準偏差で示されている。アスタリスク１つは、コントロールとの比較においてＰ＜０.０５を表す；アスタリスク２つは、コントロールとの比較においてＰ＜０.０１を表す；アスタリスク３つは、コントロールとの比較においてＰ＜０.００１を表す（ｏｎｅｗａｙ ＡＮＯＶＡにより解析）。
【００７１】
（ｖｉｉｉ）マウスにおける子宮頸癌の誘導
実験開始前に１匹の雄マウスを３匹の雌マウスと共生させて、雌マウスの排卵を刺激した。４８時間後、１匹の雄マウスを１匹の雌マウスと共生させた。翌朝、雌マウスの膣栓をチェックした。雌マウスの膣に膣栓を検出した時点を妊娠初日（Ｇ=０）として考慮した。雌マウスが妊娠したら、相手の雄マウスをケージから離した。各ケージには妊娠雌マウスを１匹だけ入れてマウス間のストレスを軽減させ、また、母親による子孫の共食いの機会を減らした。妊娠マウスには妊娠１３日目から１８日目にかけて、ゴマ油に溶解したジエチルスチルべストロール（ＤＥＳ）（ＤＥＳ調製の付属解説を参照）を体重１ｋｇ当たり６７ μｇで皮下注射した。生殖器官は上記の期間に発生することから、あまりにも早期のＤＥＳ注射では、死産を生じる可能性がある。これらのマウスは、約妊娠１９日目ないし２２日目に出産した。子孫は、生後２２日目に離乳させた。１匹の雌の子孫は、生後４１日目に子宮頸部の形成異常の確認を行った。他の子孫については、シスプラチン、ゼルンボン及び生理食塩水による処理を行った。
【００７２】
子宮内でＤＥＳに曝露された全ての雌の子孫をまとめて、各グループが３匹のマウスからなる４つのグループに分配した。５番目のグループは、ＤＥＳに暴露されていない３匹のマウスからなる。マウスには、生後４６日目から開始して５２日目まで処置を行った。処置は２日に１回（４６日目、４８日目、５０日目、５２日目）行い、投与を４回行った。処置は、腹腔内注射により行った。グループ１のマウスは、０.９％の生理食塩水で処置し、このグループをポジティブコントロールグループとして用いた。グループ２のマウスには、８ｍｇ/ｋｇのゼルンボンを与え、グループ３のマウスには、１６ｍｇ/ｋｇのゼルンボンを与えた。１０ｍｇ/ｋｇのシスプラチンをグループ４のマウスに与えた。最後に、グループ５のマウスについては、本試験でネガティブコントロール（正常マウス）として用いるので、何の処置も行わなかった。処置の後、生後５４日目に全てのマウスを屠殺した。血液サンプルは心穿刺法により通常の試験管に回収して３０００ｒｐｍで１５分間遠心した。上清（血清）をエッペンドルフチューブに回収し、直ちに氷中に保存した（０℃‐一時的保存）。全てのサンプルから血清を回収した後、血清を‐２０℃に保存した。次に、マウスを解剖した。マウスの生殖器官を回収して０.９％生理食塩水で洗浄した。洗浄した器官を１０％ホルマリンに浸して室温で保存した。
【００７３】
マウスを生後５４日目に屠殺して子宮頸部組織を回収した。子宮頸部組織は１０％ホルマリン中で４週間かけて固定した。子宮頸部組織は、組織加工装置（Ｌｅｉｃａ社 ＴＰ １０２０-１-１）を用いて加工した。次に、包埋用装置（Ｌｅｉｃａ社 ＥＧ１１６０ ＴＰ １０２０）を用いて加工した組織をパラフィンワックス中に包埋した。ミクロトーム（Ｌｅｉｃａ社 ＲＭ ２１４５）を用いて包埋した組織ブロックを切片化した。ヘマトキシリン・エオジン染色法により切片を染色した。
【００７４】
図１４を参照するに、正常組織の組織切片では、細胞質に対する核の比率が低く、血管形成の兆候のない正常な上皮配置が示されている。生理食塩水で処置した雌マウスとは対照的に、図１７に示すように、雌のｂａｌｂ/ｃマウスの誘導した子宮頸癌の子宮頸部組織では、重度の異形成変化（ＣＩＮ ＩＩＩ）が認められる。これに加え、子宮頸部組織は、方向秩序の欠如した上皮細胞の配列（層全体に限定）、細胞質に対する高い核の比率（過染色性（ｈｙｐｅｒｃｈｒｏｍａｔｉｓｍ））並びに著しい血管形成を伴う細胞質の膨張及び透明化を示していた。子宮頸癌誘導した雌ｂａｌｂ/ｃマウスの１６ ｍｇ/ｋｇのゼルンボン及び１０ ｍｇ/ｋｇのシスプラチンを用いた処置（それぞれ図１６及び図１５に示す）では、軽度の細胞質の透明化を伴う軽度の異形成変化（ＣＩＮ Ｉ）、方向秩序の欠如した上皮細胞の配列及び子宮頸部切片に向かう軽度の脈管形成が示されていた。
【００７５】
シスプラチン及びゼルンボンの両方について、軽度の異形成（ＣＩＮ Ｉ）が増殖により、重症度の高い異形成（ＣＩＮ ＩＩＩ）に進行することを阻害する能力を有することが実証された。化合物ゼルンボンは、参照薬物シスプラチンと同様に、子宮頸部組織の異形成進行を軽減させることができる。
【００７６】
（ｉｘ）マウスの子宮頸癌における抗癌剤としてのゼルンボンの評価
血清インターロイキン-６（ＩＬ-６）の測定及び定量
子宮頸癌誘導した雌マウス由来の血清血液ＩＬ-６濃度については、化合物ゼルンボン、シスプラチン及び生理食塩水（ポジティブコントロール）で処置した後に、市販の抗マウスＩＬ-６ ＥＬＩＳＡイムノアッセイキットを用いて測定と定量を行った。正常マウスの血清ＩＬ-６濃度をネガティブコントロールとして用いた。
【００７７】
図１８を参照するに、子宮頸癌誘導してゼルンボン及びシスプラチンで処置した雌マウスの血清ＩＬ-６濃度は、子宮頸癌誘導して生理食塩水で処置したマウスと比べて低かった（Ｐ＜０.０１、Ｏｎｅ-Ｗａｙ ＡＮＯＶＡで解析）。結果では、１６ ｍｇ/ｋｇのゼルンボンン及び１０ ｍｇ/ｋｇのシスプラチンで処置したマウスの血清ＩＬ-６レベルが、正常マウス（ネガティブコントロール）の血清レベルと最も近似していたことが示された。Ｐｏｓｔ Ｈｏｃ比較検定（Ｏｎｅ-Ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）により、生理食塩水で処置したマウスと他の４種類の処置グループの血清ＩＬ-６濃度の平均値が有意に異なっていることが示されている（Ｐ＜０.０１）。ゼルンボン及びシスプラチンで処置したマウスの血清ＩＬ-６濃度では、有意な低下が認められた（Ｐ＜０.０１）。結果は、ゼルンボンとシスプラチンが、殆ど同程度にＩＬ-６の分泌を低下又は阻害できたことを示している。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｚｉｎｇｉｂｅｒ属の植物から得られ、以下の式を有することを特徴とする化合物（Ｉ）の、癌の予防及び治療用の医薬製剤の製造における使用。
【化１】
【請求項２】
前記化合物が、子宮頸部及び卵巣の癌細胞の増殖を阻害することにより、所望の治療効果を提供することを特徴とする、請求項１記載の使用。
【請求項３】
前記植物が、Ｚｉｎｇｉｂｅｒ ｚｅｒｕｍｂｅｔ及びＺｉｎｇｉｂｅｒ ａｒｏｍａｔｉｃｕｍからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１記載の使用。
【請求項４】
前記化合物が、根茎、茎、根及び芽を含む植物材料から得られることを特徴とする、請求項１記載の使用。
【請求項５】
（ｉ）Ｚｉｎｇｉｂｅｒ属の植物材料から非極性有機抽出物を調製する工程；
（ｉｉ）工程（ｉ）の生成物をシリカゲルカラムを通して、１種類の有機溶媒及び複数の有機溶媒の混合物で順に溶離する分画化に付することで、Ｚｉｎｇｉｂｅｒ属の植物由来の非極性有機抽出物の分画を得る工程；及び
（ｉｉｉ）再結晶法、分配法及びクロマトグラフィー法により前記化合物を単離及び精製する工程、
を含む、請求項１記載の化合物の抽出及び精製方法。
【請求項６】
Ｚｉｎｇｉｂｅｒ属の植物の根茎、茎、根及び/又は芽を、有機溶媒及び/又は水及び有機溶媒の混合溶液を用いた抽出に付することにより工程（ｉ）が行われる、請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記有機溶媒が、エタノール及び/又はヘキサンである、請求項６記載の方法。
【請求項８】
工程（ｉｉ）記載の有機溶媒が、ヘキサン及び酢酸エチルからなる群から選択可能な、請求項５記載の方法。
【請求項９】
有効成分として請求項１に記載の前記化合物（Ｉ）を子宮頸部及び卵巣の癌の予防及び治療に有効な量で含む医薬製剤。
【請求項１０】
前記医薬製剤が、粉末、顆粒、錠剤、カプセル、水性薬物又は注射液として、許容可能な担体に含まれて提供される、請求項９記載の医薬製剤。
【請求項１】
Ｚｉｎｇｉｂｅｒ属の植物から得られ、以下の式を有することを特徴とする化合物（Ｉ）の、癌の予防及び治療用の医薬製剤の製造における使用。
【化１】
【請求項２】
前記化合物が、子宮頸部及び卵巣の癌細胞の増殖を阻害することにより、所望の治療効果を提供することを特徴とする、請求項１記載の使用。
【請求項３】
前記植物が、Ｚｉｎｇｉｂｅｒ ｚｅｒｕｍｂｅｔ及びＺｉｎｇｉｂｅｒ ａｒｏｍａｔｉｃｕｍからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１記載の使用。
【請求項４】
前記化合物が、根茎、茎、根及び芽を含む植物材料から得られることを特徴とする、請求項１記載の使用。
【請求項５】
（ｉ）Ｚｉｎｇｉｂｅｒ属の植物材料から非極性有機抽出物を調製する工程；
（ｉｉ）工程（ｉ）の生成物をシリカゲルカラムを通して、１種類の有機溶媒及び複数の有機溶媒の混合物で順に溶離する分画化に付することで、Ｚｉｎｇｉｂｅｒ属の植物由来の非極性有機抽出物の分画を得る工程；及び
（ｉｉｉ）再結晶法、分配法及びクロマトグラフィー法により前記化合物を単離及び精製する工程、
を含む、請求項１記載の化合物の抽出及び精製方法。
【請求項６】
Ｚｉｎｇｉｂｅｒ属の植物の根茎、茎、根及び/又は芽を、有機溶媒及び/又は水及び有機溶媒の混合溶液を用いた抽出に付することにより工程（ｉ）が行われる、請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記有機溶媒が、エタノール及び/又はヘキサンである、請求項６記載の方法。
【請求項８】
工程（ｉｉ）記載の有機溶媒が、ヘキサン及び酢酸エチルからなる群から選択可能な、請求項５記載の方法。
【請求項９】
有効成分として請求項１に記載の前記化合物（Ｉ）を子宮頸部及び卵巣の癌の予防及び治療に有効な量で含む医薬製剤。
【請求項１０】
前記医薬製剤が、粉末、顆粒、錠剤、カプセル、水性薬物又は注射液として、許容可能な担体に含まれて提供される、請求項９記載の医薬製剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１０Ｃ】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１０Ｃ】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【公表番号】特表２０１０−５１０２０７（Ｐ２０１０−５１０２０７Ａ）
【公表日】平成２２年４月２日（２０１０．４．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５３７０９９（Ｐ２００９−５３７０９９）
【出願日】平成１９年１１月２０日（２００７．１１．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＭＹ２００７／００００８２
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０６３０４５
【国際公開日】平成２０年５月２９日（２００８．５．２９）
【出願人】（５０５２９１４１３）ユニバーシティー プトラ マレーシア (11)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年４月２日（２０１０．４．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１１月２０日（２００７．１１．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＭＹ２００７／００００８２
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０６３０４５
【国際公開日】平成２０年５月２９日（２００８．５．２９）
【出願人】（５０５２９１４１３）ユニバーシティー プトラ マレーシア (11)
【Ｆターム（参考）】
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