抗菌ペプチド多量体
本発明は、例えばディフェンシンペプチドなどの抗菌ペプチドの多量体に関する。ディフェンシンペプチドの多量体は、抗菌活性を有し、抗菌組成物、医薬組成物、点眼用組成物、コンタクトレンズ用液剤、医療器具をコーティングするための組成物などに製剤化することができる。また本発明は、宿主内を含めて、微生物全般の増殖を阻害および／または抑制するためのペプチド多量体（例えばディフェンシンペプチドの多量体）の使用に関する。さらに本発明は、ディフェンシン（例えばｈＢＤ３）由来ペプチドの多量体を製造する方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗菌性を有するペプチドの新規多量体に関する。また本発明は、前記多量体の製造方法に関する。本発明は、広範囲の微生物の増殖を阻害するための、前記多量体の使用に関する。さらに本発明は、前記ペプチドを含む組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ディフェンシンは、カチオン性の抗菌ペプチドで、自然免疫系の構成要素である。ヒトでは、アルファディフェンシンは好中球または消化管のパネート細胞によって、ベータディフェンシンは上皮細胞によって産生される。ディフェンシンは、グラム陰性菌、グラム陽性菌、一部の真菌類やエンベロープウイルスなどの広範囲の微生物に対して抗菌性を有する。
【０００３】
この抗菌性の正確なメカニズムは完全にはわかっていないが、このペプチドの持つ疎水性や正味の正電荷が、微生物の細胞壁や細胞膜の相互作用やそれらの破壊に重要であると思われる。
【０００４】
複数の研究から、細菌の細胞膜において、全長型のディフェンシンが非共有結合の形態でダイマーを形成する可能性が示唆されている（Ｈｏｏｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０００；Ｈｏｏｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｓｃｈｉｂｉｌｉ ｅｔ ａｌ．，２００２）。またある研究では、ディフェンシンの二量体化が抗菌性に影響を与える可能性が示唆されている（Ｃａｍｐｏｐｉａｎｏ ｅｔ ａｌ．，２００４）。しかしながら、このダイマーの特性についての詳細な検討や解析は行われていない。
【０００５】
抗生物質に対する耐性の出現は、抗生物質の開発における障害の１つである。ディフェンシンの抗菌活性は完全には理解されていないが、現在考えられるディフェンシンの作用機序からすると、耐性が現れるまでに相当時間がかかるか、または極めて弱い耐性しか現れない可能性が示唆されており、ディフェンシンの抗菌剤としての使用は有望であると言える。しかし、ディフェンシンは、哺乳動物細胞などの宿主細胞に対して毒性を示すことも知られているため、抗菌剤としての適用は制限される可能性がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、抗菌活性が高くかつ宿主細胞に対する毒性が低い、ディフェンシンの新たなペプチド誘導体の開発が切望されている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、ｈＢＤ３由来の単離多量体（配列番号１）に関する。
ｈＢＤ３（配列番号１）
ＧＩＩＮＴＬＱＫＹＹＣＲＶＲＧＧＲＣＡＶＬＳＣＬＰＫＥＥＱＩＧＫＣＳＴＲＧＲＫＣＣＲＲＫＫ
【０００８】
第１の態様において、本発明は、式（Ｕ）ｎ（式中、Ｕは、配列番号２を含むペプチド、またはそのフラグメントもしくは変異体であり、ｎは２以上である）で表されるディフェンシンペプチドの単離多量体に関する。
配列番号２
ＧＩＩＮＴＬＱＫＹＹＸＲＶＲＧＧＲＸＡＶＬＳＸＬＰＫＥＥＱＩＧＫＸＳＴＲＧＲＫＸＸＲＲＺＺ
Ｘは任意のアミノ酸を包含し；Ｚは任意のアミノ酸を包含するか、または存在しなくてもよい。例えば、Ｚとしては、リジン、オルニチンまたはアルギニンが挙げられるが、これらに限定されない。具体的には、Ｚはリジンであってよい。
【０００９】
別の態様において、本発明は、ペプチドＵを少なくとも２つ含む単離多量体に関する。ただし、前記ペプチドＵは、配列番号２またはそのフラグメントもしくは変異体を含む。
前記多量体には、ペプチドＵの繰り返しが存在する。具体的には、繰り返し単位であるペプチドＵ同士は共有結合により連結している。さらに、ペプチドＵ同士は、少なくとも１つのアミノ酸Ｂを介して連結していてもよい。Ｂはそれぞれ、アミン基を少なくとも２つ有するアミノ酸であってよい。例えば、Ｂとしては、リジン、オルニチンまたはアルギニンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１０】
本発明の任意の多量体における繰り返し単位、すなわちペプチドＵは、ＷＯ２００７／１２６３９２に記載のいずれのペプチドであってもよい。
ペプチドＵとしては、配列番号２に由来するペプチドフラグメントなどが挙げられる。このフラグメントは、配列番号２に由来するものであれば、いかなる長さのフラグメントであってもよい。具体的には、ペプチドＵは、配列番号３またはそのフラグメントもしくは変異体を含んでもよい。
配列番号３
ＧＩＩＮＴＬＱＫＹＹＸＲＶＲＧＧＲＸＡＶＬＳＸＬＰＫＥＥＱＩＧＫＸＳＴＲＧＲＫＸＸＲＲ
Ｘは任意のアミノ酸を包含する。
多量体のペプチドＵは、＋１〜＋１１の電荷を有してもよい。
【００１１】
別の態様において、本発明は、式（Ｕ）ｎＢｍＺｊ（式中、Ｕは、配列番号３またはそのフラグメントもしくは変異体を含み、Ｂはそれぞれ、アミン基を少なくとも２つ有するアミノ酸残基を少なくとも１つ包含し、Ｚは任意のアミノ酸を包含し、ｎは２以上であり、ｍは１以上であり、ｊは０以上である）で表される単離多量体に関する。Ｂは、アミン基を少なくとも２つ有するアミノ酸を包含してもよい。具体的には、Ｂとしては、リジン、オルニチンまたはアルギニンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１２】
本発明の一態様において、（Ｕ）ｎＢｍＺｊのＢとＺはいずれもリジン（Ｋ）を包含してもよい。このとき、上記の式は（Ｕ）ｎＫｍＫｊで表される。また、さらなる態様において、ｍがｎ−１と等しくてもよく、ｊが１であってもよい。このとき、上記の多量体の式は（Ｕ）ｎＫｎ−１Ｋ（すなわち（ＵＫ）ｎ）で表される。式（Ｕ）ｎＫｍＫｊまたは（Ｕ）ｎＫｎ−１ＫにおけるペプチドＵは、配列番号３またはそのフラグメントもしくは変異体を含んでもよい。
【００１３】
本発明の多量体は、直鎖状、分岐状のいずれであってもよい。多量体（Ｕ）ｎが直鎖状である場合、ｎ回繰り返されるペプチドＵは、配列番号２またはその任意のフラグメントもしくは変異体を含んでもよい。
分岐状の多量体、例えば多量体（Ｕ）ｎＢｍＺｊに関しては、末端の残基ＢｍＺｊで分岐していてもよい。
【００１４】
本発明の多量体は、繰り返し単位であるペプチドＵを任意の数含んでもよい。例えば、前記多量体は、繰り返し単位であるペプチドＵを２〜１０個、２〜２０個、または２〜３０個含んでもよい。さらに前記多量体は、ダイマー、トリマー、テトラマー、ペンタマー、ヘキサマー、ヘプタマー、オクタマー、ノナマー、デカマーのいずれであってもよい。具体的には、ｎは偶数であってもよい。さらに具体的には、ｎは、２から始まる２の累乗倍に相当する値のいずれを包含してもよい。
【００１５】
さらに、本発明の多量体の任意のアミノ酸残基は、保護基を少なくとも１つ有するアミノ酸を包含してもよい。前記保護基は、Ｂｏｃ、Ｂｕｔ、Ｆｍｏｃ、Ｐｂｆなどを包含してもよい。
【００１６】
また本発明は、本発明の少なくとも１つの多量体を製造する方法に関する。
従って、本発明は、式（Ｕ）ｎ（式中、Ｕは、配列番号２を含むペプチド、またはそのフラグメントもしくは変異体である）で表される少なくとも１つの多量体を製造する方法であって、少なくとも２つのＵを連結することを含む方法に関する。
【００１７】
また、本発明の多量体は、組換えＤＮＡ技術により作製してもよい。本発明の多量体の全長またはその任意の一部を、組換えＤＮＡ技術により作製してもよい。例えば、複数のペプチドモノマーをそれぞれ組換えＤＮＡ法により作製し、これらを化学的手法により連結して多量体を形成させてもよい。
【００１８】
従って、本発明は、本発明の多量体の全長またはその任意の一部をコードする単離核酸分子にも関する。前記核酸分子は、ベクターに挿入してもよい。さらに、本発明の多量体の全長または任意の一部を発現させるために、前記核酸分子または該核酸分子を含むベクターを宿主細胞に導入してもよい。
【００１９】
また本発明の多量体は、化学合成法により新規合成（ｄｅ ｎｏｖｏ合成）してもよい。例えば、本発明の多量体を、本発明の固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）法により合成してもよい。
【００２０】
また本発明は、式：（Ｕ）ｎＢｍＺｊ（式中、Ｕは、配列番号３またはそのフラグメントもしくは変異体を含み、Ｂはそれぞれ、アミン基を少なくとも２つ有するアミノ酸を包含し、Ｚは任意のアミノ酸を包含し、ｎは２以上であり、ｍは１以上であり、ｊは０以上である）で表される少なくとも１つの多量体を製造する方法であって、
（i）少なくとも１つの固相を準備する工程；
（ii）固相に少なくとも１つの１番目のアミノ酸Ｚを結合させる工程；
（iii）固相に結合させた１番目のアミノ酸残基に、保護基を有するアミノ酸残基Ｂを少なくとも１つ連結する工程；
（iv）連結させた残基Ｂから保護基を除去する工程；
（v）ペプチドＵの配列に従って、保護基を有するアミノ酸残基をＣ末端からＮ末端の方向へ順に連結し、連結の都度、次の連結のために保護基を除去することによって、さらなる鎖の伸長を行う工程；および
（vi）加える残基の数に応じて、アミノ酸残基の連結を終了する工程
を含む方法に関する。
【００２１】
保護基を有するアミノ酸Ｂは、保護基で保護されている側鎖を少なくとも２つ含む。具体的には、Ｂとしては、リジン、オルニチンまたはアルギニンが挙げられるが、これらに限定されない。固相に結合させた１番目のアミノ酸Ｚとしても、同様に、リジン、オルニチンまたはアルギニンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２２】
上記の方法を拡張し、さらなる多量体を合成してもよい。例えば、さらなる多量体を合成するために拡張した方法は、工程（iv）の後に、
（iv）（ａ）連結させた残基Ｂに、保護基を有する残基Ｂをさらに連結する工程；
（iv）（ｂ）（iv）（ａ）で連結させた残基Ｂから保護基を除去する工程；および
（iv）（ｃ）工程（iv）（ａ）および（iv）（ｂ）を繰り返し行う工程、または
（iv）（ｄ）工程（v）および（vi）に進む工程
をさらに含む。
【００２３】
形成される多量体は、Ｂのアミン基の数に依存する。Ｂのアミン基の数が２である場合、例えば、Ｂがリジン（Ｋ）またはオルニチンである場合、上記の拡張した方法により、先の方法で合成される多量体から繰り返し単位数が２の累乗倍に増加した多量体を合成できる。この拡張した方法により、４量体、８量体、１６量体、３２量体、６４量体などが形成される。
【００２４】
Ｂが、３つのアミン基（２つは第一アミン基で、１つは第二アミン基である）を有するアルギニン（Ｒ）である場合、最初に形成される多量体はトリマーである。続いて形成される多量体は、アルギニンを用いる場合、繰り返し単位数が３の累乗倍に増加する。
【００２５】
多量体化する過程において、Ｂとして、リジンまたはオルニチンとアルギニンとの組み合わせ、またはその逆の順序での組み合わせを用いてもよく、このようにして繰り返し単位数の異なる多量体を合成することができる。
【００２６】
合成が終了した後、固相から多量体を遊離させてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】保護基を有するリジン残基、すなわちＬｙｓ（Ｆｍｏｃ）、ならびにＶ２モノマーおよびＶ２ダイマーの構造を示す。太字で示すリジン（Ｋ）残基は、合成時にＬｙｓ（Ｆｍｏｃ）が組み込まれた位置を示す。
【図２】固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）法によるＶ２ダイマーの合成を示す。工程（i）は、ＤＭＦ（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド）中、２０％ピペリジンを用いて保護基を除去する工程を示す。工程（ii）は、ＮＭＰ（Ｎ−メチルピロリドン）中、０．５Ｍ ＨＢＴＵ（（Ｎ−［１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル］−（ジメチルアミノ）メチレン）−Ｎ−メチルメタンアミニウム）、０．５Ｍ ＨＯＢＴ（Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール）、および２Ｍ ＤＩＥＡ（ジイソプロピルエチルアミン）を用いて行うカップリング反応の工程を示す。樹脂に結合しているリジン残基にＦｍｏｃ（Ｌｙｓ）を結合させて、工程（i）を再度行う。次いで、各鎖にアルギニン残基（Ｒ）を２個ずつ加える。工程（iii）は、０．５Ｍ ＨＢＴＵ／０．５Ｍ ＨＯＢＴ／２Ｍ ＤＩＥＡを用いて、ＳＰＰＳ法のサイクルを６回繰り返すことを含む鎖の伸長工程を示す。この工程により、Ｖ２ダイマーの残りのアミノ酸が組み込まれる。工程（iv）は、ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）９０％、フェノール５．０％、水１．５％、ＴＩＳ（トリイソプロピルシラン）１．０％およびＥＤＴ（エタンジチオール）２．５％からなる切断試薬を用いて、樹脂からダイマーを遊離させる切断工程を示す。このダイマーには、ＲＧＲＫＶＶＲＲ（配列番号４４）の繰り返しが存在する。
【図３】本発明のＳＰＰＳ法を用いて繰り返し単位数が２の累乗倍に増加した多量体を形成できることを示す。例えばダイマー、テトラマー、オクタマーなどといったようにモノマー単位数が２の累乗倍に増加する多量体を製造することができる。イタリック太字で示すリジン（Ｋ）残基は、合成時にＬｙｓ（Ｆｍｏｃ）が組み込まれた位置を示す。図３の配列は、ＲＧＲＫＶＶＲＲＫＫ（配列番号４５）およびＲＧＲＫＶＶＲＲ（配列番号４６）である。
【図４】Ｖ２ダイマーがヒト結膜上皮細胞に対する毒性を持たないことを、天然のｈＢＤ３と比較して示すグラフである。この結果は、独立で行った４回の試験により得られたものであり、各データポイントは平均と標準偏差を示す。Ｘ軸はペプチド濃度（μｇ／ｍｌ）を示し、Ｙ軸は細胞の生存率（％）を示す。
【図５】野生型ｈＢＤ３とそのＣ末端ペプチドのウサギ赤血球に対する溶血作用を示す。
【図６】野生型ｈＢＦＤ３とそのＣ末端ペプチドのヒト結膜上皮細胞に対する細胞毒性作用を示す。
【図７】ヘテロダイマーの製造方法の一例を示す。図７の配列は、ＲＧＲＫＶＶＲＲ（配列番号４４）およびＲＧＲＫＶＶＲＲＶＶ（配列番号４６）である。
【図８】ヘテロテトラマーの製造方法の一例を示す。図８の配列は、ＲＲＶＶＫＲＧＲＫ（配列番号５８） ＲＧＲＫＶＶＲＲ（配列番号４４）およびＲＧＲＫＶＶＲＲＶＶ（配列番号４６）である。
【図９】ホモテトラマーの製造方法の一例を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
定義
ペプチド配列中または式中にＸが存在する場合、Ｘは任意のアミノ酸を示す。任意のアミノ酸には、保護基を有するシステイン残基が含まれ、例えばＣ（Ａｃｍ）、Ｃ（Ｂｕｔ）、Ｃ（Ｃａｍ）、Ｃ（ｔ−Ｂｕｔｈｉｏ）、Ｃ（Ｂｚｌ）、Ｃ（４−ＭｅＯ−Ｂｚｌ）、Ｃ（Ｍｍｔ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２９】
ペプチドまたは多量体の変異体とは、多量体のペプチド配列が変異したものを意味し、このペプチド配列においては、１以上のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていてもよい。この置換は、通常、類似の特性を有するアミノ酸による保存的置換である。この変異体は、通常、＋１〜＋１１の正味電荷を保持しており、通常、活性を有し、十分な抗菌性と低い細胞毒性を示す。
【００３０】
保護基を有するアミノ酸とは、反応基の化学反応を抑制および／または阻止するために、１以上の反応基が不活性分子で修飾されているアミノ酸を意味する。
【００３１】
第１の態様において、本発明は、式（Ｕ）ｎ（式中、Ｕは、配列番号２を含むペプチド、またはそのフラグメントもしくは変異体であり、ｎは２以上である）で表されるディフェンシンペプチドの単離多量体に関する。
配列番号２
ＧＩＩＮＴＬＱＫＹＹＸＲＶＲＧＧＲＸＡＶＬＳＸＬＰＫＥＥＱＩＧＫＸＳＴＲＧＲＫＸＸＲＲＺＺ
Ｘは任意のアミノ酸を包含してよく；Ｚは任意のアミノ酸を包含するか、または存在しなくてもよい。例えば、Ｚとしては、リジン、オルニチンまたはアルギニンが挙げられるが、これらに限定されない。具体的には、Ｚはリジンであってよい。
【００３２】
別の態様において、本発明は、ペプチドＵを少なくとも２つ含む単離多量体を提供する。ただし、前記ペプチドＵは、配列番号２またはそのフラグメントもしくは変異体を含む。
前記多量体には、ペプチドＵの繰り返しが存在する。具体的には、繰り返し単位であるペプチドＵ同士は共有結合により連結している。ペプチドＵ同士は、少なくとも１つのアミノ酸Ｂを介して連結していてもよい。Ｂは、アミン基を少なくとも２つ有するアミノ酸を包含してもよい。例えば、Ｂとしては、リジン、オルニチンまたはアルギニンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３３】
本発明の任意の多量体における繰り返し単位、すなわちペプチドＵは、ＷＯ２００７／１２６３９２に記載のいずれのペプチドであってもよい。
ペプチドＵとしては、配列番号２に由来するペプチドフラグメントなどが挙げられる。このフラグメントは、配列番号２に由来するものであれば、いかなる長さのフラグメントであってもよい。具体的には、ペプチドＵは、配列番号３またはそのフラグメントもしくは変異体を含んでもよい。
配列番号３
ＧＩＩＮＴＬＱＫＹＹＸＲＶＲＧＧＲＸＡＶＬＳＸＬＰＫＥＥＱＩＧＫＸＳＴＲＧＲＫＸＸＲＲ
Ｘは任意のアミノ酸を包含する。
多量体のペプチドＵは、＋１〜＋１１の電荷を有してもよい。
【００３４】
またペプチドＵは、配列番号４〜５８のいずれかまたはそのフラグメントもしくは変異体を含んでもよい。
配列番号４（ｈＢＤ３のＣ末端３８アミノ酸由来のペプチド）
ＫＹＹＸＲＶＲＧＧＲＸＡＶＬＳＸＬＰＫＥＥＱＩＧＫＸＳＴＲＧＲＫＸＸＲＲＺＺ
Ｘは任意のアミノ酸を包含し；Ｚは任意のアミノ酸を包含するか、または存在しなくてもよい。
配列番号５（ｈＢＤ３のＣ末端３６アミノ酸由来のペプチド）
ＹＸＲＶＲＧＧＲＸＡＶＬＳＸＬＰＫＥＥＱＩＧＫＸＳＴＲＧＲＫＸＸＲＲＺＺ
Ｘは任意のアミノ酸を包含し；Ｚは任意のアミノ酸を包含するか、または存在しなくてもよい。
配列番号６（ｈＢＤ３のＣ末端４０アミノ酸由来のペプチド）
ＬＱＫＹＹＸＲＶＲＧＧＲＸＡＶＬＳＸＬＰＫＥＥＱＩＧＫＸＳＴＲＧＲＫＸＸＲＲＺＺ
Ｘは任意のアミノ酸を包含し；Ｚは任意のアミノ酸を包含するか、または存在しなくてもよい。
配列番号７（ｈＢＤ３のＣ末端２９アミノ酸由来のペプチド）
ＲＸＡＶＬＳＸＬＰＫＥＥＱＩＧＫＸＳＴＲＧＲＫＸＸＲＲＺＺ
Ｘは任意のアミノ酸を包含し；Ｚは任意のアミノ酸を包含するか、または存在しなくてもよい。
配列番号８
ＫＥＥＱＩＧＫＸＳＴＲＧＲＫＸＸＲＲＺＺ（ｈＢＤ３のＣ末端２０アミノ酸由来のペプチド）
Ｘは任意のアミノ酸を包含し；Ｚは任意のアミノ酸を包含するか、または存在しなくてもよい。
配列番号９
ＫＸＳＴＲＧＲＫＸＸＲＲＺＺ（ｈＢＤ３のＣ末端１４アミノ酸由来のペプチド）
Ｘは任意のアミノ酸を包含し；Ｚは任意のアミノ酸を包含するか、または存在しなくてもよい。
【００３５】
配列番号１０（ｈＢＤ３の第８〜２６番目のアミノ酸に相当する１９アミノ酸由来のペプチド）
ＫＹＹＸＲＶＲＧＧＲＸＡＶＬＳＸＬＰＫ
Ｘは任意のアミノ酸を包含する。
配列番号１１
ＧＩＩＮＴＬＱＫＹＹＸＲＶＲＧＧＲ（ｈＢＤ３のＮ末端１７アミノ酸由来のペプチド）
Ｘは任意のアミノ酸を包含する。
配列番号１２（ＣがＷで置換された全長型ｈＢＤ３由来のペプチド）
ＧＩＩＮＴＬＱＫＹＹＷＲＶＲＧＧＲＷＡＶＬＳＷＬＰＫＥＥＱＩＧＫＷＳＴＲＧＲＫＷＷＲＲＺＺ
Ｚは任意のアミノ酸を包含するか、または存在しなくてもよい。
配列番号１３（ＣがＦで置換された全長型ｈＢＤ３由来のペプチド）
ＧＩＩＮＴＬＱＫＹＹＦＲＶＲＧＧＲＦＡＶＬＳＦＬＰＫＥＥＱＩＧＫＦＳＴＲＧＲＫＦＦＲＲＺＺ
Ｚは任意のアミノ酸を包含するか、または存在しなくてもよい。
配列番号１４（ＣがＹで置換された全長型ｈＢＤ３由来のペプチド）
ＧＩＩＮＴＬＱＫＹＹＹＲＶＲＧＧＲＹＡＶＬＳＹＬＰＫＥＥＱＩＧＫＹＳＴＲＧＲＫＹＹＲＲＺＺ
Ｚは任意のアミノ酸を包含するか、または存在しなくてもよい。
配列番号１５（ＣがＳで置換された全長型ｈＢＤ３由来のペプチド）
ＧＩＩＮＴＬＱＫＹＹＳＲＶＲＧＧＲＳＡＶＬＳＳＬＰＫＥＥＱＩＧＫＳＳＴＲＧＲＫＳＳＲＲＺＺ
Ｚは任意のアミノ酸を包含するか、または存在しなくてもよい。
配列番号１６（ＣがＡで置換された全長型ｈＢＤ３由来のペプチド）
ＧＩＩＮＴＬＱＫＹＹＡＲＶＲＧＧＲＡＡＶＬＳＡＬＰＫＥＥＱＩＧＫＡＳＴＲＧＲＫＡＡＲＲＺＺ
Ｚは任意のアミノ酸を包含するか、または存在しなくてもよい。
配列番号１７（ＣがＣ（Ａｃｍ）で置換された全長型ｈＢＤ３由来のペプチド）
ＧＩＩＮＴＬＱＫＹＹＣ（Ａｃｍ）ＲＶＲＧＧＲＣ（Ａｃｍ）Ｃ（Ａｃｍ）ＶＬＳＡＬＰＫＥＥＱＩＧＫＣ（Ａｃｍ）ＳＴＲＧＲＫＣ（Ａｃｍ）Ｃ（Ａｃｍ）ＲＲＺＺ
Ｚは任意のアミノ酸を包含するか、または存在しなくてもよい。
配列番号１８（ＣがＣ（Ｂｕｔ）で置換された全長型ｈＢＤ３由来のペプチド）
ＧＩＩＮＴＬＱＫＹＹＣ（Ｂｕｔ）ＲＶＲＧＧＲＣ（Ｂｕｔ）Ｃ（Ｂｕｔ）ＶＬＳＡＬＰＫＥＥＱＩＧＫＣ（Ｂｕｔ）ＳＴＲＧＲＫＣ（Ｂｕｔ）Ｃ（Ｂｕｔ）ＲＲＺＺ
Ｚは任意のアミノ酸を包含するか、または存在しなくてもよい。
配列番号１９（ＣがＣ（ｔ−Ｂｕｔｈｉｏ）で置換された全長型ｈＢＤ３由来のペプチド）
ＧＩＩＮＴＬＱＫＹＹＣ（ｔ−Ｂｕｔｈｉｏ）ＲＶＲＧＧＲＣ（ｔ−Ｂｕｔｈｉｏ）Ｃ（ｔ−Ｂｕｔｈｉｏ）ＶＬＳＡＬＰＫＥＥＱＩＧＫＣ（ｔ−Ｂｕｔｈｉｏ）ＳＴＲＧＲＫＣ（ｔ−Ｂｕｔｈｉｏ）Ｃ（ｔ−Ｂｕｔｈｉｏ）ＲＲＺＺ
Ｚは任意のアミノ酸を包含するか、または存在しなくてもよい。
【００３６】
配列番号２０（ＣがＣ（Ｂｚｌ）で置換された全長型ｈＢＤ３由来のペプチド）
ＧＩＩＮＴＬＱＫＹＹＣ（Ｂｚｌ）ＲＶＲＧＧＲＣ（Ｂｚｌ）Ｃ（Ｂｚｌ）ＶＬＳＡＬＰＫＥＥＱＩＧＫＣ（Ｂｚｌ）ＳＴＲＧＲＫＣ（Ｂｚｌ）Ｃ（Ｂｚｌ）ＲＲＺＺ
Ｚは任意のアミノ酸を包含するか、または存在しなくてもよい。
配列番号２１（ＣがＣ（４−ＭｅＢｚｌ）で置換された全長型ｈＢＤ３由来のペプチド）
ＧＩＩＮＴＬＱＫＹＹＣ（４−ＭｅＢｚｌ）ＲＶＲＧＧＲＣ（４−ＭｅＢｚｌ）Ｃ（４−ＭｅＢｚｌ）ＶＬＳＡＬＰＫＥＥＱＩＧＫＣ（４−ＭｅＢｚｌ）ＳＴＲＧＲＫＣ（４−ＭｅＢｚｌ）Ｃ（４−ＭｅＢｚｌ）ＲＲＺＺ
Ｚは任意のアミノ酸を包含するか、または存在しなくてもよい。
配列番号２２（ＣがＣ（４−ＭｅＯＢｚｌ）で置換された全長型ｈＢＤ３由来のペプチド）
ＧＩＩＮＴＬＱＫＹＹＣ（４−ＭｅＯＢｚｌ）ＲＶＲＧＧＲＣ（４−ＭｅＯＢｚｌ）Ｃ（４−ＭｅＯＢｚｌ）ＶＬＳＡＬＰＫＥＥＱＩＧＫＣ（４−ＭｅＯＢｚｌ）ＳＴＲＧＲＫＣ（４−ＭｅＯＢｚｌ）Ｃ（４−ＭｅＯＢｚｌ）ＲＲＺＺ
Ｚは任意のアミノ酸を包含するか、または存在しなくてもよい。
配列番号２３（ＣがＣ（Ｍｍｔ）で置換された全長型ｈＢＤ３由来のペプチド）
ＧＩＩＮＴＬＱＫＹＹＣ（Ｍｍｔ）ＲＶＲＧＧＲＣ（Ｍｍｔ）Ｃ（Ｍｍｔ）ＶＬＳＡＬＰＫＥＥＱＩＧＫＣ（Ｍｍｔ）ＳＴＲＧＲＫＣ（Ｍｍｔ）Ｃ（Ｍｍｔ）ＲＲＺＺ
Ｚは任意のアミノ酸を包含するか、または存在しなくてもよい。
配列番号２４（Ｃが修飾を受けたＣで置換された全長型ｈＢＤ３由来のペプチド）
ＧＩＩＮＴＬＱＫＹＹＸＲＶＲＧＧＲＸＸＶＬＳＡＬＰＫＥＥＱＩＧＫＸＳＴＲＧＲＫＸＸＲＲＺＺ
ＸはＣ（Ａｃｍ）、Ｃ（Ｂｕｔ）、Ｃ（ｔ−Ｂｕｔｈｉｏ）、Ｃ（Ｂｚｌ）、Ｃ（４−ＭｅＢｚｌ）、Ｃ（４−ＭｅＯＢｚｌ）またはＣ（Ｍｍｔ）を包含し；Ｚは任意のアミノ酸を包含するか、または存在しなくてもよい。
配列番号２５（Ｃが任意のアミノ酸Ｘで置換されたｈＢＤ３のＣ末端１０アミノ酸由来のフラグメント）
ＲＧＲＫＸＸＲＲＺＺ
Ｘは任意のアミノ酸を包含し；Ｚは任意のアミノ酸を包含するか、または存在しなくてもよい。
配列番号２６（ＣがＷで置換されたｈＢＤ３のＣ末端１０アミノ酸由来のフラグメント）
ＲＧＲＫＷＷＲＲＺＺ
Ｚは任意のアミノ酸を包含するか、または存在しなくてもよい。
配列番号２７（ＣがＦで置換されたｈＢＤ３のＣ末端１０アミノ酸由来のフラグメント）
ＲＧＲＫＦＦＲＲＺＺ
Ｚは任意のアミノ酸を包含するか、または存在しなくてもよい。
配列番号２８（ＣがＹで置換されたｈＢＤ３のＣ末端１０アミノ酸由来のフラグメント）
ＲＧＲＫＹＹＲＲＺＺ
Ｚは任意のアミノ酸を包含するか、または存在しなくてもよい。
配列番号２９（ＣがＬで置換されたｈＢＤ３のＣ末端１０アミノ酸由来のフラグメント）
ＲＧＲＫＬＬＲＲＺＺ
Ｚは任意のアミノ酸を包含するか、または存在しなくてもよい。
【００３７】
配列番号３０（ＣがＩで置換されたｈＢＤ３のＣ末端１０アミノ酸由来のフラグメント）
ＲＧＲＫＩＩＲＲＺＺ
Ｚは任意のアミノ酸を包含するか、または存在しなくてもよい。
配列番号３１（ＣがＨで置換されたｈＢＤ３のＣ末端１０アミノ酸由来のフラグメント）
ＲＧＲＫＨＨＲＲＺＺ
Ｚは任意のアミノ酸を包含するか、または存在しなくてもよい。
配列番号３２（ＣがＣ（Ａｃｍ）、Ｃ（Ｂｕｔ）、Ｃ（ｔ−Ｂｕｔｈｉｏ）、Ｃ（Ｂｚｌ）、Ｃ（４−ＭｅＢｚｌ）、Ｃ（４−ＭｅＯＢｚｌ）またはＣ（Ｍｍｔ）で置換されたｈＢＤ３のＣ末端１０アミノ酸由来のフラグメント）
ＲＧＲＫＸＸＲＲＺＺ
ＸはＣ（Ａｃｍ）、Ｃ（Ｂｕｔ）、Ｃ（ｔ−Ｂｕｔｈｉｏ）、Ｃ（Ｂｚｌ）、Ｃ（４−ＭｅＢｚｌ）、Ｃ（４−ＭｅＯＢｚｌ）またはＣ（Ｍｍｔ）を包含し；Ｚは任意のアミノ酸を包含するか、または存在しなくてもよい。
配列番号３３（ＣがＶで置換されたｈＢＤ３のＣ末端１０アミノ酸由来のフラグメント）
ＲＧＲＫＶＶＲＲＺＺ
Ｚは任意のアミノ酸を包含するか、または存在しなくてもよい。
配列番号３４（ｈＢＤ３のＣ末端１０アミノ酸由来のペプチド）
ＲＧＲＫＣＣＲＲＺＺ
Ｚは任意のアミノ酸を包含するか、または存在しなくてもよい。
配列番号３５（ＣがＣ（Ａｃｍ）、Ｃ（Ｂｕｔ）、Ｃ（ｔ−Ｂｕｔｈｉｏ）、Ｃ（Ｂｚｌ）、Ｃ（４−ＭｅＢｚｌ）、Ｃ（４−ＭｅＯＢｚｌ）またはＣ（Ｍｍｔ）で置換されたｈＢＤ３のＣ末端１０アミノ酸由来のペプチド）
ＲＧＲＫＸＸＲＲＫＫ
ＸはＣ（Ａｃｍ）、Ｃ（Ｂｕｔ）、Ｃ（ｔ−Ｂｕｔｈｉｏ）、Ｃ（Ｂｚｌ）、Ｃ（４−ＭｅＢｚｌ）、Ｃ（４−ＭｅＯＢｚｌ）またはＣ（Ｍｍｔ）を包含する。
配列番号３６（Ｃが任意のアミノ酸で置換されたｈＢＤ３のＣ末端由来のペプチド。ただし、ｈＢＤ３のＣ末端のＫＫは含まない。）
ＲＧＲＫＸＸＲＲ
配列番号３７（Ｗ２−８ＡＡ：ＣがＷで置換されたｈＢＤ３のＣ末端由来のペプチド。ただし、ｈＢＤ３のＣ末端のＫＫは含まない。）
ＲＧＲＫＷＷＲＲ
配列番号３８（ＣがＦで置換されたｈＢＤ３のＣ末端由来のペプチド。ただし、ｈＢＤ３のＣ末端のＫＫは含まない。）
ＲＧＲＫＦＦＲＲ
配列番号３９（Ｙ２−８ＡＡ：ＣがＹで置換されたｈＢＤ３のＣ末端由来のペプチド。ただし、ｈＢＤ３のＣ末端のＫＫは含まない。）
ＲＧＲＫＹＹＲＲ
【００３８】
配列番号４０（ＣがＬで置換されたｈＢＤ３のＣ末端由来のペプチド。ただし、ｈＢＤ３のＣ末端のＫＫは含まない。）
ＲＧＲＫＬＬＲＲ
配列番号４１（ＣがＩで置換されたｈＢＤ３のＣ末端由来のペプチド。ただし、ｈＢＤ３のＣ末端のＫＫは含まない。）
ＲＧＲＫＩＩＲＲ
配列番号４２（ＣがＨで置換されたｈＢＤ３のＣ末端由来のペプチド。ただし、ｈＢＤ３のＣ末端のＫＫは含まない。）
ＲＧＲＫＨＨＲＲ
配列番号４３（ＣがＣ（Ａｃｍ）、Ｃ（Ｂｕｔ）、Ｃ（ｔ−Ｂｕｔｈｉｏ）、Ｃ（Ｂｚｌ）、Ｃ（４−ＭｅＢｚｌ）、Ｃ（４−ＭｅＯＢｚｌ）またはＣ（Ｍｍｔ）で置換されたｈＢＤ３のＣ末端由来のペプチド。ただし、ｈＢＤ３のＣ末端のＫＫは含まない。）
ＲＧＲＫＣＸＸＲＲ
ＸはＣ（Ａｃｍ）、Ｃ（Ｂｕｔ）、Ｃ（ｔ−Ｂｕｔｈｉｏ）、Ｃ（Ｂｚｌ）、Ｃ（４−ＭｅＢｚｌ）、Ｃ（４−ＭｅＯＢｚｌ）またはＣ（Ｍｍｔ）を包含する。
配列番号４４（Ｖ２−８ＡＡ：ＣがＶで置換されたｈＢＤ３のＣ末端由来のペプチド。ただし、ｈＢＤ３のＣ末端のＫＫは含まない。）
ＲＧＲＫＶＶＲＲ
配列番号４５（Ｖ２モノマー）
ＲＧＲＫＶＶＲＲＫＫ
配列番号４６（Ｖ４モノマー、Ｖ４−１０ ＡＡ）
ＲＧＲＫＶＶＲＲＶＶ
配列番号４７（Ｙ４モノマー、Ｙ４−１０ ＡＡ）
ＲＧＲＫＹＹＲＲＹＹ
配列番号４８（Ｗ４モノマー、Ｗ４−１０ ＡＡ）
ＲＧＲＫＷＷＲＲＷＷ
配列番号４９（Ｖ３モノマー）
ＲＶＲＫＶＶＲＲ
【００３９】
配列番号５０（Ｖ２Ｒモノマー）
ＲＲＲＫＶＶＲＲ
配列番号５１（Ｖ２Ｄモノマー）
ＲＤＲＫＶＶＲＲ
配列番号５２（Ｅ２モノマー）
ＲＧＲＫＥＥＲＲ
配列番号５３（Ｋ２モノマー）
ＲＧＲＫＫＫＲＲ
配列番号５４
ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲ
配列番号５５
ＶＶＶＶ
配列番号５６
ＹＹＹＹ
配列番号５７
ＲＲＶＶＫＲＧＲ
配列番号５８
ＲＲＶＶＫＲＧＲＫ
【００４０】
別の態様において、本発明は、式（Ｕ）ｎＢｍＺｊ（式中、Ｕは、配列番号３またはそのフラグメントもしくは変異体を含み、Ｂは、アミン基を少なくとも２つ有するアミノ酸を包含し、Ｚは任意のアミノ酸を包含し、ｎは２以上であり、ｍは１以上であり、ｊは０以上である）で表される単離多量体に関する。具体的には、Ｂとしては、リジン、オルニチンまたはアルギニンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４１】
本発明の一態様において、（Ｕ）ｎＢｍＺｊのＢとＺはいずれもリジン（Ｋ）を包含してもよい。このとき、上記の式は（Ｕ）ｎＫｍＫｊで表される。また、さらなる態様において、ｍがｎ−１と等しくてもよく、ｊが１であってもよい。このとき、上記の多量体の式は（Ｕ）ｎＫｎ−１Ｋ（すなわち（ＵＫ）ｎ）で表される。式（Ｕ）ｎＫｍＫｊまたは（Ｕ）ｎＫｎ−１ＫにおけるペプチドＵは、配列番号３またはそのフラグメントもしくは変異体を含んでもよい。
【００４２】
式（Ｕ）ｎＢｍＺｊ、（Ｕ）ｎＫｍＫｊまたは（Ｕ）ｎＫｎ−１ＫにおけるペプチドＵは、配列番号３またはそのフラグメントもしくは変異体を含んでもよく、前記フラグメントまたは変異体としては、例えばＲＧＲＫＸＸＲＲ（配列番号３６）または配列番号３７〜４４のいずれかが挙げられる。
例えば、ｍ＝ｎ−１、ｊ＝１、Ｂ＝Ｚ＝Ｋであり、かつＵが配列番号４４を含む場合、多量体は式（配列番号４４）ｎＫｎ−１Ｋを有する。ｎ＝２である場合、多量体は式（配列番号４４）２ＫＫを有する。
【００４３】
本発明の多量体は、直鎖状、分岐状のいずれであってもよい。多量体（Ｕ）ｎが直鎖状である場合、ｎ回繰り返されるペプチドＵは、配列番号２またはその任意のフラグメントもしくは変異体を含んでもよい。配列番号２の任意のフラグメントまたは変異体としては、配列番号３〜５８のいずれかが挙げられる。例えば、多量体は、（配列番号３５）ｎ、（配列番号３６）ｎ、または（配列番号４５）ｎを含んでもよい。
分岐状の多量体、例えば多量体（Ｕ）ｎＢｍＺｊに関しては、末端の残基ＢｍＺｊで分岐していてもよい。
【００４４】
本発明の多量体は、繰り返し単位を任意の数含んでもよい。例えば、前記多量体は、繰り返しサブユニットを２〜１０個、２〜２０個、または２〜３０個含んでもよい。さらに前記多量体は、ダイマー、トリマー、テトラマー、ペンタマー、ヘキサマー、ヘプタマー、オクタマー、ノナマー、デカマーのいずれであってもよい。
【００４５】
例えば、式（配列番号３６）２ＢＺで表される分岐状ダイマーに関しては、該ダイマーは下記の構造を含んでもよい。
【化１】
あるいは、Ｚは存在しなくてもよく、このとき、上記ダイマーは下記の構造を有する。
【化２】
具体的には、本発明の任意の多量体において、ＸはＶであってもよい。このＶ２モノマーは、配列ＲＧＲＫＶＶＲＲ（配列番号４４）を有する。
【００４６】
また本発明は、さらなる態様において、式：（Ｕ）ｎＫｍＺｊ（式中、Ｕは、配列番号３またはそのフラグメントもしくは変異体を含み、Ｚは任意のアミノ酸を包含し、ｎは２以上であり、ｍは１以上であり、ｊは１である）で表される少なくとも１つの多量体を製造する方法であって、
（i）少なくとも１つの固相を準備する工程；
（ii）固相に少なくとも１つの１番目のアミノ酸残基Ｚを結合させる工程；
（iii）固相に結合させた１番目のアミノ酸残基に、保護基を有するＫ残基を少なくとも１つ連結する工程；
（iv）連結させたＫ残基から保護基を除去する工程；
（v）ペプチドＵの配列に従って、保護基を有するアミノ酸残基をＣ末端からＮ末端の方向へ順に連結し、連結の都度、次の連結のために保護基を除去することによって、さらなる鎖の伸長を行う工程；および
（vi）加える残基の数に応じて、アミノ酸残基の連結を終了する工程
を含む方法に関する。
【００４７】
固相に結合させた１番目のアミノ酸Ｚは、任意のアミノ酸であってよい。例えば、Ｚとしては、リジン、オルニチンまたはアルギニンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４８】
合成が終了した後、固相から多量体を遊離させてもよい。
【００４９】
例えば、ペプチド配列ＲＧＲＫＫＸＸＲＲ（配列番号３６）を作製するために、上記の工程を実施すると、下記のダイマーが合成される。イタリック太字で示すリジン（Ｋ）残基は、合成時にＬｙｓ（Ｆｍｏｃ）が組み込まれた位置を示す。
【化３】
この合成方法では、残基Ｚおよびリジン残基を２つのモノマー単位が共有している。
具体的には、ＸがＶで、ＺがＫである場合、下記のダイマーが合成される。このダイマーは、（配列番号４４）２ＫＫで表されるＶ２ダイマーである。
【化４】
【００５０】
上記の方法を拡張し、さらなる多量体を合成してもよい。例えば、さらなる多量体を合成するために拡張した方法は、工程（iv）の後に、
（iv）（ａ）連結させた２番目のリジン残基に、保護基を有するリジン残基をさらに連結する工程；
（iv）（ｂ）（iv）（ａ）で連結させたリジン残基から保護基を除去する工程；および
（iv）（ｃ）工程（iv）（ａ）および（iv）（ｂ）を繰り返し行う工程、または
（iv）（ｄ）工程（v）および（vi）に進む工程
をさらに含む。
【００５１】
この拡張した方法により、先の方法で合成される多量体から繰り返し単位数が２の累乗倍に増加した多量体を合成できる。この拡張した方法により、４量体、８量体、１６量体、３２量体、６４量体などが形成される。この拡張した方法において追加された工程を１回実施することによって、下記に示すようなテトラマーが合成される。ＸがＶで、ＢおよびＺがＫである場合、得られるテトラマーはＶ２−テトラマーとして公知である。このＶ２テトラマーの繰り返し単位はＲＧＲＫＶＶＲＲ（配列番号４４）である。
【化５】
【００５２】
さらに、この拡張した方法において追加された工程を２回繰り返すことによって、オクタマーが合成される。本発明の多量体は、末端のＫ残基を含まなくてもよい。
【００５３】
上記のように製造される多量体は、多量体内で１種類のペプチドモノマー単位が繰り返されているホモ多量体である。本発明のペプチド多量体は、ホモダイマー、ホモテトラマーなど、いかなるホモ多量体であってもよい。
【００５４】
さらに、上記の製造方法を拡張して、多量体内に異なるペプチド単位が存在するヘテロ多量体を製造してもよい。ホモ多量体を製造する場合、保護基を有するアミノ酸Ｂは、同一の保護基で保護されている側鎖を少なくとも２つ有する。しかし、ヘテロ多量体（例えばヘテロダイマー）を製造する際には、異なる保護基を有するアミノ酸Ｃを用いてもよい。アミノ酸Ｃにおいては、鎖の伸長に利用できる側鎖が、少なくとも２種類の異なる保護基で保護されている。この場合、第１の保護基を除去して、少なくとも１つの第１の反応側鎖からペプチド鎖を伸長させてもよい。第１のペプチド鎖を伸長させた後、別の保護基を除去して、少なくとも１つの第２の反応側鎖から続けて鎖を伸長させてもよい。このようにして、第１のペプチド鎖と第２のペプチド鎖が異なるアミノ酸配列を有していてもよい。
【００５５】
本発明は、別の態様において、式［（Ｕ１）（Ｕ２）］ｎ／２（Ｃ）ｎ／２ＢｍＺ（式中、Ｕ１およびＵ２はそれぞれペプチドを含み、Ｕ１≠Ｕ２かつｎ＝２ｘであり、ｘ＝０または正の整数であり、ｍ＝１または０である）で表されるペプチド多量体を製造する方法であって、
（i）少なくとも１つの固相を準備する工程；
（ii）固相に少なくとも１つの１番目のアミノ酸Ｚを結合させる工程；
（iii）必要に応じて、固相に結合させたＺにアミノ酸Ｂを少なくとも１つ連結する工程；
（iv）ＺまたはＢに、異なる保護基で保護された基を少なくとも２つ含むアミノ酸Ｃを少なくとも１つ連結する工程；
（v）連結させたアミノ酸Ｃから第１の保護基を除去して、第１の反応側鎖を露出させる工程；
（vi）Ｃの第１の反応側鎖から、第１のペプチドＵ１の鎖を伸長させる工程；
（vii）連結させたアミノ酸Ｂから第２の保護基を除去して、少なくとも１つの第２の反応側鎖を露出させる工程；および
（viii）Ｃの第２の反応側鎖から、第２のペプチドＵ２の鎖を伸長させる工程
を含む方法に関する。
【００５６】
このようにして、ヘテロペプチド多量体を製造してもよい。
任意で実施できる工程（ii）を省略すると、ヘテロダイマーが形成される。任意で実施できる工程（ii）を１回行うと、ヘテロテトラマーを製造することができる。工程（ii）を適宜繰り返すことにより、その他のヘテロ多量体を製造することができる。
【００５７】
本発明は、別の態様において、式［（Ｕ１）（Ｕ２）］ｎ／２（Ｃ）ｎ／２ＢｍＺ（式中、Ｕ１およびＵ２はペプチド配列を含み、Ｕ１≠Ｕ２であり、ＣおよびＢはそれぞれ、アミン基を少なくとも２つ有するアミノ酸を包含し、Ｚは任意のアミノ酸を包含し、ｎ＝２ｘであり、ｘ＝０または正の整数であり、ｍ＝１または０である）で表される単離ペプチド多量体に関する。
Ｃ、ＢおよびＺとしては、リジン（Ｋ）、オルニチンまたはアルギニン（Ｒ）が挙げられるが、これらに限定されない。
具体的には、Ｕ１またはＵ２はそれぞれ、配列番号２を含むペプチド、またはそのフラグメントもしくは変異体であってよい。
Ｕ１は、配列番号１〜５８のいずれかを含んでもよいが、これらに限定されない。
Ｕ２は、配列番号１〜５８のいずれかを含んでもよいが、これらに限定されない。
ｎ＝２かつｍ＝１である場合、多量体は、式［（Ｕ１）（Ｕ２）］ＣＺで表されるヘテロダイマーである。
【００５８】
例えば、Ｕ１はＲＧＲＫＶＶＲＲ（配列番号４４）を含んでもよく、Ｕ２はＲＧＲＫＶＶＲＲＶＶ（配列番号４６）を含んでもよく、ＣおよびＺはＫであり、ｍ＝０、かつｎ＝２である。このとき、上記ヘテロダイマーは、下記の構造を含む。
【化６】
例えば、Ｕ１はＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号５４）を含んでもよく、Ｕ２はＶＶＶＶ（配列番号５５）を含んでもよく、ＣおよびＺはＫであり、ｍ＝０、かつｎ＝２である。このとき、上記ヘテロダイマーは、以下の構造を含む。
【化７】
例えば、Ｕ１はＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号５４）を含んでもよく、Ｕ２はＹＹＹＹ（配列番号５６）を含んでもよく、ＣおよびＺはＫであり、ｍ＝０、かつｎ＝２である。このとき、上記ヘテロダイマーは、以下の構造を含む。
【化８】
ｎ＝４かつｍ＝１である場合、上記ヘテロ多量体はヘテロテトラマーである。このヘテロマーは、式［（Ｕ１）（Ｕ２）］２（Ｃ）２Ｂ１Ｚで表すことができる。
【００５９】
本発明の方法を拡張し、トリマーなど他のペプチド多量体を合成してもよい。ホモトリマーおよびヘテロトリマーのいずれも合成できる。
【００６０】
式Ｕ３Ｕ２ＣＵ１Ｚ（式中、Ｕ１、Ｕ２およびＵ３はそれぞれペプチドを含み、Ｃは、アミン基を少なくとも２つ含むアミノ酸を包含し、Ｚは任意のアミノ酸を包含する）で表されるペプチドトリマーを製造する方法であって、
（i）少なくとも１つの固相を準備する工程；
（ii）固相に少なくとも１つの１番目のアミノ酸Ｚを結合させる工程；および
（iii）Ｚから、ペプチドＵ１の鎖を伸長させる工程
を含む方法。
ただし、
（Ａ）前記ペプチドトリマーが、式Ｕ３Ｕ２（Ｃ）Ｕ１Ｚで表されるヘテロペプチドである場合、
前記方法は、
（iv）ペプチドＵ１のアミノ酸に、異なる保護基を有するアミノ酸Ｃを連結する工程；
（v）連結させたアミノ酸Ｃから第１の保護基を除去する工程；
（vi）アミノ酸Ｃから、ペプチドＵ２の鎖を伸長させる工程；
（vii）連結させたアミノ酸Ｃから第２の保護基を除去する工程；および
（viii）アミノ酸Ｃから、ペプチドＵ３の鎖を伸長させる工程
をさらに含み、
（Ｂ）Ｕ２＝Ｕ３＝Ｕ１かつＣ＝Ｂであり、前記ペプチドトリマーが式（Ｕ１）２ＢＵ１Ｚを含む場合、
前記方法は、
（iv）ペプチドＵ１のアミノ酸に、保護基を有するアミノ酸Ｂを連結する工程；
（v）連結させたアミノ酸Ｂから保護基を除去する工程；および
（vi）アミノ酸Ｂから、２つのペプチドＵ１の鎖を伸長させる工程
をさらに含み、
（Ｃ）Ｕ２＝Ｕ３≠Ｕ１かつＣ＝Ｂであり、前記ペプチドトリマーが式（Ｕ２）２Ｂ（Ｕ１）Ｚを含む場合、
前記方法は、
（iv）ペプチドＵ１のアミノ酸に、保護基を有するアミノ酸Ｂを連結する工程；
（v）連結させたアミノ酸Ｂから保護基を除去する工程；および
（vi）アミノ酸Ｂから、少なくとも２つのペプチドＵ２の鎖を伸長させる工程
をさらに含む。
上記（Ａ）および（Ｃ）の場合には、ヘテロペプチドトリマーを製造することができる。上記（Ｂ）の場合には、ホモペプチドトリマーを製造することができる。
【００６１】
本発明は、別の態様において、式Ｕ３Ｕ２ＣＵ１Ｚ（式中、Ｕ１、Ｕ２およびＵ３はそれぞれペプチド配列を含み、Ｃは、アミン基を少なくとも２つ有するアミノ酸を包含し、Ｚは任意のアミノ酸を包含する）で表される単離ペプチドトリマーに関する。具体的には、このペプチドはアミノ酸Ｃで分岐している。
このとき、上記単離ペプチドトリマーは、下記の構造を含む。
【化９】
Ｃ、ＢおよびＺとしては、リジン（Ｋ）、オルニチンまたはアルギニン（Ｒ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６２】
具体的には、Ｕ１、Ｕ２またはＵ３はそれぞれ、配列番号２またはそのフラグメントもしくは変異体を含んでもよい。
例えば、Ｕ１、Ｕ２またはＵ３はそれぞれ、配列番号１〜５８のいずれかを含んでもよい。ヘテロペプチドトリマーである場合、２つのペプチドが同一の配列を含み、第３のペプチドがそれとは異なる配列を有してもよい。
ヘテロペプチドトリマーＵ３Ｕ２ＣＵ１Ｚにおいて、Ｕ１、Ｕ２およびＵ３はそれぞれ異なるペプチド配列であってもよいが、そうでなくてもよい。例えば、Ｕ１およびＵ２が同一の配列を含み、Ｕ３がそれとは異なる配列を含んでいてもよい。また、Ｕ１およびＵ３が同一の配列を含み、Ｕ２もそれと同一の配列を有してもよい。
Ｕ２＝Ｕ３≠Ｕ１かつＣ＝Ｂである場合、上記ペプチドは式（Ｕ２）２ＢＵ１Ｚで表される。
Ｕ１＝Ｕ３≠Ｕ２である場合、上記ペプチドは式Ｕ１Ｕ２ＣＵ１Ｚで表される。
Ｕ１＝Ｕ２≠Ｕ３である場合、上記ペプチドは式Ｕ３Ｕ１ＣＵ１Ｚで表される。
ただし、Ｕ１＝Ｕ２＝Ｕ３かつＣ＝Ｂである場合、上記ペプチドは式（Ｕ１）２ＢＵ１Ｚで表されるホモペプチドトリマーとなる。
ヘテロペプチドトリマーおよびその合成の一例を図８に示し、実施例１Ｄに記載する。
【００６３】
従って、本発明は、式Ｕ３Ｕ２ＫＵ１Ｋ（式中、Ｕ１はＲＲＶＶＫＲＧＲ（配列番号５７）を含み、Ｕ２はＲＧＲＫＶＶＲＲ（配列番号４４）を含み、Ｕ３はＲＧＲＫＶＶＲＲＶＶ（配列番号４６）を含む）で表される単離ペプチドトリマーに関する。このヘテロトリマーはＶ２Ｖ２Ｖ４−ヘテロトリマーであり、下記の構造を有する。
【化１０】
【００６４】
本発明の多量体は、抗菌性を有する。従って、本発明の多量体は、微生物の増殖を阻害および／または抑制するために用いることができる。
【００６５】
また本発明は、微生物を本発明の少なくとも１つの多量体と接触させることを含む、微生物の増殖を阻害および／または抑制する方法を提供する。
【００６６】
また本発明は、対象に本発明の少なくとも１つの多量体を投与することを含む、少なくとも１つの微生物感染症を治療する方法を提供する。さらに本発明は、対象に本発明の少なくとも１つの多量体を投与することを含む、対象における少なくとも１種の微生物の増殖を阻害および／または抑制することを提供する。
前記微生物は、ウイルス、真菌、細菌のいずれであってもよい。
【００６７】
従って、本発明は、抗菌組成物の製造のための、本発明の任意の態様による多量体の使用にも関する。前記抗菌組成物は、例えば対象における、少なくとも１種の微生物の増殖を阻害および／または抑制するために用いることができる。
【００６８】
また本発明は、少なくとも１つの微生物感染症を治療する医薬品を製造するための、本発明の任意の態様による多量体の使用を包含する。
【００６９】
従って、本発明の多量体は、抗菌組成物および／または医薬組成物としてもよい。本発明の抗菌組成物および／または医薬組成物は、外用、経口投与用、非経口投与用または吸入用の製剤にすることができる。また本発明の多量体は、点眼用の組成物および／もしくは液剤ならびに／またはコンタクトレンズ用液剤に製剤化することができる。
【００７０】
また本発明の多量体は、器具のコーティングのための組成物としてもよい。前記器具としては、カテーテル、針、シース、ステント、包帯などの医療器具が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７１】
また本発明は、キットも包含するが、このキットとは、本発明の少なくとも１つの多量体、本発明の少なくとも１つの多量体を含む少なくとも１つの抗菌組成物および／または医薬組成物を含むものを言う。
【００７２】
これまで、本発明について一般的な説明をしてきたが、下記の実施例を参照することにより同じ内容をより容易に理解できるであろう。ただし、下記の実施例は、例示の目的で記載されているものであり、本発明を何ら限定するものではない。
【実施例】
【００７３】
具体的記載のない、当技術分野において公知の標準的な分子生物学手法については、概してＳａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２００１）に記載の手法に従った。
【００７４】
実施例１：多量体の固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）法
（Ａ）ホモダイマーの合成
以下のペプチドの合成方法は、Ｋｒａｊｅｗｓｋｉら（２００４）の方法を改変したものである。フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基で保護されたＬ−アミノ酸および樹脂は、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社（ＡＡＰＰＴＥＣ社）（ケンタッキー州、米国）から購入し、側鎖保護基、すなわちＬｙｓ（Ｆｍｏｃ）、Ａｒｇ（ｐｂｆ）、Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、Ｔｙｒ（Ｂｕｔ）、Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）およびＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｗａｎｇ樹脂（置換率０．７２ｍｍｏｌ／ｇ）と共に使用した。ただしＬｙｓ（Ｆｍｏｃ）は、ダイマーの合成において、Ｃ末端から２番目の残基としてのみ組み込んだ。ダイマーの合成は、Ａｐｅｘ ３９６（Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｍＴｅｃｈ社）を用いてＦｍｏｃ法により行った。
【００７５】
市販のＦｍｏｃ−Ｂｏｃ−Ｌｙｓ−Ｗａｎｇ樹脂を出発点として用いた。あるいは、０．５Ｍ ＤＩＣ（Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド）を用いて、１番目のアミノ酸をＷａｎｇ樹脂へ結合させた。続くカップリング反応（またはアシル化反応）は、ＮＭＰ中、０．５Ｍ ＨＢＴＵ／０．５Ｍ ＨＯＢＴ／２Ｍ ＤＩＥＡを用いて行った。別法として、ＤＭＦ中、ＨＢＴＵ−ＨＯＢＴを用いて、合成スケール０．０８ｍｍｏｌでカップリング反応を行ってもよい。Ｆｍｏｃ基の除去は、ＤＭＦ中、２０％ピペリジンを用いて行った。
【００７６】
反応に用いた樹脂を、ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）９０％、フェノール５．０％、水１．５％、ＴＩＳ（トリイソプロピルシラン）１．０％、ＥＤＴ（エタンジオール）２．５％を含む試薬で処理し、多量体を遊離させた。別法として、ＴＦＡ／ＴＩＳ／フェノール／チオアニソール（Ｔｈｉｏｎｉｓｏｌｅ）／水（９０／１／２．５／５／１．５（容量パーセント比））からなる混合液を新たに調製し、これを用いて、反応で得られたペプチド結合樹脂を室温で２〜３時間処理してもよい。
【００７７】
次いで、このペプチド粗生成物をろ過した後、氷冷したジエチルエーテルに注いで沈殿させ、沈殿物を遠心分離して氷冷したエーテルで３回洗浄し、真空下室温で乾燥させた、または固形の粗生成物中に含まれるエーテルや他の残存溶媒をドラフト内で自然に蒸発させて乾燥させた。沈殿物をエーテルから直接乾燥させることにより、ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）塩が得られた。ＴＦＡ塩は、ペプチド溶液のｐＨや培養中の細胞の生存率に影響を与える可能性がある。ＴＦＡ塩は、２％酢酸を２ｍｌ加えて凍結乾燥させると酢酸塩に変換されるため、これにより、他のペプチドの取扱いが容易になり、極微量のスカベンジャーを除去することができる。
この合成方法のスキームを図２に示す。
【００７８】
上記のＳＰＰＳ法によって、ダイマーの粗生成物および精製ダイマーが高収率で得られるだろう。例えば、Ｖ２ダイマーの粗生成物および精製Ｖ２ダイマーの収率は、それぞれ９０％および２７％である。０．０８ｍｍｏｌの合成スケールでは、５０ｍｇの精製Ｖ２ダイマーが得られるだろう。
【００７９】
上述した方法は合成方法の一例であって、これに変更を加えてもよい。例えば、このＳＰＰＳ法では、アミノ酸残基の保護や脱保護にいかなる方法を用いてもよい。
【００８０】
（Ｂ）ホモテトラマーの合成
上記の合成方法を拡張して、図９に示すようなホモテトラマーを合成してもよい。
【００８１】
固相化ＮＨ２−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）に連結したＦｍｏｃ−Ｌｙｓを脱保護した後、このリジンに２つのＦｍｏｃ−Ｌｙｓ残基を連結した。アミノ酸鎖のさらなる伸長を行うことにより、図に示すようなホモテトラマー（Ｖ２テトラマー）を合成した。脱保護反応（工程i）、カップリング反応（工程ii）および鎖の伸長反応の各条件は、ホモダイマーの合成と同様であった。
【００８２】
（Ｃ）ヘテロダイマーの合成
図７に示すヘテロダイマーの合成においては、異なる保護基で保護されたアミノ酸Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）−ＯＨを分岐点として用いてヘテロダイマーを合成した。Ｆｍｏｃ基とＡｌｏｃ基の反応性は異なり、Ｆｍｏｃ基の除去に用いられる塩基条件下では、Ａｌｏｃ基は安定である。
【００８３】
固相化Ｆｍｏｃ−ＮＨ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｗａｎｇ樹脂の脱保護は、上記と同様にして行った。
【００８４】
次いで、図７に示すように、Ｗａｎｇ樹脂に結合しているリジン残基にＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）−ＯＨを連結した（カップリング工程ii）。Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）からＦｍｏｃ基のみを除去し（Ｆｍｏｃ脱保護）、第１の鎖の伸長を行った（工程iii）。第１の鎖のアミノ酸残基がすべて連結した（すなわち、第１の鎖が完成した）ところで、Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）のＡｌｏｃ基をパラジウム触媒を用いて除去し（Ａｌｏｃ脱保護）、第２の鎖の伸長を行った。第２の鎖のアミノ酸残基がすべて連結した（すなわち、第２の鎖も完成した）後、酸分解により生成物を遊離させた。アミノ酸残基の反応基を保護するために合成時に必要に応じて使用した保護基（例えば、Ｂｏｃ、ｐｂｆ、Ｍｔｒ）が残っている場合は、それらをすべて除去した。
【００８５】
（Ｄ）ヘテロペプチドトリマーの合成
ヘテロペプチドトリマーの合成例を図８に示す。固相化リジン（Ｋ）残基から、まずＲＧＲＫＶＶＲＲ（配列番号５７）で表される第１のペプチド（Ｕ１）を伸長させる。次いで、ペプチドＲＧＲＫＶＶＲＲのＮ末端にあるＲ残基にＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）−ＯＨを連結する。次いで、Ｆｍｏｃ基を除去して、Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）残基の第１のアミン基に、鎖の伸長反応により、ＲＧＲＫＶＶＲＲ（配列番号４４）で表される第２のペプチド（Ｕ２）を加える。第２の鎖を伸長させた後、Ａｌｏｃ基を除去して、リジン残基の第２のアミン基に、鎖の伸長反応により、ＲＧＲＫＶＶＲＲＶＶ（配列番号４６）で表される第３のペプチド（Ｕ３）を加える。
【００８６】
あるいは、第１のペプチドＵ１を伸長させた後、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨを加えて、ペプチドＵ２を２つ同時に伸長させ、ヘテロトリマーＵ２Ｕ２（Ｋ）Ｕ１Ｋを形成させることもできる。
【００８７】
ホモペプチドトリマーに関しては、ペプチドＵを伸長させた後、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨを用いて、同一のペプチドＵを２つ同時に伸長させ、ホモトリマーを形成させることもできる。
【００８８】
実施例２：抗菌アッセイ
抗菌ペプチドの抗菌活性の試験方法として、以下に示す絶対的殺菌の手法を用いた。
【００８９】
試験微生物の調製
試験微生物として、米国培養菌保存施設（ＡＴＣＣ）から入手した基準培養菌、またはシンガポール総合病院病理部（ｔｈｅ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ）から入手した臨床分離株を用いた。試験に使用する培養菌はすべて、ストックからの継代数が５代以下のものとした。
【００９０】
細菌はトリプチケースソイ寒天（ＴＳＡ）斜面培地で、酵母はサブローデキストロース寒天（ＳＤＡ）斜面培地で、３５℃で１６時間培養して増殖させた。増殖した微生物を遠心分離により回収し、２０℃にて、米国薬局方（ＵＳＰ）規格リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で２回洗浄した。
【００９１】
試験微生物
以下の微生物を試験に使用した。
１．セレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）ＡＴＣＣ １１７７８
２．カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）ＡＴＣＣ １０２３１
３．緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）臨床分離株
ＰＡＥ２３０ ＤＲ４８７７／０７、唾液由来
４．緑膿菌臨床分離株ＰＡＥ２３９ ＤＭ５７９０／０７、創傷由来
５．緑膿菌臨床分離株ＰＡＥ２４０ ＤＵ１４４７６／０７、尿由来
６．緑膿菌臨床分離株ＰＡＥ２４９ ＤＭ１５０１３、創傷由来
７．緑膿菌臨床分離株０７ＤＭ０２３２５７、眼由来
８．緑膿菌臨床分離株０７ＤＭ０２３３７６、眼由来
９．緑膿菌臨床分離株０７ＤＭ０２３１５５、眼由来
１０．緑膿菌臨床分離株０７ＤＭ０２３１０４、眼由来
１１．緑膿菌ＡＴＣＣ ９０２７
１２．緑膿菌ＡＴＣＣ ２７８５３
１３．大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＡＴＣＣ ２５９２２
１４．大腸菌臨床分離株ＤＢ１６０２７、血液由来
１５．大腸菌臨床分離株ＤＵ４６３８１Ｒ、尿由来
１６．メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）ＤＭ０９８０８Ｒ、眼由来
１７．黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）臨床分離株
ＤＭ４００１、眼由来
１８．カンジダ・アルビカンス臨床分離株ＤＦ２６７２Ｒ、尿由来
１９．フザリウム・ソラニ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ）ＡＴＣＣ ３６０３１
【００９２】
化合物試験液の調製
凍結乾燥した抗菌化合物を精製水に溶解し、１，０００μｇ／ｍｌの濃度に調製してスクリューキャップ付プラスチックチューブに分注した。これをストック液として−２０℃で保存した。
【００９３】
試験当日、ストック液のチューブを１本解凍し、精製水で希釈して５００μｇ／ｍｌの濃度に調製した。次いで、ＵＳＰ規格リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）またはその他の溶液（例えば１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）、１０ｍＭカリウム緩衝液（ｐＨ７．２）または１５５．２ｍＭ ＮａＣｌが挙げられるが、これらに限定されない）を用いてさらに希釈を行い、必要な試験濃度に調製した。試験濃度は通常６．２５〜５０μｇ／ｍｌである。
【００９４】
標準的な濃度に調製した１０μｌの試験微生物液を、所定の試験濃度に調製した１ｍｌの化合物試験液に接種し、最終的な微生物数が可能な限り１×１０５〜１×１０６ｃｆｕ／ｍｌとなるようにした。次いで、菌を接種した試験液を３５℃で４時間インキュベートした。インキュベーションの温度および時間は必要に応じて変更してよい。
【００９５】
インキュベーション後、試験液をＤ／Ｅ Ｎｅｕｔｒａｌｉｓｉｎｇ Ｂｒｏｔｈ（ＮＢ）で１０倍に希釈して、抗菌作用を失わせた。さらにＮＢで希釈して、この希釈液を、細菌の場合はＴＳＡプレート培地に、酵母の場合はＳＤＡプレート培地に塗布した。これらのプレートを３５℃で７２時間インキュベートした後、各微生物の生菌数を求めた。
【００９６】
上記試験と並行して、試験液の代わりに、試験液の調製に使用した緩衝液に試験微生物を接種して接種コントロールとし、上記試験と同様の条件でインキュベーションを行った。接種コントロールの生菌数も上記試験と同様にして求めた。
【００９７】
化合物の抗菌活性は、試験微生物の接種コントロールにおけるコロニー形成単位（ｃｆｕ）の対数値から、３５℃で４時間化合物と接触した後に生存している試験微生物のｃｆｕの対数値を減算して得られる対数減少値で表した。
【００９８】
実施例３〜７にも上記の方法を用いた。具体的には、実施例６におけるゲンタマイシンに対するアッセイ方法は、抗菌化合物の代わりにゲンタマイシンを用いたという点を除いて上記の方法と同様である。
【００９９】
実施例３：緑膿菌ＡＴＣＣ ９０２７に対するＶ２ダイマーの抗菌活性
Ｖ２ダイマーの抗菌性を緑膿菌ＡＴＣＣ ９０２７を用いて調べた。
【０１００】
Ｖ２ダイマーは、ＵＳＰ規格リン酸緩衝液（米国薬局方に従い調製したもの）中、生理的ｐＨ値であるｐＨ７．２において、緑膿菌ＡＴＣＣ ９０２７に対する抗菌活性を示す。この抗菌活性は効果が高く、細菌数の大幅な減少が見られた（表１を参照）。接種した細菌の量は〜１０７個であったが、１２．５μｇ／ｍｌのＶ２ダイマーと４時間接触させることにより、溶液はほぼ殺菌された。
【表１】
【０１０１】
上記で使用したＵＳＰ規格緩衝液の塩溶液は生理的条件に比べて薄いため、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）を使用して、生理的な塩条件におけるＶ２ダイマーの抗菌活性も調べた。Ｖ２ダイマーは、生理的な塩濃度においても、緑膿菌ＡＴＣＣ ９０２７に対して高い抗菌活性を維持していた（表２）。
【表２】
【０１０２】
さらに、１５５．２ｍＭ ＮａＣｌを用いて、高塩濃度条件下におけるＶ２ダイマーの抗菌活性も調べた。その結果、１２．５〜５０μｇ／ｍｌのＶ２ダイマーは、高塩濃度において抗菌活性を示すことが分かった。
【表３】
【０１０３】
実施例４：ｈＢＤ３由来ペプチドモノマーとＶ２ダイマーとの比較
上述したｈＢＤ３由来の１０アミノ酸からなるペプチドモノマー（ＷＯ２００７／１２６３９２）の緑膿菌ＡＴＣＣ ９０２７に対する抗菌活性も調べた。
ＵＳＰ規格リン酸緩衝液を用いてＶ２、Ｌ２、Ｃ２、Ｆ２およびＨ２モノマーの抗菌性を調べたものを表４に示す。
【表４】
注：対数減少値０．５は、６８％の細菌が死滅したことを示す；対数減少値１は、９０％の細菌が死滅したことを示す；対数減少値２は、９９％の細菌が死滅したことを示す；対数減少値３は、９９．９％の細菌が死滅したことを示す。
【０１０４】
表１のＶ２ダイマーの結果と表４のＶ２モノマーの結果とを比較すると、Ｖ２ダイマーはＶ２モノマーよりはるかに高い殺菌効率を示すことがわかる。Ｖ２ダイマーは、１２．５μｇ／ｍｌの濃度で４時間菌に接触させた場合、対数減少値が６を超えていたが（表１）、これに対してＶ２モノマーは、１２．５μｇ／ｍｌの濃度での対数減少値が３．２３であり、５０μｇ／ｍｌの濃度でも３．９７に過ぎなかった（表４）。
【０１０５】
実施例５：緑膿菌の臨床分離株に対するＶ２ダイマーの抗菌活性
唾液、創傷、尿および眼に由来する複数の緑膿菌の臨床分離株に対しても、Ｖ２ダイマーの抗菌活性を調べた。Ｖ２ダイマーは、これらの臨床分離株に対しても抗菌活性を示す（表５〜８を参照）ことから、実際の臨床試料に対してもＶ２ダイマーを効果的に使用できることが示唆される。
【表５】
【０１０６】
【表６】
【０１０７】
【表７】
【０１０８】
【表８−１】
【表８−２】
【０１０９】
１０ｍＭリン酸緩衝液を用いた生理的な塩条件下における、臨床分離株に対するＶ２ダイマーの抗菌活性も調べた。Ｖ２ダイマーは、反復試験において、眼由来の臨床分離株（表９Ａ、９Ｂおよび９Ｃ）、ならびに創傷由来、唾液由来および尿由来の臨床分離株（表１０Ａおよび１０Ｂ）に対して抗菌活性を示した。このことから、生理的条件下においてもＶ２ダイマーを臨床分離株に対して使用できることが示唆される。
【表９】
【０１１０】
【表１０】
【０１１１】
実施例６：Ｖ２ダイマーとゲンタマイシンの抗菌活性の比較
緑膿菌の臨床分離株に対するＶ２ダイマーとゲンタマイシンの抗菌活性を比較した。
【０１１２】
第１の試験では、Ｖ２ダイマーとゲンタマイシンのいずれについても、創傷由来および唾液由来の臨床分離株に対してアッセイを行い、両者を比較した（表５を参照）。この試験から、創傷由来の分離株に対しては、Ｖ２ダイマーはゲンタマイシンと同等の活性を有することが分かった。唾液由来の分離株に対しては、Ｖ２ダイマーの方が高い抗菌活性を示した。
【表１１】
【０１１３】
第２の試験では、Ｖ２ダイマーとゲンタマイシン双方の、尿由来および唾液由来の臨床分離株に対する抗菌活性を調べて、両者を比較した（表６を参照）。Ｖ２ダイマーは、これら２種の分離株に対してもゲンタマイシンと同等の活性を示した。
【表１２】
【０１１４】
第３の試験では、Ｖ２ダイマーとゲンタマイシン双方の、眼由来の臨床分離株に対する抗菌活性を調べて、両者を比較した（表１３を参照）。この試験から、Ｖ２ダイマーとゲンタマイシンは眼由来の緑膿菌臨床分離株に対して同等の活性を有することがわかる。
【表１３】
【０１１５】
上記の試験結果をまとめると、Ｖ２ダイマーとゲンタマイシンは同等の抗菌活性を有しており、Ｖ２ダイマーは微生物に対してゲンタマイシンと同等の効果を発揮するものとして使用できることが示唆される。
【０１１６】
実施例７：その他の微生物に対するＶ２ダイマーの抗菌活性
（Ａ）カンジダ・アルビカンスＡＴＣＣ １０２３１
カンジダ・アルビカンスＡＴＣＣ １０２３１に対するＶ２ダイマーの抗菌活性を調べた。７．２×１０５ＣＦＵのカンジダ・アルビカンスを含むＵＳＰ規格リン酸緩衝液を、種々の濃度に調製したＶ２ダイマーと混合し、３５℃で４時間インキュベートした。その結果、５０、２５および１２．５μｇ／ｍｌの濃度におけるＶ２ダイマーのカンジダ・アルビカンスＡＴＣＣ １０２３１に対する対数減少値は３．６〜４であった（表１４）。
【表１４】
【０１１７】
（Ｂ）セレウス菌ＡＴＣＣ １１７７８
セレウス菌ＡＴＣＣ １１７７８に対するＶ２ダイマーの抗菌活性を調べた。Ｖ２ダイマーは、セレウス菌に対して抗菌活性を示した（表１５）。
【表１５】
【０１１８】
（Ｃ）大腸菌臨床分離株ＤＢ００１６０２７Ｒ
さらに、Ｖ２ダイマーは、ゲンタマイシン、アンピシリンなどの抗生物質に対して耐性を有する薬剤感受性パターンを示す大腸菌の多剤耐性株ＤＢ００１６０２７Ｒ（血液由来の臨床分離株）の菌数を減少させることが可能であった。
【表１６】
【０１１９】
Ｖ２ダイマーがカンジダ・アルビカンスやその他の細菌に対する抗菌性を有することは、有効な広域スペクトル抗菌剤としてのＶ２ダイマーの可能性を示唆している。さらにＶ２ダイマーが大腸菌の多剤耐性株に対して効果を有することは、他の抗生物質が使用できない微生物に対する有効な治療薬としてのＶ２ダイマーの可能性を示唆している。
【０１２０】
実施例８：Ｖ２ダイマーの細胞毒性
ＷＯ２００７／１２６３９２に記載の方法に従って、ヒト結膜細胞に対するＶ２ダイマーの毒性を調べ、野生型ｈＢＤ３と比較した。図４から、Ｖ２ダイマーのヒト結膜細胞に対する毒性は野生型ｈＢＤ３より低いことが分かる。野生型ｈＢＤ３は、およそ１５μｇ／ｍｌの濃度で細胞毒性を示したが、Ｖ２ダイマーは１００μｇ／ｍｌの濃度でも細胞毒性を示さなかった。Ｖ２ダイマーの細胞毒性プロファイルは、ＷＯ２００７／１２６３９２に記載のモノマーペプチドと同等であった。
【０１２１】
Ｖ２ダイマーはヒト結膜細胞に対する毒性が低く、抗菌活性が高いことから、宿主における微生物感染症の治療および／または微生物の増殖抑制の目的で、Ｖ２ダイマーを宿主に対して使用できることが示唆される。ＷＯ２００７／１２６３９２に記載の他のペプチドダイマーも同様に、高い抗菌活性と低い細胞毒性を示すと考えられる。
【０１２２】
実施例９：マクロ液体希釈法による最小阻止濃度（ＭＩＣ）の測定
米国臨床研究所規格委員会（ＮＣＣＬ）のマクロ液体希釈法を改変して、ＭＩＣを求めた。希釈には、Ｃａ２＋とＭｇ２＋を加えず、１／６の濃度に希釈したミュラーヒントンブロス（Ｍｕｅｌｌｅｒ Ｈｉｎｔｏｎ Ｂｒｏｔｈ（ＭＨＢ））を使用した。このＭＨＢ（１／６の濃度）を用いて、Ｖ２ダイマー溶液の２倍段階希釈系列を試験管に作製した。ＭＨＢ（１／６の濃度）を用いて調製した試験微生物の接種液１ｍｌを、Ｖ２ダイマーの各希釈液１ｍｌに添加し、各試験管内の終濃度が１０４〜１０５コロニー形成単位／ｍｌになるようにした。これらの試験管を３５℃で１６〜２０時間インキュベートした。試験サンプルと平行して、培地と微生物のみを含むポジティブコントロールの試験管と、培地のみを含むネガティブコントロールの試験管もインキュベートした。上記の操作を、試験微生物ごとに独立した試験として繰り返した。それぞれの臨床分離株または基準微生物に対するＶ２ダイマーペプチドのＭＩＣは、試験微生物の視認可能な増殖を阻害するペプチドの最小濃度とした。
他のペプチドのＭＩＣも求めて、ゲンタマイシンと比較した。ＭＩＣの結果を表１７〜２０に示す。
【０１２３】
【表１７】
【０１２４】
【表１８】
【０１２５】
【表１９】
【０１２６】
【表２０】
【０１２７】
参考資料
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Hoover D.M., Rajashankar K. R., Blumenthal R., Puri A., Oppenheim J. J., Chertov O. and Lubkowski J., (2000) The structure of human beta-defensin-2 shows evidence of higher order oligomerization. J. Biol. Chem. 275(42):32911-8.
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Krajewski K., Marchand C.,Long, Y-Q., Pommier, Y. and Roller, P. P. (2004) Synthesis and HIV-1 integrase inhibitory activity of dimeric and tetrameric analogs of indolicin Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters 14: 5595-5598.
National Committee for Clinical Laboratory Standards (1987) Methods for determining bactericidal activity of antimicrobial agents by National Committee for Clinical Laboratory Standards (Villanova, PA).
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WO 2007/126392
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗菌性を有するペプチドの新規多量体に関する。また本発明は、前記多量体の製造方法に関する。本発明は、広範囲の微生物の増殖を阻害するための、前記多量体の使用に関する。さらに本発明は、前記ペプチドを含む組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ディフェンシンは、カチオン性の抗菌ペプチドで、自然免疫系の構成要素である。ヒトでは、アルファディフェンシンは好中球または消化管のパネート細胞によって、ベータディフェンシンは上皮細胞によって産生される。ディフェンシンは、グラム陰性菌、グラム陽性菌、一部の真菌類やエンベロープウイルスなどの広範囲の微生物に対して抗菌性を有する。
【０００３】
この抗菌性の正確なメカニズムは完全にはわかっていないが、このペプチドの持つ疎水性や正味の正電荷が、微生物の細胞壁や細胞膜の相互作用やそれらの破壊に重要であると思われる。
【０００４】
複数の研究から、細菌の細胞膜において、全長型のディフェンシンが非共有結合の形態でダイマーを形成する可能性が示唆されている（Ｈｏｏｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０００；Ｈｏｏｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｓｃｈｉｂｉｌｉ ｅｔ ａｌ．，２００２）。またある研究では、ディフェンシンの二量体化が抗菌性に影響を与える可能性が示唆されている（Ｃａｍｐｏｐｉａｎｏ ｅｔ ａｌ．，２００４）。しかしながら、このダイマーの特性についての詳細な検討や解析は行われていない。
【０００５】
抗生物質に対する耐性の出現は、抗生物質の開発における障害の１つである。ディフェンシンの抗菌活性は完全には理解されていないが、現在考えられるディフェンシンの作用機序からすると、耐性が現れるまでに相当時間がかかるか、または極めて弱い耐性しか現れない可能性が示唆されており、ディフェンシンの抗菌剤としての使用は有望であると言える。しかし、ディフェンシンは、哺乳動物細胞などの宿主細胞に対して毒性を示すことも知られているため、抗菌剤としての適用は制限される可能性がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、抗菌活性が高くかつ宿主細胞に対する毒性が低い、ディフェンシンの新たなペプチド誘導体の開発が切望されている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、ｈＢＤ３由来の単離多量体（配列番号１）に関する。
ｈＢＤ３（配列番号１）
ＧＩＩＮＴＬＱＫＹＹＣＲＶＲＧＧＲＣＡＶＬＳＣＬＰＫＥＥＱＩＧＫＣＳＴＲＧＲＫＣＣＲＲＫＫ
【０００８】
第１の態様において、本発明は、式（Ｕ）ｎ（式中、Ｕは、配列番号２を含むペプチド、またはそのフラグメントもしくは変異体であり、ｎは２以上である）で表されるディフェンシンペプチドの単離多量体に関する。
配列番号２
ＧＩＩＮＴＬＱＫＹＹＸＲＶＲＧＧＲＸＡＶＬＳＸＬＰＫＥＥＱＩＧＫＸＳＴＲＧＲＫＸＸＲＲＺＺ
Ｘは任意のアミノ酸を包含し；Ｚは任意のアミノ酸を包含するか、または存在しなくてもよい。例えば、Ｚとしては、リジン、オルニチンまたはアルギニンが挙げられるが、これらに限定されない。具体的には、Ｚはリジンであってよい。
【０００９】
別の態様において、本発明は、ペプチドＵを少なくとも２つ含む単離多量体に関する。ただし、前記ペプチドＵは、配列番号２またはそのフラグメントもしくは変異体を含む。
前記多量体には、ペプチドＵの繰り返しが存在する。具体的には、繰り返し単位であるペプチドＵ同士は共有結合により連結している。さらに、ペプチドＵ同士は、少なくとも１つのアミノ酸Ｂを介して連結していてもよい。Ｂはそれぞれ、アミン基を少なくとも２つ有するアミノ酸であってよい。例えば、Ｂとしては、リジン、オルニチンまたはアルギニンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１０】
本発明の任意の多量体における繰り返し単位、すなわちペプチドＵは、ＷＯ２００７／１２６３９２に記載のいずれのペプチドであってもよい。
ペプチドＵとしては、配列番号２に由来するペプチドフラグメントなどが挙げられる。このフラグメントは、配列番号２に由来するものであれば、いかなる長さのフラグメントであってもよい。具体的には、ペプチドＵは、配列番号３またはそのフラグメントもしくは変異体を含んでもよい。
配列番号３
ＧＩＩＮＴＬＱＫＹＹＸＲＶＲＧＧＲＸＡＶＬＳＸＬＰＫＥＥＱＩＧＫＸＳＴＲＧＲＫＸＸＲＲ
Ｘは任意のアミノ酸を包含する。
多量体のペプチドＵは、＋１〜＋１１の電荷を有してもよい。
【００１１】
別の態様において、本発明は、式（Ｕ）ｎＢｍＺｊ（式中、Ｕは、配列番号３またはそのフラグメントもしくは変異体を含み、Ｂはそれぞれ、アミン基を少なくとも２つ有するアミノ酸残基を少なくとも１つ包含し、Ｚは任意のアミノ酸を包含し、ｎは２以上であり、ｍは１以上であり、ｊは０以上である）で表される単離多量体に関する。Ｂは、アミン基を少なくとも２つ有するアミノ酸を包含してもよい。具体的には、Ｂとしては、リジン、オルニチンまたはアルギニンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１２】
本発明の一態様において、（Ｕ）ｎＢｍＺｊのＢとＺはいずれもリジン（Ｋ）を包含してもよい。このとき、上記の式は（Ｕ）ｎＫｍＫｊで表される。また、さらなる態様において、ｍがｎ−１と等しくてもよく、ｊが１であってもよい。このとき、上記の多量体の式は（Ｕ）ｎＫｎ−１Ｋ（すなわち（ＵＫ）ｎ）で表される。式（Ｕ）ｎＫｍＫｊまたは（Ｕ）ｎＫｎ−１ＫにおけるペプチドＵは、配列番号３またはそのフラグメントもしくは変異体を含んでもよい。
【００１３】
本発明の多量体は、直鎖状、分岐状のいずれであってもよい。多量体（Ｕ）ｎが直鎖状である場合、ｎ回繰り返されるペプチドＵは、配列番号２またはその任意のフラグメントもしくは変異体を含んでもよい。
分岐状の多量体、例えば多量体（Ｕ）ｎＢｍＺｊに関しては、末端の残基ＢｍＺｊで分岐していてもよい。
【００１４】
本発明の多量体は、繰り返し単位であるペプチドＵを任意の数含んでもよい。例えば、前記多量体は、繰り返し単位であるペプチドＵを２〜１０個、２〜２０個、または２〜３０個含んでもよい。さらに前記多量体は、ダイマー、トリマー、テトラマー、ペンタマー、ヘキサマー、ヘプタマー、オクタマー、ノナマー、デカマーのいずれであってもよい。具体的には、ｎは偶数であってもよい。さらに具体的には、ｎは、２から始まる２の累乗倍に相当する値のいずれを包含してもよい。
【００１５】
さらに、本発明の多量体の任意のアミノ酸残基は、保護基を少なくとも１つ有するアミノ酸を包含してもよい。前記保護基は、Ｂｏｃ、Ｂｕｔ、Ｆｍｏｃ、Ｐｂｆなどを包含してもよい。
【００１６】
また本発明は、本発明の少なくとも１つの多量体を製造する方法に関する。
従って、本発明は、式（Ｕ）ｎ（式中、Ｕは、配列番号２を含むペプチド、またはそのフラグメントもしくは変異体である）で表される少なくとも１つの多量体を製造する方法であって、少なくとも２つのＵを連結することを含む方法に関する。
【００１７】
また、本発明の多量体は、組換えＤＮＡ技術により作製してもよい。本発明の多量体の全長またはその任意の一部を、組換えＤＮＡ技術により作製してもよい。例えば、複数のペプチドモノマーをそれぞれ組換えＤＮＡ法により作製し、これらを化学的手法により連結して多量体を形成させてもよい。
【００１８】
従って、本発明は、本発明の多量体の全長またはその任意の一部をコードする単離核酸分子にも関する。前記核酸分子は、ベクターに挿入してもよい。さらに、本発明の多量体の全長または任意の一部を発現させるために、前記核酸分子または該核酸分子を含むベクターを宿主細胞に導入してもよい。
【００１９】
また本発明の多量体は、化学合成法により新規合成（ｄｅ ｎｏｖｏ合成）してもよい。例えば、本発明の多量体を、本発明の固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）法により合成してもよい。
【００２０】
また本発明は、式：（Ｕ）ｎＢｍＺｊ（式中、Ｕは、配列番号３またはそのフラグメントもしくは変異体を含み、Ｂはそれぞれ、アミン基を少なくとも２つ有するアミノ酸を包含し、Ｚは任意のアミノ酸を包含し、ｎは２以上であり、ｍは１以上であり、ｊは０以上である）で表される少なくとも１つの多量体を製造する方法であって、
（i）少なくとも１つの固相を準備する工程；
（ii）固相に少なくとも１つの１番目のアミノ酸Ｚを結合させる工程；
（iii）固相に結合させた１番目のアミノ酸残基に、保護基を有するアミノ酸残基Ｂを少なくとも１つ連結する工程；
（iv）連結させた残基Ｂから保護基を除去する工程；
（v）ペプチドＵの配列に従って、保護基を有するアミノ酸残基をＣ末端からＮ末端の方向へ順に連結し、連結の都度、次の連結のために保護基を除去することによって、さらなる鎖の伸長を行う工程；および
（vi）加える残基の数に応じて、アミノ酸残基の連結を終了する工程
を含む方法に関する。
【００２１】
保護基を有するアミノ酸Ｂは、保護基で保護されている側鎖を少なくとも２つ含む。具体的には、Ｂとしては、リジン、オルニチンまたはアルギニンが挙げられるが、これらに限定されない。固相に結合させた１番目のアミノ酸Ｚとしても、同様に、リジン、オルニチンまたはアルギニンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２２】
上記の方法を拡張し、さらなる多量体を合成してもよい。例えば、さらなる多量体を合成するために拡張した方法は、工程（iv）の後に、
（iv）（ａ）連結させた残基Ｂに、保護基を有する残基Ｂをさらに連結する工程；
（iv）（ｂ）（iv）（ａ）で連結させた残基Ｂから保護基を除去する工程；および
（iv）（ｃ）工程（iv）（ａ）および（iv）（ｂ）を繰り返し行う工程、または
（iv）（ｄ）工程（v）および（vi）に進む工程
をさらに含む。
【００２３】
形成される多量体は、Ｂのアミン基の数に依存する。Ｂのアミン基の数が２である場合、例えば、Ｂがリジン（Ｋ）またはオルニチンである場合、上記の拡張した方法により、先の方法で合成される多量体から繰り返し単位数が２の累乗倍に増加した多量体を合成できる。この拡張した方法により、４量体、８量体、１６量体、３２量体、６４量体などが形成される。
【００２４】
Ｂが、３つのアミン基（２つは第一アミン基で、１つは第二アミン基である）を有するアルギニン（Ｒ）である場合、最初に形成される多量体はトリマーである。続いて形成される多量体は、アルギニンを用いる場合、繰り返し単位数が３の累乗倍に増加する。
【００２５】
多量体化する過程において、Ｂとして、リジンまたはオルニチンとアルギニンとの組み合わせ、またはその逆の順序での組み合わせを用いてもよく、このようにして繰り返し単位数の異なる多量体を合成することができる。
【００２６】
合成が終了した後、固相から多量体を遊離させてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】保護基を有するリジン残基、すなわちＬｙｓ（Ｆｍｏｃ）、ならびにＶ２モノマーおよびＶ２ダイマーの構造を示す。太字で示すリジン（Ｋ）残基は、合成時にＬｙｓ（Ｆｍｏｃ）が組み込まれた位置を示す。
【図２】固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）法によるＶ２ダイマーの合成を示す。工程（i）は、ＤＭＦ（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド）中、２０％ピペリジンを用いて保護基を除去する工程を示す。工程（ii）は、ＮＭＰ（Ｎ−メチルピロリドン）中、０．５Ｍ ＨＢＴＵ（（Ｎ−［１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル］−（ジメチルアミノ）メチレン）−Ｎ−メチルメタンアミニウム）、０．５Ｍ ＨＯＢＴ（Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール）、および２Ｍ ＤＩＥＡ（ジイソプロピルエチルアミン）を用いて行うカップリング反応の工程を示す。樹脂に結合しているリジン残基にＦｍｏｃ（Ｌｙｓ）を結合させて、工程（i）を再度行う。次いで、各鎖にアルギニン残基（Ｒ）を２個ずつ加える。工程（iii）は、０．５Ｍ ＨＢＴＵ／０．５Ｍ ＨＯＢＴ／２Ｍ ＤＩＥＡを用いて、ＳＰＰＳ法のサイクルを６回繰り返すことを含む鎖の伸長工程を示す。この工程により、Ｖ２ダイマーの残りのアミノ酸が組み込まれる。工程（iv）は、ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）９０％、フェノール５．０％、水１．５％、ＴＩＳ（トリイソプロピルシラン）１．０％およびＥＤＴ（エタンジチオール）２．５％からなる切断試薬を用いて、樹脂からダイマーを遊離させる切断工程を示す。このダイマーには、ＲＧＲＫＶＶＲＲ（配列番号４４）の繰り返しが存在する。
【図３】本発明のＳＰＰＳ法を用いて繰り返し単位数が２の累乗倍に増加した多量体を形成できることを示す。例えばダイマー、テトラマー、オクタマーなどといったようにモノマー単位数が２の累乗倍に増加する多量体を製造することができる。イタリック太字で示すリジン（Ｋ）残基は、合成時にＬｙｓ（Ｆｍｏｃ）が組み込まれた位置を示す。図３の配列は、ＲＧＲＫＶＶＲＲＫＫ（配列番号４５）およびＲＧＲＫＶＶＲＲ（配列番号４６）である。
【図４】Ｖ２ダイマーがヒト結膜上皮細胞に対する毒性を持たないことを、天然のｈＢＤ３と比較して示すグラフである。この結果は、独立で行った４回の試験により得られたものであり、各データポイントは平均と標準偏差を示す。Ｘ軸はペプチド濃度（μｇ／ｍｌ）を示し、Ｙ軸は細胞の生存率（％）を示す。
【図５】野生型ｈＢＤ３とそのＣ末端ペプチドのウサギ赤血球に対する溶血作用を示す。
【図６】野生型ｈＢＦＤ３とそのＣ末端ペプチドのヒト結膜上皮細胞に対する細胞毒性作用を示す。
【図７】ヘテロダイマーの製造方法の一例を示す。図７の配列は、ＲＧＲＫＶＶＲＲ（配列番号４４）およびＲＧＲＫＶＶＲＲＶＶ（配列番号４６）である。
【図８】ヘテロテトラマーの製造方法の一例を示す。図８の配列は、ＲＲＶＶＫＲＧＲＫ（配列番号５８） ＲＧＲＫＶＶＲＲ（配列番号４４）およびＲＧＲＫＶＶＲＲＶＶ（配列番号４６）である。
【図９】ホモテトラマーの製造方法の一例を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
定義
ペプチド配列中または式中にＸが存在する場合、Ｘは任意のアミノ酸を示す。任意のアミノ酸には、保護基を有するシステイン残基が含まれ、例えばＣ（Ａｃｍ）、Ｃ（Ｂｕｔ）、Ｃ（Ｃａｍ）、Ｃ（ｔ−Ｂｕｔｈｉｏ）、Ｃ（Ｂｚｌ）、Ｃ（４−ＭｅＯ−Ｂｚｌ）、Ｃ（Ｍｍｔ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２９】
ペプチドまたは多量体の変異体とは、多量体のペプチド配列が変異したものを意味し、このペプチド配列においては、１以上のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていてもよい。この置換は、通常、類似の特性を有するアミノ酸による保存的置換である。この変異体は、通常、＋１〜＋１１の正味電荷を保持しており、通常、活性を有し、十分な抗菌性と低い細胞毒性を示す。
【００３０】
保護基を有するアミノ酸とは、反応基の化学反応を抑制および／または阻止するために、１以上の反応基が不活性分子で修飾されているアミノ酸を意味する。
【００３１】
第１の態様において、本発明は、式（Ｕ）ｎ（式中、Ｕは、配列番号２を含むペプチド、またはそのフラグメントもしくは変異体であり、ｎは２以上である）で表されるディフェンシンペプチドの単離多量体に関する。
配列番号２
ＧＩＩＮＴＬＱＫＹＹＸＲＶＲＧＧＲＸＡＶＬＳＸＬＰＫＥＥＱＩＧＫＸＳＴＲＧＲＫＸＸＲＲＺＺ
Ｘは任意のアミノ酸を包含してよく；Ｚは任意のアミノ酸を包含するか、または存在しなくてもよい。例えば、Ｚとしては、リジン、オルニチンまたはアルギニンが挙げられるが、これらに限定されない。具体的には、Ｚはリジンであってよい。
【００３２】
別の態様において、本発明は、ペプチドＵを少なくとも２つ含む単離多量体を提供する。ただし、前記ペプチドＵは、配列番号２またはそのフラグメントもしくは変異体を含む。
前記多量体には、ペプチドＵの繰り返しが存在する。具体的には、繰り返し単位であるペプチドＵ同士は共有結合により連結している。ペプチドＵ同士は、少なくとも１つのアミノ酸Ｂを介して連結していてもよい。Ｂは、アミン基を少なくとも２つ有するアミノ酸を包含してもよい。例えば、Ｂとしては、リジン、オルニチンまたはアルギニンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３３】
本発明の任意の多量体における繰り返し単位、すなわちペプチドＵは、ＷＯ２００７／１２６３９２に記載のいずれのペプチドであってもよい。
ペプチドＵとしては、配列番号２に由来するペプチドフラグメントなどが挙げられる。このフラグメントは、配列番号２に由来するものであれば、いかなる長さのフラグメントであってもよい。具体的には、ペプチドＵは、配列番号３またはそのフラグメントもしくは変異体を含んでもよい。
配列番号３
ＧＩＩＮＴＬＱＫＹＹＸＲＶＲＧＧＲＸＡＶＬＳＸＬＰＫＥＥＱＩＧＫＸＳＴＲＧＲＫＸＸＲＲ
Ｘは任意のアミノ酸を包含する。
多量体のペプチドＵは、＋１〜＋１１の電荷を有してもよい。
【００３４】
またペプチドＵは、配列番号４〜５８のいずれかまたはそのフラグメントもしくは変異体を含んでもよい。
配列番号４（ｈＢＤ３のＣ末端３８アミノ酸由来のペプチド）
ＫＹＹＸＲＶＲＧＧＲＸＡＶＬＳＸＬＰＫＥＥＱＩＧＫＸＳＴＲＧＲＫＸＸＲＲＺＺ
Ｘは任意のアミノ酸を包含し；Ｚは任意のアミノ酸を包含するか、または存在しなくてもよい。
配列番号５（ｈＢＤ３のＣ末端３６アミノ酸由来のペプチド）
ＹＸＲＶＲＧＧＲＸＡＶＬＳＸＬＰＫＥＥＱＩＧＫＸＳＴＲＧＲＫＸＸＲＲＺＺ
Ｘは任意のアミノ酸を包含し；Ｚは任意のアミノ酸を包含するか、または存在しなくてもよい。
配列番号６（ｈＢＤ３のＣ末端４０アミノ酸由来のペプチド）
ＬＱＫＹＹＸＲＶＲＧＧＲＸＡＶＬＳＸＬＰＫＥＥＱＩＧＫＸＳＴＲＧＲＫＸＸＲＲＺＺ
Ｘは任意のアミノ酸を包含し；Ｚは任意のアミノ酸を包含するか、または存在しなくてもよい。
配列番号７（ｈＢＤ３のＣ末端２９アミノ酸由来のペプチド）
ＲＸＡＶＬＳＸＬＰＫＥＥＱＩＧＫＸＳＴＲＧＲＫＸＸＲＲＺＺ
Ｘは任意のアミノ酸を包含し；Ｚは任意のアミノ酸を包含するか、または存在しなくてもよい。
配列番号８
ＫＥＥＱＩＧＫＸＳＴＲＧＲＫＸＸＲＲＺＺ（ｈＢＤ３のＣ末端２０アミノ酸由来のペプチド）
Ｘは任意のアミノ酸を包含し；Ｚは任意のアミノ酸を包含するか、または存在しなくてもよい。
配列番号９
ＫＸＳＴＲＧＲＫＸＸＲＲＺＺ（ｈＢＤ３のＣ末端１４アミノ酸由来のペプチド）
Ｘは任意のアミノ酸を包含し；Ｚは任意のアミノ酸を包含するか、または存在しなくてもよい。
【００３５】
配列番号１０（ｈＢＤ３の第８〜２６番目のアミノ酸に相当する１９アミノ酸由来のペプチド）
ＫＹＹＸＲＶＲＧＧＲＸＡＶＬＳＸＬＰＫ
Ｘは任意のアミノ酸を包含する。
配列番号１１
ＧＩＩＮＴＬＱＫＹＹＸＲＶＲＧＧＲ（ｈＢＤ３のＮ末端１７アミノ酸由来のペプチド）
Ｘは任意のアミノ酸を包含する。
配列番号１２（ＣがＷで置換された全長型ｈＢＤ３由来のペプチド）
ＧＩＩＮＴＬＱＫＹＹＷＲＶＲＧＧＲＷＡＶＬＳＷＬＰＫＥＥＱＩＧＫＷＳＴＲＧＲＫＷＷＲＲＺＺ
Ｚは任意のアミノ酸を包含するか、または存在しなくてもよい。
配列番号１３（ＣがＦで置換された全長型ｈＢＤ３由来のペプチド）
ＧＩＩＮＴＬＱＫＹＹＦＲＶＲＧＧＲＦＡＶＬＳＦＬＰＫＥＥＱＩＧＫＦＳＴＲＧＲＫＦＦＲＲＺＺ
Ｚは任意のアミノ酸を包含するか、または存在しなくてもよい。
配列番号１４（ＣがＹで置換された全長型ｈＢＤ３由来のペプチド）
ＧＩＩＮＴＬＱＫＹＹＹＲＶＲＧＧＲＹＡＶＬＳＹＬＰＫＥＥＱＩＧＫＹＳＴＲＧＲＫＹＹＲＲＺＺ
Ｚは任意のアミノ酸を包含するか、または存在しなくてもよい。
配列番号１５（ＣがＳで置換された全長型ｈＢＤ３由来のペプチド）
ＧＩＩＮＴＬＱＫＹＹＳＲＶＲＧＧＲＳＡＶＬＳＳＬＰＫＥＥＱＩＧＫＳＳＴＲＧＲＫＳＳＲＲＺＺ
Ｚは任意のアミノ酸を包含するか、または存在しなくてもよい。
配列番号１６（ＣがＡで置換された全長型ｈＢＤ３由来のペプチド）
ＧＩＩＮＴＬＱＫＹＹＡＲＶＲＧＧＲＡＡＶＬＳＡＬＰＫＥＥＱＩＧＫＡＳＴＲＧＲＫＡＡＲＲＺＺ
Ｚは任意のアミノ酸を包含するか、または存在しなくてもよい。
配列番号１７（ＣがＣ（Ａｃｍ）で置換された全長型ｈＢＤ３由来のペプチド）
ＧＩＩＮＴＬＱＫＹＹＣ（Ａｃｍ）ＲＶＲＧＧＲＣ（Ａｃｍ）Ｃ（Ａｃｍ）ＶＬＳＡＬＰＫＥＥＱＩＧＫＣ（Ａｃｍ）ＳＴＲＧＲＫＣ（Ａｃｍ）Ｃ（Ａｃｍ）ＲＲＺＺ
Ｚは任意のアミノ酸を包含するか、または存在しなくてもよい。
配列番号１８（ＣがＣ（Ｂｕｔ）で置換された全長型ｈＢＤ３由来のペプチド）
ＧＩＩＮＴＬＱＫＹＹＣ（Ｂｕｔ）ＲＶＲＧＧＲＣ（Ｂｕｔ）Ｃ（Ｂｕｔ）ＶＬＳＡＬＰＫＥＥＱＩＧＫＣ（Ｂｕｔ）ＳＴＲＧＲＫＣ（Ｂｕｔ）Ｃ（Ｂｕｔ）ＲＲＺＺ
Ｚは任意のアミノ酸を包含するか、または存在しなくてもよい。
配列番号１９（ＣがＣ（ｔ−Ｂｕｔｈｉｏ）で置換された全長型ｈＢＤ３由来のペプチド）
ＧＩＩＮＴＬＱＫＹＹＣ（ｔ−Ｂｕｔｈｉｏ）ＲＶＲＧＧＲＣ（ｔ−Ｂｕｔｈｉｏ）Ｃ（ｔ−Ｂｕｔｈｉｏ）ＶＬＳＡＬＰＫＥＥＱＩＧＫＣ（ｔ−Ｂｕｔｈｉｏ）ＳＴＲＧＲＫＣ（ｔ−Ｂｕｔｈｉｏ）Ｃ（ｔ−Ｂｕｔｈｉｏ）ＲＲＺＺ
Ｚは任意のアミノ酸を包含するか、または存在しなくてもよい。
【００３６】
配列番号２０（ＣがＣ（Ｂｚｌ）で置換された全長型ｈＢＤ３由来のペプチド）
ＧＩＩＮＴＬＱＫＹＹＣ（Ｂｚｌ）ＲＶＲＧＧＲＣ（Ｂｚｌ）Ｃ（Ｂｚｌ）ＶＬＳＡＬＰＫＥＥＱＩＧＫＣ（Ｂｚｌ）ＳＴＲＧＲＫＣ（Ｂｚｌ）Ｃ（Ｂｚｌ）ＲＲＺＺ
Ｚは任意のアミノ酸を包含するか、または存在しなくてもよい。
配列番号２１（ＣがＣ（４−ＭｅＢｚｌ）で置換された全長型ｈＢＤ３由来のペプチド）
ＧＩＩＮＴＬＱＫＹＹＣ（４−ＭｅＢｚｌ）ＲＶＲＧＧＲＣ（４−ＭｅＢｚｌ）Ｃ（４−ＭｅＢｚｌ）ＶＬＳＡＬＰＫＥＥＱＩＧＫＣ（４−ＭｅＢｚｌ）ＳＴＲＧＲＫＣ（４−ＭｅＢｚｌ）Ｃ（４−ＭｅＢｚｌ）ＲＲＺＺ
Ｚは任意のアミノ酸を包含するか、または存在しなくてもよい。
配列番号２２（ＣがＣ（４−ＭｅＯＢｚｌ）で置換された全長型ｈＢＤ３由来のペプチド）
ＧＩＩＮＴＬＱＫＹＹＣ（４−ＭｅＯＢｚｌ）ＲＶＲＧＧＲＣ（４−ＭｅＯＢｚｌ）Ｃ（４−ＭｅＯＢｚｌ）ＶＬＳＡＬＰＫＥＥＱＩＧＫＣ（４−ＭｅＯＢｚｌ）ＳＴＲＧＲＫＣ（４−ＭｅＯＢｚｌ）Ｃ（４−ＭｅＯＢｚｌ）ＲＲＺＺ
Ｚは任意のアミノ酸を包含するか、または存在しなくてもよい。
配列番号２３（ＣがＣ（Ｍｍｔ）で置換された全長型ｈＢＤ３由来のペプチド）
ＧＩＩＮＴＬＱＫＹＹＣ（Ｍｍｔ）ＲＶＲＧＧＲＣ（Ｍｍｔ）Ｃ（Ｍｍｔ）ＶＬＳＡＬＰＫＥＥＱＩＧＫＣ（Ｍｍｔ）ＳＴＲＧＲＫＣ（Ｍｍｔ）Ｃ（Ｍｍｔ）ＲＲＺＺ
Ｚは任意のアミノ酸を包含するか、または存在しなくてもよい。
配列番号２４（Ｃが修飾を受けたＣで置換された全長型ｈＢＤ３由来のペプチド）
ＧＩＩＮＴＬＱＫＹＹＸＲＶＲＧＧＲＸＸＶＬＳＡＬＰＫＥＥＱＩＧＫＸＳＴＲＧＲＫＸＸＲＲＺＺ
ＸはＣ（Ａｃｍ）、Ｃ（Ｂｕｔ）、Ｃ（ｔ−Ｂｕｔｈｉｏ）、Ｃ（Ｂｚｌ）、Ｃ（４−ＭｅＢｚｌ）、Ｃ（４−ＭｅＯＢｚｌ）またはＣ（Ｍｍｔ）を包含し；Ｚは任意のアミノ酸を包含するか、または存在しなくてもよい。
配列番号２５（Ｃが任意のアミノ酸Ｘで置換されたｈＢＤ３のＣ末端１０アミノ酸由来のフラグメント）
ＲＧＲＫＸＸＲＲＺＺ
Ｘは任意のアミノ酸を包含し；Ｚは任意のアミノ酸を包含するか、または存在しなくてもよい。
配列番号２６（ＣがＷで置換されたｈＢＤ３のＣ末端１０アミノ酸由来のフラグメント）
ＲＧＲＫＷＷＲＲＺＺ
Ｚは任意のアミノ酸を包含するか、または存在しなくてもよい。
配列番号２７（ＣがＦで置換されたｈＢＤ３のＣ末端１０アミノ酸由来のフラグメント）
ＲＧＲＫＦＦＲＲＺＺ
Ｚは任意のアミノ酸を包含するか、または存在しなくてもよい。
配列番号２８（ＣがＹで置換されたｈＢＤ３のＣ末端１０アミノ酸由来のフラグメント）
ＲＧＲＫＹＹＲＲＺＺ
Ｚは任意のアミノ酸を包含するか、または存在しなくてもよい。
配列番号２９（ＣがＬで置換されたｈＢＤ３のＣ末端１０アミノ酸由来のフラグメント）
ＲＧＲＫＬＬＲＲＺＺ
Ｚは任意のアミノ酸を包含するか、または存在しなくてもよい。
【００３７】
配列番号３０（ＣがＩで置換されたｈＢＤ３のＣ末端１０アミノ酸由来のフラグメント）
ＲＧＲＫＩＩＲＲＺＺ
Ｚは任意のアミノ酸を包含するか、または存在しなくてもよい。
配列番号３１（ＣがＨで置換されたｈＢＤ３のＣ末端１０アミノ酸由来のフラグメント）
ＲＧＲＫＨＨＲＲＺＺ
Ｚは任意のアミノ酸を包含するか、または存在しなくてもよい。
配列番号３２（ＣがＣ（Ａｃｍ）、Ｃ（Ｂｕｔ）、Ｃ（ｔ−Ｂｕｔｈｉｏ）、Ｃ（Ｂｚｌ）、Ｃ（４−ＭｅＢｚｌ）、Ｃ（４−ＭｅＯＢｚｌ）またはＣ（Ｍｍｔ）で置換されたｈＢＤ３のＣ末端１０アミノ酸由来のフラグメント）
ＲＧＲＫＸＸＲＲＺＺ
ＸはＣ（Ａｃｍ）、Ｃ（Ｂｕｔ）、Ｃ（ｔ−Ｂｕｔｈｉｏ）、Ｃ（Ｂｚｌ）、Ｃ（４−ＭｅＢｚｌ）、Ｃ（４−ＭｅＯＢｚｌ）またはＣ（Ｍｍｔ）を包含し；Ｚは任意のアミノ酸を包含するか、または存在しなくてもよい。
配列番号３３（ＣがＶで置換されたｈＢＤ３のＣ末端１０アミノ酸由来のフラグメント）
ＲＧＲＫＶＶＲＲＺＺ
Ｚは任意のアミノ酸を包含するか、または存在しなくてもよい。
配列番号３４（ｈＢＤ３のＣ末端１０アミノ酸由来のペプチド）
ＲＧＲＫＣＣＲＲＺＺ
Ｚは任意のアミノ酸を包含するか、または存在しなくてもよい。
配列番号３５（ＣがＣ（Ａｃｍ）、Ｃ（Ｂｕｔ）、Ｃ（ｔ−Ｂｕｔｈｉｏ）、Ｃ（Ｂｚｌ）、Ｃ（４−ＭｅＢｚｌ）、Ｃ（４−ＭｅＯＢｚｌ）またはＣ（Ｍｍｔ）で置換されたｈＢＤ３のＣ末端１０アミノ酸由来のペプチド）
ＲＧＲＫＸＸＲＲＫＫ
ＸはＣ（Ａｃｍ）、Ｃ（Ｂｕｔ）、Ｃ（ｔ−Ｂｕｔｈｉｏ）、Ｃ（Ｂｚｌ）、Ｃ（４−ＭｅＢｚｌ）、Ｃ（４−ＭｅＯＢｚｌ）またはＣ（Ｍｍｔ）を包含する。
配列番号３６（Ｃが任意のアミノ酸で置換されたｈＢＤ３のＣ末端由来のペプチド。ただし、ｈＢＤ３のＣ末端のＫＫは含まない。）
ＲＧＲＫＸＸＲＲ
配列番号３７（Ｗ２−８ＡＡ：ＣがＷで置換されたｈＢＤ３のＣ末端由来のペプチド。ただし、ｈＢＤ３のＣ末端のＫＫは含まない。）
ＲＧＲＫＷＷＲＲ
配列番号３８（ＣがＦで置換されたｈＢＤ３のＣ末端由来のペプチド。ただし、ｈＢＤ３のＣ末端のＫＫは含まない。）
ＲＧＲＫＦＦＲＲ
配列番号３９（Ｙ２−８ＡＡ：ＣがＹで置換されたｈＢＤ３のＣ末端由来のペプチド。ただし、ｈＢＤ３のＣ末端のＫＫは含まない。）
ＲＧＲＫＹＹＲＲ
【００３８】
配列番号４０（ＣがＬで置換されたｈＢＤ３のＣ末端由来のペプチド。ただし、ｈＢＤ３のＣ末端のＫＫは含まない。）
ＲＧＲＫＬＬＲＲ
配列番号４１（ＣがＩで置換されたｈＢＤ３のＣ末端由来のペプチド。ただし、ｈＢＤ３のＣ末端のＫＫは含まない。）
ＲＧＲＫＩＩＲＲ
配列番号４２（ＣがＨで置換されたｈＢＤ３のＣ末端由来のペプチド。ただし、ｈＢＤ３のＣ末端のＫＫは含まない。）
ＲＧＲＫＨＨＲＲ
配列番号４３（ＣがＣ（Ａｃｍ）、Ｃ（Ｂｕｔ）、Ｃ（ｔ−Ｂｕｔｈｉｏ）、Ｃ（Ｂｚｌ）、Ｃ（４−ＭｅＢｚｌ）、Ｃ（４−ＭｅＯＢｚｌ）またはＣ（Ｍｍｔ）で置換されたｈＢＤ３のＣ末端由来のペプチド。ただし、ｈＢＤ３のＣ末端のＫＫは含まない。）
ＲＧＲＫＣＸＸＲＲ
ＸはＣ（Ａｃｍ）、Ｃ（Ｂｕｔ）、Ｃ（ｔ−Ｂｕｔｈｉｏ）、Ｃ（Ｂｚｌ）、Ｃ（４−ＭｅＢｚｌ）、Ｃ（４−ＭｅＯＢｚｌ）またはＣ（Ｍｍｔ）を包含する。
配列番号４４（Ｖ２−８ＡＡ：ＣがＶで置換されたｈＢＤ３のＣ末端由来のペプチド。ただし、ｈＢＤ３のＣ末端のＫＫは含まない。）
ＲＧＲＫＶＶＲＲ
配列番号４５（Ｖ２モノマー）
ＲＧＲＫＶＶＲＲＫＫ
配列番号４６（Ｖ４モノマー、Ｖ４−１０ ＡＡ）
ＲＧＲＫＶＶＲＲＶＶ
配列番号４７（Ｙ４モノマー、Ｙ４−１０ ＡＡ）
ＲＧＲＫＹＹＲＲＹＹ
配列番号４８（Ｗ４モノマー、Ｗ４−１０ ＡＡ）
ＲＧＲＫＷＷＲＲＷＷ
配列番号４９（Ｖ３モノマー）
ＲＶＲＫＶＶＲＲ
【００３９】
配列番号５０（Ｖ２Ｒモノマー）
ＲＲＲＫＶＶＲＲ
配列番号５１（Ｖ２Ｄモノマー）
ＲＤＲＫＶＶＲＲ
配列番号５２（Ｅ２モノマー）
ＲＧＲＫＥＥＲＲ
配列番号５３（Ｋ２モノマー）
ＲＧＲＫＫＫＲＲ
配列番号５４
ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲ
配列番号５５
ＶＶＶＶ
配列番号５６
ＹＹＹＹ
配列番号５７
ＲＲＶＶＫＲＧＲ
配列番号５８
ＲＲＶＶＫＲＧＲＫ
【００４０】
別の態様において、本発明は、式（Ｕ）ｎＢｍＺｊ（式中、Ｕは、配列番号３またはそのフラグメントもしくは変異体を含み、Ｂは、アミン基を少なくとも２つ有するアミノ酸を包含し、Ｚは任意のアミノ酸を包含し、ｎは２以上であり、ｍは１以上であり、ｊは０以上である）で表される単離多量体に関する。具体的には、Ｂとしては、リジン、オルニチンまたはアルギニンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４１】
本発明の一態様において、（Ｕ）ｎＢｍＺｊのＢとＺはいずれもリジン（Ｋ）を包含してもよい。このとき、上記の式は（Ｕ）ｎＫｍＫｊで表される。また、さらなる態様において、ｍがｎ−１と等しくてもよく、ｊが１であってもよい。このとき、上記の多量体の式は（Ｕ）ｎＫｎ−１Ｋ（すなわち（ＵＫ）ｎ）で表される。式（Ｕ）ｎＫｍＫｊまたは（Ｕ）ｎＫｎ−１ＫにおけるペプチドＵは、配列番号３またはそのフラグメントもしくは変異体を含んでもよい。
【００４２】
式（Ｕ）ｎＢｍＺｊ、（Ｕ）ｎＫｍＫｊまたは（Ｕ）ｎＫｎ−１ＫにおけるペプチドＵは、配列番号３またはそのフラグメントもしくは変異体を含んでもよく、前記フラグメントまたは変異体としては、例えばＲＧＲＫＸＸＲＲ（配列番号３６）または配列番号３７〜４４のいずれかが挙げられる。
例えば、ｍ＝ｎ−１、ｊ＝１、Ｂ＝Ｚ＝Ｋであり、かつＵが配列番号４４を含む場合、多量体は式（配列番号４４）ｎＫｎ−１Ｋを有する。ｎ＝２である場合、多量体は式（配列番号４４）２ＫＫを有する。
【００４３】
本発明の多量体は、直鎖状、分岐状のいずれであってもよい。多量体（Ｕ）ｎが直鎖状である場合、ｎ回繰り返されるペプチドＵは、配列番号２またはその任意のフラグメントもしくは変異体を含んでもよい。配列番号２の任意のフラグメントまたは変異体としては、配列番号３〜５８のいずれかが挙げられる。例えば、多量体は、（配列番号３５）ｎ、（配列番号３６）ｎ、または（配列番号４５）ｎを含んでもよい。
分岐状の多量体、例えば多量体（Ｕ）ｎＢｍＺｊに関しては、末端の残基ＢｍＺｊで分岐していてもよい。
【００４４】
本発明の多量体は、繰り返し単位を任意の数含んでもよい。例えば、前記多量体は、繰り返しサブユニットを２〜１０個、２〜２０個、または２〜３０個含んでもよい。さらに前記多量体は、ダイマー、トリマー、テトラマー、ペンタマー、ヘキサマー、ヘプタマー、オクタマー、ノナマー、デカマーのいずれであってもよい。
【００４５】
例えば、式（配列番号３６）２ＢＺで表される分岐状ダイマーに関しては、該ダイマーは下記の構造を含んでもよい。
【化１】
あるいは、Ｚは存在しなくてもよく、このとき、上記ダイマーは下記の構造を有する。
【化２】
具体的には、本発明の任意の多量体において、ＸはＶであってもよい。このＶ２モノマーは、配列ＲＧＲＫＶＶＲＲ（配列番号４４）を有する。
【００４６】
また本発明は、さらなる態様において、式：（Ｕ）ｎＫｍＺｊ（式中、Ｕは、配列番号３またはそのフラグメントもしくは変異体を含み、Ｚは任意のアミノ酸を包含し、ｎは２以上であり、ｍは１以上であり、ｊは１である）で表される少なくとも１つの多量体を製造する方法であって、
（i）少なくとも１つの固相を準備する工程；
（ii）固相に少なくとも１つの１番目のアミノ酸残基Ｚを結合させる工程；
（iii）固相に結合させた１番目のアミノ酸残基に、保護基を有するＫ残基を少なくとも１つ連結する工程；
（iv）連結させたＫ残基から保護基を除去する工程；
（v）ペプチドＵの配列に従って、保護基を有するアミノ酸残基をＣ末端からＮ末端の方向へ順に連結し、連結の都度、次の連結のために保護基を除去することによって、さらなる鎖の伸長を行う工程；および
（vi）加える残基の数に応じて、アミノ酸残基の連結を終了する工程
を含む方法に関する。
【００４７】
固相に結合させた１番目のアミノ酸Ｚは、任意のアミノ酸であってよい。例えば、Ｚとしては、リジン、オルニチンまたはアルギニンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４８】
合成が終了した後、固相から多量体を遊離させてもよい。
【００４９】
例えば、ペプチド配列ＲＧＲＫＫＸＸＲＲ（配列番号３６）を作製するために、上記の工程を実施すると、下記のダイマーが合成される。イタリック太字で示すリジン（Ｋ）残基は、合成時にＬｙｓ（Ｆｍｏｃ）が組み込まれた位置を示す。
【化３】
この合成方法では、残基Ｚおよびリジン残基を２つのモノマー単位が共有している。
具体的には、ＸがＶで、ＺがＫである場合、下記のダイマーが合成される。このダイマーは、（配列番号４４）２ＫＫで表されるＶ２ダイマーである。
【化４】
【００５０】
上記の方法を拡張し、さらなる多量体を合成してもよい。例えば、さらなる多量体を合成するために拡張した方法は、工程（iv）の後に、
（iv）（ａ）連結させた２番目のリジン残基に、保護基を有するリジン残基をさらに連結する工程；
（iv）（ｂ）（iv）（ａ）で連結させたリジン残基から保護基を除去する工程；および
（iv）（ｃ）工程（iv）（ａ）および（iv）（ｂ）を繰り返し行う工程、または
（iv）（ｄ）工程（v）および（vi）に進む工程
をさらに含む。
【００５１】
この拡張した方法により、先の方法で合成される多量体から繰り返し単位数が２の累乗倍に増加した多量体を合成できる。この拡張した方法により、４量体、８量体、１６量体、３２量体、６４量体などが形成される。この拡張した方法において追加された工程を１回実施することによって、下記に示すようなテトラマーが合成される。ＸがＶで、ＢおよびＺがＫである場合、得られるテトラマーはＶ２−テトラマーとして公知である。このＶ２テトラマーの繰り返し単位はＲＧＲＫＶＶＲＲ（配列番号４４）である。
【化５】
【００５２】
さらに、この拡張した方法において追加された工程を２回繰り返すことによって、オクタマーが合成される。本発明の多量体は、末端のＫ残基を含まなくてもよい。
【００５３】
上記のように製造される多量体は、多量体内で１種類のペプチドモノマー単位が繰り返されているホモ多量体である。本発明のペプチド多量体は、ホモダイマー、ホモテトラマーなど、いかなるホモ多量体であってもよい。
【００５４】
さらに、上記の製造方法を拡張して、多量体内に異なるペプチド単位が存在するヘテロ多量体を製造してもよい。ホモ多量体を製造する場合、保護基を有するアミノ酸Ｂは、同一の保護基で保護されている側鎖を少なくとも２つ有する。しかし、ヘテロ多量体（例えばヘテロダイマー）を製造する際には、異なる保護基を有するアミノ酸Ｃを用いてもよい。アミノ酸Ｃにおいては、鎖の伸長に利用できる側鎖が、少なくとも２種類の異なる保護基で保護されている。この場合、第１の保護基を除去して、少なくとも１つの第１の反応側鎖からペプチド鎖を伸長させてもよい。第１のペプチド鎖を伸長させた後、別の保護基を除去して、少なくとも１つの第２の反応側鎖から続けて鎖を伸長させてもよい。このようにして、第１のペプチド鎖と第２のペプチド鎖が異なるアミノ酸配列を有していてもよい。
【００５５】
本発明は、別の態様において、式［（Ｕ１）（Ｕ２）］ｎ／２（Ｃ）ｎ／２ＢｍＺ（式中、Ｕ１およびＵ２はそれぞれペプチドを含み、Ｕ１≠Ｕ２かつｎ＝２ｘであり、ｘ＝０または正の整数であり、ｍ＝１または０である）で表されるペプチド多量体を製造する方法であって、
（i）少なくとも１つの固相を準備する工程；
（ii）固相に少なくとも１つの１番目のアミノ酸Ｚを結合させる工程；
（iii）必要に応じて、固相に結合させたＺにアミノ酸Ｂを少なくとも１つ連結する工程；
（iv）ＺまたはＢに、異なる保護基で保護された基を少なくとも２つ含むアミノ酸Ｃを少なくとも１つ連結する工程；
（v）連結させたアミノ酸Ｃから第１の保護基を除去して、第１の反応側鎖を露出させる工程；
（vi）Ｃの第１の反応側鎖から、第１のペプチドＵ１の鎖を伸長させる工程；
（vii）連結させたアミノ酸Ｂから第２の保護基を除去して、少なくとも１つの第２の反応側鎖を露出させる工程；および
（viii）Ｃの第２の反応側鎖から、第２のペプチドＵ２の鎖を伸長させる工程
を含む方法に関する。
【００５６】
このようにして、ヘテロペプチド多量体を製造してもよい。
任意で実施できる工程（ii）を省略すると、ヘテロダイマーが形成される。任意で実施できる工程（ii）を１回行うと、ヘテロテトラマーを製造することができる。工程（ii）を適宜繰り返すことにより、その他のヘテロ多量体を製造することができる。
【００５７】
本発明は、別の態様において、式［（Ｕ１）（Ｕ２）］ｎ／２（Ｃ）ｎ／２ＢｍＺ（式中、Ｕ１およびＵ２はペプチド配列を含み、Ｕ１≠Ｕ２であり、ＣおよびＢはそれぞれ、アミン基を少なくとも２つ有するアミノ酸を包含し、Ｚは任意のアミノ酸を包含し、ｎ＝２ｘであり、ｘ＝０または正の整数であり、ｍ＝１または０である）で表される単離ペプチド多量体に関する。
Ｃ、ＢおよびＺとしては、リジン（Ｋ）、オルニチンまたはアルギニン（Ｒ）が挙げられるが、これらに限定されない。
具体的には、Ｕ１またはＵ２はそれぞれ、配列番号２を含むペプチド、またはそのフラグメントもしくは変異体であってよい。
Ｕ１は、配列番号１〜５８のいずれかを含んでもよいが、これらに限定されない。
Ｕ２は、配列番号１〜５８のいずれかを含んでもよいが、これらに限定されない。
ｎ＝２かつｍ＝１である場合、多量体は、式［（Ｕ１）（Ｕ２）］ＣＺで表されるヘテロダイマーである。
【００５８】
例えば、Ｕ１はＲＧＲＫＶＶＲＲ（配列番号４４）を含んでもよく、Ｕ２はＲＧＲＫＶＶＲＲＶＶ（配列番号４６）を含んでもよく、ＣおよびＺはＫであり、ｍ＝０、かつｎ＝２である。このとき、上記ヘテロダイマーは、下記の構造を含む。
【化６】
例えば、Ｕ１はＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号５４）を含んでもよく、Ｕ２はＶＶＶＶ（配列番号５５）を含んでもよく、ＣおよびＺはＫであり、ｍ＝０、かつｎ＝２である。このとき、上記ヘテロダイマーは、以下の構造を含む。
【化７】
例えば、Ｕ１はＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号５４）を含んでもよく、Ｕ２はＹＹＹＹ（配列番号５６）を含んでもよく、ＣおよびＺはＫであり、ｍ＝０、かつｎ＝２である。このとき、上記ヘテロダイマーは、以下の構造を含む。
【化８】
ｎ＝４かつｍ＝１である場合、上記ヘテロ多量体はヘテロテトラマーである。このヘテロマーは、式［（Ｕ１）（Ｕ２）］２（Ｃ）２Ｂ１Ｚで表すことができる。
【００５９】
本発明の方法を拡張し、トリマーなど他のペプチド多量体を合成してもよい。ホモトリマーおよびヘテロトリマーのいずれも合成できる。
【００６０】
式Ｕ３Ｕ２ＣＵ１Ｚ（式中、Ｕ１、Ｕ２およびＵ３はそれぞれペプチドを含み、Ｃは、アミン基を少なくとも２つ含むアミノ酸を包含し、Ｚは任意のアミノ酸を包含する）で表されるペプチドトリマーを製造する方法であって、
（i）少なくとも１つの固相を準備する工程；
（ii）固相に少なくとも１つの１番目のアミノ酸Ｚを結合させる工程；および
（iii）Ｚから、ペプチドＵ１の鎖を伸長させる工程
を含む方法。
ただし、
（Ａ）前記ペプチドトリマーが、式Ｕ３Ｕ２（Ｃ）Ｕ１Ｚで表されるヘテロペプチドである場合、
前記方法は、
（iv）ペプチドＵ１のアミノ酸に、異なる保護基を有するアミノ酸Ｃを連結する工程；
（v）連結させたアミノ酸Ｃから第１の保護基を除去する工程；
（vi）アミノ酸Ｃから、ペプチドＵ２の鎖を伸長させる工程；
（vii）連結させたアミノ酸Ｃから第２の保護基を除去する工程；および
（viii）アミノ酸Ｃから、ペプチドＵ３の鎖を伸長させる工程
をさらに含み、
（Ｂ）Ｕ２＝Ｕ３＝Ｕ１かつＣ＝Ｂであり、前記ペプチドトリマーが式（Ｕ１）２ＢＵ１Ｚを含む場合、
前記方法は、
（iv）ペプチドＵ１のアミノ酸に、保護基を有するアミノ酸Ｂを連結する工程；
（v）連結させたアミノ酸Ｂから保護基を除去する工程；および
（vi）アミノ酸Ｂから、２つのペプチドＵ１の鎖を伸長させる工程
をさらに含み、
（Ｃ）Ｕ２＝Ｕ３≠Ｕ１かつＣ＝Ｂであり、前記ペプチドトリマーが式（Ｕ２）２Ｂ（Ｕ１）Ｚを含む場合、
前記方法は、
（iv）ペプチドＵ１のアミノ酸に、保護基を有するアミノ酸Ｂを連結する工程；
（v）連結させたアミノ酸Ｂから保護基を除去する工程；および
（vi）アミノ酸Ｂから、少なくとも２つのペプチドＵ２の鎖を伸長させる工程
をさらに含む。
上記（Ａ）および（Ｃ）の場合には、ヘテロペプチドトリマーを製造することができる。上記（Ｂ）の場合には、ホモペプチドトリマーを製造することができる。
【００６１】
本発明は、別の態様において、式Ｕ３Ｕ２ＣＵ１Ｚ（式中、Ｕ１、Ｕ２およびＵ３はそれぞれペプチド配列を含み、Ｃは、アミン基を少なくとも２つ有するアミノ酸を包含し、Ｚは任意のアミノ酸を包含する）で表される単離ペプチドトリマーに関する。具体的には、このペプチドはアミノ酸Ｃで分岐している。
このとき、上記単離ペプチドトリマーは、下記の構造を含む。
【化９】
Ｃ、ＢおよびＺとしては、リジン（Ｋ）、オルニチンまたはアルギニン（Ｒ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６２】
具体的には、Ｕ１、Ｕ２またはＵ３はそれぞれ、配列番号２またはそのフラグメントもしくは変異体を含んでもよい。
例えば、Ｕ１、Ｕ２またはＵ３はそれぞれ、配列番号１〜５８のいずれかを含んでもよい。ヘテロペプチドトリマーである場合、２つのペプチドが同一の配列を含み、第３のペプチドがそれとは異なる配列を有してもよい。
ヘテロペプチドトリマーＵ３Ｕ２ＣＵ１Ｚにおいて、Ｕ１、Ｕ２およびＵ３はそれぞれ異なるペプチド配列であってもよいが、そうでなくてもよい。例えば、Ｕ１およびＵ２が同一の配列を含み、Ｕ３がそれとは異なる配列を含んでいてもよい。また、Ｕ１およびＵ３が同一の配列を含み、Ｕ２もそれと同一の配列を有してもよい。
Ｕ２＝Ｕ３≠Ｕ１かつＣ＝Ｂである場合、上記ペプチドは式（Ｕ２）２ＢＵ１Ｚで表される。
Ｕ１＝Ｕ３≠Ｕ２である場合、上記ペプチドは式Ｕ１Ｕ２ＣＵ１Ｚで表される。
Ｕ１＝Ｕ２≠Ｕ３である場合、上記ペプチドは式Ｕ３Ｕ１ＣＵ１Ｚで表される。
ただし、Ｕ１＝Ｕ２＝Ｕ３かつＣ＝Ｂである場合、上記ペプチドは式（Ｕ１）２ＢＵ１Ｚで表されるホモペプチドトリマーとなる。
ヘテロペプチドトリマーおよびその合成の一例を図８に示し、実施例１Ｄに記載する。
【００６３】
従って、本発明は、式Ｕ３Ｕ２ＫＵ１Ｋ（式中、Ｕ１はＲＲＶＶＫＲＧＲ（配列番号５７）を含み、Ｕ２はＲＧＲＫＶＶＲＲ（配列番号４４）を含み、Ｕ３はＲＧＲＫＶＶＲＲＶＶ（配列番号４６）を含む）で表される単離ペプチドトリマーに関する。このヘテロトリマーはＶ２Ｖ２Ｖ４−ヘテロトリマーであり、下記の構造を有する。
【化１０】
【００６４】
本発明の多量体は、抗菌性を有する。従って、本発明の多量体は、微生物の増殖を阻害および／または抑制するために用いることができる。
【００６５】
また本発明は、微生物を本発明の少なくとも１つの多量体と接触させることを含む、微生物の増殖を阻害および／または抑制する方法を提供する。
【００６６】
また本発明は、対象に本発明の少なくとも１つの多量体を投与することを含む、少なくとも１つの微生物感染症を治療する方法を提供する。さらに本発明は、対象に本発明の少なくとも１つの多量体を投与することを含む、対象における少なくとも１種の微生物の増殖を阻害および／または抑制することを提供する。
前記微生物は、ウイルス、真菌、細菌のいずれであってもよい。
【００６７】
従って、本発明は、抗菌組成物の製造のための、本発明の任意の態様による多量体の使用にも関する。前記抗菌組成物は、例えば対象における、少なくとも１種の微生物の増殖を阻害および／または抑制するために用いることができる。
【００６８】
また本発明は、少なくとも１つの微生物感染症を治療する医薬品を製造するための、本発明の任意の態様による多量体の使用を包含する。
【００６９】
従って、本発明の多量体は、抗菌組成物および／または医薬組成物としてもよい。本発明の抗菌組成物および／または医薬組成物は、外用、経口投与用、非経口投与用または吸入用の製剤にすることができる。また本発明の多量体は、点眼用の組成物および／もしくは液剤ならびに／またはコンタクトレンズ用液剤に製剤化することができる。
【００７０】
また本発明の多量体は、器具のコーティングのための組成物としてもよい。前記器具としては、カテーテル、針、シース、ステント、包帯などの医療器具が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７１】
また本発明は、キットも包含するが、このキットとは、本発明の少なくとも１つの多量体、本発明の少なくとも１つの多量体を含む少なくとも１つの抗菌組成物および／または医薬組成物を含むものを言う。
【００７２】
これまで、本発明について一般的な説明をしてきたが、下記の実施例を参照することにより同じ内容をより容易に理解できるであろう。ただし、下記の実施例は、例示の目的で記載されているものであり、本発明を何ら限定するものではない。
【実施例】
【００７３】
具体的記載のない、当技術分野において公知の標準的な分子生物学手法については、概してＳａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２００１）に記載の手法に従った。
【００７４】
実施例１：多量体の固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）法
（Ａ）ホモダイマーの合成
以下のペプチドの合成方法は、Ｋｒａｊｅｗｓｋｉら（２００４）の方法を改変したものである。フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基で保護されたＬ−アミノ酸および樹脂は、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社（ＡＡＰＰＴＥＣ社）（ケンタッキー州、米国）から購入し、側鎖保護基、すなわちＬｙｓ（Ｆｍｏｃ）、Ａｒｇ（ｐｂｆ）、Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、Ｔｙｒ（Ｂｕｔ）、Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）およびＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｗａｎｇ樹脂（置換率０．７２ｍｍｏｌ／ｇ）と共に使用した。ただしＬｙｓ（Ｆｍｏｃ）は、ダイマーの合成において、Ｃ末端から２番目の残基としてのみ組み込んだ。ダイマーの合成は、Ａｐｅｘ ３９６（Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｍＴｅｃｈ社）を用いてＦｍｏｃ法により行った。
【００７５】
市販のＦｍｏｃ−Ｂｏｃ−Ｌｙｓ−Ｗａｎｇ樹脂を出発点として用いた。あるいは、０．５Ｍ ＤＩＣ（Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド）を用いて、１番目のアミノ酸をＷａｎｇ樹脂へ結合させた。続くカップリング反応（またはアシル化反応）は、ＮＭＰ中、０．５Ｍ ＨＢＴＵ／０．５Ｍ ＨＯＢＴ／２Ｍ ＤＩＥＡを用いて行った。別法として、ＤＭＦ中、ＨＢＴＵ−ＨＯＢＴを用いて、合成スケール０．０８ｍｍｏｌでカップリング反応を行ってもよい。Ｆｍｏｃ基の除去は、ＤＭＦ中、２０％ピペリジンを用いて行った。
【００７６】
反応に用いた樹脂を、ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）９０％、フェノール５．０％、水１．５％、ＴＩＳ（トリイソプロピルシラン）１．０％、ＥＤＴ（エタンジオール）２．５％を含む試薬で処理し、多量体を遊離させた。別法として、ＴＦＡ／ＴＩＳ／フェノール／チオアニソール（Ｔｈｉｏｎｉｓｏｌｅ）／水（９０／１／２．５／５／１．５（容量パーセント比））からなる混合液を新たに調製し、これを用いて、反応で得られたペプチド結合樹脂を室温で２〜３時間処理してもよい。
【００７７】
次いで、このペプチド粗生成物をろ過した後、氷冷したジエチルエーテルに注いで沈殿させ、沈殿物を遠心分離して氷冷したエーテルで３回洗浄し、真空下室温で乾燥させた、または固形の粗生成物中に含まれるエーテルや他の残存溶媒をドラフト内で自然に蒸発させて乾燥させた。沈殿物をエーテルから直接乾燥させることにより、ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）塩が得られた。ＴＦＡ塩は、ペプチド溶液のｐＨや培養中の細胞の生存率に影響を与える可能性がある。ＴＦＡ塩は、２％酢酸を２ｍｌ加えて凍結乾燥させると酢酸塩に変換されるため、これにより、他のペプチドの取扱いが容易になり、極微量のスカベンジャーを除去することができる。
この合成方法のスキームを図２に示す。
【００７８】
上記のＳＰＰＳ法によって、ダイマーの粗生成物および精製ダイマーが高収率で得られるだろう。例えば、Ｖ２ダイマーの粗生成物および精製Ｖ２ダイマーの収率は、それぞれ９０％および２７％である。０．０８ｍｍｏｌの合成スケールでは、５０ｍｇの精製Ｖ２ダイマーが得られるだろう。
【００７９】
上述した方法は合成方法の一例であって、これに変更を加えてもよい。例えば、このＳＰＰＳ法では、アミノ酸残基の保護や脱保護にいかなる方法を用いてもよい。
【００８０】
（Ｂ）ホモテトラマーの合成
上記の合成方法を拡張して、図９に示すようなホモテトラマーを合成してもよい。
【００８１】
固相化ＮＨ２−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）に連結したＦｍｏｃ−Ｌｙｓを脱保護した後、このリジンに２つのＦｍｏｃ−Ｌｙｓ残基を連結した。アミノ酸鎖のさらなる伸長を行うことにより、図に示すようなホモテトラマー（Ｖ２テトラマー）を合成した。脱保護反応（工程i）、カップリング反応（工程ii）および鎖の伸長反応の各条件は、ホモダイマーの合成と同様であった。
【００８２】
（Ｃ）ヘテロダイマーの合成
図７に示すヘテロダイマーの合成においては、異なる保護基で保護されたアミノ酸Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）−ＯＨを分岐点として用いてヘテロダイマーを合成した。Ｆｍｏｃ基とＡｌｏｃ基の反応性は異なり、Ｆｍｏｃ基の除去に用いられる塩基条件下では、Ａｌｏｃ基は安定である。
【００８３】
固相化Ｆｍｏｃ−ＮＨ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｗａｎｇ樹脂の脱保護は、上記と同様にして行った。
【００８４】
次いで、図７に示すように、Ｗａｎｇ樹脂に結合しているリジン残基にＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）−ＯＨを連結した（カップリング工程ii）。Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）からＦｍｏｃ基のみを除去し（Ｆｍｏｃ脱保護）、第１の鎖の伸長を行った（工程iii）。第１の鎖のアミノ酸残基がすべて連結した（すなわち、第１の鎖が完成した）ところで、Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）のＡｌｏｃ基をパラジウム触媒を用いて除去し（Ａｌｏｃ脱保護）、第２の鎖の伸長を行った。第２の鎖のアミノ酸残基がすべて連結した（すなわち、第２の鎖も完成した）後、酸分解により生成物を遊離させた。アミノ酸残基の反応基を保護するために合成時に必要に応じて使用した保護基（例えば、Ｂｏｃ、ｐｂｆ、Ｍｔｒ）が残っている場合は、それらをすべて除去した。
【００８５】
（Ｄ）ヘテロペプチドトリマーの合成
ヘテロペプチドトリマーの合成例を図８に示す。固相化リジン（Ｋ）残基から、まずＲＧＲＫＶＶＲＲ（配列番号５７）で表される第１のペプチド（Ｕ１）を伸長させる。次いで、ペプチドＲＧＲＫＶＶＲＲのＮ末端にあるＲ残基にＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）−ＯＨを連結する。次いで、Ｆｍｏｃ基を除去して、Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）残基の第１のアミン基に、鎖の伸長反応により、ＲＧＲＫＶＶＲＲ（配列番号４４）で表される第２のペプチド（Ｕ２）を加える。第２の鎖を伸長させた後、Ａｌｏｃ基を除去して、リジン残基の第２のアミン基に、鎖の伸長反応により、ＲＧＲＫＶＶＲＲＶＶ（配列番号４６）で表される第３のペプチド（Ｕ３）を加える。
【００８６】
あるいは、第１のペプチドＵ１を伸長させた後、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨを加えて、ペプチドＵ２を２つ同時に伸長させ、ヘテロトリマーＵ２Ｕ２（Ｋ）Ｕ１Ｋを形成させることもできる。
【００８７】
ホモペプチドトリマーに関しては、ペプチドＵを伸長させた後、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨを用いて、同一のペプチドＵを２つ同時に伸長させ、ホモトリマーを形成させることもできる。
【００８８】
実施例２：抗菌アッセイ
抗菌ペプチドの抗菌活性の試験方法として、以下に示す絶対的殺菌の手法を用いた。
【００８９】
試験微生物の調製
試験微生物として、米国培養菌保存施設（ＡＴＣＣ）から入手した基準培養菌、またはシンガポール総合病院病理部（ｔｈｅ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ）から入手した臨床分離株を用いた。試験に使用する培養菌はすべて、ストックからの継代数が５代以下のものとした。
【００９０】
細菌はトリプチケースソイ寒天（ＴＳＡ）斜面培地で、酵母はサブローデキストロース寒天（ＳＤＡ）斜面培地で、３５℃で１６時間培養して増殖させた。増殖した微生物を遠心分離により回収し、２０℃にて、米国薬局方（ＵＳＰ）規格リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で２回洗浄した。
【００９１】
試験微生物
以下の微生物を試験に使用した。
１．セレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）ＡＴＣＣ １１７７８
２．カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）ＡＴＣＣ １０２３１
３．緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）臨床分離株
ＰＡＥ２３０ ＤＲ４８７７／０７、唾液由来
４．緑膿菌臨床分離株ＰＡＥ２３９ ＤＭ５７９０／０７、創傷由来
５．緑膿菌臨床分離株ＰＡＥ２４０ ＤＵ１４４７６／０７、尿由来
６．緑膿菌臨床分離株ＰＡＥ２４９ ＤＭ１５０１３、創傷由来
７．緑膿菌臨床分離株０７ＤＭ０２３２５７、眼由来
８．緑膿菌臨床分離株０７ＤＭ０２３３７６、眼由来
９．緑膿菌臨床分離株０７ＤＭ０２３１５５、眼由来
１０．緑膿菌臨床分離株０７ＤＭ０２３１０４、眼由来
１１．緑膿菌ＡＴＣＣ ９０２７
１２．緑膿菌ＡＴＣＣ ２７８５３
１３．大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＡＴＣＣ ２５９２２
１４．大腸菌臨床分離株ＤＢ１６０２７、血液由来
１５．大腸菌臨床分離株ＤＵ４６３８１Ｒ、尿由来
１６．メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）ＤＭ０９８０８Ｒ、眼由来
１７．黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）臨床分離株
ＤＭ４００１、眼由来
１８．カンジダ・アルビカンス臨床分離株ＤＦ２６７２Ｒ、尿由来
１９．フザリウム・ソラニ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ）ＡＴＣＣ ３６０３１
【００９２】
化合物試験液の調製
凍結乾燥した抗菌化合物を精製水に溶解し、１，０００μｇ／ｍｌの濃度に調製してスクリューキャップ付プラスチックチューブに分注した。これをストック液として−２０℃で保存した。
【００９３】
試験当日、ストック液のチューブを１本解凍し、精製水で希釈して５００μｇ／ｍｌの濃度に調製した。次いで、ＵＳＰ規格リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）またはその他の溶液（例えば１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）、１０ｍＭカリウム緩衝液（ｐＨ７．２）または１５５．２ｍＭ ＮａＣｌが挙げられるが、これらに限定されない）を用いてさらに希釈を行い、必要な試験濃度に調製した。試験濃度は通常６．２５〜５０μｇ／ｍｌである。
【００９４】
標準的な濃度に調製した１０μｌの試験微生物液を、所定の試験濃度に調製した１ｍｌの化合物試験液に接種し、最終的な微生物数が可能な限り１×１０５〜１×１０６ｃｆｕ／ｍｌとなるようにした。次いで、菌を接種した試験液を３５℃で４時間インキュベートした。インキュベーションの温度および時間は必要に応じて変更してよい。
【００９５】
インキュベーション後、試験液をＤ／Ｅ Ｎｅｕｔｒａｌｉｓｉｎｇ Ｂｒｏｔｈ（ＮＢ）で１０倍に希釈して、抗菌作用を失わせた。さらにＮＢで希釈して、この希釈液を、細菌の場合はＴＳＡプレート培地に、酵母の場合はＳＤＡプレート培地に塗布した。これらのプレートを３５℃で７２時間インキュベートした後、各微生物の生菌数を求めた。
【００９６】
上記試験と並行して、試験液の代わりに、試験液の調製に使用した緩衝液に試験微生物を接種して接種コントロールとし、上記試験と同様の条件でインキュベーションを行った。接種コントロールの生菌数も上記試験と同様にして求めた。
【００９７】
化合物の抗菌活性は、試験微生物の接種コントロールにおけるコロニー形成単位（ｃｆｕ）の対数値から、３５℃で４時間化合物と接触した後に生存している試験微生物のｃｆｕの対数値を減算して得られる対数減少値で表した。
【００９８】
実施例３〜７にも上記の方法を用いた。具体的には、実施例６におけるゲンタマイシンに対するアッセイ方法は、抗菌化合物の代わりにゲンタマイシンを用いたという点を除いて上記の方法と同様である。
【００９９】
実施例３：緑膿菌ＡＴＣＣ ９０２７に対するＶ２ダイマーの抗菌活性
Ｖ２ダイマーの抗菌性を緑膿菌ＡＴＣＣ ９０２７を用いて調べた。
【０１００】
Ｖ２ダイマーは、ＵＳＰ規格リン酸緩衝液（米国薬局方に従い調製したもの）中、生理的ｐＨ値であるｐＨ７．２において、緑膿菌ＡＴＣＣ ９０２７に対する抗菌活性を示す。この抗菌活性は効果が高く、細菌数の大幅な減少が見られた（表１を参照）。接種した細菌の量は〜１０７個であったが、１２．５μｇ／ｍｌのＶ２ダイマーと４時間接触させることにより、溶液はほぼ殺菌された。
【表１】
【０１０１】
上記で使用したＵＳＰ規格緩衝液の塩溶液は生理的条件に比べて薄いため、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）を使用して、生理的な塩条件におけるＶ２ダイマーの抗菌活性も調べた。Ｖ２ダイマーは、生理的な塩濃度においても、緑膿菌ＡＴＣＣ ９０２７に対して高い抗菌活性を維持していた（表２）。
【表２】
【０１０２】
さらに、１５５．２ｍＭ ＮａＣｌを用いて、高塩濃度条件下におけるＶ２ダイマーの抗菌活性も調べた。その結果、１２．５〜５０μｇ／ｍｌのＶ２ダイマーは、高塩濃度において抗菌活性を示すことが分かった。
【表３】
【０１０３】
実施例４：ｈＢＤ３由来ペプチドモノマーとＶ２ダイマーとの比較
上述したｈＢＤ３由来の１０アミノ酸からなるペプチドモノマー（ＷＯ２００７／１２６３９２）の緑膿菌ＡＴＣＣ ９０２７に対する抗菌活性も調べた。
ＵＳＰ規格リン酸緩衝液を用いてＶ２、Ｌ２、Ｃ２、Ｆ２およびＨ２モノマーの抗菌性を調べたものを表４に示す。
【表４】
注：対数減少値０．５は、６８％の細菌が死滅したことを示す；対数減少値１は、９０％の細菌が死滅したことを示す；対数減少値２は、９９％の細菌が死滅したことを示す；対数減少値３は、９９．９％の細菌が死滅したことを示す。
【０１０４】
表１のＶ２ダイマーの結果と表４のＶ２モノマーの結果とを比較すると、Ｖ２ダイマーはＶ２モノマーよりはるかに高い殺菌効率を示すことがわかる。Ｖ２ダイマーは、１２．５μｇ／ｍｌの濃度で４時間菌に接触させた場合、対数減少値が６を超えていたが（表１）、これに対してＶ２モノマーは、１２．５μｇ／ｍｌの濃度での対数減少値が３．２３であり、５０μｇ／ｍｌの濃度でも３．９７に過ぎなかった（表４）。
【０１０５】
実施例５：緑膿菌の臨床分離株に対するＶ２ダイマーの抗菌活性
唾液、創傷、尿および眼に由来する複数の緑膿菌の臨床分離株に対しても、Ｖ２ダイマーの抗菌活性を調べた。Ｖ２ダイマーは、これらの臨床分離株に対しても抗菌活性を示す（表５〜８を参照）ことから、実際の臨床試料に対してもＶ２ダイマーを効果的に使用できることが示唆される。
【表５】
【０１０６】
【表６】
【０１０７】
【表７】
【０１０８】
【表８−１】
【表８−２】
【０１０９】
１０ｍＭリン酸緩衝液を用いた生理的な塩条件下における、臨床分離株に対するＶ２ダイマーの抗菌活性も調べた。Ｖ２ダイマーは、反復試験において、眼由来の臨床分離株（表９Ａ、９Ｂおよび９Ｃ）、ならびに創傷由来、唾液由来および尿由来の臨床分離株（表１０Ａおよび１０Ｂ）に対して抗菌活性を示した。このことから、生理的条件下においてもＶ２ダイマーを臨床分離株に対して使用できることが示唆される。
【表９】
【０１１０】
【表１０】
【０１１１】
実施例６：Ｖ２ダイマーとゲンタマイシンの抗菌活性の比較
緑膿菌の臨床分離株に対するＶ２ダイマーとゲンタマイシンの抗菌活性を比較した。
【０１１２】
第１の試験では、Ｖ２ダイマーとゲンタマイシンのいずれについても、創傷由来および唾液由来の臨床分離株に対してアッセイを行い、両者を比較した（表５を参照）。この試験から、創傷由来の分離株に対しては、Ｖ２ダイマーはゲンタマイシンと同等の活性を有することが分かった。唾液由来の分離株に対しては、Ｖ２ダイマーの方が高い抗菌活性を示した。
【表１１】
【０１１３】
第２の試験では、Ｖ２ダイマーとゲンタマイシン双方の、尿由来および唾液由来の臨床分離株に対する抗菌活性を調べて、両者を比較した（表６を参照）。Ｖ２ダイマーは、これら２種の分離株に対してもゲンタマイシンと同等の活性を示した。
【表１２】
【０１１４】
第３の試験では、Ｖ２ダイマーとゲンタマイシン双方の、眼由来の臨床分離株に対する抗菌活性を調べて、両者を比較した（表１３を参照）。この試験から、Ｖ２ダイマーとゲンタマイシンは眼由来の緑膿菌臨床分離株に対して同等の活性を有することがわかる。
【表１３】
【０１１５】
上記の試験結果をまとめると、Ｖ２ダイマーとゲンタマイシンは同等の抗菌活性を有しており、Ｖ２ダイマーは微生物に対してゲンタマイシンと同等の効果を発揮するものとして使用できることが示唆される。
【０１１６】
実施例７：その他の微生物に対するＶ２ダイマーの抗菌活性
（Ａ）カンジダ・アルビカンスＡＴＣＣ １０２３１
カンジダ・アルビカンスＡＴＣＣ １０２３１に対するＶ２ダイマーの抗菌活性を調べた。７．２×１０５ＣＦＵのカンジダ・アルビカンスを含むＵＳＰ規格リン酸緩衝液を、種々の濃度に調製したＶ２ダイマーと混合し、３５℃で４時間インキュベートした。その結果、５０、２５および１２．５μｇ／ｍｌの濃度におけるＶ２ダイマーのカンジダ・アルビカンスＡＴＣＣ １０２３１に対する対数減少値は３．６〜４であった（表１４）。
【表１４】
【０１１７】
（Ｂ）セレウス菌ＡＴＣＣ １１７７８
セレウス菌ＡＴＣＣ １１７７８に対するＶ２ダイマーの抗菌活性を調べた。Ｖ２ダイマーは、セレウス菌に対して抗菌活性を示した（表１５）。
【表１５】
【０１１８】
（Ｃ）大腸菌臨床分離株ＤＢ００１６０２７Ｒ
さらに、Ｖ２ダイマーは、ゲンタマイシン、アンピシリンなどの抗生物質に対して耐性を有する薬剤感受性パターンを示す大腸菌の多剤耐性株ＤＢ００１６０２７Ｒ（血液由来の臨床分離株）の菌数を減少させることが可能であった。
【表１６】
【０１１９】
Ｖ２ダイマーがカンジダ・アルビカンスやその他の細菌に対する抗菌性を有することは、有効な広域スペクトル抗菌剤としてのＶ２ダイマーの可能性を示唆している。さらにＶ２ダイマーが大腸菌の多剤耐性株に対して効果を有することは、他の抗生物質が使用できない微生物に対する有効な治療薬としてのＶ２ダイマーの可能性を示唆している。
【０１２０】
実施例８：Ｖ２ダイマーの細胞毒性
ＷＯ２００７／１２６３９２に記載の方法に従って、ヒト結膜細胞に対するＶ２ダイマーの毒性を調べ、野生型ｈＢＤ３と比較した。図４から、Ｖ２ダイマーのヒト結膜細胞に対する毒性は野生型ｈＢＤ３より低いことが分かる。野生型ｈＢＤ３は、およそ１５μｇ／ｍｌの濃度で細胞毒性を示したが、Ｖ２ダイマーは１００μｇ／ｍｌの濃度でも細胞毒性を示さなかった。Ｖ２ダイマーの細胞毒性プロファイルは、ＷＯ２００７／１２６３９２に記載のモノマーペプチドと同等であった。
【０１２１】
Ｖ２ダイマーはヒト結膜細胞に対する毒性が低く、抗菌活性が高いことから、宿主における微生物感染症の治療および／または微生物の増殖抑制の目的で、Ｖ２ダイマーを宿主に対して使用できることが示唆される。ＷＯ２００７／１２６３９２に記載の他のペプチドダイマーも同様に、高い抗菌活性と低い細胞毒性を示すと考えられる。
【０１２２】
実施例９：マクロ液体希釈法による最小阻止濃度（ＭＩＣ）の測定
米国臨床研究所規格委員会（ＮＣＣＬ）のマクロ液体希釈法を改変して、ＭＩＣを求めた。希釈には、Ｃａ２＋とＭｇ２＋を加えず、１／６の濃度に希釈したミュラーヒントンブロス（Ｍｕｅｌｌｅｒ Ｈｉｎｔｏｎ Ｂｒｏｔｈ（ＭＨＢ））を使用した。このＭＨＢ（１／６の濃度）を用いて、Ｖ２ダイマー溶液の２倍段階希釈系列を試験管に作製した。ＭＨＢ（１／６の濃度）を用いて調製した試験微生物の接種液１ｍｌを、Ｖ２ダイマーの各希釈液１ｍｌに添加し、各試験管内の終濃度が１０４〜１０５コロニー形成単位／ｍｌになるようにした。これらの試験管を３５℃で１６〜２０時間インキュベートした。試験サンプルと平行して、培地と微生物のみを含むポジティブコントロールの試験管と、培地のみを含むネガティブコントロールの試験管もインキュベートした。上記の操作を、試験微生物ごとに独立した試験として繰り返した。それぞれの臨床分離株または基準微生物に対するＶ２ダイマーペプチドのＭＩＣは、試験微生物の視認可能な増殖を阻害するペプチドの最小濃度とした。
他のペプチドのＭＩＣも求めて、ゲンタマイシンと比較した。ＭＩＣの結果を表１７〜２０に示す。
【０１２３】
【表１７】
【０１２４】
【表１８】
【０１２５】
【表１９】
【０１２６】
【表２０】
【０１２７】
参考資料
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WO 2007/126392
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｕ）ｎ（式中、Ｕは、配列番号２を含むペプチド、またはそのフラグメントもしくは変異体であり、ｎは２以上である）で表されるディフェンシンペプチドの単離多量体。
【請求項２】
前記ペプチドＵ同士が、共有結合により連結している請求項１に記載の単離多量体。
【請求項３】
前記ペプチドＵ同士が、少なくとも１つのアミノ酸Ｂを介して連結している、先行する請求項のいずれか１項に記載の単離多量体。
【請求項４】
前記ペプチドＵが、配列番号３〜５８のいずれかまたはそのフラグメントもしくは変異体を含む、先行する請求項のいずれか１項に記載の単離多量体。
【請求項５】
前記ペプチドＵが、＋１〜＋１１の電荷を有する、先行する請求項のいずれか１項に記載の単離多量体。
【請求項６】
式（Ｕ）ｎＢｍＺｊ（式中、Ｕは、配列番号３またはそのフラグメントもしくは変異体を含み、Ｂはそれぞれ、アミン基を少なくとも２つ有するアミノ酸を少なくとも１つ包含し、Ｚは任意のアミノ酸を包含し、ｍは１以上であり、ｊは０以上である）を有する、先行する請求項のいずれか１項に記載の単離多量体。
【請求項７】
前記ペプチドＵが、配列番号３６〜４４のいずれかまたはそのフラグメントもしくは変異体を含む請求項６に記載の単離多量体。
【請求項８】
Ｂがそれぞれ、リジン、オルニチンまたはアルギニンを包含する請求項６または７に記載の単離多量体。
【請求項９】
ｍ＝ｎ−１、ｊ＝１かつＢ＝Ｚ＝Ｋであり、前記多量体が式（Ｕ）ｎＫｎ−１Ｋを有し、Ｕが配列番号３６〜４４のいずれかを含む請求項６〜８のいずれか１項に記載の単離多量体。
【請求項１０】
ｎ＝２であり、前記多量体が式（Ｕ）２ＫＫを有し、Ｕが配列番号３６〜４４のいずれかを含む請求項８に記載の単離多量体。
【請求項１１】
ｍ＝ｎ−１、ｊ＝１かつＢ＝Ｚ＝Ｋであり、Ｕが配列番号４４を含み、前記多量体が式（配列番号４４）ｎＫｎ−１Ｋを有する請求項６〜８のいずれか１項に記載の単離多量体。
【請求項１２】
ｎ＝２であり、前記多量体が式（配列番号４４）２ＫＫを有する請求項１１に記載の単離多量体。
【請求項１３】
分岐状である、先行する請求項のいずれか１項に記載の単離多量体。
【請求項１４】
直鎖状である、先行する請求項のいずれか１項に記載の単離多量体。
【請求項１５】
先行する請求項のいずれか１項に記載の多量体の全長または任意の一部をコードする単離核酸分子。
【請求項１６】
請求項１５に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項１７】
請求項１５に記載の核酸分子または請求項１６に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１８】
少なくとも２つのペプチドＵを連結することを含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の多量体を製造する方法。
【請求項１９】
前記多量体が式（Ｕ）ｎＢｍＺｊで表され、
（i）少なくとも１つの固相を準備する工程；
（ii）固相に少なくとも１つの１番目のアミノ酸Ｚを結合させる工程；
（iii）固相に結合させたＺに、保護基を有するアミノ酸残基Ｂを少なくとも１つ連結する工程；
（iv）連結させたアミノ酸残基Ｂから保護基を除去する工程；
（v）ペプチドＵの配列に従って、保護基を有するアミノ酸残基をＣ末端からＮ末端の方向へ順に連結し、連結の都度、次の連結のために保護基を除去することによって、さらなる鎖の伸長を行う工程；
（vi）加える残基の数に応じて、アミノ酸残基の連結を終了する工程；および
（vii）必要に応じて、得られた多量体を固相から遊離させる工程
を含む請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
工程（iv）の後に、
（iv）（ａ）連結させた残基Ｂに、保護基を有する残基Ｂをさらに連結する工程；
（iv）（ｂ）（iv）（ａ）で連結させた残基Ｂから保護基を除去する工程；および
（iv）（ｃ）工程（iv）（ａ）および（iv）（ｂ）を繰り返し行う工程、または
（iv）（ｄ）工程（v）および（vi）に進む工程
をさらに含む請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
Ｂがそれぞれ、リジン、アルギニンまたはオルニチンを包含する請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ペプチドＵが、配列番号３またはそのフラグメントもしくは変異体を含む請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記ペプチドＵが、配列番号３６〜４４のいずれかを含む請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
少なくとも１種の微生物の増殖を阻害および／または抑制するための請求項１〜１４、４８〜４９および５１〜５７のいずれか１項に記載の単離多量体。
【請求項２５】
少なくとも１つの微生物感染症の治療に使用するための請求項１〜１４、４８〜４９および５１〜５７のいずれか１項に記載の単離多量体。
【請求項２６】
点眼用の組成物および／もしくは液剤ならびに／またはコンタクトレンズ用液剤に使用するための請求項１〜１４、４８〜４９および５１〜５７のいずれか１項に記載の単離多量体。
【請求項２７】
請求項１〜１４、４８〜４９および５１〜５７のいずれか１項に記載の多量体を含む抗菌組成物。
【請求項２８】
請求項１〜１４、４８〜４９および５１〜５７のいずれか１項に記載の多量体を含む医薬組成物。
【請求項２９】
外用、経口投与用、非経口投与用または吸入用に製剤化されている、請求項２７に記載の抗菌組成物または請求項２８に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
点眼剤および／またはコンタクトレンズ用液剤に適した、請求項２７もしくは２９に記載の抗菌組成物または請求項２８もしくは２９に記載の医薬組成物。
【請求項３１】
請求項１〜１４、４８〜４９および５１〜５７のいずれか１項に記載の多量体ならびに／または請求項２７もしくは２９に記載の抗菌組成物を含むコンタクトレンズ用液剤。
【請求項３２】
請求項１〜１４、４８〜４９および５１〜５７のいずれか１項に記載の多量体を含む、器具をコーティングするための組成物。
【請求項３３】
請求項３２に記載の組成物でコーティングされた器具。
【請求項３４】
医療器具を包含する請求項３３に記載の器具。
【請求項３５】
カテーテル、針、シース、ステントまたは包帯を包含する請求項３３または３４に記載の器具。
【請求項３６】
少なくとも１つの適切な容器に、請求項１〜１４、４８〜４９および５１〜５７のいずれか１項に記載の少なくとも１つの多量体、請求項２７もしくは２９に記載の少なくとも１つの抗菌組成物ならびに／または請求項２８もしくは２９に記載の少なくとも１つの医薬組成物を含むキット。
【請求項３７】
少なくとも１種の微生物の増殖を阻害および／または抑制する方法であって、前記微生物を、請求項１〜１４、４８〜４９および５１〜５７のいずれか１項に記載の少なくとも１つの多量体、ならびに／または請求項２７もしくは２９に記載の抗菌組成物と接触させることを含む方法。
【請求項３８】
請求項１〜１４、４８〜４９および５１〜５７のいずれか１項に記載の少なくとも１つの多量体、請求項２７もしくは２９に記載の少なくとも１つの抗菌組成物ならびに／または請求項２８もしくは２９に記載の少なくとも１つの医薬組成物を対象に投与することを含む、少なくとも１つの微生物感染症を治療する方法。
【請求項３９】
対象における少なくとも１種の微生物の増殖を阻害および／または抑制する方法であって、請求項１〜１４、４８〜４９および５１〜５７のいずれか１項に記載の少なくとも１つの多量体、請求項２７もしくは２９に記載の少なくとも１つの抗菌組成物ならびに／または請求項２８もしくは２９に記載の少なくとも１つの医薬組成物を前記対象に投与することを含む方法。
【請求項４０】
抗菌組成物の製造のための請求項１〜１４、４８〜４９および５１〜５７のいずれか１項に記載の多量体の使用。
【請求項４１】
前記抗菌組成物が、対象における少なくとも１種の微生物の増殖を阻害および／または抑制するために用いられる請求項４０に記載の使用。
【請求項４２】
微生物感染症の治療薬を製造するための請求項１〜１４、４８〜４９および５１〜５７のいずれか１項に記載の多量体の使用。
【請求項４３】
点眼用の組成物および／もしくは液剤ならびに／またはコンタクトレンズ用液剤の製造のための請求項１〜１４、４８〜４９および５１〜５７のいずれか１項に記載の多量体の使用。
【請求項４４】
器具をコーティングするための組成物を製造するための請求項１〜１４、４８〜４９および５１〜５７のいずれか１項に記載の多量体の使用。
【請求項４５】
前記器具が医療器具である請求項４４に記載の使用。
【請求項４６】
前記器具がカテーテル、針、シース、ステントまたは包帯である請求項４４または４５に記載の使用。
【請求項４７】
式［（Ｕ１）（Ｕ２）］ｎ／２（Ｃ）ｎ／２ＢｍＺ（式中、Ｕ１およびＵ２はそれぞれペプチドを含み、Ｕ１≠Ｕ２かつｎ＝２ｘであり、ｘ＝０または正の整数であり、ｍ＝１または０である）で表されるペプチド多量体を製造する方法であって、
（i）少なくとも１つの固相を準備する工程；
（ii）固相に少なくとも１つの１番目のアミノ酸Ｚを結合させる工程；
（iii）必要に応じて、固相に結合させたＺにアミノ酸Ｂを少なくとも１つ連結する工程；
（iv）ＺまたはＢに、異なる保護基で保護された基を少なくとも２つ含むアミノ酸Ｃを少なくとも１つ連結する工程；
（v）連結させたアミノ酸Ｃから第１の保護基を除去して、第１の反応側鎖を露出させる工程；
（vi）Ｃの第１の反応側鎖から、第１のペプチドＵ１の鎖を伸長させる工程；
（vii）連結させたアミノ酸Ｂから第２の保護基を除去して、少なくとも１つの第２の反応側鎖を露出させる工程；および
（viii）Ｃの第２の反応側鎖から、第２のペプチドＵ２の鎖を伸長させる工程
を含む方法。
【請求項４８】
式［（Ｕ１）（Ｕ２）］ｎ／２（Ｃ）ｎ／２ＢｍＺ（式中、Ｕ１およびＵ２はペプチド配列を含み、Ｕ１≠Ｕ２であり、ＣおよびＢはそれぞれ、アミン基を少なくとも２つ有するアミノ酸を包含し、Ｚは任意のアミノ酸を包含し、ｎ＝２ｘであり、ｘ＝０または正の整数であり、ｍ＝１または０である）で表される単離ペプチド多量体。
【請求項４９】
Ｕ１またはＵ２が、配列番号２またはそのフラグメントもしくは変異体を含む請求項４８に記載の単離ペプチド多量体。
【請求項５０】
式Ｕ３Ｕ２ＣＵ１Ｚ（式中、Ｕ１、Ｕ２およびＵ３はそれぞれペプチドを含み、Ｃは、アミン基を少なくとも２つ有するアミノ酸を包含し、Ｚは任意のアミノ酸を包含する）で表されるペプチドトリマーを製造する方法であって、
（i）少なくとも１つの固相を準備する工程；
（ii）固相に少なくとも１つの１番目のアミノ酸Ｚを結合させる工程；および
（iii）Ｚから、ペプチドＵ１の鎖を伸長させる工程
を含み、
（Ａ）前記ペプチドトリマーが、式Ｕ３Ｕ２（Ｃ）Ｕ１Ｚで表されるヘテロペプチドである場合、
（iv）ペプチドＵ１のアミノ酸に、異なる保護基を有するアミノ酸Ｃを連結する工程；
（v）連結させたアミノ酸Ｃから第１の保護基を除去する工程；
（vi）アミノ酸Ｃから、ペプチドＵ２の鎖を伸長させる工程；
（vii）連結させたアミノ酸Ｃから第２の保護基を除去する工程；および
（viii）アミノ酸Ｃから、ペプチドＵ３の鎖を伸長させる工程
をさらに含み、
（Ｂ）Ｕ２＝Ｕ３＝Ｕ１かつＣ＝Ｂであり、前記ペプチドトリマーが式（Ｕ１）２ＢＵ１Ｚを含む場合、
（iv）ペプチドＵ１のアミノ酸に、保護基を有するアミノ酸Ｂを連結する工程；
（v）連結させたアミノ酸Ｂから保護基を除去する工程；および
（vi）アミノ酸Ｂから、２つのペプチドＵ１の鎖を伸長させる工程
をさらに含み、
（Ｃ）Ｕ２＝Ｕ３≠Ｕ１かつＣ＝Ｂであり、前記ペプチドトリマーが式（Ｕ２）２ＢＵ１Ｚを含む場合、
（iv）ペプチドＵ１のアミノ酸に、保護基を有するアミノ酸Ｂを連結する工程；
（v）連結させたアミノ酸Ｂから保護基を除去する工程；および
（vi）アミノ酸Ｂから、少なくとも２つのペプチドＵ２の鎖を伸長させる工程
をさらに含む方法。
【請求項５１】
式Ｕ３Ｕ２ＣＵ１Ｚ（式中、Ｕ１、Ｕ２およびＵ３はそれぞれペプチドを含み、Ｃは、アミン基を少なくとも２つ有するアミノ酸を包含し、Ｚは任意のアミノ酸を包含する）で表される単離ペプチドトリマー。
【請求項５２】
アミノ酸Ｃで分岐している請求項５１に記載の単離ペプチドトリマー。
【請求項５３】
Ｕ１、Ｕ２またはＵ３がそれぞれ、配列番号２またはそのフラグメントもしくは変異体を含む請求項５１または５２に記載の単離ペプチドトリマー。
【請求項５４】
Ｕ２＝Ｕ３≠Ｕ１かつＣ＝Ｂであり、前記ペプチドが（Ｕ２）２ＢＵ１Ｚを含む請求項５１〜５３のいずれか１項に記載の単離ペプチドトリマー。
【請求項５５】
Ｕ１＝Ｕ３≠Ｕ２であり、前記ペプチドが式Ｕ１Ｕ２ＣＵ１Ｚを含む請求項５１〜５３のいずれか１項に記載の単離ペプチドトリマー。
【請求項５６】
Ｕ１＝Ｕ２≠Ｕ３であり、前記ペプチドが式Ｕ３Ｕ１ＣＵ１Ｚを含む請求項５１〜５３のいずれか１項に記載の単離ペプチドトリマー。
【請求項５７】
Ｕ１＝Ｕ２＝Ｕ３かつＣ＝Ｂであり、前記ペプチドが式（Ｕ１）２ＢＵ１Ｚを含む請求項５１〜５３のいずれか１項に記載の単離ペプチドトリマー。
【請求項１】
式（Ｕ）ｎ（式中、Ｕは、配列番号２を含むペプチド、またはそのフラグメントもしくは変異体であり、ｎは２以上である）で表されるディフェンシンペプチドの単離多量体。
【請求項２】
前記ペプチドＵ同士が、共有結合により連結している請求項１に記載の単離多量体。
【請求項３】
前記ペプチドＵ同士が、少なくとも１つのアミノ酸Ｂを介して連結している、先行する請求項のいずれか１項に記載の単離多量体。
【請求項４】
前記ペプチドＵが、配列番号３〜５８のいずれかまたはそのフラグメントもしくは変異体を含む、先行する請求項のいずれか１項に記載の単離多量体。
【請求項５】
前記ペプチドＵが、＋１〜＋１１の電荷を有する、先行する請求項のいずれか１項に記載の単離多量体。
【請求項６】
式（Ｕ）ｎＢｍＺｊ（式中、Ｕは、配列番号３またはそのフラグメントもしくは変異体を含み、Ｂはそれぞれ、アミン基を少なくとも２つ有するアミノ酸を少なくとも１つ包含し、Ｚは任意のアミノ酸を包含し、ｍは１以上であり、ｊは０以上である）を有する、先行する請求項のいずれか１項に記載の単離多量体。
【請求項７】
前記ペプチドＵが、配列番号３６〜４４のいずれかまたはそのフラグメントもしくは変異体を含む請求項６に記載の単離多量体。
【請求項８】
Ｂがそれぞれ、リジン、オルニチンまたはアルギニンを包含する請求項６または７に記載の単離多量体。
【請求項９】
ｍ＝ｎ−１、ｊ＝１かつＢ＝Ｚ＝Ｋであり、前記多量体が式（Ｕ）ｎＫｎ−１Ｋを有し、Ｕが配列番号３６〜４４のいずれかを含む請求項６〜８のいずれか１項に記載の単離多量体。
【請求項１０】
ｎ＝２であり、前記多量体が式（Ｕ）２ＫＫを有し、Ｕが配列番号３６〜４４のいずれかを含む請求項８に記載の単離多量体。
【請求項１１】
ｍ＝ｎ−１、ｊ＝１かつＢ＝Ｚ＝Ｋであり、Ｕが配列番号４４を含み、前記多量体が式（配列番号４４）ｎＫｎ−１Ｋを有する請求項６〜８のいずれか１項に記載の単離多量体。
【請求項１２】
ｎ＝２であり、前記多量体が式（配列番号４４）２ＫＫを有する請求項１１に記載の単離多量体。
【請求項１３】
分岐状である、先行する請求項のいずれか１項に記載の単離多量体。
【請求項１４】
直鎖状である、先行する請求項のいずれか１項に記載の単離多量体。
【請求項１５】
先行する請求項のいずれか１項に記載の多量体の全長または任意の一部をコードする単離核酸分子。
【請求項１６】
請求項１５に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項１７】
請求項１５に記載の核酸分子または請求項１６に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１８】
少なくとも２つのペプチドＵを連結することを含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の多量体を製造する方法。
【請求項１９】
前記多量体が式（Ｕ）ｎＢｍＺｊで表され、
（i）少なくとも１つの固相を準備する工程；
（ii）固相に少なくとも１つの１番目のアミノ酸Ｚを結合させる工程；
（iii）固相に結合させたＺに、保護基を有するアミノ酸残基Ｂを少なくとも１つ連結する工程；
（iv）連結させたアミノ酸残基Ｂから保護基を除去する工程；
（v）ペプチドＵの配列に従って、保護基を有するアミノ酸残基をＣ末端からＮ末端の方向へ順に連結し、連結の都度、次の連結のために保護基を除去することによって、さらなる鎖の伸長を行う工程；
（vi）加える残基の数に応じて、アミノ酸残基の連結を終了する工程；および
（vii）必要に応じて、得られた多量体を固相から遊離させる工程
を含む請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
工程（iv）の後に、
（iv）（ａ）連結させた残基Ｂに、保護基を有する残基Ｂをさらに連結する工程；
（iv）（ｂ）（iv）（ａ）で連結させた残基Ｂから保護基を除去する工程；および
（iv）（ｃ）工程（iv）（ａ）および（iv）（ｂ）を繰り返し行う工程、または
（iv）（ｄ）工程（v）および（vi）に進む工程
をさらに含む請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
Ｂがそれぞれ、リジン、アルギニンまたはオルニチンを包含する請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ペプチドＵが、配列番号３またはそのフラグメントもしくは変異体を含む請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記ペプチドＵが、配列番号３６〜４４のいずれかを含む請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
少なくとも１種の微生物の増殖を阻害および／または抑制するための請求項１〜１４、４８〜４９および５１〜５７のいずれか１項に記載の単離多量体。
【請求項２５】
少なくとも１つの微生物感染症の治療に使用するための請求項１〜１４、４８〜４９および５１〜５７のいずれか１項に記載の単離多量体。
【請求項２６】
点眼用の組成物および／もしくは液剤ならびに／またはコンタクトレンズ用液剤に使用するための請求項１〜１４、４８〜４９および５１〜５７のいずれか１項に記載の単離多量体。
【請求項２７】
請求項１〜１４、４８〜４９および５１〜５７のいずれか１項に記載の多量体を含む抗菌組成物。
【請求項２８】
請求項１〜１４、４８〜４９および５１〜５７のいずれか１項に記載の多量体を含む医薬組成物。
【請求項２９】
外用、経口投与用、非経口投与用または吸入用に製剤化されている、請求項２７に記載の抗菌組成物または請求項２８に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
点眼剤および／またはコンタクトレンズ用液剤に適した、請求項２７もしくは２９に記載の抗菌組成物または請求項２８もしくは２９に記載の医薬組成物。
【請求項３１】
請求項１〜１４、４８〜４９および５１〜５７のいずれか１項に記載の多量体ならびに／または請求項２７もしくは２９に記載の抗菌組成物を含むコンタクトレンズ用液剤。
【請求項３２】
請求項１〜１４、４８〜４９および５１〜５７のいずれか１項に記載の多量体を含む、器具をコーティングするための組成物。
【請求項３３】
請求項３２に記載の組成物でコーティングされた器具。
【請求項３４】
医療器具を包含する請求項３３に記載の器具。
【請求項３５】
カテーテル、針、シース、ステントまたは包帯を包含する請求項３３または３４に記載の器具。
【請求項３６】
少なくとも１つの適切な容器に、請求項１〜１４、４８〜４９および５１〜５７のいずれか１項に記載の少なくとも１つの多量体、請求項２７もしくは２９に記載の少なくとも１つの抗菌組成物ならびに／または請求項２８もしくは２９に記載の少なくとも１つの医薬組成物を含むキット。
【請求項３７】
少なくとも１種の微生物の増殖を阻害および／または抑制する方法であって、前記微生物を、請求項１〜１４、４８〜４９および５１〜５７のいずれか１項に記載の少なくとも１つの多量体、ならびに／または請求項２７もしくは２９に記載の抗菌組成物と接触させることを含む方法。
【請求項３８】
請求項１〜１４、４８〜４９および５１〜５７のいずれか１項に記載の少なくとも１つの多量体、請求項２７もしくは２９に記載の少なくとも１つの抗菌組成物ならびに／または請求項２８もしくは２９に記載の少なくとも１つの医薬組成物を対象に投与することを含む、少なくとも１つの微生物感染症を治療する方法。
【請求項３９】
対象における少なくとも１種の微生物の増殖を阻害および／または抑制する方法であって、請求項１〜１４、４８〜４９および５１〜５７のいずれか１項に記載の少なくとも１つの多量体、請求項２７もしくは２９に記載の少なくとも１つの抗菌組成物ならびに／または請求項２８もしくは２９に記載の少なくとも１つの医薬組成物を前記対象に投与することを含む方法。
【請求項４０】
抗菌組成物の製造のための請求項１〜１４、４８〜４９および５１〜５７のいずれか１項に記載の多量体の使用。
【請求項４１】
前記抗菌組成物が、対象における少なくとも１種の微生物の増殖を阻害および／または抑制するために用いられる請求項４０に記載の使用。
【請求項４２】
微生物感染症の治療薬を製造するための請求項１〜１４、４８〜４９および５１〜５７のいずれか１項に記載の多量体の使用。
【請求項４３】
点眼用の組成物および／もしくは液剤ならびに／またはコンタクトレンズ用液剤の製造のための請求項１〜１４、４８〜４９および５１〜５７のいずれか１項に記載の多量体の使用。
【請求項４４】
器具をコーティングするための組成物を製造するための請求項１〜１４、４８〜４９および５１〜５７のいずれか１項に記載の多量体の使用。
【請求項４５】
前記器具が医療器具である請求項４４に記載の使用。
【請求項４６】
前記器具がカテーテル、針、シース、ステントまたは包帯である請求項４４または４５に記載の使用。
【請求項４７】
式［（Ｕ１）（Ｕ２）］ｎ／２（Ｃ）ｎ／２ＢｍＺ（式中、Ｕ１およびＵ２はそれぞれペプチドを含み、Ｕ１≠Ｕ２かつｎ＝２ｘであり、ｘ＝０または正の整数であり、ｍ＝１または０である）で表されるペプチド多量体を製造する方法であって、
（i）少なくとも１つの固相を準備する工程；
（ii）固相に少なくとも１つの１番目のアミノ酸Ｚを結合させる工程；
（iii）必要に応じて、固相に結合させたＺにアミノ酸Ｂを少なくとも１つ連結する工程；
（iv）ＺまたはＢに、異なる保護基で保護された基を少なくとも２つ含むアミノ酸Ｃを少なくとも１つ連結する工程；
（v）連結させたアミノ酸Ｃから第１の保護基を除去して、第１の反応側鎖を露出させる工程；
（vi）Ｃの第１の反応側鎖から、第１のペプチドＵ１の鎖を伸長させる工程；
（vii）連結させたアミノ酸Ｂから第２の保護基を除去して、少なくとも１つの第２の反応側鎖を露出させる工程；および
（viii）Ｃの第２の反応側鎖から、第２のペプチドＵ２の鎖を伸長させる工程
を含む方法。
【請求項４８】
式［（Ｕ１）（Ｕ２）］ｎ／２（Ｃ）ｎ／２ＢｍＺ（式中、Ｕ１およびＵ２はペプチド配列を含み、Ｕ１≠Ｕ２であり、ＣおよびＢはそれぞれ、アミン基を少なくとも２つ有するアミノ酸を包含し、Ｚは任意のアミノ酸を包含し、ｎ＝２ｘであり、ｘ＝０または正の整数であり、ｍ＝１または０である）で表される単離ペプチド多量体。
【請求項４９】
Ｕ１またはＵ２が、配列番号２またはそのフラグメントもしくは変異体を含む請求項４８に記載の単離ペプチド多量体。
【請求項５０】
式Ｕ３Ｕ２ＣＵ１Ｚ（式中、Ｕ１、Ｕ２およびＵ３はそれぞれペプチドを含み、Ｃは、アミン基を少なくとも２つ有するアミノ酸を包含し、Ｚは任意のアミノ酸を包含する）で表されるペプチドトリマーを製造する方法であって、
（i）少なくとも１つの固相を準備する工程；
（ii）固相に少なくとも１つの１番目のアミノ酸Ｚを結合させる工程；および
（iii）Ｚから、ペプチドＵ１の鎖を伸長させる工程
を含み、
（Ａ）前記ペプチドトリマーが、式Ｕ３Ｕ２（Ｃ）Ｕ１Ｚで表されるヘテロペプチドである場合、
（iv）ペプチドＵ１のアミノ酸に、異なる保護基を有するアミノ酸Ｃを連結する工程；
（v）連結させたアミノ酸Ｃから第１の保護基を除去する工程；
（vi）アミノ酸Ｃから、ペプチドＵ２の鎖を伸長させる工程；
（vii）連結させたアミノ酸Ｃから第２の保護基を除去する工程；および
（viii）アミノ酸Ｃから、ペプチドＵ３の鎖を伸長させる工程
をさらに含み、
（Ｂ）Ｕ２＝Ｕ３＝Ｕ１かつＣ＝Ｂであり、前記ペプチドトリマーが式（Ｕ１）２ＢＵ１Ｚを含む場合、
（iv）ペプチドＵ１のアミノ酸に、保護基を有するアミノ酸Ｂを連結する工程；
（v）連結させたアミノ酸Ｂから保護基を除去する工程；および
（vi）アミノ酸Ｂから、２つのペプチドＵ１の鎖を伸長させる工程
をさらに含み、
（Ｃ）Ｕ２＝Ｕ３≠Ｕ１かつＣ＝Ｂであり、前記ペプチドトリマーが式（Ｕ２）２ＢＵ１Ｚを含む場合、
（iv）ペプチドＵ１のアミノ酸に、保護基を有するアミノ酸Ｂを連結する工程；
（v）連結させたアミノ酸Ｂから保護基を除去する工程；および
（vi）アミノ酸Ｂから、少なくとも２つのペプチドＵ２の鎖を伸長させる工程
をさらに含む方法。
【請求項５１】
式Ｕ３Ｕ２ＣＵ１Ｚ（式中、Ｕ１、Ｕ２およびＵ３はそれぞれペプチドを含み、Ｃは、アミン基を少なくとも２つ有するアミノ酸を包含し、Ｚは任意のアミノ酸を包含する）で表される単離ペプチドトリマー。
【請求項５２】
アミノ酸Ｃで分岐している請求項５１に記載の単離ペプチドトリマー。
【請求項５３】
Ｕ１、Ｕ２またはＵ３がそれぞれ、配列番号２またはそのフラグメントもしくは変異体を含む請求項５１または５２に記載の単離ペプチドトリマー。
【請求項５４】
Ｕ２＝Ｕ３≠Ｕ１かつＣ＝Ｂであり、前記ペプチドが（Ｕ２）２ＢＵ１Ｚを含む請求項５１〜５３のいずれか１項に記載の単離ペプチドトリマー。
【請求項５５】
Ｕ１＝Ｕ３≠Ｕ２であり、前記ペプチドが式Ｕ１Ｕ２ＣＵ１Ｚを含む請求項５１〜５３のいずれか１項に記載の単離ペプチドトリマー。
【請求項５６】
Ｕ１＝Ｕ２≠Ｕ３であり、前記ペプチドが式Ｕ３Ｕ１ＣＵ１Ｚを含む請求項５１〜５３のいずれか１項に記載の単離ペプチドトリマー。
【請求項５７】
Ｕ１＝Ｕ２＝Ｕ３かつＣ＝Ｂであり、前記ペプチドが式（Ｕ１）２ＢＵ１Ｚを含む請求項５１〜５３のいずれか１項に記載の単離ペプチドトリマー。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図７】
【図８】
【図９】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図７】
【図８】
【図９】
【図６】
【公表番号】特表２０１１−５２１９０２（Ｐ２０１１−５２１９０２Ａ）
【公表日】平成２３年７月２８日（２０１１．７．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５０６２３５（Ｐ２０１１−５０６２３５）
【出願日】平成２１年４月２１日（２００９．４．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＳＧ２００９／０００１４４
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１３１５４８
【国際公開日】平成２１年１０月２９日（２００９．１０．２９）
【出願人】（５０８３２０７２３）シンガポール ヘルス サービシーズ ピーティーイー リミテッド (3)
【出願人】（５０８３２０７３４）エイジェンシー フォー サイエンス，テクノロジー アンド リサーチ (7)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年７月２８日（２０１１．７．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年４月２１日（２００９．４．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＳＧ２００９／０００１４４
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１３１５４８
【国際公開日】平成２１年１０月２９日（２００９．１０．２９）
【出願人】（５０８３２０７２３）シンガポール ヘルス サービシーズ ピーティーイー リミテッド (3)
【出願人】（５０８３２０７３４）エイジェンシー フォー サイエンス，テクノロジー アンド リサーチ (7)
【Ｆターム（参考）】
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