新規なワカメペプチド、Ｌ−チロシル−Ｌ−プロリン及び血圧降下剤
【目的】ワカメのプロテアーゼＳアマノ並びにプロレザーＦＧ−１分解液から、アンジオテンシン変換酵素阻害作用を有し、血圧降下作用を有する新規なワカメペプチド、Ｌ−チロシル−Ｌ−プロリンを提供する。
【構成】ワカメをプロテアーゼ等で分解処理し、新規なアンジオテンシン変換酵素阻害作用を有するジペプチドはＬ−チロシル−Ｌ−プロリンであり、この新規なワカメペプチドは生体内での血圧降下作用を有し、毒性も極めて低い。
【構成】ワカメをプロテアーゼ等で分解処理し、新規なアンジオテンシン変換酵素阻害作用を有するジペプチドはＬ−チロシル−Ｌ−プロリンであり、この新規なワカメペプチドは生体内での血圧降下作用を有し、毒性も極めて低い。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬品として有用性を有するＬ−チロシル−Ｌ−プロリンで示されるジペプチド構造を有する新規なワカメペプチド並びにその新規なワカメペプチドを有効成分とする血圧降下剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
食品由来のペプチドは、アンジオテンシン変換酵素阻害剤及び血圧降下剤としての利点を持つ。
【特許文献１】 特許第２０４６４８３号
【特許文献２】 特許第２６７８１８０号
【特許文献３】 特許第２９２０８２９号
【特許文献４】 特許第３１０８９２０号
【特許文献５】 特願２００１−１１３２９５号
【特許文献６】 特願２００１−１１８９１４号
【特許文献７】 特願２００１−２２８７５４号
【特許文献８】 特願２００１−３５５３６８号
【非特許文献１】 マリンバイオテクノロジー、６卷、１６３頁、１９９８年．
【非特許文献２】 日本水産学会誌、６４巻、８６２頁、１９９８年．
【非特許文献３】 マリンバイオテクノロジー、３卷、３０５頁、２００１年．
【非特許文献４】 ジャーナル・ニュートリショナル・バイケミストリー、９卷、４１５頁、１９９８年．
【非特許文献５】 ジャーナル・ニュートリショナル・バイケミストリー、１１卷、４５０頁、２０００年．
【非特許文献６】 Ｓ．Ｈ．Ｆｅｒｒｅｉａ ｅｔ ａｌ：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，９，３５８３（１９７０）．
【非特許文献７】 Ｇ．Ｏｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ：Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｓ．Ａｃｔａ，５６６，１２８（１９７９）．
【非特許文献８】 Ｓ．Ｍａｒｕｙａｍａ ｅｔ ａｌ．：Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４６，１３９３（１９８３）．
【非特許文献９】 山本節子等：日胸疾会誌，１８，２９７−３０２（１９８９）．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
近年、海藻由来の食品たんぱく質の酵素分解中にアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害ペプチド等の薬理活性ペプチドが本発明者によって報告されてきた。すなわち、海苔たんぱく質由来のＡＣＥ阻害ペプチドとしてＩｌｅ−Ｔｙｒ；Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ；Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ；Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ等［非特許文献１］が、ヒジキたんぱく質由来のＡＣＥ阻害ペプチドとしてＧｌｙ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ；Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ；Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ等［非特許文献２］が報告されてきている。微藻類由来としては、クロレラ・スピルリナたんぱく質由来のＡＣＥ阻害ペプチドとしてＩｌｅ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ；Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ；Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ，Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ，Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｌａ，Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ；Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ，Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｐｈｅ等［非特許文献３］が報告されてきている。又、ニンニク抽出物からはＳｅｒ−Ｔｙｒ；Ｇｌｙ−Ｔｙｒ；Ｐｈｅ−Ｔｙｒ；Ａｓｎ−Ｔｙｒ；Ｓｅｒ−Ｐｈｅ；Ｇｌｙ−Ｐｈｅ；Ａｓｎ−Ｐｈｅ等［非特許文献４］が報告されてきている。更には，ワカメたんぱく質由来のＡＣＥ阻害ペプチドとしてＡｌａ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ；Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ；Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ；Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ等［非特許文献５］が報告されてきている。ところで、レニン−アンジオテンシン系が生体の水・電解質及び血液の調節に重要な役割を果たしていることはよく知られている。このレニン−アンジオテンシン系にはアンジオテンシン変換酵素（以下、ＡＣＥと略記する）が存在し、アンジオテンシンＩはＡＣＥによってアンジオテンシンＩＩに変換される。アンジオテンシンＩＩは強力な昇圧物質で、血管、副腎皮質のみならず中枢神経系並びに末梢神経系に働いて血圧上昇を促す。又、ＡＣＥは生体内降圧物質であるブラジキニンを分解し、不活性化する作用を有し、昇圧系に関与している。従って、ＡＣＥの活性を阻害することによって血圧を降下させることが可能であり、又、そのことは臨床的に高血圧の予防、治療に有効であると考えられている。この目的のためプロリン誘導体であるカプトリルが合成され、その降圧作用が確認されて以来、カプトリルの構造研究に基づく種々のＡＣＥ阻害剤の合成研究が盛んに行われ、最近ではマレイン酸エナラブリルやアラセブリル等の物質が、次々と臨床の場に供されている。現在、ＡＣＥ阻害剤は本態性高血圧症、病候性高血圧症を問わず、又、軽症、重症を問わず、幅広く用いられ、高血圧症の第一次選択の治療薬中に加えられ、多く優れた点を有することが見出されている。一方、ＡＣＥ阻害物質の作用機序としては、アンジオテンシンＩＩの産生抑制によるアルドステロンやバソプレッシンの分泌抑制、又、腎動脈収縮の解除によるナトリウムや水の排泄促進が考えられている。更に、ＡＣＥ阻害剤については、それがカリクレン−キニン系の不活性化を抑制し、プロスタグランジン系を賦活させることにより末梢血管拡張やナトリウム及び水の排泄を更に促進させると考えられており、心不全の悪循環を断つ上で合目的な治療薬として期待されている。ＡＣＥ阻害物質としては、上記の合成品の他に天然物又は天然物由来の物質として蛇毒由来のブラジキニン増強因子（Ｃ末端がＰｒｏ）［非特許文献６］、ゼラチンのコラゲナーゼ消化物由来の６種類のペプチド（いずれもＣ末端がＡｌａ−Ｈｙｐ）［非特許文献７］、牛カゼインのトリプシン消化物由来のペプチド（Ｃ末端がＧｌｙ−Ｌｙｓ）［非特許文献８］等に始まり本発明者等のイワシ筋肉由来の５種のヘクサペウチド（いずれもＣ末端から２番目又は３番目がＰｒｏ、Ｎ末端がＬｅｕ）［特許文献１］、海苔たんぱく質由来のテトラペプチド（Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ）［特許文献２］、朝鮮人参たんぱく質由来のペンタペプチド（Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）［特許文献３］、クロレラたんぱく質由来のペンタペプチド（Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｌａ）及び３種のワカメたんぱく質由来のテトラペプチド（Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ，Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ，Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ）［特許文献４］等が挙げられ、いずれもＡＣＥ阻害剤となり得ることが開示されている。先に述べたように、ＡＣＥ阻害剤としてのワカメたんぱく質由来のワカメペプチドに関する提案は本発明者によって多くの提案［特許文献５，６，７，８］がなされているが、ワカメペプチドの中で、規則性を持ったアミノ酸配列を有するジペプチドのＡＣＥ阻害作用（試験管内薬理効果）並びに経口投与による降圧効果（生体内薬理効果）は不明であり、発見されて以来未だ医薬品としての開発が進んでいるとの報告はない（式中、アミノ酸残基を表す各記号は、アミノ酸化学において慣用の表示法によるものである）。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者は、褐藻コンブ目（Ｌａｍｉｎａｒｉａｌｅｓ）の海藻種に属するワカメの蛋白質分解酵素の分解液から薬理作用を有する物質を検索し、新規なワカメペプチドが強いアンジオテンシン変換酵素阻害作用を有することを見出した。そして更に、新規なワカメペプチドを医薬として実用化するための研究を鋭意行った。その結果、この新規なワカメペプチドが血圧降下作用を有し、天然物由来のアンジオテンシン変換酵素阻害剤としての有用性を見出した。本発明は係る知見に基づくものである。本発明に係る新規なワカメペプチドは、Ｌ−チロシル−Ｌ−プロリンで示されるジペプチド構造を有し、常温における性状は白色の粉末である。
【０００５】
本発明による新規なワカメペプチドは、化学的に合成する方法又はワカメのたんぱく質分解酵素の分解液から分離精製する方法を挙げることができる。本発明に係る新規なワカメペプチドを化学的に合成する場合には、液相法又は固相法等の通常のペプチド合成方法によって行うことができるが、好ましくは固相法によってポリマー性の固相支持体へ前記ワカメペプチドのカルボキシル末端側（Ｃ末端）アミノ酸残基に対応したＬ体のアミノ酸を順次ペプチド結合によって結合して行くのが良い。そして、そのようにして得られた合成ジペプチドは、トリフルオロメタンスルホン酸、フッ化水素等を用いてポロマー性の固相支持体から切断した後、アミノ酸側鎖の保護基を除去し、逆相系のカラムを用いた高速液体クロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣと略記する）などを用いた通常の方法で精製することができる。
【０００６】
上記したように、本発明に係る新規なワカメペプチドは、ワカメのたんぱく質分解酵素の分解液から分離精製することができるが、その場合には例えば以下のようにして行うことができる。上記の新規なワカメペプチドを含有しているワカメのたんぱく質部分を用いて加水分解する。加水分解は常法に従って行う。例えば、プロテアーゼＳアマノ、プロレザーＦＧ−１等のタンパク質分解酵素で加水分解する場合は、ワカメを必要とあれば更に加水分解した後、酵素の至適温度まで加温しｐＨを至適値（ｐＨ８．０、ｐＨ１０．０）に調整し酵素を加えてインキュベートする。次いで必要に応じ中和した後、酵素を失活させて加水分解液を得る。その加水分解物を濾紙及び／又はセライト等を用いて濾過することによって不溶性成分を除去し、その得られた濾液をセロファンなどの半透膜を用いて適当な溶媒（例えば、水、トリス−塩酸緩衝液、リン酸緩衝液の中性の緩衝液等）中で十分に透析し、その濾液中の成分で半透膜を通過した成分を含む溶液を強酸性陽イオン交換樹脂（例えば、ダウケミカル社製のＤｏｗｅｘ ５０Ｗ等）にかけ、その吸着溶出分画からアンジオテンシン変換酵素（以下、ＡＣＥと略記する）阻害活性を有する成分を含有する分画を得、得られたＡＣＥ阻害活性画分をゲル濾過（例えば、ファルマシア社製のＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５等）によって分画し、得られたＡＣＥ阻害活性画分を陽イオン交換ゲル濾過（例えば、ファルマシア社製のＳＰ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｃ−２５等）によって分画し、これらクロマトグラフィー精製により得られたＡＣＥ阻害活性画分を、更に逆相ＨＰＬＣによって分画する。
【０００７】
本発明に係る新規なワカメペプチドの製法において用いる褐藻類としては、本発明の目的を達成できる限りいかなる褐藻類を用いても良いが、好ましくはワカメを用いるのが良い。以上のようにして得られた本発明に係る新規なワカメペプチドは、静脈内へ繰り返し投与を行った場合、抗体産生を惹起せず、アナフィラキシーショックを起こさせない。又、本発明に係る新規なワカメペプチドはＬ−アミノ酸のみの配列構造からなり、投与後、生体内のプロテアーゼにより徐々に分解される為、毒性は極めて低く、安全性は極めて高い（ＬＤ５０＞５０００ｍｇ／ｋｇ；ラット経口投与）。新規なワカメペプチドは、通常用いられる賦形剤等の添加物を用いて注射剤、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤等に調製することができる。投与方法としては、通常は、ＡＣＥを有している哺乳類（例えば、ヒト、イヌ、ラット等）に注射すること、あるいは経口投与することがあげられる。投与量は、例えば、動物体１ｋｇ当りこの新規なワカメペプチドを０．０１〜１０ｍｇの量である。投与回数は、通常１日１〜４回程度であるが、投与経路によって、適宜、調製することができる。
【０００８】
上記の各種製剤において用いられる賦形剤、結合剤、潤沢剤の種類は、特に限定されず、通常の注射剤、散剤、顆粒剤、錠剤あるいはカプセル剤に用いられるものを使用することができる。錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤に用いる添加物としては、下記のものをあげることができる。賦形剤としては、結晶セルロース等の糖類、マンニトール等の糖アルコール類、デンプン類、無水リン酸カルシウム等；結合剤としては澱粉類、ヒドロキシプロピルメチルセルローズ等；崩壊剤としてはカルボキシメチルセルロース及びそのカリウム塩類；潤滑剤としてはステアリン酸及びその塩類、タルク、ワックス類を挙げることができる。又、製剤の調整にあたっては必要に応じメントール、クエン酸及びその塩類、香料等の矯臭剤を用いることができる。注射用の無菌組成物は、常法により、新規なワカメペプチドを、注射用水、生理食塩水及びキシリトールやマンニトール等の糖アルコール注射液、プロピレングリコールやポリエチレングリコール等のグリコールに溶解又は懸濁させて注射剤とすることができる。この際、緩衝液、防腐剤、酸化防止剤等を必要に応じて添加することができる。新規なワカメペプチドを含有する製剤は凍結乾燥品又は乾燥粉末の形とし、用時、通常の溶解剤、例えば水又は生理食塩液に溶解して用いることもできる。
【０００９】
本発明に係る新規なワカメペプチドは優れたアンジオテンシン変換酵素阻害作用を有し、血圧降下作用、ブラジキニン不活化抑制作用を示す。従って、本態性高血圧、腎性高血圧、副腎性高血圧等の高血圧症の予防、治療剤、これらうっ血性心不全に対する臓器循環の正常化と長期予後の改善（延命効果）作用を有し、心不全の治療剤として有用である。
【発明を実施するための最良の形態・実施例】
【００１０】
本発明に係る新規なワカメペプチドは、Ｌ−チロシル−Ｌ−プロリンで示されるジペプチド構造を有し、常温における性状は白色の粉末である。以下に実施例として、製造例及び試験例を記載し、本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００１１】
製造例１
徳島県鳴門市大毛島地区において、１９９８年１月から６月にかけて採集した天然産ワカメを十分洗浄して供試料とした。採集されたワカメ葉状部２．４ｋｇを細かく刻み、０．５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．９）２４Ｌを加え攪拌（３７℃、３６時間）後、グラスフィルター（Ｇ−３）で吸引ろ過した。ろ過したペースト液を廃棄し、得られた沈殿物に脱イオン水を加えてホモジナイズ後、凍結乾燥してワカメ由来のたんぱく質とした。このワカメ由来のたんぱく質粉末の一般分析の結果は、水分２．８ｇ／１００ｇ、たんぱく質７４．１ｇ／１００ｇ、脂質２．１ｇ／１００ｇ、糖質１０．４ｇ／１００ｇ、繊維９．１ｇ／１００ｇ、灰分１．５ｇ／１００ｇであった。上記調製したワカメ由来のたんぱく質粉末１０ｇに脱イオン水２５０ｍＬを加えて作成したたんぱく質液に、天野製薬製プロテアーゼＳアマノあるいはプロレザーＦＧ−１各々３００ｍｇ添加後、プロテアーゼＳアマノ添加たんぱく質液のｐＨを８．０に、又、プロレザーＦＧ−１添加たんぱく質液のｐＨを１０．０に調整後、６５℃で５時間撹拌しながら酵素分解を行った。各々分解反応液を直ちに限外濾過膜（アミコン社製、ＹＭ１０型；分画分子量約１万）に通過させた通過液を、Ｄｏｗｅｘ５０Ｗ×４［Ｈ＋］カラム（φ４．０×５５ｃｍ）に加えた。そのカラムを脱イオン水で十分洗滌した後、２規定のアンモニウム水２Ｌを用いて溶出した。減圧濃縮によりアンモニアを除去した後、濃縮液を予め脱イオン水で緩衝化したＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５（φ１．６×１１３ｃｍ）に負荷し、流速１２ｍＬ／ｈｒ、各分画量５．７ｍＬでゲル濾過を行った。ゲル濾過クロマトグラフィー後、ＡＣＥ阻害活性の高い画分を集め減圧濃縮後、予め、脱イオン水で緩衝化したＳＰ−ＳｅｐｈａｄｅｘＣ−２５［Ｈ＋］カラム（φ１．８×４０ｃｍ）に負荷し、脱イオン水５００ｍＬから１．５％塩化ナトリウム５００ｍＬの濃度勾配法を行い、流速７０ｍＬ／ｈｒ、各分画量１０ｍＬでクロマトグラフィーを行った。クロマトグラフィー後、ＡＣＥ阻害活性の高かった画分を集めて凍結乾燥して精製ペプチド粉末を得た。この精製ペプチド粉末２０ｍｇを６０μＬの脱イオン水に溶解した後、高速液体クロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣと略記する）を行った。カラムとしては野村化学社製Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ ＯＤＳ−５（４．５ｍｍＩＤ×２５ｃｍＬ）を使用し、移動相としては０．０５％トリフルオロ酢酸（以下、ＴＦＡと略記する）から２５％アセトニトリル／０．０５％ＴＦＡの濃度勾配法を行い、流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ、検出波長２２０ｎｍでＨＰＬＣを行い、プロテアーゼＳアマノ添加たんぱく質液由来のペプチドフラグメントとして溶出時間６１．１分に、又、プロレザーＦＧ−１添加たんぱく質液由来のペプチドフラグメントとして溶出時間８３．３分に、各々ＡＣＥ阻害活性の高いペプチドフラグメントを得た。このようにして得られたＡＣＥ阻害作用を有するペプチドのアミノ酸配列は、アプライドバイオシステ厶（ＡＢＩ）社製のプロテインシークエンサー４７７Ａ型を用いて決定された。その結果、プロテアーゼＳアマノ添加たんぱく質液由来のペプチドフラグメント並びにプロレザーＦＧ−１添加たんぱく質液由来のペプチドフラグメント共々、Ｌ−チロシル−Ｌ−プロリンで示されるジペプチド構造を有するワカメペプチドであることが確認された。常温における性状は白色の粉末である。
尚、本発明に係るジペプチドすなわち新規なワカメペプチドをＡＣＥ阻害剤として、例えば錠剤に製剤する場合には、常法に従って、例えば次のように処理すればよい：▲１▼ワカメペプチド１１ｇ、▲２▼乳糖６７ｇ、▲３▼コーンスターチ３８ｇ、▲４▼ステアリン酸マグネシウム１．３ｇを原料とし、先ず▲１▼、▲２▼及び２１ｇのコーンスターチを混和し、１２ｇのコーンスターチから作ったペーストとともに顆粒化し、この顆粒に８ｇのコーンスターチと▲４▼とを加え、得られた混合物を圧縮錠剤機で打錠し、錠剤１０００個を製造する。
【００１２】
製造例２
本例は、合成法による製造例である。
Ｌ−チロル−Ｌ−プロリンの合成法
アプライドバイオシステム社製のペプチド自動合成装置４３０Ａ型を用いた固相法によって当該ジペプチドを合成した。固相担体としては、スチレンジビニルベンゼン共重合体（ポリスチレン樹脂）をクロロメチル化した樹脂を使用した。まず、当該ジペプチドのアミノ酸配列に従って、常法どおり、そのＣ末端側のからプロリンからクロロメチル樹脂に反応させペプチド結合樹脂を得た。この時のアミノ酸は、ｔ−ブトキシカルボニル（以下、ｔ−Ｂｏｃと略記する）基で保護されたｔ−Ｂｏｃアミノ酸を使用した。次にこのペプチド結合樹脂をエタンジチオールとチオアニソールからなる混合液に懸濁し、室温で１０分間撹拌後、氷冷下でトリフルオロ酢酸（以下、ＴＦＡと略記する）を加え、更に１０分間撹拌した。この混合液にトリフルオロメタンスルホン酸を滴下し、室温で３０分間撹拌した後、無水エーテルを加えてその生成物を沈澱させて分離し、その沈澱物を無水エーテルで数回洗浄した後、減圧下で乾燥した。このようにして得られた未精製の合成ペプチドは蒸留水又はメタノールに溶解した後、逆相系のカラムＣ１８（５μｍ）を用いたＨＰＬＣにより精製した。移動相として（Ａ）０．１％ＴＦＡ含有蒸留水、（Ｂ）０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリル溶液を使用し、（Ａ）液が６７分間で８１％→６５％の濃度勾配法により流速１．６ｍＬ／ｍｉｎでクロマトグラフィーを行った。紫外部波長２０００ｎｍで検出し、最大の吸収を示した溶出画分を分取し、これを凍結乾燥することによって目的とする合成ジペプチドを得た。
【００１３】
この合成ジペプチドをマススペクトル分析、アミノ酸分析及びアミノ酸配列決定機で、アミノ酸組成がＬ−チロシル−Ｌ−プロリンで示されるジペプチド構造を有するワカメペプチドであることが確認された。合成によって得られた本発明係るジペプチドすなわち新規なワカメペプチドは、以下に示す試験によって薬理効果が確認された。
【００１４】
試験例１
アンジオテンシン変換酵素阻害活性測定法：ＡＣＥ（シグマ社製、酵素番号ＥＣ３．４．１５．１）２．５ｍＵ、合成基質Ｈｉｐｐｕｒｙｌ−Ｌ−ｈｉｓｔｉｄｙｌ−Ｌ−ｌｅｕｃｉｎｅ（ペプチド研究所製）１２．５ｍＭを用いＬｉｅｂｅｒｍａｎの測定法を改良した山本等の方法［非特許文献９］に準じて測定した。すなわち、生成した馬尿酸を酢酸エチルにて抽出し２２５ｎｍの吸光度で測定した。被検液での吸光度をＥｓ、被検液の代わりに緩衝液を加えた時の値をＥｃ、予め反応停止液を加えて反応させた時の値をＥｂとして次式から阻害率（％）を求めた。
阻害率（％）＝（Ｅｃ−Ｅｓ）／（Ｅｃ−Ｅｂ）×１００
ＡＣＥ阻害剤の阻害活性ＩＣ５０値は、ＡＣＥの酵素活性を５０％阻害するために必要な試料の濃度（Ｍ）で示した。本発明に係るジペプチド；Ｌ−チロシル−Ｌ−プロリンの牛肺血清のアンジオテンシン変換酵素に対する阻害活性（ＩＣ５０値）は０．８７μＭと極めて高いものであった。
【００１５】
試験例２
高血圧自然発症ラットへ投与時の降圧効果：実験動物は日本チャールズ・リバー社より１５週齢雄性高血圧自然発症ラット（以下、ＳＨＲと略記する。）を購入し、１週間の予備飼育後、収縮期血圧が１６０ｍｍＨｇ以上（体重２８０〜３３０ｇ）の動物３匹１群として用いた。ラットは、室温２３±２℃、湿度５５±１０％及び１２時間明暗（午前６時〜午後６時点灯）に調整された飼育室でステンレスワイヤー製ラット用個別ゲージに１匹ずつ収容し飼育した。飼料はオリエンタル酵母社製ＭＦ粉末飼料を、飲水は自家揚水（水道水質基準適合）をそれぞれ自由に摂取させた。血圧は非観血的尾動脈血圧測定装置（理研開発社製、ＰＳ−１００型）を用いｔａｉｌ−ｃｕｆｆ法により、投与前を０時間とし、投与後２７時間までと、投与後９週目までの期間で、ＳＨＲ尾動脈の収縮期血圧（ｍｍＨｇ、上値）、平均血圧（ｍｍＨｇ）及び拡張期血圧（ｍｍＨｇ、下値）の測定を一定時間毎に各５回づつ行い、得られた測定値の最高値と最低値を棄却し、３回の平均値をもって各時間の測定値とした。本発明に係る合成Ｌ−チロシル−Ｌ−プロリン１０ｍｇ／ｋｇをＳＨＲに２７時間まで経口投与した時の各血圧値（ｍｍＨｇ）についての結果は、表１に示すとおりである。
【表１】
又、本発明に係る合成ジペプチド；Ｌ−チロシル−Ｌ−プロリン１０ｍｇ／ｋｇをＳＨＲに９週間まで経口投与した時の各血圧値（ｍｍＨｇ）についての結果は、表２に示すとおりである。
【表２】
これらの試験の結果、本発明係るジペプチドすなわち新規なワカメペプチドは、アンジオテンシン変換酵素阻害活性を有し、ｉｎ ｖｉｖｏ（生体内）においても有意な血圧降下作用を示すことが確認された。従って、本発明係るジペプチドすなわち新規なワカメペプチドは高血圧症の治療又は予防薬として有用である。尚、本発明係るジペプチドすなわちＬ−チロシル−Ｌ−プロリンは、構造的にそのアミノ酸配列を部分構造とするペプチドにおいて、構造中に採用することもできる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬品として有用性を有するＬ−チロシル−Ｌ−プロリンで示されるジペプチド構造を有する新規なワカメペプチド並びにその新規なワカメペプチドを有効成分とする血圧降下剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
食品由来のペプチドは、アンジオテンシン変換酵素阻害剤及び血圧降下剤としての利点を持つ。
【特許文献１】 特許第２０４６４８３号
【特許文献２】 特許第２６７８１８０号
【特許文献３】 特許第２９２０８２９号
【特許文献４】 特許第３１０８９２０号
【特許文献５】 特願２００１−１１３２９５号
【特許文献６】 特願２００１−１１８９１４号
【特許文献７】 特願２００１−２２８７５４号
【特許文献８】 特願２００１−３５５３６８号
【非特許文献１】 マリンバイオテクノロジー、６卷、１６３頁、１９９８年．
【非特許文献２】 日本水産学会誌、６４巻、８６２頁、１９９８年．
【非特許文献３】 マリンバイオテクノロジー、３卷、３０５頁、２００１年．
【非特許文献４】 ジャーナル・ニュートリショナル・バイケミストリー、９卷、４１５頁、１９９８年．
【非特許文献５】 ジャーナル・ニュートリショナル・バイケミストリー、１１卷、４５０頁、２０００年．
【非特許文献６】 Ｓ．Ｈ．Ｆｅｒｒｅｉａ ｅｔ ａｌ：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，９，３５８３（１９７０）．
【非特許文献７】 Ｇ．Ｏｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ：Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｓ．Ａｃｔａ，５６６，１２８（１９７９）．
【非特許文献８】 Ｓ．Ｍａｒｕｙａｍａ ｅｔ ａｌ．：Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４６，１３９３（１９８３）．
【非特許文献９】 山本節子等：日胸疾会誌，１８，２９７−３０２（１９８９）．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
近年、海藻由来の食品たんぱく質の酵素分解中にアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害ペプチド等の薬理活性ペプチドが本発明者によって報告されてきた。すなわち、海苔たんぱく質由来のＡＣＥ阻害ペプチドとしてＩｌｅ−Ｔｙｒ；Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ；Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ；Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ等［非特許文献１］が、ヒジキたんぱく質由来のＡＣＥ阻害ペプチドとしてＧｌｙ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ；Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ；Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ等［非特許文献２］が報告されてきている。微藻類由来としては、クロレラ・スピルリナたんぱく質由来のＡＣＥ阻害ペプチドとしてＩｌｅ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ；Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ；Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ，Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ，Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｌａ，Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ；Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ，Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｐｈｅ等［非特許文献３］が報告されてきている。又、ニンニク抽出物からはＳｅｒ−Ｔｙｒ；Ｇｌｙ−Ｔｙｒ；Ｐｈｅ−Ｔｙｒ；Ａｓｎ−Ｔｙｒ；Ｓｅｒ−Ｐｈｅ；Ｇｌｙ−Ｐｈｅ；Ａｓｎ−Ｐｈｅ等［非特許文献４］が報告されてきている。更には，ワカメたんぱく質由来のＡＣＥ阻害ペプチドとしてＡｌａ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ；Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ；Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ；Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ等［非特許文献５］が報告されてきている。ところで、レニン−アンジオテンシン系が生体の水・電解質及び血液の調節に重要な役割を果たしていることはよく知られている。このレニン−アンジオテンシン系にはアンジオテンシン変換酵素（以下、ＡＣＥと略記する）が存在し、アンジオテンシンＩはＡＣＥによってアンジオテンシンＩＩに変換される。アンジオテンシンＩＩは強力な昇圧物質で、血管、副腎皮質のみならず中枢神経系並びに末梢神経系に働いて血圧上昇を促す。又、ＡＣＥは生体内降圧物質であるブラジキニンを分解し、不活性化する作用を有し、昇圧系に関与している。従って、ＡＣＥの活性を阻害することによって血圧を降下させることが可能であり、又、そのことは臨床的に高血圧の予防、治療に有効であると考えられている。この目的のためプロリン誘導体であるカプトリルが合成され、その降圧作用が確認されて以来、カプトリルの構造研究に基づく種々のＡＣＥ阻害剤の合成研究が盛んに行われ、最近ではマレイン酸エナラブリルやアラセブリル等の物質が、次々と臨床の場に供されている。現在、ＡＣＥ阻害剤は本態性高血圧症、病候性高血圧症を問わず、又、軽症、重症を問わず、幅広く用いられ、高血圧症の第一次選択の治療薬中に加えられ、多く優れた点を有することが見出されている。一方、ＡＣＥ阻害物質の作用機序としては、アンジオテンシンＩＩの産生抑制によるアルドステロンやバソプレッシンの分泌抑制、又、腎動脈収縮の解除によるナトリウムや水の排泄促進が考えられている。更に、ＡＣＥ阻害剤については、それがカリクレン−キニン系の不活性化を抑制し、プロスタグランジン系を賦活させることにより末梢血管拡張やナトリウム及び水の排泄を更に促進させると考えられており、心不全の悪循環を断つ上で合目的な治療薬として期待されている。ＡＣＥ阻害物質としては、上記の合成品の他に天然物又は天然物由来の物質として蛇毒由来のブラジキニン増強因子（Ｃ末端がＰｒｏ）［非特許文献６］、ゼラチンのコラゲナーゼ消化物由来の６種類のペプチド（いずれもＣ末端がＡｌａ−Ｈｙｐ）［非特許文献７］、牛カゼインのトリプシン消化物由来のペプチド（Ｃ末端がＧｌｙ−Ｌｙｓ）［非特許文献８］等に始まり本発明者等のイワシ筋肉由来の５種のヘクサペウチド（いずれもＣ末端から２番目又は３番目がＰｒｏ、Ｎ末端がＬｅｕ）［特許文献１］、海苔たんぱく質由来のテトラペプチド（Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ）［特許文献２］、朝鮮人参たんぱく質由来のペンタペプチド（Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）［特許文献３］、クロレラたんぱく質由来のペンタペプチド（Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｌａ）及び３種のワカメたんぱく質由来のテトラペプチド（Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ，Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ，Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ）［特許文献４］等が挙げられ、いずれもＡＣＥ阻害剤となり得ることが開示されている。先に述べたように、ＡＣＥ阻害剤としてのワカメたんぱく質由来のワカメペプチドに関する提案は本発明者によって多くの提案［特許文献５，６，７，８］がなされているが、ワカメペプチドの中で、規則性を持ったアミノ酸配列を有するジペプチドのＡＣＥ阻害作用（試験管内薬理効果）並びに経口投与による降圧効果（生体内薬理効果）は不明であり、発見されて以来未だ医薬品としての開発が進んでいるとの報告はない（式中、アミノ酸残基を表す各記号は、アミノ酸化学において慣用の表示法によるものである）。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者は、褐藻コンブ目（Ｌａｍｉｎａｒｉａｌｅｓ）の海藻種に属するワカメの蛋白質分解酵素の分解液から薬理作用を有する物質を検索し、新規なワカメペプチドが強いアンジオテンシン変換酵素阻害作用を有することを見出した。そして更に、新規なワカメペプチドを医薬として実用化するための研究を鋭意行った。その結果、この新規なワカメペプチドが血圧降下作用を有し、天然物由来のアンジオテンシン変換酵素阻害剤としての有用性を見出した。本発明は係る知見に基づくものである。本発明に係る新規なワカメペプチドは、Ｌ−チロシル−Ｌ−プロリンで示されるジペプチド構造を有し、常温における性状は白色の粉末である。
【０００５】
本発明による新規なワカメペプチドは、化学的に合成する方法又はワカメのたんぱく質分解酵素の分解液から分離精製する方法を挙げることができる。本発明に係る新規なワカメペプチドを化学的に合成する場合には、液相法又は固相法等の通常のペプチド合成方法によって行うことができるが、好ましくは固相法によってポリマー性の固相支持体へ前記ワカメペプチドのカルボキシル末端側（Ｃ末端）アミノ酸残基に対応したＬ体のアミノ酸を順次ペプチド結合によって結合して行くのが良い。そして、そのようにして得られた合成ジペプチドは、トリフルオロメタンスルホン酸、フッ化水素等を用いてポロマー性の固相支持体から切断した後、アミノ酸側鎖の保護基を除去し、逆相系のカラムを用いた高速液体クロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣと略記する）などを用いた通常の方法で精製することができる。
【０００６】
上記したように、本発明に係る新規なワカメペプチドは、ワカメのたんぱく質分解酵素の分解液から分離精製することができるが、その場合には例えば以下のようにして行うことができる。上記の新規なワカメペプチドを含有しているワカメのたんぱく質部分を用いて加水分解する。加水分解は常法に従って行う。例えば、プロテアーゼＳアマノ、プロレザーＦＧ−１等のタンパク質分解酵素で加水分解する場合は、ワカメを必要とあれば更に加水分解した後、酵素の至適温度まで加温しｐＨを至適値（ｐＨ８．０、ｐＨ１０．０）に調整し酵素を加えてインキュベートする。次いで必要に応じ中和した後、酵素を失活させて加水分解液を得る。その加水分解物を濾紙及び／又はセライト等を用いて濾過することによって不溶性成分を除去し、その得られた濾液をセロファンなどの半透膜を用いて適当な溶媒（例えば、水、トリス−塩酸緩衝液、リン酸緩衝液の中性の緩衝液等）中で十分に透析し、その濾液中の成分で半透膜を通過した成分を含む溶液を強酸性陽イオン交換樹脂（例えば、ダウケミカル社製のＤｏｗｅｘ ５０Ｗ等）にかけ、その吸着溶出分画からアンジオテンシン変換酵素（以下、ＡＣＥと略記する）阻害活性を有する成分を含有する分画を得、得られたＡＣＥ阻害活性画分をゲル濾過（例えば、ファルマシア社製のＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５等）によって分画し、得られたＡＣＥ阻害活性画分を陽イオン交換ゲル濾過（例えば、ファルマシア社製のＳＰ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｃ−２５等）によって分画し、これらクロマトグラフィー精製により得られたＡＣＥ阻害活性画分を、更に逆相ＨＰＬＣによって分画する。
【０００７】
本発明に係る新規なワカメペプチドの製法において用いる褐藻類としては、本発明の目的を達成できる限りいかなる褐藻類を用いても良いが、好ましくはワカメを用いるのが良い。以上のようにして得られた本発明に係る新規なワカメペプチドは、静脈内へ繰り返し投与を行った場合、抗体産生を惹起せず、アナフィラキシーショックを起こさせない。又、本発明に係る新規なワカメペプチドはＬ−アミノ酸のみの配列構造からなり、投与後、生体内のプロテアーゼにより徐々に分解される為、毒性は極めて低く、安全性は極めて高い（ＬＤ５０＞５０００ｍｇ／ｋｇ；ラット経口投与）。新規なワカメペプチドは、通常用いられる賦形剤等の添加物を用いて注射剤、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤等に調製することができる。投与方法としては、通常は、ＡＣＥを有している哺乳類（例えば、ヒト、イヌ、ラット等）に注射すること、あるいは経口投与することがあげられる。投与量は、例えば、動物体１ｋｇ当りこの新規なワカメペプチドを０．０１〜１０ｍｇの量である。投与回数は、通常１日１〜４回程度であるが、投与経路によって、適宜、調製することができる。
【０００８】
上記の各種製剤において用いられる賦形剤、結合剤、潤沢剤の種類は、特に限定されず、通常の注射剤、散剤、顆粒剤、錠剤あるいはカプセル剤に用いられるものを使用することができる。錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤に用いる添加物としては、下記のものをあげることができる。賦形剤としては、結晶セルロース等の糖類、マンニトール等の糖アルコール類、デンプン類、無水リン酸カルシウム等；結合剤としては澱粉類、ヒドロキシプロピルメチルセルローズ等；崩壊剤としてはカルボキシメチルセルロース及びそのカリウム塩類；潤滑剤としてはステアリン酸及びその塩類、タルク、ワックス類を挙げることができる。又、製剤の調整にあたっては必要に応じメントール、クエン酸及びその塩類、香料等の矯臭剤を用いることができる。注射用の無菌組成物は、常法により、新規なワカメペプチドを、注射用水、生理食塩水及びキシリトールやマンニトール等の糖アルコール注射液、プロピレングリコールやポリエチレングリコール等のグリコールに溶解又は懸濁させて注射剤とすることができる。この際、緩衝液、防腐剤、酸化防止剤等を必要に応じて添加することができる。新規なワカメペプチドを含有する製剤は凍結乾燥品又は乾燥粉末の形とし、用時、通常の溶解剤、例えば水又は生理食塩液に溶解して用いることもできる。
【０００９】
本発明に係る新規なワカメペプチドは優れたアンジオテンシン変換酵素阻害作用を有し、血圧降下作用、ブラジキニン不活化抑制作用を示す。従って、本態性高血圧、腎性高血圧、副腎性高血圧等の高血圧症の予防、治療剤、これらうっ血性心不全に対する臓器循環の正常化と長期予後の改善（延命効果）作用を有し、心不全の治療剤として有用である。
【発明を実施するための最良の形態・実施例】
【００１０】
本発明に係る新規なワカメペプチドは、Ｌ−チロシル−Ｌ−プロリンで示されるジペプチド構造を有し、常温における性状は白色の粉末である。以下に実施例として、製造例及び試験例を記載し、本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００１１】
製造例１
徳島県鳴門市大毛島地区において、１９９８年１月から６月にかけて採集した天然産ワカメを十分洗浄して供試料とした。採集されたワカメ葉状部２．４ｋｇを細かく刻み、０．５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．９）２４Ｌを加え攪拌（３７℃、３６時間）後、グラスフィルター（Ｇ−３）で吸引ろ過した。ろ過したペースト液を廃棄し、得られた沈殿物に脱イオン水を加えてホモジナイズ後、凍結乾燥してワカメ由来のたんぱく質とした。このワカメ由来のたんぱく質粉末の一般分析の結果は、水分２．８ｇ／１００ｇ、たんぱく質７４．１ｇ／１００ｇ、脂質２．１ｇ／１００ｇ、糖質１０．４ｇ／１００ｇ、繊維９．１ｇ／１００ｇ、灰分１．５ｇ／１００ｇであった。上記調製したワカメ由来のたんぱく質粉末１０ｇに脱イオン水２５０ｍＬを加えて作成したたんぱく質液に、天野製薬製プロテアーゼＳアマノあるいはプロレザーＦＧ−１各々３００ｍｇ添加後、プロテアーゼＳアマノ添加たんぱく質液のｐＨを８．０に、又、プロレザーＦＧ−１添加たんぱく質液のｐＨを１０．０に調整後、６５℃で５時間撹拌しながら酵素分解を行った。各々分解反応液を直ちに限外濾過膜（アミコン社製、ＹＭ１０型；分画分子量約１万）に通過させた通過液を、Ｄｏｗｅｘ５０Ｗ×４［Ｈ＋］カラム（φ４．０×５５ｃｍ）に加えた。そのカラムを脱イオン水で十分洗滌した後、２規定のアンモニウム水２Ｌを用いて溶出した。減圧濃縮によりアンモニアを除去した後、濃縮液を予め脱イオン水で緩衝化したＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５（φ１．６×１１３ｃｍ）に負荷し、流速１２ｍＬ／ｈｒ、各分画量５．７ｍＬでゲル濾過を行った。ゲル濾過クロマトグラフィー後、ＡＣＥ阻害活性の高い画分を集め減圧濃縮後、予め、脱イオン水で緩衝化したＳＰ−ＳｅｐｈａｄｅｘＣ−２５［Ｈ＋］カラム（φ１．８×４０ｃｍ）に負荷し、脱イオン水５００ｍＬから１．５％塩化ナトリウム５００ｍＬの濃度勾配法を行い、流速７０ｍＬ／ｈｒ、各分画量１０ｍＬでクロマトグラフィーを行った。クロマトグラフィー後、ＡＣＥ阻害活性の高かった画分を集めて凍結乾燥して精製ペプチド粉末を得た。この精製ペプチド粉末２０ｍｇを６０μＬの脱イオン水に溶解した後、高速液体クロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣと略記する）を行った。カラムとしては野村化学社製Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ ＯＤＳ−５（４．５ｍｍＩＤ×２５ｃｍＬ）を使用し、移動相としては０．０５％トリフルオロ酢酸（以下、ＴＦＡと略記する）から２５％アセトニトリル／０．０５％ＴＦＡの濃度勾配法を行い、流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ、検出波長２２０ｎｍでＨＰＬＣを行い、プロテアーゼＳアマノ添加たんぱく質液由来のペプチドフラグメントとして溶出時間６１．１分に、又、プロレザーＦＧ−１添加たんぱく質液由来のペプチドフラグメントとして溶出時間８３．３分に、各々ＡＣＥ阻害活性の高いペプチドフラグメントを得た。このようにして得られたＡＣＥ阻害作用を有するペプチドのアミノ酸配列は、アプライドバイオシステ厶（ＡＢＩ）社製のプロテインシークエンサー４７７Ａ型を用いて決定された。その結果、プロテアーゼＳアマノ添加たんぱく質液由来のペプチドフラグメント並びにプロレザーＦＧ−１添加たんぱく質液由来のペプチドフラグメント共々、Ｌ−チロシル−Ｌ−プロリンで示されるジペプチド構造を有するワカメペプチドであることが確認された。常温における性状は白色の粉末である。
尚、本発明に係るジペプチドすなわち新規なワカメペプチドをＡＣＥ阻害剤として、例えば錠剤に製剤する場合には、常法に従って、例えば次のように処理すればよい：▲１▼ワカメペプチド１１ｇ、▲２▼乳糖６７ｇ、▲３▼コーンスターチ３８ｇ、▲４▼ステアリン酸マグネシウム１．３ｇを原料とし、先ず▲１▼、▲２▼及び２１ｇのコーンスターチを混和し、１２ｇのコーンスターチから作ったペーストとともに顆粒化し、この顆粒に８ｇのコーンスターチと▲４▼とを加え、得られた混合物を圧縮錠剤機で打錠し、錠剤１０００個を製造する。
【００１２】
製造例２
本例は、合成法による製造例である。
Ｌ−チロル−Ｌ−プロリンの合成法
アプライドバイオシステム社製のペプチド自動合成装置４３０Ａ型を用いた固相法によって当該ジペプチドを合成した。固相担体としては、スチレンジビニルベンゼン共重合体（ポリスチレン樹脂）をクロロメチル化した樹脂を使用した。まず、当該ジペプチドのアミノ酸配列に従って、常法どおり、そのＣ末端側のからプロリンからクロロメチル樹脂に反応させペプチド結合樹脂を得た。この時のアミノ酸は、ｔ−ブトキシカルボニル（以下、ｔ−Ｂｏｃと略記する）基で保護されたｔ−Ｂｏｃアミノ酸を使用した。次にこのペプチド結合樹脂をエタンジチオールとチオアニソールからなる混合液に懸濁し、室温で１０分間撹拌後、氷冷下でトリフルオロ酢酸（以下、ＴＦＡと略記する）を加え、更に１０分間撹拌した。この混合液にトリフルオロメタンスルホン酸を滴下し、室温で３０分間撹拌した後、無水エーテルを加えてその生成物を沈澱させて分離し、その沈澱物を無水エーテルで数回洗浄した後、減圧下で乾燥した。このようにして得られた未精製の合成ペプチドは蒸留水又はメタノールに溶解した後、逆相系のカラムＣ１８（５μｍ）を用いたＨＰＬＣにより精製した。移動相として（Ａ）０．１％ＴＦＡ含有蒸留水、（Ｂ）０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリル溶液を使用し、（Ａ）液が６７分間で８１％→６５％の濃度勾配法により流速１．６ｍＬ／ｍｉｎでクロマトグラフィーを行った。紫外部波長２０００ｎｍで検出し、最大の吸収を示した溶出画分を分取し、これを凍結乾燥することによって目的とする合成ジペプチドを得た。
【００１３】
この合成ジペプチドをマススペクトル分析、アミノ酸分析及びアミノ酸配列決定機で、アミノ酸組成がＬ−チロシル−Ｌ−プロリンで示されるジペプチド構造を有するワカメペプチドであることが確認された。合成によって得られた本発明係るジペプチドすなわち新規なワカメペプチドは、以下に示す試験によって薬理効果が確認された。
【００１４】
試験例１
アンジオテンシン変換酵素阻害活性測定法：ＡＣＥ（シグマ社製、酵素番号ＥＣ３．４．１５．１）２．５ｍＵ、合成基質Ｈｉｐｐｕｒｙｌ−Ｌ−ｈｉｓｔｉｄｙｌ−Ｌ−ｌｅｕｃｉｎｅ（ペプチド研究所製）１２．５ｍＭを用いＬｉｅｂｅｒｍａｎの測定法を改良した山本等の方法［非特許文献９］に準じて測定した。すなわち、生成した馬尿酸を酢酸エチルにて抽出し２２５ｎｍの吸光度で測定した。被検液での吸光度をＥｓ、被検液の代わりに緩衝液を加えた時の値をＥｃ、予め反応停止液を加えて反応させた時の値をＥｂとして次式から阻害率（％）を求めた。
阻害率（％）＝（Ｅｃ−Ｅｓ）／（Ｅｃ−Ｅｂ）×１００
ＡＣＥ阻害剤の阻害活性ＩＣ５０値は、ＡＣＥの酵素活性を５０％阻害するために必要な試料の濃度（Ｍ）で示した。本発明に係るジペプチド；Ｌ−チロシル−Ｌ−プロリンの牛肺血清のアンジオテンシン変換酵素に対する阻害活性（ＩＣ５０値）は０．８７μＭと極めて高いものであった。
【００１５】
試験例２
高血圧自然発症ラットへ投与時の降圧効果：実験動物は日本チャールズ・リバー社より１５週齢雄性高血圧自然発症ラット（以下、ＳＨＲと略記する。）を購入し、１週間の予備飼育後、収縮期血圧が１６０ｍｍＨｇ以上（体重２８０〜３３０ｇ）の動物３匹１群として用いた。ラットは、室温２３±２℃、湿度５５±１０％及び１２時間明暗（午前６時〜午後６時点灯）に調整された飼育室でステンレスワイヤー製ラット用個別ゲージに１匹ずつ収容し飼育した。飼料はオリエンタル酵母社製ＭＦ粉末飼料を、飲水は自家揚水（水道水質基準適合）をそれぞれ自由に摂取させた。血圧は非観血的尾動脈血圧測定装置（理研開発社製、ＰＳ−１００型）を用いｔａｉｌ−ｃｕｆｆ法により、投与前を０時間とし、投与後２７時間までと、投与後９週目までの期間で、ＳＨＲ尾動脈の収縮期血圧（ｍｍＨｇ、上値）、平均血圧（ｍｍＨｇ）及び拡張期血圧（ｍｍＨｇ、下値）の測定を一定時間毎に各５回づつ行い、得られた測定値の最高値と最低値を棄却し、３回の平均値をもって各時間の測定値とした。本発明に係る合成Ｌ−チロシル−Ｌ−プロリン１０ｍｇ／ｋｇをＳＨＲに２７時間まで経口投与した時の各血圧値（ｍｍＨｇ）についての結果は、表１に示すとおりである。
【表１】
又、本発明に係る合成ジペプチド；Ｌ−チロシル−Ｌ−プロリン１０ｍｇ／ｋｇをＳＨＲに９週間まで経口投与した時の各血圧値（ｍｍＨｇ）についての結果は、表２に示すとおりである。
【表２】
これらの試験の結果、本発明係るジペプチドすなわち新規なワカメペプチドは、アンジオテンシン変換酵素阻害活性を有し、ｉｎ ｖｉｖｏ（生体内）においても有意な血圧降下作用を示すことが確認された。従って、本発明係るジペプチドすなわち新規なワカメペプチドは高血圧症の治療又は予防薬として有用である。尚、本発明係るジペプチドすなわちＬ−チロシル−Ｌ−プロリンは、構造的にそのアミノ酸配列を部分構造とするペプチドにおいて、構造中に採用することもできる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次式；Ｌ−チロシル−Ｌ−プロリン
で示されるジペプチド構造を有する新規なワカメペプチド。
【請求項２】
次式；Ｌ−チロシル−Ｌ−プロリン
で示されるジペプチド構造を有する新規なワカメペプチドを有効成分として含有することを特徴とする血圧降下剤。
【請求項１】
次式；Ｌ−チロシル−Ｌ−プロリン
で示されるジペプチド構造を有する新規なワカメペプチド。
【請求項２】
次式；Ｌ−チロシル−Ｌ−プロリン
で示されるジペプチド構造を有する新規なワカメペプチドを有効成分として含有することを特徴とする血圧降下剤。
【公開番号】特開２００７−１８２４１５（Ｐ２００７−１８２４１５Ａ）
【公開日】平成１９年７月１９日（２００７．７．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２７６４３（Ｐ２００６−２７６４３）
【出願日】平成１８年１月６日（２００６．１．６）
【出願人】（５０５４４７１５７）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年７月１９日（２００７．７．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１月６日（２００６．１．６）
【出願人】（５０５４４７１５７）
【Ｆターム（参考）】
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