新規エンテロバクター・アエロゲネス菌株およびその利用
【課題】バイオディーゼル廃液から水素およびエタノールを効率良く製造することができる新規エンテロバクター・アエロゲネス菌株およびその利用を提供する。
【解決手段】様々な土地からサンプリングした土壌、川の水等から、高濃度のグリセロール含有バイオディーゼル廃液を処理できるエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株およびエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株を見出した。
【解決手段】様々な土地からサンプリングした土壌、川の水等から、高濃度のグリセロール含有バイオディーゼル廃液を処理できるエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株およびエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株を見出した。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物性油脂、動物性油脂、廃油等の油脂をメチルエステル化してバイオディーゼル燃料を製造する際に副生成物として得られる、いわゆるバイオディーゼル廃液から水素およびエタノールを効率良く製造することができる新規エンテロバクター・アエロゲネス菌株、および上記菌株を用いて水素およびエタノールを効率良く製造する方法、並びに当該方法を行なうために用いられるキットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
バイオディーゼル燃料(BDF)は植物性油脂、動物性油脂、および廃油等の油脂をリパーゼの存在下でメタノールと反応（メタノリシス反応）させることにより得られる脂肪酸メチルエステルのことであり、軽油代替エネルギーとして車、船、自家発電用燃料など様々な用途が期待されている。特に、植物から製造されるBDFは、カーボンニュートラルが成立するため、地表圏上のCO2の絶対量を増加させないこと、排ガス中に硫黄酸化物（SOｘ）を殆ど排出されないこと、S.P.M (Suspended Particulate Matter)の排出量が従来のBDFの１／３程度に抑えられること等の利点を有している。
【０００３】
バイオディーゼル燃料の生産には、現在化学触媒法(水酸化カリウムなどのアルカリを原料に混ぜ合わせて反応させる)が主に利用されている。しかし、この方法では高濃度グリセロール含有廃液（バイオディーゼル廃液）が副産物として同時に生成され、その処理が問題となっている。一方、そのような欠点を改善し、環境に負荷をかけない生産法として酵素触媒法があるが、この方法は酵素生成のコストが高く、実用化に至っていない。
【０００４】
上記現状に鑑みて、上記グリセロール含有廃液の有効利用を行うべく、上記廃液から水素を回収する方法の開発が試みられている。例えば、特許文献１においては副生成物であるグリセロールを加熱気化させて水素ガスを発生させ回収する装置について記載されている。しかし、この方法は、加熱気化に相当量の熱量を必要とし、コスト面等に問題を有している。
【０００５】
一方、通性嫌気性細菌エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）は、グルコース等から水素を発酵生産することが知られている（非特許文献１参照）。また、本発明者らは、独自に分離したエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ１０１株が、市販グリセロールを基質として発酵させた時に、最大の水素生産量が得られることを確認している（非特許文献２参照）。さらに、本発明者らは、上記ＨＵ１０１株を固定可能な多孔質担体を用いることにより、バイオディーゼル廃液を原料とした場合でも、水素生産速度を向上させることが可能であることを確認している（特許文献２参照）。
【非特許文献１】谷生 重晴ら、「Enterobacter aerogenes の発酵水素発生と利用基質について」、醗酵工学会誌、第６７巻、第１号、ｐ２９−３４、１９８９
【非特許文献２】Y. Nakashimada, M.A. Rachman, T. Kakizono, N. Nishio, "Hydrogen production of Enterobacter aerogenes altered by extracellular and intracellular redox states" International Journal of Hydrogen Energy 27(2002),1399-1405
【特許文献１】特開２００４−２０９４１５号公報（公開日：平成１６年７月２９日）
【特許文献２】特開２００６−１８０７８２号公報（公開日：平成１８年７月１３日）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ１０１株が資化できるグリセロール濃度は１０〜２０ｇ／ｌであり、それ以上の濃度下では水素を安定に生産することはできていなかった。バイオディーゼル廃液に含まれるグリセロールの濃度が約４００〜４５０ｇ／ｌであることに鑑みると、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ１０１株で処理するためには、上記廃液を４０倍近く希釈しなければならないため、処理効率をさらに向上させることが望まれている。
【０００７】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、バイオディーゼル廃液から水素およびエタノールを効率良く製造することができる新規エンテロバクター・アエロゲネス菌株およびその利用を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、様々な土地からサンプリングした土壌、川の水等から、より高濃度のグリセロール含有バイオディーゼル廃液を処理できる細菌を鋭意探索した。その結果、新規エンテロバクター・アエロゲネス菌株であるエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株およびエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株が、バイオディーゼル廃液を５〜６倍希釈して調製した、グリセロール濃度が７５ｇ／ｌという高濃度の原料液中でも生育でき、水素およびエタノールを安定的に生産可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
本発明は、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株（以下、単に「ＨＵ２０１菌株」とも称する）に係るものであることを特徴としている。また、本発明は、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株（以下、単に「ＨＵ２０２菌株」とも称する）に係るものであることを特徴としている。
【００１０】
エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ１０１株は、バイオディーゼル廃液を含む原料液を用いる場合、水素の生産効率を高めるためには多孔質担体に固定する必要があった。一方、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株およびエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株は、バイオディーゼル廃液を含む原料液であっても、多孔質担体に固定する必要はなく、しかも高濃度のグリセロール含有バイオディーゼル廃液から水素およびエタノールを生産することができる。
【００１１】
それゆえ、バイオディーゼル廃液の希釈率を従来よりも格段に低くすることができ、高濃度のグリセロール含有バイオディーゼル廃液からの水素およびエタノールの生産効率を簡便かつ飛躍的に向上させることができる。したがって、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ１０１株を用いる場合よりも、さらにバイオディーゼル廃液の有効利用を図ることができるといえる。
【００１２】
本発明に係る菌株は、油脂をメチルエステル化して得られる生成物からメチルエステルを除去して得られるバイオディーゼル廃液を含み、グリセロール濃度が５０ｇ／ｌである原料液中のグリセロールを１５g／ｌ以上資化できることが好ましい。なお、油脂をメチルエステル化して得られる生成物からメチルエステルを除去して得られるバイオディーゼル廃液を含む原料液を、以下、単に「原料液」という場合がある。
【００１３】
エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ１０１株は、グリセロール濃度が１０〜２０ｇ／ｌの原料液しか資化できず、グリセロール濃度が５０ｇ／ｌである原料液中での生育は困難であった。上記ＨＵ２０１菌株およびＨＵ２０２菌株は、グリセロール濃度が５０ｇ／ｌである原料液中でも十分に生育でき、しかも原料液中のグリセロールを１５g／ｌ以上資化できる。それゆえ、バイオディーゼル廃液を効率的に利用することができる。
【００１４】
本発明に係るグリセロール資化剤は、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株および／またはエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株を含有することが好ましい。
【００１５】
上述のように、これらの本発明に係る菌株は、従来よりもはるかに高濃度のグリセロールを含有する原料液から、安定的に水素およびエタノールを生産することができる。したがって、上記構成によれば、従来廃棄されていたバイオディーゼル廃液の有効利用を図ることができる。
【００１６】
本発明に係る水素およびエタノールの製造方法は、原料液として、油脂をメチルエステル化して得られる生成物からメチルエステルを除去して得られるバイオディーゼル廃液を含むものを用い、上記原料液を、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株および／またはエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株によって発酵させる発酵工程を含むことが好ましい。
【００１７】
上記バイオディーゼル廃液は、その大部分がグリセロールである。エンテロバクター（Enterobacter）属細菌は、そのグリセロールを利用して水素およびエタノールを発酵生産することができる。そして、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株およびエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株は、グリセロールを高濃度に含有するバイオディーゼル廃液を含む原料液中でも生育でき、グリセロールを資化して水素およびエタノールを生産することができる。
【００１８】
したがって、上記構成によれば、バイオディーゼル廃液からの水素およびエタノールの発酵生産の効率を従来法に比して格段に向上させることができる。
【００１９】
本発明に係る水素およびエタノールの製造方法は、上記原料液がコーンスティープリカーを含有することが好ましい。
【００２０】
後述する実施例に示すように、コーンスティープリカー（以下「ＣＳＬ」称する）を原料液に含有させることによって、グリセロール濃度９０ｇ／ｌという、エンテロバクター（Enterobacter）属細菌の生育が通常確認できなかった高濃度の原料液中であってもエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株およびエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株を生育させることが可能となる。それゆえ、上記構成によれば、バイオディーゼル廃液からの水素およびエタノールの発酵生産の効率をさらに飛躍的に向上させることができる。
【００２１】
本発明に係る水素およびエタノールの製造方法は、上記原料液のグリセロール濃度が２０ｇ／ｌを超えることが好ましい。
【００２２】
エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ１０１株を用いた従来の方法では、グリセロール濃度が２０ｇ／ｌを超える原料液を資化することはできなかった。上記構成によれば、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株およびエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株が高濃度のグリセロールを含有する原料液中でも生育可能であるため、グリセロール濃度が２０ｇ／ｌを超えていても、原料液を十分に資化し、水素およびエタノールを生産することができる。よって、バイオディーゼル廃液からの水素およびエタノールの発酵生産の効率を向上させることができる。
【００２３】
本発明に係る水素およびエタノールの製造方法は、上記発酵工程において、原料液および／または上記発酵によって得られた発酵液のｐＨを６．５以上７．５以下に保持することが好ましい。原料液を発酵させると、水素およびエタノール以外に、主に１，３−プロパンジオールからなる有機酸が多量に生成し、グリセロールの円滑な資化を妨げる傾向が見られる。上記構成によれば、原料液および／または発酵液のｐＨが中性付近に保たれるため、有機酸の影響を回避することができ、水素およびエタノールの発酵生産の効率をさらに向上させることができる。
【００２４】
本発明に係る水素およびエタノールの製造方法を行うためのキットは、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株および／またはエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株、並びに上記菌株を培養可能な培地が含まれることが好ましい。
【００２５】
上記本発明にかかるキットによれば、バイオディーゼル廃液から水素およびエタノールを効率良く、且つ簡便に生産することができるという効果を奏する。
【発明の効果】
【００２６】
本発明は、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株に係るものである。また、本発明は、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株に係るものである。これらの菌株は、高濃度でグリセロールを含有するバイオディーゼル廃液を含む原料液を資化することができる。それゆえ、高濃度のグリセロール含有バイオディーゼル廃液からの水素およびエタノールの生産効率を簡便かつ飛躍的に向上させることができるという効果を奏する。
【００２７】
水素は燃料電池用の燃料としてその利用が期待されており、またエタノールも燃料、溶媒として広範囲に利用されているものである。よって本発明は、植物性油脂、動物性油脂を始めとするバイオマスを無駄にすることなく、有効に利用することができる菌株およびこれを用いた水素およびエタノールの製造方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
本発明の実施の形態について説明すれば以下のとおりであるが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００２９】
〔１．本発明に係る菌株〕
本発明に係る菌株であるエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株およびエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株は、本発明者らが自然界から独自に分離した菌株であり、検討の結果、高濃度でグリセロールを含むバイオディーゼル廃液を資化することができることを見出したものである。そこで、まず、これらの菌株について具体的に説明する。
【００３０】
（１）形態的性質および培養的性質
表１に示す培地に生育したエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株およびＨＵ２０２菌株の形態的性質および培養的性質を説明する。
【００３１】
【表１】
【００３２】
上記ＨＵ２０１菌株、ＨＵ２０２菌株ともに、形態的には桿菌であり、表１に示す培地を用いて３７℃で３日間培養後のコロニーは直径０．５ｍｍの円形で、色調は白色であった。コロニーの隆起状態は半球状、周縁は全縁、表面の形状はスムーズで、透明度は半透明、粘稠性を有していた。培地の混濁状態は白濁であった。コロニーの形態の多型性としては、変異によるコロニー形態の変化はなく、培養条件や生理的状態によるコロニー形態の変化もなかった。運動性を有し、鞭毛の着生状態は周毛状である。また、胞子は有さない。
【００３３】
図１（ａ）は、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株の形態を撮影した写真であり、図１（ｂ）は、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株の形態を撮影した写真である。上記ＨＵ２０１菌株、ＨＵ２０２菌株の培養液を数μｌプレパラートに垂らし、カバーガラスを被せ、顕微鏡(Nikon ： E600W、倍率１０００倍)を用いて形態観察を行なった。上記ＨＵ２０１菌株、ＨＵ２０２菌株はともに桿状であり、長さは約１μｍであった。
【００３４】
図２は、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株およびＨＵ２０２菌株の比増殖速度を解析した結果を示すものである。
【００３５】
表１に示す培地を蒸留水で１０倍希釈し、対数増殖期が終わるまで、吸光光度計（島津分光高度計 UV-1600）で、ＯＤ６００を測定し菌体濃度の指標とした。結果を図２に示した。
【００３６】
図３は、図２に示す結果を基に、対数増殖期におけるＯＤ値の対数を取りプロットしたものである。図３に示される２本の検量線のうち、下方の検量線は、式１で表される。
ｙ＝０．１９８ｘ−３．５２（ｘ：ｔｉｍｅ、Ｒ2＝０．９９３）・・・（１）
また、上方の検量線は式２で表される。
ｙ＝０．１８６ｘ−３．０９（ｘ：ｔｉｍｅ、Ｒ2＝０．９６３）・・・（２）
式１で表されるグラフの傾きより、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株の比増殖速度を０．１９８ｈ-1、式２で表されるグラフの傾きより、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株の比増殖速度を０．１８６ｈ-1と決定した。
【００３７】
（２）生理学的性質
エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株およびＨＵ２０２菌株の生理学的性質は、表２に示すとおりである。
【００３８】
【表２】
【００３９】
なお、表２では、表２に記載した性質を有する場合を「＋」、有さない場合を「−」で表している。
【００４０】
（３）新種の特徴を示すために必要な性質
エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株およびＨＵ２０２菌株の特徴を示すために必要な性質は、表３に示すとおりである。
【００４１】
【表３】
【００４２】
なお、表３では、表３に記載した性質を有する場合を「＋」、有さない場合を「−」で表している。
【００４３】
（４）化学分類学的性質
エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株およびＨＵ２０２菌株の化学分類学的性質として、例えば以下のものを挙げることができる。
【００４４】
エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株およびＨＵ２０２菌株の近縁菌種とのDNA-DNA 相同性としては、１６S rRNA遺伝子の相同性が、Enterobacter aerogensesと９８%、Enterobacter amnigenseと９７%、Enterobacter asburiaeと９８%、Enterobacter gergoviaeと９６%、Enterobacter hormaecheiと９７%、 Enterobacter intermediusと９７%、Enterobacter sakazakiiと９６%である。
【００４５】
なお、上記エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株は、独立行政法人 産業技術総合研究所特許生物寄託センターにおいて、ＦＥＲＭ ＡＰ−２１４９２として寄託されている（寄託日：平成２０年１月２５日）。エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株は、独立行政法人 産業技術総合研究所特許生物寄託センターにおいて、ＦＥＲＭ ＡＰ−２１４９３として寄託されている（寄託日：平成２０年１月２５日）。
【００４６】
（５）本発明に係る菌株の単離方法
まず、福井県敦賀市の砂浜、砂浜付近松林、広島大学構内等からサンプリングした土壌及び余剰汚泥をリン酸バッファーで１０倍希釈して、５分間振盪後、静置した。この際に分離した上清をサンプル微生物含有液とした。また、広島県内河川水の場合は、そのままサンプル微生物含有液とした。
【００４７】
次に、試験管に、表１に示す合成培地からグリセロールを除いたもの８ｍｌに炭素源としての市販のグリセロール（シグマアルドリッチジャパン製）１ｍｌを加えたもの（以下「液体培地」という）を入れ、上記サンプル微生物含有液１ｍｌを、それぞれ接種し、３７℃、１２０ｒｐｍ、嫌気条件下で振とう培養した。サンプル微生物含有液の対照としては、上記液体培地を１０００倍希釈したものを用いた。上記液体培地中のグリセロール濃度は、５０ｇ／ｌである。
【００４８】
上記液体培地は、１２０℃で１５分間オートクレーブを用いて滅菌後に使用したが、オートクレーブする際、培地中に炭素源、リン酸塩、マグネシウム塩が同時に存在すると培地が褐変するため、炭素源、リン酸塩、マグネシウム塩をそれぞれ別々に調製し、表１に示す合成培地からグリセロールを除いたものを滅菌後に、シリンジで嫌気的に混合した。プレート培地は上記液体培地に２％の寒天粉末を添加して作成した。なお、嫌気条件を得るために培地を１００℃、１５分煮沸した後、氷浴にて急冷しながら窒素ガスを吹き込み、脱気を行った。
【００４９】
３７℃で５日間培養後、ロールチューブ法を用いてコロニーの形状、色等を確認した。ロールチューブ法は、ブチルゴム栓付きの試験管を用い、無酸素の混合ガス（水素：窒素：二酸化炭素など）を噴射させて、酸素を遮断しながら微生物を試験管などに分注し、検査する方法である（Hungate, R.E., Methods in Microbiology,Vol 3B, Academic Press, New York, 1969, p117）。
【００５０】
候補となる微生物は、５０ｇ／ｌのグリセロール液体培地で増殖し、かつ水素を生成するものとした。従って、コロニーを取り、液体培地に接種し、回分培養を行った。回分培養液の一部を新たな液体培地に接種し、再び回分培養を行った。この作業を２回繰り返し、候補として２菌株を選択した。当該２菌株はそれぞれ単一菌であり、なおかつ５０ｇ／ｌのグリセロールの消費が見られ、高濃度下でのグリセロール資化性があることを確認した。また、16S rRNAの相同性より、これらの２菌株を、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株と命名した。
【００５１】
なお、グリセロール資化性は、高速液体クロマトグラフィーを用いて、培養開始時と最終日におけるグリセロール量の差から残存グリセロール量を導き出すことによって判断した。
【００５２】
（６）本発明に係る菌株の同定
市販グリセロールを炭素源とした上記液体培地にて対数増殖期まで培養した上記ＨＵ２０１菌株およびＨＵ２０２菌株の培養液各１５ｍｌを３０００ｒｐｍ、１５分、４℃で遠心分離して集菌し、上清を除去した。菌体を１．５ｍｌのＴＥ ｂｕｆｆｅｒに懸濁し、５ｍｇのリゾチーム（シグマ製）を加えた後、３７℃で３０分間ゆっくりと振盪した。溶菌液を２．５ｍｌ加え、静かに混合した後、５５℃で６０分間インキュベートした。次に、フェノールクロロホルム混液（東京化成工業製）を１．２５ｍｌ加えて１０分間振盪し、完全に混合した後、１１，０００ｒｐｍ、１５分間遠心して３層に分離し、上層を新しいチューブに移した。
【００５３】
もう一度フェノールクロロホルム混液を加え、上層を新しいチューブに移すまでの操作を行った。３Ｍ酢酸ナトリウム溶液を上層の１／１０量、エタノールを上層の２．５倍量加えて静かに混合し、室温で１０分間静置した。次に、１１，０００ｒｐｍ、１５分間遠心してＤＮＡを沈殿させ、静かに上清を除去した。さらに、１１，０００ｒｐｍ、１分間遠心し、余分なエタノールを完全に除去した。次に、７０％エタノールを２０ｍｌ加え１３，２００ｒｐｍ、２分間遠心し、静かに上清を除去した。さらに、１３，２００ｒｐｍ、３０秒間遠心し、余分なエタノールを完全に除去した後、ｄＨ2Ｏを２００μｌ加えてＤＮＡを完全に溶解させ、−２０℃で保存した。その結果、２５μｇ以上のゲノムＤＮＡが得られた。
【００５４】
得られたゲノムを鋳型にPremix Taq kit、ＰＣＲ装置（PC808,ASTEC）を用いてＰＣＲを行い、16S rRNA遺伝子を増幅させた。ＰＣＲの反応液組成および反応条件は表４、表５に示すとおりである。
【００５５】
なお、プライマーとしては、Forward Primer 27F（Escherichia coil,positions 8-27、配列番号４）およびReverse Primer 1492R（Escherichia coil,positions1510-1492、配列番号５）を用いた。
【００５６】
【表４】
【００５７】
【表５】
【００５８】
ＰＣＲ産物を０．８％アガロースゲルにて電気泳動し、目的物が増幅されていることを確認した。精製したFragmentをTAクローニングによってp GEM-T easy vectorに組み込み、E.coli DH5αに導入して形質転換させた。100μg/ml Ampicillin、80μg/ml Xgal、そして0.5mM IPTGを含むLB培地上に形質転換させたE.coliを培養し、青白選別法を行って組換えプラスミドを持つE.coliを選別した。選別したE.coliからプラスミドを回収し、精製した。
【００５９】
回収後のプラスミドに含まれる16S rRNA遺伝子の塩基配列の決定は、自然科学研究支援開発センターに依頼した。得られた遺伝子配列を元に、DNA Data Bank of JapanのHP(http://www.ddbj.nig.ac.jp/Welcome-j.html)のBLAST検索を行い、ホモロジー検索を行った。その結果、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株およびＨＵ２０２菌株共にKlebsiella pneumoniaeと９９％、Enterobacter aerogenses（C1111株、C4-1株、An19-2株、An14-1株, An10-1株、An2-1株、A20-1株、 NCTC10006T株, C2111株, RW9516株, RW7M1株）と９８％、 Enterobacter amnigenseと９７％、Enterobacter asburiaeと９８％、Enterobacter gergoviaeと９６％、Enterobacter hormaechei と９７％、 Enterobacter intermedius と９７％、Enterobacter sakazakii と９６％の相同性があることが分かった。
【００６０】
図４〜６は、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株とKlebsiella pneumoniaeの16S rRNA遺伝子の塩基配列を対比した結果を示すものである。図７〜９は、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株とklebsiella pneumoniaeの16S rRNA遺伝子の塩基配列を対比した結果を示すものである。
【００６１】
また、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株の16S rRNA遺伝子の塩基配列を配列番号１に、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株の16S rRNA遺伝子の塩基配列を配列番号２に示し、対比したKlebsiella pneumoniaeの16S rRNA遺伝子の塩基配列を配列番号３に示した。
【００６２】
エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株とエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株とは、約１５００塩基中４塩基の違いが見られた。また、後述する実施例において説明する図１３に示したように生産物にも違いが見られる。したがって、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株とエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株とは同一の菌株ではないと判断される。
【００６３】
〔２．本発明に係るグリセロール資化剤〕
本発明に係るグリセロール資化剤は、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株および／またはエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株を含有する。なお、本明細書において、「資化」とは、油脂をメチルエステル化して得られる生成物からメチルエステルを除去して得られるバイオディーゼル廃液を含む原料液を発酵させ、水素および／またはエタノールを生産することをいう。
【００６４】
すなわち、本発明に係るグリセロール資化剤は、上記ＨＵ２０１菌株のみからなるものであってもよいし、上記ＨＵ２０２菌株のみからなるものであってもよいし、上記ＨＵ２０１菌株および上記ＨＵ２０２菌株からなるものであってもよい。上記ＨＵ２０１菌株と上記ＨＵ２０２菌株とを併用する場合は、両者の混合比は任意である。
【００６５】
また、本発明に係るグリセロール資化剤は、上記ＨＵ２０１菌株および上記ＨＵ２０２菌株のグリセロール資化性を阻害するものでない限り、上記ＨＵ２０１菌株および上記ＨＵ２０２菌株以外の成分を含んでいてもよい。例えば、菌株の保護剤として、スキムミルク、グルタミン酸ナトリウム、アドニトール、システイン・ＨＣｌ、リン酸緩衝液等を含むことができる。上記保護剤の含有量は特に限定されるものではないが、菌株の重量に対してスキムミルクで１５重量％〜２５重量％、グルタミン酸ナトリウムで２〜４％、アドニトールで１〜２％であることが好ましい。
【００６６】
上記グリセロール資化剤を製造する方法は特に限定されるものではないが、例えば殺菌した保護剤を上記ＨＵ２０１菌株および／または上記ＨＵ２０２菌株と混合し、定法に従って凍結乾燥する方法や、Ｌ−乾燥する方法等によって調製することができる。
【００６７】
凍結乾燥またはＬ−乾燥したグリセロール資化剤は、例えば、３７℃で生理食塩水を適宜加えることによって復元することができる。
【００６８】
上記ＨＵ２０１菌株および／または上記ＨＵ２０２菌株は、高濃度のグリセロール含有バイオディーゼル廃液から水素およびエタノールを生産することができる。よって、本発明に係るグリセロール資化剤は従来廃棄されていたバイオディーゼル廃液の有効利用を図ることができる。
【００６９】
〔３．水素およびエタノールの製造方法〕
本発明に係る水素およびエタノールの製造方法は、原料液として、油脂をメチルエステル化して得られる生成物からメチルエステルを除去して得られるバイオディーゼル廃液を含むものを用い、上記原料液を、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株および／またはエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株によって発酵させる発酵工程を含む。以下、構成ごとに分けて具体的に説明する。
【００７０】
（バイオディーゼル廃液）
本発明の製造方法の原料液を構成するバイオディーゼル廃液は、バイオディーゼル燃料を製造する際に副生成物として得られるグリセロールを多量に含むものである。バイオディーゼル燃料の製造原理は、式Ｉに示す反応式に示すようにして行なわれる。
【００７１】
【化１】
【００７２】
より具体的には、油脂（別名：トリグリセリド、トリアシルグリセロール）とメタノールとが化学反応（メチルエステル化）によりメチルエステルおよびグリセロールが生成する。この生成したメチルエステルがバイオディーゼル燃料であり、この反応液からメチルエステル（バイオディーゼル燃料）を除去したものがバイオディーゼル廃液である。
【００７３】
なおバイオディーゼル燃料を製造する際に油脂をメチルエステル化する方法としては、特に限定されるものではなく、公知の方法を用いればよい。例えば、油脂とメタノールとをリパーゼ等の触媒存在下で反応させる方法、または超臨界メタノールと油脂とを反応させる方法（吉川 浩ら、「超臨界メタノールによる植物油からのバイオディーゼル燃料の製造」高圧討論会講演要旨集、ＶＯＬ．４２ｎｄ、ｐ１０９（２００１）、SAKA S, KUSDIANA D,「超臨界メタノールを利用した植物油廃棄物からバイオディーゼル燃料の生産」、資源処理技術、ＶＯＬ．４７、ＮＯ．２、ｐ９５−１０２）等を用いて行うことができる。
【００７４】
このバイオディーゼル燃料を製造する際に用いる油脂としては特に限定されるものではなく、植物性油脂、動物性油脂またはその廃油等を油脂として用いることが可能である。上記植物性油脂としては、パーム油、ナタネ油、ゴマ油、オリーブ油等が挙げられ、動物性油脂としては、ラード、牛脂、魚油等が挙げられる。また上記油脂には、不純物等が含まれるものであっても、試薬グレードの油脂を用いてもよい。試薬グレードの油脂を用いた場合には、メチルエステル化後の反応液中に含まれる不純物が少なく、バイオディーゼル燃料の回収が容易であること、バイオディーゼル廃液を本発明に係る菌株によって発酵させる際の効率が高いという理由から、純度の高い油脂を用いることが好ましいといえる。
【００７５】
また油脂をメチルエステル化して得られた生成物から、メチルエステル（バイオディーゼル燃料）を除去する方法としては、デカンテーション等の公知の方法を用いればよい。より具体的には、メチルエステル化後（メタノリシス後）、反応液を静置することにより、生成されたバイオディーゼル燃料は上層に、グリセロールを含むバイオディーゼル廃液部分は下層に分かれる。よって、デカンテーション等の方法により容易にバイオディーゼル燃料とバイオディーゼル廃液とを分離できる。上記のようにしてメチルエステル（バイオディーゼル燃料）を反応液中から除去した残渣が、本発明の製造方法において利用するバイオディーゼル廃液である。
【００７６】
かかるバイオディーゼル廃液には、主成分としてグリセロールが多量に含まれている。バイオディーゼル燃料の製造に用いる油脂に含まれる成分によって異なるが、バイオディーゼル廃液にはその他、乳酸、酢酸、エタノール等が含まれる場合がある。
【００７７】
（原料液）
本発明の製造方法に用いる上記原料液は、上記バイオディーゼル廃液が含まれていれば特に限定されるものではなく、バイオディーゼル廃液そのものを原料液として用いても良く、また適宜、水等の溶媒を添加し原料液として用いてもよい。上記溶媒の添加率（換言すれば希釈率）は特に限定されるものではなく、後に行なう本発明に係る菌株による発酵工程に用いる原料液として好適なものとなるように適宜検討の上、決定すればよい。
【００７８】
本発明に係る菌株、すなわちエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株とエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株は、いずれも高濃度のグリセロールを資化することができる。特許文献２に記載されているように、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ１０１株は、が処理できる原料液のグリセロール濃度は１０〜２０ｇ／ｌであったが、本発明に係る菌株は、後述するようにグリセロール濃度が７５ｇ／ｌの原料液まで処理可能であり、ＣＳＬを原料液に添加した場合はグリセロール濃度が９０ｇ／ｌの原料液まで処理可能であることを確認している。
【００７９】
それゆえ、上記原料液のグリセロール濃度は、２０ｇ／ｌを超えることが好ましい。これにより、上記希釈率を従来よりも大幅に低下させることができる。もちろん、２０g／ｌ以下の場合も問題なくグリセロールを資化することができる。
【００８０】
またその他、本発明に係る菌株の生育に必要な培地成分が含まれていてもよい。当該培地成分が含まれることによって、本発明に係る菌株の生育・増殖が活発になり、バイオディーゼル廃液からの水素・およびエタノールの発酵生産効率がさらに向上する。
【００８１】
上記培地成分としては、本発明に係る菌株の培養に好適なものを適宜選択の上、添加すればよい。特に、酵母抽出液、およびカゼイン酵素分解物は、一般に微生物用培地に用いられている成分であり、本発明に用いる培地成分としては好適である。
【００８２】
なお、酵母抽出液（別名：イーストエキス、酵母エキス）とは、ビール酵母（Saccharomyces cerevisiae ）等の酵母の内容物を抽出したものであり、一般に市販されているものである。本発明においてもかかる市販されているものを適宜利用すればよい。例えば、粉末酵母エキスＳ（日本製薬株式会社製）、Yeast Extract, Bact（Difco社製）等を用いればよい。上記酵母抽出物の添加量としては、原料液に０．０５重量％以上１重量％以下が好ましく、原料液に０．２５重量％以上０．５重量％以下がさらに好ましい。
【００８３】
また、上記カゼイン酵素分解物とは、牛乳カゼイン等のカゼインをペプシン、トリプシン等のタンパク質分解酵素（プロテアーゼ）で処理したものであり、一般に市販されているものである。本発明においてもかかる市販されているものを適宜利用すればよい。例えば、ポリペプトン（日本製薬株式会社製）、Trypton, Bact（Difco社製）等を用いればよい。上記カゼイン酵素分解物の添加量としては、原料液に０．１重量％以上１重量％以下が好ましく、原料液に０．２５重量％以上０．０５重量％以下がさらに好ましい。
【００８４】
その他の培地成分としては、（ＮＨ4）2ＳＯ4，ＭｇＳＯ4、Ｃｏ（ＮＯ3）2、Ｆｅ（ＮＨ4）2ＳＯ4、Ｎａ2ＭｏＯ4，ＣａＣｌ2，Ｎａ2ＳｅＯ3，ニコチン酸、ＮｉＣｌ2、その他ビタミン類等をミネラルとして添加してもよい。また、バッファー成分として、Ｋ2ＨＰＯ4、ＫＨ2ＰＯ4等が含まれていてもよい。また微量元素としてＭｎＣｌ2、Ｈ3ＢＯ3、ＡｌＫ（ＳＯ4）、ＣｕＣｌ2、ＥＤＴＡ等が含まれていてもよい。上記化合物は市販されているものを使用することができる。
【００８５】
（微生物）
本発明の製造方法における発酵工程に用いる微生物は、既に説明したように、通性嫌気性細菌のエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株および／またはエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株である。エンテロバクター(Enterobacter)属細菌のグリセロールの代謝経路について図１０に示す。
【００８６】
エンテロバクター(Enterobacter)属細菌は、ブドウ糖などの解糖系で得られた余剰なＮＡＤＨを２,３−ブタンジオール、エタノール、乳酸および酢酸などに配分することにより還元当量のバランスを保つ、いわゆる混合有機酸発酵を行なって生育する。この中で水素（図１０中、Ｈ2）は、以下の経路によって生成される。(1)エタノール（図１０中、Ethanol）および酢酸（図１０中、Acetate）生成の中間生成物であるピルビン酸（図１０中、Pyruvate）がアセチルＣｏＡ（図１０中、Acetyl-CoA）へと代謝される際に、ピルビン酸−ギ酸リアーゼによりギ酸（図１０中、Formate）が生成される。(2)当該ギ酸（図１０中、Formate）からヒドロゲナーゼの作用により水素（図１０中、Ｈ2）が生成される。
【００８７】
よって、本発明の製造方法にエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株および／またはエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株を用いることによって、バイオディーゼル廃液に含まれるグリセロールを利用して水素およびエタノールを発酵生産することができる。
【００８８】
（発酵工程）
本発明にかかる製造方法は、既述の原料液を、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株および／またはエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株によって発酵させる発酵工程を含んでいる。かかる発酵工程は、本発明に係る菌株が原料液から水素およびエタノールを発酵生産する工程である。その発酵条件としては、本発明に係る菌株が水素およびエタノールを発酵生産する条件として好ましい条件であれば特に限定されるものではなく、その発酵方法は連続培養であっても回分培養（バッチ培養）であっても半回分培養であってもよい。
【００８９】
回分培養は、発酵槽に原料と微生物を仕込み発酵終了後に発酵液を抜き出すという培養方法であり、連続培養は微生物を固定化等により発酵槽の中に閉じ込め、原料の流入と発酵液の流出を連続的に行なう培養方法である。半回分培養は、流加培養ともいい、培養中に、培地自体や培地中の特定の成分を添加する方法である。連続培養は、長期間連続的に発酵することにより、発酵槽の単位体積あたりの生産性が回分培養に比して高いというメリットがあるためにより好ましいといえるが、本発明に係る菌株は、担体に固定化せずとも高濃度のグリセロールを資化し、水素およびエタノールを発酵生産することができるため、半回分培養であっても効率よく水素およびエタノールの生産を行うことができる。
【００９０】
また本発明における発酵工程は、通気培養であっても、静置培養であっても、攪拌培養であっても振盪培養であってもよい。
【００９１】
また培養温度については本発明に係る菌株の生育に好適な条件を採用すれば良く、２８℃〜４０℃が好ましく、３０℃〜３７℃がさらに好ましく、３７℃が最も好ましい。
【００９２】
回分培養を行う場合は、原料液を試験管等の反応容器中に入れ、本発明に係る菌株を接種した後、振盪培養等を行えばよい。本発明に係る菌株は、担体に固定せずとも高濃度のグリセロールを資化できるので、回分培養であっても水素およびエタノールを生産することができるが、図１０に示すように、グリセロールの代謝中には、水素およびエタノール以外に、１，３−プロパンジオール、酢酸、２，３−ブタンジオール、乳酸等の有機酸が多量に発生するため、上記発酵によって得られた発酵液のｐＨは、発酵工程の進行に連れて低下し、酸性となる。
【００９３】
一方、本発明に係る菌株の至適ｐＨは中性付近（ｐＨ６．５以上７．５以下）であるため、回分培養反応では、発酵生産の速度が低下し、原料液中のグリセロール濃度に関わらず、ある程度の量以上のグリセロールを利用できなくなるという問題がある。
【００９４】
それゆえ、上記発酵工程においては、原料液および／または上記発酵によって得られた発酵液のｐＨを６．５以上７．５以下に保持することが好ましい。これによって、発酵液のｐＨが本発明に係る菌株の至適ｐＨに保持されるので、効率よくグリセロールを資化し、水素およびエタノールを生産することができる。
【００９５】
そのため、上記発酵工程においては、回分培養よりも半回分培養または連続培養を行うことが好ましい。半回分培養を行うための培養装置としては特に限定されるものではなく、公知の培養装置を適宜選択の上、利用が可能である。図１１に半回分培養を行なうための培養装置の模式図を示す。半回分培養装置１１は、発酵槽１２、アルカリ液貯留槽１３、アルカリ液流入孔１４、サンプリング孔１５、ｐＨ測定装置１６、電極１７、ポンプ１８、排気口１９、とからなっている。発酵槽１２には原料液および／または上記発酵によって得られた発酵液２０（以下「発酵液２０」という）が入っている。また、発酵液２０の温度は、発酵槽１２を恒温槽（図示せず）に載置すること等により、一定に保たれている。
【００９６】
ｐＨ測定装置１６が電極１７によって、発酵液２０のｐＨを測定し、ｐＨが６．５未満であることを検知すると、ｐＨ測定装置はコンピュータ２１に指示を送り、コンピュータ２１は、ポンプ１８を起動する。そして、アルカリ液がアルカリ液貯留槽１３からポンプ１８によって、アルカリ液流入孔１４を通って発酵槽１２に供給され、発酵液２０のｐＨが６．５以上７．５以下に保持される。
【００９７】
上記「アルカリ液」としては、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等の水溶液を用いることができ、有機酸を中和できるものであれば特に限定されるものではない。
【００９８】
一方、発酵生産された水素ガスを含む気体成分は、排気口１９を通って発酵槽１２外へと排出され、ガス回収槽（図示せず）において回収されるようになっている。サンプリングは、サンプリング孔１５から適宜行えるようになっている。例えば、サンプリング孔１５からサンプルを採取し、高速液体クロマトグラフィーを用いてグリセロール量を分析することにより、発酵の進捗状況を確認することができる。
【００９９】
このように、本発明に係る菌株は、担体に固定しなくてもグリセロールを効率よく資化することができるが、もちろん担体を用い、連続培養を行ってもよい。
【０１００】
原料の流入と発酵液の流出を行なう連続培養では、その発酵液の流出の際に微生物が一緒に流出することを防止する必要がある。このために微生物の固定化等を行なって、発酵槽からの流出を防いでいる。上記微生物の流出を防ぐ方法としては、固定化担体を用いて発酵槽内に微生物を固定化してもよいし、特に固定化担体を用いることなく増殖した微生物同士が自己凝集体（フロック）を形成して発酵槽内に留まるという方法であってもよい。ただし、固定化担体の自重により固定化担体に固定化された微生物が発酵液の表層に浮遊することがなく、確実に発酵槽内に留まることができるということ、浮遊することが無いために原料液と微生物が接触する頻度が高まり発酵生産効率が向上すること、および発酵槽内の微生物の菌体密度を向上させることができる等の理由から、固定化担体を用いる方法が好ましいといえる。
【０１０１】
上記担体としては、少なくともその表面に、（より好ましくは、その表面および内部に）微生物を固定することが可能な担体であれば限定されるものではない。ただし、微生物が固定化しやすく、その微生物の固定量が増加するという理由から、上記担体は多孔質であることが好ましい。上記多孔質である担体（以下、「多孔質担体」という）は、文字通りその表面に多数の孔があり、その孔内部および表面に微生物、すなわち本発明に係る菌株が吸着し、本発明に係る菌株を固定化することができる。
【０１０２】
担体（より好ましくは多孔質担体）に本発明に係る菌株を固定化する方法としては、特に限定されるものではないが、例えば発酵槽内に原料液と担体（より好ましくは多孔質担体）を仕込み、そこに本発明に係る菌株を接種し培養する方法が挙げられる。すなわち特に、固定化操作を別途行なうのではなく、発酵工程によって増殖してきた本発明に係る菌株の培養液が担体（より好ましくは多孔質担体）と接触することにより、その表面および内部に固定化されるという方法である。
【０１０３】
なお、本発明の製造方法の発酵工程とは別に本発明に係る菌株を培養し、担体（より好ましくは多孔質担体）に固定化するという操作を行ない、本発明に係る菌株が固定化された担体（より好ましくは多孔質担体）を発酵工程に導入するというものであってもよい。
【０１０４】
本発明の製造方法において使用する上記多孔質担体は、特に限定されるものではなく、連続培養用に市販されている固定化担体を適宜利用可能である。例えば、ナガオ株式会社製: ペレット状セラミックスSP1-4、協和エンジニアリング株式会社製: クラゲール、株式会社サンバイオ社製：バイオポーラスなどが利用可能である。
【０１０５】
なお本発明に使用する担体（より好ましくは多孔質担体）は、粒子状であることが好ましく、その平均粒子径が３ｍｍ以上２０ｍｍ以下であることが好ましい。上記担体（より好ましくは多孔質担体）は、既述の通り表面および内部に微生物が固定されることにより、菌体密度を向上させるための部材である。したがって菌体密度をさらに向上させるためには、担体（より好ましくは多孔質担体）は粒子状であり、その粒子径はできるだけ小さいことが好ましいといえる。
【０１０６】
ただし、過度に粒子径が小さくなると原料液表面に浮遊してしまい、菌体密度を向上させることができなくなる。よって担体（より好ましくは多孔質担体）の平均粒子径を上記のごとく３ｍｍ以上２０ｍｍ以下にすることが好ましいといえ、３ｍｍ以上１０ｍｍ以下にすることがさらに好ましいといえる。平均粒子径が上記の範囲の担体（より好ましくは多孔質担体）を用いることで、菌体密度をさらに向上させることができ、水素およびエタノール生産量をさらに向上させることができるという効果を奏する。
【０１０７】
また本発明の製造方法は、上記多孔質担体が、貫通孔を有する多孔質担体であることが好ましい。多孔質担体に貫通孔がない場合、本発明に係る菌株の培養液が、多孔質体の孔の内部まで入り込むことができないのに対し、多孔質担体に貫通孔がある場合は、当該多孔質担体の貫通孔を本発明に係る菌株の培養液の培養液が通過することができ、多孔質担体のさらに内部まで本発明に係る菌株が入り込むことができる。それゆえ、本発明に係る菌株の多孔質担体に対する固定化量を向上させることができ、水素およびエタノール生産量をさらに向上させることができるという効果を奏する。上記貫通孔を有する多孔質担体は、既述のナガオ株式会社製: ペレット状セラミックスSP1-4、協和エンジニアリング株式会社製: クラゲール、株式会社サンバイオ社製：バイオポーラスなどが利用可能である。
【０１０８】
なお使用する担体の材質は、特に限定されるものではなく、例えばレンガ様の素焼き材；セラミックス、ポリビニルアルコール等の高分子材料；木材チップ、セルロース等の生体高分子化合物が利用可能である。
【０１０９】
連続培養に使用する装置としては、特に限定されるものではなく、公知の培養装置を適宜選択の上、利用が可能である。図１２に連続培養を行なうための連続培養装置の模式図を示す。連続培養装置１は、発酵槽２、恒温ジャケット３、恒温水流出孔３ａ、恒温水流入孔３ｂ、恒温水槽３ｃ、細菌固定化多孔質担体４、原料液流入孔５、発酵液流出孔６、原料液タンク７、ポンプ８、排気口９、ガス回収槽１０とからなっている。
【０１１０】
原料液は原料液タンク７からポンプ８によって、原料液流入孔５を通って発酵槽２に供給される。原料液は、細菌固定化多孔質担体４に固定化されたエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株および／またはエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株によって発酵する。発酵後のエタノールを含む発酵液は、原料液の供給に伴い発酵液流出孔６を通って発酵槽２外へと流出し回収される。
【０１１１】
一方、発酵生産された水素ガスを含む気体成分は、排気口９を通って発酵槽２外へと排出され、ガス回収槽１０において回収されるようになっている。なお発酵槽２内の温度は、発酵槽の外側面を覆うように設けられた恒温ジャケット３内に恒温水槽３ｃから供給される恒温水によって、一定に保たれている。恒温水は、恒温水槽３ｃから恒温水流入孔３ｂを通って恒温ジャケット３内に供給され、恒温水流出孔３ａから再び恒温水槽３ｃに戻るという要領により循環している。
【０１１２】
上記の連続培養において、発酵槽２内への原料液の供給量（以下、原料液希釈率という）の好適な条件は、用いる原料液の組成，多孔質担体の種類，本発明に係る菌株の状態，培養条件等によって異なるために、限定されるものではないが、０．６ｈ-1以上１．２ｈ-1以下が好ましく、０．７ｈ-1以上１．２ｈ-1以下がさらに好ましい。上記好ましい範囲以上の希釈率で原料液を供給すると、本発明に係る菌株の発酵能力を原料供給量が上まり、十分発酵していないにもかかわらず発酵槽２外へ流出してしまう状態となり、発酵効率が下がり、水素およびエタノールの回収量が少なくなってしまう。
【０１１３】
一方、上記好ましい範囲以下の希釈率で原料液を供給すると、発酵は十分に進むが生成物であるエタノール等によって菌体が死滅したり、雑菌の汚染の危険性が高くなるために好ましくない。なお「原料液希釈率」とは、１時間当たりに供給される原料液量の全原料液量に対する割合のことである。
【０１１４】
（コーンスティープリカー（ＣＳＬ）の使用）
ＣＳＬは、コーンスターチ製造工業でコーンスターチを生産する際に生じる副産物である。ＣＳＬは、コーンスターチ製造過程で、とうもろこし粒を０．１〜０．３％の亜硫酸液に４５〜５０℃、約４０〜４８時間乳酸発酵させながら浸漬する工程があり、浸漬を終わった後、浸漬槽から抜液され、真空蒸発装置によって固形分５０％前後まで濃縮されることによって生成される。ＣＳＬは、酵母エキスに替わる安価な炭素源の候補物質として用いられている。
【０１１５】
本発明者は、ＣＳＬを原料液に含有させることによって、グリセロール濃度９０ｇ／ｌという、エンテロバクター（Enterobacter）属細菌の生育が通常確認できなかった高濃度であっても本発明に係る菌株を生育させることができることを確認した。
【０１１６】
よって、本発明に係る水素およびエタノールの製造方法は、上記原料液がＣＳＬを含有することが好ましい。
【０１１７】
ＣＳＬには、とうもろこし粒から溶出された可溶性タンパク質、ペプチド、アミノ酸、糖類、ビタミン類が含まれる他、多量の乳酸、アミノ酸およびペプチドが含まれるきわめて粘稠な液体である。また、ＣＳＬは、原料とうもろこしの品種、産地、浸漬条件などによって成分比にかなり差異があるが、濃縮前の組成として、総固形分含量が６．０〜７．０％、乳酸が１．６〜２．０％、還元糖が０．４〜０．５％、総窒素０．４〜０．６％、灰分１．１〜１．３％、ｐＨ３．６〜３．８が標準とされている（滝昭夫ら、三重大学農学部学術報告７５号、ｐ５９~６７、１９８７）。
【０１１８】
本発明で用いるＣＳＬは、上記組成を満たしていれば特に限定されるものではない。ＣＳＬを原料液に添加する時期は、特に限定されるものではないが、本発明の菌株の生育性を高め、グリセロール資化性を向上させる観点から、予め原料液に混合しておくことが好ましい。ＣＳＬの原料液への添加量は、特に限定されるものではないが、濃度０．１〜２ｇ／ｌであることが好ましく、０．１〜０．４ｇ／ｌであることがより好ましい。
【０１１９】
（その他の工程）
本発明にかかる製造方法は、上記発酵工程のほかに、本発明に係る菌株を予め増殖させておく前培養工程、多孔質担体に予め本発明に係る菌株を固定化しておく固定化工程、生成した水素またはエタノールを精製する精製工程、生成した水素またはエタノールをガスクロマトグラフィー等で分析する工程、バイオディーゼル燃料の製造工程等の工程が含まれていてもよい。
【０１２０】
〔４．本発明に係るキット〕
本発明に係るキットは、上記本発明にかかる水素およびエタノールの製造方法を行うためのキットであって、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株および／またはエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株並びに上記菌株を培養可能な培地が含まれる。
【０１２１】
上記培地としては、本発明に係る菌株の培養に好適な成分を適宜選択し、適用したものであればよい。上記成分としては、例えば酵母抽出液、カゼイン酵素分解物、ビタミン類、バッファー成分、微量元素等を挙げることができる。また、培地の一例としては、例えば表１に挙げたグリセロール培地を好適に用いることができる。
【０１２２】
さらに、本発明に係るキットには、例えば図１１または図１２に示すような培養装置（バイオリアクター）が含まれていてもよい。
【０１２３】
以下添付した図面に沿って実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【０１２４】
＜実施例１：グリセロール濃度２５ｇ／ｌの原料液を用いたエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株またはエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株による水素の発酵生産＞
試験管に、表１に示す合成培地からグリセロールを除いたもの８ｍｌに、グリセロール濃度が原料液に対して２５ｇ／ｌとなるようにリン酸バッファーで希釈した炭素源を加えて原料液を調製し、これにエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株またはエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株の１白金耳を１ｍｌリン酸バッファーに懸濁した液１ｍｌをそれぞれ接種し、ｐＨをリン酸バッファーによって７．０に調整し、３７℃、５日間暗所にて静置培養を行い、ガス量測定、ガス組成測定、サンプリングを適時行った。
【０１２５】
なお、ガス組成は、ガスタイトシリンジを用いてサンプルを抜き取り、ガスクロマトグラフィー（GC-8A：Shimazu；TCD：Thermal Conductivity Detector）で分析した。分析条件は表６に示すとおりである。
【０１２６】
【表６】
【０１２７】
炭素源としては、表７に示すバイオディーゼル廃液、減圧蒸留でメタノールを除去したバイオディーゼル廃液または市販グリセロールを用いた。なお、表７に示すバイオディーゼル廃液は、広島県大朝町で回収されたものを使用した。
【０１２８】
【表７】
【０１２９】
水素生成量を測定した結果を、図１３に示した。図１３（ａ）は、上記ＨＵ２０１菌株を用い、３種類の炭素源を発酵させた場合の水素生成量を示すものである。図１３（ｂ）は、上記ＨＵ２０２菌株を用い、３種類の炭素源を発酵させた場合の水素生成量を示すものである。図中、白抜きのひし形のシンボルは、炭素源としてバイオディーゼル廃液を用いた場合（「２５ｇＢＷ」と表示）、白抜き四角形のシンボルは、炭素源としてメタノールを除去したバイオディーゼル廃液を用いた場合（「２５ｇＢＭ」と表示）、白抜き三角形のシンボルは、炭素源として市販グリセロールを用いた場合（「２５ｇ純グリ」と表示）の水素生成量を示している。
【０１３０】
図１３より、上記ＨＵ２０１菌株およびＨＵ２０２菌株は、グリセロールがどのような炭素源として供給されるかに関わらず、安定した水素生成を行うことが確認された。
【０１３１】
＜実施例２：グリセロール濃度５０ｇ／ｌの原料液を用いた場合における水素の発酵生産＞
そこで、次に、原料液のグリセロール濃度を５０ｇ／ｌに引き上げ、様々な土地から採取したサンプル菌（１０種類）を用いて、実施例１と同様の実験を行った。結果は図１４に示した。図１４の横軸は、サンプル番号と、実施例１に示した炭素源の種類の組み合わせになっており、例えば、「１−ＢＭ」はサンプル１に、メタノールを除去したバイオディーゼル廃液を５０ｇ／ｌで供したことを示し、「１−ＢＷ」は、サンプル１に、表７に示すバイオディーゼル廃液を５０ｇ／ｌで供したことを示す。図１４には、１０種類のサンプル菌のうち、水素生成を行ったもののみを表示している。このうち、サンプル１が上記ＨＵ２０１菌株であり、サンプル２が上記ＨＵ２０２菌株である。なお、サンプル４，５，６はそれぞれ未同定の細菌である。
【０１３２】
図１４に示すように、グリセロール濃度を５０ｇ／ｌとした場合は、上記ＨＵ２０１菌株およびＨＵ２０２菌株のみが安定に生育し、安定した水素生産を行うことができることが確認された。水素生成量は、グリセロール濃度２５ｇ／ｌのときと大きな差は見られなかった。
【０１３３】
続いて、上記ＨＵ２０１菌株およびＨＵ２０２菌株による発酵生産の結果生成したガス以外の生産物を、５日間培養後の原料液を高速液体クロマトグラフィー（HPLC : High Performance Liquid Chromatography；JASCO Gulliver series UV-910＆PU-980, JASCO）に供することによって分析した。分析条件は表８に示すとおりである。なお、残存グリセロールは、生産物の分析と同様、高速液体クロマトグラフィーを用いて、培養開始時と最終日におけるグリセロールの差から導き出した。
【０１３４】
【表８】
【０１３５】
結果を図１５に示した。図１５（ａ）は、上記ＨＵ２０１菌株による発酵生産後の残存グリセロールおよびガス以外の最終生産物の変化を示すものであり、図１５（ｂ）は、上記ＨＵ２０２菌株による発酵生産後の残存グリセロールおよびガス以外の最終生産物の変化を示すものである。図１５中、「残存Ｇｌｙｃｅｒｏｌ」は５日間培養後の残存グリセロール量を示し、「１３−ＰＤ」は１，３−プロパンジオールを、「Ｅｔｈａｎｏｌ」はエタノールを、「Ｌａｃｔａｔｅ」は乳酸を、「Ａｃｅｔａｔｅ」は酢酸を表している。
【０１３６】
図１４、１５より、上記ＨＵ２０１菌株、ＨＵ２０２菌株のいずれもが、５０ｇ／ｌという高濃度のグリセロール存在下でも生育でき、目的産物である水素およびエタノールを生産していることが明らかとなった。
【０１３７】
図１４、１５に示すように、上記ＨＵ２０１菌株およびＨＵ２０２菌株は、ともにグリセロールを約２０g／ｌ消費（つまり資化）し、水素を約３５ｍｍｏｌ／ｌ生成した。また、上記ＨＵ２０１菌株はエタノールを約８０ｍｍｏｌ／ｌ、ＨＵ２０２菌株は約５０ｍｍｏｌ／ｌ生成した。この実験において、バイオディーゼル廃液に含まれている塩などの培養阻害物質の影響は見られなかった。
【０１３８】
コスト面、発酵後の処理の手間を少なくすることなどの実用性を考えた場合、バイオディーゼル廃液は、できるだけ添加物を加えず、しかもできるだけ希釈せずに発酵に供することが望ましい。本発明に係る菌株によれば、５０ｇ／ｌという高濃度でグリセロールを含有する原料液を資化することができた。よって、本発明に係る菌株によれば、バイオディーゼル廃液の効率的な利用を行うことができる。
【０１３９】
＜実施例３：エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株またはエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株が生育可能なグリセロール濃度の検討＞
表７に示すバイオディーゼル廃液の濃度をさらに上げ、上記ＨＵ２０１菌株およびＨＵ２０２菌株が生育可能な最大グリセロール濃度を検討した。試験管に、表１に示す合成培地からグリセロールを除いたもの８ｍｌに、グリセロール濃度が原料液に対して５０、６０，７０，８０，９０ｇ／ｌとなるようにリン酸バッファーで希釈したバイオディーゼル廃液を加えて原料液を調製し、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株またはエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株の１白金耳を１ｍｌリン酸バッファーに懸濁した液を１ｍｌそれぞれ接種し、ｐＨをリン酸バッファーによって７．０に調整し、３７℃、５日間暗所にて静置培養を行った。５日間培養後の水素生成量を、実施例１と同様にガスクロマトグラフィーを用いて測定した。
【０１４０】
図１６は、上記ＨＵ２０１菌株およびＨＵ２０２菌株が生育可能なグリセロール濃度を検討した結果を示すものである。図１６より、上記ＨＵ２０１菌株およびＨＵ２０２菌株が生育できる最大グリセロール濃度は、共に７５ｇ／ｌ付近（約75,000ppm）であると考えられる。これは表７に示すバイオディーゼル廃液を約５〜６倍希釈したものに相当する。上述のように、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ１０１株で処理するためには、バイオディーゼル廃液を４０倍近く希釈しなければならないことに鑑みると、本発明に係る菌株は、上記ＨＵ１０１株に比べて非常に高度なグリセロール資化力を有することが分かる。
【０１４１】
＜実施例４：流加培養実験＞
これまでは、培養開始時の減量液のｐＨを７．０に調整し、試験管内で回分培養を行ってきたが、発酵に伴って産生される有機酸の影響によって原料液のｐＨが低下すると、図１５に示すようにグリセロールの消費が停止する。
【０１４２】
そこで、次に、リアクターを用い、原料液および／または上記発酵によって得られた発酵液のｐＨを６．７５〜７．０に保ちながら、発酵工程を行った。リアクターの概略は図１１に示すとおりである。
【０１４３】
上記リアクターに、表１に示す合成培地からグリセロールを除いたもの５００ｍｌに、グリセロール濃度が原料液に対して４０ｇ／ｌとなるようにリン酸バッファーで希釈した炭素源（表７に示すバイオディーゼル廃液）を加えて原料液を調製し、同一培地で前もって２日間前培養したエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株またはエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株の培養液５０ｍｌをそれぞれ接種し、ｐＨを５Ｎ水酸化ナトリウムの水溶液によって７．０に調整し、３７℃、５日間暗所にて静置培養を行った。原料液および／または上記発酵によって得られた発酵液のｐＨが６．７５未満になった場合、水酸化ナトリウムの水溶液（濃度５Ｎ）をリアクター内に添加することにより、原料液および／または上記発酵によって得られた発酵液のｐＨを６．７５〜７．０に保った。
【０１４４】
なお、「原料液および／または上記発酵によって得られた発酵液」とは、まだ発酵が開始されていない原料液、発酵途中の、原料液および発酵によって得られた発酵液の混合物、発酵が完了した後の発酵液のいずれもが含まれる。
【０１４５】
図１７（ａ）は、上記ＨＵ２０１菌株を用い、半回分培養（流加培養）による発酵生産後の残存グリセロールおよび最終生産物の変化を示すものであり、図１７（ｂ）は、上記ＨＵ２０２菌株を用い、半回分培養（流加培養）による発酵生産後の残存グリセロールおよび最終生産物の変化を示すものである。
【０１４６】
図１７（ａ）および（ｂ）に示すように、ｐＨを７付近に保持することにより全てのグリセロールを消費させることができた。またｐＨを７付近に保持することによって、１,３−プロパンジオールの生産量を、回分培養の場合に比べ、約１／８に抑えることが出来た。そしてエタノール生産量も２倍近く向上させることができた。
【０１４７】
＜実施例５：ＣＳＬの添加＞
試験管に、表１に示す合成培地からグリセロールを除いたもの８ｍｌに、グリセロール濃度が原料液に対して９０ｇ／ｌとなるようにリン酸バッファーで希釈したバイオディーゼル廃液を加えて原料液を調製し、当該原料液に、ＣＳＬ（ヤエガキ醗酵技研（株）より提供）を０．１ｍｌ、０．４ｍｌ，０．７ｍｌまたは１．０ｍｌ加えた。次に、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株またはエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株の１白金耳をリン酸バッファー１ｍｌに懸濁した液１ｍｌを接種しｐＨをリン酸バッファーによって７．０に調整した。３７℃、５日間暗所にて静置培養を行った後の水素生成量を、実施例１と同様にガスクロマトグラフィーを用いて測定した。
【０１４８】
図１８は、ＣＳＬの添加量と水素生成量との関係を示すグラフである。図１８において、白抜きの四角形のシンボルはＨＵ２０１を、黒い三角形のシンボルはＨＵ２０２を用いた場合の結果を表している。図１６に示すように、ＣＳＬを添加しない場合は、上記ＨＵ２０１菌株およびＨＵ２０２菌株が生育できる最大のグリセロール濃度は７５ｇ／ｌ付近であったが、ＣＳＬを添加することによって、９０ｇ／ｌという、非常に高濃度のグリセロール存在下であっても安定に生育し、水素を生産することができることが分かった。特に、ＣＳＬの添加量が０．４ｍｌまでの範囲においては、３０ｍｍｏｌ／ｌ以上の水素を生成した。
【産業上の利用可能性】
【０１４９】
本発明に係る菌株は、非常に高濃度のグリセロール存在下でも安定に生育し、水素およびエタノールを生産することができるため、バイオディーゼル廃液の有効利用に資することができる。したがって、本発明は、食品工業、化学工業、エネルギー産業等広範な産業において廃水、廃液処理の工程として利用が可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１５０】
【図１】図１（ａ）は、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株の形態を撮影した写真であり、図１（ｂ）はエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株の形態を撮影した写真である。
【図２】エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株およびＨＵ２０２菌株の比増殖速度を解析した結果を示すものである。
【図３】図２に示す結果を基に、対数増殖期におけるOD値の対数を取りプロットした結果を示すものである。
【図４】エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株とklebsiella pneumoniaeの16S rRNA遺伝子の塩基配列を対比した結果のうち、上記ＨＵ２０１菌株の１４９８塩基配列中1番目〜５４０番目の配列に関する結果を示すものである。
【図５】エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株とklebsiella pneumoniaeの16S rRNA遺伝子の塩基配列を対比した結果のうち、上記ＨＵ２０１菌株の１４９８塩基配列中５４１番目〜１０８０番目の配列に関する結果を示すものである。
【図６】エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株とklebsiella pneumoniaeの16S rRNA遺伝子の塩基配列を対比した結果のうち、上記ＨＵ２０１菌株の１４９８塩基配列中１０８１番目〜１４９８番目の配列に関する結果を示すものである。
【図７】エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株とklebsiella pneumoniaeの16S rRNA遺伝子の塩基配列を対比した結果のうち、上記ＨＵ２０２菌株の１４８１塩基配列中２０番目〜５５９番目の配列に関する結果を示すものである。
【図８】エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株とklebsiella pneumoniaeの16S rRNA遺伝子の塩基配列を対比した結果のうち、上記ＨＵ２０２菌株の１４８１塩基配列中５６０番目〜１０９９番目の配列に関する結果を示すものである。
【図９】エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株とklebsiella pneumoniaeの16S rRNA遺伝子の塩基配列を対比した結果のうち、上記ＨＵ２０２菌株の１４８１塩基配列中１１００番目〜１４８１番目の配列に関する結果を示すものである。
【図１０】エンテロバクター(Enterobacter)属細菌のグリセロールの代謝経路を示す模式図である。
【図１１】半回分培養を行なうための培養装置の模式図である。
【図１２】連続培養を行なうための連続培養装置の模式図である。
【図１３】（ａ）は、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株を用い、３種類の炭素源を発酵させた場合の水素生成量を示すものである。（ｂ）は、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株を用い、３種類の炭素源を発酵させた場合の水素生成量を示すものである。
【図１４】原料液のグリセロール濃度を５０ｇ／ｌとした場合における、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株およびエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株による水素生産量を示すものである。
【図１５】（ａ）は、上記ＨＵ２０１菌株による発酵生産後の残存グリセロールおよびガス以外の最終生産物の変化を示すものであり、（ｂ）は、上記ＨＵ２０２菌株による発酵生産後の残存グリセロールおよびガス以外の最終生産物の変化を示すものである。
【図１６】エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株およびＨＵ２０２菌株が生育可能なグリセロール濃度を検討した結果を示すものである。
【図１７】（ａ）は、上記ＨＵ２０１菌株を用い、流加培養による発酵生産後の残存グリセロールおよび最終生産物の変化を示すものであり、（ｂ）は、上記ＨＵ２０２菌株を用い、流加培養による発酵生産後の残存グリセロールおよび最終生産物の変化を示すものである。
【図１８】ＣＳＬの添加量と水素生成量との関係を示すグラフである。
【符号の説明】
【０１５１】
１ 連続培養装置
２ 発酵槽
３ 恒温ジャケット
３ａ 恒温水流出孔
３ｂ 恒温水流入孔
３ｃ 恒温水槽
４ 細菌固定化多孔質担体
５ 原料液流入孔
６ 発酵液流出孔
７ 原料液タンク
８ ポンプ
９ 排気口
１０ ガス回収槽
１１ 半回分培養装置
１２ 発酵槽
１３ アルカリ液貯留槽
１４ アルカリ液流入孔
１５ サンプリング孔
１６ ｐＨ測定装置
１７ 電極
１８ ポンプ
１９ 排気口
２０ 発酵液
２１ コンピュータ
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物性油脂、動物性油脂、廃油等の油脂をメチルエステル化してバイオディーゼル燃料を製造する際に副生成物として得られる、いわゆるバイオディーゼル廃液から水素およびエタノールを効率良く製造することができる新規エンテロバクター・アエロゲネス菌株、および上記菌株を用いて水素およびエタノールを効率良く製造する方法、並びに当該方法を行なうために用いられるキットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
バイオディーゼル燃料(BDF)は植物性油脂、動物性油脂、および廃油等の油脂をリパーゼの存在下でメタノールと反応（メタノリシス反応）させることにより得られる脂肪酸メチルエステルのことであり、軽油代替エネルギーとして車、船、自家発電用燃料など様々な用途が期待されている。特に、植物から製造されるBDFは、カーボンニュートラルが成立するため、地表圏上のCO2の絶対量を増加させないこと、排ガス中に硫黄酸化物（SOｘ）を殆ど排出されないこと、S.P.M (Suspended Particulate Matter)の排出量が従来のBDFの１／３程度に抑えられること等の利点を有している。
【０００３】
バイオディーゼル燃料の生産には、現在化学触媒法(水酸化カリウムなどのアルカリを原料に混ぜ合わせて反応させる)が主に利用されている。しかし、この方法では高濃度グリセロール含有廃液（バイオディーゼル廃液）が副産物として同時に生成され、その処理が問題となっている。一方、そのような欠点を改善し、環境に負荷をかけない生産法として酵素触媒法があるが、この方法は酵素生成のコストが高く、実用化に至っていない。
【０００４】
上記現状に鑑みて、上記グリセロール含有廃液の有効利用を行うべく、上記廃液から水素を回収する方法の開発が試みられている。例えば、特許文献１においては副生成物であるグリセロールを加熱気化させて水素ガスを発生させ回収する装置について記載されている。しかし、この方法は、加熱気化に相当量の熱量を必要とし、コスト面等に問題を有している。
【０００５】
一方、通性嫌気性細菌エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）は、グルコース等から水素を発酵生産することが知られている（非特許文献１参照）。また、本発明者らは、独自に分離したエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ１０１株が、市販グリセロールを基質として発酵させた時に、最大の水素生産量が得られることを確認している（非特許文献２参照）。さらに、本発明者らは、上記ＨＵ１０１株を固定可能な多孔質担体を用いることにより、バイオディーゼル廃液を原料とした場合でも、水素生産速度を向上させることが可能であることを確認している（特許文献２参照）。
【非特許文献１】谷生 重晴ら、「Enterobacter aerogenes の発酵水素発生と利用基質について」、醗酵工学会誌、第６７巻、第１号、ｐ２９−３４、１９８９
【非特許文献２】Y. Nakashimada, M.A. Rachman, T. Kakizono, N. Nishio, "Hydrogen production of Enterobacter aerogenes altered by extracellular and intracellular redox states" International Journal of Hydrogen Energy 27(2002),1399-1405
【特許文献１】特開２００４−２０９４１５号公報（公開日：平成１６年７月２９日）
【特許文献２】特開２００６−１８０７８２号公報（公開日：平成１８年７月１３日）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ１０１株が資化できるグリセロール濃度は１０〜２０ｇ／ｌであり、それ以上の濃度下では水素を安定に生産することはできていなかった。バイオディーゼル廃液に含まれるグリセロールの濃度が約４００〜４５０ｇ／ｌであることに鑑みると、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ１０１株で処理するためには、上記廃液を４０倍近く希釈しなければならないため、処理効率をさらに向上させることが望まれている。
【０００７】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、バイオディーゼル廃液から水素およびエタノールを効率良く製造することができる新規エンテロバクター・アエロゲネス菌株およびその利用を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、様々な土地からサンプリングした土壌、川の水等から、より高濃度のグリセロール含有バイオディーゼル廃液を処理できる細菌を鋭意探索した。その結果、新規エンテロバクター・アエロゲネス菌株であるエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株およびエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株が、バイオディーゼル廃液を５〜６倍希釈して調製した、グリセロール濃度が７５ｇ／ｌという高濃度の原料液中でも生育でき、水素およびエタノールを安定的に生産可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
本発明は、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株（以下、単に「ＨＵ２０１菌株」とも称する）に係るものであることを特徴としている。また、本発明は、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株（以下、単に「ＨＵ２０２菌株」とも称する）に係るものであることを特徴としている。
【００１０】
エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ１０１株は、バイオディーゼル廃液を含む原料液を用いる場合、水素の生産効率を高めるためには多孔質担体に固定する必要があった。一方、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株およびエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株は、バイオディーゼル廃液を含む原料液であっても、多孔質担体に固定する必要はなく、しかも高濃度のグリセロール含有バイオディーゼル廃液から水素およびエタノールを生産することができる。
【００１１】
それゆえ、バイオディーゼル廃液の希釈率を従来よりも格段に低くすることができ、高濃度のグリセロール含有バイオディーゼル廃液からの水素およびエタノールの生産効率を簡便かつ飛躍的に向上させることができる。したがって、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ１０１株を用いる場合よりも、さらにバイオディーゼル廃液の有効利用を図ることができるといえる。
【００１２】
本発明に係る菌株は、油脂をメチルエステル化して得られる生成物からメチルエステルを除去して得られるバイオディーゼル廃液を含み、グリセロール濃度が５０ｇ／ｌである原料液中のグリセロールを１５g／ｌ以上資化できることが好ましい。なお、油脂をメチルエステル化して得られる生成物からメチルエステルを除去して得られるバイオディーゼル廃液を含む原料液を、以下、単に「原料液」という場合がある。
【００１３】
エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ１０１株は、グリセロール濃度が１０〜２０ｇ／ｌの原料液しか資化できず、グリセロール濃度が５０ｇ／ｌである原料液中での生育は困難であった。上記ＨＵ２０１菌株およびＨＵ２０２菌株は、グリセロール濃度が５０ｇ／ｌである原料液中でも十分に生育でき、しかも原料液中のグリセロールを１５g／ｌ以上資化できる。それゆえ、バイオディーゼル廃液を効率的に利用することができる。
【００１４】
本発明に係るグリセロール資化剤は、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株および／またはエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株を含有することが好ましい。
【００１５】
上述のように、これらの本発明に係る菌株は、従来よりもはるかに高濃度のグリセロールを含有する原料液から、安定的に水素およびエタノールを生産することができる。したがって、上記構成によれば、従来廃棄されていたバイオディーゼル廃液の有効利用を図ることができる。
【００１６】
本発明に係る水素およびエタノールの製造方法は、原料液として、油脂をメチルエステル化して得られる生成物からメチルエステルを除去して得られるバイオディーゼル廃液を含むものを用い、上記原料液を、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株および／またはエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株によって発酵させる発酵工程を含むことが好ましい。
【００１７】
上記バイオディーゼル廃液は、その大部分がグリセロールである。エンテロバクター（Enterobacter）属細菌は、そのグリセロールを利用して水素およびエタノールを発酵生産することができる。そして、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株およびエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株は、グリセロールを高濃度に含有するバイオディーゼル廃液を含む原料液中でも生育でき、グリセロールを資化して水素およびエタノールを生産することができる。
【００１８】
したがって、上記構成によれば、バイオディーゼル廃液からの水素およびエタノールの発酵生産の効率を従来法に比して格段に向上させることができる。
【００１９】
本発明に係る水素およびエタノールの製造方法は、上記原料液がコーンスティープリカーを含有することが好ましい。
【００２０】
後述する実施例に示すように、コーンスティープリカー（以下「ＣＳＬ」称する）を原料液に含有させることによって、グリセロール濃度９０ｇ／ｌという、エンテロバクター（Enterobacter）属細菌の生育が通常確認できなかった高濃度の原料液中であってもエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株およびエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株を生育させることが可能となる。それゆえ、上記構成によれば、バイオディーゼル廃液からの水素およびエタノールの発酵生産の効率をさらに飛躍的に向上させることができる。
【００２１】
本発明に係る水素およびエタノールの製造方法は、上記原料液のグリセロール濃度が２０ｇ／ｌを超えることが好ましい。
【００２２】
エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ１０１株を用いた従来の方法では、グリセロール濃度が２０ｇ／ｌを超える原料液を資化することはできなかった。上記構成によれば、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株およびエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株が高濃度のグリセロールを含有する原料液中でも生育可能であるため、グリセロール濃度が２０ｇ／ｌを超えていても、原料液を十分に資化し、水素およびエタノールを生産することができる。よって、バイオディーゼル廃液からの水素およびエタノールの発酵生産の効率を向上させることができる。
【００２３】
本発明に係る水素およびエタノールの製造方法は、上記発酵工程において、原料液および／または上記発酵によって得られた発酵液のｐＨを６．５以上７．５以下に保持することが好ましい。原料液を発酵させると、水素およびエタノール以外に、主に１，３−プロパンジオールからなる有機酸が多量に生成し、グリセロールの円滑な資化を妨げる傾向が見られる。上記構成によれば、原料液および／または発酵液のｐＨが中性付近に保たれるため、有機酸の影響を回避することができ、水素およびエタノールの発酵生産の効率をさらに向上させることができる。
【００２４】
本発明に係る水素およびエタノールの製造方法を行うためのキットは、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株および／またはエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株、並びに上記菌株を培養可能な培地が含まれることが好ましい。
【００２５】
上記本発明にかかるキットによれば、バイオディーゼル廃液から水素およびエタノールを効率良く、且つ簡便に生産することができるという効果を奏する。
【発明の効果】
【００２６】
本発明は、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株に係るものである。また、本発明は、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株に係るものである。これらの菌株は、高濃度でグリセロールを含有するバイオディーゼル廃液を含む原料液を資化することができる。それゆえ、高濃度のグリセロール含有バイオディーゼル廃液からの水素およびエタノールの生産効率を簡便かつ飛躍的に向上させることができるという効果を奏する。
【００２７】
水素は燃料電池用の燃料としてその利用が期待されており、またエタノールも燃料、溶媒として広範囲に利用されているものである。よって本発明は、植物性油脂、動物性油脂を始めとするバイオマスを無駄にすることなく、有効に利用することができる菌株およびこれを用いた水素およびエタノールの製造方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
本発明の実施の形態について説明すれば以下のとおりであるが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００２９】
〔１．本発明に係る菌株〕
本発明に係る菌株であるエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株およびエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株は、本発明者らが自然界から独自に分離した菌株であり、検討の結果、高濃度でグリセロールを含むバイオディーゼル廃液を資化することができることを見出したものである。そこで、まず、これらの菌株について具体的に説明する。
【００３０】
（１）形態的性質および培養的性質
表１に示す培地に生育したエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株およびＨＵ２０２菌株の形態的性質および培養的性質を説明する。
【００３１】
【表１】
【００３２】
上記ＨＵ２０１菌株、ＨＵ２０２菌株ともに、形態的には桿菌であり、表１に示す培地を用いて３７℃で３日間培養後のコロニーは直径０．５ｍｍの円形で、色調は白色であった。コロニーの隆起状態は半球状、周縁は全縁、表面の形状はスムーズで、透明度は半透明、粘稠性を有していた。培地の混濁状態は白濁であった。コロニーの形態の多型性としては、変異によるコロニー形態の変化はなく、培養条件や生理的状態によるコロニー形態の変化もなかった。運動性を有し、鞭毛の着生状態は周毛状である。また、胞子は有さない。
【００３３】
図１（ａ）は、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株の形態を撮影した写真であり、図１（ｂ）は、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株の形態を撮影した写真である。上記ＨＵ２０１菌株、ＨＵ２０２菌株の培養液を数μｌプレパラートに垂らし、カバーガラスを被せ、顕微鏡(Nikon ： E600W、倍率１０００倍)を用いて形態観察を行なった。上記ＨＵ２０１菌株、ＨＵ２０２菌株はともに桿状であり、長さは約１μｍであった。
【００３４】
図２は、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株およびＨＵ２０２菌株の比増殖速度を解析した結果を示すものである。
【００３５】
表１に示す培地を蒸留水で１０倍希釈し、対数増殖期が終わるまで、吸光光度計（島津分光高度計 UV-1600）で、ＯＤ６００を測定し菌体濃度の指標とした。結果を図２に示した。
【００３６】
図３は、図２に示す結果を基に、対数増殖期におけるＯＤ値の対数を取りプロットしたものである。図３に示される２本の検量線のうち、下方の検量線は、式１で表される。
ｙ＝０．１９８ｘ−３．５２（ｘ：ｔｉｍｅ、Ｒ2＝０．９９３）・・・（１）
また、上方の検量線は式２で表される。
ｙ＝０．１８６ｘ−３．０９（ｘ：ｔｉｍｅ、Ｒ2＝０．９６３）・・・（２）
式１で表されるグラフの傾きより、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株の比増殖速度を０．１９８ｈ-1、式２で表されるグラフの傾きより、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株の比増殖速度を０．１８６ｈ-1と決定した。
【００３７】
（２）生理学的性質
エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株およびＨＵ２０２菌株の生理学的性質は、表２に示すとおりである。
【００３８】
【表２】
【００３９】
なお、表２では、表２に記載した性質を有する場合を「＋」、有さない場合を「−」で表している。
【００４０】
（３）新種の特徴を示すために必要な性質
エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株およびＨＵ２０２菌株の特徴を示すために必要な性質は、表３に示すとおりである。
【００４１】
【表３】
【００４２】
なお、表３では、表３に記載した性質を有する場合を「＋」、有さない場合を「−」で表している。
【００４３】
（４）化学分類学的性質
エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株およびＨＵ２０２菌株の化学分類学的性質として、例えば以下のものを挙げることができる。
【００４４】
エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株およびＨＵ２０２菌株の近縁菌種とのDNA-DNA 相同性としては、１６S rRNA遺伝子の相同性が、Enterobacter aerogensesと９８%、Enterobacter amnigenseと９７%、Enterobacter asburiaeと９８%、Enterobacter gergoviaeと９６%、Enterobacter hormaecheiと９７%、 Enterobacter intermediusと９７%、Enterobacter sakazakiiと９６%である。
【００４５】
なお、上記エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株は、独立行政法人 産業技術総合研究所特許生物寄託センターにおいて、ＦＥＲＭ ＡＰ−２１４９２として寄託されている（寄託日：平成２０年１月２５日）。エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株は、独立行政法人 産業技術総合研究所特許生物寄託センターにおいて、ＦＥＲＭ ＡＰ−２１４９３として寄託されている（寄託日：平成２０年１月２５日）。
【００４６】
（５）本発明に係る菌株の単離方法
まず、福井県敦賀市の砂浜、砂浜付近松林、広島大学構内等からサンプリングした土壌及び余剰汚泥をリン酸バッファーで１０倍希釈して、５分間振盪後、静置した。この際に分離した上清をサンプル微生物含有液とした。また、広島県内河川水の場合は、そのままサンプル微生物含有液とした。
【００４７】
次に、試験管に、表１に示す合成培地からグリセロールを除いたもの８ｍｌに炭素源としての市販のグリセロール（シグマアルドリッチジャパン製）１ｍｌを加えたもの（以下「液体培地」という）を入れ、上記サンプル微生物含有液１ｍｌを、それぞれ接種し、３７℃、１２０ｒｐｍ、嫌気条件下で振とう培養した。サンプル微生物含有液の対照としては、上記液体培地を１０００倍希釈したものを用いた。上記液体培地中のグリセロール濃度は、５０ｇ／ｌである。
【００４８】
上記液体培地は、１２０℃で１５分間オートクレーブを用いて滅菌後に使用したが、オートクレーブする際、培地中に炭素源、リン酸塩、マグネシウム塩が同時に存在すると培地が褐変するため、炭素源、リン酸塩、マグネシウム塩をそれぞれ別々に調製し、表１に示す合成培地からグリセロールを除いたものを滅菌後に、シリンジで嫌気的に混合した。プレート培地は上記液体培地に２％の寒天粉末を添加して作成した。なお、嫌気条件を得るために培地を１００℃、１５分煮沸した後、氷浴にて急冷しながら窒素ガスを吹き込み、脱気を行った。
【００４９】
３７℃で５日間培養後、ロールチューブ法を用いてコロニーの形状、色等を確認した。ロールチューブ法は、ブチルゴム栓付きの試験管を用い、無酸素の混合ガス（水素：窒素：二酸化炭素など）を噴射させて、酸素を遮断しながら微生物を試験管などに分注し、検査する方法である（Hungate, R.E., Methods in Microbiology,Vol 3B, Academic Press, New York, 1969, p117）。
【００５０】
候補となる微生物は、５０ｇ／ｌのグリセロール液体培地で増殖し、かつ水素を生成するものとした。従って、コロニーを取り、液体培地に接種し、回分培養を行った。回分培養液の一部を新たな液体培地に接種し、再び回分培養を行った。この作業を２回繰り返し、候補として２菌株を選択した。当該２菌株はそれぞれ単一菌であり、なおかつ５０ｇ／ｌのグリセロールの消費が見られ、高濃度下でのグリセロール資化性があることを確認した。また、16S rRNAの相同性より、これらの２菌株を、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株と命名した。
【００５１】
なお、グリセロール資化性は、高速液体クロマトグラフィーを用いて、培養開始時と最終日におけるグリセロール量の差から残存グリセロール量を導き出すことによって判断した。
【００５２】
（６）本発明に係る菌株の同定
市販グリセロールを炭素源とした上記液体培地にて対数増殖期まで培養した上記ＨＵ２０１菌株およびＨＵ２０２菌株の培養液各１５ｍｌを３０００ｒｐｍ、１５分、４℃で遠心分離して集菌し、上清を除去した。菌体を１．５ｍｌのＴＥ ｂｕｆｆｅｒに懸濁し、５ｍｇのリゾチーム（シグマ製）を加えた後、３７℃で３０分間ゆっくりと振盪した。溶菌液を２．５ｍｌ加え、静かに混合した後、５５℃で６０分間インキュベートした。次に、フェノールクロロホルム混液（東京化成工業製）を１．２５ｍｌ加えて１０分間振盪し、完全に混合した後、１１，０００ｒｐｍ、１５分間遠心して３層に分離し、上層を新しいチューブに移した。
【００５３】
もう一度フェノールクロロホルム混液を加え、上層を新しいチューブに移すまでの操作を行った。３Ｍ酢酸ナトリウム溶液を上層の１／１０量、エタノールを上層の２．５倍量加えて静かに混合し、室温で１０分間静置した。次に、１１，０００ｒｐｍ、１５分間遠心してＤＮＡを沈殿させ、静かに上清を除去した。さらに、１１，０００ｒｐｍ、１分間遠心し、余分なエタノールを完全に除去した。次に、７０％エタノールを２０ｍｌ加え１３，２００ｒｐｍ、２分間遠心し、静かに上清を除去した。さらに、１３，２００ｒｐｍ、３０秒間遠心し、余分なエタノールを完全に除去した後、ｄＨ2Ｏを２００μｌ加えてＤＮＡを完全に溶解させ、−２０℃で保存した。その結果、２５μｇ以上のゲノムＤＮＡが得られた。
【００５４】
得られたゲノムを鋳型にPremix Taq kit、ＰＣＲ装置（PC808,ASTEC）を用いてＰＣＲを行い、16S rRNA遺伝子を増幅させた。ＰＣＲの反応液組成および反応条件は表４、表５に示すとおりである。
【００５５】
なお、プライマーとしては、Forward Primer 27F（Escherichia coil,positions 8-27、配列番号４）およびReverse Primer 1492R（Escherichia coil,positions1510-1492、配列番号５）を用いた。
【００５６】
【表４】
【００５７】
【表５】
【００５８】
ＰＣＲ産物を０．８％アガロースゲルにて電気泳動し、目的物が増幅されていることを確認した。精製したFragmentをTAクローニングによってp GEM-T easy vectorに組み込み、E.coli DH5αに導入して形質転換させた。100μg/ml Ampicillin、80μg/ml Xgal、そして0.5mM IPTGを含むLB培地上に形質転換させたE.coliを培養し、青白選別法を行って組換えプラスミドを持つE.coliを選別した。選別したE.coliからプラスミドを回収し、精製した。
【００５９】
回収後のプラスミドに含まれる16S rRNA遺伝子の塩基配列の決定は、自然科学研究支援開発センターに依頼した。得られた遺伝子配列を元に、DNA Data Bank of JapanのHP(http://www.ddbj.nig.ac.jp/Welcome-j.html)のBLAST検索を行い、ホモロジー検索を行った。その結果、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株およびＨＵ２０２菌株共にKlebsiella pneumoniaeと９９％、Enterobacter aerogenses（C1111株、C4-1株、An19-2株、An14-1株, An10-1株、An2-1株、A20-1株、 NCTC10006T株, C2111株, RW9516株, RW7M1株）と９８％、 Enterobacter amnigenseと９７％、Enterobacter asburiaeと９８％、Enterobacter gergoviaeと９６％、Enterobacter hormaechei と９７％、 Enterobacter intermedius と９７％、Enterobacter sakazakii と９６％の相同性があることが分かった。
【００６０】
図４〜６は、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株とKlebsiella pneumoniaeの16S rRNA遺伝子の塩基配列を対比した結果を示すものである。図７〜９は、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株とklebsiella pneumoniaeの16S rRNA遺伝子の塩基配列を対比した結果を示すものである。
【００６１】
また、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株の16S rRNA遺伝子の塩基配列を配列番号１に、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株の16S rRNA遺伝子の塩基配列を配列番号２に示し、対比したKlebsiella pneumoniaeの16S rRNA遺伝子の塩基配列を配列番号３に示した。
【００６２】
エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株とエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株とは、約１５００塩基中４塩基の違いが見られた。また、後述する実施例において説明する図１３に示したように生産物にも違いが見られる。したがって、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株とエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株とは同一の菌株ではないと判断される。
【００６３】
〔２．本発明に係るグリセロール資化剤〕
本発明に係るグリセロール資化剤は、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株および／またはエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株を含有する。なお、本明細書において、「資化」とは、油脂をメチルエステル化して得られる生成物からメチルエステルを除去して得られるバイオディーゼル廃液を含む原料液を発酵させ、水素および／またはエタノールを生産することをいう。
【００６４】
すなわち、本発明に係るグリセロール資化剤は、上記ＨＵ２０１菌株のみからなるものであってもよいし、上記ＨＵ２０２菌株のみからなるものであってもよいし、上記ＨＵ２０１菌株および上記ＨＵ２０２菌株からなるものであってもよい。上記ＨＵ２０１菌株と上記ＨＵ２０２菌株とを併用する場合は、両者の混合比は任意である。
【００６５】
また、本発明に係るグリセロール資化剤は、上記ＨＵ２０１菌株および上記ＨＵ２０２菌株のグリセロール資化性を阻害するものでない限り、上記ＨＵ２０１菌株および上記ＨＵ２０２菌株以外の成分を含んでいてもよい。例えば、菌株の保護剤として、スキムミルク、グルタミン酸ナトリウム、アドニトール、システイン・ＨＣｌ、リン酸緩衝液等を含むことができる。上記保護剤の含有量は特に限定されるものではないが、菌株の重量に対してスキムミルクで１５重量％〜２５重量％、グルタミン酸ナトリウムで２〜４％、アドニトールで１〜２％であることが好ましい。
【００６６】
上記グリセロール資化剤を製造する方法は特に限定されるものではないが、例えば殺菌した保護剤を上記ＨＵ２０１菌株および／または上記ＨＵ２０２菌株と混合し、定法に従って凍結乾燥する方法や、Ｌ−乾燥する方法等によって調製することができる。
【００６７】
凍結乾燥またはＬ−乾燥したグリセロール資化剤は、例えば、３７℃で生理食塩水を適宜加えることによって復元することができる。
【００６８】
上記ＨＵ２０１菌株および／または上記ＨＵ２０２菌株は、高濃度のグリセロール含有バイオディーゼル廃液から水素およびエタノールを生産することができる。よって、本発明に係るグリセロール資化剤は従来廃棄されていたバイオディーゼル廃液の有効利用を図ることができる。
【００６９】
〔３．水素およびエタノールの製造方法〕
本発明に係る水素およびエタノールの製造方法は、原料液として、油脂をメチルエステル化して得られる生成物からメチルエステルを除去して得られるバイオディーゼル廃液を含むものを用い、上記原料液を、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株および／またはエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株によって発酵させる発酵工程を含む。以下、構成ごとに分けて具体的に説明する。
【００７０】
（バイオディーゼル廃液）
本発明の製造方法の原料液を構成するバイオディーゼル廃液は、バイオディーゼル燃料を製造する際に副生成物として得られるグリセロールを多量に含むものである。バイオディーゼル燃料の製造原理は、式Ｉに示す反応式に示すようにして行なわれる。
【００７１】
【化１】
【００７２】
より具体的には、油脂（別名：トリグリセリド、トリアシルグリセロール）とメタノールとが化学反応（メチルエステル化）によりメチルエステルおよびグリセロールが生成する。この生成したメチルエステルがバイオディーゼル燃料であり、この反応液からメチルエステル（バイオディーゼル燃料）を除去したものがバイオディーゼル廃液である。
【００７３】
なおバイオディーゼル燃料を製造する際に油脂をメチルエステル化する方法としては、特に限定されるものではなく、公知の方法を用いればよい。例えば、油脂とメタノールとをリパーゼ等の触媒存在下で反応させる方法、または超臨界メタノールと油脂とを反応させる方法（吉川 浩ら、「超臨界メタノールによる植物油からのバイオディーゼル燃料の製造」高圧討論会講演要旨集、ＶＯＬ．４２ｎｄ、ｐ１０９（２００１）、SAKA S, KUSDIANA D,「超臨界メタノールを利用した植物油廃棄物からバイオディーゼル燃料の生産」、資源処理技術、ＶＯＬ．４７、ＮＯ．２、ｐ９５−１０２）等を用いて行うことができる。
【００７４】
このバイオディーゼル燃料を製造する際に用いる油脂としては特に限定されるものではなく、植物性油脂、動物性油脂またはその廃油等を油脂として用いることが可能である。上記植物性油脂としては、パーム油、ナタネ油、ゴマ油、オリーブ油等が挙げられ、動物性油脂としては、ラード、牛脂、魚油等が挙げられる。また上記油脂には、不純物等が含まれるものであっても、試薬グレードの油脂を用いてもよい。試薬グレードの油脂を用いた場合には、メチルエステル化後の反応液中に含まれる不純物が少なく、バイオディーゼル燃料の回収が容易であること、バイオディーゼル廃液を本発明に係る菌株によって発酵させる際の効率が高いという理由から、純度の高い油脂を用いることが好ましいといえる。
【００７５】
また油脂をメチルエステル化して得られた生成物から、メチルエステル（バイオディーゼル燃料）を除去する方法としては、デカンテーション等の公知の方法を用いればよい。より具体的には、メチルエステル化後（メタノリシス後）、反応液を静置することにより、生成されたバイオディーゼル燃料は上層に、グリセロールを含むバイオディーゼル廃液部分は下層に分かれる。よって、デカンテーション等の方法により容易にバイオディーゼル燃料とバイオディーゼル廃液とを分離できる。上記のようにしてメチルエステル（バイオディーゼル燃料）を反応液中から除去した残渣が、本発明の製造方法において利用するバイオディーゼル廃液である。
【００７６】
かかるバイオディーゼル廃液には、主成分としてグリセロールが多量に含まれている。バイオディーゼル燃料の製造に用いる油脂に含まれる成分によって異なるが、バイオディーゼル廃液にはその他、乳酸、酢酸、エタノール等が含まれる場合がある。
【００７７】
（原料液）
本発明の製造方法に用いる上記原料液は、上記バイオディーゼル廃液が含まれていれば特に限定されるものではなく、バイオディーゼル廃液そのものを原料液として用いても良く、また適宜、水等の溶媒を添加し原料液として用いてもよい。上記溶媒の添加率（換言すれば希釈率）は特に限定されるものではなく、後に行なう本発明に係る菌株による発酵工程に用いる原料液として好適なものとなるように適宜検討の上、決定すればよい。
【００７８】
本発明に係る菌株、すなわちエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株とエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株は、いずれも高濃度のグリセロールを資化することができる。特許文献２に記載されているように、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ１０１株は、が処理できる原料液のグリセロール濃度は１０〜２０ｇ／ｌであったが、本発明に係る菌株は、後述するようにグリセロール濃度が７５ｇ／ｌの原料液まで処理可能であり、ＣＳＬを原料液に添加した場合はグリセロール濃度が９０ｇ／ｌの原料液まで処理可能であることを確認している。
【００７９】
それゆえ、上記原料液のグリセロール濃度は、２０ｇ／ｌを超えることが好ましい。これにより、上記希釈率を従来よりも大幅に低下させることができる。もちろん、２０g／ｌ以下の場合も問題なくグリセロールを資化することができる。
【００８０】
またその他、本発明に係る菌株の生育に必要な培地成分が含まれていてもよい。当該培地成分が含まれることによって、本発明に係る菌株の生育・増殖が活発になり、バイオディーゼル廃液からの水素・およびエタノールの発酵生産効率がさらに向上する。
【００８１】
上記培地成分としては、本発明に係る菌株の培養に好適なものを適宜選択の上、添加すればよい。特に、酵母抽出液、およびカゼイン酵素分解物は、一般に微生物用培地に用いられている成分であり、本発明に用いる培地成分としては好適である。
【００８２】
なお、酵母抽出液（別名：イーストエキス、酵母エキス）とは、ビール酵母（Saccharomyces cerevisiae ）等の酵母の内容物を抽出したものであり、一般に市販されているものである。本発明においてもかかる市販されているものを適宜利用すればよい。例えば、粉末酵母エキスＳ（日本製薬株式会社製）、Yeast Extract, Bact（Difco社製）等を用いればよい。上記酵母抽出物の添加量としては、原料液に０．０５重量％以上１重量％以下が好ましく、原料液に０．２５重量％以上０．５重量％以下がさらに好ましい。
【００８３】
また、上記カゼイン酵素分解物とは、牛乳カゼイン等のカゼインをペプシン、トリプシン等のタンパク質分解酵素（プロテアーゼ）で処理したものであり、一般に市販されているものである。本発明においてもかかる市販されているものを適宜利用すればよい。例えば、ポリペプトン（日本製薬株式会社製）、Trypton, Bact（Difco社製）等を用いればよい。上記カゼイン酵素分解物の添加量としては、原料液に０．１重量％以上１重量％以下が好ましく、原料液に０．２５重量％以上０．０５重量％以下がさらに好ましい。
【００８４】
その他の培地成分としては、（ＮＨ4）2ＳＯ4，ＭｇＳＯ4、Ｃｏ（ＮＯ3）2、Ｆｅ（ＮＨ4）2ＳＯ4、Ｎａ2ＭｏＯ4，ＣａＣｌ2，Ｎａ2ＳｅＯ3，ニコチン酸、ＮｉＣｌ2、その他ビタミン類等をミネラルとして添加してもよい。また、バッファー成分として、Ｋ2ＨＰＯ4、ＫＨ2ＰＯ4等が含まれていてもよい。また微量元素としてＭｎＣｌ2、Ｈ3ＢＯ3、ＡｌＫ（ＳＯ4）、ＣｕＣｌ2、ＥＤＴＡ等が含まれていてもよい。上記化合物は市販されているものを使用することができる。
【００８５】
（微生物）
本発明の製造方法における発酵工程に用いる微生物は、既に説明したように、通性嫌気性細菌のエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株および／またはエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株である。エンテロバクター(Enterobacter)属細菌のグリセロールの代謝経路について図１０に示す。
【００８６】
エンテロバクター(Enterobacter)属細菌は、ブドウ糖などの解糖系で得られた余剰なＮＡＤＨを２,３−ブタンジオール、エタノール、乳酸および酢酸などに配分することにより還元当量のバランスを保つ、いわゆる混合有機酸発酵を行なって生育する。この中で水素（図１０中、Ｈ2）は、以下の経路によって生成される。(1)エタノール（図１０中、Ethanol）および酢酸（図１０中、Acetate）生成の中間生成物であるピルビン酸（図１０中、Pyruvate）がアセチルＣｏＡ（図１０中、Acetyl-CoA）へと代謝される際に、ピルビン酸−ギ酸リアーゼによりギ酸（図１０中、Formate）が生成される。(2)当該ギ酸（図１０中、Formate）からヒドロゲナーゼの作用により水素（図１０中、Ｈ2）が生成される。
【００８７】
よって、本発明の製造方法にエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株および／またはエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株を用いることによって、バイオディーゼル廃液に含まれるグリセロールを利用して水素およびエタノールを発酵生産することができる。
【００８８】
（発酵工程）
本発明にかかる製造方法は、既述の原料液を、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株および／またはエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株によって発酵させる発酵工程を含んでいる。かかる発酵工程は、本発明に係る菌株が原料液から水素およびエタノールを発酵生産する工程である。その発酵条件としては、本発明に係る菌株が水素およびエタノールを発酵生産する条件として好ましい条件であれば特に限定されるものではなく、その発酵方法は連続培養であっても回分培養（バッチ培養）であっても半回分培養であってもよい。
【００８９】
回分培養は、発酵槽に原料と微生物を仕込み発酵終了後に発酵液を抜き出すという培養方法であり、連続培養は微生物を固定化等により発酵槽の中に閉じ込め、原料の流入と発酵液の流出を連続的に行なう培養方法である。半回分培養は、流加培養ともいい、培養中に、培地自体や培地中の特定の成分を添加する方法である。連続培養は、長期間連続的に発酵することにより、発酵槽の単位体積あたりの生産性が回分培養に比して高いというメリットがあるためにより好ましいといえるが、本発明に係る菌株は、担体に固定化せずとも高濃度のグリセロールを資化し、水素およびエタノールを発酵生産することができるため、半回分培養であっても効率よく水素およびエタノールの生産を行うことができる。
【００９０】
また本発明における発酵工程は、通気培養であっても、静置培養であっても、攪拌培養であっても振盪培養であってもよい。
【００９１】
また培養温度については本発明に係る菌株の生育に好適な条件を採用すれば良く、２８℃〜４０℃が好ましく、３０℃〜３７℃がさらに好ましく、３７℃が最も好ましい。
【００９２】
回分培養を行う場合は、原料液を試験管等の反応容器中に入れ、本発明に係る菌株を接種した後、振盪培養等を行えばよい。本発明に係る菌株は、担体に固定せずとも高濃度のグリセロールを資化できるので、回分培養であっても水素およびエタノールを生産することができるが、図１０に示すように、グリセロールの代謝中には、水素およびエタノール以外に、１，３−プロパンジオール、酢酸、２，３−ブタンジオール、乳酸等の有機酸が多量に発生するため、上記発酵によって得られた発酵液のｐＨは、発酵工程の進行に連れて低下し、酸性となる。
【００９３】
一方、本発明に係る菌株の至適ｐＨは中性付近（ｐＨ６．５以上７．５以下）であるため、回分培養反応では、発酵生産の速度が低下し、原料液中のグリセロール濃度に関わらず、ある程度の量以上のグリセロールを利用できなくなるという問題がある。
【００９４】
それゆえ、上記発酵工程においては、原料液および／または上記発酵によって得られた発酵液のｐＨを６．５以上７．５以下に保持することが好ましい。これによって、発酵液のｐＨが本発明に係る菌株の至適ｐＨに保持されるので、効率よくグリセロールを資化し、水素およびエタノールを生産することができる。
【００９５】
そのため、上記発酵工程においては、回分培養よりも半回分培養または連続培養を行うことが好ましい。半回分培養を行うための培養装置としては特に限定されるものではなく、公知の培養装置を適宜選択の上、利用が可能である。図１１に半回分培養を行なうための培養装置の模式図を示す。半回分培養装置１１は、発酵槽１２、アルカリ液貯留槽１３、アルカリ液流入孔１４、サンプリング孔１５、ｐＨ測定装置１６、電極１７、ポンプ１８、排気口１９、とからなっている。発酵槽１２には原料液および／または上記発酵によって得られた発酵液２０（以下「発酵液２０」という）が入っている。また、発酵液２０の温度は、発酵槽１２を恒温槽（図示せず）に載置すること等により、一定に保たれている。
【００９６】
ｐＨ測定装置１６が電極１７によって、発酵液２０のｐＨを測定し、ｐＨが６．５未満であることを検知すると、ｐＨ測定装置はコンピュータ２１に指示を送り、コンピュータ２１は、ポンプ１８を起動する。そして、アルカリ液がアルカリ液貯留槽１３からポンプ１８によって、アルカリ液流入孔１４を通って発酵槽１２に供給され、発酵液２０のｐＨが６．５以上７．５以下に保持される。
【００９７】
上記「アルカリ液」としては、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等の水溶液を用いることができ、有機酸を中和できるものであれば特に限定されるものではない。
【００９８】
一方、発酵生産された水素ガスを含む気体成分は、排気口１９を通って発酵槽１２外へと排出され、ガス回収槽（図示せず）において回収されるようになっている。サンプリングは、サンプリング孔１５から適宜行えるようになっている。例えば、サンプリング孔１５からサンプルを採取し、高速液体クロマトグラフィーを用いてグリセロール量を分析することにより、発酵の進捗状況を確認することができる。
【００９９】
このように、本発明に係る菌株は、担体に固定しなくてもグリセロールを効率よく資化することができるが、もちろん担体を用い、連続培養を行ってもよい。
【０１００】
原料の流入と発酵液の流出を行なう連続培養では、その発酵液の流出の際に微生物が一緒に流出することを防止する必要がある。このために微生物の固定化等を行なって、発酵槽からの流出を防いでいる。上記微生物の流出を防ぐ方法としては、固定化担体を用いて発酵槽内に微生物を固定化してもよいし、特に固定化担体を用いることなく増殖した微生物同士が自己凝集体（フロック）を形成して発酵槽内に留まるという方法であってもよい。ただし、固定化担体の自重により固定化担体に固定化された微生物が発酵液の表層に浮遊することがなく、確実に発酵槽内に留まることができるということ、浮遊することが無いために原料液と微生物が接触する頻度が高まり発酵生産効率が向上すること、および発酵槽内の微生物の菌体密度を向上させることができる等の理由から、固定化担体を用いる方法が好ましいといえる。
【０１０１】
上記担体としては、少なくともその表面に、（より好ましくは、その表面および内部に）微生物を固定することが可能な担体であれば限定されるものではない。ただし、微生物が固定化しやすく、その微生物の固定量が増加するという理由から、上記担体は多孔質であることが好ましい。上記多孔質である担体（以下、「多孔質担体」という）は、文字通りその表面に多数の孔があり、その孔内部および表面に微生物、すなわち本発明に係る菌株が吸着し、本発明に係る菌株を固定化することができる。
【０１０２】
担体（より好ましくは多孔質担体）に本発明に係る菌株を固定化する方法としては、特に限定されるものではないが、例えば発酵槽内に原料液と担体（より好ましくは多孔質担体）を仕込み、そこに本発明に係る菌株を接種し培養する方法が挙げられる。すなわち特に、固定化操作を別途行なうのではなく、発酵工程によって増殖してきた本発明に係る菌株の培養液が担体（より好ましくは多孔質担体）と接触することにより、その表面および内部に固定化されるという方法である。
【０１０３】
なお、本発明の製造方法の発酵工程とは別に本発明に係る菌株を培養し、担体（より好ましくは多孔質担体）に固定化するという操作を行ない、本発明に係る菌株が固定化された担体（より好ましくは多孔質担体）を発酵工程に導入するというものであってもよい。
【０１０４】
本発明の製造方法において使用する上記多孔質担体は、特に限定されるものではなく、連続培養用に市販されている固定化担体を適宜利用可能である。例えば、ナガオ株式会社製: ペレット状セラミックスSP1-4、協和エンジニアリング株式会社製: クラゲール、株式会社サンバイオ社製：バイオポーラスなどが利用可能である。
【０１０５】
なお本発明に使用する担体（より好ましくは多孔質担体）は、粒子状であることが好ましく、その平均粒子径が３ｍｍ以上２０ｍｍ以下であることが好ましい。上記担体（より好ましくは多孔質担体）は、既述の通り表面および内部に微生物が固定されることにより、菌体密度を向上させるための部材である。したがって菌体密度をさらに向上させるためには、担体（より好ましくは多孔質担体）は粒子状であり、その粒子径はできるだけ小さいことが好ましいといえる。
【０１０６】
ただし、過度に粒子径が小さくなると原料液表面に浮遊してしまい、菌体密度を向上させることができなくなる。よって担体（より好ましくは多孔質担体）の平均粒子径を上記のごとく３ｍｍ以上２０ｍｍ以下にすることが好ましいといえ、３ｍｍ以上１０ｍｍ以下にすることがさらに好ましいといえる。平均粒子径が上記の範囲の担体（より好ましくは多孔質担体）を用いることで、菌体密度をさらに向上させることができ、水素およびエタノール生産量をさらに向上させることができるという効果を奏する。
【０１０７】
また本発明の製造方法は、上記多孔質担体が、貫通孔を有する多孔質担体であることが好ましい。多孔質担体に貫通孔がない場合、本発明に係る菌株の培養液が、多孔質体の孔の内部まで入り込むことができないのに対し、多孔質担体に貫通孔がある場合は、当該多孔質担体の貫通孔を本発明に係る菌株の培養液の培養液が通過することができ、多孔質担体のさらに内部まで本発明に係る菌株が入り込むことができる。それゆえ、本発明に係る菌株の多孔質担体に対する固定化量を向上させることができ、水素およびエタノール生産量をさらに向上させることができるという効果を奏する。上記貫通孔を有する多孔質担体は、既述のナガオ株式会社製: ペレット状セラミックスSP1-4、協和エンジニアリング株式会社製: クラゲール、株式会社サンバイオ社製：バイオポーラスなどが利用可能である。
【０１０８】
なお使用する担体の材質は、特に限定されるものではなく、例えばレンガ様の素焼き材；セラミックス、ポリビニルアルコール等の高分子材料；木材チップ、セルロース等の生体高分子化合物が利用可能である。
【０１０９】
連続培養に使用する装置としては、特に限定されるものではなく、公知の培養装置を適宜選択の上、利用が可能である。図１２に連続培養を行なうための連続培養装置の模式図を示す。連続培養装置１は、発酵槽２、恒温ジャケット３、恒温水流出孔３ａ、恒温水流入孔３ｂ、恒温水槽３ｃ、細菌固定化多孔質担体４、原料液流入孔５、発酵液流出孔６、原料液タンク７、ポンプ８、排気口９、ガス回収槽１０とからなっている。
【０１１０】
原料液は原料液タンク７からポンプ８によって、原料液流入孔５を通って発酵槽２に供給される。原料液は、細菌固定化多孔質担体４に固定化されたエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株および／またはエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株によって発酵する。発酵後のエタノールを含む発酵液は、原料液の供給に伴い発酵液流出孔６を通って発酵槽２外へと流出し回収される。
【０１１１】
一方、発酵生産された水素ガスを含む気体成分は、排気口９を通って発酵槽２外へと排出され、ガス回収槽１０において回収されるようになっている。なお発酵槽２内の温度は、発酵槽の外側面を覆うように設けられた恒温ジャケット３内に恒温水槽３ｃから供給される恒温水によって、一定に保たれている。恒温水は、恒温水槽３ｃから恒温水流入孔３ｂを通って恒温ジャケット３内に供給され、恒温水流出孔３ａから再び恒温水槽３ｃに戻るという要領により循環している。
【０１１２】
上記の連続培養において、発酵槽２内への原料液の供給量（以下、原料液希釈率という）の好適な条件は、用いる原料液の組成，多孔質担体の種類，本発明に係る菌株の状態，培養条件等によって異なるために、限定されるものではないが、０．６ｈ-1以上１．２ｈ-1以下が好ましく、０．７ｈ-1以上１．２ｈ-1以下がさらに好ましい。上記好ましい範囲以上の希釈率で原料液を供給すると、本発明に係る菌株の発酵能力を原料供給量が上まり、十分発酵していないにもかかわらず発酵槽２外へ流出してしまう状態となり、発酵効率が下がり、水素およびエタノールの回収量が少なくなってしまう。
【０１１３】
一方、上記好ましい範囲以下の希釈率で原料液を供給すると、発酵は十分に進むが生成物であるエタノール等によって菌体が死滅したり、雑菌の汚染の危険性が高くなるために好ましくない。なお「原料液希釈率」とは、１時間当たりに供給される原料液量の全原料液量に対する割合のことである。
【０１１４】
（コーンスティープリカー（ＣＳＬ）の使用）
ＣＳＬは、コーンスターチ製造工業でコーンスターチを生産する際に生じる副産物である。ＣＳＬは、コーンスターチ製造過程で、とうもろこし粒を０．１〜０．３％の亜硫酸液に４５〜５０℃、約４０〜４８時間乳酸発酵させながら浸漬する工程があり、浸漬を終わった後、浸漬槽から抜液され、真空蒸発装置によって固形分５０％前後まで濃縮されることによって生成される。ＣＳＬは、酵母エキスに替わる安価な炭素源の候補物質として用いられている。
【０１１５】
本発明者は、ＣＳＬを原料液に含有させることによって、グリセロール濃度９０ｇ／ｌという、エンテロバクター（Enterobacter）属細菌の生育が通常確認できなかった高濃度であっても本発明に係る菌株を生育させることができることを確認した。
【０１１６】
よって、本発明に係る水素およびエタノールの製造方法は、上記原料液がＣＳＬを含有することが好ましい。
【０１１７】
ＣＳＬには、とうもろこし粒から溶出された可溶性タンパク質、ペプチド、アミノ酸、糖類、ビタミン類が含まれる他、多量の乳酸、アミノ酸およびペプチドが含まれるきわめて粘稠な液体である。また、ＣＳＬは、原料とうもろこしの品種、産地、浸漬条件などによって成分比にかなり差異があるが、濃縮前の組成として、総固形分含量が６．０〜７．０％、乳酸が１．６〜２．０％、還元糖が０．４〜０．５％、総窒素０．４〜０．６％、灰分１．１〜１．３％、ｐＨ３．６〜３．８が標準とされている（滝昭夫ら、三重大学農学部学術報告７５号、ｐ５９~６７、１９８７）。
【０１１８】
本発明で用いるＣＳＬは、上記組成を満たしていれば特に限定されるものではない。ＣＳＬを原料液に添加する時期は、特に限定されるものではないが、本発明の菌株の生育性を高め、グリセロール資化性を向上させる観点から、予め原料液に混合しておくことが好ましい。ＣＳＬの原料液への添加量は、特に限定されるものではないが、濃度０．１〜２ｇ／ｌであることが好ましく、０．１〜０．４ｇ／ｌであることがより好ましい。
【０１１９】
（その他の工程）
本発明にかかる製造方法は、上記発酵工程のほかに、本発明に係る菌株を予め増殖させておく前培養工程、多孔質担体に予め本発明に係る菌株を固定化しておく固定化工程、生成した水素またはエタノールを精製する精製工程、生成した水素またはエタノールをガスクロマトグラフィー等で分析する工程、バイオディーゼル燃料の製造工程等の工程が含まれていてもよい。
【０１２０】
〔４．本発明に係るキット〕
本発明に係るキットは、上記本発明にかかる水素およびエタノールの製造方法を行うためのキットであって、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株および／またはエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株並びに上記菌株を培養可能な培地が含まれる。
【０１２１】
上記培地としては、本発明に係る菌株の培養に好適な成分を適宜選択し、適用したものであればよい。上記成分としては、例えば酵母抽出液、カゼイン酵素分解物、ビタミン類、バッファー成分、微量元素等を挙げることができる。また、培地の一例としては、例えば表１に挙げたグリセロール培地を好適に用いることができる。
【０１２２】
さらに、本発明に係るキットには、例えば図１１または図１２に示すような培養装置（バイオリアクター）が含まれていてもよい。
【０１２３】
以下添付した図面に沿って実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【０１２４】
＜実施例１：グリセロール濃度２５ｇ／ｌの原料液を用いたエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株またはエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株による水素の発酵生産＞
試験管に、表１に示す合成培地からグリセロールを除いたもの８ｍｌに、グリセロール濃度が原料液に対して２５ｇ／ｌとなるようにリン酸バッファーで希釈した炭素源を加えて原料液を調製し、これにエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株またはエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株の１白金耳を１ｍｌリン酸バッファーに懸濁した液１ｍｌをそれぞれ接種し、ｐＨをリン酸バッファーによって７．０に調整し、３７℃、５日間暗所にて静置培養を行い、ガス量測定、ガス組成測定、サンプリングを適時行った。
【０１２５】
なお、ガス組成は、ガスタイトシリンジを用いてサンプルを抜き取り、ガスクロマトグラフィー（GC-8A：Shimazu；TCD：Thermal Conductivity Detector）で分析した。分析条件は表６に示すとおりである。
【０１２６】
【表６】
【０１２７】
炭素源としては、表７に示すバイオディーゼル廃液、減圧蒸留でメタノールを除去したバイオディーゼル廃液または市販グリセロールを用いた。なお、表７に示すバイオディーゼル廃液は、広島県大朝町で回収されたものを使用した。
【０１２８】
【表７】
【０１２９】
水素生成量を測定した結果を、図１３に示した。図１３（ａ）は、上記ＨＵ２０１菌株を用い、３種類の炭素源を発酵させた場合の水素生成量を示すものである。図１３（ｂ）は、上記ＨＵ２０２菌株を用い、３種類の炭素源を発酵させた場合の水素生成量を示すものである。図中、白抜きのひし形のシンボルは、炭素源としてバイオディーゼル廃液を用いた場合（「２５ｇＢＷ」と表示）、白抜き四角形のシンボルは、炭素源としてメタノールを除去したバイオディーゼル廃液を用いた場合（「２５ｇＢＭ」と表示）、白抜き三角形のシンボルは、炭素源として市販グリセロールを用いた場合（「２５ｇ純グリ」と表示）の水素生成量を示している。
【０１３０】
図１３より、上記ＨＵ２０１菌株およびＨＵ２０２菌株は、グリセロールがどのような炭素源として供給されるかに関わらず、安定した水素生成を行うことが確認された。
【０１３１】
＜実施例２：グリセロール濃度５０ｇ／ｌの原料液を用いた場合における水素の発酵生産＞
そこで、次に、原料液のグリセロール濃度を５０ｇ／ｌに引き上げ、様々な土地から採取したサンプル菌（１０種類）を用いて、実施例１と同様の実験を行った。結果は図１４に示した。図１４の横軸は、サンプル番号と、実施例１に示した炭素源の種類の組み合わせになっており、例えば、「１−ＢＭ」はサンプル１に、メタノールを除去したバイオディーゼル廃液を５０ｇ／ｌで供したことを示し、「１−ＢＷ」は、サンプル１に、表７に示すバイオディーゼル廃液を５０ｇ／ｌで供したことを示す。図１４には、１０種類のサンプル菌のうち、水素生成を行ったもののみを表示している。このうち、サンプル１が上記ＨＵ２０１菌株であり、サンプル２が上記ＨＵ２０２菌株である。なお、サンプル４，５，６はそれぞれ未同定の細菌である。
【０１３２】
図１４に示すように、グリセロール濃度を５０ｇ／ｌとした場合は、上記ＨＵ２０１菌株およびＨＵ２０２菌株のみが安定に生育し、安定した水素生産を行うことができることが確認された。水素生成量は、グリセロール濃度２５ｇ／ｌのときと大きな差は見られなかった。
【０１３３】
続いて、上記ＨＵ２０１菌株およびＨＵ２０２菌株による発酵生産の結果生成したガス以外の生産物を、５日間培養後の原料液を高速液体クロマトグラフィー（HPLC : High Performance Liquid Chromatography；JASCO Gulliver series UV-910＆PU-980, JASCO）に供することによって分析した。分析条件は表８に示すとおりである。なお、残存グリセロールは、生産物の分析と同様、高速液体クロマトグラフィーを用いて、培養開始時と最終日におけるグリセロールの差から導き出した。
【０１３４】
【表８】
【０１３５】
結果を図１５に示した。図１５（ａ）は、上記ＨＵ２０１菌株による発酵生産後の残存グリセロールおよびガス以外の最終生産物の変化を示すものであり、図１５（ｂ）は、上記ＨＵ２０２菌株による発酵生産後の残存グリセロールおよびガス以外の最終生産物の変化を示すものである。図１５中、「残存Ｇｌｙｃｅｒｏｌ」は５日間培養後の残存グリセロール量を示し、「１３−ＰＤ」は１，３−プロパンジオールを、「Ｅｔｈａｎｏｌ」はエタノールを、「Ｌａｃｔａｔｅ」は乳酸を、「Ａｃｅｔａｔｅ」は酢酸を表している。
【０１３６】
図１４、１５より、上記ＨＵ２０１菌株、ＨＵ２０２菌株のいずれもが、５０ｇ／ｌという高濃度のグリセロール存在下でも生育でき、目的産物である水素およびエタノールを生産していることが明らかとなった。
【０１３７】
図１４、１５に示すように、上記ＨＵ２０１菌株およびＨＵ２０２菌株は、ともにグリセロールを約２０g／ｌ消費（つまり資化）し、水素を約３５ｍｍｏｌ／ｌ生成した。また、上記ＨＵ２０１菌株はエタノールを約８０ｍｍｏｌ／ｌ、ＨＵ２０２菌株は約５０ｍｍｏｌ／ｌ生成した。この実験において、バイオディーゼル廃液に含まれている塩などの培養阻害物質の影響は見られなかった。
【０１３８】
コスト面、発酵後の処理の手間を少なくすることなどの実用性を考えた場合、バイオディーゼル廃液は、できるだけ添加物を加えず、しかもできるだけ希釈せずに発酵に供することが望ましい。本発明に係る菌株によれば、５０ｇ／ｌという高濃度でグリセロールを含有する原料液を資化することができた。よって、本発明に係る菌株によれば、バイオディーゼル廃液の効率的な利用を行うことができる。
【０１３９】
＜実施例３：エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株またはエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株が生育可能なグリセロール濃度の検討＞
表７に示すバイオディーゼル廃液の濃度をさらに上げ、上記ＨＵ２０１菌株およびＨＵ２０２菌株が生育可能な最大グリセロール濃度を検討した。試験管に、表１に示す合成培地からグリセロールを除いたもの８ｍｌに、グリセロール濃度が原料液に対して５０、６０，７０，８０，９０ｇ／ｌとなるようにリン酸バッファーで希釈したバイオディーゼル廃液を加えて原料液を調製し、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株またはエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株の１白金耳を１ｍｌリン酸バッファーに懸濁した液を１ｍｌそれぞれ接種し、ｐＨをリン酸バッファーによって７．０に調整し、３７℃、５日間暗所にて静置培養を行った。５日間培養後の水素生成量を、実施例１と同様にガスクロマトグラフィーを用いて測定した。
【０１４０】
図１６は、上記ＨＵ２０１菌株およびＨＵ２０２菌株が生育可能なグリセロール濃度を検討した結果を示すものである。図１６より、上記ＨＵ２０１菌株およびＨＵ２０２菌株が生育できる最大グリセロール濃度は、共に７５ｇ／ｌ付近（約75,000ppm）であると考えられる。これは表７に示すバイオディーゼル廃液を約５〜６倍希釈したものに相当する。上述のように、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ１０１株で処理するためには、バイオディーゼル廃液を４０倍近く希釈しなければならないことに鑑みると、本発明に係る菌株は、上記ＨＵ１０１株に比べて非常に高度なグリセロール資化力を有することが分かる。
【０１４１】
＜実施例４：流加培養実験＞
これまでは、培養開始時の減量液のｐＨを７．０に調整し、試験管内で回分培養を行ってきたが、発酵に伴って産生される有機酸の影響によって原料液のｐＨが低下すると、図１５に示すようにグリセロールの消費が停止する。
【０１４２】
そこで、次に、リアクターを用い、原料液および／または上記発酵によって得られた発酵液のｐＨを６．７５〜７．０に保ちながら、発酵工程を行った。リアクターの概略は図１１に示すとおりである。
【０１４３】
上記リアクターに、表１に示す合成培地からグリセロールを除いたもの５００ｍｌに、グリセロール濃度が原料液に対して４０ｇ／ｌとなるようにリン酸バッファーで希釈した炭素源（表７に示すバイオディーゼル廃液）を加えて原料液を調製し、同一培地で前もって２日間前培養したエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株またはエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株の培養液５０ｍｌをそれぞれ接種し、ｐＨを５Ｎ水酸化ナトリウムの水溶液によって７．０に調整し、３７℃、５日間暗所にて静置培養を行った。原料液および／または上記発酵によって得られた発酵液のｐＨが６．７５未満になった場合、水酸化ナトリウムの水溶液（濃度５Ｎ）をリアクター内に添加することにより、原料液および／または上記発酵によって得られた発酵液のｐＨを６．７５〜７．０に保った。
【０１４４】
なお、「原料液および／または上記発酵によって得られた発酵液」とは、まだ発酵が開始されていない原料液、発酵途中の、原料液および発酵によって得られた発酵液の混合物、発酵が完了した後の発酵液のいずれもが含まれる。
【０１４５】
図１７（ａ）は、上記ＨＵ２０１菌株を用い、半回分培養（流加培養）による発酵生産後の残存グリセロールおよび最終生産物の変化を示すものであり、図１７（ｂ）は、上記ＨＵ２０２菌株を用い、半回分培養（流加培養）による発酵生産後の残存グリセロールおよび最終生産物の変化を示すものである。
【０１４６】
図１７（ａ）および（ｂ）に示すように、ｐＨを７付近に保持することにより全てのグリセロールを消費させることができた。またｐＨを７付近に保持することによって、１,３−プロパンジオールの生産量を、回分培養の場合に比べ、約１／８に抑えることが出来た。そしてエタノール生産量も２倍近く向上させることができた。
【０１４７】
＜実施例５：ＣＳＬの添加＞
試験管に、表１に示す合成培地からグリセロールを除いたもの８ｍｌに、グリセロール濃度が原料液に対して９０ｇ／ｌとなるようにリン酸バッファーで希釈したバイオディーゼル廃液を加えて原料液を調製し、当該原料液に、ＣＳＬ（ヤエガキ醗酵技研（株）より提供）を０．１ｍｌ、０．４ｍｌ，０．７ｍｌまたは１．０ｍｌ加えた。次に、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株またはエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株の１白金耳をリン酸バッファー１ｍｌに懸濁した液１ｍｌを接種しｐＨをリン酸バッファーによって７．０に調整した。３７℃、５日間暗所にて静置培養を行った後の水素生成量を、実施例１と同様にガスクロマトグラフィーを用いて測定した。
【０１４８】
図１８は、ＣＳＬの添加量と水素生成量との関係を示すグラフである。図１８において、白抜きの四角形のシンボルはＨＵ２０１を、黒い三角形のシンボルはＨＵ２０２を用いた場合の結果を表している。図１６に示すように、ＣＳＬを添加しない場合は、上記ＨＵ２０１菌株およびＨＵ２０２菌株が生育できる最大のグリセロール濃度は７５ｇ／ｌ付近であったが、ＣＳＬを添加することによって、９０ｇ／ｌという、非常に高濃度のグリセロール存在下であっても安定に生育し、水素を生産することができることが分かった。特に、ＣＳＬの添加量が０．４ｍｌまでの範囲においては、３０ｍｍｏｌ／ｌ以上の水素を生成した。
【産業上の利用可能性】
【０１４９】
本発明に係る菌株は、非常に高濃度のグリセロール存在下でも安定に生育し、水素およびエタノールを生産することができるため、バイオディーゼル廃液の有効利用に資することができる。したがって、本発明は、食品工業、化学工業、エネルギー産業等広範な産業において廃水、廃液処理の工程として利用が可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１５０】
【図１】図１（ａ）は、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株の形態を撮影した写真であり、図１（ｂ）はエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株の形態を撮影した写真である。
【図２】エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株およびＨＵ２０２菌株の比増殖速度を解析した結果を示すものである。
【図３】図２に示す結果を基に、対数増殖期におけるOD値の対数を取りプロットした結果を示すものである。
【図４】エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株とklebsiella pneumoniaeの16S rRNA遺伝子の塩基配列を対比した結果のうち、上記ＨＵ２０１菌株の１４９８塩基配列中1番目〜５４０番目の配列に関する結果を示すものである。
【図５】エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株とklebsiella pneumoniaeの16S rRNA遺伝子の塩基配列を対比した結果のうち、上記ＨＵ２０１菌株の１４９８塩基配列中５４１番目〜１０８０番目の配列に関する結果を示すものである。
【図６】エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株とklebsiella pneumoniaeの16S rRNA遺伝子の塩基配列を対比した結果のうち、上記ＨＵ２０１菌株の１４９８塩基配列中１０８１番目〜１４９８番目の配列に関する結果を示すものである。
【図７】エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株とklebsiella pneumoniaeの16S rRNA遺伝子の塩基配列を対比した結果のうち、上記ＨＵ２０２菌株の１４８１塩基配列中２０番目〜５５９番目の配列に関する結果を示すものである。
【図８】エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株とklebsiella pneumoniaeの16S rRNA遺伝子の塩基配列を対比した結果のうち、上記ＨＵ２０２菌株の１４８１塩基配列中５６０番目〜１０９９番目の配列に関する結果を示すものである。
【図９】エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株とklebsiella pneumoniaeの16S rRNA遺伝子の塩基配列を対比した結果のうち、上記ＨＵ２０２菌株の１４８１塩基配列中１１００番目〜１４８１番目の配列に関する結果を示すものである。
【図１０】エンテロバクター(Enterobacter)属細菌のグリセロールの代謝経路を示す模式図である。
【図１１】半回分培養を行なうための培養装置の模式図である。
【図１２】連続培養を行なうための連続培養装置の模式図である。
【図１３】（ａ）は、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株を用い、３種類の炭素源を発酵させた場合の水素生成量を示すものである。（ｂ）は、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株を用い、３種類の炭素源を発酵させた場合の水素生成量を示すものである。
【図１４】原料液のグリセロール濃度を５０ｇ／ｌとした場合における、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株およびエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株による水素生産量を示すものである。
【図１５】（ａ）は、上記ＨＵ２０１菌株による発酵生産後の残存グリセロールおよびガス以外の最終生産物の変化を示すものであり、（ｂ）は、上記ＨＵ２０２菌株による発酵生産後の残存グリセロールおよびガス以外の最終生産物の変化を示すものである。
【図１６】エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株およびＨＵ２０２菌株が生育可能なグリセロール濃度を検討した結果を示すものである。
【図１７】（ａ）は、上記ＨＵ２０１菌株を用い、流加培養による発酵生産後の残存グリセロールおよび最終生産物の変化を示すものであり、（ｂ）は、上記ＨＵ２０２菌株を用い、流加培養による発酵生産後の残存グリセロールおよび最終生産物の変化を示すものである。
【図１８】ＣＳＬの添加量と水素生成量との関係を示すグラフである。
【符号の説明】
【０１５１】
１ 連続培養装置
２ 発酵槽
３ 恒温ジャケット
３ａ 恒温水流出孔
３ｂ 恒温水流入孔
３ｃ 恒温水槽
４ 細菌固定化多孔質担体
５ 原料液流入孔
６ 発酵液流出孔
７ 原料液タンク
８ ポンプ
９ 排気口
１０ ガス回収槽
１１ 半回分培養装置
１２ 発酵槽
１３ アルカリ液貯留槽
１４ アルカリ液流入孔
１５ サンプリング孔
１６ ｐＨ測定装置
１７ 電極
１８ ポンプ
１９ 排気口
２０ 発酵液
２１ コンピュータ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株。
【請求項２】
エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株。
【請求項３】
油脂をメチルエステル化して得られる生成物からメチルエステルを除去して得られるバイオディーゼル廃液を含み、グリセロール濃度が５０ｇ／ｌである原料液中のグリセロールを１５g／ｌ以上資化できることを特徴とする請求項１または２に記載の菌株。
【請求項４】
請求項１に記載の菌株および／または請求項２に記載の菌株を含有することを特徴とするグリセロール資化剤。
【請求項５】
原料液として、油脂をメチルエステル化して得られる生成物からメチルエステルを除去して得られるバイオディーゼル廃液を含むものを用い、上記原料液を、請求項１に記載の菌株および／または請求項２に記載の菌株によって発酵させる発酵工程を含むことを特徴とする水素およびエタノールの製造方法。
【請求項６】
上記原料液がコーンスティープリカーを含有することを特徴とする請求項５に記載の水素およびエタノールの製造方法。
【請求項７】
上記原料液のグリセロール濃度が２０ｇ／ｌを超えることを特徴とする請求項５または６に記載の水素およびエタノールの製造方法。
【請求項８】
上記発酵工程において、原料液および／または上記発酵によって得られた発酵液のｐＨを６．５以上７．５以下に保持することを特徴とする請求項５から７のいずれか１項に記載の水素およびエタノールの製造方法。
【請求項９】
請求項５から８のいずれか１項に記載の水素およびエタノールの製造方法を行うためのキットであって、請求項１に記載の菌株および／または請求項２に記載の菌株、並びに上記菌株を培養可能な培地が含まれることを特徴とするキット。
【請求項１】
エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株。
【請求項２】
エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株。
【請求項３】
油脂をメチルエステル化して得られる生成物からメチルエステルを除去して得られるバイオディーゼル廃液を含み、グリセロール濃度が５０ｇ／ｌである原料液中のグリセロールを１５g／ｌ以上資化できることを特徴とする請求項１または２に記載の菌株。
【請求項４】
請求項１に記載の菌株および／または請求項２に記載の菌株を含有することを特徴とするグリセロール資化剤。
【請求項５】
原料液として、油脂をメチルエステル化して得られる生成物からメチルエステルを除去して得られるバイオディーゼル廃液を含むものを用い、上記原料液を、請求項１に記載の菌株および／または請求項２に記載の菌株によって発酵させる発酵工程を含むことを特徴とする水素およびエタノールの製造方法。
【請求項６】
上記原料液がコーンスティープリカーを含有することを特徴とする請求項５に記載の水素およびエタノールの製造方法。
【請求項７】
上記原料液のグリセロール濃度が２０ｇ／ｌを超えることを特徴とする請求項５または６に記載の水素およびエタノールの製造方法。
【請求項８】
上記発酵工程において、原料液および／または上記発酵によって得られた発酵液のｐＨを６．５以上７．５以下に保持することを特徴とする請求項５から７のいずれか１項に記載の水素およびエタノールの製造方法。
【請求項９】
請求項５から８のいずれか１項に記載の水素およびエタノールの製造方法を行うためのキットであって、請求項１に記載の菌株および／または請求項２に記載の菌株、並びに上記菌株を培養可能な培地が含まれることを特徴とするキット。
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１】
【公開番号】特開２００９−１８３１６２（Ｐ２００９−１８３１６２Ａ）
【公開日】平成２１年８月２０日（２００９．８．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２４０１８（Ｐ２００８−２４０１８）
【出願日】平成２０年２月４日（２００８．２．４）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２００７年８月２日 社団法人 日本生物工学会発行の「第５９回日本生物工学会大会講演要旨集」に発表
【出願人】（５０４１３６５６８）国立大学法人広島大学 (924)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年８月２０日（２００９．８．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年２月４日（２００８．２．４）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２００７年８月２日 社団法人 日本生物工学会発行の「第５９回日本生物工学会大会講演要旨集」に発表
【出願人】（５０４１３６５６８）国立大学法人広島大学 (924)
【Ｆターム（参考）】
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