新規カリウムチャネルモジュレータペプチド
新規１３残基ペプチドＭｏ１６５９を、食虫イモガイ、クビカザリイモの毒から単離した。毒抽出物のＨＰＬＣ分画で質量１６５９Ｄａに強いＵＶ吸収画分を生じた。マトリックス支援レーザー脱離イオン化及びエレクトロスプレーＭＳ／ＭＳ法を、タンパク質分解断片の解析とともに用いてデノボ配列決定をしたところ、アミノ酸配列ＦＨＧＧＳＷＹＲＦＰＷＧＹ−ＮＨ２を首尾よく得た。これは、化学合成したペプチドとの比較及び慣用のエドマン法による配列決定によって更に確認された。Ｍｏ１６５９は、圧倒的多数の芳香族残基があり、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅのような無極性脂肪族残基が存在しない特異な配列を有している。Ｍｏ１６５９にはジスルフィド結合がなく、コノトキシンと区別され、イモガイ毒からこれまでに単離された非環式ペプチドのいずれとも配列類似性がない。後根神経節ニューロンで測定した電流に対するＭｏ１６５９の効果に関する電気生理的研究は、ペプチドが不活化電位型カリウムチャネルを標的にすることを示唆している。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、心不整脈、多発性硬化症、関節リウマチ、及びカリウムチャネルの欠損に関与する他の症候群のような疾患の治療用分子としての有用性を有するカリウムチャネルモジュレータの分野に関連する。
【背景技術】
【０００２】
カリウムチャネルは膜タンパク質であり、心拍、筋収縮、神経細胞の興奮性、及び免疫機能の調節のような複雑な生物学的プロセスに関与する静止膜電位及び活動電位の持続時間を決定する（Ｋｕｒｏｋａｗａ，Ｊ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ（２００１）、３３、８７３−８８２；Ｄｏｄｓｏｎ，Ｐ．Ｄ．及びＦｏｒｓｙｔｈｅ，Ｉ．Ｄ．、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（２００４）、２７、２１０−２１７；Ｋｏｏ，Ｇ．Ｃ．ら、Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９９）、１９７、９９−１０７）。これらは神経伝達物質、薬物、毒素などの標的として作用し、合理的な薬物デザインのための魅力的な道具である。例えば、あるＫ＋チャネルの遮断薬は、リエントリー性不整脈を予防又は抑制するために利用されるクラスＩＩＩ抗不整脈作用を示す（Ｔａｍａｒｇｏ，Ｊ．ら、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００４）、６２、９−３３）。サソリ由来毒素であるＭａｒｇａｔｏｘｉｎは、多発性硬化症や関節リウマチのような自己免疫疾患を治療する特性を有することが報告されている（Ｓｈａｋ，Ｋら、Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２００３）、２２１、１００−１０６）。イモガイ由来ペプチドであるコノトキシンは、中枢神経系の受容体及びチャネルに対する最も強力なリガンドの１つである。アヤメイモ由来のκ−コノトキシン、κ−Ｐｖｉｉａは、アルツハイマー病、ランバート・イートン症候群、及び重症筋無力症を治療するための有力候補として進展している（Ｏｌｉｖｅｒａ，Ｂ．Ｍ．ら、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｏｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐａｔｅｎｔｓ（２００１）、１１、６０３−６２３）。カリウムチャネルは膜タンパク質であり、心拍、筋収縮、神経細胞の興奮性、及び免疫機能の調節のような複雑な生物学的プロセスに関与する静止膜電位及び活動電位の持続時間を決定する（Ｋｕｒｏｋａｗａ，Ｊ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ（２００１）、３３、８７３−８８２；Ｄｏｄｓｏｎ，Ｐ．Ｄ．及びＦｏｒｓｙｔｈｅ，Ｉ．Ｄ．、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（２００４）、２７、２１０−２１７；Ｋｏｏ，Ｇ．Ｃ．ら、Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９９）、１９７、９９−１０７）。これらは神経伝達物質、薬物、毒素などの標的として作用し、合理的な薬物デザインのための魅力的な道具である。例えば、あるＫ＋チャネルの遮断薬は、リエントリー性不整脈を予防又は抑制するために利用されるクラスＩＩＩ抗不整脈作用を示す（Ｔａｍａｒｇｏ，Ｊ．ら、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００４）、６２、９−３３）。サソリ由来毒素であるＭａｒｇａｔｏｘｉｎは、多発性硬化症や関節リウマチのような自己免疫疾患を治療する特性を有することが報告されている（Ｓｈａｋ，Ｋら、Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２００３）、２２１、１００−１０６）。イモガイ由来ペプチドであるコノトキシンは、中枢神経系の受容体及びチャネルに対する最も強力なリガンドの１つである。アヤメイモ由来のκ−コノトキシン、κ−Ｐｖｉｉａは、アルツハイマー病、ランバート・イートン症候群、及び重症筋無力症を治療するための有力候補として進展している（Ｏｌｉｖｅｒａ，Ｂ．Ｍ．ら、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｏｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐａｔｅｎｔｓ（２００１）、１１、６０３−６２３）。
【０００３】
Ｋ＋チャネルの分子多様性は、他のイオンチャネル群よりも大きく、８０を越える異なる遺伝子と多くのスプライス変異体がある。多様性は中枢神経系で際立って観察され、独特のカリウムチャネルセットを発現するニューロンのサブタイプが数多く存在する。電位型カリウムチャネルは、ニューロンに潜在的な作用の再分極の原因である。後根神経節ニューロンに対する初期の電気生理的研究は、少なくとも６つの電位型Ｋ＋電流、３つの過渡電流、及び３つの非不活化電流の発現を示していた。
【発明の開示】
【０００４】
発明の概要
本発明は、クビカザリイモから得た１３残基ペプチドの新規カリウムチャネル調節活性について主張する。標的配列は慣用の固相ペプチド合成法で調製されており、天然配列と同一であることがわかっている。このペプチド配列のアナログは合成法で容易に調製することができる。
【０００５】
電気生理的研究は、１３残基ペプチドＭｏ１６５９が非不活化Ｋ＋電流に特異的に作用することを示唆している。クローン化Ｋ＋チャネルを用いた研究及び合成アナログの調査は、標的チャネルサブタイプの同定及びチャネル遮断活性の分子メカニズムの確立に必要である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
発明の詳細な説明
本発明は、アミノ酸配列ＦＨＧＧＳＷＹＲＦＰＷＧＹ（配列番号１）を有する実質的に純粋なペプチドについて開示する。
【０００７】
ペプチドはカリウムチャネルモジュレータとして用いられる。
【０００８】
実質的に純粋なペプチドを調製する方法であって：
（ｉ） ペプチドの単離、及び
（ｉｉ） クロマトグラフ法によるペプチドの精製、
を含む前記方法。
【０００９】
工程（ｉ）のペプチドはクビカザリイモの毒から単離される。
【００１０】
精製工程（ｉｉ）はＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィ）で行われる。
【００１１】
ペプチドは神経生理的な障害及び神経障害の治療に用いられる。
【００１２】
ペプチドは、神経生理的な障害及び神経障害、統合失調症、てんかん、双極性障害、又は神経系に影響する症候群の治療に用いられる。
【００１３】
アミノ酸配列ＦＨＧＧＳＷＹＲＦＰＷＧＹ（配列番号１）を有するペプチドを、医薬的に許容可能な担体と共に又は伴わずに含む、医薬組成物。
【００１４】
本発明を以下の実施例において論じるが、限定的なものとみなされるべきではない。
【実施例】
【００１５】
実施例１(ペプチドの単離及び精製)
クビカザリイモ標本をインドの南東海岸から採取した。解剖後、毒管をエタノール中に保存し、流れ出た毒をｒｏｔａｖａｐｏｒで濃縮後、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）精製に供した。粗製毒抽出物をＪｕｐｉｔｅｒ ４μ、Ｐｒｏｔｅｏ ９０Å、Ｃ１８カラム（１０ｍｍ×２５０ｍｍ）に供し、０．１％ＴＦＡを含有するアセトニトリルの直線勾配で溶出させた。流速を１ｍｌ／分に維持し、２２６ｎｍで吸収をモニターした。いくつかのペプチド成分への分画を達成した。ペプチド成分を個々のＨＰＬＣ画分のＭＡＬＤＩ質量スペクトル解析で解析した。質量分析デノボ配列決定のために、分子量１６５９Ｄａに相当する保持時間２３．４分の強い成分を選択した。ペプチド成分は高分解ＭＡＬＤＩ質量スペクトルを示し、［Ｍ＋Ｈ］＋＝１６５９．１Ｄａ（モノアイソトピック質量）を証明した。挿入図は、＋２及び＋３状態を検出可能なエレクトロスプレー質量スペクトルで観察された荷電状態を示しており、分子中に少なくとも３つのプロトン化可能な基の存在を示唆している。ＤＴＴで還元した後、ヨードアセトアミドでアルキル化しても分子量は変化せず、ジスルフィド結合がないことを証明した。無水酢酸及び酢酸によるアセチル化で質量［Ｍ＋Ｈ］＋＝１７０１．３Ｄａ（ｍ＝＋４２Ｄａ）の産物を得、１級アミノ基が１つ存在することを示した。ＵＶ及び蛍光スペクトルによりＴｒｐ及びＴｙｒ残基の存在を証明した。ＭＡＬＤＩ ＭＳ／ＭＳ技術を用いて、１６５９．１Ｄａを前駆イオンとして選択してペプチド配列決定を行った。図３は、観察された断片イオンを、ｂ及びｙイオン系列の帰属と共に示している（１３）。２８５Ｄａの強いｂ２イオンの存在は、８残基セグメント−ＧＧＳＷＹＲＦＰ−の連続追跡を可能にした。７０、１１０、１３６、及び１５９のインモニウムイオンは、それぞれ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、Ｔｙｒ、及びＴｒｐ残基の存在を示唆していた。２８５Ｄａのｂ２イオンは、アミノ末端のジペプチド−ＦＨ−又は−ＨＦ−に対応するであろう。１９４．９Ｄａの質量ピークの観察は、ジペプチドイオン−ＧＨ−又は−ＨＧ−の存在を示唆していた。これはＮ末端配列−ＦＨＧ−の帰属を支持している。質量範囲１２００〜１５００Ｄａにおける強い断片の不足により、Ｃ末端配列の伸長が制限された。
【００１６】
実施例２（ペプチドの確認）
２つの個別の方法で決定した配列の確認を行った。第１に、Ｍｏ１６５９の決定した配列に対応する合成ペプチドを調製し、そのＭＳ／ＭＳフラグメンテーションパターンが天然産物と同一であることを示した（図５）。合成ペプチドと天然ペプチドとの同一性はＨＰＬＣ解析でも証明した（図５、挿入図）。第２に、自動配列決定装置を用いた慣用のエドマン法による配列決定により配列を確認した。Ｍｏ１６５９の注目すべき特徴は、１３残基の短いストレッチ中に７つもの芳香族アミノ酸（Ｆ−２、Ｙ−２、Ｗ−２、Ｈ−１）が存在することである。陽に荷電されたペプチドは、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、及びＩｌｅのような一般的な脂肪族疎水性アミノ酸を著しく欠損している。
【００１７】
実施例２（ａ）
還元及びアルキル化： 精製ペプチドを、３０μＬの０．０５Ｍ ＮＨ４ＨＣＯ３バッファー、ｐＨ８．０中に溶解した。還元するため、２００ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）保存溶液を加えて終濃度８ｍＭとし、３７℃で２時間インキュベーションし、ヨードアセトアミド保存溶液を添加して終濃度４０ｍＭとした。得られた混合物を暗所中、室温で１時間インキュベーションし、その後、ＭＡＬＤＩ ＭＳで解析した。
【００１８】
アセチル化： ペプチド溶液を乾燥させ、１：１比の酢酸及び無水酢酸中に再懸濁した。室温で５分間インキュベーションした後、得られた溶液を再度乾燥させ、１：１比（ｖ／ｖ）の０．１％ ＴＦＡ及びアセトニトリル中に再懸濁し、ＭＡＬＤＩ ＭＳを用いて解析した。トリプシン消化。精製サンプルを、ＴＰＣＫ処理トリプシン（シグマ社、米国）を５０μｌの５０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３、ｐＨ８．０中に１０μｇの酵素で用いて、３７℃で３時間消化した。消化産物をＭＡＬＤＩ及びＥＳＩ質量分析計を用いて解析した。
【００１９】
トリプシン消化： 精製サンプルを、ＴＰＣＫ処理トリプシン（シグマ社、米国）を５０μｌの５０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３、ｐＨ８．０中に１０μｇの酵素で用いて、３７℃で３時間消化した。消化産物をＭＡＬＤＩ及びＥＳＩ質量分析計を用いて解析した。トリプシンによるＭｏ１６５９の消化により、それぞれＮ末端及びＣ末端断片に対応する、質量（ＭＡＬＤＩ）１０１０Ｄａ及び６６８Ｄａの２つの断片を生じた。６６８Ｄａ断片は、先に図３において断片イオンとして検出されたＣ末端断片−ＦＰＸＸと帰属された［加水分解により、１７Ｄａ（ＯＨ）がＮ末端断片に付加され、１Ｄａ（Ｈ）がＣ末端断片に付加されていることに注意されたい］。６６８Ｄａ断片を、イオントラップ質量分析計中、エレクトロスプレーイオン源を用いて高エネルギー衝突誘起解離（ＣＩＤ）に供した。観察されたＥＳＩ ＭＳ／ＭＳフラグメンテーションパターンを図４に示す。６５１Ｄａの強いピークは、Ｃ末端からのＮＨ３の容易な喪失に相当し、Ｃ末端アミド化の存在を示唆している。イモガイペプチドは翻訳後修飾されることが多く、アミド化が一般に観察される（１４，１５）。２４５Ｄａのｂ２イオンの同定は、ＭＡＬＤＩ ＭＳ／ＭＳによって既に証明されている−ＦＰ−断片に相当し、Ｃ末端トリペプチド−ＷＧＹ−アミドの容易な同定を可能にする。最終決定した配列はＦＨＧＧＳＷＹＲＦＰＷＧＹ−ＮＨ２であり、計算された平均質量１６５９．８Ｄａ（ＥＳＩ ＭＳで観察された平均質量＝１６５９．３Ｄａ）に相当する。
【００２０】
質量分析： 四重極解析器を備えたヒューレット・パッカードのＨＰ１１００ＭＳＤシリーズ分光計でエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）質量スペクトルを得た。３００〜１５００ｍ／ｚの範囲にわたって陽イオンモードでデータを取得し、ＨＰ ＬＣ／ＭＳＤ Ｃｈｅｍｓｔａｔｉｏｎソフトウェアを用いて解析した。３３７ｎｍの窒素レーザーを備えたＢｒｕｋｅｒ ＤａｌｔｏｎｉｃｓのＵｌｔｒａｆｌｅｘ ＴＯＦ／ＴＯＦシステムを用いて、リフレクトロン陽イオンモードでＭＡＬＤＩスペクトルを採取した。等量のペプチド溶液と飽和マトリックス（α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸）とを混合することによってサンプルを調製した。標準のペプチド混合物を外部較正に用いた。Ｅｓｑｕｉｒｅ３０００プラスＬＣイオントラップ質量分析計（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ、ドイツ）でＥＳＩ ＭＳ／ＭＳデータを得た。ネブライザーに対する窒素ガス圧及び流速はそれぞれ１０ｂａｒ及び５Ｌ／分であり、乾燥ガス温度は３００℃であった。スキャン範囲を５０〜１０００ｍ／ｚにセットした。０．１％ＨＣＯＯＨを含有する１：１（ｖ／ｖ）比の水及びアセトニトリルにサンプルを溶解し、シリンジポンプによって送達されるシステムに流速１２０μｌ／時で直接注ぎ込んだ（Ｃｏｌｅ−Ｐａｒｍｅｒ、バーノンヒル、イリノイ州、米国）。ＣＩＤ実験の衝突ガスとしてヘリウムを用いた。Ｅｓｑｕｉｒｅデータ解析ソフトウェア、バージョン３．１を用いてデータを解析した。
【００２１】
エドマン法による配列決定： ＬＣ−１０Ａ ＨＰＬＣシステムを備えた島津ＰＰＳＱ−１０タンパク質配列決定装置を用いてペプチドの１次配列を決定した。
【００２２】
実施例３（Ｍｏ１６５９配列の確認）
２つの個別の方法で決定した配列の確認を行った。第１に、Ｍｏ１６５９の決定した配列に対応する合成ペプチドを調製し、そのＭＳ／ＭＳフラグメンテーションパターンが天然産物と同一であることを示した（図５）。合成ペプチドと天然ペプチドとの同一性はＨＰＬＣ解析でも証明した（図５、挿入図）。第２に、自動配列決定装置を用いた慣用のエドマン法による配列決定により配列を確認した。Ｍｏ１６５９の注目すべき特徴は、１３残基の短いストレッチ中に７つもの芳香族アミノ酸（Ｆ−２、Ｙ−２、Ｗ−２、Ｈ−１）が存在することである。陽に荷電されたペプチドは、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、及びＩｌｅのような一般的な脂肪族疎水性アミノ酸を著しく欠損している。
【００２３】
実施例４（コノペプチドＭｏ１６５０の新規性）
既存のタンパク質配列データベースの検索では、Ｍｏ１６５９の決定した配列に匹敵するものはないことを示している。異なるデータベース検索により、Ｂｌａｓｔ、ＢｌａｓｔＰなどのような異なるアルゴリズムを用いて、以下に記載のようにペプチドの独自性を証明する：
配列：ＦＨＧＧＳＷＹＲＦＰＷＧＹ（配列番号１）の独自性
配列ＦＨＧＧＳＷＹＲＦＰＷＧＹの独自性を以下の方法で示した：
Ｐｒｏｓｉｔｅを用いて配列：Ｆ−Ｈ−Ｇ−Ｇ−Ｓ−Ｗ−Ｙ−Ｒ−Ｆ−Ｐ−Ｗ−Ｇ−Ｙ（配列番号１）を検索した。
この配列をＰＤＢ、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ、ＴｒＥＭＢＬ、ＴｒＥＭＢＬ ｎｅｗで検索した。ヒットはなかった。
【００２４】
また、Ｐｒｏｓｉｔｅを用いて以下の変異体を検索した：
［ＦＹ］−Ｈ−Ｇ−Ｇ−Ｓ−Ｗ−［ＹＦ］−［ＲＫ］−［ＦＹ］−Ｐ−Ｗ−Ｇ−［ＹＦ］。
ヒットはなかった。
【００２５】
実施例５（ペプチドのカリウムチャネル活性化に関するアッセイ）
ＤＲＧニューロンの調製。電気生理的研究のために後根神経節（ＤＲＧ）ニューロンを以下のように調製した：
生後５日の雄性ウィスターラットをジエチルエーテルで麻酔した。脊柱全体を取り出し、予め酸素を含ませたリン酸緩衝化食塩水を含有する皿に移した。脊柱を保持しながら一辺の骨を脊柱の後根から切り出した。後根神経節を後根及び前根とともに細い解剖用鉗子で個々に取り出し、１．５ｍｇ／ｍｌトリプシン（ブタ膵由来、シグマ、米国）を含有するリン酸緩衝化食塩水中に移した。ＤＲＧを解剖用スプリングハサミで細かく切り、３７℃で３０分間インキュベーションした。トリプシン処理後、１０００ｒｐｍで５分間遠心して細胞を沈殿させた。上清を除去し、１０％ＦＢＳを含有する１ｍｌのＤＭＥＭで洗浄した。１０％ＦＢＳを含有する新鮮なＤＭＥＭに再懸濁した後、炎で研磨したパスツールピペットで粉砕して単一細胞の懸濁液を得た。細胞密度を増加させるために、部分的に加工した直径８ｍｍの光学研磨ガラスリングを滅菌３５ｍｍ細胞培養皿の底に置いた。ガラスリングによって形成されたウェルに懸濁細胞を蒔いた。細胞を３７℃で１時間インキュベーションした。単離ＤＲＧニューロンを電気生理的実験に用いた。
【００２６】
電気生理学： パッチクランプ技術により、ＥＰＣ−８増幅器（Ｈｅｋａ）を用いて全細胞モードでＤＲＧニューロンから単離Ｋ＋電流を記録した。抵抗１〜３ＭΩのパッチクランプ電極をホウケイ酸ガラス（Ｃｌａｒｋ Ｅｌｅｃｔｒｏｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、英国）から作製した。外部浴溶液は：１３０ｍＭ塩化コリン、３ｍＭ ＫＣｌ、２．５ｍＭ ＣｏＣｌ２、０．６ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１．２ｍＭ ＮａＨＣＯ３、及び１０ｍＭグルコース、ｐＨ７．４、並びにＴｒｉｓ塩基を含有しており；浸透圧はショ糖で３２５ｍＯｓｍ調整した。内部溶液は：１４０ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、１１ｍＭ ＥＧＴＡ、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．２、並びにＴｒｉｓ塩基を含有しており；浸透圧３１０ｍＯｓｍであった。全ての実験においてニューロンを−８０ｍＶに電圧固定した。Ｐ／４サブトラクションプロトコールを用いて容量及び漏れサブトラクションを行った。全ての実験において５０％のＲｓ補正を用いることにより電圧エラーを最小にした。データ取得及びパルスプロトコルをｐＣｌａｍｐ８ソフトウェア及びＤｉｇｉｄａｔａ１３２０アナログ／デジタル変換器（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）で調整した。浴温を２０℃に維持した。毒素を水に溶解した。毒素のボーラス適用を用いて最終浴濃度２００ｎＭを達成した。本明細書に報告するＫ＋電流に対するＭｏ１６５９の効果を、ペプチド適用後１５分に記録した。
【００２７】
Ｍｏ１６５９はＤＲＧニューロンにおいてＫ＋チャネル調節活性を示す。図６は、ＤＲＧニューロンからの、細胞全体の混合した外向きＫ＋電流に対するＭｏ１６５９の効果を示す。外部浴溶液中の２００ｎＭ Ｍｏ１６５９により、全ての電位における電流振幅の顕著な低下を観察した。混合したＫ＋電流は、速い過渡電流成分及び持続電流成分を有する。２つの異なるプレバルス電圧の後、図７に図示した同一電圧プロトコルを用いて、速い過渡電流成分を持続電流成分と別々にした。調整プレパルス電圧単独でＫ＋電流成分を完全に単離することはできないが（１８）、結果は、外部浴溶液へのＭｏ１６５９の添加は持続Ｋ＋電流成分に優位に影響することを示唆している。電流トレースのサブトラクション後に得られた過渡電流成分は、Ｍｏ１６５９によって有意に影響されないことに注目することができる。５つの異なる実験で同様の結果を得た。したがって、Ｍｏ１６５９は、不活化電位型カリウムチャネルに影響を及ぼすと思われる。興奮細胞のカリウムチャネルを遮断することによる合計Ｋ＋電流の低下は、不整脈及び心不全の療法の開発に重要なプロセスである。カリウムチャネル遮断薬を用いて活動電位持続時間を高めることは、新規クラスの抗不整脈剤を開発するための可能な戦略である。
【００２８】
実施例６（クビカザリイモペプチドＭｏ１６５９の産生方法）
貝毒からの精製： クビカザリイモ標本はインドの南東海岸より採取した。解剖後、毒管をエタノール中に保存し、流れ出た毒をｒｏｔａｖａｐｏｒで濃縮後、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）精製に供した。粗製毒抽出物をＪｕｐｉｔｅｒ ４μ、Ｐｒｏｔｅｏ ９０Å、Ｃ１８カラム（１０ｍｍ×２５０ｍｍ）に供し、０．１％ＴＦＡを含有するアセトニトリルの直線勾配で溶出させた。流速を１ｍｌ／分に維持し、２２６ｎｍで吸収をモニターした。保持時間２３．４分の強い成分は所望のＭｏ１６５９ペプチドである。この画分の均質性を分析用カラム（Ｚｏｒｂａｘ Ｃ１８ ＲＰ、孔径３００Å、粒子サイズ５μ）を用いたＨＰＬＣによる解析で示した。更に、ペプチドの同一性及び混入物質の不在をＬＣ−ＥＳＩ及びＭＡＬＤＩ質量分析で示した。
【００２９】
こうして得られたペプチドを電気生理的活性について試験し、更なる使用のため＋４℃で保存した。
【００３０】
実施例７（クビカザリイモペプチドＭｏ１６５９の化学合成）
Ｆｍｏｃ化学を用いた標準の固相ペプチド合成法でペプチドを合成した。全てのアミノ酸はＮ末端がＦｍｏｃ基（Ｎｏｖａ Ｂｉｏｃｈｅｍ）で保護されている。Ｔｙｒ及びＳｅｒの測鎖はｔ−Ｂｕ基で、ＡｒｇはＭｔｒ基で、Ｈｉｓはトリチル基で保護した。Ｆｍｏｃ−ＲｉｎｋアミドＡＭ樹脂（２００−４００メッシュ、Ｎｏｖａ Ｂｉｏｃｈｅｍ）上で保護アミノ酸のＯＰｆｐエステルを用いてカップリング反応を進めた。ビーズ容量０．６３ｍＭｇ−１の樹脂３００ｍｇを用いて合成を行った。Ｃ端アミノ酸（Ｔｙｒ）を、固相支持体から出ているアミノ官能基とのアミド結合の形成によって樹脂に連結させた。ＨＢＴＵ（Ｎ−［（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）（ジメチルアミノ）メチレン］−Ｎ−メチルメタナミニウム ヘキサフルオロリン酸Ｎ−オキシド）を用いてＳｅｒとＨｉｓをカップリングさせた。２０％ピペリジンのジメチルホルムアミド溶液でＦｍｏｃ脱保護を行った。合成後、５％アニソール（４００μｌ）及び１％エタンジチオール（８０μｌ）を陽イオンスカベンジャーとして含有する９４％ＴＦＡ（７．５２ｍｌ）を用いて１００ｍｇの樹脂からペプチドを切断した。５〜６時間後、樹脂をろ過して除去し、ＴＦＡを真空で蒸発させて除去し、ペプチドをエーテルで沈殿させた。沈殿物をエーテルで繰り返し洗浄し、ＲＰ ＨＰＬＣで精製した。
【００３１】
本発明はペプチド配列について記載しており、それに基づいてそれぞれのアミノ酸の公知のトリプレット暗号からＤＮＡ配列を生ずることができるという事実を利用して、このペプチドを組換えＤＮＡ技術で作製することも可能である。こうして得られるＤＮＡ配列は合成することができる／関連遺伝子のストレッチを貝ＤＮＡから、ｃＤＮＡクローニング、ポリメラーゼ連鎖反応などの方法を用いて得ることができ、原核系又は真核系の発現ベクターにクローニングすることができる。このようにして得られるクローンを遺伝子操作して、ペプチドＭｏ１６５９を公知の方法で作製し、公知の方法で均質になるまで精製することができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、心不整脈、多発性硬化症、関節リウマチ、及びカリウムチャネルの欠損に関与する他の症候群のような疾患の治療用分子としての有用性を有するカリウムチャネルモジュレータの分野に関連する。
【背景技術】
【０００２】
カリウムチャネルは膜タンパク質であり、心拍、筋収縮、神経細胞の興奮性、及び免疫機能の調節のような複雑な生物学的プロセスに関与する静止膜電位及び活動電位の持続時間を決定する（Ｋｕｒｏｋａｗａ，Ｊ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ（２００１）、３３、８７３−８８２；Ｄｏｄｓｏｎ，Ｐ．Ｄ．及びＦｏｒｓｙｔｈｅ，Ｉ．Ｄ．、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（２００４）、２７、２１０−２１７；Ｋｏｏ，Ｇ．Ｃ．ら、Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９９）、１９７、９９−１０７）。これらは神経伝達物質、薬物、毒素などの標的として作用し、合理的な薬物デザインのための魅力的な道具である。例えば、あるＫ＋チャネルの遮断薬は、リエントリー性不整脈を予防又は抑制するために利用されるクラスＩＩＩ抗不整脈作用を示す（Ｔａｍａｒｇｏ，Ｊ．ら、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００４）、６２、９−３３）。サソリ由来毒素であるＭａｒｇａｔｏｘｉｎは、多発性硬化症や関節リウマチのような自己免疫疾患を治療する特性を有することが報告されている（Ｓｈａｋ，Ｋら、Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２００３）、２２１、１００−１０６）。イモガイ由来ペプチドであるコノトキシンは、中枢神経系の受容体及びチャネルに対する最も強力なリガンドの１つである。アヤメイモ由来のκ−コノトキシン、κ−Ｐｖｉｉａは、アルツハイマー病、ランバート・イートン症候群、及び重症筋無力症を治療するための有力候補として進展している（Ｏｌｉｖｅｒａ，Ｂ．Ｍ．ら、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｏｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐａｔｅｎｔｓ（２００１）、１１、６０３−６２３）。カリウムチャネルは膜タンパク質であり、心拍、筋収縮、神経細胞の興奮性、及び免疫機能の調節のような複雑な生物学的プロセスに関与する静止膜電位及び活動電位の持続時間を決定する（Ｋｕｒｏｋａｗａ，Ｊ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ（２００１）、３３、８７３−８８２；Ｄｏｄｓｏｎ，Ｐ．Ｄ．及びＦｏｒｓｙｔｈｅ，Ｉ．Ｄ．、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（２００４）、２７、２１０−２１７；Ｋｏｏ，Ｇ．Ｃ．ら、Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９９）、１９７、９９−１０７）。これらは神経伝達物質、薬物、毒素などの標的として作用し、合理的な薬物デザインのための魅力的な道具である。例えば、あるＫ＋チャネルの遮断薬は、リエントリー性不整脈を予防又は抑制するために利用されるクラスＩＩＩ抗不整脈作用を示す（Ｔａｍａｒｇｏ，Ｊ．ら、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００４）、６２、９−３３）。サソリ由来毒素であるＭａｒｇａｔｏｘｉｎは、多発性硬化症や関節リウマチのような自己免疫疾患を治療する特性を有することが報告されている（Ｓｈａｋ，Ｋら、Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２００３）、２２１、１００−１０６）。イモガイ由来ペプチドであるコノトキシンは、中枢神経系の受容体及びチャネルに対する最も強力なリガンドの１つである。アヤメイモ由来のκ−コノトキシン、κ−Ｐｖｉｉａは、アルツハイマー病、ランバート・イートン症候群、及び重症筋無力症を治療するための有力候補として進展している（Ｏｌｉｖｅｒａ，Ｂ．Ｍ．ら、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｏｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐａｔｅｎｔｓ（２００１）、１１、６０３−６２３）。
【０００３】
Ｋ＋チャネルの分子多様性は、他のイオンチャネル群よりも大きく、８０を越える異なる遺伝子と多くのスプライス変異体がある。多様性は中枢神経系で際立って観察され、独特のカリウムチャネルセットを発現するニューロンのサブタイプが数多く存在する。電位型カリウムチャネルは、ニューロンに潜在的な作用の再分極の原因である。後根神経節ニューロンに対する初期の電気生理的研究は、少なくとも６つの電位型Ｋ＋電流、３つの過渡電流、及び３つの非不活化電流の発現を示していた。
【発明の開示】
【０００４】
発明の概要
本発明は、クビカザリイモから得た１３残基ペプチドの新規カリウムチャネル調節活性について主張する。標的配列は慣用の固相ペプチド合成法で調製されており、天然配列と同一であることがわかっている。このペプチド配列のアナログは合成法で容易に調製することができる。
【０００５】
電気生理的研究は、１３残基ペプチドＭｏ１６５９が非不活化Ｋ＋電流に特異的に作用することを示唆している。クローン化Ｋ＋チャネルを用いた研究及び合成アナログの調査は、標的チャネルサブタイプの同定及びチャネル遮断活性の分子メカニズムの確立に必要である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
発明の詳細な説明
本発明は、アミノ酸配列ＦＨＧＧＳＷＹＲＦＰＷＧＹ（配列番号１）を有する実質的に純粋なペプチドについて開示する。
【０００７】
ペプチドはカリウムチャネルモジュレータとして用いられる。
【０００８】
実質的に純粋なペプチドを調製する方法であって：
（ｉ） ペプチドの単離、及び
（ｉｉ） クロマトグラフ法によるペプチドの精製、
を含む前記方法。
【０００９】
工程（ｉ）のペプチドはクビカザリイモの毒から単離される。
【００１０】
精製工程（ｉｉ）はＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィ）で行われる。
【００１１】
ペプチドは神経生理的な障害及び神経障害の治療に用いられる。
【００１２】
ペプチドは、神経生理的な障害及び神経障害、統合失調症、てんかん、双極性障害、又は神経系に影響する症候群の治療に用いられる。
【００１３】
アミノ酸配列ＦＨＧＧＳＷＹＲＦＰＷＧＹ（配列番号１）を有するペプチドを、医薬的に許容可能な担体と共に又は伴わずに含む、医薬組成物。
【００１４】
本発明を以下の実施例において論じるが、限定的なものとみなされるべきではない。
【実施例】
【００１５】
実施例１(ペプチドの単離及び精製)
クビカザリイモ標本をインドの南東海岸から採取した。解剖後、毒管をエタノール中に保存し、流れ出た毒をｒｏｔａｖａｐｏｒで濃縮後、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）精製に供した。粗製毒抽出物をＪｕｐｉｔｅｒ ４μ、Ｐｒｏｔｅｏ ９０Å、Ｃ１８カラム（１０ｍｍ×２５０ｍｍ）に供し、０．１％ＴＦＡを含有するアセトニトリルの直線勾配で溶出させた。流速を１ｍｌ／分に維持し、２２６ｎｍで吸収をモニターした。いくつかのペプチド成分への分画を達成した。ペプチド成分を個々のＨＰＬＣ画分のＭＡＬＤＩ質量スペクトル解析で解析した。質量分析デノボ配列決定のために、分子量１６５９Ｄａに相当する保持時間２３．４分の強い成分を選択した。ペプチド成分は高分解ＭＡＬＤＩ質量スペクトルを示し、［Ｍ＋Ｈ］＋＝１６５９．１Ｄａ（モノアイソトピック質量）を証明した。挿入図は、＋２及び＋３状態を検出可能なエレクトロスプレー質量スペクトルで観察された荷電状態を示しており、分子中に少なくとも３つのプロトン化可能な基の存在を示唆している。ＤＴＴで還元した後、ヨードアセトアミドでアルキル化しても分子量は変化せず、ジスルフィド結合がないことを証明した。無水酢酸及び酢酸によるアセチル化で質量［Ｍ＋Ｈ］＋＝１７０１．３Ｄａ（ｍ＝＋４２Ｄａ）の産物を得、１級アミノ基が１つ存在することを示した。ＵＶ及び蛍光スペクトルによりＴｒｐ及びＴｙｒ残基の存在を証明した。ＭＡＬＤＩ ＭＳ／ＭＳ技術を用いて、１６５９．１Ｄａを前駆イオンとして選択してペプチド配列決定を行った。図３は、観察された断片イオンを、ｂ及びｙイオン系列の帰属と共に示している（１３）。２８５Ｄａの強いｂ２イオンの存在は、８残基セグメント−ＧＧＳＷＹＲＦＰ−の連続追跡を可能にした。７０、１１０、１３６、及び１５９のインモニウムイオンは、それぞれ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、Ｔｙｒ、及びＴｒｐ残基の存在を示唆していた。２８５Ｄａのｂ２イオンは、アミノ末端のジペプチド−ＦＨ−又は−ＨＦ−に対応するであろう。１９４．９Ｄａの質量ピークの観察は、ジペプチドイオン−ＧＨ−又は−ＨＧ−の存在を示唆していた。これはＮ末端配列−ＦＨＧ−の帰属を支持している。質量範囲１２００〜１５００Ｄａにおける強い断片の不足により、Ｃ末端配列の伸長が制限された。
【００１６】
実施例２（ペプチドの確認）
２つの個別の方法で決定した配列の確認を行った。第１に、Ｍｏ１６５９の決定した配列に対応する合成ペプチドを調製し、そのＭＳ／ＭＳフラグメンテーションパターンが天然産物と同一であることを示した（図５）。合成ペプチドと天然ペプチドとの同一性はＨＰＬＣ解析でも証明した（図５、挿入図）。第２に、自動配列決定装置を用いた慣用のエドマン法による配列決定により配列を確認した。Ｍｏ１６５９の注目すべき特徴は、１３残基の短いストレッチ中に７つもの芳香族アミノ酸（Ｆ−２、Ｙ−２、Ｗ−２、Ｈ−１）が存在することである。陽に荷電されたペプチドは、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、及びＩｌｅのような一般的な脂肪族疎水性アミノ酸を著しく欠損している。
【００１７】
実施例２（ａ）
還元及びアルキル化： 精製ペプチドを、３０μＬの０．０５Ｍ ＮＨ４ＨＣＯ３バッファー、ｐＨ８．０中に溶解した。還元するため、２００ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）保存溶液を加えて終濃度８ｍＭとし、３７℃で２時間インキュベーションし、ヨードアセトアミド保存溶液を添加して終濃度４０ｍＭとした。得られた混合物を暗所中、室温で１時間インキュベーションし、その後、ＭＡＬＤＩ ＭＳで解析した。
【００１８】
アセチル化： ペプチド溶液を乾燥させ、１：１比の酢酸及び無水酢酸中に再懸濁した。室温で５分間インキュベーションした後、得られた溶液を再度乾燥させ、１：１比（ｖ／ｖ）の０．１％ ＴＦＡ及びアセトニトリル中に再懸濁し、ＭＡＬＤＩ ＭＳを用いて解析した。トリプシン消化。精製サンプルを、ＴＰＣＫ処理トリプシン（シグマ社、米国）を５０μｌの５０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３、ｐＨ８．０中に１０μｇの酵素で用いて、３７℃で３時間消化した。消化産物をＭＡＬＤＩ及びＥＳＩ質量分析計を用いて解析した。
【００１９】
トリプシン消化： 精製サンプルを、ＴＰＣＫ処理トリプシン（シグマ社、米国）を５０μｌの５０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３、ｐＨ８．０中に１０μｇの酵素で用いて、３７℃で３時間消化した。消化産物をＭＡＬＤＩ及びＥＳＩ質量分析計を用いて解析した。トリプシンによるＭｏ１６５９の消化により、それぞれＮ末端及びＣ末端断片に対応する、質量（ＭＡＬＤＩ）１０１０Ｄａ及び６６８Ｄａの２つの断片を生じた。６６８Ｄａ断片は、先に図３において断片イオンとして検出されたＣ末端断片−ＦＰＸＸと帰属された［加水分解により、１７Ｄａ（ＯＨ）がＮ末端断片に付加され、１Ｄａ（Ｈ）がＣ末端断片に付加されていることに注意されたい］。６６８Ｄａ断片を、イオントラップ質量分析計中、エレクトロスプレーイオン源を用いて高エネルギー衝突誘起解離（ＣＩＤ）に供した。観察されたＥＳＩ ＭＳ／ＭＳフラグメンテーションパターンを図４に示す。６５１Ｄａの強いピークは、Ｃ末端からのＮＨ３の容易な喪失に相当し、Ｃ末端アミド化の存在を示唆している。イモガイペプチドは翻訳後修飾されることが多く、アミド化が一般に観察される（１４，１５）。２４５Ｄａのｂ２イオンの同定は、ＭＡＬＤＩ ＭＳ／ＭＳによって既に証明されている−ＦＰ−断片に相当し、Ｃ末端トリペプチド−ＷＧＹ−アミドの容易な同定を可能にする。最終決定した配列はＦＨＧＧＳＷＹＲＦＰＷＧＹ−ＮＨ２であり、計算された平均質量１６５９．８Ｄａ（ＥＳＩ ＭＳで観察された平均質量＝１６５９．３Ｄａ）に相当する。
【００２０】
質量分析： 四重極解析器を備えたヒューレット・パッカードのＨＰ１１００ＭＳＤシリーズ分光計でエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）質量スペクトルを得た。３００〜１５００ｍ／ｚの範囲にわたって陽イオンモードでデータを取得し、ＨＰ ＬＣ／ＭＳＤ Ｃｈｅｍｓｔａｔｉｏｎソフトウェアを用いて解析した。３３７ｎｍの窒素レーザーを備えたＢｒｕｋｅｒ ＤａｌｔｏｎｉｃｓのＵｌｔｒａｆｌｅｘ ＴＯＦ／ＴＯＦシステムを用いて、リフレクトロン陽イオンモードでＭＡＬＤＩスペクトルを採取した。等量のペプチド溶液と飽和マトリックス（α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸）とを混合することによってサンプルを調製した。標準のペプチド混合物を外部較正に用いた。Ｅｓｑｕｉｒｅ３０００プラスＬＣイオントラップ質量分析計（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ、ドイツ）でＥＳＩ ＭＳ／ＭＳデータを得た。ネブライザーに対する窒素ガス圧及び流速はそれぞれ１０ｂａｒ及び５Ｌ／分であり、乾燥ガス温度は３００℃であった。スキャン範囲を５０〜１０００ｍ／ｚにセットした。０．１％ＨＣＯＯＨを含有する１：１（ｖ／ｖ）比の水及びアセトニトリルにサンプルを溶解し、シリンジポンプによって送達されるシステムに流速１２０μｌ／時で直接注ぎ込んだ（Ｃｏｌｅ−Ｐａｒｍｅｒ、バーノンヒル、イリノイ州、米国）。ＣＩＤ実験の衝突ガスとしてヘリウムを用いた。Ｅｓｑｕｉｒｅデータ解析ソフトウェア、バージョン３．１を用いてデータを解析した。
【００２１】
エドマン法による配列決定： ＬＣ−１０Ａ ＨＰＬＣシステムを備えた島津ＰＰＳＱ−１０タンパク質配列決定装置を用いてペプチドの１次配列を決定した。
【００２２】
実施例３（Ｍｏ１６５９配列の確認）
２つの個別の方法で決定した配列の確認を行った。第１に、Ｍｏ１６５９の決定した配列に対応する合成ペプチドを調製し、そのＭＳ／ＭＳフラグメンテーションパターンが天然産物と同一であることを示した（図５）。合成ペプチドと天然ペプチドとの同一性はＨＰＬＣ解析でも証明した（図５、挿入図）。第２に、自動配列決定装置を用いた慣用のエドマン法による配列決定により配列を確認した。Ｍｏ１６５９の注目すべき特徴は、１３残基の短いストレッチ中に７つもの芳香族アミノ酸（Ｆ−２、Ｙ−２、Ｗ−２、Ｈ−１）が存在することである。陽に荷電されたペプチドは、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、及びＩｌｅのような一般的な脂肪族疎水性アミノ酸を著しく欠損している。
【００２３】
実施例４（コノペプチドＭｏ１６５０の新規性）
既存のタンパク質配列データベースの検索では、Ｍｏ１６５９の決定した配列に匹敵するものはないことを示している。異なるデータベース検索により、Ｂｌａｓｔ、ＢｌａｓｔＰなどのような異なるアルゴリズムを用いて、以下に記載のようにペプチドの独自性を証明する：
配列：ＦＨＧＧＳＷＹＲＦＰＷＧＹ（配列番号１）の独自性
配列ＦＨＧＧＳＷＹＲＦＰＷＧＹの独自性を以下の方法で示した：
Ｐｒｏｓｉｔｅを用いて配列：Ｆ−Ｈ−Ｇ−Ｇ−Ｓ−Ｗ−Ｙ−Ｒ−Ｆ−Ｐ−Ｗ−Ｇ−Ｙ（配列番号１）を検索した。
この配列をＰＤＢ、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ、ＴｒＥＭＢＬ、ＴｒＥＭＢＬ ｎｅｗで検索した。ヒットはなかった。
【００２４】
また、Ｐｒｏｓｉｔｅを用いて以下の変異体を検索した：
［ＦＹ］−Ｈ−Ｇ−Ｇ−Ｓ−Ｗ−［ＹＦ］−［ＲＫ］−［ＦＹ］−Ｐ−Ｗ−Ｇ−［ＹＦ］。
ヒットはなかった。
【００２５】
実施例５（ペプチドのカリウムチャネル活性化に関するアッセイ）
ＤＲＧニューロンの調製。電気生理的研究のために後根神経節（ＤＲＧ）ニューロンを以下のように調製した：
生後５日の雄性ウィスターラットをジエチルエーテルで麻酔した。脊柱全体を取り出し、予め酸素を含ませたリン酸緩衝化食塩水を含有する皿に移した。脊柱を保持しながら一辺の骨を脊柱の後根から切り出した。後根神経節を後根及び前根とともに細い解剖用鉗子で個々に取り出し、１．５ｍｇ／ｍｌトリプシン（ブタ膵由来、シグマ、米国）を含有するリン酸緩衝化食塩水中に移した。ＤＲＧを解剖用スプリングハサミで細かく切り、３７℃で３０分間インキュベーションした。トリプシン処理後、１０００ｒｐｍで５分間遠心して細胞を沈殿させた。上清を除去し、１０％ＦＢＳを含有する１ｍｌのＤＭＥＭで洗浄した。１０％ＦＢＳを含有する新鮮なＤＭＥＭに再懸濁した後、炎で研磨したパスツールピペットで粉砕して単一細胞の懸濁液を得た。細胞密度を増加させるために、部分的に加工した直径８ｍｍの光学研磨ガラスリングを滅菌３５ｍｍ細胞培養皿の底に置いた。ガラスリングによって形成されたウェルに懸濁細胞を蒔いた。細胞を３７℃で１時間インキュベーションした。単離ＤＲＧニューロンを電気生理的実験に用いた。
【００２６】
電気生理学： パッチクランプ技術により、ＥＰＣ−８増幅器（Ｈｅｋａ）を用いて全細胞モードでＤＲＧニューロンから単離Ｋ＋電流を記録した。抵抗１〜３ＭΩのパッチクランプ電極をホウケイ酸ガラス（Ｃｌａｒｋ Ｅｌｅｃｔｒｏｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、英国）から作製した。外部浴溶液は：１３０ｍＭ塩化コリン、３ｍＭ ＫＣｌ、２．５ｍＭ ＣｏＣｌ２、０．６ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１．２ｍＭ ＮａＨＣＯ３、及び１０ｍＭグルコース、ｐＨ７．４、並びにＴｒｉｓ塩基を含有しており；浸透圧はショ糖で３２５ｍＯｓｍ調整した。内部溶液は：１４０ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、１１ｍＭ ＥＧＴＡ、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．２、並びにＴｒｉｓ塩基を含有しており；浸透圧３１０ｍＯｓｍであった。全ての実験においてニューロンを−８０ｍＶに電圧固定した。Ｐ／４サブトラクションプロトコールを用いて容量及び漏れサブトラクションを行った。全ての実験において５０％のＲｓ補正を用いることにより電圧エラーを最小にした。データ取得及びパルスプロトコルをｐＣｌａｍｐ８ソフトウェア及びＤｉｇｉｄａｔａ１３２０アナログ／デジタル変換器（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）で調整した。浴温を２０℃に維持した。毒素を水に溶解した。毒素のボーラス適用を用いて最終浴濃度２００ｎＭを達成した。本明細書に報告するＫ＋電流に対するＭｏ１６５９の効果を、ペプチド適用後１５分に記録した。
【００２７】
Ｍｏ１６５９はＤＲＧニューロンにおいてＫ＋チャネル調節活性を示す。図６は、ＤＲＧニューロンからの、細胞全体の混合した外向きＫ＋電流に対するＭｏ１６５９の効果を示す。外部浴溶液中の２００ｎＭ Ｍｏ１６５９により、全ての電位における電流振幅の顕著な低下を観察した。混合したＫ＋電流は、速い過渡電流成分及び持続電流成分を有する。２つの異なるプレバルス電圧の後、図７に図示した同一電圧プロトコルを用いて、速い過渡電流成分を持続電流成分と別々にした。調整プレパルス電圧単独でＫ＋電流成分を完全に単離することはできないが（１８）、結果は、外部浴溶液へのＭｏ１６５９の添加は持続Ｋ＋電流成分に優位に影響することを示唆している。電流トレースのサブトラクション後に得られた過渡電流成分は、Ｍｏ１６５９によって有意に影響されないことに注目することができる。５つの異なる実験で同様の結果を得た。したがって、Ｍｏ１６５９は、不活化電位型カリウムチャネルに影響を及ぼすと思われる。興奮細胞のカリウムチャネルを遮断することによる合計Ｋ＋電流の低下は、不整脈及び心不全の療法の開発に重要なプロセスである。カリウムチャネル遮断薬を用いて活動電位持続時間を高めることは、新規クラスの抗不整脈剤を開発するための可能な戦略である。
【００２８】
実施例６（クビカザリイモペプチドＭｏ１６５９の産生方法）
貝毒からの精製： クビカザリイモ標本はインドの南東海岸より採取した。解剖後、毒管をエタノール中に保存し、流れ出た毒をｒｏｔａｖａｐｏｒで濃縮後、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）精製に供した。粗製毒抽出物をＪｕｐｉｔｅｒ ４μ、Ｐｒｏｔｅｏ ９０Å、Ｃ１８カラム（１０ｍｍ×２５０ｍｍ）に供し、０．１％ＴＦＡを含有するアセトニトリルの直線勾配で溶出させた。流速を１ｍｌ／分に維持し、２２６ｎｍで吸収をモニターした。保持時間２３．４分の強い成分は所望のＭｏ１６５９ペプチドである。この画分の均質性を分析用カラム（Ｚｏｒｂａｘ Ｃ１８ ＲＰ、孔径３００Å、粒子サイズ５μ）を用いたＨＰＬＣによる解析で示した。更に、ペプチドの同一性及び混入物質の不在をＬＣ−ＥＳＩ及びＭＡＬＤＩ質量分析で示した。
【００２９】
こうして得られたペプチドを電気生理的活性について試験し、更なる使用のため＋４℃で保存した。
【００３０】
実施例７（クビカザリイモペプチドＭｏ１６５９の化学合成）
Ｆｍｏｃ化学を用いた標準の固相ペプチド合成法でペプチドを合成した。全てのアミノ酸はＮ末端がＦｍｏｃ基（Ｎｏｖａ Ｂｉｏｃｈｅｍ）で保護されている。Ｔｙｒ及びＳｅｒの測鎖はｔ−Ｂｕ基で、ＡｒｇはＭｔｒ基で、Ｈｉｓはトリチル基で保護した。Ｆｍｏｃ−ＲｉｎｋアミドＡＭ樹脂（２００−４００メッシュ、Ｎｏｖａ Ｂｉｏｃｈｅｍ）上で保護アミノ酸のＯＰｆｐエステルを用いてカップリング反応を進めた。ビーズ容量０．６３ｍＭｇ−１の樹脂３００ｍｇを用いて合成を行った。Ｃ端アミノ酸（Ｔｙｒ）を、固相支持体から出ているアミノ官能基とのアミド結合の形成によって樹脂に連結させた。ＨＢＴＵ（Ｎ−［（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）（ジメチルアミノ）メチレン］−Ｎ−メチルメタナミニウム ヘキサフルオロリン酸Ｎ−オキシド）を用いてＳｅｒとＨｉｓをカップリングさせた。２０％ピペリジンのジメチルホルムアミド溶液でＦｍｏｃ脱保護を行った。合成後、５％アニソール（４００μｌ）及び１％エタンジチオール（８０μｌ）を陽イオンスカベンジャーとして含有する９４％ＴＦＡ（７．５２ｍｌ）を用いて１００ｍｇの樹脂からペプチドを切断した。５〜６時間後、樹脂をろ過して除去し、ＴＦＡを真空で蒸発させて除去し、ペプチドをエーテルで沈殿させた。沈殿物をエーテルで繰り返し洗浄し、ＲＰ ＨＰＬＣで精製した。
【００３１】
本発明はペプチド配列について記載しており、それに基づいてそれぞれのアミノ酸の公知のトリプレット暗号からＤＮＡ配列を生ずることができるという事実を利用して、このペプチドを組換えＤＮＡ技術で作製することも可能である。こうして得られるＤＮＡ配列は合成することができる／関連遺伝子のストレッチを貝ＤＮＡから、ｃＤＮＡクローニング、ポリメラーゼ連鎖反応などの方法を用いて得ることができ、原核系又は真核系の発現ベクターにクローニングすることができる。このようにして得られるクローンを遺伝子操作して、ペプチドＭｏ１６５９を公知の方法で作製し、公知の方法で均質になるまで精製することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列ＦＨＧＧＳＷＹＲＦＰＷＧＹ（配列番号１）を有する実質的に純粋なペプチド。
【請求項２】
カリウムチャネルモジュレータとして用いられる、請求項１に記載の実質的に純粋なペプチド。
【請求項３】
請求項１に記載の実質的に純粋なペプチドを調製する方法であって：
（ｉ） ペプチドの単離、及び
（ｉｉ） クロマトグラフ法によるペプチドの精製
を含む、前記方法。
【請求項４】
工程（ｉ）のペプチドが、食虫イモガイの毒から単離される、請求項３に記載の実質的に純粋なペプチドの調製方法。
【請求項５】
食虫イモガイがクビカザリイモである、請求項４に記載の実質的に純粋なペプチドの調製方法。
【請求項６】
精製工程（ｉｉ）がＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィ）によって行われる、請求項３に記載の実質的に純粋なペプチドの調整方法。
【請求項７】
神経生理的な障害及び神経障害の治療に用いられる、請求項１に記載の実質的に純粋なペプチド。
【請求項８】
神経生理的な障害及び神経障害、統合失調症、てんかん、双極性障害、又は神経系に影響する症候群の治療に用いられる、請求項７に記載の実質的に純粋なペプチド。
【請求項９】
アミノ酸配列ＦＨＧＧＳＷＹＲＦＰＷＧＹ（配列番号１）を有するペプチドを、医薬的に許容可能な担体と共に又は伴わずに含む、医薬組成物。
【請求項１】
アミノ酸配列ＦＨＧＧＳＷＹＲＦＰＷＧＹ（配列番号１）を有する実質的に純粋なペプチド。
【請求項２】
カリウムチャネルモジュレータとして用いられる、請求項１に記載の実質的に純粋なペプチド。
【請求項３】
請求項１に記載の実質的に純粋なペプチドを調製する方法であって：
（ｉ） ペプチドの単離、及び
（ｉｉ） クロマトグラフ法によるペプチドの精製
を含む、前記方法。
【請求項４】
工程（ｉ）のペプチドが、食虫イモガイの毒から単離される、請求項３に記載の実質的に純粋なペプチドの調製方法。
【請求項５】
食虫イモガイがクビカザリイモである、請求項４に記載の実質的に純粋なペプチドの調製方法。
【請求項６】
精製工程（ｉｉ）がＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィ）によって行われる、請求項３に記載の実質的に純粋なペプチドの調整方法。
【請求項７】
神経生理的な障害及び神経障害の治療に用いられる、請求項１に記載の実質的に純粋なペプチド。
【請求項８】
神経生理的な障害及び神経障害、統合失調症、てんかん、双極性障害、又は神経系に影響する症候群の治療に用いられる、請求項７に記載の実質的に純粋なペプチド。
【請求項９】
アミノ酸配列ＦＨＧＧＳＷＹＲＦＰＷＧＹ（配列番号１）を有するペプチドを、医薬的に許容可能な担体と共に又は伴わずに含む、医薬組成物。
【公表番号】特表２００８−５０５０５５（Ｐ２００８−５０５０５５Ａ）
【公表日】平成２０年２月２１日（２００８．２．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５５３６９４（Ｐ２００６−５５３６９４）
【出願日】平成１６年１０月８日（２００４．１０．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００４／００３２７８
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０８５２７６
【国際公開日】平成１７年９月１５日（２００５．９．１５）
【出願人】（５０６０９８８０４）ナショナル センター フォー バイオロジカル サイエンシズ (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年２月２１日（２００８．２．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１０月８日（２００４．１０．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００４／００３２７８
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０８５２７６
【国際公開日】平成１７年９月１５日（２００５．９．１５）
【出願人】（５０６０９８８０４）ナショナル センター フォー バイオロジカル サイエンシズ (2)
【Ｆターム（参考）】
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