新規カルノシン誘導体及び組成物
【課 題】Ｌ−カルノシンの有する難点を克服し、カルノシナーゼに安定で、かつ抗酸化作用が優れている新規なＬ−カルノシン誘導体の提供。
【解決手段】一般式（ＩＩ）
で示されるＬ−カルノシン誘導体、またはその薬理的に許容し得る塩、エステルもしくはアミド。この化合物は活性酸素種による障害に起因する疾病の治療または予防、老化防止などを目的とした医薬品、皮膚用化粧品などに利用できる。
【解決手段】一般式（ＩＩ）
で示されるＬ−カルノシン誘導体、またはその薬理的に許容し得る塩、エステルもしくはアミド。この化合物は活性酸素種による障害に起因する疾病の治療または予防、老化防止などを目的とした医薬品、皮膚用化粧品などに利用できる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カルノシナーゼに対して安定で、かつ抗酸化活性に優れた新規Ｌ−カルノシン誘導体及び該誘導体を含有する組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
活性酸素種によって引き起こされる脂質や蛋白質の過酸化は、ヒト及び他の哺乳動物組織の構造及び機能が加齢と共に低下する要因の一つと考えられており、かかる過酸化を防止するための物質が、抗酸化剤として医薬品、化粧品、栄養補助食品などに適用されている。
【０００３】
このような物質の例として、式（Ｉ）：
【化１】
で示されるＬ−カルノシン（β−アラニル−Ｌ−ヒスチジン）が知られている（例えば、特許文献１）。
【０００４】
Ｌ−カルノシンは、脊椎動物の骨格筋の非蛋白画分（例えば、非特許文献１，２）、水晶体（例えば、非特許文献３）などに多く含まれる天然の抗酸化剤で、組織や血中成分の脂質、蛋白質などが活性酸素種、脂質過酸化物（例えば、非特許文献４，５）、あるいは不飽和脂肪酸の酸化により二次的に生じるアクロレイン、４−ヒドロキシ−トランス−２，３−ノネナール（ＨＮＥ）などのα，β−不飽和アルデヒド（例えば、非特許文献６，７）などにより損傷を受けるのを防ぐうえで重要な役割を果たしていることが知られている。そのため、Ｌ−カルノシンは一部の国で栄養補助食品、化粧品として使用されているが、血漿中、あるいは組織中に多量に存在するカルノシナーゼという酵素によって容易に加水分解されてβ−アラニンとＬ−ヒスチジンとなり、その生理活性を完全に失うので、医薬品としては何ら利用されておらず、またＬ−カルノシンを主成分とする栄養補助食品や化粧品などの製品もその効果が必ずしも満足できるものではない。また、本発明者らが知る限りにおいては、Ｌ−カルノシンを化学修飾した誘導体で上記目的に使用されているものはない。
【０００５】
【特許文献１】特開２００３−２６７９９２号公報
【非特許文献１】K. G. Crush, Com. Biocem. Physiol., Vol.34, 3, 1970
【非特許文献２】A. A. Boldyrev., S. E. Severin, Adv. Enzyme Regul., Vol.30, 1990
【非特許文献３】F. Margolis, Science, Vol.184, 909, 1974
【非特許文献４】M. A. Babizhayev et al., Biochem. J., Vol.304, 509, 1994
【非特許文献５】J. H. Kang et al., Molecules and Cells, Vol.13, 107, 2002
【非特許文献６】G. Poli, R. Schaur, IUBMB Life, Vol.50, 315, 2000
【非特許文献７】F. J .Romero et al., Environ. Health Perspect., Vol.106, 1229, 1998
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、Ｌ−カルノシンの有する難点を克服し、カルノシナーゼに安定で、かつ抗酸化作用が優れている新規なＬ−カルノシン誘導体を提供することにある。また、本発明の目的は、この新規なＬ−カルノシン誘導体を、活性酸素種による障害に起因する疾病の治療または予防、老化防止などを目的とした医薬品、皮膚用化粧品などに適用できる組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、種々の動物生体内に多量に存在する天然の抗酸化剤であり、安全性に優れたＬ−カルノシン（すなわち、β−アラニル−Ｌ−ヒスチジン）に着目し、抗酸化活性がＬ−カルノシンより優れ、かつカルノシナーゼなどのペプチダーゼに対して安定な新規Ｌ−カルノシン誘導体の開発を目指して鋭意研究を行った結果、新規なカルノシン誘導体の創成に成功した。また本発明者らは、前記カルノシン誘導体がＬ−カルノシンよりも強力な抗酸化活性を示し、かつカルノシナーゼなどのプロテアーゼ抵抗性に優れることを見出すと共に、該誘導体がＬ−カルノシンよりも優れた紫外線防御作用や皮膚の保湿作用を示すことを見出し、さらに検討を重ねて本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明は、
［１］ 式（ＩＩ）：
【化２】
で示されるＬ−カルノシン誘導体、またはその薬理的に許容し得る塩、エステルもしくはアミド、
［２］ Ｌ−カルノシン誘導体（ＩＩ）が、Ｎ−［（２ＲＳ）−６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボニル］−Ｌ−カルノシンである前記［１］記載の化合物、
［３］ Ｌ−カルノシン誘導体（ＩＩ）が、Ｎ−［（２Ｒ）−６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボニル］−Ｌ−カルノシンである前記［１］記載の化合物、
［４］ Ｌ−カルノシン誘導体（ＩＩ）が、Ｎ−［（２Ｓ）−６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボニル］−Ｌ−カルノシンである前記［１］記載の化合物、
［５］ 前記［１］〜［４］のいずれかに記載の化合物を含有する医薬、
［６］ 前記［１］〜［４］のいずれかに記載の化合物を含有する化粧品、および
［７］ 前記［１］〜［４］のいずれかに記載の化合物を含有する抗酸化剤、
に関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、新規なＬ−カルノシン誘導体（ＩＩ）は天然Ｌ−カルノシンより強力な抗酸化活性を有し、カルノシナーゼなどのプロテアーゼによる加水分解に抵抗するので、経口的あるいは非経口的に投与したときに生体の各種組織内で安定に存在することができ、ヒトあるいはその他の哺乳動物の組織、皮膚などの活性酸素種による障害の予防・治療にとって有用である。したがって、例えば動脈硬化、心筋梗塞、脳梗塞、くも膜下出血などの虚血性疾患の予防や治療に用いることができ、抗老化（アンチエージング）効果が期待できるほか、紫外線防御作用や皮膚の保水性や弾力性を高めるなどの効果を有するので、皮膚の健康を増進する化粧品としても有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の目的化合物は、一般式（ＩＩ）：
【化３】
で示されるＬ−カルノシン誘導体、またはその薬理的に許容し得る塩、エステルもしくはアミドである。
【００１１】
「薬理学的に許容し得る塩」としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩のようなアルカリ金属塩、塩酸塩、硫酸塩のような無機酸塩、リンゴ酸塩、フマール酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩のような有機酸塩が挙げられる。
【００１２】
「そのエステル」としては、カルボキシル基の「一般的な保護基」であるエステルか、あるいは「生体内で加水分解のような生物学的方法により開裂し得る保護基」であるエステルが挙げられる。
【００１３】
「一般的な保護基」としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基のようなアルキル基；ベンジル基、フェネチル基のようなアラルキル基；ヒドロキシエチル基、３−ヒドロキシプロピル基のようなヒドロキシ置換アルキル基などが挙げられる。
【００１４】
また、「生体内で加水分解のような生物学的方法により開裂し得る保護基」としては、例えば、メトキシメチル基、１−エトキシエチル基、１−メチル−１−メトキシエチル基、エトキシメチル基、ｎ−プロポキシメチル基、ｔｅｒｔ−ブトキシメチル基のようなアルコキシ置換アルキル基；メトキシカルボニルメチル基のようなアルコキシカルボニル置換アルキル基；メチルチオメチル基、エチルチオメチル基のようなアルキルチオ置換アルキル基；アセトキシメチル基、１−アセトキシエチル基、プロピオニルオキシメチル基、１−プロピオニルオキシエチル基、ブチリルオキシメチル基、ピバロイルオキシメチル基、１−ピバロイルオキシエチル基、バレリルオキシメチル基、イソバレリルオキシメチル基、１−シクロヘキサンカルボニルオキシエチル基のような脂肪族アシルオキシ置換アルキル基；メトキシカルボニルオキシメチル基、エトキシカルボニルオキシメチル基、プロポキシカルボニルオキシメチル基のようなアルコキシカルボニルオキシ置換アルキル基などが挙げられる。
【００１５】
また、「そのアミド」を形成する基としては、例えば、式（Ａ）：
【化４】
［式中、ＲａおよびＲｂはそれぞれ独立して水素原子、アルキル基またはアラルキル基を示すか、あるいは両者が隣接する窒素原子と共に５〜７員複素環式基を形成していてもよいことを示す。］
で示される基が挙げられる。
【００１６】
本発明に係る新規なＬ−カルノシン誘導体（ＩＩ）は、例えば、下記の方法１または方法２によって製造することができる。
（方法１）
一般式（Ｉａ）：
【化５】
［式中、Ｒは水素原子またはカルボキシル基の保護基を示す。］
で示されるＬ−カルノシン類化合物と一般式（ＩＩＩ）：
【化６】
［式中、Ｒ’は水素原子または水酸基の保護基を示す。]
で示される６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン誘導体またはそのカルボキシル基における反応性誘導体を反応させ、Ｒおよび／またはＲ’が保護基である場合は、さらに生成物から該保護基を除去するか、あるいは
（方法２）
一般式（ＩＶ）：
【化７】
［式中、Ｒは上記と同意義を示す。］
で示されるＬ−ヒスチジン類化合物と式（Ｖ）：
【化８】
［式中、Ｒ’は上記と同意義を示す。］
で示される化合物またはそのカルボキシル基における反応性誘導体を反応させ、Ｒおよび／またはＲ’が保護基である場合は、さらに生成物から該保護基を除去することにより、目的化合物（ＩＩ）を製造することができる。
【００１７】
上記方法２における原料化合物（Ｖ）は次のようにして製造できる。すなわち式（ＶＩ）
【化９】
［式中、Ｒは前記と同意義を示す。］
で示されるβ−アラニン類化合物と上記化合物（ＩＩＩ）またはそのカルボキシル基における反応性誘導体を反応させ、次いで必要により脱保護することにより化合物（Ｖ）を製造することができる。
【００１８】
式（Ｉａ）、（ＩＶ）及び（ＶＩ）で示される化合物中、Ｒで示される基がカルボキシル基の保護基である場合、該保護基としては、アミノ酸やペプチド化学の分野でカルボン酸の保護基として公知のものが挙げられる。かかる保護基としては、例えばアルキル基（例、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基など）や、アラルキル基（例、ベンジル基、ｐ−メトキシベンジル基など）などが挙げられる。
【００１９】
一方、式（ＩＩＩ）及び（Ｖ）で示される化合物中、Ｒ’で示される水酸基の保護基としては、例えばアシル基（例えば、ホルミル基、アセチル基、ベンゾイル基など）、アルコキシカルボニル基（例えば、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、プロポキシカルボニル基、ブトキシカルボニル基、イソブトキシカルボニル基、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基など）、アラルキル基（例えば、ベンジル基、ｐ−メトキシベンジル基など）などが挙げられる。
【００２０】
化合物（ＩＩＩ）と化合物（Ｉａ）との反応、あるいは化合物（Ｖ）と化合物（ＩＶ）との反応：
これらの反応は通常適宜の縮合剤の存在下、または化合物（ＩＩＩ）もしくは化合物（Ｖ）を一旦それぞれそのカルボキシル基における反応性誘導体に導いた後、化合物（Ｉａ）もしくは化合物（ＩＶ）とそれぞれ反応させることにより行われる。上記反応に用いられる縮合剤としては、それ自体公知のもの、例えばジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）［例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩など］、カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリス（ピロリジノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）、ジフェニルリン酸アジド（ＤＰＰＡ）などが挙げられ、これらは必要によりＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＨＯＳｕ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）などの共存下に使用してもよい。また、化合物（ＩＩＩ）もしくは化合物（Ｖ）のカルボキシル基における反応性誘導体としては、例えば酸クロリド、活性エステル（例えば、ｐ−ニトロフェニルエステル、ペンタクロロフェニルエステル、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドとのエステル、１−ヒドロキシベンゾトリアゾールとのエステルなど）、イミダゾリド、混合酸無水物（例えば、メトキシ蟻酸、エトキシ蟻酸、プロポキシ蟻酸、ブトキシ蟻酸、イソブトキシ蟻酸、ｔｅｒｔ−ブトキシ蟻酸、フェノキシ蟻酸、２，２−ジメチルプロピオン酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、トルエンスルホン酸との混合酸無水物など）などが挙げられる。これら反応性誘導体をいったん単離して化合物（Ｉａ）もしくは化合物（ＩＶ）と反応させてもよく、これら反応性誘導体を反応系内で生成させた後、あるいは生成させながら化合物（Ｉａ）あるいは（ＩＶ）と反応させてもよい。
【００２１】
上記の反応は、通常溶媒中必要により適宜塩基の共存下に行われる。溶媒としては、通常不活性な有機溶媒が用いられるが、場合により水を溶媒として用いることもでき、あるいはまたこれらの混合物を用いることもできる。用いる有機溶媒としては、例えばハロゲン化アルキル類（例えば、塩化メチレン、クロロホルムなど）、芳香族炭化水素類（例えば、ベンゼン、トルエン、キシレンなど）、エーテル類（例えば、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、メチルイソブチルエーテル、メチルシクロペンチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサンなど）、エステル類（例えば、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチルなど）、ケトン類（例えば、アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトンなど）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピペリドン、ジメチルスルホキシドなどが挙げられる。用いられうる塩基としては、例えば無機塩基（例えば、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウムなど）、有機塩基（例えば、ピリジン、トリエチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、Ｎ−メチルモルホリン、Ｎ−メチルピペリジンなど）などが挙げられる。反応温度は用いる縮合剤、あるいは化合物（ＩＩＩ）の反応性誘導体もしくは化合物（Ｖ）の反応性誘導体の種類等によっても異なるが、通常、約−３０℃〜１００℃、好ましくは−１０℃〜約４０℃の範囲である。縮合剤、塩基の使用量は、通常、化合物（ＩＩＩ）もしくは化合物（Ｖ）１モルに対し１〜５当量、好ましくは１〜３当量である。化合物（ＩＩＩ）もしくは（Ｖ）をそれらの反応性誘導体の形で使用する場合、その使用量は化合物（ＩＶ）もしくは化合物（ＶＩ）１モルに対して０．１〜３当量、好ましくは０．３〜１当量である。
【００２２】
このようにして得られた化合物中のＲおよび／またはＲ’が水素原子以外の保護基である場合、その保護基に応じた、それ自体公知の適宜の反応条件（例、酸、アルカリによる加水分解、パラジウム炭素を触媒とする接触還元等）を用いて脱保護することにより、目的の化合物（ＩＩ）を得ることができる。目的化合物（ＩＩ）は、例えば溶媒抽出、クロマトグラフィー、再結晶などを行うことにより単離精製することができる。
【００２３】
原料化合物（Ｖ）を化合物（ＩＩＩ）と化合物（ＩＶ）から製造する場合も、原則的に上記した縮合反応および脱保護反応と全く同様にして実施できる。
【００２４】
また、原料化合物（ＩＩＩ）あるいは（Ｖ）は、不斉炭素を有するので2種の光学異性体［（Ｒ）体および（Ｓ）体］が存在する。したがって、用いる化合物（ＩＩＩ）あるいは化合物（Ｖ）の光学異性体の違いにより、目的物（ＩＩ）はそれぞれがジアステレオマーの関係にある２種の異性体、［（Ｒ）−（Ｓ）］体または［（Ｓ）−（Ｓ）］体として得ることができ、あるいは化合物（ＩＩＩ）あるいは（Ｖ）のラセミ体を用いれば、目的物（ＩＩ）を該ジアステレオマーの混合物、［（ＲＳ）−（Ｓ）］体として得ることができる。また、目的物（ＩＩ）のジアステレオマー混合物は必要によりそれぞれのジアステレオマーとして分離精製することもできる。本発明の目的物（ＩＩ）はこれらの各ジアステレオマーおよびそれらの混合物のいずれも包含するものであるが、光学的に純粋な［（Ｒ）−（Ｓ）］体または［（Ｓ）−（Ｓ）］体が好ましい。
【００２５】
上記のようにして得られる化合物（ＩＩ）は、必要により、その薬理的に許容し得る塩、エステルもしくはアミドとすることができる。塩形成反応、エステル化反応、アミド化反応はこの技術分野で採用されている常法に従って実施することができる。また、エステルは前記方法１または方法２における合成中間体としても得られる。
【００２６】
上記のようにして得られる本発明の目的化合物（ＩＩ）またはその薬理的に許容し得る塩、エステルまたはアミドは、優れた抗酸化活性を有し、カルノシナーゼあるいは他のプロテアーゼによる分解にも抵抗するので、経口的あるいは非経口的に投与したとき、ヒトあるいはその他の哺乳動物の生体内で分解され難く、安定した抗酸化剤として作用する。したがって、活性酸素種によって引き起こされるさまざまな疾病、例えば動脈硬化、心筋梗塞、狭心症、脳梗塞、くも膜下出血などの虚血性疾患の予防や治療に用いることができるほか、活性酸素種が深くかかわって起こるさまざまな老化現象に対する抗老化（アンチエージング）効果が期待できる。また、目的化合物（ＩＩ）は皮膚の老化を予防あるいは遅延させ、紫外線防御作用を有するので、化粧品に配合して皮膚用化粧品として使用することができる。
【００２７】
本発明の目的化合物を医薬として用いる場合、医薬の剤型としては、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤などの経口投与用製剤、あるいは注射剤、座剤などの非経口投与用製剤が挙げられる。これらの製剤は、賦形剤（例えば、乳糖、白糖、ブドウ糖、マンニトール、ソルビトール、トウモロコシデンプン、バレイショデンプン、結晶性セルロース、アラビアゴム、デキストラン、プルラン、軽質無水珪酸、合成珪酸アルミニウム、炭酸カルシウム、燐酸水素カルシウムなど）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、コロイドシリカなど）、結合剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、マクロゴールなど）、崩壊剤（例えば、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルスターチ、カルボキシメチルスターチナトリウム、架橋ポリビニルピロリドンなど）、安定剤（例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン、ベンジルアルコールなど）、矯味矯臭剤（例えば、通常使用される甘味料、酸味料、香料など）、希釈剤などの添加剤を用いて周知の方法で製造される。目的化合物の投与量は、疾患の種類、症状、年齢、投与方法などによって異なるが、例えば、経口投与に場合には、０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ／日、特に０．５〜２０ｍｇ／ｋｇ／日が好ましい。また、静脈注射の場合には、０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇ／日、特に０．１〜２ｍｇ／ｋｇ／日が好ましい。
【００２８】
また、本発明の目的化合物を化粧品として用いる場合、化粧品の剤形は軟膏、クリーム、乳液、ローション、油状、ゲル状など、皮膚に塗布するのに適した剤形であれば任意であるが、軟膏の形が好ましい。軟膏は、公知の軟膏基剤を使用し、公知の方法に従って調製することができる。基剤の例は、例えば、白色ワセリン、黄色ワセリン、吸水ワセリン、マクロゴール、パラフィン、流動パラフィン、プラスチベース、シリコーン、牛脂、ロウ、ラノリン、植物油、ヒドロキシプロピルセルロースなどが挙げられる。製剤は慣用の化粧料添加剤、例えば香料を含むことができる。目的化合物の化粧品中への配合量は特に限定されないが、通常、０．０１〜５ｗ／ｗ％、特に０．１〜２ｗ／ｗ％が好ましい。
【００２９】
以下に参考例、実施例をあげて本発明をより詳細に説明するが、これが発明を限定するものではない。なお、本明細書において、「アルキル基」とは、炭素数１〜６のアルキル基が好ましく、アルコキシ基としては炭素数１〜６のアルコキシ基が好ましく、脂肪族アシル基としては、炭素数１〜６の脂肪族アシル基が好ましい。また、本発明の目的化合物（ＩＩ）などに含まれるクロマン骨格は、“３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾピラン”とも命名される。
【実施例】
【００３０】
（参考例１）Ｌ−カルノシンベンジルエステル・２（ｐ−トルエンスルホン酸）塩
Ｌ−カルノシン（原料化合物（Ｉ））（２２．６ｇ，０．１ｍｏｌ）及びｐ−トルエンスルホン酸・１水和物（以下、ＴｓＯＨ・Ｈ２Ｏと略記）（３９．９ｇ，０．２１ｍｏｌ）を水（１００ｍｌ）に溶解後、減圧下に水を留去した。残留物に、ＴｓＯＨ・Ｈ２Ｏ（５．０ｇ，０．０２６ｍｏｌ）及びベンジルアルコール（７５ｍｌ）を添加して溶解後、さらにクロロホルム（８０ｍｌ）を添加して、生成する水を共沸条件下にモレキュラーシーブス−４Ａで除きながら、薄層クロマトグラフィー（以下、ＴＬＣと略記）にて原料化合物（Ｉ）のスポットが消失するまで１２時間加熱還流した。
クロロホルムを減圧下に留去し、残留物に酢酸エチル（以下、ＡｃＯＥｔと略記）（３００ｍｌ）を添加して残渣油状物質を洗浄した。さらに、この油状物質を約３０℃に加温してＡｃＯＥｔ（４ｘ３００ｍｌ）で洗浄した後、減圧下に乾燥すると標題化合物（５２．５ｇ，７９．７％）がアモルファス状物質として得られた。
１Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ ２．３０（６Ｈ，ｓ），２．４５−２．５６（２Ｈ，ｍ），２．８８−３．２３（４Ｈ，ｍ），４．６０−４．７４（１Ｈ，ｍ），５．１２（２Ｈ，ｓ），７．０８−７．１６（４Ｈ，ｂｒ ｄ），７．２８−７．５３（１０Ｈ，ｍ），７．６８（３Ｈ，ｂｒ ｓ），８．９９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．２Ｈｚ）．
【００３１】
（参考例２）Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−カルノシンベンジルエステル
Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−β−アラニン（１．５ｇ，７．９２ｍｍｏｌ）及びＬ−ヒスチジンベンジルエステル・２（ｐ−トルエンスルホン酸）塩（７．０２ｇ，１１．９ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（以下、ＤＭＦと略記）（２０ｍｌ）溶液に、氷冷下Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（以下、ＤＩＥＡと略記）（３．０７ｇ，２３．８ｍｍｏｌ）、続いて１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（１．６７ｇ，８．７２ｍｍｏｌ）を加えた後、室温にて７２時間撹拌した。反応液をＡｃＯＥｔ（４０ｍｌ）で希釈し、これを水（１ｘ４０ｍｌ，２ｘ１０ｍｌ）及び飽和食塩水（２０ｍｌ）で洗浄した。水層をさらにＡｃＯＥｔ（２ｘ１５ｍｌ）で抽出後、全有機層を乾燥（ＭｇＳＯ４）し、溶媒を留去した。油状残留物を、ヘキサン／酢酸エチル（１：１）、続いてクロロホルム／メタノール（１５：１）を溶媒としてシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて分離精製したところ、標題化合物（３．１４ｇ，９５％）が無色アモルファス状物質として得られた。
１Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ １．４３（９Ｈ，ｓ），２．４２（２Ｈ，ｂｒ ｄｄ），３．０６（１Ｈ，ｄ ｏｆ ａ ｐａｉｒ ｏｆ ＡＢｑ，ＪＡＢ＝１５．６Ｈｚ，ＪＡＸ＝４．９Ｈｚ），３．１２（１Ｈ，ｄ ｏｆ ａ ｐａｉｒ ｏｆ ＡＢｑ，ＪＡＢ＝１５．６Ｈｚ，ＪＢＸ＝４．９Ｈｚ），３．３４−３．４９（２Ｈ，ｍ），４．８４（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝７．５，４．９Ｈｚ），５．０８および５．１７（１Ｈ ｅａｃｈ，ＡＢｑ，Ｊ＝１２．２Ｈｚ），５．５９（２Ｈ，ｂｒ ｔ），６．５３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．１Ｈｚ），７．２２（１Ｈ，ｂｒ ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），７．２５−７．４０（５Ｈ，ｍ），７．５０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．１Ｈｚ）．
【００３２】
（参考例３）Ｌ−カルノシンベンジルエステル・２塩酸塩
Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−カルノシンベンジルエステル（１．００ｇ，２．４０ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（５ｍｌ）溶液に４Ｎ塩化水素‐ＡｃＯＥｔ溶液（３ｍｌ）を室温にて滴下した後、同温にて１０分間撹拌した。反応液を減圧下に濃縮すると、Ｌ−カルノシンベンジルエステル・２塩酸塩（９４０ｍｇ，定量的）が得られた。
１Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）：δ ２．６９（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ），３．１０−３．３８（４Ｈ，ｍ），４．７３−４．９４（１Ｈ，ｍ），５．１５および５．２２（１Ｈ ｅａｃｈ，ＡＢｑ，Ｊ＝１２．１Ｈｚ），７．２７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．３Ｈｚ），７．３０−７．４４（５Ｈ，ｍ），８．７８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．３Ｈｚ）．
【００３３】
（参考例４）（±）−６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボニル−β−アラニン（化合物（Ｖ），Ｒ’＝Ｈ）
（±）−６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸（化合物（ＩＩＩ），Ｒ’＝Ｈ）（１．００ｇ，３．９９ｍｍｏｌ）及びβ−アラニンエチルエステル・塩酸塩（７３６ｍｇ，４．７９ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１０ｍｌ）溶液に、ＤＩＥＡ（２．０７ｇ，１６．０ｍｍｏｌ）、続いてベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリス（ピロリジノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（以下、ＰｙＢＯＰと略記）（２．０８ｇ，３．９９ｍｍｏｌ）を添加した。その後、反応液を室温にて一晩撹拌した。ＴＬＣにより原料（化合物（ＩＩＩ），Ｒ’＝Ｈ）が消失していることを確認した。反応液をＡｃＯＥｔ（３０ｍｌ）にて希釈した後、これを１ＮＨＣｌ（２ｘ２０ｍｌ）、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（１ｘ１５ｍｌ）及び飽和食塩水（２０ｍｌ）で洗浄後、乾燥（ＭｇＳＯ４）した。溶媒を留去した後、粗生成物をヘキサン／酢酸エチル（３：１）を溶媒としてシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製すると、標題化合物のエチルエステル（１．４２ｇ，定量的）が黄白色アモルファス状物質として得られた。
１Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ １．２１（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ），１．４９（３Ｈ，ｓ），１．８８（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝１３．５，８．１，６．６Ｈｚ），２．０９（３Ｈ，ｓ），２．１８（６Ｈ，ｓ），２．２４−２．７２（５Ｈ，ｍ），３．４９（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．１Ｈｚ），４．０５および４．０６（ｔｏｔａｌ ２Ｈ，ｂｏｔｈ ｑ，Ｊ＝７．１Ｈｚ），４．５０（１Ｈ，ｓ），７．０５（１Ｈ，ｂｒ ｔ，Ｊ＝６．１Ｈｚ）．
【００３４】
本エチルエステル（１．４０ｇ，３．９９ｍｍｏｌ）のメタノール（１０ｍｌ）溶液に水酸化リチウム・１水和物（０．５０ｇ，１２．０ｍｍｏｌ）の水（４ｍｌ）溶液を滴下後、２時間還流した。メタノールを減圧留去した後、残留液の液性を１Ｎ塩酸にてｐＨ１に調整した。析出した結晶をＡｃＯＥｔ（１ｘ５０ｍｌ，２ｘ１０ｍｌ）で抽出し、有機層を乾燥（ＭｇＳＯ４）した後、溶媒を留去すると標題化合物（１．２４ｇ，９６．５％）が白色アモルファス状物質として得られた。
１Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）：δ １．４５（３Ｈ，ｓ），１．８２（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝１３．４，８．６，６．４Ｈｚ），２．０６（３Ｈ，ｓ），２．１４（６Ｈ，ｓ），２．２１−２．７１（５Ｈ，ｍ），３．３４−３．４７（２Ｈ，ｍ），７．５０（１Ｈ，ｂｒ ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ）．
【００３５】
（実施例１）
１）Ｎ−［（２ＲＳ）−６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボニル］−Ｌ−カルノシンベンジルエステル（Ｒ：Ｓ＝１：１混合物）
Ａ法：Ｌ−カルノシンベンジルエステル・２（ｐ−トルエンスルホン酸）塩（０．８６ｇ，１．３ｍｍｏｌ）のピリジン（５ｍｌ）溶液に室温にて（±）−６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸（２５０ｍｇ，１．０ｍｍｏｌ）を添加後、５−１０℃にて１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（２８０ｍｇ，１．４６ｍｍｏｌ）を加え、反応液を室温にて６時間撹拌した。ピリジンを減圧下に留去後、残留物をＡｃＯＥｔ（２０ｍｌ）に溶解し、飽和食塩水（２ｘ２０ｍｌ）で洗浄後、乾燥（ＭｇＳＯ４）した。溶媒を減圧下に留去後、残留物をヘキサン／酢酸エチル（１：１）、続いてクロロホルム／メタノール（１０：１）を溶媒としてシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製すると、標題化合物（２６０ｍｇ，５６．８％）が粘性油状物質として得られた。
１Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ １．４８および１．５１（ｔｏｔａｌ ３Ｈ，ｂｏｔｈ ｓ），１．７０−２．７０（６Ｈ，ｍ），２．０７および２．０８（ｔｏｔａｌ ３Ｈ，ｂｏｔｈ ｓ），２．１４および２．１７（ｔｏｔａｌ ６Ｈ，ｂｏｔｈ ｓ），２．８０−３．１０（２Ｈ，ｍ），３．２０−３．６７（２Ｈ，ｍ），４．３８（０．５Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝６．８，６．１Ｈｚ），４．７３（０．５Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝７．５，５．７Ｈｚ），５．０３および５．０９（１Ｈ ｅａｃｈ，ＡＢｑ，Ｊ＝１２．３Ｈｚ），６．４６（０．５Ｈ，ｂｒ ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），６．５３（０．５Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．０Ｈｚ），６．５７（０．５Ｈ，ｄ，Ｊ＝０．９Ｈｚ），７．１０−７．４０（６．５Ｈ，ｍ），７．４５（０．５Ｈ，ｄ，Ｊ＝０．９Ｈｚ），７．４９（０．５Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．０Ｈｚ）．
【００３６】
Ｂ法：（±）−６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボニル−β−アラニン（化合物（Ｖ），Ｒ’＝Ｈ）（６００ｍｇ，１．８７ｍｍｏｌ）及びＬ−ヒスチジンベンジルエステル・２（ｐ−トルエンスルホン酸）塩（３．３０ｇ，５．６０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１０ｍｌ）溶液に、室温にて、ＤＩＥＡ（１．２１ｇ，９．３４ｍｍｏｌ）、続いて１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（３９４ｍｇ，２．０５ｍｍｏｌ）を加えた後、同温にて９６時間撹拌した。反応液をＡｃＯＥｔ（４０ｍｌ）で希釈し、これを水（１ｘ２０ｍｌ，４ｘ１０ｍｌ）及び飽和食塩水（１５ｍｌ）で洗浄した後、乾燥（ＭｇＳＯ４）し、溶媒を留去した。油状残留物をヘキサン／酢酸エチル（１：１）、続いてクロロホルム／メタノール（１０：１）を溶媒としてシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて分離精製すると、標題化合物（８６９ｍｇ，８５％）が粘性油状物質として得られた。
【００３７】
２）Ｎ−［（２ＲＳ）−６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボニル］−Ｌ−カルノシン・・・化合物（１）
Ｎ−［（２ＲＳ）−６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボニル］−Ｌ−カルノシンベンジルエステル（Ｒ：Ｓ＝１：１混合物）（８９５ｍｇ，１．６３ｍｍｏｌ）のメタノール（８ｍｌ）溶液に１０％パラジウム炭素（水分含量：５２．７％）（２００ｍｇ）を加え、常温、常圧で接触還元した。触媒をろ去した後、溶媒を留去すると、微黄色粘性油状物質が得られた。これをメタノール／クロロホルム（１：３）に溶解後、ＡｃＯＥｔを徐々に加えて生成物を晶出させた後、上澄液を除去した（本操作を３回繰り返した）。溶媒を留去後、油状残留物をメタノール（１．５ｍｌ）に溶解し、リグロイン（沸点範囲８０〜１１０℃，４〜５ｍｌ）を徐々に加えて懸濁液とした。その後、溶媒を減圧下に留去し、さらに真空乾燥すると、標題化合物（６１７ｍｇ，８２％）が微黄白色アモルファス状物質として得られた。
１Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）：δ １．４３６および１．４４４（ｔｏｔａｌ ３Ｈ，ｂｏｔｈ ｓ），１．７５−１．９０（１Ｈ，ｍ），２．０５（３Ｈ，ｓ），２．１３（３Ｈ，ｓ），２．１４（３Ｈ，ｓ），２．１０−２．７０（５Ｈ，ｍ），２．９９−３．５２（４Ｈ，ｍ），４．６４−４．７２（１Ｈ，ｍ），７．２９（０．５Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．３Ｈｚ），７．３０（０．５Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．３Ｈｚ），７．５９（０．５Ｈ，ｂｒ ｔ），７．９０（０．５Ｈ，ｓ），８．７４（０．５Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．３Ｈｚ），８．８１（０．５Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．３Ｈｚ）．
エレクトロスプレーイオン化法質量分析
陽イオンモード：
観測値（Ｍ＋Ｈ）＋：４５９．１ ｆｏｒ Ｃ２３Ｈ３１Ｎ４Ｏ６
計算値：４５９．２ ｆｏｒ ｉｓｏｔｏｐｅ ｍｏｄｅｌ ＭＨ；
陰イオンモード：
観測値（Ｍ−Ｈ）−：４５７．１ ｆｏｒ Ｃ２３Ｈ２９Ｎ４Ｏ６
計算値：４５７．２ ｆｏｒ ｉｓｏｔｏｐｅ ｍｏｄｅｌ（Ｍ−Ｈ）．
ＨＰＬＣ分析（下記）の結果、化合物（１）は２種のジアステレオマー混合物（１：１）であった。
【数１】
【００３８】
（実施例２）
１）Ｎ−［（２Ｒ）−６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボニル］−Ｌ−カルノシンベンジルエステル
Ｌ−カルノシンベンジルエステル・２塩酸塩（１．１２ｇ，２．８８ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（３ｍｌ）溶液に室温にて（２Ｒ）−６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸（７２１ｍｇ，２．８８ｍｍｏｌ）及びジクロロメタン（３ｍｌ）を加えて溶解し、続いてＤＩＥＡ（１．１２ｇ，８．６４ｍｍｏｌ）、ＰｙＢＯＰ（１．５０ｇ，２．８８ｍｍｏｌ）を加えた後、反応液を室温にて７２時間撹拌した。大部分のジクロロメタンを減圧留去後、残留物をＡｃＯＥｔ（４０ｍｌ）に溶解し、これを水（１ｘ３０ｍｌ，３ｘ１０ｍｌ）及び飽和食塩水（２０ｍｌ）で洗浄した（水層のｐＨ：５．５）。水層をさらにＡｃＯＥｔ（２ｘ１０ｍｌ）で抽出した後、全有機層を乾燥（ＭｇＳＯ４）し、濃縮した。油状残留物をクロロホルム、続いてクロロホルム／メタノール（１５：１）を溶媒としてシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて分離精製すると標題化合物（１．５８ｇ，定量的）が白色アモルファス状物質として得られた。
１Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ １．５０（３Ｈ，ｓ），１．６９−１．８８（１Ｈ，ｍ），２．０５−２．６７（５Ｈ，ｍ），２．０７（３Ｈ，ｓ），２．１５（６Ｈ，ｓ），２．９０および２．９７（１Ｈ ｅａｃｈ，ＡＢＸ ｓｙｓｔｅｍ，ＪＡＢ＝１５．６Ｈｚ，ＪＡＸ＝６．１Ｈｚ），３．２１−３．３８（１Ｈ，ｍ），３．４９−３．６７（１Ｈ，ｍ），４．４６（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝６．８，６．１Ｈｚ），５．０４および５．１０（１Ｈ ｅａｃｈ，ＡＢｑ，Ｊ＝１２．３Ｈｚ），６．３３（２Ｈ，ｂｒ），６．４９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．０Ｈｚ），６．５４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），７．１６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．０，５．２Ｈｚ），７．２２−７．３７（５Ｈ，ｍ），７．４９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．０Ｈｚ）．
【００３９】
２）Ｎ−［（２Ｒ）−６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボニル］−Ｌ−カルノシン・・・化合物（２）
Ｎ−［（２Ｒ）−６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボニル］−Ｌ−カルノシンベンジルエステル（７００ｍｇ，１．２７ｍｍｏｌ）のメタノール（３ｍｌ）溶液に１０％パラジウム炭素（水分含量：５２．７％）（１００ｍｇ）を加えて、常温、常圧で接触還元した。その後、触媒をろ去し、ろ液を減圧下に濃縮すると黄白色アモルファスが得られた。これにＡｃＯＥｔ（５ｍｌ）を加えて撹拌した後、上澄液を除いた。さらにクロロホルム（３ｍｌ）を加えて同様に洗浄した。残渣をメタノールに溶解した後、減圧下に濃縮し、続いて真空乾燥すると、標題化合物（５６４ｍｇ，９７％）が黄白色アモルファス状物質として得られた。
１Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）：δ １．４４（３Ｈ，ｓ），１．８１（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝１３．４，８．２，６．２Ｈｚ，），２．０５（３Ｈ，ｓ），２．１３（３Ｈ，ｓ），２．１４（３Ｈ，ｓ），２．１７−２．７０（５Ｈ，ｍ），３．０６（１Ｈ，ＡＢＸ ｓｙｓｔｅｍ，ＪＡＢ＝１５．３Ｈｚ，ＪＡＸ＝７．８Ｈｚ），３．２０（１Ｈ，ＡＢＸ ｓｙｓｔｅｍ，ＪＡＢ＝１５．３Ｈｚ，ＪＢＸ＝５．６Ｈｚ），３．３０−３．４８（２Ｈ，ｍ），４．６６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．８，５．６Ｈｚ），７．２７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．５Ｈｚ），８．７０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．５Ｈｚ）．
１３Ｃ−ＮＭＲ（５０．３ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）：δ １２．０，１２．４，１３．０，２１．６，２４．７，２８．２，３１．０，３６．０，３６．６，５２．９，７９．１，１１８．５，１１８．６，１２２．２，１２３．３，１２４．９，１３１．５，１３５．０，１４５．７，１４７．３，１７３．４，１７３．８，１７７．１．
エレクトロスプレーイオン化法質量分析
陽イオンモード：
観測値（Ｍ＋Ｈ）＋：４５９．１ ｆｏｒ Ｃ２３Ｈ３１Ｎ４Ｏ６
計算値：４５９．２ ｆｏｒ ｉｓｏｔｏｐｅ ｍｏｄｅｌ ＭＨ；
陰イオンモード：
観測値（Ｍ−Ｈ）−：４５７．１ ｆｏｒ Ｃ２３Ｈ２９Ｎ４Ｏ６
計算値：４５７．２ ｆｏｒ ｉｓｏｔｏｐｅ ｍｏｄｅｌ（Ｍ−Ｈ）．
【００４０】
（実施例３）
１）Ｎ−［（２Ｓ）−６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボニル］−Ｌ−カルノシンベンジルエステル
カルノシンベンジルエステル・２塩酸塩（９４０ｍｇ，２．４０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（３ｍｌ）溶液に室温にて（Ｓ）−６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸（６０１ｍｇ，２．４０ｍｍｏｌ）及びジクロロメタン（３ｍｌ）を加えて溶解し、続いてＤＩＥＡ（９３１ｍｇ，７．２０ｍｍｏｌ）、ＰｙＢＯＰ（１．２５ｇ，２．４０ｍｍｏｌ）を加えた後、反応液を室温にて７２時間撹拌した。大部分のジクロロメタンを減圧留去後、反応混合物をＡｃＯＥｔ（４０ｍｌ）にて希釈して、これを水（１ｘ３０ｍｌ，３ｘ１０ｍｌ）及び飽和食塩水（２０ｍｌ）で洗浄した（水層のｐＨ：５．５）。水層をさらにＡｃＯＥｔ（３ｘ１０ｍｌ）で抽出した後、全有機層を乾燥（ＭｇＳＯ４）後、濃縮した。油状残留物をクロロホルム、続いてクロロホルム／メタノール（１５：１）を溶媒としてシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて分離精製すると標題化合物（１．０８ｇ，８１％）が白色アモルファス状物質として得られた。
１Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ １．４７（３Ｈ，ｓ），１．７７−１．９４（１Ｈ，ｍ），２．０６（３Ｈ，ｓ），２．１３（６Ｈ，ｓ），２．１８−２．６８（５Ｈ，ｍ），２．９９および３．０５（１Ｈ ｅａｃｈ，ＡＢＸ ｓｙｓｔｅｍ，ＪＡＢ＝１５．６Ｈｚ，ＪＡＸ＝５．７Ｈｚ），３．３７−３．５６（２Ｈ，ｍ），４．７３（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝７．５，５．７Ｈｚ），５．０３および５．０９（１Ｈ ｅａｃｈ，ＡＢｑ，Ｊ＝１２．３Ｈｚ），５．９０（２Ｈ，ｂｒ），６．５５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝０．９Ｈｚ），７．１１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），７．１８−７．３５（６Ｈ，ｍ），７．４７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝０．９Ｈｚ）．
【００４１】
２）Ｎ−［（２Ｓ）−６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボニル］−Ｌ−カルノシン・・・化合物（３）
Ｎ−［（２Ｓ）−６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボニル］−Ｌ−カルノシンベンジルエステル（６００ｍｇ，１．０９ｍｍｏｌ）のメタノール（３ｍｌ）溶液に１０％パラジウム炭素（水分含量：５２．７％）（８０ｍｇ）を加えて、アスピレーターによる減圧脱気及び反応フラスコ内の水素ガス置換操作を５回繰り返した後、水素雰囲気下（風船使用）に５時間激しく撹拌した。その後、Ｐｄ触媒をろ去し、ろ液を減圧下に濃縮すると黄白色アモルファスが得られた。これにＡｃＯＥｔ（５ｍｌ）を加えて撹拌した後、上澄液を除いた。さらにクロロホルム（３ｍｌ）を加えて同様に洗浄した。このアモルファス残渣をメタノールに溶解した後、減圧下に濃縮し、続いて真空乾燥すると、標題化合物（４９８ｍｇ，定量的）が黄白色アモルファス状物質として得られた。
１Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）：δ １．４３（３Ｈ，ｓ），１．７９（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝１３．４，８．２，６．４Ｈｚ，），２．０４（３Ｈ，ｓ），２．１２（３Ｈ，ｓ），２．１３（３Ｈ，），２．１８−２．６８（５Ｈ，ｍ），３．０２（１Ｈ，ＡＢＸ ｓｙｓｔｅｍ，ＪＡＢ＝１５．３Ｈｚ，ＪＡＸ＝７．０Ｈｚ），３．１６（１Ｈ，ＡＢＸ ｓｙｓｔｅｍ，ＪＡＢ＝１５．３Ｈｚ，ＪＢＸ＝５．３Ｈｚ），３．３３−３．４６（２Ｈ，ｍ），４．４６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．０，５．３Ｈｚ），７．１６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．１Ｈｚ），８．４７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．１Ｈｚ）．
１３Ｃ−ＮＭＲ（５０．３ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）：δ １２．０，１２．４，１３．０，２１．６，２４．８，２９．５，３１．０，３６．２，３６．７，５４．９，７９．１，１１８．３，１１８．６，１２２．３，１２３．２，１２５．０，１３２．８，１３４．９，１４５．７，１４７．３，１７３．３，１７６．１，１７７．０．
エレクトロスプレーイオン化法質量分析
陽イオンモード：
観測値（Ｍ＋Ｈ）＋：４５９．１ ｆｏｒ Ｃ２３Ｈ３１Ｎ４Ｏ６
計算値：４５９．２ ｆｏｒ ｉｓｏｔｏｐｅ ｍｏｄｅｌ ＭＨ；
陰イオンモード：
観測値（Ｍ−Ｈ）−：４５７．１ ｆｏｒ Ｃ２３Ｈ２９Ｎ４Ｏ６
計算値：４５７．２ ｆｏｒ ｉｓｏｔｏｐｅ ｍｏｄｅｌ（Ｍ−Ｈ）．
【００４２】
（実施例４）抗酸化作用（ＤＰＰＨテスト）
K. Schlesierらの方法（Free Radical Research, Vol.36, 177-187, 2002）に従い、化合物（１）、（２）、（３）の０．０２５ｍＭ〜０．１５０ｍＭ濃度における２，２−ジフェニル−１−ピクリルヒドラジルラジカル（ＤＰＰＨ）の消去作用を調べた。その結果は、下記表１の通りである。
表１から明らかなように、本発明の化合物はいずれも濃度依存的にＤＰＰＨの消去作用を示したが、Ｌ−カルノシンは高濃度でもそのような作用を殆ど示さなかった。
【００４３】
【表１】
【００４４】
（実施例５）リポ蛋白の酸化抑制作用（ＭＤＡテスト）
１０５ｍＭ−ＫＯＨ、２０ｍＭ−リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）を含む水溶液０．５ｍｌにヒト血漿５０μｌ及び被験化合物の水溶液５−２５μｌを加えて下記表２に示す最終濃度に調整した。次いで、新たに調整した１００ｍＭ−ＦｅＳＯ４溶液２０μｌを加え、３７℃で６０分間インキュベーションした。その５０μｌをとり、脂質の過酸化によって生じるマロンアルデヒド（ＭＤＡ）をチオバルビタール酸反応性物質（ＴＢＲＡＳ）として定量し、コントロールに対する％で示した。結果は、下記表２の通りである。
表２から明らかなように、本発明の化合物（１）、（２）および（３）は、Ｌ−カルノシンよりも強いリポ蛋白酸化抑制作用を示した。
【００４５】
【表２】
【００４６】
（実施例６）加水分解酵素に対する抵抗性
ヒト血清２００μｌを８００μｌの１２５ｍＭ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）、３００μｌの５ｍＭ−ＣｄＣｌ２／３０ｍＭ−クエン酸ナトリウム水溶液、３００μｌの水の混合物に加え、３７℃で３０分間インキュベーションした後、４００μｌの５０ｍＭ−試験サンプル水溶液（０．０５Ｍ−ＮａＯＨでｐＨ＝８．５に調整）を加え、最終的に１０ｍＭ溶液とした。これを０分（インキュベーション前）、インキュベーション開始１０、２０、３０、６０、９０、及び１８０分後にそれぞれの１００μｌをとり、ＨＰＬＣを用いて化合物残存量を測定した。結果は、下記表３の通りである。なお、表中、０分を１００としたときの被験化合物の残存率を示す。また、Ｌ−カルノシンは２人のドナー１、２から得た血清での平均値、化合物（２）および（３）はドナー別の数値で示した。
表３から明らかなように、Ｌ−カルノシンは比較的速やかに加水分解されたが、本発明化合物（２）および（３）は、９０分、１８０分後でも殆ど分解されず安定であった。
【００４７】
【表３】
【００４８】
（実施例７）紫外線防御作用
化合物（２）、化合物（３）の紫外線防御作用を測定し、対照化合物Ｌ−カルノシン及び２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−メチルフェノール（ＢＨＴ）と比較した。
健康なボランティアーの脊椎に対して対称な２箇所（それぞれ直径２５ｍｍの円）を選び、一方には被験化合物の０．３％溶液を塗布し、他方をコントロールとした。両方にＨＢ ４００ＵＶバルブ（Ｐｈｉｌｉｐｓ）で１分間紫外線照射し、照射前と照射２４時間後の局所における紅斑の強さＩ０、Ｉ２４をセンサーＭｅｘａｍｅｔｅｒ（Courage & Kazaka Electronics, Germany）を用いて測定し、その差ΔＩを求めた。紅斑の度合いKを次の計算式を用いて求めた。
【数２】
結果は表４の通りである。なお、表中、紅斑の度合いＫの値はコントロールを１００としたときの値を示す。
表４から明らかなように、本発明化合物はＬ−カルノシン、ＢＨＴよりも優れた紫外線防御作用を示し、特に化合物（３）の作用は最も顕著で、既知の紫外線防御剤であるＢＨＴより有意に優れていた。
【００４９】
【表４】
【００５０】
（実施例８）皮膚上皮の保湿作用と弾力性に及ぼす効果
健常人の前腕部近辺に直径２５ｍｍのテストエリアを設定し共鳴器を設置した。ここに被験化合物の０．３％溶液を５０μｌ／ｃｍ２の割合で塗布し、塗布前と塗布５分後の皮膚共鳴周波数Ｑをそれぞれ測定し、それぞれの差ΔＱを求めた。ΔＱが大きいほど、皮膚上皮が膨潤し弾力を増すことを示す。各化合物のΔＱ間の有意差検定はコンピュータープログラム“Ｂｉｏｓｔａｔｉｓｔｉｃａ”を用いて行った。結果は、下記表５の通りである。
【００５１】
【表５】
【００５２】
結果及び考察
Ｌ−カルノシンは水と差がなく、むしろ保湿作用は弱い傾向が認められたが、これはＬ−カルノシンが何らかの形で水分子と相互作用をし、水単独の場合よりも皮膚の水分含量をやや低下させるためと考えられる。しかしながら本発明化合物（３）は水よりも強力な保湿効果を示したので、化合物（３）はＬ−カルノシン水溶液や水単独の場合よりも皮膚の弾力性を増加させることが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明に係るＬ−カルノシン誘導体（ＩＩ）、またはその薬理的に許容し得る塩、エステルもしくはアミドは、天然Ｌ−カルノシンより強力な抗酸化活性を有し、カルノシナーゼなどのプロテアーゼによる加水分解に抵抗するので、経口的あるいは非経口的に投与したときに生体の各種組織内で安定に存在することができ、ヒトあるいはその他の哺乳動物の組織、皮膚などの活性酸素種による障害の予防・治療にとって有用である。したがって、本発明の目的化合物は、例えば動脈硬化、心筋梗塞、脳梗塞、くも膜下出血などの虚血性疾患の予防や治療に用いることができ、抗老化（アンチエージング）効果が期待できるほか、紫外線防御作用や皮膚の保水性や弾力性を高めるなどの効果を有するので、皮膚の健康を増進する化粧品としても有用である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カルノシナーゼに対して安定で、かつ抗酸化活性に優れた新規Ｌ−カルノシン誘導体及び該誘導体を含有する組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
活性酸素種によって引き起こされる脂質や蛋白質の過酸化は、ヒト及び他の哺乳動物組織の構造及び機能が加齢と共に低下する要因の一つと考えられており、かかる過酸化を防止するための物質が、抗酸化剤として医薬品、化粧品、栄養補助食品などに適用されている。
【０００３】
このような物質の例として、式（Ｉ）：
【化１】
で示されるＬ−カルノシン（β−アラニル−Ｌ−ヒスチジン）が知られている（例えば、特許文献１）。
【０００４】
Ｌ−カルノシンは、脊椎動物の骨格筋の非蛋白画分（例えば、非特許文献１，２）、水晶体（例えば、非特許文献３）などに多く含まれる天然の抗酸化剤で、組織や血中成分の脂質、蛋白質などが活性酸素種、脂質過酸化物（例えば、非特許文献４，５）、あるいは不飽和脂肪酸の酸化により二次的に生じるアクロレイン、４−ヒドロキシ−トランス−２，３−ノネナール（ＨＮＥ）などのα，β−不飽和アルデヒド（例えば、非特許文献６，７）などにより損傷を受けるのを防ぐうえで重要な役割を果たしていることが知られている。そのため、Ｌ−カルノシンは一部の国で栄養補助食品、化粧品として使用されているが、血漿中、あるいは組織中に多量に存在するカルノシナーゼという酵素によって容易に加水分解されてβ−アラニンとＬ−ヒスチジンとなり、その生理活性を完全に失うので、医薬品としては何ら利用されておらず、またＬ−カルノシンを主成分とする栄養補助食品や化粧品などの製品もその効果が必ずしも満足できるものではない。また、本発明者らが知る限りにおいては、Ｌ−カルノシンを化学修飾した誘導体で上記目的に使用されているものはない。
【０００５】
【特許文献１】特開２００３−２６７９９２号公報
【非特許文献１】K. G. Crush, Com. Biocem. Physiol., Vol.34, 3, 1970
【非特許文献２】A. A. Boldyrev., S. E. Severin, Adv. Enzyme Regul., Vol.30, 1990
【非特許文献３】F. Margolis, Science, Vol.184, 909, 1974
【非特許文献４】M. A. Babizhayev et al., Biochem. J., Vol.304, 509, 1994
【非特許文献５】J. H. Kang et al., Molecules and Cells, Vol.13, 107, 2002
【非特許文献６】G. Poli, R. Schaur, IUBMB Life, Vol.50, 315, 2000
【非特許文献７】F. J .Romero et al., Environ. Health Perspect., Vol.106, 1229, 1998
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、Ｌ−カルノシンの有する難点を克服し、カルノシナーゼに安定で、かつ抗酸化作用が優れている新規なＬ−カルノシン誘導体を提供することにある。また、本発明の目的は、この新規なＬ−カルノシン誘導体を、活性酸素種による障害に起因する疾病の治療または予防、老化防止などを目的とした医薬品、皮膚用化粧品などに適用できる組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、種々の動物生体内に多量に存在する天然の抗酸化剤であり、安全性に優れたＬ−カルノシン（すなわち、β−アラニル−Ｌ−ヒスチジン）に着目し、抗酸化活性がＬ−カルノシンより優れ、かつカルノシナーゼなどのペプチダーゼに対して安定な新規Ｌ−カルノシン誘導体の開発を目指して鋭意研究を行った結果、新規なカルノシン誘導体の創成に成功した。また本発明者らは、前記カルノシン誘導体がＬ−カルノシンよりも強力な抗酸化活性を示し、かつカルノシナーゼなどのプロテアーゼ抵抗性に優れることを見出すと共に、該誘導体がＬ−カルノシンよりも優れた紫外線防御作用や皮膚の保湿作用を示すことを見出し、さらに検討を重ねて本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明は、
［１］ 式（ＩＩ）：
【化２】
で示されるＬ−カルノシン誘導体、またはその薬理的に許容し得る塩、エステルもしくはアミド、
［２］ Ｌ−カルノシン誘導体（ＩＩ）が、Ｎ−［（２ＲＳ）−６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボニル］−Ｌ−カルノシンである前記［１］記載の化合物、
［３］ Ｌ−カルノシン誘導体（ＩＩ）が、Ｎ−［（２Ｒ）−６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボニル］−Ｌ−カルノシンである前記［１］記載の化合物、
［４］ Ｌ−カルノシン誘導体（ＩＩ）が、Ｎ−［（２Ｓ）−６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボニル］−Ｌ−カルノシンである前記［１］記載の化合物、
［５］ 前記［１］〜［４］のいずれかに記載の化合物を含有する医薬、
［６］ 前記［１］〜［４］のいずれかに記載の化合物を含有する化粧品、および
［７］ 前記［１］〜［４］のいずれかに記載の化合物を含有する抗酸化剤、
に関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、新規なＬ−カルノシン誘導体（ＩＩ）は天然Ｌ−カルノシンより強力な抗酸化活性を有し、カルノシナーゼなどのプロテアーゼによる加水分解に抵抗するので、経口的あるいは非経口的に投与したときに生体の各種組織内で安定に存在することができ、ヒトあるいはその他の哺乳動物の組織、皮膚などの活性酸素種による障害の予防・治療にとって有用である。したがって、例えば動脈硬化、心筋梗塞、脳梗塞、くも膜下出血などの虚血性疾患の予防や治療に用いることができ、抗老化（アンチエージング）効果が期待できるほか、紫外線防御作用や皮膚の保水性や弾力性を高めるなどの効果を有するので、皮膚の健康を増進する化粧品としても有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の目的化合物は、一般式（ＩＩ）：
【化３】
で示されるＬ−カルノシン誘導体、またはその薬理的に許容し得る塩、エステルもしくはアミドである。
【００１１】
「薬理学的に許容し得る塩」としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩のようなアルカリ金属塩、塩酸塩、硫酸塩のような無機酸塩、リンゴ酸塩、フマール酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩のような有機酸塩が挙げられる。
【００１２】
「そのエステル」としては、カルボキシル基の「一般的な保護基」であるエステルか、あるいは「生体内で加水分解のような生物学的方法により開裂し得る保護基」であるエステルが挙げられる。
【００１３】
「一般的な保護基」としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基のようなアルキル基；ベンジル基、フェネチル基のようなアラルキル基；ヒドロキシエチル基、３−ヒドロキシプロピル基のようなヒドロキシ置換アルキル基などが挙げられる。
【００１４】
また、「生体内で加水分解のような生物学的方法により開裂し得る保護基」としては、例えば、メトキシメチル基、１−エトキシエチル基、１−メチル−１−メトキシエチル基、エトキシメチル基、ｎ−プロポキシメチル基、ｔｅｒｔ−ブトキシメチル基のようなアルコキシ置換アルキル基；メトキシカルボニルメチル基のようなアルコキシカルボニル置換アルキル基；メチルチオメチル基、エチルチオメチル基のようなアルキルチオ置換アルキル基；アセトキシメチル基、１−アセトキシエチル基、プロピオニルオキシメチル基、１−プロピオニルオキシエチル基、ブチリルオキシメチル基、ピバロイルオキシメチル基、１−ピバロイルオキシエチル基、バレリルオキシメチル基、イソバレリルオキシメチル基、１−シクロヘキサンカルボニルオキシエチル基のような脂肪族アシルオキシ置換アルキル基；メトキシカルボニルオキシメチル基、エトキシカルボニルオキシメチル基、プロポキシカルボニルオキシメチル基のようなアルコキシカルボニルオキシ置換アルキル基などが挙げられる。
【００１５】
また、「そのアミド」を形成する基としては、例えば、式（Ａ）：
【化４】
［式中、ＲａおよびＲｂはそれぞれ独立して水素原子、アルキル基またはアラルキル基を示すか、あるいは両者が隣接する窒素原子と共に５〜７員複素環式基を形成していてもよいことを示す。］
で示される基が挙げられる。
【００１６】
本発明に係る新規なＬ−カルノシン誘導体（ＩＩ）は、例えば、下記の方法１または方法２によって製造することができる。
（方法１）
一般式（Ｉａ）：
【化５】
［式中、Ｒは水素原子またはカルボキシル基の保護基を示す。］
で示されるＬ−カルノシン類化合物と一般式（ＩＩＩ）：
【化６】
［式中、Ｒ’は水素原子または水酸基の保護基を示す。]
で示される６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン誘導体またはそのカルボキシル基における反応性誘導体を反応させ、Ｒおよび／またはＲ’が保護基である場合は、さらに生成物から該保護基を除去するか、あるいは
（方法２）
一般式（ＩＶ）：
【化７】
［式中、Ｒは上記と同意義を示す。］
で示されるＬ−ヒスチジン類化合物と式（Ｖ）：
【化８】
［式中、Ｒ’は上記と同意義を示す。］
で示される化合物またはそのカルボキシル基における反応性誘導体を反応させ、Ｒおよび／またはＲ’が保護基である場合は、さらに生成物から該保護基を除去することにより、目的化合物（ＩＩ）を製造することができる。
【００１７】
上記方法２における原料化合物（Ｖ）は次のようにして製造できる。すなわち式（ＶＩ）
【化９】
［式中、Ｒは前記と同意義を示す。］
で示されるβ−アラニン類化合物と上記化合物（ＩＩＩ）またはそのカルボキシル基における反応性誘導体を反応させ、次いで必要により脱保護することにより化合物（Ｖ）を製造することができる。
【００１８】
式（Ｉａ）、（ＩＶ）及び（ＶＩ）で示される化合物中、Ｒで示される基がカルボキシル基の保護基である場合、該保護基としては、アミノ酸やペプチド化学の分野でカルボン酸の保護基として公知のものが挙げられる。かかる保護基としては、例えばアルキル基（例、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基など）や、アラルキル基（例、ベンジル基、ｐ−メトキシベンジル基など）などが挙げられる。
【００１９】
一方、式（ＩＩＩ）及び（Ｖ）で示される化合物中、Ｒ’で示される水酸基の保護基としては、例えばアシル基（例えば、ホルミル基、アセチル基、ベンゾイル基など）、アルコキシカルボニル基（例えば、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、プロポキシカルボニル基、ブトキシカルボニル基、イソブトキシカルボニル基、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基など）、アラルキル基（例えば、ベンジル基、ｐ−メトキシベンジル基など）などが挙げられる。
【００２０】
化合物（ＩＩＩ）と化合物（Ｉａ）との反応、あるいは化合物（Ｖ）と化合物（ＩＶ）との反応：
これらの反応は通常適宜の縮合剤の存在下、または化合物（ＩＩＩ）もしくは化合物（Ｖ）を一旦それぞれそのカルボキシル基における反応性誘導体に導いた後、化合物（Ｉａ）もしくは化合物（ＩＶ）とそれぞれ反応させることにより行われる。上記反応に用いられる縮合剤としては、それ自体公知のもの、例えばジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）［例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩など］、カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリス（ピロリジノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）、ジフェニルリン酸アジド（ＤＰＰＡ）などが挙げられ、これらは必要によりＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＨＯＳｕ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）などの共存下に使用してもよい。また、化合物（ＩＩＩ）もしくは化合物（Ｖ）のカルボキシル基における反応性誘導体としては、例えば酸クロリド、活性エステル（例えば、ｐ−ニトロフェニルエステル、ペンタクロロフェニルエステル、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドとのエステル、１−ヒドロキシベンゾトリアゾールとのエステルなど）、イミダゾリド、混合酸無水物（例えば、メトキシ蟻酸、エトキシ蟻酸、プロポキシ蟻酸、ブトキシ蟻酸、イソブトキシ蟻酸、ｔｅｒｔ−ブトキシ蟻酸、フェノキシ蟻酸、２，２−ジメチルプロピオン酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、トルエンスルホン酸との混合酸無水物など）などが挙げられる。これら反応性誘導体をいったん単離して化合物（Ｉａ）もしくは化合物（ＩＶ）と反応させてもよく、これら反応性誘導体を反応系内で生成させた後、あるいは生成させながら化合物（Ｉａ）あるいは（ＩＶ）と反応させてもよい。
【００２１】
上記の反応は、通常溶媒中必要により適宜塩基の共存下に行われる。溶媒としては、通常不活性な有機溶媒が用いられるが、場合により水を溶媒として用いることもでき、あるいはまたこれらの混合物を用いることもできる。用いる有機溶媒としては、例えばハロゲン化アルキル類（例えば、塩化メチレン、クロロホルムなど）、芳香族炭化水素類（例えば、ベンゼン、トルエン、キシレンなど）、エーテル類（例えば、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、メチルイソブチルエーテル、メチルシクロペンチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサンなど）、エステル類（例えば、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチルなど）、ケトン類（例えば、アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトンなど）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピペリドン、ジメチルスルホキシドなどが挙げられる。用いられうる塩基としては、例えば無機塩基（例えば、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウムなど）、有機塩基（例えば、ピリジン、トリエチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、Ｎ−メチルモルホリン、Ｎ−メチルピペリジンなど）などが挙げられる。反応温度は用いる縮合剤、あるいは化合物（ＩＩＩ）の反応性誘導体もしくは化合物（Ｖ）の反応性誘導体の種類等によっても異なるが、通常、約−３０℃〜１００℃、好ましくは−１０℃〜約４０℃の範囲である。縮合剤、塩基の使用量は、通常、化合物（ＩＩＩ）もしくは化合物（Ｖ）１モルに対し１〜５当量、好ましくは１〜３当量である。化合物（ＩＩＩ）もしくは（Ｖ）をそれらの反応性誘導体の形で使用する場合、その使用量は化合物（ＩＶ）もしくは化合物（ＶＩ）１モルに対して０．１〜３当量、好ましくは０．３〜１当量である。
【００２２】
このようにして得られた化合物中のＲおよび／またはＲ’が水素原子以外の保護基である場合、その保護基に応じた、それ自体公知の適宜の反応条件（例、酸、アルカリによる加水分解、パラジウム炭素を触媒とする接触還元等）を用いて脱保護することにより、目的の化合物（ＩＩ）を得ることができる。目的化合物（ＩＩ）は、例えば溶媒抽出、クロマトグラフィー、再結晶などを行うことにより単離精製することができる。
【００２３】
原料化合物（Ｖ）を化合物（ＩＩＩ）と化合物（ＩＶ）から製造する場合も、原則的に上記した縮合反応および脱保護反応と全く同様にして実施できる。
【００２４】
また、原料化合物（ＩＩＩ）あるいは（Ｖ）は、不斉炭素を有するので2種の光学異性体［（Ｒ）体および（Ｓ）体］が存在する。したがって、用いる化合物（ＩＩＩ）あるいは化合物（Ｖ）の光学異性体の違いにより、目的物（ＩＩ）はそれぞれがジアステレオマーの関係にある２種の異性体、［（Ｒ）−（Ｓ）］体または［（Ｓ）−（Ｓ）］体として得ることができ、あるいは化合物（ＩＩＩ）あるいは（Ｖ）のラセミ体を用いれば、目的物（ＩＩ）を該ジアステレオマーの混合物、［（ＲＳ）−（Ｓ）］体として得ることができる。また、目的物（ＩＩ）のジアステレオマー混合物は必要によりそれぞれのジアステレオマーとして分離精製することもできる。本発明の目的物（ＩＩ）はこれらの各ジアステレオマーおよびそれらの混合物のいずれも包含するものであるが、光学的に純粋な［（Ｒ）−（Ｓ）］体または［（Ｓ）−（Ｓ）］体が好ましい。
【００２５】
上記のようにして得られる化合物（ＩＩ）は、必要により、その薬理的に許容し得る塩、エステルもしくはアミドとすることができる。塩形成反応、エステル化反応、アミド化反応はこの技術分野で採用されている常法に従って実施することができる。また、エステルは前記方法１または方法２における合成中間体としても得られる。
【００２６】
上記のようにして得られる本発明の目的化合物（ＩＩ）またはその薬理的に許容し得る塩、エステルまたはアミドは、優れた抗酸化活性を有し、カルノシナーゼあるいは他のプロテアーゼによる分解にも抵抗するので、経口的あるいは非経口的に投与したとき、ヒトあるいはその他の哺乳動物の生体内で分解され難く、安定した抗酸化剤として作用する。したがって、活性酸素種によって引き起こされるさまざまな疾病、例えば動脈硬化、心筋梗塞、狭心症、脳梗塞、くも膜下出血などの虚血性疾患の予防や治療に用いることができるほか、活性酸素種が深くかかわって起こるさまざまな老化現象に対する抗老化（アンチエージング）効果が期待できる。また、目的化合物（ＩＩ）は皮膚の老化を予防あるいは遅延させ、紫外線防御作用を有するので、化粧品に配合して皮膚用化粧品として使用することができる。
【００２７】
本発明の目的化合物を医薬として用いる場合、医薬の剤型としては、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤などの経口投与用製剤、あるいは注射剤、座剤などの非経口投与用製剤が挙げられる。これらの製剤は、賦形剤（例えば、乳糖、白糖、ブドウ糖、マンニトール、ソルビトール、トウモロコシデンプン、バレイショデンプン、結晶性セルロース、アラビアゴム、デキストラン、プルラン、軽質無水珪酸、合成珪酸アルミニウム、炭酸カルシウム、燐酸水素カルシウムなど）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、コロイドシリカなど）、結合剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、マクロゴールなど）、崩壊剤（例えば、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルスターチ、カルボキシメチルスターチナトリウム、架橋ポリビニルピロリドンなど）、安定剤（例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン、ベンジルアルコールなど）、矯味矯臭剤（例えば、通常使用される甘味料、酸味料、香料など）、希釈剤などの添加剤を用いて周知の方法で製造される。目的化合物の投与量は、疾患の種類、症状、年齢、投与方法などによって異なるが、例えば、経口投与に場合には、０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ／日、特に０．５〜２０ｍｇ／ｋｇ／日が好ましい。また、静脈注射の場合には、０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇ／日、特に０．１〜２ｍｇ／ｋｇ／日が好ましい。
【００２８】
また、本発明の目的化合物を化粧品として用いる場合、化粧品の剤形は軟膏、クリーム、乳液、ローション、油状、ゲル状など、皮膚に塗布するのに適した剤形であれば任意であるが、軟膏の形が好ましい。軟膏は、公知の軟膏基剤を使用し、公知の方法に従って調製することができる。基剤の例は、例えば、白色ワセリン、黄色ワセリン、吸水ワセリン、マクロゴール、パラフィン、流動パラフィン、プラスチベース、シリコーン、牛脂、ロウ、ラノリン、植物油、ヒドロキシプロピルセルロースなどが挙げられる。製剤は慣用の化粧料添加剤、例えば香料を含むことができる。目的化合物の化粧品中への配合量は特に限定されないが、通常、０．０１〜５ｗ／ｗ％、特に０．１〜２ｗ／ｗ％が好ましい。
【００２９】
以下に参考例、実施例をあげて本発明をより詳細に説明するが、これが発明を限定するものではない。なお、本明細書において、「アルキル基」とは、炭素数１〜６のアルキル基が好ましく、アルコキシ基としては炭素数１〜６のアルコキシ基が好ましく、脂肪族アシル基としては、炭素数１〜６の脂肪族アシル基が好ましい。また、本発明の目的化合物（ＩＩ）などに含まれるクロマン骨格は、“３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾピラン”とも命名される。
【実施例】
【００３０】
（参考例１）Ｌ−カルノシンベンジルエステル・２（ｐ−トルエンスルホン酸）塩
Ｌ−カルノシン（原料化合物（Ｉ））（２２．６ｇ，０．１ｍｏｌ）及びｐ−トルエンスルホン酸・１水和物（以下、ＴｓＯＨ・Ｈ２Ｏと略記）（３９．９ｇ，０．２１ｍｏｌ）を水（１００ｍｌ）に溶解後、減圧下に水を留去した。残留物に、ＴｓＯＨ・Ｈ２Ｏ（５．０ｇ，０．０２６ｍｏｌ）及びベンジルアルコール（７５ｍｌ）を添加して溶解後、さらにクロロホルム（８０ｍｌ）を添加して、生成する水を共沸条件下にモレキュラーシーブス−４Ａで除きながら、薄層クロマトグラフィー（以下、ＴＬＣと略記）にて原料化合物（Ｉ）のスポットが消失するまで１２時間加熱還流した。
クロロホルムを減圧下に留去し、残留物に酢酸エチル（以下、ＡｃＯＥｔと略記）（３００ｍｌ）を添加して残渣油状物質を洗浄した。さらに、この油状物質を約３０℃に加温してＡｃＯＥｔ（４ｘ３００ｍｌ）で洗浄した後、減圧下に乾燥すると標題化合物（５２．５ｇ，７９．７％）がアモルファス状物質として得られた。
１Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ ２．３０（６Ｈ，ｓ），２．４５−２．５６（２Ｈ，ｍ），２．８８−３．２３（４Ｈ，ｍ），４．６０−４．７４（１Ｈ，ｍ），５．１２（２Ｈ，ｓ），７．０８−７．１６（４Ｈ，ｂｒ ｄ），７．２８−７．５３（１０Ｈ，ｍ），７．６８（３Ｈ，ｂｒ ｓ），８．９９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．２Ｈｚ）．
【００３１】
（参考例２）Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−カルノシンベンジルエステル
Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−β−アラニン（１．５ｇ，７．９２ｍｍｏｌ）及びＬ−ヒスチジンベンジルエステル・２（ｐ−トルエンスルホン酸）塩（７．０２ｇ，１１．９ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（以下、ＤＭＦと略記）（２０ｍｌ）溶液に、氷冷下Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（以下、ＤＩＥＡと略記）（３．０７ｇ，２３．８ｍｍｏｌ）、続いて１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（１．６７ｇ，８．７２ｍｍｏｌ）を加えた後、室温にて７２時間撹拌した。反応液をＡｃＯＥｔ（４０ｍｌ）で希釈し、これを水（１ｘ４０ｍｌ，２ｘ１０ｍｌ）及び飽和食塩水（２０ｍｌ）で洗浄した。水層をさらにＡｃＯＥｔ（２ｘ１５ｍｌ）で抽出後、全有機層を乾燥（ＭｇＳＯ４）し、溶媒を留去した。油状残留物を、ヘキサン／酢酸エチル（１：１）、続いてクロロホルム／メタノール（１５：１）を溶媒としてシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて分離精製したところ、標題化合物（３．１４ｇ，９５％）が無色アモルファス状物質として得られた。
１Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ １．４３（９Ｈ，ｓ），２．４２（２Ｈ，ｂｒ ｄｄ），３．０６（１Ｈ，ｄ ｏｆ ａ ｐａｉｒ ｏｆ ＡＢｑ，ＪＡＢ＝１５．６Ｈｚ，ＪＡＸ＝４．９Ｈｚ），３．１２（１Ｈ，ｄ ｏｆ ａ ｐａｉｒ ｏｆ ＡＢｑ，ＪＡＢ＝１５．６Ｈｚ，ＪＢＸ＝４．９Ｈｚ），３．３４−３．４９（２Ｈ，ｍ），４．８４（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝７．５，４．９Ｈｚ），５．０８および５．１７（１Ｈ ｅａｃｈ，ＡＢｑ，Ｊ＝１２．２Ｈｚ），５．５９（２Ｈ，ｂｒ ｔ），６．５３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．１Ｈｚ），７．２２（１Ｈ，ｂｒ ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），７．２５−７．４０（５Ｈ，ｍ），７．５０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．１Ｈｚ）．
【００３２】
（参考例３）Ｌ−カルノシンベンジルエステル・２塩酸塩
Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−カルノシンベンジルエステル（１．００ｇ，２．４０ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（５ｍｌ）溶液に４Ｎ塩化水素‐ＡｃＯＥｔ溶液（３ｍｌ）を室温にて滴下した後、同温にて１０分間撹拌した。反応液を減圧下に濃縮すると、Ｌ−カルノシンベンジルエステル・２塩酸塩（９４０ｍｇ，定量的）が得られた。
１Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）：δ ２．６９（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ），３．１０−３．３８（４Ｈ，ｍ），４．７３−４．９４（１Ｈ，ｍ），５．１５および５．２２（１Ｈ ｅａｃｈ，ＡＢｑ，Ｊ＝１２．１Ｈｚ），７．２７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．３Ｈｚ），７．３０−７．４４（５Ｈ，ｍ），８．７８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．３Ｈｚ）．
【００３３】
（参考例４）（±）−６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボニル−β−アラニン（化合物（Ｖ），Ｒ’＝Ｈ）
（±）−６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸（化合物（ＩＩＩ），Ｒ’＝Ｈ）（１．００ｇ，３．９９ｍｍｏｌ）及びβ−アラニンエチルエステル・塩酸塩（７３６ｍｇ，４．７９ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１０ｍｌ）溶液に、ＤＩＥＡ（２．０７ｇ，１６．０ｍｍｏｌ）、続いてベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリス（ピロリジノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（以下、ＰｙＢＯＰと略記）（２．０８ｇ，３．９９ｍｍｏｌ）を添加した。その後、反応液を室温にて一晩撹拌した。ＴＬＣにより原料（化合物（ＩＩＩ），Ｒ’＝Ｈ）が消失していることを確認した。反応液をＡｃＯＥｔ（３０ｍｌ）にて希釈した後、これを１ＮＨＣｌ（２ｘ２０ｍｌ）、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（１ｘ１５ｍｌ）及び飽和食塩水（２０ｍｌ）で洗浄後、乾燥（ＭｇＳＯ４）した。溶媒を留去した後、粗生成物をヘキサン／酢酸エチル（３：１）を溶媒としてシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製すると、標題化合物のエチルエステル（１．４２ｇ，定量的）が黄白色アモルファス状物質として得られた。
１Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ １．２１（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ），１．４９（３Ｈ，ｓ），１．８８（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝１３．５，８．１，６．６Ｈｚ），２．０９（３Ｈ，ｓ），２．１８（６Ｈ，ｓ），２．２４−２．７２（５Ｈ，ｍ），３．４９（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．１Ｈｚ），４．０５および４．０６（ｔｏｔａｌ ２Ｈ，ｂｏｔｈ ｑ，Ｊ＝７．１Ｈｚ），４．５０（１Ｈ，ｓ），７．０５（１Ｈ，ｂｒ ｔ，Ｊ＝６．１Ｈｚ）．
【００３４】
本エチルエステル（１．４０ｇ，３．９９ｍｍｏｌ）のメタノール（１０ｍｌ）溶液に水酸化リチウム・１水和物（０．５０ｇ，１２．０ｍｍｏｌ）の水（４ｍｌ）溶液を滴下後、２時間還流した。メタノールを減圧留去した後、残留液の液性を１Ｎ塩酸にてｐＨ１に調整した。析出した結晶をＡｃＯＥｔ（１ｘ５０ｍｌ，２ｘ１０ｍｌ）で抽出し、有機層を乾燥（ＭｇＳＯ４）した後、溶媒を留去すると標題化合物（１．２４ｇ，９６．５％）が白色アモルファス状物質として得られた。
１Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）：δ １．４５（３Ｈ，ｓ），１．８２（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝１３．４，８．６，６．４Ｈｚ），２．０６（３Ｈ，ｓ），２．１４（６Ｈ，ｓ），２．２１−２．７１（５Ｈ，ｍ），３．３４−３．４７（２Ｈ，ｍ），７．５０（１Ｈ，ｂｒ ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ）．
【００３５】
（実施例１）
１）Ｎ−［（２ＲＳ）−６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボニル］−Ｌ−カルノシンベンジルエステル（Ｒ：Ｓ＝１：１混合物）
Ａ法：Ｌ−カルノシンベンジルエステル・２（ｐ−トルエンスルホン酸）塩（０．８６ｇ，１．３ｍｍｏｌ）のピリジン（５ｍｌ）溶液に室温にて（±）−６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸（２５０ｍｇ，１．０ｍｍｏｌ）を添加後、５−１０℃にて１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（２８０ｍｇ，１．４６ｍｍｏｌ）を加え、反応液を室温にて６時間撹拌した。ピリジンを減圧下に留去後、残留物をＡｃＯＥｔ（２０ｍｌ）に溶解し、飽和食塩水（２ｘ２０ｍｌ）で洗浄後、乾燥（ＭｇＳＯ４）した。溶媒を減圧下に留去後、残留物をヘキサン／酢酸エチル（１：１）、続いてクロロホルム／メタノール（１０：１）を溶媒としてシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製すると、標題化合物（２６０ｍｇ，５６．８％）が粘性油状物質として得られた。
１Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ １．４８および１．５１（ｔｏｔａｌ ３Ｈ，ｂｏｔｈ ｓ），１．７０−２．７０（６Ｈ，ｍ），２．０７および２．０８（ｔｏｔａｌ ３Ｈ，ｂｏｔｈ ｓ），２．１４および２．１７（ｔｏｔａｌ ６Ｈ，ｂｏｔｈ ｓ），２．８０−３．１０（２Ｈ，ｍ），３．２０−３．６７（２Ｈ，ｍ），４．３８（０．５Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝６．８，６．１Ｈｚ），４．７３（０．５Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝７．５，５．７Ｈｚ），５．０３および５．０９（１Ｈ ｅａｃｈ，ＡＢｑ，Ｊ＝１２．３Ｈｚ），６．４６（０．５Ｈ，ｂｒ ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），６．５３（０．５Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．０Ｈｚ），６．５７（０．５Ｈ，ｄ，Ｊ＝０．９Ｈｚ），７．１０−７．４０（６．５Ｈ，ｍ），７．４５（０．５Ｈ，ｄ，Ｊ＝０．９Ｈｚ），７．４９（０．５Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．０Ｈｚ）．
【００３６】
Ｂ法：（±）−６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボニル−β−アラニン（化合物（Ｖ），Ｒ’＝Ｈ）（６００ｍｇ，１．８７ｍｍｏｌ）及びＬ−ヒスチジンベンジルエステル・２（ｐ−トルエンスルホン酸）塩（３．３０ｇ，５．６０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１０ｍｌ）溶液に、室温にて、ＤＩＥＡ（１．２１ｇ，９．３４ｍｍｏｌ）、続いて１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（３９４ｍｇ，２．０５ｍｍｏｌ）を加えた後、同温にて９６時間撹拌した。反応液をＡｃＯＥｔ（４０ｍｌ）で希釈し、これを水（１ｘ２０ｍｌ，４ｘ１０ｍｌ）及び飽和食塩水（１５ｍｌ）で洗浄した後、乾燥（ＭｇＳＯ４）し、溶媒を留去した。油状残留物をヘキサン／酢酸エチル（１：１）、続いてクロロホルム／メタノール（１０：１）を溶媒としてシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて分離精製すると、標題化合物（８６９ｍｇ，８５％）が粘性油状物質として得られた。
【００３７】
２）Ｎ−［（２ＲＳ）−６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボニル］−Ｌ−カルノシン・・・化合物（１）
Ｎ−［（２ＲＳ）−６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボニル］−Ｌ−カルノシンベンジルエステル（Ｒ：Ｓ＝１：１混合物）（８９５ｍｇ，１．６３ｍｍｏｌ）のメタノール（８ｍｌ）溶液に１０％パラジウム炭素（水分含量：５２．７％）（２００ｍｇ）を加え、常温、常圧で接触還元した。触媒をろ去した後、溶媒を留去すると、微黄色粘性油状物質が得られた。これをメタノール／クロロホルム（１：３）に溶解後、ＡｃＯＥｔを徐々に加えて生成物を晶出させた後、上澄液を除去した（本操作を３回繰り返した）。溶媒を留去後、油状残留物をメタノール（１．５ｍｌ）に溶解し、リグロイン（沸点範囲８０〜１１０℃，４〜５ｍｌ）を徐々に加えて懸濁液とした。その後、溶媒を減圧下に留去し、さらに真空乾燥すると、標題化合物（６１７ｍｇ，８２％）が微黄白色アモルファス状物質として得られた。
１Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）：δ １．４３６および１．４４４（ｔｏｔａｌ ３Ｈ，ｂｏｔｈ ｓ），１．７５−１．９０（１Ｈ，ｍ），２．０５（３Ｈ，ｓ），２．１３（３Ｈ，ｓ），２．１４（３Ｈ，ｓ），２．１０−２．７０（５Ｈ，ｍ），２．９９−３．５２（４Ｈ，ｍ），４．６４−４．７２（１Ｈ，ｍ），７．２９（０．５Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．３Ｈｚ），７．３０（０．５Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．３Ｈｚ），７．５９（０．５Ｈ，ｂｒ ｔ），７．９０（０．５Ｈ，ｓ），８．７４（０．５Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．３Ｈｚ），８．８１（０．５Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．３Ｈｚ）．
エレクトロスプレーイオン化法質量分析
陽イオンモード：
観測値（Ｍ＋Ｈ）＋：４５９．１ ｆｏｒ Ｃ２３Ｈ３１Ｎ４Ｏ６
計算値：４５９．２ ｆｏｒ ｉｓｏｔｏｐｅ ｍｏｄｅｌ ＭＨ；
陰イオンモード：
観測値（Ｍ−Ｈ）−：４５７．１ ｆｏｒ Ｃ２３Ｈ２９Ｎ４Ｏ６
計算値：４５７．２ ｆｏｒ ｉｓｏｔｏｐｅ ｍｏｄｅｌ（Ｍ−Ｈ）．
ＨＰＬＣ分析（下記）の結果、化合物（１）は２種のジアステレオマー混合物（１：１）であった。
【数１】
【００３８】
（実施例２）
１）Ｎ−［（２Ｒ）−６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボニル］−Ｌ−カルノシンベンジルエステル
Ｌ−カルノシンベンジルエステル・２塩酸塩（１．１２ｇ，２．８８ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（３ｍｌ）溶液に室温にて（２Ｒ）−６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸（７２１ｍｇ，２．８８ｍｍｏｌ）及びジクロロメタン（３ｍｌ）を加えて溶解し、続いてＤＩＥＡ（１．１２ｇ，８．６４ｍｍｏｌ）、ＰｙＢＯＰ（１．５０ｇ，２．８８ｍｍｏｌ）を加えた後、反応液を室温にて７２時間撹拌した。大部分のジクロロメタンを減圧留去後、残留物をＡｃＯＥｔ（４０ｍｌ）に溶解し、これを水（１ｘ３０ｍｌ，３ｘ１０ｍｌ）及び飽和食塩水（２０ｍｌ）で洗浄した（水層のｐＨ：５．５）。水層をさらにＡｃＯＥｔ（２ｘ１０ｍｌ）で抽出した後、全有機層を乾燥（ＭｇＳＯ４）し、濃縮した。油状残留物をクロロホルム、続いてクロロホルム／メタノール（１５：１）を溶媒としてシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて分離精製すると標題化合物（１．５８ｇ，定量的）が白色アモルファス状物質として得られた。
１Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ １．５０（３Ｈ，ｓ），１．６９−１．８８（１Ｈ，ｍ），２．０５−２．６７（５Ｈ，ｍ），２．０７（３Ｈ，ｓ），２．１５（６Ｈ，ｓ），２．９０および２．９７（１Ｈ ｅａｃｈ，ＡＢＸ ｓｙｓｔｅｍ，ＪＡＢ＝１５．６Ｈｚ，ＪＡＸ＝６．１Ｈｚ），３．２１−３．３８（１Ｈ，ｍ），３．４９−３．６７（１Ｈ，ｍ），４．４６（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝６．８，６．１Ｈｚ），５．０４および５．１０（１Ｈ ｅａｃｈ，ＡＢｑ，Ｊ＝１２．３Ｈｚ），６．３３（２Ｈ，ｂｒ），６．４９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．０Ｈｚ），６．５４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），７．１６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．０，５．２Ｈｚ），７．２２−７．３７（５Ｈ，ｍ），７．４９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．０Ｈｚ）．
【００３９】
２）Ｎ−［（２Ｒ）−６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボニル］−Ｌ−カルノシン・・・化合物（２）
Ｎ−［（２Ｒ）−６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボニル］−Ｌ−カルノシンベンジルエステル（７００ｍｇ，１．２７ｍｍｏｌ）のメタノール（３ｍｌ）溶液に１０％パラジウム炭素（水分含量：５２．７％）（１００ｍｇ）を加えて、常温、常圧で接触還元した。その後、触媒をろ去し、ろ液を減圧下に濃縮すると黄白色アモルファスが得られた。これにＡｃＯＥｔ（５ｍｌ）を加えて撹拌した後、上澄液を除いた。さらにクロロホルム（３ｍｌ）を加えて同様に洗浄した。残渣をメタノールに溶解した後、減圧下に濃縮し、続いて真空乾燥すると、標題化合物（５６４ｍｇ，９７％）が黄白色アモルファス状物質として得られた。
１Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）：δ １．４４（３Ｈ，ｓ），１．８１（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝１３．４，８．２，６．２Ｈｚ，），２．０５（３Ｈ，ｓ），２．１３（３Ｈ，ｓ），２．１４（３Ｈ，ｓ），２．１７−２．７０（５Ｈ，ｍ），３．０６（１Ｈ，ＡＢＸ ｓｙｓｔｅｍ，ＪＡＢ＝１５．３Ｈｚ，ＪＡＸ＝７．８Ｈｚ），３．２０（１Ｈ，ＡＢＸ ｓｙｓｔｅｍ，ＪＡＢ＝１５．３Ｈｚ，ＪＢＸ＝５．６Ｈｚ），３．３０−３．４８（２Ｈ，ｍ），４．６６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．８，５．６Ｈｚ），７．２７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．５Ｈｚ），８．７０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．５Ｈｚ）．
１３Ｃ−ＮＭＲ（５０．３ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）：δ １２．０，１２．４，１３．０，２１．６，２４．７，２８．２，３１．０，３６．０，３６．６，５２．９，７９．１，１１８．５，１１８．６，１２２．２，１２３．３，１２４．９，１３１．５，１３５．０，１４５．７，１４７．３，１７３．４，１７３．８，１７７．１．
エレクトロスプレーイオン化法質量分析
陽イオンモード：
観測値（Ｍ＋Ｈ）＋：４５９．１ ｆｏｒ Ｃ２３Ｈ３１Ｎ４Ｏ６
計算値：４５９．２ ｆｏｒ ｉｓｏｔｏｐｅ ｍｏｄｅｌ ＭＨ；
陰イオンモード：
観測値（Ｍ−Ｈ）−：４５７．１ ｆｏｒ Ｃ２３Ｈ２９Ｎ４Ｏ６
計算値：４５７．２ ｆｏｒ ｉｓｏｔｏｐｅ ｍｏｄｅｌ（Ｍ−Ｈ）．
【００４０】
（実施例３）
１）Ｎ−［（２Ｓ）−６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボニル］−Ｌ−カルノシンベンジルエステル
カルノシンベンジルエステル・２塩酸塩（９４０ｍｇ，２．４０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（３ｍｌ）溶液に室温にて（Ｓ）−６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸（６０１ｍｇ，２．４０ｍｍｏｌ）及びジクロロメタン（３ｍｌ）を加えて溶解し、続いてＤＩＥＡ（９３１ｍｇ，７．２０ｍｍｏｌ）、ＰｙＢＯＰ（１．２５ｇ，２．４０ｍｍｏｌ）を加えた後、反応液を室温にて７２時間撹拌した。大部分のジクロロメタンを減圧留去後、反応混合物をＡｃＯＥｔ（４０ｍｌ）にて希釈して、これを水（１ｘ３０ｍｌ，３ｘ１０ｍｌ）及び飽和食塩水（２０ｍｌ）で洗浄した（水層のｐＨ：５．５）。水層をさらにＡｃＯＥｔ（３ｘ１０ｍｌ）で抽出した後、全有機層を乾燥（ＭｇＳＯ４）後、濃縮した。油状残留物をクロロホルム、続いてクロロホルム／メタノール（１５：１）を溶媒としてシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて分離精製すると標題化合物（１．０８ｇ，８１％）が白色アモルファス状物質として得られた。
１Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ １．４７（３Ｈ，ｓ），１．７７−１．９４（１Ｈ，ｍ），２．０６（３Ｈ，ｓ），２．１３（６Ｈ，ｓ），２．１８−２．６８（５Ｈ，ｍ），２．９９および３．０５（１Ｈ ｅａｃｈ，ＡＢＸ ｓｙｓｔｅｍ，ＪＡＢ＝１５．６Ｈｚ，ＪＡＸ＝５．７Ｈｚ），３．３７−３．５６（２Ｈ，ｍ），４．７３（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝７．５，５．７Ｈｚ），５．０３および５．０９（１Ｈ ｅａｃｈ，ＡＢｑ，Ｊ＝１２．３Ｈｚ），５．９０（２Ｈ，ｂｒ），６．５５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝０．９Ｈｚ），７．１１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），７．１８−７．３５（６Ｈ，ｍ），７．４７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝０．９Ｈｚ）．
【００４１】
２）Ｎ−［（２Ｓ）−６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボニル］−Ｌ−カルノシン・・・化合物（３）
Ｎ−［（２Ｓ）−６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボニル］−Ｌ−カルノシンベンジルエステル（６００ｍｇ，１．０９ｍｍｏｌ）のメタノール（３ｍｌ）溶液に１０％パラジウム炭素（水分含量：５２．７％）（８０ｍｇ）を加えて、アスピレーターによる減圧脱気及び反応フラスコ内の水素ガス置換操作を５回繰り返した後、水素雰囲気下（風船使用）に５時間激しく撹拌した。その後、Ｐｄ触媒をろ去し、ろ液を減圧下に濃縮すると黄白色アモルファスが得られた。これにＡｃＯＥｔ（５ｍｌ）を加えて撹拌した後、上澄液を除いた。さらにクロロホルム（３ｍｌ）を加えて同様に洗浄した。このアモルファス残渣をメタノールに溶解した後、減圧下に濃縮し、続いて真空乾燥すると、標題化合物（４９８ｍｇ，定量的）が黄白色アモルファス状物質として得られた。
１Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）：δ １．４３（３Ｈ，ｓ），１．７９（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝１３．４，８．２，６．４Ｈｚ，），２．０４（３Ｈ，ｓ），２．１２（３Ｈ，ｓ），２．１３（３Ｈ，），２．１８−２．６８（５Ｈ，ｍ），３．０２（１Ｈ，ＡＢＸ ｓｙｓｔｅｍ，ＪＡＢ＝１５．３Ｈｚ，ＪＡＸ＝７．０Ｈｚ），３．１６（１Ｈ，ＡＢＸ ｓｙｓｔｅｍ，ＪＡＢ＝１５．３Ｈｚ，ＪＢＸ＝５．３Ｈｚ），３．３３−３．４６（２Ｈ，ｍ），４．４６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．０，５．３Ｈｚ），７．１６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．１Ｈｚ），８．４７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．１Ｈｚ）．
１３Ｃ−ＮＭＲ（５０．３ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）：δ １２．０，１２．４，１３．０，２１．６，２４．８，２９．５，３１．０，３６．２，３６．７，５４．９，７９．１，１１８．３，１１８．６，１２２．３，１２３．２，１２５．０，１３２．８，１３４．９，１４５．７，１４７．３，１７３．３，１７６．１，１７７．０．
エレクトロスプレーイオン化法質量分析
陽イオンモード：
観測値（Ｍ＋Ｈ）＋：４５９．１ ｆｏｒ Ｃ２３Ｈ３１Ｎ４Ｏ６
計算値：４５９．２ ｆｏｒ ｉｓｏｔｏｐｅ ｍｏｄｅｌ ＭＨ；
陰イオンモード：
観測値（Ｍ−Ｈ）−：４５７．１ ｆｏｒ Ｃ２３Ｈ２９Ｎ４Ｏ６
計算値：４５７．２ ｆｏｒ ｉｓｏｔｏｐｅ ｍｏｄｅｌ（Ｍ−Ｈ）．
【００４２】
（実施例４）抗酸化作用（ＤＰＰＨテスト）
K. Schlesierらの方法（Free Radical Research, Vol.36, 177-187, 2002）に従い、化合物（１）、（２）、（３）の０．０２５ｍＭ〜０．１５０ｍＭ濃度における２，２−ジフェニル−１−ピクリルヒドラジルラジカル（ＤＰＰＨ）の消去作用を調べた。その結果は、下記表１の通りである。
表１から明らかなように、本発明の化合物はいずれも濃度依存的にＤＰＰＨの消去作用を示したが、Ｌ−カルノシンは高濃度でもそのような作用を殆ど示さなかった。
【００４３】
【表１】
【００４４】
（実施例５）リポ蛋白の酸化抑制作用（ＭＤＡテスト）
１０５ｍＭ−ＫＯＨ、２０ｍＭ−リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）を含む水溶液０．５ｍｌにヒト血漿５０μｌ及び被験化合物の水溶液５−２５μｌを加えて下記表２に示す最終濃度に調整した。次いで、新たに調整した１００ｍＭ−ＦｅＳＯ４溶液２０μｌを加え、３７℃で６０分間インキュベーションした。その５０μｌをとり、脂質の過酸化によって生じるマロンアルデヒド（ＭＤＡ）をチオバルビタール酸反応性物質（ＴＢＲＡＳ）として定量し、コントロールに対する％で示した。結果は、下記表２の通りである。
表２から明らかなように、本発明の化合物（１）、（２）および（３）は、Ｌ−カルノシンよりも強いリポ蛋白酸化抑制作用を示した。
【００４５】
【表２】
【００４６】
（実施例６）加水分解酵素に対する抵抗性
ヒト血清２００μｌを８００μｌの１２５ｍＭ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）、３００μｌの５ｍＭ−ＣｄＣｌ２／３０ｍＭ−クエン酸ナトリウム水溶液、３００μｌの水の混合物に加え、３７℃で３０分間インキュベーションした後、４００μｌの５０ｍＭ−試験サンプル水溶液（０．０５Ｍ−ＮａＯＨでｐＨ＝８．５に調整）を加え、最終的に１０ｍＭ溶液とした。これを０分（インキュベーション前）、インキュベーション開始１０、２０、３０、６０、９０、及び１８０分後にそれぞれの１００μｌをとり、ＨＰＬＣを用いて化合物残存量を測定した。結果は、下記表３の通りである。なお、表中、０分を１００としたときの被験化合物の残存率を示す。また、Ｌ−カルノシンは２人のドナー１、２から得た血清での平均値、化合物（２）および（３）はドナー別の数値で示した。
表３から明らかなように、Ｌ−カルノシンは比較的速やかに加水分解されたが、本発明化合物（２）および（３）は、９０分、１８０分後でも殆ど分解されず安定であった。
【００４７】
【表３】
【００４８】
（実施例７）紫外線防御作用
化合物（２）、化合物（３）の紫外線防御作用を測定し、対照化合物Ｌ−カルノシン及び２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−メチルフェノール（ＢＨＴ）と比較した。
健康なボランティアーの脊椎に対して対称な２箇所（それぞれ直径２５ｍｍの円）を選び、一方には被験化合物の０．３％溶液を塗布し、他方をコントロールとした。両方にＨＢ ４００ＵＶバルブ（Ｐｈｉｌｉｐｓ）で１分間紫外線照射し、照射前と照射２４時間後の局所における紅斑の強さＩ０、Ｉ２４をセンサーＭｅｘａｍｅｔｅｒ（Courage & Kazaka Electronics, Germany）を用いて測定し、その差ΔＩを求めた。紅斑の度合いKを次の計算式を用いて求めた。
【数２】
結果は表４の通りである。なお、表中、紅斑の度合いＫの値はコントロールを１００としたときの値を示す。
表４から明らかなように、本発明化合物はＬ−カルノシン、ＢＨＴよりも優れた紫外線防御作用を示し、特に化合物（３）の作用は最も顕著で、既知の紫外線防御剤であるＢＨＴより有意に優れていた。
【００４９】
【表４】
【００５０】
（実施例８）皮膚上皮の保湿作用と弾力性に及ぼす効果
健常人の前腕部近辺に直径２５ｍｍのテストエリアを設定し共鳴器を設置した。ここに被験化合物の０．３％溶液を５０μｌ／ｃｍ２の割合で塗布し、塗布前と塗布５分後の皮膚共鳴周波数Ｑをそれぞれ測定し、それぞれの差ΔＱを求めた。ΔＱが大きいほど、皮膚上皮が膨潤し弾力を増すことを示す。各化合物のΔＱ間の有意差検定はコンピュータープログラム“Ｂｉｏｓｔａｔｉｓｔｉｃａ”を用いて行った。結果は、下記表５の通りである。
【００５１】
【表５】
【００５２】
結果及び考察
Ｌ−カルノシンは水と差がなく、むしろ保湿作用は弱い傾向が認められたが、これはＬ−カルノシンが何らかの形で水分子と相互作用をし、水単独の場合よりも皮膚の水分含量をやや低下させるためと考えられる。しかしながら本発明化合物（３）は水よりも強力な保湿効果を示したので、化合物（３）はＬ−カルノシン水溶液や水単独の場合よりも皮膚の弾力性を増加させることが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明に係るＬ−カルノシン誘導体（ＩＩ）、またはその薬理的に許容し得る塩、エステルもしくはアミドは、天然Ｌ−カルノシンより強力な抗酸化活性を有し、カルノシナーゼなどのプロテアーゼによる加水分解に抵抗するので、経口的あるいは非経口的に投与したときに生体の各種組織内で安定に存在することができ、ヒトあるいはその他の哺乳動物の組織、皮膚などの活性酸素種による障害の予防・治療にとって有用である。したがって、本発明の目的化合物は、例えば動脈硬化、心筋梗塞、脳梗塞、くも膜下出血などの虚血性疾患の予防や治療に用いることができ、抗老化（アンチエージング）効果が期待できるほか、紫外線防御作用や皮膚の保水性や弾力性を高めるなどの効果を有するので、皮膚の健康を増進する化粧品としても有用である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（ＩＩ）：
【化１】
で示されるＬ−カルノシン誘導体、またはその薬理的に許容し得る塩、エステルもしくはアミド。
【請求項２】
Ｌ−カルノシン誘導体（ＩＩ）が、Ｎ−［（２ＲＳ）−６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボニル］−Ｌ−カルノシンである請求項１記載の化合物。
【請求項３】
Ｌ−カルノシン誘導体（ＩＩ）が、Ｎ−［（２Ｒ）−６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボニル］−Ｌ−カルノシンである請求項１記載の化合物。
【請求項４】
Ｌ−カルノシン誘導体（ＩＩ）が、Ｎ−［（２Ｓ）−６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボニル］−Ｌ−カルノシンである請求項１記載の化合物。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の化合物を含有する医薬。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれかに記載の化合物を含有する化粧品。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれかに記載の化合物を含有する抗酸化剤。
【請求項１】
式（ＩＩ）：
【化１】
で示されるＬ−カルノシン誘導体、またはその薬理的に許容し得る塩、エステルもしくはアミド。
【請求項２】
Ｌ−カルノシン誘導体（ＩＩ）が、Ｎ−［（２ＲＳ）−６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボニル］−Ｌ−カルノシンである請求項１記載の化合物。
【請求項３】
Ｌ−カルノシン誘導体（ＩＩ）が、Ｎ−［（２Ｒ）−６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボニル］−Ｌ−カルノシンである請求項１記載の化合物。
【請求項４】
Ｌ−カルノシン誘導体（ＩＩ）が、Ｎ−［（２Ｓ）−６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボニル］−Ｌ−カルノシンである請求項１記載の化合物。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の化合物を含有する医薬。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれかに記載の化合物を含有する化粧品。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれかに記載の化合物を含有する抗酸化剤。
【公開番号】特開２００８−１９１８８（Ｐ２００８−１９１８８Ａ）
【公開日】平成２０年１月３１日（２００８．１．３１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−１９０７７６（Ｐ２００６−１９０７７６）
【出願日】平成１８年７月１１日（２００６．７．１１）
【出願人】（０００２３６５７３）浜理薬品工業株式会社 (18)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１月３１日（２００８．１．３１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年７月１１日（２００６．７．１１）
【出願人】（０００２３６５７３）浜理薬品工業株式会社 (18)
【Ｆターム（参考）】
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