本発明は、ヘビの毒素の分野に関するものであり、本発明は新規なヘビの毒素のタンパク質およびそれをコードする核酸を提供する。また、新規なヘビの毒素の発見に基づく、様々な使用方法および組成物も提供する。ここでは鎮静剤として使用される薬品の製造において、発明の新規なタンパク質、核酸分子、ベクターまたはホスト細胞の使用を提供する。更に、神経系または筋肉系の疾患治療に使用される医薬品の製造において、発明の新規なタンパク質、核酸分子、ベクターまたはホスト細胞の使用を提供する。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はヘビ毒の分野に関するものであり、発明は新規ヘビ毒素タンパク質およびそれをコードする核酸を提供する。また新規ヘビ毒素の発見に基づいた様々な方法および組成物も提供する。
【背景技術】
【０００２】
ヘビ毒は、酵素および非酵素タンパク質を含む生物活性化合物、ならびにペプチド、脂質、核酸、炭水化物、およびアミンを含む低分子成分の複合混合物である（１〜２）。毒液タンパク質は、一般的には複数の適用的な役割を果たしている：被食者の不動化、麻痺、殺滅、および消化（３）。従ってヘビ毒は、攻撃および防御両方の目的に役立つ（４）。過去４０年にわたって非常に多くの毒素タンパク質がヘビの毒液から単離され特徴付けられてきた（５）。しかしながらこれらの毒素タンパク質は極めて少数の構造学的スーパーファミリーのタンパク質に属している（６）。スーパーファミリーのメンバーは、類似した分子骨格を共有しているが、時に異なる生物学的機能を示す。
【０００３】
ヘビ毒に見出される主要な酵素群としては、ホスホリパーゼ、セリンプロテイナーゼ、メタロプロテイナーゼ、ホスホジエステラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ、およびヌクレアーゼが挙げられる（２、７）。一般的に、毒液内の酵素は１３，０００Ｄａ〜１５０，０００Ｄａの範囲の分子量を有する。これらの多くは加水分解酵素であり、消化的な役割を持っている。一方１０００を超える非酵素毒液タンパク質の特徴が調べられており、それらはスリーフィンガー毒素、セリンプロテイナーゼインヒビター、レクチン、サラファトキシン、神経成長因子、心房性ナトリウム利尿ペプチド、ブラジキニン−増強ペプチド、ヘルベプリン（ｈｅｌｖｅｐｒｉｎｓ）／ＣＲＩＳＰタンパク質、ジスインテグリン、およびワプリン（ｗａｐｒｉｎ）にグループ分けされている（６〜９）。非酵素ポリペプチド毒素は、約１，０００Ｄａから２５，０００Ｄａの分子量を有し、ジスルフィド結合に富んでいる。それゆえにそれらは頑丈であり、ひとたび単離されると比較的安定である。低分子化合物は、１，５００Ｄａ未満の分子量を有する。それらは生物学的には低活性であり、酵素の補助因子と推定されている（２）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
我々は、Ｏｐｈｉｏｐｈａｇｕｓ ｂａｎｎａｈ（キングコブラ）毒由来の新規タンパク質オハニン（Ｏｈａｎｉｎ）を同定、精製し、且つ完全なアミノ酸配列を決定した。それは１０７アミノ酸残基を含む、ＥＳＩ質量分析法で見積もった時に分子量１１９５１．４７±０．６７Ｄａの小型のタンパク質である。それはいかなる既知のヘビ毒タンパク質のファミリーとも類似性を示さず、従って新規のヘビ毒タンパク質ファミリーの最初のメンバーである。それはＲＲＹおよびＳＰＲＹドメイン（リアノジン受容体およびＤｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍにおける機能の分からないドメイン）ならびにＢ３０．２ドメインと類似性を示す。それは腹腔内投与した時、１０ｍｇ／ｋｇの用量まで非致死性である。１ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇの用量のオハニンが投与されたマウスは、動きが怠慢となり静かになった。これをうけて、赤外線センサーを用いてマウスの運動活性に対するその効果を調べた。オハニンは統計的有意且つ用量依存的な運動低下をマウスに起こした。ホットプレートアッセイでは、用量依存的は疼痛過敏作用を示した。
【０００５】
このタンパク質の反応誘発能力が腹腔内投与時に比べ脳室内注射時に、運動実験およびホットプレート実験の両方で大きく低下したことはオハニンが中枢神経系に働くことを強く示唆している。それはｉ．ｐ．（腹腔内）投与時に比べｉ．ｃ．ｖ．（脳室内投与）投与時に６，５００倍強力であった。毒液に含まれるこのタンパク質の元々の量は少ない（〜１ｍｇ／ｇ）ため、合成遺伝子が構築され、発現された。大腸菌の不溶性分画中に得られた組換え体タンパク質は、変性条件で精製されて折りたたみ直された。組換え体オハニンは、円偏光二色性およびホットプレートアッセイで決定したとき、構造的にも機能的にも未変性タンパク質に類似しており、今後の構造−機能相関研究にとってそれが有益であることが示唆された。
【０００６】
この新規タンパク質を更に特徴付けるために、我々はオハニンをコードするｃＤＮＡの配列を決定した。興味深いことに、そのｃＤＮＡはＢ３０．２類似ドメイン含有タンパク質ファミリーを含め、ＧｅｎＢａｎｋデータベース内の既知配列のいずれとも有意な配列類似性を示さなかった。その５’−非翻訳領域が異なる２種類のｍＲＮＡサブタイプが存在することが見出された。完全長のｃＤＮＡ配列はポリＡテールを除いて長さ１５５８ｂｐであった。それは２０残基のシグナルペプチド、それに続く１０７残基の成熟オハニン、および成熟タンパク質のＣ末端領域にある６３残基のプロペプチド断片を有している。オハニンは、プロペプチド領域にまで至る完全なＳＰＲＹドメインを有する。この新規タンパク質ファミリーはベスプリン（ｖｅｓｐｒｙｎ）（毒液ＰＲＹ−ＳＰＲＹドメイン含有タンパク質）と名付けられた。しかしながら、比較的長いＮ末端セグメントを持つ、その他全てのＢ３０．２類似ドメイン含有タンパク質ファミリーとは異なり、オハニンはそのＰＲＹ−ＳＰＲＹドメインの前に８個の残基しか持っていない。
【０００７】
プロ−オハニンは大腸菌の中でＮ末端にヘキサヒスチジンのタグが付いた可溶性の融合タンパク質として発現された。オハニンと同様に、組換え体プロ−オハニンについても、マウスにおけるその生物学的機能が調べられた。移動活動およびホットプレートアッセイの両分析からは、プロ−オハニンは成熟オハニンと比較したとき腹腔内投与を受けたマウスでは同様の薬理作用を示さないことが強く示唆されたことに注目すべきである。しかしプロ−オハニンは、マウス脳室内に直接注射された時には強力な移動低下作用および感覚過敏作用を示した。プロ−タンパク質の大きなサイズおよび／または立体構造の変化が、プロ−オハニンの血液脳関門の通過を阻止し、結果として中枢神経系での標的分子との相互作用を妨げたのだろう。興味深いことにプロペプチドセグメントの存在は、オハニンの血液脳関門通過能力を阻害するが、それは中枢神経系での薬理作用を高める。プロ−オハニンはｉ．ｃ．ｖ経路から注射された時、オハニンに比べ〜３５倍強力である。さらには、０．３μｇ／ｋｇのプロ−オハニンは、実験マウスの移動活動を〜９０％阻止できる。
【０００８】
我々はまたオハニン遺伝子のゲノム構造についても研究した。サザンハイブリダイゼーションは、オハニンがキングコブラゲノム内の単一遺伝子によってコードされていることを示した。ゲノムＤＮＡ配列の分析は、オハニン遺伝子が７０８６ｂｐであること；および５個のエクソンと４個のイントロンを持つことを示している。観察された２種類のｍＲＮＡは、ヘビ毒遺伝子が異なるスプライシングを受けて作られる。オハニンとその他Ｂ３０．２類似ドメイン含有タンパク質との間でゲノム構造が類似していることは、これらタンパク質のＢ３０．２類似ドメインが共通の祖先から進化し、毒腺での機能に適応したことを示している。
【０００９】
これは、実験マウスに移動低下および疼痛過敏を誘導することが最初に報告されたヘビ毒タンパク質である。オハニンは、新規薬理作用物質または研究用ツールのプロトタイプの開発において有益であると考えられている。
【００１０】
従って、発明の第１の側面は次のものを含む：
（ａ）配列番号１（シグナルペプチドを除くオハニンのアミノ酸配列）に記載のオハニンの成熟配列を含むタンパク質；
（ｂ）配列番号３（オハニンおよびそのシグナルペプチドのアミノ酸配列）に記載のオハニンおよびそのシグナルペプチドの成熟配列を含むタンパク質；
（ｃ）配列番号５（シグナルペプチドを除くプロ−オハニンのアミノ酸配列）に記載のプロ−オハニンのアミノ酸配列を含むタンパク質；ならびに
（ｄ）配列番号７（シグナルペプチドを含むプロ−オハニンのアミノ酸配列）に記載のプロ−オハニンおよびそのシグナルペプチドのアミノ酸配列を含むタンパク質。
【００１１】
典型的には、発明の第１側面のタンパク質は、対立遺伝子変異体のような天然の生物学的変異体を含む。また単一もしくは複数のアミノ酸置換、付加、挿入、および／または欠失、ならびに／あるいは化学修飾されたアミノ酸置換を含む機能的均等物も含まれるが、ここで言う「機能的均等物」とは：（ｉ）移動低下または疼痛過敏の少なくとも一方を誘導するタンパク質の能力を保持しているタンパク質；または（ｉｉ）タンパク質と共通の抗原決定基を持つタンパク質を意味する。また活性断片も含むが、ここで言う「活性断片」とは：（ｉ）移動低下または疼痛過敏の少なくとも一方を誘導するタンパク質の能力を保持しているか、または（ｉｉ）タンパク質と共通の抗原決定基を持つ切断されたタンパク質を意味する。また、タンパク質が、例えば生物活性、放射活性、酵素、もしくは蛍光でよい標識物、または抗体のようなペプチドまたはその他タンパク質と融合している融合タンパク質も含まれる。
【００１２】
不確かさを回避するために、発明の第１側面は：天然の生物学的変異体の機能的均等物；天然の生物学的変異体および機能的均等物の活性断片；ならびに天然の生物学的変異体、機能的均等物、および活性断片を含む融合タンパク質を含む。
【００１３】
発明の第２の側面は、発明の第１側面のタンパク質をコードする核酸分子を提供する。
【００１４】
発明の第３の側面は、発明の第２側面の核酸分子を含有する、発現ベクターのようなベクターを提供する。
【００１５】
発明の第４の側面は、発明の第３側面のベクターを用いて形質転換した宿主細胞を提供する。
【００１６】
発明の第５の側面は、発明の第１側面のタンパク質を産生する方法であって、発明の第４側面の宿主細胞を発明の第１側面のタンパク質の発現に好適な条件の下で培養することを含む方法を提供する。この発明の第５側面の方法は、タンパク質を精製することを更に含んでもよい。
【００１７】
発明の第６の側面は、発明の第１側面のタンパク質を産生する方法であって、例えば固相ペプチド合成またはコンビナトリアルケミストリーによるタンパク質の化学的合成を含む方法を提供する。
【００１８】
発明の第７の側面は、発明の第１側面のタンパク質に結合できる抗体を作製する方法を提供する。
【００１９】
発明の第８の側面は、発明の第１側面のタンパク質に結合できる抗体を提供する。
【００２０】
発明の第９の側面は、発明の第１側面のタンパク質に対する抗毒素を産生する方法であって、発明の第１側面のタンパク質で動物を免疫すること、および動物から抗毒素として使用するために抗体を回収することを含む方法を提供する。
【００２１】
発明の第１０の側面は、発明の第１側面のタンパク質に対し有効な抗毒素を提供することである。望ましくは、抗毒素は発明の第９側面に従って産生される。
【００２２】
発明の第１１の側面は、発明の第１側面のポリペプチドの調整因子（例えばアゴニストまたはアンタゴニスト）化合物を同定するための方法を提供する。
【００２３】
発明の第１２の側面は、発明の第１側面のタンパク質、発明の第２側面の核酸分子、発明の第３側面のベクター、発明の第４側面の宿主細胞、発明の第８側面の抗体、発明の第１０側面の抗毒素、または発明の第１１側面で同定された調整因子（例えばアゴニストもしくはアンタゴニスト）を含む医薬組成物を提供する。
【００２４】
発明の第１３の側面は医薬品で使用するための、発明の第１側面のタンパク質、発明の第２側面の核酸分子、発明の第３側面のベクター、発明の第４側面の宿主細胞、発明の第８側面の抗体、発明の第１０側面の抗毒素、または発明の第１１側面で同定された調整因子（例えばアゴニストもしくはアンタゴニスト）を提供する。
【００２５】
発明の第１４の側面は、鎮静剤として使用される医薬品製造における、発明の第１側面のタンパク質、発明の第２側面の核酸分子、発明の第３側面のベクター、または発明の第４側面の宿主細胞の使用を提供する。
【００２６】
発明の第１５の側面は、神経系または筋肉系の疾患治療に使用される医薬品製造における、第１の側面のタンパク質、発明の第２側面の核酸分子、発明の第３側面のベクター、または発明の第４側面の宿主細胞を提供する
【００２７】
発明の第１６の側面は、発明の第１側面のタンパク質、発明の第２側面の核酸分子、発明の第３側面のベクター、発明の第４側面の宿主細胞、または発明の第１２側面の医薬組成物を動物に投与することを含む、動物を鎮静化する方法を提供する。
【００２８】
発明の第１７の側面は、発明の第１側面のタンパク質、発明の第２側面の核酸分子、発明の第３側面のベクター、発明の第４側面の宿主細胞、または発明の第１２側面の医薬組成物を、神経系または筋肉系の疾患を持つ患者に投与することを含む、患者を治療する方法を提供する。
【００２９】
発明の第１８の側面は、発明の第１側面のタンパク質を含む防御用組成物を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
発明の第１側面は次のものを含む：
（ａ）配列番号１（シグナルペプチドを除くオハニンのアミノ酸配列）に記載のオハニンの成熟配列を含むタンパク質；
（ｂ）配列番号３（オハニンのアミノ酸配列およびそのシグナルペプチド）に記載のオハニンの成熟配列およびそのシグナルペプチドを含むタンパク質；
（ｃ）配列番号５（シグナルペプチドを除くプロ−オハニンのアミノ酸配列）に記載のプロ−オハニンのアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｄ）配列番号７（シグナルペプチドを含むプロ−オハニンのアミノ酸配列）に記載のプロ−オハニンのアミノ酸配列およびそのシグナルペプチドを含むタンパク質。
【００３１】
発明の第１側面のタンパク質は、対立遺伝子変異体のような天然の生物学的変異体を含む。また単一または複数のアミノ酸置換、付加、挿入、および／または欠失、ならびに／あるいは化学修飾されたアミノ酸の置換を含む機能的等価物も含まれるが、ここでいう「機能的等価物」とは：（ｉ）移動低下または疼痛過敏の少なくとも一方を誘導するタンパク質の能力を保持するか、または（ｉｉ）タンパク質と共通の抗原決定基を有しているタンパク質を意味する。また活性断片も含まれるが、ここでいう「活性断片」とは：移動低下または疼痛過敏の少なくとも一方を誘導するタンパク質の能力を保持するか、または（ｉｉ）タンパク質と共通の抗原決定基を有している、切断されたタンパク質を意味する。また発明のタンパク質が、例えば、生物活性、放射活性、酵素性もしくは蛍光性である標識物、または抗体のようなペプチドまたはその他タンパク質と融合している融合タンパク質も含まれる。
【００３２】
不確かさを回避するために、発明の第１側面は：天然の生物学的変異体の機能的均等物；天然の生物学的変異体および機能的均等物の活性断片；ならびに天然の生物学的変異体、機能的均等物、および活性断片を含む融合タンパク質を含む。
【００３３】
用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は互換的に用いられ、天然または合成により作られたかにかかわらず、ペプチド結合または修飾されたペプチド結合を介して連結されたアミノ酸の任意のポリマー（ジペプチド以上の大きさ）を指す。約１０〜２０アミノ酸残基未満のポリペプチドは、一般的には「ペプチド」と呼ばれる。
【００３４】
発明のタンパク質は、炭水化物群のような非ペプチド成分を含むこともできる。炭水化物およびその他の非ペプチド成分は、タンパク質を産生する細胞によって付加することができ、それは細胞のタイプによって異なるだろう。タンパク質は、ここではそのアミノ酸主鎖構造に関して定義されている；炭水化物群のような成分は一般的には明示されていないが、しかし存在していることもある。しかし未変性オハニンは翻訳後修飾を受けないと信じられていることから、発明の第１側面のタンパク質は、糖化またはジスルフィド結合のような翻訳後修飾を含まないことが望ましい。しかしながら、当然発明の第１側面のタンパク質がプロ−タンパク質として発現される場合には、タンパク質はプロセッシングを受けて成熟型になる。それ故に、発明の第１側面の成熟タンパク質または発明の第１側面のタンパク質は、それらの成熟型にプロセッシングされる場合、糖化またはジスルフィド結合のような翻訳後修飾を含まないことが望ましい。
【００３５】
ここで用いられる用語「含む」および文法的なその変形は、「含む（備える）」または「成る（構成される）」を意味する。従って、例えばＸを「含む」組成物は、Ｘだけから成っても、または１つ以上の追加の成分を含んでもよい。同様に、ある配列を含むポリペプチドまたは核酸分子は、示した配列だけから成っても、１以上の追加の成分を含んでもよい。
【００３６】
発明の第１側面の一つの態様では、配列番号１に記載されている成熟オハニンアミノ酸配列を含むポリペプチドが提供される。配列番号１は、１０７個のアミノ酸から成り、図３に示されている。一つの態様では、配列番号１に記載されている成熟オハニンアミノ酸配列から成るポリペプチドが提供される。
【００３７】
発明の第１側面の別の態様では、配列番号３に記載されているアミノ酸配列を含むポリペプチドが提供される。配列番号３は、オハニンの成熟配列（即ち配列番号１の１０７アミノ酸）と先行するその２０個のアミノ酸シグナルペプチド配列から成る。シグナルペプチド配列は図９の下線が付けられた配列である。一つの態様では、配列番号３に記載されているアミノ酸配列から成るポリペプチドが提供される。
【００３８】
発明の第１側面の別の態様では、配列番号５に記載されているアミノ酸配列を含むポリペプチドが提供される。配列番号５は、プロ−オハニン配列、即ち配列番号１の１０７個のアミノ酸および６３個のアミノ酸のＣ末端プロ配列である。一つの態様では、配列番号５に記載されているアミノ酸配列から成るポリペプチドが提供される。
【００３９】
発明の第１側面の別の態様では、配列番号７に記載されているアミノ酸配列を含むポリペプチドが提供される。配列番号７は２０個のアミノ酸のシグナルペプチド配列が先行するプロ−オハニン配列であり、即ち配列番号７は図３の１０７個のアミノ酸配列、および６３個のＣ末端プロ配列、およびシグナル配列から成る。配列番号７は図９に示す。一つの態様では、配列番号７に記載されているアミノ酸配列から成るポリペプチドが提供される。
【００４０】
発明の一つの態様では、発明のタンパク質、特に配列番号１、３、５、または７に記載されているタンパク質の天然の生物学的変異体が提供される。天然の生物学的変異体は、そこからポリペプチドが導出される種内に存在する対立遺伝子変異体を含む。このような変異体は、１個以上のアミノ酸残基が保存的または非保存的アミノ酸残基（保存的アミノ酸残基が望ましい）で置換されたポリペプチドを含んでよい。典型的にはこのような置換はＡｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、とＩｌｅとの間；ＳｅｒとＴｈｒの間；酸性残基ＡｓｐとＧｌｕの間；ＡｓｎとＧｌｎの間；塩基性残基ＬｙｓとＡｒｇの間；または芳香族残基ＰｈｅとＴｙｒの間である。
【００４１】
特に好ましいのは、複数、即ち５〜１０個、１〜５個、１〜３個、１〜２個、またはちょうど１個のアミノ酸が、任意の組み合わせにより置換、欠失、または付加されている天然の変異体である。特に好ましいものはタンパク質の性質および活性を変えないサイレントな置換、付加、および欠失である。これに関しては保存的置換も特に好ましい。「突然変異体」ポリペプチドは、１個以上のアミノ酸残基が置換基を含むポリペプチドも含む。
【００４２】
発明の第１側面の更なる態様は、野生型タンパク質の配列からの単一または複数のアミノ酸置換、付加、挿入、および／または欠失、ならびに／あるいは化学修飾されたアミノ酸を含む発明のタンパク質（特に配列番号１、３、５、または７、およびその天然の生物学的変異体）の機能的均等物を提供するが、ここでいう「機能的均等物」とは：（ｉ）移動低下または疼痛過敏の少なくとも一方を誘導するタンパク質の能力を保持しているタンパク質；または（ｉｉ）タンパク質と共通の抗原決定基を持つタンパク質を意味する。
【００４３】
移動低下または疼痛過敏を誘導するタンパク質の能力について言及する場合でタンパク質が不活性なプロ−タンパク質の場合（少なくとも腹腔内投与したとき）は、移動低下および疼痛過敏を誘導するその能力についての言及は、もちろんその成熟（活性）型に処理された時、またはｉ．ｃ．ｖ．投与された時のそれらの誘導能力についてのものである。
【００４４】
移動低下または疼痛過敏を誘導するタンパク質の能力を決定する方法は当技術分野では既知である。また、移動低下または疼痛過敏を誘導するタンパク質の能力を決定する方法は、実施例の節に記載されている。実施例の節に記載されている方法は、移動低下または疼痛過敏を誘導するタンパク質の能力の決定に好適に用いることができる。
【００４５】
好ましくは、発明の第１側面のタンパク質は、オハニンの移動低下誘導効力の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％を保持する。オハニン（配列番号１）の移動低下誘導能力と比較したタンパク質の移動低下誘導能力は、本明細書の実施例の節に記載されている方法を用いて、移動に対するタンパク質の作用を比較することで評価できる。タンパク質の作用は、それらが共にｉ．ｐ．またはｉ．ｃ．ｖ．投与された時に比較できる。比較は、タンパク質が例えば０．１ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、および１０ｍｇ／ｋｇの用量でｉ．ｐ，投与された時に実施できる。比較はまた、タンパク質を０．３μｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ、または１０μｇ／ｋｇの用量でｉ．ｃ．ｖ．投与された時に比較できる。
【００４６】
一つの態様では、発明の第１側面のタンパク質は、オハニンの疼痛過敏誘導効力の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％を保持するが、他所に記されているように、特定の態様では、タンパク質にとって疼痛過敏誘導能力を低下または無くすことが都合よいこともある。オハニン（配列番号１）の疼痛過敏誘導能力と比較したタンパク質の疼痛過敏誘導能力は、本明細書の実施例の節に記載されている方法を用いて、熱痛の痛覚に対するタンパク質の作用を比較することで評価できる。タンパク質の作用は、それらが共にｉ．ｐ．またはｉ．ｃ．ｖ．投与された時に比較できる。比較は、タンパク質が例えば０．１ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、および１０ｍｇ／ｋｇの用量でｉ．ｐ，投与された時に実施できる。比較はまた、タンパク質を０．３μｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ、または１０μｇ／ｋｇの用量でｉ．ｃ．ｖ．投与された時に比較できる。
【００４７】
発明のこの側面による機能的に均等であるポリペプチドは、発明のポリペプチドに相同であるポリペプチドであってよい。好ましくは、発明のこの側面による機能的に均等であるポリペプチドは、配列が配列番号１、３、５、または７の様な、ここに明示的に引用されているポリペプチドに相同であるポリペプチドであってよい。
【００４８】
２つのポリペプチドは、一方のポリペプチドの配列がもう一方のポリペプチドの配列と十分高い程度の同一性または類似性を有する時、「相同」であると言われる。「同一性」とは、アラインメントをとった配列の特定位置にあるアミノ酸残基が配列間で同一であることを表す。「類似性」とは、アラインメントをとった配列中の特定位置にあるアミノ酸残基が配列間で類似のタイプであることを表す。
【００４９】
タンパク質の相同性を測る方法は当技術分野では周知であり、同業者は、この意味に関係して、相同性がアミノ酸同一性を下に計算される（「ハードホモロジー」と呼ばれることもある）ことを了解するだろう。例えばＵＷＧＣＧパッケージは、それを用いて相同性が計算できるＢＥＳＴＦＩＴプログラムを提供する（例えば初期設定で使用して）（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２、ｐ３８７〜３９５）。ＰＩＬＥＵＰおよびＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いて、例えばＡｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ．Ｆ．（１９９３）Ｊ Ｍｏｌ Ｅｖｏｌ ３６：２９０〜３００；Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ．Ｆ ｅｔ ａｌ（１９９０）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２１５：４０３に記載されているように相同性を計算し、または配列を並べることもできる（例えば初期設定で使用して）。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウエアは、インターネットを通して、ワールドワイドウェブ、例えば「ｗｗｗ．ｎｃｂｉ，ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／」上にあるＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎから公的に入手できる。このアルゴリズムは最初に、データベース配列中の同じ長さのワードとアラインメントを取った時に、正の値を持つ閾値スコアＴに一致するかまたは満たす問い合わせ配列中にある長さＷの短いワードを同定することによって高いスコアを持つ配列のペア（ＨＳＰ）を特定することを含む。Ｔは類似ワードスコア（ｎｅｉｇｈｂｏｕｒｈｏｏｄ ｗｏｒｄ ｓｃｏｒｅ）閾値（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ、上記）と呼ばれる。これら初期類似ワードスコア閾値を満たしたもの（ヒット）を種として探索を行い、それらを含むＨＳＰを見つける。ワードヒットを各配列に沿って、累積されたアラインメントスコアが増加できる間、両方向に伸長していく。両鎖について伸長していく。ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の類似性の統計学的分析を行う；例えばＫａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｄ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３を参照。ＢＬＡＳＴアルゴリズムが提供する類似性に関する一つの手段は、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列の間の致が相互に置換される確率を明らかにする。
【００５０】
典型的には、タンパク質の生物活性（疼痛過敏および移動低下の少なくとも一方を誘導する能力）が保持されているか、またはタンパク質が相手のタンパク質と共通の抗原決定基を持っている場合には、２つのタンパク質間の相同性が６０％より高いことが機能的均等の指標と考えられている。好ましくは、発明のこの側面の機能的に均等なポリペプチドは、ポリペプチドまたはその断片と、６０％を超える配列同一度を示す。より好ましきポリペプチドは、それぞれ７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％を超える相同度を有する。
【００５１】
発明の機能的に均等なポリペプチドは、それ故に突然変異体（アミノ酸置換、挿入、または欠損を含む突然変異体のような）を含むと解釈される。このような突然変異体は、その中の１以上のアミノ酸残基が保存的または非保存的なアミノ酸残基（好ましくは保存的アミノ酸残基）によって置換されているポリペプチドを含んでよく、またそのような置換アミノ酸残基は遺伝子コードによってコードされているものでも、されていないものでもよい。典型的には、このような置換はＡｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅの間；ＳｅｒとＴｈｒの間；酸性残基のＡｓｐとＧｌｕの間；ＡｓｎとＧｌｎの間；塩基性残基のＬｙｓとＡｒｇの間；または芳香族残基のＰｈｅとＴｙｒの間で起こる。
【００５２】
特に好ましい変異体は、複数、即ち５〜１０、１〜５、１〜３，１〜２個の間、またはちょうど１個のアミノ酸が、任意の組み合わせにより置換、欠失、または付加されているものである。特に好ましいものはタンパク質の性質および活性を変えないサイレントな置換、付加、および欠失である。これに関しては保存的置換も特に好ましい。「突然変異体」ポリペプチドは、１個以上のアミノ酸残基が置換基を含むポリペプチドも含む。
【００５３】
改良された機能を持つ機能的均等物は、タンパク質配列中の特定残基の体系的または指向的突然変異を通じてもデザインできる。望ましいと思われる一つ改良は、ポリペプチドの疼痛過敏機能を低下または無効にするものであろう。これはポリペプチドを、その移動低下／沈静化を誘導する能力に関して用いる場合、または動物に投与して抗体を作らせる場合に望ましいだろう。
【００５４】
発明の活性断片は、発明のポリペプチドに由来する、少なくともｎ個の連続するアミノ酸を含まねばならない。好適には、活性断片は、配列番号１、３、５、または７のポリペプチドに由来する、少なくともｎ個の連続するアミノ酸を含むだろう。ｎは、好ましくは７以上である（例えば８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、５０、１００、１５０以上）。このような断片は「独立」したものでよく、即ち他のアミノ酸またはポリペプチドの一部でなくとも、またはこれに融合していなくともよく、あるいはそれが一部を、または領域を形成するより大きなポリペプチド内に含まれていてもよい。より大きなポリペプチド内に含まれる場合、発明の断片は単一の連続する領域を形成するのが最も好ましい。これに加えて複数の断片が単一のより大きなポリペプチドの中に含まれてもよい。
【００５５】
発明の第１側面の一つの態様では、発明のタンパク質と共通な抗原決定基を持つ機能的均等物または活性断片が提供される。好ましくは、抗原決定基は、配列番号１、３、５、または７に記載のアミノ酸配列、あるいはその天然の変異体から成るポリペプチドと共有される。
【００５６】
「抗原決定基」とは、特定の抗体と接触させる分子の断片（即ちエピトープ）を指す。「抗原決定基」またはエピトープは、通常は、アミノ酸または糖側鎖のような化学的に活性な表面分子のグループから成り、特異的な三次元構造の特徴および特異的電荷特性を有している。
【００５７】
好ましくは、機能的均等物または活性断片は、配列番号１に記載のアミノ酸配列と共通の抗原決定基を有する。
【００５８】
タンパク質の抗原決定基を模擬できる比較的短い合成ペプチドを用いて、前記タンパク質に対する抗体産生を刺激できることが知られている（例えばＳｕｔｃｌｉｆｆｅ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１９：６６０（１９８３）を参照）。抗原エピトープを担持するペプチドおよびポリペプチドは、少なくとも４〜１０個の配列番号１のアミノ酸、少なくとも１０〜１５個の配列番号１のアミノ酸、または約１５〜約３０個の配列番号１のアミノ酸を含むことができる。このようなエピトープ担持ペプチドおよびポリペプチドは、ここに記したように配列番号１を断片化することによって、または化学的ペプチド合成によって作ることができる。更には、抗原決定基は、無作為なペプチドライブラリーのファージディスプレイによって選択できる（例えば、Ｌａｎｅ ａｎｄ Ｓｔｅｐｈｅｎ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５：２６８（１９９３）、およびＣｏｒｔｅｓｅ ｅｔ ａｌ．、Ｃｕｒｒ．Ｇｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７．６１６（１９９６）を参照）。抗原決定基を同定する方法および抗原決定基を含む小ペプチドから抗体を産生する標準的な方法は、例えばＭｏｌｅによって、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．１０、Ｍａｎｓｏｎ（編）（Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ、１９９２）の中、ページ１０５〜１１６の「Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ」に、Ｐｒｉｃｅによって、Ｍｏｎｏｃｏｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｅｎｇｉｅｅｒｉｎｇ，ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃｌａ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ、Ｒｉｔｔｅｒ ａｎｄ Ｌａｄｙｍａｎ（編）（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ １９９５）の中、ページ６０８４の「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅ−Ｄｅｒｉｖｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」に、およびＣｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、ページ９１〜９５およびページ９１〜９１１（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ １９９７）に記載されている。
【００５９】
抗原決定基を持つこのようなポリペプチドを用いて、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体のような、発明のポリペプチドに免疫特異的であるリガンドを作ることができる。このような抗体を用いて、発明のポリペプチドを発現しているクローンを単離または同定すること、あるいはアフィニティークロマトグラフィーによりポリペプチドを精製することができる。抗体は更に、診断または治療補助として、とりわけ当業者に明らかな他の応用に用いることもできる。
【００６０】
発明の第１側面の一つの態様では、例えば生物活性、放射活性、酵素、もしくは蛍光でよい標識物、または抗体のようなペプチドまたはその他タンパク質と融合している発明のタンパク質を含む融合タンパク質が提供される。
【００６１】
例えば、分泌またはリーダー配列、プロ配列、精製に役立つ配列、または例えば組換え体製造中に高いタンパク質安定性を付与する配列を含む、１個以上の追加のアミノ酸配列を加えることが有利であることが多々ある。これに代わって、またはこれに加えて、成熟ポリペプチドを別の化合物、ポリペプチドの半減期を延長するような化合物（例えばポリエチレングリコール）に融合することもできる。
【００６２】
融合タンパク質は、発明のポリペプチドの活性に対する阻害剤についてのペプチドライブラリーのスクリーニングにとっても有用であろう。それは市販されている抗体が認識できる融合タンパク質を発現させるのに有用であろう。融合タンパク質はまた、切断部位を発明のポリペプチドの配列と異種タンパク質の配列との間の位置に入るように遺伝子工学的に作成し、ポリペプチドを切断して異種タンパク質から分離して精製することもできる。「異種タンパク質」と表現する場合、我々は自然界において発明のポリペプチドとの関連性が見いだせないタンパク質を含める。
【００６３】
発明の第１側面の好ましい態様では、配列番号１、３、５、または７に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質が提供される。好ましくは、タンパク質は、配列番号１、３、５、または７に記載のアミノ酸配列から成る。
【００６４】
発明の第２の側面は、発明の第１側面のタンパク質をコードする核酸分子を提供する。
【００６５】
発明の第２側面の一つの態様では、核酸分子は配列番号１、３、５、または７に記載のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含んでよい。
【００６６】
発明の第２側面の一つの態様では、核酸分子は配列番号１、３、５、または７に記載のアミノ酸配列から成るタンパク質をコードする核酸配列から成ってよい。
【００６７】
一つの態様では、核酸分子は配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードする配列番号２に記載の配列を含むことができる。一つの態様では、核酸分子は配列番号２に記載の配列から成ってよい。
【００６８】
一つの態様では、核酸分子は配列番号３に記載のアミノ酸配列をコードする配列番号４に記載の配列を含むことができる。一つの態様では、核酸分子は配列番号４に記載の配列から成り得る。
【００６９】
一つの態様では、核酸分子は配列番号５に記載のアミノ酸配列をコードする配列番号６に記載の配列を含むことができる。一つの態様では、核酸分子は配列番号６に記載の配列から成り得る。
【００７０】
一つの態様では、核酸分子は配列番号７に記載のアミノ酸配列をコードする配列番号８に記載の配列を含むことができる。一つの態様では、核酸分子は配列番号８に記載の配列から成り得る。
【００７１】
別の態様では、核酸分子は配列番号９に記載の核酸配列（シグナルペプチド配列を含むオハニン／プロ−オハニンの完全長ｃＤＮＡ配列）を含むことができる。一つの態様では、核酸分子は配列番号９に記載の核酸配列から成り得る。
【００７２】
別の態様では、核酸分子は配列番号１０に記載の核酸配列（シグナルペプチド配列を除くオハニン／プロ−オハニンのゲノムＤＮＡ配列）を含むことができる。一つの態様では、核酸分子は配列番号１０に記載の核酸配列から成り得る。
【００７３】
当業者は、遺伝子コードの縮重の結果、多数の核酸分子が発明の第１側面のタンパク質をコードし、既知および自然界に在る遺伝子のポリヌクレオチド配列と最小限の相同性しか持たないものが生じ得ることを認識するだろう。かくして発明は可能なコドン選択に基づいた組み合わせの選択によって作ることができる、可能なポリヌクレオチドの変異体のそれぞれ、および全てを包含する。
【００７４】
更には、当業者はコドンを選択して、特定の原核または真核宿主で起こるポリペプチドの発現の率を、宿主が特定のコドンを利用する頻度に従って上げることができることを認識するだろう。
【００７５】
本発明の核酸は、ｍＲＮＡのようなＲＮＡの形でも、または例えばクローニングもしくは合成で作られたｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを含むＤＮＡの形でもよい。ＤＮＡは二重鎖でも一本鎖でもよい。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡはセンス鎖としても知られるコーディング鎖でも、アンチセンス鎖とも呼ばれる非コーディング鎖でもよい。
【００７６】
用語「核酸分子」は、修飾された主鎖を含むようなＤＮＡおよびＲＮＡの類似体も含む。
【００７７】
発明の第２側面の一つの態様では、配列番号１、３、５、または７に記載されているアミノ酸配列を含む（および場合によっては該アミノ酸配列から成る）タンパク質をコードする核酸分子と相同である核酸分子が提供される。
【００７８】
一つの態様では、配列番号２、４、６、８、９、または１０に記載されている核酸配列に相同である核酸が提供される。
【００７９】
特定の態様では、配列比較アルゴリズムによって決定した時に少なくとも７０％、および最も好ましくは少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％のヌクレオチドが、規定長のＤＮＡ配列と一致する時、２つのＤＮＡ配列は「相同」である。
【００８０】
２つの核酸配列間の相同性の強さは、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｐｒｏｇｒａｍ Ｍａｎｕａｌ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ ８、１９９６年８月、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、ＵＳＡ ５３７１１）（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ、Ｓ．Ｂ．ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．、（１９７０）、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、４８、４４３〜４５３）の中に提供されているＧＡＰのような、当技術分野で既知であるコンピュータプログラムを用いて決定できる。ＧＡＰを次のＤＮＡ配列比較向け設定で使用する：ＧＡＰ創造ペナルティー５．０、およびＧＡＰエクステンションペナルティー０．３。
【００８１】
核酸分子は、ＧＣＧプログラムパッケージの一部として入手できるＰｉｌｅｕｐアラインメントソフトウエアーを、例えばギャップ創造ペナルティー５およびギャップ幅ペナルティー０．３の初期設定で用いて互いにアラインメントを取ることができる。
【００８２】
発明の第２側面の核酸分子はまた、発明の核酸分子、特に配列番号：２、４、６、８、９、または１０（好ましくは配列番号２）に規定されている核酸配列と、厳密性の低い条件で、より好ましくは中程度の厳密性で、更により好ましくは高い厳密性の条件でハイブリダイゼーションできる変異体であって、発明の第１側面のタンパク質をコードする変異体を含んでもよい。低厳密性ハイブリダイゼーション条件は、２×ＳＳＣ中で５０℃で実施されるハイブリダイゼーションに対応するだろう。
【００８３】
ある核酸分子が特定の核酸とハイブリダイゼーションするか否かを判定するための好適な実験条件は、検証対象となる核酸の関連サンプルを含有するフィルターを５×ＳＳＣに１０分間予備浸漬すること、およびフィルターを５×ＳＳＣ、５ｘデンハルトの溶液、０．５％ＳＤＳ、および１００μｇ／ｍｌの変性超音波処理した鮭精子ＤＮＡの溶液内で予備ハイブリダイゼーションし、続いてＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に記載されているハイブリダイゼーション法に従って、１０ｎｇ／ｍｌ濃度の３２Ｐ−ｄＣＴＰ標識プローブを含む同一溶液中で１２時間、約４５℃でハイブリダイゼーションすることを含むだろう。
【００８４】
次にフィルターを３０分間、２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、少なくとも５５℃（低厳密性）、少なくとも６０℃（中厳密性）、少なくとも７０℃（高厳密性）、または少なくとも７５℃（非常に高厳密性）で２回洗浄する。ハイブリダイゼーションは、フィルターをｘ線フィルムに露光することで検出できる。
【００８５】
更には、ハイブリダイゼーションの厳密性を変えるのに利用できる、当業者に周知である様々な条件および要因が存在する。例えば、特定の核酸にハイブリダイゼーションする核酸の長さおよび性質（ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成）；塩、およびホルムアミド、硫酸デギストラン、ポリエチレングリコール等の有無といったその他成分の濃度；ならびにハイブリダイゼーションおよび／または洗浄段階の温度の変更である。
【００８６】
更には、ある２つの核酸配列が特定の指定条件の下でハイブリダイゼーションするか理論的に予測することも可能である。従って上記の経験的な方法に替わって、変異体核酸配列が、例えば配列番号：２、４、６、８、９、または１０の核酸とハイブリダイゼーションするかどうかを、配列が分かっている２つの非相同核酸配列が例えば塩濃度および温度などの指定された条件でハイブリダイゼーションするＴ_ｍ（融解温度）の理論的計算に基づいて決定できる。
【００８７】
非相同核酸配列の融解温度（Ｔ_{ｍ（ｈｅｔｅｒｏ）}）を決定する場合、最初に相同核酸配列の融解温度（Ｔ_{ｍ（ｈｏｍｏ）}）を決定する必要がある。２つの完全に相補的な核酸鎖（ホモ二重鎮形成）間の融解温度（Ｔ_{ｍ（ｈｏｍｏ）}）は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、１９９５に概要が説明されている次式に従って決定できる：
Ｔ_{ｍ（ｈｏｍｏ）}＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇＭ）＋０．４１（％ＧＣ）−０．６１（％ｆｏｒｍ）−５００／Ｌ
Ｍ＝一価陽イオンのモル濃度を示す
％ＧＣ＝配列中の全塩基数の％グアニン（Ｇ）およびシトシン（Ｃ）
％ｆｏｒｍ＝ハイブリダイゼーション緩衝液中の％ホルムアミド、および
Ｌ＝核酸配列の長さ
【００８８】
上記の式により決定されたＴ_ｍは、２つの完全に相補的な核酸配列間のホモ二重鎖形成のＴ_ｍ（Ｔ_{ｍ（ｈｏｍｏ）}）である。このＴ_ｍ、の値を２つの非相同核酸配列のＴ_ｍに適応するために、２つの非相同配列間の１％のヌクレオチド差は、Ｔ_ｍが１℃下がることに等しいと仮定する。それ故にヘテロ二重鎖形成のＴ_{ｍ（ｈｅｔｅｒｏ）}は、問題の類似配列と上記ヌクレオチドプローブとの間の相同性％差をＴ_{ｍ（ｈｏｍｏ）}から差し引くことによって得られる。
【００８９】
本発明のポリペプチド、核酸分子、および抗体は「精製される」。ここで使用する用語「精製される」とは、その自然状態から「ヒトの手によって」変えられることを意味する；即ち、それが自然界で起こった場合には、それはその天然宿主から変更を受けるかまたは取り除かれ、それに伴う不純物は減らされるか、または排除される。一つの態様では、目的の種は存在する優勢種である（即ち、モルベースで、組成物中のその他個別種に比べ量の多いものである）。実質的に精製された分画としては、目的種が、存在する全高分子種の少なくとも約３０パーセント（モルベースで）を構成する組成物が挙げられる。一般的には、実質的に純粋な組成物は、組成物中に存在する全高分子種の約８０〜９０パーセント以上を構成する。最も好ましくは、目的種は実質的に均一になるまで精製され、そのとき組成物は実質的に単一の高分子種から成る（通常の検出法によって組成物中に汚染種は検出されない）。
【００９０】
発明の第３側面は、発現ベクターのような、発明の第２側面の核酸分子を含むベクターを提供する。本発明のベクターは、転写プロモータ、および転写ターミネータを含み、このときプロモータは核酸分子と作動可能に連結しており、且つ核酸分子は転写ターミネータと作動可能に連結している。
【００９１】
本発明のベクターは、好適宿主細胞の中に在る前記ベクターを、好適な条件下で選択できるようにするマーカー遺伝子のような別の遺伝子を含んでもよい。
【００９２】
本発明は、これらベクターおよび発現ベクターを含む組換え体宿主細胞も包含する。従って、発明の第４の側面は、発明の第３側面のベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。例示的な宿主細胞としては、細菌、酵母、真菌、昆虫、鳥類、哺乳類、および植物細胞が挙げられる。特に好ましいものは、オハニンを未変性オハニンに類似の形態で発現する大腸菌のような細胞である（オハニンは糖化またはジスルフィド架橋のような翻訳後修飾を含まない）。
【００９３】
発明の第５の側面は、発明の第１側面のタンパク質の製造方法であって、発明の第４側面の宿主細胞を、発明の第１側面のタンパク質の発現に好適な条件の下に培養することを含む方法を提供する。
【００９４】
発明の第６の側面は、発明の第１側面のタンパク質の製造方法であって、例えば固相ペプチド合成またはコンビナトリアルケミストリーによるタンパク質の化学合成を含む方法を提供する。このような技術は当技術分野では周知であり、当業者は容易に実施できるだろう。
【００９５】
発明の第５および第６側面の方法は、タンパク質を精製する行為を更に含んでよい。このような技術は当技術分野では周知であり、当業者は容易に実施できるだろう。
【００９６】
発明の第７の側面は、発明の第１側面のタンパク質に結合できる抗体を作成する方法を提供する。
【００９７】
発明の第８の側面は、発明の第１側面のタンパク質に結合できる抗体を提供する。
【００９８】
発明の抗体は、問題の抗原に結合するポリクローナルまたはモノクローナル抗体調製物、単一特異的抗血清、ヒト抗体でよく、あるいはヒト化抗体、変更抗体（Ｆａｂ’）２断片、Ｆ（ａｂ）断片、Ｆｖ断片、単一ドメイン抗体、二量体もしくは三量体抗体断片もしくは構築物、ミニ抗体、またはそれらの機能的断片のようなハイブリッドまたはキメラ抗体でもよい。
【００９９】
抗体は、当業者に周知であり、例えば米国特許第４，０１１，３０８号；第４，７２２，８９０号；第４，０１６，０４３号；第３，８７６，５０４号；第３，７７０，３８０号、および第４，３７２，７４５号に開示されている技術を用いて作ることができる。Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎ．Ｙ．（１９８８）も参照。例えばポリクローナル抗体は、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、またはヤギのような好適な動物を関心対象の抗原で免疫感作することによって作られる。免疫原性を高めるために、免疫前に抗原にキャリアーを連結することができる。このようなキャリアーは当業者には周知である。免疫は、一般的には抗原を食塩水に、好ましくはフロイントの完全アジュバントのようなアジュバントの中に混合または乳化し、混合液または乳剤を非経口的（一般には皮下または筋肉内）注射することによって行われる。動物は、一般的には２〜６週後に、抗原の食塩水溶液、好ましくはフロイントの不完全アジュバントを用いて１回以上注射し、追加免疫される。抗体は当技術分野で既知である方法を用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏ免疫によっても作ることができる。次に免疫した動物からポリクローナル抗血清を得る。
【０１００】
モノクローナル抗体は、一般的にはＫｏｈｌｅｒ ＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５〜４９７の方法、またはその改良法を用いて調製される。典型的には、マウスまたはラットを上記に従って免疫する。ウサギも使用できる。しかしながら、動物から採血して血清を得る代わりに、脾臓（および場合によっては複数の大型のリンパ節）を取り出し、単細胞に解離する。望ましい場合には、細胞浮遊液を抗原をコーティングしたプレートまたはウェルに加えて脾臓細胞を篩いにかけてもよい（非特異的な付着細胞を除いた後に）。抗原に特異的な膜結合免疫グロブリンを発現しているＢ細胞はプレートに結合し、浮遊液の残りと一緒に洗い流されない。次に得られたＢ細胞、または全ての解離脾臓細胞を誘導して骨髄腫細胞と融合させハイブリドーマを形成させ、選択培地の中で培養する（例えばヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン培地、「ＨＡＴ」）。得られたハイブリドーマを限界希釈法によってプレーティングし、免疫抗原に特異的に結合する（同時に無関係の抗体とは結合しない）抗体の産生についてアッセイする。
【０１０１】
次に選択したモノクローナル抗体分泌ハイブリドーマをｉｎ ｖｉｔｒｏ（例えば組織培養ボトルもしくは中空糸リアクター）またはｉｎ ｖｉｖｏ（例えばマウス腹水）のいずれかで培養する。
【０１０２】
ヒト化およびキメラ抗体も発明には有用である。ハイブリッド（キメラ）抗体分子はＷｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３４９：２９３〜２９９および米国特許第４，８１６，５６７号に一般的に論じられている。ヒト化抗体分子は、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３〜３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙａｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９；１５３４〜１５３６；および１９９４年９月２１日公開された英国特許出願第ＧＢ２，２７６，１６９号に一般的に論じられている。
【０１０３】
抗体は、分子と特異的に反応し、それによって分子を抗体に結合させることができる場合に、分子を結合できると考えられる。
【０１０４】
好ましくは、抗体またはその断片は、約１０^５Ｍ^−１より高い、より好ましくは約１０^６Ｍ^−１より高い、より好ましくは約１０^７Ｍ^−１より更に高い、最も好ましくは約１０^８Ｍ^−１〜１０^９Ｍ^−１より高い結合親和性または親和力を有する。抗体の結合親和性は当業者によって、例えばＳｃａｔｃｈａｒｄ分析（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ、Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５１：６６０（１９４９））によって容易に決定できる。
【０１０５】
発明の第９の側面は、分子、例えば発明の第１側面のタンパク質に対する抗毒素を製造する方法であって、動物を発明の第１側面のタンパク質で免疫し、抗毒素として用いるために動物から抗体を採取することを含む方法を提供する。
【０１０６】
治療薬を製造する伝統的な方法は、ウマ、ヤギ、またはヒツジのような哺乳動物を毒液に対し免疫感作させるものである。それらの毒性を下げるために、毒液をホルマリンで処理して修飾することができる。それらの吸収を遅延させるために、修飾した毒液を水酸化アルミニウムゲルと混合してもよい。次にこうして作製した抗体を動物から単離し、患者、典型的にはヒトの患者に解毒薬として用いる。ごく最近、ニワトリのような鳥類を用いて哺乳動物以外の動物が使用されている。この場合は、若いニワトリを少量の標的ヘビ毒で免疫し、これらの動物は成長すると毒素に対する解毒薬として働く抗体を産生する。ニワトリが成熟したメンドリになり産卵を始めると、抗毒素タンパク質が通過して卵黄の中に蓄積することが分かっている。次に、卵を集めて解毒薬製造に用いるタンパク質を抽出する。
【０１０７】
次に最初の動物（例えばウマまたはニワトリ）の血清を病気に罹っている動物（「宿主」）に投与して、特異的且つ反応的な抗体の供給源を与える。投与された抗体はある程度内因性の抗体のように機能して、ヘビ毒に結合してその毒性を下げる。
【０１０８】
発明の第１０の側面は、発明の第１側面のタンパク質に対し有効な抗毒素を提供する。抗毒素は、発明の第９側面に従って作ることができるが、発明の第１１側面の方法を用いてもよい。
【０１０９】
発明の更なる側面は、発明のタンパク質を薬物の設計および抗毒素のモデルとして用いることを想定している。従って発明の第１１側面は、発明の第１側面のポリペプチドの調整因子（例えばアゴニストまたはアンタゴニスト）化合物を同定するための方法を提供する。
【０１１０】
発明の第１側面のポリペプチドは、数ある薬物スクリーニング技術のいずれかにおいて化合物ライブラリーのスクリーニングに利用できる。このような化合物は、発明の第１側面のポリペプチドの活性を調整（作動または拮抗）できる。
【０１１１】
一つの態様では、方法は試験化合物を発明の第１側面のポリペプチドと接触させること、および試験化合物が発明の第１側面または第２側面のポリペプチドに結合したか判定することを含む。方法は更に、試験化合物が発明の第１側面または第２側面のポリペプチドの活性を高めるか、または下げるか判定することも含む。試験化合物が発明の第１側面または第２側面のポリペプチドの活性を高めるか、または下げるか判定する方法は当業者にとって既知であり、例えば、実験／ソフトウエアまたはＸ線結晶学を一体化することが挙げられる。
【０１１２】
発明のスクリーニング法に使用する発明のポリペプチドは溶液中で遊離していても、固体支持物に固定されても、細胞表面にあっても、あるいは細胞内に局在してもよい。
【０１１３】
試験化合物（即ち、潜在的調整因子、例えばアゴニストもしくはアンタゴニスト化合物）は、天然または修飾された基質、酵素、受容体、最大２０００Ｄａ、好ましくは８００Ｄａ以下の天然もしくは合成有機低分子のような有機低分子、ペプチド模擬体、無機分子、ペプチド、ポリペプチド、抗体、上記のものの構造もしくは機能的模擬物を含む様々な形態を取ることができる。
【０１１４】
試験化合物は、例えば細胞、無細胞調製物、化学物質ライブラリー、または天然産物の混合物から単離できる。これら調整因子（例えばアゴニストもしくはアンタゴニスト）は天然の基質もしくは修飾された基質、リガンド、酵素、受容体、または構造的もしくは機能的な模擬物でよい。このようなスクリーニング技術の好適なレビューについては、Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １（２）：第５章（１９９１）を参照。
【０１１５】
良好な調整因子（例えばアンタゴニストもしくはアゴニスト）となる可能性が最も高い化合物は、発明のポリペプチドに結合する分子である（アンタゴニストの場合、それとの結合によるポリペプチドの生物学的作用の誘導はない）。
【０１１６】
アンタゴニストは、発明のポリペプチドの受容体と競合結合する利点により二者択一的に機能するだろう。
【０１１７】
アゴニストは、発明のポリペプチドの受容体へ結合して、受容体と発明のポリペプチドとの開の結合親和性を上げることによって、二者択一的に機能するだろう。
【０１１８】
潜在的アンタゴニストとしては、発明のポリペプチドに結合し、それによってその活性を阻害または消失させる低分子の有機分子、ペプチド、ポリペプチド、および抗体が上げられる。この方法では、正常な細胞結合分子へのポリペプチドの結合が阻害され、ポリペプチドの天然の生物活性は阻止されるだろう。
【０１０９】
発明の調整因子およびアンタゴニストは、抗毒素として利用できることが当業者に理解されるだろう。
【０１２０】
上記した特定の態様では、ポリペプチドを担持している表面への試験化合物の付着を、試験化合物に直接もしくは間接的に結合させた標識物を用いて検出する簡単な結合アッセイ、または標識された競合物と競合させるアッセイを用いることができる。
【０１２１】
使用可能な薬物スクリーニングの別の技術は、関心対象のポリペプチドに対し好適な結合親和性を有する化合物の大量スクリーニングを提供する（国際特許出願ＷＯ０８４／０３５６４を参照）。この方法では、多種類の小試験化合物が固体基質上に合成され、次にこれを発明のポリペプチドと反応させて、洗浄する。ポリペプチドを固定する一つの方法は、非中和抗体を用いるものである。次に結合したポリペプチドは、当技術分野で周知の方法を用いて検出できる。精製したポリペプチドは、上記した薬物スクリーニング技術で使用するために、プレート上に直接コーティングすることもできる。
【０１２２】
Ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ法も、調整因子（例えばアゴニストまたはアンタゴニスト）の同定に用いることができる。次に、望ましい場合には、調整因子（例えばアゴニストおよびアンタゴニスト）成分の活性を実験的に確認することもできる。
【０１２３】
発明の第１２の側面は、発明の第１側面のタンパク質、発明の第２側面の核酸分子、発明の第３側面のベクター、発明の第４側面の宿主細胞、発明の８側面の抗体、発明の第１０側面の抗毒素、または発明の第１１側面の調整因子（例えばアゴニストまたはアンタゴニスト）を含む医薬組成物を提供する。
【０１２４】
本発明の医薬組成物は、薬学的に許容される担体を含んでよい。組成物は単独、または少なくとも１種類の、安定化化合物のようなその他作用物質と一緒に投与することができ、それらは食塩水、緩衝化食塩水、デキストロース、および水を含むが、これらに限定されない無菌の生体適合性の医薬担体に含めて投与してよい。
【０１２５】
本発明で利用される医薬組成物は、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、脳室内、骨髄内、包膜内、心室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻内、腸、局所、舌下、または直腸を含むが、これらに限定されない多くの経路から投与できる。
【０１２６】
活性成分に加えてこれら医薬組成物は、薬学的に利用できる、活性化合物を調合しやすくする賦形剤および補助剤を含む好適な薬学的に許容される担体を含んでよい。調剤および投与の技術に関する更なる詳細については、最新版のＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｅａｓｔｏｎ Ｐａ）に見ることができる。
【０１２７】
経口投与向けの医薬組成物は、当技術分野で周知である薬学的に許容される担体を、経口投与に適した用量で使用して調合できる。このような担体は、医薬組成物を、患者が摂取するための錠剤、ピル、ドラジェ、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液等に調合できるようにする。
【０１２８】
経口使用向けの医薬調製物は、活性化合物を固体賦形剤とを混合し、得られた顆粒混合物を加工して（必要に応じて粉砕した後）錠剤、またはドラジェ核を得ることにより入手できる。望ましい場合には、好適な補助剤を加えることができる。好適な賦形剤としては、ラクトース、ショ糖、マンニトール、およびソルビトールを含む糖；トウモロコシ、ムギ、コメ、ジャガイモまたはその他植物のデンプン；メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル−セルロース、またはカルボキシメチルセルロースナトリウムのようなセルロース；アラビアゴム、トラガントゴムを含むゴム；ならびにゼラチンおよびコラーゲンのようなタンパク質などの、炭水化物またはタンパク質が挙げられる。望ましい場合には、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、およびアルギン酸、またはアルギン酸ナトリウムといったその塩のような崩壊剤または可溶化剤を加えてもよい。
【０１２９】
ドラジェ核は、濃縮糖液のような好適なコーティングと共に用いることができ、それらはまたアラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チタン、ラッカー液、および好適な有機溶媒もしくは溶媒混合物を含んでよい。色素または顔料は、製品を区別するかまたは活性化合物の量、即ち用量の特徴を表すために錠剤またはドラジェコーティングに加えることができる。
【０１３０】
経口的に使用できる医薬調製物は、ゼラチン製のプッシュフィットカプセルならびに、ゼラチン製であり、グリセロールまたはソルビトールのようなコーティングを持つ軟質の密封カプセルが挙げられる。プッシュフィットカプセルは、ラクトースもしくはデンプンのような充填剤もしくは結合剤、タルクもしくはステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、および場合によって安定化剤と混合した活性成分を含むことができる。軟質カプセルでは、活性化合物は、安定化剤を含んでも含まなくともよい、脂肪油、液体、またはポリエチレングリコール液のような好適な液体に溶解または懸濁できる。
【０１３１】
非経口投与に好適な医薬調合物は、水溶液、好ましくはハンクス液、リンゲル液、または生理緩衝食塩水のような生理的に適合した緩衝液に調合できる。水性注射懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランのような懸濁液の粘度を上げる物質を含んでよい。これに加えて、活性化合物の懸濁液は、適切な油性注射懸濁液としても調製できる。好適な親油性溶媒またはビークルとしては、ゴマ油のような脂肪油、オレイン酸エチル、トリグリセリド、またはリポソームのような合成脂肪酸エステルが挙げられる。非脂肪ポリカチオン性アミノポリマーはデリバリーにも用いることができる。場合によっては、懸濁液は好適な安定化剤、または化合物の溶解度を上げ、且つ極めて高い濃度の溶液を調製できるようにする作用物質を含んでもよい。
【０１３２】
局所または鼻内投与の場合は、浸透対象となる具体的バリアーにとって適切である浸透剤を調合物中に使用する。このような浸透剤は当技術分野に公知である。本発明の医薬組成物は、当技術分野で既知である様式、例えば通常の混合、溶解、顆粒化、ドラジェ作成、湿式粉砕、乳化、封入化、閉じ込め、または凍結乾燥工程の手段によって製造できる。
【０１３３】
医薬組成物は塩として提供でき、且つ塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、およびコハク酸を含むが、これらに限定されない多くの酸と形成することができる。塩は、対応する遊離塩基型に比べ、水溶液またはその他プロトン性溶媒により可溶性である傾向を示す。
【０１３４】
医薬組成物は調製された後、それらは適切な容器に入れ、指定された状態の治療についてラベルを貼ることができる。このようなラベルには、投与の量、頻度、および方法が記載される。
【０１３５】
発明での使用に好適な医薬組成物としては、活性成分が所定の目的を達成するのに有効な量含まれている組成物が挙げられる。有効投与量の決定は、十分当業者の能力の範囲内である。
【０１３６】
任意の化合物の治療有効用量は、例えば腫瘍性細胞のような細胞の培養アッセイ、またはマウス、ラット、ウサギ、イヌ、もしくはブタのような動物モデルのどちらかでまず予測することができる。。動物モデルはまた、適切な濃度範囲および投与経路を決定するのにも用いることができる。このような情報を次に用いて、ヒトの投与に関し有益な用量および経路を決定することができる。
【０１３７】
治療有効用量とは、症状または状態を緩和する活性成分の量を指す。治療効力および毒性は、ＥＤ５０（集団の５０％の治療効果がある用量）、またはＬＤ５０（集団の５０％にとって致死的である用量）を統計学的に計算するといった細胞培養または実験動物での標準的な薬学的手順によって決定することができる。毒性と治療効果の用量比は、治療指数であり、それはＬＤ５０／ＥＤ５０として表すことができる。高い治療指数を示す医薬組成物が好ましい。細胞培養アッセイおよび動物研究から得たデータを用いて、ヒトに使用する場合の用量範囲を定式化する。このような組成物中に含まれる用量は、毒性がほとんど、もしくは全くないＥＤ５０を含む血中濃度の範囲内であることが好ましい。用量は、使用する投与形状、患者の感受性、および投与経路によって、この範囲内で変わる。
【０１３８】
正確な投与量は、治療を必要としている対象に関係する要因を考慮に入れながら実施者によって決められるだろう。投与量および投与は、十分なレベルの活性成分が提供されるか、または所望する効果を維持するように調整される。考慮の対象となる要因としては、疾患状態の重篤度、対象の一般健康状態、対象の年齢、体重、および性別、投与時間および頻度、薬物の組み合わせ、反応感受性、および治療に対する反応性が挙げられる。長期作用型の医薬組成物は、具体的な調合物の半減期またはクリアランス速度に応じて３〜４日おき、毎週１回、または２週に１回投与されるだろう。
【０１３９】
通常の投与量は、投与経路によって、約０．１μｇ〜１００，０００μｇ、最大合計用量約１グラムまで変わることがある。具体的な投与量およびデリバリー方法に関するガイダンスは文献中に報告されており、また一般的には当技術分野の実施者にとって入手可能なもものである。
【０１４０】
発明の第１側面のポリペプチドを医薬調製物／医薬品に使用する場合には、天然産ポリペプチドの持つ疼痛過敏機能が低下しているか、または失われているポリペプチドを用いることが望ましいだろう。これを達成するための方法は当業者には既知であり、例えば部位指定突然変異誘導が挙げられる。ポリペプチドがオハニン（配列番号１）に比べて疼痛過敏特性が低下しているか、または無いかを決定することは、例えば、以下実施例の項に記載するように、ホットプレートアッセイにてマウスに対する問題のポリペプチドおよびオハニンの作用を比較することによって経験的に決定できる。
【０１４１】
以下に更に詳しく論じるように、オハニンは腹腔内注射した場合に比べて、脳室内注射によって投与した時有意に高い効力を示すことが知られている。このことから、発明の一つの態様では、発明の成分は、例えば脳室内注射によって神経系に直接投与され、それに合わせて調合できる。発明の別の態様では、発明の成分は静脈内に投与できる。
【０１４２】
医薬品に使用するための、発明の第１側面のタンパク質、発明の第２側面の核酸分子、発明の第３側面のベクター、発明の第４側面の宿主細胞、発明の第８側面の抗体、発明の第１０側面の抗毒素、発明の第１１側面の調整因子（例えばアゴニストもしくはアンタゴニスト）に関する第１３側面。
【０１４３】
発明の第１４側面は、鎮静剤として使用する医薬品製造における、発明の第１２側面に記載の発明の第１側面のタンパク質、発明の第２側面の核酸分子、発明の第３側面のベクター、発明の第４側面の宿主細胞の使用を提供する。
【０１４４】
上記し、且つ下記に更に詳しく記載するように、オハニンのマウスへの投与は、マウスを緩慢化し、且つ運動性を下げる。それ故に、発明の各種成分は、鎮静剤として有用であろう。
【０１４５】
好ましくは、医薬品は、ブタ、ウシ、ヒト、およびウマのような温血動物を沈静化するためのものである。動物がストレス状態に対し敏感であることにより困難な問題が起こる。例えば、繁殖、輸送条件、気候等の要因により、屠殺場まで運搬される間に最大５％のブタが興奮して死亡する。動物の運搬距離が長くなり、数日または数週間を要する距離では損失はさらに大きくなり、また今日、例えばウマ、ウシ、ヒツジ、およびブタの輸送では、船または飛行機により長距離運搬されることもある。同様のことはニワトリやトリ、例えば外国産のトリについても見られ、飼育されることになる場所まで長距離運ばれることもある。このような輸送に伴う興奮状態および攻撃性は、おそらくは小屋で飼育されている豚に見られる凶暴性の原因でもあろう。ウマおよびウシのようなより大型の動物では、単に輸送だけでなく体重測定といった作業においてもその興奮性が大きな問題の原因となることがある。
【０１４６】
上記の理由から、ストレス状態にある時に興奮性の動物、特にウマ、ウシ、およびブタについては、沈静剤を使って興奮を鎮める処置が採られている。
【０１４７】
上記したように、発明の成分を医薬目的で用いる場合、オハニンタンパク質の疼痛過敏効果は低減させるか、無効にすることが一般的に望まれる。
【０１４８】
発明の成分を鎮静剤として用いる場合、前記成分を含む医薬組成物は１種類以上の追加の鎮静剤を更に含んでもよい。
【０１４９】
発明の第１５の側面は、神経学的または筋肉性の苦痛を治療するための医薬品製造における、発明の第１側面のタンパク質、発明の第２側面の核酸分子、発明の第３側面のベクター、発明の第４側面の宿主細胞、または発明の第１２側面の医薬組成物の使用を提供する。
【０１５０】
以下に記載するように、オハニンは中枢神経系に直接作用して移動低下を誘導できる。オハニンのこれらの機能が、オハニンを神経学的または筋肉性の苦痛の治療にとって有用なものにしている。本発明によって効果的に治療できる障害としてはパーキンソン病、ハンチントン舞踏病、てんかん、膀胱痙攣、座位不能、アルツハイマー病、記憶喪失、筋萎縮性側索硬化症、双極性障害、緊張病、脳腫瘍、認知症、うつ病、糖尿病性神経症、ダウン症候群、遅発性ジスキネジー、失調症、てんかん、ハンチトン病、末梢神経症、多発性硬化症、神経線維腫症、妄想性精神病、ヘルペス後神経痛、総合失調症、およびトゥレット症候群が挙げられる。本発明は失禁、喘息、気管支痙攣、シャックリ等の、振戦または筋肉痙攣が存在するか、または顕在化するその他分野にも応用できる。
【０１５１】
発明の第１６の側面は、発明の第１側面のタンパク質、発明の第２側面の核酸分子、発明の第３側面のベクター、発明の第４側面の宿主細胞、または発明の第１２側面の医薬組成物を動物に投与することを含む、動物を沈静化する方法を提供する。
【０１５２】
発明の第１７の側面は、発明の第１側面のタンパク質、発明の第２側面の核酸分子、発明の第３側面のベクター、または発明の第４側面の宿主細胞を患者に投与することを含む、神経系または筋肉系の疾患を患う患者を治療する方法を提供する。
【０１５３】
発明の第１８の側面は、発明の第１側面のタンパク質を含む防御用組成物を提供する。
【０１５４】
防御用組成物は、個人的な防御目的に用いられる組成物を含む。発明の第１８側面の組成物は、例えば潜在的または実際の個人攻撃に対抗しての使用に有益であり、公人または法的処置によって用いられる。発明の第１８側面の防御用組成物の調合については、上記の発明の医薬組成物について論じた部分に見出すことができる。
【０１５５】
発明の第１８側面の一つの態様では、組成物は攻撃者等に対して素早く投与できるようにスプレーの形で提供される。
【０１５６】
当業者は、攻撃者を迅速に無能化することが望まれる場合に、吸収が容易であり、且つそれ自体が防御用組成物としての使用に好適である調合物を考案できるだろう。
【０１５７】
オハニンの疼痛を誘導する能力と運動性を低下させる能力の両方が、防御を目的とする場合にオハニンを有用なものにしている。更には、以下論じるようにオハニンが投与されたマウスは、麻痺または脳内出血もしくは壊死の明瞭な兆候を示すことなく回復した。このことからオハニンの作用は可逆的と考えられ、これは個人的安全および法的処置のための調合物としてオハニンを特に好適なものにしている。
【０１５８】
発明は特定の箇所では、発明の特別な側面に関係して記載されているが、当業者はそのコメントが発明の他の側面にも等しく当てはまること、記述をそのように解釈しなければならないことを了解するだろう。
【０１５９】
本発明の実施は、特に明記しない限り、当業者の技術水準内である分子生物学、微生物学、および組換え体ＤＮＡ技術の通常の技術を用いる。このような技術は、文献に十分に説明されている。参考となるテキストの例としては次のものが挙げられる：Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（２０００）およびその後の版。
【実施例】
【０１６０】
実験手順
材料
凍結乾燥されたキングコブラの粗毒液はＰＴ Ｖｅｎｏｍ Ｉｎｄｏ Ｐｅｒｓａｄａ（Ｊａｋａｒｔａ、Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ）から得た。キングコブラの毒腺および肝臓は、寛大にもＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ、ＳｉｎｇａｐｏｒｅのＤｒ Ｂｒｙａｎ Ｇ．Ｆｒｙから提供された。腺および肝臓を直ちに液体窒素で凍結し、使用時まで−７０℃で維持した。全ての化学物質および試薬は、次のものを除いて全てＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）より購入した：Ｌｙｓ−ＣエンドペプチダーゼおよびトリプシンはＷａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｏｓａｋａ、Ｊａｐａｎ）より購入し、エドマン分解Ｎ末端配列決定用の試薬（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）、アセトニトリル（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＬＢ培地および寒天はＱ．ＢＩＯｇｅｎｅ（Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）より購入し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル標準物質（Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ ｂｒｏａｄ ｒａｎｇｅ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ標準物質およびＰｒｅｃｉｓｉｏｎ ｐｌｕｓ ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄｄｕａｌ−ｃｏｌｏｒ標準物質）はＢｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）から購入した。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ３０ Ｈｉｌｏａｄ（１６／６０）およびμＲＰＣ Ｃ２／Ｃ１８（１０μ １２０Å ２．１ｍｍ×１００ｍｍ）カラムはＡｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ（Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）から得た。ＲＰ−Ｊｕｐｉｔｅｒ Ｃ１８（５μ ３００Å １ｍｍ×１５０ｍｍ）およびＲＰ−Ｊｕｐｉｔｅｒ Ｃ１８（１０μ ３００Å １０ｍｍ×２５０ｍｍ）カラムはＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）から購入した。ニッケル−ＮＴＡアガロースはＱｉａｇｅｎ ＧｍｂＨ（Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。オリゴヌクレオチドは全てＢｉｏＢａｓｉｃ（Ｓｈａｎｇｈａｉ、Ｃｈｉｎａ）および１^ｓｔ Ｂａｓｅ Ｐｔｅ．Ｌｔｄ．（Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ）から購入した。Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑポリメーラゼ、ｄＮＴＰミックス、およびラダー（５０ｂｐ、１００ｂｐ、および１Ｋｂ Ｐｌｕｓ）はＧＩＢＣＯ ＢＲＬ（登録商標）（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）から購入した。使用した全ての制限エンドヌクレアーゼは、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（登録商標）（Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ、ＵＳＡ）から、またｐＧＥＭＴ−ｅａｓｙベクターはＰｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）から得た。ＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｍｉｎｉキット、ＱＩＡＧＥＮ（登録商標）ＯｎｅＳｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲキット、ＱＩＡｐｒｅｐ（登録商標）Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット、ＱＩＡＥＸ ＩＩ Ｇｅｌ ＥｘｔｒａｃｔｉｏｎキットおよびＤＮｅａｓｙ（登録商標）ＴｉｓｓｕｅキットはＱｉａｇｅｎ ＧｍｂＨ（Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。ＳＭＡＲＴ（商標）ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ ＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎキットはＣｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）から購入した。ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）ＢｉｇＤｙｅ（商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎキット（バージョン３．０）はＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）から購入した。水はＭｉｌｌｉＱシステム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使って精製した。
【０１６１】
動物
動物実験には雄のＳｗｉｓｓアルビノマウス（２０±２ｇ）を使用した。環境の変化および行動研究中の取り扱いからの影響を軽減するために、それぞれの場合について、マウスをＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｈｏｌｄｉｎｇ Ｃｅｎｔｅｒおよび研究環境に３日間および少なくとも実験前１時間順応させた。動物は標準条件に維持され、食事（低タンパク質食）および水は自由に摂取させた。動物は照明管理された（１２時間の明暗サイクル、０７：００に点灯）２３℃、６０％相対湿度の室の中でケージ当たり４匹ずつ飼育した。全ての行動実験は、０８：３０時〜１３：００時の間に行われた。各試験群は、少なくとも７匹のマウスから成り、各マウスは１回のみ使用した。全ての動物実験は、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｉｎｇｐｏｒｅが定めるガイドラインに従って行われた（Ｈｏｗａｒｄ−Ｊｏｎｅｓ（１０）に適合）。
【０１６２】
キングコブラ毒液の液体クロマトグラフィー−質量分析装置（ＬＣ／ＭＳ）
凍結乾燥された粗毒液（６０μｇ）は、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｓｃｉｅｘ ＡＰＩ３００ ＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステム質量分析装置（Ｔｈｏｒｎｔｏｎ、Ｃａｎａｄａ）に接続された、０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）で平衡化しておいたＲＰ−Ｊｕｐｉｔｅｒ Ｃ１８分析カラムに直接注入する前に、２０μｌのＭｉｌｌｉＱ水に溶解した。粗混合液は、８０％（ｖ／ｖ）ＡＣＮ（アセトニトリル）の０．１％ＴＦＡ溶液の直線勾配を用いて、流速５０μｌ／分で溶出した。ＥＳＩ／ＭＳ（エレクトロスプレー質量スペクトル）データは、オリフィス電子８０Ｖの陽イオンモードで得た。窒素は、カーテンガスとして流速０．６リットル／分で、また噴霧ガスとしては１００ｐｓｉの圧力設定で使用した。完全スキャンデータを、５００〜３０００ｍ／ｚのイオン幅について、０．１Ｄａ刻みに獲得した。データ処理は、ＢｉｏＭｕｌｔｉｖｉｅｗソフトウエア（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｓｃｉｅｘ、Ｔｈｏｒｎｔｏｎ、Ｃａｎａｄａ）の助けを借りて行った。
【０１６３】
単離および精製
凍結乾燥された粗毒液（各２００ｍｇの複数のバッチ）を２ｍｌのＭｉｌｌｉＱ水に溶解し、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）で予備平衡化しておいたＳｕｐｅｒｄｅｘ ３０カラムにかけた。タンパク質はＦＰＬＣ（Ｆａｓｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｓｙｓｔｅｍ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）で５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）を用いて流速１ｍｌ／分で溶出した。タンパク質の溶出は、２８０ｎｍでモニタリングした。次に関心対象の分画をＶｉｓｉｏｎ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて、０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）で平衡化したＲＰ−Ｊｕｐｉｔｅｒ Ｃ１８半調製カラムにかけた。結合したタンパク質は、８０％ＡＣＮの０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）溶液の直線勾配を用いて、流速２ｍｌ／分で１時間かけて溶出した。タンパク質の溶出は２８０ｎｍおよび２１５ｎｍでモニタリングした。関心対象のタンパク質は、質量を決定して（以下に記載する）同定した。
【０１６４】
還元およびピリジルエチル化
凍結乾燥し精製された関心対象タンパク質を、既に報告した方法（１１）を用いて還元し、ピリジルエチル化した。タンパク質（５００μｇ）を５００μｌの変性緩衝液（６Ｍ ＧｄｎＣｌ（グアニジン塩酸）、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０）に溶解した。β−ＭＥ（β−メルカプトエタノール）を１０μｌ加えた後、混合液を３７℃で２時間、真空下でインキュベーションした。続いて４−ビニルピリジンを２０μｌ混合液に加えて、室温（〜２５℃）で更に２時間、真空下に維持した。還元し、ピリジルエチル化されたタンパク質を、ＳＭＡＲＴ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）上の０．１％のＴＦＡ（ｖ／ｖ）で平衡化したＲＰ−μＲＰＣ Ｃ２／Ｃ１８分析カラムにかけた。結合したタンパク質を、８０％ＡＣＮの０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）溶液の直線勾配を用いて、１時間かけて流速２００μｌ／分で溶出した。タンパク質の溶出は２８０ｎｍおよび２１５ｎｍでモニタリングした。
【０１６５】
酵素切断
Ｌｙｓ−Ｃエンドペプチダーゼおよびトリプシンによるピリジルエチル化タンパク質の消化を、３７℃で２０時間行った。タンパク質（１５０μｇ）を１５０μｌの酵素消化緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、４Ｍ尿素、５ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ７．５）に溶解し、プロテアーゼを１：５０（ｗ／ｗ）の割合で加えた。
【０１６６】
化学切断
還元ピリジルエチル化タンパク質のギ酸による消化（Ａｓｐ特異的）は、Ｉｎｇｌｉｓ（１２）が記載した通りに実施した。簡単に説明すると、ピリジルエチル化タンパク質１５０μｇをガラス製バイアルに入った２％のギ酸に溶解し、次に−３０℃で凍結した。続いて真空下、室温でバイアルを融解してから開封した。次にバイアルを１０８℃で２時間加熱し、室温まで冷ました。
【０１６７】
消化されたペプチドの分離
酵素消化および化学的消化の両方によって生成されたペプチドを、ＳＭＡＲＴ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）上のＲＰ−μＲＰＣ Ｃ２／Ｃ１８分析カラムを用いて、８０％ＡＣＮの０．１％ＴＧＡ（ｖ／ｖ）溶液の直線勾配を用い、１時間かけて分画化した。ペプチドの溶出を２１５ｎｍおよび２８０ｎｍでモニタリングした。
【０１６８】
エレクトロスプレーイオン化−質量分析装置（ＥＳＩ／ＭＳ）
ＥＳＩ／ＭＳを用いて、未変性タンパク質およびペプチド両方の正確な質量および純度（±０．０１％）を決定した。ＲＰ−ＨＰＬＣ分画をＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｓｃｉｅｘ ＡＰＩ３００ ＬＣ／ＭＣ／ＭＳシステム質量分析装置（Ｔｈｏｒｎｔｏｎ、Ｃａｎａｄａ）に直接注入した。イオンスプレー、オリフィス、およびリングの電圧はそれぞれ４６００Ｖ、５０Ｖ、および３５０Ｖに設定した。窒素を流速０．６リットル／分でカーテンガスとして、また圧力を１００ｐｓｉに設定して噴霧ガスとして使用した。質量はＬＣ−１０ＡＤ Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙポンプを溶媒デリバリーシステム（４０％ＡＣＮ、０．１％ＴＦＡ溶液）として用いて流速５０μｌ／分で直接注入し決定した。ＢｉｏＭｕｌｔｉｖｉｅｗソフトウエアを用いて、未加工の質量スペクトルを分析し、デコンボリューションした。
【０１６９】
アミノ末端配列の決定
未変性および消化したペプチドのＮ末端の配列は、オンライン７８５Ａ ＰＴＨ−アミノ酸分析装置と一緒にＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ ４９４パルス液相タンパク質シーケンサー（Ｐｒｏｃｉｓｅ）を用い、自動エドマン分解によって決定した。次に標準的なクロマトグラムを用いて各分離プロフィールをマッピングして、誘導体化されたＰＴＨ−アミノ酸を連続的に同定した。
【０１７０】
タンパク質投与方法
ｉ．ｐ．（腹腔内投与）経路から注射される容積は２００μｌであり、タンパク質は水に溶解した。ｉ．ｃ．ｖ．（脳室内）注射は、頭蓋の頂部から２ｍｍまで通るように改良された針の付いた１０μｌのルアーチップＨａｍｉｌｔｏｎマイクロシリンジを使ってブレグマの側方１．５ｍｍ、後方１．０ｍｍにある穿刺点を通して、２μｌの容積で行った（１３）。ｉ．ｃ．ｖ注射用のタンパク質はＡＣＳＦ（人工脳脊髄液）に溶解した。針を回転させながら引き抜いた。これら２種類の投与方法を、移動活動およびホットプレート実験に用いた。
【０１７１】
Ｉｎ ｖｉｖｏ毒性試験
未変性のタンパク質をマウスに０．１ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、および１０ｍｇ／ｋｇの用量でｉ．ｐ．注射した（ｎ＝２）。注射後、マウスの行動観察を１５分おきに、６時間まで記録した。動物は２４時間後に屠殺し、死体解剖を行った。
【０１７２】
移動活動
マウスの移動活動は、赤外線センサー、シグナル増幅回路、および制御回路から構成されるＮＳ−ＡＳ０１活動モニタリングシステム（Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）で測定した。マウスの運動は、マウスの体温に付随する赤外線に基づいて、赤外線センサーによって検出された。各マウスを飼育ケージから取り出し、ケージ全体に８チャンネルの赤外線センサーを配置したケージ（１２ｃｍ×１２ｃｍ×３０ｃｍ）に一匹ずつ入れた。ケージの床には、約４０ｍｌのおがくずを敷した。別々のケージに入れた８匹の動物の運動活動を同時に測定した。４ｃｍ以上の距離の運動は全て赤外線センサーによって検知され、それぞれが注射されたマウスの全身運動の数値となった。動物の活動性は、予備走行実験を実施して評価しておいた。その後の実験に用いられた動物は、最初に行ったこの２０分間の予備走行実験中に最低で４５０カウント、最大で８５０カウントを示した。次に活動性のマウスにタンパク質を投与して、同じ運動活動モニタリングシステムにかけた。その直後から移動活動のカウントを１０分間隔で８０分間、コンピュータ接続分析システム（ＡＢ Ｓｙｓｔｅｍ−２４Ａ、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）を使って集めた。
【０１７３】
ホットプレートアッセイ
各マウスを透明なプラスチック製の輪（直径１２ｃｍ、高さ１３ｃｍ）を使って拘束した状態でホットプレート（５５℃）の上に置いた。ホットプレート装置は滑らかな金属表面１５ｃｍ×１５ｃｍを持つ密封された木製の箱で、水槽（Ｍｏｄｅｌ Ｙ２２ Ｇｒａｎｔ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）を使って加熱した。マウスをホットプレートの上にそっと置いてから、次の反応の一つ、すなわち、ＷｏｏｌｆｅとＭａｃＤｏｎａｌｄが記載したような（１４）跳躍、なめること、または後ろ脚の踏みつけのうちの一つを初めて示した時間までの潜伏期間を測定した。ホットプレートアッセイは、ｉ．ｐ．またはｉ．ｃ．ｖ．経路による薬物投与から１５分後に行った。
【０１７４】
結果の分析および統計学
移動活動の変化は、反復測定しながら二元配置分散分析によって分析した。オハニンによって誘導された疼痛過敏作用は、一元配置分散分析を用いて分析した。全ての分散分析は続いて、ボンフェローニ補正により事後分析を行った。統計的有意は、ｐ＜０．０５の時とした。
【０１７５】
合成遺伝子のデザイン、アセンブリ、およびクローニング
３６９ｂｐを含む完全長の合成遺伝子は２つの断片からアセンブルしたが、各断片は、特異的アニーリングを促進するために５０％を超える高いＧＣ含有量を持つ２１ｂｐの重複領域をそれぞれ持つ、９６ｂｐ〜１１７ｂｐの２つの重複オリゴヌクレオチドから組み立てられた。プライマー１（５’−ＧＧＡＡＴＴＣＧＴＣＧＡＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＣＴＡＧＣＣＣＧＣＣＧＧＧＴＡＡＣＴＧＧＣＡＧＡＡＡＧＣＧＧＡＣＧＴＣＡＣＣＴＴＣＧＡＴＡＧＣＡＡＣＡＣＣＧＣＧＴＴＣＧＡＡＡＧＣＣＴＧＧＴＧＧＴＧＡＧＣＣＣＧＧＡＣ−３’）およびプライマー２（５’−ＴＣＣＣＣＣＣＧＧＧＣＴＧＣＣＴＡＧＧＡＣＧＣＡＣＧＧＧＣＴＣＧＡＧＧＡＧＡＡＧＣＧＴＴＣＣＧＧＧＣＴＡＴＣＣＧＧＣＡＣＡＣＣＴＴＴＣＧＧＣＡＣＡＣＣＡＡＣＧＴＴＴＴＣＣＡＣＧＧＴＴＴＴＴＴＴＧＴＣＣＧＧＧＣＴＣＡＣＣＡＣＣＡＧＧＣＴ−３’）を用いて、第１断片を調製した；プライマー３（５’−ＴＣＣＣＣＣＣＧＧＧＴＴＴＣＣＧＴＴＣＣＧＧＡＡＡＡＣＡＣＴＴＣＴＴＣＧＡＧＧＴＧＡＡＡＴＡＣＧＧＴＡＣＣＣＡＧＣＧＴＧＡＡＴＧＧＧＣＧＧＴＧＧＧＧＣＴＡＧＣＧＧＧＴＡＡＡＡＧＣＧＴＧＡＡＧＣＧＴＡＡＧＧＧＴＴＡＣ−３’）およびプライマー４（５’−ＧＡＣＴＡＧＴＡＡＧＣＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＡＣＡＧＡＣＣＴＴＴＣＴＧＣＣＡＧＡＴＡＣＧＴＴＣＴＴＣＣＧＣＡＣＣＡＧＣＣＴＴＡＡＧＴＡＡＣＣＣＴＴＡＣＧＣＴＴＣＡＣＧＣＴ−３’）を用いて第２断片を調製した。下線を付したヌクレオチドは、ＸｍａＩ制限部位のフランキング配列である。両断片を生成するＰＣＲ混合物は、合計容積２５μｌの中に最終濃度０．３ＵのＰｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑポリメラーゼ、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ混合物、および０．２μＭのプライマーを含んでいた。増幅条件は次の通りである：９４℃／１分間を１サイクル；９４℃／３０秒、５５℃／３０秒、７２℃／１分間を２０サイクル；７２℃／５分間の最終伸長。２つの断片はＸｍａＩで消化し、一つに連結して完全長の合成遺伝子を得た。この連結産物をｐＧＥＭＴ−ｅａｓｙベクターにクローニングし、配列を決定した。
【０１７６】
組換え体オハニンの発現
発現ベクター内にクローニングするために、３６９ｂｐの合成遺伝子断片を制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩで二重消化した。ベクターＭ（ｐＥＴ３２Ａの改良版）を用いて、大腸菌ＢＬ２１／ＤＥ株にて合成オハニンを発現させた。サブクローニングの結果、Ｎ末端がヘキサヒスチジンタグから成る融合タンパク質が発現した。発現させるために、ベクターＭ／オハニンを含む単一コロニーを１００μｇ／ｍｌのＡｍｐ（アンピシリン）を含むＬＢ培地に接種し、３７℃、２００ｒｐｍで１４時間インキュベーションした。一晩培養したものを１００μｇ／ｍｌのＡｍｐを１：５０の希釈率で含む新鮮なＬＢ培地に接種した。再度、細菌培養物を３７℃、２００ｒｐｍで、培養物のＡ_６００が約０．６に達するまでインキュベーションした。次にイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を最終濃度０．１ｍＭになるように加えて発現を誘導し、さらに細菌を集める前に１６℃、２００ｒｐｍで１６時間インキュベーションした。細菌細胞は使用時まで−８０℃で保管した。大腸菌での組換え体タンパク質の発現は、Ｌａｅｍｍｌｉ（１５）の方法に従った、１５％のアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動）によって分析した。
【０１７７】
Ｈｉｓタグの付いた融合タンパク質を発現している細胞を１５分間融解し、最終濃度０．５ｍｇ／ｍｌのリゾチームを用いて、４℃で１５分間溶解し、続いて適切に冷却しながら、溶解緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭ β−ＭＥ ｐＨ８．０）の中で軽く超音波処理（１分間処理を６回）を加えた。１６，０００ｒｐｍで遠心分離した後、封入体および細胞破砕物を含む沈殿を集め、変性条件（６Ｍ ＧｄｎＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭ β−ＭＥｐＨ８．０）で結合緩衝液中に再懸濁した。
【０１７８】
融合タンパク質の精製、リフォールディング（再折りたたみ）、および切断
沈殿物溶解のプロセスは、変性条件の下、結合緩衝液を用いて４℃で少なくとも４時間続けた。結合緩衝液で溶解できなかった細胞破砕物は、遠心分離によって取り除いた。上清を結合緩衝液で事前に平衡化しておいた荷電Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂カラムにかけた。アフィニティークロマトグラフィーは製造元のガイドラインに従って実施した。洗浄緩衝液（１０ｍＭのＩＭＤ（イミダゾール）、６Ｍ ＧｄｎＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭ β−ＭＥ ｐＨ８．０）を用いて徹底的に洗浄した後、結合したタンパク質を最小容積の溶出緩衝液（２５０ｍＭ ＩＭＤ、６Ｍ ＧｄｎＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭ β−ＭＥ ｐＨ８．０）を用いて溶出した。融合タンパク質の溶出および濃度は２８０ｎｍでモニタリングした。
【０１７９】
続くリフォールディングの段階は全て４℃で行った。最初に変性した融合タンパク質の濃度を、２８０ｎｍでモニタリングした時に約６ｍｇ／ｍｌになるよう溶出緩衝液を用いて調節した。次に変性した融合タンパク質１５ｍｇ（２．５ｍｌ）を５ｍＭ β−ＭＥを含むＭｉｌｌｉＱ水中にゆっくりと希釈した。５ｍＭ β−ＭＥを含むＭｉｌｌｉＱ水をペリスタルティックポンプ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて流速５０μｌ／分で、激しく攪拌している変性融合タンパク質の入ったビーカーにＧｄｎＣｌの濃度がゆっくりと１Ｍに低下するまで送り込んだ。希釈された、折りたたまれていないタンパク質を、２００倍過剰量の、５ｍＭ β−ＭＥを含むＭｉｌｌｉＱ水に対し、１２時間毎に交換しながら、３６時間透析した。
【０１８０】
凍結乾燥したリフォールディングされた融合タンパク質（１ｍｇ／ｍｌ）を０．１Ｍ ＨＣｌに溶解した。Ｍｅｔ含量に対し１００：１モル過剰量のＣＮＢｒを加える前に、溶液にＮ_２を３分間フラッシングした。ＣＮＢｒ（ブロモシアン）の溶液は、最終濃度が１００ｍｇ／ｍｌになるように適当量の固体を１００％ＡＣＮに溶解して実験前に新たに調製した。反応混合液は、ＲＰ−ＨＬＰＣにかけて精製する前に、室温、暗所で２４時間インキュベーションした。
【０１８１】
円二色性（ＣＤ）スペクトルの測定
未変性および組換え体オハニンの二次構造は、経路長２ｍｍのセルとＪａｓｃｏ Ｊ８１０分光偏光計（Ｊａｓｃｏ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）を用いて、２６０ｎｍから１９０ｎｍの波長域について２２℃でＵＶ ＣＤスペクトルを記録して測定した。キュベットチャンバーは、実験前および実験中、持続的に窒素でパージした。未変性および組換え体タンパク質の測定は共にＭｉｌｌｉＱ水の中で行い、３回のスキャンの平均を取って、良好なシグナル対ノイズ比を得た。結果はｄｅｇ．ｃｍ^２．ｄｍｏｌ^−１を単位とした平均残留楕円率（θ）として表した。αヘリックス、βシート、およびランダムコイル含有量は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｍｂｌ−ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｄｅ／〜ａｎｄｒａｄｅ／ｋ２ｄ／に記載されている方法を用いて見積もった。
【０１８２】
トータルＲＮＡの単離
トータルＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｍｉｎｉキットの製造元のプロトコールに従ってキングコブラの毒液から単離した。簡単に説明すると、毒液腺組織（３０ｍｇ）を液体窒素中で、モーターおよび−８０℃に前もって冷却しておいた乳棒を用いて粉砕し、さらにＨｅｉｄｏｌｐｈ ＤＩＡＸ６００ホモジェナイザー（Ｓｃｈｗａｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて６００μｌの緩衝液ＲＬＴと共に更にホモジェナイズした。完全に均一になった溶解物を２０〜３０秒後に得て、溶解物を最大速度で３分間遠心分離した。透明になった溶解物を新しい１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに移した。７０％エタノール（５５０μｌ）を溶解物に加え、ピペッティングによってよく混合した。次に混合液を、１５秒間、１３，０００ｒｐｍの遠心分離にかけるための２ｍｌの収集用チューブの上にセットしたＲＮｅａｓｙミニスピンカラムに連続的にかけた。ピペットを使って緩衝液ＲＷ１（７００μｌ）をＲＮｅａｓｙカラムに加え、カラムを１５秒間、１３，０００ｒｐｍで遠心分離して洗浄した。ＲＮｅａｓｙカラムを新しい採取用チューブに移した。緩衝液ＲＰＥ（５００μｌ）を用いてＲＮｅａｓｙカラムを１５秒間、１３，０００ｒｐｍで洗浄した。ピペットを使って更に５００μｌの緩衝液ＲＰＥをＲＮｅａｓｙカラムに加え、２分間、最大速度で遠心分離してＲＮｅａｓｙ膜を乾かした。ＲＮｅａｓｙカラムを新しい１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに移した。無ＲＮａｓｅ水（４０μｌ）をＲＮｅａｓｙ膜の上に直接加えた。室温で１分間インキュベーションした後、１分間、１４，０００ｒｐｍで遠心分離を行い膜からＲＮＡを溶出した。ＲＮＡの完全性は、変性アガロースゲル電気泳動によって調べた。
【０１８３】
逆転写酵素−ポリメラーゼチェインリアクション（ＲＴ−ＰＣＲ）
遺伝子特異的配列を生成するために、ＱＩＡＧＥＮ（登録商標）ＯｎｅＳｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲキットを用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。簡単に説明すると、ＲＴ−ＰＣＲ混合液は合計容積５０μｌの中に２μｌのＱＩＡＧＥＮ ＯｎｅＳｔｅｐ ＲＴ−ＰＣ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ、ならびに最終濃度２５０ｎｇのトータルＲＮＡ、０．４ｍＭのｄＮＴＰ混合物、および０．６μＭの縮重プライマーを含んでいた。使用した縮重プライマーは：ＲＴ１センスプライマー５’−ＧＧＮＡＡＹＴＧＧＣＡＲＡＡＲＧＣＮＧＡＹ−３’およびＲＴ２アンチセンスプライマー５’−ＣＣＡＣＣＡＮＡＲＮＣＣＹＴＴＹＴＧＣＣＡ−３’であった。逆転写および増幅条件は次の通りである：逆転写、５０℃／３０分間；初期ＰＣＲ活性化段階、９５℃／１５分間；直後に９４℃／１分間の変性、５０℃／１分間のアニーリング、７２℃／２分間の伸長の３段階サーマルサイクリングを３０サイクル；および最終伸長、７２℃／１０分間。次にＰＣＲ産物を１．５％ＴＡＥアガロースゲル電気泳動で分離した。ｐＧＥＭＴ−ｅａｓｙベクターに連結する前に最も強いバンドを切り出し、精製した。ｐＧＥＭＴ−ｅａｓｙベクター内の挿入体の配列を、Ｔ７およびＳＰ６プライマーを用いて両鎖について、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）３１００Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いてジデオキシチェインターミネーション法により決定した。ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）ＢｉｇＤｙｅ（商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎキット（バージョン３．０）を用いてサイクルシークエンシング反応を行った。配列データの分析は、Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ａｎａｌｙｓｉｓ ３．７（Ｓａｍｐｌｅ Ｍａｎａｇｅｒ）ソフトウエア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて行った。
【０１８４】
ｃＤＮＡ末端の５’−および３’−迅速増幅（ＲＡＣＥ）
５’−および３’−ＲＡＣＥ−Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡライブラリーは、ＳＭＡＲＴ（商標）ＲＡＣＥキットを、製造元プロトコール通りに使用して構築した。ｃＤＮＡ増幅の場合はＰＣＲ反応混合液を調製した。５’−ＲＡＣＥ反応混合液は、合計容積２５μｌの中に、２．５μｌの５’−ＲＡＣＥ Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ、５μｌのＵｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｉｍｅｒ Ｍｉｘ（ＵＰＭ）、ならびに最終濃度１．５ＵのＰｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑポリメラーゼ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ_２、０．２ｍＭのｄＮＴＰ混合物、および０．２μＭのアンチセンスプライマー（ＧＳＰ２）（５’−ＣＴＴＣＣＣＡＧＣＴＡＡＣＣＣＡＡＣＡＧＣＣＣＡＴＴＣＣＣ−３’）を含んだ。３段階のサーマルサイクリングプロフィールは次の通りである：９４℃／１分間のホットスタートを１サイクル；９４℃／３０秒間の変性、６７℃／３０秒間のアニーリング、７２℃／２分間の伸長を３０サイクル、それに続いて７２℃／１０分間の最終伸長である。完全長のｃＤＮＡ配列を生ずる３’−ＲＡＣＥ反応混合液は、合計容積２５μｌ中に、２．５μｌの５’−ＲＡＣＥ Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ、５μｌのＵｎｉｖｅｒｓａｌ ＰｒｉｍｅｒＭｉｘ（ＵＰＭ）、および最終濃度１．５ＵのＰｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑポリメラーゼ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ_２、０．２ｍＭのｄＮＴＰ混合物、および０．２μＭのセンスプライマー（ＧＳＰ１）（５’−ＧＡＴＣＡＴＴＴＧＡＴＣＣＡＧＡＧＡＡＧＡＣＡＣＡＧＴＣＴＣ−３’）を含んだ。３段階のサーマルサイクリングプロフィールは次の通りである：９４℃／１分間のホットスタートを１サイクル；９４℃／３０秒間の変性、６８℃／３０秒間のアニーリング、７２℃／２分間の伸長を３０サイクル、それに続いて７２℃／１０分間の最終伸長である。ＰＣＲ産物は１．５％ＴＡＥアガロースゲル電気泳動で分離した。ｐＧＥＭＴ−ｅａｓｙベクターに連結する前に最も強いバンドを切り出し、精製した。完全長のＲＡＣＥクローンの配列を決定し、ＤＮＡｓｉｓ Ｆｏｒ Ｗｉｎｄｏｗｓ（バージョン２．５）から入手できるコンティグ結合方法を用いてアセンブルした。
【０１８５】
組換え体プローオハニンの発現
シグナルペプチド領域を除く全オープンリーディングフレームをカバーしたｃＤＮＡに、ＰＣＲを用いて両端に制限部位を加えた。ｃＤＮＡ断片の導入および増幅に使用したプライマーは次の通りである：センスプライマー（１９Ｋ１）５’−ＧＴＣＧＡＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧＴＣＡＣＣＴＣＣＴＧＧＧＡＡＴＴＧＧＣＡＧ−３’およびアンチセンスプライマー（１９Ｋ２）５’−ＡＡＧＣＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＡＡＧＡＴＴＴＧＣＧＡＧＴＧＡＡＡＣＡＣＧ−３’。ＰＣＲ反応混合液は、合計容積２５μｌ中に、最終濃度１．５ＵのＰｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑポリメラーゼ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ_２、０．２ｍＭのｄＮＴＰ混合物、および０．２μＭを含んだ。３段階のサーマルサイクリングプロフィールは次の通りである：９４℃／１分間のホットスタートを１サイクル；９４℃／１分間の変性、７０℃／３０秒間のアニーリング、７２℃／１分間の伸長を３０サイクル、それに続いて７２℃／５分間の最終伸長である。ゲル精製したＰＣＲ産物を、発現ベクター内にクローニングするために制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩで消化した。発現ベクターであるベクターＭを用いて、プロ−オハニンを大腸菌ＢＬ２１／ＤＥ３株で発現した。サブクローニングの結果、Ｎ末端領域がヘキサヒスチジンタグから成る融合タンパク質が発現した。
【０１８６】
発現を目的として、ベクターＭ／プロ−オハニンを含む単一コロニーを１００μｇ／ｍｌのＡｍｐを含むＬＢ培地に接種し、３７℃、２００ｒｐｍで振盪しながら一晩培養した。種培養物を、１００μｇ／ｍｌのＡｍｐを１：５０の希釈率で含む新鮮なＬＢ培地に接種した。再度、細菌培養物を３７℃で、２００ｒｐｍで振盪しながら、培養物のＡ_６００が０．６に達するまで培養した。ＩＰＴＧを最終濃度０．１ｍＭになるように加えて発現を誘導した。さらに細菌を集める前に１６℃で、２００ｒｐｍで振盪しながら更に培養した。細菌培養物を３０分間、６，０００ｒｐｍで遠沈した。Ｈｉｓタグを発現している細胞を最終濃度０．５ｍｇ／ｍｌのリゾチームを用いて、４℃で１５分間溶解し、続いて溶解緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭ β−ＭＥ ｐＨ８．０）中で、適切に冷却しながら軽く超音波処理した。１６，０００ｒｐｍで遠心分離した後、上清を集めた。
【０１８７】
融合タンパク質の精製および切断
上清を荷電Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂カラムにかけた。アフィニティークロマトグラフィーは製造元のガイドラインに従って実施した。洗浄緩衝液（１０ｍＭ ＩＭＤ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭ β−ＭＥ ｐＨ８．０）を用いて徹底的に洗浄した後、結合したタンパク質を最小容積の溶出緩衝液（２５０ｍＭ ＩＭＤ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭ β−ＭＥ ｐＨ８．０）を用いて溶出した。融合タンパク質の溶出および濃度は２８０ｎｍでモニタリングした。
【０１８８】
凍結乾燥した純粋な融合タンパク質をＭｉｌｌｉＱ水に、０．５ｍｇ／ｍｌの濃度になるように溶解した。保存トロンビンはＭｉｌｌｉＱ水を使って１Ｕ／μｌの濃度に調製した。次にトロンビンを、組換え体タンパク質２００μｇに対しプロテアーゼ１Ｕの割合で加え、２２℃でゆっくり振盪しながら切断反応を１６時間続けた。大腸菌での組換え体タンパク質の発現および切断は、Ｌａｅｍｍｌｉ（１５）の方法に従った、１５％のアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。切断された組換え体タンパク質は、Ｊｕｐｉｔｅｒ Ｃ１８半調製カラムを用いたＲＰ−ＨＰＬＣによって、その融合ペプチドおよびトロンビンから分離された。組換え体タンパク質の確認および正確な分子量（±０．０１％）は、エドマン分解配列決定およびＥＳＩ／ＭＳによって決定した。
【０１８９】
ゲノムＤＮＡの単離
ゲノムＤＮＡは、ＤＮｅａｓｙ（登録商標）Ｔｉｓｓｕｅキットの製造元のプロトコールに従ってキングコブラの肝臓組織から単離した。簡単に説明すると、肝臓組織（２５ｍｇ）を液体窒素中で、モーターおよび−８０℃に前もって冷却しておいた乳棒を用いて粉砕した。組織粉末を新しい１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに移した。緩衝液ＡＴＬおよびプロテイナーゼＫをそれぞれ１８０μｌおよび２０μｌ加えて、細胞を溶解した。溶解物を振盪中の水槽の中で、５５℃でインキュベーションした。３時間後、４００μｇのＲＮａｓｅＡを加え、ゆっくり混合し、１６℃で２分間インキュベーションしてＲＮＡ汚染を防止した。７０℃で１０分間インキュベーションする前に、緩衝液ＡＬ（２００μｌ）を加えて、ゆっくり混合した。１００％エタノール（２００μｌ）を溶解物に加えてゲノムＤＮＡを沈殿させた。１分間、８，０００ｒｐｍで遠心分離するために、溶解物および白色の沈殿の混合物を２ｍｌ採取チューブ上に設置したＤＮｅａｓｙミニスピンカラムにかけた。ＤＮｅａｓｙスピンカラムを新しい採取用チューブに移した。緩衝液ＡＷ１（５００μｌ）を用いてＤＮｅａｓｙカラム中でゲノムＤＮＡを洗浄し、１分間、８，０００ｒｐｍで遠心分離した。さらに５００μｌの緩衝液ＡＷ２を用いてゲノムＤＮＡを洗浄してからスピンカラムをさらに１４，０００ｒｐｍ、３分間の遠心分離にかけ、次の溶出時に残留エタノールが確実に持ち込まれれないようにした。ＤＮｅａｓｙカラムを新しい１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに移した。緩衝液ＡＥ（２００μｌ）をＤＮｅａｓｙ膜に直接かけた。室温で１分間インキュベーションした後、１分間、８，０００ｒｐｍで遠心分離を行い膜からゲノムＤＮＡを溶出した。ゲノムＤＮＡの完全性は、０．８％アガロースゲル電気泳動によって調べた。
【０１９０】
ゲノムＤＮＡのＰＣＲ
ｇＤＮＡ増幅のためにＰＣＲ反応混合液を調製した。ＰＣＲ反応混合液は、合計容積２５μｌ中に、鋳型となるｇＤＮＡを１μｌ、ならびに最終濃度として１．５ＵのＰｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑポリメラーゼ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ_２、０．２ｍＭのｄＮＴＰ混合物、および０．２μＭのプライマーを含んだ。使用したプライマーは：図１５−Ａに示すセンス（ｇＤＮＡ１）５’−ＴＣＡＣＣＴＣＣＴＧＧＧＡＡＴＴＧＧ−３’およびアンチセンス（ｇＤＮＡ２）５’−ＡＡＧＡＴＴＴＧＣＧＡＧＴＧＡＡＡＣ−３’である。３段階のサーマルサイクリングは、９４℃／１分間のホットスタート、続く９４℃／１分間、６０℃／３０秒間、７２℃／３分間を３０サイクル；および７２℃／１０分間の最終伸長を含んだ。ＰＣＲ産物は１．５％アガロースゲルで分析し、強いバンドを切り出して精製した。挿入体を担持する１６個のクローンの配列を、Ｔ７およびＳＰ６プライマーを使って両鎖について決定した。１６個全てのクローンについて、追加の内部プライマーを用いて配列を決定して配列を完成させ、ＤＮＡｓｉｓ Ｆｏｒ Ｗｉｎｄｏｗｓ（バージョン２．５）から入手できるコンティグ結合方法を用いてアセンブルした。
【０１９１】
メカニズムに関する研究
これらの実験で使用したオハニンおよびプロ−オハニンをコードする遺伝子は、前述したようにベクターＭにクローニングされ、大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換された。精製は若干変更を加えたＰｕｎｇら（３４）の方法に従って行った。精製されたＮ末端オリゴヒスチジンタグ付きオハニンおよびプロ−オハニン（Ｈｉｓ−オハニンおよびＨｉｓ−プロ−オハニンとそれぞれ称する）を免疫蛍光検出に直接使用した。
【０１９２】
オハニンおよびプロ−オハニンのＩｎ ｖｉｖｏ投与
体重２０〜２５ｇのＳｗｉｓｓアルビノマウスを用いた。脳室内および腹腔内注射は共に、Ｐｕｎｇら（３４）が記載した方法を用いて行った。次に動物を全採血して、外科的に脳を取り出した。
【０１９３】
凍結解剖
マウスの脳を、ロボトミー外科技術を用いて取り出し、３０％ショ糖、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−アセタート、５ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．４）を含み、完全プロテアーゼインヒビターカクテル錠剤（Ｒｏｃｈｅ）を補充した溶液の中に、４℃で１２時間入れた。
【０１９４】
次に溶液中の脳に、前もって−２５℃に冷却しておいたＬｅｉｃａ ＣＭ８４０クリオトームを使って凍結解剖するための準備を行った。チャンバー内にクリオチャックを置き、十分量のＯｐｔｉｍａｌ Ｃｕｔｔｉｎｇ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ媒体（ＯＣＴ）をチャックの上部まで加えて、媒体をほぼ凍結状態にした。次に脳をその横に横方向に置いてからさらにＯＣＴを加えて、脳全体をＯＣＴで覆い、２０分間放置して凍結させた。次にチャックを逆さまにして、温度が平衡に達するまで液体窒素に浸した。次に脳をクリオトームに載せて、１０μｍの切片を切り出し、Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ Ｐｌｕｓ（Ｍｅｎｚｅｌ−Ｇｌａｓｅｒ）スライドの上に載せた。スライドは−２０℃で保存した。アッセイ前にスライドを、４℃にて、０．０１％ＢＳＡを溶解したリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）の中に一晩入れて、タンパク質および抗体のスライド表面への非特異結合を防止した。
【０１９５】
Ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイ
タンパク質は０．０５μＭの濃度でＰＢＳに溶解した。次にタンパク質溶液（１ｍｌ）を、注射していない脳の切片を載せた各スライドに掛けて４℃で一晩インキュベーションした。次にスライドを氷冷したＰＢＳと共に振盪インキュベータの中に入れてすすぎ洗いし、振盪インキュベータで室温にて３０分間振盪した。競合アッセイについては、最初のすすぎ洗い段階が終わった後に、１ｍｌの第２タンパク質溶液を各スライドに加えて４℃にて一晩、再度インキュベーションし、すすぎ洗い処置を繰り返した。
【０１９６】
すすぎ洗い段階後に、氷冷したＰＢＳを用いて、振盪インキュベータの上で、それぞれ室温にて１５分間、更に２回洗浄を行った。
【０１９７】
免疫蛍光
Ａｎａｓｐｅｃ Ｉｎｃ製のウサギ抗Ｈｉｓ抗体（α−Ｈｉｓ、ヤギ）を、ＰＢＳ中に１：１０００の割合で使用した。抗体溶液（１ｍｌ）を調製済みの各スライドに掛けて、一晩、４℃でインキュベーションした。次にスライドを、振盪インキュベータの中の氷冷ＰＢＳ中に入れて、室温で１５分間振盪インキュベータで振盪し、３回洗浄した。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ製Ａｌｅｘａ−ｆｌｕｏ４８８で標識した抗ウサギ二次抗体を１：５００の割合で使用した。二次抗体溶液をスライドの上に掛けて、暗所、４℃で一晩インキュベーションした。スライドを一次抗体洗浄時と同様にして暗所で洗浄し、半乾燥状態で放置した。次にＰｒｏｌｏｎｇ Ｇｏｌｄ Ａｎｔｉｆａｄｅマウンティング媒体をＤＡＰＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）と共にスライドの上に加え、カバーガラスをその上に載せた。脳の切片は、Ａｘｉｏｃａｍ ＨＲｃデジタルカメラアタッチメントの付いたＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ ２００Ｍ顕微鏡で観察した。連続写真は、Ａｘｉｏｖｉｓｉｏｎバージョン４．３．０．１０１を用いて、４０５および４８０ｎｍの波長で撮影した。写真はＰｈｏｔｏｓｈｏｐバージョン５．５を使って編集し、重ね合わせた。
【０１９８】
結果
キングコブラ毒液からの新規タンパク質の同定
Ｏｐｈｉｏｐｈａｇｕｓ ｈａｎｎａｈ（キングコブラ）の粗毒液のプロフィールをＬＣ／ＭＣ（図１）を使って調べ、毒液中に新規の興味深いタンパク質成分を同定した。ＬＣ／ＭＳで検出したペプチドおよびタンパク質は、保持時間別に系統だててまとめた（図１−Ａ）。５０分後に溶出したタンパク質は比較的ノイズの多いｍ／ｚスペクトルを示したことから、これらの分子についてはその質量を決定しなかった。これは、タンパク質のサイズが大きいこと、ならびに糖化およびその他の翻訳後修飾によるものと思われた。このようにしてＬＣ／ＭＳを用いたキングコブラ毒液の質量プロファイリングからは、この技術が有効でなく、限界があることが明らかになった。我々はＬＣ／ＭＳプロフィールを用いて、まずよく知られている毒素ファミリーの質量と異なる質量を持つタンパク質を探した。我々は分子量１１９５１．３５±３．９２Ｄａを持つタンパク質を同定したが、これは確立されたどのファミリーとも異なっており、それ故に我々はこの新規タンパク質を更に研究することとした。
【０１９９】
新規タンパク質の単離および精製
前記新規タンパク質を、２段階の精製手順を介してキングコブラ毒液から精製した。第１段階は、ゲル濾過クロマトグラフィーを用いた粗毒液の分離を含む。新規タンパク質の分子量はおおよそ１２ｋＤａであることから、ゲル濾過クロマトグラフィーには、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ３０（Ｈｉｌｏａｄ １６／６０）カラムを選択した。粗毒液のゲル濾過では５つの主要ピークが得られた（図２−Ａ）。我々はゲル濾過クロマトグラフィーの先頭の３つのピークをＲＰ−ＨＰＬＣにかけた。ＲＰ−ＨＰＬＣから出てきた個々の分画をＥＳＩ／ＭＳを用いて評価した（データ未提示）。ゲル濾過のピーク１ｂから、３８〜４０％の緩衝液Ｂ（８０％ＡＣＮの０．１％ＴＦＡ溶液）（図２−Ｂ）の勾配に溶出されたタンパク質分画が均一であり、分子量が１１９５１．４７±０．６７Ｄａであることが見出された（図２−Ｃ）。新規タンパク質の全体収量は、粗毒液１ｇからおおよそ１ｍｇであった。
【０２００】
アミノ酸配列の決定
未変性タンパク質のＮ末端配列をエドマン分解によって決定し、その結果、先頭４０個の残基が同定された。前記Ｎ末端配列は、既知のヘビ毒素ファミリーのタンパク質のいずれとも配列相同性を示さなかった。全配列を決定するために、ピリジルエチル化タンパク質をＬｙｓ−Ｃエンドペプチダーゼ、トリプシン、およびギ酸で消化した。各消化物からのペプチドは逆相ＨＰＬＣによって分離した（図３）。精製ペプチドの分子量およびアミノ末端配列を得て、全長のアミノ酸配列を完成させた（図４）。ペプチドおよびタンパク質全体の配列は、消化ペプチドの計算質量と観察質量とを比較して確認した（図３−Ｄ）。観察分子量は計算分子量とよく一致した。新規タンハク質は１個の遊離システインと共に１０７個のアミノ酸残基を含み、翻訳後修飾は含んでいなかった。我々はこのタンパク質を、それがキングコブラＯｐｈｉｏｐｈａｇｕｓ ｈａｎｎａｈの毒液から精製されたことからオハニンと命名した。
【０２０１】
オハニンの配列分析
ＢＬＡＳＴＰアルゴリズム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）（１６）を用いてオハニンの完全長アミノ酸配列と他のタンパク質の配列とを比較し、モノクルコブラ（Ｎａｊａ ｋａｏｕｔｈｉａ）から単離されたタイ（Ｔｈａｉ）コブリン（ＳＰ：Ｐ８２８８５）との間に９３％の配列同一性があることを示した。その配列はタンパク質データベースに寄託したが、タイコブリンに関する発表文献はない。かくしてオハニンとタイコブリンは、ヘビ毒素の新規ファミリーの最初のメンバーを形作っている。タイコブリンとの間を除いてオハニンはＧｅｎＢａｎｋデータベース内のその他タンパク質との間に有意な配列類似性を示さなかった（Ｅ値＞１０^−５）。
【０２０２】
第２段階として、Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ＰｒｏｔｅｉｎＤｏｍａｉｎＤａｔａｂａｓｅ（保存タンパク質ドメインデータベース）（ＣＤＤ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ／ｃｄｄ／ｗｒｐｓｂ．ｃｇｉ）（１７）を用いて保存ドメインを探索し、ドメインがタンパク質の構造および機能の基本単位であるとする仮定（１８）に基づいて、オハニンの生物学的機能を推測した。オハニンの残基９〜１０７は、端部を切りそろえたＰＲＹ−ＳＰＲＹドメインと全体で４４％の同一性と５４％の類似性を示した（図５）。ＰＲＹはＳＰＲＹドメインと交互に存在しているドメインである（詳しくは考察を参照）。ＳＰＲＹドメインは、Ｂ３０．２類似ドメイン内のサブドメインとして同定された（１９）。ＳＰＲＹドメインおよびＢ３０．２類似ドメインは、様々なタンパク質で見出されている（詳しくはＨｅｎｒｙら、（２０、２１）を参照せよ）。
【０２０３】
Ｉｎ ｖｉｖｏ毒性試験
オハニンを、マウスでのｉｎ ｖｉｖｏ毒性試験に用いた。全てのマウスについて、実験開始前には活動的であることが観察された。タンパク質をｉ．ｐ．注射すると、１ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇの用量が注射されたマウスについては静かになり、動きが緩慢になることが観察された。しかしながらマウスは注射２時間後には回復し、四肢および呼吸器系に麻痺の顕著な兆候は認められなかった。１０ｍｇ／ｋｇの用量でさえ死亡例は無かった。注射後２４時間目の肉眼による病理分析からは、コントロール動物から得た病理分析と比較して、脳、心臓、肺、腎臓、脾臓、および肝臓に出血または壊死を示す証拠は認められなかった（データ未提示）。
【０２０４】
移動活動
ｉｎ ｖｉｖｏ毒性試験での我々の観察を定量的に検証するために、注射したマウスの移動活動に対するオハニンの作用を調べた。図６−Ａに示すように、オハニンは０．１ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、および１０ｍｇ／ｋｇの用量では、ｉ．ｐ．注射後に用量依存的な移動低下を誘導した（Ｆ_３，３０＝５．７８７、ｐ＜０．０１）。移動活動の低下は、図６−Ａに示すように１０ｍｇ／ｋｇの用量と０．１ｍｇ／ｋｇの用量の間（ｐ＝０．０３０）；１０ｍｇ／ｋｇの用量とコントロール（ｐ＝０．００４）の間で統計学的に有意であった。１０ｍｇ／ｋｇの用量では、全運動カウント数がコントロール（１９４２±１４７）に比べて７４２±１９０まで低下した。図６−Ｂに示すように、この用量依存的な阻害は、注射後１０分の時点でさえ異なっていた。２元配置反復測定分散分析が示すように、１時間の実験期間中、同一用量内には統計学的に有意な時間効果は存在しておらず、阻害作用からまだ回復していないことが示唆された。実験期間（１時間）を超えてこの作用を測定することはしなかった。長時間の身体的活動および食事を与えないことはマウスを消耗させる。それ故に、実験期間を超えた場合の動きの緩慢化は、タンパク質の作用だけによるものではない可能性がある。
【０２０５】
脳室内注射を利用して、中枢神経系に対するオハニンの直接作用について評価した。ｉ．ｃ．ｖ．に用いた投与量は、高、中、および低用量いずれもｉ．ｐ．で使用した用量に比べ約１０００倍少なかった。オハニンは、図６−Ｃに示すように統計学的に有意（Ｆ_３，２６＝９．１１２、ｐ＜０．００１）且つ用量依存的な移動低下を示し、０．３μｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ、および１０μｇ／ｋｇそれぞれのコントロールと比較した時のｐ値は０．０２７、０．００９、および０．０００であった。０．３μｇ／ｋｇの用量でさえ、合計運動カウントはコントロールのマウス（２１０９±２６４）に比べて１１５５±２４８に低下した。これに加えて反応の開始が、注射直後から用量依存的に低下し、１時間で終了した（図６−Ｄ）。全実験期間を通して、同一用量内に有意な時間効果は存在しなかった。このことは、極めて低用量であるが、ｉ．ｐ．注射の場合に似ていた。ｉ．ｐ．およびｉ．ｃ．ｖ．注射それぞれのＩＣ_５０（移動カウントを〜５０％阻害するのに必要な用量）値は３．２５ｍｇ／ｋｇおよび０．５μｇ／ｋｇであった。かくしてオハニンはｉ．ｃ．ｖ．経路で注射した時に、〜６，５００倍低い用量で移動低下を誘導する高い能力を示し、観察された移動に対する作用について中枢神経系の経路が示唆された。
【０２０６】
ホットプレートアッセイ
オハニン投与したマウスに熱痛刺激が起こす痛覚について、ホットプレートアッセイを用いて評価した。ホットプレートアッセイで使用した投与量は、移動活動に使用したものと同じであった。疼痛刺激に対するオハニンの作用は、ｉ．ｐ．およびｉ．ｃ．ｖ．注射１５分後に評価した。図７−Ａおよび図７−Ｂに示すように、ｉ．ｐ．およびｉ．ｃ．ｖ．注射は共に同様のＵ字型の用量反応曲線を示した。オハニンをｉ．ｐ．注射した場合については、全投与量について有意な作用は認められなかった。（Ｆ_３，２８＝０．８６７、ｐ＞０．０５）（図７−Ａ）。しかしながら、０．３μｇ／ｋｇおよび１μｇ／ｋｇの用量でｉ．ｃ．ｖ．注射した時には、オハニンは用量依存的な疼痛過敏作用を示した（Ｆ_３，５０＝６．３９０、ｐ＜０．０１）。しかし、より高い用量の１０μｇ／ｋｇでは、有意な疼痛過敏作用は存在しなかった。図７−Ｂに示すように、潜伏期間は、１μｇ／ｋｇとコントロールの間（ｐ＝０．００２）；１μｇ／ｋｇと１０μｇ／ｋｇの間（ｐ＝０．０１５）で統計学的に有意であった。
【０２０７】
合成遺伝子のデザイン、アセンブリ、およびクローニング
粗毒液中に元々存在しているオハニンの量は少ないため、オハニンをコードする合成遺伝子を、そのタンパク質配列に基づき、帰納的（ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ）ＰＣＲ法（２２）によって構築した。オハニンは糖化またはジスルフィド架橋のような翻訳後修飾を含んでいないことから大腸菌発現システムを選択した。第２に、大腸菌発現系でのオハニンの過剰発現は、組換え体タンパク質を適切量提供して、その構造−機能相関についての我々の今後の研究を容易にする上でも有利である。
【０２０８】
合成遺伝子のデザインおよび構築の全体ストラテジーを図８に示す（詳細については考察も参照）。図８−Ａは、ベクターＭでの発現のための合成遺伝子構築体を示す。図８−Ｂは、完全長の合成遺伝子を逆翻訳したＤＮＡ配列を示す。３６９ｂｐの合成遺伝子を得るために重複したオリゴヌクレオチドを生成するためのストラテジーを図８−Ｃに示す。２組のオリゴヌクレオチドを用いて２つの断片（Ｐ１およびＰ２）をアセンブルした。次にこの２つの断片をＸｍａＩ部位を介して連結し全体遺伝子を生成した。重複しているオリゴを伸長して断片１および２を生成するためのＰＣＲ反応を、２組のオリゴヌクレオチド（図８−Ｄ）を用いて行った。ＸｍａＩ制限部位を介した断片の連結によって、３６９ｂｐの完全長合成遺伝子を得た（図８−Ｅ）。合成遺伝子をｐＧＥＭＴ−ｅａｓｙベクターにクローニングし、発現ベクター内にサブクローニングする前にＴ７およびＳＰ６プライマーを使って両鎖について配列を決定した。
【０２０９】
組換え体オハニンの発現
ベクターＭ／オハニン構築体を含む大腸菌を用いて組換え体オハニンを発現させた。０．１ｍＭ ＩＰＴＧを用いて、１６℃で一晩誘導した後に細菌培養物から調製した全タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析から、見かけ上の分子量が約１４ｋＤａのタンパク質が大量にあることが証明された。未誘導および誘導した培養物から抽出した全タンパク質と、融合タンパク質を可溶性および不溶性タンパク質に分画化したものを、一つにまとめて比較したものを図９−Ａに示す。融合タンパク質に相当する１４ｋＤａ（１として矢印で示す）の明瞭なバンドが不溶性分画に見られた。発現ベクター、細菌株、培養時の細胞密度、インキュベーション時間、緩衝液、および使用したＩＰＴＧのような様々なパラメータを変えても、組換え体タンパク質の発現について有意な差は観察されなかった（データ未提示）。
【０２１０】
融合タンパク質の精製および切断
融合タンパク質内のＨｉｓタグによって、変性条件下において、単一のアフィニティーカラムを用いて迅速に精製することができる。精製段階を図９−Ｂに示す。レーン３は１つの主要種（〜１４ｋＤａ）を示し、レーン５はリフォールディング後に見かけ上の分子量１４ｋＤａを持つ融合タンパク質を示す。未変性タンパク質と比較した時に、組換え体タンパク質に追加された２ｋＤａは、Ｎ末端のＨｉｓタグ、トロンビン、およびＣＮＢｒ切断部位に対応している（図８−Ａ）。細菌培養物１リットルから、Ｎｉ−ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーを用いて、２５ｍｇのＨｉｓタグ付き融合タンパク質が精製された。
【０２１１】
ＣＮＢｒを用いて、組換え体タンパク質（図９−Ｃ）からＨｉｓタグを切断した。切断後、組換え体オハニンをＲＰ−ＨＰＬＣを用いて精製し（図１０−Ａ）、タンパク質の分子量および均一性をＥＳＩ−ＭＳを用いて決定した。組換え体オハニンは、ＥＳＩ／ＭＳで評価したところ均一で、分子量は１２２２６．９１±０．８９Ｄａであった（図１０−Ｂ）。組換え体タンパク質の同一性を、エドマン分解によるＮ末端配列決定を利用して更に確認した。組換え体オハニンのＮ末端配列はＡＳＰＰＧであり、これはＣＮＢｒ切断の効率を上げるために挿入されたアラニンを除いて未変性タンパク質のＮ末端と一致した。
【０２１２】
組換え体オハニンの特徴付け
未変性および組換え体タンパク質の二次構造をＣＤ分光分析によって評価した（図１１−Ａ）。未変性タンパク質のＣＤスペクトルは、２００ｎｍおよび２１５ｎｍ近くで極端に負の楕円率を示し、βシートおよび複数のβシート構造を持つランダムコイル構造の存在が示唆された。組換え体タンパク質のＣＤスペクトルは未変性タンパク質のそれに近く、２００ｎｍおよび２１５ｎｍに負の楕円率を示した。ＣＤスペクトルから計算した二次構造の骨格を図１１−Ｂに示す。
【０２１３】
組換え体オハニンが未変性タンパク質に類似した薬理作用を有しているか検証するために、我々はｉ．ｃ．ｖ．投与したマウスでのその疼痛過敏作用について調べた。組換え体オハニンは、未変性タンパク質と同様のＵ字型の用量反応曲線を示した（Ｆ_３，４５＝５．７８３、ｐ＜０．０１）（図７−Ｂおよび図７−Ｃ）。１μｇ／ｋｇ用量とコントロールの間；および１μｇ／ｋｇと１０μｇ／ｋｇ用量の間に有意差が認められ、それぞれのｐ値は０．００７および０．０１５であった。これらの結果は、組換え体オハニンが構造的および機能的に毒液から単離された未変性タンパク質に類似していることを示している。
【０２１４】
オハニンのクローニングおよび配列決定
キングコブラ毒腺から抽出されたトータルＲＮＡは微量であったが（抽出当たり〜４μｇ）、ＲＮＡの質は比較的良好であった。我々はＲＴ−ＰＣＲとＲＡＣＥ技術を組み合わせて用い、完全長のオハニンのｃＤＮＡを得た。遺伝子特異的な配列を単離するために、ＲＴ−ＰＣＲをまずトータルＲＮＡを鋳型にして行った。縮重プライマーＲＴ１およびＲＴ２は既知のアミノ酸配列に基づいてデザインした。増幅された長さ〜２００ｂｐの断片をゲル精製し、ｐＧＥＭＴ−ｅａｓｙベクターに連結して配列を決定した。配列決定分析からは、８つのクローン全てが、オハニンの部分配列と完全に相同であるアミノ酸配列をコードしていることが明らかにされた。
【０２１５】
次に５’コーディング領域をその５’−ＵＴＲ（非翻訳領域）と一緒にＵＰＭ（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｉｍｅｒ Ｍｉｘ）およびアンチセンスプライマー、ＧＳＰ２を用いて増幅した。２本のバンド、それぞれ５５０および６００ｂｐを５’−ＲＡＣＥ増幅によって得た（図１２−Ａ）。しかしながら、５５０ｂｐのバンドだけがオハニンの予想コーディング配列を示した。我々はさらに５’−ＵＴＲ配列の開始部分からセンスプライマー、ＧＳＰＩをデザインした。ＧＳＰ１およびＵＰＭを用いて３’−ＲＡＣＥ増幅を行い、１５５８ｂｐの完全長ｃＤＮＡを得た（図１２−Ｂ）。オハニンの完全長ｃＤＮＡ配列およびそれから導出されたアミノ酸配列を図１２−Ｃに示す。
【０２１６】
ｃＤＮＡは１９０アミノ酸の推定オープンリーディングフレームをコードしている。それには２３４ｂｐの５’−ＵＴＲと、ポリＡテールを含む７８３ｂｐの３’−ＵＴＲがフランキングしていた。興味深いことに、推定オープンリーディングフレームは、成熟オハニンのＣ末端にさらに６３個のアミノ酸をコードしていた。これはヘビを起源とする成熟タンパク質について、初めて報告されたＣ末端にプロペプチドセグメントを持つｃＤＮＡ配列である。それ故に、そのプロ−タンパク質ドメインが付いたオハニンを、プロ−オハニンと命名した。導出されたアミノ酸配列分析から、成熟オハニンを産生するプロ−オハニンの切断は二塩基性のＲＲ部位に起こると思われる。
【０２１７】
プロ−オハニンの配列アラインメント
ＢＬＡＳＴＮアルゴリズム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）（１５）を用いた完全長ｃＤＮＡ配列の比較からは、今までのところＧｅｎＢａｎｋデータベースに寄託されている他のヌクレオチド配列と配列相同性は確認されていない。しかしながら、導出されたアミノ酸配列は、完全なＰＲＹ−ＳＰＲＹおよびＢ３０．２類似ドメインと相同性を示し、プロ−タンパク質にはＨｅｎｒｙら（２０、２１）が提案している３^ｒｄモチーフが存在していた。導出されたタンパク質配列と、Ｂ３０．２類似ドメインとのアラインメントを図１３に示す。タンパク質配列はＰＲＹ−ＳＰＲＹドメインと、３８％の全体同一性および４９％の類似性を共有した。Ｂ３０．２類似ドメインを持つタンパク質の概略図を図１４に示す。
【０２１８】
プロ−オハニンの発現
プロ−オハニンを、大腸菌を用いて発現させるために発現ベクターにクローニングした。プライマー１９Ｋ１および１９Ｋ２を用いて増幅し、同時にＭｅｔおよび停止コドンだけでなくベクターＭにクローニングするための制限部位も加えた。増幅された、制限部位をフランキングした配列を消化して、ＢａｍＨＩ部位およびＮｏｔＩ部位で発現ベクターと連結した。連結のための特異的制限部位を使用することで、プロ−オハニンが適切な向きで確実に挿入されるようにし、一方Ｍｅｔを第２の代替切断部位として挿入した。増幅断片を示すアガロースゲルを図１５−Ａに示す。プロ−オハニン発現ベクターの構造の概略図を図１５−Ｂに示す。
【０２１９】
最終構築体を大腸菌株ＤＨ５αにトランスフェクションし、クローニングした。陽性反応を示したクローンから得たプラスミドを、組換え体プロ−オハニンを発現させるために大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）にトランスフェクションした。単一コロニーを接種して１００ｍｌの種培養物として増殖させた。種培養物を更に新鮮なＬＢ培地に１：５０の希釈率で接種した。細菌培養中のプロ−オハニンの発現は、後期対数期に０．１ｍＭのＩＰＴＧを用いて誘導し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。ＩＰＴＧ誘導後に細菌培養物から調製した全タンパク質を、未誘導培養物からの全タンパク質と比較し、分子量約２０ｋＤａ（融合タンパク質の予想値）を持つバンドの発現が増加していることが分かった（図１６−Ａ）。
【０２２０】
可溶性融合タンパク質は、非変性条件下にてＮｉ−ＮＴＡカラムを用いて全タンパク質から精製した（図１６−Ｂ）。融合タンパク質の合計収量はおおよそ５０ｍｇ／１リットル細菌培養物であった。精製した融合タンパク質をトロンビン切断にかけた（図１６−Ｃ）。トロンビン切断で得た収量は、ＣＮＢｒ切断で得た場合に比べ若干高かった。組換え体プロ−オハニンは、ＲＰ−ＨＰＬＣを用いて精製した（データ未提示）。ＲＰ−ＨＰＬＣプロフィールは、融合ペプチドとプロ−オハニンにそれぞれ対応する２つの明確に分離したピークを示した。ＥＳＩ−ＭＳを用いて、プロ−オハニンの正確な分子量および均一性を決定した。Ｂｉｏｓｐｅｃ Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔスペクトルは、プロ−オハニンが均一で、分子量が１９２７７．２７±２．３２（図１７）であることを示した。プロ−オハニンの先頭８個の残基は、エドマン分解配列決定法によってＧＳＭＳＰＰＧＮであると決定された。この配列は、プロ−オハニンの推定Ｎ末端配列に一致しており、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、およびＭｅｔはトロンビン切断時に持ち込まれ残った残基であった。
【０２２１】
組換え体プロ−オハニンの二次構造
オハニンとプロ−オハニン両方の二次構造含有率を、１２．５μＭ濃度について、ＣＤ分光法を用いて測定した（図１８−Ａ）。オハニンのＣＤスペクトルは、２１５ｎｍ付近で極端な負の楕円率を示し、βシート構造の存在を示した（７％αヘリックス、４８％βシート、および４５％ランダムコイル）（図１８−Ｂ）。オハニンと異なり、プロ−オハニンのＣＤスペクトルは、２２％αヘリックス、２９％βシート、および４９％ランダムコイルから成る混合型の二次構造プロフィールを示した。従って、図１８に見られるように、プロ−オハニンのＣ末端プロペプチドセグメントの存在が、そのαヘリックス含有量を上げていることは明らかである。オハニンおよびプロ−オハニンは共に〜５０％のランダムコイル構造を持っている。
【０２２２】
プロ−オハニンの機能的特徴付け
精製プロ−オハニンについて、マウスでのｉｎ ｖｉｖｏ毒性を調べた。それはｉ．ｐ．投与時には、１０ｍｇ／ｋｇの用量まで非致死性であった。成熟オハニンを注射した時に見られたような、緩慢化の明瞭な兆候は見られなかった。これに加えて２４時間後にマウスを屠殺した時の目視検査では、脳、心臓、肺、腎臓、脾臓、および肝臓に、検知可能な出血または壊死は見られなかった（データ未提示）。
【０２２３】
プロ−オハニンの移動活動に及ぼす作用
前節で記載したように、オハニンはｉ．ｐ．注射後に用量依存的、且つ統計有意に移動低下を誘導する（Ｆ_３，３０＝５．７８７、ｐ＜０．０１）（３４）。マウスの移動活動に及ぼすプロ−オハニンの作用を、０．１ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、および１０ｍｇ／ｋｇの用量をｉ．ｐ．注射して調べた。最高用量（１０ｍｇ／ｋｇ用量）時のプロ−オハニンの全運動カウントは約２０４８±２２５であり、コントロールのカウント（１９４２±１４７）と同等であった。従ってプロ−オハニンは、オハニン（図１９−Ａ）に比べると、ｉ．ｐ．注射後、実験マウスの運動性に有意に阻害をもたらさないことは明らかである（Ｆ_３，２８＝０．２５１、ｐ＞０．０５）（図１９−Ｂ）。
【０２２４】
プロ−オハニンを用いて、ｉ．ｃ．ｖ．注射時の移動に対する直接作用についても調べた。この場合もｉ．ｃ．ｖ．注射に用いた用量は、ｉ．ｐ．注射に用いた用量に比べ約１０００倍低くかった。興味深いことに、低用量（０．３μｇ／ｋｇ；ｐ＝０．０００）でもコントロールのマウス（２１０９±２６４）に比べてマウスの全運動カウントは１９０±４３まで低下した。したがってプロ−オハニンは、０．３μｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ、および１０μｇ／ｋｇの全ての用量について、ｉ．ｃ．ｖ．注射後、高いマウス移動低下誘導能力を示した（Ｆ_３，２５＝３５．５６５、ｐ＝０．０００）（図１９−Ｄおよび図１９−Ｃ）。
【０２２５】
プロ−オハニンの疼痛過敏に及ぼす作用
オハニンと同様にして、ホットプレート実験に及ぼすプロ−オハニンの作用を注射１５分後に評価した。プロ−オハニンは、腹腔内投与時には、オハニン注射したマウスのような用量依存性もＵ字型の用量反応曲線も示さなかった（Ｆ_３，２８＝０．９２２、ｐ＞０．０５）（図２０−Ｂおよび図２０−Ａ）。脳室内注射時には、プロ−オハニンは使用した全ての用量（０．３μｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ、および１０μｇ／ｋｇ）についてコントロールに比べて比較的短い潜伏期間を示した（Ｆ_３，３９＝３．２７５、ｐ＜０．０５）（図２０−Ｄ）。疼痛過敏作用は、０．３μｇ／ｋｇ用量とコントロールとの間でのみ有意であった（ｐ＝０．０２６）。
【０２２６】
移動実験およびホットプレートアッセイについての観察は、オハニンとプロ−オハニンとの間に興味深い薬理作用の差を示した。オハニンはｉ．ｐ．でもｉ．ｃ．ｖ．注射経路でも移動低下と疼痛過敏を誘導したが、プロ−オハニンは脳室内投与時のみ活性であった。
【０２２７】
サザンブロットハイブリダイゼーション
上記した様に、オハニンには２種類のｍＲＮＡサブタイプが存在している。これら２種類のｍＲＮＡが２つの独立した遺伝子の産物であるか、または異なるスプライシングに由来するものであるか明らかにすることは興味深い。第１段階として我々はゲノムサザンハイブリダイゼーション実験を行った。キングコブラのゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨＩ、およびＮｄｅＩで別々に消化した。これらゲノムＤＮＡ消化物を、そのｃＤＮＡのヌクレオチド３１９〜６１６からデザインした２９７ｂｐのＤＩＧ標識プローブでハイブリダイゼーションした。我々は、４種類全ての消化物について単一のバンドを観察し（図２１）、オハニンがキングコブラゲノムの中では単一の遺伝子にコードされていることが示唆された。
【０２２８】
オハニン遺伝子のクローニングおよび配列決定
オハニン遺伝子のゲノム構造を決定するために、ゲノムＤＮＡのＰＣＲおよび「ゲノムウォーキング」法を用いた。オハニンのｃＤＮＡの配列を用いて、エクソン−イントロンの境界をマッピングした。最初の増幅では、ｇＤＮＡｓｉｇｐｅｐおよびｇＤＮＡｓｔｏｐを用いて、そのコーディング領域を増幅した。得られた断片は〜１．９ｋｂであった（データ未提示）。ゲノムＤＮＡの３’−ＵＴＲ領域をＰＣＲ増幅しようとした我々の試みからは、別の〜７５０ｂｐのバンドが得られた。
【０２２９】
我々は転写開始部位からシグナルペプチド領域までについてデザインしたプライマーを用いて、ゲノムＤＮＡからの５’−ＵＴＲ領域増幅を試みた。しかしながら、複数回試みたもののバンドは得られなかった。このことから我々は、我々のプライマーがイントロンの存在によって中断されているか、または用いたサーマルサイクリングプロフィールがまだ最適でないのではないかと考えた。そこでゲノムウォーカーライブラリーを構築した。「ゲノムウォーク」は、アンチセンスプライマーｇＤＮＡ５ＵＴＲ１およびｇＤＮＡ５ＵＴＲｎｅｓ２を、キットのアダプタープライマー（ＡＰ１およびＡＰ２）と一緒に用いて行った。得られた〜１．６５ｋｂの断片の配列を完全に決定した。
【０２３０】
ｃＤＮＡの５’領域および以前に得た〜１．６５ｋｂのゲノムＤＮＡ断片（データ未提示）からデザインしたプライマー１−ｇＤＮＡ５ＵＴＲおよび２−ｇＤＮＡ５ＵＴＲを用いてｇＤＮＡ ＰＣＲを行い、更に上流に別の〜１．８ｋｂのものを得た。サーマルサイクリングプロフィールを最適化して、我々は更にプライマー９−ｇＤＮＡ５ＵＴＲおよび６−ｇＤＮＡ５ＵＴＲを用いて、ｃＤＮＡの転写開始部位領域に対応する〜１．４ｋｂの別の断片も生成した（データ未提示）。
【０２３１】
かくして我々はオハニンｃＤＮＡの５’−ＵＴＲから３’−ＵＴＲ領域に至る合計７０８６ｂｐの遺伝子配列を得た（図２２および図２３）。オハニンの全てのエクソンとイントロンについて、スプライス結合部にフランキングしている配列を決定した（図２３−Ａ）。エクソン−イントロン境界のドナーおよびアクセプタのスプライス部位から、イントロンがＧＴで始まり、ＡＧで終わるという規則を確認した。オハニン遺伝子は５個のエクソンと４個のイントロンを含んでいた。オハニンのコーディング領域は、同定された５個のエクソンのうちの２つのエクソンからできている。エクソン１、２、および３は、主に５’−ＵＴＲをコードしている。興味深いことにエクソン２はｍＲＮＡのサブタイプの一つではスプライシングを受けて除かれていた（図１−Ｃ、図４−Ｂ、および図４−Ｃ）。エクソン４は、残りの５’−ＵＴＲ領域（１１ｂｐ）、シグナルペプチド、およびオハニンの先頭８個のアミノ酸残基を含んでいる。エクソン５は、残基９〜１０７までのオハニン、プロペプチドセグメント、ならびに３’−ＵＴＲに対応する配列をコードしている（図２２および図２３）。
【０２３２】
Ｈｉｓ−プロ−オハニンのｉｎ ｖｉｔｒｏ結合研究
マウスでの移動活動に関するこれまでの研究から、オハニンとプロ−オハニンは共にｉ．ｃ．ｖ．注射によって強力な移動低下作用を示すことが明らかになった。そこでＮ末端にＨｉｓタグを融合させたプロ−オハニン（Ｈｉｓ−プロ−オハニンと呼ぶ）について、まずｉｎ ｖｉｔｒｏでの脳切片結合能力を試験した（図２４）。我々の結果は、図２５に示すようにＨｉｓ−プロ−オハニンが脳の海馬および小脳領域に特異的に結合することを示した。脳切片の他の領域は染色されずに残った。同様にＨｉｓ−プロ−オハニンと共に予備インキュベーションしなかったコントロール実験も蛍光染色を示さなかった（図２５）。
【０２３３】
その特異性を更に確認するために、競合結合コントロールアッセイを行った（図２６）。脳切片を未変性オハニンと予備インキュベーションし、続いて染色前にＨｉｓ−プロ−オハニンとインキュベーションした。蛍光染色が低下するのが分かった（図２７）。かくして我々の結果は、Ｈｉｓ−プロ−オハニンが脳に特異的に結合すること、およびこの相互作用が成熟タンパク質の領域を介して仲介されることを示した。
【０２３４】
Ｈｉｓ−オハニンおよびＨｉｓ−プロ−オハニンのＩｎ ｖｉｖｏ結合研究
次に我々はオハニンおよび／またはプロ−オハニンが血液脳関門を通過して観察された薬理作用を発揮するか確認することを試みた（図２８）。かくしてＨｉｓ−オハニンおよびＨｉｓ−プロ−オハニンをｉ．ｐ．およびｉ．ｃ．ｖ．経路から注射し、３種類の濃度について、脳内のタンパク質の存在を免疫蛍光を用いて検出した。図２９は、Ｈｉｓ−オハニンがｉｎ ｖｉｖｏにおいて小脳および海馬に用量依存的な様式で結合することを示している。しかしながら、Ｈｉｓ−プロ−オハニンを投与すると、同じ領域の染色が顕著に低下することが見られた（図３０）。このことは、プロ−オハニンが血液脳関門を通過できることを示してはいるが、適切な免疫蛍光染色を可能にするために投与したタンパク質の量がこれまでに報告した最高濃度（１０ｍｇ／ｋｇ）よりも１０００倍高いことを指摘しておかねばならない。
【０２３５】
得られた結果は、オハニンが中枢神経系に直接影響を及ぼしてその作用を示すという、またオハニンが血液脳関門を通過して頭蓋空間を横切るという我々のこれまでの報告を裏付けている。これに加えて、前駆体タンパク質、プロ−オハニンは、仮にできたとしても効率的に横断できないことも示唆された（図３０）。
【０２３６】
考察
我々は、ＬＣ−ＭＳを用いた最初のキングコブラ毒液スクリーニングで、異常な分子量を持つ新規タンパク質の存在を確認した（図１）。ここでは、このタンパク質、オハニンの精製および特徴付けについて記載している。オハニンの完全アミノ酸配列は、エドマン分解によって決定した。それは単一のシスティン残基を含む１０７個のアミノ酸残基を有している（図３）。それは確立されたどのヘビ毒タンパク質ファミリーとも類似性を有していない。かくしてオハニンおよびタイコブリン（タイコブラについて報告されたアイソフォーム）は、新規のヘビ毒タンパク質ファミリーの最初のメンバーである。このファミリーのメンバーの固有の特徴は、システィン残基の含有量が低いことであると思われる（＜１％）。これに対し、他の全てのヘビ毒タンパク質ファミリーは、複数のジスルフィド結合および高いシスティン残基含有量を持つ（一般的に８〜１０％より高い）。
【０２３７】
オハニンおよびＢ３０．２類似ドメインタンパク質
ＣＤＤ研究は、オハニンがＰＲＹ−ＳＰＲＹドメインと類似性を共有していることを明らかにした（図５）。ＳＰＲＹドメインの３つのコピーは、３種類の哺乳類リアノジン受容体（ＲｙＲ）サブタイプに最初に確認された。このドメインは、Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍの二重特異性キナーゼ、ｓｐｌＡにも３コピー存在している。ｓｐｌＡおよびＲｙＲに於いて反復していることから、これらの配列はＳＰＲＹドメインと呼ばれている（２３）。ＳＰＲＹドメインは、Ｂ３０．２類似ドメインファミリーのサブドメインであることが確認されている（１９）。ＳＰＲＹドメインは、Ｂ３０．２類似ドメインと比較するとＮ末端領域に欠失がある。〜５０個の残基を含むＰＲＹドメインが、ＳＰＲＹドメイン（〜１１０〜１２０残基）のＮ末端領域に常に見いだせることを指摘することは興味深い。それ故に、両ＰＲＹ−ＳＰＲＹドメインをＢ３０．２類似ドメインのサブドメインと見なすことができるだろう。
【０２３８】
Ｂ３０．２ドメインはヒトクラスＩ組織適合性複合体（ＭＨＣ）領域内にマッピングされる単一のエクソンにコードされている約１６０〜１７０アミノ酸の保存されたタンパク質ドメインである（２４）。そのためにそれは、それが最初に同定されたＭＨＣ１領域内のＢ３０．２エクソンに従って命名された。Ｂ３０．２類似ドメインは、核、細胞質、膜貫通、または分泌タンパク質内、特にＣ末端領域に存在し、これらのタンパク質はＮ末端ドメインのタイプおよび／または機能に従って分類されている（２０、２１）。第１のカテゴリーは、ＢＢｏｘおよびコイルドコイルドメインを持つＲＩＮＧ（ＲｅａｌｌｙＩｎｔｅｒｅｓｔｉｎｇＮｅｗＧｅｎｅ）フィンガータンパク質のサブセットを含む。第２のカテゴリーは可変（ＩｇＶ）および定常１（ＩｇＣ１）タイプの２つの免疫グロブリン類似折りたたみを持つＢＴＮ（ブチロフィリン）およびＢＴＮ２／ＢＴＮ３推定タンパク質を含む。第３のカテゴリーは、オニダルマオコゼＳｙｎａｎｃｅｊａ ｈｏｒｒｉｄａの毒液から単離された致死毒素であるストヌストキシンを含む。これに加えて、エンテロフィリン、ＳＯＣＳボックス（サイトカインシグナル伝達の抑制因子）、およびビタミンＫ依存性ガンマカルボキシラーゼファミリーもまたＢ３０．２類似ドメインをそれらのＣ末端領域に含んでいる。Ｂ３０．２類似ドメインタンパク質は様々な種および様々なタンパク質コンテクストに見出されるが、Ｂ３０．２類似ドメインの機能はまだ明確には分かっていない（２０、２１）。構造上の類似性に基づいて、我々はオハニンを急速に拡大しているＢ３０．２類似ドメインファミリーの新規メンバーとして加えた。しかしながら、それはＢ３０．２類似ドメインを含む他のクラスのタンパク質のいずれとも無関係と思われた。オハニンが、Ｂ３０．２類似ドメインを含む他のタンパク質に比べ、わずか８個のアミノ酸残基だけの比較的短いＮ末端領域を有していることを指摘することは興味深い。これに加えて、オハニンはより短いＣ末端領域も有しており、Ｂ３０．２類似ドメインのＣ末端領域の５０〜６０アミノ酸残基を欠いている。Ｂ３０．２類似ドメインに存在する同様のＣ末端切断は、ヒト細胞株ＫＧ−１（ｇｂ：Ｄ５０９１９）およびＳｔａｆ５０（ｇｂ：Ｘ８２２００）から単離されたＫＩＡＡ０１２９にも見出されている（図５）。
【０２３９】
オハニンの生物学的機能
オハニンは、ｉ．ｐ．注射により、実験マウスに用量依存的様式で移動低下を誘導した（図４）。ヘビ毒素中の神経毒は骨格筋の麻痺誘導において特に重要であることを指摘しておく（２５）。オハニンが末梢神経筋接合の遮断を誘導するか試験するために、われわれは単離したニワトリの二腹頸神経筋標本（ＣＢＣＮＭ）に対する作用について研究した。オハニンはＣＢＣＮＭ刺激の直接単収縮反応だけでなく、ＡＣｈ、ＣＣｈ、およびＫＣＩのような外から作用させたアゴニストに対する反応にも作用を示さなかった（Ｙ．Ｆ．Ｐｕｎｇ、Ｊ．Ｃ．Ｗｉｃｋｒａｍａｒａｔｎａ、Ｎ．Ｇ．Ｌｕｍｓｄｅｎ、Ｗ．Ｃ．Ｈｏｄｇｓｏｎ、およびＲ．Ｍ．Ｋｉｎｉ、未発表の観察）。これらの結果は、オハニンがシナプス前およびシナプス後毒性（筋肉毒性を含む）を持たないことを示している。このことから、我々はオハニンをマウス脳室内に直接注射して、中枢神経系での薬理作用を検証した。オハニンは、ｉ．ｐ．注射した場合に比べて、ｉ．ｃ．ｖ．注射した時に、〜６，５００倍より強力な移動低下活性を生じた。それ故オハニンは、おそらくは中枢神経系に対する直接作用を介して移動低下を誘導する。オハニンが血液脳関門を通過できるか明らかにするために、更に研究が行われている。
【０２４０】
ホットプレートアッセイでは、ｉ．ｐ．およびｉ．ｃ．ｖ．注射経路の両方で、Ｕ字型の用量反応曲線が得られた（図７−Ａおよび図７−Ｂ）。低および中濃度では平均潜在期間が短かったが、高用量と各コントロールとの間に潜在期間について明瞭な差は存在しなかった。この結果は、運動系が正常に機能することに依存しているホットプレートアッセイの結果を解釈する際には、オハニンによる移動低下障害作用について考慮すべきであることを示唆している。投与されたオハニンの用量が高いほど潜伏期間が長くなることは、運動が大きく障害されたことによる可能性がある。その結果として、マウスは熱痛を感じても直ちにそれに反応することができないのかもしれない。さらにホットプレートアッセイでは、全身投与に比べてｉ．ｃ．ｖ．注射したとき、タンパク質が非常に低い用量で反応を誘導できることは、、オハニンが中枢神経系におそらく直接作用することを強く示唆している。しかしながら、オハニンの正確な作用モードについては、今もなお研究の途上にある。
【０２４１】
ブチロフィリンは泌乳中の乳脂肪球の出芽および放出に関係している（２４、２６）。そのＢ３０．２類似ドメインはキサンチンデヒドロゲナーゼ／オキシダーゼと相互作用し、この相互作用がその機能にとって重要であると考えられている（２６、２７）。同様のドメインを含むタンパク質は、それらの機能を類似のタンパク質−タンパク質相互作用および機序を通して発揮するという仮定に基づいて、Ｈｅｎｒｙら（２０、２１）は、内皮細胞由来弛緩因子（おそらくはＮＯもしくはＮＯ産生物質）の放出を介して伝達されるというＳＮＴＸの血圧降下活性のメカニズムを提案している。これによれば、ＳＮＴＸはそのＢ３０．２類似ドメインを介してキサンチンオキシダーゼと相互作用し、キサンチンオキシダーゼが媒介するＮＯ合成酵素の阻害を解除する。これは次にＮＯの合成増加および血管弛緩をもたらすだろう（２０、２１、２８、２９）。我々の研究では、オハニンは、静脈投与した場合１ｍｇ／ｋｇの用量までは、麻酔したＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットの血圧に何ら有意な作用を示さなかった（Ｙ．Ｆ．Ｐｕｎｇ、Ｓ．Ｍ．Ａｔａｎ、Ｓ．Ｍｏｏｃｈｈａｌａ、およびＲ．Ｍ．Ｋｉｎｉ、未発表の観察）。我々はオハニンとキサンチンオキシダーゼとの直接的な相互作用を検証していないが、オハニンの機能がキサンチンオキシダーゼとは無関係であることを提案している。
【０２４２】
合成遺伝子のデザインおよびオハニンのクローニング
我々は、ヘビ由来の小型の新規毒液タンパク質の構造機能相関研究に関心がある（７）。毒液タンパク質を薬物デザインおよび抗毒素のモデルとして用いるこれらの研究では、タンパク質を得る確実で安価な方法が必要とされる。タンパク質を獲得するための一つの潜在的方法は、それらを固相ペプチド合成およびコンビナトリアルケミストリーを用いて作成することである。第２の、より安価な方法は、分子生物学的技術を用いて細菌宿主細胞にタンパク質を過剰発現させることである。タンパク質製造のための合成遺伝子は、強力な方法である。この方法では、ｃＤＮＡ配列に対し、単一アミノ酸またはタンパク質ドメイン全体を容易に変更できる（３０）。
【０２４３】
合成遺伝子は、次のようにデザインした：第１に、オハニンのアミノ酸配列を、大腸菌で最も頻度の高いトリプレットコドンを用いてヌクレオチド配列に逆翻訳した（３１）。第２に、広範な発現ベクターへ容易にサブクローニングできるように合計６個の一般的な制限部位を合成遺伝子の５’および３’領域に加えた。第３に、将来のカセットを基本とする突然変異導入のために、１０個の固有の制限部位を、コードするアミノ酸配列が変化しないようにして配列内に導入した。最終目標は、各種制限酵素が遺伝子を１回のみ切断するように制限部位を含むヌクレオチド配列を作製することであった。これに加えて、制限部位をＢ３０．２類似ドメインの保存配列モチーフおよび遺伝子のシステイン残基にフランキングさせ、且つ約２０〜４５ｂｐ毎に存在させた。このような構造により、二種類の制限エンドヌクレアーゼを用いて消化することで、コードされているアミノ酸配列を容易に操作し、除去し、且つ交換用のＤＮＡセグメントを連結することが可能となる。第４に、オハニンがそのアミノ酸配列中にＭｅｔ残基を含まないことから、Ｍｅｔ−Ａｌａ残基のコドンをオハニンのＮ末端に組み込んで発現後の融合タンパク質からのＣＮＢｒ切断を容易にした。第５に、最後のアミノ酸残基の後に停止コドンを入れて、翻訳の工程を停止させた。最後に、ＤＮＡｍａｎおよびＤＮＡｓｉｓのような各種コンピュータプログラムを用いて配列をチェックし、続いて不要の制限部位および過剰な二次構造の可能性について目視検査を行った（図８）。この合成遺伝子を用いて、我々は大腸菌に組換え体オハニンを産生させた。組換え体オハニンは、ＣＤによって決定されたその折りたたみ、および機能について（図１１）、ならびに生物学的活性（図７−Ｃ）について未変性のタンパク質に類似していた。従って、デザインされた合成遺伝子は、この新規タンパク質の構造−機能相関に関する将来の研究にとって重要である。
【０２４４】
オハニンの生理学的役割
ヘビ毒素は薬理学的に活性なペプチドおよびタンパク質の複合混合物である。それらは攻撃および防御の両機能に重要な役割を果たしている。神経毒のような、これらのタンパク質のいくつかは、被食者を麻痺させるのに関係するが、一方加水分解酵素を含むその他のものは被食者を消化するのに関係している。我々は、オハニンは被食者の運動性を緩慢にすることで貢献し、その捕獲を助ける。疼痛過敏作用もまた、捕食動物に疼痛を誘導することで防御機能に役立つだろう。毒液中に存在するその他成分と関係してオハニンが果たしている役割を明らかにするには、更なる研究が必要である。
【０２４５】
プロ−オハニンのプロペプチドセグメントの潜在的意義
オハニンは毒液腺の中で、プレプロ−タンパク質としてＣ末端プロペプチドセグメントと共に合成される（図１２）。これは、成熟タンパク質のＣ末端にプロペプチドセグメントを含むヘビ毒タンパク質として報告された、これまでのところ最初のものである。
【０２４６】
特徴付けするために、プロタンパク質を大腸菌に発現させ、精製した。組換え体プロ−オハニンは非常に可溶性であるタンパク質として得たが、これに対し組換え体オハニンは、溶解性を上げる努力をしたものの発現後不溶性である。従って、プロペプチドセグメントの存在は、大腸菌での大規模発現後に成熟タンパク質を可溶化するのに役立つことは明らかである。しかしながら、プロペプチドセグメントが溶解度を上げること、および／または毒液腺細胞もしくは管腔内での成熟タンパク質の正しい折りたたみを高めることを促進するのかは明らかではない。成熟タンパク質が粗毒液中に微量存在することを指摘しておく。かくしてこのことは、毒液内でのオハニンの溶解性にとってプロペプチドセグメントが必要ない可能性を示唆している。
【０２４７】
オハニンと同様にプロ−オハニンについても、マウスにおいてその生物学的機能を評価した。移動活動およびホットプレートアッセイの両分析は、プロ−オハニンが腹腔内投与したマウスにおいて、成熟オハニンと比較した時、同様の薬理作用は示さないことを強く示唆していることを指摘しなければならない。しかしプロ−オハニンは、マウス脳室内に直接注射した時、強力な移動低下および疼痛過敏作用を示した。プロタンパク質の大きなサイズおよび／または立体構造の変化が、プロ−オハニンの血液脳関門通過を阻害し、その結果中枢神経系における分子標的との相互作用を妨害しているのかもしれない。興味深いことに、ポリペプチドセグメントの存在はオハニンの血液脳関門通過能力を阻害するが、それは中枢神経系でのオハニンの薬理作用を促進する。プロ−オハニンはｉ．ｃ．ｖ．経路から注射した時には、オハニンよりも〜３５倍強力であることを指摘しなければならない。さらには、プロ−オハニンは、０．３μｇ／ｋｇの用量にて、実験マウスの移動活動を〜９０％阻害できる。
【０２４８】
エクソンの起源
我々はまた、オハニン遺伝子がＰＲＹ−ＳＰＲＹおよびＢ３０．２ドメインの直前に局在する単一のイントロンを有することも示した（図２２および２３）。現在イントロンの起源については２つ見解がある。一つの理論、初期エクソンは、エクソンが古代ミニ遺伝子の子孫であり、イントロンはそれらの間の間隔であるというものである（３２）。別の理論は、後期イントロンは、イントロンの挿入によって中断されていない遺伝子から分断された遺伝子が生じたというものである（３３）。簡単に説明すると、最初の理論は、エクソンがタンパク質の個別の機能または構造単位を表すことを示唆するが、一方第２の理論はイントロンの挿入が若干無秩序であることを示唆している。プロ−オハニン遺伝子の構造上の類似性は、それがＢ３０．２ドメインタンパク質と同一の先祖遺伝子から進化したらしいことを示している。このことは更に、オハニン遺伝子の進化が初期エクソン理論により近いことを示している。
【０２４９】
オハニンおよびプロ−オハニンのメカニズム
オハニンおよびプロ−オハニンが海馬および小脳に局在することは、移動低下作用を示すこのタンパク質の正確な性質を示唆している。海馬は、動物の移動活動に間接的に影響する代謝に関係することが分かっている。実際、海馬の神経細胞は、フェニルシクリプリン（ｐｈｅｎｙｌｃｙｃｌｉｐｒｉｎ）およびコカインによる移動低下に関係している。オハニンはアンタゴニストと同じ受容体に作用して、その移動低下作用を示す可能性がある。一方、小脳は動物の全体のバランスに関係している。アンフェタミンを用いたこれまでの実験は、小脳の神経細胞に作用することを示し、且つアンフェタミン投与の結果として移動低下を示すことを示した。また、同じ神経細胞がオハニンの相互作用にも関係している可能性もある。バランスに影響する神経細胞がオハニンの影響を受けるかは未だ不明であるが、バランスの欠如は全体的な移動能力の欠如をもたらすだろう。
【０２５０】
結論
我々は、キングコブラ毒液から新規タンパク質のオハニンを同定し、精製し、且つ機能的に特徴付けした。オハニンは移動低下および疼痛過敏をマウスに誘導する。ｉ．ｃ．ｖ．経路により投与されたオハニンが全身投与した場合に比べ効果的であることは、末梢神経系の役割を排除することはできないが、その作用が中枢神経系を介していることを強く示唆している。我々は将来の構造および機能相関研究のために、合成遺伝子発現系も確立した。オハニンの分子レベルの詳細な作用メカニズムは現在研究中である。
【０２５１】
これに加えて、我々はまたオハニンのｃＤＮＡをクローニングし、配列を決定した。１５５８ｂｐの完全長のｃＤＮＡ配列は、Ｃ末端にプロペプチドセグメントを持つプレプロ−オハニンをコードしている。組換え体プロ−オハニンは、ｉ．ｃ．ｖ．注射時には移動に対し強力な作用を示したが、ｉ．ｐ．注射時には示さなかった。このことから、オハニンの生物学的活性にとっては成熟が重要であると考えられる。ゲノムＤＮＡの配列決定からは、５つのエクソンと４つのイントロンの存在が示された。興味深いことに、５’非翻訳領域をコードする第２エクソンは二者択一的なスプライシングを受ける。これらの所見を全てまとめると、オハニンはＢ３０．２ドメイン含有タンパク質の新規サブファミリーを形成していることが示される。
【図面の簡単な説明】
【０２５２】
【図１】 キングコブラ毒からの新規タンパク質の探索。粗毒液（６０μｇ）をＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｓｃｉｅｘ ＡＰＩ３００ ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ質量分析装置に取り付けられたＲＰ−Ｊｕｐｉｔｅｒ Ｃ１８分析用カラムにかけた。結合したタンパク質は、８０％ＡＣＮの０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）溶液の直線勾配を用いて、５０μｌ／分の流速で溶出した。関心対象のタンパク質を含有するピークを矢印で示す。
【図１−Ａ】 ＬＣ／ＭＳによってキングコブラ毒から検出されたペプチドおよびタンパク質の質量。
【図２】 新規タンパク質の単離および精製。（Ａ）キングコブラ毒のゲル濾過。粗毒液（２００ｍｇ）をＳｕｐｅｒｄｅｘ ３０カラム（Ｈｉｌｏａｄ １６／６０）にかけた。カラムを５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）で予備平衡化した。タンパク質を同一緩衝液中に１ｍｌ／分の流速で溶出した。水平の実線（ピーク１ｂ）は関心対象のタンパク質を含有する分画を示す。（Ｂ）ゲル濾過のピーク１ｂのＲＰ−ＨＰＬＣ。ＪｕｐｉｔｅｒＣ１８半調製カラムを０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡを用いて平衡化した。関心対象のタンパク質を、３８〜４０％Ｂ（８０％ＡＣＮの０．１％ＴＦＡ溶液）の勾配を付けて２ｍｌ／分の流速でカラムから溶出した。矢印は、関心対象のタンパク質に対応するピークを示す。（Ｃ）新規タンパク質のＥＳＩ／ＭＳ。タンパク質はＢｉｏｓｐｅｃ Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔスペクトルによれば、１１９５１．４７±０．６７Ｄａの分子量を持つ。
【図３】 ペプチド消化物の精製。Ｌｙｓ−Ｃエンドペプチダーゼ消化ペプチド（Ａ）；トリプシン処理ペプチド（Ｂ）；およびギ酸消化ペプチド（Ｃ）。
【図３−Ｄ】 オハニンのペプチドの理論質量および実測質量。
【図４】 オハニンのアミノ酸配列。タンパク質配列はエドマン分解によって決定した。太字、実線の矢印、未変性のピリジルエチル化オハニンのＮ末端配列；破線矢印、Ｌｙｓ−Ｃペプチド；点線矢印、トリプシンペプチド；および実線矢印、ギ酸消化ペプチド。
【図５】 オハニンのＢ３０．２類似ドメインと他のＢ３０．２類似ドメイン含有タンパク質との配列アラインメント。Ｂ３０．２類似ドメイン含有タンパク質は次の通りである：オハニン（ｓｐ：Ｐ８３２３４）、タイコブリン（Ｔｈａｉｃｏｂｒｉｎ）（ｓｐ：Ｐ８２８８５）、ＰＲＹ−ＳＰＲＹドメイン（ＰＲＹ−ＳＰＲＹドメインの保存配列は、ＣＤＤデータベースより得た）、ＲＦＰ（リングフィンガータンパク質、ｇｂ：Ｊ０３４０７）、ＢＴＮ（ブチロフィリン（Ｂｕｔｙｒｏｐｈｉｌｉｎ）、ｓｐ：Ｐ１８８９２）、アルファＳＮＴＸ（ストヌストキシン（Ｓｔｏｎｕｓｔｏｘｉｎ）α−サブユニット、ｇｂ：Ｕ３６２３７）、ＫＩＡＡ０１２９（ｇｂ：Ｄ５０９１９）、およびＳｔａｆ５０（ｇｂ：Ｘ８２２００）。同一および保存された残基にはそれぞれ黒および灰色の陰を付けた。３種類の保存されたＬＤＰ、ＷＥＶＥ、およびＬＤＹＥモチーフには囲いを付けた。カッコ内の数字は、タンパク質のＢ３０．２類似ドメイン間の類似性をパーセント表示したものである。次のアミノ酸残基グループ間の置換を保存的変更とする：Ｙ、Ｆ、およびＷ；ＳおよびＴ；Ｖ、Ｌ、Ｉ、およびＭ；Ｈ、Ｒ、およびＫ；ＤおよびＥ；ＮおよびＱ；ＡおよびＧ。
【図６】 マウスの移動活動に及ぼすオハニンの作用。オハニンｉ．ｐ．注射後の移動活動の累積（Ａ）および経時変化（Ｂ）（ｎ＝８〜９）。オハニンｉ．ｃ．ｖ．注射後の移動運動の累積（Ｃ）および経時変化（Ｄ）（ｎ＝７〜９）。移動活動の用量依存的な阻害は、オハニンのｉ．ｃ．ｖ．注射の方が６，５００倍以上強力である。データは移動活動の平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍで表している；（Ａ）および（Ｃ）では一元配置分散分析を用い、（Ｂ）および（Ｄ）では二元配置分散分析を用いた；Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ検定による事後分析：ａ、Ｐ＜０．０５；ｂ、Ｐ＜０．０１、およびｃ、Ｐ＜０．００１。
【図７】 未変性の組換え体オハニンの疼痛過敏作用。未変性オハニンｉ．ｐ．注射後の５５℃ホットプレートアッセイでの潜在期（ｎ＝８）（Ａ）；および同ｉ．ｃ．ｖ．注射後（ｎ＝８〜１６）（Ｂ）。（Ｃ）組換え体オハニンｉ．ｃ．ｖ．注射後の潜在期（ｎ＝８から１６）。未変性および組換え体オハニンは共にｉ．ｃ．ｖ．投与時に、低および中間用量について用量依存的な疼痛過敏を示した。データは、平均潜在期±Ｓ．Ｅ．Ｍで表している；一元配置分散分析後にＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ検定を行った：ａ、Ｐ＜０．０５およびｂ、Ｐ＜０．０１。
【図８】 オハニンの合成遺伝子のデザイン、構築、およびクローニング。（Ａ）発現構築体の概略図。トロンビンおよびＣＮＢｒ切断部位はそれぞれＴｂおよびＣＮＢｒで示した。２つの矢印の間のＤＮＡ断片がＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩ部位でベクターＭに挿入された。（Ｂ）合成遺伝子の全長配列。アミノ酸配列をＤＮＡ配列の下に示した。１０カ所の固有の制限部位（ＡａｔＩＩ、ＢｓｔＢＩ、ＡｃｌＩ、ＸｈｏＩ、ＡｖｒＩＩ、ＸｍａＩ、ＢｓｐＥＩ、ＫｐｎＩ、ＮｈｅＩ、およびＡｆｌＩＩ）は太字で示している。（Ｃ）合成遺伝子構築のストラテジー。長さ９６ｂｐ〜１１７ｂｐの２組のオリゴヌクレオチドを用いて、２つの断片（Ｐ１およびＰ２）をアセンブルした。これら２つの断片を次にＸｍａＩ部位を介して連結し、全体遺伝子を作成した（詳細については実験手順を参照）。この２つの断片（Ｄ）および合成遺伝子（Ｅ）のアガロースゲル（１．５％、ｗ／ｖ）電気泳動像。
【図９】 組換え体オハニンのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。サンプルを１５％ポリアクリルアミドゲル上で分離し、クマシーブリリアントブルーＲ２５０で染色した。（Ａ）大腸菌での組換え体オハニンの発現および溶解性。レーンＭ、予備染色した広域標準物質；レーン１〜５、それぞれ細菌培養物からＩＰＴＧ誘導後０、１０、１２、１４および１６時間後に得た全タンパク質サンプル；レーン６および７、超音波処理後に上清および沈殿から得たタンパク質サンプル。（Ｂ）融合タンパク質の精製および巻き戻し。レーンＭ：予備染色されたプレシジョンプラス二色標準物質；レーン１および２、超音波処理を１回および２回行ったものから得た全タンパク質サンプル；レーン３、変性条件下でのアフィニティーカラムからの融合タンパク質の溶出；レーン４、空レーン；レーン５、巻き戻された融合タンパク質。（Ｃ）ＣＮＢｒによる融合タンパク質の切断。レーンＭ、予備染色されたプレシジョンプラス二色標準物質；レーン１および２、切断前および後の融合タンパク質。融合ペプチド（〜２ｋＤａ）は１５％ポリアクリルアミドゲルで分離するには小さすぎる。１、２、および３と印したバンドは、それぞれ発現した融合タンパク質、リゾチーム、および組換え体オハニンである。
【図１０】 組換え体オハニンの精製。（Ａ）トロンビン切断後の組換え体オハニンのＲＰ−ＨＰＬＣ。矢印は、組換え体タンパク質含有分画を示す。（Ｂ）組換え体オハニンのＥＳＩ／ＭＳ。組換え体タンパク質は、Ｂｉｏｓｐｅｃ Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔスペクトルが指示するところによれば、１２２２６．９１±０．８９Ｄａの分子量を持つ。
【図１１】 未変性および組換え体オハニンのＣＤスペクトル。（Ａ）ＣＤスペクトルは２ｍｍ路程キュベットを用いて記録した。測定はＭｉｌｌｉＱ水の中で行った。使用した濃度は１２．５μＭであった。未変性および組換え体オハニンのＣＤスペクトルは、それぞれ太線と細線で示している。（Ｂ）未変性および組換え体オハニンの構造内容。
【図１２】 オハニンｃＤＮＡのクローニングおよび配列決定。（Ａ）５’−ＲＡＣＥ増幅。５’−ＵＴＲを伴うオハニンの一部コーディング領域を、ＧＳＰ２およびＵＰＭを用いた５’−ＲＡＣＥ増幅によって得た。（Ｂ）３’−ＲＡＣＥ増幅。ポリＡテールを除く１５５８ｂｐの全長ｃＤＮＡをもたらす３’−ＲＡＣＥ増幅を、ＧＳＰ１およびＵＰＭを用いて行った。（Ｃ）オハニン（ｇｂ：ＡＹ３５１４３３）のヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列。ヌクレオチドは５’−から３’−方向に示している。最長のオープンリーディングフレームの逆翻訳より推定されたアミノ酸配列を示している：推定シグナルペプチドには下線をつけてある；オハニンは太字でマークした；２塩基切断部位は囲いを付け、プロペプチドセグメントはイタリックで示した。停止コドンはアスタリスクで示し、ポリアデニル化シグナル、ＡＡＴＡＡＡは二重下線を付けた。タイプＩＩｃＤＮＡのヌクレオチド消失部分には黒色の陰を付けた。
【図１３】 Ｂ３０．２類似ドメインの配列アラインメント。ドメインはプロ−オハニン（ｇｂ：ＡＹ３５１４３３）、タイコブリン（ｓｐ；Ｐ８２８８５）、ＲＦＰ（リングフィンガータンパク質、ｇｂ：ＮＭ １７２０１６）、ＢＴＮ（ブチロフィリン、ｇｂ：ＮＰ ０３８５１１）、ＰＲＹ−ＳＰＲＹドメイン（ＰＲＹ−ＳＰＲＹドメインの保存配列はＣＤＤデータベースから得た）、ＳＮＴＸのベータサブユニット（β−サブユニットストヌストキシン、ｇｂ：Ｑ９１４５３）、ＳＮＴＸのアルファサブユニット（α−サブユニットストヌストキシン、ｇｂ：Ｑ９８９８９）、エンテロフィリン（ｇｂ：ＡＦ１２６８３３）、およびＳＰＲＹドメイン含有ＳＯＣＳボックスタンパク質４（サイトカインシグナル伝達の抑制因子、ｇｂ：ＮＰ ６６０１１６）。同一および保存された残基には黒および灰色の陰を付けている。プロ−オハニンのＡｒｇ−Ａｒｇ２塩基切断部位は太字で示し、プロペプチドセグメントはイタリックで表した。３つの保存されたＬＤＰ、ＷＥＶＥ、およびＬＤＹＥモチーフには囲いを付けた。配列のアラインメントを最適にし、且つ相同性を最大にするために、ギャップ（−）を入れた。矢印はＰＲＹとＳＲＰＹドメインの境界を示す。カッコ内の数字はプロ−オハニンのＢ３０．２類似ドメインと他のＢ３０．２類似ドメイン含有タンパク質の間の類似性のパーセンテージを表す。アミノ酸残基の次のグループ内の置換は保存的な交換とされる：Ｙ、Ｆ、およびＷ；ＳおよびＴ；Ｖ、Ｌ、Ｉ、およびＭ；Ｈ、Ｒ、およびＫ；Ｄ、Ｅ、Ｎ、およびＱ；ＡおよびＧ。
【図１４】 Ｂ３０．２類似ドメインを持つタンパク質の概略図。Ｂ３０．２類似ドメインには黒色の陰を付け、未同定のドメインはドットを付けた。
【図１５】 プロ−オハニンの発現構築体。（Ａ）１９Ｋ１および１９Ｋ２プライマーから増幅されたプロ−オハニンに対応する核酸配列のアガロースゲル（１．５％、ｗ／ｖ）電気泳動。（Ｂ）発現構築体の概略図。トロンビンおよびＣＮＢｒ切断部位は、それぞれＴｂおよびＣＮＢｒで示した。プロ−オハニンに対応する〜５３０ｂｐのｃＤＮＡ断片を、ＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩ部位にある２つの矢印の間に挿入した。
【図１６】 組換え体プロ−オハニンのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。サンプルを１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離し、クマシーブリリアントブルーＲ２５０で染色した。（Ａ）大腸菌での組換え体プロ−オハニンの発現。レーンＭ、予備染色されたプレシジョンプラス二色標準物質；レーン１、誘導前の細菌培養物から得た全タンパク質サンプル；レーン２、ＩＰＴＧ誘導後。（Ｂ）融合タンパク質の精製。レーンＭ：予備染色されたプレシジョンプラス二色標準物質；レーン１および２、未変性条件下でのアフィニティーカラムからの融合タンパク質の溶出。（Ｃ）トロンビンによる融合タンパク質の切断。レーンＭ、予備染色されたプレシジョンプラス二色標準物質；レーン１および２、切断前および後の融合タンパク質。１および２と印したバンドは、それぞれ発現した融合タンパク質および組換え体プロ−オハニンである。融合ペプチド（〜２ｋＤａ）は１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離するには小さすぎる。
【図１７】 ＲＰ−ＨＰＬＣを用いた組換え体プロ−オハニンの精製。水平のバーは組換え体プロ−オハニンに対応するピークを示す。
【図１８】 オハニンとプロ−オハニンのＣＤスペクトルの比較。（Ａ）ＣＤスペクトルは２ｍｍ路程キュベットを用い、ＭｉｌｌｉＱ水内にて、１２．５μＭのタンパク質について記録した。太線、オハニン；細線、プロ−オハニン。（Ｂ）オハニンおよびプロ−オハニンの二次構造の内容。
【図１９】 オハニンおよびプロ−オハニンの移動低下作用。オハニン（Ａ）およびプロ−オハニン（Ｂ）腹腔内注射後（ｎ＝８〜９）の累積移動活動。オハニン（Ｃ）およびプロ−オハニン（Ｄ）のｉ．ｃ．ｖ．注射後（ｎ＝６〜９）の累積移動活動。データは移動活動平均カウント±Ｓ．Ｅ．Ｍで表した；一元配置分散分析を用いた；Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ検定による事後分析：ａ、Ｐ＜０．０５；ｂ、Ｐ＜０．０１、およびｃ、Ｐ＜０．００１。
【図２０】 オハニンおよびプロ−オハニンの疼痛過敏作用。腹腔内注射後（ｎ＝８）（Ａ）および（Ｂ）；ｉ．ｃ．ｖ．注射後（ｎ＝８〜１６）（Ｃ）および（Ｄ）の５５℃でのホットプレートアッセイ潜在期間。（Ａ）および（Ｃ）、オハニンを注射したマウスから得られた潜在期間；（Ｂ）および（Ｄ）、プロ−オハニンを注射したマウスから得られた潜在期間。ｉ．ｃ．ｖ．経路で投与した時、オハニンは低用量および中用量で用量依存的な疼痛過敏作用を示した；一方プロ−オハニンは、全ての用量について潜在期間は比較的短い。データは平均潜在時間±Ｓ．Ｅ．Ｍで表した；一元配置分散分析後にＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ検定を行った：ａ、Ｐ＜０．０５およびｂ、Ｐ＜０．０１。
【図２１】 オハニンのゲノムサザンブロッティング。キングコブラのゲノムＤＮＡ（各レーンに１０μｇ）をＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＲａｍＨＩまたはＮｄｅＩ酵素で消化した。サザンハイブリダイゼーションは、４種類全ての消化について１本のバンドの存在を示している。かくしてオハニンは、キングコブラゲノム中の単一遺伝子によってコードされている。λＨｉｎｄＩＩＩマーカーの移動位置が指示されている。
【図２２】 オハニンゲノムの配列。ゲノムＤＮＡのＰＣＲおよび「ゲノムウォーキング」法の両方を用いて、７０８６ｂｐの完全長のゲノム配列を得た。エクソン−イントロンの境界は、ｃＤＮＡおよびゲノム配列に基づいて決定した。エクソンには灰色の陰を付けて大文字で示し、一方イントロンは小文字で示した。タイプＩＩｃＤＮＡの中で消失しているエクソンには黒の陰を付けた。３カ所あるＡＴＧは太字で示した；推定シグナルペプチドには下線を付けた；二塩基プロセッシング部位には囲いを付けた；プロペプチドセグメントはイタリックで印し、停止コドンにはアスタリスクを付け示し、ポリアデニル化シグナルであるＡＡＴＡＡＡには二重下線を付けた。
【図２３】 オハニンのゲノム構造。オハニン遺伝子は５つのエクソンと４つのイントロンを含んでいる。エクソン１〜５は、それぞれ５３、７６、９５、９６、および１２３８ｂｐのサイズを持っている。イントロンはそれぞれ１１６０、１７４３、１２９２〜１３３３ｂｐである。もう一つのスプラシング例ではエクソン２全体が除かれ、より短い１４８２ｂｐの転写体ができる。完全なｃＤＮＡはタイプＩと名付けられ、一方もう一つのスプラシング（エクソン２が無い）に対応する短いｃＤＮＡはタイプＩＩｃＤＮＡと名付けられた。
【図２３−Ａ】 オハニン遺伝子のエクソン−イントロンの境界。
【図２４】 Ｈｉｓ−プロ−オハニンのｉｎ ｖｉｔｒｏ結合研究のストラテジー
【図２５】 Ｈｉｓ−プロ−オハニンとの予備インキュベーション無しの非蛍光コントロール実験と比較した、脳の海馬および小脳領域へのＨｉｓ−プロ−オハニンｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイでの蛍光を示す免疫蛍光スライド。
【図２６】 Ｈｉｓ−プロ−オハニンの結合特異性を評価する競合結合コントロールアッセイを示す概略図。
【図２７】 コントロールと比較したＨｉｓ−プロ−オハニンの結合特性を示す免疫蛍光スライド。
【図２８】 Ｈｉｓ−オハニンとＨｉｓ−プロ−オハニンのｉｎ ｖｉｖｏ結合研究のストラテジー。
【図２９】 脳の（Ａ）海馬および（Ｂ）小脳領域内でのオハニンおよびプロ−オハニンの用量依存的結合を示す免疫蛍光スライド。
【図３０】 オハニンおよびプロ−オハニンの血液脳関門通過能力を示す免疫蛍光スライド。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号１の配列を含むタンパク質、
（ｂ）配列番号３の配列を含むタンパク質、
（ｃ）配列番号５の配列を含むタンパク質、
（ｄ）配列番号７の配列を含むタンパク質、あるいは
（ｅ）（ｉ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、もしくは（ｄ）のタンパク質の対立遺伝子変異、
（ｉｉ）移動低下もしくは疼痛過敏の少なくとも一方を誘導する能力を保持した機能的均等物、または（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、もしくは（ｅ）（ｉ）のタンパク質と共通の抗原決定基を有する機能的均等物である（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、もしくは（ｅ）（ｉ）のタンパク質の機能的均等物、
（ｉｉｉ）活性断片が移動低下もしくは疼痛過敏の少なくとも一方を誘導する能力を保持しているか、または活性断片が（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）（ｉ）、もしくは（ｅ）（ｉｉ）のタンパク質と共通の抗原決定基を有している、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）（ｉ）、もしくは（ｅ）（ｉｉ）のタンパク質の活性断片、または
（ｉｖ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）（ｉ）、（ｅ）（ｉｉ）、もしくは（ｅ）（ｉｉｉ）のタンパク質を含む融合タンパク質
を含む群から選択されるタンパク質。
【請求項２】
請求項１に記載のタンパク質をコードする核酸分子。
【請求項３】
請求項２に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項４】
請求項３に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項５】
請求項１に記載のタンパク質を製造する方法であって、請求項４に記載の宿主細胞を培養することを含む方法。
【請求項６】
請求項１に記載のタンパク質を製造する方法であって、タンパク質の化学的合成を含む方法。
【請求項７】
化学的合成が固相ペプチド合成またはコンビナトリアルケミストリーでよい、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
動物を請求項１に記載のタンパク質を用いて免疫すること、および動物から抗体を採取すること、またはモノクローナル抗体作製に使用するために動物から細胞を採取することを含む、請求項１に記載のタンパク質に結合できるポリクローナルまたはモノクローナル抗体の作製方法。
【請求項９】
請求項１に記載のタンパク質に結合する抗体。
【請求項１０】
動物を請求項１に記載のタンパク質を用いて免疫すること、および抗毒素として使用するために動物から抗体を採取することを含む、請求項１に記載のタンパク質に対する抗毒素を作製する方法。
【請求項１１】
動物がウマ、ヤギ、ヒツジ、またはトリである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１のタンパク質に対し有効な抗毒素。
【請求項１３】
請求項１に記載のタンパク質の調整因子を同定するための方法。
【請求項１４】
請求項１に記載のタンパク質、請求項２に記載の核酸分子、請求項３に記載のベクター、請求項４に記載の宿主細胞、請求項９に記載の抗体、請求項１１に記載の抗毒素、または請求項１３の方法により同定された調整因子を含む、医薬組成物。
【請求項１５】
医薬品に使用するための請求項１に記載のタンパク質、請求項２に記載の核酸分子、請求項３に記載のベクター、請求項４に記載の宿主細胞、請求項９に記載の抗体、請求項１１に記載の抗毒素、または請求項１３の方法により同定された調整因子。
【請求項１６】
鎮静剤として使用するための医薬品製造への請求項１に記載のタンパク質、請求項２に記載の核酸分子、請求項３に記載のベクター、請求項４に記載の宿主細胞、請求項９に記載の抗体、請求項１１に記載の抗毒素、または請求項１４の方法で同定された調整因子の使用。
【請求項１７】
神経系または筋肉系の疾患の治療に使用するための医薬品を製造するための請求項１に記載のタンパク質、請求項２に記載の核酸分子、請求項３に記載のベクター、請求項４に記載の宿主細胞。
【請求項１８】
請求項１に記載のタンパク質、請求項２に記載の核酸分子、請求項３に記載のベクター、請求項４に記載の宿主細胞、または請求項１４に記載の医薬組成物を動物に投与することを含む、動物を沈静化させる方法。
【請求項１９】
請求項１に記載のタンパク質、請求項２に記載の核酸分子、請求項３に記載のベクター、請求項４に記載の宿主細胞、または請求項１４に記載の医薬組成物を患者に投与することを含む、神経系または筋肉系の疾患を持つ患者を治療する方法。
【請求項２０】
請求項１に記載のタンパク質を含む、防御用組成物。

【図１】

【図１Ａ】

【図２】

【図３】

【図３Ｄ】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１２Ｃ】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【図１６】

【図１７】

【図１８】

【図１９】

【図２０】

【図２１】

【図２２】


【図２３】

【図２３Ａ】

【図２４】

【図２５】

【図２６】

【図２７】

【図２８】

【図２９Ａ】

【図２９Ｂ】

【図３０】

【公表番号】特表２００８−５２５０２０（Ｐ２００８−５２５０２０Ａ）
【公表日】平成２０年７月１７日（２００８．７．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５４８１６３（Ｐ２００７−５４８１６３）
【出願日】平成１７年１２月２２日（２００５．１２．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＳＧ２００５／０００４２９
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０６８６２５
【国際公開日】平成１８年６月２９日（２００６．６．２９）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＷＩＮＤＯＷＳ
【出願人】（５０１４８２５９２）ナショナル　ユニバーシティ　オブ　シンガポール (9)
【Ｆターム（参考）】