新規血清型のストレプトコッカスミュータンスおよびその利用
本発明は、ストレプトコッカス ミュータンス血清型特異的多糖抗原のグルコース側鎖量を低下させるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。本発明はまた、当該ポリヌクレオチドを有する新規ストレプトコッカス ミュータンス株、および当該ストレプトコッカス ミュータンス株に特異的な抗体、ならびに被験体中に存在する当該ストレプトコッカス ミュータンス株を検出する方法に関する。本方法に従うと、血清型が不定であるストレプトコッカス ミュータンスが被験体中に存在か否かが確認され得、その結果、感染性心内膜炎発症の可能性の高い対象を特定し得る。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ストレプトコッカス ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ））の新規血清型株、当該新規血清型株に特異的な抗体、当該抗体を作製する方法、当該抗体を用いる当該新規株を検出するための方法およびキット、ならびに、Ｓ．ｍｕｔａｎｓの新規血清型株に特異的な多糖抗原の生合成に関与する酵素をコードするポリヌクレオチド、当該ポリヌクレオチドを用いる当該新規株を検出するための方法およびキットに関する。具体的には、上記抗体と被験体サンプルから抽出した表層多糖抗原とを免疫反応させることによって、または被験体サンプルより抽出したゲノムＤＮＡに対して上記ポリヌクレオチドを用いてハイブリダイゼーションを行うかもしくは上記ポリヌクレオチドを用いてＰＣＲ反応を行うことによって、被験体におけるＳ．ｍｕｔａｎｓの新規血清型株の存在を検出する方法および当該検出方法を行うためのキットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ストレプトコッカス ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）が、う蝕（むし歯）の原因菌として有名である。う蝕は、Ｓ．ｍｕｔａｎｓが発生する酸によって歯が溶出する疾患である。Ｓ．ｍｕｔａｎｓは、口腔内で増殖して酵素グルコシルトランスフェラーゼを分泌する。この酵素は、食物中の糖分を分解して不溶性の多糖類グルカンを生成する。生成したグルカンは、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ菌体とともに歯の表面に付着してプラーク（歯垢）を形成する。Ｓ．ｍｕｔａｎｓは、プラーク内で糖を代謝して乳酸などの酸を生成する。この酸が歯表面のエナメル質からカルシウムを溶出し、その結果、う蝕が進行する。以上のように、う蝕は、歯科領域において重要な疾患の１つであるので、う蝕の治療および予防に関する研究が進められている。
【０００３】
細菌を分類する公知の方法としては、生理生化学的性状に基づく方法、キノン組成、菌体脂肪酸組成または細胞壁成分等に基づく方法、ＤＮＡのＧ＋Ｃ含量に基づく方法、ＤＮＡ相同性に基づく方法、ＤＮＡプローブを用いる方法、および１６ＳリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）遺伝子の塩基配列の解析を行う方法等が挙げられる。特に、近年では、１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列に基づいて系統分類したグループ（クラスター）を指標とする細菌の分類および識別が行なわれている。
【０００４】
ミュータンス連鎖球菌（ｍｕｔａｎｓ ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）は、その細胞壁多糖類の組成およびその連鎖における相違に基づいて、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）（血清型ｃ、ｅ、ｆ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｏｂｒｉｎｕｓ（血清型ｄ、ｇ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｒｉｃｅｔｕｓ（血清型ａ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｔｔｕｓ（血清型ｂ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆｅｒｕｓ（血清型ｃ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｃａｃａｅ（血清型ｃ）、及びＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄｏｗｎｅｉ（血清型ｈ）の計８つの血清型に分類される。
【０００５】
さらに、Ｓ．ｍｕｔａｎｓは、感染性心内膜炎（Ｉｎｆｅｃｔｉｖｅ Ｅｎｄｏｃａｒｄｉｔｉｓ；ＩＥ）患者の血液より分離されることがある。感染性心内膜炎は、歯科領域において最も良く知られている全身性疾患の一つである。感染性心内膜炎は致死的な感染症であり、心臓弁置換術を受けた患者または心臓に先天性奇形を有する患者が罹患しやすいとされる。感染性心内膜炎は、歯科治療によって患者の血液中に原因菌が侵入し、心内膜に細菌塊を形成して炎症を引き起こす。この原因菌は、口腔に存在する連鎖球菌（特に、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｎｇｕｉｎｉｓ）であることが多いが、Ｓ．ｍｕｔａｎｓもまた原因菌として挙げられ得る。
【０００６】
通常、感染性心内膜炎を発症する患者を歯科治療する場合は、治療の前に抗生物質の投与が行なわれ、そして抗生物質の血中濃度が上昇してから下降するまでの間に治療が行なわれる（非特許文献１および２参照）。
【０００７】
【非特許文献１】 Ｄａｊａｎｉ Ａ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｅｎｄｏｃａｒｄｉｔｉｓ；Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ ｂｙ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｈｅａｒｔ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １９９７ ９６：３５８−３６６．
【非特許文献２】 Ｎａｋａｔａｎｉ Ｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｖｅ ｅｎｄｏｃａｒｄｉｔｉｓ ｉｎ Ｊａｐａｎ；ａｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ８４８ ｃａｓｅｓ ｉｎ ２０００ ａｎｄ ２００１．Ｃｉｒｃ．Ｊ．２００３ ６７：９０１−９０５．
【０００８】
感染性心内膜炎を予防するために、多量の抗生物質が使用される。例えば、ペニシリン系抗生物質であるサワシリンは、体重２５ｋｇの子供に１回につき１０００ｍｇがカプセルまたは粉末にて術前投与される。
【０００９】
このような多量の抗生物質は、医学的に必要である。しかし、抗生物質の乱用に起因する薬剤耐性菌の出現は、近年大きな問題となっている。従って、抗生物質の使用量を減らすこと、および抗生物質の使用による耐性菌出現を抑制することは、有用である。
【００１０】
本発明者らの以前の研究において、抜歯処置の後の菌血症患者または感染性心内膜炎患者から分離した４つの連鎖球菌株は、その生物学的な性質および１６ＳリボソームＲＮＡの塩基配列に基づいてＳ．ｍｕｔａｎｓ株と特定された（非特許文献３参照）。通常、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ株は、その約８０％以上が血清型ｃに分類されるが、上記患者の血液から分離した４株のＳ．ｍｕｔａｎｓはいずれも血清型ｃではなかった。これらの株のうち、１株が血清型ｅ、１株が血清型ｆであり、残りの２つの株（ＴＷ２９５及びＴＷ８７１）は、公知の血清型（ｃ型、ｅ型またはｆ型）のいずれにも属さず、血清学的に不定であった。
【００１１】
Ｓ．ｍｕｔａｎｓ株の血清型を決定する血清型特異的な多糖抗原は、ラムノース基本骨格とα−又はβ−結合のグルコシド基側鎖とを有するラムノース−グルコースポリマーからなる。上記ＴＷ２９５株及びＴＷ８７１株の血清学的に不定であるという性質は、血清型特異的な多糖抗原におけるグルコース側鎖の量の低下に起因することが示された。さらに、血清学的に不定な株（便宜上、Ｓ．ｍｕｔａｎｓの血清型不定株と称する）ＴＷ２９５及びＴＷ８７１における血清型特異多糖抗原は、ｇｌｕＡ遺伝子（グルコース側鎖ドナーにおける直前の前駆体の生産を触媒する酵素をコードする）を不活性化した変異株における血清型特異多糖抗原と類似しており、ｇｌｕＡ遺伝子不活化変異株およびＳ．ｍｕｔａｎｓの血清型不定株のいずれにおいても、血清型特異多糖抗原のグルコースの量は低い。
【００１２】
また、Ｓ．ｍｕｔａｎｓの血清型不定株は、口腔から分離した株と同じくらい高い疎水性とショ糖依存的付着能とを有することが示され、また、食作用を受けにくいことが明らかになった。
【００１３】
【非特許文献３】 Ｆｕｊｉｗａｒａ，Ｔ．，Ｋ．Ｎａｋａｎｏ，Ｍ．Ｋａｗａｇｕｃｈｉ，Ｔ．Ｏｏｓｈｉｍａ，Ｓ．Ｓｏｂｕｅ，Ｓ．Ｋａｗａｂａｔａ，Ｉ．Ｎａｋａｇａｗａ，ａｎｄ Ｓ．Ｈａｍａｄａ．２００１．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ｕｎｔｙｐａｂｌｅ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ ｓｔｒａｉｎｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｂａｃｔｅｒｅｍｉａ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｏｒａｌ Ｓｃｉ．１０９：３３０−３３４．
【００１４】
上記の知見は、高い疎水性とショ糖依存的な付着レベルとに起因して、Ｓ．ｍｕｔａｎｓの血清型不定株がヒトの口腔に存在し得ることを意味する。さらに、Ｓ．ｍｕｔａｎｓの血清型不定株は、食作用を受けにくいために、血液中においてより長く生存することが可能になり、その結果、血液より分離されたと考えられる。
【００１５】
感染性心内膜炎を予防するために、患者が感染性心内膜炎の原因菌（例えば、Ｓ．ｍｕｔａｎｓの血清型不定株）を保有するか否かを簡便に同定することが、非常に望まれている。さらに、感染性心内膜炎の原因菌を特定することは、治療に用いる抗生物質を選択する際に有用である。しかし、患者が感染性心内膜炎の原因菌を保有するか否かを簡便に同定する方法や、感染性心内膜炎の原因菌を特定する方法は、未だ開発途上である。
【００１６】
上述したように、Ｓ．ｍｕｔａｎｓの血清型不定株は血液中でも安定であり、その結果、Ｓ．ｍｕｔａｎｓの血清型不定株が感染した患者は感染性心内膜炎を発症する可能性が高いと考えられる。Ｓ．ｍｕｔａｎｓの血清型不定株は、死に至る可能性がある感染性心内膜炎の発症を予防する観点から重要であると考えられているので、Ｓ．ｍｕｔａｎｓの血清型不定株の分離および同定が、特に望まれる。
【００１７】
本発明の目的は、当該Ｓ．ｍｕｔａｎｓの血清型不定株を分離および同定して、被験体中に存在するか否かを有効かつ効率的に判定する方法を提供することにある。
【発明の開示】
【００１８】
本発明者等は、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、免疫方法に改良を加えることによって、Ｓ．ｍｕｔａｎｓの血清型不定株に対する抗血清を取得し、Ｓ．ｍｕｔａｎｓの血清型不定株を新規血清型（ｋ型）と定義した。
【００１９】
この新規血清型ｋ型を規定する多糖抗原を解析するために、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ多糖抗原の生合成に関与する酵素（ｒｇｐＡ、ｒｇｐＢ、ｒｇｐＣ、ｒｇｐＤ、ｒｇｐＥ、ｒｇｐＦ、ＯＲＦ７、ｒｇｐＨ、ｒｇｐＩおよびＯＲＦ１０）をコードする遺伝子の全配列を、当該ｋ型株において特定した。これらの遺伝子配列についてｋ型株と既知の血清型Ｓ．ｍｕｔａｎｓ株との間で比較して、ｒｇｐＦにおいて複数のｋ型株に共通した特異配列が存在することを見出した。さらに本発明者らは、ｒｇｐＦにおいて見出されたＳ．ｍｕｔａｎｓのｋ型株に特異的な塩基配列に基づいて設計したプライマーを用いて、被験体より得られた組織サンプルをＰＣＲ増幅することによって、当該被験体におけるＳ．ｍｕｔａｎｓの血清型不定株の存在を有効かつ効率的に検出することが可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００２０】
即ち、本発明のポリヌクレオチドまたはそのフラグメントは、ストレプトコッカス ミュータンスの血清型特異多糖抗原のグルコース側鎖の量が低下したストレプトコッカス ミュータンス株に特異的な塩基配列あるいは当該塩基配列の相補配列を含むことを特徴としている。
【００２１】
好ましくは、本発明のポリヌクレオチドまたはそのフラグメントは、ストレプトコッカス ミュータンス特異的な多糖抗原のグルコース側鎖量を低下させるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであることを特徴としている。
【００２２】
上記ポリヌクレオチドは、
配列番号１ないし４の何れか１つに示される塩基配列；または
配列番号１ないし４の何れか１つに示される塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列、
からなることを特徴とするポリヌクレオチドであることが好ましい。
【００２３】
上記ポリヌクレオチドはまた、
配列番号１ないし４の何れか１つに示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または
配列番号１ないし４の何れか１つに示される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、
であることが好ましい。
【００２４】
さらに好ましくは、上記ポリヌクレオチドは、配列番号１ないし４の何れか１つに示される塩基配列からなることを特徴としている。
【００２５】
上記構成によれば、新規血清型を有するストレプトコッカス ミュータンス株に特異的に存在するポリヌクレオチドを提供することができる。
【００２６】
即ち、本発明のオリゴヌクレオチドは、ストレプトコッカス ミュータンスの血清型特異多糖抗原のグルコース側鎖の量が低下したストレプトコッカス ミュータンス株に特異的な塩基配列あるいは当該塩基配列の相補配列を含むことを特徴としている。
【００２７】
好ましくは、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号１ないし４の何れか１つに示される塩基配列の少なくとも１２個連続する塩基配列またはその相補配列を含むことを特徴としている。
【００２８】
上記オリゴヌクレオチドは、配列番号８ないし１０に示される塩基配列またはその相補配列を含むことが好ましい。
【００２９】
上記構成によれば、新規血清型を有するストレプトコッカス ミュータンス株を特異的に検出することに優れたオリゴヌクレオチドを提供することができる。
【００３０】
即ち、本発明のポリペプチドは、ストレプトコッカス ミュータンス特異的な多糖抗原のグルコース側鎖量を低下させることを特徴としている。
【００３１】
好ましくは、本発明のポリペプチドは、上記ポリヌクレオチドまたはそのフラグメントによってコードされることを特徴としている。
【００３２】
さらに好ましくは、本発明のポリペプチドは、配列番号１ないし４の何れか１つに示される塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされることを特徴としている。
【００３３】
上記構成によれば、ストレプトコッカス ミュータンスの血清型ｃ、ｅまたはｆの株以外の新規血清型を有するストレプトコッカス ミュータンス株に特異的に存在するポリペプチドを提供することができる。
【００３４】
即ち、本発明のストレプトコッカス ミュータンス株は、ストレプトコッカス ミュータンス特異的な多糖抗原のグルコース側鎖量が低下していることを特徴とする。
【００３５】
好ましくは、本発明のストレプトコッカス ミュータンス株は、ストレプトコッカス ミュータンスの血清型特異多糖抗原のグルコース側鎖の量が低下した新規血清型であることを特徴としている。
【００３６】
１つの局面において、本発明のストレプトコッカス ミュータンス株は、上記ポリヌクレオチドを有することが好ましい
他の局面において、本発明のストレプトコッカス ミュータンス株は、上記ポリペプチドを発現することが好ましい。
【００３７】
上記構成によれば、既知の血清型を有するストレプトコッカス ミュータンスに関する新たな知見を加えるとともに、既知の血清型を有するストレプトコッカス ミュータンスだけでは解明できなかった疾患の治療および／または予防に有用であるストレプトコッカス ミュータンス株を提供することができる。
【００３８】
即ち、本発明の抗体は、上記の課題を解決するために、ストレプトコッカス ミュータンスの血清型ｃ、ｅまたはｆの株に特異的な多糖抗原のグルコース側鎖の量が低下したストレプトコッカス ミュータンス株の多糖抗原に特異的に結合することを特徴としている。
【００３９】
即ち、本発明の抗体は、ストレプトコッカス ミュータンスの血清型特異多糖抗原のグルコース側鎖の量が低下したストレプトコッカス ミュータンス株に特異的な多糖抗原に結合することを特徴としている。
【００４０】
好ましくは、本発明の抗体は、上記ストレプトコッカス ミュータンス株の血清型特異多糖抗原と特異的に結合することを特徴とする。
【００４１】
上記構成によれば、ストレプトコッカス ミュータンスの血清型特異多糖抗原のグルコース側鎖の量が低下したストレプトコッカス ミュータンス株、すなわち、新規血清型を有するストレプトコッカス ミュータンス株を検出するために有用な抗体を提供することができる。
【００４２】
即ち、本発明の被験体サンプル中のストレプトコッカス ミュータンス株を検出する方法は、上記オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてＰＣＲ反応を行なう工程を包含することを特徴とする。
【００４３】
好ましくは、本発明の被験体サンプル中のストレプトコッカス ミュータンス株を検出する方法は、被験体サンプルより細菌を分離する工程、および、上記分離した細菌のゲノムＤＮＡまたは総ＲＮＡを抽出する工程をさらに包含することを特徴とする。
【００４４】
本発明の被験体サンプル中のストレプトコッカス ミュータンス株を検出する方法において、上記組織サンプルは血液、唾液または歯垢より得られることが好ましい。
【００４５】
本発明の被験体サンプル中のストレプトコッカス ミュータンス株を検出する方法において、上記プライマーは、配列番号８に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号９または１０に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであることが好ましい。
【００４６】
即ち、上記構成によれば、新規血清型を有するストレプトコッカス ミュータンス株の血清型特異多糖抗原の生合成に重要な酵素をコードする遺伝子の存在を検出して当該新規血清型株の存在を知ることができる。
【００４７】
即ち、本発明の被験体サンプル中のストレプトコッカス ミュータンス株を検出する方法は、上記の課題を解決するために、上記オリゴヌクレオチドをプローブとして用いてハイブリダイゼーション反応を行なう工程を包含することを特徴とする。
【００４８】
好ましくは、本発明の被験体サンプル中のストレプトコッカス ミュータンス株を検出する方法は、被験体サンプルより細菌を分離する工程、および、上記分離した細菌のゲノムＤＮＡまたは総ＲＮＡを抽出する工程をさらに包含することを特徴とする。
【００４９】
本発明の被験体サンプル中のストレプトコッカス ミュータンス株を検出する方法において、上記組織サンプルは、血液、唾液または歯垢より得られることが好ましい。
【００５０】
本発明の被験体サンプル中のストレプトコッカス ミュータンス株を検出する方法において、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号８ないし１０の何れかに示される塩基配列からなることが好ましい。
【００５１】
本発明の被験体サンプル中のストレプトコッカス ミュータンス株を検出する方法において、上記細菌を分離する工程が上記抗体を用いることが好ましい。
【００５２】
即ち、本発明のハイブリダイゼーション反応によってストレプトコッカス ミュータンスの血清型を判定する方法は、上記の課題を解決するために、上記ハイブリダイゼーション反応に使用されるプローブとして、ストレプトコッカス ミュータンスの血清型特異多糖抗原のグルコース側鎖の量が低下したストレプトコッカス ミュータンス株に特異的な塩基配列あるいは当該塩基配列の相補配列を含むオリゴヌクレオチドが用いられるとともに、上記特異的な塩基配列が、配列番号１ないし４の何れか１つに示される塩基配列の少なくとも１２個連続する塩基配列であることを特徴としている。
【００５３】
好ましくは、本発明のハイブリダイゼーション反応によってストレプトコッカス ミュータンスの血清型を判定する方法は、さらに、上記ハイブリダイゼーション反応に使用されるプローブとして、ストレプトコッカス ミュータンスの血清型ｃ、ｅまたはｆの株に特異的な塩基配列の少なくとも１２個連続する塩基配列あるいは当該塩基配列の相補配列を含むオリゴヌクレオチドが用いられることを特徴としている。
【００５４】
好ましくは、本発明のハイブリダイゼーション反応によってストレプトコッカス ミュータンスの血清型を判定する方法は、さらに、被験体の組織サンプルから染色体ＤＮＡまたは総ＲＮＡを得ることを特徴としている。
【００５５】
好ましくは、本発明のハイブリダイゼーション反応によってストレプトコッカス ミュータンスの血清型を判定する方法は、さらに、上記組織サンプルが血液、唾液または歯垢より得られることを特徴としている。
【００５６】
好ましくは、本発明の本発明のハイブリダイゼーション反応によってストレプトコッカス ミュータンスの血清型を判定する方法は、さらに、唾液または歯垢より菌を分離する工程を包含することを特徴としている。
【００５７】
上記構成によれば、ストレプトコッカス ミュータンスの血清型ｃ、ｅまたはｆの株に特異的な多糖類のグルコース側鎖の量が低下したストレプトコッカス ミュータンス株を特異的に検出することに優れたストレプトコッカス ミュータンスの血清型を判定する方法を提供することができる。
【００５８】
即ち、上記構成によれば、新規血清型を有するストレプトコッカス ミュータンス株の血清型特異多糖抗原の生合成に重要な酵素を検出して当該新規血清型株の存在を知ることができる。
【００５９】
即ち、本発明のストレプトコッカス ミュータンスの血清型特異多糖抗原のグルコース側鎖の量が低下したストレプトコッカス ミュータンス株を検出する方法は、上記の課題を解決するために、上記の抗体を用いて免疫反応を行う工程を包含することを特徴としている。
【００６０】
好ましくは、本発明の被験体サンプル中のストレプトコッカス ミュータンス株を検出する方法は、
被験体サンプルより細菌を分離する工程；
上記分離した細菌と請求の範囲第９項に記載の抗体をインキュベートする工程；
および
上記抗体と結合した細菌を検出する工程、
を包含することを特徴とする。
【００６１】
上記構成によれば、新規血清型を有するストレプトコッカス ミュータンスの有用な検出方法を提供することができる。
【００６２】
即ち、本発明の被験体中のストレプトコッカス ミュータンス株の血清型を判定する方法は、上記ストレプトコッカス ミュータンス株を検出する方法を用いることを特徴とする。
【００６３】
即ち、本発明のＰＣＲ反応によってＳ．ｍｕｔａｎｓの血清型を判定する方法は、上記の課題を解決するために、上記ＰＣＲ反応に使用されるプライマーとして、Ｓ．ｍｕｔａｎｓの血清型特異多糖抗原のグルコース側鎖の量が低下したＳ．ｍｕｔａｎｓ株に特異的な塩基配列あるいは当該塩基配列の相補配列を含むオリゴヌクレオチドが用いられるとともに、上記特異的な塩基配列が、配列番号１ないし４の何れか１つに示される塩基配列の少なくとも１２個連続する塩基配列であることを特徴としている。
【００６４】
好ましくは、本発明のＰＣＲ反応によってストレプトコッカス ミュータンスの血清型を判定する方法は、さらに、上記ＰＣＲ反応に使用されるプライマーとして、ストレプトコッカス ミュータンスの血清型ｃ、ｅまたはｆの株に特異的な塩基配列の少なくとも１２個連続する塩基配列あるいは当該塩基配列の相補配列を含むオリゴヌクレオチドが用いられることを特徴としている。
【００６５】
好ましくは、本発明のＰＣＲ反応によってストレプトコッカス ミュータンスの血清型を判定する方法は、さらに、被験体の組織サンプルから染色体ＤＮＡまたは総ＲＮＡを得ることを特徴としている。
【００６６】
好ましくは、本発明のＰＣＲ反応によってストレプトコッカス ミュータンスの血清型を判定する方法は、さらに、上記組織サンプルが血液、唾液または歯垢より得られることを特徴としている。
【００６７】
好ましくは、本発明のＰＣＲ反応によってストレプトコッカス ミュータンスの血清型を判定する方法は、さらに、唾液または歯垢より菌を分離する工程を包含することを特徴としている。
【００６８】
上記構成によれば、ストレプトコッカス ミュータンスの血清型特異多糖抗原のグルコース側鎖の量が低下したストレプトコッカス ミュータンス株を特異的に検出することに優れたストレプトコッカス ミュータンスの血清型を判定する方法を提供することができる。
【００６９】
即ち、本発明のストレプトコッカス ミュータンスの血清型を判定する方法は、上記の課題を解決するために、ストレプトコッカス ミュータンスの血清型特異多糖抗原のグルコース側鎖の量が低下したストレプトコッカス ミュータンス株に特異的に結合する抗体を用いることを特徴としている。
【００７０】
好ましくは、本発明のストレプトコッカス ミュータンスの血清型を判定する方法は、さらに、ストレプトコッカス ミュータンスの血清型特異多糖抗原のグルコース側鎖の量が低下したストレプトコッカス ミュータンス株に特異的に結合する抗体を用いることを特徴としている。
【００７１】
上記構成によれば、ストレプトコッカス ミュータンスの血清型特異多糖抗原のグルコース側鎖の量が低下したストレプトコッカス ミュータンス株を特異的に検出することに優れたストレプトコッカス ミュータンスの血清型を判定する方法を提供することができる。
【００７２】
即ち、本発明のストレプトコッカス ミュータンス株のスクリーニング方法は、上記のストレプトコッカス ミュータンス株を検出する方法を用いることを特徴とする。
【００７３】
即ち、本発明のストレプトコッカス ミュータンスの血清型特異多糖抗原のグルコース側鎖の量が低下したストレプトコッカス ミュータンス株をスクリーニングする方法は、上記のポリヌクレオチドまたはそのフラグメントを用いることを特徴としている。
【００７４】
好ましくは、本発明のストレプトコッカス ミュータンスの血清型特異多糖抗原のグルコース側鎖の量が低下したストレプトコッカス ミュータンス株をスクリーニングする方法は、上記のポリヌクレオチドまたはそのフラグメントがＰＣＲ反応に用いられることを特徴としている。
【００７５】
好ましくは、本発明のストレプトコッカス ミュータンスの血清型特異多糖抗原のグルコース側鎖の量が低下したストレプトコッカス ミュータンス株をスクリーニングする方法は、上記のポリヌクレオチドまたはそのフラグメントがハイブリダイゼーション反応に用いられることを特徴としている。
【００７６】
好ましくは、本発明のストレプトコッカス ミュータンスの血清型特異多糖抗原のグルコース側鎖の量が低下したストレプトコッカス ミュータンス株をスクリーニングする方法は、上記の抗体を用いることを特徴としている。
【００７７】
上記構成によれば、ストレプトコッカス ミュータンスの血清型特異多糖抗原のグルコース側鎖の量が低下したストレプトコッカス ミュータンス株のスクリーニングに優れた方法を提供することができる。
【００７８】
即ち、本発明のストレプトコッカス ミュータンス株は、上記のスクリーニング方法によって取得されることを特徴とする。
【００７９】
即ち、本発明のストレプトコッカス ミュータンスの血清型特異多糖抗原のグルコース側鎖の量が低下したストレプトコッカス ミュータンス株は、上記のスクリーニング方法によって分離されることを特徴としている。
【００８０】
上記構成によれば、新たにスクリーニングされたストレプトコッカス ミュータンスの血清型特異多糖抗原のグルコース側鎖の量が低下したストレプトコッカス ミュータンス株を提供することができる。
【００８１】
即ち、本発明のストレプトコッカス ミュータンスの血清型特異多糖抗原のグルコース側鎖の量が低下したストレプトコッカス ミュータンス株は、上記の課題を解決するために、上記のスクリーニング方法によってスクリーニングされることを特徴としている。
【００８２】
上記構成によれば、新規血清型を有するストレプトコッカス ミュータンス株をさらに提供することができる。
【００８３】
即ち、本発明のストレプトコッカス ミュータンス株を検出するためのキットは、上記のオリゴヌクレオチドを備えることを特徴とする。
【００８４】
本発明のストレプトコッカス ミュータンス株を検出するためのキットにおいて、上記オリゴヌクレオチドは配列番号９に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであることが好ましい。
【００８５】
本発明のストレプトコッカス ミュータンス株を検出するためのキットにおいて、配列番号８に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをさらに備えることが好ましい。
【００８６】
本発明のストレプトコッカス ミュータンス株を検出するためのキットにおいて、配列番号１０に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをさらに備えることが好ましい。
【００８７】
本発明のストレプトコッカス ミュータンス株を検出するためのキットは、ＰＣＲ反応またはハイブリダイゼーション反応に用いることが好ましい。
【００８８】
即ち、本発明のストレプトコッカス ミュータンスの血清型を判定するためのキットは、上記の課題を解決するために、ストレプトコッカス ミュータンスの血清型特異多糖抗原のグルコース側鎖の量が低下したストレプトコッカス ミュータンス株に特異的である塩基配列あるいは当該塩基配列の相補配列を含むオリゴヌクレオチドを備えるとともに、上記特異的な塩基配列が、配列番号１ないし４の何れか１つに示される塩基配列の少なくとも１２個連続する塩基配列であることを特徴としている。
【００８９】
好ましくは、本発明のストレプトコッカス ミュータンスの血清型を判定するためのキットは、さらに、ストレプトコッカス ミュータンスの血清型ｃ、ｅまたはｆの株に特異的な塩基配列の少なくとも１２個連続する塩基配列またはその相補配列を含むオリゴヌクレオチドを備えることを特徴としている。
【００９０】
好ましくは、本発明のストレプトコッカス ミュータンスの血清型を判定するためのキットは、さらに、被験体の組織サンプルから染色体ＤＮＡまたは総ＲＮＡを得るための試薬を含むことを特徴としている。
【００９１】
好ましくは、本発明のストレプトコッカス ミュータンスの血清型を判定するためのキットは、さらに、上記組織サンプルが血液、唾液または歯垢より得られることを特徴としている。
【００９２】
好ましくは、本発明のストレプトコッカス ミュータンスの血清型を判定するためのキットは、さらに、唾液または歯垢より菌を分離するための試薬を含むことを特徴としている。
【００９３】
好ましくは、本発明のストレプトコッカス ミュータンスの血清型を判定するためのキットは、さらに、ＰＣＲ反応に用いるための試薬を含むことを特徴としている。
【００９４】
好ましくは、本発明のストレプトコッカス ミュータンスの血清型を判定するためのキットは、さらに、ハイブリダイゼーション反応に用いるための試薬を含むことを特徴としている。
【００９５】
好ましくは、本発明のストレプトコッカス ミュータンスの血清型を判定するためのキットは、さらに、上記オリゴヌクレオチドが標識されていることを特徴としている。
【００９６】
上記構成によれば、ストレプトコッカス ミュータンスの血清型特異多糖抗原のグルコース側鎖の量が低下したストレプトコッカス ミュータンス株を特異的に検出することに優れたストレプトコッカス ミュータンスの血清型を判定するためのキットを提供することができる。
【００９７】
即ち、上記構成によれば、新規血清型を有するストレプトコッカス ミュータンス株に特異的な多糖抗原の生合成に重要な酵素をコードする遺伝子の存在を検出して当該新規血清型株の存在を知ることができる。
【００９８】
即ち、本発明のストレプトコッカス ミュータンスの血清型を判定するためのキットは、上記の課題を解決するために、ストレプトコッカス ミュータンスの血清型特異多糖抗原のグルコース側鎖の量が低下したストレプトコッカス ミュータンス株に特異的に結合する抗体を備えることを特徴としている。
【００９９】
好ましくは、本発明のストレプトコッカス ミュータンスの血清型を判定するためのキットは、新規血清型を有するストレプトコッカス ミュータンス株に特異的に結合する上記抗体を備えることを特徴とする。
【０１００】
上記構成によれば、新規血清型を有するストレプトコッカス ミュータンス株の検出に有用なキットを提供することができる。
【０１０１】
好ましくは、本発明のストレプトコッカス ミュータンスの血清型を判定するためのキットは、さらに、ストレプトコッカス ミュータンスの血清型特異多糖抗原のグルコース側鎖の量が低下したストレプトコッカス ミュータンス株の多糖抗原に特異的に結合する抗体を備えることを特徴としている。
【０１０２】
上記構成によれば、ストレプトコッカス ミュータンスの血清型特異多糖抗原のグルコース側鎖の量が低下したストレプトコッカス ミュータンス株、すなわち、新規血清型を有するストレプトコッカス ミュータンス株を特異的に検出することに優れたストレプトコッカス ミュータンスの血清型を判定するためのキットを提供することができる。
【０１０３】
即ち、本発明の抗体の製造方法は、上記の課題を解決するために、従来の免疫方法を改良していることを特徴としている。
【０１０４】
１つの局面において、本発明の抗体の製造方法は、リン酸緩衝化生理食塩水に懸濁した上記ストレプトコッカス ミュータンス株を５日間連続でウサギ耳介静脈に注射する工程を包含することが好ましい。
【０１０５】
本発明の抗体の製造方法は、１週間間隔をあけた後、さらなる２週間において１週間に５日間ずつリン酸緩衝化生理食塩水に懸濁した上記ストレプトコッカス ミュータンス株を反復注射する工程をさらに包含することが好ましい。
【０１０６】
上記方法によれば、ストレプトコッカス ミュータンスの血清型特異多糖抗原のグルコース側鎖の量が低下したストレプトコッカス ミュータンス株、すなわち、新規血清型を有するストレプトコッカス ミュータンス株に特異的に結合する抗体の製造方法を提供することができる。
【０１０７】
上記構成によれば、従来の免疫方法では取得し得なかった新規血清型を有するストレプトコッカス ミュータンス表層抗原に対する抗体を提供することができる。
【０１０８】
即ち、本発明の細菌検出器具は、新規血清型を有するストレプトコッカス ミュータンス株に特異的な塩基配列またはその相補配列を含むオリゴヌクレオチドが基板上に固定化されていることを特徴としている。
【０１０９】
好ましくは、本発明の細菌検出器具において、上記塩基配列は、新規血清型を有するストレプトコッカス ミュータンス株に特異的な多糖抗原の生合成に重要な酵素をコードするポリヌクレオチドの塩基配列の少なくとも１２個連続する塩基配列であることを特徴としている。
【０１１０】
上記構成によれば、サンプル中に含まれる新規血清型を有するストレプトコッカス ミュータンス株を検出・同定することができる。
【０１１１】
さらに上記構成によれば、サンプル中に含まれるストレプトコッカス ミュータンス株の網羅的な検査を行なうことができる。
【０１１２】
本発明のさらに他の目的、特徴、および優れた点は、以下に示す記載によって十分わかるであろう。また、本発明の利益は、添付図面を参照した次の説明で明白になるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１１３】
【図１】Ａ〜Ｅは、Ｓ．ｍｕｔａｎｓのＴＷ２９５株に特異的な抗血清およびＴＷ８７１株に特異的な抗血清と、ＴＷ２９５株、ＴＷ８７１株、ｃ型株、ｅ型株およびｆ型株から調製したランツ−ランドール（ＲＲ）抗原との反応を示す図である。
【図２】Ａ〜Ｃは、Ｓ．ｍｕｔａｎｓにおけるＰＡ、ＣＡ−ＧＴＦおよびＣＦ−ＧＴＦの発現のウエスタンブロットの結果を示す図である。
【図３】Ａ・Ｂは、Ｓ．ｍｕｔａｎｓの口腔分離株および血液分離株の食作用率を示す図である。
【図４】Ｓ．ｍｕｔａｎｓの血清型ｃ型とｋ型とにおけるｒｇｐＦ遺伝子前半部の塩基配列を比較することにより、変異の存在を示す図である。
【図５】Ｓ．ｍｕｔａｎｓの血清型ｃ型とｋ型とにおけるｒｇｐＦ遺伝子前半部の塩基配列を比較する図であり、図４の続きを示す。
【図６】Ｓ．ｍｕｔａｎｓの血清型ｃ型とｋ型とにおけるｒｇｐＦ遺伝子前半部の塩基配列を比較する図であり、図５の続きを示す。
【図７】Ｓ．ｍｕｔａｎｓの血清型ｃ型とｋ型とにおけるｒｇｐＦ遺伝子前半部の塩基配列を比較する図であり、図６の続きを示す。
【図８】Ｓ．ｍｕｔａｎｓの血清型ｃ型とｋ型とにおけるｒｇｐＦ遺伝子前半部の塩基配列を比較する図であり、図７の続きを示す。
【図９】Ｓ．ｍｕｔａｎｓの血清型ｃ型とｋ型とにおけるｒｇｐＦ遺伝子前半部の塩基配列を比較する図であり、図８の続きを示す。
【図１０】Ｓ．ｍｕｔａｎｓの血清型ｃ型とｋ型とにおけるｒｇｐＦ遺伝子前半部の塩基配列を比較する図であり、図９の続きを示す。
【図１１】Ｓ．ｍｕｔａｎｓの血清型ｃ型とｋ型とにおけるｒｇｐＦ遺伝子前半部の塩基配列を比較する図であり、図１０の続きを示す。
【図１２】Ｓ．ｍｕｔａｎｓの血清型ｃ型とｋ型とにおけるｒｇｐＦ遺伝子前半部の塩基配列を比較する図であり、図１１の続きを示す。
【図１３】Ｓ．ｍｕｔａｎｓの血清型ｃ型とｋ型とにおけるｒｇｐＦ遺伝子前半部の塩基配列を比較する図であり、図１２の続きを示す。
【図１４】Ｓ．ｍｕｔａｎｓの血清型ｃ型とｋ型との塩基配列を整列させて、ｒｇｐＦ遺伝子前半部の塩基配列を比較した図である。
【図１５】至適なＰＣＲ条件を示す図である。
【図１６】ＭＴ８１４８株（ｃ型）、ＴＷ２９５株（ｋ型）およびＦＴ１株（ｋ型）から抽出したゲノムＤＮＡを希釈しそれをテンプレートにして血清型に特異的なプライマーを用いてＰＣＲ増幅して検出感度を求めた結果を示す図である。
【図１７】Ａ・Ｂは、種々の血清型のＳ．ｍｕｔａｎｓ株および種々の連鎖球菌から抽出したゲノムＤＮＡをテンプレートにして血清型特異的プライマーを用いてＰＣＲ増幅した結果を示す図である。
【図１８】Ａ・Ｂは、唾液サンプルから抽出したゲノムＤＮＡをテンプレートにして血清型特異的プライマーを用いてＰＣＲ増幅した結果を示す図である。
【図１９】Ａ・Ｂは、Ｓ．ｍｕｔａｎｓにおけるＣＡ−ＧＴＦ発現およびＣＦ−ＧＴＦ発現のウエスタンイムノブロット検出を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１１４】
本発明の実施の一形態について以下に詳細に説明するが、本発明は以下の記載に限定されるものではない。
【０１１５】
（１）血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株
Ｓ．ｍｕｔａｎｓは、感染性心内膜炎を発症する患者の血液より時折単離されるが、その侵入機構および生存機構は、解明の余地を残す。菌血症または感染性心内膜炎を発症する患者より得た４つの血液分離株のうち２つ（ＴＷ２９５株およびＴＷ８７１株）は、免疫沈降試験によると血清学的に不定であった。
【０１１６】
これらの血清型不定株に対する抗血清を用いる免疫拡散分析は、１００人の被験体より得た１００株の口腔分離株のうち２つが陽性反応を示した。５０人の被験体より得た２５００株の口腔分離株に対するさらなる免疫拡散分析において、単一の患者より得た５０個の分離株全てが抗ｃ型抗血清、抗ｅ型抗血清、および抗ｆ型抗血清と反応しないが、抗ＴＷ２９５抗血清および抗ＴＷ８７１抗血清と反応した。これらの株は、対照株であるＳ．ｍｕｔａｎｓ株ＭＴ８１４８と同様の生物学的特性（例えば、高レベルのショ糖依存的吸着および菌体疎水性、ならびにグルコシルトランスフェラーゼおよびタンパク質抗原（ＰＡ）の発現）を示した。本発明者らは、この生物を血清型ｋと名付けた。
【０１１７】
本発明者らは、ヒト血液サンプルおよび口腔サンプルより血清型ｋの新たなＳ．ｍｕｔａｎｓ株を分離し、そして特徴付けた。血清型ｋ株の血清学的特徴は、ＭＴ８１４８のｇｌｕＡ不活化変異株（ＭＴ８１４８ＧＤ）の特徴と同様であることを見出した。
【０１１８】
血清型ｋの口腔分離株は、血液分離株およびＭＴ８１４８ＧＤと同様に食作用に抵抗性を示した。これらの結果は、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ血清型ｋ株がヒトロ腔内に存在するだけでなく、食作用に対する低い感受性に起因して血液中で生存し得るということを示す。
【０１１９】
ＭＴ８１４８ＧＤは、ガラス表面に対するショ糖依存的付着、唾液で被覆したヒドロキシアパタイトに対するショ糖非依存的付着、デキストラン結合活性、および菌体結合型（ｃｅｌｌ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）グルコシルトランスフェラーゼ（ＧＴＦ）活性などの生物学的特性に関して、その親株であるＭＴ８１４８株よりも有意に低い。
【０１２０】
さらに、ウエスタンブロット分析は、血清型ｋにおけるＧＴＦＢ／ＧＴＦＣの発現率比がＭＴ８１４８より減少したことを示したが、ラットに対するう蝕誘発能は、ＭＴ８１４８、ＭＴ８１４８ＧＤおよび血清型ｋの口腔分離株の間で同程度であった。
【０１２１】
これらの結果は、Ｓ．ｍｕｔａｎｓの血清型特異的多糖におけるグルコース側鎖の欠失がう蝕誘発能と関連し得るが、その他の主要な表層タンパク質（例えば、ＧＴＦ、ＰＡｃ等）よりもその程度が低いということを示す。
【０１２２】
本発明において、従来の免疫方法に改良を加えることによって、血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株に対する抗血清が取得された。Ｓ．ｍｕｔａｎｓ株の血清型特異多糖抗原の生合成に関わる遺伝子群の配列を特定して血清型ｋと既知株とを比較した結果、血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株に共通して存在するｒｇｐＦ遺伝子の配列において変異が同定された。
【０１２３】
（Ａ）ポリヌクレオチド
本発明は、ストレプトコッカス ミュータンス特異的な多糖抗原のグルコース側鎖量を低下させるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。本明細書中において使用される場合、「ストレプトコッカス ミュータンス特異的な多糖抗原のグルコース側鎖量を低下させるポリペプチド」は、「血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株に特異的な多糖抗原の生合成に関与するポリペプチド」または「血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株の血清型特異多糖抗原の生合成に関与するポリペプチド」と置換可能に使用される。一実施形態において、本発明は、配列番号１ないし４の何れか１つに示される塩基配列を有するポリヌクレオチドまたはそのフラグメントを提供する。本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は「核酸」または「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。本明細書中で使用される場合、用語「塩基配列」は、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」と交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、ＣおよびＴと省略される）の配列として示される。また、「配列番号１ないし４の何れか１つに示される塩基配列を含むポリヌクレオチドまたはそのフラグメント」とは、配列番号１ないし４の各デオキシヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃおよび／またはＴによって示される配列を含むポリヌクレオチドまたはその断片部分が意図される。
【０１２４】
本発明に係るポリヌクレオチドは、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態、またはＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）で存在し得る。ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であり得る。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、コード鎖（センス鎖としても知られる）であり得るか、またはそれは、非コード鎖（アンチセンス鎖としても知られる）であり得る。
【０１２５】
本明細書中で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、ヌクレオチドが数個ないし数十個結合したものが意図され、「ポリヌクレオチド」と交換可能に使用される。オリゴヌクレオチドは、短いものはジヌクレオチド（二量体）、トリヌクレオチド（三量体）といわれ、長いものは３０マーまたは１００マーというように重合しているヌクレオチドの数で表される。オリゴヌクレオチドは、より長いポリヌクレオチドのフラグメントとして生成されても、化学合成されてもよい。
【０１２６】
本発明のポリヌクレオチドのフラグメントは、少なくとも１２ｎｔ（ヌクレオチド）、好ましくは約１５ｎｔ、そしてより好ましくは少なくとも約２０ｎｔ、なおより好ましくは少なくとも約３０ｎｔ、そしてさらにより好ましくは少なくとも約４０ｎｔの長さのフラグメントが意図される。例えば、「配列番号１ないし４の何れか１つに示されるヌクレオチド配列の少なくとも２０ｎｔの長さのフラグメント」によって、配列番号１ないし４の何れか１つに示されるヌクレオチド配列からの２０以上の連続した塩基を含むフラグメントが意図される。本明細書を参照すれば配列番号１ないし４の何れか１つに示されるヌクレオチド配列が提供されるので、当業者は，このようなＤＮＡフラグメントを容易に作製することができる。例えば、制限エンドヌクレアーゼ切断または超音波による剪断は、種々のサイズのフラグメントを作製するために容易に使用され得る。あるいは、このようなフラグメントは、合成的に作製され得る。適切なフラグメント（オリゴヌクレオチド）が、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（ＡＢＩ，８５０ Ｌｉｎｃｏｌｎ Ｃｅｎｔｅｒ Ｄｒ．，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ ９４４０４）３９２型シンセサイザーなどによって合成される。
【０１２７】
本発明は、血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株に特異的な多糖抗原の生合成に関与するポリペプチドをコードするか否かに関係なく、配列番号１ないし４の何れか１つに示される塩基配列の少なくとも１２個連続する配列またはその相補配列からなるポリヌクレオチドに関する。特定のポリヌクレオチドが血清型ｋの血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株に特異的な多糖抗原の生合成に関与するポリペプチドをコードしない場合でさえ、当業者は、上記ポリヌクレオチドが、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のプライマー、またはハイブリダイゼーションプローブとして使用され得ることを容易に理解する。本発明のポリヌクレオチドは、血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株に特異的な多糖抗原の生合成に関与するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを特異的にＰＣＲ増幅できるので、本発明のポリヌクレオチドは、血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株に特異的な多糖抗原の生合成に関与するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするハイブリダイゼーションプローブとしてもまた利用可能である。血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株に特異的な多糖抗原の生合成に関与するポリペプチドをコードしない本発明のポリヌクレオチドの他の用途としては、Ｖｅｒｍａら、Ｈｕｍａｎ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）に記載の、正確な染色体位置を提供するための分裂中期染色体展開物に対するインサイチュハイブリダイゼーション（例えば、ＦＩＳＨ）；および、特定の組織における血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株に特異的な多糖抗原の生合成に関与するポリペプチドに関するｍＲＮＡ発現を検出するためのノーザンブロット分析が挙げられる。
【０１２８】
例えば、「長さが少なくとも２０ｎｔ」のポリヌクレオチドの部分によって、参照のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列からの２０以上の隣接したヌクレオチドが意図される。好ましい実施形態において、本発明のこのような部分は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による標的配列の増幅のためのプライマーとして、または従来のＤＮＡハイブリダイゼーション技術に従ったプローブとしてのいずれかで診断的に有用である。
【０１２９】
別の局面において、本発明は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、上記の本発明のポリヌクレオチド（例えば、配列番号１ないし４の何れか１つに示される塩基配列からなるポリヌクレオチド）またはその一部にハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む、単離したポリヌクレオチドを提供する。用語「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、ハイブリダイゼーション溶液（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む）中にて４２℃で一晩インキュベーションした後、約６５℃にて０．１×ＳＳＣ中でフィルターを洗浄することが意図される。ポリヌクレオチドの「一部」にハイブリダイズするポリヌクレオチドによって、参照のポリヌクレオチドの少なくとも約１５ヌクレオチド（ｎｔ）、そしてより好ましくは少なくとも約２０ｎｔ、さらにより好ましくは少なくとも約３０ｎｔ、そしてさらにより好ましくは約３０〜７０ｎｔにハイブリダイズするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）が意図される。これらは、本明細書中においてより詳細に考察されるような診断用プライマーおよび診断用プローブとして有用である。
【０１３０】
血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株の血清型特異多糖抗原の生合成に関与するポリペプチドをコードする本発明のポリヌクレオチドとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：それ自体によって、成熟ポリペプチドのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；成熟したポリペプチドのコード配列およびさらなる配列（例えば、リーダー配列をコードする配列）（例えば、プレタンパク質配列またはプロタンパク質配列またはプレプロタンパク質配列）；イントロン、非コード５’配列および非コード３’配列（例えば、転写、ｍＲＮＡプロセシング（スプライシングおよびポリアデニル化シグナルを含む）において役割を担う転写非翻訳配列）；さらなる機能性を提供するようなさらなるアミノ酸をコードするさらなるコード配列。従って、例えば、ポリペプチドをコードする配列は、マーカー配列（例えば、融合されたポリペプチドの精製を容易にするペプチドをコードする配列）に融合され得る。本発明のこの局面の特定の好ましい実施態様において、マーカーアミノ酸配列は、ヘキサ−ヒスチジンペプチド（例えば、ｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）において提供されるタグ）であり、他の中では、それらの多くは公的および／または商業的に入手可能である。例えば、Ｇｅｎｔｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８２１−８２４（１９８９）において記載されるように、ヘキサヒスチジンは、融合タンパク質の簡便な精製を提供する。「ＨＡ」タグは、インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質由来のエピトープに対応する精製のために有用な別のペプチドであり、それは、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ３７：７６７（１９８４）によって記載されている。他のそのような融合タンパク質は、Ｎ末端またはＣ末端にてＦｃに融合される血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株に特異的な多糖抗原の生合成に関与するポリペプチドまたはそのフラグメントを含む。
【０１３１】
血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株の血清型特異多糖抗原の生合成に関与するポリペプチドまたはそのフラグメントをコードする本発明に係るポリヌクレオチドは、宿主細胞における増殖のための選択マーカーを含有するベクターに結合され得る。一般的に、プラスミドベクターは、リン酸カルシウム沈殿物のような沈殿物中か、または荷電された脂質との複合体中で導入される。また、下記で詳述するように、ＤＥＡＥデキストラン法やエレクトロポレーション法を用いてもよい。ベクターがウイルスである場合、ベクターは、適切なパッケージング細胞株を用いてインビトロでパッケージングされ得、次いで宿主細胞に形質導入され得る。
【０１３２】
本発明はさらに、血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株の血清型特異多糖抗原の生合成に関与するポリペプチドをコードする本発明のポリヌクレオチドの変異体に関する。変異体は、天然の対立遺伝子変異体のように、天然に生じ得る。「対立遺伝子変異体」によって、生物の染色体上の所定の遺伝子座を占める遺伝子のいくつかの交換可能な形態の１つが意図される。天然に存在しない変異体は、例えば当該分野で公知の変異誘発技術を用いて生成され得る。
【０１３３】
そのような変異体は、本発明のポリヌクレオチドにおいて１または数個のヌクレオチド置換、欠失、または付加によって生成される変異体を含む。置換、欠失、または付加は、１つ以上のヌクレオチドを含み得る。変異体は、コードもしくは非コード領域、またはその両方において変化され得る。コード領域における変異は、保存的もしくは非保存的なアミノ酸置換、欠失、または付加を生成し得る。
【０１３４】
このように、本発明に係るポリヌクレオチドは、少なくとも、配列番号１ないし４の何れか１つに示される塩基配列を含むかまたはその変異体であればよいといえる。また、本発明に係るポリヌクレオチドの塩基配列は、適切なリンカーペプチドをコードするポリヌクレオチドで連結されていてもよい。
【０１３５】
つまり、本発明の目的は、血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株に特異的な多糖抗原の生合成に関与するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび当該ポリヌクレオチドを検出するために使用するポリヌクレオチド（オリゴヌクレオチド）を提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載したポリヌクレオチド作製方法等に存するのではない。したがって、上記各方法以外によって取得される血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株に特異的な多糖抗原の生合成に関与するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび当該ポリヌクレオチドを検出するために使用するポリヌクレオチド（オリゴヌクレオチド）も本発明の範囲に属することに留意しなければならない。
【０１３６】
（Ｂ）ポリペプチド
本発明者らは、新規血清型（ｋ型）のＳ．ｍｕｔａｎｓ株を見出し、この血清型を規定する多糖抗原の生合成に関与する酵素の１つであるｒｇｐＦにおいて変異が存在することを見出した。
【０１３７】
本明細書中で使用される場合、用語「ポリペプチド」は、「ペプチド」または「タンパク質」と交換可能に使用される。また、ポリペプチドの「フラグメント」は、当該ポリペプチドの部分断片が意図される。本発明に係るポリペプチドはまた、天然供給源より単離されても、化学合成されてもよい。
【０１３８】
用語「単離された」ポリペプチドまたはタンパク質は、その天然の環境から取り出されたポリペプチドまたはタンパク質が意図される。例えば、宿主細胞中で発現された組換え産生されたポリペプチドおよびタンパク質は、任意の適切な技術によって実質的に精製されている天然または組換えのポリペプチドおよびタンパク質と同様に、単離されていると考えられる。
【０１３９】
本発明に係るポリペプチドは、天然の精製産物、化学合成手順の産物、および原核生物宿主または真核生物宿主（例えば、細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含む）から組換え技術によって産生された産物を含む。組換え産生手順において用いられる宿主に依存して、本発明に係るポリペプチドは、グリコシル化され得るか、または非グリコシル化され得る。さらに、本発明に係るポリペプチドはまた、いくつかの場合、宿主媒介プロセスの結果として、開始の改変メチオニン残基を含み得る。
【０１４０】
１つの局面において、本発明は、ｋ型Ｓ．ｍｕｔａｎｓ株のｒｇｐＦポリペプチドを提供する。本明細書中で使用される場合、「ｋ型Ｓ．ｍｕｔａｎｓ株のｒｇｐＦポリペプチド」は、新規血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株の多糖抗原の生合成に関与する酵素であるｒｇｐＦポリペプチドが意図される。
【０１４１】
１つの実施形態において、本発明は、配列番号１ないし４の何れか１つに示される塩基配列によってコードされるポリペプチドを提供する。本発明の好ましいポリペプチドとしては、成熟ポリペプチド、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞内ドメイン、または膜貫通ドメインの全てまたは一部を欠失した細胞外および細胞内ドメインを含むポリペプチドが挙げられる。
【０１４２】
本発明は、さらに、実質的なｋ型Ｓ．ｍｕｔａｎｓ株のｒｇｐＦポリペプチド活性を示すｋ型Ｓ．ｍｕｔａｎｓ株のｒｇｐＦポリペプチドの変異体を提供する。１つの実施形態において、本発明は、配列番号１ないし４の何れか１つに示される塩基配列によってコードされるポリペプチドにおいて１または数個のアミノ酸が置換、付加または欠失した、ｋ型Ｓ．ｍｕｔａｎｓ株のｒｇｐＦポリペプチド活性を示すポリペプチド変異体を提供する。
【０１４３】
本明細書中で使用される場合、用語「ｋ型Ｓ．ｍｕｔａｎｓ株のｒｇｐＦポリペプチド活性」は、公知の血清型のＳ．ｍｕｔａｎｓ株には存在しない多糖抗原、すなわち、ｋ型Ｓ．ｍｕｔａｎｓ株に特異的な多糖抗原の生合成に関与するｒｇｐＦポリペプチドの特徴が意図される。
【０１４４】
このような変異体は、欠失、挿入、逆転、反復、およびタイプ置換（例えば、親水性の残基の別の残基への置換（通常は強く親水性の残基を強く疎水性の残基には置換しない））を含む。「中性」アミノ酸置換は、一般的にほとんど活性に影響しない。
【０１４５】
ポリペプチドのアミノ酸配列中のいくつかのアミノ酸が、このポリペプチドの構造または機能に有意に影響することなく容易に改変され得ることは、当該分野において周知である。さらに、人為的に改変させるだけではく、天然のタンパク質において、当該タンパク質の構造または機能を有意に変化させない変異体が存在することもまた周知である。
【０１４６】
当業者は、周知技術を使用してポリペプチドのアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸を容易に変異させることができる。例えば、公知の点変異導入法に従えば、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の塩基を変異させることができる。また、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の部位に対応するプライマーを設計して欠失変異体または付加変異体を作製することができる。さらに、本明細書中に記載される方法を用いれば、作製した変異体が所望の活性を有するか否かを容易に決定し得る。
【０１４７】
好ましい変異体は、保存的もしくは非保存的アミノ酸置換、欠失、または付加を有する。好ましくは、サイレント置換、付加、および欠失であり、特に好ましくは、保存的置換である。これらは、ｋ型Ｓ．ｍｕｔａｎｓ株のｒｇｐＦポリペプチド活性を変化しない。
【０１４８】
代表的に保存的置換と見られるのは、脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅの中での１つのアミノ酸の別のアミノ酸への置換；ヒドロキシル残基ＳｅｒおよびＴｈｒの置換、酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの置換、アミド残基ＡｓｎおよびＧｌｎの間の置換、塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇの置換、ならびに芳香族残基Ｐｈｅ、Ｔｙｒの間の置換である。
【０１４９】
上記に詳細に示されるように、どのアミノ酸の変化が表現型的にサイレントでありそうか（すなわち、機能に対して有意に有害な効果を有しそうにないか）に関するさらなるガイダンスは、Ｂｏｗｉｅ，Ｊ．Ｕ．ら「Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｅｓｓａｇｅ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ」，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１３０６−１３１０（１９９０）（本明細書中に参考として援用される）に見出され得る。
【０１５０】
別の局面において、本発明に係るポリペプチドは、融合タンパク質のような改変された形態で組換え発現され得る。例えば、付加的なアミノ酸、特に荷電性アミノ酸の領域が、宿主細胞内での、精製の間の、または精製に続く操作および保存の間の、安定性および持続性を改善するために、ポリペプチドのＮ末端に付加され得る。
【０１５１】
特定の局面において、本発明に係るｋ型Ｓ．ｍｕｔａｎｓ株のｒｇｐＦポリペプチドは、例えば、融合されたポリペプチドの精製を容易にするペプチドをコードする配列であるタグ標識（タグ配列またはマーカー配列）をＮ末端またはＣ末端へ付加され得る。このような配列は、ポリペプチドの最終調製の前に除去されてもよい。本発明のこの局面の特定の好ましい実施態様において、タグアミノ酸配列は、ヘキサ−ヒスチジンペプチド（例えば、ｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）において提供されるタグ）であり、他の中では、それらの多くは公的および／または商業的に入手可能である。例えば、Ｇｅｎｔｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８２１−８２４（１９８９）（本明細書中に参考として援用される）において記載されるように、ヘキサヒスチジンは、融合タンパク質の簡便な精製を提供する。「ＨＡ」タグは、インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質由来のエピトープに対応する精製のために有用な別のペプチドであり、それは、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ３７：７６７（１９８４）（本明細書中に参考として援用される）によって記載されている。他のそのような融合タンパク質は、ＮまたはＣ末端にてＦｃに融合される本実施形態に係るｋ型Ｓ．ｍｕｔａｎｓ株のｒｇｐＦポリペプチドまたはそのフラグメントを含む。
【０１５２】
本発明に係るｋ型Ｓ．ｍｕｔａｎｓ株のｒｇｐＦポリペプチドは、下記で詳述されるように組換え生成されても、化学合成されてもよい。
【０１５３】
組換え生成は、当該分野において周知の方法を使用して行なうことができ、例えば、以下に詳述されるようなベクターおよび細胞を用いて行なうことができる。
【０１５４】
合成ペプチドは、化学合成の公知の方法を使用して合成され得る。例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎは、４週間未満で調製されそして特徴付けられたＨＡ１ポリペプチドセグメントの単一アミノ酸改変体を示す１０〜２０ｍｇの２４８の異なる１３残基ペプチドのような多数のペプチドの合成のための簡単な方法を記載している。Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｒ．Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：５１３１−５１３５（１９８５）。この「Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ＳＭＰＳ）」プロセスは、さらにＨｏｕｇｈｔｅｎら（１９８６）の米国特許第４，６３１，２１１号に記載される。この手順において、種々のペプチドの固相合成のための個々の樹脂は、別々の溶媒透過性パケットに含まれ、固相法に関連する多くの同一の反復工程の最適な使用を可能にする。完全なマニュアル手順は、５００〜１０００以上の合成が同時に行われるのを可能にする（Ｈｏｕｇｈｔｅｎら、前出、５１３４）。これらの文献は、本明細書中に参考として援用される。
【０１５５】
１つの局面において、本発明は、本明細書中に記載のｋ型Ｓ．ｍｕｔａｎｓ株のｒｇｐＦポリペプチドのエピトープ保有部分のアミノ酸配列を有するポリペプチドに関する。本発明のｋ型Ｓ．ｍｕｔａｎｓ株のｒｇｐＦポリペプチドのエピトープ保有部分のアミノ酸配列を有するポリペプチドは、少なくとも６個、７個、８個、９個、１０個のアミノ酸を有するポリペプチドの部分を含むが、配列番号１ないし４の何れか１つに示される塩基配列によってコードされる本発明のｋ型Ｓ．ｍｕｔａｎｓ株のｒｇｐＦポリペプチドの全アミノ酸配列の長さまでの任意の長さ（全体を含む）のエピトープ保有部分ポリペプチドもまた含まれる。
【０１５６】
本発明のｋ型Ｓ．ｍｕｔａｎｓ株のｒｇｐＦポリペプチドのエピトープ部分は、当該分野で公知の方法により同定される。例えば、Ｇｅｙｓｅｎら（１９８４）は、酵素−結合免疫吸着アッセイにおける反応に十分に純粋な何百というペプチドを同時に固体支持体上に迅速に合成する手順を開示する。合成ペプチドの抗体との相互作用は、次いで、それらを支持体から除去することなく容易に検出される。この様式において、所望のタンパク質の免疫原性エピトープを保有するペプチドは、当業者により容易に同定され得る。例えば、口蹄疫ウイルスのコートタンパク質における免疫学的に重要なエピトープは、タンパク質の２１３のアミノ酸配列全体を覆う全ての２０８の可能なヘキサペプチドの重複セットの合成による７アミノ酸の解明によりＧｅｙｓｅｎらによって位置付けされた。次いで、全ての２０アミノ酸が順にエピトープ内の各位置で置換されたペプチドの完全な置換セットが合成され、そして抗体との反応のための特異性を与える特定のアミノ酸が決定された。従って、本発明のエピトープ保有ペプチドのペプチドアナログは、この方法により日常的に作製され得る。Ｇｅｙｓｅｎ（１９８７）の米国特許第４，７０８，７８１号は、所望のタンパク質の免疫原性エピトープを保有するペプチドを同定するこの方法をさらに記載している。
【０１５７】
「免疫原性エピトープ」は、タンパク質全体が免疫原である場合、抗体応答を誘発するタンパク質の一部として定義される。これらの免疫原性エピトープは、分子上の２、３の焦点に制限されると考えられている。一方では、抗体が結合し得るタンパク質分子の領域は、「抗原性エピトープ」と定義され得る。タンパク質の免疫原性エピトープの数は、一般には、抗原性エピトープの数よりも少ない。例えば、Ｇｅｙｓｅｎ，Ｈ．Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：３９９８−４００２（１９８４）を参照のこと。
【０１５８】
本発明の抗原性エピトープ保有ペプチドは、本発明のポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体を含む抗体を惹起するのに有用である。従って、抗原エピトープ保有ペプチドで免疫化されたドナーからの脾臓細胞の融合により得られるハイブリドーマの大部分は、一般に天然のタンパク質と反応性がある抗体を分泌する。抗原性エピトープ保有ペプチドにより惹起された抗体は、模倣タンパク質を検出するのに有用であり、そして異なるペプチドに対する抗体が、翻訳後プロセシングを受けるタンパク質前駆体の種々の領域の末路を追跡するために使用され得る。免疫沈降アッセイにおいて、短いペプチド（例えば、約９アミノ酸）でさえ、より長いペプチドに結合しそして置換し得ることが示されているので、ペプチドおよび抗ペプチド抗体は、模倣タンパク質についての種々の定性的または定量的アッセイ、例えば、競合的アッセイにおいて使用され得る。例えば、Ｗｉｌｓｏｎ，Ｉ．Ａ．ら、Ｃｅｌｌ ３７：７６７−７７８（１９８４）７７７を参照のこと。本発明の抗ペプチド抗体もまた、模倣タンパク質の精製（例えば、当該分野で周知の方法を使用して、吸着クロマトグラフィーにより）に有用である。
【０１５９】
上記のガイドラインに従って設計された本発明の抗原性エピトープ保有ペプチドは、好ましくは本発明のポリペプチドのアミノ酸配列内に含まれる少なくとも７、より好ましくは少なくとも９、そして最も好ましくは約１５〜約３０アミノ酸の間の配列を含む。しかし、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列の約３０〜約５０アミノ酸または全体までの任意の長さおよび全体を含む、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列のより大部分を含むペプチドまたはポリペプチドもまた、本発明のエピトープ保有ペプチドであると考えられ、そしてまた模倣タンパク質と反応する抗体を誘導するのに有用である。好ましくは、エピトープ保有ペプチドのアミノ酸配列は、水性溶媒中で実質的な溶解性を提供するように選択され（すなわち、その配列は、比較的親水性残基を含み、そして高度な疎水性配列は好ましくは回避される）；そしてプロリン残基を含む配列が特に好ましい。
【０１６０】
本発明のエピトープ保有ペプチドは、本発明のポリヌクレオチドを使用する組換え手段を含むペプチドを作製するための任意の従来の手段によって産生され得る。例えば、短いエピトープ保有アミノ酸配列は、組換え体産生および精製の間、ならびに抗ペプチド抗体を産生するための免疫化の間、キャリアとして作用するより大きなポリペプチドに融合され得る。エピトープ保有ペプチドはまた、化学合成の公知の方法を使用して合成され得る。
【０１６１】
本発明のエピトープ保有ペプチドは、当該分野に周知の方法によって抗体を誘導するために使用される。例えば、Ｃｈｏｗ，Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：９１０−９１４；およびＢｉｔｔｌｅ，Ｆ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２３４７−２３５４（１９８５）を参照のこと。一般には、動物は遊離ペプチドで免疫化され得る；しかし、抗ペプチド抗体力価はペプチドを高分子キャリア（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）または破傷風トキソイド）にカップリングすることにより追加免疫され得る。例えば、システインを含有するペプチドは、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）のようなリンカーを使用してキャリアにカップリングされ得、一方、他のペプチドは、グルタルアルデヒドのようなより一般的な連結剤を使用してキャリアにカップリングされ得る。ウサギ、ラット、およびマウスのような動物は、遊離またはキャリア−カップリングペプチドのいずれかで、例えば、約１００μｇのペプチドまたはキャリアタンパク質およびＦｒｅｕｎｄのアジュバントを含むエマルジョンの腹腔内および／または皮内注射により免疫化される。いくつかの追加免疫注射が、例えば、固体表面に吸着された遊離ペプチドを使用してＥＬＩＳＡアッセイにより検出され得る有用な力価の抗ペプチド抗体を提供するために、例えば、約２週間の間隔で必要とされ得る。免疫化動物からの血清における抗ペプチド抗体の力価は、抗ペプチド抗体の選択により、例えば、当該分野で周知の方法による固体支持体上のペプチドへの吸着および選択された抗体の溶出により増加され得る。
【０１６２】
（Ｃ）ベクターおよび細胞
本発明は、ｋ型Ｓ．ｍｕｔａｎｓ株のｒｇｐＦポリペプチドを生成するために使用されるベクターに関する。本発明に係るベクターは、インビトロ翻訳に用いるベクターであっても組換え発現に用いるベクターであってもよい。
【０１６３】
本発明はまた、本発明に係るｋ型Ｓ．ｍｕｔａｎｓ株のｒｇｐＦポリペプチドを組換え的に生成するための本発明に係るポリヌクレオチドを含む組換え構築物で形質転換された宿主細胞、および組換え技術によるｋ型Ｓ．ｍｕｔａｎｓ株のｒｇｐＦポリペプチドまたはそのフラグメントの産生方法に関する。
【０１６４】
組換え構築物は、感染、形質導入、トランスフェクション、エレクトロポレーション、および形質転換のような周知の技術を用いて宿主細胞に導入され得る。組換え構築物としてのベクターは、例えば、ファージベクター、プラスミドベクター、ウイルスベクター、またはレトロウイルスベクターであり得る。レトロウイルスベクターは、複製可能かまたは複製欠損であり得る。後者の場合、ウイルスの増殖は、一般的に、相補宿主細胞においてのみ生じる。
【０１６５】
発現させる目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、当該分野において周知の方法を用いて取得することができる。公知のタンパク質の部分配列は、所望の部位に対してプライマーを設計してＰＣＲ増幅することによって対応するポリヌクレオチドを取得した後、発現ベクターに挿入して細胞内で容易に得られる。
【０１６６】
目的の挿入ポリヌクレオチドに対するシス作用性制御領域を含有するベクターが好ましい。適切なトランス作用性因子は、宿主によって供給され得るか、相補ベクターによって供給され得るか、または宿主への導入の際にベクター自体によって供給され得る。
【０１６７】
特定の実施態様において、ベクターは、誘導性および／または細胞型特異的であり得る特異的な発現を提供するベクターが好ましい。このようなベクターの中で特に好ましいベクターは、温度および栄養添加物のような操作することが容易である環境因子によって誘導性のベクターである。
【０１６８】
本発明において有用な発現ベクターとしては、染色体ベクター、エピソームベクター、およびウイルス由来ベクター（例えば、細菌プラスミド、バクテリオファージ、酵母エピソーム、酵母染色体エレメント、ウイルス（例えば、バキュロウイルス、パポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、トリポックスウイルス、仮性狂犬病ウイルス、およびレトロウイルス）、ならびにそれらの組合せに由来するベクター（例えば、コスミドおよびファージミド）が挙げられる。
【０１６９】
ＤＮＡ挿入物は、適切なプロモーター（例えば、ファージλＰＬプロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、およびｔａｃプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーターおよび後期プロモーター、ならびにレトロウイルスＬＴＲのプロモーター）に作動可能に連結されるべきである。他の適切なプロモーターは、当業者に公知である。発現構築物は、さらに、転写開始、転写終結のための部位、および、転写領域中に翻訳のためのリボゾーム結合部位を含む。構築物によって発現される成熟転写物のコード部分は、翻訳されるべきポリペプチドの始めに転写開始コドンを含み、そして終わりに適切に位置される終止コドンを含む。
【０１７０】
発現ベクターは、好ましくは少なくとも１つの選択マーカーを含む。このようなマーカーとしては、真核生物細胞培養についてはジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性遺伝子、Ｅ．ｃｏｌｉおよび他の細菌における培養についてはテトラサイクリン耐性遺伝子またはアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。適切な宿主の代表的な例としては、細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ細胞、およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ細胞）；真菌細胞（例えば酵母細胞）；昆虫細胞（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２細胞およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｓｆ９細胞）；動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、およびＢｏｗｅｓ黒色腫細胞）；ならびに植物細胞が挙げられる。上記の宿主細胞のための適切な培養培地および条件は当分野で周知である。
【０１７１】
好ましい実施形態において、本発明に係るベクターは、細菌（特に、Ｅ．ｃｏｌｉ）において本発明に係るｋ型Ｓ．ｍｕｔａｎｓ株のｒｇｐＦポリペプチドを発現し得る。細菌における使用に好ましいベクターの中には、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、およびｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎから入手可能）；ｐＢＳベクター、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔベクター、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能）；ならびにｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能）が含まれる。
【０１７２】
本発明における使用に適した公知の細菌プロモーターの中には、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃＩおよびｌａｃＺプロモーター、Ｔ３プロモーターおよびＴ７プロモーター、ｇｐｔプロモーター、λＰＲプロモーターおよびλＰＬプロモーター、ならびにｔｒｐプロモーターが含まれる。適切な真核生物プロモーターとしては、ＣＭＶ前初期プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、初期ＳＶ４０プロモーターおよび後期ＳＶ４０プロモーター、レトロウイルスＬＴＲのプロモーター（例えば、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のプロモーター）、ならびにメタロチオネインプロモーター（例えば、マウスメタロチオネインＩプロモーター）が挙げられる。
【０１７３】
別の実施形態において、本発明に係るベクターは、高等真核生物細胞において本発明に係るｋ型Ｓ．ｍｕｔａｎｓ株のｒｇｐＦポリペプチドを発現し得る。高等真核生物細胞によるＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増大させ得る。エンハンサーは、所定の宿主細胞型におけるプロモーターの転写活性を増大するように働く、通常約１０〜３００ｂｐのＤＮＡのシス作用性エレメントである。エンハンサーの例としては、ＳＶ４０エンハンサー（これは、複製起点の後期側上の１００〜２７０ｂｐに位置される）、サイトメガロウイルスの初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側上のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。
【０１７４】
好ましい真核生物ベクターとしては、ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、およびｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能）；ならびにｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、およびｐＳＶＬ（Ｐｈｒｍａｃｉａから入手可能）が挙げられる。他の適切なベクターは、当業者に周知である。
【０１７５】
宿主細胞への構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染または他の方法によってもたらされ得る。このような方法は、Ｄａｖｉｓら、Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８６）（本明細書中に参考として援用される）のような多くの標準的研究室マニュアルに記載されている。
【０１７６】
高等真核生物によるＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増大させ得る。エンハンサーは、所定の宿主細胞型におけるプロモーターの転写活性を増大するように働く、通常約１０〜３００ｂｐのＤＮＡのシス作用性エレメントである。エンハンサーの例としては、ＳＶ４０エンハンサー（これは、複製起点の後期側上の１００〜２７０ｂｐに位置される）、サイトメガロウイルスの初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側上のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。
【０１７７】
翻訳されたタンパク質の小胞体の管腔内へか、周辺質空間内へか、または細胞外環境内への分泌のために、適切な分泌シグナルが、発現されるポリペプチド中に組み込まれ得る。シグナルは、ポリペプチドに対して内因性であり得るか、またはそれらは異種シグナルであり得る。
【０１７８】
従って、ポリペプチドは、融合タンパク質のような改変された形態で発現され得、そして分泌シグナルだけでなく、付加的な異種の機能的領域も含み得る。例えば、付加的なアミノ酸、特に荷電性アミノ酸の領域が、宿主細胞内での、精製の間の、または続く操作および保存の間の、安定性および持続性を改善するために、ポリペプチドのＮ末端に付加され得る。また、ペプチド部分が、精製を容易にするためにポリペプチドへ付加され得る。そのような領域は、ポリペプチドの最終調製の前に除去され得る。とりわけ、分泌または排出を生じるため、安定性を改善するため、および精製を容易にするためのペプチド部分のポリペプチドへの付加は、当分野でよく知られており、そして日常的な技術である。好ましい融合タンパク質は、タンパク質の可溶化に有用な免疫グロブリン由来の異種領域を含む。例えば、ＥＰ Ａ ０ ４６４ ５３３（また、カナダ対応出願２０４５８６９）は、別のヒトタンパク質またはその一部とともに免疫グロブリン分子における定常領域の種々の部分を含む融合タンパク質を開示する。多くの場合、融合タンパク質中のＦｃ部分は、治療および診断における使用に十分に有利であり、従って、例えば改善された薬物動態学的特性を生じる（ＥＰ Ａ ０２３２ ２６２）。一方、いくつかの使用について、融合タンパク質が、記載される有利な様式で、発現され、検出され、および精製された後にＦｃ部分が欠失され得ることが望ましい。これは、Ｆｃ部分が、治療および診断における使用の妨害であると判明する場合（例えば、融合タンパク質が免疫のための抗原として使用されるべき場合）である。薬物探索において、例えばｈＩＬ−５のようなヒトタンパク質は、ｈＩＬ−５のアンタゴニストを同定するための高処理能力スクリーニングアッセイの目的でＦｃ部分と融合されている。Ｄ．Ｂｅｎｎｅｔｔら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ Ｖｏｌ．８：５２−５８（１９９５）、およびＫ．Ｊｏｈａｎｓｏｎら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｖｏｌ．２７０，Ｎｏ．１６，９４５９−９４７１頁（１９９５）を参照のこと。
【０１７９】
ｋ型Ｓ．ｍｕｔａｎｓ株のｒｇｐＦポリペプチドは、周知の方法（例えば、硫安沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィー）によって組換え細胞培養物から回収され、そして精製され得る。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）が精製のために用いられる。
【０１８０】
このように、本発明に係るベクターは、少なくとも、本発明に係るポリヌクレオチドを含めばよいといえる。すなわち、発現ベクター以外のベクターも、本発明の技術的範囲に含まれる点に留意すべきである。
【０１８１】
また、本発明に係る細胞は、少なくとも、本発明に係るベクターを含めばよいといえる。すなわち、市販の細胞以外の初代培養細胞も、本発明の技術的範囲に含まれる点に留意すべきである。
【０１８２】
つまり、本発明の目的は、本発明に係るポリヌクレオチドを含有するベクターおよび当該ベクターを含有する細胞を提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載した個々のベクター種および細胞種、ならびにベクター作製方法および細胞導入方法に存するのではない。したがって、上記以外のベクター種および細胞種、ならびにベクター作製方法および細胞導入方法を用いて取得したベクターおよび細胞も本発明の範囲に属することに留意しなければならない。
【０１８３】
（Ｄ）細菌
本発明は、分離された血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株を提供する。好ましくは、本発明の血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株は、以下で詳述されるような血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株に特異的に結合する抗体を用いて、生物学的サンプルより分離される。好ましい血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株としては、血液分離株２株（ＴＷ２９５およびＴＷ８７１）、口腔分離株１５４株（ＦＴ１〜ＦＴ５１、ＳＵ１〜ＳＵ５１、およびＹＫ１〜ＹＫ５０、ならびにＡＴ１およびＹＴ１）が挙げられるがこれらに限定されない。用語「生物学的サンプル」は、個体、体液、細胞株、組織培養物、または血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株タンパク質もしくはそのＤＮＡもしくはｍＲＮＡを含む他の供給源から得られる、任意の生物学的サンプルが意図される。生物学的サンプルとしては、血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株タンパク質を含む体液（例えば、血液、唾液、歯垢、血清、血漿、尿、滑液および髄液）あるいは血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株タンパク質を発現する可能性のある組織供給源が挙げられる。本明細書中で使用される場合、用語「組織サンプル」は、組織供給源より得られた生物学的サンプルが意図される。哺乳動物から組織生検および体液を得るための方法は当該分野で周知である。生物学的サンプルがｍＲＮＡを含む場合、組織生検が好ましい供給源である。本明細書中で使用される場合、用語「サンプル」としては、上記生物学的サンプルおよび上記組織サンプル以外に、上記生物学的サンプルおよび上記組織サンプルより抽出したゲノムＤＮＡサンプルおよび／または総ＲＮＡサンプルも挙げられる。
【０１８４】
１つの局面において、本発明は、Ｓ．ｍｕｔａｎｓの血清型特異多糖抗原のグルコース側鎖の量が低下したＳ．ｍｕｔａｎｓ株を提供する。本明細書中で使用される場合、用語「Ｓ．ｍｕｔａｎｓの血清型ｃ、ｅまたはｆの株に特異的な多糖類のグルコース側鎖の量が低下した」は、Ｓ．ｍｕｔａｎｓの血清型ｃ、ｅまたはｆの株に特異的な既知の抗体を用いて検出することができないことが意図される。従って、本明細書を参照して、この用語は、Ｓ．ｍｕｔａｎｓの血清型ｃ、ｅまたはｆの株に特異的な多糖抗原のグルコース側鎖が全くないことを意味するのではなく、Ｓ．ｍｕｔａｎｓの血清型ｃ、ｅまたはｆの株に特異的な既知の抗体に対する抗原性が著しく低下している状態であるということを意図していることを、当業者は容易に理解する。
【０１８５】
（Ｅ）抗体
本発明は、Ｓ．ｍｕｔａｎｓの血清型ｃ、ｅ、もしくはｆの株に特異的な多糖抗原のグルコース側鎖の量が低下した血清型の株に特異的に結合する抗体を提供する。好ましくは、本発明は、血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株に特異的に結合する抗体を提供する。本明細書中で使用される場合、用語「抗体」は、免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭおよびこれらのＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｃフラグメント）を意味し、例としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単鎖抗体、抗イディオタイプ抗体およびヒト化抗体が挙げられるがこれらに限定されない。本発明の抗体は、従来の免疫方法では取得し得なかったが、免疫方法に創意工夫を重ねることによって取得された。さらに、本発明の抗体は、ｋ型以外の血清型を有する既知のＳ．ｍｕｔａｎｓ株を公知のグルコース側鎖欠失方法を用いて作製した変異株を用いて作製される。さらに、本発明の抗体は、本発明のポリペプチドを抗原に用いて作製される。本発明の抗体は、血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株の検出および／または診断に有用であり得る。
【０１８６】
本明細書中で使用される場合、用語「血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株に対する抗体」は、血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株抗原に特異的に結合し得る完全な分子および抗体フラグメント（例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメント）を含むことを意味する。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントは完全な抗体のＦｃ部分を欠いており、循環によってさらに迅速に除去され、そして完全な抗体の非特異的組織結合をほとんど有し得ない（Ｗａｈｌら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２４：３１６−３２５（１９８３））。従って、これらのフラグメントもまた好ましい。
【０１８７】
あるいは、血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株抗原に結合し得るさらなる抗体が、抗イディオタイプ抗体の使用を通じて二工程手順で産生され得る。このような方法は、抗体それ自体が抗原であるという事実を使用し、従って、二次抗体に結合する抗体を得ることが可能である。この方法に従って、血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株特異的抗体は、動物（好ましくは、マウス）を免疫するために使用される。次いで、このような動物の脾細胞はハイブリドーマ細胞を産生するために使用され、そしてハイブリドーマ細胞は、血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株特異的抗体に結合する能力が血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株抗原によってブロックされ得る抗体を産生するクローンを同定するためにスクリーニングされる。このような抗体は、血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株特異的抗体に対する抗イディオタイプ抗体を含み、そしてさらなる血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株特異的抗体の形成を誘導するために動物を免疫するために使用され得る。
【０１８８】
ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２ならびに本発明の抗体の他のフラグメントは、本明細書中で開示される方法に従って使用され得ることが、明らかである。このようなフラグメントは、代表的には、パパイン（Ｆａｂフラグメントを生じる）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを生じる）のような酵素を使用するタンパク質分解による切断によって産生される。あるいは、血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株結合フラグメントは、組換えＤＮＡ技術の適用または合成化学によって産生され得る。
【０１８９】
ヒトにおける診断のために、インビボでのイメージングを用いて、上昇レベルの血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株を検出する場合、「ヒト化」キメラモノクローナル抗体を使用することが好ましくあり得る。このような抗体は、上記のモノクローナル抗体を生成するハイブリドーマ細胞由来の遺伝構築物を用いて生成され得る。キメラ抗体を生成するための方法は、当該分野で公知である。総説については、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２（１９８５）；Ｏｉら、Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４（１９８６）；Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら、ＥＰ １７１４９６；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、ＥＰ １７３４９４；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、ＷＯ ８６０１５３３；Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、ＷＯ ８７０２６７１；Ｂｏｕｌｉａｎｎｅら、Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６４３（１９８４）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３１４：２６８（１９８５）を参照のこと。
【０１９０】
このように、本発明に係る抗体は、少なくとも、本発明に係るｋ型Ｓ．ｍｕｔａｎｓ株を認識する抗体フラグメント（例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメント）を備えていればよいといえる。すなわち、本発明に係るｋ型Ｓ．ｍｕｔａｎｓ株を認識する抗体フラグメントと、異なる抗体分子のＦｃフラグメントとからなる免疫グロブリンも本発明に含まれることに留意すべきである。
【０１９１】
つまり、本発明の目的は、本発明に係るｋ型Ｓ．ｍｕｔａｎｓ株を認識する抗体を提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載した個々の免疫グロブリンの種類（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧまたはＩｇＭ）、キメラ抗体作製方法、ペプチド抗原作製方法等に存するのではない。したがって、上記各方法以外によって取得される抗体も本発明の範囲に属することに留意しなければならない。
【０１９２】
（２）血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株の検出法および診断法
本発明にかかるＳ．ｍｕｔａｎｓの血清型検出法および診断法は、被験体に存在し得る血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株を検出および診断するものである。
【０１９３】
感染因子、または、代謝産物、核酸、およびタンパク質を含む病気の指標となる分子の検出は、医学的疾患の診断および治療、ならびに研究における基本的な要素である。多くの方法論が現在検出に使用されている。これらの方法論は、一般に、病気を引き起こす因子の成分をコードする遺伝物質のような、核酸に対する診断アッセイ、および病気を引き起こす因子または病気の副産物のいずれかの成分であるタンパク質に対する抗体をベースにした診断アッセイに分けられる。
【０１９４】
本発明は、生物学的サンプルにおいて、特に被験体から得られた組織または他の細胞または体液において、血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株に特異的な多糖抗原の生合成に関与する酵素をコードするポリヌクレオチドを検出することによって、血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株関連障害を診断する方法を提供する。
【０１９５】
（Ａ）核酸に対する検出法および診断法
核酸に対するアッセイは、ポリヌクレオチド（核酸分子）の存在を検出するための放射性標識プローブを用いるノーザンブロットハイブリダイゼーションのような単純な方法から、ハイブリダイゼーション技術による配列の検出に使用され得るところまで非常に少量の特定の核酸配列を増幅するためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の使用までの範囲にわたる。ヌクレオチドプローブは、市販の染料、または酵素、蛍光、化学発光、あるいは放射性の標識を用いて標識され得る。これらのプローブは、ハイブリダイゼーションにより細胞中または組織試料中の遺伝子または関連配列（そこではその遺伝子は通常の成分である）の発現を検出するために、および生物の感染から生じる疾患を有すると疑われるヒトからの血清または組織試料をスクリーニングするために使用され得る。プライマーがまた、逆転写酵素、またはＤＮＡポリメラーゼおよびポリメラーゼ連鎖反応を用いて調製され得、組織または液体中に非常に少量で存在するポリヌクレオチドの検出のために使用され得る。
【０１９６】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、特に、クローニング、遺伝子発現の分析、ＤＮＡ配列決定、遺伝的マッピング、薬物の発見などにおいて適用される、非常に重要な手段である。例えば、Ｉｎｎｉｓら、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ａ ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ（１９９０）；および米国特許第４，６８３，１９５，４，６８３号を参照のこと。
【０１９７】
本発明は、配列番号１ないし４に示される塩基配列の少なくとも１２個連続する塩基配列またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてＰＣＲ反応を行う工程を包含する、血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株を検出する方法を提供する。ＰＣＲ試薬および方法論は、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，７６１ Ｍａｉｎ Ａｖｅ．，Ｎｏｒｗａｌｋ，Ｃｏｎｎ．０６８５０；またはＲｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１１４５ Ａｔｌａｎｔｉｃ Ａｖｅ．，Ｓｕｉｔｅ １００，Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ ９４５０１から入手可能である。好ましいＰＣＲ反応は、２０ｍｌのＰＣＲ反応液（２０ｎｇ／μｌのゲノムＤＮＡを５μｌ、ｄＮＴＰ混合物 ２μｌ、１０×ＰＣＲ緩衝液 ２μｌ、順方向プライマー（２０ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ、逆方向プライマー（２０ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ、ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ ０．１μｌ、ＭｉｌｌｉＱ水 ８．９μｌを含む）を、９４℃で５分間処理した後、９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で３０秒間を３０サイクル行い、次いで７２℃で７分間処理して行うが、これに限られない。本明細書中で使用される場合、用語「少なくとも１２個」は、１２、１３、１４、１５、またはそれ以上の整数をいう。本発明に従うと、被験体から得られたサンプル中に血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株が存在するか否かを、有効かつ効率的に判定し得る。
【０１９８】
伝統的には、ＰＣＲおよびハイブリダイゼーションプロセスは、別の作業として行われている。しかし、ＰＣＲおよびハイブリダイゼーションプロセスを組み合わせることによって得られる利点がいくつかある：（ｉ）単一の試薬添加工程が必要とされるのみであり、これにより、反応チューブを開ける必要なく、この組み合わされた反応を進行させることが可能であり、これにより、サンプルの混同およびサンプルの汚染の機会を減少させる；（ｉｉ）必要とされる試薬がより少量である；（ｉｉｉ）必要とされる試薬添加工程がより少なく、自動化をより容易にする；そして（ｉｖ）ｉｎ ｓｉｔｕの方法の場合、熱循環の間に細胞サンプルの完全性を保護するのに使用されるサンプル封じ込め（ｃｏｎｔａｉｎｍｅｎｔ）アセンブリを分解する必要がない。単一の反応において、ＰＣＲをハイブリダイゼーションプロセスと組み合わせた、１つの存在する方法は、「Ｔａｑｍａｎ」として知られる技術である。例えば、Ｈｏｌｌａｎｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：７２７６−７２８０（１９９１）を参照のこと。
【０１９９】
インサイチュでのＰＣＲは、特定の増幅された核酸が、標的核酸配列を元々含んでいた細胞または下位の細胞構造内に実質的に含まれるように、固定された細胞において実行されるＰＣＲ増幅をいう。細胞は、水性懸濁液中にあっても、または組織サンプルの部分（例えば、組織化学的切片または細胞化学的スメア）であってもよい。本明細書中で使用される場合、用語「組織化学的切片」は、凍結または化学的に固定され、ワックスまたはプラスチック中に包埋されることにより固められ、薄板（代表的には、数ミクロンの厚さ）にスライスされ、そして固体支持体（例えば、顕微鏡スライド）に付着された生物学的組織の固体サンプルをいい、そして用語「細胞化学的スメア」は、化学的に固定されそして顕微鏡スライドに付着された細胞（例えば、血球）の懸濁物をいう。好ましくは、細胞は、プロテイナーゼ消化、界面活性剤または有機溶媒を用いる液体抽出、または透過化（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）法のような他のものによって、ＰＣＲ試薬に対して透過性にされている。
【０２００】
本明細書中で使用する場合、用語「固定された細胞」は、溶媒変化、温度変化、機械的ストレス、または乾燥による破裂に対して細胞構造（特に、膜）を強化するために化学的に処理された生物学的細胞のサンプルをいう。細胞は、懸濁物中に固定されても、または組織サンプルの部分として固定されても、いずれでもよい。細胞固定液は、一般に、細胞構造のタンパク質構成要素を、最も一般的には、タンパク質アミノ基と反応することによって架橋する化学薬品である。好ましい固定液には、緩衝化ホルマリン、９５％エタノール、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、およびグルタルアルデヒドが含まれる。固定された細胞の透過性は、プロテイナーゼ、または界面活性剤、または膜脂質を溶解する有機溶媒での処理により増加され得る。
【０２０１】
本発明は、配列番号１ないし４に示される塩基配列の少なくとも１２個連続する塩基配列またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドをプローブとして用いてハイブリダイゼーション反応を行う工程をさらに包含する血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株を検出する方法を提供する。本発明に従うと、被験体から得られたサンプル中に存在するＳ．ｍｕｔａｎｓ株を、有効かつ効率的に判定し得る。
【０２０２】
本発明のオリゴヌクレオチドは、染色体とのインサイチュハイブリダイゼーションによって遺伝子マッピングするため、および例えばノーザンブロット分析によってヒト組織中の血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株の発現を検出するためのプローブとして有用である。以下に詳細に記載されるように、特定の組織における血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株遺伝子発現の変化を検出することは、特定の疾患および／または障害を提示し得る。
【０２０３】
好ましい実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、標識される。適切な標識としては、例えば、基質との反応による過酸化水素の生成を触媒するオキシダーゼ群由来の酵素が挙げられる。グルコースオキシダーゼは、それが良好な安定性を有し、そしてその基質（グルコース）が容易に入手できるために、特に好ましい。オキシダーゼ標識の活性は、酵素−標識抗体／基質反応によって形成される過酸化水素の濃度を測定することによってアッセイされ得る。酵素に加えて、他の適切な標識として、放射性同位元素（例えば、ヨウ素（１２５Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、イオウ（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１２Ｉｎ）、およびテクネチウム（９９ｍＴｃ））、ならびに蛍光標識（例えば、フルオレセインおよびローダミン）ならびにビオチンが挙げられる。
【０２０４】
（Ｂ）タンパク質に対する検出法および診断法
タンパク質に対するアッセイは、さらに、分子（通常抗体）と、検出されるタンパク質との結合反応、または、酵素の活性化をもたらし、検出可能な色の変化を生じる基質を開裂し得る、酵素と酵素に結合する標的された分子間の反応を含む方法に分けられる。多くの結合アッセイは、染料、酵素または放射性または蛍光標識を含み、検出を増強する。タンパク質に対する抗体は、患者、免疫化動物、または抗原特異的モノクローナル細胞株から得られ得る。これらの抗体アッセイは、サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイ、ウエスタンブロット、放射性イムノアッセイ、および免疫拡散アッセイのようなアッセイを包含する。その他のアッセイは、分子の固定化および検出のためにアビジンおよびビオチンのような分子を用いる。これらの試薬を調製する技術およびそれを使用する方法は、当業者に公知である。
【０２０５】
本発明は、ストレプトコッカス ミュータンスの血清型ｃ、ｅ、もしくはｆの株に特異的な多糖類のグルコース側鎖の量が低下した血清型の株に特異的に結合する抗体を用いて免疫反応を行う工程を包含する血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株を検出する方法を提供する。本明細書中で使用される場合、用語「免疫反応」としては、サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイ、ウエスタンブロット、放射性イムノアッセイ、および免疫拡散アッセイのようなアッセイが挙げられるがこれらに限定されない。本発明に従うと、被験体から得られたサンプル中に血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株が存在するか否かを、有効かつ効率的に判定し得る。
【０２０６】
上記のように、本発明に従うと、血中に侵入した際に、多型核白血球による食作用を受けにくいＳ．ｍｕｔａｎｓ株を保有するか否かを判定し得る。さらに、他の主要な原因菌の同定法と組み合わせることによって、感染性心内膜炎予防の対象者を減少させ、抗生物質の使用量を低下させ、抗生物質の使用による耐性菌出現を抑制することが可能である。
【０２０７】
本発明はさらに、本明細書中に記載される血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株に特異的に結合する抗体を用いる血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株の診断方法を提供する。抗体を使用するアッセイ方法としては、サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイ、ウエスタンイムノブロット、放射性イムノアッセイ、および免疫拡散アッセイのようなアッセイが挙げられる。その他のアッセイは、分子の固定化および検出のためにアビジンおよびビオチンのような分子を用いる。これらの試薬を調製する技術およびそれを使用する方法は、当業者に公知である。
【０２０８】
生物学的サンプル中の血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株タンパク質レベルのアッセイは、任意の当該分野で公知の方法を使用して行われ得る。抗体に基づく技術が、生物学的サンプル中の血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株タンパク質レベルをアッセイするために好ましい。例えば、組織中での血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株タンパク質の発現は、ウェスタンブロットアッセイまたはドットブロットアッセイを含む、伝統的な免疫組織学的方法で研究され得る。これらの場合、特異的認識は一次抗体（ポリクローナルまたはモノクローナル）によって提供されるが、二次検出系は、蛍光、酵素、または他の結合された二次抗体を利用し得る。結果として、病理学試験のための組織切片の免疫組織学的染色が得られる。
【０２０９】
血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株タンパク質レベルを検出するために有用な他の抗体に基づく方法は、イムノアッセイ（例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ））を含む。例えば、血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株特異的モノクローナル抗体は、血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株タンパク質を検出および定量するための、免疫吸着剤としておよび酵素標識プローブとしての両方に使用され得る。サンプル中に存在する血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株タンパク質の量は、直線回帰コンピューターアルゴリズムを使用して、標準的な調製物中に存在する量との比較によって算出され得る。抗原を検出するためのこのようなＥＬＩＳＡは、Ｉａｃｏｂｅｌｌｉら、Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ １１：１９−３０（１９８８）に記載されている。別のＥＬＩＳＡアッセイにおいては、２つの異なる特異的なモノクローナル抗体が、体液中の血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株タンパク質を検出するために使用され得る。このアッセイにおいて、一方の抗体が免疫吸着剤として使用され、そして他方が酵素標識プローブとして使用される。
【０２１０】
適切な酵素標識は、例えば、基質との反応による過酸化水素の生成を触媒するオキシダーゼ群由来のものを含む。グルコースオキシダーゼは、それが良好な安定性を有し、そしてその基質（グルコース）が容易に入手できるために、特に好ましい。オキシダーゼ標識の活性は、酵素−標識抗体／基質反応によって形成される過酸化水素の濃度を測定することによってアッセイされ得る。酵素に加えて、他の適切な標識として、放射性同位元素（例えば、ヨウ素（１２５Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、イオウ（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１２Ｉｎ）、およびテクネチウム（９９ｍＴｃ））、ならびに蛍光標識（例えば、フルオレセインおよびローダミン）ならびにビオチンが挙げられる。
【０２１１】
個体から得られる生物学的サンプル中の血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株レベルをアッセイすることに加えて、血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株はまた、画像解析によってインビボで検出され得る。血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株のインビボでの画像解析のための抗体標識またはマーカーとして、Ｘ線撮影法、ＮＭＲ、またはＥＳＲによって検出可能なものが挙げられる。Ｘ線撮影法については、適切な標識として、検出可能な放射線を放射するが、被検体に対して明らかには有害ではない、バリウムまたはセシウムのような放射性同位元素が挙げられる。ＮＭＲおよびＥＳＲのための適切なマーカーとして、関連のハイブリドーマの栄養分の標識によって抗体中に取り込まれ得る、重水素のような検出可能な特徴的な回転を有するものが挙げられる。
【０２１２】
放射性同位元素（例えば、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ、９９ｍＴｃ）、放射性不透過体（ｒａｄｉｏ−ｏｐａｑｕｅ）基質、または核磁気共鳴によって検出可能な物質のような適切な検出可能な画像解析部分で標識されている、血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株特異的抗体または抗体フラグメントが、障害について試験される哺乳動物中に（例えば、非経口的、皮下、または静脈内）導入される。被検体の大きさおよび使用される画像解析システムによって、診断用の画像を生じるために必要とされる画像解析部分の量が決定されることが、当該分野で理解される。放射性同位元素部分の場合、ヒト被検体については、注射される放射活性の量は、通常約５〜２０ミリキュリーの範囲の９９ｍＴｃである。次いで、標識抗体または抗体フラグメントは、血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株を含む細胞の位置に優先的に蓄積する。インビボでの腫瘍画像解析は、Ｓ．Ｗ．Ｂｕｒｃｈｉｅｌら、「Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ」（Ｔｕｍｅｒ Ｉｍａｇｉｎｇ第１３章：Ｔｈｅ Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，Ｂｕｒｃｈｉｅｌ，Ｓ．Ｗ．およびＲｈｏｄｅｓ，Ｂ．Ａ．編、Ｍａｓｓｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｉｎｃ．（１９８２））に記載されている。
【０２１３】
本発明の血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株特異的抗体にさらに適切な標識は、以下に提供される。適切な酵素標識の例としては、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、スタフィロコッカスヌクレアーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、α−グリセロールリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ、およびアセチルコリンエステラーゼが挙げられる。
【０２１４】
適切な放射性同位体標識の例としては、３Ｈ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３２Ｐ、３５Ｓ、１４Ｃ、５１Ｃｒ、５７Ｔｏ、５８Ｃｏ、５９Ｆｅ、７５Ｓｅ、１５２Ｅｕ、９０Ｙ、６７Ｃｕ、２１７Ｃｉ、２１１Ａｔ、２１２Ｐｂ、４７Ｓｃ、１０９Ｐｄなどが挙げられる。１１１Ｉｎは、インビボでのイメージングが用いられる場合に好ましい同位体である。なぜなら、これは、１２５Ｉまたは１３１Ｉで標識したモノクローナル抗体の肝臓による脱ハロゲン化の問題を回避するからである。さらに、この放射性核種は、イメージングのためにより好ましいγ放出エネルギーを有する（Ｐｅｒｋｉｎｓら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．１０：２９６−３０１（１９８５）；Ｃａｒａｓｑｕｉｌｌｏら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２８：２８１−２８７（１９８７））。例えば、１−（Ｐ−イソチオシアネートベンジル）−ＤＰＴＡを用いてモノクローナル抗体にカップリングした１１１Ｉｎは、非腫瘍性組織（特に肝臓）における取り込みをほとんど示さなかった。それゆえ、腫瘍局在化の特異性を増強する（Ｅｓｔｅｂａｎら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２８：８６１−８７０（１９８７））。
【０２１５】
適切な非放射性同位体標識の例としては、１５７Ｇｄ、５５Ｍｎ、１６２Ｄｙ、５２Ｔｒ、および５６Ｆｅが挙げられる。
【０２１６】
適切な蛍光標識の例としては、１５２Ｅｕ標識、フルオレセイン標識、イソチオシアネート標識、ローダミン標識、フィコエリトリン標識、フィコシアニン標識、アロフィコシアニン標識、ｏ−フタルアルデヒド標識、およびフルオレサミン標識が挙げられる。
【０２１７】
適切な毒素標識の例としては、ジフテリア毒素、リシン、およびコレラ毒素が挙げられる。
【０２１８】
化学発光標識の例としては、ルミナール標識、イソルミナール標識、芳香族アクリジニウムエステル標識、イミダゾール標識、アクリジニウム塩標識、シュウ酸エステル標識、ルシフェリン標識、ルシフェラーゼ標識、およびエクオリン標識が挙げられる。
【０２１９】
核磁気共鳴コントラスト剤の例としては、Ｇｄ、Ｍｎ、およびＦｅのような重金属原子核が挙げられる。
【０２２０】
上記の標識を抗体に結合するための代表的な技術は、Ｋｅｎｎｅｄｙら（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ ７０：１−３１（１９７６））およびＳｃｈｕｒｓら（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ ８１：１−４０（１９７７））により提供される。後者において言及されるカップリング技術は、グルタルアルデヒド方法、過ヨウ素酸方法、ジマレイミド方法、ｍ−マレイミドベンジル−Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミドエステル方法であり、これらの方法は全て本明細書中に参考として援用される。
【０２２１】
（Ｃ）血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株のスクリーニング
本発明は、生物学的サンプルから血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株をスクリーニングする方法を提供する。１つの局面において、本発明は、配列番号１ないし４に示される塩基配列を含みかつＳ．ｍｕｔａｎｓの血清型特異多糖抗原のグルコース側鎖の量が低下した血清型の株に特異的な塩基配列またはその相補配列からなるポリヌクレオチドまたはそのフラグメントを用いて、Ｓ．ｍｕｔａｎｓの血清型特異多糖抗原のグルコース側鎖の量が低下した血清型の株をスクリーニングする方法を提供する。好ましい実施形態において、上記Ｓ．ｍｕｔａｎｓの血清型特異多糖抗原のグルコース側鎖の量が低下した血清型の株は、血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株である。さらに好ましい実施形態において、本発明のスクリーニング方法は、本発明の抗体を用いてＳ．ｍｕｔａｎｓ株の血清型を確認する工程をさらに包含する。
【０２２２】
別の局面において、本発明は、Ｓ．ｍｕｔａｎｓの血清型特異多糖抗原のグルコース側鎖の量が低下した血清型の株に特異的に結合する抗体を用いて、Ｓ．ｍｕｔａｎｓの血清型特異多糖抗原のグルコース側鎖の量が低下した血清型の株をスクリーニングする方法を提供する。好ましい実施形態において、上記Ｓ．ｍｕｔａｎｓの血清型特異多糖抗原のグルコース側鎖の量が低下した血清型の株は、血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株である。さらに好ましい実施形態において、本発明のスクリーニング方法は、本発明のポリヌクレオチドまたはそのフラグメントを用いてＳ．ｍｕｔａｎｓ株の血清型を確認する工程をさらに包含する。
【０２２３】
本発明はさらに、上記のスクリーニング方法を用いて同定された、Ｓ．ｍｕｔａｎｓの血清型特異多糖抗原のグルコース側鎖の量が低下した血清型の株を提供する。好ましい実施形態において、上記Ｓ．ｍｕｔａｎｓの血清型特異多糖抗原のグルコース側鎖の量が低下した血清型の株は、血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株である。さらに好ましい実施形態において、上記血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株は、ＴＷ２９５、ＴＷ８７１、ＦＴ１〜ＦＴ５１、ＳＵ１〜ＳＵ５１、ＹＫ１〜ＹＫ５０、ＦＴ１ＧＤ、ＹＫ１Ｒ、ＡＴ１およびＹＴ１が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２２４】
（３）血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株の検出キットおよび診断キット
本発明にかかるＳ．ｍｕｔａｎｓの血清型判定キットは、判定対象となるＳ．ｍｕｔａｎｓ株が上記ｋ型であるか否かを判定するものである。
【０２２５】
本発明は、配列番号１ないし４に示される塩基配列の少なくとも１２個連続する塩基配列またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドを備える、血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株を検出するためのキットを提供する。好ましくは、本発明のキットは、ｃ型、ｅ型またはｆ型のＳ．ｍｕｔａｎｓ株に特異的に結合するオリゴヌクレオチドをさらに備える。さらに好ましくは、上記オリゴヌクレオチドは標識されている。本発明に従えば、患者が血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株を保有するか否かを簡便に同定し得る。特に、これまで検出限界以下であった症例において血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株を検出し得る。
【０２２６】
１つの局面において、本発明のキットは、上記オリゴヌクレオチドがＰＣＲプライマーである。好ましい実施形態において、本発明のキットは、ＰＣＲ反応に用いるための試薬をさらに含む。
【０２２７】
別の局面において、本発明のキットは、上記オリゴヌクレオチドがハイブリダイゼーションプローブである。好ましい実施形態において、本発明のキットは、ハイブリダイゼーション反応に用いるための試薬をさらに含む。
【０２２８】
一実施形態において、本発明のキットは、配列番号９に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを備えることを特徴とする。本実施形態に係るキットは、配列番号８に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをさらに備えることが好ましく、配列番号１０に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをさらに備えることがなお好ましい。
【０２２９】
本発明はさらに、血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株の多糖抗原に特異的に結合する抗体を備える、血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株を検出するためのキットを提供する。好ましくは、上記オリゴヌクレオチドは標識されている。本発明に従えば、患者が血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株を保有するか否かを簡便に同定し得る。特に、これまで検出限界以下であった症例において血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株を検出し得る。
【０２３０】
（４）血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株の検出器具および診断器具
本発明に係る細菌検出器具は、サンプル中の細菌を検出・同定するための器具であって、対象となる細菌が属する種または属に特異的な塩基配列に基づくオリゴヌクレオチドが基板表面に固定化されており、当該オリゴヌクレオチドとサンプルに由来する核酸とのハイブリダイゼーションによりサンプル中の細菌を検出・同定するものである。血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株の検出に用いる場合、上記オリゴヌクレオチドは、血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株に特異的な多糖抗原の生合成に関与する酵素をコードするポリヌクレオチドの塩基配列の少なくとも１２個連続する塩基配列またはその相補配列を含む。さらに他種の細菌を網羅的に検査する場合は、当該他種の細菌（複数であってもよい）に特異的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドも基板上に固定化することが好ましい。このように、複数種の細菌を含むサンプルを使用するアッセイに供することによって、血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株がどのような細菌種と共存する傾向があるかを知ることができる。
【０２３１】
（Ａ）基板
本発明に係る細菌検出器具に用いる基板の材質としては、オリゴヌクレオチドを安定して固定化することができるものであればよい。例えば、ポリカーボネートやプラスティックなどの合成樹脂、ガラス等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。基板の形態も特に限定されるものではないが、例えば、板状、フィルム状等の基板を好適に用いることができる。
【０２３２】
〔基板表面に固定化されるオリゴヌクレオチド〕
本発明に係る細菌検出器具の基板表面に固定化されるオリゴヌクレオチドは、検出対象細菌が属する種または属に特異的な塩基配列に基づくオリゴヌクレオチドであればよい。当該オリゴヌクレオチドとサンプル由来の核酸との間にハイブリダイゼーションが成立することにより、サンプル中に含まれている目的の種または属に属する細菌を検出することが可能となる。なお、上記検出対象細菌が属する種または属に特異的な塩基配列に基づくオリゴヌクレオチドを、以下適宜「キャプチャーオリゴ」と称する。
【０２３３】
上記特異的な塩基配列は、検出対象細菌のゲノムの塩基配列から属または種特異的な塩基配列を見出せばよいが、検出対象細菌のリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列から見出すことが好ましい。なかでも細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子は属または種特異的な塩基配列を多く有していることが知られており、１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応するＤＮＡ配列中から属または種特異的な塩基配列を見出すことが特に好ましい。リボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬ、ＤＤＢＪ等のデータベース等から入手することができる。
【０２３４】
キャプチャーオリゴは上記属または種特異的な塩基配列に基づいて設計すればよい。したがって、上記属または種特異的な塩基配列そのものであってもよいし、検出対象細菌から調製した核酸と特異的なハイブリダイゼーションが成立する限りにおいて、変異が含まれていてもよい。変異の位置は特に限定されるものではない。
【０２３５】
キャプチャーオリゴの長さ（塩基数）は特に限定されるものではないが、短すぎるとハイブリダイゼーションの検出が困難になり、長すぎると非特異的ハイブリダイゼーションを許容してしまう。発明者らは、キャプチャーオリゴの長さの最適化について検討を重ね、標準的な長さを１２〜５０塩基長とした。好ましくは、１２〜４０塩基長、より好ましくは１２〜３０塩基長、さらにより好ましくは、１３〜２２塩基長であるが、これらに限定されない。塩基長は主として配列特性（特定の塩基の含有率，同一塩基のリピート）に依存するものであり、結合性の良いものは短鎖でも特異的ハイブリダイゼーションが可能であることが、発明者らにより確認されている。
【０２３６】
キャプチャーオリゴが、サンプル由来の核酸とのハイブリダイゼーションを妨害するヘアピン構造、ループ構造、またはそれ以外の立体構造を持つ場合、キャプチャーオリゴを構成する１またはそれ以上のヌクレオチドをイノシンまたはいずれのヌクレオチドとも対合しない核酸に置換することにより、その立体構造を解除することができる。
【０２３７】
キャプチャーオリゴの合成法は特に限定されるものではなく、公知の方法（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）に記載の方法等）により合成すればよい。一般的には、市販のＤＮＡ合成機を用いて化学合成することができる。
【０２３８】
本発明に係る細菌検出器具において、上記検出対象細菌が属する種または属に特異的な塩基配列に基づくオリゴヌクレオチドのみではなく、それらに加えて、いわゆるコントロール・キャプチャーオリゴを基板表面に固定化することが好ましい。コントロール・キャプチャーオリゴには、陽性コントロール・キャプチャーオリゴおよび陰性コントロール・キャプチャーオリゴが含まれる。陽性コントロール・キャプチャーオリゴは、後述するプローブ調製工程において増幅反応がうまくいっているかどうかを判定するために用いるものである。陰性コントロール・キャプチャーオリゴは、非特異的ハイブリダイゼーションが生じていないこと、すなわち擬陽性のハイブリダイゼーションシグナルが生じていないことを確認するために用いるものである。これらの陽性コントロール・キャプチャーオリゴおよび陰性コントロール・キャプチャーオリゴが基板表面に固定化された細菌検出器具も本発明に含まれる。
【０２３９】
陽性コントロール・キャプチャーオリゴは検出対象細菌から調製するプローブに含まれる塩基配列に基づいて設計されるものであればよい。また、複数の検出対象細菌を同時に同一の細菌検出器具を用いて検出する場合には、各検出対象細菌について陽性コントロール・キャプチャーオリゴを設計してもよいが、複数の検出対象細菌から調製するプローブに共通する塩基配列に基づいて設計してもよい。すべての検出対象細菌から調製するプローブに共通する塩基配列がない場合は、いくつかのグループごとに陽性コントロール・キャプチャーオリゴを設計してもよい。あるいは、プライマー配列部分が同じで、対象となる細菌の配列とは異なる人工的な配列を設計し、この配列の一部を陽性コントロール・キャプチャーオリゴとすることもできる。上記人工的な配列を鋳型としてプローブを調製し（本明細書では、このようなプローブをコントロールプローブと称する。）、サンプルから調製したプローブに添加することにより、ハイブリダイゼーションの特異性を検証することが可能となる。なお、上記プローブについては後述する。
【０２４０】
陰性コントロール・キャプチャーオリゴは、陽性コントロール・キャプチャーオリゴの塩基配列において、１塩基以上であり、かつ、当該配列の有する塩基数の２０％未満の範囲内で人為的な塩基の置換を含む塩基配列を有するように設計することが好ましい。塩基置換を行う塩基数は、ハイブリダイゼーションの条件との関係で決定され、検出対象細菌由来のプローブがハイブリダイゼーションを生じないような塩基数を選択すればよい。
【０２４１】
検出対象細菌は特に限定されるものではなく、目的とするサンプル中から検出しようとする細菌を適宜選択すればよい。例えば、食品中に混入し当該食品を汚染する可能性のある細菌を挙げることができる。食品中に有害な細菌が混入することは、公衆衛生上非常に大きな問題となる。上記の食品汚染細菌の存在および／またはその量と比較することによって、本発明の血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株の存在および／またはその量を測定することができる。
【０２４２】
食品を汚染する細菌としては、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ペディオコッカス属（Ｐｅｄｉｏｃｕｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、メガスフェラ属（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ）およびペクチネータス属（Ｐｅｃｔｉｎａｔｕｓ）に属する細菌を挙げることができる。また、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）に属する細菌種としては、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、ラクトバチルス・コリニフォルミス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏｒｙｎｉｆｏｒｍｉｓ）、ラクトバチルス・カルバトス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｕｒｖａｔｕｓ）、ラクトバチルス・デルブリュッキィ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、ラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、ラクトバチルス・リンドネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｎｄｎｅｒｉ）、ラクトバチルス・マレファーメンタンス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｌｅｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・ブヒネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ロイコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）およびザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）に属する細菌、並びにエンテロコッカス・デュランス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｄｕｒａｎｓ）およびラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）を挙げることができる。ただし、検出対象細菌はこれらに限定されるものではない。
【０２４３】
上記例示した細菌を検出・同定するためのキャプチャーオリゴとしては、上記に列挙した細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、各属に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドを挙げることが、これらに限定されるものではない。
【０２４４】
本発明に係る細菌検出器具の基板表面に固定化されるキャプチャーオリゴは、対象とする細菌から調製されたプローブとハイブリダイゼーションが成立するものであれば特に限定されるものではない。
【０２４５】
１つの基板上に固定化するキャプチャーオリゴは、少なくとも１種類以上であればよく、特に上限はない。一般に、試料中に混入した細菌を検出する場合は、サンプル中から検出可能な細菌を１つの基板で網羅的に検出できることが、操作の簡便性および検査の迅速性の観点から好ましいといえる。したがって、本発明に係る細菌検出器具も、１つの基板上に目的の細菌種または属に対応するキャプチャーオリゴを複数固定化した、いわゆるマイクロアレイ型の器具とすることが最も好ましい。
【０２４６】
（Ｂ）オリゴヌクレオチド（キャプチャーオリゴ）の固定化
オリゴヌクレオチドの基板表面への固定化法は特に限定されるものではなく、公知の方法を適宜選択して用いればよい。例えば、物理的吸着、電気的結合または分子共有結合などの一般的なハイブリダイゼーション法に用いられる手法が利用可能である。本発明に係る細菌検出器具においては、表面にカルボジイミド基またはイソシアネート基を有する基材を使用し（米国特許：ＵＳ５，９０８，７４６、特開平８−２３９７５号）、固定化することが好ましい。
【０２４７】
オリゴヌクレオチドをスポッティングする際に、オリゴヌクレオチドのスポット量が少なすぎると、オリゴヌクレオチドとプローブとの間の反応性を十分に確保することができず、判定が困難になることがある。また、高集積度のスポッティングは技術的な問題と同時にコストがかかり、さらにプローブの蛍光標識や化学発色などを用いたハイブリダイゼーションシグナルの検出にもより精密で高額な検出装置（例えば、スキャナー）が必要となる。したがって、オリゴヌクレオチドは、基板の表面に径１０〜１，０００μｍのサイズに固定することが好ましい。オリゴヌクレオチドの基板上へのスポッティング方法は特に限定されるものではない。例えば、スポッティングマシンを使用して基板上にオリゴヌクレオチド溶液をスポッティングすることにより行うことができる。これによりオリゴヌクレオチド溶液は、通常ほぼ円形にスポッティングされる。
【０２４８】
（５）本発明の用途
本発明を用いることによって、患者が感染性心内膜炎の原因菌の１つであるＳ．ｍｕｔａｎｓのうち病原性の高い可能性のある菌株を保有するか否かを簡便に同定し得る。特に、これまで検出限界以下であった症例において原因菌を検出し得る。感染性心内膜炎発症のリスクの高い菌株を保有する個体の限定が可能となり、それにより感染性心内膜炎を予防するために使用される多量の抗生物質を抑制し得、抗生物質の乱用に起因する薬剤耐性菌の出現を抑制し得る。また、原因菌となるＳ．ｍｕｔａｎｓ株と症状との間の相関関係を知ることができるとともに、他の原因菌との関係についてさらなる情報を与えることができる。
【０２４９】
以下、本発明を実施例に基づいてより具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【実施例１】
【０２５０】
（Ａ）Ｓ．ｍｕｔａｎｓ臨床口腔分離株の収集およびＳ．ｍｕｔａｎｓ血清型の同定
１９８２年から１９９０年の間に５７１人の幼児から分離した１３２６個のＳ．ｍｕｔａｎｓ株（分離株のＭＴ４０００シリーズまたはＭＴ１００００シリーズ）を、本発明者らの研究室ストックより選択した。
【０２５１】
さらに、２００２年８月に大阪大学歯学部病院小児歯科（日本国大阪府吹田市）へ訪れた１００人の被験体（３〜１７歳；平均８．９歳）より得た株を、無作為に選択した（ＮＮ２０００シリーズ）。これらの被験体は、８８人の健常な幼児とともに、口唇裂および口蓋裂を有する患者５人、心室中隔欠損を有する患者３人、エナメル質形成不全症を有する患者２人、二分脊椎を有する患者１人、ならびに自閉症の患者１人を含んだ。
【０２５２】
臨床標本の収集を、ヒト被験体に関与する研究のための大阪大学倫理委員会規定に従って行った。プラークサンプルを、滅菌したＰＢＳ中に懸濁し、希釈し、そしてバシトラシン（０．２単位／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）および１５％（ｗ／ｖ）のスクロースを含有するＭＳ寒天培地（Ｄｉｆｃｏ）上に広げた。コロニーの形態に基づいて、各被験体からコロニーを１つ選択して実験に供した。
【０２５３】
Ｍａｓｕｄａ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．，１９８５．Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ ｉｎ ｓｏｍｅ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｆａｍｉｌｉｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｓ．４４：２２３−２３２に記載の方法に従って、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ株のｃ型、ｅ型およびｆ型に対する抗血清を取得し、この抗血清を使用する免疫拡散法によって、上記臨床標本の血清型を決定した。
【０２５４】
ＭＴシリーズ１３２６株の全てが血清学的にｃ、ｅまたはｆとして分類され、血清型が不定である分離株は見出されなかった。一方、ＮＮ２０００シリーズ１００株のうちの７８株、１７株および３株は、それぞれ血清型ｃ、ｅおよびｆとして分類され、残りの２株（ＦＴ１（ＮＮ２０１１）およびＳＵ１（ＮＮ２０２９））は、ｃ型、ｅ型またはｆ型に特異的な抗血清と反応しなかった（表１）。また、血清学的に不定な株（ＦＴ１株またはＳＵ１株）を保有する被験体の各々から、５０コロニーを分離した。
【０２５５】
【表１】
【０２５６】
（Ｂ）Ｓ．ｍｕｔａｎｓ株
上述したＳ．ｍｕｔａｎｓ株のｃ型、ｅ型およびｆ型に対する抗血清を用いて、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ血液分離株ＴＷ２９５、ＴＷ８７１、ＴＷ９６４およびＴＷ１３７８が、それぞれ、血清型不定株、血清型不定株、ｆ型株およびｅ型株であることを同定した。これらのＳ．ｍｕｔａｎｓ株ならびに上述した口腔分離株であるＭＴ８１４８（ｃ型株）、ＭＴ４２４５株（ｅ型株）、およびＭＴ４２５１（ｆ型株）の特徴を、表２に示す。
【０２５７】
【表２】
【０２５８】
（Ｃ）Ｓ．ｍｕｔａｎｓに対する抗血清の作製
Ｓ．ｍｕｔａｎｓ血清型不定株に対する抗血清を取得した。新規血清型のＳ．ｍｕｔａｎｓに対する抗血清は、その抗原性が著しく低下しているために従来の方法では抗血清が得られなかったが、本発明者らは、免疫法を工夫することによってその高血清を得ることに成功した。
【０２５９】
具体的には、Ｓ．ｍｕｔａｎｓのＴＷ２９５株およびＴＷ８７１株の全菌体を、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）に懸濁し、各々の菌体について一日あたり乾燥重量５ｍｇを、５日間連続でウサギ耳介静脈に注射した。１週間間隔をあけた後、さらなる２週間において１週間に５日間ずつ反復注射し、ウサギ耳介静脈より採血し、Ｓ．ｍｕｔａｎｓのＴＷ２９５株に対する抗血清およびＴＷ８７１株に対する抗血清を得た。
【０２６０】
（Ｄ）グルコース側鎖欠失変異株の構築、およびその細菌学的特徴づけおよび血清学的特徴づけ
ＭＴ８１４８のグルコース側鎖欠失（ＧＤ）変異株を、ｇｌｕＡ遺伝子に抗生物質耐性遺伝子の挿入不活化によって構築した。Ｓ．ｍｕｔａｎｓ株Ｘｃ（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＡＢ００１５６２）およびＯｋｌａｈｏｍａ大学より公開されているＳ．ｍｕｔａｎｓゲノムデータベース（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＡＥ０１４１３３）から得たｇｌｕＡ配列に基づいて構築したプライマーとともにＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄポリメラーゼ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ）を用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、ｇｌｕＡ遺伝子およびその隣接領域を増幅した。この増幅したフラグメントを、次いで、ｐＳＴ Ｂｌｕｅ−１ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ）にクローニングして、プラスミドｐＲＮ１０１を作製した。ｐＲＮ１０１のｇｌｕＡのオープンリーディングフレームの中央部を、Ｓｔｕ１によって消化し、次いで、ｐＶＡ８３８より得た８３０ｂｐのエリスロマイシン耐性遺伝子（ｅｒｍ）フラグメントを挿入してプラスミドｐＲＮ１０２を構築した。制限酵素Ｎｏｔ Ｉでの消化によって線状化した後、このプラスミドを、ＴｏｂｉａｎおよびＭａｃｒｉｎａの方法によってＳ．ｍｕｔａｎｓ ＭＴ８１４８株に導入した。この形質転換体を、エリスロマイシン（１０μｇ／ｍｌ）を含有するＭｉｔｉｓ−ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ（ＭＳ）寒天培地（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，Ｍｉｃｈ．）プレート上でスクリーニングした。ｇｌｕＡ遺伝子のＰＣＲ増幅および免疫拡散法によって、変異株ＭＴ８１４８ＧＤの適切な挿入不活化を確認した。
【０２６１】
ＭＴ８１４８ＧＤは、Ｓ．ｍｕｔａｎｓの典型的な生物学的特徴を示した。この特徴としては、ＭＳ寒天培地上での粗いコロニー、糖発酵能陽性、ＰＡおよびＧＴＦの発現、ならびに高レベルのショ糖依存的付着および菌体疎水性が挙げられる。
【０２６２】
（Ｅ）種々のＳ．ｍｕｔａｎｓ株に対する抗血清の反応性
上記の抗体を用いて免疫拡散法（ゲル内沈降反応）を行なうために、ＴＷ２９５株およびＴＷ８７１株、ならびにｃ型、ｅ型およびｆ型のＳ．ｍｕｔａｎｓ株を一晩培養し、１２１℃で１５分加熱した後に遠心分離して、上清として抗原（ランツ−ランドール（ＲＲ）抗原）を得た。
【０２６３】
Ｓ．ｍｕｔａｎｓのＴＷ２９５株に対する抗血清およびＴＷ８７１株に対する抗血清は、Ｓ．ｍｕｔａｎｓのｃ型株、ｅ型株およびｆ型株から調製した抗原と反応しなかったが、Ｓ．ｍｕｔａｎｓのＴＷ２９５株およびＴＷ８７１株から調製した抗原と反応した（図１Ａ〜Ｅ）。これらＳ．ｍｕｔａｎｓのＴＷ２９５株およびＴＷ８７１株の血清型をｋ型と名付けた。
【０２６４】
なお、図１Ａの中央のウェルは、ＴＷ２９５株から得たＲＲ抽出物を含み（ウェル１）、外側のウェルは、ＴＷ２９５株に対する抗血清（ウェル２）およびＴＷ８７１株に対する抗血清（ウェル３）、ならびに血清型ｃに特異的な抗血清（ウェル４）、血清型ｅに特異的な抗血清（ウェル５）および血清型ｆに特異的な抗血清（ウェル６）を含む。また、図１Ｂの中央のウェルは、ＴＷ８７１株に対する抗血清を含み（ウェル７）、の外側のウェルは、ＴＷ２９５株から得たＲＲ抽出物（ウェル８）、ＴＷ８７１株から得たＲＲ抽出物（ウェル９）、ＭＴ４２５１株（ｆ）から得たＲＲ抽出物（ウェル１０）、ＭＴ４２４５株（ｅ）から得たＲＲ抽出物（ウェル１１）およびＭＴ８１４８株（ｃ）から得たＲＲ抽出物（ウェル１２）を含む。また、図１Ｃの中央のウェルは、ＦＴ１株から得たＲＲ抽出物を含み（ウェル１３）、外側のウェルは、ＴＷ８７１株に特異的な抗血清（ウェル１４）、血清型ｃに特異的な抗血清（ウェル１５）、血清型ｅに特異的な抗血清（ウェル１６）および血清型ｆに特異的な抗血清（ウェル１７）を含む。図１Ｄの中央のウェルは、血清型ｃに特異的な抗血清を含み（ウェル１８）、外側のウェルは、ＭＴ８１４８株から得たＲＲ抽出物（ウェル１９）およびＭＴ８１４８ＧＤ株（ｃ）から得たＲＲ抽出物（ウェル２０）を含む。図１Ｅの中央のウェルは、ＴＷ８７１株に対する抗血清を含み（ウェル２１）、図１Ｅの外側のウェルは、ＴＷ２９５株から得たＲＲ抽出物（ウェル２２）、ＴＷ８７１株から得たＲＲ抽出物（ウェル２３）、ＦＴ１株から得たＲＲ抽出物（ウェル２４）、ＳＵ１株から得たＲＲ抽出物（ウェル２５）、ＹＫ１株から得たＲＲ抽出物（ウェル２６）およびＭＴ８１４８ＧＤ株から得たＲＲ抽出物（ウェル２７）を含む。
【０２６５】
ＭＭ８１４８ＧＤのＲＲ抽出物は、ＴＷ８７１に対する抗血清と沈降バンドを形成し（しかし、血清型ｃ特異的抗血清とは沈降バンドを形成しない）、このバンドは、ＴＷ２９５、ＴＷ８７１、ＦＴ１、ＳＵ１およびＹＫ１の沈降バンドと融合した。
【０２６６】
さらに、この抗血清を用いて、１００人の被験体から分離した１００株（ＮＮ２０００シリーズ）のＳ．ｍｕｔａｎｓ中にｋ型株が存在する頻度を調べた。２株のＲＲ抗原は、ｃ型、ｅ型またはｆ型のＳ．ｍｕｔａｎｓ株に対する抗血清とは反応しなかったが、ｋ型のＳ．ｍｕｔａｎｓ株に対する抗血清と反応した。残りの９８株のＲＲ抗原は、ｃ型株、ｅ型株またはｆ型株に特異的な抗血清のいずれかと反応した。よって、ＮＮ２０００シリーズのＳ．ｍｕｔａｎｓ臨床口腔分離株における血清型不定株（ＦＴ１株およびＳＵ１株）はｋ型株であると同定した。
【０２６７】
（Ｆ）血清型不定株Ｓ．ｍｕｔａｎｓの特徴づけ
血清型が不定な臨床分離株のショ糖依存的付着および菌体疎水性を、それぞれ、Ｈａｍａｄａら（１９８１）、およびＲｏｓｅｎｂｅｒｇら（１９８０）、によって記載されるように評価した。菌体結合型（ｃｅｌｌ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）グルコシルトランスフェラーゼ（ＣＡ−ＧＴＦ）または菌体遊離型（ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ）グルコシルトランスフェラーゼ（ＣＦ−ＧＴＦ）および表層タンパク質抗原（ＰＡ）の発現を、ＧＴＦおよびＰＡに特異的な抗体を用いるウエスタンブロット分析を使用して分析した（図２Ａ〜Ｃ）。ゲノムＤＮＡを試験菌体より抽出し、１６Ｓ ｒＲＮＡ配列を決定し、そして対照株ＮＣＴＣ１０４４９（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．Ｘ５８３０３、Ｓ７０３５８）の配列と比較した。
【０２６８】
なお、図２ＡおよびＢでは、全細胞を、７％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、Ｓ．ｍｕｔａｎｓのＰＡ（図２Ａ）またはＣＡ−ＧＴＦ（図２Ｂ）に対するウサギ抗体と反応させた。一方、図２Ｃでは、硫酸アンモニウム沈殿によって濃縮した細胞上清（Ｃ）ＰＶＤＦ膜上に転写したタンパク質を、７％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、ＣＦ−ＧＴＦ（Ｃ）に対するウサギ抗体と反応させた。各レーンについて説明すると、レーン１がＭＴ８１４８株であり、レーン２がＦＴ１株であり、レーン３がＳＵ１株であり、レーン４がＹＫ１株である。ＦＴ１株およびＳＵ１株は、ＰＡおよび３つの型のＧＴＦを発現した。
【０２６９】
ＦＴ１株およびＳＵ１株は、高レベルのショ糖依存的付着および菌体疎水性を示し（データ示さず）、そしてこれらの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列は、ＮＣＴＣ１０４４９株（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．Ｘ５８３０３およびＳ７０５３８）の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列と同一であった。さらに、ＦＴ１株のＲＲ抽出物は、ＴＷ８７１株およびＴＷ２９５株に対する抗血清とともに沈降バンドを形成し、このバンドはまた、ＴＷ８７１のＲＲ抽出物とＴＷ８７１に対する抗血清との沈降バンドと融合した。さらに、ＦＴ１株およびＳＵ１株を有する被験体の各々より得た５０株は、ｃ型、ｅ型またはｆ型に特異的な抗血清と反応性ではなかった。
【０２７０】
また、これら両方の株は、Ｓ．ｍｕｔａｎｓの特徴であるＭＳ寒天培地上での粗いコロニー、バシトラシン耐性、血液寒天上でのγ溶血性、マンニトール、ソルビトール、ラフィノースおよびメリビオースにおける糖発酵能陽性、ならびにデキストラン凝集陰性を示した。
【０２７１】
（Ｇ）さらなる臨床分離株の解析
Ｓ．ｍｕｔａｎｓのさらなる臨床的分離株２５００個を、２００３年初頭に大阪大学歯学部病院の小児歯科へ訪れた別の群の被験体５０人（３〜１９歳；平均７．８歳）より得た。これらの被験体は、４５人の健常な幼児および一般的健康問題または口腔の健康問題（例えば、ダウン症、先天性心障害、口唇裂および口蓋裂、エナメル質形成不全症、ならびに部分的無歯症）を有する患者５人を含んだ。
【０２７２】
表３は、Ｓ．ｍｕｔａｎｓの上記分離株２５００個（そのうち２４５０個はｃ型、ｅ型またはｆ型に分類された）の血清型分布を示す。
【０２７３】
【表３】
【０２７４】
一方で、単一の被験体（ダウン症の少女）より得た他の５０株（ＹＫ１〜ＹＫ５０）のＲＲ抽出物が、ＴＷ８７１に対する抗血清と沈降バンドを形成した。このバンドはまた、ＴＷ２９５、ＴＷ８７１、ＦＴ１およびＳＵ１のＲＲ抽出物の沈降バンドと融合した。表４は、個々の被験体における血清型分布パターンを示し、これらの被験体のほとんどが、Ｓ．ｍｕｔａｎｓの血清型ｃのみを保有し、次いで血清型ｅのみを保有するが、５０人の被験体のうち５人は複数の血清型を保有するということが、見出された。
【０２７５】
【表４】
【０２７６】
（Ｈ）食作用アッセイ
生物を、Ｂｒａｉｎ Ｈｅａｒｔ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ ｂｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ）中にて３７℃で１８時間培養した。この菌体を洗浄した後、細胞濃度を、ＰＢＳで１．０×１０８ＣＦＵ／ｍｌに調整した。ヒト末梢血（５００μｌ）を、健常なボランティアより収集し、そして細菌５００μｌ（５．０×１０７ＣＦＵ）とともに３７℃で１０分間インキュベートした。ギムザ染色（Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）を用いて染色し、光学顕微鏡（倍率、×１００；Ｏｌｙｍｐｕｓ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて、食作用を呈している多型核白血球（ＰＭＮ）の割合を求めた。１００個のＰＭＮ当たり食菌したＰＭＮの平均値（５００個のＰＭＮを試験した）によって、比率を表した。
【０２７７】
さらに、ＭＴ８１４８株、ＭＴ８１４８ＧＤ株、ＦＴ１株、およびＴＷ２９５株における経時的な食作用の比率の変化を、１５分後、３０分後、６０分後、９０分後および１２０分後に観察した。種々の因子について群の間での差異を、要因モデルについての統計学的分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって評価した（図３）。
【０２７８】
図３Ａ・Ｂは、Ｓ．ｍｕｔａｎｓの口腔分離株および血液分離株の食作用率を示す。なお、図３Ａ・Ｂに示す結果は、５回の実験の平均±標準偏差を示す。図３Ａでは、１２株の食作用率を、１０分間のインキュベーション後に試験した。図３Ｂでは、１５分間、３０分間、６０分間、９０分間および１２０分間のインキュベーションにおけるＭＴ８１４８（●）、ＭＴ８１４８ＧＤ（○）、ＦＴ１（▲）およびＴＷ２９５（□）の食作用率の変化を示す。
【０２７９】
ＭＴ８１４８ＧＤ株の食作用率は２２．０±２．４％であり、これは、親株ＭＴ８１４８の食作用率（６８．４±４．１％）より有意に低かった（Ｐ＜０．００１）。さらに、ＮＮ２００１（ｃ）、ＮＮ２００２（ｅ）およびＮＮ２００３（ｆ）の口腔分離株は、ＭＴ８１４８と同等の食作用率を示したが、血清型ｋの口腔分離株であるＦＴ１、ＳＵ１およびＹＫ１はまた、ＭＴ８１４８よりも有意に低い食作用率を示した（Ｐ＜０．００１）。さらに、血液分離株の４つ全ての食作用率は、口腔分離株の食作用の割合よりも有意に低かった（Ｐ＜０．００１）。また、ＭＴ８１４８ＧＤ、ＦＴ１およびＴＷ２９５の食作用率は、不活化６０分間までＭＴ８１４８よりも有意に低く、ＴＷ２９５の食作用率はまた、不活化の９０分間後ＭＴ８１４８よりも有意に低かった（Ｐ＜０．００１）。
【０２８０】
感染性心内膜炎は、病原性細菌の血流中への侵入によって開始されることが知られているが、侵入機構および血液中でのＳ．ｍｕｔａｎｓの生存機構は、未だ明らかになっていない。本実施例において、本発明者らは、血清型特異多糖抗原においてグルコース側鎖を欠失した同系の変異株の食作用率が、親株の食作用率より低いことを見出した。フィッシャーＰＬＳＤ分析によって決定した場合、ＭＴ８１４８（血清型ｃ）と他の株との間に統計学的に有意な差異があった（＊Ｐ＜０．００１）。
【０２８１】
さらに、血清型ｋの口腔分離株および血液分離株は、ＰＭＮによる食作用率が低下した。総じて、これらの知見は、血清型ｋ株（これは、血清型特異多糖抗原においてグルコース側鎖を欠くと考えられている）がおそらく菌血症病原性株であり得ることを示唆する。一方で、血液分離株であるＴＷ９６４（ｅ）およびＴＷ１３７８（ｆ）は、口腔分離株であるＮＮ２００２（ｅ）およびＮＮ２００３（ｆ）より食作用に対して感受性ではない。しかし、本発明者らは、ＴＷ９６４がグルカン結合タンパク質Ａを欠くが、ＴＷ１３７８ではこのような変異は何ら見られなかったということを示した。従って、食作用能に対する効果を有する血清型特異的多糖抗原以外に、菌体表層構造物の変異が存在し得る。
【０２８２】
（Ｉ）考察
血液分離株２株（ＴＷ２９５およびＴＷ８７１）、口腔分離株１５２株（ＦＴ１〜ＦＴ５１、ＳＵ１〜ＳＵ５１、およびＹＫ１〜ＹＫ５０）、および、ｇｌｕＡ不活化株（ＭＴ８１４８ＧＤ）のＲＲ抽出物は、ＴＷ２９５またはＴＷ８７１に対する抗血清と沈降バンドを形成した。一方で、これらの分離株は、Ｓ．ｍｕｔａｎｓに典型的な生物学的特徴（高レベルのショ糖依存的付着および疎水性、ならびにグルコシルトランスフェラーゼが挙げられる）を有することが示された。
【０２８３】
本研究においてＳ．ｍｕｔａｎｓ血清型ｃ、ｅおよびｆが分離される頻度は、デンマークでの研究において報告されたものと非常に類似した。この報告において、ヒト歯垢サンプルより得られた７６個のｍｕｔａｎｓ ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉのうち１つおよびヒトう蝕性病変より得られた７０個のｍｕｔａｎｓ ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉのうち７つは、血清型ａ〜ｇとして血清学的に分類することができなかった。生化学的分析は、これらの血清型不定株がＳ．ｍｕｔａｎｓに属することを示したが、血清型特異的多糖の構造は分布していなかった。別の研究において、ヒトの歯垢サンプル、う蝕性象牙質サンプル、または糞サンプルより採取された１０４７個のＳ．ｍｕｔａｎｓ分離株またはＳ．ｓｏｂｒｉｎｕｓ分離株の全ては、血清型ｃ、ｅ、ｆ、ｄまたはｇとして分類され得た。さらに、日本の別の地域において実施された最近の研究において、歯垢より得られた１４４個のＳ．ｍｕｔａｎｓまたはＳ．ｓｏｒｂｉｎｕｓの全てが、血清型ｃ、ｅ、ｄまたはｇとして分類され、そしてｆ型株または血清型不定株は検出されなかった。一方で、最近日本において、１０３人の被験体のうち９人が、血清学的に不定なＳ．ｍｕｔａｎｓを保有することが報告されたが、血清型特異的多糖の特徴に関する正確な記載はなかった。以上のことは、本発明者らは、最近日本において血清型ｋ型が出現したことを示している。
【０２８４】
本研究において、この新たな血清型を有するＳ．ｍｕｔａｎｓが３人の幼児由来のプラークサンプル中に見出され、１５２株全てが血清型ｋとして分類された。これらの臨床分離株の起源は、未だ同定されていないが、血清型ｋ株は、これら３人の被験体より得られた歯垢サンプル中に見出されたＳ．ｍｕｔａｎｓ株の大部分を占めた。そしてこれらの全てが、高レベルの菌体疎水性およびショ糖依存的付着、ならびに食作用に対する高い抵抗性を示した。これらの知見は、Ｓ．ｍｕｔａｎｓの血清型ｋ株が、ＧＴＦおよびＰＡの発現ならびに高い疎水性およびショ糖依存的付着に起因してヒトの口腔中に存在すること、ならびにより低い食作用能に起因して血液中で生存し得ることが明らかとなった。従って、心障害を有する幼児に対して特別な注意が払われなければならない。特に、口腔中にＳ．ｍｕｔａｎｓ血清型ｋ株を保有するダウン症患者については、心室中隔欠損とともに多型核白血球（ＰＭＮ）の機能障害を合併することもあるため、より危険であり得る。これらの患者において新たな血清型ｋが検出されるということは危険性の増加を示し得るので、歯科処置の前に抗生物質処方のような臨床的アプローチが必要とされ得、そしてこのことは留意されるべきである。
【０２８５】
［実施例２．Ｓ．ｍｕｔａｎｓのｋ型株に特異的な遺伝子配列の検索］
Ｓ．ｍｕｔａｎｓのｋ型株（ＴＷ２９５株、ＴＷ８７１株、ＦＴ１株、ＹＴ１株）からゲノムＤＮＡを抽出し、それぞれの株において、血清型特異的多糖抗原の生合成に関与する酵素をコードする遺伝子配列を特定し、血清型ｃのＭＴ８１４８株において対応する配列と比較した。さらに、Ｓ．ｍｕｔａｎｓのｋ型株のＤＮＡ配列をデータベース上の株（Ｘｃ株：ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＡＢ０１０９７０、ＵＡ１５９株：ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＡＥ０１４１３３）のＤＮＡ配列と比較して、ｋ型株に特異的な遺伝子配列を特定した。ｋ型株においてｒｇｐ遺伝子群中で様々な変異が認められたが、全てのｋ型株に共通して、ｒｇｐＦ遺伝子の前半部において変異が認められた（図４〜図１３）。
【０２８６】
［実施例３．Ｓ．ｍｕｔａｎｓのｋ型株の簡易同定法の確立］
Ｓ．ｍｕｔａｎｓのｃ型株と比較した場合、Ｓ．ｍｕｔａｎｓのｋ型株において、ｒｇｐＦ遺伝子の前半部分３分の１に特異的な遺伝子配列が存在した。その領域を利用して、ｒｇｐＦ遺伝子の開始コドンの上流部において各血清型（ｃ型、ｅ型、ｆ型およびｋ型）の株の間で共通する配列に基づいて順方向プライマーを設計し（ＡＴＴＣＣＣＧＣＣＧＴＴＧＧＡＣＣＡＴＴＣＣ（配列番号８）：ＣＥＦＫ−Ｆ）、ｋ型に特異的な配列に基づく逆方向プライマー（ＣＣＡＡＴＧＴＧＡＴＴＣＡＴＣＣＣＡＴＣＡＣ（配列番号９）：Ｋ−Ｒ）、ならびにｃ型、ｅ型およびｆ型に特異的な配列に基づく逆方向プライマー（ＣＣＧＡＣＡＡＡＧＡＣＣＡＴＴＣＣＡＴＣＴＣ（配列番号１０）：ＣＥＦ−Ｒ）を設計した（表５および図１４）。
【０２８７】
【表５】
【０２８８】
上記のプライマー対を用いてｋ型株のみが特異的にＰＣＲ増幅する系を確立した。具体的には、Ｓ．ｍｕｔａｎｓのｋ型株（ＴＷ２９５株、ＴＷ８７１株、ＦＴ１株、ＹＴ１株）および唾液サンプルからゲノムＤＮＡを抽出し、ＣＥＦＫ−ＦとＣＥＦ−Ｒとのプライマー対、およびＣＥＦＫ−ＦとＫ−Ｒとのプライマー対を用いて、図１５に従ってＰＣＲ反応溶液を、９４℃５分を１サイクル、９４℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃３０秒を３０サイクル、７２℃７分１サイクルの条件でＰＣＲ反応を行った。得られた反応溶液を１．５％アガロースゲルで電気泳動した。その結果を図１６に示す。
【０２８９】
［実施例４：Ｓ．ｍｕｔａｎｓの血清型ｋ以外の株または血清型ｋ株についてのＰＣＲアッセイの感度］
Ｓ．ｍｕｔａｎｓ菌体の滴定培養を用いて、プライマー対ＣＥＦＫ−ＦおよびＣＥＦ−Ｒならびにプライマー対ＣＥＦＫ−ＦおよびＫ−Ｒを用いるＰＣＲ反応の感度を調べた。具体的には、１ｍｌ当たり１０８個のＭＴ８１４８株（ｃ型）、ＴＷ２９５株（ｋ型）およびＦＴ１株（ｋ型）について、プライマー対ＣＥＦＫ−ＦおよびＫ−Ｒを用いてＰＣＲを行った。テンプレートとして、上記菌体より抽出したゲノムＤＮＡを用いた。滅菌水中に希釈した既知の数（５×１０４個、５×１０３個、５×１０２個、５×１０１個、および５個）の菌体を使用することによって、ＰＣＲの検出限界を決定した（図１６）。
【０２９０】
なお、図１６では、１ｍｌ当たり１０８個のＭＴ８１４８株（ｃ型）、ＴＷ２９５株（ｋ型）およびＦＴ１株（ｋ型）の細胞の滴定培養を用いて、ＰＣＲ反応の感度を調べた。以下の数の細胞を添加した：５×１０４（レーン１）、５×１０３（レーン２）、５×１０２（レーン３）、５×１０１（レーン４）、および５（レーン５）。Ｍは、分子サイズマーカー（１００ｂｐ ＤＮＡラダー）を示す。
【０２９１】
Ｓ．ｍｕｔａｎｓのｋ型株（ＴＷ２９５株およびＦＴ１株）において、ｋ型に特異的なプライマーによるＰＣＲ増幅が生じ、ｃ型（ＭＴ８１４８株）において、ｋ型に特異的なプライマーによるＰＣＲ増幅が起こらなかった。
【０２９２】
検出限界は、血清型ｃ／ｅ／ｆ株に特異的なプライマー対において５０〜５００細胞、血清型ｋ株に特異的なプライマー対において５〜５０細胞であり、非常に良好な感度であることがわかった。
【０２９３】
［実施例５：Ｓ．ｍｕｔａｎｓ血清型ｋ株の検出のためのＰＣＲアッセイ］
種々の血清型のＳ．ｍｕｔａｎｓ株およびＳ．ｍｕｔａｎｓ以外の連鎖球菌より抽出したＤＮＡをテンプレートに用いて、プライマー対ＣＥＦＫ−ＦおよびＣＥＦ−Ｒ、プライマー対ＣＥＦＫ−ＦおよびＫ−Ｒを使用するＰＣＲの確からしさを確認した（図１７Ａ・Ｂ）。
【０２９４】
なお、図１７Ａでは、血清型ｃ／ｅ／ｆ株に特異的なプライマー対（ＣＥＦＫ−ＦおよびＣＥＦ−Ｒ）を用いて、血清型ｃ／ｅ／ｆ株の細菌より抽出したゲノムＤＮＡ（レーン１〜４）、血清型ｋ株の細菌より抽出したゲノムＤＮＡ（レーン５〜８）、唾液サンプルより抽出したゲノムＤＮＡ（レーン９〜１４）をテンプレートとして、ＰＣＲ反応を行った。また、図１７Ｂでは、血清型ｋ株に特異的なプライマー対（ＣＥＦＫ−ＦおよびＫ−Ｒ）（Ｂ）を用いて、血清型ｃ／ｅ／ｆ株の細菌より抽出したゲノムＤＮＡ（レーン１〜４）、血清型ｋ株の細菌より抽出したゲノムＤＮＡ（レーン５〜８）、唾液サンプルより抽出したゲノムＤＮＡ（レーン９〜１４）をテンプレートとして、ＰＣＲ反応を行った。
【０２９５】
各レーンについて説明すると、レーン１がＭＴ８１４８（ｃ型）であり、レーン２がＮＮ２００１（ｃ型）であり、レーン３がＮＮ２００２（ｅ型）であり、レーン４がＮＮ２００３（ｆ型）であり、レーン５がＴＷ２９５（ｋ型）であり、レーン６がＴＷ８７１（ｋ型）であり、レーン７がＦＴ１（ｋ型）であり、レーン８がＹＴ１（ｋ型）であり、レーン９がＳｔｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｎｇｕｉｎｉｓ ＡＴＣＣ１０５５６であり、レーン１０がＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｏｒａｌｉｓ ＡＴＣＣ１０５５７であり、レーン１１がＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｄｏｎｉｉ ＡＴＣＣ１０５５８であり、レーン１２がＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓ ＡＴＣＣ９０３であり、レーン１３がＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｌｌｅｒｉ ＮＣＴＣ１０７０３であり、レーン１４がＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ ＨＨＴである。
【０２９６】
プライマー対ＣＥＦＫ−ＦおよびＣＥＦ−Ｒは、血清型ｃ／ｅ／ｆ株を特異的に検出し、プライマー対ＣＥＦＫ−ＦおよびＫ−Ｒは、血清型ｋ株を特異的に検出したが、いずれのプライマー対も、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ以外の連鎖球菌を検出しなかった。このように、プライマー対ＣＥＦＫ−ＦおよびＣＥＦＫ−Ｒ、ならびにプライマー対ＣＥＦＫ−ＦおよびＫ−Ｒを使用すると、それぞれ血清型ｃ／ｅ／ｆ株および血清型ｋ株を特異的に検出し得るだけでなく、Ｓ．ｍｕｔａｎｓのみを特異的に検出し得ることがわかった。
【０２９７】
［実施例６：唾液サンプルを用いるＰＣＲ反応によるＳ．ｍｕｔａｎｓ血清型ｋ株を有する被験体の同定］
吐出した全唾液（約１ｍｌ）を、２００４年１〜２月に大阪大学歯学部小児歯科を訪れた２００人の小児あるいは思春期の患者（２〜１８歳（平均年齢７．９±３．６歳））より収集した。これらの唾液サンプルを、Ｈｏｓｈｉｎｏら（２００４）によって報告された方法をいくらか改変したＰＣＲアッセイに用いた．簡単には、無刺激の全唾液を滅菌チューブ中に収集して氷上に置いた。菌体を、５００μｌの唾液から１６，０００×ｇにて５分間で微量遠心管中に回収し、電子オーブン中にて５００Ｗで５分間処理し、Ｎ−アセチルムラミリダーゼＳＧ（Ｓｅｉｋａｇａｋｕ Ｃｏｒｐ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）中にて５０℃で１時間消化した．次いで、８０μｌの核溶解（ｎｕｃｌｅｉｌｙｓｉｓ）液（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加して、８０℃で５分間インキュベートし、その後６０μｌのタンパク質沈降溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加した。１６，０００×ｇにて３分間の遠心分離によってタンパク質を除去し、フェノール−クロロホルム抽出およびエタノール沈殿によって、ＤＮＡを生成した。抽出したＤＮＡを、５０μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））中に溶解した。このＤＮＡ抽出方法は、歯垢から菌体ゲノムを抽出する際にも用いることができる。
【０２９８】
上記のように得たＤＮＡをテンプレートに用いるＰＣＲによって、プライマー対ＣＥＦＫ−ＦおよびＣＥＦ−Ｒを使用して血清型ｃ／ｅ／ｆ株を（Ａ）、プライマー対ＣＥＦＫ−ＦおよびＫ−Ｒを使用して血清型ｋ株（Ｂ）を検出した（図１８Ａ・Ｂ）。その結果、被験体２００人から得た臨床標本のうち１９０個が、血清型ｋ株に非特異的（血清型ｃ／ｅ／ｆ株に特異的）なプライマー対に対して陽性を示したが（Ａ）、血清型ｋ株に特異的なプライマー対（Ｂ）に対して陰性であった。また、残りの１０個の標本は、血清型ｋ株に特異的なプライマー対（Ｂ）および血清型ｋ株に非特異的（血清型ｃ／ｅ／ｆ株に特異的）なプライマー対（Ａ）に対して陽性を示した。
【０２９９】
なお、図１８Ａでは、プライマー対ＣＥＦＫ−ＦおよびＣＥＦ−Ｒを使用して、血清型ｋ株に非特異的（血清型ｃ／ｅ／ｆ株に特異的）なプライマー対（Ａ）に対して陽性を示したが血清型ｋ株に特異的なプライマー対（Ｂ）に対して陰性であった上記１９０個の標本のうちで代表的な５例を示す。また、図１８Ｂでは、血清型ｋ株の検出のために、プライマー対ＣＥＦＫ−ＦおよびＫ−Ｒを使用した。各レーンについて説明すると、レーン１〜５が血清型ｋ株に特異的なプライマー対に対して陰性であった上記１９０株の標本のうち代表的な５例を示す。レーン６〜８は、血清型ｋ株に特異的なプライマー対に対して陽性であった株を示す。
【０３００】
以上のように、Ｓ．ｍｕｔａｎｓのｋ型株（ＴＷ２９５株、ＴＷ８７１株、ＦＴ１株、ＳＵ１株、ＹＫ１株、ＹＴ１株およびＡＴ１株）、ならびにＳ．ｍｕｔａｎｓ臨床分離株（ＮＮ２０００シリーズ：ｃ型７８株、ｅ型１７株、ｆ型３株）において、ｋ型に特異的なプライマーによるＰＣＲ増幅が生じ、ｃ型、ｅ型またはｆ型に特異的なプライマーによるＰＣＲ増幅は起こらなかった。また、９８個のｃ型、ｅ型またはｆ型のＳ．ｍｕｔａｎｓ株において、ｃ型、ｅ型またはｆ型に特異的なプライマーによるＰＣＲ増幅が起こり、ｋ型に特異的なプライマーによるＰＣＲ増幅が起こらなかった。
【実施例７】
【０３０１】
Ｓ．ｍｕｔａｎｓは、その細胞表面多糖の化学組成に基づいてｃ型、ｅ型およびｆ型の血清型に分類される（Ｌｉｎｚｅｒら、１９８７）。Ｓ．ｍｕｔａｎｓの血清型特異的多糖は、ラムノース骨格およびα連結グルコシド残基またはβ連結グルコシド残基の側鎖を有するラムノース−グルコースポリマーからなることが知られている。本発明者らの以前の研究において、菌血症を発症する患者の血液より得た血清型不定株（ＴＷ２９５）および感染性心内膜炎を発症する患者の血液より得た血清型不定株（ＴＷ８７１）は、血清型特異的多糖においてグルコース側鎖の量が低下することが示された（Ｆｕｊｉｗａｒａら、２００１）。
【０３０２】
実施例１に示すように、ｋ型の血清型を示すＭＴ８１４８ＧＤは、高レベルのショ糖依存的付着を示したが、その付着率は、親株ＭＴ８１４８（ｃ型）の付着率よりも有意に低かった。
【０３０３】
最近、血清型特異的多糖が、ヒト単核球および線維芽細胞に対する連鎖球菌の付着において重要な役割を担うことが実証され、そして最も有効なサイトカイン刺激成分であることが予測された（Ｅｎｇｅｌｓ−Ｄｅｕｔｓｃｈら、２００３）。しかし、血清型特異的多糖とう蝕との間の関係は、解明の余地を残す。
【０３０４】
そこで本発明者らは、新たに解明されたＳ．ｍｕｔａｎｓの血清型ｋ株のう蝕原性における血清型特異的多糖のグルコース側鎖の役割を分析した。
【０３０５】
（Ａ）Ｓ．ｍｕｔａｎｓ株
本実施例において使用したＳ．ｍｕｔａｎｓ株を、表６に示す。ＭＴ８１４８（ｃ）の口腔分離株を、本発明者らの研究室の培養物ストックコレクションより選択した。ＦＴ１株（ｋ）、ＳＵ１株（ｋ）およびＹＫ１株（ｋ）をまた、日本人の幼児の口腔より分離した。さらに、ＹＴ１株を、６歳の健常な少年の口腔より分離し、実施例１に記載する方法に従ってＳ．ｍｕｔａｎｓ血清型ｋであることを確認した。ＭＴ８１４８Ｒ株およびＹＫ１Ｒ株を、漸増濃度のストレプトマイシン（寒天培地１ｍｌ当たり最終濃度１５００μｇまで）中での継代培養を繰り返すことによってストレプトマイシンに対して耐性にした（Ｏｏｓｈｉｍａら、２０００）。ＭＴ８１４８ＧＤ株（ＭＴ８１４８のｇｌｕＡ不活化同系変異株）を、実施例１と同様に構築した。
【０３０６】
【表６】
【０３０７】
（Ｂ）う蝕原性特性のインビトロ分析
Ｓ．ｍｕｔａｎｓのガラスチューブに対するショ糖依存的付着性および唾液被覆ヒドロキシアパタイト（ＳＨＡ）に対するショ糖非依存的付着性を、以前に記載した（Ｏｏｓｈｉｍａら、２００１；Ｎａｋａｎｏら、２００２）ように分析した。菌体疎水性およびデキストラン結合活性をまた、以前に記載した（Ｆｕｊｉｗａｒａら、２００１；Ｎａｋａｎｏら、２００２）ように分析した。
【０３０８】
種々の因子について群の間での差異を、要因モデルについての統計学的分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって評価した（表７）。
【０３０９】
表７は、う蝕原性のインビトロ分析より得た生物学的特性を示す。ＭＴ８１４８ＧＤは、ガラス表面に対するショ糖依存的付着性、ＳＨＡに対するショ糖非依存的吸着率、デキストラン結合能、ＣＡ−ＣＴＦ活性およびＣＦ−ＣＴＦ活性について有意に低い値を示した（Ｐ＜０．００１）。しかし、ＦＴ１とＦＴ１ＧＤとの間ではこれらの特性に関して有意差はなかった。
【０３１０】
【表７】
【０３１１】
（Ｃ）ＧＴＦの発現
発現したタンパク質の量を評価するために、本発明者らの以前の研究において作製した抗菌体結合型（ＣＡ）ＧＴＦ抗血清および抗菌体遊離型（ＣＦ）ＧＴＦ抗血清を用いて、ＧＴＦのイムノブロットを行った。試験生物を、３７℃にてＢｒａｉｎ Ｈｅａｒｔ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ（ＢＨＩ）ブロス（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ，ＵＳＡ）中で、５５０ｎｍでの吸光度１．０まで増殖させた。この菌体および上清（硫酸アンモニウム沈殿によって濃縮した）を、ＳＤＳゲルローディング緩衝液中に溶解した。等量の各タンパク質を、７％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、次いで、ポリビニリデンジフルオリド膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ，ＵＳＡ）上に転写した。この転写したタンパク質バンドを、ＣＡ−ＧＴＦまたはＣＦ−ＧＴＦに対するウサギ抗体と反応させ、次いで、アルカリホスファターゼ複合体化抗ウサギ免疫グロブリンＧ抗体（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ，ＵＳＡ）および５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート−ニトロブルーテトラゾリウム基質（Ｍｏｓｓ Ｉｎｃ．，Ｐａｓａｄｅｎａ，ＭＤ，ＵＳＡ）を使用して可視化した。さらに、各株におけるＧＴＦＢに対する発現強度／ＧＴＦＣに対する発現強度の比を、ＮＩＨ ｉｍａｇｅソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ，ＶＡ，ＵＳＡ）を使用する反応バンドの相対的デンシトメトリー分析によって評価した。
【０３１２】
ＧＴＦＢ、ＧＴＦＣ、およびＧＴＦＤが試験した株の全てにおいて発現することを見出した。しかし、ＧＴＦＢの強度は、ＭＴ８１４８において他のいずれの株においてよりも有意に強かった。ＧＴＦＢ発現強度／ＧＴＦＣ発現強度の比は、１．８０±０．１５であった。この値は、ＭＴ８１４８ＧＤの値（０．８０±０．１１）および血清型ｋのほかの血液分離株および口腔分離株の値（０．１７〜０．８１の範囲の値）より有意に高かった（Ｐ＜０．００１）。対照的に、試験した全ての株の中でＧＴＦＤ発現強度において有意差はなかった。
【０３１３】
（Ｄ）ＣＡ−ＧＴＦ活性およびＣＦ−ＣＴＦ活性の測定
ＣＡ−ＧＴＦ活性およびＣＦ−ＣＴＦ活性を、以前に記載された方法（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏら、２００３）を用いて［１４Ｃ］ショ糖からの［１４Ｃ］グルカン合成によって評価した。ＧＴＦ活性１単位を、１μｍｏｌのグルコース残基が１分間にショ糖からグルカンへ組み込まれるために必要な酵素量として規定した。
【０３１４】
血清型ｋの血液分離株ＴＷ２９５およびＴＷ８７１、ならびに３つの口腔分離株ＳＵ１、ＹＫ１およびＹＴ１の各々は、ＭＴ８１４８より有意に低いショ糖依存的付着率、デキストラン結合能、ＣＡ−ＣＴＦ活性、およびＣＦ−ＣＴＦ活性を示した（Ｐ＜０．００１）。ＳＨＡに対するショ糖非依存的吸着率と同様に、試験した血清型ｋ株（ＳＵ１株およびＹＫ１株を除く）の値は、ＭＴ８１４８の値よりも有意に低かった（Ｐ＜０．００１）。さらに、ＭＴ８１４８と試験した他の株との間では菌体疎水性において有意差はなかった。
【０３１５】
（Ｅ）ラットにおけるう蝕誘発実験
以前に記載された方法（Ｎａｋａｎｏら、２００２）に従って、３６匹の特異的病原体のない（ＳＰＦ）Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｉｎｃ．，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）（１群あたり１２匹）において、う蝕誘発活性を試験した。試験した３株（ＭＴ８１４８Ｒ、ＭＴ８１４８ＲＧＤおよびＹＫ１Ｒ）を、１×１０９ＣＦＵずつ５日間毎日１８〜２２日齢のラットに経口的に感染させた後、各ラットについてプラークおよびう蝕のスコアを、７２日齢の時点で評価した。
【０３１６】
種々の因子について群の間での差異を、要因モデルについての統計学的分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって評価した。
【０３１７】
ラットにおいて、血清型ｋは、明らかなう蝕を誘発した。しかし、ＭＴ８１４８Ｒ株とその変異株ＭＴ８１４８ＲＧＤと口腔分離株ＹＫ１Ｒとの間でう蝕スコアまたはプラーク指数において有意差はなかった（表８）。
【０３１８】
【表８】
【０３１９】
（Ｆ）考察
本実施例において、ｇｌｕＡ遺伝子（グルコース側鎖ドナーにおける直前の前駆体であるＵＤＰ−Ｄ−グルコースの生産を触媒する酵素をコードする）の挿入不活化によって構築したＭＴ８１４８ＧＤの生物学的特性を、親株であるＭＴ８１４８の生物学的特性と比較した。ＵＤＰ−Ｄ−グルコースは、低ｐＨ環境条件におけるＳ．ｍｕｔａｎｓの生存度に重要であることが報告されているので、本発明者らは、ｇｌｕＡ遺伝子自体がう蝕原性に関連する特性の変更を引き起こし得るということを予想した。従って、本発明者らは、ｇｌｕＡ遺伝子を挿入不活化した、血清型ｋ株ＦＴ１のさらなる変異株（ＦＴ１ＧＤ）を構築した。本発明者らの結果は、ＦＴ１とＦＴ１ＧＤとの間で生物学的特性に有意差がなかったことを示した（表７）。このことは、ｇｌｕＡ遺伝子自体の不活化が、このインビトロアッセイで測定した特性に関連しないことを示す。従って、本発明者らは、血清型特異的多糖のグルコース側鎖の存在が、より高いショ糖依存的付着、ショ糖非依存的付着、デキストラン結合能、ならびにＣＡ−ＣＴＦ活性およびＣＦ−ＣＴＦ活性に重要であると結論付けた。
【０３２０】
ＣＡ−ＣＴＦ活性およびＣＦ−ＣＴＦ活性の低減は、血清型ｋの臨床分離株において突出していた（表７）。さらに、血清型ｋの臨床分離株におけるＣＡ−ＣＴＦ活性およびＣＦ−ＣＴＦ活性は、３０個のＳ．ｍｕｔａｎｓ分離株（１６株の血清型ｃ、８株の血清型ｅ、および６株の血清型ｆ）におけるＣＡ−ＣＴＦ活性およびＣＦ−ＣＴＦ活性より有意に低かった。インビトロでの付着能に必要とされる最適なＧＴＦＢ／ＧＴＦＣ／ＧＴＦＤの比率を、本発明者らの以前の研究において決定した（Ｏｏｓｈｉｍａら、２００１）。この比率からの隔たりは、菌体の付着能やプラークバイオフィルムの構造に影響を与える（Ｉｄｏｎｅら、２００３）。本研究におけるウエスタンブロット分析は、ＧＴＦＢの発現が、ＭＹ８１４８より血清型ｋ株においてより低い傾向があることを示した（図１９Ａ・Ｂ）。
【０３２１】
なお、図１９Ａでは、全菌体（Ａ）を、７％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、ＰＶＤＦ膜上に転写したタンパク質バンドを、Ｓ．ｍｕｔａｎｓのＣＡ−ＧＴＦに対するウサギ抗体と反応させた。図１９Ｂでは、硫酸アンモニウム沈殿によって濃縮された培養上清を、７％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、ＰＶＤＦ膜上に転写したタンパク質バンドを、ＣＦ−ＧＴＦに対するウサギ抗体と反応させた。各レーンについて説明すると、レーン１がＭＴ８１４８株であり、レーン２がＭＴ８１４８ＧＤ株であり、レーン３がＴＷ２９５株であり、レーン４がＴＷ８７１株であり、レーン５がＦＴ１株であり、レーン６がＦＴ１ＧＤ株であり、レーン７がＳＵ１株であり、レーン８がＹＫ１株であり、レーン９がＹＴ１株である。
【０３２２】
ＧＴＦＢは、不溶性グルカン合成の大部分を担うと考えられ、ミュータンス連鎖球菌の歯面への付着および歯垢の蓄積において、重要な毒性因子であると考えられている（Ｍａｔｔｏｓ−Ｇｒａｎｅｒら、２０００）。従って、血清型ｋ株のより低いＣＡ−ＣＴＦ活性は、ＧＴＦＢのより低い発現に起因し得る。一方で、菌体表層でのその発現は、血清型特異的多糖のグルコース側鎖の存在と相関し得る。総じて、これらの結果は、Ｓ．ｍｕｔａｎｓの他の主要な表面構造（例えば、ＧＴＦ、ＰＡおよびＧｂｐ）より程度が低いが、Ｓ．ｍｕｔａｎｓの血清型特異的多糖におけるグルコース側鎖の欠失がＳ．ｍｕｔａｎｓのう蝕原性と関連し得ることと結論付けられる。
【０３２３】
尚、発明を実施するための最良の形態の項においてなした具体的な実施態様または実施例は、あくまでも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、そのような具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべきものではなく、本発明の精神と次に記載する特許請求の範囲内で、いろいろと変更して実施することができるものである。
【産業上の利用可能性】
【０３２４】
これまで、感染性心内膜炎の発症に関与するＳ．ｍｕｔａｎｓ株については、他のＳ．ｍｕｔａｎｓ株と判別することは容易ではなかった。しかしながら、本発明では、感染性心内膜炎の感染に関与する可能性の高いＳ．ｍｕｔａｎｓ株を、新規な血清型ｋ型として容易に確認することができるので、本発明は、歯科医療分野等の医療現場だけでなく、医薬品産業や検査産業等に広く利用することができる。
【０３２５】
本発明によって、死に至る可能性がある感染性心内膜炎の発症を予防する観点から重要であると考えられているＳ．ｍｕｔａｎｓの血清型不定株が被験体中に存在するか否かを有効かつ効率的に判定する方法を提供することができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ストレプトコッカス ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ））の新規血清型株、当該新規血清型株に特異的な抗体、当該抗体を作製する方法、当該抗体を用いる当該新規株を検出するための方法およびキット、ならびに、Ｓ．ｍｕｔａｎｓの新規血清型株に特異的な多糖抗原の生合成に関与する酵素をコードするポリヌクレオチド、当該ポリヌクレオチドを用いる当該新規株を検出するための方法およびキットに関する。具体的には、上記抗体と被験体サンプルから抽出した表層多糖抗原とを免疫反応させることによって、または被験体サンプルより抽出したゲノムＤＮＡに対して上記ポリヌクレオチドを用いてハイブリダイゼーションを行うかもしくは上記ポリヌクレオチドを用いてＰＣＲ反応を行うことによって、被験体におけるＳ．ｍｕｔａｎｓの新規血清型株の存在を検出する方法および当該検出方法を行うためのキットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ストレプトコッカス ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）が、う蝕（むし歯）の原因菌として有名である。う蝕は、Ｓ．ｍｕｔａｎｓが発生する酸によって歯が溶出する疾患である。Ｓ．ｍｕｔａｎｓは、口腔内で増殖して酵素グルコシルトランスフェラーゼを分泌する。この酵素は、食物中の糖分を分解して不溶性の多糖類グルカンを生成する。生成したグルカンは、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ菌体とともに歯の表面に付着してプラーク（歯垢）を形成する。Ｓ．ｍｕｔａｎｓは、プラーク内で糖を代謝して乳酸などの酸を生成する。この酸が歯表面のエナメル質からカルシウムを溶出し、その結果、う蝕が進行する。以上のように、う蝕は、歯科領域において重要な疾患の１つであるので、う蝕の治療および予防に関する研究が進められている。
【０００３】
細菌を分類する公知の方法としては、生理生化学的性状に基づく方法、キノン組成、菌体脂肪酸組成または細胞壁成分等に基づく方法、ＤＮＡのＧ＋Ｃ含量に基づく方法、ＤＮＡ相同性に基づく方法、ＤＮＡプローブを用いる方法、および１６ＳリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）遺伝子の塩基配列の解析を行う方法等が挙げられる。特に、近年では、１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列に基づいて系統分類したグループ（クラスター）を指標とする細菌の分類および識別が行なわれている。
【０００４】
ミュータンス連鎖球菌（ｍｕｔａｎｓ ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）は、その細胞壁多糖類の組成およびその連鎖における相違に基づいて、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）（血清型ｃ、ｅ、ｆ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｏｂｒｉｎｕｓ（血清型ｄ、ｇ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｒｉｃｅｔｕｓ（血清型ａ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｔｔｕｓ（血清型ｂ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆｅｒｕｓ（血清型ｃ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｃａｃａｅ（血清型ｃ）、及びＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄｏｗｎｅｉ（血清型ｈ）の計８つの血清型に分類される。
【０００５】
さらに、Ｓ．ｍｕｔａｎｓは、感染性心内膜炎（Ｉｎｆｅｃｔｉｖｅ Ｅｎｄｏｃａｒｄｉｔｉｓ；ＩＥ）患者の血液より分離されることがある。感染性心内膜炎は、歯科領域において最も良く知られている全身性疾患の一つである。感染性心内膜炎は致死的な感染症であり、心臓弁置換術を受けた患者または心臓に先天性奇形を有する患者が罹患しやすいとされる。感染性心内膜炎は、歯科治療によって患者の血液中に原因菌が侵入し、心内膜に細菌塊を形成して炎症を引き起こす。この原因菌は、口腔に存在する連鎖球菌（特に、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｎｇｕｉｎｉｓ）であることが多いが、Ｓ．ｍｕｔａｎｓもまた原因菌として挙げられ得る。
【０００６】
通常、感染性心内膜炎を発症する患者を歯科治療する場合は、治療の前に抗生物質の投与が行なわれ、そして抗生物質の血中濃度が上昇してから下降するまでの間に治療が行なわれる（非特許文献１および２参照）。
【０００７】
【非特許文献１】 Ｄａｊａｎｉ Ａ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｅｎｄｏｃａｒｄｉｔｉｓ；Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ ｂｙ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｈｅａｒｔ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １９９７ ９６：３５８−３６６．
【非特許文献２】 Ｎａｋａｔａｎｉ Ｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｖｅ ｅｎｄｏｃａｒｄｉｔｉｓ ｉｎ Ｊａｐａｎ；ａｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ８４８ ｃａｓｅｓ ｉｎ ２０００ ａｎｄ ２００１．Ｃｉｒｃ．Ｊ．２００３ ６７：９０１−９０５．
【０００８】
感染性心内膜炎を予防するために、多量の抗生物質が使用される。例えば、ペニシリン系抗生物質であるサワシリンは、体重２５ｋｇの子供に１回につき１０００ｍｇがカプセルまたは粉末にて術前投与される。
【０００９】
このような多量の抗生物質は、医学的に必要である。しかし、抗生物質の乱用に起因する薬剤耐性菌の出現は、近年大きな問題となっている。従って、抗生物質の使用量を減らすこと、および抗生物質の使用による耐性菌出現を抑制することは、有用である。
【００１０】
本発明者らの以前の研究において、抜歯処置の後の菌血症患者または感染性心内膜炎患者から分離した４つの連鎖球菌株は、その生物学的な性質および１６ＳリボソームＲＮＡの塩基配列に基づいてＳ．ｍｕｔａｎｓ株と特定された（非特許文献３参照）。通常、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ株は、その約８０％以上が血清型ｃに分類されるが、上記患者の血液から分離した４株のＳ．ｍｕｔａｎｓはいずれも血清型ｃではなかった。これらの株のうち、１株が血清型ｅ、１株が血清型ｆであり、残りの２つの株（ＴＷ２９５及びＴＷ８７１）は、公知の血清型（ｃ型、ｅ型またはｆ型）のいずれにも属さず、血清学的に不定であった。
【００１１】
Ｓ．ｍｕｔａｎｓ株の血清型を決定する血清型特異的な多糖抗原は、ラムノース基本骨格とα−又はβ−結合のグルコシド基側鎖とを有するラムノース−グルコースポリマーからなる。上記ＴＷ２９５株及びＴＷ８７１株の血清学的に不定であるという性質は、血清型特異的な多糖抗原におけるグルコース側鎖の量の低下に起因することが示された。さらに、血清学的に不定な株（便宜上、Ｓ．ｍｕｔａｎｓの血清型不定株と称する）ＴＷ２９５及びＴＷ８７１における血清型特異多糖抗原は、ｇｌｕＡ遺伝子（グルコース側鎖ドナーにおける直前の前駆体の生産を触媒する酵素をコードする）を不活性化した変異株における血清型特異多糖抗原と類似しており、ｇｌｕＡ遺伝子不活化変異株およびＳ．ｍｕｔａｎｓの血清型不定株のいずれにおいても、血清型特異多糖抗原のグルコースの量は低い。
【００１２】
また、Ｓ．ｍｕｔａｎｓの血清型不定株は、口腔から分離した株と同じくらい高い疎水性とショ糖依存的付着能とを有することが示され、また、食作用を受けにくいことが明らかになった。
【００１３】
【非特許文献３】 Ｆｕｊｉｗａｒａ，Ｔ．，Ｋ．Ｎａｋａｎｏ，Ｍ．Ｋａｗａｇｕｃｈｉ，Ｔ．Ｏｏｓｈｉｍａ，Ｓ．Ｓｏｂｕｅ，Ｓ．Ｋａｗａｂａｔａ，Ｉ．Ｎａｋａｇａｗａ，ａｎｄ Ｓ．Ｈａｍａｄａ．２００１．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ｕｎｔｙｐａｂｌｅ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ ｓｔｒａｉｎｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｂａｃｔｅｒｅｍｉａ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｏｒａｌ Ｓｃｉ．１０９：３３０−３３４．
【００１４】
上記の知見は、高い疎水性とショ糖依存的な付着レベルとに起因して、Ｓ．ｍｕｔａｎｓの血清型不定株がヒトの口腔に存在し得ることを意味する。さらに、Ｓ．ｍｕｔａｎｓの血清型不定株は、食作用を受けにくいために、血液中においてより長く生存することが可能になり、その結果、血液より分離されたと考えられる。
【００１５】
感染性心内膜炎を予防するために、患者が感染性心内膜炎の原因菌（例えば、Ｓ．ｍｕｔａｎｓの血清型不定株）を保有するか否かを簡便に同定することが、非常に望まれている。さらに、感染性心内膜炎の原因菌を特定することは、治療に用いる抗生物質を選択する際に有用である。しかし、患者が感染性心内膜炎の原因菌を保有するか否かを簡便に同定する方法や、感染性心内膜炎の原因菌を特定する方法は、未だ開発途上である。
【００１６】
上述したように、Ｓ．ｍｕｔａｎｓの血清型不定株は血液中でも安定であり、その結果、Ｓ．ｍｕｔａｎｓの血清型不定株が感染した患者は感染性心内膜炎を発症する可能性が高いと考えられる。Ｓ．ｍｕｔａｎｓの血清型不定株は、死に至る可能性がある感染性心内膜炎の発症を予防する観点から重要であると考えられているので、Ｓ．ｍｕｔａｎｓの血清型不定株の分離および同定が、特に望まれる。
【００１７】
本発明の目的は、当該Ｓ．ｍｕｔａｎｓの血清型不定株を分離および同定して、被験体中に存在するか否かを有効かつ効率的に判定する方法を提供することにある。
【発明の開示】
【００１８】
本発明者等は、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、免疫方法に改良を加えることによって、Ｓ．ｍｕｔａｎｓの血清型不定株に対する抗血清を取得し、Ｓ．ｍｕｔａｎｓの血清型不定株を新規血清型（ｋ型）と定義した。
【００１９】
この新規血清型ｋ型を規定する多糖抗原を解析するために、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ多糖抗原の生合成に関与する酵素（ｒｇｐＡ、ｒｇｐＢ、ｒｇｐＣ、ｒｇｐＤ、ｒｇｐＥ、ｒｇｐＦ、ＯＲＦ７、ｒｇｐＨ、ｒｇｐＩおよびＯＲＦ１０）をコードする遺伝子の全配列を、当該ｋ型株において特定した。これらの遺伝子配列についてｋ型株と既知の血清型Ｓ．ｍｕｔａｎｓ株との間で比較して、ｒｇｐＦにおいて複数のｋ型株に共通した特異配列が存在することを見出した。さらに本発明者らは、ｒｇｐＦにおいて見出されたＳ．ｍｕｔａｎｓのｋ型株に特異的な塩基配列に基づいて設計したプライマーを用いて、被験体より得られた組織サンプルをＰＣＲ増幅することによって、当該被験体におけるＳ．ｍｕｔａｎｓの血清型不定株の存在を有効かつ効率的に検出することが可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００２０】
即ち、本発明のポリヌクレオチドまたはそのフラグメントは、ストレプトコッカス ミュータンスの血清型特異多糖抗原のグルコース側鎖の量が低下したストレプトコッカス ミュータンス株に特異的な塩基配列あるいは当該塩基配列の相補配列を含むことを特徴としている。
【００２１】
好ましくは、本発明のポリヌクレオチドまたはそのフラグメントは、ストレプトコッカス ミュータンス特異的な多糖抗原のグルコース側鎖量を低下させるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであることを特徴としている。
【００２２】
上記ポリヌクレオチドは、
配列番号１ないし４の何れか１つに示される塩基配列；または
配列番号１ないし４の何れか１つに示される塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列、
からなることを特徴とするポリヌクレオチドであることが好ましい。
【００２３】
上記ポリヌクレオチドはまた、
配列番号１ないし４の何れか１つに示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または
配列番号１ないし４の何れか１つに示される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、
であることが好ましい。
【００２４】
さらに好ましくは、上記ポリヌクレオチドは、配列番号１ないし４の何れか１つに示される塩基配列からなることを特徴としている。
【００２５】
上記構成によれば、新規血清型を有するストレプトコッカス ミュータンス株に特異的に存在するポリヌクレオチドを提供することができる。
【００２６】
即ち、本発明のオリゴヌクレオチドは、ストレプトコッカス ミュータンスの血清型特異多糖抗原のグルコース側鎖の量が低下したストレプトコッカス ミュータンス株に特異的な塩基配列あるいは当該塩基配列の相補配列を含むことを特徴としている。
【００２７】
好ましくは、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号１ないし４の何れか１つに示される塩基配列の少なくとも１２個連続する塩基配列またはその相補配列を含むことを特徴としている。
【００２８】
上記オリゴヌクレオチドは、配列番号８ないし１０に示される塩基配列またはその相補配列を含むことが好ましい。
【００２９】
上記構成によれば、新規血清型を有するストレプトコッカス ミュータンス株を特異的に検出することに優れたオリゴヌクレオチドを提供することができる。
【００３０】
即ち、本発明のポリペプチドは、ストレプトコッカス ミュータンス特異的な多糖抗原のグルコース側鎖量を低下させることを特徴としている。
【００３１】
好ましくは、本発明のポリペプチドは、上記ポリヌクレオチドまたはそのフラグメントによってコードされることを特徴としている。
【００３２】
さらに好ましくは、本発明のポリペプチドは、配列番号１ないし４の何れか１つに示される塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされることを特徴としている。
【００３３】
上記構成によれば、ストレプトコッカス ミュータンスの血清型ｃ、ｅまたはｆの株以外の新規血清型を有するストレプトコッカス ミュータンス株に特異的に存在するポリペプチドを提供することができる。
【００３４】
即ち、本発明のストレプトコッカス ミュータンス株は、ストレプトコッカス ミュータンス特異的な多糖抗原のグルコース側鎖量が低下していることを特徴とする。
【００３５】
好ましくは、本発明のストレプトコッカス ミュータンス株は、ストレプトコッカス ミュータンスの血清型特異多糖抗原のグルコース側鎖の量が低下した新規血清型であることを特徴としている。
【００３６】
１つの局面において、本発明のストレプトコッカス ミュータンス株は、上記ポリヌクレオチドを有することが好ましい
他の局面において、本発明のストレプトコッカス ミュータンス株は、上記ポリペプチドを発現することが好ましい。
【００３７】
上記構成によれば、既知の血清型を有するストレプトコッカス ミュータンスに関する新たな知見を加えるとともに、既知の血清型を有するストレプトコッカス ミュータンスだけでは解明できなかった疾患の治療および／または予防に有用であるストレプトコッカス ミュータンス株を提供することができる。
【００３８】
即ち、本発明の抗体は、上記の課題を解決するために、ストレプトコッカス ミュータンスの血清型ｃ、ｅまたはｆの株に特異的な多糖抗原のグルコース側鎖の量が低下したストレプトコッカス ミュータンス株の多糖抗原に特異的に結合することを特徴としている。
【００３９】
即ち、本発明の抗体は、ストレプトコッカス ミュータンスの血清型特異多糖抗原のグルコース側鎖の量が低下したストレプトコッカス ミュータンス株に特異的な多糖抗原に結合することを特徴としている。
【００４０】
好ましくは、本発明の抗体は、上記ストレプトコッカス ミュータンス株の血清型特異多糖抗原と特異的に結合することを特徴とする。
【００４１】
上記構成によれば、ストレプトコッカス ミュータンスの血清型特異多糖抗原のグルコース側鎖の量が低下したストレプトコッカス ミュータンス株、すなわち、新規血清型を有するストレプトコッカス ミュータンス株を検出するために有用な抗体を提供することができる。
【００４２】
即ち、本発明の被験体サンプル中のストレプトコッカス ミュータンス株を検出する方法は、上記オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてＰＣＲ反応を行なう工程を包含することを特徴とする。
【００４３】
好ましくは、本発明の被験体サンプル中のストレプトコッカス ミュータンス株を検出する方法は、被験体サンプルより細菌を分離する工程、および、上記分離した細菌のゲノムＤＮＡまたは総ＲＮＡを抽出する工程をさらに包含することを特徴とする。
【００４４】
本発明の被験体サンプル中のストレプトコッカス ミュータンス株を検出する方法において、上記組織サンプルは血液、唾液または歯垢より得られることが好ましい。
【００４５】
本発明の被験体サンプル中のストレプトコッカス ミュータンス株を検出する方法において、上記プライマーは、配列番号８に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号９または１０に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであることが好ましい。
【００４６】
即ち、上記構成によれば、新規血清型を有するストレプトコッカス ミュータンス株の血清型特異多糖抗原の生合成に重要な酵素をコードする遺伝子の存在を検出して当該新規血清型株の存在を知ることができる。
【００４７】
即ち、本発明の被験体サンプル中のストレプトコッカス ミュータンス株を検出する方法は、上記の課題を解決するために、上記オリゴヌクレオチドをプローブとして用いてハイブリダイゼーション反応を行なう工程を包含することを特徴とする。
【００４８】
好ましくは、本発明の被験体サンプル中のストレプトコッカス ミュータンス株を検出する方法は、被験体サンプルより細菌を分離する工程、および、上記分離した細菌のゲノムＤＮＡまたは総ＲＮＡを抽出する工程をさらに包含することを特徴とする。
【００４９】
本発明の被験体サンプル中のストレプトコッカス ミュータンス株を検出する方法において、上記組織サンプルは、血液、唾液または歯垢より得られることが好ましい。
【００５０】
本発明の被験体サンプル中のストレプトコッカス ミュータンス株を検出する方法において、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号８ないし１０の何れかに示される塩基配列からなることが好ましい。
【００５１】
本発明の被験体サンプル中のストレプトコッカス ミュータンス株を検出する方法において、上記細菌を分離する工程が上記抗体を用いることが好ましい。
【００５２】
即ち、本発明のハイブリダイゼーション反応によってストレプトコッカス ミュータンスの血清型を判定する方法は、上記の課題を解決するために、上記ハイブリダイゼーション反応に使用されるプローブとして、ストレプトコッカス ミュータンスの血清型特異多糖抗原のグルコース側鎖の量が低下したストレプトコッカス ミュータンス株に特異的な塩基配列あるいは当該塩基配列の相補配列を含むオリゴヌクレオチドが用いられるとともに、上記特異的な塩基配列が、配列番号１ないし４の何れか１つに示される塩基配列の少なくとも１２個連続する塩基配列であることを特徴としている。
【００５３】
好ましくは、本発明のハイブリダイゼーション反応によってストレプトコッカス ミュータンスの血清型を判定する方法は、さらに、上記ハイブリダイゼーション反応に使用されるプローブとして、ストレプトコッカス ミュータンスの血清型ｃ、ｅまたはｆの株に特異的な塩基配列の少なくとも１２個連続する塩基配列あるいは当該塩基配列の相補配列を含むオリゴヌクレオチドが用いられることを特徴としている。
【００５４】
好ましくは、本発明のハイブリダイゼーション反応によってストレプトコッカス ミュータンスの血清型を判定する方法は、さらに、被験体の組織サンプルから染色体ＤＮＡまたは総ＲＮＡを得ることを特徴としている。
【００５５】
好ましくは、本発明のハイブリダイゼーション反応によってストレプトコッカス ミュータンスの血清型を判定する方法は、さらに、上記組織サンプルが血液、唾液または歯垢より得られることを特徴としている。
【００５６】
好ましくは、本発明の本発明のハイブリダイゼーション反応によってストレプトコッカス ミュータンスの血清型を判定する方法は、さらに、唾液または歯垢より菌を分離する工程を包含することを特徴としている。
【００５７】
上記構成によれば、ストレプトコッカス ミュータンスの血清型ｃ、ｅまたはｆの株に特異的な多糖類のグルコース側鎖の量が低下したストレプトコッカス ミュータンス株を特異的に検出することに優れたストレプトコッカス ミュータンスの血清型を判定する方法を提供することができる。
【００５８】
即ち、上記構成によれば、新規血清型を有するストレプトコッカス ミュータンス株の血清型特異多糖抗原の生合成に重要な酵素を検出して当該新規血清型株の存在を知ることができる。
【００５９】
即ち、本発明のストレプトコッカス ミュータンスの血清型特異多糖抗原のグルコース側鎖の量が低下したストレプトコッカス ミュータンス株を検出する方法は、上記の課題を解決するために、上記の抗体を用いて免疫反応を行う工程を包含することを特徴としている。
【００６０】
好ましくは、本発明の被験体サンプル中のストレプトコッカス ミュータンス株を検出する方法は、
被験体サンプルより細菌を分離する工程；
上記分離した細菌と請求の範囲第９項に記載の抗体をインキュベートする工程；
および
上記抗体と結合した細菌を検出する工程、
を包含することを特徴とする。
【００６１】
上記構成によれば、新規血清型を有するストレプトコッカス ミュータンスの有用な検出方法を提供することができる。
【００６２】
即ち、本発明の被験体中のストレプトコッカス ミュータンス株の血清型を判定する方法は、上記ストレプトコッカス ミュータンス株を検出する方法を用いることを特徴とする。
【００６３】
即ち、本発明のＰＣＲ反応によってＳ．ｍｕｔａｎｓの血清型を判定する方法は、上記の課題を解決するために、上記ＰＣＲ反応に使用されるプライマーとして、Ｓ．ｍｕｔａｎｓの血清型特異多糖抗原のグルコース側鎖の量が低下したＳ．ｍｕｔａｎｓ株に特異的な塩基配列あるいは当該塩基配列の相補配列を含むオリゴヌクレオチドが用いられるとともに、上記特異的な塩基配列が、配列番号１ないし４の何れか１つに示される塩基配列の少なくとも１２個連続する塩基配列であることを特徴としている。
【００６４】
好ましくは、本発明のＰＣＲ反応によってストレプトコッカス ミュータンスの血清型を判定する方法は、さらに、上記ＰＣＲ反応に使用されるプライマーとして、ストレプトコッカス ミュータンスの血清型ｃ、ｅまたはｆの株に特異的な塩基配列の少なくとも１２個連続する塩基配列あるいは当該塩基配列の相補配列を含むオリゴヌクレオチドが用いられることを特徴としている。
【００６５】
好ましくは、本発明のＰＣＲ反応によってストレプトコッカス ミュータンスの血清型を判定する方法は、さらに、被験体の組織サンプルから染色体ＤＮＡまたは総ＲＮＡを得ることを特徴としている。
【００６６】
好ましくは、本発明のＰＣＲ反応によってストレプトコッカス ミュータンスの血清型を判定する方法は、さらに、上記組織サンプルが血液、唾液または歯垢より得られることを特徴としている。
【００６７】
好ましくは、本発明のＰＣＲ反応によってストレプトコッカス ミュータンスの血清型を判定する方法は、さらに、唾液または歯垢より菌を分離する工程を包含することを特徴としている。
【００６８】
上記構成によれば、ストレプトコッカス ミュータンスの血清型特異多糖抗原のグルコース側鎖の量が低下したストレプトコッカス ミュータンス株を特異的に検出することに優れたストレプトコッカス ミュータンスの血清型を判定する方法を提供することができる。
【００６９】
即ち、本発明のストレプトコッカス ミュータンスの血清型を判定する方法は、上記の課題を解決するために、ストレプトコッカス ミュータンスの血清型特異多糖抗原のグルコース側鎖の量が低下したストレプトコッカス ミュータンス株に特異的に結合する抗体を用いることを特徴としている。
【００７０】
好ましくは、本発明のストレプトコッカス ミュータンスの血清型を判定する方法は、さらに、ストレプトコッカス ミュータンスの血清型特異多糖抗原のグルコース側鎖の量が低下したストレプトコッカス ミュータンス株に特異的に結合する抗体を用いることを特徴としている。
【００７１】
上記構成によれば、ストレプトコッカス ミュータンスの血清型特異多糖抗原のグルコース側鎖の量が低下したストレプトコッカス ミュータンス株を特異的に検出することに優れたストレプトコッカス ミュータンスの血清型を判定する方法を提供することができる。
【００７２】
即ち、本発明のストレプトコッカス ミュータンス株のスクリーニング方法は、上記のストレプトコッカス ミュータンス株を検出する方法を用いることを特徴とする。
【００７３】
即ち、本発明のストレプトコッカス ミュータンスの血清型特異多糖抗原のグルコース側鎖の量が低下したストレプトコッカス ミュータンス株をスクリーニングする方法は、上記のポリヌクレオチドまたはそのフラグメントを用いることを特徴としている。
【００７４】
好ましくは、本発明のストレプトコッカス ミュータンスの血清型特異多糖抗原のグルコース側鎖の量が低下したストレプトコッカス ミュータンス株をスクリーニングする方法は、上記のポリヌクレオチドまたはそのフラグメントがＰＣＲ反応に用いられることを特徴としている。
【００７５】
好ましくは、本発明のストレプトコッカス ミュータンスの血清型特異多糖抗原のグルコース側鎖の量が低下したストレプトコッカス ミュータンス株をスクリーニングする方法は、上記のポリヌクレオチドまたはそのフラグメントがハイブリダイゼーション反応に用いられることを特徴としている。
【００７６】
好ましくは、本発明のストレプトコッカス ミュータンスの血清型特異多糖抗原のグルコース側鎖の量が低下したストレプトコッカス ミュータンス株をスクリーニングする方法は、上記の抗体を用いることを特徴としている。
【００７７】
上記構成によれば、ストレプトコッカス ミュータンスの血清型特異多糖抗原のグルコース側鎖の量が低下したストレプトコッカス ミュータンス株のスクリーニングに優れた方法を提供することができる。
【００７８】
即ち、本発明のストレプトコッカス ミュータンス株は、上記のスクリーニング方法によって取得されることを特徴とする。
【００７９】
即ち、本発明のストレプトコッカス ミュータンスの血清型特異多糖抗原のグルコース側鎖の量が低下したストレプトコッカス ミュータンス株は、上記のスクリーニング方法によって分離されることを特徴としている。
【００８０】
上記構成によれば、新たにスクリーニングされたストレプトコッカス ミュータンスの血清型特異多糖抗原のグルコース側鎖の量が低下したストレプトコッカス ミュータンス株を提供することができる。
【００８１】
即ち、本発明のストレプトコッカス ミュータンスの血清型特異多糖抗原のグルコース側鎖の量が低下したストレプトコッカス ミュータンス株は、上記の課題を解決するために、上記のスクリーニング方法によってスクリーニングされることを特徴としている。
【００８２】
上記構成によれば、新規血清型を有するストレプトコッカス ミュータンス株をさらに提供することができる。
【００８３】
即ち、本発明のストレプトコッカス ミュータンス株を検出するためのキットは、上記のオリゴヌクレオチドを備えることを特徴とする。
【００８４】
本発明のストレプトコッカス ミュータンス株を検出するためのキットにおいて、上記オリゴヌクレオチドは配列番号９に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであることが好ましい。
【００８５】
本発明のストレプトコッカス ミュータンス株を検出するためのキットにおいて、配列番号８に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをさらに備えることが好ましい。
【００８６】
本発明のストレプトコッカス ミュータンス株を検出するためのキットにおいて、配列番号１０に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをさらに備えることが好ましい。
【００８７】
本発明のストレプトコッカス ミュータンス株を検出するためのキットは、ＰＣＲ反応またはハイブリダイゼーション反応に用いることが好ましい。
【００８８】
即ち、本発明のストレプトコッカス ミュータンスの血清型を判定するためのキットは、上記の課題を解決するために、ストレプトコッカス ミュータンスの血清型特異多糖抗原のグルコース側鎖の量が低下したストレプトコッカス ミュータンス株に特異的である塩基配列あるいは当該塩基配列の相補配列を含むオリゴヌクレオチドを備えるとともに、上記特異的な塩基配列が、配列番号１ないし４の何れか１つに示される塩基配列の少なくとも１２個連続する塩基配列であることを特徴としている。
【００８９】
好ましくは、本発明のストレプトコッカス ミュータンスの血清型を判定するためのキットは、さらに、ストレプトコッカス ミュータンスの血清型ｃ、ｅまたはｆの株に特異的な塩基配列の少なくとも１２個連続する塩基配列またはその相補配列を含むオリゴヌクレオチドを備えることを特徴としている。
【００９０】
好ましくは、本発明のストレプトコッカス ミュータンスの血清型を判定するためのキットは、さらに、被験体の組織サンプルから染色体ＤＮＡまたは総ＲＮＡを得るための試薬を含むことを特徴としている。
【００９１】
好ましくは、本発明のストレプトコッカス ミュータンスの血清型を判定するためのキットは、さらに、上記組織サンプルが血液、唾液または歯垢より得られることを特徴としている。
【００９２】
好ましくは、本発明のストレプトコッカス ミュータンスの血清型を判定するためのキットは、さらに、唾液または歯垢より菌を分離するための試薬を含むことを特徴としている。
【００９３】
好ましくは、本発明のストレプトコッカス ミュータンスの血清型を判定するためのキットは、さらに、ＰＣＲ反応に用いるための試薬を含むことを特徴としている。
【００９４】
好ましくは、本発明のストレプトコッカス ミュータンスの血清型を判定するためのキットは、さらに、ハイブリダイゼーション反応に用いるための試薬を含むことを特徴としている。
【００９５】
好ましくは、本発明のストレプトコッカス ミュータンスの血清型を判定するためのキットは、さらに、上記オリゴヌクレオチドが標識されていることを特徴としている。
【００９６】
上記構成によれば、ストレプトコッカス ミュータンスの血清型特異多糖抗原のグルコース側鎖の量が低下したストレプトコッカス ミュータンス株を特異的に検出することに優れたストレプトコッカス ミュータンスの血清型を判定するためのキットを提供することができる。
【００９７】
即ち、上記構成によれば、新規血清型を有するストレプトコッカス ミュータンス株に特異的な多糖抗原の生合成に重要な酵素をコードする遺伝子の存在を検出して当該新規血清型株の存在を知ることができる。
【００９８】
即ち、本発明のストレプトコッカス ミュータンスの血清型を判定するためのキットは、上記の課題を解決するために、ストレプトコッカス ミュータンスの血清型特異多糖抗原のグルコース側鎖の量が低下したストレプトコッカス ミュータンス株に特異的に結合する抗体を備えることを特徴としている。
【００９９】
好ましくは、本発明のストレプトコッカス ミュータンスの血清型を判定するためのキットは、新規血清型を有するストレプトコッカス ミュータンス株に特異的に結合する上記抗体を備えることを特徴とする。
【０１００】
上記構成によれば、新規血清型を有するストレプトコッカス ミュータンス株の検出に有用なキットを提供することができる。
【０１０１】
好ましくは、本発明のストレプトコッカス ミュータンスの血清型を判定するためのキットは、さらに、ストレプトコッカス ミュータンスの血清型特異多糖抗原のグルコース側鎖の量が低下したストレプトコッカス ミュータンス株の多糖抗原に特異的に結合する抗体を備えることを特徴としている。
【０１０２】
上記構成によれば、ストレプトコッカス ミュータンスの血清型特異多糖抗原のグルコース側鎖の量が低下したストレプトコッカス ミュータンス株、すなわち、新規血清型を有するストレプトコッカス ミュータンス株を特異的に検出することに優れたストレプトコッカス ミュータンスの血清型を判定するためのキットを提供することができる。
【０１０３】
即ち、本発明の抗体の製造方法は、上記の課題を解決するために、従来の免疫方法を改良していることを特徴としている。
【０１０４】
１つの局面において、本発明の抗体の製造方法は、リン酸緩衝化生理食塩水に懸濁した上記ストレプトコッカス ミュータンス株を５日間連続でウサギ耳介静脈に注射する工程を包含することが好ましい。
【０１０５】
本発明の抗体の製造方法は、１週間間隔をあけた後、さらなる２週間において１週間に５日間ずつリン酸緩衝化生理食塩水に懸濁した上記ストレプトコッカス ミュータンス株を反復注射する工程をさらに包含することが好ましい。
【０１０６】
上記方法によれば、ストレプトコッカス ミュータンスの血清型特異多糖抗原のグルコース側鎖の量が低下したストレプトコッカス ミュータンス株、すなわち、新規血清型を有するストレプトコッカス ミュータンス株に特異的に結合する抗体の製造方法を提供することができる。
【０１０７】
上記構成によれば、従来の免疫方法では取得し得なかった新規血清型を有するストレプトコッカス ミュータンス表層抗原に対する抗体を提供することができる。
【０１０８】
即ち、本発明の細菌検出器具は、新規血清型を有するストレプトコッカス ミュータンス株に特異的な塩基配列またはその相補配列を含むオリゴヌクレオチドが基板上に固定化されていることを特徴としている。
【０１０９】
好ましくは、本発明の細菌検出器具において、上記塩基配列は、新規血清型を有するストレプトコッカス ミュータンス株に特異的な多糖抗原の生合成に重要な酵素をコードするポリヌクレオチドの塩基配列の少なくとも１２個連続する塩基配列であることを特徴としている。
【０１１０】
上記構成によれば、サンプル中に含まれる新規血清型を有するストレプトコッカス ミュータンス株を検出・同定することができる。
【０１１１】
さらに上記構成によれば、サンプル中に含まれるストレプトコッカス ミュータンス株の網羅的な検査を行なうことができる。
【０１１２】
本発明のさらに他の目的、特徴、および優れた点は、以下に示す記載によって十分わかるであろう。また、本発明の利益は、添付図面を参照した次の説明で明白になるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１１３】
【図１】Ａ〜Ｅは、Ｓ．ｍｕｔａｎｓのＴＷ２９５株に特異的な抗血清およびＴＷ８７１株に特異的な抗血清と、ＴＷ２９５株、ＴＷ８７１株、ｃ型株、ｅ型株およびｆ型株から調製したランツ−ランドール（ＲＲ）抗原との反応を示す図である。
【図２】Ａ〜Ｃは、Ｓ．ｍｕｔａｎｓにおけるＰＡ、ＣＡ−ＧＴＦおよびＣＦ−ＧＴＦの発現のウエスタンブロットの結果を示す図である。
【図３】Ａ・Ｂは、Ｓ．ｍｕｔａｎｓの口腔分離株および血液分離株の食作用率を示す図である。
【図４】Ｓ．ｍｕｔａｎｓの血清型ｃ型とｋ型とにおけるｒｇｐＦ遺伝子前半部の塩基配列を比較することにより、変異の存在を示す図である。
【図５】Ｓ．ｍｕｔａｎｓの血清型ｃ型とｋ型とにおけるｒｇｐＦ遺伝子前半部の塩基配列を比較する図であり、図４の続きを示す。
【図６】Ｓ．ｍｕｔａｎｓの血清型ｃ型とｋ型とにおけるｒｇｐＦ遺伝子前半部の塩基配列を比較する図であり、図５の続きを示す。
【図７】Ｓ．ｍｕｔａｎｓの血清型ｃ型とｋ型とにおけるｒｇｐＦ遺伝子前半部の塩基配列を比較する図であり、図６の続きを示す。
【図８】Ｓ．ｍｕｔａｎｓの血清型ｃ型とｋ型とにおけるｒｇｐＦ遺伝子前半部の塩基配列を比較する図であり、図７の続きを示す。
【図９】Ｓ．ｍｕｔａｎｓの血清型ｃ型とｋ型とにおけるｒｇｐＦ遺伝子前半部の塩基配列を比較する図であり、図８の続きを示す。
【図１０】Ｓ．ｍｕｔａｎｓの血清型ｃ型とｋ型とにおけるｒｇｐＦ遺伝子前半部の塩基配列を比較する図であり、図９の続きを示す。
【図１１】Ｓ．ｍｕｔａｎｓの血清型ｃ型とｋ型とにおけるｒｇｐＦ遺伝子前半部の塩基配列を比較する図であり、図１０の続きを示す。
【図１２】Ｓ．ｍｕｔａｎｓの血清型ｃ型とｋ型とにおけるｒｇｐＦ遺伝子前半部の塩基配列を比較する図であり、図１１の続きを示す。
【図１３】Ｓ．ｍｕｔａｎｓの血清型ｃ型とｋ型とにおけるｒｇｐＦ遺伝子前半部の塩基配列を比較する図であり、図１２の続きを示す。
【図１４】Ｓ．ｍｕｔａｎｓの血清型ｃ型とｋ型との塩基配列を整列させて、ｒｇｐＦ遺伝子前半部の塩基配列を比較した図である。
【図１５】至適なＰＣＲ条件を示す図である。
【図１６】ＭＴ８１４８株（ｃ型）、ＴＷ２９５株（ｋ型）およびＦＴ１株（ｋ型）から抽出したゲノムＤＮＡを希釈しそれをテンプレートにして血清型に特異的なプライマーを用いてＰＣＲ増幅して検出感度を求めた結果を示す図である。
【図１７】Ａ・Ｂは、種々の血清型のＳ．ｍｕｔａｎｓ株および種々の連鎖球菌から抽出したゲノムＤＮＡをテンプレートにして血清型特異的プライマーを用いてＰＣＲ増幅した結果を示す図である。
【図１８】Ａ・Ｂは、唾液サンプルから抽出したゲノムＤＮＡをテンプレートにして血清型特異的プライマーを用いてＰＣＲ増幅した結果を示す図である。
【図１９】Ａ・Ｂは、Ｓ．ｍｕｔａｎｓにおけるＣＡ−ＧＴＦ発現およびＣＦ−ＧＴＦ発現のウエスタンイムノブロット検出を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１１４】
本発明の実施の一形態について以下に詳細に説明するが、本発明は以下の記載に限定されるものではない。
【０１１５】
（１）血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株
Ｓ．ｍｕｔａｎｓは、感染性心内膜炎を発症する患者の血液より時折単離されるが、その侵入機構および生存機構は、解明の余地を残す。菌血症または感染性心内膜炎を発症する患者より得た４つの血液分離株のうち２つ（ＴＷ２９５株およびＴＷ８７１株）は、免疫沈降試験によると血清学的に不定であった。
【０１１６】
これらの血清型不定株に対する抗血清を用いる免疫拡散分析は、１００人の被験体より得た１００株の口腔分離株のうち２つが陽性反応を示した。５０人の被験体より得た２５００株の口腔分離株に対するさらなる免疫拡散分析において、単一の患者より得た５０個の分離株全てが抗ｃ型抗血清、抗ｅ型抗血清、および抗ｆ型抗血清と反応しないが、抗ＴＷ２９５抗血清および抗ＴＷ８７１抗血清と反応した。これらの株は、対照株であるＳ．ｍｕｔａｎｓ株ＭＴ８１４８と同様の生物学的特性（例えば、高レベルのショ糖依存的吸着および菌体疎水性、ならびにグルコシルトランスフェラーゼおよびタンパク質抗原（ＰＡ）の発現）を示した。本発明者らは、この生物を血清型ｋと名付けた。
【０１１７】
本発明者らは、ヒト血液サンプルおよび口腔サンプルより血清型ｋの新たなＳ．ｍｕｔａｎｓ株を分離し、そして特徴付けた。血清型ｋ株の血清学的特徴は、ＭＴ８１４８のｇｌｕＡ不活化変異株（ＭＴ８１４８ＧＤ）の特徴と同様であることを見出した。
【０１１８】
血清型ｋの口腔分離株は、血液分離株およびＭＴ８１４８ＧＤと同様に食作用に抵抗性を示した。これらの結果は、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ血清型ｋ株がヒトロ腔内に存在するだけでなく、食作用に対する低い感受性に起因して血液中で生存し得るということを示す。
【０１１９】
ＭＴ８１４８ＧＤは、ガラス表面に対するショ糖依存的付着、唾液で被覆したヒドロキシアパタイトに対するショ糖非依存的付着、デキストラン結合活性、および菌体結合型（ｃｅｌｌ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）グルコシルトランスフェラーゼ（ＧＴＦ）活性などの生物学的特性に関して、その親株であるＭＴ８１４８株よりも有意に低い。
【０１２０】
さらに、ウエスタンブロット分析は、血清型ｋにおけるＧＴＦＢ／ＧＴＦＣの発現率比がＭＴ８１４８より減少したことを示したが、ラットに対するう蝕誘発能は、ＭＴ８１４８、ＭＴ８１４８ＧＤおよび血清型ｋの口腔分離株の間で同程度であった。
【０１２１】
これらの結果は、Ｓ．ｍｕｔａｎｓの血清型特異的多糖におけるグルコース側鎖の欠失がう蝕誘発能と関連し得るが、その他の主要な表層タンパク質（例えば、ＧＴＦ、ＰＡｃ等）よりもその程度が低いということを示す。
【０１２２】
本発明において、従来の免疫方法に改良を加えることによって、血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株に対する抗血清が取得された。Ｓ．ｍｕｔａｎｓ株の血清型特異多糖抗原の生合成に関わる遺伝子群の配列を特定して血清型ｋと既知株とを比較した結果、血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株に共通して存在するｒｇｐＦ遺伝子の配列において変異が同定された。
【０１２３】
（Ａ）ポリヌクレオチド
本発明は、ストレプトコッカス ミュータンス特異的な多糖抗原のグルコース側鎖量を低下させるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。本明細書中において使用される場合、「ストレプトコッカス ミュータンス特異的な多糖抗原のグルコース側鎖量を低下させるポリペプチド」は、「血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株に特異的な多糖抗原の生合成に関与するポリペプチド」または「血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株の血清型特異多糖抗原の生合成に関与するポリペプチド」と置換可能に使用される。一実施形態において、本発明は、配列番号１ないし４の何れか１つに示される塩基配列を有するポリヌクレオチドまたはそのフラグメントを提供する。本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は「核酸」または「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。本明細書中で使用される場合、用語「塩基配列」は、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」と交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、ＣおよびＴと省略される）の配列として示される。また、「配列番号１ないし４の何れか１つに示される塩基配列を含むポリヌクレオチドまたはそのフラグメント」とは、配列番号１ないし４の各デオキシヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃおよび／またはＴによって示される配列を含むポリヌクレオチドまたはその断片部分が意図される。
【０１２４】
本発明に係るポリヌクレオチドは、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態、またはＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）で存在し得る。ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であり得る。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、コード鎖（センス鎖としても知られる）であり得るか、またはそれは、非コード鎖（アンチセンス鎖としても知られる）であり得る。
【０１２５】
本明細書中で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、ヌクレオチドが数個ないし数十個結合したものが意図され、「ポリヌクレオチド」と交換可能に使用される。オリゴヌクレオチドは、短いものはジヌクレオチド（二量体）、トリヌクレオチド（三量体）といわれ、長いものは３０マーまたは１００マーというように重合しているヌクレオチドの数で表される。オリゴヌクレオチドは、より長いポリヌクレオチドのフラグメントとして生成されても、化学合成されてもよい。
【０１２６】
本発明のポリヌクレオチドのフラグメントは、少なくとも１２ｎｔ（ヌクレオチド）、好ましくは約１５ｎｔ、そしてより好ましくは少なくとも約２０ｎｔ、なおより好ましくは少なくとも約３０ｎｔ、そしてさらにより好ましくは少なくとも約４０ｎｔの長さのフラグメントが意図される。例えば、「配列番号１ないし４の何れか１つに示されるヌクレオチド配列の少なくとも２０ｎｔの長さのフラグメント」によって、配列番号１ないし４の何れか１つに示されるヌクレオチド配列からの２０以上の連続した塩基を含むフラグメントが意図される。本明細書を参照すれば配列番号１ないし４の何れか１つに示されるヌクレオチド配列が提供されるので、当業者は，このようなＤＮＡフラグメントを容易に作製することができる。例えば、制限エンドヌクレアーゼ切断または超音波による剪断は、種々のサイズのフラグメントを作製するために容易に使用され得る。あるいは、このようなフラグメントは、合成的に作製され得る。適切なフラグメント（オリゴヌクレオチド）が、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（ＡＢＩ，８５０ Ｌｉｎｃｏｌｎ Ｃｅｎｔｅｒ Ｄｒ．，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ ９４４０４）３９２型シンセサイザーなどによって合成される。
【０１２７】
本発明は、血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株に特異的な多糖抗原の生合成に関与するポリペプチドをコードするか否かに関係なく、配列番号１ないし４の何れか１つに示される塩基配列の少なくとも１２個連続する配列またはその相補配列からなるポリヌクレオチドに関する。特定のポリヌクレオチドが血清型ｋの血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株に特異的な多糖抗原の生合成に関与するポリペプチドをコードしない場合でさえ、当業者は、上記ポリヌクレオチドが、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のプライマー、またはハイブリダイゼーションプローブとして使用され得ることを容易に理解する。本発明のポリヌクレオチドは、血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株に特異的な多糖抗原の生合成に関与するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを特異的にＰＣＲ増幅できるので、本発明のポリヌクレオチドは、血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株に特異的な多糖抗原の生合成に関与するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするハイブリダイゼーションプローブとしてもまた利用可能である。血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株に特異的な多糖抗原の生合成に関与するポリペプチドをコードしない本発明のポリヌクレオチドの他の用途としては、Ｖｅｒｍａら、Ｈｕｍａｎ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）に記載の、正確な染色体位置を提供するための分裂中期染色体展開物に対するインサイチュハイブリダイゼーション（例えば、ＦＩＳＨ）；および、特定の組織における血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株に特異的な多糖抗原の生合成に関与するポリペプチドに関するｍＲＮＡ発現を検出するためのノーザンブロット分析が挙げられる。
【０１２８】
例えば、「長さが少なくとも２０ｎｔ」のポリヌクレオチドの部分によって、参照のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列からの２０以上の隣接したヌクレオチドが意図される。好ましい実施形態において、本発明のこのような部分は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による標的配列の増幅のためのプライマーとして、または従来のＤＮＡハイブリダイゼーション技術に従ったプローブとしてのいずれかで診断的に有用である。
【０１２９】
別の局面において、本発明は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、上記の本発明のポリヌクレオチド（例えば、配列番号１ないし４の何れか１つに示される塩基配列からなるポリヌクレオチド）またはその一部にハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む、単離したポリヌクレオチドを提供する。用語「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、ハイブリダイゼーション溶液（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む）中にて４２℃で一晩インキュベーションした後、約６５℃にて０．１×ＳＳＣ中でフィルターを洗浄することが意図される。ポリヌクレオチドの「一部」にハイブリダイズするポリヌクレオチドによって、参照のポリヌクレオチドの少なくとも約１５ヌクレオチド（ｎｔ）、そしてより好ましくは少なくとも約２０ｎｔ、さらにより好ましくは少なくとも約３０ｎｔ、そしてさらにより好ましくは約３０〜７０ｎｔにハイブリダイズするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）が意図される。これらは、本明細書中においてより詳細に考察されるような診断用プライマーおよび診断用プローブとして有用である。
【０１３０】
血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株の血清型特異多糖抗原の生合成に関与するポリペプチドをコードする本発明のポリヌクレオチドとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：それ自体によって、成熟ポリペプチドのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；成熟したポリペプチドのコード配列およびさらなる配列（例えば、リーダー配列をコードする配列）（例えば、プレタンパク質配列またはプロタンパク質配列またはプレプロタンパク質配列）；イントロン、非コード５’配列および非コード３’配列（例えば、転写、ｍＲＮＡプロセシング（スプライシングおよびポリアデニル化シグナルを含む）において役割を担う転写非翻訳配列）；さらなる機能性を提供するようなさらなるアミノ酸をコードするさらなるコード配列。従って、例えば、ポリペプチドをコードする配列は、マーカー配列（例えば、融合されたポリペプチドの精製を容易にするペプチドをコードする配列）に融合され得る。本発明のこの局面の特定の好ましい実施態様において、マーカーアミノ酸配列は、ヘキサ−ヒスチジンペプチド（例えば、ｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）において提供されるタグ）であり、他の中では、それらの多くは公的および／または商業的に入手可能である。例えば、Ｇｅｎｔｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８２１−８２４（１９８９）において記載されるように、ヘキサヒスチジンは、融合タンパク質の簡便な精製を提供する。「ＨＡ」タグは、インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質由来のエピトープに対応する精製のために有用な別のペプチドであり、それは、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ３７：７６７（１９８４）によって記載されている。他のそのような融合タンパク質は、Ｎ末端またはＣ末端にてＦｃに融合される血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株に特異的な多糖抗原の生合成に関与するポリペプチドまたはそのフラグメントを含む。
【０１３１】
血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株の血清型特異多糖抗原の生合成に関与するポリペプチドまたはそのフラグメントをコードする本発明に係るポリヌクレオチドは、宿主細胞における増殖のための選択マーカーを含有するベクターに結合され得る。一般的に、プラスミドベクターは、リン酸カルシウム沈殿物のような沈殿物中か、または荷電された脂質との複合体中で導入される。また、下記で詳述するように、ＤＥＡＥデキストラン法やエレクトロポレーション法を用いてもよい。ベクターがウイルスである場合、ベクターは、適切なパッケージング細胞株を用いてインビトロでパッケージングされ得、次いで宿主細胞に形質導入され得る。
【０１３２】
本発明はさらに、血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株の血清型特異多糖抗原の生合成に関与するポリペプチドをコードする本発明のポリヌクレオチドの変異体に関する。変異体は、天然の対立遺伝子変異体のように、天然に生じ得る。「対立遺伝子変異体」によって、生物の染色体上の所定の遺伝子座を占める遺伝子のいくつかの交換可能な形態の１つが意図される。天然に存在しない変異体は、例えば当該分野で公知の変異誘発技術を用いて生成され得る。
【０１３３】
そのような変異体は、本発明のポリヌクレオチドにおいて１または数個のヌクレオチド置換、欠失、または付加によって生成される変異体を含む。置換、欠失、または付加は、１つ以上のヌクレオチドを含み得る。変異体は、コードもしくは非コード領域、またはその両方において変化され得る。コード領域における変異は、保存的もしくは非保存的なアミノ酸置換、欠失、または付加を生成し得る。
【０１３４】
このように、本発明に係るポリヌクレオチドは、少なくとも、配列番号１ないし４の何れか１つに示される塩基配列を含むかまたはその変異体であればよいといえる。また、本発明に係るポリヌクレオチドの塩基配列は、適切なリンカーペプチドをコードするポリヌクレオチドで連結されていてもよい。
【０１３５】
つまり、本発明の目的は、血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株に特異的な多糖抗原の生合成に関与するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび当該ポリヌクレオチドを検出するために使用するポリヌクレオチド（オリゴヌクレオチド）を提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載したポリヌクレオチド作製方法等に存するのではない。したがって、上記各方法以外によって取得される血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株に特異的な多糖抗原の生合成に関与するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび当該ポリヌクレオチドを検出するために使用するポリヌクレオチド（オリゴヌクレオチド）も本発明の範囲に属することに留意しなければならない。
【０１３６】
（Ｂ）ポリペプチド
本発明者らは、新規血清型（ｋ型）のＳ．ｍｕｔａｎｓ株を見出し、この血清型を規定する多糖抗原の生合成に関与する酵素の１つであるｒｇｐＦにおいて変異が存在することを見出した。
【０１３７】
本明細書中で使用される場合、用語「ポリペプチド」は、「ペプチド」または「タンパク質」と交換可能に使用される。また、ポリペプチドの「フラグメント」は、当該ポリペプチドの部分断片が意図される。本発明に係るポリペプチドはまた、天然供給源より単離されても、化学合成されてもよい。
【０１３８】
用語「単離された」ポリペプチドまたはタンパク質は、その天然の環境から取り出されたポリペプチドまたはタンパク質が意図される。例えば、宿主細胞中で発現された組換え産生されたポリペプチドおよびタンパク質は、任意の適切な技術によって実質的に精製されている天然または組換えのポリペプチドおよびタンパク質と同様に、単離されていると考えられる。
【０１３９】
本発明に係るポリペプチドは、天然の精製産物、化学合成手順の産物、および原核生物宿主または真核生物宿主（例えば、細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含む）から組換え技術によって産生された産物を含む。組換え産生手順において用いられる宿主に依存して、本発明に係るポリペプチドは、グリコシル化され得るか、または非グリコシル化され得る。さらに、本発明に係るポリペプチドはまた、いくつかの場合、宿主媒介プロセスの結果として、開始の改変メチオニン残基を含み得る。
【０１４０】
１つの局面において、本発明は、ｋ型Ｓ．ｍｕｔａｎｓ株のｒｇｐＦポリペプチドを提供する。本明細書中で使用される場合、「ｋ型Ｓ．ｍｕｔａｎｓ株のｒｇｐＦポリペプチド」は、新規血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株の多糖抗原の生合成に関与する酵素であるｒｇｐＦポリペプチドが意図される。
【０１４１】
１つの実施形態において、本発明は、配列番号１ないし４の何れか１つに示される塩基配列によってコードされるポリペプチドを提供する。本発明の好ましいポリペプチドとしては、成熟ポリペプチド、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞内ドメイン、または膜貫通ドメインの全てまたは一部を欠失した細胞外および細胞内ドメインを含むポリペプチドが挙げられる。
【０１４２】
本発明は、さらに、実質的なｋ型Ｓ．ｍｕｔａｎｓ株のｒｇｐＦポリペプチド活性を示すｋ型Ｓ．ｍｕｔａｎｓ株のｒｇｐＦポリペプチドの変異体を提供する。１つの実施形態において、本発明は、配列番号１ないし４の何れか１つに示される塩基配列によってコードされるポリペプチドにおいて１または数個のアミノ酸が置換、付加または欠失した、ｋ型Ｓ．ｍｕｔａｎｓ株のｒｇｐＦポリペプチド活性を示すポリペプチド変異体を提供する。
【０１４３】
本明細書中で使用される場合、用語「ｋ型Ｓ．ｍｕｔａｎｓ株のｒｇｐＦポリペプチド活性」は、公知の血清型のＳ．ｍｕｔａｎｓ株には存在しない多糖抗原、すなわち、ｋ型Ｓ．ｍｕｔａｎｓ株に特異的な多糖抗原の生合成に関与するｒｇｐＦポリペプチドの特徴が意図される。
【０１４４】
このような変異体は、欠失、挿入、逆転、反復、およびタイプ置換（例えば、親水性の残基の別の残基への置換（通常は強く親水性の残基を強く疎水性の残基には置換しない））を含む。「中性」アミノ酸置換は、一般的にほとんど活性に影響しない。
【０１４５】
ポリペプチドのアミノ酸配列中のいくつかのアミノ酸が、このポリペプチドの構造または機能に有意に影響することなく容易に改変され得ることは、当該分野において周知である。さらに、人為的に改変させるだけではく、天然のタンパク質において、当該タンパク質の構造または機能を有意に変化させない変異体が存在することもまた周知である。
【０１４６】
当業者は、周知技術を使用してポリペプチドのアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸を容易に変異させることができる。例えば、公知の点変異導入法に従えば、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の塩基を変異させることができる。また、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の部位に対応するプライマーを設計して欠失変異体または付加変異体を作製することができる。さらに、本明細書中に記載される方法を用いれば、作製した変異体が所望の活性を有するか否かを容易に決定し得る。
【０１４７】
好ましい変異体は、保存的もしくは非保存的アミノ酸置換、欠失、または付加を有する。好ましくは、サイレント置換、付加、および欠失であり、特に好ましくは、保存的置換である。これらは、ｋ型Ｓ．ｍｕｔａｎｓ株のｒｇｐＦポリペプチド活性を変化しない。
【０１４８】
代表的に保存的置換と見られるのは、脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅの中での１つのアミノ酸の別のアミノ酸への置換；ヒドロキシル残基ＳｅｒおよびＴｈｒの置換、酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの置換、アミド残基ＡｓｎおよびＧｌｎの間の置換、塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇの置換、ならびに芳香族残基Ｐｈｅ、Ｔｙｒの間の置換である。
【０１４９】
上記に詳細に示されるように、どのアミノ酸の変化が表現型的にサイレントでありそうか（すなわち、機能に対して有意に有害な効果を有しそうにないか）に関するさらなるガイダンスは、Ｂｏｗｉｅ，Ｊ．Ｕ．ら「Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｅｓｓａｇｅ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ」，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１３０６−１３１０（１９９０）（本明細書中に参考として援用される）に見出され得る。
【０１５０】
別の局面において、本発明に係るポリペプチドは、融合タンパク質のような改変された形態で組換え発現され得る。例えば、付加的なアミノ酸、特に荷電性アミノ酸の領域が、宿主細胞内での、精製の間の、または精製に続く操作および保存の間の、安定性および持続性を改善するために、ポリペプチドのＮ末端に付加され得る。
【０１５１】
特定の局面において、本発明に係るｋ型Ｓ．ｍｕｔａｎｓ株のｒｇｐＦポリペプチドは、例えば、融合されたポリペプチドの精製を容易にするペプチドをコードする配列であるタグ標識（タグ配列またはマーカー配列）をＮ末端またはＣ末端へ付加され得る。このような配列は、ポリペプチドの最終調製の前に除去されてもよい。本発明のこの局面の特定の好ましい実施態様において、タグアミノ酸配列は、ヘキサ−ヒスチジンペプチド（例えば、ｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）において提供されるタグ）であり、他の中では、それらの多くは公的および／または商業的に入手可能である。例えば、Ｇｅｎｔｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８２１−８２４（１９８９）（本明細書中に参考として援用される）において記載されるように、ヘキサヒスチジンは、融合タンパク質の簡便な精製を提供する。「ＨＡ」タグは、インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質由来のエピトープに対応する精製のために有用な別のペプチドであり、それは、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ３７：７６７（１９８４）（本明細書中に参考として援用される）によって記載されている。他のそのような融合タンパク質は、ＮまたはＣ末端にてＦｃに融合される本実施形態に係るｋ型Ｓ．ｍｕｔａｎｓ株のｒｇｐＦポリペプチドまたはそのフラグメントを含む。
【０１５２】
本発明に係るｋ型Ｓ．ｍｕｔａｎｓ株のｒｇｐＦポリペプチドは、下記で詳述されるように組換え生成されても、化学合成されてもよい。
【０１５３】
組換え生成は、当該分野において周知の方法を使用して行なうことができ、例えば、以下に詳述されるようなベクターおよび細胞を用いて行なうことができる。
【０１５４】
合成ペプチドは、化学合成の公知の方法を使用して合成され得る。例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎは、４週間未満で調製されそして特徴付けられたＨＡ１ポリペプチドセグメントの単一アミノ酸改変体を示す１０〜２０ｍｇの２４８の異なる１３残基ペプチドのような多数のペプチドの合成のための簡単な方法を記載している。Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｒ．Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：５１３１−５１３５（１９８５）。この「Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ＳＭＰＳ）」プロセスは、さらにＨｏｕｇｈｔｅｎら（１９８６）の米国特許第４，６３１，２１１号に記載される。この手順において、種々のペプチドの固相合成のための個々の樹脂は、別々の溶媒透過性パケットに含まれ、固相法に関連する多くの同一の反復工程の最適な使用を可能にする。完全なマニュアル手順は、５００〜１０００以上の合成が同時に行われるのを可能にする（Ｈｏｕｇｈｔｅｎら、前出、５１３４）。これらの文献は、本明細書中に参考として援用される。
【０１５５】
１つの局面において、本発明は、本明細書中に記載のｋ型Ｓ．ｍｕｔａｎｓ株のｒｇｐＦポリペプチドのエピトープ保有部分のアミノ酸配列を有するポリペプチドに関する。本発明のｋ型Ｓ．ｍｕｔａｎｓ株のｒｇｐＦポリペプチドのエピトープ保有部分のアミノ酸配列を有するポリペプチドは、少なくとも６個、７個、８個、９個、１０個のアミノ酸を有するポリペプチドの部分を含むが、配列番号１ないし４の何れか１つに示される塩基配列によってコードされる本発明のｋ型Ｓ．ｍｕｔａｎｓ株のｒｇｐＦポリペプチドの全アミノ酸配列の長さまでの任意の長さ（全体を含む）のエピトープ保有部分ポリペプチドもまた含まれる。
【０１５６】
本発明のｋ型Ｓ．ｍｕｔａｎｓ株のｒｇｐＦポリペプチドのエピトープ部分は、当該分野で公知の方法により同定される。例えば、Ｇｅｙｓｅｎら（１９８４）は、酵素−結合免疫吸着アッセイにおける反応に十分に純粋な何百というペプチドを同時に固体支持体上に迅速に合成する手順を開示する。合成ペプチドの抗体との相互作用は、次いで、それらを支持体から除去することなく容易に検出される。この様式において、所望のタンパク質の免疫原性エピトープを保有するペプチドは、当業者により容易に同定され得る。例えば、口蹄疫ウイルスのコートタンパク質における免疫学的に重要なエピトープは、タンパク質の２１３のアミノ酸配列全体を覆う全ての２０８の可能なヘキサペプチドの重複セットの合成による７アミノ酸の解明によりＧｅｙｓｅｎらによって位置付けされた。次いで、全ての２０アミノ酸が順にエピトープ内の各位置で置換されたペプチドの完全な置換セットが合成され、そして抗体との反応のための特異性を与える特定のアミノ酸が決定された。従って、本発明のエピトープ保有ペプチドのペプチドアナログは、この方法により日常的に作製され得る。Ｇｅｙｓｅｎ（１９８７）の米国特許第４，７０８，７８１号は、所望のタンパク質の免疫原性エピトープを保有するペプチドを同定するこの方法をさらに記載している。
【０１５７】
「免疫原性エピトープ」は、タンパク質全体が免疫原である場合、抗体応答を誘発するタンパク質の一部として定義される。これらの免疫原性エピトープは、分子上の２、３の焦点に制限されると考えられている。一方では、抗体が結合し得るタンパク質分子の領域は、「抗原性エピトープ」と定義され得る。タンパク質の免疫原性エピトープの数は、一般には、抗原性エピトープの数よりも少ない。例えば、Ｇｅｙｓｅｎ，Ｈ．Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：３９９８−４００２（１９８４）を参照のこと。
【０１５８】
本発明の抗原性エピトープ保有ペプチドは、本発明のポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体を含む抗体を惹起するのに有用である。従って、抗原エピトープ保有ペプチドで免疫化されたドナーからの脾臓細胞の融合により得られるハイブリドーマの大部分は、一般に天然のタンパク質と反応性がある抗体を分泌する。抗原性エピトープ保有ペプチドにより惹起された抗体は、模倣タンパク質を検出するのに有用であり、そして異なるペプチドに対する抗体が、翻訳後プロセシングを受けるタンパク質前駆体の種々の領域の末路を追跡するために使用され得る。免疫沈降アッセイにおいて、短いペプチド（例えば、約９アミノ酸）でさえ、より長いペプチドに結合しそして置換し得ることが示されているので、ペプチドおよび抗ペプチド抗体は、模倣タンパク質についての種々の定性的または定量的アッセイ、例えば、競合的アッセイにおいて使用され得る。例えば、Ｗｉｌｓｏｎ，Ｉ．Ａ．ら、Ｃｅｌｌ ３７：７６７−７７８（１９８４）７７７を参照のこと。本発明の抗ペプチド抗体もまた、模倣タンパク質の精製（例えば、当該分野で周知の方法を使用して、吸着クロマトグラフィーにより）に有用である。
【０１５９】
上記のガイドラインに従って設計された本発明の抗原性エピトープ保有ペプチドは、好ましくは本発明のポリペプチドのアミノ酸配列内に含まれる少なくとも７、より好ましくは少なくとも９、そして最も好ましくは約１５〜約３０アミノ酸の間の配列を含む。しかし、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列の約３０〜約５０アミノ酸または全体までの任意の長さおよび全体を含む、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列のより大部分を含むペプチドまたはポリペプチドもまた、本発明のエピトープ保有ペプチドであると考えられ、そしてまた模倣タンパク質と反応する抗体を誘導するのに有用である。好ましくは、エピトープ保有ペプチドのアミノ酸配列は、水性溶媒中で実質的な溶解性を提供するように選択され（すなわち、その配列は、比較的親水性残基を含み、そして高度な疎水性配列は好ましくは回避される）；そしてプロリン残基を含む配列が特に好ましい。
【０１６０】
本発明のエピトープ保有ペプチドは、本発明のポリヌクレオチドを使用する組換え手段を含むペプチドを作製するための任意の従来の手段によって産生され得る。例えば、短いエピトープ保有アミノ酸配列は、組換え体産生および精製の間、ならびに抗ペプチド抗体を産生するための免疫化の間、キャリアとして作用するより大きなポリペプチドに融合され得る。エピトープ保有ペプチドはまた、化学合成の公知の方法を使用して合成され得る。
【０１６１】
本発明のエピトープ保有ペプチドは、当該分野に周知の方法によって抗体を誘導するために使用される。例えば、Ｃｈｏｗ，Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：９１０−９１４；およびＢｉｔｔｌｅ，Ｆ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２３４７−２３５４（１９８５）を参照のこと。一般には、動物は遊離ペプチドで免疫化され得る；しかし、抗ペプチド抗体力価はペプチドを高分子キャリア（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）または破傷風トキソイド）にカップリングすることにより追加免疫され得る。例えば、システインを含有するペプチドは、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）のようなリンカーを使用してキャリアにカップリングされ得、一方、他のペプチドは、グルタルアルデヒドのようなより一般的な連結剤を使用してキャリアにカップリングされ得る。ウサギ、ラット、およびマウスのような動物は、遊離またはキャリア−カップリングペプチドのいずれかで、例えば、約１００μｇのペプチドまたはキャリアタンパク質およびＦｒｅｕｎｄのアジュバントを含むエマルジョンの腹腔内および／または皮内注射により免疫化される。いくつかの追加免疫注射が、例えば、固体表面に吸着された遊離ペプチドを使用してＥＬＩＳＡアッセイにより検出され得る有用な力価の抗ペプチド抗体を提供するために、例えば、約２週間の間隔で必要とされ得る。免疫化動物からの血清における抗ペプチド抗体の力価は、抗ペプチド抗体の選択により、例えば、当該分野で周知の方法による固体支持体上のペプチドへの吸着および選択された抗体の溶出により増加され得る。
【０１６２】
（Ｃ）ベクターおよび細胞
本発明は、ｋ型Ｓ．ｍｕｔａｎｓ株のｒｇｐＦポリペプチドを生成するために使用されるベクターに関する。本発明に係るベクターは、インビトロ翻訳に用いるベクターであっても組換え発現に用いるベクターであってもよい。
【０１６３】
本発明はまた、本発明に係るｋ型Ｓ．ｍｕｔａｎｓ株のｒｇｐＦポリペプチドを組換え的に生成するための本発明に係るポリヌクレオチドを含む組換え構築物で形質転換された宿主細胞、および組換え技術によるｋ型Ｓ．ｍｕｔａｎｓ株のｒｇｐＦポリペプチドまたはそのフラグメントの産生方法に関する。
【０１６４】
組換え構築物は、感染、形質導入、トランスフェクション、エレクトロポレーション、および形質転換のような周知の技術を用いて宿主細胞に導入され得る。組換え構築物としてのベクターは、例えば、ファージベクター、プラスミドベクター、ウイルスベクター、またはレトロウイルスベクターであり得る。レトロウイルスベクターは、複製可能かまたは複製欠損であり得る。後者の場合、ウイルスの増殖は、一般的に、相補宿主細胞においてのみ生じる。
【０１６５】
発現させる目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、当該分野において周知の方法を用いて取得することができる。公知のタンパク質の部分配列は、所望の部位に対してプライマーを設計してＰＣＲ増幅することによって対応するポリヌクレオチドを取得した後、発現ベクターに挿入して細胞内で容易に得られる。
【０１６６】
目的の挿入ポリヌクレオチドに対するシス作用性制御領域を含有するベクターが好ましい。適切なトランス作用性因子は、宿主によって供給され得るか、相補ベクターによって供給され得るか、または宿主への導入の際にベクター自体によって供給され得る。
【０１６７】
特定の実施態様において、ベクターは、誘導性および／または細胞型特異的であり得る特異的な発現を提供するベクターが好ましい。このようなベクターの中で特に好ましいベクターは、温度および栄養添加物のような操作することが容易である環境因子によって誘導性のベクターである。
【０１６８】
本発明において有用な発現ベクターとしては、染色体ベクター、エピソームベクター、およびウイルス由来ベクター（例えば、細菌プラスミド、バクテリオファージ、酵母エピソーム、酵母染色体エレメント、ウイルス（例えば、バキュロウイルス、パポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、トリポックスウイルス、仮性狂犬病ウイルス、およびレトロウイルス）、ならびにそれらの組合せに由来するベクター（例えば、コスミドおよびファージミド）が挙げられる。
【０１６９】
ＤＮＡ挿入物は、適切なプロモーター（例えば、ファージλＰＬプロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、およびｔａｃプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーターおよび後期プロモーター、ならびにレトロウイルスＬＴＲのプロモーター）に作動可能に連結されるべきである。他の適切なプロモーターは、当業者に公知である。発現構築物は、さらに、転写開始、転写終結のための部位、および、転写領域中に翻訳のためのリボゾーム結合部位を含む。構築物によって発現される成熟転写物のコード部分は、翻訳されるべきポリペプチドの始めに転写開始コドンを含み、そして終わりに適切に位置される終止コドンを含む。
【０１７０】
発現ベクターは、好ましくは少なくとも１つの選択マーカーを含む。このようなマーカーとしては、真核生物細胞培養についてはジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性遺伝子、Ｅ．ｃｏｌｉおよび他の細菌における培養についてはテトラサイクリン耐性遺伝子またはアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。適切な宿主の代表的な例としては、細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ細胞、およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ細胞）；真菌細胞（例えば酵母細胞）；昆虫細胞（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２細胞およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｓｆ９細胞）；動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、およびＢｏｗｅｓ黒色腫細胞）；ならびに植物細胞が挙げられる。上記の宿主細胞のための適切な培養培地および条件は当分野で周知である。
【０１７１】
好ましい実施形態において、本発明に係るベクターは、細菌（特に、Ｅ．ｃｏｌｉ）において本発明に係るｋ型Ｓ．ｍｕｔａｎｓ株のｒｇｐＦポリペプチドを発現し得る。細菌における使用に好ましいベクターの中には、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、およびｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎから入手可能）；ｐＢＳベクター、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔベクター、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能）；ならびにｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能）が含まれる。
【０１７２】
本発明における使用に適した公知の細菌プロモーターの中には、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃＩおよびｌａｃＺプロモーター、Ｔ３プロモーターおよびＴ７プロモーター、ｇｐｔプロモーター、λＰＲプロモーターおよびλＰＬプロモーター、ならびにｔｒｐプロモーターが含まれる。適切な真核生物プロモーターとしては、ＣＭＶ前初期プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、初期ＳＶ４０プロモーターおよび後期ＳＶ４０プロモーター、レトロウイルスＬＴＲのプロモーター（例えば、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のプロモーター）、ならびにメタロチオネインプロモーター（例えば、マウスメタロチオネインＩプロモーター）が挙げられる。
【０１７３】
別の実施形態において、本発明に係るベクターは、高等真核生物細胞において本発明に係るｋ型Ｓ．ｍｕｔａｎｓ株のｒｇｐＦポリペプチドを発現し得る。高等真核生物細胞によるＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増大させ得る。エンハンサーは、所定の宿主細胞型におけるプロモーターの転写活性を増大するように働く、通常約１０〜３００ｂｐのＤＮＡのシス作用性エレメントである。エンハンサーの例としては、ＳＶ４０エンハンサー（これは、複製起点の後期側上の１００〜２７０ｂｐに位置される）、サイトメガロウイルスの初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側上のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。
【０１７４】
好ましい真核生物ベクターとしては、ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、およびｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能）；ならびにｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、およびｐＳＶＬ（Ｐｈｒｍａｃｉａから入手可能）が挙げられる。他の適切なベクターは、当業者に周知である。
【０１７５】
宿主細胞への構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染または他の方法によってもたらされ得る。このような方法は、Ｄａｖｉｓら、Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８６）（本明細書中に参考として援用される）のような多くの標準的研究室マニュアルに記載されている。
【０１７６】
高等真核生物によるＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増大させ得る。エンハンサーは、所定の宿主細胞型におけるプロモーターの転写活性を増大するように働く、通常約１０〜３００ｂｐのＤＮＡのシス作用性エレメントである。エンハンサーの例としては、ＳＶ４０エンハンサー（これは、複製起点の後期側上の１００〜２７０ｂｐに位置される）、サイトメガロウイルスの初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側上のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。
【０１７７】
翻訳されたタンパク質の小胞体の管腔内へか、周辺質空間内へか、または細胞外環境内への分泌のために、適切な分泌シグナルが、発現されるポリペプチド中に組み込まれ得る。シグナルは、ポリペプチドに対して内因性であり得るか、またはそれらは異種シグナルであり得る。
【０１７８】
従って、ポリペプチドは、融合タンパク質のような改変された形態で発現され得、そして分泌シグナルだけでなく、付加的な異種の機能的領域も含み得る。例えば、付加的なアミノ酸、特に荷電性アミノ酸の領域が、宿主細胞内での、精製の間の、または続く操作および保存の間の、安定性および持続性を改善するために、ポリペプチドのＮ末端に付加され得る。また、ペプチド部分が、精製を容易にするためにポリペプチドへ付加され得る。そのような領域は、ポリペプチドの最終調製の前に除去され得る。とりわけ、分泌または排出を生じるため、安定性を改善するため、および精製を容易にするためのペプチド部分のポリペプチドへの付加は、当分野でよく知られており、そして日常的な技術である。好ましい融合タンパク質は、タンパク質の可溶化に有用な免疫グロブリン由来の異種領域を含む。例えば、ＥＰ Ａ ０ ４６４ ５３３（また、カナダ対応出願２０４５８６９）は、別のヒトタンパク質またはその一部とともに免疫グロブリン分子における定常領域の種々の部分を含む融合タンパク質を開示する。多くの場合、融合タンパク質中のＦｃ部分は、治療および診断における使用に十分に有利であり、従って、例えば改善された薬物動態学的特性を生じる（ＥＰ Ａ ０２３２ ２６２）。一方、いくつかの使用について、融合タンパク質が、記載される有利な様式で、発現され、検出され、および精製された後にＦｃ部分が欠失され得ることが望ましい。これは、Ｆｃ部分が、治療および診断における使用の妨害であると判明する場合（例えば、融合タンパク質が免疫のための抗原として使用されるべき場合）である。薬物探索において、例えばｈＩＬ−５のようなヒトタンパク質は、ｈＩＬ−５のアンタゴニストを同定するための高処理能力スクリーニングアッセイの目的でＦｃ部分と融合されている。Ｄ．Ｂｅｎｎｅｔｔら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ Ｖｏｌ．８：５２−５８（１９９５）、およびＫ．Ｊｏｈａｎｓｏｎら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｖｏｌ．２７０，Ｎｏ．１６，９４５９−９４７１頁（１９９５）を参照のこと。
【０１７９】
ｋ型Ｓ．ｍｕｔａｎｓ株のｒｇｐＦポリペプチドは、周知の方法（例えば、硫安沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィー）によって組換え細胞培養物から回収され、そして精製され得る。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）が精製のために用いられる。
【０１８０】
このように、本発明に係るベクターは、少なくとも、本発明に係るポリヌクレオチドを含めばよいといえる。すなわち、発現ベクター以外のベクターも、本発明の技術的範囲に含まれる点に留意すべきである。
【０１８１】
また、本発明に係る細胞は、少なくとも、本発明に係るベクターを含めばよいといえる。すなわち、市販の細胞以外の初代培養細胞も、本発明の技術的範囲に含まれる点に留意すべきである。
【０１８２】
つまり、本発明の目的は、本発明に係るポリヌクレオチドを含有するベクターおよび当該ベクターを含有する細胞を提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載した個々のベクター種および細胞種、ならびにベクター作製方法および細胞導入方法に存するのではない。したがって、上記以外のベクター種および細胞種、ならびにベクター作製方法および細胞導入方法を用いて取得したベクターおよび細胞も本発明の範囲に属することに留意しなければならない。
【０１８３】
（Ｄ）細菌
本発明は、分離された血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株を提供する。好ましくは、本発明の血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株は、以下で詳述されるような血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株に特異的に結合する抗体を用いて、生物学的サンプルより分離される。好ましい血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株としては、血液分離株２株（ＴＷ２９５およびＴＷ８７１）、口腔分離株１５４株（ＦＴ１〜ＦＴ５１、ＳＵ１〜ＳＵ５１、およびＹＫ１〜ＹＫ５０、ならびにＡＴ１およびＹＴ１）が挙げられるがこれらに限定されない。用語「生物学的サンプル」は、個体、体液、細胞株、組織培養物、または血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株タンパク質もしくはそのＤＮＡもしくはｍＲＮＡを含む他の供給源から得られる、任意の生物学的サンプルが意図される。生物学的サンプルとしては、血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株タンパク質を含む体液（例えば、血液、唾液、歯垢、血清、血漿、尿、滑液および髄液）あるいは血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株タンパク質を発現する可能性のある組織供給源が挙げられる。本明細書中で使用される場合、用語「組織サンプル」は、組織供給源より得られた生物学的サンプルが意図される。哺乳動物から組織生検および体液を得るための方法は当該分野で周知である。生物学的サンプルがｍＲＮＡを含む場合、組織生検が好ましい供給源である。本明細書中で使用される場合、用語「サンプル」としては、上記生物学的サンプルおよび上記組織サンプル以外に、上記生物学的サンプルおよび上記組織サンプルより抽出したゲノムＤＮＡサンプルおよび／または総ＲＮＡサンプルも挙げられる。
【０１８４】
１つの局面において、本発明は、Ｓ．ｍｕｔａｎｓの血清型特異多糖抗原のグルコース側鎖の量が低下したＳ．ｍｕｔａｎｓ株を提供する。本明細書中で使用される場合、用語「Ｓ．ｍｕｔａｎｓの血清型ｃ、ｅまたはｆの株に特異的な多糖類のグルコース側鎖の量が低下した」は、Ｓ．ｍｕｔａｎｓの血清型ｃ、ｅまたはｆの株に特異的な既知の抗体を用いて検出することができないことが意図される。従って、本明細書を参照して、この用語は、Ｓ．ｍｕｔａｎｓの血清型ｃ、ｅまたはｆの株に特異的な多糖抗原のグルコース側鎖が全くないことを意味するのではなく、Ｓ．ｍｕｔａｎｓの血清型ｃ、ｅまたはｆの株に特異的な既知の抗体に対する抗原性が著しく低下している状態であるということを意図していることを、当業者は容易に理解する。
【０１８５】
（Ｅ）抗体
本発明は、Ｓ．ｍｕｔａｎｓの血清型ｃ、ｅ、もしくはｆの株に特異的な多糖抗原のグルコース側鎖の量が低下した血清型の株に特異的に結合する抗体を提供する。好ましくは、本発明は、血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株に特異的に結合する抗体を提供する。本明細書中で使用される場合、用語「抗体」は、免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭおよびこれらのＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｃフラグメント）を意味し、例としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単鎖抗体、抗イディオタイプ抗体およびヒト化抗体が挙げられるがこれらに限定されない。本発明の抗体は、従来の免疫方法では取得し得なかったが、免疫方法に創意工夫を重ねることによって取得された。さらに、本発明の抗体は、ｋ型以外の血清型を有する既知のＳ．ｍｕｔａｎｓ株を公知のグルコース側鎖欠失方法を用いて作製した変異株を用いて作製される。さらに、本発明の抗体は、本発明のポリペプチドを抗原に用いて作製される。本発明の抗体は、血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株の検出および／または診断に有用であり得る。
【０１８６】
本明細書中で使用される場合、用語「血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株に対する抗体」は、血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株抗原に特異的に結合し得る完全な分子および抗体フラグメント（例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメント）を含むことを意味する。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントは完全な抗体のＦｃ部分を欠いており、循環によってさらに迅速に除去され、そして完全な抗体の非特異的組織結合をほとんど有し得ない（Ｗａｈｌら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２４：３１６−３２５（１９８３））。従って、これらのフラグメントもまた好ましい。
【０１８７】
あるいは、血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株抗原に結合し得るさらなる抗体が、抗イディオタイプ抗体の使用を通じて二工程手順で産生され得る。このような方法は、抗体それ自体が抗原であるという事実を使用し、従って、二次抗体に結合する抗体を得ることが可能である。この方法に従って、血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株特異的抗体は、動物（好ましくは、マウス）を免疫するために使用される。次いで、このような動物の脾細胞はハイブリドーマ細胞を産生するために使用され、そしてハイブリドーマ細胞は、血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株特異的抗体に結合する能力が血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株抗原によってブロックされ得る抗体を産生するクローンを同定するためにスクリーニングされる。このような抗体は、血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株特異的抗体に対する抗イディオタイプ抗体を含み、そしてさらなる血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株特異的抗体の形成を誘導するために動物を免疫するために使用され得る。
【０１８８】
ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２ならびに本発明の抗体の他のフラグメントは、本明細書中で開示される方法に従って使用され得ることが、明らかである。このようなフラグメントは、代表的には、パパイン（Ｆａｂフラグメントを生じる）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを生じる）のような酵素を使用するタンパク質分解による切断によって産生される。あるいは、血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株結合フラグメントは、組換えＤＮＡ技術の適用または合成化学によって産生され得る。
【０１８９】
ヒトにおける診断のために、インビボでのイメージングを用いて、上昇レベルの血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株を検出する場合、「ヒト化」キメラモノクローナル抗体を使用することが好ましくあり得る。このような抗体は、上記のモノクローナル抗体を生成するハイブリドーマ細胞由来の遺伝構築物を用いて生成され得る。キメラ抗体を生成するための方法は、当該分野で公知である。総説については、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２（１９８５）；Ｏｉら、Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４（１９８６）；Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら、ＥＰ １７１４９６；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、ＥＰ １７３４９４；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、ＷＯ ８６０１５３３；Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、ＷＯ ８７０２６７１；Ｂｏｕｌｉａｎｎｅら、Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６４３（１９８４）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３１４：２６８（１９８５）を参照のこと。
【０１９０】
このように、本発明に係る抗体は、少なくとも、本発明に係るｋ型Ｓ．ｍｕｔａｎｓ株を認識する抗体フラグメント（例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメント）を備えていればよいといえる。すなわち、本発明に係るｋ型Ｓ．ｍｕｔａｎｓ株を認識する抗体フラグメントと、異なる抗体分子のＦｃフラグメントとからなる免疫グロブリンも本発明に含まれることに留意すべきである。
【０１９１】
つまり、本発明の目的は、本発明に係るｋ型Ｓ．ｍｕｔａｎｓ株を認識する抗体を提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載した個々の免疫グロブリンの種類（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧまたはＩｇＭ）、キメラ抗体作製方法、ペプチド抗原作製方法等に存するのではない。したがって、上記各方法以外によって取得される抗体も本発明の範囲に属することに留意しなければならない。
【０１９２】
（２）血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株の検出法および診断法
本発明にかかるＳ．ｍｕｔａｎｓの血清型検出法および診断法は、被験体に存在し得る血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株を検出および診断するものである。
【０１９３】
感染因子、または、代謝産物、核酸、およびタンパク質を含む病気の指標となる分子の検出は、医学的疾患の診断および治療、ならびに研究における基本的な要素である。多くの方法論が現在検出に使用されている。これらの方法論は、一般に、病気を引き起こす因子の成分をコードする遺伝物質のような、核酸に対する診断アッセイ、および病気を引き起こす因子または病気の副産物のいずれかの成分であるタンパク質に対する抗体をベースにした診断アッセイに分けられる。
【０１９４】
本発明は、生物学的サンプルにおいて、特に被験体から得られた組織または他の細胞または体液において、血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株に特異的な多糖抗原の生合成に関与する酵素をコードするポリヌクレオチドを検出することによって、血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株関連障害を診断する方法を提供する。
【０１９５】
（Ａ）核酸に対する検出法および診断法
核酸に対するアッセイは、ポリヌクレオチド（核酸分子）の存在を検出するための放射性標識プローブを用いるノーザンブロットハイブリダイゼーションのような単純な方法から、ハイブリダイゼーション技術による配列の検出に使用され得るところまで非常に少量の特定の核酸配列を増幅するためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の使用までの範囲にわたる。ヌクレオチドプローブは、市販の染料、または酵素、蛍光、化学発光、あるいは放射性の標識を用いて標識され得る。これらのプローブは、ハイブリダイゼーションにより細胞中または組織試料中の遺伝子または関連配列（そこではその遺伝子は通常の成分である）の発現を検出するために、および生物の感染から生じる疾患を有すると疑われるヒトからの血清または組織試料をスクリーニングするために使用され得る。プライマーがまた、逆転写酵素、またはＤＮＡポリメラーゼおよびポリメラーゼ連鎖反応を用いて調製され得、組織または液体中に非常に少量で存在するポリヌクレオチドの検出のために使用され得る。
【０１９６】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、特に、クローニング、遺伝子発現の分析、ＤＮＡ配列決定、遺伝的マッピング、薬物の発見などにおいて適用される、非常に重要な手段である。例えば、Ｉｎｎｉｓら、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ａ ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ（１９９０）；および米国特許第４，６８３，１９５，４，６８３号を参照のこと。
【０１９７】
本発明は、配列番号１ないし４に示される塩基配列の少なくとも１２個連続する塩基配列またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてＰＣＲ反応を行う工程を包含する、血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株を検出する方法を提供する。ＰＣＲ試薬および方法論は、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，７６１ Ｍａｉｎ Ａｖｅ．，Ｎｏｒｗａｌｋ，Ｃｏｎｎ．０６８５０；またはＲｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１１４５ Ａｔｌａｎｔｉｃ Ａｖｅ．，Ｓｕｉｔｅ １００，Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ ９４５０１から入手可能である。好ましいＰＣＲ反応は、２０ｍｌのＰＣＲ反応液（２０ｎｇ／μｌのゲノムＤＮＡを５μｌ、ｄＮＴＰ混合物 ２μｌ、１０×ＰＣＲ緩衝液 ２μｌ、順方向プライマー（２０ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ、逆方向プライマー（２０ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ、ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ ０．１μｌ、ＭｉｌｌｉＱ水 ８．９μｌを含む）を、９４℃で５分間処理した後、９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で３０秒間を３０サイクル行い、次いで７２℃で７分間処理して行うが、これに限られない。本明細書中で使用される場合、用語「少なくとも１２個」は、１２、１３、１４、１５、またはそれ以上の整数をいう。本発明に従うと、被験体から得られたサンプル中に血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株が存在するか否かを、有効かつ効率的に判定し得る。
【０１９８】
伝統的には、ＰＣＲおよびハイブリダイゼーションプロセスは、別の作業として行われている。しかし、ＰＣＲおよびハイブリダイゼーションプロセスを組み合わせることによって得られる利点がいくつかある：（ｉ）単一の試薬添加工程が必要とされるのみであり、これにより、反応チューブを開ける必要なく、この組み合わされた反応を進行させることが可能であり、これにより、サンプルの混同およびサンプルの汚染の機会を減少させる；（ｉｉ）必要とされる試薬がより少量である；（ｉｉｉ）必要とされる試薬添加工程がより少なく、自動化をより容易にする；そして（ｉｖ）ｉｎ ｓｉｔｕの方法の場合、熱循環の間に細胞サンプルの完全性を保護するのに使用されるサンプル封じ込め（ｃｏｎｔａｉｎｍｅｎｔ）アセンブリを分解する必要がない。単一の反応において、ＰＣＲをハイブリダイゼーションプロセスと組み合わせた、１つの存在する方法は、「Ｔａｑｍａｎ」として知られる技術である。例えば、Ｈｏｌｌａｎｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：７２７６−７２８０（１９９１）を参照のこと。
【０１９９】
インサイチュでのＰＣＲは、特定の増幅された核酸が、標的核酸配列を元々含んでいた細胞または下位の細胞構造内に実質的に含まれるように、固定された細胞において実行されるＰＣＲ増幅をいう。細胞は、水性懸濁液中にあっても、または組織サンプルの部分（例えば、組織化学的切片または細胞化学的スメア）であってもよい。本明細書中で使用される場合、用語「組織化学的切片」は、凍結または化学的に固定され、ワックスまたはプラスチック中に包埋されることにより固められ、薄板（代表的には、数ミクロンの厚さ）にスライスされ、そして固体支持体（例えば、顕微鏡スライド）に付着された生物学的組織の固体サンプルをいい、そして用語「細胞化学的スメア」は、化学的に固定されそして顕微鏡スライドに付着された細胞（例えば、血球）の懸濁物をいう。好ましくは、細胞は、プロテイナーゼ消化、界面活性剤または有機溶媒を用いる液体抽出、または透過化（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）法のような他のものによって、ＰＣＲ試薬に対して透過性にされている。
【０２００】
本明細書中で使用する場合、用語「固定された細胞」は、溶媒変化、温度変化、機械的ストレス、または乾燥による破裂に対して細胞構造（特に、膜）を強化するために化学的に処理された生物学的細胞のサンプルをいう。細胞は、懸濁物中に固定されても、または組織サンプルの部分として固定されても、いずれでもよい。細胞固定液は、一般に、細胞構造のタンパク質構成要素を、最も一般的には、タンパク質アミノ基と反応することによって架橋する化学薬品である。好ましい固定液には、緩衝化ホルマリン、９５％エタノール、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、およびグルタルアルデヒドが含まれる。固定された細胞の透過性は、プロテイナーゼ、または界面活性剤、または膜脂質を溶解する有機溶媒での処理により増加され得る。
【０２０１】
本発明は、配列番号１ないし４に示される塩基配列の少なくとも１２個連続する塩基配列またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドをプローブとして用いてハイブリダイゼーション反応を行う工程をさらに包含する血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株を検出する方法を提供する。本発明に従うと、被験体から得られたサンプル中に存在するＳ．ｍｕｔａｎｓ株を、有効かつ効率的に判定し得る。
【０２０２】
本発明のオリゴヌクレオチドは、染色体とのインサイチュハイブリダイゼーションによって遺伝子マッピングするため、および例えばノーザンブロット分析によってヒト組織中の血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株の発現を検出するためのプローブとして有用である。以下に詳細に記載されるように、特定の組織における血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株遺伝子発現の変化を検出することは、特定の疾患および／または障害を提示し得る。
【０２０３】
好ましい実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、標識される。適切な標識としては、例えば、基質との反応による過酸化水素の生成を触媒するオキシダーゼ群由来の酵素が挙げられる。グルコースオキシダーゼは、それが良好な安定性を有し、そしてその基質（グルコース）が容易に入手できるために、特に好ましい。オキシダーゼ標識の活性は、酵素−標識抗体／基質反応によって形成される過酸化水素の濃度を測定することによってアッセイされ得る。酵素に加えて、他の適切な標識として、放射性同位元素（例えば、ヨウ素（１２５Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、イオウ（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１２Ｉｎ）、およびテクネチウム（９９ｍＴｃ））、ならびに蛍光標識（例えば、フルオレセインおよびローダミン）ならびにビオチンが挙げられる。
【０２０４】
（Ｂ）タンパク質に対する検出法および診断法
タンパク質に対するアッセイは、さらに、分子（通常抗体）と、検出されるタンパク質との結合反応、または、酵素の活性化をもたらし、検出可能な色の変化を生じる基質を開裂し得る、酵素と酵素に結合する標的された分子間の反応を含む方法に分けられる。多くの結合アッセイは、染料、酵素または放射性または蛍光標識を含み、検出を増強する。タンパク質に対する抗体は、患者、免疫化動物、または抗原特異的モノクローナル細胞株から得られ得る。これらの抗体アッセイは、サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイ、ウエスタンブロット、放射性イムノアッセイ、および免疫拡散アッセイのようなアッセイを包含する。その他のアッセイは、分子の固定化および検出のためにアビジンおよびビオチンのような分子を用いる。これらの試薬を調製する技術およびそれを使用する方法は、当業者に公知である。
【０２０５】
本発明は、ストレプトコッカス ミュータンスの血清型ｃ、ｅ、もしくはｆの株に特異的な多糖類のグルコース側鎖の量が低下した血清型の株に特異的に結合する抗体を用いて免疫反応を行う工程を包含する血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株を検出する方法を提供する。本明細書中で使用される場合、用語「免疫反応」としては、サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイ、ウエスタンブロット、放射性イムノアッセイ、および免疫拡散アッセイのようなアッセイが挙げられるがこれらに限定されない。本発明に従うと、被験体から得られたサンプル中に血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株が存在するか否かを、有効かつ効率的に判定し得る。
【０２０６】
上記のように、本発明に従うと、血中に侵入した際に、多型核白血球による食作用を受けにくいＳ．ｍｕｔａｎｓ株を保有するか否かを判定し得る。さらに、他の主要な原因菌の同定法と組み合わせることによって、感染性心内膜炎予防の対象者を減少させ、抗生物質の使用量を低下させ、抗生物質の使用による耐性菌出現を抑制することが可能である。
【０２０７】
本発明はさらに、本明細書中に記載される血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株に特異的に結合する抗体を用いる血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株の診断方法を提供する。抗体を使用するアッセイ方法としては、サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイ、ウエスタンイムノブロット、放射性イムノアッセイ、および免疫拡散アッセイのようなアッセイが挙げられる。その他のアッセイは、分子の固定化および検出のためにアビジンおよびビオチンのような分子を用いる。これらの試薬を調製する技術およびそれを使用する方法は、当業者に公知である。
【０２０８】
生物学的サンプル中の血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株タンパク質レベルのアッセイは、任意の当該分野で公知の方法を使用して行われ得る。抗体に基づく技術が、生物学的サンプル中の血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株タンパク質レベルをアッセイするために好ましい。例えば、組織中での血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株タンパク質の発現は、ウェスタンブロットアッセイまたはドットブロットアッセイを含む、伝統的な免疫組織学的方法で研究され得る。これらの場合、特異的認識は一次抗体（ポリクローナルまたはモノクローナル）によって提供されるが、二次検出系は、蛍光、酵素、または他の結合された二次抗体を利用し得る。結果として、病理学試験のための組織切片の免疫組織学的染色が得られる。
【０２０９】
血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株タンパク質レベルを検出するために有用な他の抗体に基づく方法は、イムノアッセイ（例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ））を含む。例えば、血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株特異的モノクローナル抗体は、血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株タンパク質を検出および定量するための、免疫吸着剤としておよび酵素標識プローブとしての両方に使用され得る。サンプル中に存在する血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株タンパク質の量は、直線回帰コンピューターアルゴリズムを使用して、標準的な調製物中に存在する量との比較によって算出され得る。抗原を検出するためのこのようなＥＬＩＳＡは、Ｉａｃｏｂｅｌｌｉら、Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ １１：１９−３０（１９８８）に記載されている。別のＥＬＩＳＡアッセイにおいては、２つの異なる特異的なモノクローナル抗体が、体液中の血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株タンパク質を検出するために使用され得る。このアッセイにおいて、一方の抗体が免疫吸着剤として使用され、そして他方が酵素標識プローブとして使用される。
【０２１０】
適切な酵素標識は、例えば、基質との反応による過酸化水素の生成を触媒するオキシダーゼ群由来のものを含む。グルコースオキシダーゼは、それが良好な安定性を有し、そしてその基質（グルコース）が容易に入手できるために、特に好ましい。オキシダーゼ標識の活性は、酵素−標識抗体／基質反応によって形成される過酸化水素の濃度を測定することによってアッセイされ得る。酵素に加えて、他の適切な標識として、放射性同位元素（例えば、ヨウ素（１２５Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、イオウ（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１２Ｉｎ）、およびテクネチウム（９９ｍＴｃ））、ならびに蛍光標識（例えば、フルオレセインおよびローダミン）ならびにビオチンが挙げられる。
【０２１１】
個体から得られる生物学的サンプル中の血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株レベルをアッセイすることに加えて、血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株はまた、画像解析によってインビボで検出され得る。血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株のインビボでの画像解析のための抗体標識またはマーカーとして、Ｘ線撮影法、ＮＭＲ、またはＥＳＲによって検出可能なものが挙げられる。Ｘ線撮影法については、適切な標識として、検出可能な放射線を放射するが、被検体に対して明らかには有害ではない、バリウムまたはセシウムのような放射性同位元素が挙げられる。ＮＭＲおよびＥＳＲのための適切なマーカーとして、関連のハイブリドーマの栄養分の標識によって抗体中に取り込まれ得る、重水素のような検出可能な特徴的な回転を有するものが挙げられる。
【０２１２】
放射性同位元素（例えば、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ、９９ｍＴｃ）、放射性不透過体（ｒａｄｉｏ−ｏｐａｑｕｅ）基質、または核磁気共鳴によって検出可能な物質のような適切な検出可能な画像解析部分で標識されている、血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株特異的抗体または抗体フラグメントが、障害について試験される哺乳動物中に（例えば、非経口的、皮下、または静脈内）導入される。被検体の大きさおよび使用される画像解析システムによって、診断用の画像を生じるために必要とされる画像解析部分の量が決定されることが、当該分野で理解される。放射性同位元素部分の場合、ヒト被検体については、注射される放射活性の量は、通常約５〜２０ミリキュリーの範囲の９９ｍＴｃである。次いで、標識抗体または抗体フラグメントは、血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株を含む細胞の位置に優先的に蓄積する。インビボでの腫瘍画像解析は、Ｓ．Ｗ．Ｂｕｒｃｈｉｅｌら、「Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ」（Ｔｕｍｅｒ Ｉｍａｇｉｎｇ第１３章：Ｔｈｅ Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，Ｂｕｒｃｈｉｅｌ，Ｓ．Ｗ．およびＲｈｏｄｅｓ，Ｂ．Ａ．編、Ｍａｓｓｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｉｎｃ．（１９８２））に記載されている。
【０２１３】
本発明の血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株特異的抗体にさらに適切な標識は、以下に提供される。適切な酵素標識の例としては、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、スタフィロコッカスヌクレアーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、α−グリセロールリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ、およびアセチルコリンエステラーゼが挙げられる。
【０２１４】
適切な放射性同位体標識の例としては、３Ｈ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３２Ｐ、３５Ｓ、１４Ｃ、５１Ｃｒ、５７Ｔｏ、５８Ｃｏ、５９Ｆｅ、７５Ｓｅ、１５２Ｅｕ、９０Ｙ、６７Ｃｕ、２１７Ｃｉ、２１１Ａｔ、２１２Ｐｂ、４７Ｓｃ、１０９Ｐｄなどが挙げられる。１１１Ｉｎは、インビボでのイメージングが用いられる場合に好ましい同位体である。なぜなら、これは、１２５Ｉまたは１３１Ｉで標識したモノクローナル抗体の肝臓による脱ハロゲン化の問題を回避するからである。さらに、この放射性核種は、イメージングのためにより好ましいγ放出エネルギーを有する（Ｐｅｒｋｉｎｓら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．１０：２９６−３０１（１９８５）；Ｃａｒａｓｑｕｉｌｌｏら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２８：２８１−２８７（１９８７））。例えば、１−（Ｐ−イソチオシアネートベンジル）−ＤＰＴＡを用いてモノクローナル抗体にカップリングした１１１Ｉｎは、非腫瘍性組織（特に肝臓）における取り込みをほとんど示さなかった。それゆえ、腫瘍局在化の特異性を増強する（Ｅｓｔｅｂａｎら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２８：８６１−８７０（１９８７））。
【０２１５】
適切な非放射性同位体標識の例としては、１５７Ｇｄ、５５Ｍｎ、１６２Ｄｙ、５２Ｔｒ、および５６Ｆｅが挙げられる。
【０２１６】
適切な蛍光標識の例としては、１５２Ｅｕ標識、フルオレセイン標識、イソチオシアネート標識、ローダミン標識、フィコエリトリン標識、フィコシアニン標識、アロフィコシアニン標識、ｏ−フタルアルデヒド標識、およびフルオレサミン標識が挙げられる。
【０２１７】
適切な毒素標識の例としては、ジフテリア毒素、リシン、およびコレラ毒素が挙げられる。
【０２１８】
化学発光標識の例としては、ルミナール標識、イソルミナール標識、芳香族アクリジニウムエステル標識、イミダゾール標識、アクリジニウム塩標識、シュウ酸エステル標識、ルシフェリン標識、ルシフェラーゼ標識、およびエクオリン標識が挙げられる。
【０２１９】
核磁気共鳴コントラスト剤の例としては、Ｇｄ、Ｍｎ、およびＦｅのような重金属原子核が挙げられる。
【０２２０】
上記の標識を抗体に結合するための代表的な技術は、Ｋｅｎｎｅｄｙら（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ ７０：１−３１（１９７６））およびＳｃｈｕｒｓら（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ ８１：１−４０（１９７７））により提供される。後者において言及されるカップリング技術は、グルタルアルデヒド方法、過ヨウ素酸方法、ジマレイミド方法、ｍ−マレイミドベンジル−Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミドエステル方法であり、これらの方法は全て本明細書中に参考として援用される。
【０２２１】
（Ｃ）血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株のスクリーニング
本発明は、生物学的サンプルから血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株をスクリーニングする方法を提供する。１つの局面において、本発明は、配列番号１ないし４に示される塩基配列を含みかつＳ．ｍｕｔａｎｓの血清型特異多糖抗原のグルコース側鎖の量が低下した血清型の株に特異的な塩基配列またはその相補配列からなるポリヌクレオチドまたはそのフラグメントを用いて、Ｓ．ｍｕｔａｎｓの血清型特異多糖抗原のグルコース側鎖の量が低下した血清型の株をスクリーニングする方法を提供する。好ましい実施形態において、上記Ｓ．ｍｕｔａｎｓの血清型特異多糖抗原のグルコース側鎖の量が低下した血清型の株は、血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株である。さらに好ましい実施形態において、本発明のスクリーニング方法は、本発明の抗体を用いてＳ．ｍｕｔａｎｓ株の血清型を確認する工程をさらに包含する。
【０２２２】
別の局面において、本発明は、Ｓ．ｍｕｔａｎｓの血清型特異多糖抗原のグルコース側鎖の量が低下した血清型の株に特異的に結合する抗体を用いて、Ｓ．ｍｕｔａｎｓの血清型特異多糖抗原のグルコース側鎖の量が低下した血清型の株をスクリーニングする方法を提供する。好ましい実施形態において、上記Ｓ．ｍｕｔａｎｓの血清型特異多糖抗原のグルコース側鎖の量が低下した血清型の株は、血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株である。さらに好ましい実施形態において、本発明のスクリーニング方法は、本発明のポリヌクレオチドまたはそのフラグメントを用いてＳ．ｍｕｔａｎｓ株の血清型を確認する工程をさらに包含する。
【０２２３】
本発明はさらに、上記のスクリーニング方法を用いて同定された、Ｓ．ｍｕｔａｎｓの血清型特異多糖抗原のグルコース側鎖の量が低下した血清型の株を提供する。好ましい実施形態において、上記Ｓ．ｍｕｔａｎｓの血清型特異多糖抗原のグルコース側鎖の量が低下した血清型の株は、血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株である。さらに好ましい実施形態において、上記血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株は、ＴＷ２９５、ＴＷ８７１、ＦＴ１〜ＦＴ５１、ＳＵ１〜ＳＵ５１、ＹＫ１〜ＹＫ５０、ＦＴ１ＧＤ、ＹＫ１Ｒ、ＡＴ１およびＹＴ１が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２２４】
（３）血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株の検出キットおよび診断キット
本発明にかかるＳ．ｍｕｔａｎｓの血清型判定キットは、判定対象となるＳ．ｍｕｔａｎｓ株が上記ｋ型であるか否かを判定するものである。
【０２２５】
本発明は、配列番号１ないし４に示される塩基配列の少なくとも１２個連続する塩基配列またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドを備える、血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株を検出するためのキットを提供する。好ましくは、本発明のキットは、ｃ型、ｅ型またはｆ型のＳ．ｍｕｔａｎｓ株に特異的に結合するオリゴヌクレオチドをさらに備える。さらに好ましくは、上記オリゴヌクレオチドは標識されている。本発明に従えば、患者が血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株を保有するか否かを簡便に同定し得る。特に、これまで検出限界以下であった症例において血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株を検出し得る。
【０２２６】
１つの局面において、本発明のキットは、上記オリゴヌクレオチドがＰＣＲプライマーである。好ましい実施形態において、本発明のキットは、ＰＣＲ反応に用いるための試薬をさらに含む。
【０２２７】
別の局面において、本発明のキットは、上記オリゴヌクレオチドがハイブリダイゼーションプローブである。好ましい実施形態において、本発明のキットは、ハイブリダイゼーション反応に用いるための試薬をさらに含む。
【０２２８】
一実施形態において、本発明のキットは、配列番号９に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを備えることを特徴とする。本実施形態に係るキットは、配列番号８に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをさらに備えることが好ましく、配列番号１０に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをさらに備えることがなお好ましい。
【０２２９】
本発明はさらに、血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株の多糖抗原に特異的に結合する抗体を備える、血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株を検出するためのキットを提供する。好ましくは、上記オリゴヌクレオチドは標識されている。本発明に従えば、患者が血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株を保有するか否かを簡便に同定し得る。特に、これまで検出限界以下であった症例において血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株を検出し得る。
【０２３０】
（４）血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株の検出器具および診断器具
本発明に係る細菌検出器具は、サンプル中の細菌を検出・同定するための器具であって、対象となる細菌が属する種または属に特異的な塩基配列に基づくオリゴヌクレオチドが基板表面に固定化されており、当該オリゴヌクレオチドとサンプルに由来する核酸とのハイブリダイゼーションによりサンプル中の細菌を検出・同定するものである。血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株の検出に用いる場合、上記オリゴヌクレオチドは、血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株に特異的な多糖抗原の生合成に関与する酵素をコードするポリヌクレオチドの塩基配列の少なくとも１２個連続する塩基配列またはその相補配列を含む。さらに他種の細菌を網羅的に検査する場合は、当該他種の細菌（複数であってもよい）に特異的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドも基板上に固定化することが好ましい。このように、複数種の細菌を含むサンプルを使用するアッセイに供することによって、血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株がどのような細菌種と共存する傾向があるかを知ることができる。
【０２３１】
（Ａ）基板
本発明に係る細菌検出器具に用いる基板の材質としては、オリゴヌクレオチドを安定して固定化することができるものであればよい。例えば、ポリカーボネートやプラスティックなどの合成樹脂、ガラス等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。基板の形態も特に限定されるものではないが、例えば、板状、フィルム状等の基板を好適に用いることができる。
【０２３２】
〔基板表面に固定化されるオリゴヌクレオチド〕
本発明に係る細菌検出器具の基板表面に固定化されるオリゴヌクレオチドは、検出対象細菌が属する種または属に特異的な塩基配列に基づくオリゴヌクレオチドであればよい。当該オリゴヌクレオチドとサンプル由来の核酸との間にハイブリダイゼーションが成立することにより、サンプル中に含まれている目的の種または属に属する細菌を検出することが可能となる。なお、上記検出対象細菌が属する種または属に特異的な塩基配列に基づくオリゴヌクレオチドを、以下適宜「キャプチャーオリゴ」と称する。
【０２３３】
上記特異的な塩基配列は、検出対象細菌のゲノムの塩基配列から属または種特異的な塩基配列を見出せばよいが、検出対象細菌のリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列から見出すことが好ましい。なかでも細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子は属または種特異的な塩基配列を多く有していることが知られており、１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応するＤＮＡ配列中から属または種特異的な塩基配列を見出すことが特に好ましい。リボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬ、ＤＤＢＪ等のデータベース等から入手することができる。
【０２３４】
キャプチャーオリゴは上記属または種特異的な塩基配列に基づいて設計すればよい。したがって、上記属または種特異的な塩基配列そのものであってもよいし、検出対象細菌から調製した核酸と特異的なハイブリダイゼーションが成立する限りにおいて、変異が含まれていてもよい。変異の位置は特に限定されるものではない。
【０２３５】
キャプチャーオリゴの長さ（塩基数）は特に限定されるものではないが、短すぎるとハイブリダイゼーションの検出が困難になり、長すぎると非特異的ハイブリダイゼーションを許容してしまう。発明者らは、キャプチャーオリゴの長さの最適化について検討を重ね、標準的な長さを１２〜５０塩基長とした。好ましくは、１２〜４０塩基長、より好ましくは１２〜３０塩基長、さらにより好ましくは、１３〜２２塩基長であるが、これらに限定されない。塩基長は主として配列特性（特定の塩基の含有率，同一塩基のリピート）に依存するものであり、結合性の良いものは短鎖でも特異的ハイブリダイゼーションが可能であることが、発明者らにより確認されている。
【０２３６】
キャプチャーオリゴが、サンプル由来の核酸とのハイブリダイゼーションを妨害するヘアピン構造、ループ構造、またはそれ以外の立体構造を持つ場合、キャプチャーオリゴを構成する１またはそれ以上のヌクレオチドをイノシンまたはいずれのヌクレオチドとも対合しない核酸に置換することにより、その立体構造を解除することができる。
【０２３７】
キャプチャーオリゴの合成法は特に限定されるものではなく、公知の方法（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）に記載の方法等）により合成すればよい。一般的には、市販のＤＮＡ合成機を用いて化学合成することができる。
【０２３８】
本発明に係る細菌検出器具において、上記検出対象細菌が属する種または属に特異的な塩基配列に基づくオリゴヌクレオチドのみではなく、それらに加えて、いわゆるコントロール・キャプチャーオリゴを基板表面に固定化することが好ましい。コントロール・キャプチャーオリゴには、陽性コントロール・キャプチャーオリゴおよび陰性コントロール・キャプチャーオリゴが含まれる。陽性コントロール・キャプチャーオリゴは、後述するプローブ調製工程において増幅反応がうまくいっているかどうかを判定するために用いるものである。陰性コントロール・キャプチャーオリゴは、非特異的ハイブリダイゼーションが生じていないこと、すなわち擬陽性のハイブリダイゼーションシグナルが生じていないことを確認するために用いるものである。これらの陽性コントロール・キャプチャーオリゴおよび陰性コントロール・キャプチャーオリゴが基板表面に固定化された細菌検出器具も本発明に含まれる。
【０２３９】
陽性コントロール・キャプチャーオリゴは検出対象細菌から調製するプローブに含まれる塩基配列に基づいて設計されるものであればよい。また、複数の検出対象細菌を同時に同一の細菌検出器具を用いて検出する場合には、各検出対象細菌について陽性コントロール・キャプチャーオリゴを設計してもよいが、複数の検出対象細菌から調製するプローブに共通する塩基配列に基づいて設計してもよい。すべての検出対象細菌から調製するプローブに共通する塩基配列がない場合は、いくつかのグループごとに陽性コントロール・キャプチャーオリゴを設計してもよい。あるいは、プライマー配列部分が同じで、対象となる細菌の配列とは異なる人工的な配列を設計し、この配列の一部を陽性コントロール・キャプチャーオリゴとすることもできる。上記人工的な配列を鋳型としてプローブを調製し（本明細書では、このようなプローブをコントロールプローブと称する。）、サンプルから調製したプローブに添加することにより、ハイブリダイゼーションの特異性を検証することが可能となる。なお、上記プローブについては後述する。
【０２４０】
陰性コントロール・キャプチャーオリゴは、陽性コントロール・キャプチャーオリゴの塩基配列において、１塩基以上であり、かつ、当該配列の有する塩基数の２０％未満の範囲内で人為的な塩基の置換を含む塩基配列を有するように設計することが好ましい。塩基置換を行う塩基数は、ハイブリダイゼーションの条件との関係で決定され、検出対象細菌由来のプローブがハイブリダイゼーションを生じないような塩基数を選択すればよい。
【０２４１】
検出対象細菌は特に限定されるものではなく、目的とするサンプル中から検出しようとする細菌を適宜選択すればよい。例えば、食品中に混入し当該食品を汚染する可能性のある細菌を挙げることができる。食品中に有害な細菌が混入することは、公衆衛生上非常に大きな問題となる。上記の食品汚染細菌の存在および／またはその量と比較することによって、本発明の血清型ｋのＳ．ｍｕｔａｎｓ株の存在および／またはその量を測定することができる。
【０２４２】
食品を汚染する細菌としては、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ペディオコッカス属（Ｐｅｄｉｏｃｕｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、メガスフェラ属（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ）およびペクチネータス属（Ｐｅｃｔｉｎａｔｕｓ）に属する細菌を挙げることができる。また、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）に属する細菌種としては、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、ラクトバチルス・コリニフォルミス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏｒｙｎｉｆｏｒｍｉｓ）、ラクトバチルス・カルバトス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｕｒｖａｔｕｓ）、ラクトバチルス・デルブリュッキィ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、ラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、ラクトバチルス・リンドネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｎｄｎｅｒｉ）、ラクトバチルス・マレファーメンタンス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｌｅｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・ブヒネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ロイコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）およびザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）に属する細菌、並びにエンテロコッカス・デュランス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｄｕｒａｎｓ）およびラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）を挙げることができる。ただし、検出対象細菌はこれらに限定されるものではない。
【０２４３】
上記例示した細菌を検出・同定するためのキャプチャーオリゴとしては、上記に列挙した細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、各属に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドを挙げることが、これらに限定されるものではない。
【０２４４】
本発明に係る細菌検出器具の基板表面に固定化されるキャプチャーオリゴは、対象とする細菌から調製されたプローブとハイブリダイゼーションが成立するものであれば特に限定されるものではない。
【０２４５】
１つの基板上に固定化するキャプチャーオリゴは、少なくとも１種類以上であればよく、特に上限はない。一般に、試料中に混入した細菌を検出する場合は、サンプル中から検出可能な細菌を１つの基板で網羅的に検出できることが、操作の簡便性および検査の迅速性の観点から好ましいといえる。したがって、本発明に係る細菌検出器具も、１つの基板上に目的の細菌種または属に対応するキャプチャーオリゴを複数固定化した、いわゆるマイクロアレイ型の器具とすることが最も好ましい。
【０２４６】
（Ｂ）オリゴヌクレオチド（キャプチャーオリゴ）の固定化
オリゴヌクレオチドの基板表面への固定化法は特に限定されるものではなく、公知の方法を適宜選択して用いればよい。例えば、物理的吸着、電気的結合または分子共有結合などの一般的なハイブリダイゼーション法に用いられる手法が利用可能である。本発明に係る細菌検出器具においては、表面にカルボジイミド基またはイソシアネート基を有する基材を使用し（米国特許：ＵＳ５，９０８，７４６、特開平８−２３９７５号）、固定化することが好ましい。
【０２４７】
オリゴヌクレオチドをスポッティングする際に、オリゴヌクレオチドのスポット量が少なすぎると、オリゴヌクレオチドとプローブとの間の反応性を十分に確保することができず、判定が困難になることがある。また、高集積度のスポッティングは技術的な問題と同時にコストがかかり、さらにプローブの蛍光標識や化学発色などを用いたハイブリダイゼーションシグナルの検出にもより精密で高額な検出装置（例えば、スキャナー）が必要となる。したがって、オリゴヌクレオチドは、基板の表面に径１０〜１，０００μｍのサイズに固定することが好ましい。オリゴヌクレオチドの基板上へのスポッティング方法は特に限定されるものではない。例えば、スポッティングマシンを使用して基板上にオリゴヌクレオチド溶液をスポッティングすることにより行うことができる。これによりオリゴヌクレオチド溶液は、通常ほぼ円形にスポッティングされる。
【０２４８】
（５）本発明の用途
本発明を用いることによって、患者が感染性心内膜炎の原因菌の１つであるＳ．ｍｕｔａｎｓのうち病原性の高い可能性のある菌株を保有するか否かを簡便に同定し得る。特に、これまで検出限界以下であった症例において原因菌を検出し得る。感染性心内膜炎発症のリスクの高い菌株を保有する個体の限定が可能となり、それにより感染性心内膜炎を予防するために使用される多量の抗生物質を抑制し得、抗生物質の乱用に起因する薬剤耐性菌の出現を抑制し得る。また、原因菌となるＳ．ｍｕｔａｎｓ株と症状との間の相関関係を知ることができるとともに、他の原因菌との関係についてさらなる情報を与えることができる。
【０２４９】
以下、本発明を実施例に基づいてより具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【実施例１】
【０２５０】
（Ａ）Ｓ．ｍｕｔａｎｓ臨床口腔分離株の収集およびＳ．ｍｕｔａｎｓ血清型の同定
１９８２年から１９９０年の間に５７１人の幼児から分離した１３２６個のＳ．ｍｕｔａｎｓ株（分離株のＭＴ４０００シリーズまたはＭＴ１００００シリーズ）を、本発明者らの研究室ストックより選択した。
【０２５１】
さらに、２００２年８月に大阪大学歯学部病院小児歯科（日本国大阪府吹田市）へ訪れた１００人の被験体（３〜１７歳；平均８．９歳）より得た株を、無作為に選択した（ＮＮ２０００シリーズ）。これらの被験体は、８８人の健常な幼児とともに、口唇裂および口蓋裂を有する患者５人、心室中隔欠損を有する患者３人、エナメル質形成不全症を有する患者２人、二分脊椎を有する患者１人、ならびに自閉症の患者１人を含んだ。
【０２５２】
臨床標本の収集を、ヒト被験体に関与する研究のための大阪大学倫理委員会規定に従って行った。プラークサンプルを、滅菌したＰＢＳ中に懸濁し、希釈し、そしてバシトラシン（０．２単位／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）および１５％（ｗ／ｖ）のスクロースを含有するＭＳ寒天培地（Ｄｉｆｃｏ）上に広げた。コロニーの形態に基づいて、各被験体からコロニーを１つ選択して実験に供した。
【０２５３】
Ｍａｓｕｄａ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．，１９８５．Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ ｉｎ ｓｏｍｅ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｆａｍｉｌｉｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｓ．４４：２２３−２３２に記載の方法に従って、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ株のｃ型、ｅ型およびｆ型に対する抗血清を取得し、この抗血清を使用する免疫拡散法によって、上記臨床標本の血清型を決定した。
【０２５４】
ＭＴシリーズ１３２６株の全てが血清学的にｃ、ｅまたはｆとして分類され、血清型が不定である分離株は見出されなかった。一方、ＮＮ２０００シリーズ１００株のうちの７８株、１７株および３株は、それぞれ血清型ｃ、ｅおよびｆとして分類され、残りの２株（ＦＴ１（ＮＮ２０１１）およびＳＵ１（ＮＮ２０２９））は、ｃ型、ｅ型またはｆ型に特異的な抗血清と反応しなかった（表１）。また、血清学的に不定な株（ＦＴ１株またはＳＵ１株）を保有する被験体の各々から、５０コロニーを分離した。
【０２５５】
【表１】
【０２５６】
（Ｂ）Ｓ．ｍｕｔａｎｓ株
上述したＳ．ｍｕｔａｎｓ株のｃ型、ｅ型およびｆ型に対する抗血清を用いて、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ血液分離株ＴＷ２９５、ＴＷ８７１、ＴＷ９６４およびＴＷ１３７８が、それぞれ、血清型不定株、血清型不定株、ｆ型株およびｅ型株であることを同定した。これらのＳ．ｍｕｔａｎｓ株ならびに上述した口腔分離株であるＭＴ８１４８（ｃ型株）、ＭＴ４２４５株（ｅ型株）、およびＭＴ４２５１（ｆ型株）の特徴を、表２に示す。
【０２５７】
【表２】
【０２５８】
（Ｃ）Ｓ．ｍｕｔａｎｓに対する抗血清の作製
Ｓ．ｍｕｔａｎｓ血清型不定株に対する抗血清を取得した。新規血清型のＳ．ｍｕｔａｎｓに対する抗血清は、その抗原性が著しく低下しているために従来の方法では抗血清が得られなかったが、本発明者らは、免疫法を工夫することによってその高血清を得ることに成功した。
【０２５９】
具体的には、Ｓ．ｍｕｔａｎｓのＴＷ２９５株およびＴＷ８７１株の全菌体を、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）に懸濁し、各々の菌体について一日あたり乾燥重量５ｍｇを、５日間連続でウサギ耳介静脈に注射した。１週間間隔をあけた後、さらなる２週間において１週間に５日間ずつ反復注射し、ウサギ耳介静脈より採血し、Ｓ．ｍｕｔａｎｓのＴＷ２９５株に対する抗血清およびＴＷ８７１株に対する抗血清を得た。
【０２６０】
（Ｄ）グルコース側鎖欠失変異株の構築、およびその細菌学的特徴づけおよび血清学的特徴づけ
ＭＴ８１４８のグルコース側鎖欠失（ＧＤ）変異株を、ｇｌｕＡ遺伝子に抗生物質耐性遺伝子の挿入不活化によって構築した。Ｓ．ｍｕｔａｎｓ株Ｘｃ（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＡＢ００１５６２）およびＯｋｌａｈｏｍａ大学より公開されているＳ．ｍｕｔａｎｓゲノムデータベース（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＡＥ０１４１３３）から得たｇｌｕＡ配列に基づいて構築したプライマーとともにＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄポリメラーゼ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ）を用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、ｇｌｕＡ遺伝子およびその隣接領域を増幅した。この増幅したフラグメントを、次いで、ｐＳＴ Ｂｌｕｅ−１ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ）にクローニングして、プラスミドｐＲＮ１０１を作製した。ｐＲＮ１０１のｇｌｕＡのオープンリーディングフレームの中央部を、Ｓｔｕ１によって消化し、次いで、ｐＶＡ８３８より得た８３０ｂｐのエリスロマイシン耐性遺伝子（ｅｒｍ）フラグメントを挿入してプラスミドｐＲＮ１０２を構築した。制限酵素Ｎｏｔ Ｉでの消化によって線状化した後、このプラスミドを、ＴｏｂｉａｎおよびＭａｃｒｉｎａの方法によってＳ．ｍｕｔａｎｓ ＭＴ８１４８株に導入した。この形質転換体を、エリスロマイシン（１０μｇ／ｍｌ）を含有するＭｉｔｉｓ−ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ（ＭＳ）寒天培地（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，Ｍｉｃｈ．）プレート上でスクリーニングした。ｇｌｕＡ遺伝子のＰＣＲ増幅および免疫拡散法によって、変異株ＭＴ８１４８ＧＤの適切な挿入不活化を確認した。
【０２６１】
ＭＴ８１４８ＧＤは、Ｓ．ｍｕｔａｎｓの典型的な生物学的特徴を示した。この特徴としては、ＭＳ寒天培地上での粗いコロニー、糖発酵能陽性、ＰＡおよびＧＴＦの発現、ならびに高レベルのショ糖依存的付着および菌体疎水性が挙げられる。
【０２６２】
（Ｅ）種々のＳ．ｍｕｔａｎｓ株に対する抗血清の反応性
上記の抗体を用いて免疫拡散法（ゲル内沈降反応）を行なうために、ＴＷ２９５株およびＴＷ８７１株、ならびにｃ型、ｅ型およびｆ型のＳ．ｍｕｔａｎｓ株を一晩培養し、１２１℃で１５分加熱した後に遠心分離して、上清として抗原（ランツ−ランドール（ＲＲ）抗原）を得た。
【０２６３】
Ｓ．ｍｕｔａｎｓのＴＷ２９５株に対する抗血清およびＴＷ８７１株に対する抗血清は、Ｓ．ｍｕｔａｎｓのｃ型株、ｅ型株およびｆ型株から調製した抗原と反応しなかったが、Ｓ．ｍｕｔａｎｓのＴＷ２９５株およびＴＷ８７１株から調製した抗原と反応した（図１Ａ〜Ｅ）。これらＳ．ｍｕｔａｎｓのＴＷ２９５株およびＴＷ８７１株の血清型をｋ型と名付けた。
【０２６４】
なお、図１Ａの中央のウェルは、ＴＷ２９５株から得たＲＲ抽出物を含み（ウェル１）、外側のウェルは、ＴＷ２９５株に対する抗血清（ウェル２）およびＴＷ８７１株に対する抗血清（ウェル３）、ならびに血清型ｃに特異的な抗血清（ウェル４）、血清型ｅに特異的な抗血清（ウェル５）および血清型ｆに特異的な抗血清（ウェル６）を含む。また、図１Ｂの中央のウェルは、ＴＷ８７１株に対する抗血清を含み（ウェル７）、の外側のウェルは、ＴＷ２９５株から得たＲＲ抽出物（ウェル８）、ＴＷ８７１株から得たＲＲ抽出物（ウェル９）、ＭＴ４２５１株（ｆ）から得たＲＲ抽出物（ウェル１０）、ＭＴ４２４５株（ｅ）から得たＲＲ抽出物（ウェル１１）およびＭＴ８１４８株（ｃ）から得たＲＲ抽出物（ウェル１２）を含む。また、図１Ｃの中央のウェルは、ＦＴ１株から得たＲＲ抽出物を含み（ウェル１３）、外側のウェルは、ＴＷ８７１株に特異的な抗血清（ウェル１４）、血清型ｃに特異的な抗血清（ウェル１５）、血清型ｅに特異的な抗血清（ウェル１６）および血清型ｆに特異的な抗血清（ウェル１７）を含む。図１Ｄの中央のウェルは、血清型ｃに特異的な抗血清を含み（ウェル１８）、外側のウェルは、ＭＴ８１４８株から得たＲＲ抽出物（ウェル１９）およびＭＴ８１４８ＧＤ株（ｃ）から得たＲＲ抽出物（ウェル２０）を含む。図１Ｅの中央のウェルは、ＴＷ８７１株に対する抗血清を含み（ウェル２１）、図１Ｅの外側のウェルは、ＴＷ２９５株から得たＲＲ抽出物（ウェル２２）、ＴＷ８７１株から得たＲＲ抽出物（ウェル２３）、ＦＴ１株から得たＲＲ抽出物（ウェル２４）、ＳＵ１株から得たＲＲ抽出物（ウェル２５）、ＹＫ１株から得たＲＲ抽出物（ウェル２６）およびＭＴ８１４８ＧＤ株から得たＲＲ抽出物（ウェル２７）を含む。
【０２６５】
ＭＭ８１４８ＧＤのＲＲ抽出物は、ＴＷ８７１に対する抗血清と沈降バンドを形成し（しかし、血清型ｃ特異的抗血清とは沈降バンドを形成しない）、このバンドは、ＴＷ２９５、ＴＷ８７１、ＦＴ１、ＳＵ１およびＹＫ１の沈降バンドと融合した。
【０２６６】
さらに、この抗血清を用いて、１００人の被験体から分離した１００株（ＮＮ２０００シリーズ）のＳ．ｍｕｔａｎｓ中にｋ型株が存在する頻度を調べた。２株のＲＲ抗原は、ｃ型、ｅ型またはｆ型のＳ．ｍｕｔａｎｓ株に対する抗血清とは反応しなかったが、ｋ型のＳ．ｍｕｔａｎｓ株に対する抗血清と反応した。残りの９８株のＲＲ抗原は、ｃ型株、ｅ型株またはｆ型株に特異的な抗血清のいずれかと反応した。よって、ＮＮ２０００シリーズのＳ．ｍｕｔａｎｓ臨床口腔分離株における血清型不定株（ＦＴ１株およびＳＵ１株）はｋ型株であると同定した。
【０２６７】
（Ｆ）血清型不定株Ｓ．ｍｕｔａｎｓの特徴づけ
血清型が不定な臨床分離株のショ糖依存的付着および菌体疎水性を、それぞれ、Ｈａｍａｄａら（１９８１）、およびＲｏｓｅｎｂｅｒｇら（１９８０）、によって記載されるように評価した。菌体結合型（ｃｅｌｌ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）グルコシルトランスフェラーゼ（ＣＡ−ＧＴＦ）または菌体遊離型（ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ）グルコシルトランスフェラーゼ（ＣＦ−ＧＴＦ）および表層タンパク質抗原（ＰＡ）の発現を、ＧＴＦおよびＰＡに特異的な抗体を用いるウエスタンブロット分析を使用して分析した（図２Ａ〜Ｃ）。ゲノムＤＮＡを試験菌体より抽出し、１６Ｓ ｒＲＮＡ配列を決定し、そして対照株ＮＣＴＣ１０４４９（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．Ｘ５８３０３、Ｓ７０３５８）の配列と比較した。
【０２６８】
なお、図２ＡおよびＢでは、全細胞を、７％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、Ｓ．ｍｕｔａｎｓのＰＡ（図２Ａ）またはＣＡ−ＧＴＦ（図２Ｂ）に対するウサギ抗体と反応させた。一方、図２Ｃでは、硫酸アンモニウム沈殿によって濃縮した細胞上清（Ｃ）ＰＶＤＦ膜上に転写したタンパク質を、７％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、ＣＦ−ＧＴＦ（Ｃ）に対するウサギ抗体と反応させた。各レーンについて説明すると、レーン１がＭＴ８１４８株であり、レーン２がＦＴ１株であり、レーン３がＳＵ１株であり、レーン４がＹＫ１株である。ＦＴ１株およびＳＵ１株は、ＰＡおよび３つの型のＧＴＦを発現した。
【０２６９】
ＦＴ１株およびＳＵ１株は、高レベルのショ糖依存的付着および菌体疎水性を示し（データ示さず）、そしてこれらの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列は、ＮＣＴＣ１０４４９株（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．Ｘ５８３０３およびＳ７０５３８）の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列と同一であった。さらに、ＦＴ１株のＲＲ抽出物は、ＴＷ８７１株およびＴＷ２９５株に対する抗血清とともに沈降バンドを形成し、このバンドはまた、ＴＷ８７１のＲＲ抽出物とＴＷ８７１に対する抗血清との沈降バンドと融合した。さらに、ＦＴ１株およびＳＵ１株を有する被験体の各々より得た５０株は、ｃ型、ｅ型またはｆ型に特異的な抗血清と反応性ではなかった。
【０２７０】
また、これら両方の株は、Ｓ．ｍｕｔａｎｓの特徴であるＭＳ寒天培地上での粗いコロニー、バシトラシン耐性、血液寒天上でのγ溶血性、マンニトール、ソルビトール、ラフィノースおよびメリビオースにおける糖発酵能陽性、ならびにデキストラン凝集陰性を示した。
【０２７１】
（Ｇ）さらなる臨床分離株の解析
Ｓ．ｍｕｔａｎｓのさらなる臨床的分離株２５００個を、２００３年初頭に大阪大学歯学部病院の小児歯科へ訪れた別の群の被験体５０人（３〜１９歳；平均７．８歳）より得た。これらの被験体は、４５人の健常な幼児および一般的健康問題または口腔の健康問題（例えば、ダウン症、先天性心障害、口唇裂および口蓋裂、エナメル質形成不全症、ならびに部分的無歯症）を有する患者５人を含んだ。
【０２７２】
表３は、Ｓ．ｍｕｔａｎｓの上記分離株２５００個（そのうち２４５０個はｃ型、ｅ型またはｆ型に分類された）の血清型分布を示す。
【０２７３】
【表３】
【０２７４】
一方で、単一の被験体（ダウン症の少女）より得た他の５０株（ＹＫ１〜ＹＫ５０）のＲＲ抽出物が、ＴＷ８７１に対する抗血清と沈降バンドを形成した。このバンドはまた、ＴＷ２９５、ＴＷ８７１、ＦＴ１およびＳＵ１のＲＲ抽出物の沈降バンドと融合した。表４は、個々の被験体における血清型分布パターンを示し、これらの被験体のほとんどが、Ｓ．ｍｕｔａｎｓの血清型ｃのみを保有し、次いで血清型ｅのみを保有するが、５０人の被験体のうち５人は複数の血清型を保有するということが、見出された。
【０２７５】
【表４】
【０２７６】
（Ｈ）食作用アッセイ
生物を、Ｂｒａｉｎ Ｈｅａｒｔ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ ｂｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ）中にて３７℃で１８時間培養した。この菌体を洗浄した後、細胞濃度を、ＰＢＳで１．０×１０８ＣＦＵ／ｍｌに調整した。ヒト末梢血（５００μｌ）を、健常なボランティアより収集し、そして細菌５００μｌ（５．０×１０７ＣＦＵ）とともに３７℃で１０分間インキュベートした。ギムザ染色（Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）を用いて染色し、光学顕微鏡（倍率、×１００；Ｏｌｙｍｐｕｓ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて、食作用を呈している多型核白血球（ＰＭＮ）の割合を求めた。１００個のＰＭＮ当たり食菌したＰＭＮの平均値（５００個のＰＭＮを試験した）によって、比率を表した。
【０２７７】
さらに、ＭＴ８１４８株、ＭＴ８１４８ＧＤ株、ＦＴ１株、およびＴＷ２９５株における経時的な食作用の比率の変化を、１５分後、３０分後、６０分後、９０分後および１２０分後に観察した。種々の因子について群の間での差異を、要因モデルについての統計学的分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって評価した（図３）。
【０２７８】
図３Ａ・Ｂは、Ｓ．ｍｕｔａｎｓの口腔分離株および血液分離株の食作用率を示す。なお、図３Ａ・Ｂに示す結果は、５回の実験の平均±標準偏差を示す。図３Ａでは、１２株の食作用率を、１０分間のインキュベーション後に試験した。図３Ｂでは、１５分間、３０分間、６０分間、９０分間および１２０分間のインキュベーションにおけるＭＴ８１４８（●）、ＭＴ８１４８ＧＤ（○）、ＦＴ１（▲）およびＴＷ２９５（□）の食作用率の変化を示す。
【０２７９】
ＭＴ８１４８ＧＤ株の食作用率は２２．０±２．４％であり、これは、親株ＭＴ８１４８の食作用率（６８．４±４．１％）より有意に低かった（Ｐ＜０．００１）。さらに、ＮＮ２００１（ｃ）、ＮＮ２００２（ｅ）およびＮＮ２００３（ｆ）の口腔分離株は、ＭＴ８１４８と同等の食作用率を示したが、血清型ｋの口腔分離株であるＦＴ１、ＳＵ１およびＹＫ１はまた、ＭＴ８１４８よりも有意に低い食作用率を示した（Ｐ＜０．００１）。さらに、血液分離株の４つ全ての食作用率は、口腔分離株の食作用の割合よりも有意に低かった（Ｐ＜０．００１）。また、ＭＴ８１４８ＧＤ、ＦＴ１およびＴＷ２９５の食作用率は、不活化６０分間までＭＴ８１４８よりも有意に低く、ＴＷ２９５の食作用率はまた、不活化の９０分間後ＭＴ８１４８よりも有意に低かった（Ｐ＜０．００１）。
【０２８０】
感染性心内膜炎は、病原性細菌の血流中への侵入によって開始されることが知られているが、侵入機構および血液中でのＳ．ｍｕｔａｎｓの生存機構は、未だ明らかになっていない。本実施例において、本発明者らは、血清型特異多糖抗原においてグルコース側鎖を欠失した同系の変異株の食作用率が、親株の食作用率より低いことを見出した。フィッシャーＰＬＳＤ分析によって決定した場合、ＭＴ８１４８（血清型ｃ）と他の株との間に統計学的に有意な差異があった（＊Ｐ＜０．００１）。
【０２８１】
さらに、血清型ｋの口腔分離株および血液分離株は、ＰＭＮによる食作用率が低下した。総じて、これらの知見は、血清型ｋ株（これは、血清型特異多糖抗原においてグルコース側鎖を欠くと考えられている）がおそらく菌血症病原性株であり得ることを示唆する。一方で、血液分離株であるＴＷ９６４（ｅ）およびＴＷ１３７８（ｆ）は、口腔分離株であるＮＮ２００２（ｅ）およびＮＮ２００３（ｆ）より食作用に対して感受性ではない。しかし、本発明者らは、ＴＷ９６４がグルカン結合タンパク質Ａを欠くが、ＴＷ１３７８ではこのような変異は何ら見られなかったということを示した。従って、食作用能に対する効果を有する血清型特異的多糖抗原以外に、菌体表層構造物の変異が存在し得る。
【０２８２】
（Ｉ）考察
血液分離株２株（ＴＷ２９５およびＴＷ８７１）、口腔分離株１５２株（ＦＴ１〜ＦＴ５１、ＳＵ１〜ＳＵ５１、およびＹＫ１〜ＹＫ５０）、および、ｇｌｕＡ不活化株（ＭＴ８１４８ＧＤ）のＲＲ抽出物は、ＴＷ２９５またはＴＷ８７１に対する抗血清と沈降バンドを形成した。一方で、これらの分離株は、Ｓ．ｍｕｔａｎｓに典型的な生物学的特徴（高レベルのショ糖依存的付着および疎水性、ならびにグルコシルトランスフェラーゼが挙げられる）を有することが示された。
【０２８３】
本研究においてＳ．ｍｕｔａｎｓ血清型ｃ、ｅおよびｆが分離される頻度は、デンマークでの研究において報告されたものと非常に類似した。この報告において、ヒト歯垢サンプルより得られた７６個のｍｕｔａｎｓ ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉのうち１つおよびヒトう蝕性病変より得られた７０個のｍｕｔａｎｓ ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉのうち７つは、血清型ａ〜ｇとして血清学的に分類することができなかった。生化学的分析は、これらの血清型不定株がＳ．ｍｕｔａｎｓに属することを示したが、血清型特異的多糖の構造は分布していなかった。別の研究において、ヒトの歯垢サンプル、う蝕性象牙質サンプル、または糞サンプルより採取された１０４７個のＳ．ｍｕｔａｎｓ分離株またはＳ．ｓｏｂｒｉｎｕｓ分離株の全ては、血清型ｃ、ｅ、ｆ、ｄまたはｇとして分類され得た。さらに、日本の別の地域において実施された最近の研究において、歯垢より得られた１４４個のＳ．ｍｕｔａｎｓまたはＳ．ｓｏｒｂｉｎｕｓの全てが、血清型ｃ、ｅ、ｄまたはｇとして分類され、そしてｆ型株または血清型不定株は検出されなかった。一方で、最近日本において、１０３人の被験体のうち９人が、血清学的に不定なＳ．ｍｕｔａｎｓを保有することが報告されたが、血清型特異的多糖の特徴に関する正確な記載はなかった。以上のことは、本発明者らは、最近日本において血清型ｋ型が出現したことを示している。
【０２８４】
本研究において、この新たな血清型を有するＳ．ｍｕｔａｎｓが３人の幼児由来のプラークサンプル中に見出され、１５２株全てが血清型ｋとして分類された。これらの臨床分離株の起源は、未だ同定されていないが、血清型ｋ株は、これら３人の被験体より得られた歯垢サンプル中に見出されたＳ．ｍｕｔａｎｓ株の大部分を占めた。そしてこれらの全てが、高レベルの菌体疎水性およびショ糖依存的付着、ならびに食作用に対する高い抵抗性を示した。これらの知見は、Ｓ．ｍｕｔａｎｓの血清型ｋ株が、ＧＴＦおよびＰＡの発現ならびに高い疎水性およびショ糖依存的付着に起因してヒトの口腔中に存在すること、ならびにより低い食作用能に起因して血液中で生存し得ることが明らかとなった。従って、心障害を有する幼児に対して特別な注意が払われなければならない。特に、口腔中にＳ．ｍｕｔａｎｓ血清型ｋ株を保有するダウン症患者については、心室中隔欠損とともに多型核白血球（ＰＭＮ）の機能障害を合併することもあるため、より危険であり得る。これらの患者において新たな血清型ｋが検出されるということは危険性の増加を示し得るので、歯科処置の前に抗生物質処方のような臨床的アプローチが必要とされ得、そしてこのことは留意されるべきである。
【０２８５】
［実施例２．Ｓ．ｍｕｔａｎｓのｋ型株に特異的な遺伝子配列の検索］
Ｓ．ｍｕｔａｎｓのｋ型株（ＴＷ２９５株、ＴＷ８７１株、ＦＴ１株、ＹＴ１株）からゲノムＤＮＡを抽出し、それぞれの株において、血清型特異的多糖抗原の生合成に関与する酵素をコードする遺伝子配列を特定し、血清型ｃのＭＴ８１４８株において対応する配列と比較した。さらに、Ｓ．ｍｕｔａｎｓのｋ型株のＤＮＡ配列をデータベース上の株（Ｘｃ株：ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＡＢ０１０９７０、ＵＡ１５９株：ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＡＥ０１４１３３）のＤＮＡ配列と比較して、ｋ型株に特異的な遺伝子配列を特定した。ｋ型株においてｒｇｐ遺伝子群中で様々な変異が認められたが、全てのｋ型株に共通して、ｒｇｐＦ遺伝子の前半部において変異が認められた（図４〜図１３）。
【０２８６】
［実施例３．Ｓ．ｍｕｔａｎｓのｋ型株の簡易同定法の確立］
Ｓ．ｍｕｔａｎｓのｃ型株と比較した場合、Ｓ．ｍｕｔａｎｓのｋ型株において、ｒｇｐＦ遺伝子の前半部分３分の１に特異的な遺伝子配列が存在した。その領域を利用して、ｒｇｐＦ遺伝子の開始コドンの上流部において各血清型（ｃ型、ｅ型、ｆ型およびｋ型）の株の間で共通する配列に基づいて順方向プライマーを設計し（ＡＴＴＣＣＣＧＣＣＧＴＴＧＧＡＣＣＡＴＴＣＣ（配列番号８）：ＣＥＦＫ−Ｆ）、ｋ型に特異的な配列に基づく逆方向プライマー（ＣＣＡＡＴＧＴＧＡＴＴＣＡＴＣＣＣＡＴＣＡＣ（配列番号９）：Ｋ−Ｒ）、ならびにｃ型、ｅ型およびｆ型に特異的な配列に基づく逆方向プライマー（ＣＣＧＡＣＡＡＡＧＡＣＣＡＴＴＣＣＡＴＣＴＣ（配列番号１０）：ＣＥＦ−Ｒ）を設計した（表５および図１４）。
【０２８７】
【表５】
【０２８８】
上記のプライマー対を用いてｋ型株のみが特異的にＰＣＲ増幅する系を確立した。具体的には、Ｓ．ｍｕｔａｎｓのｋ型株（ＴＷ２９５株、ＴＷ８７１株、ＦＴ１株、ＹＴ１株）および唾液サンプルからゲノムＤＮＡを抽出し、ＣＥＦＫ−ＦとＣＥＦ−Ｒとのプライマー対、およびＣＥＦＫ−ＦとＫ−Ｒとのプライマー対を用いて、図１５に従ってＰＣＲ反応溶液を、９４℃５分を１サイクル、９４℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃３０秒を３０サイクル、７２℃７分１サイクルの条件でＰＣＲ反応を行った。得られた反応溶液を１．５％アガロースゲルで電気泳動した。その結果を図１６に示す。
【０２８９】
［実施例４：Ｓ．ｍｕｔａｎｓの血清型ｋ以外の株または血清型ｋ株についてのＰＣＲアッセイの感度］
Ｓ．ｍｕｔａｎｓ菌体の滴定培養を用いて、プライマー対ＣＥＦＫ−ＦおよびＣＥＦ−Ｒならびにプライマー対ＣＥＦＫ−ＦおよびＫ−Ｒを用いるＰＣＲ反応の感度を調べた。具体的には、１ｍｌ当たり１０８個のＭＴ８１４８株（ｃ型）、ＴＷ２９５株（ｋ型）およびＦＴ１株（ｋ型）について、プライマー対ＣＥＦＫ−ＦおよびＫ−Ｒを用いてＰＣＲを行った。テンプレートとして、上記菌体より抽出したゲノムＤＮＡを用いた。滅菌水中に希釈した既知の数（５×１０４個、５×１０３個、５×１０２個、５×１０１個、および５個）の菌体を使用することによって、ＰＣＲの検出限界を決定した（図１６）。
【０２９０】
なお、図１６では、１ｍｌ当たり１０８個のＭＴ８１４８株（ｃ型）、ＴＷ２９５株（ｋ型）およびＦＴ１株（ｋ型）の細胞の滴定培養を用いて、ＰＣＲ反応の感度を調べた。以下の数の細胞を添加した：５×１０４（レーン１）、５×１０３（レーン２）、５×１０２（レーン３）、５×１０１（レーン４）、および５（レーン５）。Ｍは、分子サイズマーカー（１００ｂｐ ＤＮＡラダー）を示す。
【０２９１】
Ｓ．ｍｕｔａｎｓのｋ型株（ＴＷ２９５株およびＦＴ１株）において、ｋ型に特異的なプライマーによるＰＣＲ増幅が生じ、ｃ型（ＭＴ８１４８株）において、ｋ型に特異的なプライマーによるＰＣＲ増幅が起こらなかった。
【０２９２】
検出限界は、血清型ｃ／ｅ／ｆ株に特異的なプライマー対において５０〜５００細胞、血清型ｋ株に特異的なプライマー対において５〜５０細胞であり、非常に良好な感度であることがわかった。
【０２９３】
［実施例５：Ｓ．ｍｕｔａｎｓ血清型ｋ株の検出のためのＰＣＲアッセイ］
種々の血清型のＳ．ｍｕｔａｎｓ株およびＳ．ｍｕｔａｎｓ以外の連鎖球菌より抽出したＤＮＡをテンプレートに用いて、プライマー対ＣＥＦＫ−ＦおよびＣＥＦ−Ｒ、プライマー対ＣＥＦＫ−ＦおよびＫ−Ｒを使用するＰＣＲの確からしさを確認した（図１７Ａ・Ｂ）。
【０２９４】
なお、図１７Ａでは、血清型ｃ／ｅ／ｆ株に特異的なプライマー対（ＣＥＦＫ−ＦおよびＣＥＦ−Ｒ）を用いて、血清型ｃ／ｅ／ｆ株の細菌より抽出したゲノムＤＮＡ（レーン１〜４）、血清型ｋ株の細菌より抽出したゲノムＤＮＡ（レーン５〜８）、唾液サンプルより抽出したゲノムＤＮＡ（レーン９〜１４）をテンプレートとして、ＰＣＲ反応を行った。また、図１７Ｂでは、血清型ｋ株に特異的なプライマー対（ＣＥＦＫ−ＦおよびＫ−Ｒ）（Ｂ）を用いて、血清型ｃ／ｅ／ｆ株の細菌より抽出したゲノムＤＮＡ（レーン１〜４）、血清型ｋ株の細菌より抽出したゲノムＤＮＡ（レーン５〜８）、唾液サンプルより抽出したゲノムＤＮＡ（レーン９〜１４）をテンプレートとして、ＰＣＲ反応を行った。
【０２９５】
各レーンについて説明すると、レーン１がＭＴ８１４８（ｃ型）であり、レーン２がＮＮ２００１（ｃ型）であり、レーン３がＮＮ２００２（ｅ型）であり、レーン４がＮＮ２００３（ｆ型）であり、レーン５がＴＷ２９５（ｋ型）であり、レーン６がＴＷ８７１（ｋ型）であり、レーン７がＦＴ１（ｋ型）であり、レーン８がＹＴ１（ｋ型）であり、レーン９がＳｔｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｎｇｕｉｎｉｓ ＡＴＣＣ１０５５６であり、レーン１０がＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｏｒａｌｉｓ ＡＴＣＣ１０５５７であり、レーン１１がＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｄｏｎｉｉ ＡＴＣＣ１０５５８であり、レーン１２がＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓ ＡＴＣＣ９０３であり、レーン１３がＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｌｌｅｒｉ ＮＣＴＣ１０７０３であり、レーン１４がＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ ＨＨＴである。
【０２９６】
プライマー対ＣＥＦＫ−ＦおよびＣＥＦ−Ｒは、血清型ｃ／ｅ／ｆ株を特異的に検出し、プライマー対ＣＥＦＫ−ＦおよびＫ−Ｒは、血清型ｋ株を特異的に検出したが、いずれのプライマー対も、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ以外の連鎖球菌を検出しなかった。このように、プライマー対ＣＥＦＫ−ＦおよびＣＥＦＫ−Ｒ、ならびにプライマー対ＣＥＦＫ−ＦおよびＫ−Ｒを使用すると、それぞれ血清型ｃ／ｅ／ｆ株および血清型ｋ株を特異的に検出し得るだけでなく、Ｓ．ｍｕｔａｎｓのみを特異的に検出し得ることがわかった。
【０２９７】
［実施例６：唾液サンプルを用いるＰＣＲ反応によるＳ．ｍｕｔａｎｓ血清型ｋ株を有する被験体の同定］
吐出した全唾液（約１ｍｌ）を、２００４年１〜２月に大阪大学歯学部小児歯科を訪れた２００人の小児あるいは思春期の患者（２〜１８歳（平均年齢７．９±３．６歳））より収集した。これらの唾液サンプルを、Ｈｏｓｈｉｎｏら（２００４）によって報告された方法をいくらか改変したＰＣＲアッセイに用いた．簡単には、無刺激の全唾液を滅菌チューブ中に収集して氷上に置いた。菌体を、５００μｌの唾液から１６，０００×ｇにて５分間で微量遠心管中に回収し、電子オーブン中にて５００Ｗで５分間処理し、Ｎ−アセチルムラミリダーゼＳＧ（Ｓｅｉｋａｇａｋｕ Ｃｏｒｐ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）中にて５０℃で１時間消化した．次いで、８０μｌの核溶解（ｎｕｃｌｅｉｌｙｓｉｓ）液（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加して、８０℃で５分間インキュベートし、その後６０μｌのタンパク質沈降溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加した。１６，０００×ｇにて３分間の遠心分離によってタンパク質を除去し、フェノール−クロロホルム抽出およびエタノール沈殿によって、ＤＮＡを生成した。抽出したＤＮＡを、５０μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））中に溶解した。このＤＮＡ抽出方法は、歯垢から菌体ゲノムを抽出する際にも用いることができる。
【０２９８】
上記のように得たＤＮＡをテンプレートに用いるＰＣＲによって、プライマー対ＣＥＦＫ−ＦおよびＣＥＦ−Ｒを使用して血清型ｃ／ｅ／ｆ株を（Ａ）、プライマー対ＣＥＦＫ−ＦおよびＫ−Ｒを使用して血清型ｋ株（Ｂ）を検出した（図１８Ａ・Ｂ）。その結果、被験体２００人から得た臨床標本のうち１９０個が、血清型ｋ株に非特異的（血清型ｃ／ｅ／ｆ株に特異的）なプライマー対に対して陽性を示したが（Ａ）、血清型ｋ株に特異的なプライマー対（Ｂ）に対して陰性であった。また、残りの１０個の標本は、血清型ｋ株に特異的なプライマー対（Ｂ）および血清型ｋ株に非特異的（血清型ｃ／ｅ／ｆ株に特異的）なプライマー対（Ａ）に対して陽性を示した。
【０２９９】
なお、図１８Ａでは、プライマー対ＣＥＦＫ−ＦおよびＣＥＦ−Ｒを使用して、血清型ｋ株に非特異的（血清型ｃ／ｅ／ｆ株に特異的）なプライマー対（Ａ）に対して陽性を示したが血清型ｋ株に特異的なプライマー対（Ｂ）に対して陰性であった上記１９０個の標本のうちで代表的な５例を示す。また、図１８Ｂでは、血清型ｋ株の検出のために、プライマー対ＣＥＦＫ−ＦおよびＫ−Ｒを使用した。各レーンについて説明すると、レーン１〜５が血清型ｋ株に特異的なプライマー対に対して陰性であった上記１９０株の標本のうち代表的な５例を示す。レーン６〜８は、血清型ｋ株に特異的なプライマー対に対して陽性であった株を示す。
【０３００】
以上のように、Ｓ．ｍｕｔａｎｓのｋ型株（ＴＷ２９５株、ＴＷ８７１株、ＦＴ１株、ＳＵ１株、ＹＫ１株、ＹＴ１株およびＡＴ１株）、ならびにＳ．ｍｕｔａｎｓ臨床分離株（ＮＮ２０００シリーズ：ｃ型７８株、ｅ型１７株、ｆ型３株）において、ｋ型に特異的なプライマーによるＰＣＲ増幅が生じ、ｃ型、ｅ型またはｆ型に特異的なプライマーによるＰＣＲ増幅は起こらなかった。また、９８個のｃ型、ｅ型またはｆ型のＳ．ｍｕｔａｎｓ株において、ｃ型、ｅ型またはｆ型に特異的なプライマーによるＰＣＲ増幅が起こり、ｋ型に特異的なプライマーによるＰＣＲ増幅が起こらなかった。
【実施例７】
【０３０１】
Ｓ．ｍｕｔａｎｓは、その細胞表面多糖の化学組成に基づいてｃ型、ｅ型およびｆ型の血清型に分類される（Ｌｉｎｚｅｒら、１９８７）。Ｓ．ｍｕｔａｎｓの血清型特異的多糖は、ラムノース骨格およびα連結グルコシド残基またはβ連結グルコシド残基の側鎖を有するラムノース−グルコースポリマーからなることが知られている。本発明者らの以前の研究において、菌血症を発症する患者の血液より得た血清型不定株（ＴＷ２９５）および感染性心内膜炎を発症する患者の血液より得た血清型不定株（ＴＷ８７１）は、血清型特異的多糖においてグルコース側鎖の量が低下することが示された（Ｆｕｊｉｗａｒａら、２００１）。
【０３０２】
実施例１に示すように、ｋ型の血清型を示すＭＴ８１４８ＧＤは、高レベルのショ糖依存的付着を示したが、その付着率は、親株ＭＴ８１４８（ｃ型）の付着率よりも有意に低かった。
【０３０３】
最近、血清型特異的多糖が、ヒト単核球および線維芽細胞に対する連鎖球菌の付着において重要な役割を担うことが実証され、そして最も有効なサイトカイン刺激成分であることが予測された（Ｅｎｇｅｌｓ−Ｄｅｕｔｓｃｈら、２００３）。しかし、血清型特異的多糖とう蝕との間の関係は、解明の余地を残す。
【０３０４】
そこで本発明者らは、新たに解明されたＳ．ｍｕｔａｎｓの血清型ｋ株のう蝕原性における血清型特異的多糖のグルコース側鎖の役割を分析した。
【０３０５】
（Ａ）Ｓ．ｍｕｔａｎｓ株
本実施例において使用したＳ．ｍｕｔａｎｓ株を、表６に示す。ＭＴ８１４８（ｃ）の口腔分離株を、本発明者らの研究室の培養物ストックコレクションより選択した。ＦＴ１株（ｋ）、ＳＵ１株（ｋ）およびＹＫ１株（ｋ）をまた、日本人の幼児の口腔より分離した。さらに、ＹＴ１株を、６歳の健常な少年の口腔より分離し、実施例１に記載する方法に従ってＳ．ｍｕｔａｎｓ血清型ｋであることを確認した。ＭＴ８１４８Ｒ株およびＹＫ１Ｒ株を、漸増濃度のストレプトマイシン（寒天培地１ｍｌ当たり最終濃度１５００μｇまで）中での継代培養を繰り返すことによってストレプトマイシンに対して耐性にした（Ｏｏｓｈｉｍａら、２０００）。ＭＴ８１４８ＧＤ株（ＭＴ８１４８のｇｌｕＡ不活化同系変異株）を、実施例１と同様に構築した。
【０３０６】
【表６】
【０３０７】
（Ｂ）う蝕原性特性のインビトロ分析
Ｓ．ｍｕｔａｎｓのガラスチューブに対するショ糖依存的付着性および唾液被覆ヒドロキシアパタイト（ＳＨＡ）に対するショ糖非依存的付着性を、以前に記載した（Ｏｏｓｈｉｍａら、２００１；Ｎａｋａｎｏら、２００２）ように分析した。菌体疎水性およびデキストラン結合活性をまた、以前に記載した（Ｆｕｊｉｗａｒａら、２００１；Ｎａｋａｎｏら、２００２）ように分析した。
【０３０８】
種々の因子について群の間での差異を、要因モデルについての統計学的分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって評価した（表７）。
【０３０９】
表７は、う蝕原性のインビトロ分析より得た生物学的特性を示す。ＭＴ８１４８ＧＤは、ガラス表面に対するショ糖依存的付着性、ＳＨＡに対するショ糖非依存的吸着率、デキストラン結合能、ＣＡ−ＣＴＦ活性およびＣＦ−ＣＴＦ活性について有意に低い値を示した（Ｐ＜０．００１）。しかし、ＦＴ１とＦＴ１ＧＤとの間ではこれらの特性に関して有意差はなかった。
【０３１０】
【表７】
【０３１１】
（Ｃ）ＧＴＦの発現
発現したタンパク質の量を評価するために、本発明者らの以前の研究において作製した抗菌体結合型（ＣＡ）ＧＴＦ抗血清および抗菌体遊離型（ＣＦ）ＧＴＦ抗血清を用いて、ＧＴＦのイムノブロットを行った。試験生物を、３７℃にてＢｒａｉｎ Ｈｅａｒｔ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ（ＢＨＩ）ブロス（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ，ＵＳＡ）中で、５５０ｎｍでの吸光度１．０まで増殖させた。この菌体および上清（硫酸アンモニウム沈殿によって濃縮した）を、ＳＤＳゲルローディング緩衝液中に溶解した。等量の各タンパク質を、７％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、次いで、ポリビニリデンジフルオリド膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ，ＵＳＡ）上に転写した。この転写したタンパク質バンドを、ＣＡ−ＧＴＦまたはＣＦ−ＧＴＦに対するウサギ抗体と反応させ、次いで、アルカリホスファターゼ複合体化抗ウサギ免疫グロブリンＧ抗体（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ，ＵＳＡ）および５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート−ニトロブルーテトラゾリウム基質（Ｍｏｓｓ Ｉｎｃ．，Ｐａｓａｄｅｎａ，ＭＤ，ＵＳＡ）を使用して可視化した。さらに、各株におけるＧＴＦＢに対する発現強度／ＧＴＦＣに対する発現強度の比を、ＮＩＨ ｉｍａｇｅソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ，ＶＡ，ＵＳＡ）を使用する反応バンドの相対的デンシトメトリー分析によって評価した。
【０３１２】
ＧＴＦＢ、ＧＴＦＣ、およびＧＴＦＤが試験した株の全てにおいて発現することを見出した。しかし、ＧＴＦＢの強度は、ＭＴ８１４８において他のいずれの株においてよりも有意に強かった。ＧＴＦＢ発現強度／ＧＴＦＣ発現強度の比は、１．８０±０．１５であった。この値は、ＭＴ８１４８ＧＤの値（０．８０±０．１１）および血清型ｋのほかの血液分離株および口腔分離株の値（０．１７〜０．８１の範囲の値）より有意に高かった（Ｐ＜０．００１）。対照的に、試験した全ての株の中でＧＴＦＤ発現強度において有意差はなかった。
【０３１３】
（Ｄ）ＣＡ−ＧＴＦ活性およびＣＦ−ＣＴＦ活性の測定
ＣＡ−ＧＴＦ活性およびＣＦ−ＣＴＦ活性を、以前に記載された方法（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏら、２００３）を用いて［１４Ｃ］ショ糖からの［１４Ｃ］グルカン合成によって評価した。ＧＴＦ活性１単位を、１μｍｏｌのグルコース残基が１分間にショ糖からグルカンへ組み込まれるために必要な酵素量として規定した。
【０３１４】
血清型ｋの血液分離株ＴＷ２９５およびＴＷ８７１、ならびに３つの口腔分離株ＳＵ１、ＹＫ１およびＹＴ１の各々は、ＭＴ８１４８より有意に低いショ糖依存的付着率、デキストラン結合能、ＣＡ−ＣＴＦ活性、およびＣＦ−ＣＴＦ活性を示した（Ｐ＜０．００１）。ＳＨＡに対するショ糖非依存的吸着率と同様に、試験した血清型ｋ株（ＳＵ１株およびＹＫ１株を除く）の値は、ＭＴ８１４８の値よりも有意に低かった（Ｐ＜０．００１）。さらに、ＭＴ８１４８と試験した他の株との間では菌体疎水性において有意差はなかった。
【０３１５】
（Ｅ）ラットにおけるう蝕誘発実験
以前に記載された方法（Ｎａｋａｎｏら、２００２）に従って、３６匹の特異的病原体のない（ＳＰＦ）Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｉｎｃ．，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）（１群あたり１２匹）において、う蝕誘発活性を試験した。試験した３株（ＭＴ８１４８Ｒ、ＭＴ８１４８ＲＧＤおよびＹＫ１Ｒ）を、１×１０９ＣＦＵずつ５日間毎日１８〜２２日齢のラットに経口的に感染させた後、各ラットについてプラークおよびう蝕のスコアを、７２日齢の時点で評価した。
【０３１６】
種々の因子について群の間での差異を、要因モデルについての統計学的分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって評価した。
【０３１７】
ラットにおいて、血清型ｋは、明らかなう蝕を誘発した。しかし、ＭＴ８１４８Ｒ株とその変異株ＭＴ８１４８ＲＧＤと口腔分離株ＹＫ１Ｒとの間でう蝕スコアまたはプラーク指数において有意差はなかった（表８）。
【０３１８】
【表８】
【０３１９】
（Ｆ）考察
本実施例において、ｇｌｕＡ遺伝子（グルコース側鎖ドナーにおける直前の前駆体であるＵＤＰ−Ｄ−グルコースの生産を触媒する酵素をコードする）の挿入不活化によって構築したＭＴ８１４８ＧＤの生物学的特性を、親株であるＭＴ８１４８の生物学的特性と比較した。ＵＤＰ−Ｄ−グルコースは、低ｐＨ環境条件におけるＳ．ｍｕｔａｎｓの生存度に重要であることが報告されているので、本発明者らは、ｇｌｕＡ遺伝子自体がう蝕原性に関連する特性の変更を引き起こし得るということを予想した。従って、本発明者らは、ｇｌｕＡ遺伝子を挿入不活化した、血清型ｋ株ＦＴ１のさらなる変異株（ＦＴ１ＧＤ）を構築した。本発明者らの結果は、ＦＴ１とＦＴ１ＧＤとの間で生物学的特性に有意差がなかったことを示した（表７）。このことは、ｇｌｕＡ遺伝子自体の不活化が、このインビトロアッセイで測定した特性に関連しないことを示す。従って、本発明者らは、血清型特異的多糖のグルコース側鎖の存在が、より高いショ糖依存的付着、ショ糖非依存的付着、デキストラン結合能、ならびにＣＡ−ＣＴＦ活性およびＣＦ−ＣＴＦ活性に重要であると結論付けた。
【０３２０】
ＣＡ−ＣＴＦ活性およびＣＦ−ＣＴＦ活性の低減は、血清型ｋの臨床分離株において突出していた（表７）。さらに、血清型ｋの臨床分離株におけるＣＡ−ＣＴＦ活性およびＣＦ−ＣＴＦ活性は、３０個のＳ．ｍｕｔａｎｓ分離株（１６株の血清型ｃ、８株の血清型ｅ、および６株の血清型ｆ）におけるＣＡ−ＣＴＦ活性およびＣＦ−ＣＴＦ活性より有意に低かった。インビトロでの付着能に必要とされる最適なＧＴＦＢ／ＧＴＦＣ／ＧＴＦＤの比率を、本発明者らの以前の研究において決定した（Ｏｏｓｈｉｍａら、２００１）。この比率からの隔たりは、菌体の付着能やプラークバイオフィルムの構造に影響を与える（Ｉｄｏｎｅら、２００３）。本研究におけるウエスタンブロット分析は、ＧＴＦＢの発現が、ＭＹ８１４８より血清型ｋ株においてより低い傾向があることを示した（図１９Ａ・Ｂ）。
【０３２１】
なお、図１９Ａでは、全菌体（Ａ）を、７％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、ＰＶＤＦ膜上に転写したタンパク質バンドを、Ｓ．ｍｕｔａｎｓのＣＡ−ＧＴＦに対するウサギ抗体と反応させた。図１９Ｂでは、硫酸アンモニウム沈殿によって濃縮された培養上清を、７％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、ＰＶＤＦ膜上に転写したタンパク質バンドを、ＣＦ−ＧＴＦに対するウサギ抗体と反応させた。各レーンについて説明すると、レーン１がＭＴ８１４８株であり、レーン２がＭＴ８１４８ＧＤ株であり、レーン３がＴＷ２９５株であり、レーン４がＴＷ８７１株であり、レーン５がＦＴ１株であり、レーン６がＦＴ１ＧＤ株であり、レーン７がＳＵ１株であり、レーン８がＹＫ１株であり、レーン９がＹＴ１株である。
【０３２２】
ＧＴＦＢは、不溶性グルカン合成の大部分を担うと考えられ、ミュータンス連鎖球菌の歯面への付着および歯垢の蓄積において、重要な毒性因子であると考えられている（Ｍａｔｔｏｓ−Ｇｒａｎｅｒら、２０００）。従って、血清型ｋ株のより低いＣＡ−ＣＴＦ活性は、ＧＴＦＢのより低い発現に起因し得る。一方で、菌体表層でのその発現は、血清型特異的多糖のグルコース側鎖の存在と相関し得る。総じて、これらの結果は、Ｓ．ｍｕｔａｎｓの他の主要な表面構造（例えば、ＧＴＦ、ＰＡおよびＧｂｐ）より程度が低いが、Ｓ．ｍｕｔａｎｓの血清型特異的多糖におけるグルコース側鎖の欠失がＳ．ｍｕｔａｎｓのう蝕原性と関連し得ることと結論付けられる。
【０３２３】
尚、発明を実施するための最良の形態の項においてなした具体的な実施態様または実施例は、あくまでも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、そのような具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべきものではなく、本発明の精神と次に記載する特許請求の範囲内で、いろいろと変更して実施することができるものである。
【産業上の利用可能性】
【０３２４】
これまで、感染性心内膜炎の発症に関与するＳ．ｍｕｔａｎｓ株については、他のＳ．ｍｕｔａｎｓ株と判別することは容易ではなかった。しかしながら、本発明では、感染性心内膜炎の感染に関与する可能性の高いＳ．ｍｕｔａｎｓ株を、新規な血清型ｋ型として容易に確認することができるので、本発明は、歯科医療分野等の医療現場だけでなく、医薬品産業や検査産業等に広く利用することができる。
【０３２５】
本発明によって、死に至る可能性がある感染性心内膜炎の発症を予防する観点から重要であると考えられているＳ．ｍｕｔａｎｓの血清型不定株が被験体中に存在するか否かを有効かつ効率的に判定する方法を提供することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ストレプトコッカス ミュータンス特異的な多糖抗原のグルコース側鎖量を低下させるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、
配列番号１ないし４の何れか１つに示される塩基配列；または
配列番号１ないし４の何れか１つに示される塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列、
からなることを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項２】
ストレプトコッカス ミュータンス特異的な多糖抗原のグルコース側鎖量を低下させるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、
配列番号１ないし４の何れか１つに示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または
配列番号１ないし４の何れか１つに示される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、
であることを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号１ないし４の何れか１つに示される少なくとも１２個連続する塩基配列または当該塩基配列の相補配列からなることを特徴とするオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
配列番号８ないし１０の何れか１つに示される塩基配列からなることを特徴とする請求の範囲第３項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
請求の範囲第１項または第２項に記載のポリヌクレオチドによってコードされることを特徴とするポリペプチド。
【請求項６】
ストレプトコッカス ミュータンス特異的な多糖抗原のグルコース側鎖量が低下していることを特徴とするストレプトコッカス ミュータンス株。
【請求項７】
請求の範囲第１項または第２項に記載のポリヌクレオチドを有することを特徴とする請求の範囲第６項に記載のストレプトコッカス ミュータンス株。
【請求項８】
請求の範囲第５項に記載のポリペプチドを発現することを特徴とする請求の範囲第６項に記載のストレプトコッカス ミュータンス株。
【請求項９】
請求の範囲第６項ないし第８項の何れか１項に記載のストレプトコッカス ミュータンス株と特異的に結合することを特徴とする抗体。
【請求項１０】
被験体サンプル中のストレプトコッカス ミュータンス株を検出する方法であって、
被験体サンプルより細菌を分離する工程；
上記分離した細菌のゲノムＤＮＡまたは総ＲＮＡを抽出する工程；および
上記ゲノムＤＮＡまたは総ＲＮＡをテンプレートにして、請求の範囲第３項または第４項に記載のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてＰＣＲ反応を行なう工程、
を包含することを特徴とするストレプトコッカス ミュータンス株を検出する方法。
【請求項１１】
上記組織サンプルが血液、唾液または歯垢より得られることを特徴とする請求の範囲第１０項に記載のストレプトコッカス ミュータンス株を検出する方法。
【請求項１２】
上記プライマーが、配列番号８に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号９または１０に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求の範囲第１０項または第１１項に記載のストレプトコッカス ミュータンス株を検出する方法。
【請求項１３】
被験体サンプル中のストレプトコッカス ミュータンス株を検出する方法であって、
被験体サンプルより細菌を分離する工程；
上記分離した細菌のゲノムＤＮＡまたは総ＲＮＡを抽出する工程；および
上記ゲノムＤＮＡまたは総ＲＮＡに対して、請求の範囲第３項または第４項に記載のオリゴヌクレオチドをプローブとして用いてハイブリダイゼーション反応を行なう工程、
を包含することを特徴とするストレプトコッカス ミュータンス株を検出する方法。
【請求項１４】
上記組織サンプルが血液、唾液または歯垢より得られることを特徴とする請求の範囲第１３項に記載のストレプトコッカス ミュータンス株を検出する方法。
【請求項１５】
上記オリゴヌクレオチドが配列番号８ないし１０の何れかに示される塩基配列からなることを特徴とする請求の範囲第１３項または第１４項に記載のストレプトコッカス ミュータンス株を検出する方法。
【請求項１６】
上記細菌を分離する工程が請求の範囲第９項に記載の抗体を用いることを特徴とする請求の範囲第１０項ないし第１５項の何れか１項に記載のストレプトコッカス ミュータンス株を検出する方法。
【請求項１７】
被験体サンプル中のストレプトコッカス ミュータンス株を検出する方法であって、
被験体サンプルより細菌を分離する工程；
上記分離した細菌と請求の範囲第９項に記載の抗体をインキュベートする工程；および
上記抗体と結合した細菌を検出する工程、
を包含することを特徴とするストレプトコッカス ミュータンス株を検出する方法。
【請求項１８】
請求の範囲第１０項ないし第１７項の何れか１項に記載のストレプトコッカス ミュータンス株を検出する方法を用いることを特徴とする被験体中のストレプトコッカス ミュータンス株の血清型を判定する方法。
【請求項１９】
請求の範囲第１０項ないし第１７項の何れか１項に記載のストレプトコッカス ミュータンス株を検出する方法を用いることを特徴とするストレプトコッカス ミュータンス株のスクリーニング方法。
【請求項２０】
請求の範囲第１９項に記載のスクリーニング方法によって取得されることを特徴とするストレプトコッカス ミュータンス株。
【請求項２１】
請求の範囲第３項または第４項に記載のオリゴヌクレオチドを備えることを特徴とするストレプトコッカス ミュータンス株を検出するためのキット。
【請求項２２】
上記オリゴヌクレオチドが配列番号９に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求の範囲第２１項に記載のストレプトコッカス ミュータンス株を検出するためのキット。
【請求項２３】
配列番号８に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをさらに備えることを特徴とする請求の範囲第２２項に記載のストレプトコッカス ミュータンス株を検出するためのキット。
【請求項２４】
配列番号１０に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをさらに備えることを特徴とする請求の範囲第２３項に記載のストレプトコッカス ミュータンス株を検出するためのキット。
【請求項２５】
ＰＣＲ反応またはハイブリダイゼーション反応に用いることを特徴とする請求の範囲第２１項ないし第２４項の何れか１項に記載のストレプトコッカス ミュータンス株を検出するためのキット。
【請求項２６】
請求の範囲第９項に記載の抗体を備えることを特徴とするストレプトコッカス ミュータンス株を検出するためのキット。
【請求項２７】
請求の範囲第９項に記載の抗体を製造する方法であって、緩衝液に懸濁した請求の範囲第６項ないし第８項の何れか１項に記載のストレプトコッカス ミュータンス株を５日間連続でウサギ耳介静脈に注射する工程を包含することを特徴とする抗体を製造する方法。
【請求項２８】
上記工程の後に１週間間隔をあけ、さらなる２週間において１週間に５日間ずつリン酸緩衝化生理食塩水に懸濁した上記ストレプトコッカス ミュータンス株を反復注射する工程をさらに包含することを特徴とする請求の範囲第２７項に記載の抗体を製造する方法。
【請求項２９】
配列番号１ないし４に示される塩基配列の少なくとも１２個連続する塩基配列を含むオリゴヌクレオチドが基板上に固定化されていることを特徴とする細菌検出器具。
【請求項３０】
上記オリゴヌクレオチドが、請求の範囲第３項または第４項に記載のオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求の範囲第２９項に記載の細菌検出器具。
【請求項１】
ストレプトコッカス ミュータンス特異的な多糖抗原のグルコース側鎖量を低下させるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、
配列番号１ないし４の何れか１つに示される塩基配列；または
配列番号１ないし４の何れか１つに示される塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列、
からなることを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項２】
ストレプトコッカス ミュータンス特異的な多糖抗原のグルコース側鎖量を低下させるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、
配列番号１ないし４の何れか１つに示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または
配列番号１ないし４の何れか１つに示される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、
であることを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号１ないし４の何れか１つに示される少なくとも１２個連続する塩基配列または当該塩基配列の相補配列からなることを特徴とするオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
配列番号８ないし１０の何れか１つに示される塩基配列からなることを特徴とする請求の範囲第３項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
請求の範囲第１項または第２項に記載のポリヌクレオチドによってコードされることを特徴とするポリペプチド。
【請求項６】
ストレプトコッカス ミュータンス特異的な多糖抗原のグルコース側鎖量が低下していることを特徴とするストレプトコッカス ミュータンス株。
【請求項７】
請求の範囲第１項または第２項に記載のポリヌクレオチドを有することを特徴とする請求の範囲第６項に記載のストレプトコッカス ミュータンス株。
【請求項８】
請求の範囲第５項に記載のポリペプチドを発現することを特徴とする請求の範囲第６項に記載のストレプトコッカス ミュータンス株。
【請求項９】
請求の範囲第６項ないし第８項の何れか１項に記載のストレプトコッカス ミュータンス株と特異的に結合することを特徴とする抗体。
【請求項１０】
被験体サンプル中のストレプトコッカス ミュータンス株を検出する方法であって、
被験体サンプルより細菌を分離する工程；
上記分離した細菌のゲノムＤＮＡまたは総ＲＮＡを抽出する工程；および
上記ゲノムＤＮＡまたは総ＲＮＡをテンプレートにして、請求の範囲第３項または第４項に記載のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてＰＣＲ反応を行なう工程、
を包含することを特徴とするストレプトコッカス ミュータンス株を検出する方法。
【請求項１１】
上記組織サンプルが血液、唾液または歯垢より得られることを特徴とする請求の範囲第１０項に記載のストレプトコッカス ミュータンス株を検出する方法。
【請求項１２】
上記プライマーが、配列番号８に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号９または１０に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求の範囲第１０項または第１１項に記載のストレプトコッカス ミュータンス株を検出する方法。
【請求項１３】
被験体サンプル中のストレプトコッカス ミュータンス株を検出する方法であって、
被験体サンプルより細菌を分離する工程；
上記分離した細菌のゲノムＤＮＡまたは総ＲＮＡを抽出する工程；および
上記ゲノムＤＮＡまたは総ＲＮＡに対して、請求の範囲第３項または第４項に記載のオリゴヌクレオチドをプローブとして用いてハイブリダイゼーション反応を行なう工程、
を包含することを特徴とするストレプトコッカス ミュータンス株を検出する方法。
【請求項１４】
上記組織サンプルが血液、唾液または歯垢より得られることを特徴とする請求の範囲第１３項に記載のストレプトコッカス ミュータンス株を検出する方法。
【請求項１５】
上記オリゴヌクレオチドが配列番号８ないし１０の何れかに示される塩基配列からなることを特徴とする請求の範囲第１３項または第１４項に記載のストレプトコッカス ミュータンス株を検出する方法。
【請求項１６】
上記細菌を分離する工程が請求の範囲第９項に記載の抗体を用いることを特徴とする請求の範囲第１０項ないし第１５項の何れか１項に記載のストレプトコッカス ミュータンス株を検出する方法。
【請求項１７】
被験体サンプル中のストレプトコッカス ミュータンス株を検出する方法であって、
被験体サンプルより細菌を分離する工程；
上記分離した細菌と請求の範囲第９項に記載の抗体をインキュベートする工程；および
上記抗体と結合した細菌を検出する工程、
を包含することを特徴とするストレプトコッカス ミュータンス株を検出する方法。
【請求項１８】
請求の範囲第１０項ないし第１７項の何れか１項に記載のストレプトコッカス ミュータンス株を検出する方法を用いることを特徴とする被験体中のストレプトコッカス ミュータンス株の血清型を判定する方法。
【請求項１９】
請求の範囲第１０項ないし第１７項の何れか１項に記載のストレプトコッカス ミュータンス株を検出する方法を用いることを特徴とするストレプトコッカス ミュータンス株のスクリーニング方法。
【請求項２０】
請求の範囲第１９項に記載のスクリーニング方法によって取得されることを特徴とするストレプトコッカス ミュータンス株。
【請求項２１】
請求の範囲第３項または第４項に記載のオリゴヌクレオチドを備えることを特徴とするストレプトコッカス ミュータンス株を検出するためのキット。
【請求項２２】
上記オリゴヌクレオチドが配列番号９に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求の範囲第２１項に記載のストレプトコッカス ミュータンス株を検出するためのキット。
【請求項２３】
配列番号８に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをさらに備えることを特徴とする請求の範囲第２２項に記載のストレプトコッカス ミュータンス株を検出するためのキット。
【請求項２４】
配列番号１０に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをさらに備えることを特徴とする請求の範囲第２３項に記載のストレプトコッカス ミュータンス株を検出するためのキット。
【請求項２５】
ＰＣＲ反応またはハイブリダイゼーション反応に用いることを特徴とする請求の範囲第２１項ないし第２４項の何れか１項に記載のストレプトコッカス ミュータンス株を検出するためのキット。
【請求項２６】
請求の範囲第９項に記載の抗体を備えることを特徴とするストレプトコッカス ミュータンス株を検出するためのキット。
【請求項２７】
請求の範囲第９項に記載の抗体を製造する方法であって、緩衝液に懸濁した請求の範囲第６項ないし第８項の何れか１項に記載のストレプトコッカス ミュータンス株を５日間連続でウサギ耳介静脈に注射する工程を包含することを特徴とする抗体を製造する方法。
【請求項２８】
上記工程の後に１週間間隔をあけ、さらなる２週間において１週間に５日間ずつリン酸緩衝化生理食塩水に懸濁した上記ストレプトコッカス ミュータンス株を反復注射する工程をさらに包含することを特徴とする請求の範囲第２７項に記載の抗体を製造する方法。
【請求項２９】
配列番号１ないし４に示される塩基配列の少なくとも１２個連続する塩基配列を含むオリゴヌクレオチドが基板上に固定化されていることを特徴とする細菌検出器具。
【請求項３０】
上記オリゴヌクレオチドが、請求の範囲第３項または第４項に記載のオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求の範囲第２９項に記載の細菌検出器具。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０６３９９２
【国際公開日】平成１７年７月１４日（２００５．７．１４）
【発行日】平成１９年１２月２０日（２００７．１２．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５１６７０６（Ｐ２００５−５１６７０６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１９６３１
【国際出願日】平成１６年１２月２８日（２００４．１２．２８）
【出願人】（０００００１９０４）サントリー株式会社 (319)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１７年７月１４日（２００５．７．１４）
【発行日】平成１９年１２月２０日（２００７．１２．２０）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１９６３１
【国際出願日】平成１６年１２月２８日（２００４．１２．２８）
【出願人】（０００００１９０４）サントリー株式会社 (319)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]