有機酸生産酵母の培養方法
【課題】有機酸生産酵母に適した培養方法を提供する。
【解決手段】有機酸生産酵母の培養液における単位時間あたりのｐＨ変化量を含むｐＨ情報を取得し、少なくとも前記ｐＨ変化量に基づいて炭素源流加量を調節しつつ培養する流加培養工程を備えるように培養する。こうすることで培養液中の炭素源動態に対応して的確にかつレスポンスよく流加量を調節できるため、効率的な増殖が可能となっている。
【解決手段】有機酸生産酵母の培養液における単位時間あたりのｐＨ変化量を含むｐＨ情報を取得し、少なくとも前記ｐＨ変化量に基づいて炭素源流加量を調節しつつ培養する流加培養工程を備えるように培養する。こうすることで培養液中の炭素源動態に対応して的確にかつレスポンスよく流加量を調節できるため、効率的な増殖が可能となっている。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有機酸生産酵母の培養方法、該培養方法を利用した有機酸生産酵母の菌体生産方法、有機酸生産方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、乳酸などの有機酸を発酵生産する手段として、遺伝的に改変した酵母が用いられるようになってきている。工業的規模でこうした遺伝子組換え酵母を用いて有機酸生産を行うには、まず、生産に使用する酵母菌体を増殖、すなわち、酵母菌体を生産する。有機酸の効率的な発酵生産には、こうした酵母菌体の生産自体を効率的に行うことが重要である。
【０００３】
一般的に、酵母には、好気培養中に好気発酵を伴う「クラブトリーポジティブ」な株と、好気発酵を伴わない「クラブトリーネガティブ」な株が存在する。一般的には前者にはサッカロマイセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）などが含まれ、後者にはクルイベルマイセス（Kluyverimyces）、ピキア（Picha）などが含まれる。「クラブトリーネガティブ」な株は非常に増殖が遅いので一般的には「クラブトリーポジティブ」な株を用いる。
【０００４】
サッカロマイセス・セレビジエなどの酵母菌体を増殖するためには、糖濃度をできるだけ低く制御して好気発酵を抑制して菌体を短時間に効率的に増殖させることが重要である。好気発酵は、クラブトリー効果ともいわれ、糖濃度が高い場合に、Ｏ２濃度が十分であっても糖がアルコール発酵経路に利用され、結果として菌体収率が低下する現象である。このため、酵母菌体を増殖させる場合、基質濃度を低濃度に制御できる流加培養が採用され、基質濃度を培養系の特定物質をモニターして添加すべき基質濃度を決定して培養系の基質濃度を制御することが行われている。
【０００５】
こうした制御方法としては、ＣＯ２制御やＲＱ（呼吸商：排気ガス中のＣＯ２の発生量とＯ２減少量との比）制御がある。ＣＯ２制御やＲＱ制御は、培養系から排出されるＣＯ２量に基づいて好気発酵レベルを検知し、それにより基質添加量を決定するものである。また、培養液中のエタノール量を直接検出するエタノール制御も用いられている（特許文献１）。さらに、溶存酸素（ＤＯ）を指標とする制御方法（特許文献２）、培養液のｐＨを指標とする制御方法（非特許文献１）、ＤＯとｐＨとの双方を指標とする制御方法（特許文献３）がある。ＤＯを指標とする方法は、増殖が抑制されると酸素消費量が低下してＤＯが上昇することを利用し、一定量の基質を添加後ＤＯが上昇するまでの期間に基づいて培養系中の菌体に必要な基質量を算出している。また、ｐＨによる制御方法は、培養系内の糖が消費しつくされると菌体は有機酸を消費し始めてｐＨが上昇することを利用して、ｐＨに閾値を設定して、閾値を超えたときに基質を添加するというものである。
【特許文献１】特開平５−７６３４６号公報
【特許文献２】特開平６−２６１７４１号公報
【特許文献３】特開昭６３−５７０３６号公報
【非特許文献１】D. Porto et al., Ros. Microbiol. 1991, 142, 535-539
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、乳酸生産酵母については、乳酸収率を向上させるために、アルコール（エタノール）生産量を低減させるように遺伝子工学的な改良が施されている。こうした改良は、アルコール発酵経路をできるだけ抑制すること意図している。したがって、培養液中のエタノールやエタノールに付随して発生するＣＯ２さらにはＲＱを指標とする制御方法を使用することは好ましくない。
【０００７】
また、非特許文献１や特許文献２に記載のＤＯ制御やｐＨ制御ではＤＯやｐＨが閾値以上になるのを待って制御するため、培養時間が長くなる傾向があるとともに、培養系において好気発酵が開始されたタイミングにはなんら制御されない。しかも、本発明者らによれば、ＤＯの上昇は、糖が枯渇した後に遅れて観察されることがわかった。
【０００８】
以上のように、有機酸生産酵母に適した菌体増殖のための培養方法は未だ見出されていない。
【０００９】
そこで、本発明は、有機酸生産酵母に適した培養方法、該酵母の菌体生産方法、培養装置、培養制御方法及び培養制御プログラムを提供することを一つの目的とする。また、本発明は、的確に炭素源濃度を制御できる培養方法、該酵母の菌体生産方法、培養装置、培養制御方法及び培養制御プログラムを提供することを他の一つの目的とする。また、本発明は、こうして培養された有機酸生産酵母を用いた有機酸の生産方法を提供することを他の一つの目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の一つの形態によれば、有機酸生産酵母の培養方法であって、前記有機酸生産酵母の培養液における単位時間あたりのｐＨ変化量を含むｐＨ情報を取得し、少なくとも前記ｐＨ変化量に基づいて炭素源流加量を調節しつつ流加培養する工程を備える、培養方法が提供される。前記有機酸は乳酸であることが好ましい。
【００１１】
この培養方法においては、前記ｐＨ変化量が正のときには前記流加量を増大させ、前記ｐＨ変化量が負のときには前記流加量を低下させることができる。また、前記ｐＨ情報は、測定ｐＨ値と所定のｐＨ閾値との関係を含んでおり、前記ｐＨ変化量が正であってかつ測定ｐＨ値がｐＨ上限閾値を超えたときには前記流加量を増大させ、前記ｐＨ変化量が負であってかつ測定ｐＨ値がｐＨ下限閾値を超えたときには前記流加量を低下させるようにすることができる。
【００１２】
また、前記ｐＨ情報はｐＨ測定値と目標ｐＨ値とのｐＨ差分量を含んでおり、直前の流加量と前記ｐＨ差分量とに基づいて設定される流加量で炭素源を流加するようにしてもよいし、直前の流加量と前記ｐＨ変化量とに基づいて設定される流加量で炭素源を流加するようにしてもよい。
【００１３】
さらに、前記ｐＨ情報はｐＨ測定値と目標ｐＨ値とのｐＨ差分量を含んでおり、直前の流加量と前記ｐＨ差分量とに基づく第１の流加量及び／又は直前の流加量と前記ｐＨ変化量とに基づく第２の流加量で炭素源を添加するようにしてもよい。
【００１４】
さらにまた、前記ｐＨ情報はｐＨ測定値と目標ｐＨ値とのｐＨ差分量を含んでおり、前記流加量を増大させるときには、直前の流加量と前記ｐＨ差分量とに基づいて流加量を決定し、前記流加量を低下させるときには、直前の流加量と前記ｐＨ変化量とに基づいて流加量を決定するようにしてもよい。
【００１５】
本培養方法においては、前記有機酸生産酵母は、クラブトリー効果を発現する遺伝子のプロモーターの制御下に有機酸生産関連遺伝子を保持していることが好ましく、前記プロモーターは、ピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子のプロモーターであることが好ましい。
【００１６】
本発明の他の一つの形態によれば、有機酸生産酵母の菌体生産方法であって、上記いずれかに記載の流加培養工程を実施する、方法が提供される。
【００１７】
また、本発明の他の一つの形態によれば、有機酸の生産方法であって、上記菌体生産方法によって生産された有機酸生産酵母を用いて有機酸を生産する、方法が提供される。
【００１８】
さらにまた、本発明の他の一つの形態によれば、有機酸生産酵母の培養装置であって、培養槽と、前記培養槽中の培養液に炭素源を流加する炭素源流加手段と、前記培養液のｐＨを測定するｐＨ測定手段と、前記ｐＨ測定手段による測定結果に基づく単位時間あたりのｐＨ変化量を含むｐＨ情報を取得し、少なくとも前記ｐＨ変化量に基づいて前記炭素源流加手段により前記培養液に添加される炭素源流加量を設定する流加量制御手段と、を備える培養装置が提供される。
【００１９】
本発明の他の一つの形態によれば、有機酸生産酵母の培養制御方法であって、
前記有機酸生産酵母の培養液のｐＨを取得するステップと、前記ステップでの測定結果に基づく単位時間あたりのｐＨ変化量を含むｐＨ情報を取得するステップと、少なくとも前記ｐＨ情報に基づいて前記培養液に流加する炭素源流加量を設定するステップとを備える、方法が提供される。
【００２０】
また、本発明の他の一つの形態によれば、有機酸生産酵母の培養制御プログラムであって、１又は２以上のコンピュータに、請求項１４に記載の各ステップを実行させる、プログラムが提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明の有機酸生産酵母の培養方法は、前記有機酸生産酵母の培養液における単位時間あたりのｐＨ変化量を含むｐＨ情報を取得し、少なくとも前記ｐＨ変化量に基づいて炭素源流加量を調節しつつ流加培養する工程を備えることを特徴としている。
【００２２】
本発明は、本発明者らが、炭素源が不足すると培養液中の有機酸が消費されることにより、炭素源の過不足を培養液のｐＨ変化としてレスポンスよく検知できることを見出したことによるものである。さらに、有機酸生産酵母の菌体増殖時に、炭素源が過剰になると好気発酵によりエタノールとともにあるいはエタノールに替わって有機酸が生産されることで、炭素源の過不足をより精度よく検知できることを見出したことによるものである。
【００２３】
有機酸生産酵母の培養液のｐＨ変化量は、有機酸生産酵母の培養液における有機酸の生産／消費動態、すなわち、炭素源供給量の過剰及び不足を的確にかつレスポンスよく検知するパラメータであることがわかった。このため、本発明の培養方法によれば、少なくともｐＨ変化量に基づいて流加量を調節することにより炭素源濃度を適切に制御して好ましい菌体増殖状態を得ることができる。また、本発明によれば、菌体増殖には望ましくない有機酸の存在を利用して有機酸の動態によるｐＨ変化量を指標として用いることにより効果的な流加量制御を行うことができる。また、ｐＨ変化量を指標として流加量を制御することで同時に酸やアルカリによるｐＨ調整を回避することができる。
【００２４】
以下、本発明の培養方法、有機酸生産酵母の生産方法、有機酸生産酵母の培養装置、有機酸生産酵母の培養制御方法及び培養制御プログラム並びに有機酸の生産方法について順次説明する。
【００２５】
（有機酸生産酵母の培養方法）
本培養方法における有機酸生産酵母は、有機酸生産が活性化された酵母であればよい。自然界からのスクリーニング、人工突然変異及び遺伝子工学的改変などのいずれの手法によって得られた酵母であってもよいが、遺伝子組換えにより有機酸を生産するように形質転換された酵母であることが好ましい。遺伝子組換え酵母は、一般に有機酸を高効率に発現するように構築されているからである。有機酸生産酵素遺伝子は酵母の染色体外にあっても染色体上にあってもよいし、どのようなプロモーターの制御下に保持されていてもよい。どういった形態であれ、糖から有機酸の生産する能力を有する以上は菌体増殖の過程で有機酸を生産する可能性があるからである。
【００２６】
また、本発明において「有機酸」とは、酸性を示す有機化合物であるが、有機酸が備える酸性基としては好ましくはカルボン酸基である。また、「有機酸」には、遊離の酸の他、有機酸塩を含む。このような有機酸として、具体的には、乳酸、酪酸、酢酸、ピルビン酸、コハク酸、ギ酸、リンゴ酸、クエン酸、マロン酸、プロピオン酸、アスコルビン酸、アジピン酸などを挙げることができるが、好ましくは、乳酸である。乳酸には、Ｌ−乳酸、Ｄ−乳酸、及びＤＬ−乳酸があるが、これらのいずれをも含む。
【００２７】
遺伝子組換え酵母においては適当なプロモーターの制御下に有機酸合成酵素をコードする遺伝子を発現可能に保持している。高効率で有機酸を生産するには、例えば、ピルビン酸脱炭酸酵素１（ＰＤＣ１）などのピルビン酸脱炭酸酵素（ＰＤＣ）遺伝子プロモーター、アルコール脱水素酵素１（ＡＤＨ１）などのアルコール脱水素酵素（ＡＤＨ）遺伝子プロモーター、高浸透圧応答７遺伝子（ＨＯＲ７遺伝子）プロモーター、グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素２遺伝子（ＴＤＨ２遺伝子）プロモーター、熱ショックタンパク質３０遺伝子（ＨＳＰ３０遺伝子）プロモーター、ヘキソース輸送タンパク質７遺伝子（ＨＸＴ７遺伝子）プロモーター、チオレドキシンペルオキシダーゼ１遺伝子（ＡＨＰ１遺伝子）プロモーター、膜タンパク質１関連遺伝子（ＭＲＨ１遺伝子）プロモーター、グリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素３（ＴＤＨ３）遺伝子プロモーター、グリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素１遺伝子（ＴＤＨ１遺伝子）プロモーター、トリオースリン酸イソメラーゼ１遺伝子（ＴＰＩ１遺伝子）プロモーター及び細胞壁関連タンパク質１２遺伝子（ＣＣＷ１２遺伝子）及びリボゾーマルプロテインＳ３１遺伝子（ＲＳＰ３１遺伝子）プロモーターなどが挙げられる。なお、これらはいずれも酵母における内在性プロモーターであり、酵母において有機酸を生産させるのに好ましい高発現プロモーターである。これらの１種又は２種以上を本発明の有機酸生産酵母において好ましく用いることができる。
【００２８】
本発明の有機酸生産酵母においては、糖濃度が高いと発現が促進されるか又は発現が抑制されるプロモーターの制御下に有機酸合成酵素遺伝子を保持していることが好ましい。こうすることで糖濃度に応じて有機酸を生産させるとともに消費させることもできるからである。より好ましくは糖濃度が高いと発現が促進されるプロモーターの制御下に有機酸合成酵素遺伝子を保持している。さらに好ましくは、クラブトリー効果を発現する遺伝子のプロモーターの制御下に有機酸合成酵素遺伝子を保持している。このようなクラブトリー効果を発現する遺伝子のプロモーターは酵母においては本来的に強力なプロモーターであり、有機酸生産に好適であるからである。こうしたプロモーターとしては、具体的には、酵母におけるアルコール発酵経路にあるピルビン酸脱炭酸酵素（ＰＤＣ）遺伝子のプロモーターやアルコール脱水素酵素（ＡＤＨ）遺伝子などのプロモーターが挙げられる。これらの酵素はそれぞれアイソザイムが存在しているが、ＰＤＣ１プロモーターやＡＤＨ１あるいはＡＤＨ２プロモーターであることが好ましい。より好ましくはＰＤＣ１プロモーターである。ＰＤＣ１プロモーターの制御下で有機酸を合成する酵素を発現させることにより、培養液中の炭素源の過不足に対して良好なレスポンスで有機酸を生産及び消費させることができ、炭素源の過不足を培養液のｐＨ動態として感度よく検出できるとともに、高効率で有機酸を発酵することが期待できるからである。なお、これらのプロモーターの１種又は２種以上がノックアウト等により抑制又は不活性化されていることが好ましく、より好ましくは、酵母染色体上においてこれらのプロモーターの制御下において内在されていた遺伝子に替わって有機酸生産酵素遺伝子が保持されている。こうした有機酸生産酵母は、例えば、特開２００３−９３０６０、特開２００３−２５９８７８、特開２００３−３３４０９２、特開２００４−１８７６４３、特開２００５−１３９２７０に開示されている。
【００２９】
有機酸合成酵素としては、乳酸生産の場合には、Ｌ−乳酸脱水素酵素、Ｄ−乳酸脱水素酵素等の酵素、ピルビン酸生産の場合にはピルビン酸キナーゼ等、酢酸生産の場合にはピルビン酸オキシダーゼ等、コハク酸生産の場合にはスクシニルＣｏＡシンテターゼ等、リンゴ酸の場合にはフマル酸ヒドラターゼ等、クエン酸生産の場合にはクエン酸シンテターゼ等を例示できる。
【００３０】
例えば、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）としては、生物の種類に応じてあるいは生体内においても各種同族体が存在する。本発明において使用する乳酸脱水素酵素としては、天然由来のＬＤＨの他、化学合成的あるいは遺伝子工学的に人工的に合成されたＬＤＨも包含している。ＬＤＨとしては、好ましくは、乳酸菌などの原核生物もしくはカビなどの真核微生物由来であり、より好ましくは、植物、動物、昆虫などの高等真核生物由来であり、さらに好ましくは、ウシを始めとする哺乳類を含む高等真核生物由来である。Ｌ−ＬＤＨとしては、ウシ由来のＬＤＨ（Ｌ−ＬＤＨ）である。さらに、本発明におけるＬＤＨは、これらのＬＤＨのホモログも包含している。ＬＤＨホモログは、天然由来のＬＤＨのアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸でありかつＬＤＨ活性を有しているタンパク質、および、天然由来のＬＤＨとアミノ配列の相同性が少なくとも７０％、好ましくは８０％以上を有しかつＬＤＨ活性を有しているタンパク質を含んでいる。また、Ｄ−ＬＤＨとしては、大腸菌、タコ及び乳酸菌由来のものなどが挙げられる。好ましくは乳酸菌由来のＤ−ＬＤＨである。なお、有機酸合成酵素をコードするコード領域は、酵母において複数コピー導入されていることが好ましい。
【００３１】
こうした組換え酵母は、通常の遺伝子組換え酵母の作製法に基づいて取得することができる。すなわち、宿主の酵母に、トランスフォーメーション法など従来公知の酵母への遺伝子導入法から選択される適切な手段により、外来遺伝子を導入することができる。外来遺伝子導入のためのＤＮＡ構築物は、例えば、適当なプロモーターとコードＤＮＡと転写調節領域等を含むＤＮＡ構築物とすることができる。こうしたＤＮＡ構築物としては、特に限定しないで、ＤＮＡそのもの、プラスミド（ＤＮＡ）、ウイルス（ＤＮＡ）バクテリオファージ（ＤＮＡ）、レトロトランスポゾン（ＤＮＡ）、人工染色体（ＹＡＣ）などから、外来遺伝子の導入形態（染色体外あるいは染色体内）に応じて選択される。ＤＮＡ構築物には、ターミネーター他、必要に応じてエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）を連結することができる。選択マーカーとしては、特に限定しないで、薬剤抵抗性遺伝子、栄養要求性遺伝子などを始めとする公知の各種選択マーカー遺伝子を利用できる。なお、ＰＤＣ１遺伝子のプロモーターなど特定のプロモーターの制御下に相同組換えにより有機酸合成酵素のコード領域を導入することも当業者であれば適宜行うことができる。
【００３２】
こうした組換え酵母の宿主酵母としては、サッカロマイセス・セレビシエ、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）などのサッカロマイセス属酵母を含む「クラブトリーポジティブ」な酵母が挙げられる。クラブトリーポジティブ」な酵母は、本来的に又は遺伝子組換え若しくは変異などによって人工的に「クラブトリーポジティブ」を獲得した酵母であってもよい。こうした酵母のなかでも、サッカロマイセス・セレビシエなどのサッカロマイセス属酵母が好ましい。
【００３３】
こうした有機酸生産酵母を培養する培養液の組成は特に限定されない。通常の培地を必要に応じて選択することができる。また、炭素源としては、ショ糖、糖蜜、グルコースなどの各種の糖類のほかグリセロール等を用いることができるが、好ましくは糖類を用いる。有機酸生産酵母の培養液は、当初の培養液とその後に流加される流加液とによって構成されることになるが、流加液における糖も同様のものを用いることができる。また、流加液にも、適宜窒素源やビタミン類などを含ませることができる。
【００３４】
流加培養工程の培養条件は、適宜設定することができるが、培養液のｐＨは、４．０以上６．５以下であることが好ましい。より好ましくは、４．５以上であり、また、６．０以下である。また、培養温度は、例えば、２５℃〜３５℃程度、好ましくは３０℃〜３２℃程度とすることができる。なお、培養中は、必要に応じてアンピシリン、テトラサイクリンなどの抗生物質を培地に添加することができる。
【００３５】
本発明の培養方法は、こうした有機酸生産酵母の培養液におけるｐＨ情報に基づいて炭素源流加量を調節しつつ流加培養する工程を備えている。なお、流加培養とは、炭素源を含む流加基質を連続的にあるいは断続的に添加しつつ培養する方法である。
【００３６】
本発明の培養方法によって菌体増殖のために流加培養方法を実施する場合、流加量制御のために必要な有機酸を培養液中に含有させておく必要がある。本発明は培養液中の有機酸動態を利用するものだからである。したがって、好ましくは流加培養に先立って、バッチ方式で培養するシード培養を実施し、ある程度の菌体濃度（例えば、ＯＤ換算で４０程度）で培養液中のグルコース濃度が所定量以下（例えば、０．０１質量％以下）になったとき流加培養を開始するようにする。こうした状態の培養液には乳酸が既に生産されている。なお、本培養方法においては、有機酸が流加量制御に必要であるため、培養終了直前まで存在していることが好ましく、培養終了とともに消費されていることが好ましい。したがって、本培養方法によれば、培養液中の有機酸は全体として減少させるようになっている。
【００３７】
炭素源の流加量は、少なくとも一つのパラメータに基づいて設定されることが好ましく、こうした流加量の設定は一定時間間隔あるいはパラメータの測定値等に基づいて適宜行われるようになっていることが好ましい。本発明の培養方法では上記パラメータとしてｐＨ情報を用いる。炭素源不足時には、培養液中の有機酸が消費されてｐＨが上昇するため、培養液中の炭素源動態をｐＨの上昇として検出して炭素源を制御できる。また、糖濃度に応じて発現が促進され又は抑制されるプロモーター下に有機酸合成酵素遺伝子を保持する有機酸生産酵母においては、炭素源過剰時若しくは不足時に有機酸が生産され、炭素源不足時若しくは過剰時に有機酸が消費されるため、また、ｐＨは他のＣＯ２やＤＯなどのパラメータに比較して高い測定精度でセンサーにより検出でき、また、糖濃度が高いと活性化するプロモーターやクラブトリー効果を発現する遺伝子のプロモーターの制御下に有機酸合成酵素遺伝子がある場合には、これらの他のパラメータよりも応答性よく炭素の過不足に反応して検出できる。さらに、ｐＨをパラメータとすることは、有機酸生産酵母のアルコール発酵能が抑制されている場合には特に有効である。
【００３８】
このように、有機酸生産酵母の流加培養においてｐＨは炭素源動態(代謝流れ)や菌体増殖の感度のよい指標であるため、ｐＨ変化を利用することで細やかでかつ効果的な増殖制御が可能となっている。本発明者らによれば、流加によりｐＨが上昇も下降もしないとき、すなわち、有機酸が発生も消費もされないときに最も効率的でかつ高い増殖速度が得られるという知見を得ている。しかしながら、ｐＨが一定になるように流加量を調整することは極めて困難であるため種々検討したところ、ｐＨ変化量に基づいて流加量を調節することにより、結果としてｐＨを緩やかにハンチングさせながら一定値に近づけることができ、これにより、ｐＨ一定状態に近い高効率でかつ高速な増殖が得られることがわかったのである。すなわち、ｐＨ変化量に基づいてｐＨのハンチング範囲（ｐＨの変動範囲）を小さくするように、あるいはｐＨのハンチング周期を長くするように、さらにはこれらの両方を達成するように流加量を調節することが、菌体増殖に有効であることがわかった。
【００３９】
培養液のｐＨ情報は、流加培養工程において連続的又は間欠的に培養液のｐＨを測定することにより得ることができる。
【００４０】
ｐＨ情報は、少なくとも所定時間あたりのｐＨ変化量を含んでいる。上記したように、ｐＨ変化量は、有機酸生産酵母の培養状態における炭素源の過不足の好ましい指標である。培養液における単位時間あたりのｐＨ変化量を検出するには、少なくとも異なるタイミングで培養液のｐＨを測定すればよい。所定時間あたりのｐＨ変化量は、新たに測定したｐＨ値から所定時間前に測定したｐＨ値を差し引いたｐＨ差分値として得ることができる。ここでｐＨ変化量の特定する所定時間は、培養工程を通じて一定に設定してもよいし、培養工程の経過に応じて適宜あるいは予め変化させるようにしてもよい。このような所定時間は、ｐＨ変化量に基づいて流加量をフィードバック制御するのに好ましい時間間隔でもある。こうした所定時間は、例えば、１０秒から３０分程度とすることができ、好ましくは、１分から２０分程度、より好ましくは５分〜１５分程度とすることができる。
【００４１】
ｐＨ情報は、ｐＨ変化量のほか、新たに測定したｐＨ値とｐＨ上限閾値又はｐＨ下限閾値との関係を含むことができる。閾値は、流加量を制御するか否かを判定するための値であり、例えば、目標ｐＨ値を挟んで上下それぞれ一定範囲をｐＨ不感帯となるように目標ｐＨ値よりも高いｐＨ上限閾値と目標ｐＨ値よりも低いｐＨ下限閾値とを設定することができる。したがって、測定ｐＨ値が上下限閾値を超えていれば流加量を制御し、上下限閾値以内であれば流加量は制御されない（流加量は維持される）こととなる。また、閾値の上下に広ければ大きいほど不感帯が大きくなり流加量制御が抑制され、閾値が狭いほど不感帯は小さくなり流加量制御が積極的に行われる。
【００４２】
ｐＨ情報には、さらに、測定ｐＨ値と目標ｐＨ値との差分、すなわち、目標ｐＨ値から測定ｐＨ値を差し引いたｐＨ差分量もｐＨ情報に含めることができる。ｐＨ差分量は、例えば、流加量を算出するのに用いることができる。なお、ｐＨ変化量も流加量の算出に用いることができる。
【００４３】
なお、ｐＨ情報には、ｐＨ変化量算出の基礎である測定ｐＨ値のほか所定時間前のｐＨ測定値も当然に包含されるものである。また、目標ｐＨ値や上下のｐＨ閾値は、通常予め設定しておくことができる。
【００４４】
ｐＨ情報に基づいて流加量を調節する手法としては、ＰＩＤ制御などの定値制御、シンプレックス法、勾配法、遺伝的アルゴリズム等などの最適制御、ファジイ制御等などを用いることができる。こうした制御においては、例えば、ｐＨ変化量が正のとき、すなわち、ｐＨが上昇傾向にあるときには直前の流加量よりも流加量を増大させ、ｐＨ変化量が負のとき、すなわち、ｐＨが低下傾向にあるときには直前の流加量よりも流加量を低下させるようにすることができる。ｐＨ上昇傾向は、炭素源が不足して有機酸が消費された結果であり、ｐＨ低下傾向は、炭素源が過剰で有機酸が生産された結果だからである。なお、ｐＨ変化量が０のときには、流加量は維持される。こうした流加量制御によれば、炭素源の不足に対応して流加量を積極的に制御することができる。
【００４５】
さらに、ｐＨ変化量が正であってかつ測定ｐＨ値がｐＨ上限閾値を超えたときには流加量を増大させ、ｐＨ変化量が負であってかつ測定ｐＨ値がｐＨ下限閾値を超えたときには流加量を低下させるようにすることもできる。ｐＨ変化量が０のときには流加量を維持するようにする。こうすること過度に流加量を増大させたり低下させたりすることを防ぐことができる。
【００４６】
また、流加量は、各種の制御手法に応じて設定することができるが、有機酸生産酵母においては、直前に設定し実行した流加量とｐＨ差分量及び／又はｐＨ変化量とに基づいて設定することができる。また、ｐＨ差分量及び／又はｐＨ変化に比例させるようにすることが好ましい。例えば、流加量をｐＨ差分量に比例させることで、ｐＨ値を目標ｐＨ値に対して反転させるようにするように制御でき、ｐＨ変化量に比例させることで、ｐＨ値が目標ｐＨ値に対して反転させるよりもｐＨの上下動がなくなるように制御できる。流加量はいずれの方式によって設定してもよいが、例えば、ｐＨ変化量が正のときも負のときにも、ｐＨ差分量に比例させるように設定してもよいし、ｐＨ変化量が正（ｐＨ上昇時）のときには、ｐＨ差分量に比例させるように設定できる。また、ｐＨ変化量が正のときには、ｐＨ差分量に比例させるように設定し、ｐＨ変化量が負（ｐＨ下降時）のときにはｐＨ変化量に比例させるように設定してもよい。
【００４７】
このように、ｐＨの下降時には流加をやめるのでなく流加量を減らすのであるが、その際、ｐＨ変化量に基づくなどして流加量を減らすことで好気発酵を抑制して有機酸を消費させることで緩やかに目標値にまで上昇させるようにし、ｐＨ上昇時には流加量を増大させるのであるが、その際、ｐＨ差分量に基づくなどして積極的に炭素源を流加して微量に好気発酵させて有機酸を発生させることでｐＨを速やかに下降させるようにするようにする。こうすることで、ｐＨのハンチング範囲やハンチング周期を好適化してハンチングを緩やかにすることで容易にｐＨ変動を一定値に近づけるようにすることができる。この結果、高収率かつ高速に流加培養することができる。
【００４８】
流加量を設定するための式としては、例えば、以下の式（１）及び（２）が挙げられる。式（１）は、ｐＨ差分量に比例させて流加量を決定するものであり、式（２）はｐＨ変化量に比例させて添加量を決定するものである。なお、以下の式において流加量は重量としたが、必要に応じて流加液の濃度、流加速度、流加時間等の異なる形態で算出することができる。
ＦＲ’＝ＦＲ＋Ａ×ＦＲ×（ｐＨＰＶ−ｐＨＳＶ）＋Ｃ ・・・（１）
ＦＲ’＝ＦＲ＋Ｂ×ＦＲΔｐＨ＋Ｃ ・・・（２）
ただし、
ＦＲ’：新たに設定される流加量（ｇ）
ＦＲ：直前の流加量（ｇ）
ｐＨＰＶ：ｐＨ測定値
ｐＨＳＶ：目標ｐＨ値
ｐＨＦＮＺ：ｐＨ値の不感帯（例えば、０．０１）
ΔｐＨ：所定時間あたりのｐＨ変化量（ｐＨ測定値−前回のｐＨ測定値）
Ａ：係数（実験に基づいて設定することができる。例えば、１）
Ｂ：係数（実験に基づいて設定することができる。例えば、２）
Ｃ：定数（実験に基づいて設定することができる。例えば、０）
【００４９】
これらの式（１）及び（２）を用いた制御形態を図１及び図２に示す。図１には、式（１）又は式（２）で制御した場合の流加量の増減とｐＨ挙動とを示す。図２には、ｐＨ上昇時には式（１）を用いｐＨ下降時には式（２）を用いて制御した場合の流加量の増減とｐＨ挙動とを示す。なお、図２に示すように、式（１）は、ΔｐＨ＞０かつｐＨＰＶ＞（ｐＨＳＶ＋ｐＨＦＮＺ）のときに採用することが好ましく、式（２）はΔｐＨ＜０かつｐＨＰＶ＜(ｐＨＳＶ−ｐＨＦＮＺ)のときに採用することが好ましく、これら以外のときには流加量を変化させないとすることが好ましい。
【００５０】
流加培養工程は、培養液中の溶存酸素濃度がゼロになるなど、菌体濃度が上昇しなくなったときに終了することが好ましい。より好ましくは、流加培養終了時に乳酸が実質的になくなってｐＨの上下動がなくなった時点である。なお、流加培養終了時に乳酸が培地中に存在するときには、乳酸を消費させるように炭素源なしでの培養を時間が許す限り継続することが好ましい。
【００５１】
以上説明した有機酸生産酵母の培養方法によれば、培養液における炭素源の過不足を的確にかつレスポンスよく得ることができるため、有機酸生産酵母の菌体増殖に適した培養を実施できる。この結果、高効率かつ高速で菌体を増殖させることができる。特に、上記方法によれば、ｐＨ変化量に基づいて流加量を制御する結果、少なくともｐＨを緩やかにハンチングさせることになり、この結果、容易にｐＨを一定範囲値内にとどめることができる。このように、ｐＨ変化量に基づいて流加量を制御することで、ある程度のｐＨ変動を許容しつつも酸やアルカリによるｐＨ調整を回避して高効率かつ高速に流加培養を行うことができる。
【００５２】
また、以上説明した培養方法において２種類の流加量算出式を用いることにより、ハンチングを緩やかにして菌体増殖効率を高めている。すなわち、ｐＨ下降時（炭素源過剰時）にはｐＨ変化量を利用する式(２)などを用いてｐＨの上下動がなくなって一定値になるように制御することで、いずれ菌体が増殖して糖が不足し有機酸を消費することで緩やかにｐＨを上昇方向に転換させることができる。一方、ｐＨ上昇時にｐＨ差分量を利用する式(１)などを用いることで、過剰気味に制御してｐＨを速やかに目標値まで下降させるようにする。こうした制御により、全体としてｐＨのハンチング範囲を一定以下に維持しつつハンチング周期を長くしてハンチングを緩やかにし、一層ｐＨ一定の状態に近づけることができる。この結果、菌体増殖を一層高効率かつ高速化することができる。
【００５３】
（有機酸生産酵母の培養装置）
次に、有機酸生産酵母の培養装置について説明する。本発明の培養方法は、例えば、図３に示す培養装置２によって実施することができる。図３に示す培養装置２は、培養槽１０と、培養槽１０中の培養液のｐＨを検知するｐＨセンサ２０と、培養槽１０の培養液に炭素源を含んだ流加基質を流加する流加装置３０と、流加量等を制御するコンピュータ４０とを備えている。
【００５４】
培養槽１０は特に限定しないが流加培養に適した培養槽を用いることができる。流加装置３０は、特に限定しないが、流加液を貯留する貯留槽３２と流加液を培養槽１０に流加することができるポンプ３４と供給経路３６とを備えているとともに、ポンプ３４の駆動量や時間などをコントロールする流加装置３０の駆動制御装置３８を備えている。コンピュータ４０は、ＣＰＵを中心としてＲＯＭ、ＲＡＭ等で構成されるマイクロプロセッサを有するコントローラ４１や各種の入出力インターフェースのほかにディスプレイ４２を備えている。コンピュータ４０のＣＰＵは、ｐＨセンサ２０からの信号を取得するとともに、ポンプ３４の作動時間や流加液の供給速度などに関する各種の制御信号を駆動制御装置３８に出力するようになっている。なお、培養槽１０には、さらに、培養液に酸素を供給する酸素供給装置、培養液の撹拌装置などのほか、ＤＯセンサ、ＣＯ２センサなどを備えることもできる。
【００５５】
なお、培養装置２におけるｐＨセンサ２０は、本発明の培養装置におけるｐＨ測定手段に相当し、流加装置３０は、同様に炭素源流加手段に相当し、コンピュータ４０は流加量制御手段に相当している。
【００５６】
（有機酸生産酵母の流加培養制御方法及びプログラム）
次に、有機酸生産酵母の流加培養制御方法及びプログラムについて説明する。本発明の流加培養制御方法は、上記した本発明の培養方法を実施するのに好ましい制御方法であって、有機酸生産酵母の培養液のｐＨを取得するステップと、前記ステップでの測定結果に基づく単位時間あたりのｐＨ変化量を含むｐＨ情報を取得するステップと、少なくとも前記ｐＨ変化量に基づいて前記培養液に流加する炭素源流加量を設定するステップとを備えている。また、本発明のプログラムは、上記制御方法における各ステップを１又は２以上のコンピュータに実行させるプログラムである。以下、本発明の制御方法及びプログラムを、培養装置２を用いて有機酸生産酵母を流加培養するときの流加動作を用いて説明する。
【００５７】
図４には、流加動作のフローチャートの一例を示す。なお、流加培養は、まず有機酸生産酵母を一定量にまで増殖させるシード培養を行い、培養液中のグルコース量又は菌体量が一定量以上になったときに、菌体濃度等に基づいた所定の流加量で開始するものとする。また、以下に説明する流加動作フローは一定間隔毎（例えば、１０分間）にコンピュータ４０のＣＰＵによって実施され、こうした流加動作を実施するためのプログラムは、コンピュータ４０のコントローラのＲＯＭに予め記憶されているものとする。なお、流加培養開始時点での培養液のｐＨ、流加開始時点での流加量、ｐＨ目標値（ｐＨＳＶ）、上限閾値及び下限閾値がそれぞれＲＡＭの所定領域に格納されているものとする。
【００５８】
まず、ＣＰＵは、ｐＨセンサ２０からｐＨ測定値（ｐＨＰＶ）を取得する（ステップＳ１０）。そして、ＲＡＭの所定領域に格納された流加培養開始時のｐＨを取得してそのｐＨ変化量（ΔｐＨ）を算出する（ステップＳ２０）。次いで、ΔｐＨが０より大きいか、小さいか、あるいはゼロであるかを判定する（ステップＳ３０）。このステップＳ３０では、流加量を更新するか否か及び更新方法を決定する。ΔｐＨがゼロのとき、すなわち、ｐＨ変動がないときには直前の流加量ＦＲを維持するようにする。すなわち、新たに設定する流加量ＦＲとしてＦＲ’をＲＡＭの所定領域に格納する（ステップＳ４０）。そしてＦＲ’を駆動制御装置３８に出力して（ステップＳ５０）、この処理を終了する。
【００５９】
また、ΔｐＨがゼロより大きい場合、すなわち、ｐＨが上昇している場合には、さらに、ｐＨ測定値（ｐＨＰＶ）がｐＨの上限閾値を超えて大きいかどうかを判定する（ステップＳ６０）。ｐＨ測定値が上限閾値以下の場合には、ステップＳ４０及びステップＳ５０を実行してこの処理を終了する。すなわち、前回設定した流加量ＦＲはそのまま維持される。一方、ｐＨ測定値が上限閾値より大きい場合には、ｐＨ測定値からｐＨ目標値（ｐＨＳＶ）を差し引いたｐＨ差分量を算出し、このｐＨ差分量と前回流加量ＦＲとを利用して式(１)から新たな流加量ＦＲ’を算出し、ＦＲ’をＲＡＭのＦＲ格納領域に格納することでＦＲをＦＲ’で更新する（ステップＳ７０）。そして、ＦＲ’を駆動制御装置３８に出力して（ステップＳ８０）、この処理を終了する。
【００６０】
さらに、ΔｐＨがゼロより小さい場合、すなわち、ｐＨが下降している場合には、ｐＨ測定値（ｐＨＰＶ）が下限閾値を超えて小さいかどうかを判定する（ステップＳ９０）。ｐＨ測定値が下限閾値以上の場合には、ステップＳ４０及びステップＳ５０を実施して、この処理を終了する。すなわち、前回の流加量ＦＲはそのまま維持される。一方、ｐＨ測定値が下限閾値を超える場合には、ｐＨ変化量（ΔｐＨ）と前回流加量ＦＲとを利用して式(２)から新たな流加量ＦＲ’を算出し、ＦＲ’をＲＡＭのＦＲ格納領域に格納することでＦＲをＦＲ’に更新する（ステップＳ１００）。そして、ＦＲ’を駆動制御装置３８に出力して（ステップＳ１１０）、この処理を終了する。
【００６１】
流加量ＦＲ’についての制御信号の出力先である駆動制御装置３８は、ＦＲ’に基づいて流加装置の駆動制御処理を実行する。流加装置の駆動制御処理のフローチャートの一例を図５に示す。図５に示すように、駆動制御装置３８が流加量ＦＲ’の制御信号を受信したときには（ステップＳ２００）、流加量ＦＲ’と流加液中の炭素源濃度と流加速度から、流加量ＦＲ’を流加するのに必要な流加時間Ｔを算出し（ステップＳ２１０）、算出した流加時間Ｔだけ流加液を培養槽１０に流加するようにポンプ３４等を駆動する信号を出力して（ステップＳ２２０）、この処理を終了する。こうした一連の流加量制御動作は、流加培養が終了するまで継続される。
【００６２】
以上説明した流加動作制御によれば、上記培養方法における効果をコンピュータによる制御により容易に得ることができる。
【００６３】
なお、以上の動作説明においては、ｐＨ変化量に基づいて流加量の設定方法を決定しているため、ｐＨ変化量に基づいて炭素源流加量を設定しているといえる。また、上記動作説明においては、流加量の設定を、上記式(１)及び上記式(２)により行うものとしたが、これに限定するものではなく、本発明の培養方法において説明したような各種の設定方法を採用して設定することができる。流加量の設定に際して必要なｐＨ情報は、流加量の設定ステップにおいて併せて演算等により取得してもよいし、ｐＨ変化量の取得ステップにおいて予め取得してもよく、適宜必要なステップで必要な情報を取得すればよい。
【００６４】
また、上記動作説明においては、こうしたプログラムは、コンピュータ４０のＲＯＭに格納されているものとしたが、コンピュータが読み取り可能な記憶媒体（例えば、ハードディスク、ＲＯＭ、ＦＤ、ＣＤ、ＤＶＤ、チップ）などに記録されていてもよいし、伝送媒体（インターネットやＬＡＮなどの通信網）を介してあるコンピュータから他のコンピュータに配信されたものであってもよいし、その他どのような形態で授受されたものであってもよい。
【００６５】
さらに、上記動作説明においては、本発明の制御方法及びプログラムは、コンピュータ４０のコントローラ４１のＣＰＵが実施するものとして説明したが、コンピュータ４０のＣＰＵと駆動制御装置３８に内蔵されるＣＰＵが実行するものであってもよいし、駆動制御装置３８のＣＰＵのみが実行するものであってもよい。
【００６６】
（有機酸生産酵母の菌体生産方法、有機酸生産方法）
本発明の有機酸生産酵母の菌体生産方法は、上記した培養方法の流加培養工程を実施する方法である。この菌体生産方法によれば、有機酸生産酵母を効率的に増殖させることができるため、短時間で良好な菌体収率で菌体を生産することができる。また、本発明の有機酸生産方法は、こうして生産した有機酸生産酵母を用いて有機酸を生産する方法である。本有機酸生産方法によれば、効率的に増殖された有機酸生産酵母を用いて有機酸を生産するため、効率的に有機酸を生産することができる。
【実施例】
【００６７】
以下、本発明を、実施例を挙げて具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲内において、種々なる形態で実施することができる。
【００６８】
本実施例では、遺伝子組換え酵母ＴＣ２０株（ＬＤＨ８コピー導入、ＧＰＤ１遺伝子破壊株）（特願２００４−２６５６５５に記載）を用いた。ＴＣ２０株は以下のようにして取得した。
【００６９】
特開２００３−２５９８７８号公報（特願２００２−６５８７９）で作製した乳酸生産能を持つ酵母を胞子形成培地（１％リン酸カリウム，０．１％イーストエキストラクト，０．０５％ブドウ糖，２％寒天）で胞子を形成させ、ホモタリック性を利用して２倍化を行い、２倍体である染色体両方にＬＤＨ遺伝子が導入されている株を取得し、これをＫＣＢ−２７−７株とした。
【００７０】
大腸菌Ｋ１２株をテンプレートとして、ハイグロマイシン耐性遺伝子（以下、ＨＰＨ遺伝子）のＤＮＡ断片をＰＣＲで増幅した。ＨＰＨ遺伝子のＤＮＡ塩基配列はＧＥＮＢＡＮＫデータベースにＶ０１４９９で登録されており、ＨＰＨ遺伝子の両末端のプライマーＨＰＨ−Ｕ（5’ -ATG AAA AAG CCT GAA CTC ACC-3’ （配列番号１））とＨＰＨ−Ｄ（5’ -CTA TTC CTT TGC CCT CGG ACG-3’ （配列番号２））を使用した。
【００７１】
酵母ＩＦＯ２２６０株（社団法人発酵研究所に登録されている菌株）のゲノムＤＮＡをテンプレートとして、ＴＤＨ３プロモーター領域のＤＮＡ断片をＰＣＲで増幅した。ＴＤＨ３遺伝子のＤＮＡ塩基配列はＧＥＮＢＡＮＫデータベースにＺ７２９７７で登録されており、プライマーＴＤＨ３Ｐ−Ｕ（5’ -ATA TAT GGA TCC TAG CGT TGA ATG TTA GCG TCA AC-3’ ；ＴＤＨ３プロモーター配列にＢａｍＨＩサイトを付加（配列番号３））、ＴＤＨ−３Ｐ−Ｄ（5’ -ATA TAT CCC GGG TTT GTT TGT TTA TGT GTG TTT ATT CG-3’；ＴＤＨ３プロモーター配列にＳｍａＩサイトを付加（配列番号４））を使用した。
【００７２】
酵母ＩＦＯ２２６０株のゲノムＤＮＡをテンプレートとして、ＣＹＣ１ターミネーター領域のＤＮＡ断片をＰＣＲで増幅した。ＣＹＣ１ターミネーター領域のＤＮＡ塩基配列はＧＥＮＢＡＮＫデータベースにＺ４９５４８で登録されており、プライマーＣＹＣＴ−Ｕ（5’ -ATA TAT AAG CTT ACA GGC CCC TTT TCC TTT G-3’ ；ＣＹＣ１ターミネーター配列にＨｉｎｄＩＩＩサイトを付加（配列番号５））、ＴＤＨ−３Ｐ−Ｄ（5’ -ATA TAT GTC GAC GTT ACA TGC GTA CAC GCG-3’； ＣＹＣ１ターミネーター配列にＳａIＩサイトを付加（配列番号６））を使用した。
【００７３】
ＨＰＨ遺伝子断片を大腸菌プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ（プロメガ製）のＥｃｏＲＶ部位に挿入した。このプラスミドをｐＢｈｐｈと命名した。本プラスミドをＢａｍＨＩとＳｍａＩ部位で切断後、ＴＤＨ３プロモーター断片を挿入し、このプラスミドをｐＢｈｐｈ−Ｐと命名した。さらに本プラスミドをＨｉｎｄＩＩＩとＳａＩＩ部位で切断後、ＣＹＣ１ターミネーター断片を挿入し、このプラスミドをｐＢｈｐｈ−ＰＴと命名した。ｐＢｈｐｈ−ＰＴをテンプレートとしてＴＤＨ３プロモーター領域、ＣＹＣ１ターミネーター領域を付加したＨＰＨ遺伝子カセットの両末端にＧＰＤ１遺伝子の一部（７７ｂｐ）が付加したＤＮＡ断片をＰＣＲで増幅した。付加したＧＰＤ１遺伝子のＤＮＡ塩基配列はＧＥＮＢＡＮＫデータベースにＺ２４４５４で登録されており、プライマーはＨＰＨ遺伝子の外側にＧＰＤ１遺伝子の−１２７〜−５１領域を付加したＧＰＤ１−ＣＹＣ１−Ｒ（5’ -TTA CGT TAC CTT AAA TTC TTT CTC CCT TTA ATT TTC TTT TAT CTT ACT CTC CTA CAT AAG ACA TCA AGA AAC AAT TGg tta cat gcgtac acg cgtttg t-3’；大文字はＧＰＤ１遺伝子配列部分、小文字はＨＰＨ遺伝子配列部分（配列番号７））と、同じくＧＰＤ１遺伝子の＋１１００〜＋１１７６領域を付加したＧＰＤ１−ＴＤＨ３−Ｆ（5’ -CTA ATC TTC ATG TAG ATC TAA TTC TTC AAT CAT GTC CGG CAG GTT CTT CAT TGG GTA GTT GTT GTA AAC GAT TTG Gta gcg ttg aatgtt agc gtcaac a-3’； 大文字はＧＰＤ１遺伝子配列部分、小文字はＨＰＨ遺伝子配列部分（配列番号８））を使用した。このＰＣＲ産物を用いて、ＫＣＢ２７−７株を酢酸リチウム法（Ito et al.,J.Bacteriol.,153,163-168(1983)）にて形質転換した。形質転換後、２００μｇ／ｍｌハイグロマイシンを含むＹＰＤ培地のプレートにまいて、３０℃で２日間培養し、形質転換体を得た。形質転換体よりゲノムＤＮＡを調製し、ＰＣＲ法により挿入ＤＮＡ断片の外側のプライマーであるＧＰＤ１−２９５Ｆ（5’ -TGC TTC TCT CCC CTT CTT-3’（配列番号９））、ＧＰＤ１＋１４７２Ｒ（5’ -CAG CCT CTG AAT GAG TGG T-3’（配列番号１０））を用いて、ＨＰＨ遺伝子がＧＰＤ１遺伝子領域の染色体に組み込まれていることを確認した。
【００７４】
この株を胞子形成培地で胞子を形成させ、ホモタリック性を利用して２倍化を行った。２倍体である染色体のＧＰＤ１遺伝子領域の両方にＨＰＨ遺伝子が組み込まれＧＰＤ１遺伝子が破壊されている株を取得した。これをＴＣ２０株とした。
【００７５】
こうした取得したＴＣ２０株を用いて、以下の要領で流加培養を実施し、流加培養中のｐＨ、ＤＯ、ＣＯ２、ＲＱ、流加液量（ｇ）、菌体、グルコース、乳酸、エタノールをモニターした。なお、菌体収率は、（流加培養時間中に増殖した菌体量）/（流加培養に使用した流加基質に含まれる糖量）で算出し、菌体濃度OD660は吸光度計を用いて測定した。培養装置は、図６に示す構成のものを用いた。この培養装置では、培養槽に設置したｐＨセンサのデータがコンピュータに入力されてコンピュータのソフト上で所定の制御式により流加量を算出し、この流加量をフィードコントローラに出力し、流加量に応じて作動時間でポンプを作動させた。
【００７６】
流加培養は、通常のバッチ培養を事前に行い、ある程度の菌体濃度（ＯＤ６６０で４０前後）になり培地中のグルコースが枯渇したところで開始した。バッチ培養は以下に記載の糖蜜培地５００ｍｌとＹＰＤ培地で一晩前培養した菌体懸濁液（菌体濃度ＯＤ６６０が約１０）を１Ｌジャーに仕込み、攪拌回転数５００ｒｐｍ、通気１ｖｖｍ、ｐＨ調整剤として１Ｎ硫酸水溶液と１Ｎ ＮａＯＨ水溶液を使用し２０時間培養した。また、流加培養は、グルコース濃度が０．０１％以下になったことを確認して開始した。なお、この時、ジャー内の菌体濃度ＯＤ６６０は２０から４０であった。なお、流加培養を開始する時点での流加量（ｇ）は、推定菌体量（ｇ）×０．３８で算出した。
【００７７】
（バッチ培養培地と流加基質の組成）
バッチ培養に使用した糖蜜培地及び流加液の組成を以下の表に示す。なお、それぞれに消泡剤としてアデカノール０．０８％（ｖ／ｖ）を添加した。糖蜜培地の初発糖濃度は約３．２％、流加基質の糖濃度は約２０％となっている。
表 糖蜜培地および流加基質の組成（１Ｌ当たり）
糖蜜培地 流加基質
調整糖蜜溶液 １２０ｍｌ ７６６ｍｌ
尿素（Ｎ源） ２．８ｇ １９ｇ
リン酸２水素１カリウム ０．４ｇ ２ｇ
※調整糖蜜は重さ換算で糖蜜１に、温水０．４１５、１Ｎ硫酸０．２を加え溶解させたもの
【００７８】
流加培養においては、ｐＨセンサからの出力値を用いて、以下の２種類の制御方式で流加量の調整を行なった。すなわち、下記式により新たな流加量ＦＲ’を設定し、ＦＲ’をフィードコントローラに出力し、フィードコントローラによりＦＲ’に基づいてポンプの作動時間を調整して流加量を制御した。流加量の調整は１０分間隔でおこなった（ＴＣ＝１０分）。制御方式Ｉ及びＩＩによる流加量の増減等について図７に示す。
＜制御方式Ｉ＞
（１）ΔｐＨ＞０かつｐＨＰＶ＞（ｐＨＳＶ＋ｐＨＦＮＺ）の時、
ＦＲ’＝ＦＲ＋Ａ×ＦＲ×（ｐＨＰＶ−ｐＨＳＶ）＋Ｃ 式(１)
（２）ΔｐＨ＜０かつｐＨＰＶ＜（ｐＨＳＶ−ｐＨＦＮＺ）の時、
ＦＲ’＝ＦＲ＋Ａ×ＦＲ×（ｐＨＰＶ−ｐＨＳＶ）＋Ｃ 式(１)
＜制御方式ＩＩ＞
（１）ΔｐＨ＞０かつｐＨＰＶ＞（ｐＨＳＶ＋ｐＨＦＮＺ）の時、
ＦＲ’＝ＦＲ＋Ａ×ＦＲ×（ｐＨＰＶ−ｐＨＳＶ）＋Ｃ 式(１)
（２）ΔｐＨ＜０かつｐＨＰＶ＜（ｐＨＳＶ−ｐＨＦＮＺ）の時、
ＦＲ’＝ＦＲ＋Ｂ×ＦＲ×ΔｐＨ＋Ｃ 式(２)
ただし、
ＦＲ’：新たに設定される流加量（ｇ）
ＦＲ：直前流加量（ｇ）
ｐＨＰＶ：ｐＨ測定値
ｐＨＳＶ：目標ｐＨ値
ｐＨＦＮＺ：ｐＨ値の不感帯（本実施例では、０．０１とした。）
ΔｐＨ：所定時間あたりのｐＨ変化量（ｐＨ測定値−前回のｐＨ測定値）
Ａ：係数（本実施例では１とした。）
Ｂ：係数（本実施例では２とした。）
Ｃ：定数（本実施例では０とした。）
【００７９】
なお、下記(１)及び(２)以外のときには、ＦＲ’＝ＦＲとして流加量を変化させないこととした。なお、対照として、従来技術であるＲＱ制御法による流加培養を実施した。結果を表１に示す。
【００８０】
【表１】
【００８１】
表１に示すように、いずれの制御方式Ｉ及びＩＩによっても、ＲＱ制御方式よりも優れた菌体収率を得ることができた。特に、制御方式ＩＩによって優れた菌体収率を得ることができた。また、ｐＨ等のモニター結果によれば、制御方式ＩＩによる場合には、ｐＨのハンチング周期が長くなるとともに、ＤＯの上昇やＣＯ２の下降傾向が抑制されてより好ましい流加経過を得ることができた。また、制御方式Ｉに比較して全体的に流加時間が短縮されていた。
【配列表フリーテキスト】
【００８２】
配列番号１〜１０：合成プライマー
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】式（１）又は式（２）で制御した場合の流加量の増減とｐＨ挙動とを示す図。
【図２】ｐＨ上昇時には式（１）を用いｐＨ下降時には式（２）を用いて制御した場合の流加量の増減とｐＨ挙動とを示す図。
【図３】本発明の培養装置の一例を示す図。
【図４】本発明の培養方法を実施するのに好適な流加動作制御のフローチャートの一例を示す図。
【図５】本発明の培養方法を実施するのに好適な流加装置駆動制御のフローチャートの一例を示す図。
【図６】実施例における培養装置構成を示す図。
【図７】実施例の流加培養時における流加制御方式Ｉ及びＩＩについての説明図。
【符号の説明】
【００８４】
２ 培養装置、 １０ 培養槽、２０ ｐＨセンサ、３０ 流加装置、３２ 加流液の貯留槽、３４ ポンプ、３６ 供給経路、、３８ 流加装置駆動制御装置、４０ コンピュータ、４１ コントローラ、４２ ディスプレイ。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有機酸生産酵母の培養方法、該培養方法を利用した有機酸生産酵母の菌体生産方法、有機酸生産方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、乳酸などの有機酸を発酵生産する手段として、遺伝的に改変した酵母が用いられるようになってきている。工業的規模でこうした遺伝子組換え酵母を用いて有機酸生産を行うには、まず、生産に使用する酵母菌体を増殖、すなわち、酵母菌体を生産する。有機酸の効率的な発酵生産には、こうした酵母菌体の生産自体を効率的に行うことが重要である。
【０００３】
一般的に、酵母には、好気培養中に好気発酵を伴う「クラブトリーポジティブ」な株と、好気発酵を伴わない「クラブトリーネガティブ」な株が存在する。一般的には前者にはサッカロマイセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）などが含まれ、後者にはクルイベルマイセス（Kluyverimyces）、ピキア（Picha）などが含まれる。「クラブトリーネガティブ」な株は非常に増殖が遅いので一般的には「クラブトリーポジティブ」な株を用いる。
【０００４】
サッカロマイセス・セレビジエなどの酵母菌体を増殖するためには、糖濃度をできるだけ低く制御して好気発酵を抑制して菌体を短時間に効率的に増殖させることが重要である。好気発酵は、クラブトリー効果ともいわれ、糖濃度が高い場合に、Ｏ２濃度が十分であっても糖がアルコール発酵経路に利用され、結果として菌体収率が低下する現象である。このため、酵母菌体を増殖させる場合、基質濃度を低濃度に制御できる流加培養が採用され、基質濃度を培養系の特定物質をモニターして添加すべき基質濃度を決定して培養系の基質濃度を制御することが行われている。
【０００５】
こうした制御方法としては、ＣＯ２制御やＲＱ（呼吸商：排気ガス中のＣＯ２の発生量とＯ２減少量との比）制御がある。ＣＯ２制御やＲＱ制御は、培養系から排出されるＣＯ２量に基づいて好気発酵レベルを検知し、それにより基質添加量を決定するものである。また、培養液中のエタノール量を直接検出するエタノール制御も用いられている（特許文献１）。さらに、溶存酸素（ＤＯ）を指標とする制御方法（特許文献２）、培養液のｐＨを指標とする制御方法（非特許文献１）、ＤＯとｐＨとの双方を指標とする制御方法（特許文献３）がある。ＤＯを指標とする方法は、増殖が抑制されると酸素消費量が低下してＤＯが上昇することを利用し、一定量の基質を添加後ＤＯが上昇するまでの期間に基づいて培養系中の菌体に必要な基質量を算出している。また、ｐＨによる制御方法は、培養系内の糖が消費しつくされると菌体は有機酸を消費し始めてｐＨが上昇することを利用して、ｐＨに閾値を設定して、閾値を超えたときに基質を添加するというものである。
【特許文献１】特開平５−７６３４６号公報
【特許文献２】特開平６−２６１７４１号公報
【特許文献３】特開昭６３−５７０３６号公報
【非特許文献１】D. Porto et al., Ros. Microbiol. 1991, 142, 535-539
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、乳酸生産酵母については、乳酸収率を向上させるために、アルコール（エタノール）生産量を低減させるように遺伝子工学的な改良が施されている。こうした改良は、アルコール発酵経路をできるだけ抑制すること意図している。したがって、培養液中のエタノールやエタノールに付随して発生するＣＯ２さらにはＲＱを指標とする制御方法を使用することは好ましくない。
【０００７】
また、非特許文献１や特許文献２に記載のＤＯ制御やｐＨ制御ではＤＯやｐＨが閾値以上になるのを待って制御するため、培養時間が長くなる傾向があるとともに、培養系において好気発酵が開始されたタイミングにはなんら制御されない。しかも、本発明者らによれば、ＤＯの上昇は、糖が枯渇した後に遅れて観察されることがわかった。
【０００８】
以上のように、有機酸生産酵母に適した菌体増殖のための培養方法は未だ見出されていない。
【０００９】
そこで、本発明は、有機酸生産酵母に適した培養方法、該酵母の菌体生産方法、培養装置、培養制御方法及び培養制御プログラムを提供することを一つの目的とする。また、本発明は、的確に炭素源濃度を制御できる培養方法、該酵母の菌体生産方法、培養装置、培養制御方法及び培養制御プログラムを提供することを他の一つの目的とする。また、本発明は、こうして培養された有機酸生産酵母を用いた有機酸の生産方法を提供することを他の一つの目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の一つの形態によれば、有機酸生産酵母の培養方法であって、前記有機酸生産酵母の培養液における単位時間あたりのｐＨ変化量を含むｐＨ情報を取得し、少なくとも前記ｐＨ変化量に基づいて炭素源流加量を調節しつつ流加培養する工程を備える、培養方法が提供される。前記有機酸は乳酸であることが好ましい。
【００１１】
この培養方法においては、前記ｐＨ変化量が正のときには前記流加量を増大させ、前記ｐＨ変化量が負のときには前記流加量を低下させることができる。また、前記ｐＨ情報は、測定ｐＨ値と所定のｐＨ閾値との関係を含んでおり、前記ｐＨ変化量が正であってかつ測定ｐＨ値がｐＨ上限閾値を超えたときには前記流加量を増大させ、前記ｐＨ変化量が負であってかつ測定ｐＨ値がｐＨ下限閾値を超えたときには前記流加量を低下させるようにすることができる。
【００１２】
また、前記ｐＨ情報はｐＨ測定値と目標ｐＨ値とのｐＨ差分量を含んでおり、直前の流加量と前記ｐＨ差分量とに基づいて設定される流加量で炭素源を流加するようにしてもよいし、直前の流加量と前記ｐＨ変化量とに基づいて設定される流加量で炭素源を流加するようにしてもよい。
【００１３】
さらに、前記ｐＨ情報はｐＨ測定値と目標ｐＨ値とのｐＨ差分量を含んでおり、直前の流加量と前記ｐＨ差分量とに基づく第１の流加量及び／又は直前の流加量と前記ｐＨ変化量とに基づく第２の流加量で炭素源を添加するようにしてもよい。
【００１４】
さらにまた、前記ｐＨ情報はｐＨ測定値と目標ｐＨ値とのｐＨ差分量を含んでおり、前記流加量を増大させるときには、直前の流加量と前記ｐＨ差分量とに基づいて流加量を決定し、前記流加量を低下させるときには、直前の流加量と前記ｐＨ変化量とに基づいて流加量を決定するようにしてもよい。
【００１５】
本培養方法においては、前記有機酸生産酵母は、クラブトリー効果を発現する遺伝子のプロモーターの制御下に有機酸生産関連遺伝子を保持していることが好ましく、前記プロモーターは、ピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子のプロモーターであることが好ましい。
【００１６】
本発明の他の一つの形態によれば、有機酸生産酵母の菌体生産方法であって、上記いずれかに記載の流加培養工程を実施する、方法が提供される。
【００１７】
また、本発明の他の一つの形態によれば、有機酸の生産方法であって、上記菌体生産方法によって生産された有機酸生産酵母を用いて有機酸を生産する、方法が提供される。
【００１８】
さらにまた、本発明の他の一つの形態によれば、有機酸生産酵母の培養装置であって、培養槽と、前記培養槽中の培養液に炭素源を流加する炭素源流加手段と、前記培養液のｐＨを測定するｐＨ測定手段と、前記ｐＨ測定手段による測定結果に基づく単位時間あたりのｐＨ変化量を含むｐＨ情報を取得し、少なくとも前記ｐＨ変化量に基づいて前記炭素源流加手段により前記培養液に添加される炭素源流加量を設定する流加量制御手段と、を備える培養装置が提供される。
【００１９】
本発明の他の一つの形態によれば、有機酸生産酵母の培養制御方法であって、
前記有機酸生産酵母の培養液のｐＨを取得するステップと、前記ステップでの測定結果に基づく単位時間あたりのｐＨ変化量を含むｐＨ情報を取得するステップと、少なくとも前記ｐＨ情報に基づいて前記培養液に流加する炭素源流加量を設定するステップとを備える、方法が提供される。
【００２０】
また、本発明の他の一つの形態によれば、有機酸生産酵母の培養制御プログラムであって、１又は２以上のコンピュータに、請求項１４に記載の各ステップを実行させる、プログラムが提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明の有機酸生産酵母の培養方法は、前記有機酸生産酵母の培養液における単位時間あたりのｐＨ変化量を含むｐＨ情報を取得し、少なくとも前記ｐＨ変化量に基づいて炭素源流加量を調節しつつ流加培養する工程を備えることを特徴としている。
【００２２】
本発明は、本発明者らが、炭素源が不足すると培養液中の有機酸が消費されることにより、炭素源の過不足を培養液のｐＨ変化としてレスポンスよく検知できることを見出したことによるものである。さらに、有機酸生産酵母の菌体増殖時に、炭素源が過剰になると好気発酵によりエタノールとともにあるいはエタノールに替わって有機酸が生産されることで、炭素源の過不足をより精度よく検知できることを見出したことによるものである。
【００２３】
有機酸生産酵母の培養液のｐＨ変化量は、有機酸生産酵母の培養液における有機酸の生産／消費動態、すなわち、炭素源供給量の過剰及び不足を的確にかつレスポンスよく検知するパラメータであることがわかった。このため、本発明の培養方法によれば、少なくともｐＨ変化量に基づいて流加量を調節することにより炭素源濃度を適切に制御して好ましい菌体増殖状態を得ることができる。また、本発明によれば、菌体増殖には望ましくない有機酸の存在を利用して有機酸の動態によるｐＨ変化量を指標として用いることにより効果的な流加量制御を行うことができる。また、ｐＨ変化量を指標として流加量を制御することで同時に酸やアルカリによるｐＨ調整を回避することができる。
【００２４】
以下、本発明の培養方法、有機酸生産酵母の生産方法、有機酸生産酵母の培養装置、有機酸生産酵母の培養制御方法及び培養制御プログラム並びに有機酸の生産方法について順次説明する。
【００２５】
（有機酸生産酵母の培養方法）
本培養方法における有機酸生産酵母は、有機酸生産が活性化された酵母であればよい。自然界からのスクリーニング、人工突然変異及び遺伝子工学的改変などのいずれの手法によって得られた酵母であってもよいが、遺伝子組換えにより有機酸を生産するように形質転換された酵母であることが好ましい。遺伝子組換え酵母は、一般に有機酸を高効率に発現するように構築されているからである。有機酸生産酵素遺伝子は酵母の染色体外にあっても染色体上にあってもよいし、どのようなプロモーターの制御下に保持されていてもよい。どういった形態であれ、糖から有機酸の生産する能力を有する以上は菌体増殖の過程で有機酸を生産する可能性があるからである。
【００２６】
また、本発明において「有機酸」とは、酸性を示す有機化合物であるが、有機酸が備える酸性基としては好ましくはカルボン酸基である。また、「有機酸」には、遊離の酸の他、有機酸塩を含む。このような有機酸として、具体的には、乳酸、酪酸、酢酸、ピルビン酸、コハク酸、ギ酸、リンゴ酸、クエン酸、マロン酸、プロピオン酸、アスコルビン酸、アジピン酸などを挙げることができるが、好ましくは、乳酸である。乳酸には、Ｌ−乳酸、Ｄ−乳酸、及びＤＬ−乳酸があるが、これらのいずれをも含む。
【００２７】
遺伝子組換え酵母においては適当なプロモーターの制御下に有機酸合成酵素をコードする遺伝子を発現可能に保持している。高効率で有機酸を生産するには、例えば、ピルビン酸脱炭酸酵素１（ＰＤＣ１）などのピルビン酸脱炭酸酵素（ＰＤＣ）遺伝子プロモーター、アルコール脱水素酵素１（ＡＤＨ１）などのアルコール脱水素酵素（ＡＤＨ）遺伝子プロモーター、高浸透圧応答７遺伝子（ＨＯＲ７遺伝子）プロモーター、グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素２遺伝子（ＴＤＨ２遺伝子）プロモーター、熱ショックタンパク質３０遺伝子（ＨＳＰ３０遺伝子）プロモーター、ヘキソース輸送タンパク質７遺伝子（ＨＸＴ７遺伝子）プロモーター、チオレドキシンペルオキシダーゼ１遺伝子（ＡＨＰ１遺伝子）プロモーター、膜タンパク質１関連遺伝子（ＭＲＨ１遺伝子）プロモーター、グリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素３（ＴＤＨ３）遺伝子プロモーター、グリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素１遺伝子（ＴＤＨ１遺伝子）プロモーター、トリオースリン酸イソメラーゼ１遺伝子（ＴＰＩ１遺伝子）プロモーター及び細胞壁関連タンパク質１２遺伝子（ＣＣＷ１２遺伝子）及びリボゾーマルプロテインＳ３１遺伝子（ＲＳＰ３１遺伝子）プロモーターなどが挙げられる。なお、これらはいずれも酵母における内在性プロモーターであり、酵母において有機酸を生産させるのに好ましい高発現プロモーターである。これらの１種又は２種以上を本発明の有機酸生産酵母において好ましく用いることができる。
【００２８】
本発明の有機酸生産酵母においては、糖濃度が高いと発現が促進されるか又は発現が抑制されるプロモーターの制御下に有機酸合成酵素遺伝子を保持していることが好ましい。こうすることで糖濃度に応じて有機酸を生産させるとともに消費させることもできるからである。より好ましくは糖濃度が高いと発現が促進されるプロモーターの制御下に有機酸合成酵素遺伝子を保持している。さらに好ましくは、クラブトリー効果を発現する遺伝子のプロモーターの制御下に有機酸合成酵素遺伝子を保持している。このようなクラブトリー効果を発現する遺伝子のプロモーターは酵母においては本来的に強力なプロモーターであり、有機酸生産に好適であるからである。こうしたプロモーターとしては、具体的には、酵母におけるアルコール発酵経路にあるピルビン酸脱炭酸酵素（ＰＤＣ）遺伝子のプロモーターやアルコール脱水素酵素（ＡＤＨ）遺伝子などのプロモーターが挙げられる。これらの酵素はそれぞれアイソザイムが存在しているが、ＰＤＣ１プロモーターやＡＤＨ１あるいはＡＤＨ２プロモーターであることが好ましい。より好ましくはＰＤＣ１プロモーターである。ＰＤＣ１プロモーターの制御下で有機酸を合成する酵素を発現させることにより、培養液中の炭素源の過不足に対して良好なレスポンスで有機酸を生産及び消費させることができ、炭素源の過不足を培養液のｐＨ動態として感度よく検出できるとともに、高効率で有機酸を発酵することが期待できるからである。なお、これらのプロモーターの１種又は２種以上がノックアウト等により抑制又は不活性化されていることが好ましく、より好ましくは、酵母染色体上においてこれらのプロモーターの制御下において内在されていた遺伝子に替わって有機酸生産酵素遺伝子が保持されている。こうした有機酸生産酵母は、例えば、特開２００３−９３０６０、特開２００３−２５９８７８、特開２００３−３３４０９２、特開２００４−１８７６４３、特開２００５−１３９２７０に開示されている。
【００２９】
有機酸合成酵素としては、乳酸生産の場合には、Ｌ−乳酸脱水素酵素、Ｄ−乳酸脱水素酵素等の酵素、ピルビン酸生産の場合にはピルビン酸キナーゼ等、酢酸生産の場合にはピルビン酸オキシダーゼ等、コハク酸生産の場合にはスクシニルＣｏＡシンテターゼ等、リンゴ酸の場合にはフマル酸ヒドラターゼ等、クエン酸生産の場合にはクエン酸シンテターゼ等を例示できる。
【００３０】
例えば、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）としては、生物の種類に応じてあるいは生体内においても各種同族体が存在する。本発明において使用する乳酸脱水素酵素としては、天然由来のＬＤＨの他、化学合成的あるいは遺伝子工学的に人工的に合成されたＬＤＨも包含している。ＬＤＨとしては、好ましくは、乳酸菌などの原核生物もしくはカビなどの真核微生物由来であり、より好ましくは、植物、動物、昆虫などの高等真核生物由来であり、さらに好ましくは、ウシを始めとする哺乳類を含む高等真核生物由来である。Ｌ−ＬＤＨとしては、ウシ由来のＬＤＨ（Ｌ−ＬＤＨ）である。さらに、本発明におけるＬＤＨは、これらのＬＤＨのホモログも包含している。ＬＤＨホモログは、天然由来のＬＤＨのアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸でありかつＬＤＨ活性を有しているタンパク質、および、天然由来のＬＤＨとアミノ配列の相同性が少なくとも７０％、好ましくは８０％以上を有しかつＬＤＨ活性を有しているタンパク質を含んでいる。また、Ｄ−ＬＤＨとしては、大腸菌、タコ及び乳酸菌由来のものなどが挙げられる。好ましくは乳酸菌由来のＤ−ＬＤＨである。なお、有機酸合成酵素をコードするコード領域は、酵母において複数コピー導入されていることが好ましい。
【００３１】
こうした組換え酵母は、通常の遺伝子組換え酵母の作製法に基づいて取得することができる。すなわち、宿主の酵母に、トランスフォーメーション法など従来公知の酵母への遺伝子導入法から選択される適切な手段により、外来遺伝子を導入することができる。外来遺伝子導入のためのＤＮＡ構築物は、例えば、適当なプロモーターとコードＤＮＡと転写調節領域等を含むＤＮＡ構築物とすることができる。こうしたＤＮＡ構築物としては、特に限定しないで、ＤＮＡそのもの、プラスミド（ＤＮＡ）、ウイルス（ＤＮＡ）バクテリオファージ（ＤＮＡ）、レトロトランスポゾン（ＤＮＡ）、人工染色体（ＹＡＣ）などから、外来遺伝子の導入形態（染色体外あるいは染色体内）に応じて選択される。ＤＮＡ構築物には、ターミネーター他、必要に応じてエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）を連結することができる。選択マーカーとしては、特に限定しないで、薬剤抵抗性遺伝子、栄養要求性遺伝子などを始めとする公知の各種選択マーカー遺伝子を利用できる。なお、ＰＤＣ１遺伝子のプロモーターなど特定のプロモーターの制御下に相同組換えにより有機酸合成酵素のコード領域を導入することも当業者であれば適宜行うことができる。
【００３２】
こうした組換え酵母の宿主酵母としては、サッカロマイセス・セレビシエ、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）などのサッカロマイセス属酵母を含む「クラブトリーポジティブ」な酵母が挙げられる。クラブトリーポジティブ」な酵母は、本来的に又は遺伝子組換え若しくは変異などによって人工的に「クラブトリーポジティブ」を獲得した酵母であってもよい。こうした酵母のなかでも、サッカロマイセス・セレビシエなどのサッカロマイセス属酵母が好ましい。
【００３３】
こうした有機酸生産酵母を培養する培養液の組成は特に限定されない。通常の培地を必要に応じて選択することができる。また、炭素源としては、ショ糖、糖蜜、グルコースなどの各種の糖類のほかグリセロール等を用いることができるが、好ましくは糖類を用いる。有機酸生産酵母の培養液は、当初の培養液とその後に流加される流加液とによって構成されることになるが、流加液における糖も同様のものを用いることができる。また、流加液にも、適宜窒素源やビタミン類などを含ませることができる。
【００３４】
流加培養工程の培養条件は、適宜設定することができるが、培養液のｐＨは、４．０以上６．５以下であることが好ましい。より好ましくは、４．５以上であり、また、６．０以下である。また、培養温度は、例えば、２５℃〜３５℃程度、好ましくは３０℃〜３２℃程度とすることができる。なお、培養中は、必要に応じてアンピシリン、テトラサイクリンなどの抗生物質を培地に添加することができる。
【００３５】
本発明の培養方法は、こうした有機酸生産酵母の培養液におけるｐＨ情報に基づいて炭素源流加量を調節しつつ流加培養する工程を備えている。なお、流加培養とは、炭素源を含む流加基質を連続的にあるいは断続的に添加しつつ培養する方法である。
【００３６】
本発明の培養方法によって菌体増殖のために流加培養方法を実施する場合、流加量制御のために必要な有機酸を培養液中に含有させておく必要がある。本発明は培養液中の有機酸動態を利用するものだからである。したがって、好ましくは流加培養に先立って、バッチ方式で培養するシード培養を実施し、ある程度の菌体濃度（例えば、ＯＤ換算で４０程度）で培養液中のグルコース濃度が所定量以下（例えば、０．０１質量％以下）になったとき流加培養を開始するようにする。こうした状態の培養液には乳酸が既に生産されている。なお、本培養方法においては、有機酸が流加量制御に必要であるため、培養終了直前まで存在していることが好ましく、培養終了とともに消費されていることが好ましい。したがって、本培養方法によれば、培養液中の有機酸は全体として減少させるようになっている。
【００３７】
炭素源の流加量は、少なくとも一つのパラメータに基づいて設定されることが好ましく、こうした流加量の設定は一定時間間隔あるいはパラメータの測定値等に基づいて適宜行われるようになっていることが好ましい。本発明の培養方法では上記パラメータとしてｐＨ情報を用いる。炭素源不足時には、培養液中の有機酸が消費されてｐＨが上昇するため、培養液中の炭素源動態をｐＨの上昇として検出して炭素源を制御できる。また、糖濃度に応じて発現が促進され又は抑制されるプロモーター下に有機酸合成酵素遺伝子を保持する有機酸生産酵母においては、炭素源過剰時若しくは不足時に有機酸が生産され、炭素源不足時若しくは過剰時に有機酸が消費されるため、また、ｐＨは他のＣＯ２やＤＯなどのパラメータに比較して高い測定精度でセンサーにより検出でき、また、糖濃度が高いと活性化するプロモーターやクラブトリー効果を発現する遺伝子のプロモーターの制御下に有機酸合成酵素遺伝子がある場合には、これらの他のパラメータよりも応答性よく炭素の過不足に反応して検出できる。さらに、ｐＨをパラメータとすることは、有機酸生産酵母のアルコール発酵能が抑制されている場合には特に有効である。
【００３８】
このように、有機酸生産酵母の流加培養においてｐＨは炭素源動態(代謝流れ)や菌体増殖の感度のよい指標であるため、ｐＨ変化を利用することで細やかでかつ効果的な増殖制御が可能となっている。本発明者らによれば、流加によりｐＨが上昇も下降もしないとき、すなわち、有機酸が発生も消費もされないときに最も効率的でかつ高い増殖速度が得られるという知見を得ている。しかしながら、ｐＨが一定になるように流加量を調整することは極めて困難であるため種々検討したところ、ｐＨ変化量に基づいて流加量を調節することにより、結果としてｐＨを緩やかにハンチングさせながら一定値に近づけることができ、これにより、ｐＨ一定状態に近い高効率でかつ高速な増殖が得られることがわかったのである。すなわち、ｐＨ変化量に基づいてｐＨのハンチング範囲（ｐＨの変動範囲）を小さくするように、あるいはｐＨのハンチング周期を長くするように、さらにはこれらの両方を達成するように流加量を調節することが、菌体増殖に有効であることがわかった。
【００３９】
培養液のｐＨ情報は、流加培養工程において連続的又は間欠的に培養液のｐＨを測定することにより得ることができる。
【００４０】
ｐＨ情報は、少なくとも所定時間あたりのｐＨ変化量を含んでいる。上記したように、ｐＨ変化量は、有機酸生産酵母の培養状態における炭素源の過不足の好ましい指標である。培養液における単位時間あたりのｐＨ変化量を検出するには、少なくとも異なるタイミングで培養液のｐＨを測定すればよい。所定時間あたりのｐＨ変化量は、新たに測定したｐＨ値から所定時間前に測定したｐＨ値を差し引いたｐＨ差分値として得ることができる。ここでｐＨ変化量の特定する所定時間は、培養工程を通じて一定に設定してもよいし、培養工程の経過に応じて適宜あるいは予め変化させるようにしてもよい。このような所定時間は、ｐＨ変化量に基づいて流加量をフィードバック制御するのに好ましい時間間隔でもある。こうした所定時間は、例えば、１０秒から３０分程度とすることができ、好ましくは、１分から２０分程度、より好ましくは５分〜１５分程度とすることができる。
【００４１】
ｐＨ情報は、ｐＨ変化量のほか、新たに測定したｐＨ値とｐＨ上限閾値又はｐＨ下限閾値との関係を含むことができる。閾値は、流加量を制御するか否かを判定するための値であり、例えば、目標ｐＨ値を挟んで上下それぞれ一定範囲をｐＨ不感帯となるように目標ｐＨ値よりも高いｐＨ上限閾値と目標ｐＨ値よりも低いｐＨ下限閾値とを設定することができる。したがって、測定ｐＨ値が上下限閾値を超えていれば流加量を制御し、上下限閾値以内であれば流加量は制御されない（流加量は維持される）こととなる。また、閾値の上下に広ければ大きいほど不感帯が大きくなり流加量制御が抑制され、閾値が狭いほど不感帯は小さくなり流加量制御が積極的に行われる。
【００４２】
ｐＨ情報には、さらに、測定ｐＨ値と目標ｐＨ値との差分、すなわち、目標ｐＨ値から測定ｐＨ値を差し引いたｐＨ差分量もｐＨ情報に含めることができる。ｐＨ差分量は、例えば、流加量を算出するのに用いることができる。なお、ｐＨ変化量も流加量の算出に用いることができる。
【００４３】
なお、ｐＨ情報には、ｐＨ変化量算出の基礎である測定ｐＨ値のほか所定時間前のｐＨ測定値も当然に包含されるものである。また、目標ｐＨ値や上下のｐＨ閾値は、通常予め設定しておくことができる。
【００４４】
ｐＨ情報に基づいて流加量を調節する手法としては、ＰＩＤ制御などの定値制御、シンプレックス法、勾配法、遺伝的アルゴリズム等などの最適制御、ファジイ制御等などを用いることができる。こうした制御においては、例えば、ｐＨ変化量が正のとき、すなわち、ｐＨが上昇傾向にあるときには直前の流加量よりも流加量を増大させ、ｐＨ変化量が負のとき、すなわち、ｐＨが低下傾向にあるときには直前の流加量よりも流加量を低下させるようにすることができる。ｐＨ上昇傾向は、炭素源が不足して有機酸が消費された結果であり、ｐＨ低下傾向は、炭素源が過剰で有機酸が生産された結果だからである。なお、ｐＨ変化量が０のときには、流加量は維持される。こうした流加量制御によれば、炭素源の不足に対応して流加量を積極的に制御することができる。
【００４５】
さらに、ｐＨ変化量が正であってかつ測定ｐＨ値がｐＨ上限閾値を超えたときには流加量を増大させ、ｐＨ変化量が負であってかつ測定ｐＨ値がｐＨ下限閾値を超えたときには流加量を低下させるようにすることもできる。ｐＨ変化量が０のときには流加量を維持するようにする。こうすること過度に流加量を増大させたり低下させたりすることを防ぐことができる。
【００４６】
また、流加量は、各種の制御手法に応じて設定することができるが、有機酸生産酵母においては、直前に設定し実行した流加量とｐＨ差分量及び／又はｐＨ変化量とに基づいて設定することができる。また、ｐＨ差分量及び／又はｐＨ変化に比例させるようにすることが好ましい。例えば、流加量をｐＨ差分量に比例させることで、ｐＨ値を目標ｐＨ値に対して反転させるようにするように制御でき、ｐＨ変化量に比例させることで、ｐＨ値が目標ｐＨ値に対して反転させるよりもｐＨの上下動がなくなるように制御できる。流加量はいずれの方式によって設定してもよいが、例えば、ｐＨ変化量が正のときも負のときにも、ｐＨ差分量に比例させるように設定してもよいし、ｐＨ変化量が正（ｐＨ上昇時）のときには、ｐＨ差分量に比例させるように設定できる。また、ｐＨ変化量が正のときには、ｐＨ差分量に比例させるように設定し、ｐＨ変化量が負（ｐＨ下降時）のときにはｐＨ変化量に比例させるように設定してもよい。
【００４７】
このように、ｐＨの下降時には流加をやめるのでなく流加量を減らすのであるが、その際、ｐＨ変化量に基づくなどして流加量を減らすことで好気発酵を抑制して有機酸を消費させることで緩やかに目標値にまで上昇させるようにし、ｐＨ上昇時には流加量を増大させるのであるが、その際、ｐＨ差分量に基づくなどして積極的に炭素源を流加して微量に好気発酵させて有機酸を発生させることでｐＨを速やかに下降させるようにするようにする。こうすることで、ｐＨのハンチング範囲やハンチング周期を好適化してハンチングを緩やかにすることで容易にｐＨ変動を一定値に近づけるようにすることができる。この結果、高収率かつ高速に流加培養することができる。
【００４８】
流加量を設定するための式としては、例えば、以下の式（１）及び（２）が挙げられる。式（１）は、ｐＨ差分量に比例させて流加量を決定するものであり、式（２）はｐＨ変化量に比例させて添加量を決定するものである。なお、以下の式において流加量は重量としたが、必要に応じて流加液の濃度、流加速度、流加時間等の異なる形態で算出することができる。
ＦＲ’＝ＦＲ＋Ａ×ＦＲ×（ｐＨＰＶ−ｐＨＳＶ）＋Ｃ ・・・（１）
ＦＲ’＝ＦＲ＋Ｂ×ＦＲΔｐＨ＋Ｃ ・・・（２）
ただし、
ＦＲ’：新たに設定される流加量（ｇ）
ＦＲ：直前の流加量（ｇ）
ｐＨＰＶ：ｐＨ測定値
ｐＨＳＶ：目標ｐＨ値
ｐＨＦＮＺ：ｐＨ値の不感帯（例えば、０．０１）
ΔｐＨ：所定時間あたりのｐＨ変化量（ｐＨ測定値−前回のｐＨ測定値）
Ａ：係数（実験に基づいて設定することができる。例えば、１）
Ｂ：係数（実験に基づいて設定することができる。例えば、２）
Ｃ：定数（実験に基づいて設定することができる。例えば、０）
【００４９】
これらの式（１）及び（２）を用いた制御形態を図１及び図２に示す。図１には、式（１）又は式（２）で制御した場合の流加量の増減とｐＨ挙動とを示す。図２には、ｐＨ上昇時には式（１）を用いｐＨ下降時には式（２）を用いて制御した場合の流加量の増減とｐＨ挙動とを示す。なお、図２に示すように、式（１）は、ΔｐＨ＞０かつｐＨＰＶ＞（ｐＨＳＶ＋ｐＨＦＮＺ）のときに採用することが好ましく、式（２）はΔｐＨ＜０かつｐＨＰＶ＜(ｐＨＳＶ−ｐＨＦＮＺ)のときに採用することが好ましく、これら以外のときには流加量を変化させないとすることが好ましい。
【００５０】
流加培養工程は、培養液中の溶存酸素濃度がゼロになるなど、菌体濃度が上昇しなくなったときに終了することが好ましい。より好ましくは、流加培養終了時に乳酸が実質的になくなってｐＨの上下動がなくなった時点である。なお、流加培養終了時に乳酸が培地中に存在するときには、乳酸を消費させるように炭素源なしでの培養を時間が許す限り継続することが好ましい。
【００５１】
以上説明した有機酸生産酵母の培養方法によれば、培養液における炭素源の過不足を的確にかつレスポンスよく得ることができるため、有機酸生産酵母の菌体増殖に適した培養を実施できる。この結果、高効率かつ高速で菌体を増殖させることができる。特に、上記方法によれば、ｐＨ変化量に基づいて流加量を制御する結果、少なくともｐＨを緩やかにハンチングさせることになり、この結果、容易にｐＨを一定範囲値内にとどめることができる。このように、ｐＨ変化量に基づいて流加量を制御することで、ある程度のｐＨ変動を許容しつつも酸やアルカリによるｐＨ調整を回避して高効率かつ高速に流加培養を行うことができる。
【００５２】
また、以上説明した培養方法において２種類の流加量算出式を用いることにより、ハンチングを緩やかにして菌体増殖効率を高めている。すなわち、ｐＨ下降時（炭素源過剰時）にはｐＨ変化量を利用する式(２)などを用いてｐＨの上下動がなくなって一定値になるように制御することで、いずれ菌体が増殖して糖が不足し有機酸を消費することで緩やかにｐＨを上昇方向に転換させることができる。一方、ｐＨ上昇時にｐＨ差分量を利用する式(１)などを用いることで、過剰気味に制御してｐＨを速やかに目標値まで下降させるようにする。こうした制御により、全体としてｐＨのハンチング範囲を一定以下に維持しつつハンチング周期を長くしてハンチングを緩やかにし、一層ｐＨ一定の状態に近づけることができる。この結果、菌体増殖を一層高効率かつ高速化することができる。
【００５３】
（有機酸生産酵母の培養装置）
次に、有機酸生産酵母の培養装置について説明する。本発明の培養方法は、例えば、図３に示す培養装置２によって実施することができる。図３に示す培養装置２は、培養槽１０と、培養槽１０中の培養液のｐＨを検知するｐＨセンサ２０と、培養槽１０の培養液に炭素源を含んだ流加基質を流加する流加装置３０と、流加量等を制御するコンピュータ４０とを備えている。
【００５４】
培養槽１０は特に限定しないが流加培養に適した培養槽を用いることができる。流加装置３０は、特に限定しないが、流加液を貯留する貯留槽３２と流加液を培養槽１０に流加することができるポンプ３４と供給経路３６とを備えているとともに、ポンプ３４の駆動量や時間などをコントロールする流加装置３０の駆動制御装置３８を備えている。コンピュータ４０は、ＣＰＵを中心としてＲＯＭ、ＲＡＭ等で構成されるマイクロプロセッサを有するコントローラ４１や各種の入出力インターフェースのほかにディスプレイ４２を備えている。コンピュータ４０のＣＰＵは、ｐＨセンサ２０からの信号を取得するとともに、ポンプ３４の作動時間や流加液の供給速度などに関する各種の制御信号を駆動制御装置３８に出力するようになっている。なお、培養槽１０には、さらに、培養液に酸素を供給する酸素供給装置、培養液の撹拌装置などのほか、ＤＯセンサ、ＣＯ２センサなどを備えることもできる。
【００５５】
なお、培養装置２におけるｐＨセンサ２０は、本発明の培養装置におけるｐＨ測定手段に相当し、流加装置３０は、同様に炭素源流加手段に相当し、コンピュータ４０は流加量制御手段に相当している。
【００５６】
（有機酸生産酵母の流加培養制御方法及びプログラム）
次に、有機酸生産酵母の流加培養制御方法及びプログラムについて説明する。本発明の流加培養制御方法は、上記した本発明の培養方法を実施するのに好ましい制御方法であって、有機酸生産酵母の培養液のｐＨを取得するステップと、前記ステップでの測定結果に基づく単位時間あたりのｐＨ変化量を含むｐＨ情報を取得するステップと、少なくとも前記ｐＨ変化量に基づいて前記培養液に流加する炭素源流加量を設定するステップとを備えている。また、本発明のプログラムは、上記制御方法における各ステップを１又は２以上のコンピュータに実行させるプログラムである。以下、本発明の制御方法及びプログラムを、培養装置２を用いて有機酸生産酵母を流加培養するときの流加動作を用いて説明する。
【００５７】
図４には、流加動作のフローチャートの一例を示す。なお、流加培養は、まず有機酸生産酵母を一定量にまで増殖させるシード培養を行い、培養液中のグルコース量又は菌体量が一定量以上になったときに、菌体濃度等に基づいた所定の流加量で開始するものとする。また、以下に説明する流加動作フローは一定間隔毎（例えば、１０分間）にコンピュータ４０のＣＰＵによって実施され、こうした流加動作を実施するためのプログラムは、コンピュータ４０のコントローラのＲＯＭに予め記憶されているものとする。なお、流加培養開始時点での培養液のｐＨ、流加開始時点での流加量、ｐＨ目標値（ｐＨＳＶ）、上限閾値及び下限閾値がそれぞれＲＡＭの所定領域に格納されているものとする。
【００５８】
まず、ＣＰＵは、ｐＨセンサ２０からｐＨ測定値（ｐＨＰＶ）を取得する（ステップＳ１０）。そして、ＲＡＭの所定領域に格納された流加培養開始時のｐＨを取得してそのｐＨ変化量（ΔｐＨ）を算出する（ステップＳ２０）。次いで、ΔｐＨが０より大きいか、小さいか、あるいはゼロであるかを判定する（ステップＳ３０）。このステップＳ３０では、流加量を更新するか否か及び更新方法を決定する。ΔｐＨがゼロのとき、すなわち、ｐＨ変動がないときには直前の流加量ＦＲを維持するようにする。すなわち、新たに設定する流加量ＦＲとしてＦＲ’をＲＡＭの所定領域に格納する（ステップＳ４０）。そしてＦＲ’を駆動制御装置３８に出力して（ステップＳ５０）、この処理を終了する。
【００５９】
また、ΔｐＨがゼロより大きい場合、すなわち、ｐＨが上昇している場合には、さらに、ｐＨ測定値（ｐＨＰＶ）がｐＨの上限閾値を超えて大きいかどうかを判定する（ステップＳ６０）。ｐＨ測定値が上限閾値以下の場合には、ステップＳ４０及びステップＳ５０を実行してこの処理を終了する。すなわち、前回設定した流加量ＦＲはそのまま維持される。一方、ｐＨ測定値が上限閾値より大きい場合には、ｐＨ測定値からｐＨ目標値（ｐＨＳＶ）を差し引いたｐＨ差分量を算出し、このｐＨ差分量と前回流加量ＦＲとを利用して式(１)から新たな流加量ＦＲ’を算出し、ＦＲ’をＲＡＭのＦＲ格納領域に格納することでＦＲをＦＲ’で更新する（ステップＳ７０）。そして、ＦＲ’を駆動制御装置３８に出力して（ステップＳ８０）、この処理を終了する。
【００６０】
さらに、ΔｐＨがゼロより小さい場合、すなわち、ｐＨが下降している場合には、ｐＨ測定値（ｐＨＰＶ）が下限閾値を超えて小さいかどうかを判定する（ステップＳ９０）。ｐＨ測定値が下限閾値以上の場合には、ステップＳ４０及びステップＳ５０を実施して、この処理を終了する。すなわち、前回の流加量ＦＲはそのまま維持される。一方、ｐＨ測定値が下限閾値を超える場合には、ｐＨ変化量（ΔｐＨ）と前回流加量ＦＲとを利用して式(２)から新たな流加量ＦＲ’を算出し、ＦＲ’をＲＡＭのＦＲ格納領域に格納することでＦＲをＦＲ’に更新する（ステップＳ１００）。そして、ＦＲ’を駆動制御装置３８に出力して（ステップＳ１１０）、この処理を終了する。
【００６１】
流加量ＦＲ’についての制御信号の出力先である駆動制御装置３８は、ＦＲ’に基づいて流加装置の駆動制御処理を実行する。流加装置の駆動制御処理のフローチャートの一例を図５に示す。図５に示すように、駆動制御装置３８が流加量ＦＲ’の制御信号を受信したときには（ステップＳ２００）、流加量ＦＲ’と流加液中の炭素源濃度と流加速度から、流加量ＦＲ’を流加するのに必要な流加時間Ｔを算出し（ステップＳ２１０）、算出した流加時間Ｔだけ流加液を培養槽１０に流加するようにポンプ３４等を駆動する信号を出力して（ステップＳ２２０）、この処理を終了する。こうした一連の流加量制御動作は、流加培養が終了するまで継続される。
【００６２】
以上説明した流加動作制御によれば、上記培養方法における効果をコンピュータによる制御により容易に得ることができる。
【００６３】
なお、以上の動作説明においては、ｐＨ変化量に基づいて流加量の設定方法を決定しているため、ｐＨ変化量に基づいて炭素源流加量を設定しているといえる。また、上記動作説明においては、流加量の設定を、上記式(１)及び上記式(２)により行うものとしたが、これに限定するものではなく、本発明の培養方法において説明したような各種の設定方法を採用して設定することができる。流加量の設定に際して必要なｐＨ情報は、流加量の設定ステップにおいて併せて演算等により取得してもよいし、ｐＨ変化量の取得ステップにおいて予め取得してもよく、適宜必要なステップで必要な情報を取得すればよい。
【００６４】
また、上記動作説明においては、こうしたプログラムは、コンピュータ４０のＲＯＭに格納されているものとしたが、コンピュータが読み取り可能な記憶媒体（例えば、ハードディスク、ＲＯＭ、ＦＤ、ＣＤ、ＤＶＤ、チップ）などに記録されていてもよいし、伝送媒体（インターネットやＬＡＮなどの通信網）を介してあるコンピュータから他のコンピュータに配信されたものであってもよいし、その他どのような形態で授受されたものであってもよい。
【００６５】
さらに、上記動作説明においては、本発明の制御方法及びプログラムは、コンピュータ４０のコントローラ４１のＣＰＵが実施するものとして説明したが、コンピュータ４０のＣＰＵと駆動制御装置３８に内蔵されるＣＰＵが実行するものであってもよいし、駆動制御装置３８のＣＰＵのみが実行するものであってもよい。
【００６６】
（有機酸生産酵母の菌体生産方法、有機酸生産方法）
本発明の有機酸生産酵母の菌体生産方法は、上記した培養方法の流加培養工程を実施する方法である。この菌体生産方法によれば、有機酸生産酵母を効率的に増殖させることができるため、短時間で良好な菌体収率で菌体を生産することができる。また、本発明の有機酸生産方法は、こうして生産した有機酸生産酵母を用いて有機酸を生産する方法である。本有機酸生産方法によれば、効率的に増殖された有機酸生産酵母を用いて有機酸を生産するため、効率的に有機酸を生産することができる。
【実施例】
【００６７】
以下、本発明を、実施例を挙げて具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲内において、種々なる形態で実施することができる。
【００６８】
本実施例では、遺伝子組換え酵母ＴＣ２０株（ＬＤＨ８コピー導入、ＧＰＤ１遺伝子破壊株）（特願２００４−２６５６５５に記載）を用いた。ＴＣ２０株は以下のようにして取得した。
【００６９】
特開２００３−２５９８７８号公報（特願２００２−６５８７９）で作製した乳酸生産能を持つ酵母を胞子形成培地（１％リン酸カリウム，０．１％イーストエキストラクト，０．０５％ブドウ糖，２％寒天）で胞子を形成させ、ホモタリック性を利用して２倍化を行い、２倍体である染色体両方にＬＤＨ遺伝子が導入されている株を取得し、これをＫＣＢ−２７−７株とした。
【００７０】
大腸菌Ｋ１２株をテンプレートとして、ハイグロマイシン耐性遺伝子（以下、ＨＰＨ遺伝子）のＤＮＡ断片をＰＣＲで増幅した。ＨＰＨ遺伝子のＤＮＡ塩基配列はＧＥＮＢＡＮＫデータベースにＶ０１４９９で登録されており、ＨＰＨ遺伝子の両末端のプライマーＨＰＨ−Ｕ（5’ -ATG AAA AAG CCT GAA CTC ACC-3’ （配列番号１））とＨＰＨ−Ｄ（5’ -CTA TTC CTT TGC CCT CGG ACG-3’ （配列番号２））を使用した。
【００７１】
酵母ＩＦＯ２２６０株（社団法人発酵研究所に登録されている菌株）のゲノムＤＮＡをテンプレートとして、ＴＤＨ３プロモーター領域のＤＮＡ断片をＰＣＲで増幅した。ＴＤＨ３遺伝子のＤＮＡ塩基配列はＧＥＮＢＡＮＫデータベースにＺ７２９７７で登録されており、プライマーＴＤＨ３Ｐ−Ｕ（5’ -ATA TAT GGA TCC TAG CGT TGA ATG TTA GCG TCA AC-3’ ；ＴＤＨ３プロモーター配列にＢａｍＨＩサイトを付加（配列番号３））、ＴＤＨ−３Ｐ−Ｄ（5’ -ATA TAT CCC GGG TTT GTT TGT TTA TGT GTG TTT ATT CG-3’；ＴＤＨ３プロモーター配列にＳｍａＩサイトを付加（配列番号４））を使用した。
【００７２】
酵母ＩＦＯ２２６０株のゲノムＤＮＡをテンプレートとして、ＣＹＣ１ターミネーター領域のＤＮＡ断片をＰＣＲで増幅した。ＣＹＣ１ターミネーター領域のＤＮＡ塩基配列はＧＥＮＢＡＮＫデータベースにＺ４９５４８で登録されており、プライマーＣＹＣＴ−Ｕ（5’ -ATA TAT AAG CTT ACA GGC CCC TTT TCC TTT G-3’ ；ＣＹＣ１ターミネーター配列にＨｉｎｄＩＩＩサイトを付加（配列番号５））、ＴＤＨ−３Ｐ−Ｄ（5’ -ATA TAT GTC GAC GTT ACA TGC GTA CAC GCG-3’； ＣＹＣ１ターミネーター配列にＳａIＩサイトを付加（配列番号６））を使用した。
【００７３】
ＨＰＨ遺伝子断片を大腸菌プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ（プロメガ製）のＥｃｏＲＶ部位に挿入した。このプラスミドをｐＢｈｐｈと命名した。本プラスミドをＢａｍＨＩとＳｍａＩ部位で切断後、ＴＤＨ３プロモーター断片を挿入し、このプラスミドをｐＢｈｐｈ−Ｐと命名した。さらに本プラスミドをＨｉｎｄＩＩＩとＳａＩＩ部位で切断後、ＣＹＣ１ターミネーター断片を挿入し、このプラスミドをｐＢｈｐｈ−ＰＴと命名した。ｐＢｈｐｈ−ＰＴをテンプレートとしてＴＤＨ３プロモーター領域、ＣＹＣ１ターミネーター領域を付加したＨＰＨ遺伝子カセットの両末端にＧＰＤ１遺伝子の一部（７７ｂｐ）が付加したＤＮＡ断片をＰＣＲで増幅した。付加したＧＰＤ１遺伝子のＤＮＡ塩基配列はＧＥＮＢＡＮＫデータベースにＺ２４４５４で登録されており、プライマーはＨＰＨ遺伝子の外側にＧＰＤ１遺伝子の−１２７〜−５１領域を付加したＧＰＤ１−ＣＹＣ１−Ｒ（5’ -TTA CGT TAC CTT AAA TTC TTT CTC CCT TTA ATT TTC TTT TAT CTT ACT CTC CTA CAT AAG ACA TCA AGA AAC AAT TGg tta cat gcgtac acg cgtttg t-3’；大文字はＧＰＤ１遺伝子配列部分、小文字はＨＰＨ遺伝子配列部分（配列番号７））と、同じくＧＰＤ１遺伝子の＋１１００〜＋１１７６領域を付加したＧＰＤ１−ＴＤＨ３−Ｆ（5’ -CTA ATC TTC ATG TAG ATC TAA TTC TTC AAT CAT GTC CGG CAG GTT CTT CAT TGG GTA GTT GTT GTA AAC GAT TTG Gta gcg ttg aatgtt agc gtcaac a-3’； 大文字はＧＰＤ１遺伝子配列部分、小文字はＨＰＨ遺伝子配列部分（配列番号８））を使用した。このＰＣＲ産物を用いて、ＫＣＢ２７−７株を酢酸リチウム法（Ito et al.,J.Bacteriol.,153,163-168(1983)）にて形質転換した。形質転換後、２００μｇ／ｍｌハイグロマイシンを含むＹＰＤ培地のプレートにまいて、３０℃で２日間培養し、形質転換体を得た。形質転換体よりゲノムＤＮＡを調製し、ＰＣＲ法により挿入ＤＮＡ断片の外側のプライマーであるＧＰＤ１−２９５Ｆ（5’ -TGC TTC TCT CCC CTT CTT-3’（配列番号９））、ＧＰＤ１＋１４７２Ｒ（5’ -CAG CCT CTG AAT GAG TGG T-3’（配列番号１０））を用いて、ＨＰＨ遺伝子がＧＰＤ１遺伝子領域の染色体に組み込まれていることを確認した。
【００７４】
この株を胞子形成培地で胞子を形成させ、ホモタリック性を利用して２倍化を行った。２倍体である染色体のＧＰＤ１遺伝子領域の両方にＨＰＨ遺伝子が組み込まれＧＰＤ１遺伝子が破壊されている株を取得した。これをＴＣ２０株とした。
【００７５】
こうした取得したＴＣ２０株を用いて、以下の要領で流加培養を実施し、流加培養中のｐＨ、ＤＯ、ＣＯ２、ＲＱ、流加液量（ｇ）、菌体、グルコース、乳酸、エタノールをモニターした。なお、菌体収率は、（流加培養時間中に増殖した菌体量）/（流加培養に使用した流加基質に含まれる糖量）で算出し、菌体濃度OD660は吸光度計を用いて測定した。培養装置は、図６に示す構成のものを用いた。この培養装置では、培養槽に設置したｐＨセンサのデータがコンピュータに入力されてコンピュータのソフト上で所定の制御式により流加量を算出し、この流加量をフィードコントローラに出力し、流加量に応じて作動時間でポンプを作動させた。
【００７６】
流加培養は、通常のバッチ培養を事前に行い、ある程度の菌体濃度（ＯＤ６６０で４０前後）になり培地中のグルコースが枯渇したところで開始した。バッチ培養は以下に記載の糖蜜培地５００ｍｌとＹＰＤ培地で一晩前培養した菌体懸濁液（菌体濃度ＯＤ６６０が約１０）を１Ｌジャーに仕込み、攪拌回転数５００ｒｐｍ、通気１ｖｖｍ、ｐＨ調整剤として１Ｎ硫酸水溶液と１Ｎ ＮａＯＨ水溶液を使用し２０時間培養した。また、流加培養は、グルコース濃度が０．０１％以下になったことを確認して開始した。なお、この時、ジャー内の菌体濃度ＯＤ６６０は２０から４０であった。なお、流加培養を開始する時点での流加量（ｇ）は、推定菌体量（ｇ）×０．３８で算出した。
【００７７】
（バッチ培養培地と流加基質の組成）
バッチ培養に使用した糖蜜培地及び流加液の組成を以下の表に示す。なお、それぞれに消泡剤としてアデカノール０．０８％（ｖ／ｖ）を添加した。糖蜜培地の初発糖濃度は約３．２％、流加基質の糖濃度は約２０％となっている。
表 糖蜜培地および流加基質の組成（１Ｌ当たり）
糖蜜培地 流加基質
調整糖蜜溶液 １２０ｍｌ ７６６ｍｌ
尿素（Ｎ源） ２．８ｇ １９ｇ
リン酸２水素１カリウム ０．４ｇ ２ｇ
※調整糖蜜は重さ換算で糖蜜１に、温水０．４１５、１Ｎ硫酸０．２を加え溶解させたもの
【００７８】
流加培養においては、ｐＨセンサからの出力値を用いて、以下の２種類の制御方式で流加量の調整を行なった。すなわち、下記式により新たな流加量ＦＲ’を設定し、ＦＲ’をフィードコントローラに出力し、フィードコントローラによりＦＲ’に基づいてポンプの作動時間を調整して流加量を制御した。流加量の調整は１０分間隔でおこなった（ＴＣ＝１０分）。制御方式Ｉ及びＩＩによる流加量の増減等について図７に示す。
＜制御方式Ｉ＞
（１）ΔｐＨ＞０かつｐＨＰＶ＞（ｐＨＳＶ＋ｐＨＦＮＺ）の時、
ＦＲ’＝ＦＲ＋Ａ×ＦＲ×（ｐＨＰＶ−ｐＨＳＶ）＋Ｃ 式(１)
（２）ΔｐＨ＜０かつｐＨＰＶ＜（ｐＨＳＶ−ｐＨＦＮＺ）の時、
ＦＲ’＝ＦＲ＋Ａ×ＦＲ×（ｐＨＰＶ−ｐＨＳＶ）＋Ｃ 式(１)
＜制御方式ＩＩ＞
（１）ΔｐＨ＞０かつｐＨＰＶ＞（ｐＨＳＶ＋ｐＨＦＮＺ）の時、
ＦＲ’＝ＦＲ＋Ａ×ＦＲ×（ｐＨＰＶ−ｐＨＳＶ）＋Ｃ 式(１)
（２）ΔｐＨ＜０かつｐＨＰＶ＜（ｐＨＳＶ−ｐＨＦＮＺ）の時、
ＦＲ’＝ＦＲ＋Ｂ×ＦＲ×ΔｐＨ＋Ｃ 式(２)
ただし、
ＦＲ’：新たに設定される流加量（ｇ）
ＦＲ：直前流加量（ｇ）
ｐＨＰＶ：ｐＨ測定値
ｐＨＳＶ：目標ｐＨ値
ｐＨＦＮＺ：ｐＨ値の不感帯（本実施例では、０．０１とした。）
ΔｐＨ：所定時間あたりのｐＨ変化量（ｐＨ測定値−前回のｐＨ測定値）
Ａ：係数（本実施例では１とした。）
Ｂ：係数（本実施例では２とした。）
Ｃ：定数（本実施例では０とした。）
【００７９】
なお、下記(１)及び(２)以外のときには、ＦＲ’＝ＦＲとして流加量を変化させないこととした。なお、対照として、従来技術であるＲＱ制御法による流加培養を実施した。結果を表１に示す。
【００８０】
【表１】
【００８１】
表１に示すように、いずれの制御方式Ｉ及びＩＩによっても、ＲＱ制御方式よりも優れた菌体収率を得ることができた。特に、制御方式ＩＩによって優れた菌体収率を得ることができた。また、ｐＨ等のモニター結果によれば、制御方式ＩＩによる場合には、ｐＨのハンチング周期が長くなるとともに、ＤＯの上昇やＣＯ２の下降傾向が抑制されてより好ましい流加経過を得ることができた。また、制御方式Ｉに比較して全体的に流加時間が短縮されていた。
【配列表フリーテキスト】
【００８２】
配列番号１〜１０：合成プライマー
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】式（１）又は式（２）で制御した場合の流加量の増減とｐＨ挙動とを示す図。
【図２】ｐＨ上昇時には式（１）を用いｐＨ下降時には式（２）を用いて制御した場合の流加量の増減とｐＨ挙動とを示す図。
【図３】本発明の培養装置の一例を示す図。
【図４】本発明の培養方法を実施するのに好適な流加動作制御のフローチャートの一例を示す図。
【図５】本発明の培養方法を実施するのに好適な流加装置駆動制御のフローチャートの一例を示す図。
【図６】実施例における培養装置構成を示す図。
【図７】実施例の流加培養時における流加制御方式Ｉ及びＩＩについての説明図。
【符号の説明】
【００８４】
２ 培養装置、 １０ 培養槽、２０ ｐＨセンサ、３０ 流加装置、３２ 加流液の貯留槽、３４ ポンプ、３６ 供給経路、、３８ 流加装置駆動制御装置、４０ コンピュータ、４１ コントローラ、４２ ディスプレイ。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
有機酸生産酵母の培養方法であって、
前記有機酸生産酵母の培養液における単位時間あたりのｐＨ変化量を含むｐＨ情報を取得し、少なくとも前記ｐＨ変化量に基づいて炭素源流加量を調節しつつ培養する流加培養工程を備える、培養方法。
【請求項２】
前記ｐＨ変化量が正のときには前記流加量を増大させ、前記ｐＨ変化量が負のときには前記流加量を低下させる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ｐＨ情報は、測定ｐＨ値と所定のｐＨ閾値との関係を含んでおり、
前記ｐＨ変化量が正であってかつ測定ｐＨ値がｐＨ上限閾値を超えたときには前記流加量を増大させ、前記ｐＨ変化量が負であってかつ測定ｐＨ値がｐＨ下限閾値を超えたときには前記流加量を低下させる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ｐＨ情報はｐＨ測定値と目標ｐＨ値とのｐＨ差分量を含んでおり、
直前の流加量と前記ｐＨ差分量とに基づいて設定される添加量で炭素源を流加する、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
直前の流加量と前記ｐＨ変化量とに基づいて設定される添加量で炭素源を流加する、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記ｐＨ情報はｐＨ測定値と目標ｐＨ値とのｐＨ差分量を含んでおり、
直前の流加量と前記ｐＨ差分量とに基づく第１の流加量及び／又は直前の流加量と前記ｐＨ変化量とに基づく第２の流加量で炭素源を流加する、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記ｐＨ情報はｐＨ測定値と目標ｐＨ値とのｐＨ差分量を含んでおり、
前記流加量を増大させるときには、直前の流加量と前記ｐＨ差分量とに基づいて流加量を設定し、
前記流加量を低下させるときには、直前の流加量と前記ｐＨ変化量とに基づいて流加量を設定する、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記有機酸生産酵母は、クラブトリー効果を発現する遺伝子のプロモーターの制御下に有機酸生産酵素遺伝子を保持する、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記プロモーターは、ピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子のプロモーターである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記有機酸は乳酸である、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
有機酸生産酵母の菌体生産方法であって、
請求項１〜１０のいずれかに記載の流加培養工程を実施する、方法。
【請求項１２】
有機酸の生産方法であって、
請求項１１に記載の菌体生産方法によって生産された有機酸生産酵母を用いて有機酸を生産する、方法。
【請求項１３】
有機酸生産酵母の培養装置であって、
培養槽と、
前記培養槽中の培養液に炭素源を流加する炭素源流加手段と、
前記培養液のｐＨを測定するｐＨ測定手段と、
前記ｐＨ測定手段による測定結果に基づく単位時間あたりのｐＨ変化量を含むｐＨ情報を取得し、少なくともｐＨ変化量に基づいて前記炭素源流加手段により前記培養液に添加される炭素源流加量を設定する流加量制御手段と、
を備える、培養装置。
【請求項１４】
有機酸生産酵母の培養制御方法であって、
前記有機酸生産酵母の培養液のｐＨを取得するステップと、
前記ステップでの測定結果に基づく単位時間あたりのｐＨ変化量を含むｐＨ情報を取得するステップと、
少なくとも前記ｐＨ情報に基づいて前記培養液に流加する炭素源流加量を設定するステップと、
を備える、方法。
【請求項１５】
有機酸生産酵母の培養制御プログラムであって、
１又は２以上のコンピュータに、請求項１４に記載の各ステップを実行させる、プログラム。
【請求項１】
有機酸生産酵母の培養方法であって、
前記有機酸生産酵母の培養液における単位時間あたりのｐＨ変化量を含むｐＨ情報を取得し、少なくとも前記ｐＨ変化量に基づいて炭素源流加量を調節しつつ培養する流加培養工程を備える、培養方法。
【請求項２】
前記ｐＨ変化量が正のときには前記流加量を増大させ、前記ｐＨ変化量が負のときには前記流加量を低下させる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ｐＨ情報は、測定ｐＨ値と所定のｐＨ閾値との関係を含んでおり、
前記ｐＨ変化量が正であってかつ測定ｐＨ値がｐＨ上限閾値を超えたときには前記流加量を増大させ、前記ｐＨ変化量が負であってかつ測定ｐＨ値がｐＨ下限閾値を超えたときには前記流加量を低下させる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ｐＨ情報はｐＨ測定値と目標ｐＨ値とのｐＨ差分量を含んでおり、
直前の流加量と前記ｐＨ差分量とに基づいて設定される添加量で炭素源を流加する、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
直前の流加量と前記ｐＨ変化量とに基づいて設定される添加量で炭素源を流加する、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記ｐＨ情報はｐＨ測定値と目標ｐＨ値とのｐＨ差分量を含んでおり、
直前の流加量と前記ｐＨ差分量とに基づく第１の流加量及び／又は直前の流加量と前記ｐＨ変化量とに基づく第２の流加量で炭素源を流加する、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記ｐＨ情報はｐＨ測定値と目標ｐＨ値とのｐＨ差分量を含んでおり、
前記流加量を増大させるときには、直前の流加量と前記ｐＨ差分量とに基づいて流加量を設定し、
前記流加量を低下させるときには、直前の流加量と前記ｐＨ変化量とに基づいて流加量を設定する、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記有機酸生産酵母は、クラブトリー効果を発現する遺伝子のプロモーターの制御下に有機酸生産酵素遺伝子を保持する、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記プロモーターは、ピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子のプロモーターである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記有機酸は乳酸である、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
有機酸生産酵母の菌体生産方法であって、
請求項１〜１０のいずれかに記載の流加培養工程を実施する、方法。
【請求項１２】
有機酸の生産方法であって、
請求項１１に記載の菌体生産方法によって生産された有機酸生産酵母を用いて有機酸を生産する、方法。
【請求項１３】
有機酸生産酵母の培養装置であって、
培養槽と、
前記培養槽中の培養液に炭素源を流加する炭素源流加手段と、
前記培養液のｐＨを測定するｐＨ測定手段と、
前記ｐＨ測定手段による測定結果に基づく単位時間あたりのｐＨ変化量を含むｐＨ情報を取得し、少なくともｐＨ変化量に基づいて前記炭素源流加手段により前記培養液に添加される炭素源流加量を設定する流加量制御手段と、
を備える、培養装置。
【請求項１４】
有機酸生産酵母の培養制御方法であって、
前記有機酸生産酵母の培養液のｐＨを取得するステップと、
前記ステップでの測定結果に基づく単位時間あたりのｐＨ変化量を含むｐＨ情報を取得するステップと、
少なくとも前記ｐＨ情報に基づいて前記培養液に流加する炭素源流加量を設定するステップと、
を備える、方法。
【請求項１５】
有機酸生産酵母の培養制御プログラムであって、
１又は２以上のコンピュータに、請求項１４に記載の各ステップを実行させる、プログラム。
【図４】
【図５】
【図１】
【図２】
【図３】
【図６】
【図７】
【図５】
【図１】
【図２】
【図３】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２００７−１７５０２９（Ｐ２００７−１７５０２９Ａ）
【公開日】平成１９年７月１２日（２００７．７．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−３８０２４２（Ｐ２００５−３８０２４２）
【出願日】平成１７年１２月２８日（２００５．１２．２８）
【出願人】（０００００３６０９）株式会社豊田中央研究所 (4,200)
【出願人】（０００００３２０７）トヨタ自動車株式会社 (59,920)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年７月１２日（２００７．７．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１２月２８日（２００５．１２．２８）
【出願人】（０００００３６０９）株式会社豊田中央研究所 (4,200)
【出願人】（０００００３２０７）トヨタ自動車株式会社 (59,920)
【Ｆターム（参考）】
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