有用ポリペプチド
【課題】抗炎症、抗感染症、癌転移抑制等の医薬品、乳製品等の食品およびタンパク質の改善法、炎症性疾患や癌の悪性度の診断法を提供する。
【解決手段】β１,３-N-アセチルグルコサミン転移酵素活性を有する新規ポリペプチド、該ポリペプチドの製造法、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡが組み込まれた組換え体ベクター、該組換え体ベクターを保有する質転換体、該ポリペプチドを用いた糖鎖または複合糖質の製造法、該形質転換体を利用した糖鎖または複合糖質の製造法、該ポリペプチドを認識する抗体、該ポリぺプチドをコードする遺伝子の発現を変動させる物質のスクリーニング法、該ポリペプチドの有する活性を変動させる物質のスクリーニング法。
【解決手段】β１,３-N-アセチルグルコサミン転移酵素活性を有する新規ポリペプチド、該ポリペプチドの製造法、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡが組み込まれた組換え体ベクター、該組換え体ベクターを保有する質転換体、該ポリペプチドを用いた糖鎖または複合糖質の製造法、該形質転換体を利用した糖鎖または複合糖質の製造法、該ポリペプチドを認識する抗体、該ポリぺプチドをコードする遺伝子の発現を変動させる物質のスクリーニング法、該ポリペプチドの有する活性を変動させる物質のスクリーニング法。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）からなる群より選ばれるポリペプチドであり、かつポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖の合成に関与する活性を有するポリペプチドを有効成分として含有する、糖鎖合成剤。
（ａ） 配列番号２記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ） 配列番号２記載のアミノ酸配列の４５番目から３７２番目のアミノ酸配列を含むポリペプチド
（ｃ） 配列番号３記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｄ） 配列番号３記載のアミノ酸配列の４５番目から３７２番目のアミノ酸配列を含むポリペプチド
（ｅ） 配列番号４記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｆ） 配列番号４記載のアミノ酸配列の６２番目から３７８番目のアミノ酸配列を含むポリペプチド
【請求項２】
ポリペプチドが、請求項１記載のポリペプチドの有するアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖の合成に関与する活性を有するポリペプチドである、請求項１記載の糖鎖合成剤。
【請求項３】
ポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖の合成に関与する活性が、β1,3-N-アセチルグルコサミン転移酵素活性である、請求項１または２記載の糖鎖合成剤。
【請求項４】
以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）からなる群より選ばれるポリペプチド。
（ａ） 配列番号３記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ） 配列番号３記載のアミノ酸配列の４５番目から３７２番目のアミノ酸配列を含むポリペプチド
（ｃ） 配列番号４記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｄ） 配列番号４記載のアミノ酸配列の６２番目から３７８番目のアミノ酸配列を含むポリペプチド
【請求項５】
配列番号４記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖の合成に関与する活性を有するポリペプチド。
【請求項６】
配列番号２記載のアミノ酸配列の４５番目から３７２番目のアミノ酸配列を含み、かつ配列番号２記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含まないポリペプチドであり、かつポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖の合成に関与する活性を有するポリペプチド。
【請求項７】
ポリペプチドが、請求項６記載のポリペプチドの有するアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖の合成に関与する活性を有するポリペプチド。
【請求項８】
ポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖の合成に関与する活性が、β1,3-N-アセチルグルコサミン転移酵素活性である、請求項４〜７いずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項９】
ポリペプチドのβ1,3-N-アセチルグルコサミン転移酵素活性が、糖鎖の非還元末端に存在するガラクトース残基にβ1,3結合でＮ−アセチルグルコサミンを転移する活性である請求項８記載のポリペプチド。
【請求項１０】
β1,3-N-アセチルグルコサミン転移酵素活性が、 i)Ｎ−アセチルラクトサミン（Galβ1-4GlcNAc）またはラクトース（Galβ1-4Glc）、 ii) Ｎ−アセチルラクトサミンまたはラクトース構造を非還元末端に有するオリゴ糖、 およびiii) Ｎ−アセチルラクトサミンまたはラクトース構造を非還元末端に有する複合糖質から選ばれる受容基質の非還元末端に存在するガラクトース残基に、β1,3結合でＮ−アセチルグルコサミンを転移する活性である請求項８または９記載のポリペプチド。
【請求項１１】
以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）からなる群より選ばれるポリペプチドであり、かつポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖の合成に関与する活性を有する糖転移酵素。
（ａ） 配列番号２記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ） 配列番号２記載のアミノ酸配列の４５番目から３７２番目のアミノ酸配列を含むポリペプチド
（ｃ） 配列番号３記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｄ） 配列番号３記載のアミノ酸配列の４５番目から３７２番目のアミノ酸配列を含むポリペプチド
（ｅ） 配列番号４記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｆ） 配列番号４記載のアミノ酸配列の６２番目から３７８番目のアミノ酸配列を含むポリペプチド
【請求項１２】
ポリペプチドが、請求項１１記載のポリペプチドの有するアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖の合成に関与する活性を有するポリペプチドである、請求項１１記載の糖転移酵素。
【請求項１３】
請求項４〜１０のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項１４】
配列番号７または８記載の塩基配列を有するＤＮＡ。
【請求項１５】
配列番号８記載の塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつβ1,3-N-アセチルグルコサミン転移酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項１６】
請求項１３〜１５いずれか１項に記載のＤＮＡを含有する、炎症、癌または癌転移検出剤。
【請求項１７】
請求項１３〜１５いずれか１項に記載のＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡ。
【請求項１８】
組換え体ＤＮＡが、プラスミドｐＡＭｏ−Ｇ４−２、ｐＡＭｏ−Ｇ７、ｐＡＭｏＦ２−Ｇ４、ｐＶＬ１３９３−Ｆ２Ｇ４、ｐＢＳ−Ｇ４−２およびｐＴ７Ｂ−Ｇ７からなる群より選ばれるプラスミドである、請求項１７記載の組換え体ＤＮＡ。
【請求項１９】
請求項１７または１８記載の組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体。
【請求項２０】
形質転換体が、微生物、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、非ヒトトランスジェニック動物およびトランスジェニック植物からなる群から選ばれる形質転換体である、請求項１９記載の形質転換体。
【請求項２１】
微生物が、Escherichia属に属する微生物である、請求項２０記載の形質転換体。
【請求項２２】
Escherichia coliMM294/pBS-G4(FERM BP-6695)またはEscherichia coliMM294/pT7B-G7(FERM BP-6696)。
【請求項２３】
動物細胞が、マウス・ミエローマ細胞、ラット・ミエローマ細胞、マウス・ハイブリドーマ細胞、CHO細胞、BHK細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞、Namalwa細胞、Namalwa KJM-1細胞、ヒト胎児腎臓細胞およびヒト白血病細胞からなる群から選ばれる動物細胞である、請求項２０記載の形質転換体。
【請求項２４】
昆虫細胞が、Spodoptera frugiperdaの卵巣細胞、Trichoplusia niの卵巣細胞およびカイコの卵巣細胞からなる群から選ばれる昆虫細胞である、請求項２０記載の形質転換体。
【請求項２５】
請求項４〜１０のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体を培養液中で培養し、該ポリペプチドを該培養物中に生成・蓄積させ、該培養物中より該ポリペプチドを採取することを特徴とする、該ポリペプチドの製造法。
【請求項２６】
形質転換体が、微生物、動物細胞、植物細胞または昆虫細胞からなる群から選ばれる形質転換体である、請求項２５記載の製造法。
【請求項２７】
請求項４〜１０のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡを保有する非ヒトトランスジェニック動物を飼育し、該ポリペプチドを該動物中に生成・蓄積させ、該動物中より該ポリペプチドを採取することを特徴とする、該ポリペプチドの製造法。
【請求項２８】
生成・蓄積が動物のミルク中であることを特徴とする、請求項２７記載の製造法。
【請求項２９】
請求項４〜１０のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡを保有するトランスジェニック植物を栽培し、該ポリペプチドを該植物中に生成蓄積させ、該植物中より該ポリペプチドを採取することを特徴とする、該ポリペプチドの製造法。
【請求項３０】
請求項４〜１０のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡを用い、in vitroでの転写・翻訳系により該ポリペプチドを合成することを特徴とする、該ポリペプチドの製造法。
【請求項３１】
請求項１または２記載の糖鎖合成剤を酵素源として用い、
（ａ）該酵素源、
（ｂ）i)Ｎ−アセチルラクトサミン（Galβ1-4GlcNAc）、Galβ1-3GlcNAcまたはラクトース（Galβ1-4Glc）、 ii) Ｎ−アセチルラクトサミン、Galβ1-3GlcNAc
またはラクトース構造を非還元末端に有するオリゴ糖、 およびiii) Ｎ−アセチルラクトサミン、Galβ1-3GlcNAcまたはラクトース構造を非還元末端に有する複合糖質から選ばれる受容基質、および
（ｃ）ウリジン−５’−二リン酸Ｎ−アセチルグルコサミンを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中に、該受容基質のガラクトース残基にβ1,3結合でＮ−アセチルグルコサミンが付与された糖鎖または複合糖質を生成・蓄積させ、該水性媒体中より該糖鎖または複合糖質を採取することを特徴とする、該糖鎖または複合糖質の製造法。
【請求項３２】
請求項３１記載の方法により得られるＮ−アセチルグルコサミンが付与された糖鎖または複合糖質を受容基質として用い、
（ａ）該受容基質、
（ｂ）GlcNAc β1,4-ガラクトース転移酵素、および
（ｃ）ウリジン−５’−二リン酸ガラクトースを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中に、該受容基質の非還元末端のＮ−アセチルグルコサミン残基にβ1,4結合でガラクトースが付与された反応産物を生成・蓄積させ、該水性媒体中より該ガラクトースが付与された糖鎖または複合糖質を採取することを特徴とする、該ガラクトースが付与された該糖鎖または複合糖質の製造法。
【請求項３３】
請求項１または２記載の糖鎖合成剤を酵素源として用い、
（ａ）該酵素源、
（ｂ）GlcNAc β1,4-ガラクトース転移酵素、
（ｃ）i)Ｎ−アセチルラクトサミン（Galβ1-4GlcNAc）、Galβ1-3GlcNAcまたはラクトース（Galβ1-4Glc）、 ii) Ｎ−アセチルラクトサミン、Galβ1-3GlcNAc
またはラクトース構造を非還元末端に有するオリゴ糖、 iii) Ｎ−アセチルラクトサミン、Galβ1-3GlcNAcまたはラクトース構造を非還元末端に有する複合糖質、およびｉｖ）請求項３１または３２記載の方法により得られる糖鎖または複合糖質からなる群より選ばれる受容基質、
（ｄ）ウリジン−５’−二リン酸Ｎ−アセチルラクトサミン、および
（ｅ）ウリジン−５’−二リン酸ガラクトースを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中に、該受容基質の非還元末端にポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖が付与された反応産物を生成・蓄積させ、該水性媒体中より該ポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖が付与された糖鎖または複合糖質を採取することを特徴とする、該ポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖が付与された該糖鎖または複合糖質の製造法。
【請求項３４】
請求項１または２記載の糖鎖合成剤の有効成分であるポリペプチドをコードするＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体を培養液中で培養し、該培養物中に、 GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc構造を有する糖、GlcNAcβ1-3Galβ1-3GlcNAc構造を有する糖、GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc構造を有する糖、(Galβ1-4GlcNAcβ1-3)nGalβ1-4GlcNAc構造を有しｎが１以上である糖、および（Galβ1-4GlcNAcβ1-3)nGalβ1-4Glc構造を有しｎが１以上である糖からなる群より選ばれる糖よりなる糖鎖、または該糖鎖を含有する複合糖質を生成・蓄積させ、該培養物中より該糖鎖または複合糖質を採取することを特徴とする、該糖鎖または複合糖質の製造法。
【請求項３５】
形質転換体が、微生物、動物細胞、植物細胞または昆虫細胞である、請求項３４記載の製造法。
【請求項３６】
請求項１または２記載の糖鎖合成剤の有効成分であるポリペプチドをコードするＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡを保有する非ヒトトランスジェニック動物を飼育し、該動物中に、 GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc構造を有する糖、GlcNAcβ1-3Galβ1-3GlcNAc構造を有する糖、GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc構造を有する糖、(Galβ1-4GlcNAcβ1-3)nGalβ1-4GlcNAc構造を有しnが１以上である糖、および(Galβ1-4GlcNAcβ1-3)nGalβ1-4Glc構造を有しnが１以上である糖からなる群より選ばれる糖よりなる糖鎖、または該糖鎖を含有する複合糖質を生成・蓄積させ、該動物中より該糖鎖または複合糖質を採取することを特徴とする、該糖鎖または複合糖質の製造法。
【請求項３７】
請求項１または２記載の糖鎖合成剤の有効成分であるポリペプチドをコードするＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡを保有するトランスジェニック植物を栽培し、該植物中に、 GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc構造を有する糖、GlcNAcβ1-3Galβ1-3GlcNAc構造を有する糖、GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc構造を有する糖、(Galβ1-4GlcNAcβ1-3)nGalβ1-4GlcNAc構造を有しｎが１以上である糖、および(Galβ1-4GlcNAcβ1-3)nGalβ1-4Glc構造を有しｎが１以上である糖からなる群より選ばれる糖よりなる糖鎖、または該糖鎖を含有する複合糖質を生成・蓄積させ、該植物中より該糖鎖または複合糖質を採取することを特徴とする、該糖鎖または複合糖質の製造法。
【請求項３８】
複合糖質が、糖蛋白質、糖脂質、プロテオグリカン、グリコペプチド、リポ多糖、ペプチドグリカン、およびステロイド化合物等に糖鎖が結合した配糖体から選ばれる複合糖質である、請求項３１〜３７のいずれか１項に記載の製造法。
【請求項３９】
生成・蓄積が動物のミルク中であることを特徴とする、請求項３６記載の製造法。
【請求項４０】
請求項１３〜１５いずれか１項に記載のＤＮＡを用い、ハイブリダイゼーション法により、配列番号２〜４いずれか１つに記載のアミノ酸配列を有するポリぺプチドをコードする遺伝子の発現量を定量する方法。
【請求項４１】
配列番号８記載の塩基配列を有するＤＮＡの連続した２５〜６０塩基と同じ配列を有するオリゴヌクレオチド、該オリゴヌクレオチドと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド、および該オリゴヌクレオチドの誘導体から選ばれるオリゴヌクレオチド。
【請求項４２】
オリゴヌクレオチドの誘導体が、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスフォロチオエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスフォアミデート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合がペプチド核酸結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（phenoxazine-modified cytosine)で置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体およびオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体から選ばれるオリゴヌクレオチド誘導体である、請求項４１記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４３】
請求項４〜１０のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡの有する塩基配列の連続した２５〜６０塩基と同じ配列を有するオリゴヌクレオチド、該オリゴヌクレオチドと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド、および該オリゴヌクレオチドの誘導体から選ばれるオリゴヌクレオチドを用い、ポリメラーゼ・チェイン・リアクション法により、請求項４〜１０のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする遺伝子の発現量を定量する方法。
【請求項４４】
請求項４０または４３記載の方法を用いた、炎症、癌または癌転移の検出法。
【請求項４５】
請求項１３〜１５いずれか１項に記載のＤＮＡの有する塩基配列の連続した６〜６０塩基と同じ配列を有するオリゴヌクレオチド、該オリゴヌクレオチドと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド、および該オリゴヌクレオチドの誘導体から選ばれるオリゴヌクレオチドを用い、請求項４〜１０のいずれか１項に記載のポリぺプチドをコードするＤＮＡの転写またはｍＲＮＡの翻訳を抑制する方法。
【請求項４６】
請求項４〜１０のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡの有する塩基配列の連続した６〜６０塩基と同じ配列を有するオリゴヌクレオチド、該オリゴヌクレオチドと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド、および該オリゴヌクレオチドの誘導体から選ばれるオリゴヌクレオチド。
【請求項４７】
請求項４〜１０のいずれか１項に記載のポリペプチドを認識する抗体。
【請求項４８】
請求項４７記載の抗体を用いる、請求項４〜１０のいずれか１項に記載のポリペプチドの免疫学的検出法。
【請求項４９】
請求項４７記載の抗体を用い、請求項４〜１０のいずれか１項に記載のポリペプチドを検出することを特徴とする、免疫組織染色法。
【請求項５０】
請求項４７記載の抗体を含有する、免疫組織染色剤。
【請求項５１】
請求項４７記載の抗体を含有する、炎症、癌または癌転移の診断薬。
【請求項５２】
請求項４〜１０のいずれか１項に記載のポリペプチドと被験試料とを接触させることを特徴とする、該ポリペプチドの有するβ１,３-Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性を変動させる化合物のスクリーニング法。
【請求項５３】
請求項４〜１０のいずれか１項に記載のポリペプチドを発現する細胞と被験試料とを接触させ、ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖を認識する抗体またはレクチンを用い、ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖含量を測定することを特徴とする、該ポリぺプチドをコードする遺伝子の発現を変動させる化合物のスクリーニング法。
【請求項５４】
請求項４〜１０のいずれか１項に記載のポリペプチドを発現する細胞と被験試料とを接触させ、請求項４７記載の抗体を用い、該ポリペプチド含量を測定することを特徴とする、該ポリぺプチドをコードする遺伝子の発現を変動させる化合物のスクリーニング法。
【請求項５５】
請求項４〜１０のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする遺伝子の転写を司るプロモーターＤＮＡ。
【請求項５６】
プロモーターＤＮＡが、白血球細胞、小腸細胞、大腸細胞、膵臓細胞、胃細胞、大腸癌細胞、膵癌細胞および胃癌細胞から選ばれる細胞で機能しているプロモーターである、請求項５５記載のプロモーターＤＮＡ。
【請求項５７】
プロモーターＤＮＡが、ヒトまたはマウス由来のプロモーターＤＮＡである、請求項５５または５６記載のプロモーターＤＮＡ。
【請求項５８】
請求項５５〜５７のいずれか１項に記載のプロモーターＤＮＡおよび該プロモーターＤＮＡの下流に連結させたレポーター遺伝子を含有するプラスミドを用いて動物細胞を形質転換し、該形質転換体と被検試料とを接触させ、該レポーター遺伝子の翻訳産物の含量を測定することを特徴とする、該プロモーターによる転写の効率を変動させる化合物のスクリーニング法。
【請求項５９】
レポーター遺伝子が、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、β-ラクタマーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子およびグリーン・フルオレッセント・プロテイン遺伝子より選ばれる遺伝子である、請求項５８記載のスクリーニング法。
【請求項６０】
請求項５２〜５４、５８および５９のいずれか１項に記載のスクリーニング法により得られる化合物。
【請求項６１】
請求項４〜１０のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡを欠損または変異させたノックアウト非ヒト動物。
【請求項６２】
ノックアウト非ヒト動物がマウスである、請求項６１記載のノックアウト非ヒト動物。
【請求項１】
以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）からなる群より選ばれるポリペプチドであり、かつポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖の合成に関与する活性を有するポリペプチドを有効成分として含有する、糖鎖合成剤。
（ａ） 配列番号２記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ） 配列番号２記載のアミノ酸配列の４５番目から３７２番目のアミノ酸配列を含むポリペプチド
（ｃ） 配列番号３記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｄ） 配列番号３記載のアミノ酸配列の４５番目から３７２番目のアミノ酸配列を含むポリペプチド
（ｅ） 配列番号４記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｆ） 配列番号４記載のアミノ酸配列の６２番目から３７８番目のアミノ酸配列を含むポリペプチド
【請求項２】
ポリペプチドが、請求項１記載のポリペプチドの有するアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖の合成に関与する活性を有するポリペプチドである、請求項１記載の糖鎖合成剤。
【請求項３】
ポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖の合成に関与する活性が、β1,3-N-アセチルグルコサミン転移酵素活性である、請求項１または２記載の糖鎖合成剤。
【請求項４】
以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）からなる群より選ばれるポリペプチド。
（ａ） 配列番号３記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ） 配列番号３記載のアミノ酸配列の４５番目から３７２番目のアミノ酸配列を含むポリペプチド
（ｃ） 配列番号４記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｄ） 配列番号４記載のアミノ酸配列の６２番目から３７８番目のアミノ酸配列を含むポリペプチド
【請求項５】
配列番号４記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖の合成に関与する活性を有するポリペプチド。
【請求項６】
配列番号２記載のアミノ酸配列の４５番目から３７２番目のアミノ酸配列を含み、かつ配列番号２記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含まないポリペプチドであり、かつポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖の合成に関与する活性を有するポリペプチド。
【請求項７】
ポリペプチドが、請求項６記載のポリペプチドの有するアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖の合成に関与する活性を有するポリペプチド。
【請求項８】
ポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖の合成に関与する活性が、β1,3-N-アセチルグルコサミン転移酵素活性である、請求項４〜７いずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項９】
ポリペプチドのβ1,3-N-アセチルグルコサミン転移酵素活性が、糖鎖の非還元末端に存在するガラクトース残基にβ1,3結合でＮ−アセチルグルコサミンを転移する活性である請求項８記載のポリペプチド。
【請求項１０】
β1,3-N-アセチルグルコサミン転移酵素活性が、 i)Ｎ−アセチルラクトサミン（Galβ1-4GlcNAc）またはラクトース（Galβ1-4Glc）、 ii) Ｎ−アセチルラクトサミンまたはラクトース構造を非還元末端に有するオリゴ糖、 およびiii) Ｎ−アセチルラクトサミンまたはラクトース構造を非還元末端に有する複合糖質から選ばれる受容基質の非還元末端に存在するガラクトース残基に、β1,3結合でＮ−アセチルグルコサミンを転移する活性である請求項８または９記載のポリペプチド。
【請求項１１】
以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）からなる群より選ばれるポリペプチドであり、かつポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖の合成に関与する活性を有する糖転移酵素。
（ａ） 配列番号２記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ） 配列番号２記載のアミノ酸配列の４５番目から３７２番目のアミノ酸配列を含むポリペプチド
（ｃ） 配列番号３記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｄ） 配列番号３記載のアミノ酸配列の４５番目から３７２番目のアミノ酸配列を含むポリペプチド
（ｅ） 配列番号４記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｆ） 配列番号４記載のアミノ酸配列の６２番目から３７８番目のアミノ酸配列を含むポリペプチド
【請求項１２】
ポリペプチドが、請求項１１記載のポリペプチドの有するアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖の合成に関与する活性を有するポリペプチドである、請求項１１記載の糖転移酵素。
【請求項１３】
請求項４〜１０のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項１４】
配列番号７または８記載の塩基配列を有するＤＮＡ。
【請求項１５】
配列番号８記載の塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつβ1,3-N-アセチルグルコサミン転移酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項１６】
請求項１３〜１５いずれか１項に記載のＤＮＡを含有する、炎症、癌または癌転移検出剤。
【請求項１７】
請求項１３〜１５いずれか１項に記載のＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡ。
【請求項１８】
組換え体ＤＮＡが、プラスミドｐＡＭｏ−Ｇ４−２、ｐＡＭｏ−Ｇ７、ｐＡＭｏＦ２−Ｇ４、ｐＶＬ１３９３−Ｆ２Ｇ４、ｐＢＳ−Ｇ４−２およびｐＴ７Ｂ−Ｇ７からなる群より選ばれるプラスミドである、請求項１７記載の組換え体ＤＮＡ。
【請求項１９】
請求項１７または１８記載の組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体。
【請求項２０】
形質転換体が、微生物、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、非ヒトトランスジェニック動物およびトランスジェニック植物からなる群から選ばれる形質転換体である、請求項１９記載の形質転換体。
【請求項２１】
微生物が、Escherichia属に属する微生物である、請求項２０記載の形質転換体。
【請求項２２】
Escherichia coliMM294/pBS-G4(FERM BP-6695)またはEscherichia coliMM294/pT7B-G7(FERM BP-6696)。
【請求項２３】
動物細胞が、マウス・ミエローマ細胞、ラット・ミエローマ細胞、マウス・ハイブリドーマ細胞、CHO細胞、BHK細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞、Namalwa細胞、Namalwa KJM-1細胞、ヒト胎児腎臓細胞およびヒト白血病細胞からなる群から選ばれる動物細胞である、請求項２０記載の形質転換体。
【請求項２４】
昆虫細胞が、Spodoptera frugiperdaの卵巣細胞、Trichoplusia niの卵巣細胞およびカイコの卵巣細胞からなる群から選ばれる昆虫細胞である、請求項２０記載の形質転換体。
【請求項２５】
請求項４〜１０のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体を培養液中で培養し、該ポリペプチドを該培養物中に生成・蓄積させ、該培養物中より該ポリペプチドを採取することを特徴とする、該ポリペプチドの製造法。
【請求項２６】
形質転換体が、微生物、動物細胞、植物細胞または昆虫細胞からなる群から選ばれる形質転換体である、請求項２５記載の製造法。
【請求項２７】
請求項４〜１０のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡを保有する非ヒトトランスジェニック動物を飼育し、該ポリペプチドを該動物中に生成・蓄積させ、該動物中より該ポリペプチドを採取することを特徴とする、該ポリペプチドの製造法。
【請求項２８】
生成・蓄積が動物のミルク中であることを特徴とする、請求項２７記載の製造法。
【請求項２９】
請求項４〜１０のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡを保有するトランスジェニック植物を栽培し、該ポリペプチドを該植物中に生成蓄積させ、該植物中より該ポリペプチドを採取することを特徴とする、該ポリペプチドの製造法。
【請求項３０】
請求項４〜１０のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡを用い、in vitroでの転写・翻訳系により該ポリペプチドを合成することを特徴とする、該ポリペプチドの製造法。
【請求項３１】
請求項１または２記載の糖鎖合成剤を酵素源として用い、
（ａ）該酵素源、
（ｂ）i)Ｎ−アセチルラクトサミン（Galβ1-4GlcNAc）、Galβ1-3GlcNAcまたはラクトース（Galβ1-4Glc）、 ii) Ｎ−アセチルラクトサミン、Galβ1-3GlcNAc
またはラクトース構造を非還元末端に有するオリゴ糖、 およびiii) Ｎ−アセチルラクトサミン、Galβ1-3GlcNAcまたはラクトース構造を非還元末端に有する複合糖質から選ばれる受容基質、および
（ｃ）ウリジン−５’−二リン酸Ｎ−アセチルグルコサミンを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中に、該受容基質のガラクトース残基にβ1,3結合でＮ−アセチルグルコサミンが付与された糖鎖または複合糖質を生成・蓄積させ、該水性媒体中より該糖鎖または複合糖質を採取することを特徴とする、該糖鎖または複合糖質の製造法。
【請求項３２】
請求項３１記載の方法により得られるＮ−アセチルグルコサミンが付与された糖鎖または複合糖質を受容基質として用い、
（ａ）該受容基質、
（ｂ）GlcNAc β1,4-ガラクトース転移酵素、および
（ｃ）ウリジン−５’−二リン酸ガラクトースを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中に、該受容基質の非還元末端のＮ−アセチルグルコサミン残基にβ1,4結合でガラクトースが付与された反応産物を生成・蓄積させ、該水性媒体中より該ガラクトースが付与された糖鎖または複合糖質を採取することを特徴とする、該ガラクトースが付与された該糖鎖または複合糖質の製造法。
【請求項３３】
請求項１または２記載の糖鎖合成剤を酵素源として用い、
（ａ）該酵素源、
（ｂ）GlcNAc β1,4-ガラクトース転移酵素、
（ｃ）i)Ｎ−アセチルラクトサミン（Galβ1-4GlcNAc）、Galβ1-3GlcNAcまたはラクトース（Galβ1-4Glc）、 ii) Ｎ−アセチルラクトサミン、Galβ1-3GlcNAc
またはラクトース構造を非還元末端に有するオリゴ糖、 iii) Ｎ−アセチルラクトサミン、Galβ1-3GlcNAcまたはラクトース構造を非還元末端に有する複合糖質、およびｉｖ）請求項３１または３２記載の方法により得られる糖鎖または複合糖質からなる群より選ばれる受容基質、
（ｄ）ウリジン−５’−二リン酸Ｎ−アセチルラクトサミン、および
（ｅ）ウリジン−５’−二リン酸ガラクトースを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中に、該受容基質の非還元末端にポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖が付与された反応産物を生成・蓄積させ、該水性媒体中より該ポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖が付与された糖鎖または複合糖質を採取することを特徴とする、該ポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖が付与された該糖鎖または複合糖質の製造法。
【請求項３４】
請求項１または２記載の糖鎖合成剤の有効成分であるポリペプチドをコードするＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体を培養液中で培養し、該培養物中に、 GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc構造を有する糖、GlcNAcβ1-3Galβ1-3GlcNAc構造を有する糖、GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc構造を有する糖、(Galβ1-4GlcNAcβ1-3)nGalβ1-4GlcNAc構造を有しｎが１以上である糖、および（Galβ1-4GlcNAcβ1-3)nGalβ1-4Glc構造を有しｎが１以上である糖からなる群より選ばれる糖よりなる糖鎖、または該糖鎖を含有する複合糖質を生成・蓄積させ、該培養物中より該糖鎖または複合糖質を採取することを特徴とする、該糖鎖または複合糖質の製造法。
【請求項３５】
形質転換体が、微生物、動物細胞、植物細胞または昆虫細胞である、請求項３４記載の製造法。
【請求項３６】
請求項１または２記載の糖鎖合成剤の有効成分であるポリペプチドをコードするＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡを保有する非ヒトトランスジェニック動物を飼育し、該動物中に、 GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc構造を有する糖、GlcNAcβ1-3Galβ1-3GlcNAc構造を有する糖、GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc構造を有する糖、(Galβ1-4GlcNAcβ1-3)nGalβ1-4GlcNAc構造を有しnが１以上である糖、および(Galβ1-4GlcNAcβ1-3)nGalβ1-4Glc構造を有しnが１以上である糖からなる群より選ばれる糖よりなる糖鎖、または該糖鎖を含有する複合糖質を生成・蓄積させ、該動物中より該糖鎖または複合糖質を採取することを特徴とする、該糖鎖または複合糖質の製造法。
【請求項３７】
請求項１または２記載の糖鎖合成剤の有効成分であるポリペプチドをコードするＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡを保有するトランスジェニック植物を栽培し、該植物中に、 GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc構造を有する糖、GlcNAcβ1-3Galβ1-3GlcNAc構造を有する糖、GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc構造を有する糖、(Galβ1-4GlcNAcβ1-3)nGalβ1-4GlcNAc構造を有しｎが１以上である糖、および(Galβ1-4GlcNAcβ1-3)nGalβ1-4Glc構造を有しｎが１以上である糖からなる群より選ばれる糖よりなる糖鎖、または該糖鎖を含有する複合糖質を生成・蓄積させ、該植物中より該糖鎖または複合糖質を採取することを特徴とする、該糖鎖または複合糖質の製造法。
【請求項３８】
複合糖質が、糖蛋白質、糖脂質、プロテオグリカン、グリコペプチド、リポ多糖、ペプチドグリカン、およびステロイド化合物等に糖鎖が結合した配糖体から選ばれる複合糖質である、請求項３１〜３７のいずれか１項に記載の製造法。
【請求項３９】
生成・蓄積が動物のミルク中であることを特徴とする、請求項３６記載の製造法。
【請求項４０】
請求項１３〜１５いずれか１項に記載のＤＮＡを用い、ハイブリダイゼーション法により、配列番号２〜４いずれか１つに記載のアミノ酸配列を有するポリぺプチドをコードする遺伝子の発現量を定量する方法。
【請求項４１】
配列番号８記載の塩基配列を有するＤＮＡの連続した２５〜６０塩基と同じ配列を有するオリゴヌクレオチド、該オリゴヌクレオチドと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド、および該オリゴヌクレオチドの誘導体から選ばれるオリゴヌクレオチド。
【請求項４２】
オリゴヌクレオチドの誘導体が、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスフォロチオエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスフォアミデート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合がペプチド核酸結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（phenoxazine-modified cytosine)で置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体およびオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体から選ばれるオリゴヌクレオチド誘導体である、請求項４１記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４３】
請求項４〜１０のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡの有する塩基配列の連続した２５〜６０塩基と同じ配列を有するオリゴヌクレオチド、該オリゴヌクレオチドと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド、および該オリゴヌクレオチドの誘導体から選ばれるオリゴヌクレオチドを用い、ポリメラーゼ・チェイン・リアクション法により、請求項４〜１０のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする遺伝子の発現量を定量する方法。
【請求項４４】
請求項４０または４３記載の方法を用いた、炎症、癌または癌転移の検出法。
【請求項４５】
請求項１３〜１５いずれか１項に記載のＤＮＡの有する塩基配列の連続した６〜６０塩基と同じ配列を有するオリゴヌクレオチド、該オリゴヌクレオチドと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド、および該オリゴヌクレオチドの誘導体から選ばれるオリゴヌクレオチドを用い、請求項４〜１０のいずれか１項に記載のポリぺプチドをコードするＤＮＡの転写またはｍＲＮＡの翻訳を抑制する方法。
【請求項４６】
請求項４〜１０のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡの有する塩基配列の連続した６〜６０塩基と同じ配列を有するオリゴヌクレオチド、該オリゴヌクレオチドと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド、および該オリゴヌクレオチドの誘導体から選ばれるオリゴヌクレオチド。
【請求項４７】
請求項４〜１０のいずれか１項に記載のポリペプチドを認識する抗体。
【請求項４８】
請求項４７記載の抗体を用いる、請求項４〜１０のいずれか１項に記載のポリペプチドの免疫学的検出法。
【請求項４９】
請求項４７記載の抗体を用い、請求項４〜１０のいずれか１項に記載のポリペプチドを検出することを特徴とする、免疫組織染色法。
【請求項５０】
請求項４７記載の抗体を含有する、免疫組織染色剤。
【請求項５１】
請求項４７記載の抗体を含有する、炎症、癌または癌転移の診断薬。
【請求項５２】
請求項４〜１０のいずれか１項に記載のポリペプチドと被験試料とを接触させることを特徴とする、該ポリペプチドの有するβ１,３-Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性を変動させる化合物のスクリーニング法。
【請求項５３】
請求項４〜１０のいずれか１項に記載のポリペプチドを発現する細胞と被験試料とを接触させ、ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖を認識する抗体またはレクチンを用い、ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖含量を測定することを特徴とする、該ポリぺプチドをコードする遺伝子の発現を変動させる化合物のスクリーニング法。
【請求項５４】
請求項４〜１０のいずれか１項に記載のポリペプチドを発現する細胞と被験試料とを接触させ、請求項４７記載の抗体を用い、該ポリペプチド含量を測定することを特徴とする、該ポリぺプチドをコードする遺伝子の発現を変動させる化合物のスクリーニング法。
【請求項５５】
請求項４〜１０のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする遺伝子の転写を司るプロモーターＤＮＡ。
【請求項５６】
プロモーターＤＮＡが、白血球細胞、小腸細胞、大腸細胞、膵臓細胞、胃細胞、大腸癌細胞、膵癌細胞および胃癌細胞から選ばれる細胞で機能しているプロモーターである、請求項５５記載のプロモーターＤＮＡ。
【請求項５７】
プロモーターＤＮＡが、ヒトまたはマウス由来のプロモーターＤＮＡである、請求項５５または５６記載のプロモーターＤＮＡ。
【請求項５８】
請求項５５〜５７のいずれか１項に記載のプロモーターＤＮＡおよび該プロモーターＤＮＡの下流に連結させたレポーター遺伝子を含有するプラスミドを用いて動物細胞を形質転換し、該形質転換体と被検試料とを接触させ、該レポーター遺伝子の翻訳産物の含量を測定することを特徴とする、該プロモーターによる転写の効率を変動させる化合物のスクリーニング法。
【請求項５９】
レポーター遺伝子が、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、β-ラクタマーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子およびグリーン・フルオレッセント・プロテイン遺伝子より選ばれる遺伝子である、請求項５８記載のスクリーニング法。
【請求項６０】
請求項５２〜５４、５８および５９のいずれか１項に記載のスクリーニング法により得られる化合物。
【請求項６１】
請求項４〜１０のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡを欠損または変異させたノックアウト非ヒト動物。
【請求項６２】
ノックアウト非ヒト動物がマウスである、請求項６１記載のノックアウト非ヒト動物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【公開番号】特開２０１０−１５４８５７（Ｐ２０１０−１５４８５７Ａ）
【公開日】平成２２年７月１５日（２０１０．７．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−４２９５（Ｐ２０１０−４２９５）
【出願日】平成２２年１月１２日（２０１０．１．１２）
【分割の表示】特願２００１−５０６８４０（Ｐ２００１−５０６８４０）の分割
【原出願日】平成１２年６月２９日（２０００．６．２９）
【出願人】（０００００１０２９）協和発酵キリン株式会社 (276)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年７月１５日（２０１０．７．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１月１２日（２０１０．１．１２）
【分割の表示】特願２００１−５０６８４０（Ｐ２００１−５０６８４０）の分割
【原出願日】平成１２年６月２９日（２０００．６．２９）
【出願人】（０００００１０２９）協和発酵キリン株式会社 (276)
【Ｆターム（参考）】
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