核酸分析デバイス、及び核酸分析装置
【課題】本発明の目的は、あるプローブ分子を、支持基体の所定位置に、簡便且つ高効率で固定することに関する。
【解決手段】本発明は、支持基体の所定位置に微小な金属パッドを設け、当該金属パッドに対し、ポリペプチドからなるリンカーを固着させ、当該リンカーにプローブ分子を結合させることに関する。本発明により、プローブ分子を所定位置に固定した核酸分析デバイスを提供できる。核酸分析デバイスを用いた核酸分析において、「dephasing」が起こることがないため読み取塩基長を長くでき、かつ、多種類の被解析ＤＮＡ断片を一度に解析可能であるため、非常に高いスループットとすることができる。
【解決手段】本発明は、支持基体の所定位置に微小な金属パッドを設け、当該金属パッドに対し、ポリペプチドからなるリンカーを固着させ、当該リンカーにプローブ分子を結合させることに関する。本発明により、プローブ分子を所定位置に固定した核酸分析デバイスを提供できる。核酸分析デバイスを用いた核酸分析において、「dephasing」が起こることがないため読み取塩基長を長くでき、かつ、多種類の被解析ＤＮＡ断片を一度に解析可能であるため、非常に高いスループットとすることができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プローブ分子を支持基体に固定した核酸分析デバイスに関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸分析デバイスとして、ＤＮＡやＲＮＡの塩基配列を決定する新しい技術が開発されている。
【０００３】
現在、通常用いられている電気泳動を利用した方法においては、配列決定用のＤＮＡ断片又はＲＮＡ試料から逆転写反応を行い予め合成したｃＤＮＡ断片試料を調製し、周知のサンガー法によるジデオキシ反応を実行した後、電気泳動を行い、分子量分離展開パターンを計測して解析する。
【０００４】
これに対し、近年、試料となるＤＮＡ断片を基板に数多く固定して、数多くの断片の配列情報をパラレルに決定する方法が提案されている。
【０００５】
特に、被解析ＤＮＡ断片試料をＰＣＲにより増幅してから基板上に固定する所謂クラスタ方式（「Nature 2005, Vol. 437, pp. 376-380.（非特許文献１）」参照）に加え、被解析ＤＮＡ断片試料を一分子ずつ固定して配列を解読する単分子方式が提案されている。
単分子方式では、テンプレートとなるＤＮＡ試料断片が１分子だけ、所定の位置に固定される、あるいは、ランダムに平滑基板上に固定され、基板上に核酸合成酵素と蛍光色素付きヌクレオチドが供給されると基板上で伸長反応が起き、取り込まれたヌクレオチドの蛍光色素の発光を一分子レベルで検出することにより、ヌクレオチドの識別を行う。単分子方式の場合には、「Science 2008, Vol. 320, pp. 106-109.（非特許文献２）」にあるような逐次反応方式に加えて、「Science 2009, Vol. 323, pp. 133-138.（非特許文献３）
」にあるようなリアルタイム計測方式も提案されている。クラスタ方式の利点は、検出対象のＤＮＡがＰＣＲで増幅された数千から数万分子であることから蛍光検出が容易であることである。一方、弱点は、数千から数万分子の伸長反応を平均値として評価するため、数千から数万分子の伸長反応の速度が不揃いで、伸長反応の進み具合にばらつきが生じると、一度に複数の蛍光色素の発光が検出されてしまい、取り込まれた塩基の同定ができなくなってしまう点にある。この現象は「dephasing」と呼ばれ、伸長する塩基鎖が長くなった時ほど起こりやすくなるため、クラスタ方式の読み取り塩基長が比較的短いことの主原因の一つとなっている。
【０００６】
これに対して、単分子方式では読み取り対象のＤＮＡ断片が一分子しかないため、前記の「dephasing」は原理的になく、クラスタ方式に比べ読み取り塩基長が大幅に長くなることが期待されている。一方、蛍光測定は一分子レベルで行わなくてはならないことから高感度検出技術が必要になるとともに、一分子ずつプローブ分子（ＤＮＡ断片試料や、核酸合成酵素とＤＮＡ断片試料の複合体）を所定の位置に固定する技術も必要となる。
【０００７】
「PNAS 2003, Vol. 100, pp. 3960-3964.（非特許文献４）」では、一分子ずつプローブ分子を固定する方法として、あらかじめアビジンを導入した高分子膜をガラス基板上に
設けておき、末端にビオチン修飾を施した核酸プローブ分子の溶液を低濃度で基板表面と反応させることにより、ランダムに一分子プローブを固定することが提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特表２００４−５３３６０１号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Nature 2005, Vol. 437, pp. 376-380.
【非特許文献２】Science 2008, Vol. 320, pp. 106-109.
【非特許文献３】Science 2009, Vol. 323, pp. 133-138.
【非特許文献４】PNAS 2003, Vol. 100, pp. 3960-3964.
【非特許文献５】Angewandte Chemie International Edition 2006, Vol. 45, pp. 3252-3256.
【非特許文献６】Nanotechnology, 2007, vol. 18, pp. 044017-044021.
【非特許文献７】P.N.A.S. 2006, vol. 103, pp. 19635-19640.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
プローブ分子を精度良く核酸分析デバイスの所定位置に固定することについて本願発明者が鋭意検討した結果、次の知見を得るに至った。
【００１１】
非特許文献４に開示されている技術では、固定は容易ではある。しかし、蛍光測定で配列を読み取る段階になると、ＣＣＤカメラにより検出したランダムに存在する蛍光分子から数値データを取得する際、膨大なデータ処理時間を必要とする。また、プローブ分子同士が近接して固定されてしまうと、これらの二つのプローブ分子からの蛍光が識別できなくなるという問題も生じる。
【００１２】
本発明の目的は、あるプローブ分子を、支持基体の所定位置に、簡便且つ高効率で固定することに関する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、支持基体の所定位置に微小な金属パッドを設け、当該金属パッドに対し、ポリペプチドからなるリンカーを固着させ、当該リンカーにプローブ分子を結合させることに関する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、プローブ分子を所定位置に固定した核酸分析デバイスを提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】核酸分析デバイスの概略構成図。
【図２】核酸分析デバイスの概略構成図。
【図３】核酸分析デバイスの製造方法の一例。
【図４】核酸分析デバイスの製造方法の一例。
【図５】核酸分析デバイスを用いた核酸分析装置の概略構成図。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
実施例では、検出対象の核酸を捕捉するプローブ分子を支持基体に固定した核酸分析用デバイスであって、前記支持基体の所定位置に金属パッドが形成されており、前記プローブ分子が、ポリペプチドからなるリンカーを介して前記金属パッドに固定されているものを開示する。好ましくは、プローブ分子を、一つの前記金属パッドに対して一分子のみ固定する。
【００１７】
また、実施例では、検出対象の核酸を捕捉するプローブ分子を支持基体に固定した核酸分析デバイスであって、前記支持基体の所定位置に金属パッドが形成されており、前記プローブ分子が微粒子に固定されており、当該微粒子が、ポリペプチドからなるリンカーを介して前記金属パッドに固定されているものを開示する。好ましくは、プローブ分子を、一つの微粒子に対して一分子のみ固定し、当該微粒子を、前記金属パッドに固定する。また、好ましくは、半導体、又は金属から選ばれる材料からなる微粒子を用いる。
【００１８】
また、実施例では、検出対象の核酸を捕捉するプローブ分子である核酸、又は核酸合成酵素を支持基体に固定した核酸分析用デバイスを開示する。
【００１９】
また、実施例では、支持基体の所定位置に金属パッドが、金，チタン，ニッケル、又はアルミから選ばれる材料からなる核酸分析デバイスを開示する。
【００２０】
また、実施例では、核酸分析デバイスに対して、蛍光色素を有するヌクレオチド、及び核酸試料を供給する手段と、核酸分析デバイスに光を照射する手段と、核酸分析デバイスにおいてヌクレオチド，核酸合成酵素、及び核酸試料が共存することにより起きる核酸伸長反応により核酸鎖中に取り込まれた蛍光色素の蛍光を測定する発光検出手段、を備え、核酸試料の塩基配列情報を取得する核酸分析装置を開示する。
【００２１】
以下、上記及びその他の本発明の新規な特徴と効果について、図を参照して説明する。
ここでは、本発明を完全に理解してもらうため、特定の実施形態について詳細な説明を行うが、本発明はここに記した内容に限定されるものではない。また、各実施例は適宜組み合せることが可能であり、当該組み合せ形態についても本明細書は開示している。
【実施例１】
【００２２】
本実施例における核酸分析デバイスの構成について、図１を用いて説明する。平滑な支持基体１０１の上に接着用パッド１０２を規則正しく、例えば図１に示すように格子状に形成する。接着用パッド１０２とポリペプチドリンカー１０３は、線状分子１０５を介して化学結合により結ばれている。線状分子１０５の末端の官能基１０６と、接着用パッド１０２は、化学的相互作用により結合していることが好ましい。その際、官能基１０６は、平滑な支持基体１０１との相互作用が弱く、接着用パッド１０２との相互作用が強いことが好ましい。このような観点から、平滑基板としては、石英ガラス，サファイア，シリコン基板などを用いることができ、接着用パッド１０２には、金，チタン，ニッケル，アルミから選ばれる材料で構成することができる。本実施例の核酸分析デバイスは水溶液中で用いられることが想定され、水溶液中での腐食性を考慮すると、接着用パッド１０２には金，チタンが好ましい。官能基１０６には、平滑な支持基体１０１と接着用パッド１０２との組み合せを考えて選択せねばならないが、例えば、スルホヒドリル基，アミノ基，カルボキシル基，リン酸基，アルデヒド基等を用いることができる。一般的に広く用いられている金とスルホヒドリル基の結合が、本実施例の核酸分析デバイスが用いられる水溶液中では、酸化を受けて結合が切断される恐れがあることを鑑み、接着用パッド１０２と官能基１０６との結合の安定性を考慮すると、接着用パッド１０２にはチタン，官能基１０６にはリン酸基を用いることが好ましい。線状分子１０５は、ポリペプチドリンカー１０３と接着用パッド１０２を結ぶ役割を果たし、長さに大きな限定はないが、炭素数にして３から２０程度の直鎖状分子が好ましい。線状分子１０５は、直接ポリペプチドリンカー１０３に結合していることが好ましい。
【００２３】
ポリペプチドリンカー１０３としては、構造の安定性が高いタンパク質が好ましく、α−へリックス構造，β−シート構造やβ−バレル構造などを有するタンパク質を用いることができる。特に、β−バレル構造は、β−シート間に少なくともループモチーフ（折れ曲がり部）を備えた複数組の逆平行β−シートを上下の方向性を持って樽状の壁を構成する立体的に安定な構造であり、好適である。例えば、Thrombin, subunit H, Proto-oncogene -Oncogene Product P14tcl1, Plasminogen Kringle 4, Elongation Factor Tu (Ef-tu)；domain 3, Alpha-1, 4-glucan-4-glucanohydrolase；Chain A, domain 2, M1 Pyruva
te Kinase；Domain 3, Lyase, Ornithine Decarboxylase；Chain A, domain 1, Barwin-like endoglucanases, OB fold (Dihydrolipoamide Acetyltransferase, E2P), Cathepsin
D, subunit A；domain 1, Cyclophilin, Butyryl-CoA Dehydrogenase, subunit A；domain 2, Lipocalin, Ribosomal Protein L14, Green Fluorescent Protein (GFP), Porin,
Maltoporin；Chain A, Catalase HpII, Chain A, domain 1, Telomere-binding Protein Beta Subunit；Chain B, Intramolecular trans-sialidase, domain 3などが例示される
。βバレル構造ユニットは、その目的用途に応じて上述した各種タンパク質などから適宜選択したものを利用して構成することができる。例えば、金結合部位を有するドメインをより小さいサイズにして更なる生産性を向上させる場合は、リポカリン（Lipocalin）などの低分子タンパク質が好ましい。また、金属との結合部位を含むドメインを多量体化し
てより剛直な分子にして配向性を向上させる場合、リポカリンやポーリン（Porin）類に存在する多量体分子を選択することができる。タンパク質の機能的な分類で例示すれば、膜貫通タンパク質を挙げることができる。特に、好適なタンパク質としては外膜タンパク質であるポーリンを挙げることができる。
【００２４】
例えば、「Angewandte Chemie International Edition 2006, Vol. 45, pp. 3252-3256.（非特許文献５）」には、ポーリンの一つであるＯｍｐＦのシステイン変異体を、両親
媒性分子を共存させて金薄膜上に製膜する方法が報告されているが、本実施例のポリペプチドリンカー１０３には、このＯｍｐＦのシステイン変異体を用いることができる。非特許文献５で報告されている金とスルホヒドリル基の結合では、水溶液中での安定性に問題があるため、システイン部にリン酸基を導入し、接着用パッド１０２にはチタンを用いることが好ましい。例えば、スクシンイミドとマレイミドが繋がれたクロスリンカー試薬（Thermo Scientific社製NHS-PEG8-Maleimide）をアミノプロピルリン酸（Sigma-Aldrich社製）と反応させた後、ＯｍｐＦのシステイン変異体と反応させることにより、システイン
部にリン酸基を導入する。これをガラス基板上に形成したチタンパッドと反応させることにより、チタンパッド上にのみＯｍｐＦを導入できる。チタンとガラスとの固定の選択性はリン酸基によってもたらされる。
【００２５】
一方、プローブ分子（図１では、核酸合成酵素１０７と核酸１０８の複合体）を固定するための結合分子１０４は、ＯｍｐＦを無細胞発現系で作る際に、ビオチンをＣ末端あるいはＮ末端に一緒に発現させることが良い。例えば、市販の試薬（Roche Diagnostic社製RTS AviTag E. coliビオチン化キット）を使うことにより、容易にビオチンを導入することができる。この方法を使うことにより、ポリペプチドリンカー一分子に一つだけビオチンを導入できる。したがって、所望の箇所にポリペプチドリンカー１０３を一分子だけ固定すると、結果的に結合分子１０４が一分子存在し、所定の濃度のプローブ分子溶液を反応させると、所定の箇所に、プローブ分子を確実に一分子だけ固定することができる。
【００２６】
接着用パッド１０２にポリペプチドリンカー１０３を一分子だけ固定するためには、接着用パッド１０２の直径をポリペプチドリンカー１０３の直径の２倍以下、より好ましくは同等以下に作ることが好ましい。前記ＯｍｐＦの場合、直径が約２０ｎｍ程度であるので、接着用パッド１０２の直径を４０ｎｍ以下に作ればよく、より確実には２０ｎｍ程度であるのが好ましい。
【００２７】
接着用パッド１０２を平滑な支持基体１０１上に形成する方法としては、半導体で既に実用化されている薄膜プロセスを活用することができる。例えば、マスクを通した蒸着・スパッタリング、あるいは蒸着・スパッタリングにより薄膜を形成した後、ドライあるいはウエットエッチングにより製造することができる。規則正しく配置することは、前記薄膜プロセスを用いることで容易に実現できる。パッド間の間隔は任意に設定できる。検出手段として光計測を行う場合は、光検出の回折限界を考えると、間隔を５００ｎｍ以上とすることが好ましい。
【００２８】
プローブ分子を微粒子表面に予め固定をしておき、前記微粒子をポリペプチドリンカーに固定をすることも有効である。概念図を図２に示す。ガラス基板などの平滑支持基体２０１の上に接着用パッド２０２を形成し、前記接着用パッド２０２上に、官能基２０６を末端に有する線状分子２０５を介してポリペプチドリンカー２０３が結合している。プローブ分子（図２では、核酸合成酵素２０７と核酸２０８の複合体）は、予め微粒子２０９に固定されており、微粒子２０９は結合分子２０４によってポリペプチドリンカー２０３と結合している。
【００２９】
微粒子２０９としては、金属微粒子や半導体微粒子を用いることができる。例えば、金の微粒子として、直径５ｎｍ〜１００ｎｍのものが市販されており、活用することができる。また、半導体微粒子としては、ＣｄＳｅ等の化合物半導体により構成され、その直径が１０ｎｍ〜２０ｎｍ程度の微粒子が市販されており、活用することができる。金微粒子を用いた場合には、スルホヒドリル基，アミノ基等を結合の官能基とすることにより、プローブ分子との結合及び結合分子２０４との結合が実現できる。結合分子２０４としてポリペプチドリンカー２０３中のシステインを活用することもできる。半導体微粒子を用いる場合には、ストレプトアビジンにより表面が修飾された微粒子が市販されており、結合分子２０４として前述した方法によりポリペプチドリンカー２０３末端に導入したビオチンを用いることができる。プローブ分子と微粒子２０９との結合にも、同じように、プローブ分子末端をビオチン化しておくことが有効である。
【００３０】
微粒子２０９として金属微粒子を用いた場合には、光照射によって微粒子２０９の近傍に近接場を形成することができ、捕捉した核酸分子あるいはヌクレオチドを蛍光で検出する場合、前記蛍光が前記近接場による増強効果を受け、前記核酸分子の検出に非常に有効である。特に、検出すべき核酸分子又はヌクレオチドが同一蛍光色素でラベルされており、且つ試料溶液の濃度が高い中で特定の分子を検出する場合には有効である。前記微粒子として、可視域で局在プラズモンを励起することが可能な、金，銀，白金，アルミニウム等により構成された、その直径が１００ｎｍ程度以下の微粒子を用いることにより、蛍光をより増強して観察することができる。金微粒子の表面プラズモンによる蛍光増強の現象については、例えば、「Nanotechnology, 2007, vol. 18, pp 044017-044021.（非特許文献６）」に報告されている。ヌクレオチドに付いた蛍光色素の蛍光を増強させて測定する
ことができ、信号／ノイズを高くすることができる。特に、プローブ分子として核酸合成酵素を用いた場合には、局在プラズモンが作る増強場内に、常に蛍光色素を入れることができ、安定した蛍光増強が得られ好ましい。
【００３１】
また、微粒子２０９として半導体微粒子を用いた場合には、光照射によって前記微粒子２０９を励起することができ、前記微粒子２０９をエネルギーのドナーとして、捕捉した核酸分子又はヌクレオチド分子を標識している蛍光色素を前記エネルギーのアクセプターとして動作させ、前記検出対象分子の蛍光による検出を可能とすることができる。エネルギー移動は、おおよそ１０ｎｍ以下の近傍でしか起こらない現象であることから、前記金属微粒子の場合と同様に、検出すべき核酸分子又はヌクレオチドが同一蛍光色素でラベルされており、且つ試料溶液の濃度が高い中で特定の分子を検出する場合には有効である。
この場合、励起光源は半導体微粒子のみを励起すればよく、一種類の光源でよい点で好ましい。
【００３２】
プローブ分子として、核酸合成酵素を用いる場合、ヌクレオチドを供給することにより、基板上で核酸伸張反応を起こすことができる。また、プローブ分子として、核酸を用いる場合には、解析対象である核酸試料の核酸断片を捕捉させた後、核酸合成酵素とヌクレオチドを供給することにより、基板上で核酸伸長反応を起こすことができる。
【００３３】
本実施例の核酸分析デバイスから核酸試料に関する情報を検出するやり方にはいくつかの方式が考えられるが、感度，簡便性の観点から蛍光検出法を用いる方式が好ましい。まず、核酸分析デバイスに対して核酸試料を供給し、核酸捕捉プローブ（核酸あるいは核酸合成酵素）に核酸試料を捕捉させる。次に、蛍光色素を有するヌクレオチドを供給し、核酸捕捉プローブが核酸である場合には、核酸合成酵素も供給する。デバイス上で核酸伸長反応を起こし、伸長反応中に核酸鎖中に取り込まれた蛍光色素の蛍光測定を行う。この場合、所定のヌクレオチド（一種類）を供給，未反応ヌクレオチドの洗浄，蛍光観察、違う種類のヌクレオチドの供給以降を繰り返し行う、いわゆる逐次伸長反応方式は容易に実現できる。蛍光観察後蛍光色素を消光するか、蛍光色素がリン酸部位に付いたヌクレオチドを用い、連続的な反応を起こすことにより、核酸試料の塩基配列情報を得ることができる。一方、４種類のヌクレオチドが各々異なる蛍光色素を有するものを供給し、洗浄することなく、連続的な核酸伸長反応を起こし、連続的に蛍光観察を行うことにより、いわゆるリアルタイム反応方式を実現することもできる。この場合、蛍光色素がリン酸部位に付いたヌクレオチドを用いると、伸長反応後リン酸部位が切断されるため、消光することなく連続的に蛍光測定することにより、核酸試料の塩基配列情報を得ることができる。
【実施例２】
【００３４】
本実施例における核酸分析デバイスについて説明する。
【００３５】
核酸分析デバイスの製造方法の一例を、図３を用いて説明する。平滑な支持基体３０１上に電子線用ポジ型レジスト３０２をスピンコート法により塗工する。平滑な支持基体としては、ガラス基板，サファイア基板，シリコンウエハ等が用いられる。核酸分析デバイスとしたときに、微粒子を配列した面と反対側の裏面より励起光を照射する必要がある場合には、光透過性に優れた石英基板やサファイア基板を用いればよい。電子線用ポジ型レジストとしては、例えば、ポリメチルメタクリレートやＺＥＰ−５２０Ａ（日本ゼオン社製）を挙げることができる。基板上のマーカーの位置を用いて位置合わせを行った上で、電子線直描露光を行って、レジストにスルーホールを形成する。例えば、直径３０ｎｍのスルーホールを形成する。スルーホールは、並行処理で解析できる核酸の分子数に依存するが、１μｍ程度のピッチで形成することが、製造上の簡便さ・歩留まりの高さと並行処理で解析できる核酸の分子数を勘案すると適している。スルーホール形成領域も、並行処理で解析できる核酸の分子数によるが、検出装置側の位置精度，位置分解能にも大きく依存する。例えば、１μｍピッチで反応サイト（微粒子）を構成した場合、スルーホール形成領域を１mm×１mmとすると、１００万反応サイトを形成できる。スルーホールの形成後
、接着用パッド３０３を構成する材料、例えば、金，チタン，ニッケル，アルミ、をスパッタリングで製膜する。平滑な支持基体としてガラス基板，サファイア基板を用い、接着用パッド材料として金，アルミ，ニッケルを用いる場合には、前記基板材料と前記接着用パッド材料との間に接着を補強する意味でチタンやクロムの薄膜を入れることが好ましい。
【００３６】
ポリヌクレオチドリンカーは、例えば、「特表２００４−５３３６０１（特許文献１）」に開示されている方法で作製することができる。大腸菌のＯｍｐＦのＤＮＡ配列（特許文献１の図１参照）を基に、プラスミドクローンを作製する。システインの変異は、変異導入試薬（Stratagene社製QuickChange）とＧＡＡグルタミン酸コドンの代わりにＴＧＴシステインコドンをコードする変異誘発プライマー（特許文献１の化２参照）を用いて導入することができる。純粋なプラスミドＤＮＡは、XL1-blue E. coli(Stratagene社製）の形質転換体とミニプレップキット（Promega社製Wizard SV）を用いて得ることができる
。さらに、大腸菌無細胞タンパク発現系（Roche Applied Science社製 RTS 100 E. coli HY kit）を用いてＯｍｐＦを生産できる。一方、プローブ分子を固定するための結合分子１０４は、ＯｍｐＦを無細胞発現系で作る際に、ビオチンをＣ末端あるいはＮ末端に一緒に発現させることにより作製できる。ビオチン導入試薬（Roche Diagnostic社製RTS AviTag E. coliビオチン化キット）を使うことにより、容易にビオチンを導入することができる。この方法を使うことにより、ポリペプチドリンカー一分子に一つだけビオチンが導入される。
【００３７】
チタンパッドを用いる際には、前記システイン部にリン酸基を導入する。スクシンイミドとマレイミドが繋がれたクロスリンカー試薬（Thermo Scientific社製NHS-PEG8-Maleimide）をアミノプロピルリン酸（Sigma-Aldrich社製）と反応させた後、ＯｍｐＦのシステイン変異体と反応させることにより、システイン部にリン酸基を導入する。これをガラス
基板上に形成したチタンパッドと反応させることにより、チタンパッド上にのみＯｍｐＦを導入できる。最終的には、プローブ分子を一分子のみ、所望の位置に配置したチタンパッド上に導入した核酸分析デバイスを製造することができる。
【実施例３】
【００３８】
本実施例では、ポリペプチドリンカーとプローブ分子との間に微粒子を介した構成の核酸分析デバイスについて、その製造方法の一例を、図４を用いて説明する。以下、実施例１及び２との相違点を中心に説明する。
【００３９】
核酸の表面には、予め微粒子を修飾しておくことが好ましい。金または白金微粒子を用いる場合には、アミノチオールを反応させた後、ビオチン−スクシンイミド（Pierce社製NHS-Biotin）を反応させ、最後にストレプトアビジンを反応させることにより、アビジン修飾することが容易にできる。金または白金以外の金属微粒子を用いる場合には、酸素雰囲気中で加熱処理することにより表面を酸化処理した後、アミノシランを反応させ、次にビオチン−スクシンイミド（Pierce社製NHS-Biotin）を反応させ、最後にストレプトアビジンを反応させることにより金属微粒子表面をアビジン修飾することが容易にできる。微粒子として、半導体微粒子を用いる場合には、市販の微粒子を用いることができる。例えば、直径が１５〜２０ｎｍである製品名「Ｑｄｏｔ（Ｒ）ストレプトアビジン標識」（インビトロジェン社製）を利用することができる。核酸捕捉プローブとしてオリゴヌクレオチドを用いる場合には、末端をビオチン修飾して合成しておくことにより、微粒子上に容易に固定できる。核酸捕捉プローブとして核酸合成酵素を用いる場合には、予め、RTS AviTag E. coliビオチン化キット（ロッシュアプライドサイエンス社製）を用いて発現系を組み、核酸合成酵素を作ることにより、容易に、核酸合成酵素を微粒子上に固定できる。
【００４０】
そして、核酸捕捉プローブを固定した微粒子を接着用パッドと反応させることにより、核酸分析デバイスを製造することができる。
【実施例４】
【００４１】
本実施例における核酸分析装置について説明する。核酸分析デバイスを用いた核酸分析装置の好ましい構成の一例について図５を参照しながら説明する。以下、実施例１〜３との相違点を中心に説明する。
【００４２】
本実施例では、核酸分析デバイスに対して、蛍光色素を有するヌクレオチド，核酸合成酵素、及び核酸試料を供給する手段と、核酸分析デバイスに光を照射する手段と、核酸分析デバイス上においてヌクレオチド，核酸合成酵素、及び核酸試料が共存することにより起きる核酸伸長反応により核酸鎖中に取り込まれた蛍光色素の蛍光を測定する発光検出手段と、を備える。より具体的には、カバープレート５０１と検出窓５０２と溶液交換用口である注入口５０３と排出口５０４から構成される反応チャンバに前記のデバイス５０５を設置する。なお、カバープレート５０１と検出窓５０２の材質として，ＰＤＭＳ（Polydimethylsiloxane）を使用する。また、検出窓５０２の厚さは０.１７mmとする。ＹＡＧレーザ光源（波長５３２ｎｍ，出力２０ｍＷ）５０７およびＹＡＧレーザ光源（波長３５
５ｎｍ，出力２０ｍＷ）５０８から発振するレーザ光５０９および５１０を、レーザ光５０９のみをλ／４板５１１によって円偏光し、ダイクロイックミラー５１２（４１０ｎｍ以下を反射）によって、前記２つのレーザ光を同軸になるよう調整した後、レンズ５１３によって集光し、その後、プリズム５１４を介してデバイス５０５へ臨界角以上で照射する。
【００４３】
以下、微粒子として直径５０ｎｍ程度の金微粒子を用いた場合を例にとり、説明する。
この場合、レーザ照射により，デバイス５０５表面上に存在する金微粒子において局在型表面プラズモンが発生し、金微粒子に結合したプローブ分子により捕捉された標的物質の蛍光体は蛍光増強場内に存在することになる。蛍光体はレーザ光で励起され，その増強された蛍光の一部は検出窓５０２を介して出射される。また、検出窓５０２より出射される蛍光は，対物レンズ５１５（×６０，ＮＡ１.３５，作動距離０.１５mm）により平行光束とされ，光学フィルタ５１６により背景光及び励起光が遮断され，結像レンズ５１７により２次元ＣＣＤカメラ５１８上に結像される。
【００４４】
逐次反応方式の場合には、蛍光色素付きヌクレオチドとして、「P.N.A.S. 2006, vol. 103, pp 19635-19640.（非特許文献７）」に開示されているような、リボースの３′ＯＨの位置に３′−Ｏ−アリル基を保護基として入れ、また、ピリミジンの５位の位置にあるいはプリンの７位の位置にアリル基を介して蛍光色素と結びつけたものが使用できる。アリル基は、光照射あるいはパラジウムと接触することにより切断されるため、色素の消光と伸長反応の制御を同時に達成することができる。逐次反応でも、未反応のヌクレオチドを洗浄で除去する必要はない。さらに、洗浄工程が必要ないことからリアルタイムで伸長反応を計測することも可能である。この場合には、前記ヌクレオチドにおいて、リボースの３′ＯＨの位置に３′−Ｏ−アリル基を保護基として入れる必要は無く、光照射で切断可能な官能基を介して色素と結びついているヌクレオチドを用いれば良い。
【００４５】
微粒子として、半導体微粒子を用いた場合にも、上述の核酸分析装置の例は適用可能である。例えば、半導体微粒子としてＱｄｏ（Ｒ）５６５ conjugate（インビトロジェン社製）を用いると、ＹＡＧレーザ光源（波長５３２ｎｍ，出力２０ｍＷ）５０７で十分に励起できる。この励起エネルギーは５３２ｎｍの光では励起されないアレクサ６３３（インビトロジェン社製）へ移動することにより蛍光を発するようになる。つまり、未反応のヌクレオチドに付随する色素は励起されることはなく、プローブ分子に捕捉され半導体微粒子に近接しエネルギー移動が起きてはじめて発光するため、捕捉されたヌクレオチドを蛍光測定で識別することが可能である。
【００４６】
上記のように、本実施例の核酸分析デバイスを用いて核酸分析装置を組上げることにより、洗浄工程を入れることなく、解析時間の短縮化，デバイス及び分析装置の簡便化が図れ、逐次反応方式のみならず、リアルタイムで塩基の伸長反応を計測することも可能となり、従来技術に対して大幅なスループットの改善が図れる。
【産業上の利用可能性】
【００４７】
核酸分析デバイスを用いた核酸分析において、「dephasing」が起こることがないため読み取塩基長を長くでき、かつ、多種類の被解析ＤＮＡ断片を一度に解析可能であるため、非常に高いスループットとすることができる。
【符号の説明】
【００４８】
１０１，２０１，３０１，４０１ 支持基体
１０２，２０２，３０３，４０３ 接着用パッド
１０３，２０３，３０４，４０４ ポリペプチドリンカー
１０４，２０４，３０５，４０５ 結合分子
１０５，２０５ 線状分子
１０６，２０６，３０６，４０６ 線状分子末端の官能基
１０７，２０７，３０７，４０７ 核酸合成酵素
１０８，２０８ 核酸
２０９，４０８ 微粒子
３０２，４０２ 電子線用ポジ型レジスト
４０９ アビジン
５０１ カバープレート
５０２ 検出窓
５０３ 注入口
５０４ 排出口
５０５ デバイス
５０６ 流路
５０７，５０８ ＹＡＧレーザ光源
５０９，５１０ レーザ光
５１１ λ／４板
５１２ ダイクロイックミラー
５１３ レンズ
５１４ プリズム
５１５ 対物レンズ
５１６ 光学フィルタ
５１７ 結像レンズ
５１８ ２次元ＣＣＤカメラ
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プローブ分子を支持基体に固定した核酸分析デバイスに関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸分析デバイスとして、ＤＮＡやＲＮＡの塩基配列を決定する新しい技術が開発されている。
【０００３】
現在、通常用いられている電気泳動を利用した方法においては、配列決定用のＤＮＡ断片又はＲＮＡ試料から逆転写反応を行い予め合成したｃＤＮＡ断片試料を調製し、周知のサンガー法によるジデオキシ反応を実行した後、電気泳動を行い、分子量分離展開パターンを計測して解析する。
【０００４】
これに対し、近年、試料となるＤＮＡ断片を基板に数多く固定して、数多くの断片の配列情報をパラレルに決定する方法が提案されている。
【０００５】
特に、被解析ＤＮＡ断片試料をＰＣＲにより増幅してから基板上に固定する所謂クラスタ方式（「Nature 2005, Vol. 437, pp. 376-380.（非特許文献１）」参照）に加え、被解析ＤＮＡ断片試料を一分子ずつ固定して配列を解読する単分子方式が提案されている。
単分子方式では、テンプレートとなるＤＮＡ試料断片が１分子だけ、所定の位置に固定される、あるいは、ランダムに平滑基板上に固定され、基板上に核酸合成酵素と蛍光色素付きヌクレオチドが供給されると基板上で伸長反応が起き、取り込まれたヌクレオチドの蛍光色素の発光を一分子レベルで検出することにより、ヌクレオチドの識別を行う。単分子方式の場合には、「Science 2008, Vol. 320, pp. 106-109.（非特許文献２）」にあるような逐次反応方式に加えて、「Science 2009, Vol. 323, pp. 133-138.（非特許文献３）
」にあるようなリアルタイム計測方式も提案されている。クラスタ方式の利点は、検出対象のＤＮＡがＰＣＲで増幅された数千から数万分子であることから蛍光検出が容易であることである。一方、弱点は、数千から数万分子の伸長反応を平均値として評価するため、数千から数万分子の伸長反応の速度が不揃いで、伸長反応の進み具合にばらつきが生じると、一度に複数の蛍光色素の発光が検出されてしまい、取り込まれた塩基の同定ができなくなってしまう点にある。この現象は「dephasing」と呼ばれ、伸長する塩基鎖が長くなった時ほど起こりやすくなるため、クラスタ方式の読み取り塩基長が比較的短いことの主原因の一つとなっている。
【０００６】
これに対して、単分子方式では読み取り対象のＤＮＡ断片が一分子しかないため、前記の「dephasing」は原理的になく、クラスタ方式に比べ読み取り塩基長が大幅に長くなることが期待されている。一方、蛍光測定は一分子レベルで行わなくてはならないことから高感度検出技術が必要になるとともに、一分子ずつプローブ分子（ＤＮＡ断片試料や、核酸合成酵素とＤＮＡ断片試料の複合体）を所定の位置に固定する技術も必要となる。
【０００７】
「PNAS 2003, Vol. 100, pp. 3960-3964.（非特許文献４）」では、一分子ずつプローブ分子を固定する方法として、あらかじめアビジンを導入した高分子膜をガラス基板上に
設けておき、末端にビオチン修飾を施した核酸プローブ分子の溶液を低濃度で基板表面と反応させることにより、ランダムに一分子プローブを固定することが提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特表２００４−５３３６０１号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Nature 2005, Vol. 437, pp. 376-380.
【非特許文献２】Science 2008, Vol. 320, pp. 106-109.
【非特許文献３】Science 2009, Vol. 323, pp. 133-138.
【非特許文献４】PNAS 2003, Vol. 100, pp. 3960-3964.
【非特許文献５】Angewandte Chemie International Edition 2006, Vol. 45, pp. 3252-3256.
【非特許文献６】Nanotechnology, 2007, vol. 18, pp. 044017-044021.
【非特許文献７】P.N.A.S. 2006, vol. 103, pp. 19635-19640.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
プローブ分子を精度良く核酸分析デバイスの所定位置に固定することについて本願発明者が鋭意検討した結果、次の知見を得るに至った。
【００１１】
非特許文献４に開示されている技術では、固定は容易ではある。しかし、蛍光測定で配列を読み取る段階になると、ＣＣＤカメラにより検出したランダムに存在する蛍光分子から数値データを取得する際、膨大なデータ処理時間を必要とする。また、プローブ分子同士が近接して固定されてしまうと、これらの二つのプローブ分子からの蛍光が識別できなくなるという問題も生じる。
【００１２】
本発明の目的は、あるプローブ分子を、支持基体の所定位置に、簡便且つ高効率で固定することに関する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、支持基体の所定位置に微小な金属パッドを設け、当該金属パッドに対し、ポリペプチドからなるリンカーを固着させ、当該リンカーにプローブ分子を結合させることに関する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、プローブ分子を所定位置に固定した核酸分析デバイスを提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】核酸分析デバイスの概略構成図。
【図２】核酸分析デバイスの概略構成図。
【図３】核酸分析デバイスの製造方法の一例。
【図４】核酸分析デバイスの製造方法の一例。
【図５】核酸分析デバイスを用いた核酸分析装置の概略構成図。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
実施例では、検出対象の核酸を捕捉するプローブ分子を支持基体に固定した核酸分析用デバイスであって、前記支持基体の所定位置に金属パッドが形成されており、前記プローブ分子が、ポリペプチドからなるリンカーを介して前記金属パッドに固定されているものを開示する。好ましくは、プローブ分子を、一つの前記金属パッドに対して一分子のみ固定する。
【００１７】
また、実施例では、検出対象の核酸を捕捉するプローブ分子を支持基体に固定した核酸分析デバイスであって、前記支持基体の所定位置に金属パッドが形成されており、前記プローブ分子が微粒子に固定されており、当該微粒子が、ポリペプチドからなるリンカーを介して前記金属パッドに固定されているものを開示する。好ましくは、プローブ分子を、一つの微粒子に対して一分子のみ固定し、当該微粒子を、前記金属パッドに固定する。また、好ましくは、半導体、又は金属から選ばれる材料からなる微粒子を用いる。
【００１８】
また、実施例では、検出対象の核酸を捕捉するプローブ分子である核酸、又は核酸合成酵素を支持基体に固定した核酸分析用デバイスを開示する。
【００１９】
また、実施例では、支持基体の所定位置に金属パッドが、金，チタン，ニッケル、又はアルミから選ばれる材料からなる核酸分析デバイスを開示する。
【００２０】
また、実施例では、核酸分析デバイスに対して、蛍光色素を有するヌクレオチド、及び核酸試料を供給する手段と、核酸分析デバイスに光を照射する手段と、核酸分析デバイスにおいてヌクレオチド，核酸合成酵素、及び核酸試料が共存することにより起きる核酸伸長反応により核酸鎖中に取り込まれた蛍光色素の蛍光を測定する発光検出手段、を備え、核酸試料の塩基配列情報を取得する核酸分析装置を開示する。
【００２１】
以下、上記及びその他の本発明の新規な特徴と効果について、図を参照して説明する。
ここでは、本発明を完全に理解してもらうため、特定の実施形態について詳細な説明を行うが、本発明はここに記した内容に限定されるものではない。また、各実施例は適宜組み合せることが可能であり、当該組み合せ形態についても本明細書は開示している。
【実施例１】
【００２２】
本実施例における核酸分析デバイスの構成について、図１を用いて説明する。平滑な支持基体１０１の上に接着用パッド１０２を規則正しく、例えば図１に示すように格子状に形成する。接着用パッド１０２とポリペプチドリンカー１０３は、線状分子１０５を介して化学結合により結ばれている。線状分子１０５の末端の官能基１０６と、接着用パッド１０２は、化学的相互作用により結合していることが好ましい。その際、官能基１０６は、平滑な支持基体１０１との相互作用が弱く、接着用パッド１０２との相互作用が強いことが好ましい。このような観点から、平滑基板としては、石英ガラス，サファイア，シリコン基板などを用いることができ、接着用パッド１０２には、金，チタン，ニッケル，アルミから選ばれる材料で構成することができる。本実施例の核酸分析デバイスは水溶液中で用いられることが想定され、水溶液中での腐食性を考慮すると、接着用パッド１０２には金，チタンが好ましい。官能基１０６には、平滑な支持基体１０１と接着用パッド１０２との組み合せを考えて選択せねばならないが、例えば、スルホヒドリル基，アミノ基，カルボキシル基，リン酸基，アルデヒド基等を用いることができる。一般的に広く用いられている金とスルホヒドリル基の結合が、本実施例の核酸分析デバイスが用いられる水溶液中では、酸化を受けて結合が切断される恐れがあることを鑑み、接着用パッド１０２と官能基１０６との結合の安定性を考慮すると、接着用パッド１０２にはチタン，官能基１０６にはリン酸基を用いることが好ましい。線状分子１０５は、ポリペプチドリンカー１０３と接着用パッド１０２を結ぶ役割を果たし、長さに大きな限定はないが、炭素数にして３から２０程度の直鎖状分子が好ましい。線状分子１０５は、直接ポリペプチドリンカー１０３に結合していることが好ましい。
【００２３】
ポリペプチドリンカー１０３としては、構造の安定性が高いタンパク質が好ましく、α−へリックス構造，β−シート構造やβ−バレル構造などを有するタンパク質を用いることができる。特に、β−バレル構造は、β−シート間に少なくともループモチーフ（折れ曲がり部）を備えた複数組の逆平行β−シートを上下の方向性を持って樽状の壁を構成する立体的に安定な構造であり、好適である。例えば、Thrombin, subunit H, Proto-oncogene -Oncogene Product P14tcl1, Plasminogen Kringle 4, Elongation Factor Tu (Ef-tu)；domain 3, Alpha-1, 4-glucan-4-glucanohydrolase；Chain A, domain 2, M1 Pyruva
te Kinase；Domain 3, Lyase, Ornithine Decarboxylase；Chain A, domain 1, Barwin-like endoglucanases, OB fold (Dihydrolipoamide Acetyltransferase, E2P), Cathepsin
D, subunit A；domain 1, Cyclophilin, Butyryl-CoA Dehydrogenase, subunit A；domain 2, Lipocalin, Ribosomal Protein L14, Green Fluorescent Protein (GFP), Porin,
Maltoporin；Chain A, Catalase HpII, Chain A, domain 1, Telomere-binding Protein Beta Subunit；Chain B, Intramolecular trans-sialidase, domain 3などが例示される
。βバレル構造ユニットは、その目的用途に応じて上述した各種タンパク質などから適宜選択したものを利用して構成することができる。例えば、金結合部位を有するドメインをより小さいサイズにして更なる生産性を向上させる場合は、リポカリン（Lipocalin）などの低分子タンパク質が好ましい。また、金属との結合部位を含むドメインを多量体化し
てより剛直な分子にして配向性を向上させる場合、リポカリンやポーリン（Porin）類に存在する多量体分子を選択することができる。タンパク質の機能的な分類で例示すれば、膜貫通タンパク質を挙げることができる。特に、好適なタンパク質としては外膜タンパク質であるポーリンを挙げることができる。
【００２４】
例えば、「Angewandte Chemie International Edition 2006, Vol. 45, pp. 3252-3256.（非特許文献５）」には、ポーリンの一つであるＯｍｐＦのシステイン変異体を、両親
媒性分子を共存させて金薄膜上に製膜する方法が報告されているが、本実施例のポリペプチドリンカー１０３には、このＯｍｐＦのシステイン変異体を用いることができる。非特許文献５で報告されている金とスルホヒドリル基の結合では、水溶液中での安定性に問題があるため、システイン部にリン酸基を導入し、接着用パッド１０２にはチタンを用いることが好ましい。例えば、スクシンイミドとマレイミドが繋がれたクロスリンカー試薬（Thermo Scientific社製NHS-PEG8-Maleimide）をアミノプロピルリン酸（Sigma-Aldrich社製）と反応させた後、ＯｍｐＦのシステイン変異体と反応させることにより、システイン
部にリン酸基を導入する。これをガラス基板上に形成したチタンパッドと反応させることにより、チタンパッド上にのみＯｍｐＦを導入できる。チタンとガラスとの固定の選択性はリン酸基によってもたらされる。
【００２５】
一方、プローブ分子（図１では、核酸合成酵素１０７と核酸１０８の複合体）を固定するための結合分子１０４は、ＯｍｐＦを無細胞発現系で作る際に、ビオチンをＣ末端あるいはＮ末端に一緒に発現させることが良い。例えば、市販の試薬（Roche Diagnostic社製RTS AviTag E. coliビオチン化キット）を使うことにより、容易にビオチンを導入することができる。この方法を使うことにより、ポリペプチドリンカー一分子に一つだけビオチンを導入できる。したがって、所望の箇所にポリペプチドリンカー１０３を一分子だけ固定すると、結果的に結合分子１０４が一分子存在し、所定の濃度のプローブ分子溶液を反応させると、所定の箇所に、プローブ分子を確実に一分子だけ固定することができる。
【００２６】
接着用パッド１０２にポリペプチドリンカー１０３を一分子だけ固定するためには、接着用パッド１０２の直径をポリペプチドリンカー１０３の直径の２倍以下、より好ましくは同等以下に作ることが好ましい。前記ＯｍｐＦの場合、直径が約２０ｎｍ程度であるので、接着用パッド１０２の直径を４０ｎｍ以下に作ればよく、より確実には２０ｎｍ程度であるのが好ましい。
【００２７】
接着用パッド１０２を平滑な支持基体１０１上に形成する方法としては、半導体で既に実用化されている薄膜プロセスを活用することができる。例えば、マスクを通した蒸着・スパッタリング、あるいは蒸着・スパッタリングにより薄膜を形成した後、ドライあるいはウエットエッチングにより製造することができる。規則正しく配置することは、前記薄膜プロセスを用いることで容易に実現できる。パッド間の間隔は任意に設定できる。検出手段として光計測を行う場合は、光検出の回折限界を考えると、間隔を５００ｎｍ以上とすることが好ましい。
【００２８】
プローブ分子を微粒子表面に予め固定をしておき、前記微粒子をポリペプチドリンカーに固定をすることも有効である。概念図を図２に示す。ガラス基板などの平滑支持基体２０１の上に接着用パッド２０２を形成し、前記接着用パッド２０２上に、官能基２０６を末端に有する線状分子２０５を介してポリペプチドリンカー２０３が結合している。プローブ分子（図２では、核酸合成酵素２０７と核酸２０８の複合体）は、予め微粒子２０９に固定されており、微粒子２０９は結合分子２０４によってポリペプチドリンカー２０３と結合している。
【００２９】
微粒子２０９としては、金属微粒子や半導体微粒子を用いることができる。例えば、金の微粒子として、直径５ｎｍ〜１００ｎｍのものが市販されており、活用することができる。また、半導体微粒子としては、ＣｄＳｅ等の化合物半導体により構成され、その直径が１０ｎｍ〜２０ｎｍ程度の微粒子が市販されており、活用することができる。金微粒子を用いた場合には、スルホヒドリル基，アミノ基等を結合の官能基とすることにより、プローブ分子との結合及び結合分子２０４との結合が実現できる。結合分子２０４としてポリペプチドリンカー２０３中のシステインを活用することもできる。半導体微粒子を用いる場合には、ストレプトアビジンにより表面が修飾された微粒子が市販されており、結合分子２０４として前述した方法によりポリペプチドリンカー２０３末端に導入したビオチンを用いることができる。プローブ分子と微粒子２０９との結合にも、同じように、プローブ分子末端をビオチン化しておくことが有効である。
【００３０】
微粒子２０９として金属微粒子を用いた場合には、光照射によって微粒子２０９の近傍に近接場を形成することができ、捕捉した核酸分子あるいはヌクレオチドを蛍光で検出する場合、前記蛍光が前記近接場による増強効果を受け、前記核酸分子の検出に非常に有効である。特に、検出すべき核酸分子又はヌクレオチドが同一蛍光色素でラベルされており、且つ試料溶液の濃度が高い中で特定の分子を検出する場合には有効である。前記微粒子として、可視域で局在プラズモンを励起することが可能な、金，銀，白金，アルミニウム等により構成された、その直径が１００ｎｍ程度以下の微粒子を用いることにより、蛍光をより増強して観察することができる。金微粒子の表面プラズモンによる蛍光増強の現象については、例えば、「Nanotechnology, 2007, vol. 18, pp 044017-044021.（非特許文献６）」に報告されている。ヌクレオチドに付いた蛍光色素の蛍光を増強させて測定する
ことができ、信号／ノイズを高くすることができる。特に、プローブ分子として核酸合成酵素を用いた場合には、局在プラズモンが作る増強場内に、常に蛍光色素を入れることができ、安定した蛍光増強が得られ好ましい。
【００３１】
また、微粒子２０９として半導体微粒子を用いた場合には、光照射によって前記微粒子２０９を励起することができ、前記微粒子２０９をエネルギーのドナーとして、捕捉した核酸分子又はヌクレオチド分子を標識している蛍光色素を前記エネルギーのアクセプターとして動作させ、前記検出対象分子の蛍光による検出を可能とすることができる。エネルギー移動は、おおよそ１０ｎｍ以下の近傍でしか起こらない現象であることから、前記金属微粒子の場合と同様に、検出すべき核酸分子又はヌクレオチドが同一蛍光色素でラベルされており、且つ試料溶液の濃度が高い中で特定の分子を検出する場合には有効である。
この場合、励起光源は半導体微粒子のみを励起すればよく、一種類の光源でよい点で好ましい。
【００３２】
プローブ分子として、核酸合成酵素を用いる場合、ヌクレオチドを供給することにより、基板上で核酸伸張反応を起こすことができる。また、プローブ分子として、核酸を用いる場合には、解析対象である核酸試料の核酸断片を捕捉させた後、核酸合成酵素とヌクレオチドを供給することにより、基板上で核酸伸長反応を起こすことができる。
【００３３】
本実施例の核酸分析デバイスから核酸試料に関する情報を検出するやり方にはいくつかの方式が考えられるが、感度，簡便性の観点から蛍光検出法を用いる方式が好ましい。まず、核酸分析デバイスに対して核酸試料を供給し、核酸捕捉プローブ（核酸あるいは核酸合成酵素）に核酸試料を捕捉させる。次に、蛍光色素を有するヌクレオチドを供給し、核酸捕捉プローブが核酸である場合には、核酸合成酵素も供給する。デバイス上で核酸伸長反応を起こし、伸長反応中に核酸鎖中に取り込まれた蛍光色素の蛍光測定を行う。この場合、所定のヌクレオチド（一種類）を供給，未反応ヌクレオチドの洗浄，蛍光観察、違う種類のヌクレオチドの供給以降を繰り返し行う、いわゆる逐次伸長反応方式は容易に実現できる。蛍光観察後蛍光色素を消光するか、蛍光色素がリン酸部位に付いたヌクレオチドを用い、連続的な反応を起こすことにより、核酸試料の塩基配列情報を得ることができる。一方、４種類のヌクレオチドが各々異なる蛍光色素を有するものを供給し、洗浄することなく、連続的な核酸伸長反応を起こし、連続的に蛍光観察を行うことにより、いわゆるリアルタイム反応方式を実現することもできる。この場合、蛍光色素がリン酸部位に付いたヌクレオチドを用いると、伸長反応後リン酸部位が切断されるため、消光することなく連続的に蛍光測定することにより、核酸試料の塩基配列情報を得ることができる。
【実施例２】
【００３４】
本実施例における核酸分析デバイスについて説明する。
【００３５】
核酸分析デバイスの製造方法の一例を、図３を用いて説明する。平滑な支持基体３０１上に電子線用ポジ型レジスト３０２をスピンコート法により塗工する。平滑な支持基体としては、ガラス基板，サファイア基板，シリコンウエハ等が用いられる。核酸分析デバイスとしたときに、微粒子を配列した面と反対側の裏面より励起光を照射する必要がある場合には、光透過性に優れた石英基板やサファイア基板を用いればよい。電子線用ポジ型レジストとしては、例えば、ポリメチルメタクリレートやＺＥＰ−５２０Ａ（日本ゼオン社製）を挙げることができる。基板上のマーカーの位置を用いて位置合わせを行った上で、電子線直描露光を行って、レジストにスルーホールを形成する。例えば、直径３０ｎｍのスルーホールを形成する。スルーホールは、並行処理で解析できる核酸の分子数に依存するが、１μｍ程度のピッチで形成することが、製造上の簡便さ・歩留まりの高さと並行処理で解析できる核酸の分子数を勘案すると適している。スルーホール形成領域も、並行処理で解析できる核酸の分子数によるが、検出装置側の位置精度，位置分解能にも大きく依存する。例えば、１μｍピッチで反応サイト（微粒子）を構成した場合、スルーホール形成領域を１mm×１mmとすると、１００万反応サイトを形成できる。スルーホールの形成後
、接着用パッド３０３を構成する材料、例えば、金，チタン，ニッケル，アルミ、をスパッタリングで製膜する。平滑な支持基体としてガラス基板，サファイア基板を用い、接着用パッド材料として金，アルミ，ニッケルを用いる場合には、前記基板材料と前記接着用パッド材料との間に接着を補強する意味でチタンやクロムの薄膜を入れることが好ましい。
【００３６】
ポリヌクレオチドリンカーは、例えば、「特表２００４−５３３６０１（特許文献１）」に開示されている方法で作製することができる。大腸菌のＯｍｐＦのＤＮＡ配列（特許文献１の図１参照）を基に、プラスミドクローンを作製する。システインの変異は、変異導入試薬（Stratagene社製QuickChange）とＧＡＡグルタミン酸コドンの代わりにＴＧＴシステインコドンをコードする変異誘発プライマー（特許文献１の化２参照）を用いて導入することができる。純粋なプラスミドＤＮＡは、XL1-blue E. coli(Stratagene社製）の形質転換体とミニプレップキット（Promega社製Wizard SV）を用いて得ることができる
。さらに、大腸菌無細胞タンパク発現系（Roche Applied Science社製 RTS 100 E. coli HY kit）を用いてＯｍｐＦを生産できる。一方、プローブ分子を固定するための結合分子１０４は、ＯｍｐＦを無細胞発現系で作る際に、ビオチンをＣ末端あるいはＮ末端に一緒に発現させることにより作製できる。ビオチン導入試薬（Roche Diagnostic社製RTS AviTag E. coliビオチン化キット）を使うことにより、容易にビオチンを導入することができる。この方法を使うことにより、ポリペプチドリンカー一分子に一つだけビオチンが導入される。
【００３７】
チタンパッドを用いる際には、前記システイン部にリン酸基を導入する。スクシンイミドとマレイミドが繋がれたクロスリンカー試薬（Thermo Scientific社製NHS-PEG8-Maleimide）をアミノプロピルリン酸（Sigma-Aldrich社製）と反応させた後、ＯｍｐＦのシステイン変異体と反応させることにより、システイン部にリン酸基を導入する。これをガラス
基板上に形成したチタンパッドと反応させることにより、チタンパッド上にのみＯｍｐＦを導入できる。最終的には、プローブ分子を一分子のみ、所望の位置に配置したチタンパッド上に導入した核酸分析デバイスを製造することができる。
【実施例３】
【００３８】
本実施例では、ポリペプチドリンカーとプローブ分子との間に微粒子を介した構成の核酸分析デバイスについて、その製造方法の一例を、図４を用いて説明する。以下、実施例１及び２との相違点を中心に説明する。
【００３９】
核酸の表面には、予め微粒子を修飾しておくことが好ましい。金または白金微粒子を用いる場合には、アミノチオールを反応させた後、ビオチン−スクシンイミド（Pierce社製NHS-Biotin）を反応させ、最後にストレプトアビジンを反応させることにより、アビジン修飾することが容易にできる。金または白金以外の金属微粒子を用いる場合には、酸素雰囲気中で加熱処理することにより表面を酸化処理した後、アミノシランを反応させ、次にビオチン−スクシンイミド（Pierce社製NHS-Biotin）を反応させ、最後にストレプトアビジンを反応させることにより金属微粒子表面をアビジン修飾することが容易にできる。微粒子として、半導体微粒子を用いる場合には、市販の微粒子を用いることができる。例えば、直径が１５〜２０ｎｍである製品名「Ｑｄｏｔ（Ｒ）ストレプトアビジン標識」（インビトロジェン社製）を利用することができる。核酸捕捉プローブとしてオリゴヌクレオチドを用いる場合には、末端をビオチン修飾して合成しておくことにより、微粒子上に容易に固定できる。核酸捕捉プローブとして核酸合成酵素を用いる場合には、予め、RTS AviTag E. coliビオチン化キット（ロッシュアプライドサイエンス社製）を用いて発現系を組み、核酸合成酵素を作ることにより、容易に、核酸合成酵素を微粒子上に固定できる。
【００４０】
そして、核酸捕捉プローブを固定した微粒子を接着用パッドと反応させることにより、核酸分析デバイスを製造することができる。
【実施例４】
【００４１】
本実施例における核酸分析装置について説明する。核酸分析デバイスを用いた核酸分析装置の好ましい構成の一例について図５を参照しながら説明する。以下、実施例１〜３との相違点を中心に説明する。
【００４２】
本実施例では、核酸分析デバイスに対して、蛍光色素を有するヌクレオチド，核酸合成酵素、及び核酸試料を供給する手段と、核酸分析デバイスに光を照射する手段と、核酸分析デバイス上においてヌクレオチド，核酸合成酵素、及び核酸試料が共存することにより起きる核酸伸長反応により核酸鎖中に取り込まれた蛍光色素の蛍光を測定する発光検出手段と、を備える。より具体的には、カバープレート５０１と検出窓５０２と溶液交換用口である注入口５０３と排出口５０４から構成される反応チャンバに前記のデバイス５０５を設置する。なお、カバープレート５０１と検出窓５０２の材質として，ＰＤＭＳ（Polydimethylsiloxane）を使用する。また、検出窓５０２の厚さは０.１７mmとする。ＹＡＧレーザ光源（波長５３２ｎｍ，出力２０ｍＷ）５０７およびＹＡＧレーザ光源（波長３５
５ｎｍ，出力２０ｍＷ）５０８から発振するレーザ光５０９および５１０を、レーザ光５０９のみをλ／４板５１１によって円偏光し、ダイクロイックミラー５１２（４１０ｎｍ以下を反射）によって、前記２つのレーザ光を同軸になるよう調整した後、レンズ５１３によって集光し、その後、プリズム５１４を介してデバイス５０５へ臨界角以上で照射する。
【００４３】
以下、微粒子として直径５０ｎｍ程度の金微粒子を用いた場合を例にとり、説明する。
この場合、レーザ照射により，デバイス５０５表面上に存在する金微粒子において局在型表面プラズモンが発生し、金微粒子に結合したプローブ分子により捕捉された標的物質の蛍光体は蛍光増強場内に存在することになる。蛍光体はレーザ光で励起され，その増強された蛍光の一部は検出窓５０２を介して出射される。また、検出窓５０２より出射される蛍光は，対物レンズ５１５（×６０，ＮＡ１.３５，作動距離０.１５mm）により平行光束とされ，光学フィルタ５１６により背景光及び励起光が遮断され，結像レンズ５１７により２次元ＣＣＤカメラ５１８上に結像される。
【００４４】
逐次反応方式の場合には、蛍光色素付きヌクレオチドとして、「P.N.A.S. 2006, vol. 103, pp 19635-19640.（非特許文献７）」に開示されているような、リボースの３′ＯＨの位置に３′−Ｏ−アリル基を保護基として入れ、また、ピリミジンの５位の位置にあるいはプリンの７位の位置にアリル基を介して蛍光色素と結びつけたものが使用できる。アリル基は、光照射あるいはパラジウムと接触することにより切断されるため、色素の消光と伸長反応の制御を同時に達成することができる。逐次反応でも、未反応のヌクレオチドを洗浄で除去する必要はない。さらに、洗浄工程が必要ないことからリアルタイムで伸長反応を計測することも可能である。この場合には、前記ヌクレオチドにおいて、リボースの３′ＯＨの位置に３′−Ｏ−アリル基を保護基として入れる必要は無く、光照射で切断可能な官能基を介して色素と結びついているヌクレオチドを用いれば良い。
【００４５】
微粒子として、半導体微粒子を用いた場合にも、上述の核酸分析装置の例は適用可能である。例えば、半導体微粒子としてＱｄｏ（Ｒ）５６５ conjugate（インビトロジェン社製）を用いると、ＹＡＧレーザ光源（波長５３２ｎｍ，出力２０ｍＷ）５０７で十分に励起できる。この励起エネルギーは５３２ｎｍの光では励起されないアレクサ６３３（インビトロジェン社製）へ移動することにより蛍光を発するようになる。つまり、未反応のヌクレオチドに付随する色素は励起されることはなく、プローブ分子に捕捉され半導体微粒子に近接しエネルギー移動が起きてはじめて発光するため、捕捉されたヌクレオチドを蛍光測定で識別することが可能である。
【００４６】
上記のように、本実施例の核酸分析デバイスを用いて核酸分析装置を組上げることにより、洗浄工程を入れることなく、解析時間の短縮化，デバイス及び分析装置の簡便化が図れ、逐次反応方式のみならず、リアルタイムで塩基の伸長反応を計測することも可能となり、従来技術に対して大幅なスループットの改善が図れる。
【産業上の利用可能性】
【００４７】
核酸分析デバイスを用いた核酸分析において、「dephasing」が起こることがないため読み取塩基長を長くでき、かつ、多種類の被解析ＤＮＡ断片を一度に解析可能であるため、非常に高いスループットとすることができる。
【符号の説明】
【００４８】
１０１，２０１，３０１，４０１ 支持基体
１０２，２０２，３０３，４０３ 接着用パッド
１０３，２０３，３０４，４０４ ポリペプチドリンカー
１０４，２０４，３０５，４０５ 結合分子
１０５，２０５ 線状分子
１０６，２０６，３０６，４０６ 線状分子末端の官能基
１０７，２０７，３０７，４０７ 核酸合成酵素
１０８，２０８ 核酸
２０９，４０８ 微粒子
３０２，４０２ 電子線用ポジ型レジスト
４０９ アビジン
５０１ カバープレート
５０２ 検出窓
５０３ 注入口
５０４ 排出口
５０５ デバイス
５０６ 流路
５０７，５０８ ＹＡＧレーザ光源
５０９，５１０ レーザ光
５１１ λ／４板
５１２ ダイクロイックミラー
５１３ レンズ
５１４ プリズム
５１５ 対物レンズ
５１６ 光学フィルタ
５１７ 結像レンズ
５１８ ２次元ＣＣＤカメラ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
検出対象の核酸を捕捉するプローブ分子を支持基体に固定した核酸分析用デバイスであって、
前記支持基体の所定位置に金属パッドが形成されており、前記プローブ分子が、ポリペプチドからなるリンカーを介して前記金属パッドに固定されている核酸分析デバイス。
【請求項２】
請求項１記載の核酸分析デバイスにおいて、
前記プローブ分子が、一つの前記金属パッドに対して一分子のみ固定されていることを特徴とする核酸分析デバイス。
【請求項３】
請求項１記載の核酸分析デバイスにおいて、
前記プローブ分子が、核酸、又は核酸合成酵素であることを特徴とする核酸分析デバイス。
【請求項４】
検出対象の核酸を捕捉するプローブ分子を支持基体に固定した核酸分析デバイスであって、
前記支持基体の所定位置に金属パッドが形成されており、
前記プローブ分子が微粒子に固定されており、当該微粒子が、ポリペプチドからなるリンカーを介して前記金属パッドに固定されている核酸分析デバイス。
【請求項５】
請求項４記載の核酸分析デバイスにおいて、
前記プローブ分子が、一つの前記微粒子に対して一分子のみ固定され、当該微粒子が、前記金属パッドに固定されていることを特徴とする核酸分析デバイス。
【請求項６】
請求項４記載の核酸分析デバイスにおいて、
前記プローブ分子が、核酸、又は核酸合成酵素であることを特徴とする核酸分析デバイス。
【請求項７】
請求項４記載の核酸分析デバイスにおいて、
前記微粒子が、半導体、又は金属から選ばれる材料からなることを特徴とする核酸分析デバイス。
【請求項８】
請求項１から７のいずれか１項に記載の核酸分析デバイスにおいて、
前記金属パッドが、金，チタン，ニッケル、又はアルミから選ばれる材料からなることを特徴とする核酸分析デバイス。
【請求項９】
請求項１から８のいずれか１項に記載の核酸分析デバイスを用いる核酸分析装置であって、
核酸分析デバイスに対して、蛍光色素を有するヌクレオチド、及び核酸試料を供給する手段と、
前記核酸分析デバイスに光を照射する手段と、
前記核酸分析デバイスにおいて前記ヌクレオチド，前記核酸合成酵素、及び前記核酸試料が共存することにより起きる核酸伸長反応により核酸鎖中に取り込まれた蛍光色素の蛍光を測定する発光検出手段、を備え、
前記核酸試料の塩基配列情報を取得することを特徴とする核酸分析装置。
【請求項１】
検出対象の核酸を捕捉するプローブ分子を支持基体に固定した核酸分析用デバイスであって、
前記支持基体の所定位置に金属パッドが形成されており、前記プローブ分子が、ポリペプチドからなるリンカーを介して前記金属パッドに固定されている核酸分析デバイス。
【請求項２】
請求項１記載の核酸分析デバイスにおいて、
前記プローブ分子が、一つの前記金属パッドに対して一分子のみ固定されていることを特徴とする核酸分析デバイス。
【請求項３】
請求項１記載の核酸分析デバイスにおいて、
前記プローブ分子が、核酸、又は核酸合成酵素であることを特徴とする核酸分析デバイス。
【請求項４】
検出対象の核酸を捕捉するプローブ分子を支持基体に固定した核酸分析デバイスであって、
前記支持基体の所定位置に金属パッドが形成されており、
前記プローブ分子が微粒子に固定されており、当該微粒子が、ポリペプチドからなるリンカーを介して前記金属パッドに固定されている核酸分析デバイス。
【請求項５】
請求項４記載の核酸分析デバイスにおいて、
前記プローブ分子が、一つの前記微粒子に対して一分子のみ固定され、当該微粒子が、前記金属パッドに固定されていることを特徴とする核酸分析デバイス。
【請求項６】
請求項４記載の核酸分析デバイスにおいて、
前記プローブ分子が、核酸、又は核酸合成酵素であることを特徴とする核酸分析デバイス。
【請求項７】
請求項４記載の核酸分析デバイスにおいて、
前記微粒子が、半導体、又は金属から選ばれる材料からなることを特徴とする核酸分析デバイス。
【請求項８】
請求項１から７のいずれか１項に記載の核酸分析デバイスにおいて、
前記金属パッドが、金，チタン，ニッケル、又はアルミから選ばれる材料からなることを特徴とする核酸分析デバイス。
【請求項９】
請求項１から８のいずれか１項に記載の核酸分析デバイスを用いる核酸分析装置であって、
核酸分析デバイスに対して、蛍光色素を有するヌクレオチド、及び核酸試料を供給する手段と、
前記核酸分析デバイスに光を照射する手段と、
前記核酸分析デバイスにおいて前記ヌクレオチド，前記核酸合成酵素、及び前記核酸試料が共存することにより起きる核酸伸長反応により核酸鎖中に取り込まれた蛍光色素の蛍光を測定する発光検出手段、を備え、
前記核酸試料の塩基配列情報を取得することを特徴とする核酸分析装置。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２０１０−２４３４５４（Ｐ２０１０−２４３４５４Ａ）
【公開日】平成２２年１０月２８日（２０１０．１０．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−９５４０７（Ｐ２００９−９５４０７）
【出願日】平成２１年４月１０日（２００９．４．１０）
【出願人】（５０１３８７８３９）株式会社日立ハイテクノロジーズ (4,325)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１０月２８日（２０１０．１０．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年４月１０日（２００９．４．１０）
【出願人】（５０１３８７８３９）株式会社日立ハイテクノロジーズ (4,325)
【Ｆターム（参考）】
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