標的指向性リポソームを含む炎症性疾患治療薬または診断薬
炎症性疾患の炎症部位等の標的組織に集積し、局所的に薬剤や遺伝子を患部に送り込むための治療用または診断用のドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）として利用できる標的指向性ＤＤＳナノ粒子の提供。 糖鎖がリポソーム膜に結合されている糖鎖修飾リポソームを含む炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明は、炎症性疾患に対するドラッグデリバリーシステムに関する。
【背景技術】
米国の国家ナノテク戦略（ＮＮＩ）によって実現を目指す具体的目標の一例として、「癌細胞や標的組織を狙い撃ちする薬物や遺伝子送達システム（ＤＤＳ：ドラッグデリバリーシステム）」を掲げた。日本の総合科学技術会議のナノテクノロジー・材料分野推進戦略でも、重点領域として「医療用極小システム・材料、生物のメカニズムを活用し制御するナノバイオロジー」があり、その５年間の研究開発目標の１つとして「健康寿命延伸のための生体機能材料・ピンポイント治療等技術の基本シーズ確立」が掲げられている。一方、高齢化社会となるに伴い癌の罹患率・死亡率は年々増えており、新規な治療材料である標的指向ＤＤＳの開発が待望されている。その他の病気においても副作用のない標的指向ＤＤＳナノ材料の重要性が注目されており、その市場規模は近い将来に１０兆円を超えると予測されている。また、これらの材料は治療とともに診断への利用においても期待されている。
医薬品の治療効果は、薬物が特定の標的部位に到達し、そこで作用することにより発現される。その一方で、医薬品による副作用とは、薬物が不必要な部位に作用してしまうことである。従って、薬物を有効かつ安全に使用するためにもドラッグデリバリーシステムの開発が求められている。その中でも特に標的指向（ターゲティング）ＤＤＳとは、薬物を「体内の必要な部位に」、「必要な量を」、「必要な時間だけ」送り込むといった概念である。そのための代表的な材料としての微粒子性キャリアーであるリポソームが注目されている。この粒子に標的指向機能をもたせるために、リポソームの脂質の種類、組成比、粒子径、表面電荷を変化させるなどの受動的ターゲティング法が試みられているが、いまだ本法は不十分であり更なる改良が求められている。
一方、高機能のターゲティングを可能にするために、能動的ターゲティング法も試みられている。これは”ミサイルドラッグ”ともよばれ理想的なターゲティング法であるが、国内外においていまだ完成されたものはなく今後の発展が大いに期待されているものである。本法は、リポソーム膜面上にリガンドを結合させ、標的組織の細胞膜面上に存在するレセプターに特異的に認識させることによって、積極的にターゲティングを可能にさせる方法である。この能動的ターゲティング法での標的となる細胞膜面上に存在するレセプターのリガンドとしては、抗原、抗体、ペプチド、糖脂質や糖蛋白質などが考えられる。これらのうち、糖脂質や糖蛋白質の糖鎖は、生体組織の発生や形態形成、細胞の増殖や分化、生体防御や受精機構、癌化とその転移機構などの様々な細胞間コミュニケーションにおいて情報分子としての重要な役割を果たしていることが明らかにされつつある。
また、その標的となる各組織の細胞膜面上に存在するレセプターとしてのセレクチン、ＤＣ−ＳＩＧＮ、ＤＣ−ＳＧＮＲ、コレクチン、マンノース結合レクチン等のＣ−タイプレクチン、シグレック等のＩタイプレクチン、マンノース−６−リン酸受容体などのＰタイプレクチン、Ｒタイプレクチン、Ｌタイプレクチン、Ｍタイプレクチン、ガレクチンなどの各種のレクチン（糖鎖認識蛋白質）についての研究も進んできたことから、各種の分子構造を有する糖鎖は新しいＤＤＳリガンドとして注目されてきている（ １）Ｙａｍａｚａｋｉ，Ｎ．，Ｋｏｊｉｍａ，Ｓ．，Ｂｏｖｉｎ，Ｎ．Ｖ．，Ａｎｄｒｅ，Ｓ．，Ｇａｂｉｕｓ，Ｓ．ａｎｄ Ｇａｂｉｕｓ，Ｈ．−Ｊ．（２０００）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．４３，２２５−２４４． ２）Ｙａｍａｚａｋｉ，Ｎ．，Ｊｉｇａｍｉ，Ｙ．，Ｇａｂｉｕｓ，Ｈ．−Ｊ．，Ｋｏｊｉｍａ，Ｓ（２００１）Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３，３１９−３２９．ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇａｋ．ｃｏ．ｊｐ／ＴＩＧＧ／７１ＰＤＦ／ｙａｍａｚａｋｉ．ｐｄｆ）。
外膜表面にリガンドを結合したリポソームについては、癌などの標的部位に選択的に薬物や遺伝子などを送達するためのＤＤＳ材料として多くの研究がなされてきた。しかしながら、それらは、生体外では標的細胞に結合するが、生体内では期待される標的細胞や組織にターゲティングされないものがほとんどである（ １）Ｆｏｒｓｓｅｎ，Ｅ．ａｎｄ Ｗｉｌｌｉｓ，Ｍ．（１９９８）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．２９，２４９−２７１． ２）高橋俊雄・橋田充編（１９９９）、今日のＤＤＳ・薬物送達システム、１５９−１６７頁、医薬ジャーナル社、大阪）。糖鎖の分子認識機能を利用したＤＤＳ材料の研究開発においても、糖鎖を有する糖脂質を導入したリポソームについて若干の研究が知られているが、それらの機能評価は生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）によるもののみであり、糖鎖を有する糖蛋白質を導入したリポソームの研究はほとんど進んでいない（ １）ＤｅＦｒｅｅｓ，Ｓ．Ａ．，Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，Ｌ．，Ｇｕｏ，Ｌ．ａｎｄ Ｚａｌｉｐｓｋｙ，Ｓ．（１９９６）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１８，６１０１−６１０４． ２）Ｓｐｅｖａｋ，Ｗ．，Ｆｏｘａｌｌ，Ｃ．，Ｃｈａｒｙｃｈ，Ｄ．Ｈ．，Ｄａｓｑｕｐｔａ，Ｆ．ａｎｄ Ｎａｇｙ，Ｊ．Ｏ．（１９９６）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３９，１０１８−１０２０． ３）Ｓｔａｈｎ，Ｒ．，Ｓｃｈａｆｅｒ，Ｈ．，Ｋｅｒｎｃｈｅｎ，Ｆ．ａｎｄ Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，Ｊ．（１９９８）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ８，３１１−３１９． ４）Ｙａｍａｚａｋｉ，Ｎ．，Ｊｉｇａｍｉ，Ｙ．，Ｇａｂｉｕｓ，Ｈ．−Ｊ．，Ｋｏｊｉｍａ，Ｓ（２００１）Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３，３１９−３２９．ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇａｋ．ｃｏ．ｊｐ／ＴＩＧＧ／７１ＰＤＦ／ｙａｍａｚａｋｉ．ｐｄｆ）。したがって、糖脂質や糖蛋白質の多種多様な糖鎖を結合したリポソームについての調製法と生体内動態（ｉｎ ｖｉｖｏ）解析を含めた体系的な研究は、これまで未開発で今後の進展が期待される重要課題である。
さらに新しいタイプのＤＤＳ材料研究として、投与が最も簡便・安価に行える経口投与で使用可能なＤＤＳ材料開発も重要課題である。たとえば、ペプチド性および蛋白質性医薬品などは一般的に水溶性で高分子量であり消化管の小腸粘膜透過性が低いため酵素分解を受けるなどにより経口投与してもほとんど腸管吸収されない。そこでこれらの高分子量の医薬品や遺伝子などを腸管から血液中へ送達するためのＤＤＳ材料としてリガンド結合リポソームの研究が注目されつつある（Ｌｅｈｒ，Ｃ．−Ｍ．（２０００）Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ６５，１９−２９）。しかしながら、これらのリガンドとして糖鎖を用いた腸管吸収制御性リポソームの研究は未だ報告されていない。
本発明者等は、既に、糖鎖がリンカー蛋白質を介してリポソーム膜に結合されており、糖鎖が、ルイスＸ型三糖鎖、シアリルルイスＸ型四糖鎖、３’−シアリルラクトサミン三糖鎖、６’−シアリルラクトサミン三糖鎖から選ばれたものであり、リポソーム膜および／またはリンカー蛋白質にトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン等の低分子親水化合物が任意に結合しており親水性化されていることを特徴とする糖鎖修飾リポソームおよびラクトース２糖鎖、２’−フコシルラクトース三糖鎖、ジフコシルラクトース四糖類および３−フコシルラクトース三糖鎖から選ばれた糖鎖により修飾されたリポソームであって、糖鎖がリンカー蛋白質を介してリポソームに結合していてもよい、腸管吸収性リポソームについて特許出願を行っている。
しかし、炎症性疾患に対して治療用または診断用薬剤を標的指向的に投薬するドラッグデリバリーシステムは開発されていなかった。
炎症性疾患の中でも、リュウマチ性関節炎（Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ，ＲＡ）は関節炎を中心とした種々の先進症状を伴う自己免疫疾患であり、その患者の数は日本で７０万人程度と言われている。この患者数は自己免疫疾患中で最大であり、ＲＡの治療改善は社会的に大きな貢献をもたらすことになると思われる。
ＲＡの発症には遺伝的要因（特定のＨＬＡなど）や環境要因（ｖｉｒｕｓの感染など）が関与していると考えられているが、詳細な発症機序は不明である。しかし炎症部位には関節のシノビュウムに存在するマクロプァージとＣＤ４＋，ＣＤ８＋，Ｔ細胞の存在が確認されており、このＴ細胞がシノビュウムに存在する抗原を認識していることがわかっている（Ｔ．Ｔｏｙｏｓａｋｉ，ｅｔ．ａｌ １９９８ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ ４１，９２−１００，Ｐ．Ｌ．ｖａｎ Ｌｅｎｔ，ｅｔ ａｌ．１９９６ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ ３９，１５４５−１５５５）。そしてこれら炎症に起因する細胞にはＩＬ−１、ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｔｉｃ ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ（以下ＴＮＦ−ａ）そしてＩＬ−６などのいわゆる炎症性サイトカインが深く関与していることが示唆されている（Ｓ．Ｓａｉｊｏ，ｅｔ ａｌ．２００２ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．４６，５３３−５４４． Ｄ．Ｋｏｎｔｏｙｉａｎｎｉｓ，ｅｔ ａｌ．１９９９ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １０，３８７−３９８． Ｔ．Ｏｈｔａｎｉ，ｅｔ ａｌ．２０００ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １２，９５−１０５．）。
近年ＲＡの治療はこれらの新しい知見をもとに大きく変わり始め、最大の進歩は生物学的製剤が開発されたことである。つまりＴＮＦ−ａｌｐｈａ（以下ＴＮＦ−ａ）に対する種々の抗体治療薬の出現である。これら抗体治療薬は関節炎に対して高い治療効果を有し、関節組織破壊抑制効果もある等、従来の治療薬とは一線を画する新薬である。しかしこれら新薬は一方において、感染症をはじめとする重篤な有害事象を起こしうることが報告されている。この副作用の原因の一つとしては関節という局所の炎症をコントロールするために、非特異的に全身に大量の抗ＴＮＦ−ａ抗体が投与されることに起因していると考えられる。
従来から使用されている薬剤も含め、革新的新薬といえども副作用を有する治療薬は病巣部位に特異的に分配され、病巣部位のみで有効性を発揮することが理想的である。このようなシステムは薬剤の副作用を減らし、かつ薬効をさらに引き上げることが可能で、現在最新薬剤として注目されている生物製剤や、分子標的薬の開発と同様に重要と考えられる。
【発明の開示】
炎症性疾患部位等の標的組織に集積し、局所的に薬剤や遺伝子を患部に送り込むための治療または診断用のドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）として利用できる標的指向性ＤＤＳナノ粒子の提供。具体的には、炎症部位の血管内皮細胞に発現するＥ−セレクチン、Ｐ−セレクチン等と結合しうる糖鎖を表面に結合させたドラッグデリバリー用の標的指向性リポソームの提供。
本発明者らは、先に表面に特定の糖鎖が結合したＤＤＳ用標的指向性リポソームを開発した。該標的指向性リポソームには、シアリルルイスＸ糖鎖（ｓＬｅＸ）が結合しており、腫瘍部位、炎症部位への移行性において高い効率を有していた。
本発明者らは、この標的指向性リポソームの炎症性疾患領域への応用について鋭意検討を行い、炎症性疾患モデル動物として、眼炎症モデルマウスを作出し、上記標的指向性リポソームが眼の炎症部位に指向的に取り込まれることを見出し本発明を完成させるに至った。
今回開発されたＤｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ（以下ＤＤＳ）は炎症部位へ特異的に集積し、効率的で副作用の少ない治療システムを可能にするものである。ステロイド剤は抗炎症薬としては最も一般的なため、これが実施例に用いられたが、治療薬はこれに限らず免疫抑制剤、サイトカイン、抗サイトカイン剤、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む核酸などの分配が可能である。
すなわち、本発明は以下の通りである。
１． 糖鎖がリポソーム膜に結合されている糖鎖修飾リポソームを含む炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
２． リポソームの構成脂質が、フォスファチジルコリン類（モル比０〜７０％）、フォスファチジルエタノールアミン類（モル比０〜３０％）、フォスファチジン酸類、長鎖アルキルリン酸塩類およびジセチルリン酸類からなる群から選択される１種以上の脂質（モル比０〜３０％）、ガングリオシド類、糖脂質類、フォスファチジルグリセロール類およびスフィンゴミエリン類からなる群から選択される１種以上の脂質（モル比０〜４０％）、ならびにコレステロール類（モル比０〜７０％）を含む、１記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
３． ガングリオシド類、糖脂質類、フォスファチジルグリセロール類、スフィンゴミエリン類およびコレステロール類からなる群から選択される少なくとも１種の脂質がリポソーム表面上で集合しラフトを形成している２記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
４． 糖鎖の種類および密度が制御されて結合されている、１から３のいずれかに記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
５． リポソームの粒径が３０〜５００ｎｍである、１から４のいずれかに記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
６． リポソームの粒径が５０〜３００ｎｍである、５記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
７． リポソームのゼータ電位が−５０〜１０ｍＶである、１から６のいずれか１項記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
８． リポソームのゼータ電位が−４０〜０ｍＶである、７記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
９． リポソームのゼータ電位が−３０〜−１０ｍＶである、８記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
１０． 糖鎖がリンカー蛋白質を介してリポソーム膜に結合されている、１から９のいずれかに記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
１１． リンカー蛋白質が生体由来蛋白質である１０記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
１２． リンカー蛋白質がヒト由来蛋白質である１１記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
１３． リンカー蛋白質がヒト由来血清蛋白質である１２記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
１４． リンカー蛋白質がヒト血清アルブミンまたはウシ血清アルブミンである１０記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
１５． リンカー蛋白質がリポソーム表面上に形成されているガングリオシド類、糖脂質類、フォスファチジルグリセロール類、スフィンゴミエリン類およびコレステロール類からなる群から選択される少なくとも１種の脂質からなるラフト上に結合している１から１４のいずれかに記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
１６． リポソーム膜および／またはリンカー蛋白質に親水性化合物が結合することにより親水性化されている、１から１５のいずれかに記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
１７． 親水性化合物が低分子物質である、１６記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
１８． 親水性化合物が糖鎖に対する立体障害となりにくく標的細胞膜面上のレクチンによる糖鎖分子認識反応の進行を妨げない、１６または１７記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
１９． 親水性化合物が水酸基を有する１６から１８のいずれかに記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
２０． 親水性化合物がアミノアルコール類である１６から１９のいずれかに記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
２１． 親水性化合物がリポソーム膜表面に直接結合している１６から２０のいずれかに記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
２２． 親水性化合物により親水性化され、該親水性化合物が、一般式（１）
Ｘ−Ｒ１（Ｒ２ＯＨ）ｎ 式（１）
で示される１６記載の糖鎖修飾リポソームであって、Ｒ１は、Ｃ１からＣ４０の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を示し、Ｒ２は存在しないかもしくはＣ１からＣ４０の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を示し、Ｘはリポソーム脂質またはリンカー蛋白質と直接または架橋用の二価試薬と結合する反応性官能基を示し、ｎは自然数を示す、炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
２３． 親水性化合物により親水性化され、該親水性化合物が、一般式（２）
Ｈ２Ｎ−Ｒ３−（Ｒ４ＯＨ）ｎ 式（２）
で示される１６記載の糖鎖修飾リポソームであって、Ｒ３は、Ｃ１からＣ４０の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を示し、Ｒ４は存在しないかもしくはＣ１からＣ４０の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を示し、Ｈ２Ｎはリポソーム脂質またはリンカー蛋白質と直接または架橋用の二価試薬と結合する反応性官能基を示し、ｎは自然数を示す、炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
２４． 親水性化合物により親水性化され、該親水性化合物が、一般式（３）
Ｈ２Ｎ−Ｒ５（ＯＨ）ｎ 式（３）
で示される１６記載の糖鎖修飾リポソームであって、Ｒ５は、Ｃ１からＣ４０の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を示し、Ｈ２Ｎはリポソーム脂質またはリンカー蛋白質と直接または架橋用の二価試薬と結合する反応性官能基を示し、ｎは自然数を示す、炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
２５． リポソーム膜および／またはリンカー蛋白質にトリス（ヒドロキシアルキル）アミノアルカンである親水性化合物を共有結合により結合させることによりリポソーム膜および／またはリンカー蛋白質が親水性化されている、１６記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
２６． リポソーム膜および／またはリンカー蛋白質にトリス（ヒドロキシメチル）アミノエタン、トリス（ヒドロキシエチル）アミノエタン、トリス（ヒドロキシプロピル）アミノエタン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、トリス（ヒドロキシエチル）アミノメタン、トリス（ヒドロキシプロピル）アミノメタン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノプロパン、トリス（ヒドロキシエチル）アミノプロパン、トリス（ヒドロキシプロピル）アミノプロパンからなる群から選択される親水性化合物を共有結合により結合させることによりリポソーム膜および／またはリンカー蛋白質が親水性化されている、１６記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
２７． 糖鎖修飾リポソームが、各組織の細胞膜面上に存在するレセプターとしてのセレクチン、ＤＣ−ＳＩＧＮ、ＤＣ−ＳＧＮＲ、コレクチンおよびマンノース結合レクチンを含むＣ−タイプレクチン、シグレックを含むＩタイプレクチン、マンノース−６−リン酸受容体を含むＰタイプレクチン、Ｒタイプレクチン、Ｌタイプレクチン、Ｍタイプレクチン、ガレクチンからなる群から選択されるレクチンを標的とする１から２６のいずれかに記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
２８． 糖鎖修飾リポソームがＥ−セレクチン、Ｐ−セレクチンおよびＬ−セレクチンからなる群から選択されるセレクチンを標的とする２７記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
２９． リポソームに結合した糖鎖の結合密度が、リポソームに結合させるリンカー蛋白質１分子当り１〜６０個である、１から２８のいずれかに記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
３０． リポソームに結合した糖鎖の結合密度が、リンカー蛋白質を用いる場合は、リポソーム１粒子当り１〜３００００個であり、リンカー蛋白質を用いない場合は、リポソーム１粒子当り最高１〜５０００００個である、１から２８のいずれかに記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
３１． 糖鎖がルイスＸ型三糖鎖、シアリルルイスＸ型四糖鎖、３’−シアリルラクトサミン三糖鎖、６’−シアリルラクトサミン三糖鎖、アルファ１，２マンノビオース二糖鎖、アルファ１，３マンノビオース二糖鎖、アルファ１，４マンノビオース二糖鎖、アルファ１，６マンノビオース二糖鎖、アルファ１，３アルファ１，６マンノトリオース三糖鎖、オリゴマンノース３五糖鎖、オリゴマンノース４ｂ六糖鎖、オリゴマンノース５七糖鎖、オリゴマンノース６八糖鎖、オリゴマンノース７九糖鎖、オリゴマンノース８十糖鎖、オリゴマンノース９十一糖鎖、ラクトース二糖鎖、２’−フコシルラクトース三糖鎖、ジフコシルラクトース四糖類、３−フコシルラクトース三糖鎖、３’−シアリルラクトース三糖鎖および６’−シアリルラクトース三糖鎖からなる群から選択される、１から３０のいずれかに記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
３２． 糖鎖修飾リポソームが含む薬剤が、副腎皮質ホルモン、抗炎症薬、免疫抑制剤、抗がん剤、抗菌薬、抗ウイルス薬、血管新生抑制剤、サイトカインやケモカイン、抗サイトカイン抗体や抗ケモカイン抗体、抗サイトカイン・ケモカイン受容体抗体、ｓｉＲＮＡやＤＮＡなどの遺伝子治療関連の核酸製剤、神経保護因子および抗体医薬からなる群から選択される１から３１のいずれかに記載の炎症性疾患治療用医薬組成物。
３３． 糖鎖修飾リポソームが含む薬剤が、副腎皮質ホルモンまたは抗炎症薬である３２記載の炎症性疾患治療用医薬組成物。
３４． 糖鎖修飾リポソームが含む薬剤がプレドニゾロンである３３記載の炎症性疾患治療用医薬組成物。
３５． 薬剤が、薬剤を単独投与した場合に比べ、炎症部位に１０倍以上多く集積し得る、３２から３４のいずれかに記載の炎症性疾患治療用医薬組成物。
３６． ．炎症性疾患が脳炎、炎症性眼疾患、耳炎、咽頭炎、肺炎、胃炎、腸炎、肝炎、膵炎、腎炎、膀胱炎、尿道炎、子宮体炎、膣炎、関節炎、末梢神経炎、悪性腫瘍、感染性疾患、リウマチ、全身性エリテマトーデス、サルコイドーシスなどの自己免疫疾患、心筋梗塞、脳梗塞などの虚血性疾患、糖尿病、痛風などの代謝性疾患、外傷・熱傷・化学腐食、アルツハイマー病などの神経変性疾患からなる群から選択される、１から３５のいずれかに記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
３７． 炎症性疾患が炎症性眼疾患である３６記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
３８． 炎症性疾患がリウマチである３６記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
３９． 炎症性疾患が腸炎である３６記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
４０． 経口投与用医薬組成物である、１から３９のいずれかに記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
４１． 非経口投与用医薬組成物である、１から３９のいずれかに記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
４２． リポソーム膜が親水性化されており、表面に糖鎖が結合していないリポソームを含む炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
４３． リポソームの構成脂質が、フォスファチジルコリン類（モル比０〜７０％）、フォスファチジルエタノールアミン類（モル比０〜３０％）、フォスファチジン酸類、長鎖アルキルリン酸塩類およびジセチルリン酸類からなる群から選択される１種以上の脂質（モル比０〜３０％）、ガングリオシド類、糖脂質類、フォスファチジルグリセロール類およびスフィンゴミエリン類からなる群から選択される１種以上の脂質（モル比０〜４０％）、ならびにコレステロール類（モル比０〜７０％）を含む、４２記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
４４． リポソームが、さらに蛋白質を含む４３記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
４５． リポソーム膜および／またはリンカー蛋白質に親水性化合物が結合することにより親水性化されている、４２から４４のいずれかに記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
４６． 親水性化合物が低分子物質である、４５記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
４７． 親水性化合物が水酸基を有する４５または４６に記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
４８． 親水性化合物がアミノアルコール類である４５から４７のいずれかに記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
４９． 親水性化合物がリポソーム膜表面に直接結合している４５から４８のいずれかに記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
５０． 親水性化合物により親水性化され、該親水性化合物が、一般式（１）
Ｘ−Ｒ１（Ｒ２ＯＨ）ｎ 式（１）
で示される４５記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物であって、Ｒ１は、Ｃ１からＣ４０の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を示し、Ｒ２は存在しないかもしくはＣ１からＣ４０の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を示し、Ｘはリポソーム脂質またはリンカー蛋白質と直接または架橋用の二価試薬と結合する反応性官能基を示し、ｎは自然数を示す、炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
５１． 親水性化合物により親水性化され、該親水性化合物が、一般式（２）
Ｈ２Ｎ−Ｒ３−（Ｒ４ＯＨ）ｎ 式（２）
で示される４５記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物であって、Ｒ３は、Ｃ１からＣ４０の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を示し、Ｒ４は存在しないかもしくはＣ１からＣ４０の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を示し、Ｈ２Ｎはリポソーム脂質またはリンカー蛋白質と直接または架橋用の二価試薬と結合する反応性官能基を示し、ｎは自然数を示す、炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
５２． 親水性化合物により親水性化され、該親水性化合物が、一般式（３）
Ｈ２Ｎ−Ｒ５（ＯＨ）ｎ 式（３）
で示される４５記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物であって、Ｒ５は、Ｃ１からＣ４０の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を示し、Ｈ２Ｎはリポソーム脂質またはリンカー蛋白質と直接または架橋用の二価試薬と結合する反応性官能基を示し、ｎは自然数を示す、炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
５３． リポソーム膜および／またはリンカー蛋白質にトリス（ヒドロキシアルキル）アミノアルカンである親水性化合物を共有結合により結合させることによりリポソーム膜および／またはリンカー蛋白質が親水性化されている、４５記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
５４． リポソーム膜および／またはリンカー蛋白質にトリス（ヒドロキシメチル）アミノエタン、トリス（ヒドロキシエチル）アミノエタン、トリス（ヒドロキシプロピル）アミノエタン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、トリス（ヒドロキシエチル）アミノメタン、トリス（ヒドロキシプロピル）アミノメタン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノプロパン、トリス（ヒドロキシエチル）アミノプロパン、トリス（ヒドロキシプロピル）アミノプロパンからなる群から選択される親水性化合物を共有結合により結合させることによりリポソーム膜および／またはリンカー蛋白質が親水性化されている、５３記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
５５． リポソームが含む薬剤が、副腎皮質ホルモン、抗炎症薬、免疫抑制剤、抗がん剤、抗菌薬、抗ウイルス薬、血管新生抑制剤、サイトカインやケモカイン、抗サイトカイン抗体や抗ケモカイン抗体、抗サイトカイン・ケモカイン受容体抗体、ｓｉＲＮＡやＤＮＡなどの遺伝子治療関連の核酸製剤、神経保護因子および抗体医薬からなる群から選択される４２から５４のいずれかに記載の炎症性疾患治療用医薬組成物。
５６． リポソームが含む薬剤が、副腎皮質ホルモンまたは抗炎症薬である５５記載の炎症性疾患治療用医薬組成物。
５７． リポソームが含む薬剤がプレドニゾロンである５６記載の炎症性疾患治療用医薬組成物。
５８． 薬剤が、薬剤を単独投与した場合に比べ、炎症部位に１０倍以上多く集積し得る、５５から５７のいずれかに記載の炎症性疾患治療用医薬組成物。
５９． 炎症性疾患が脳炎、炎症性眼疾患、耳炎、咽頭炎、肺炎、胃炎、腸炎、肝炎、膵炎、腎炎、膀胱炎、尿道炎、子宮体炎、膣炎、関節炎、末梢神経炎、悪性腫瘍、感染性疾患、リウマチ、全身性エリテマトーデス、サルコイドーシスなどの自己免疫疾患、心筋梗塞、脳梗塞などの虚血性疾患、糖尿病、痛風などの代謝性疾患、外傷・熱傷・化学腐食、アルツハイマー病などの神経変性疾患からなる群から選択される、４２から５８のいずれかに記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
６０． 炎症性疾患が炎症性眼疾患である５９記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
６１． 炎症性疾患がリウマチである５９記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
６２． 炎症性疾患が腸炎である５９記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
６３． 経口投与用医薬組成物である、４２から６２のいずれかに記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
６３． 非経口投与用医薬組成物である、４２から６２のいずれかに記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００３−２８５４２２、２００３−３６９４９４号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
図１は、ルイスＸ型三糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
図２は、シアリルルイスＸ型四糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
図３は、３’−シアリルラクトサミン三糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
図４は、６’−シアリルラクトサミン三糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
図５は、アルファ１，２マンノビオース二糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
図６は、アルファ１，３マンノビオース二糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
図７は、アルファ１，４マンノビオース二糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
図８は、アルファ１，６マンノビオース二糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
図９は、アルファ１，３アルファ１，６マンノトリオース三糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
図１０は、オリゴマンノース３五糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
図１１は、オリゴマンノース４ｂ六糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
図１２は、オリゴマンノース５七糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
図１３は、オリゴマンノース６八糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
図１４は、オリゴマンノース７九糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
図１５は、オリゴマンノース８十糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
図１６は、オリゴマンノース９十一糖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
図１７は、ラクトース二糖鎖により修飾されたリポソームの構造例を示す模式図である。
図１８は、２’−フコシルラクトース三糖鎖により修飾されたリポソームの構造例を示す模式図である。
図１９は、ジフコシルラクトース四糖鎖により修飾されたリポソームの構造例を示す模式図である。
図２０は、３−フコシルラクトース三糖鎖により修飾されたリポソームの構造例を示す模式図である。
図２１は、３’−シアリルラクトース三糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
図２２は、６’−シアリルラクトース三糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
図２３は、比較試料としてのｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅを結合したリポソームの模式図である。
図２４は、実験的ぶどう膜炎発症を示す写真である。
図２５Ａは、リポソームの臓器別分布を示す図である。
図２５Ｂは、リポソームの臓器別分布を示す図であり、正常マウスに対する相対値％で示した図である。
図２６は、リポソーム分布の時間経過を示す写真である。
図２７は、正常マウスおよびＥＡＵマウスでのリポソーム分布を示す写真である。
図２８は、蛍光抗体法による検出の結果を示す写真である。
図２９は、酵素抗体法による検出の結果を示す写真である。
図３０は、結合阻害実験の結果を示す写真である。
図３１は、炎症を起こしたＲＡマウスの四肢の写真である。
図３２は、ＲＡマウスに対するプレドニゾロン包埋ＤＤＳ静脈投与による治療の結果を示す図である。
図３３は、ＲＡマウスに対するプレドニゾロン包埋ＤＤＳ経口投与による治療の結果を示す図である。
図３４は、ＲＡマウスに対する適切量のプレドニゾロン投与による治療の結果を示す図である。
図３５は、２種類の親水性化処理を行ったリポソームと未処理のリポソームの担癌マウス尾静注投与５分後の血中滞留性の比較結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
本発明は、炎症性疾患の病巣部位に標的指向性を有し、病巣部位に特異的に取り込まれ、病巣部位で封入された薬剤を放出し、病巣を治療しうる標的指向性リポソームである。
炎症時に血管内皮細胞に発現するＥ−セレクチン、Ｐ−セレクチンと白血球の細胞膜上に発現している糖鎖であるシアリルルイスＸが強く結合することが知られている。本リポソームはこのシアリルルイスＸ糖鎖またはこれと同様にＥ−セレクチン、Ｐ−セレクチン等に反応することができる糖鎖が糖鎖の種類と密度が制御されて結合しているリポソームであり、血管内皮細胞がＥ−セレクチン、Ｐ−セレクチン等を発現している病巣部位に特異的に集積すると考えられる。またＥ−セレクチン、Ｐ−セレクチン等を発現している部位は炎症や血管新生が生じている部位であり、そのような部位の血管は内皮細胞の細胞間隙が拡大しており、集積したリポソームがその隙間から病巣部位およびその周囲に拡散するものと考えられる。拡散したリポソームは病巣部位およびその周囲の各種細胞に取り込まれ（ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ）、細胞内で内包している薬剤を放出する。このようなメカニズムで炎症性疾患に効果を発揮する。
本発明のリポソームに結合させる糖鎖として、上述のようにＥ−セレクチン、Ｐ−セレクチン等に反応することができる糖鎖が挙げられる。ここで、Ｅ−セレクチン、Ｐ−セレクチン等とは、セレクチン、ＤＣ−ＳＩＧＮ、ＤＣ−ＳＧＮＲ、コレクチン、マンノース結合レクチン等のＣ−タイプレクチン、シグレック等のＩタイプレクチン、マンノース−６−リン酸受容体などのＰタイプレクチン、Ｒタイプレクチン、Ｌタイプレクチン、Ｍタイプレクチン、ガレクチンなどの各種のレクチン（糖鎖認識蛋白質）をいう。このような糖鎖は限定されないが、例えば、ルイスＸ型三糖鎖（構造式を図１に示す。以下、同様）、シアリルルイスＸ型四糖鎖（図２）、３’−シアリルラクトサミン三糖鎖（図３）、６’−シアリルラクトサミン三糖鎖（図４）、アルファ１，２マンノビオース二糖鎖（図５）、アルファ１，３マンノビオース二糖鎖（図６）、アルファ１，４マンノビオース二糖鎖（図７）、アルファ１，６マンノビオース二糖鎖（図８）、アルファ１，３アルファ１，６マンノトリオース三糖鎖（図９）、オリゴマンノース３五糖鎖（図１０）、オリゴマンノース４ｂ六糖鎖（図１１）、オリゴマンノース５七糖鎖（図１２）、オリゴマンノース６八糖鎖（図１３）、オリゴマンノース７九糖鎖（図１４）、オリゴマンノース８十糖鎖（図１５）、オリゴマンノース９十一糖鎖（図１６）、ラクトース二糖鎖（図１７）、２’−フコシルラクトース三糖鎖（図１８）、ジフコシルラクトース四糖類（図１９）、３−フコシルラクトース三糖鎖（図２０）、３’−シアリルラクトース三糖鎖（図２１）および６’−シアリルラクトース三糖鎖（図２２）が挙げられる。
（１） 標的指向性リポソームの作製
リポソームとは、通常、膜状に集合した脂質層および内部の水層から構成される閉鎖小胞を意味する。本発明のリポソームは、図１〜２２に示されるように、その表面すなわち脂質層に糖鎖が、結合している。糖鎖は直接リポソームの脂質層に結合していてもよいし、ヒト血清アルブミンのようなリンカー蛋白質を介して、共有結合していてもよい。
本発明のリポソームを構成する脂質としては、例えば、フォスファチジルコリン類、フォスファチジルエタノールアミン類、フォスファチジン酸類もしくは長鎖アルキルリン酸塩類、ガングリオシド類、糖脂質類もしくはフォスファチジルグリセロール類、コレステロール類等が挙げられ、フォスファチジルコリン類としては、ジミリストイルフォスファチジルコリン、ジパルミトイルフォスファチジルコリン、ジステアロイルフォスファチジルコリン等が、また、フォスファチジルエタノールアミン類としては、ジミリストイルフォスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルフォスファチジルエタノールアミン等が、フォスファチジン酸類もしくは長鎖アルキルリン酸塩類としては、ジミリストイルフォスファチジン酸、ジパルミトイルフォスファチジン酸、ジステアロイルフォスファチジン酸、ジセチルリン酸等が、ガングリオシド類としては、ガングリオシドＧＭ１、ガングリオシドＧＤ１ａ、ガングリオシドＧＴ１ｂ等が、糖脂質類としては、ガラクトシルセラミド、グルコシルセラミド、ラクトシルセラミド、フォスファチド、グロボシド等が、フォスファチジルグリセロール類としては、ジミリストイルフォスファチジルグリセロール、ジパルミトイルフォスファチジルグリセロール、ジステアロイルフォスファチジルグリセロール等が好ましい。このうち、フォスファチジン酸類もしくは長鎖アルキルリン酸塩類、ガングリオシド類もしくは糖脂質類、コレステロール類はリポソームの安定性を上昇させる効果を有するので、構成脂質として添加するのが望ましい。
例えば、本発明のリポソームを構成する脂質として、フォスファチジルコリン類（モル比０〜７０％）、フォスファチジルエタノールアミン類（モル比０〜３０％）、フォスファチジン酸類もしくは長鎖アルキルリン酸塩（モル比０〜３０％）、ガングリオシド類、糖脂質類もしくはフォスファチジルグリセロール鎖（モル比０〜４０％）、およびコレステロール類（モル比０〜７０％）を含むものが挙げられる。
リポソーム自体は、周知の方法に従い製造することができるが、これには、薄膜法、逆層蒸発法、エタノール注入法、脱水−再水和法等を挙げることができる。
また、超音波照射法、エクストルージョン法、フレンチプレス法、ホモジナイゼーション法等を用いて、リポソームの粒子径を調節することも可能である。本発明のリポソーム自体の製法について、具体的に述べると、例えば、まず、フォスファチジルコリン類、コレステロール、フォスファチジルエタノールアミン類、フォスファチジン酸類、ガングリオシド類、糖脂質類もしくはフォスファチジルグリセロール類を配合成分とする脂質と界面活性剤コール酸ナトリウムとの混合ミセルを調製する。
とりわけ、フォスファチジルエタノールアミン類の配合は親水性化反応部位として、ガングリオシド類または糖脂質類またはフォスファチジルグリセロール類の配合はリンカー蛋白質の結合部位として必須のものである。そして、これにより得られる混合ミセルの限外濾過を行うことによりリポソームを作製する。
本発明において使用するリポソームは、通常のものでも使用できるが、その表面は親水性化されていることが望ましい。上述のようにしてリポソームを作製した後にリポソーム表面を親水性化する。リポソーム表面の親水性化は、リポソーム表面に親水性化合物を結合させることにより行う。親水性化に用いる化合物としては、低分子の親水性化合物、好ましくは少なくとも１つのＯＨ基を有する低分子の親水性化合物、さらに好ましくは、少なくとも２つのＯＨ基を有する低分子の親水性化合物が挙げられる。また、さらに少なくとも１つのアミノ基を有する低分子の親水性化合物、すなわち分子中に少なくとも１つのＯＨ基と少なくとも１つのアミノ基を有する親水性化合物が挙げられる。親水性化合物は、低分子なので、糖鎖に対する立体障害となりにくく標的細胞膜面上のレクチンによる糖鎖分子認識反応の進行を妨げることはない。また、親水性化合物には、本発明の糖鎖修飾リポソームにおいて、レクチン等の特定の標的を指向するために用いられるレクチンが結合し得る糖鎖は含まれない。このような親水性化合物として、例えば、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンなどを含むトリス（ヒドロキシアルキル）アミノアルカン等のアミノアルコール類等が挙げられ、さらに具体的には、トリス（ヒドロキシメチル）アミノエタン、トリス（ヒドロキシエチル）アミノエタン、トリス（ヒドロキシプロピル）アミノエタン、トリス（ヒドロキシスチル）アミノメタン、トリス（ヒドロキシエチル）アミノメタン、トリス（ヒドロキシプロピル）アミノメタン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノプロパン、トリス（ヒドロキシエチル）アミノプロパン、トリス（ヒドロキシプロピル）アミノプロパン等が挙げられる。さらに、ＯＨ基を有する低分子化合物にアミノ基を導入した化合物も本発明の親水性化合物として用いることができる。該化合物は限定されないが、例えば、セロビオース等のレクチンが結合しない糖鎖にアミノ基を導入した化合物が挙げられる。例えば、リポソーム膜の脂質フォスファチジルエタノールアミン上に架橋用の２価試薬とトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンとを用いてリポソーム表面を親水性化する。親水性化合物の一般式は、下記式（１）、式（２）、式（３）等で示される。
Ｘ−Ｒ１（Ｒ２ＯＨ）ｎ式（１）
Ｈ２Ｎ−Ｒ３−｛Ｒ４ＯＨ）ｎ式（２）
Ｈ２Ｎ−Ｒ５（ＯＨ）ｎ式（３）
ここで、Ｒ１、Ｒ３およびＲ５は、Ｃ１からＣ４０、好ましくはＣ１からＣ２０、さらに好ましくはＣ１からＣ１０の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を示し、Ｒ２、Ｒ４は存在しないかもしくはＣ１からＣ４０、好ましくはＣ１からＣ２０、さらに好ましくはＣ１からＣ１０の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を示す。Ｘはリポソーム脂質と直接または架橋用の二価試薬と結合する反応性官能基を示し、例えば、ＣＯＯＨ、ＮＨ、ＣＨ２、ＣＨＯ、ＳＨ、ＮＨＳ−エステル、マレイミド、イミドエステル、活性ハロゲン、ＥＤＣ、ピリジルジスルフィド、アジドフェニル、ヒドラジド等が挙げられる。ｎは自然数を示す。
リポソームの親水性化は、従来公知の方法、例えば、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、無水マレイン酸共重合体等を共有結合により結合させたリン脂質を用いてリポソームを作成する方法（特開２０００−３０２６８５号）等の方法を採用することによっても行うことができる。
このうち、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを用いてリポソーム表面を親水性化することが特に好ましい。
本発明のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン等の低分子親水性化合物を用いる手法は、ポリエチレングリコールなどを用いる従来の親水性化方法と比較していくつかの点で好ましい。例えば、本発明のように糖鎖をリポソーム上に結合してその分子認識機能を標的指向性に利用するものでは、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン等の低分子親水化合物は低分子量物質であるので従来のポリエチレングリコールなどの高分子量物質を用いる方法に比べて、糖鎖に対する立体障害となりにくく標的細胞膜面上のレクチン（糖鎖認識蛋白質）による糖鎖分子認識反応の進行を妨げないので特に好ましい。
また、本発明によるリポソームは該親水性化処理後においても粒径分布や成分組成、分散特性が良好であり、長時間の保存性や生体内安定性も優れているのでリポソーム製剤化して利用するために好ましい。
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン等の低分子親水性化合物を用いてリポソーム表面を親水性化するには、例えばジミリストイルフォスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルフォスファチジルエタノールアミン等の脂質を用いて、常法により得たリポソーム溶液にビススルフォスクシニミヂルスベラート、ジスクシニミヂルグルタレート、ジチオビススクシニミヂルプロピオネート、ジスクシニミヂルスベラート、３，３’−ジチオビススルフォスクシニミヂルプロピオネート、エチレングリコールビススクシニミヂルスクシネート、エチレングリコールビススルフォスクシニミヂルスクシネート等の２価試薬を加えて反応させることにより、リポソーム膜上のジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミン等の脂質に２価試薬を結合させ、次いでトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを、該２価試薬の一方の結合手と反応させることにより、リポソーム表面にトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを結合せしめる。
リポソーム表面に親水性化合物を結合させる場合、リポソーム１粒子当り１〜５０００００分子、好ましくは１〜５００００分子である。
このように、リポソームを親水性化処理したリポソームは、生体内で極めて安定であり、後述のように標的指向性を有する糖鎖を結合しなくても、生体内での半減期が長いためドラッグデリバリーシステムにおけるドラッグ担体として好適に用いることができる。本発明は、表面を低分子化合物で親水性化したリポソームをも包含する。
本発明は、上記の親水性化化合物を用いて親水性化した糖鎖の結合していないリポソームそのものをも包含する。このような親水性化したリポソームは、リポソーム自体の安定性が高まり、また糖鎖を結合したときに糖鎖の認識性が高まるという利点がある。
本発明においては、上記のようにして作製したリポソームに、上記の糖鎖のいずれかを直接結合させてもよいし、さらに、糖鎖をリンカー蛋白質を介して結合させてもよい。この際、リポソームに結合させる糖鎖の種類は１種類に限らず、複数の糖鎖を結合させてもよい。この場合の複数の糖鎖は同じ組織または器官の細胞表面に共通して存在する異なるレクチンに対して結合活性を有する複数の糖鎖であってもよいし、異なる組織または器官の細胞表面に存在する異なるレクチンに対して結合活性を有する糖鎖であってもよい。前者のような複数の糖鎖を選択することにより、特定の標的組織または器官を確実に指向することができ、後者のような複数の糖鎖を選択することにより、１種類のリポソームに複数の標的を指向させることができ、マルチパーパスな標的指向性リポソームを得ることができる。
なお、糖鎖をリポソームに結合させるには、リポソームの製造時にリンカー蛋白質および／または糖鎖を混合し、リポソームを製造させつつ糖鎖をその表面に結合させることも可能であるが、あらかじめリポソーム、リンカー蛋白質および糖鎖を別途準備し、製造が完了したリポソームにリンカー蛋白質および／または糖鎖を結合させたほうが望ましい。これは、リポソームにリンカー蛋白質および／または糖鎖を結合させることにより、結合させる糖鎖の密度を制御できるからである。
糖鎖のリポソームへの直接結合は、以下に述べるような方法で行うことができる。
糖鎖を糖脂質として混合してリポソームを製造するか、製造後のリポソームのリン脂質に糖鎖を結合するとともに糖鎖密度を制御する。
リンカー蛋白質を用いて糖鎖を結合させる場合、リンカー蛋白質としては、例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）等の動物の血清アルブミンが挙げられるが、特にヒト血清アルブミンを使用する場合は、各組織に対する取り込みが多いことがマウスについての実験により確かめられている。
また、後述のように、本発明の標的指向性リポソームを医薬として用いる場合、該リポソームは医薬効果を有する化合物を含んでいる必要がある。該医薬効果を有する化合物は、リポソーム中に封入させるか、あるいはリポソーム表面に結合させればよい。
糖鎖をリンカー蛋白質を介してリポソームへ結合させるには以下に述べる方法で行えばよい。
まずリポソーム表面に蛋白質を結合させる。リポソームを、ＮａＩＯ４、Ｐｂ（Ｏ２ＣＣＨ３）４、ＮａＢｉＯ３等の酸化剤で処理して、リポソーム膜面に存在するガングリオシドを酸化し、次いで、ＮａＢＨ３ＣＮ、ＮａＢＨ４等の試薬を用いて、リンカー蛋白質とリポソーム膜面上のガングリオシドを、還元的アミノ化反応により結合させる。このリンカー蛋白質も、親水性化するのが好ましく、これにはリンカー蛋白質にヒドロキシ基を有する化合物を結合させるが、例えば、ビススルフォスクシニミヂルスベラート、ジスクシニミヂルグルタレート、ジチオビススクシニミヂルプロピオネート、ジスクシニミヂルスベラート、３，３’−ジチオビススルフォスクシニミヂルプロピオネート、エチレングリコールビススクシニミヂルスクシネート、エチレングリコールビススルフォスクシニミヂルスクシネート等の２価試薬を用いて、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンをリポソーム上のリンカー蛋白質と結合させればよい。
これを具体的に述べると、まず、リンカー蛋白質の全てのアミノ基に架橋用２価試薬の一端を結合する。そして、各種糖鎖の還元末端をグリコシルアミノ化反応して得られる糖鎖グリコシルアミン化合物を調製し、この糖鎖のアミノ基とリポソーム上の上記で結合された架橋２価試薬の一部分の他の未反応末端とを結合する。
次に、このようにして得られる糖鎖結合リポソーム膜面上蛋白質の表面に糖鎖が結合していない未反応で残っている大部分の２価試薬未反応末端を用いて親水性化処理を行う。つまり、このリポソーム上蛋白質に結合している２価試薬の未反応末端とトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン等の上述の親水性化に用いる化合物との結合反応を行い、リポソーム表面全体を親水性化する。
リポソーム表面およびリンカー蛋白質の親水性化は、各種組織への移行性、および血中における滞留性および各種組織への移行性を向上させる。これは、リポソーム表面およびリンカー蛋白質表面が親水性化されることによって、糖鎖以外の部分が、各組織等においてはあたかも生体内水分であるかのようにみえ、これにより、標的以外の組織等に認識されず、糖鎖のみがその標的組織のレクチン（糖鎖認識蛋白質）により認識されることに起因するものと思われる。
次いで、糖鎖をリポソーム上のリンカー蛋白質に結合させる。これには、糖鎖を構成する糖類の還元末端を、ＮＨ４ＨＣＯ３、ＮＨ２ＣＯＯＮＨ４等のアンモニウム塩を用いてグリコシルアミノ化し、次いで、ビススルフォスクシニミヂルスベラート、ジスクシニミヂルグルタレート、ジチオビススクシニミヂルプロピオネート、ジスクシニミヂルスベラート、３，３’−ジチオビススルフォスクシニミヂルプロピオネート、エチレングリコールビススクシニミヂルスクシネート、エチレングリコールビススルフォスクシニミヂルスクシネート等の２価試薬を用いて、リポソーム膜面上に結合したリンカー蛋白質と、上記グリコシルアミノ化された糖類とを結合させ、図１〜２２に示されるようなリポソームを得る。なお、これらの糖鎖は市販されている。
本発明のリポソームの粒径は、３０〜５００ｎｍ、好ましくは５０〜３００ｎｍ、さらに好ましくは７０〜１５０ｎｍである。また、ゼータ電位は、−５０〜１０ｍＶ、好ましくは−４０〜０ｍＶ、さらに好ましくは−３０〜−１０ｍＶである。本発明の医薬組成物に含まれるリポソーム製造の過程において、表面に何も結合していないリポソーム、親水性化されておらず糖鎖が結合したリポソーム、糖鎖が結合しておらず親水性化されたリポソームおよび親水性化され糖鎖が結合したリポソームの４つの態様のリポソームが存在し得るが、これらの４つの態様のリポソームが生理食塩水などの等張液において前記粒径の範囲およびゼータ電位の範囲に包含される。
さらに、糖鎖を結合させた場合の糖鎖の結合密度は、リポソームに結合させるリンカー蛋白質１分子当り１〜６０個、好ましくは１〜４０個、さらに好ましくは１〜２０個である。また、リポソーム１粒子当りは、リンカー蛋白質を用いる場合は、１〜３００００個、好ましくは１〜２００００個、さらに好ましくは１〜１００００個、あるいは１００〜３００００個、好ましくは１００〜２００００個、さらに好ましくは１００〜１００００個、あるいは５００〜３００００個、好ましくは５００〜２００００個、さらに好ましくは５００〜１００００個である。リンカー蛋白質を用いない場合は、リポソーム１粒子当り最高１〜５０００００個、好ましくは１〜３０００００個、さらに好ましくは１〜１０００００個以上の糖鎖を結合させることができる。
（２）本発明の標的指向性リポソームを含む炎症性疾患治療用組成物
本発明は、上記シアリルルイスＸ型糖鎖またはこれと同様にＥ−セレクチン、Ｐ−セレクチン等に反応することができる糖鎖を糖鎖の種類および密度を制御して表面に結合した標的指向性リポソームを含む炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物を包含する。さらに、本発明は親水性化化合物を用いて親水性化した糖鎖の結合していないリポソームを含む炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物を包含する。
本発明の、炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物が対象とする炎症性疾患としては、限定されないが、脳炎、炎症性眼疾患、耳炎、咽頭炎、肺炎、胃炎、腸炎、肝炎、膵炎、腎炎、膀胱炎、尿道炎、子宮体炎、膣炎、関節炎、末梢神経炎などの一般的炎症性疾患が挙げられ、さらに悪性腫瘍、感染性疾患、アレルギー性疾患、自己免疫疾患（リウマチ、全身性エリテマトーデス、サルコイドーシスなど）、虚血性疾患（心筋梗塞、脳梗塞など）、代謝性疾患（糖尿病、痛風など）、外傷・熱傷・化学腐食、神経変性疾患（アルツハイマー病など）などの続発的に炎症を引き起こす炎症性疾患が挙げられる。炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物が適応できる対象器官、組織も限定されず動物のあらゆる器官および組織を対象とし得る。また、炎症性眼疾患としては、限定されないが、ぶどう膜炎を含む内眼炎、糖尿病網膜症、血管新生黄斑症、アレルギー性結膜炎、眼窩および眼内腫瘍、視神経炎、強膜炎（後部強膜炎を含む）等が挙げられる。
本発明の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物が含む標的指向性リポソームは、炎症性疾患治療用の医薬効果を有する化合物を含み、それらの化合物は限定されないが、副腎皮質ホルモン、抗炎症薬、免疫抑制剤、抗がん剤、抗菌薬、抗ウイルス薬、血管新生抑制剤、サイトカインやケモカイン、抗サイトカイン抗体や抗ケモカイン抗体、抗サイトカイン・ケモカイン受容体抗体、ｓｉＲＮＡやＤＮＡなどの遺伝子治療関連の核酸製剤、神経保護因子等が挙げられる。
副腎皮質ホルモンとしては、コルチゾール、コルチゾン等の天然副腎皮質ホルモン（糖質コルチコイド）や、プレドニゾロン、リン酸プレドニゾロン、デキサメサゾン、リン酸デキサメサゾン、ベタメサゾン、フルオシノロンアセトニド、トリアムシノロンや等の合成副腎皮質ホルモンが挙げられる。また、その他の抗炎症薬として、アスピリンなどのサリチル酸類、インドメタシンなどのインドール酢酸誘導体、ジクロフェナク等のフェニル酢酸誘導体、メフェナム酸などのフェナム酢酸誘導体が挙げられる。さらに、エトドラク、メロキシカム、セレキシコブＲｏｆｅｃｏｘｉｂ，ＭＫ−０９６６等の選択的ＣＯＸ−２阻害剤も挙げられる。
本発明において、上述の薬剤にはその誘導体も包含される。
本発明の糖鎖修飾リポソームにこれらの薬剤を含ませて投与した場合、薬剤を単独で投与した場合に比較し、薬剤が炎症部位に集積する。単独投与の場合に比べ、２倍以上、好ましくは５倍以上、さらに好ましくは１０倍以上、特に好ましくは５０倍以上集積し得る。
これらの、化合物は、リポソーム中に封入されていても、リポソーム表面に結合していていもよいが、リポソーム中に封入されているのが望ましい。これらの化合物は、その化合物が有する官能基を利用することにより、公知の方法で、結合させることができる。
リポソーム内部への封入は、以下の方法により行う。リポソームへ薬剤等を封入するには、周知の方法を用いればよく、例えば、薬剤等の含有溶液とフォスファチジルコリン類、フォスファチジルエタノールアミン類、フォスファチジン酸類もしくは長鎖アルキルリン酸塩類、ガングリオシド類、糖脂質類もしくはフォスファチジルグリセロール類およびコレステロール類を含む脂質を用いてリポソームを形成することにより、薬剤等はリポソーム内に封入される。
本発明の医薬組成物は、シアリルルイスＸ型糖鎖またはこれと同様にＥ−セレクチン、Ｐ−セレクチン等に反応することができる糖鎖を糖鎖の種類および密度を制御して表面に結合した標的指向性リポソームまたは親水性化化合物を用いて親水性化した糖鎖の結合していないリポソームの他に薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤等を含んでいてもよい。本発明の医薬組成物は、種々の形態で投与することができる。このような投与形態としては、点眼剤等による点眼投与、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等による経口投与、あるいは注射剤、点滴剤、座薬などによる非経口投与を挙げることができる。かかる組成物は、公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤、賦形剤を含む。たとえば、錠剤用の担体、賦形剤としては、ゲル化剤、乳糖、ステアリン酸マグネシウムなどが使用される。注射剤は、本発明の糖鎖結合リポソームを通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製する。注射用の水性液としては、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが使用され、適当な溶解補助剤、たとえばアルコール、プロピレングリコールなどのポリアルコール、非イオン界面活性剤などと併用しても良い。油性液としては、ゴマ油、大豆油などが使用され、溶解補助剤としては安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用しても良い。
本発明の医薬組成物の投与経路は、限定されず、点眼、経口投与、静脈注射、筋肉注射等がある。投与量は、炎症性疾患の重篤度等により適宜決定できるが、本発明の組成物の医薬的に有効量を患者に投与する。ここで、「医薬的に有効量を投与する」とは、炎症性疾患を治療するのに適切なレベルの薬剤を患者に投与することをいう。本発明の医薬組成物の投与回数は適宜患者の症状に応じて選択される。
また、本発明の医薬組成物を診断用に用いる場合は、リポソームに蛍光色素、放射性化合物等の標識化合物を結合させる。該標識化合物結合リポソームが患部に結合し、標識化合物が患部細胞に取り込まれ、該標識化合物の存在を指標に疾患を検出・診断することができる。
さらに、本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【実施例１】
リポソームの調製
リポソームは既報の手法（Ｙａｍａｚａｋｉ，Ｎ．，Ｋｏｄａｍａ，Ｍ．ａｎｄ Ｇａｂｉｕｓ，Ｈ．−Ｊ．（１９９４）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２４２，５６−６５）により、改良型コール酸透析法を用いて調製した。すなわち、ジパルミトイルフォスファチジルコリン、コレステロール、ジセチルフォスフェート、ガングリオシド及びジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミンをモル比でそれぞれ３５：４０：５：１５：５の割合の合計脂質量４５．６ｍｇにコール酸ナトリウムを４６．９ｍｇ添加し、クロロホルム／メタノール溶液３ｍｌに溶解した。この溶液を蒸発させ、沈殿物を真空中で乾燥させることによって脂質膜を得た。得られた脂質膜をＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ８．４）３ｍｌに懸濁、超音波処理して、透明なミセル懸濁液を得た。さらに、ミセル懸濁液をＰＭ１０膜（ＡｍｉｃｏｎＣｏ．，ＵＳＡ）とＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）を用いた限外濾過にかけ均一リポソーム（平均粒径１００ｎｍ）１０ｍｌを調製した。
【実施例２】
リポソーム脂質膜面上の親水性化処理
実施例１で調製したリポソーム溶液１０ｍｌをＸＭ３００膜（Ａｍｉｃｏｎ Ｃｏ．，ＵＳＡ）とＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）を用いた限外濾過にかけ溶液のｐＨを８．５にした。次に、架橋試薬ｂｉｓ（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ）ｓｕｂｅｒａｔｅ（ＢＳ３；Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｏ．，ＵＳＡ）１０ｍｌを加え、２５℃で２時間攪拌した。その後、更に７℃で一晩攪拌してリポソーム膜上の脂質ジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミンとＢＳ３との化学結合反応を完結した。そして、このリポソーム液をＸＭ３００膜とＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）で限外濾過にかけた。次に、ＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）１ｍｌに溶かしたｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ ４０ｍｇをリポソーム液１０ｍｌに加えて、２５℃で２時間攪拌後、７℃で一晩攪拌してリポソーム膜上の脂質に結合したＢＳ３とｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅとの化学結合反応を完結した。これにより、リポソーム膜の脂質ジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミン上にｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅの水酸基が配位して水和親水性化された。
【実施例３】
リポソーム膜面上へのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の結合
既報の手法（Ｙａｍａｚａｋｉ，Ｎ．，Ｋｏｄａｍａ，Ｍ．ａｎｄ Ｇａｂｉｕｓ，Ｈ．−Ｊ．（１９９４）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２４２，５６−６５）により、カップリング反応法を用いて行った。すなわち、この反応は２段階化学反応で行い、まずはじめに、実施例２で得られた１０ｍｌのリポソーム膜面上に存在するガングリオシドを１ｍｌのＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ８．４）に溶かしたメタ過ヨウ素酸ナトリウム４３ｍｇを加えて室温で２時間攪拌して過ヨウ素酸酸化した後、ＸＭ３００膜とＰＢＳ緩衝液（ｐＨ８．０）で限外濾過することにより酸化されたリポソーム１０ｍｌを得た。このリポソーム液に、２０ｍｇのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を加えて２５℃で２時間攪拌し、次にＰＢＳ（ｐＨ８．０）に２Ｍ ＮａＢＨ３ＣＮ １００μｌを加えて１０℃で一晩攪拌してリポソーム上のガングリオシドとＨＳＡとのカップリング反応でＨＳＡを結合した。そして、ＸＭ３００膜とＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）で限外濾過をした後、ＨＳＡ結合リポソーム液１０ｍｌを得た。
【実施例４】
リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）上へのルイスＸ型三糖鎖、シアリルルイスＸ型四糖鎖、３’−シアリルラクトサミン三糖鎖、６’−シアリルラクトサミン三糖鎖、アルファ１，２マンノビオース二糖鎖、アルファ１，３マンノビオース二糖鎖、アルファ１，４マンノビオース二糖鎖、アルファ１，６マンノビオース二糖鎖、アルファ１，３アルファ１，６マンノトリオース三糖鎖、オリゴマンノース３五糖鎖、オリゴマンノース４ｂ六糖鎖、オリゴマンノース５七糖鎖、オリゴマンノース６八糖鎖、オリゴマンノース７九糖鎖、オリゴマンノース８十糖鎖またはオリゴマンノース９十一糖鎖の結合
ルイスＸ型三糖鎖（ＣａｌｂｉｏＣｈｅｍ Ｃｏ．，ＵＳＡ）５０μｇを０．２５ｇのＮＨ４ＨＣＯ３を溶かした０．５ｍｌ水溶液に加え、３７℃で３日間攪拌した後、０．４５μｍのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結してルイスＸ型三糖鎖のグリコシルアミン化合物５０μｇを得た。次に、実施例３で得たリポソーム液の一部分１ｍｌに架橋試薬３，３’−ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ（ＤＴＳＳＰ；Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｏ．，ＵＳＡ）１ｍｇを加えて２５℃で２時間、続いて７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）で限外濾過してＤＴＳＳＰがリポソーム上のＨＳＡに結合したリポソーム１ｍｌを得た。次に、このリポソーム液に上記のルイスＸ型三糖鎖のグリコシルアミン化合物５０μｇを加えて、２５℃で２時間攪拌し、その後７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のＤＴＳＳＰにルイスＸ型三糖鎖の結合を行った。その結果、図１で示されるルイスＸ型三糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリポソーム２ｍｌ（総脂質量２ｍｇ、総蛋白量２００μｇ、平均粒径１００ｎｍ）が得られた。他の糖鎖結合リポソームも用いる糖鎖を変えて同様の方法で作製した。これらの糖鎖結合リポソームは、図２から１６に示した。
【実施例５】
リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）上へのラクトース二糖鎖、２’−フコシルラクトース三糖鎖、ジフコシルラクトース四糖類、３−フコシルラクトース三糖鎖、３’−シアリルラクトース三糖鎖、６’−シアリルラクトース三糖鎖、３’−シアリルラクトサミン三糖鎖または６’−シアリルラクトサミン三糖鎖の結合（糖鎖結合量が異なるもの３種類）
ラクトース二糖鎖（Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｊａｐａｎ）（ １）５０μｇ、又は、２）２００μｇ、又は、３）１ｍｇ）を０．２５ｇのＮＨ４ＨＣＯ３を溶かした０．５ｍｌ水溶液に加え、３７℃で３日間攪拌した後、０．４５μｍのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結してラクトース二糖鎖のグリコシルアミン化合物５０μｇを得た。次に、実施例３で得たリポソーム液の一部分１ｍｌに架橋試薬３，３’−ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ（ＤＴＳＳＰ；Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｏ．，ＵＳＡ）１ｍｇを加えて２５℃で２時間、続いて７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）で限外濾過してＤＴＳＳＰがリポソーム上のＨＳＡに結合したリポソーム１ｍｌを得た。次に、このリポソーム液に上記のラクトース二糖鎖のグリコシルアミン化合物５０μｇを加えて、２５℃で２時間攪拌し、その後７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のＤＴＳＳＰにラクトース二糖鎖の結合を行った。その結果、糖鎖結合量が異なるもの３種類の図１７で示されるラクトース二糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリポソーム各２ｍｌ（総脂質量２ｍｇ、総蛋白量２００μｇ、平均粒径１００ｎｍ）が得られた。他の糖鎖結合リポソームも用いる糖鎖を変えて同様の方法で作製した。他の糖鎖結合リポソームの構造を図３、４および１８〜２２に示す。
【実施例６】
リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）上へのｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅの結合
比較試料としてのリポソームを調製するために、実施例３で得たリポソーム液の一部分１ｍｌに架橋試薬３，３’−ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ（ＤＴＳＳＰ；Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｏ．，ＵＳＡ）１ｍｇを加えて２５℃で２時間、続いて７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）で限外濾過してＤＴＳＳＰがリポソーム上のＨＳＡに結合したリポソーム１ｍｌを得た。次に、このリポソーム液にｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ（Ｗａｋｏ Ｃｏ．，Ｊａｐａｎ）１３ｍｇを加えて、２５℃で２時間攪拌し、その後７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のＤＴＳＳＰにｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅの結合を行った。その結果、図２５で示されるｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅとヒト血清アルブミンとリポソームとが結合した比較試料としてのリポソーム２ｍｌ（総脂質量２ｍｇ、総蛋白量２００μｇ、平均粒径１００ｎｍ）が得られた。
【実施例７】
リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）上の親水性化処理
実施例４または５の手段により調整されたリポソームについて、以下の手順によりリポソーム上のＨＳＡ蛋白質表面の親水性化処理を行った。糖鎖結合リポソーム２ｍｌに、ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ１３ｍｇを加えて、２５℃で２時間、その後７℃で一晩攪拌した後、ＸＭ３００膜とＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）で限外濾過し未反応物を除去して、最終産物である親水性化処理された糖鎖結合リポソーム複合体各２ｍｌ（総脂質量２ｍｇ、総蛋白量２００μｇ、平均粒径１００ｎｍ）を得た。
【実施例８】
各種の糖鎖結合リポソーム複合体によるレクチン結合活性阻害効果の測定
実施例５及び６の手段により調製した各１２種の糖鎖結合リポソーム複合体のｉｎ ｖｉｔｒｏでのレクチン結合活性は、常法（Ｙａｍａｚａｋｉ，Ｎ．（１９９９）Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ，１４，４９８−５０５）に従いレクチン固定化マイクロプレートを用いた阻害実験で測定した。すなわち、レクチン（Ｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｃｏ．，ＵＳＡ）を９６穴マイクロプレートに固化定した。このレクチン固定化プレートに、比較リガンドであるビオチン化したフコシル化フェチュイン０．１μｇとともに、濃度の異なる各種の糖鎖結合リポソーム複合体（蛋白質量として、０．０１μｇ、０．０４μｇ、０．１１μｇ、０．３３μｇ、１μｇ）を加え、４℃で２時間インキュベートした。ＰＢＳ（ｐＨ７．２）で３回洗浄した後、ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰＯ）結合ストレプトアビジンを添加し、さらに４℃で１時間インキュベート、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）で３回洗浄し、ペルオキシダーゼ基質を添加して室温で静置、４０５ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｃｏｒｐ．，ＵＳＡ）で測定した。フコシル化フェチュインのビオチン化は、ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ｂｉｏｔｉｎ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｏ．，ＵＳＡ）処理後、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−３０（Ａｍｉｃｏｎ Ｃｏ．，ＵＳＡ）により精製した。ＨＲＰＯ結合ストレプトアビジンは、ＨＲＰＯの酸化とＮａＢＨ３ＣＮを用いた還元アミノ化法によるストレプトアビジンの結合により調製した。この測定結果を表１から４に示す。
表中のリポソーム複合体の記号は、リポソームに以下の糖鎖が結合していることを示す。
ＬＸ：ルイスＸ型三糖鎖
ＳＬＸ：シアリルルイスＸ型四糖鎖
３ＳＬＮ：３’−シアリルラクトサミン三糖鎖
６ＳＬＮ：６’−シアリルラクトサミン三糖鎖
Ａ２：アルファ１，２マンノビオース二糖鎖
Ａ３：アルファ１，３マンノビオース二糖鎖
Ａ４：アルファ１，４マンノビオース二糖鎖
Ａ６：アルファ１，６マンノビオース二糖鎖
Ａ３６：アルファ１，３アルファ１，６マンノトリオース三糖鎖
Ｍａｎ３：オリゴマンノース３五糖鎖
Ｍａｎ４６：オリゴマンノース４ｂ六糖鎖
Ｍａｎ５：オリゴマンノース５七糖鎖
Ｍａｎ６：オリゴマンノース６八糖鎖
Ｍａｎ７：オリゴマンノース７九糖鎖
Ｍａｎ８：オリゴマンノース８十糖鎖
Ｍａｎ９：オリゴマンノース９十一糖鎖
ＬＡＣ：ラクトース二糖鎖
ＦＬ：２’−フコシルラクトース三糖鎖
ＤＦＬ：ジフコシルラクトース四糖類
ＦＬ：３−フコシルラクトース三糖鎖
３ＳＬ：３’−シアリルラクトース三糖鎖
６ＳＬ：６’−シアリルラクトース三糖鎖
３ＳＬＮ：３’−シアリルラクトサミン三糖鎖
６ＳＬＮ：６’−シアリルラクトサミン三糖鎖
表に示すように、各リポソームはレクチンとの結合活性を有しており、このことは糖鎖が結合していることを示している。
【実施例９】
ぶどう膜炎モデルマウスの作成
実験的ぶどう膜炎（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ Ｕｖｅｏｒｅｔｉｎｉｔｉｓ：以下ＥＡＵ）モデルマウスの作出には、以下の材料を用いた。
実験動物：Ｃ５７ＢＬ／６マウス（雌、８週齢）
接種抗原：ヒト網膜特異的蛋白ＩＲＢＰ（Ｉｎｔｅｒｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｒｅｔｉｎｏｉｄ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ）
合成ペプチド 配列 ＧＰＴＨＬＦＱＰＳＬＶＬＤＭＡＫＶＬＬＤ（１−２０）
アジュバンド：結核（Ｈ３７ＲＡ）死菌６ｍｇ／ｍｌ含有ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ ａｄｊｕｖａｎｔ（ＣＦＡ）
増幅効果剤：百日咳毒素（Ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ ｔｏｘｉｎ（ＰＴＸ））
ペプチド水溶液とアジュバントを容積比で１：１に混和し乳濁液として調製する。８週齢のＣ５７ＢＬ／６雌マウスに１匹あたり、足背皮下５０μｇ・鼠径部皮下５０μｇ、合計２００μｇ接種する。１匹あたり１００ｍｇの百日咳毒素を追加アジュバントとして腹腔内投与する。ＥＡＵ発症の程度は、０．５％トロピカミド・０．５％塩酸フェニレフリンにより瞳孔を散大させ眼底観察することにより評価した。
結果は図２４に提示する。ＥＡＵは投与１６日目をピークに発症した。
ペプチド投与後１６日目において炎症細胞が脈絡膜、網膜、硝子体腔に浸潤しているのが観察できる。
本方法でヒトの内眼炎モデルであるＥＡＵが作成されていることが確認された。
【実施例１０】
リポソームの生体内動態検討
投与リポソームは、上記実施例で作製した糖鎖結合リポソームのうち、シアリルルイスＸ糖鎖結合リポソーム（以下糖鎖＋リポソーム）および糖鎖の結合していないリポソーム（以下糖鎖−リポソーム）であった。
ＥＡＵマウスおよび正常マウスに対し、糖鎖＋リポソーム、糖鎖−リポソームをそれぞれ投与し、マウスの各臓器へのリポソームの集積を評価することを目的として行った。
ペプチド投与１６日目にＥＡＵ発症を確認したＥＡＵマウスおよび正常マウスを用意する。あらかじめ５０μｇ／ｍｌに調製したリポソーム溶液をマウスの尾静脈より静注し、静注後ヘパリン生食で脱血還流の後、全各臓器を摘出した。各臓器は１％ＴｒｉｔｏｎＸ溶液とＨＧ３０ホモゲナイザー（日立工機）を用いて組織ホモジネートとして調製の後、１００％メタノールとクロロホルムを用いて組織ホモジネートに含まれるリポソームを抽出した。リポソーム量は、リポソームに結合したＦＩＴＣの蛍光強度を蛍光マイクロプレートリーダーＢｉｏｌｕｍｉｎ９６０（モレキュラーダイナミック社）を用いて行い、４９０ｎｍのｅｘｉｔａｔｉｏｎと５２０ｎｍのｅｍｉｓｓｉｏｎで計測した。
リポソーム投与後、眼において集積の時間経過を調べた。その結果３０分をピークにして集積することが明らかとなった。従って、各臓器での集積検討はリポソーム投与３０分後に時間設定して行った。結果は図２５Ａおよび図２５Ｂに提示する。図２５Ａは集積量で示し、図２５Ｂは、正常マウスに対する相対値％で示す。まず、正常マウスでは各臓器において糖鎖＋リポソームと糖鎖−リポソームの集積に差は認めない。一方、ＥＡＵマウスの眼では糖鎖＋リポソームは正常マウスの眼の６倍の集積を認めた。しかし糖鎖−リポソームではＥＡＵマウスの眼への集積は正常マウスに比較し１．５倍にとどまっている。ＥＡＵマウスの眼以外の臓器においては糖鎖＋リポソームと糖鎖−リポソームの集積に著明な差は認めず、その値は正常マウスのそれと比較してもほぼ同程度であった。
炎症を起こした眼でのみリポソームの取り込みの増加を認めた。糖鎖−リポソームがＥＡＵマウスの眼で正常マウスの眼の１．５倍の取り込みを認めたのは血管内皮細胞間隙の拡大によるものと考えられる（ｐａｓｓｉｖｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ）。一方、糖鎖＋リポソームがＥＡＵマウスの眼で正常マウスの眼の６倍の集積（すなわち糖鎖−リポソームと比較して約４倍の集積）を認めたことは炎症部位に発現したＥ−セレクチン、Ｐ−セレクチンを標的としたためと考えられる（ａｃｔｉｖｅｔｒａｎｓｐｏｒｔ）。
【実施例１１】
リポソームの炎症部位への集積
炎症臓器（眼）のどの部位にリポソームの集積が生じるかを評価することを目的として行った。
ペプチド免疫後１６日目のＥＡＵ発症マウスの尾静脈よりリポソームを投与。３０分後にマウス眼球を摘出しそのままＯＣＴコンパウンドに包埋・凍結した。クライオトームを用いて６〜８ｕｍ凍結切片を作製しＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎ（カールツァイス社）を用いて観察した。
結果は図２６に提示する。ＥＡＵマウスに糖鎖＋リポソームを投与すると、投与後５分において強膜に集積が認められ、７分において脈絡膜の脈絡膜毛細管板に当たる部位に細い１筋の集積が認められる。投与後１０分ではその集積ラインが拡大しているのが観察できる。３０分では、集積ラインは薄まり、周囲の組織への蛍光物質の拡散が観察できる（図２６）。一方、糖鎖−リポソームでは集積ラインの形成は認められず、３０分においても明らかな蛍光物質の貯留、拡散は観察できない（図２６−Ｆ）。また、正常マウスにおいてはいずれのリポソームにおいても蛍光物質は確認できない（図２７）。
血管の最も豊富な脈絡膜毛細管板から糖鎖＋リポソームの集積が開始され、時間とともに周囲の組織に拡散していくというリポソームの炎症部位での動態があきらかとなった。これは糖鎖＋リポソームが炎症部位の血管に発現しているＥ−セレクチン、Ｐ−セレクチンを標的として集積し、その後、炎症により拡大した血管内皮細胞間隙を通って周囲組織に拡散していったものと考えることができる。一方、糖鎖−リポソームで明確な蛍光色素が観察できなかったのは、このリポソームの炎症部位への集積がｐａｓｓｉｖｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔであるため、糖鎖＋リポソームのように標的となって集積する部位がなく、個々ばらばらに組織に拡散していくためと考えられる。
【実施例１２】
Ｅ−セレクチン、Ｐ−セレクチンの発現
Ｅ−セレクチン、Ｐ−セレクチンがＥＡＵマウス眼において確かに発現しているのか、そしてその発現部位が糖鎖＋リポソームが最初に集積した集積ラインと一致しているかを確認することを目的として行った。
ＥＡＵ発症マウス、正常マウスを準備する。眼球摘出後４％グルタルアルデヒドで固定し３０％シュクロースＰＢＳで脱水した眼球をＯＣＴコンパウンドに包埋・凍結する。
（１）蛍光抗体法による検出：１４から１６μｍの凍結切片を用いて、ブロッキングの後、抗マウスＥ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ１次抗体（ポリクローナル抗体：ヤギ）を反応させる。ＦＩＴＣ結合の抗ヤギＩｇＧ二次抗体によりシグナルを検出した。
（２）酵素抗体法による検出：抗マウスＥ−ｓｅｌｅｃｔｉｎおよびＰ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ１次抗体（ポリクローナル抗体：ヤギ）による反応は蛍光抗体法と同様に行い、二次抗体反応は、ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ（登録商標）ＡＢＣ−ＡＰ ｋｉｔおよびＶｅｃｔｏｒ（登録商標）Ｒｅｄ Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｋｉｔ Ｉを用いて行った。
どちらの検出方法においても、免疫染色の特異性を確認するために、抗体を購入した会社からそれぞれの抗体作成に使用したペプチドを購入し、ブロッキングペプチドとして用い染色が消失するかいなかを確認した。
結果は図２８および２９に提示する。Ｅ−セレクチン、Ｐ−セレクチンともに糖鎖＋リポソームの集積ラインに一致した部位で強く発現していることが観察できた。また、使用した抗体に対する中和ペプチドにより染色が消失したことはこの免疫染色の特異性を示すものと考えられた。一方、正常マウスではＥ−セレクチン、Ｐ−セレクチンともに発現を認めなかった。
ＥＡＵマウスにおけるＥ−セレクチン、Ｐ−セレクチンの発現部位と糖鎖＋リポソームの集積部位が一致したことは、このリポソームの標的がＥ−セレクチン、Ｐ−セレクチンであるという理論を支持するものである。
【実施例１３】
Ｅ−セレクチンとＰ−セレクチンの抗体投与による糖鎖＋リポソームの集積阻害
糖鎖＋リポソームの標的分子が確かにＥ−セレクチンとＰ−セレクチンであることを示すことを目的として行った。
ＥＡＵ発症マウスの尾静脈より抗マウスＥ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ抗体２００μｇ、抗マウスＰ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ抗体２００μｇを同時投与し４時間待ち、受容体を中和する。コントロールとして、ＥＡＵ発症マウスの尾静脈より４００μｇのアイソタイプＩｇＧを投与したものを用意する。投与４時間後、糖鎖＋リポソームを尾静脈より投与し１０分後眼球摘出し凍結標本を作製する。６〜８μｍの凍結切片を作製しＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎを用いて、リガンド−受容体特異的結合が阻害されるか解析する。
結果を図３０に提示する。Ｅ−セレクチンとＰ−セレクチンの抗体を同時にＥＡＵマウスに投与することで糖鎖＋リポソームの集積を阻害することができた。アイソタイプＩｇＧの投与では集積を阻害することはできなかった。また、Ｅ−セレクチンとＰ−セレクチンのそれぞれの抗体単独投与では完全には集積を阻害することはできなかった。
この結果と、実施例１１で示した結果を併せて考えると、糖鎖＋リポソームの標的はＥ−セレクチンとＰ−セレクチンであると結論できる。
以上の実験結果より、シアリルルイスＸ糖鎖結合リポソームはＥ−セレクチンとＰ−セレクチンを多く発現している病巣部位特異的に薬剤をデリバーできることが示された。
実施例１４ リン酸プレドニゾロン封入リポソームの調製
（１） リン酸プレドニゾロン封入リポソームの調製と封入薬物定量と保存安定性
リポソームはコール酸透析法を用いて調製した。すなわち、ジパルミトイルフォスファチジルコリン、コレステロール、ジセチルフォスフェート、ガングリオシド及びジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミンをモル比でそれぞれ３５：４０：５：１５：５の割合で合計脂質量４５．６ｍｇになるように混合し、コール酸ナトリウム４６．９ｍｇ添加し、クロロホルム／メタノール溶液３ｍｌに溶解した。この溶液を蒸発させ、沈殿物を真空中で乾燥させることによって脂質膜を得た。得られた脂質膜をＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ８．４）３ｍｌに懸濁、超音波処理し、透明なミセル懸濁液３ｍｌを得た。このミセル懸濁液にＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）を加えて５ｍｌにしてから、更にＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ８．４）で２２５０ｍｇ／６ｍｌになるよう完全に溶解したリン酸プレドニゾロンを攪拌しながらゆっくりと滴下して均一に混合した後、このリン酸プレドニゾロン入りミセル懸濁液をＰＭ１０膜（ＡｍｉｃｏｎＣｏ．，ＵＳＡ）とＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ８．４）を用いた限外濾過にかけ均一なリン酸プレドニゾロン封入リポソーム１０ｍｌを調製した。得られた生理食塩懸濁液中（３７℃）のリン酸プレドニゾロン封入リポソーム粒子の粒子径とゼータ電位をゼータ電位・粒子径・分子量測定装置（Ｍｏｄｅｌ Ｎａｎｏ ＺＳ，Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ．，ＵＫ）により測定した結果、粒子径は５０〜３５０ｎｍ、ゼータ電位は−３０〜−１０ｍＶであった。このリポソームの封入薬物量を吸光度２６０ｎｍで測定するとおよそ２８０μｇ／ｍｌの濃度でリン酸プレドニゾロンが封入されていることがわかった。このリン酸プレドニゾロン封入リポソームは、冷蔵庫中に１年間保存した後にも沈殿や凝集を起こすことなく安定であった。
（２） リン酸プレドニゾロン封入リポソーム脂質膜面上の親水性化処理
（１）で調製したリン酸プレドニゾロン封入リポソーム溶液１０ｍｌをＸＭ３００膜（Ａｍｉｃｏｎ Ｃｏ．，ＵＳＡ）とＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）を用いた限外濾過にかけ溶液のｐＨを８．５にした。次に、架橋試薬ｂｉｓ（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ）ｓｕｂｅｒａｔｅ（ＢＳ３；Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｏ．，ＵＳＡ）１０ｍｌを加え、２５℃で２時間攪拌した。その後、更に７℃で一晩攪拌してリポソーム膜上の脂質ジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミンとＢＳ３との化学結合反応を完結した。そして、このリポソーム液をＸＭ３００膜とＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）で限外濾過にかけた。次に、ＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）１ｍｌに溶かしたｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ４０ｍｇをリポソーム液１０ｍｌに加えて、２５℃で２時間攪拌後、７℃で一晩攪拌してリポソーム膜上の脂質に結合したＢＳ３とｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅとの化学結合反応を完結した。これにより、抗癌剤ドキソルビシン封入リポソーム膜の脂質ジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミン上にｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅの水酸基が配位して水和親水性化された。
（３） リン酸プレドニゾロン封入リポソーム膜面上へのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の結合
既報の手法（Ｙａｍａｚａｋｉ，Ｎ．，Ｋｏｄａｍａ，Ｍ．ａｎｄ Ｇａｂｉｕｓ，Ｈ．−Ｊ．（１９９４）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２４２，５６−６５）により、カップリング反応法を用いて行った。すなわち、この反応は２段階化学反応で行い、まずはじめに、（２）で得られた１０ｍｌのリポソーム膜面上に存在するガングリオシドを１ｍｌのＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ８．４）に溶かしたメタ過ヨウ素酸ナトリウム４３ｍｇを加えて室温で２時間攪拌して過ヨウ素酸酸化した後、ＸＭ３００膜とＰＢＳ緩衝液（ｐＨ８．０）で限外濾過することにより酸化されたリポソーム１０ｍｌを得た。このリポソーム液に、２０ｍｇのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を加えて２５℃で２時間攪拌し、次にＰＢＳ（ｐＨ８．０）に２Ｍ ＮａＢＨ３ＣＮ １００μｌを加えて１０℃で一晩攪拌してリポソーム上のガングリオシドとＨＳＡとのカップリング反応でＨＳＡを結合した。そして、ＸＭ３００膜とＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）で限外濾過をした後、ＨＳＡ結合リン酸プレドニゾロン封入リポソーム液１０ｍｌを得た。
（４） リン酸プレドニゾロン封入リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）上へのシアリルルイスＸ型四糖鎖の結合とリンカー蛋白質（ＨＳＡ）の親水性化処理
シアリルルイスＸ型四糖鎖（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｏ．，ＵＳＡ）５０μｇを０．２５ｇのＮＨ４ＨＣＯ３を溶かした０．５ｍｌ水溶液に加え、３７℃で３日間攪拌した後、０．４５μｍのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結してシアリルルイスＸ型四糖鎖のグリコシルアミン化合物５０μｇを得た。次に、（３）で得たリン酸プレドニゾロン封入リポソーム液の一部分１ｍｌに架橋試薬３，３’−ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ）ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ（ＤＴＳＳＰ；Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｏ．，ＵＳＡ）１ｍｇを加えて２５℃で２時間、続いて７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）で限外濾過してＤＴＳＳＰがリポソーム上のＨＳＡに結合したリポソーム１ｍｌを得た。次に、このリポソーム液に上記のシアリルルイスＸ型四糖鎖のグリコシルアミン化合物５０μｇを加えて、２５℃で２時間攪拌し、その後７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のＤＴＳＳＰにシアリルルイスＸ型四糖鎖の結合を行った。次に、このリポソーム液にｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ（Ｗａｋｏ Ｃｏ．，Ｊａｐａｎ）１３ｍｇを加えて、２５℃で２時間攪拌し、その後７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のＤＴＳＳＰにｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅの結合を行った。その結果、ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅとヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリンカー蛋白質（ＨＳＡ）の親水性化処理をしたリポソームを得た。その結果、シアリルルイスＸ型四糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリンカー蛋白質（ＨＳＡ）の親水性化処理をしたリン酸プレドニゾロンン封入リポソーム２ｍｌ（総脂質量２ｍｇ、総蛋白量２００μｇ）が得られた。得られた生理食塩懸濁液中（３７℃）のリン酸プレドニゾロン封入リポソーム粒子の粒子径とゼータ電位をゼータ電位・粒子径・分子量測定装置（Ｍｏｄｅｌ Ｎａｎｏ ＺＳ，Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ．，ＵＫ）により測定した結果、粒子径は５０〜３５０ｎｍ、ゼータ電位は−３０〜−１０ｍＶであった。
（５） リン酸プレドニゾロン封入リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）上へのｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅの結合によるリンカー蛋白質（ＨＳＡ）の親水性化処理
比較試料としてのリン酸プレドニゾロン封入リポソーム（糖鎖を付けないもの）を調製するために、（３）で得たリン酸プレドニゾロン封入リポソーム液の一部分１ｍｌに架橋試薬３，３’−ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ）ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ（ＤＴＳＳＰ；Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｏ．，ＵＳＡ）１ｍｇを加えて２５℃で２時間、続いて７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）で限外濾過してＤＴＳＳＰがリポソーム上のＨＳＡに結合したリンカー蛋白質（ＨＳＡ）の親水性化処理リポソーム１ｍｌを得た。次に、このリポソーム液にｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ（Ｗａｋｏ Ｃｏ．，Ｊａｐａｎ）１３ｍｇを加えて、２５℃で２時間攪拌し、その後７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のＤＴＳＳＰにｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅの結合を行った。その結果、ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅとヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリンカー蛋白質（ＨＳＡ）の親水性化処理をした比較試料としてのリン酸プレドニゾロン封入リポソーム（糖鎖を付けないもの）２ｍｌ（総脂質量２ｍｇ、総蛋白量２００μｇ）が得られた。得られた生理食塩懸濁液中（３７℃）のリン酸プレドニゾロン封入リポソーム粒子（糖鎖を付けないもの）の粒子径とゼータ電位をゼータ電位・粒子径・分子量測定装置（Ｍｏｄｅｌ Ｎａｎｏ ＺＳ，Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ．，ＵＫ）により測定した結果、粒子径は５０〜３５０ｎｍ、ゼータ電位は−３０〜−１０ｍＶであった。
本実施例で作製したリポソームを以下の実施例１５および１６の検討に用いた。
実施例１５ 炎症部位への薬剤集積効果
ＥＡＵ発症マウスの各臓器におけるＥ−セレクチンの発現を検討することを目的として行った。
リン酸プレドニゾロン１ｍｇをマウス尾静脈から投与し、Ｅ−セレクチンの発現を認めた臓器において、１時間後の各臓器における単位重量あたりのプレドニゾロン濃度をＨＰＬＣにて測定した。次いで、今回開発したＥ−セレクチン標的指向性のシアリルルイスＸ糖鎖付きリポソーム（以下糖鎖付きリポソーム）にリン酸ブレドニゾロンを内包させたものを投与（リン酸プレドニゾロン合計５μｇ）し、１時間後の各臓器における単位重量あたりのプレドニゾロン濃度をＨＰＬＣにて測定した。
以下の結果が得られた。
１．ＥＡＵ発症マウスにおいては、眼以外に腸においてＥ−セレクチンの発現を認めた。それ以外の臓器には発現を認めなかった。
２．リン酸プレドニゾロンを単独で１ｍｇ投与した場合、眼には１００ｎｇ、腸には５００ｎｇ集積していた。一方、糖鎖付きリポソーム（リン酸プレドニゾロン合計５μｇ内包）を投与した場合、眼には２５ｎｇ、腸には２０００ｎｇ集積していた。
本実施例の結果は、リン酸プレドニゾロンを単独で１ｍｇ投与するのと同等の効果を炎症部位において得るのに、糖鎖付きリポソームを用いると、眼の炎症ではリン酸プレドニゾロン２０μｇで可能であり、腸ではわずか１．２５μｇで可能であることを示している。つまり、この糖鎖付きリポソームをデリバリーシステムとして用いると、眼では５０倍の、腸では８００倍の集積効果が得られることになる。
また、本実施例では、リン酸プレドニゾロンを投与して、測定はプレドニゾロンで測っている。リン酸プレドニゾロンは細胞内に取り込まれると、リン酸基が外れてプレドニゾロンになるので、今回の結果は、糖鎖付きリポソームで投与したリン酸プレドニゾロンが細胞内に取り込まれ、代謝されていることも同時に示している。
ＥＡＵ発症マウスの実験を総括すると、この糖鎖付きリポソームはＥ，Ｐ−セレクチンを選択的に標的としたものであり、最大８００倍の集積効果を発揮するという従来には見られなかった高精度の標的指向性を有することがあきらかとなった。また、この糖鎖付きリポソームに内包された薬剤が細胞内で代謝されていることも確認できた。以上より、本糖鎖付きリポソームを用いたドラッグデリバリーシステムは、いままでの臨床医学で用いられていた薬剤効果を得るのに、投与する薬剤量を数百分の一に減量することができ、最大限の薬剤効果と最小限の副作用を可能にするものであると結論できる。
実施例１６ 標的指向性リポゾームによるリュウマチ性関節炎の治療の検討
（１）ＲＡモデルマウスの作成
ＲＡマウスモデルとしてタイプＩＩコラーゲン誘導関節炎（Ｃｏｌｌａｇｅｎ ｔｙｐｅ ＩＩ ｉｎｄｕｃｅｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ以下ＣＩＡ）モデルを作成した。用いたマウス、試薬類は以下の通りである。
実験動物：ＤＢＡ／１Ｊマウス（８週齢、雄）
接種抗原：牛コラーゲン タイプＩＩ
アジュヴァント：結核死菌（Ｈ３７Ｒａ，２ｍｇ／ｍｌ）含有ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ ａｄｊｕｖａｎｔ（ＣＦＡ），結核死菌を含まないｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ ａｄｊｕｖａｎｔ（ＩＦＡ）
コラーゲン水溶液とＣＦＡを容積比２：１で混和し、１００μＬにコラーゲンを２００μｇ含有する乳濁液を調整、これをマウスの尾底部皮下へ注射した（Ｄａｙ０）。処置２１日後（Ｄａｙ２１）コラーゲン水溶液とＩＦＡを容積比２：１で混和し、１００μＬにコラーゲンを２００μｇ含有する乳濁液を調整し、再度マウス尾底部皮下へ注射した。
処置後３回／週の頻度でマウスの四肢を観察、以下の基準によりポイント化して炎症の定量化をした。それぞれの肢において、正常：０ポイント、軽度炎症又は発赤：１ポイント、重度発赤、腫脹又は使用の抑制：２ポイント、手掌、足底部及び関節部の変形：３ポイント（最低は０ポイント、最高で１２ポイントとなる。）このポイントを以下の式で処理してＩｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ａｃｔｉｖｉｔｙ（以下ＩＡ）を求めた。
Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ａｃｔｉｖｉｔｙ（％）＝四肢の全てのポイント数／１２ｘ１００
以下の結果が得られた。
Ｄａｙ２１から数日で後肢指に発赤が確認できるマウスが増加してきた。Ｄａｙ２８でマウスのＩＡは１６．７％に、Ｄａｙ３９で５０％に達した。図３１に炎症を起こしたマウスの四肢の写真を提示する。ＣＩＡマウス関節炎の所見は以下の通りである。Ａ：後肢指間関節の腫脹（第二指、矢印）、Ｂ：後肢指間関節の腫脹（第四指、矢印）、Ｃ：後肢指間関節の発赤（矢印）、Ｄ：正常後肢、Ｅ：前肢手関節の腫脹（矢印）、Ｆ：正常前肢
このように、上記方法によりＲＡマウスモデルとしてＣＩＡマウスが作成できた。
（２）ＲＡマウスをＤＤＳの静脈内投与により治療する実験
関節炎を起こしているマウスに治療薬を尾静脈から注射して治療が施行された。静脈注射はＤａｙ８からＤａｙ４６の期間で週２回の頻度であった。
Ｄａｙ２８で炎症所見のあるマウスを選び、それぞれの群の炎症ポイントの平均が同じになるように４群に分けた。それぞれの群は１）Ｃｏｎｔｒｏｌ：無治療群、２）ｆｒｅｅ Ｐｒｅｄ：リン酸プレドニゾロンを生理食塩に溶かした水溶液を使用し、リン酸プレドニゾロンの量が一回１００μｇ、週２００μｇ静脈注射した群、３）Ｌ−Ｐｒｅｄ：リン酸プレドニゾロンをリポゾームに包埋、糖鎖を付けないものを使用、リン酸プレドニゾロンの量が一回１０μｇ、週２０μｇ静脈注射した群、４）Ｌ−Ｐｒｅｄ−ＳＬＸ：リン酸プレドニゾロンをリポゾームに包埋、シアリルルイスＸ糖鎖を結合させたものを使用、リン酸プレドニゾロンの量が一回１０μｇ、週２０μｇ静脈注射した群、の４群であった。
この４群のマウスの数はＣｏｎｔｒｏｌ：６匹、ｆｒｅｅ Ｐｒｅｄ：７匹、Ｌ−Ｐｒｅｄ：８匹、Ｌ−Ｐｒｅｄ−ＳＬＸ：８匹であった。
以下の結果が得られた。Ｃｏｎｔｒｏｌでは経時的にＩＡが上昇し、Ｄａｙ４６の時点で６０％を突破した。ｆｒｅｅ ＰｒｅｄではＤａｙ３７でＩＡが約５０％に達した後平衡状態で推移した。Ｌ−ＰｒｅｄではＤａｙ３２からＩＡが上昇し始めＤａｙ４６では約４０％であった。Ｌ−Ｐｒｅｄ−ＳＬＸではＩＡの大きな上昇は観察されず、全経過を通して２０％以下であった（図３２）。
この結果より以下のことが判明した。
ｆｒｅｅ Ｐｒｅｄ群では静脈注射されたリン酸プレドニゾロン量１００μｇ／ｉｎｊｅｃｔｉｏｎでは炎症をコントロールするには不十分であり、Ｃｏｎｔｒｏｌ群と比してＩＡは明らかな差は観られなかった。Ｌ−Ｐｒｅｄ群では静注されたリン酸プレドニゾロン量はｆｒｅｅ Ｐｒｅｄ群の十分の一の１０μｇ／ｉｎｊｅｃｔｉｏｎであったが、ＩＡはｆｒｅｅ Ｐｒｅｄ群と同等かそれ以下であった。これはリン酸プレドニゾロンのリポゾーム化が薬剤の血中滞留性を向上させたことにより、薬効が向上した可能性があると思われた。Ｌ−Ｐｒｅｄ−ＳＬＸ群ではリン酸プレドニゾロン量は同様にｆｒｅｅ Ｐｒｅｄ群の十分の一の１０μｇ／ｉｎｊｅｃｔｉｏｎであったが、ＩＡは全く上昇せず炎症の進行は有意に抑制された。これはＬ−ＰｒｅｄとＬ−Ｐｒｅｄ−ＳＬＸの差、シアリルルイスＸ糖鎖の有無によってもたらされた効果と考えられた。つまりシアリルルイスＸ糖鎖によってリポゾームが効果的に炎症部位へ集積した可能性を示していると思われた。
当ＤＤＳは炎症部位へ極めて有効に治療薬を分配できる能力があることが証明された。これは炎症疾患の治療において病巣部に治療薬を集中させることにより、治療薬の持つ副作用を抑制または治療薬の薬効を増大せしめる可能性が示唆されたものである。
（３）ＲＡマウスをＤＤＳの経口投与により治療する実験
関節炎を起こしているマウスに治療薬を経口投与して治療が施行された。投与はＤａｙ２８からＤａｙ３９の期間で週３回の頻度であった。
Ｄａｙ２８で炎症所見のあるマウスを選び、それぞれの群の炎症ポイントの平均がほぼ同じになるように４群に分けた。それぞれの群は１）Ｃｏｎｔｒｏｌ：無治療群、２）ｆｒｅｅ Ｐｒｅｄ：リン酸プレドニゾロンを生理食塩に溶かした水溶液を使用し、リン酸プレドニゾロンの量が一回１００μｇ、週３００μｇ経口投与した群、３）Ｌ−Ｐｒｅｄ：リン酸プレドニゾロンをリポゾームに包埋、糖鎖を付けないものを使用、リン酸プレドニゾロンの量が一回１０μｇ、週３０μｇ経口投与した群、４）Ｌ−Ｐｒｅｄ−ＳＬＸ：リン酸プレドニゾロンをリポゾームに包埋、シアリルルイスＸ糖鎖を結合させたものを使用、リン酸プレドニゾロンの量が一回１０μｇ、週３０μｇ経口投与した群、の４群であった。
この４群のマウスの数はＣｏｎｔｒｏｌ：２匹、ｆｒｅｅ Ｐｒｅｄ：３匹、Ｌ−Ｐｒｅｄ：３匹、Ｌ−Ｐｒｅｄ−ＳＬＸ：４匹であった。
以下の結果が得られた。
ｆｒｅｅ Ｐｒｅｄ群はｆｅｅｄｉｎｇ ｎｅｅｄｌｅによる胃穿孔で死亡したためＤａｙ３２で実験中止された。Ｃｏｎｔｒｏｌ群、ｆｒｅｅ Ｐｒｅｄ群（Ｄａｙ３２まで）、Ｌ−Ｐｒｅｄ群ではＩＡに有意な差は観られなかった。Ｌ−Ｐｒｅｄ−ＳＬＸ群は炎症の進行を抑えることはできなかったが、Ｄａｙ３９でＬ−Ｐｒｅｄに比してＩＡは有意に低かった（図３３）。
この結果より以下のことが判明した。
Ｃｏｎｔｒｏｌ、ｆｒｅｅ ＰｒｅｄそしてＬ−Ｐｒｅｄの３群では有意な差がみられていない。これはｆｒｅｅ Ｐｒｅｄ群では経口投与されたリン酸プレドニゾロン３００μｇ／ｗｅｅｋの量が炎症の進行を抑制するのに不十分であったと推測された。またＬ−Ｐｒｅｄ群ではリポゾームが腸管で吸収されなかったか、吸収されても経口投与されたリン酸プレドニゾロンの量が３０μｇ／ｗｅｅｋであったことを考えると不十分な量であった可能性が高いと思われた。これに対してＬ−Ｐｒｅｄ−ＳＬＸ群ではＩＡが抑制されていた。これはリポゾームが腸管で吸収され、しかも経口投与リン酸プレドニゾロン量が３０μｇ／ｗｅｅｋであることを考えればリン酸プレドニゾロンが糖鎖付きリポゾームのまま炎症部位へ運ばれた可能性を示唆していると思われた。
この結果は当ＤＤＳが静脈内投与だけでなく、経口投与でも有効に機能することを示している。さらにリポゾームに包埋されれば、従来では経口吸収が不可能な薬物からでも経口投与可能な製剤がつくれる可能性を示唆するものである。
（４）ＲＡマウス治療においてリン酸プレドニゾロンの適量を求める実験
関節炎を起こしているマウスに治療薬を尾静脈から注射して治療が行われた。静脈注射はＤａｙ２８からＤａｙ４６の期間で週２回の頻度であった。
Ｄａｙ２８で炎症所見のあるマウスを選び、それぞれの群の炎症ポイントの平均がほぼ同じになるように３群に分けた。それぞれの群は１）Ｃｏｎｔｒｏｌ：無治療群、２）２５０μｇ：リン酸プレドニゾロンを生理食塩に溶かした水溶液を使用、リン酸プレドニゾロンの量が一回２５０μｇ、週５００μｇ静脈注射した群、３）５００μｇ：リン酸プレドニゾロンを生理食塩に溶かした水溶液を使用、リン酸プレドニゾロンの量が一回５００μｇ、週１０００μｇ静脈注射した群、の３群であった。
この３群のマウスの数はＣｏｎｔｒｏｌ：２匹、２５０μｇ：２匹、５００μｇ：２匹であった。
以下の結果が得られた。
Ｃｏｎｔｒｏｌ群と２５０μｇ群では有意な差は観られなかった。５００μｇ群ではＩＡの上昇が観られず、炎症の進行は抑制されていた（図３４）。
この結果より、以下のことが判明した。 当ＲＡマウスモデルで炎症の進行を抑制するためには最低５００μｇ／ｗｅｅｋより多く、１０００μｇ／ｗｅｅｋまでのリン酸プレドニゾロン量が要求されることが判明した。静脈注射による治療実験ではＬ−Ｐｒｅｄ−ＳＬＸ群が一回１０μｇ、週２０μｇのリン酸プレドニゾロン量で炎症の進行を抑制したことを考えると、当ＤＤＳでは最大５０分の一の薬物量で従来の治療効果と同様の効果を得ることができる可能性があると考えられた。
これは病巣部での薬剤濃度を維持しながら、全身への投与薬剤量を減らすことが可能で薬剤による副作用を減らすことができるし、また副作用が出現しない濃度まで薬剤の全身投与量を上げれば病巣部の薬剤濃度を上げることができ、さらに高い薬効をえることができる可能性を示している。
実施例１７ ２種類の親水性化処理を行ったリポソームの血中滞留性の検討
（１） リポソームの調製
リポソームはコール酸透析法を用いて調製した。すなわち、ジパルミトイルフォスファチジルコリン、コレステロール、ジセチルフォスフェート、ガングリオシド及びジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミンをモル比でそれぞれ３５：４０：５：１５：５の割合で合計脂質量４５．６ｍｇになるように混合し、コール酸ナトリウム４６．９ｍｇ添加し、クロロホルム／メタノール溶液３ｍｌに溶解した。この溶液を蒸発させ、沈殿物を真空中で乾燥させることによって脂質膜を得た。得られた脂質膜をＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ８．４）３ｍｌに懸濁、超音波処理し、透明なミセル懸濁液３ｍｌを得た。このミセル懸濁液にＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）を加えて５ｍｌにしてから、更にＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ８．４）で２２５０ｍｇ／６ｍｌになるよう完全に溶解したリン酸プレドニゾロンを攪拌しながらゆっくりと滴下して均一に混合した後、このリン酸プレドニゾロン入りミセル懸濁液をＰＭ１０膜（ＡｍｉｃｏｎＣｏ．，ＵＳＡ）とＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ８．４）を用いた限外濾過にかけ均一なリポソーム１０ｍｌを調製した。得られた生理食塩懸濁液中（３７℃）のリポソーム粒子の粒子径とゼータ電位をゼータ電位・粒子径・分子量測定装置（Ｍｏｄｅｌ Ｎａｎｏ ＺＳ，Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ．，ＵＫ）により測定した結果、粒子径は５０〜３５０ｎｍ、ゼータ電位は−３０〜−１０ｍＶであった。
（２） リポソーム脂質膜面上のｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅによる親水性化処理
（１）で調製したリポソーム溶液１０ｍｌをＸＭ３００膜（Ａｍｉｃｏｎ Ｃｏ．，ＵＳＡ）とＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）を用いた限外濾過にかけ溶液のｐＨを８．５にした。次に、架橋試薬ｂｉｓ（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ）ｓｕｂｅｒａｔｅ（ＢＳ３；Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｏ．，ＵＳＡ）１０ｍｌを加え、２５℃で２時間攪拌した。その後、更に７℃で一晩攪拌してリポソーム膜上の脂質ジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミンとＢＳ３との化学結合反応を完結した。そして、このリポソーム液をＸＭ３００膜とＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）で限外濾過にかけた。次に、ＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）１ｍｌに溶かしたｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ ４０ｍｇをリポソーム液１０ｍｌに加えて、２５℃で２時間攪拌後、７℃で一晩攪拌してリポソーム膜上の脂質に結合したＢＳ３とｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅとの化学結合反応を完結した。これにより、リポソーム膜の脂質ジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミン上にｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅの水酸基が配位して水和親水性化された。
（３） リポソーム脂質膜面上のセロビオースによる親水性化処理
（１）で調製したリポソーム溶液１０ｍｌをＸＭ３００膜（Ａｍｉｃｏｎ Ｃｏ．，ＵＳＡ）とＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）を用いた限外濾過にかけ溶液のｐＨを８．５にした。次に、架橋試薬ｂｉｓ（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ）ｓｕｂｅｒａｔｅ（ＢＳ３；Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｏ．，ＵＳＡ）１０ｍｌを加え、２５℃で２時間攪拌した。その後、更に７℃で一晩攪拌してリポソーム膜上の脂質ジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミンとＢＳ３との化学結合反応を完結した。そして、このリポソーム液をＸＭ３００膜とＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）で限外濾過にかけた。次に、ＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）１ｍｌに溶かしたセロビオース５０ｍｇをリポソーム液１０ｍｌに加えて、２５℃で２時間攪拌後、７℃で一晩攪拌してリポソーム膜上の脂質に結合したＢＳ３とセロビオースとの化学結合反応を完結した。これにより、リポソーム膜の脂質ジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミン上にセロビオースの水酸基が配位して水和親水性化された。
（４） ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ結合リポソーム膜面上へのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の結合
既報の手法（Ｙａｍａｚａｋｉ，Ｎ．，Ｋｏｄａｍａ，Ｍ．ａｎｄ Ｇａｂｉｕｓ，Ｈ．−Ｊ．（１９９４）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２４２，５６−６５）により、カップリング反応法を用いて行った。すなわち、この反応は２段階化学反応で行い、まずはじめに、（２）で得られた１０ｍｌのリポソーム膜面上に存在するガングリオシドを１ｍｌのＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ８．４）に溶かしたメタ過ヨウ素酸ナトリウム４３ｍｇを加えて室温で２時間攪拌して過ヨウ素酸酸化した後、ＸＭ３００膜とＰＢＳ緩衝液（ｐＨ８．０）で限外濾過することにより酸化されたリポソーム１０ｍｌを得た。このリポソーム液に、２０ｍｇのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を加えて２５℃で２時間攪拌し、次にＰＢＳ（ｐＨ８．０）に２Ｍ ＮａＢＨ３ＣＮ １００μｌを加えて１０℃で一晩攪拌してリポソーム上のガングリオシドとＨＳＡとのカップリング反応でＨＳＡを結合した。そして、ＸＭ３００膜とＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）で限外濾過をした後、ＨＳＡ結合リポソーム液１０ｍｌを得た。
（５） セロビオース結合リポソーム膜面上へのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の結合
既報の手法（Ｙａｍａｚａｋｉ，Ｎ．，Ｋｏｄａｍａ，Ｍ．ａｎｄ Ｇａｂｉｕｓ，Ｈ．−Ｊ．（１９９４）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２４２，５６−６５）により、カップリング反応法を用いて行った。すなわち、この反応は２段階化学反応で行い、まずはじめに、実施例３で得られた１０ｍｌのリポソーム膜面上に存在するガングリオシドを１ｍｌのＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ８．４）に溶かしたメタ過ヨウ素酸ナトリウム４３ｍｇを加えて室温で２時間攪拌して過ヨウ素酸酸化した後、ＸＭ３００膜とＰＢＳ緩衝液（ｐＨ８．０）で限外濾過することにより酸化されたリポソーム１０ｍｌを得た。このリポソーム液に、２０ｍｇのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を加えて２５℃で２時間攪拌し、次にＰＢＳ（ｐＨ８．０）に２Ｍ ＮａＢＨ３ＣＮ １００μｌを加えて１０℃で一晩攪拌してリポソーム上のガングリオシドとＨＳＡとのカップリング反応でＨＳＡを結合した。そして、ＸＭ３００膜とＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）で限外濾過をした後、ＨＳＡ結合リポソーム液１０ｍｌを得た。
（６） リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）上へのｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅの結合によるリンカー蛋白質（ＨＳＡ）の親水性化処理
親水性化試料の一つとしてのリポソームを調製するために、（４）で得たリポソーム液の一部分１ｍｌに架橋試薬３，３’−ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ）ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ（ＤＴＳＳＰ；Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｏ．，ＵＳＡ）１ｍｇを加えて２５℃で２時間、続いて７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）で限外濾過してＤＴＳＳＰがリポソーム上のＨＳＡに結合したリンカー蛋白質（ＨＳＡ）の親水性化処理リポソーム１ｍｌを得た。次に、このリポソーム液にｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ（Ｗａｋｏ Ｃｏ．，Ｊａｐａｎ）１３ｍｇを加えて、２５℃で２時間攪拌し、その後７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のＤＴＳＳＰにｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅの結合を行った。その結果、ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅとヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリンカー蛋白質（ＨＳＡ）の親水性化処理をした比較試料としてのリポソー２ｍｌ（総脂質量２ｍｇ、総蛋白量２００μｇ）が得られた。得られた生理食塩懸濁液中（３７℃）のリポソーム粒子の粒子径とゼータ電位をゼータ電位・粒子径・分子量測定装置（Ｍｏｄｅｌ Ｎａｎｏ ＺＳ，Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ．，ＵＫ）により測定した結果、粒子径は５０〜３５０ｎｍ、ゼータ電位は−３０〜−１０ｍＶであった。
（７） リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）上へのセロビオースの結合によるリンカー蛋白質（ＨＳＡ）の親水性化処理
親水性化試料の一つとしてのリポソームを調製するために、（５）で得たリポソーム液の一部分１ｍｌに架橋試薬３，３’−ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ）ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ（ＤＴＳＳＰ；Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｏ．，ＵＳＡ）１ｍｇを加えて２５℃で２時間、続いて７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）で限外濾過してＤＴＳＳＰがリポソーム上のＨＳＡに結合したリンカー蛋白質（ＨＳＡ）の親水性化処理リポソーム１ｍｌを得た。次に、このリポソーム液セロビオース３０ｍｇを加えて、２５℃で２時間攪拌し、その後７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のＤＴＳＳＰにセロビオースの結合を行った。その結果、セロビオースとヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリンカー蛋白質（ＨＳＡ）の親水性化処理をした親水性化試料の一つとしてのリポソーム２ｍｌ（総脂質量２ｍｇ、総蛋白量２００μｇ）が得られた。得られた生理食塩懸濁液中（３７℃）のリポソーム粒子の粒子径とゼータ電位をゼータ電位・粒子径・分子量測定装置（Ｍｏｄｅｌ Ｎａｎｏ ＺＳ，Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ．，ＵＫ）により測定した結果、粒子径は５０〜３５０ｎｍ、ゼータ電位は−３０〜−１０ｍＶであった。
（８） 親水性化処理をしてないリポソームの調製
リポソームはコール酸透析法を用いて調製した。すなわち、ジパルミトイルフォスファチジルコリン、コレステロール、ジセチルフォスフェート、ガングリオシド（糖脂質糖鎖としてＧＴ１ｂを１００％含むもの）をモル比でそれぞれ３５：４５：５：１５の割合で合計脂質量４５．６ｍｇになるように混合し、コール酸ナトリウム４６．９ｍｇ添加し、クロロホルム／メタノール溶液３ｍｌに溶解した。この溶液を蒸発させ、沈殿物を真空中で乾燥させることによって脂質膜を得た。得られた脂質膜をＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ８．４）３ｍｌに懸濁、超音波処理し、透明なミセル懸濁液３ｍｌを得た。このミセル懸濁液にＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）を加えて１０ｍｌにしてから、更にＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ８．４）で３ｍｇ／１ｍｌになるよう完全に溶解したドキソルビシンを攪拌しながらゆっくりと滴下して均一に混合した後、このドキソルビシン入りミセル懸濁液をＰＭ１０膜（ＡｍｉｃｏｎＣｏ．，ＵＳＡ）とＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ８．４）を用いた限外濾過にかけ均一な親水性化処理をしてないリポソーム粒子懸濁液１０ｍｌを調製した。得られた生理食塩懸濁液中（３７℃）の親水性化処理をしてないリポソーム粒子の粒子径とゼータ電位をゼータ電位・粒子径・分子量測定装置（Ｍｏｄｅｌ Ｎａｎｏ ＺＳ，Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ．，ＵＫ）により測定した結果、粒子径は５０〜３５０ｎｍ、ゼータ電位は−３０〜−１０ｍＶであった。
（９） クロラミンＴ法によるリポソームの１２５Ｉ標識
クロラミンＴ（Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｊａｐａｎ）溶液並びに二亜硫酸ナトリウム溶液をそれぞれ３ｍｇ／ｍｌ並びに５ｍｇ／ｍｌとなるように用事調製して用いた。実施例６から８において調製した３種のリポソームとを５０μｌずつ別々にエッペンチューブに入れ、続いて１２５Ｉ−ＮａＩ（ＮＥＮ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｏｄｕｃｔ，Ｉｎｃ．ＵＳＡ）を１５μｌ、クロラミンＴ溶液を１０μｌ加え反応させた。５分ごとにクロラミンＴ溶液１０μｌを加え、この操作を２回繰り返した後１５分後に還元剤として二亜硫酸ナトリウム１００μｌ加え、反応を停止させた。次に、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０（Ｐｈｒａｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｓｗｅｄｅｎ）カラムクロマト上に乗せ、ＰＢＳで溶出、標識体を精製した。最後に、非標識−リポソーム複合体を添加して比活性（４ｘ１０６Ｂｑ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）を調整して３種類の１２５Ｉ標識リポソーム液を得た。
（１０） 各種のリポソームの担癌マウスでの血中濃度の測定
Ｅｈｒｌｉｃｈ ａｓｃｉｔｅｓ ｔｕｍｏｒ（ＥＡＴ）細胞（約２×１０７個）を雄性ｄｄＹマウス（７週齢）大腿部皮下に移植し、癌組織が０．３〜０．６ｇに発育（６〜８日後）したものを本実験に用いた。この担癌マウスに（９）により１２５Ｉ標識した３種のリポソーム複合体０．２ｍｌを脂質量として３０μｇ／一匹の割合となるように尾静脈に注入投与し、５分後に血液を採取し、その放射能をガンマカウンタ（Ａｌｏｋａ ＡＲＣ ３００）で測定した。なお、血液への放射能分布量は、投与全放射能に対する血液１ｍｌ当たりの放射能の割合（％投与量／ｍｌ血液）で表示した。図３５に示すとおり、２種類の親水性化処理により血中滞留性が向上するが、とりわけトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンにより親水性化処理をしたリポソームの血中滞留性の向上が顕著であった。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
産業上の利用の可能性
本発明の炎症性疾患治療用標的指向性リポソームは、炎症性疾患部位に特異的に取り込まれ、リポソームに封入された炎症性疾患治療薬剤を放出する。本発明のリポソームは炎症性疾患に対するドラッグデリバリーシステムのための治療用または診断用薬剤としての効果を有する。
本発明のシアリルルイスＸ糖鎖等の糖鎖を結合したリポソームは、Ｅ，Ｐ−セレクチンを発現する病変部位に特異的に到達し、該部位で医薬効果を有する薬剤を放出するので、炎症性疾患治療用または診断用製剤として利用可能である。
実施例に示すように、本発明の炎症性疾患治療用標的指向性リポソームに抗炎症薬を封入して投与した場合、抗炎症薬を単独投与した場合に比較して、数十倍から数百倍の薬剤が炎症部位に集積し著しい効果を発揮することができる。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【技術分野】
本発明は、炎症性疾患に対するドラッグデリバリーシステムに関する。
【背景技術】
米国の国家ナノテク戦略（ＮＮＩ）によって実現を目指す具体的目標の一例として、「癌細胞や標的組織を狙い撃ちする薬物や遺伝子送達システム（ＤＤＳ：ドラッグデリバリーシステム）」を掲げた。日本の総合科学技術会議のナノテクノロジー・材料分野推進戦略でも、重点領域として「医療用極小システム・材料、生物のメカニズムを活用し制御するナノバイオロジー」があり、その５年間の研究開発目標の１つとして「健康寿命延伸のための生体機能材料・ピンポイント治療等技術の基本シーズ確立」が掲げられている。一方、高齢化社会となるに伴い癌の罹患率・死亡率は年々増えており、新規な治療材料である標的指向ＤＤＳの開発が待望されている。その他の病気においても副作用のない標的指向ＤＤＳナノ材料の重要性が注目されており、その市場規模は近い将来に１０兆円を超えると予測されている。また、これらの材料は治療とともに診断への利用においても期待されている。
医薬品の治療効果は、薬物が特定の標的部位に到達し、そこで作用することにより発現される。その一方で、医薬品による副作用とは、薬物が不必要な部位に作用してしまうことである。従って、薬物を有効かつ安全に使用するためにもドラッグデリバリーシステムの開発が求められている。その中でも特に標的指向（ターゲティング）ＤＤＳとは、薬物を「体内の必要な部位に」、「必要な量を」、「必要な時間だけ」送り込むといった概念である。そのための代表的な材料としての微粒子性キャリアーであるリポソームが注目されている。この粒子に標的指向機能をもたせるために、リポソームの脂質の種類、組成比、粒子径、表面電荷を変化させるなどの受動的ターゲティング法が試みられているが、いまだ本法は不十分であり更なる改良が求められている。
一方、高機能のターゲティングを可能にするために、能動的ターゲティング法も試みられている。これは”ミサイルドラッグ”ともよばれ理想的なターゲティング法であるが、国内外においていまだ完成されたものはなく今後の発展が大いに期待されているものである。本法は、リポソーム膜面上にリガンドを結合させ、標的組織の細胞膜面上に存在するレセプターに特異的に認識させることによって、積極的にターゲティングを可能にさせる方法である。この能動的ターゲティング法での標的となる細胞膜面上に存在するレセプターのリガンドとしては、抗原、抗体、ペプチド、糖脂質や糖蛋白質などが考えられる。これらのうち、糖脂質や糖蛋白質の糖鎖は、生体組織の発生や形態形成、細胞の増殖や分化、生体防御や受精機構、癌化とその転移機構などの様々な細胞間コミュニケーションにおいて情報分子としての重要な役割を果たしていることが明らかにされつつある。
また、その標的となる各組織の細胞膜面上に存在するレセプターとしてのセレクチン、ＤＣ−ＳＩＧＮ、ＤＣ−ＳＧＮＲ、コレクチン、マンノース結合レクチン等のＣ−タイプレクチン、シグレック等のＩタイプレクチン、マンノース−６−リン酸受容体などのＰタイプレクチン、Ｒタイプレクチン、Ｌタイプレクチン、Ｍタイプレクチン、ガレクチンなどの各種のレクチン（糖鎖認識蛋白質）についての研究も進んできたことから、各種の分子構造を有する糖鎖は新しいＤＤＳリガンドとして注目されてきている（ １）Ｙａｍａｚａｋｉ，Ｎ．，Ｋｏｊｉｍａ，Ｓ．，Ｂｏｖｉｎ，Ｎ．Ｖ．，Ａｎｄｒｅ，Ｓ．，Ｇａｂｉｕｓ，Ｓ．ａｎｄ Ｇａｂｉｕｓ，Ｈ．−Ｊ．（２０００）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．４３，２２５−２４４． ２）Ｙａｍａｚａｋｉ，Ｎ．，Ｊｉｇａｍｉ，Ｙ．，Ｇａｂｉｕｓ，Ｈ．−Ｊ．，Ｋｏｊｉｍａ，Ｓ（２００１）Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３，３１９−３２９．ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇａｋ．ｃｏ．ｊｐ／ＴＩＧＧ／７１ＰＤＦ／ｙａｍａｚａｋｉ．ｐｄｆ）。
外膜表面にリガンドを結合したリポソームについては、癌などの標的部位に選択的に薬物や遺伝子などを送達するためのＤＤＳ材料として多くの研究がなされてきた。しかしながら、それらは、生体外では標的細胞に結合するが、生体内では期待される標的細胞や組織にターゲティングされないものがほとんどである（ １）Ｆｏｒｓｓｅｎ，Ｅ．ａｎｄ Ｗｉｌｌｉｓ，Ｍ．（１９９８）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．２９，２４９−２７１． ２）高橋俊雄・橋田充編（１９９９）、今日のＤＤＳ・薬物送達システム、１５９−１６７頁、医薬ジャーナル社、大阪）。糖鎖の分子認識機能を利用したＤＤＳ材料の研究開発においても、糖鎖を有する糖脂質を導入したリポソームについて若干の研究が知られているが、それらの機能評価は生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）によるもののみであり、糖鎖を有する糖蛋白質を導入したリポソームの研究はほとんど進んでいない（ １）ＤｅＦｒｅｅｓ，Ｓ．Ａ．，Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，Ｌ．，Ｇｕｏ，Ｌ．ａｎｄ Ｚａｌｉｐｓｋｙ，Ｓ．（１９９６）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１８，６１０１−６１０４． ２）Ｓｐｅｖａｋ，Ｗ．，Ｆｏｘａｌｌ，Ｃ．，Ｃｈａｒｙｃｈ，Ｄ．Ｈ．，Ｄａｓｑｕｐｔａ，Ｆ．ａｎｄ Ｎａｇｙ，Ｊ．Ｏ．（１９９６）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３９，１０１８−１０２０． ３）Ｓｔａｈｎ，Ｒ．，Ｓｃｈａｆｅｒ，Ｈ．，Ｋｅｒｎｃｈｅｎ，Ｆ．ａｎｄ Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，Ｊ．（１９９８）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ８，３１１−３１９． ４）Ｙａｍａｚａｋｉ，Ｎ．，Ｊｉｇａｍｉ，Ｙ．，Ｇａｂｉｕｓ，Ｈ．−Ｊ．，Ｋｏｊｉｍａ，Ｓ（２００１）Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３，３１９−３２９．ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇａｋ．ｃｏ．ｊｐ／ＴＩＧＧ／７１ＰＤＦ／ｙａｍａｚａｋｉ．ｐｄｆ）。したがって、糖脂質や糖蛋白質の多種多様な糖鎖を結合したリポソームについての調製法と生体内動態（ｉｎ ｖｉｖｏ）解析を含めた体系的な研究は、これまで未開発で今後の進展が期待される重要課題である。
さらに新しいタイプのＤＤＳ材料研究として、投与が最も簡便・安価に行える経口投与で使用可能なＤＤＳ材料開発も重要課題である。たとえば、ペプチド性および蛋白質性医薬品などは一般的に水溶性で高分子量であり消化管の小腸粘膜透過性が低いため酵素分解を受けるなどにより経口投与してもほとんど腸管吸収されない。そこでこれらの高分子量の医薬品や遺伝子などを腸管から血液中へ送達するためのＤＤＳ材料としてリガンド結合リポソームの研究が注目されつつある（Ｌｅｈｒ，Ｃ．−Ｍ．（２０００）Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ６５，１９−２９）。しかしながら、これらのリガンドとして糖鎖を用いた腸管吸収制御性リポソームの研究は未だ報告されていない。
本発明者等は、既に、糖鎖がリンカー蛋白質を介してリポソーム膜に結合されており、糖鎖が、ルイスＸ型三糖鎖、シアリルルイスＸ型四糖鎖、３’−シアリルラクトサミン三糖鎖、６’−シアリルラクトサミン三糖鎖から選ばれたものであり、リポソーム膜および／またはリンカー蛋白質にトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン等の低分子親水化合物が任意に結合しており親水性化されていることを特徴とする糖鎖修飾リポソームおよびラクトース２糖鎖、２’−フコシルラクトース三糖鎖、ジフコシルラクトース四糖類および３−フコシルラクトース三糖鎖から選ばれた糖鎖により修飾されたリポソームであって、糖鎖がリンカー蛋白質を介してリポソームに結合していてもよい、腸管吸収性リポソームについて特許出願を行っている。
しかし、炎症性疾患に対して治療用または診断用薬剤を標的指向的に投薬するドラッグデリバリーシステムは開発されていなかった。
炎症性疾患の中でも、リュウマチ性関節炎（Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ，ＲＡ）は関節炎を中心とした種々の先進症状を伴う自己免疫疾患であり、その患者の数は日本で７０万人程度と言われている。この患者数は自己免疫疾患中で最大であり、ＲＡの治療改善は社会的に大きな貢献をもたらすことになると思われる。
ＲＡの発症には遺伝的要因（特定のＨＬＡなど）や環境要因（ｖｉｒｕｓの感染など）が関与していると考えられているが、詳細な発症機序は不明である。しかし炎症部位には関節のシノビュウムに存在するマクロプァージとＣＤ４＋，ＣＤ８＋，Ｔ細胞の存在が確認されており、このＴ細胞がシノビュウムに存在する抗原を認識していることがわかっている（Ｔ．Ｔｏｙｏｓａｋｉ，ｅｔ．ａｌ １９９８ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ ４１，９２−１００，Ｐ．Ｌ．ｖａｎ Ｌｅｎｔ，ｅｔ ａｌ．１９９６ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ ３９，１５４５−１５５５）。そしてこれら炎症に起因する細胞にはＩＬ−１、ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｔｉｃ ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ（以下ＴＮＦ−ａ）そしてＩＬ−６などのいわゆる炎症性サイトカインが深く関与していることが示唆されている（Ｓ．Ｓａｉｊｏ，ｅｔ ａｌ．２００２ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．４６，５３３−５４４． Ｄ．Ｋｏｎｔｏｙｉａｎｎｉｓ，ｅｔ ａｌ．１９９９ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １０，３８７−３９８． Ｔ．Ｏｈｔａｎｉ，ｅｔ ａｌ．２０００ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １２，９５−１０５．）。
近年ＲＡの治療はこれらの新しい知見をもとに大きく変わり始め、最大の進歩は生物学的製剤が開発されたことである。つまりＴＮＦ−ａｌｐｈａ（以下ＴＮＦ−ａ）に対する種々の抗体治療薬の出現である。これら抗体治療薬は関節炎に対して高い治療効果を有し、関節組織破壊抑制効果もある等、従来の治療薬とは一線を画する新薬である。しかしこれら新薬は一方において、感染症をはじめとする重篤な有害事象を起こしうることが報告されている。この副作用の原因の一つとしては関節という局所の炎症をコントロールするために、非特異的に全身に大量の抗ＴＮＦ−ａ抗体が投与されることに起因していると考えられる。
従来から使用されている薬剤も含め、革新的新薬といえども副作用を有する治療薬は病巣部位に特異的に分配され、病巣部位のみで有効性を発揮することが理想的である。このようなシステムは薬剤の副作用を減らし、かつ薬効をさらに引き上げることが可能で、現在最新薬剤として注目されている生物製剤や、分子標的薬の開発と同様に重要と考えられる。
【発明の開示】
炎症性疾患部位等の標的組織に集積し、局所的に薬剤や遺伝子を患部に送り込むための治療または診断用のドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）として利用できる標的指向性ＤＤＳナノ粒子の提供。具体的には、炎症部位の血管内皮細胞に発現するＥ−セレクチン、Ｐ−セレクチン等と結合しうる糖鎖を表面に結合させたドラッグデリバリー用の標的指向性リポソームの提供。
本発明者らは、先に表面に特定の糖鎖が結合したＤＤＳ用標的指向性リポソームを開発した。該標的指向性リポソームには、シアリルルイスＸ糖鎖（ｓＬｅＸ）が結合しており、腫瘍部位、炎症部位への移行性において高い効率を有していた。
本発明者らは、この標的指向性リポソームの炎症性疾患領域への応用について鋭意検討を行い、炎症性疾患モデル動物として、眼炎症モデルマウスを作出し、上記標的指向性リポソームが眼の炎症部位に指向的に取り込まれることを見出し本発明を完成させるに至った。
今回開発されたＤｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ（以下ＤＤＳ）は炎症部位へ特異的に集積し、効率的で副作用の少ない治療システムを可能にするものである。ステロイド剤は抗炎症薬としては最も一般的なため、これが実施例に用いられたが、治療薬はこれに限らず免疫抑制剤、サイトカイン、抗サイトカイン剤、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む核酸などの分配が可能である。
すなわち、本発明は以下の通りである。
１． 糖鎖がリポソーム膜に結合されている糖鎖修飾リポソームを含む炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
２． リポソームの構成脂質が、フォスファチジルコリン類（モル比０〜７０％）、フォスファチジルエタノールアミン類（モル比０〜３０％）、フォスファチジン酸類、長鎖アルキルリン酸塩類およびジセチルリン酸類からなる群から選択される１種以上の脂質（モル比０〜３０％）、ガングリオシド類、糖脂質類、フォスファチジルグリセロール類およびスフィンゴミエリン類からなる群から選択される１種以上の脂質（モル比０〜４０％）、ならびにコレステロール類（モル比０〜７０％）を含む、１記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
３． ガングリオシド類、糖脂質類、フォスファチジルグリセロール類、スフィンゴミエリン類およびコレステロール類からなる群から選択される少なくとも１種の脂質がリポソーム表面上で集合しラフトを形成している２記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
４． 糖鎖の種類および密度が制御されて結合されている、１から３のいずれかに記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
５． リポソームの粒径が３０〜５００ｎｍである、１から４のいずれかに記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
６． リポソームの粒径が５０〜３００ｎｍである、５記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
７． リポソームのゼータ電位が−５０〜１０ｍＶである、１から６のいずれか１項記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
８． リポソームのゼータ電位が−４０〜０ｍＶである、７記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
９． リポソームのゼータ電位が−３０〜−１０ｍＶである、８記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
１０． 糖鎖がリンカー蛋白質を介してリポソーム膜に結合されている、１から９のいずれかに記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
１１． リンカー蛋白質が生体由来蛋白質である１０記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
１２． リンカー蛋白質がヒト由来蛋白質である１１記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
１３． リンカー蛋白質がヒト由来血清蛋白質である１２記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
１４． リンカー蛋白質がヒト血清アルブミンまたはウシ血清アルブミンである１０記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
１５． リンカー蛋白質がリポソーム表面上に形成されているガングリオシド類、糖脂質類、フォスファチジルグリセロール類、スフィンゴミエリン類およびコレステロール類からなる群から選択される少なくとも１種の脂質からなるラフト上に結合している１から１４のいずれかに記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
１６． リポソーム膜および／またはリンカー蛋白質に親水性化合物が結合することにより親水性化されている、１から１５のいずれかに記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
１７． 親水性化合物が低分子物質である、１６記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
１８． 親水性化合物が糖鎖に対する立体障害となりにくく標的細胞膜面上のレクチンによる糖鎖分子認識反応の進行を妨げない、１６または１７記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
１９． 親水性化合物が水酸基を有する１６から１８のいずれかに記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
２０． 親水性化合物がアミノアルコール類である１６から１９のいずれかに記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
２１． 親水性化合物がリポソーム膜表面に直接結合している１６から２０のいずれかに記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
２２． 親水性化合物により親水性化され、該親水性化合物が、一般式（１）
Ｘ−Ｒ１（Ｒ２ＯＨ）ｎ 式（１）
で示される１６記載の糖鎖修飾リポソームであって、Ｒ１は、Ｃ１からＣ４０の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を示し、Ｒ２は存在しないかもしくはＣ１からＣ４０の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を示し、Ｘはリポソーム脂質またはリンカー蛋白質と直接または架橋用の二価試薬と結合する反応性官能基を示し、ｎは自然数を示す、炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
２３． 親水性化合物により親水性化され、該親水性化合物が、一般式（２）
Ｈ２Ｎ−Ｒ３−（Ｒ４ＯＨ）ｎ 式（２）
で示される１６記載の糖鎖修飾リポソームであって、Ｒ３は、Ｃ１からＣ４０の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を示し、Ｒ４は存在しないかもしくはＣ１からＣ４０の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を示し、Ｈ２Ｎはリポソーム脂質またはリンカー蛋白質と直接または架橋用の二価試薬と結合する反応性官能基を示し、ｎは自然数を示す、炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
２４． 親水性化合物により親水性化され、該親水性化合物が、一般式（３）
Ｈ２Ｎ−Ｒ５（ＯＨ）ｎ 式（３）
で示される１６記載の糖鎖修飾リポソームであって、Ｒ５は、Ｃ１からＣ４０の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を示し、Ｈ２Ｎはリポソーム脂質またはリンカー蛋白質と直接または架橋用の二価試薬と結合する反応性官能基を示し、ｎは自然数を示す、炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
２５． リポソーム膜および／またはリンカー蛋白質にトリス（ヒドロキシアルキル）アミノアルカンである親水性化合物を共有結合により結合させることによりリポソーム膜および／またはリンカー蛋白質が親水性化されている、１６記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
２６． リポソーム膜および／またはリンカー蛋白質にトリス（ヒドロキシメチル）アミノエタン、トリス（ヒドロキシエチル）アミノエタン、トリス（ヒドロキシプロピル）アミノエタン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、トリス（ヒドロキシエチル）アミノメタン、トリス（ヒドロキシプロピル）アミノメタン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノプロパン、トリス（ヒドロキシエチル）アミノプロパン、トリス（ヒドロキシプロピル）アミノプロパンからなる群から選択される親水性化合物を共有結合により結合させることによりリポソーム膜および／またはリンカー蛋白質が親水性化されている、１６記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
２７． 糖鎖修飾リポソームが、各組織の細胞膜面上に存在するレセプターとしてのセレクチン、ＤＣ−ＳＩＧＮ、ＤＣ−ＳＧＮＲ、コレクチンおよびマンノース結合レクチンを含むＣ−タイプレクチン、シグレックを含むＩタイプレクチン、マンノース−６−リン酸受容体を含むＰタイプレクチン、Ｒタイプレクチン、Ｌタイプレクチン、Ｍタイプレクチン、ガレクチンからなる群から選択されるレクチンを標的とする１から２６のいずれかに記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
２８． 糖鎖修飾リポソームがＥ−セレクチン、Ｐ−セレクチンおよびＬ−セレクチンからなる群から選択されるセレクチンを標的とする２７記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
２９． リポソームに結合した糖鎖の結合密度が、リポソームに結合させるリンカー蛋白質１分子当り１〜６０個である、１から２８のいずれかに記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
３０． リポソームに結合した糖鎖の結合密度が、リンカー蛋白質を用いる場合は、リポソーム１粒子当り１〜３００００個であり、リンカー蛋白質を用いない場合は、リポソーム１粒子当り最高１〜５０００００個である、１から２８のいずれかに記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
３１． 糖鎖がルイスＸ型三糖鎖、シアリルルイスＸ型四糖鎖、３’−シアリルラクトサミン三糖鎖、６’−シアリルラクトサミン三糖鎖、アルファ１，２マンノビオース二糖鎖、アルファ１，３マンノビオース二糖鎖、アルファ１，４マンノビオース二糖鎖、アルファ１，６マンノビオース二糖鎖、アルファ１，３アルファ１，６マンノトリオース三糖鎖、オリゴマンノース３五糖鎖、オリゴマンノース４ｂ六糖鎖、オリゴマンノース５七糖鎖、オリゴマンノース６八糖鎖、オリゴマンノース７九糖鎖、オリゴマンノース８十糖鎖、オリゴマンノース９十一糖鎖、ラクトース二糖鎖、２’−フコシルラクトース三糖鎖、ジフコシルラクトース四糖類、３−フコシルラクトース三糖鎖、３’−シアリルラクトース三糖鎖および６’−シアリルラクトース三糖鎖からなる群から選択される、１から３０のいずれかに記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
３２． 糖鎖修飾リポソームが含む薬剤が、副腎皮質ホルモン、抗炎症薬、免疫抑制剤、抗がん剤、抗菌薬、抗ウイルス薬、血管新生抑制剤、サイトカインやケモカイン、抗サイトカイン抗体や抗ケモカイン抗体、抗サイトカイン・ケモカイン受容体抗体、ｓｉＲＮＡやＤＮＡなどの遺伝子治療関連の核酸製剤、神経保護因子および抗体医薬からなる群から選択される１から３１のいずれかに記載の炎症性疾患治療用医薬組成物。
３３． 糖鎖修飾リポソームが含む薬剤が、副腎皮質ホルモンまたは抗炎症薬である３２記載の炎症性疾患治療用医薬組成物。
３４． 糖鎖修飾リポソームが含む薬剤がプレドニゾロンである３３記載の炎症性疾患治療用医薬組成物。
３５． 薬剤が、薬剤を単独投与した場合に比べ、炎症部位に１０倍以上多く集積し得る、３２から３４のいずれかに記載の炎症性疾患治療用医薬組成物。
３６． ．炎症性疾患が脳炎、炎症性眼疾患、耳炎、咽頭炎、肺炎、胃炎、腸炎、肝炎、膵炎、腎炎、膀胱炎、尿道炎、子宮体炎、膣炎、関節炎、末梢神経炎、悪性腫瘍、感染性疾患、リウマチ、全身性エリテマトーデス、サルコイドーシスなどの自己免疫疾患、心筋梗塞、脳梗塞などの虚血性疾患、糖尿病、痛風などの代謝性疾患、外傷・熱傷・化学腐食、アルツハイマー病などの神経変性疾患からなる群から選択される、１から３５のいずれかに記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
３７． 炎症性疾患が炎症性眼疾患である３６記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
３８． 炎症性疾患がリウマチである３６記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
３９． 炎症性疾患が腸炎である３６記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
４０． 経口投与用医薬組成物である、１から３９のいずれかに記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
４１． 非経口投与用医薬組成物である、１から３９のいずれかに記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
４２． リポソーム膜が親水性化されており、表面に糖鎖が結合していないリポソームを含む炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
４３． リポソームの構成脂質が、フォスファチジルコリン類（モル比０〜７０％）、フォスファチジルエタノールアミン類（モル比０〜３０％）、フォスファチジン酸類、長鎖アルキルリン酸塩類およびジセチルリン酸類からなる群から選択される１種以上の脂質（モル比０〜３０％）、ガングリオシド類、糖脂質類、フォスファチジルグリセロール類およびスフィンゴミエリン類からなる群から選択される１種以上の脂質（モル比０〜４０％）、ならびにコレステロール類（モル比０〜７０％）を含む、４２記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
４４． リポソームが、さらに蛋白質を含む４３記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
４５． リポソーム膜および／またはリンカー蛋白質に親水性化合物が結合することにより親水性化されている、４２から４４のいずれかに記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
４６． 親水性化合物が低分子物質である、４５記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
４７． 親水性化合物が水酸基を有する４５または４６に記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
４８． 親水性化合物がアミノアルコール類である４５から４７のいずれかに記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
４９． 親水性化合物がリポソーム膜表面に直接結合している４５から４８のいずれかに記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
５０． 親水性化合物により親水性化され、該親水性化合物が、一般式（１）
Ｘ−Ｒ１（Ｒ２ＯＨ）ｎ 式（１）
で示される４５記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物であって、Ｒ１は、Ｃ１からＣ４０の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を示し、Ｒ２は存在しないかもしくはＣ１からＣ４０の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を示し、Ｘはリポソーム脂質またはリンカー蛋白質と直接または架橋用の二価試薬と結合する反応性官能基を示し、ｎは自然数を示す、炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
５１． 親水性化合物により親水性化され、該親水性化合物が、一般式（２）
Ｈ２Ｎ−Ｒ３−（Ｒ４ＯＨ）ｎ 式（２）
で示される４５記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物であって、Ｒ３は、Ｃ１からＣ４０の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を示し、Ｒ４は存在しないかもしくはＣ１からＣ４０の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を示し、Ｈ２Ｎはリポソーム脂質またはリンカー蛋白質と直接または架橋用の二価試薬と結合する反応性官能基を示し、ｎは自然数を示す、炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
５２． 親水性化合物により親水性化され、該親水性化合物が、一般式（３）
Ｈ２Ｎ−Ｒ５（ＯＨ）ｎ 式（３）
で示される４５記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物であって、Ｒ５は、Ｃ１からＣ４０の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を示し、Ｈ２Ｎはリポソーム脂質またはリンカー蛋白質と直接または架橋用の二価試薬と結合する反応性官能基を示し、ｎは自然数を示す、炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
５３． リポソーム膜および／またはリンカー蛋白質にトリス（ヒドロキシアルキル）アミノアルカンである親水性化合物を共有結合により結合させることによりリポソーム膜および／またはリンカー蛋白質が親水性化されている、４５記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
５４． リポソーム膜および／またはリンカー蛋白質にトリス（ヒドロキシメチル）アミノエタン、トリス（ヒドロキシエチル）アミノエタン、トリス（ヒドロキシプロピル）アミノエタン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、トリス（ヒドロキシエチル）アミノメタン、トリス（ヒドロキシプロピル）アミノメタン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノプロパン、トリス（ヒドロキシエチル）アミノプロパン、トリス（ヒドロキシプロピル）アミノプロパンからなる群から選択される親水性化合物を共有結合により結合させることによりリポソーム膜および／またはリンカー蛋白質が親水性化されている、５３記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
５５． リポソームが含む薬剤が、副腎皮質ホルモン、抗炎症薬、免疫抑制剤、抗がん剤、抗菌薬、抗ウイルス薬、血管新生抑制剤、サイトカインやケモカイン、抗サイトカイン抗体や抗ケモカイン抗体、抗サイトカイン・ケモカイン受容体抗体、ｓｉＲＮＡやＤＮＡなどの遺伝子治療関連の核酸製剤、神経保護因子および抗体医薬からなる群から選択される４２から５４のいずれかに記載の炎症性疾患治療用医薬組成物。
５６． リポソームが含む薬剤が、副腎皮質ホルモンまたは抗炎症薬である５５記載の炎症性疾患治療用医薬組成物。
５７． リポソームが含む薬剤がプレドニゾロンである５６記載の炎症性疾患治療用医薬組成物。
５８． 薬剤が、薬剤を単独投与した場合に比べ、炎症部位に１０倍以上多く集積し得る、５５から５７のいずれかに記載の炎症性疾患治療用医薬組成物。
５９． 炎症性疾患が脳炎、炎症性眼疾患、耳炎、咽頭炎、肺炎、胃炎、腸炎、肝炎、膵炎、腎炎、膀胱炎、尿道炎、子宮体炎、膣炎、関節炎、末梢神経炎、悪性腫瘍、感染性疾患、リウマチ、全身性エリテマトーデス、サルコイドーシスなどの自己免疫疾患、心筋梗塞、脳梗塞などの虚血性疾患、糖尿病、痛風などの代謝性疾患、外傷・熱傷・化学腐食、アルツハイマー病などの神経変性疾患からなる群から選択される、４２から５８のいずれかに記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
６０． 炎症性疾患が炎症性眼疾患である５９記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
６１． 炎症性疾患がリウマチである５９記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
６２． 炎症性疾患が腸炎である５９記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
６３． 経口投与用医薬組成物である、４２から６２のいずれかに記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
６３． 非経口投与用医薬組成物である、４２から６２のいずれかに記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００３−２８５４２２、２００３−３６９４９４号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
図１は、ルイスＸ型三糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
図２は、シアリルルイスＸ型四糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
図３は、３’−シアリルラクトサミン三糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
図４は、６’−シアリルラクトサミン三糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
図５は、アルファ１，２マンノビオース二糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
図６は、アルファ１，３マンノビオース二糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
図７は、アルファ１，４マンノビオース二糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
図８は、アルファ１，６マンノビオース二糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
図９は、アルファ１，３アルファ１，６マンノトリオース三糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
図１０は、オリゴマンノース３五糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
図１１は、オリゴマンノース４ｂ六糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
図１２は、オリゴマンノース５七糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
図１３は、オリゴマンノース６八糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
図１４は、オリゴマンノース７九糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
図１５は、オリゴマンノース８十糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
図１６は、オリゴマンノース９十一糖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
図１７は、ラクトース二糖鎖により修飾されたリポソームの構造例を示す模式図である。
図１８は、２’−フコシルラクトース三糖鎖により修飾されたリポソームの構造例を示す模式図である。
図１９は、ジフコシルラクトース四糖鎖により修飾されたリポソームの構造例を示す模式図である。
図２０は、３−フコシルラクトース三糖鎖により修飾されたリポソームの構造例を示す模式図である。
図２１は、３’−シアリルラクトース三糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
図２２は、６’−シアリルラクトース三糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
図２３は、比較試料としてのｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅを結合したリポソームの模式図である。
図２４は、実験的ぶどう膜炎発症を示す写真である。
図２５Ａは、リポソームの臓器別分布を示す図である。
図２５Ｂは、リポソームの臓器別分布を示す図であり、正常マウスに対する相対値％で示した図である。
図２６は、リポソーム分布の時間経過を示す写真である。
図２７は、正常マウスおよびＥＡＵマウスでのリポソーム分布を示す写真である。
図２８は、蛍光抗体法による検出の結果を示す写真である。
図２９は、酵素抗体法による検出の結果を示す写真である。
図３０は、結合阻害実験の結果を示す写真である。
図３１は、炎症を起こしたＲＡマウスの四肢の写真である。
図３２は、ＲＡマウスに対するプレドニゾロン包埋ＤＤＳ静脈投与による治療の結果を示す図である。
図３３は、ＲＡマウスに対するプレドニゾロン包埋ＤＤＳ経口投与による治療の結果を示す図である。
図３４は、ＲＡマウスに対する適切量のプレドニゾロン投与による治療の結果を示す図である。
図３５は、２種類の親水性化処理を行ったリポソームと未処理のリポソームの担癌マウス尾静注投与５分後の血中滞留性の比較結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
本発明は、炎症性疾患の病巣部位に標的指向性を有し、病巣部位に特異的に取り込まれ、病巣部位で封入された薬剤を放出し、病巣を治療しうる標的指向性リポソームである。
炎症時に血管内皮細胞に発現するＥ−セレクチン、Ｐ−セレクチンと白血球の細胞膜上に発現している糖鎖であるシアリルルイスＸが強く結合することが知られている。本リポソームはこのシアリルルイスＸ糖鎖またはこれと同様にＥ−セレクチン、Ｐ−セレクチン等に反応することができる糖鎖が糖鎖の種類と密度が制御されて結合しているリポソームであり、血管内皮細胞がＥ−セレクチン、Ｐ−セレクチン等を発現している病巣部位に特異的に集積すると考えられる。またＥ−セレクチン、Ｐ−セレクチン等を発現している部位は炎症や血管新生が生じている部位であり、そのような部位の血管は内皮細胞の細胞間隙が拡大しており、集積したリポソームがその隙間から病巣部位およびその周囲に拡散するものと考えられる。拡散したリポソームは病巣部位およびその周囲の各種細胞に取り込まれ（ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ）、細胞内で内包している薬剤を放出する。このようなメカニズムで炎症性疾患に効果を発揮する。
本発明のリポソームに結合させる糖鎖として、上述のようにＥ−セレクチン、Ｐ−セレクチン等に反応することができる糖鎖が挙げられる。ここで、Ｅ−セレクチン、Ｐ−セレクチン等とは、セレクチン、ＤＣ−ＳＩＧＮ、ＤＣ−ＳＧＮＲ、コレクチン、マンノース結合レクチン等のＣ−タイプレクチン、シグレック等のＩタイプレクチン、マンノース−６−リン酸受容体などのＰタイプレクチン、Ｒタイプレクチン、Ｌタイプレクチン、Ｍタイプレクチン、ガレクチンなどの各種のレクチン（糖鎖認識蛋白質）をいう。このような糖鎖は限定されないが、例えば、ルイスＸ型三糖鎖（構造式を図１に示す。以下、同様）、シアリルルイスＸ型四糖鎖（図２）、３’−シアリルラクトサミン三糖鎖（図３）、６’−シアリルラクトサミン三糖鎖（図４）、アルファ１，２マンノビオース二糖鎖（図５）、アルファ１，３マンノビオース二糖鎖（図６）、アルファ１，４マンノビオース二糖鎖（図７）、アルファ１，６マンノビオース二糖鎖（図８）、アルファ１，３アルファ１，６マンノトリオース三糖鎖（図９）、オリゴマンノース３五糖鎖（図１０）、オリゴマンノース４ｂ六糖鎖（図１１）、オリゴマンノース５七糖鎖（図１２）、オリゴマンノース６八糖鎖（図１３）、オリゴマンノース７九糖鎖（図１４）、オリゴマンノース８十糖鎖（図１５）、オリゴマンノース９十一糖鎖（図１６）、ラクトース二糖鎖（図１７）、２’−フコシルラクトース三糖鎖（図１８）、ジフコシルラクトース四糖類（図１９）、３−フコシルラクトース三糖鎖（図２０）、３’−シアリルラクトース三糖鎖（図２１）および６’−シアリルラクトース三糖鎖（図２２）が挙げられる。
（１） 標的指向性リポソームの作製
リポソームとは、通常、膜状に集合した脂質層および内部の水層から構成される閉鎖小胞を意味する。本発明のリポソームは、図１〜２２に示されるように、その表面すなわち脂質層に糖鎖が、結合している。糖鎖は直接リポソームの脂質層に結合していてもよいし、ヒト血清アルブミンのようなリンカー蛋白質を介して、共有結合していてもよい。
本発明のリポソームを構成する脂質としては、例えば、フォスファチジルコリン類、フォスファチジルエタノールアミン類、フォスファチジン酸類もしくは長鎖アルキルリン酸塩類、ガングリオシド類、糖脂質類もしくはフォスファチジルグリセロール類、コレステロール類等が挙げられ、フォスファチジルコリン類としては、ジミリストイルフォスファチジルコリン、ジパルミトイルフォスファチジルコリン、ジステアロイルフォスファチジルコリン等が、また、フォスファチジルエタノールアミン類としては、ジミリストイルフォスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルフォスファチジルエタノールアミン等が、フォスファチジン酸類もしくは長鎖アルキルリン酸塩類としては、ジミリストイルフォスファチジン酸、ジパルミトイルフォスファチジン酸、ジステアロイルフォスファチジン酸、ジセチルリン酸等が、ガングリオシド類としては、ガングリオシドＧＭ１、ガングリオシドＧＤ１ａ、ガングリオシドＧＴ１ｂ等が、糖脂質類としては、ガラクトシルセラミド、グルコシルセラミド、ラクトシルセラミド、フォスファチド、グロボシド等が、フォスファチジルグリセロール類としては、ジミリストイルフォスファチジルグリセロール、ジパルミトイルフォスファチジルグリセロール、ジステアロイルフォスファチジルグリセロール等が好ましい。このうち、フォスファチジン酸類もしくは長鎖アルキルリン酸塩類、ガングリオシド類もしくは糖脂質類、コレステロール類はリポソームの安定性を上昇させる効果を有するので、構成脂質として添加するのが望ましい。
例えば、本発明のリポソームを構成する脂質として、フォスファチジルコリン類（モル比０〜７０％）、フォスファチジルエタノールアミン類（モル比０〜３０％）、フォスファチジン酸類もしくは長鎖アルキルリン酸塩（モル比０〜３０％）、ガングリオシド類、糖脂質類もしくはフォスファチジルグリセロール鎖（モル比０〜４０％）、およびコレステロール類（モル比０〜７０％）を含むものが挙げられる。
リポソーム自体は、周知の方法に従い製造することができるが、これには、薄膜法、逆層蒸発法、エタノール注入法、脱水−再水和法等を挙げることができる。
また、超音波照射法、エクストルージョン法、フレンチプレス法、ホモジナイゼーション法等を用いて、リポソームの粒子径を調節することも可能である。本発明のリポソーム自体の製法について、具体的に述べると、例えば、まず、フォスファチジルコリン類、コレステロール、フォスファチジルエタノールアミン類、フォスファチジン酸類、ガングリオシド類、糖脂質類もしくはフォスファチジルグリセロール類を配合成分とする脂質と界面活性剤コール酸ナトリウムとの混合ミセルを調製する。
とりわけ、フォスファチジルエタノールアミン類の配合は親水性化反応部位として、ガングリオシド類または糖脂質類またはフォスファチジルグリセロール類の配合はリンカー蛋白質の結合部位として必須のものである。そして、これにより得られる混合ミセルの限外濾過を行うことによりリポソームを作製する。
本発明において使用するリポソームは、通常のものでも使用できるが、その表面は親水性化されていることが望ましい。上述のようにしてリポソームを作製した後にリポソーム表面を親水性化する。リポソーム表面の親水性化は、リポソーム表面に親水性化合物を結合させることにより行う。親水性化に用いる化合物としては、低分子の親水性化合物、好ましくは少なくとも１つのＯＨ基を有する低分子の親水性化合物、さらに好ましくは、少なくとも２つのＯＨ基を有する低分子の親水性化合物が挙げられる。また、さらに少なくとも１つのアミノ基を有する低分子の親水性化合物、すなわち分子中に少なくとも１つのＯＨ基と少なくとも１つのアミノ基を有する親水性化合物が挙げられる。親水性化合物は、低分子なので、糖鎖に対する立体障害となりにくく標的細胞膜面上のレクチンによる糖鎖分子認識反応の進行を妨げることはない。また、親水性化合物には、本発明の糖鎖修飾リポソームにおいて、レクチン等の特定の標的を指向するために用いられるレクチンが結合し得る糖鎖は含まれない。このような親水性化合物として、例えば、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンなどを含むトリス（ヒドロキシアルキル）アミノアルカン等のアミノアルコール類等が挙げられ、さらに具体的には、トリス（ヒドロキシメチル）アミノエタン、トリス（ヒドロキシエチル）アミノエタン、トリス（ヒドロキシプロピル）アミノエタン、トリス（ヒドロキシスチル）アミノメタン、トリス（ヒドロキシエチル）アミノメタン、トリス（ヒドロキシプロピル）アミノメタン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノプロパン、トリス（ヒドロキシエチル）アミノプロパン、トリス（ヒドロキシプロピル）アミノプロパン等が挙げられる。さらに、ＯＨ基を有する低分子化合物にアミノ基を導入した化合物も本発明の親水性化合物として用いることができる。該化合物は限定されないが、例えば、セロビオース等のレクチンが結合しない糖鎖にアミノ基を導入した化合物が挙げられる。例えば、リポソーム膜の脂質フォスファチジルエタノールアミン上に架橋用の２価試薬とトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンとを用いてリポソーム表面を親水性化する。親水性化合物の一般式は、下記式（１）、式（２）、式（３）等で示される。
Ｘ−Ｒ１（Ｒ２ＯＨ）ｎ式（１）
Ｈ２Ｎ−Ｒ３−｛Ｒ４ＯＨ）ｎ式（２）
Ｈ２Ｎ−Ｒ５（ＯＨ）ｎ式（３）
ここで、Ｒ１、Ｒ３およびＲ５は、Ｃ１からＣ４０、好ましくはＣ１からＣ２０、さらに好ましくはＣ１からＣ１０の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を示し、Ｒ２、Ｒ４は存在しないかもしくはＣ１からＣ４０、好ましくはＣ１からＣ２０、さらに好ましくはＣ１からＣ１０の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を示す。Ｘはリポソーム脂質と直接または架橋用の二価試薬と結合する反応性官能基を示し、例えば、ＣＯＯＨ、ＮＨ、ＣＨ２、ＣＨＯ、ＳＨ、ＮＨＳ−エステル、マレイミド、イミドエステル、活性ハロゲン、ＥＤＣ、ピリジルジスルフィド、アジドフェニル、ヒドラジド等が挙げられる。ｎは自然数を示す。
リポソームの親水性化は、従来公知の方法、例えば、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、無水マレイン酸共重合体等を共有結合により結合させたリン脂質を用いてリポソームを作成する方法（特開２０００−３０２６８５号）等の方法を採用することによっても行うことができる。
このうち、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを用いてリポソーム表面を親水性化することが特に好ましい。
本発明のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン等の低分子親水性化合物を用いる手法は、ポリエチレングリコールなどを用いる従来の親水性化方法と比較していくつかの点で好ましい。例えば、本発明のように糖鎖をリポソーム上に結合してその分子認識機能を標的指向性に利用するものでは、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン等の低分子親水化合物は低分子量物質であるので従来のポリエチレングリコールなどの高分子量物質を用いる方法に比べて、糖鎖に対する立体障害となりにくく標的細胞膜面上のレクチン（糖鎖認識蛋白質）による糖鎖分子認識反応の進行を妨げないので特に好ましい。
また、本発明によるリポソームは該親水性化処理後においても粒径分布や成分組成、分散特性が良好であり、長時間の保存性や生体内安定性も優れているのでリポソーム製剤化して利用するために好ましい。
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン等の低分子親水性化合物を用いてリポソーム表面を親水性化するには、例えばジミリストイルフォスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルフォスファチジルエタノールアミン等の脂質を用いて、常法により得たリポソーム溶液にビススルフォスクシニミヂルスベラート、ジスクシニミヂルグルタレート、ジチオビススクシニミヂルプロピオネート、ジスクシニミヂルスベラート、３，３’−ジチオビススルフォスクシニミヂルプロピオネート、エチレングリコールビススクシニミヂルスクシネート、エチレングリコールビススルフォスクシニミヂルスクシネート等の２価試薬を加えて反応させることにより、リポソーム膜上のジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミン等の脂質に２価試薬を結合させ、次いでトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを、該２価試薬の一方の結合手と反応させることにより、リポソーム表面にトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを結合せしめる。
リポソーム表面に親水性化合物を結合させる場合、リポソーム１粒子当り１〜５０００００分子、好ましくは１〜５００００分子である。
このように、リポソームを親水性化処理したリポソームは、生体内で極めて安定であり、後述のように標的指向性を有する糖鎖を結合しなくても、生体内での半減期が長いためドラッグデリバリーシステムにおけるドラッグ担体として好適に用いることができる。本発明は、表面を低分子化合物で親水性化したリポソームをも包含する。
本発明は、上記の親水性化化合物を用いて親水性化した糖鎖の結合していないリポソームそのものをも包含する。このような親水性化したリポソームは、リポソーム自体の安定性が高まり、また糖鎖を結合したときに糖鎖の認識性が高まるという利点がある。
本発明においては、上記のようにして作製したリポソームに、上記の糖鎖のいずれかを直接結合させてもよいし、さらに、糖鎖をリンカー蛋白質を介して結合させてもよい。この際、リポソームに結合させる糖鎖の種類は１種類に限らず、複数の糖鎖を結合させてもよい。この場合の複数の糖鎖は同じ組織または器官の細胞表面に共通して存在する異なるレクチンに対して結合活性を有する複数の糖鎖であってもよいし、異なる組織または器官の細胞表面に存在する異なるレクチンに対して結合活性を有する糖鎖であってもよい。前者のような複数の糖鎖を選択することにより、特定の標的組織または器官を確実に指向することができ、後者のような複数の糖鎖を選択することにより、１種類のリポソームに複数の標的を指向させることができ、マルチパーパスな標的指向性リポソームを得ることができる。
なお、糖鎖をリポソームに結合させるには、リポソームの製造時にリンカー蛋白質および／または糖鎖を混合し、リポソームを製造させつつ糖鎖をその表面に結合させることも可能であるが、あらかじめリポソーム、リンカー蛋白質および糖鎖を別途準備し、製造が完了したリポソームにリンカー蛋白質および／または糖鎖を結合させたほうが望ましい。これは、リポソームにリンカー蛋白質および／または糖鎖を結合させることにより、結合させる糖鎖の密度を制御できるからである。
糖鎖のリポソームへの直接結合は、以下に述べるような方法で行うことができる。
糖鎖を糖脂質として混合してリポソームを製造するか、製造後のリポソームのリン脂質に糖鎖を結合するとともに糖鎖密度を制御する。
リンカー蛋白質を用いて糖鎖を結合させる場合、リンカー蛋白質としては、例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）等の動物の血清アルブミンが挙げられるが、特にヒト血清アルブミンを使用する場合は、各組織に対する取り込みが多いことがマウスについての実験により確かめられている。
また、後述のように、本発明の標的指向性リポソームを医薬として用いる場合、該リポソームは医薬効果を有する化合物を含んでいる必要がある。該医薬効果を有する化合物は、リポソーム中に封入させるか、あるいはリポソーム表面に結合させればよい。
糖鎖をリンカー蛋白質を介してリポソームへ結合させるには以下に述べる方法で行えばよい。
まずリポソーム表面に蛋白質を結合させる。リポソームを、ＮａＩＯ４、Ｐｂ（Ｏ２ＣＣＨ３）４、ＮａＢｉＯ３等の酸化剤で処理して、リポソーム膜面に存在するガングリオシドを酸化し、次いで、ＮａＢＨ３ＣＮ、ＮａＢＨ４等の試薬を用いて、リンカー蛋白質とリポソーム膜面上のガングリオシドを、還元的アミノ化反応により結合させる。このリンカー蛋白質も、親水性化するのが好ましく、これにはリンカー蛋白質にヒドロキシ基を有する化合物を結合させるが、例えば、ビススルフォスクシニミヂルスベラート、ジスクシニミヂルグルタレート、ジチオビススクシニミヂルプロピオネート、ジスクシニミヂルスベラート、３，３’−ジチオビススルフォスクシニミヂルプロピオネート、エチレングリコールビススクシニミヂルスクシネート、エチレングリコールビススルフォスクシニミヂルスクシネート等の２価試薬を用いて、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンをリポソーム上のリンカー蛋白質と結合させればよい。
これを具体的に述べると、まず、リンカー蛋白質の全てのアミノ基に架橋用２価試薬の一端を結合する。そして、各種糖鎖の還元末端をグリコシルアミノ化反応して得られる糖鎖グリコシルアミン化合物を調製し、この糖鎖のアミノ基とリポソーム上の上記で結合された架橋２価試薬の一部分の他の未反応末端とを結合する。
次に、このようにして得られる糖鎖結合リポソーム膜面上蛋白質の表面に糖鎖が結合していない未反応で残っている大部分の２価試薬未反応末端を用いて親水性化処理を行う。つまり、このリポソーム上蛋白質に結合している２価試薬の未反応末端とトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン等の上述の親水性化に用いる化合物との結合反応を行い、リポソーム表面全体を親水性化する。
リポソーム表面およびリンカー蛋白質の親水性化は、各種組織への移行性、および血中における滞留性および各種組織への移行性を向上させる。これは、リポソーム表面およびリンカー蛋白質表面が親水性化されることによって、糖鎖以外の部分が、各組織等においてはあたかも生体内水分であるかのようにみえ、これにより、標的以外の組織等に認識されず、糖鎖のみがその標的組織のレクチン（糖鎖認識蛋白質）により認識されることに起因するものと思われる。
次いで、糖鎖をリポソーム上のリンカー蛋白質に結合させる。これには、糖鎖を構成する糖類の還元末端を、ＮＨ４ＨＣＯ３、ＮＨ２ＣＯＯＮＨ４等のアンモニウム塩を用いてグリコシルアミノ化し、次いで、ビススルフォスクシニミヂルスベラート、ジスクシニミヂルグルタレート、ジチオビススクシニミヂルプロピオネート、ジスクシニミヂルスベラート、３，３’−ジチオビススルフォスクシニミヂルプロピオネート、エチレングリコールビススクシニミヂルスクシネート、エチレングリコールビススルフォスクシニミヂルスクシネート等の２価試薬を用いて、リポソーム膜面上に結合したリンカー蛋白質と、上記グリコシルアミノ化された糖類とを結合させ、図１〜２２に示されるようなリポソームを得る。なお、これらの糖鎖は市販されている。
本発明のリポソームの粒径は、３０〜５００ｎｍ、好ましくは５０〜３００ｎｍ、さらに好ましくは７０〜１５０ｎｍである。また、ゼータ電位は、−５０〜１０ｍＶ、好ましくは−４０〜０ｍＶ、さらに好ましくは−３０〜−１０ｍＶである。本発明の医薬組成物に含まれるリポソーム製造の過程において、表面に何も結合していないリポソーム、親水性化されておらず糖鎖が結合したリポソーム、糖鎖が結合しておらず親水性化されたリポソームおよび親水性化され糖鎖が結合したリポソームの４つの態様のリポソームが存在し得るが、これらの４つの態様のリポソームが生理食塩水などの等張液において前記粒径の範囲およびゼータ電位の範囲に包含される。
さらに、糖鎖を結合させた場合の糖鎖の結合密度は、リポソームに結合させるリンカー蛋白質１分子当り１〜６０個、好ましくは１〜４０個、さらに好ましくは１〜２０個である。また、リポソーム１粒子当りは、リンカー蛋白質を用いる場合は、１〜３００００個、好ましくは１〜２００００個、さらに好ましくは１〜１００００個、あるいは１００〜３００００個、好ましくは１００〜２００００個、さらに好ましくは１００〜１００００個、あるいは５００〜３００００個、好ましくは５００〜２００００個、さらに好ましくは５００〜１００００個である。リンカー蛋白質を用いない場合は、リポソーム１粒子当り最高１〜５０００００個、好ましくは１〜３０００００個、さらに好ましくは１〜１０００００個以上の糖鎖を結合させることができる。
（２）本発明の標的指向性リポソームを含む炎症性疾患治療用組成物
本発明は、上記シアリルルイスＸ型糖鎖またはこれと同様にＥ−セレクチン、Ｐ−セレクチン等に反応することができる糖鎖を糖鎖の種類および密度を制御して表面に結合した標的指向性リポソームを含む炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物を包含する。さらに、本発明は親水性化化合物を用いて親水性化した糖鎖の結合していないリポソームを含む炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物を包含する。
本発明の、炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物が対象とする炎症性疾患としては、限定されないが、脳炎、炎症性眼疾患、耳炎、咽頭炎、肺炎、胃炎、腸炎、肝炎、膵炎、腎炎、膀胱炎、尿道炎、子宮体炎、膣炎、関節炎、末梢神経炎などの一般的炎症性疾患が挙げられ、さらに悪性腫瘍、感染性疾患、アレルギー性疾患、自己免疫疾患（リウマチ、全身性エリテマトーデス、サルコイドーシスなど）、虚血性疾患（心筋梗塞、脳梗塞など）、代謝性疾患（糖尿病、痛風など）、外傷・熱傷・化学腐食、神経変性疾患（アルツハイマー病など）などの続発的に炎症を引き起こす炎症性疾患が挙げられる。炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物が適応できる対象器官、組織も限定されず動物のあらゆる器官および組織を対象とし得る。また、炎症性眼疾患としては、限定されないが、ぶどう膜炎を含む内眼炎、糖尿病網膜症、血管新生黄斑症、アレルギー性結膜炎、眼窩および眼内腫瘍、視神経炎、強膜炎（後部強膜炎を含む）等が挙げられる。
本発明の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物が含む標的指向性リポソームは、炎症性疾患治療用の医薬効果を有する化合物を含み、それらの化合物は限定されないが、副腎皮質ホルモン、抗炎症薬、免疫抑制剤、抗がん剤、抗菌薬、抗ウイルス薬、血管新生抑制剤、サイトカインやケモカイン、抗サイトカイン抗体や抗ケモカイン抗体、抗サイトカイン・ケモカイン受容体抗体、ｓｉＲＮＡやＤＮＡなどの遺伝子治療関連の核酸製剤、神経保護因子等が挙げられる。
副腎皮質ホルモンとしては、コルチゾール、コルチゾン等の天然副腎皮質ホルモン（糖質コルチコイド）や、プレドニゾロン、リン酸プレドニゾロン、デキサメサゾン、リン酸デキサメサゾン、ベタメサゾン、フルオシノロンアセトニド、トリアムシノロンや等の合成副腎皮質ホルモンが挙げられる。また、その他の抗炎症薬として、アスピリンなどのサリチル酸類、インドメタシンなどのインドール酢酸誘導体、ジクロフェナク等のフェニル酢酸誘導体、メフェナム酸などのフェナム酢酸誘導体が挙げられる。さらに、エトドラク、メロキシカム、セレキシコブＲｏｆｅｃｏｘｉｂ，ＭＫ−０９６６等の選択的ＣＯＸ−２阻害剤も挙げられる。
本発明において、上述の薬剤にはその誘導体も包含される。
本発明の糖鎖修飾リポソームにこれらの薬剤を含ませて投与した場合、薬剤を単独で投与した場合に比較し、薬剤が炎症部位に集積する。単独投与の場合に比べ、２倍以上、好ましくは５倍以上、さらに好ましくは１０倍以上、特に好ましくは５０倍以上集積し得る。
これらの、化合物は、リポソーム中に封入されていても、リポソーム表面に結合していていもよいが、リポソーム中に封入されているのが望ましい。これらの化合物は、その化合物が有する官能基を利用することにより、公知の方法で、結合させることができる。
リポソーム内部への封入は、以下の方法により行う。リポソームへ薬剤等を封入するには、周知の方法を用いればよく、例えば、薬剤等の含有溶液とフォスファチジルコリン類、フォスファチジルエタノールアミン類、フォスファチジン酸類もしくは長鎖アルキルリン酸塩類、ガングリオシド類、糖脂質類もしくはフォスファチジルグリセロール類およびコレステロール類を含む脂質を用いてリポソームを形成することにより、薬剤等はリポソーム内に封入される。
本発明の医薬組成物は、シアリルルイスＸ型糖鎖またはこれと同様にＥ−セレクチン、Ｐ−セレクチン等に反応することができる糖鎖を糖鎖の種類および密度を制御して表面に結合した標的指向性リポソームまたは親水性化化合物を用いて親水性化した糖鎖の結合していないリポソームの他に薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤等を含んでいてもよい。本発明の医薬組成物は、種々の形態で投与することができる。このような投与形態としては、点眼剤等による点眼投与、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等による経口投与、あるいは注射剤、点滴剤、座薬などによる非経口投与を挙げることができる。かかる組成物は、公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤、賦形剤を含む。たとえば、錠剤用の担体、賦形剤としては、ゲル化剤、乳糖、ステアリン酸マグネシウムなどが使用される。注射剤は、本発明の糖鎖結合リポソームを通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製する。注射用の水性液としては、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが使用され、適当な溶解補助剤、たとえばアルコール、プロピレングリコールなどのポリアルコール、非イオン界面活性剤などと併用しても良い。油性液としては、ゴマ油、大豆油などが使用され、溶解補助剤としては安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用しても良い。
本発明の医薬組成物の投与経路は、限定されず、点眼、経口投与、静脈注射、筋肉注射等がある。投与量は、炎症性疾患の重篤度等により適宜決定できるが、本発明の組成物の医薬的に有効量を患者に投与する。ここで、「医薬的に有効量を投与する」とは、炎症性疾患を治療するのに適切なレベルの薬剤を患者に投与することをいう。本発明の医薬組成物の投与回数は適宜患者の症状に応じて選択される。
また、本発明の医薬組成物を診断用に用いる場合は、リポソームに蛍光色素、放射性化合物等の標識化合物を結合させる。該標識化合物結合リポソームが患部に結合し、標識化合物が患部細胞に取り込まれ、該標識化合物の存在を指標に疾患を検出・診断することができる。
さらに、本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【実施例１】
リポソームの調製
リポソームは既報の手法（Ｙａｍａｚａｋｉ，Ｎ．，Ｋｏｄａｍａ，Ｍ．ａｎｄ Ｇａｂｉｕｓ，Ｈ．−Ｊ．（１９９４）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２４２，５６−６５）により、改良型コール酸透析法を用いて調製した。すなわち、ジパルミトイルフォスファチジルコリン、コレステロール、ジセチルフォスフェート、ガングリオシド及びジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミンをモル比でそれぞれ３５：４０：５：１５：５の割合の合計脂質量４５．６ｍｇにコール酸ナトリウムを４６．９ｍｇ添加し、クロロホルム／メタノール溶液３ｍｌに溶解した。この溶液を蒸発させ、沈殿物を真空中で乾燥させることによって脂質膜を得た。得られた脂質膜をＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ８．４）３ｍｌに懸濁、超音波処理して、透明なミセル懸濁液を得た。さらに、ミセル懸濁液をＰＭ１０膜（ＡｍｉｃｏｎＣｏ．，ＵＳＡ）とＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）を用いた限外濾過にかけ均一リポソーム（平均粒径１００ｎｍ）１０ｍｌを調製した。
【実施例２】
リポソーム脂質膜面上の親水性化処理
実施例１で調製したリポソーム溶液１０ｍｌをＸＭ３００膜（Ａｍｉｃｏｎ Ｃｏ．，ＵＳＡ）とＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）を用いた限外濾過にかけ溶液のｐＨを８．５にした。次に、架橋試薬ｂｉｓ（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ）ｓｕｂｅｒａｔｅ（ＢＳ３；Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｏ．，ＵＳＡ）１０ｍｌを加え、２５℃で２時間攪拌した。その後、更に７℃で一晩攪拌してリポソーム膜上の脂質ジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミンとＢＳ３との化学結合反応を完結した。そして、このリポソーム液をＸＭ３００膜とＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）で限外濾過にかけた。次に、ＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）１ｍｌに溶かしたｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ ４０ｍｇをリポソーム液１０ｍｌに加えて、２５℃で２時間攪拌後、７℃で一晩攪拌してリポソーム膜上の脂質に結合したＢＳ３とｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅとの化学結合反応を完結した。これにより、リポソーム膜の脂質ジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミン上にｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅの水酸基が配位して水和親水性化された。
【実施例３】
リポソーム膜面上へのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の結合
既報の手法（Ｙａｍａｚａｋｉ，Ｎ．，Ｋｏｄａｍａ，Ｍ．ａｎｄ Ｇａｂｉｕｓ，Ｈ．−Ｊ．（１９９４）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２４２，５６−６５）により、カップリング反応法を用いて行った。すなわち、この反応は２段階化学反応で行い、まずはじめに、実施例２で得られた１０ｍｌのリポソーム膜面上に存在するガングリオシドを１ｍｌのＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ８．４）に溶かしたメタ過ヨウ素酸ナトリウム４３ｍｇを加えて室温で２時間攪拌して過ヨウ素酸酸化した後、ＸＭ３００膜とＰＢＳ緩衝液（ｐＨ８．０）で限外濾過することにより酸化されたリポソーム１０ｍｌを得た。このリポソーム液に、２０ｍｇのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を加えて２５℃で２時間攪拌し、次にＰＢＳ（ｐＨ８．０）に２Ｍ ＮａＢＨ３ＣＮ １００μｌを加えて１０℃で一晩攪拌してリポソーム上のガングリオシドとＨＳＡとのカップリング反応でＨＳＡを結合した。そして、ＸＭ３００膜とＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）で限外濾過をした後、ＨＳＡ結合リポソーム液１０ｍｌを得た。
【実施例４】
リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）上へのルイスＸ型三糖鎖、シアリルルイスＸ型四糖鎖、３’−シアリルラクトサミン三糖鎖、６’−シアリルラクトサミン三糖鎖、アルファ１，２マンノビオース二糖鎖、アルファ１，３マンノビオース二糖鎖、アルファ１，４マンノビオース二糖鎖、アルファ１，６マンノビオース二糖鎖、アルファ１，３アルファ１，６マンノトリオース三糖鎖、オリゴマンノース３五糖鎖、オリゴマンノース４ｂ六糖鎖、オリゴマンノース５七糖鎖、オリゴマンノース６八糖鎖、オリゴマンノース７九糖鎖、オリゴマンノース８十糖鎖またはオリゴマンノース９十一糖鎖の結合
ルイスＸ型三糖鎖（ＣａｌｂｉｏＣｈｅｍ Ｃｏ．，ＵＳＡ）５０μｇを０．２５ｇのＮＨ４ＨＣＯ３を溶かした０．５ｍｌ水溶液に加え、３７℃で３日間攪拌した後、０．４５μｍのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結してルイスＸ型三糖鎖のグリコシルアミン化合物５０μｇを得た。次に、実施例３で得たリポソーム液の一部分１ｍｌに架橋試薬３，３’−ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ（ＤＴＳＳＰ；Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｏ．，ＵＳＡ）１ｍｇを加えて２５℃で２時間、続いて７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）で限外濾過してＤＴＳＳＰがリポソーム上のＨＳＡに結合したリポソーム１ｍｌを得た。次に、このリポソーム液に上記のルイスＸ型三糖鎖のグリコシルアミン化合物５０μｇを加えて、２５℃で２時間攪拌し、その後７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のＤＴＳＳＰにルイスＸ型三糖鎖の結合を行った。その結果、図１で示されるルイスＸ型三糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリポソーム２ｍｌ（総脂質量２ｍｇ、総蛋白量２００μｇ、平均粒径１００ｎｍ）が得られた。他の糖鎖結合リポソームも用いる糖鎖を変えて同様の方法で作製した。これらの糖鎖結合リポソームは、図２から１６に示した。
【実施例５】
リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）上へのラクトース二糖鎖、２’−フコシルラクトース三糖鎖、ジフコシルラクトース四糖類、３−フコシルラクトース三糖鎖、３’−シアリルラクトース三糖鎖、６’−シアリルラクトース三糖鎖、３’−シアリルラクトサミン三糖鎖または６’−シアリルラクトサミン三糖鎖の結合（糖鎖結合量が異なるもの３種類）
ラクトース二糖鎖（Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｊａｐａｎ）（ １）５０μｇ、又は、２）２００μｇ、又は、３）１ｍｇ）を０．２５ｇのＮＨ４ＨＣＯ３を溶かした０．５ｍｌ水溶液に加え、３７℃で３日間攪拌した後、０．４５μｍのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結してラクトース二糖鎖のグリコシルアミン化合物５０μｇを得た。次に、実施例３で得たリポソーム液の一部分１ｍｌに架橋試薬３，３’−ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ（ＤＴＳＳＰ；Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｏ．，ＵＳＡ）１ｍｇを加えて２５℃で２時間、続いて７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）で限外濾過してＤＴＳＳＰがリポソーム上のＨＳＡに結合したリポソーム１ｍｌを得た。次に、このリポソーム液に上記のラクトース二糖鎖のグリコシルアミン化合物５０μｇを加えて、２５℃で２時間攪拌し、その後７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のＤＴＳＳＰにラクトース二糖鎖の結合を行った。その結果、糖鎖結合量が異なるもの３種類の図１７で示されるラクトース二糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリポソーム各２ｍｌ（総脂質量２ｍｇ、総蛋白量２００μｇ、平均粒径１００ｎｍ）が得られた。他の糖鎖結合リポソームも用いる糖鎖を変えて同様の方法で作製した。他の糖鎖結合リポソームの構造を図３、４および１８〜２２に示す。
【実施例６】
リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）上へのｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅの結合
比較試料としてのリポソームを調製するために、実施例３で得たリポソーム液の一部分１ｍｌに架橋試薬３，３’−ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ（ＤＴＳＳＰ；Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｏ．，ＵＳＡ）１ｍｇを加えて２５℃で２時間、続いて７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）で限外濾過してＤＴＳＳＰがリポソーム上のＨＳＡに結合したリポソーム１ｍｌを得た。次に、このリポソーム液にｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ（Ｗａｋｏ Ｃｏ．，Ｊａｐａｎ）１３ｍｇを加えて、２５℃で２時間攪拌し、その後７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のＤＴＳＳＰにｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅの結合を行った。その結果、図２５で示されるｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅとヒト血清アルブミンとリポソームとが結合した比較試料としてのリポソーム２ｍｌ（総脂質量２ｍｇ、総蛋白量２００μｇ、平均粒径１００ｎｍ）が得られた。
【実施例７】
リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）上の親水性化処理
実施例４または５の手段により調整されたリポソームについて、以下の手順によりリポソーム上のＨＳＡ蛋白質表面の親水性化処理を行った。糖鎖結合リポソーム２ｍｌに、ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ１３ｍｇを加えて、２５℃で２時間、その後７℃で一晩攪拌した後、ＸＭ３００膜とＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）で限外濾過し未反応物を除去して、最終産物である親水性化処理された糖鎖結合リポソーム複合体各２ｍｌ（総脂質量２ｍｇ、総蛋白量２００μｇ、平均粒径１００ｎｍ）を得た。
【実施例８】
各種の糖鎖結合リポソーム複合体によるレクチン結合活性阻害効果の測定
実施例５及び６の手段により調製した各１２種の糖鎖結合リポソーム複合体のｉｎ ｖｉｔｒｏでのレクチン結合活性は、常法（Ｙａｍａｚａｋｉ，Ｎ．（１９９９）Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ，１４，４９８−５０５）に従いレクチン固定化マイクロプレートを用いた阻害実験で測定した。すなわち、レクチン（Ｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｃｏ．，ＵＳＡ）を９６穴マイクロプレートに固化定した。このレクチン固定化プレートに、比較リガンドであるビオチン化したフコシル化フェチュイン０．１μｇとともに、濃度の異なる各種の糖鎖結合リポソーム複合体（蛋白質量として、０．０１μｇ、０．０４μｇ、０．１１μｇ、０．３３μｇ、１μｇ）を加え、４℃で２時間インキュベートした。ＰＢＳ（ｐＨ７．２）で３回洗浄した後、ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰＯ）結合ストレプトアビジンを添加し、さらに４℃で１時間インキュベート、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）で３回洗浄し、ペルオキシダーゼ基質を添加して室温で静置、４０５ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｃｏｒｐ．，ＵＳＡ）で測定した。フコシル化フェチュインのビオチン化は、ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ｂｉｏｔｉｎ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｏ．，ＵＳＡ）処理後、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−３０（Ａｍｉｃｏｎ Ｃｏ．，ＵＳＡ）により精製した。ＨＲＰＯ結合ストレプトアビジンは、ＨＲＰＯの酸化とＮａＢＨ３ＣＮを用いた還元アミノ化法によるストレプトアビジンの結合により調製した。この測定結果を表１から４に示す。
表中のリポソーム複合体の記号は、リポソームに以下の糖鎖が結合していることを示す。
ＬＸ：ルイスＸ型三糖鎖
ＳＬＸ：シアリルルイスＸ型四糖鎖
３ＳＬＮ：３’−シアリルラクトサミン三糖鎖
６ＳＬＮ：６’−シアリルラクトサミン三糖鎖
Ａ２：アルファ１，２マンノビオース二糖鎖
Ａ３：アルファ１，３マンノビオース二糖鎖
Ａ４：アルファ１，４マンノビオース二糖鎖
Ａ６：アルファ１，６マンノビオース二糖鎖
Ａ３６：アルファ１，３アルファ１，６マンノトリオース三糖鎖
Ｍａｎ３：オリゴマンノース３五糖鎖
Ｍａｎ４６：オリゴマンノース４ｂ六糖鎖
Ｍａｎ５：オリゴマンノース５七糖鎖
Ｍａｎ６：オリゴマンノース６八糖鎖
Ｍａｎ７：オリゴマンノース７九糖鎖
Ｍａｎ８：オリゴマンノース８十糖鎖
Ｍａｎ９：オリゴマンノース９十一糖鎖
ＬＡＣ：ラクトース二糖鎖
ＦＬ：２’−フコシルラクトース三糖鎖
ＤＦＬ：ジフコシルラクトース四糖類
ＦＬ：３−フコシルラクトース三糖鎖
３ＳＬ：３’−シアリルラクトース三糖鎖
６ＳＬ：６’−シアリルラクトース三糖鎖
３ＳＬＮ：３’−シアリルラクトサミン三糖鎖
６ＳＬＮ：６’−シアリルラクトサミン三糖鎖
表に示すように、各リポソームはレクチンとの結合活性を有しており、このことは糖鎖が結合していることを示している。
【実施例９】
ぶどう膜炎モデルマウスの作成
実験的ぶどう膜炎（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ Ｕｖｅｏｒｅｔｉｎｉｔｉｓ：以下ＥＡＵ）モデルマウスの作出には、以下の材料を用いた。
実験動物：Ｃ５７ＢＬ／６マウス（雌、８週齢）
接種抗原：ヒト網膜特異的蛋白ＩＲＢＰ（Ｉｎｔｅｒｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｒｅｔｉｎｏｉｄ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ）
合成ペプチド 配列 ＧＰＴＨＬＦＱＰＳＬＶＬＤＭＡＫＶＬＬＤ（１−２０）
アジュバンド：結核（Ｈ３７ＲＡ）死菌６ｍｇ／ｍｌ含有ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ ａｄｊｕｖａｎｔ（ＣＦＡ）
増幅効果剤：百日咳毒素（Ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ ｔｏｘｉｎ（ＰＴＸ））
ペプチド水溶液とアジュバントを容積比で１：１に混和し乳濁液として調製する。８週齢のＣ５７ＢＬ／６雌マウスに１匹あたり、足背皮下５０μｇ・鼠径部皮下５０μｇ、合計２００μｇ接種する。１匹あたり１００ｍｇの百日咳毒素を追加アジュバントとして腹腔内投与する。ＥＡＵ発症の程度は、０．５％トロピカミド・０．５％塩酸フェニレフリンにより瞳孔を散大させ眼底観察することにより評価した。
結果は図２４に提示する。ＥＡＵは投与１６日目をピークに発症した。
ペプチド投与後１６日目において炎症細胞が脈絡膜、網膜、硝子体腔に浸潤しているのが観察できる。
本方法でヒトの内眼炎モデルであるＥＡＵが作成されていることが確認された。
【実施例１０】
リポソームの生体内動態検討
投与リポソームは、上記実施例で作製した糖鎖結合リポソームのうち、シアリルルイスＸ糖鎖結合リポソーム（以下糖鎖＋リポソーム）および糖鎖の結合していないリポソーム（以下糖鎖−リポソーム）であった。
ＥＡＵマウスおよび正常マウスに対し、糖鎖＋リポソーム、糖鎖−リポソームをそれぞれ投与し、マウスの各臓器へのリポソームの集積を評価することを目的として行った。
ペプチド投与１６日目にＥＡＵ発症を確認したＥＡＵマウスおよび正常マウスを用意する。あらかじめ５０μｇ／ｍｌに調製したリポソーム溶液をマウスの尾静脈より静注し、静注後ヘパリン生食で脱血還流の後、全各臓器を摘出した。各臓器は１％ＴｒｉｔｏｎＸ溶液とＨＧ３０ホモゲナイザー（日立工機）を用いて組織ホモジネートとして調製の後、１００％メタノールとクロロホルムを用いて組織ホモジネートに含まれるリポソームを抽出した。リポソーム量は、リポソームに結合したＦＩＴＣの蛍光強度を蛍光マイクロプレートリーダーＢｉｏｌｕｍｉｎ９６０（モレキュラーダイナミック社）を用いて行い、４９０ｎｍのｅｘｉｔａｔｉｏｎと５２０ｎｍのｅｍｉｓｓｉｏｎで計測した。
リポソーム投与後、眼において集積の時間経過を調べた。その結果３０分をピークにして集積することが明らかとなった。従って、各臓器での集積検討はリポソーム投与３０分後に時間設定して行った。結果は図２５Ａおよび図２５Ｂに提示する。図２５Ａは集積量で示し、図２５Ｂは、正常マウスに対する相対値％で示す。まず、正常マウスでは各臓器において糖鎖＋リポソームと糖鎖−リポソームの集積に差は認めない。一方、ＥＡＵマウスの眼では糖鎖＋リポソームは正常マウスの眼の６倍の集積を認めた。しかし糖鎖−リポソームではＥＡＵマウスの眼への集積は正常マウスに比較し１．５倍にとどまっている。ＥＡＵマウスの眼以外の臓器においては糖鎖＋リポソームと糖鎖−リポソームの集積に著明な差は認めず、その値は正常マウスのそれと比較してもほぼ同程度であった。
炎症を起こした眼でのみリポソームの取り込みの増加を認めた。糖鎖−リポソームがＥＡＵマウスの眼で正常マウスの眼の１．５倍の取り込みを認めたのは血管内皮細胞間隙の拡大によるものと考えられる（ｐａｓｓｉｖｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ）。一方、糖鎖＋リポソームがＥＡＵマウスの眼で正常マウスの眼の６倍の集積（すなわち糖鎖−リポソームと比較して約４倍の集積）を認めたことは炎症部位に発現したＥ−セレクチン、Ｐ−セレクチンを標的としたためと考えられる（ａｃｔｉｖｅｔｒａｎｓｐｏｒｔ）。
【実施例１１】
リポソームの炎症部位への集積
炎症臓器（眼）のどの部位にリポソームの集積が生じるかを評価することを目的として行った。
ペプチド免疫後１６日目のＥＡＵ発症マウスの尾静脈よりリポソームを投与。３０分後にマウス眼球を摘出しそのままＯＣＴコンパウンドに包埋・凍結した。クライオトームを用いて６〜８ｕｍ凍結切片を作製しＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎ（カールツァイス社）を用いて観察した。
結果は図２６に提示する。ＥＡＵマウスに糖鎖＋リポソームを投与すると、投与後５分において強膜に集積が認められ、７分において脈絡膜の脈絡膜毛細管板に当たる部位に細い１筋の集積が認められる。投与後１０分ではその集積ラインが拡大しているのが観察できる。３０分では、集積ラインは薄まり、周囲の組織への蛍光物質の拡散が観察できる（図２６）。一方、糖鎖−リポソームでは集積ラインの形成は認められず、３０分においても明らかな蛍光物質の貯留、拡散は観察できない（図２６−Ｆ）。また、正常マウスにおいてはいずれのリポソームにおいても蛍光物質は確認できない（図２７）。
血管の最も豊富な脈絡膜毛細管板から糖鎖＋リポソームの集積が開始され、時間とともに周囲の組織に拡散していくというリポソームの炎症部位での動態があきらかとなった。これは糖鎖＋リポソームが炎症部位の血管に発現しているＥ−セレクチン、Ｐ−セレクチンを標的として集積し、その後、炎症により拡大した血管内皮細胞間隙を通って周囲組織に拡散していったものと考えることができる。一方、糖鎖−リポソームで明確な蛍光色素が観察できなかったのは、このリポソームの炎症部位への集積がｐａｓｓｉｖｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔであるため、糖鎖＋リポソームのように標的となって集積する部位がなく、個々ばらばらに組織に拡散していくためと考えられる。
【実施例１２】
Ｅ−セレクチン、Ｐ−セレクチンの発現
Ｅ−セレクチン、Ｐ−セレクチンがＥＡＵマウス眼において確かに発現しているのか、そしてその発現部位が糖鎖＋リポソームが最初に集積した集積ラインと一致しているかを確認することを目的として行った。
ＥＡＵ発症マウス、正常マウスを準備する。眼球摘出後４％グルタルアルデヒドで固定し３０％シュクロースＰＢＳで脱水した眼球をＯＣＴコンパウンドに包埋・凍結する。
（１）蛍光抗体法による検出：１４から１６μｍの凍結切片を用いて、ブロッキングの後、抗マウスＥ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ１次抗体（ポリクローナル抗体：ヤギ）を反応させる。ＦＩＴＣ結合の抗ヤギＩｇＧ二次抗体によりシグナルを検出した。
（２）酵素抗体法による検出：抗マウスＥ−ｓｅｌｅｃｔｉｎおよびＰ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ１次抗体（ポリクローナル抗体：ヤギ）による反応は蛍光抗体法と同様に行い、二次抗体反応は、ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ（登録商標）ＡＢＣ−ＡＰ ｋｉｔおよびＶｅｃｔｏｒ（登録商標）Ｒｅｄ Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｋｉｔ Ｉを用いて行った。
どちらの検出方法においても、免疫染色の特異性を確認するために、抗体を購入した会社からそれぞれの抗体作成に使用したペプチドを購入し、ブロッキングペプチドとして用い染色が消失するかいなかを確認した。
結果は図２８および２９に提示する。Ｅ−セレクチン、Ｐ−セレクチンともに糖鎖＋リポソームの集積ラインに一致した部位で強く発現していることが観察できた。また、使用した抗体に対する中和ペプチドにより染色が消失したことはこの免疫染色の特異性を示すものと考えられた。一方、正常マウスではＥ−セレクチン、Ｐ−セレクチンともに発現を認めなかった。
ＥＡＵマウスにおけるＥ−セレクチン、Ｐ−セレクチンの発現部位と糖鎖＋リポソームの集積部位が一致したことは、このリポソームの標的がＥ−セレクチン、Ｐ−セレクチンであるという理論を支持するものである。
【実施例１３】
Ｅ−セレクチンとＰ−セレクチンの抗体投与による糖鎖＋リポソームの集積阻害
糖鎖＋リポソームの標的分子が確かにＥ−セレクチンとＰ−セレクチンであることを示すことを目的として行った。
ＥＡＵ発症マウスの尾静脈より抗マウスＥ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ抗体２００μｇ、抗マウスＰ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ抗体２００μｇを同時投与し４時間待ち、受容体を中和する。コントロールとして、ＥＡＵ発症マウスの尾静脈より４００μｇのアイソタイプＩｇＧを投与したものを用意する。投与４時間後、糖鎖＋リポソームを尾静脈より投与し１０分後眼球摘出し凍結標本を作製する。６〜８μｍの凍結切片を作製しＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎを用いて、リガンド−受容体特異的結合が阻害されるか解析する。
結果を図３０に提示する。Ｅ−セレクチンとＰ−セレクチンの抗体を同時にＥＡＵマウスに投与することで糖鎖＋リポソームの集積を阻害することができた。アイソタイプＩｇＧの投与では集積を阻害することはできなかった。また、Ｅ−セレクチンとＰ−セレクチンのそれぞれの抗体単独投与では完全には集積を阻害することはできなかった。
この結果と、実施例１１で示した結果を併せて考えると、糖鎖＋リポソームの標的はＥ−セレクチンとＰ−セレクチンであると結論できる。
以上の実験結果より、シアリルルイスＸ糖鎖結合リポソームはＥ−セレクチンとＰ−セレクチンを多く発現している病巣部位特異的に薬剤をデリバーできることが示された。
実施例１４ リン酸プレドニゾロン封入リポソームの調製
（１） リン酸プレドニゾロン封入リポソームの調製と封入薬物定量と保存安定性
リポソームはコール酸透析法を用いて調製した。すなわち、ジパルミトイルフォスファチジルコリン、コレステロール、ジセチルフォスフェート、ガングリオシド及びジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミンをモル比でそれぞれ３５：４０：５：１５：５の割合で合計脂質量４５．６ｍｇになるように混合し、コール酸ナトリウム４６．９ｍｇ添加し、クロロホルム／メタノール溶液３ｍｌに溶解した。この溶液を蒸発させ、沈殿物を真空中で乾燥させることによって脂質膜を得た。得られた脂質膜をＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ８．４）３ｍｌに懸濁、超音波処理し、透明なミセル懸濁液３ｍｌを得た。このミセル懸濁液にＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）を加えて５ｍｌにしてから、更にＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ８．４）で２２５０ｍｇ／６ｍｌになるよう完全に溶解したリン酸プレドニゾロンを攪拌しながらゆっくりと滴下して均一に混合した後、このリン酸プレドニゾロン入りミセル懸濁液をＰＭ１０膜（ＡｍｉｃｏｎＣｏ．，ＵＳＡ）とＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ８．４）を用いた限外濾過にかけ均一なリン酸プレドニゾロン封入リポソーム１０ｍｌを調製した。得られた生理食塩懸濁液中（３７℃）のリン酸プレドニゾロン封入リポソーム粒子の粒子径とゼータ電位をゼータ電位・粒子径・分子量測定装置（Ｍｏｄｅｌ Ｎａｎｏ ＺＳ，Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ．，ＵＫ）により測定した結果、粒子径は５０〜３５０ｎｍ、ゼータ電位は−３０〜−１０ｍＶであった。このリポソームの封入薬物量を吸光度２６０ｎｍで測定するとおよそ２８０μｇ／ｍｌの濃度でリン酸プレドニゾロンが封入されていることがわかった。このリン酸プレドニゾロン封入リポソームは、冷蔵庫中に１年間保存した後にも沈殿や凝集を起こすことなく安定であった。
（２） リン酸プレドニゾロン封入リポソーム脂質膜面上の親水性化処理
（１）で調製したリン酸プレドニゾロン封入リポソーム溶液１０ｍｌをＸＭ３００膜（Ａｍｉｃｏｎ Ｃｏ．，ＵＳＡ）とＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）を用いた限外濾過にかけ溶液のｐＨを８．５にした。次に、架橋試薬ｂｉｓ（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ）ｓｕｂｅｒａｔｅ（ＢＳ３；Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｏ．，ＵＳＡ）１０ｍｌを加え、２５℃で２時間攪拌した。その後、更に７℃で一晩攪拌してリポソーム膜上の脂質ジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミンとＢＳ３との化学結合反応を完結した。そして、このリポソーム液をＸＭ３００膜とＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）で限外濾過にかけた。次に、ＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）１ｍｌに溶かしたｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ４０ｍｇをリポソーム液１０ｍｌに加えて、２５℃で２時間攪拌後、７℃で一晩攪拌してリポソーム膜上の脂質に結合したＢＳ３とｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅとの化学結合反応を完結した。これにより、抗癌剤ドキソルビシン封入リポソーム膜の脂質ジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミン上にｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅの水酸基が配位して水和親水性化された。
（３） リン酸プレドニゾロン封入リポソーム膜面上へのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の結合
既報の手法（Ｙａｍａｚａｋｉ，Ｎ．，Ｋｏｄａｍａ，Ｍ．ａｎｄ Ｇａｂｉｕｓ，Ｈ．−Ｊ．（１９９４）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２４２，５６−６５）により、カップリング反応法を用いて行った。すなわち、この反応は２段階化学反応で行い、まずはじめに、（２）で得られた１０ｍｌのリポソーム膜面上に存在するガングリオシドを１ｍｌのＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ８．４）に溶かしたメタ過ヨウ素酸ナトリウム４３ｍｇを加えて室温で２時間攪拌して過ヨウ素酸酸化した後、ＸＭ３００膜とＰＢＳ緩衝液（ｐＨ８．０）で限外濾過することにより酸化されたリポソーム１０ｍｌを得た。このリポソーム液に、２０ｍｇのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を加えて２５℃で２時間攪拌し、次にＰＢＳ（ｐＨ８．０）に２Ｍ ＮａＢＨ３ＣＮ １００μｌを加えて１０℃で一晩攪拌してリポソーム上のガングリオシドとＨＳＡとのカップリング反応でＨＳＡを結合した。そして、ＸＭ３００膜とＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）で限外濾過をした後、ＨＳＡ結合リン酸プレドニゾロン封入リポソーム液１０ｍｌを得た。
（４） リン酸プレドニゾロン封入リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）上へのシアリルルイスＸ型四糖鎖の結合とリンカー蛋白質（ＨＳＡ）の親水性化処理
シアリルルイスＸ型四糖鎖（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｏ．，ＵＳＡ）５０μｇを０．２５ｇのＮＨ４ＨＣＯ３を溶かした０．５ｍｌ水溶液に加え、３７℃で３日間攪拌した後、０．４５μｍのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結してシアリルルイスＸ型四糖鎖のグリコシルアミン化合物５０μｇを得た。次に、（３）で得たリン酸プレドニゾロン封入リポソーム液の一部分１ｍｌに架橋試薬３，３’−ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ）ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ（ＤＴＳＳＰ；Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｏ．，ＵＳＡ）１ｍｇを加えて２５℃で２時間、続いて７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）で限外濾過してＤＴＳＳＰがリポソーム上のＨＳＡに結合したリポソーム１ｍｌを得た。次に、このリポソーム液に上記のシアリルルイスＸ型四糖鎖のグリコシルアミン化合物５０μｇを加えて、２５℃で２時間攪拌し、その後７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のＤＴＳＳＰにシアリルルイスＸ型四糖鎖の結合を行った。次に、このリポソーム液にｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ（Ｗａｋｏ Ｃｏ．，Ｊａｐａｎ）１３ｍｇを加えて、２５℃で２時間攪拌し、その後７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のＤＴＳＳＰにｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅの結合を行った。その結果、ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅとヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリンカー蛋白質（ＨＳＡ）の親水性化処理をしたリポソームを得た。その結果、シアリルルイスＸ型四糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリンカー蛋白質（ＨＳＡ）の親水性化処理をしたリン酸プレドニゾロンン封入リポソーム２ｍｌ（総脂質量２ｍｇ、総蛋白量２００μｇ）が得られた。得られた生理食塩懸濁液中（３７℃）のリン酸プレドニゾロン封入リポソーム粒子の粒子径とゼータ電位をゼータ電位・粒子径・分子量測定装置（Ｍｏｄｅｌ Ｎａｎｏ ＺＳ，Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ．，ＵＫ）により測定した結果、粒子径は５０〜３５０ｎｍ、ゼータ電位は−３０〜−１０ｍＶであった。
（５） リン酸プレドニゾロン封入リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）上へのｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅの結合によるリンカー蛋白質（ＨＳＡ）の親水性化処理
比較試料としてのリン酸プレドニゾロン封入リポソーム（糖鎖を付けないもの）を調製するために、（３）で得たリン酸プレドニゾロン封入リポソーム液の一部分１ｍｌに架橋試薬３，３’−ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ）ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ（ＤＴＳＳＰ；Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｏ．，ＵＳＡ）１ｍｇを加えて２５℃で２時間、続いて７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）で限外濾過してＤＴＳＳＰがリポソーム上のＨＳＡに結合したリンカー蛋白質（ＨＳＡ）の親水性化処理リポソーム１ｍｌを得た。次に、このリポソーム液にｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ（Ｗａｋｏ Ｃｏ．，Ｊａｐａｎ）１３ｍｇを加えて、２５℃で２時間攪拌し、その後７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のＤＴＳＳＰにｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅの結合を行った。その結果、ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅとヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリンカー蛋白質（ＨＳＡ）の親水性化処理をした比較試料としてのリン酸プレドニゾロン封入リポソーム（糖鎖を付けないもの）２ｍｌ（総脂質量２ｍｇ、総蛋白量２００μｇ）が得られた。得られた生理食塩懸濁液中（３７℃）のリン酸プレドニゾロン封入リポソーム粒子（糖鎖を付けないもの）の粒子径とゼータ電位をゼータ電位・粒子径・分子量測定装置（Ｍｏｄｅｌ Ｎａｎｏ ＺＳ，Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ．，ＵＫ）により測定した結果、粒子径は５０〜３５０ｎｍ、ゼータ電位は−３０〜−１０ｍＶであった。
本実施例で作製したリポソームを以下の実施例１５および１６の検討に用いた。
実施例１５ 炎症部位への薬剤集積効果
ＥＡＵ発症マウスの各臓器におけるＥ−セレクチンの発現を検討することを目的として行った。
リン酸プレドニゾロン１ｍｇをマウス尾静脈から投与し、Ｅ−セレクチンの発現を認めた臓器において、１時間後の各臓器における単位重量あたりのプレドニゾロン濃度をＨＰＬＣにて測定した。次いで、今回開発したＥ−セレクチン標的指向性のシアリルルイスＸ糖鎖付きリポソーム（以下糖鎖付きリポソーム）にリン酸ブレドニゾロンを内包させたものを投与（リン酸プレドニゾロン合計５μｇ）し、１時間後の各臓器における単位重量あたりのプレドニゾロン濃度をＨＰＬＣにて測定した。
以下の結果が得られた。
１．ＥＡＵ発症マウスにおいては、眼以外に腸においてＥ−セレクチンの発現を認めた。それ以外の臓器には発現を認めなかった。
２．リン酸プレドニゾロンを単独で１ｍｇ投与した場合、眼には１００ｎｇ、腸には５００ｎｇ集積していた。一方、糖鎖付きリポソーム（リン酸プレドニゾロン合計５μｇ内包）を投与した場合、眼には２５ｎｇ、腸には２０００ｎｇ集積していた。
本実施例の結果は、リン酸プレドニゾロンを単独で１ｍｇ投与するのと同等の効果を炎症部位において得るのに、糖鎖付きリポソームを用いると、眼の炎症ではリン酸プレドニゾロン２０μｇで可能であり、腸ではわずか１．２５μｇで可能であることを示している。つまり、この糖鎖付きリポソームをデリバリーシステムとして用いると、眼では５０倍の、腸では８００倍の集積効果が得られることになる。
また、本実施例では、リン酸プレドニゾロンを投与して、測定はプレドニゾロンで測っている。リン酸プレドニゾロンは細胞内に取り込まれると、リン酸基が外れてプレドニゾロンになるので、今回の結果は、糖鎖付きリポソームで投与したリン酸プレドニゾロンが細胞内に取り込まれ、代謝されていることも同時に示している。
ＥＡＵ発症マウスの実験を総括すると、この糖鎖付きリポソームはＥ，Ｐ−セレクチンを選択的に標的としたものであり、最大８００倍の集積効果を発揮するという従来には見られなかった高精度の標的指向性を有することがあきらかとなった。また、この糖鎖付きリポソームに内包された薬剤が細胞内で代謝されていることも確認できた。以上より、本糖鎖付きリポソームを用いたドラッグデリバリーシステムは、いままでの臨床医学で用いられていた薬剤効果を得るのに、投与する薬剤量を数百分の一に減量することができ、最大限の薬剤効果と最小限の副作用を可能にするものであると結論できる。
実施例１６ 標的指向性リポゾームによるリュウマチ性関節炎の治療の検討
（１）ＲＡモデルマウスの作成
ＲＡマウスモデルとしてタイプＩＩコラーゲン誘導関節炎（Ｃｏｌｌａｇｅｎ ｔｙｐｅ ＩＩ ｉｎｄｕｃｅｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ以下ＣＩＡ）モデルを作成した。用いたマウス、試薬類は以下の通りである。
実験動物：ＤＢＡ／１Ｊマウス（８週齢、雄）
接種抗原：牛コラーゲン タイプＩＩ
アジュヴァント：結核死菌（Ｈ３７Ｒａ，２ｍｇ／ｍｌ）含有ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ ａｄｊｕｖａｎｔ（ＣＦＡ），結核死菌を含まないｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ ａｄｊｕｖａｎｔ（ＩＦＡ）
コラーゲン水溶液とＣＦＡを容積比２：１で混和し、１００μＬにコラーゲンを２００μｇ含有する乳濁液を調整、これをマウスの尾底部皮下へ注射した（Ｄａｙ０）。処置２１日後（Ｄａｙ２１）コラーゲン水溶液とＩＦＡを容積比２：１で混和し、１００μＬにコラーゲンを２００μｇ含有する乳濁液を調整し、再度マウス尾底部皮下へ注射した。
処置後３回／週の頻度でマウスの四肢を観察、以下の基準によりポイント化して炎症の定量化をした。それぞれの肢において、正常：０ポイント、軽度炎症又は発赤：１ポイント、重度発赤、腫脹又は使用の抑制：２ポイント、手掌、足底部及び関節部の変形：３ポイント（最低は０ポイント、最高で１２ポイントとなる。）このポイントを以下の式で処理してＩｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ａｃｔｉｖｉｔｙ（以下ＩＡ）を求めた。
Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ａｃｔｉｖｉｔｙ（％）＝四肢の全てのポイント数／１２ｘ１００
以下の結果が得られた。
Ｄａｙ２１から数日で後肢指に発赤が確認できるマウスが増加してきた。Ｄａｙ２８でマウスのＩＡは１６．７％に、Ｄａｙ３９で５０％に達した。図３１に炎症を起こしたマウスの四肢の写真を提示する。ＣＩＡマウス関節炎の所見は以下の通りである。Ａ：後肢指間関節の腫脹（第二指、矢印）、Ｂ：後肢指間関節の腫脹（第四指、矢印）、Ｃ：後肢指間関節の発赤（矢印）、Ｄ：正常後肢、Ｅ：前肢手関節の腫脹（矢印）、Ｆ：正常前肢
このように、上記方法によりＲＡマウスモデルとしてＣＩＡマウスが作成できた。
（２）ＲＡマウスをＤＤＳの静脈内投与により治療する実験
関節炎を起こしているマウスに治療薬を尾静脈から注射して治療が施行された。静脈注射はＤａｙ８からＤａｙ４６の期間で週２回の頻度であった。
Ｄａｙ２８で炎症所見のあるマウスを選び、それぞれの群の炎症ポイントの平均が同じになるように４群に分けた。それぞれの群は１）Ｃｏｎｔｒｏｌ：無治療群、２）ｆｒｅｅ Ｐｒｅｄ：リン酸プレドニゾロンを生理食塩に溶かした水溶液を使用し、リン酸プレドニゾロンの量が一回１００μｇ、週２００μｇ静脈注射した群、３）Ｌ−Ｐｒｅｄ：リン酸プレドニゾロンをリポゾームに包埋、糖鎖を付けないものを使用、リン酸プレドニゾロンの量が一回１０μｇ、週２０μｇ静脈注射した群、４）Ｌ−Ｐｒｅｄ−ＳＬＸ：リン酸プレドニゾロンをリポゾームに包埋、シアリルルイスＸ糖鎖を結合させたものを使用、リン酸プレドニゾロンの量が一回１０μｇ、週２０μｇ静脈注射した群、の４群であった。
この４群のマウスの数はＣｏｎｔｒｏｌ：６匹、ｆｒｅｅ Ｐｒｅｄ：７匹、Ｌ−Ｐｒｅｄ：８匹、Ｌ−Ｐｒｅｄ−ＳＬＸ：８匹であった。
以下の結果が得られた。Ｃｏｎｔｒｏｌでは経時的にＩＡが上昇し、Ｄａｙ４６の時点で６０％を突破した。ｆｒｅｅ ＰｒｅｄではＤａｙ３７でＩＡが約５０％に達した後平衡状態で推移した。Ｌ−ＰｒｅｄではＤａｙ３２からＩＡが上昇し始めＤａｙ４６では約４０％であった。Ｌ−Ｐｒｅｄ−ＳＬＸではＩＡの大きな上昇は観察されず、全経過を通して２０％以下であった（図３２）。
この結果より以下のことが判明した。
ｆｒｅｅ Ｐｒｅｄ群では静脈注射されたリン酸プレドニゾロン量１００μｇ／ｉｎｊｅｃｔｉｏｎでは炎症をコントロールするには不十分であり、Ｃｏｎｔｒｏｌ群と比してＩＡは明らかな差は観られなかった。Ｌ−Ｐｒｅｄ群では静注されたリン酸プレドニゾロン量はｆｒｅｅ Ｐｒｅｄ群の十分の一の１０μｇ／ｉｎｊｅｃｔｉｏｎであったが、ＩＡはｆｒｅｅ Ｐｒｅｄ群と同等かそれ以下であった。これはリン酸プレドニゾロンのリポゾーム化が薬剤の血中滞留性を向上させたことにより、薬効が向上した可能性があると思われた。Ｌ−Ｐｒｅｄ−ＳＬＸ群ではリン酸プレドニゾロン量は同様にｆｒｅｅ Ｐｒｅｄ群の十分の一の１０μｇ／ｉｎｊｅｃｔｉｏｎであったが、ＩＡは全く上昇せず炎症の進行は有意に抑制された。これはＬ−ＰｒｅｄとＬ−Ｐｒｅｄ−ＳＬＸの差、シアリルルイスＸ糖鎖の有無によってもたらされた効果と考えられた。つまりシアリルルイスＸ糖鎖によってリポゾームが効果的に炎症部位へ集積した可能性を示していると思われた。
当ＤＤＳは炎症部位へ極めて有効に治療薬を分配できる能力があることが証明された。これは炎症疾患の治療において病巣部に治療薬を集中させることにより、治療薬の持つ副作用を抑制または治療薬の薬効を増大せしめる可能性が示唆されたものである。
（３）ＲＡマウスをＤＤＳの経口投与により治療する実験
関節炎を起こしているマウスに治療薬を経口投与して治療が施行された。投与はＤａｙ２８からＤａｙ３９の期間で週３回の頻度であった。
Ｄａｙ２８で炎症所見のあるマウスを選び、それぞれの群の炎症ポイントの平均がほぼ同じになるように４群に分けた。それぞれの群は１）Ｃｏｎｔｒｏｌ：無治療群、２）ｆｒｅｅ Ｐｒｅｄ：リン酸プレドニゾロンを生理食塩に溶かした水溶液を使用し、リン酸プレドニゾロンの量が一回１００μｇ、週３００μｇ経口投与した群、３）Ｌ−Ｐｒｅｄ：リン酸プレドニゾロンをリポゾームに包埋、糖鎖を付けないものを使用、リン酸プレドニゾロンの量が一回１０μｇ、週３０μｇ経口投与した群、４）Ｌ−Ｐｒｅｄ−ＳＬＸ：リン酸プレドニゾロンをリポゾームに包埋、シアリルルイスＸ糖鎖を結合させたものを使用、リン酸プレドニゾロンの量が一回１０μｇ、週３０μｇ経口投与した群、の４群であった。
この４群のマウスの数はＣｏｎｔｒｏｌ：２匹、ｆｒｅｅ Ｐｒｅｄ：３匹、Ｌ−Ｐｒｅｄ：３匹、Ｌ−Ｐｒｅｄ−ＳＬＸ：４匹であった。
以下の結果が得られた。
ｆｒｅｅ Ｐｒｅｄ群はｆｅｅｄｉｎｇ ｎｅｅｄｌｅによる胃穿孔で死亡したためＤａｙ３２で実験中止された。Ｃｏｎｔｒｏｌ群、ｆｒｅｅ Ｐｒｅｄ群（Ｄａｙ３２まで）、Ｌ−Ｐｒｅｄ群ではＩＡに有意な差は観られなかった。Ｌ−Ｐｒｅｄ−ＳＬＸ群は炎症の進行を抑えることはできなかったが、Ｄａｙ３９でＬ−Ｐｒｅｄに比してＩＡは有意に低かった（図３３）。
この結果より以下のことが判明した。
Ｃｏｎｔｒｏｌ、ｆｒｅｅ ＰｒｅｄそしてＬ−Ｐｒｅｄの３群では有意な差がみられていない。これはｆｒｅｅ Ｐｒｅｄ群では経口投与されたリン酸プレドニゾロン３００μｇ／ｗｅｅｋの量が炎症の進行を抑制するのに不十分であったと推測された。またＬ−Ｐｒｅｄ群ではリポゾームが腸管で吸収されなかったか、吸収されても経口投与されたリン酸プレドニゾロンの量が３０μｇ／ｗｅｅｋであったことを考えると不十分な量であった可能性が高いと思われた。これに対してＬ−Ｐｒｅｄ−ＳＬＸ群ではＩＡが抑制されていた。これはリポゾームが腸管で吸収され、しかも経口投与リン酸プレドニゾロン量が３０μｇ／ｗｅｅｋであることを考えればリン酸プレドニゾロンが糖鎖付きリポゾームのまま炎症部位へ運ばれた可能性を示唆していると思われた。
この結果は当ＤＤＳが静脈内投与だけでなく、経口投与でも有効に機能することを示している。さらにリポゾームに包埋されれば、従来では経口吸収が不可能な薬物からでも経口投与可能な製剤がつくれる可能性を示唆するものである。
（４）ＲＡマウス治療においてリン酸プレドニゾロンの適量を求める実験
関節炎を起こしているマウスに治療薬を尾静脈から注射して治療が行われた。静脈注射はＤａｙ２８からＤａｙ４６の期間で週２回の頻度であった。
Ｄａｙ２８で炎症所見のあるマウスを選び、それぞれの群の炎症ポイントの平均がほぼ同じになるように３群に分けた。それぞれの群は１）Ｃｏｎｔｒｏｌ：無治療群、２）２５０μｇ：リン酸プレドニゾロンを生理食塩に溶かした水溶液を使用、リン酸プレドニゾロンの量が一回２５０μｇ、週５００μｇ静脈注射した群、３）５００μｇ：リン酸プレドニゾロンを生理食塩に溶かした水溶液を使用、リン酸プレドニゾロンの量が一回５００μｇ、週１０００μｇ静脈注射した群、の３群であった。
この３群のマウスの数はＣｏｎｔｒｏｌ：２匹、２５０μｇ：２匹、５００μｇ：２匹であった。
以下の結果が得られた。
Ｃｏｎｔｒｏｌ群と２５０μｇ群では有意な差は観られなかった。５００μｇ群ではＩＡの上昇が観られず、炎症の進行は抑制されていた（図３４）。
この結果より、以下のことが判明した。 当ＲＡマウスモデルで炎症の進行を抑制するためには最低５００μｇ／ｗｅｅｋより多く、１０００μｇ／ｗｅｅｋまでのリン酸プレドニゾロン量が要求されることが判明した。静脈注射による治療実験ではＬ−Ｐｒｅｄ−ＳＬＸ群が一回１０μｇ、週２０μｇのリン酸プレドニゾロン量で炎症の進行を抑制したことを考えると、当ＤＤＳでは最大５０分の一の薬物量で従来の治療効果と同様の効果を得ることができる可能性があると考えられた。
これは病巣部での薬剤濃度を維持しながら、全身への投与薬剤量を減らすことが可能で薬剤による副作用を減らすことができるし、また副作用が出現しない濃度まで薬剤の全身投与量を上げれば病巣部の薬剤濃度を上げることができ、さらに高い薬効をえることができる可能性を示している。
実施例１７ ２種類の親水性化処理を行ったリポソームの血中滞留性の検討
（１） リポソームの調製
リポソームはコール酸透析法を用いて調製した。すなわち、ジパルミトイルフォスファチジルコリン、コレステロール、ジセチルフォスフェート、ガングリオシド及びジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミンをモル比でそれぞれ３５：４０：５：１５：５の割合で合計脂質量４５．６ｍｇになるように混合し、コール酸ナトリウム４６．９ｍｇ添加し、クロロホルム／メタノール溶液３ｍｌに溶解した。この溶液を蒸発させ、沈殿物を真空中で乾燥させることによって脂質膜を得た。得られた脂質膜をＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ８．４）３ｍｌに懸濁、超音波処理し、透明なミセル懸濁液３ｍｌを得た。このミセル懸濁液にＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）を加えて５ｍｌにしてから、更にＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ８．４）で２２５０ｍｇ／６ｍｌになるよう完全に溶解したリン酸プレドニゾロンを攪拌しながらゆっくりと滴下して均一に混合した後、このリン酸プレドニゾロン入りミセル懸濁液をＰＭ１０膜（ＡｍｉｃｏｎＣｏ．，ＵＳＡ）とＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ８．４）を用いた限外濾過にかけ均一なリポソーム１０ｍｌを調製した。得られた生理食塩懸濁液中（３７℃）のリポソーム粒子の粒子径とゼータ電位をゼータ電位・粒子径・分子量測定装置（Ｍｏｄｅｌ Ｎａｎｏ ＺＳ，Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ．，ＵＫ）により測定した結果、粒子径は５０〜３５０ｎｍ、ゼータ電位は−３０〜−１０ｍＶであった。
（２） リポソーム脂質膜面上のｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅによる親水性化処理
（１）で調製したリポソーム溶液１０ｍｌをＸＭ３００膜（Ａｍｉｃｏｎ Ｃｏ．，ＵＳＡ）とＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）を用いた限外濾過にかけ溶液のｐＨを８．５にした。次に、架橋試薬ｂｉｓ（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ）ｓｕｂｅｒａｔｅ（ＢＳ３；Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｏ．，ＵＳＡ）１０ｍｌを加え、２５℃で２時間攪拌した。その後、更に７℃で一晩攪拌してリポソーム膜上の脂質ジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミンとＢＳ３との化学結合反応を完結した。そして、このリポソーム液をＸＭ３００膜とＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）で限外濾過にかけた。次に、ＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）１ｍｌに溶かしたｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ ４０ｍｇをリポソーム液１０ｍｌに加えて、２５℃で２時間攪拌後、７℃で一晩攪拌してリポソーム膜上の脂質に結合したＢＳ３とｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅとの化学結合反応を完結した。これにより、リポソーム膜の脂質ジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミン上にｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅの水酸基が配位して水和親水性化された。
（３） リポソーム脂質膜面上のセロビオースによる親水性化処理
（１）で調製したリポソーム溶液１０ｍｌをＸＭ３００膜（Ａｍｉｃｏｎ Ｃｏ．，ＵＳＡ）とＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）を用いた限外濾過にかけ溶液のｐＨを８．５にした。次に、架橋試薬ｂｉｓ（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ）ｓｕｂｅｒａｔｅ（ＢＳ３；Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｏ．，ＵＳＡ）１０ｍｌを加え、２５℃で２時間攪拌した。その後、更に７℃で一晩攪拌してリポソーム膜上の脂質ジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミンとＢＳ３との化学結合反応を完結した。そして、このリポソーム液をＸＭ３００膜とＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）で限外濾過にかけた。次に、ＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）１ｍｌに溶かしたセロビオース５０ｍｇをリポソーム液１０ｍｌに加えて、２５℃で２時間攪拌後、７℃で一晩攪拌してリポソーム膜上の脂質に結合したＢＳ３とセロビオースとの化学結合反応を完結した。これにより、リポソーム膜の脂質ジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミン上にセロビオースの水酸基が配位して水和親水性化された。
（４） ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ結合リポソーム膜面上へのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の結合
既報の手法（Ｙａｍａｚａｋｉ，Ｎ．，Ｋｏｄａｍａ，Ｍ．ａｎｄ Ｇａｂｉｕｓ，Ｈ．−Ｊ．（１９９４）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２４２，５６−６５）により、カップリング反応法を用いて行った。すなわち、この反応は２段階化学反応で行い、まずはじめに、（２）で得られた１０ｍｌのリポソーム膜面上に存在するガングリオシドを１ｍｌのＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ８．４）に溶かしたメタ過ヨウ素酸ナトリウム４３ｍｇを加えて室温で２時間攪拌して過ヨウ素酸酸化した後、ＸＭ３００膜とＰＢＳ緩衝液（ｐＨ８．０）で限外濾過することにより酸化されたリポソーム１０ｍｌを得た。このリポソーム液に、２０ｍｇのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を加えて２５℃で２時間攪拌し、次にＰＢＳ（ｐＨ８．０）に２Ｍ ＮａＢＨ３ＣＮ １００μｌを加えて１０℃で一晩攪拌してリポソーム上のガングリオシドとＨＳＡとのカップリング反応でＨＳＡを結合した。そして、ＸＭ３００膜とＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）で限外濾過をした後、ＨＳＡ結合リポソーム液１０ｍｌを得た。
（５） セロビオース結合リポソーム膜面上へのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の結合
既報の手法（Ｙａｍａｚａｋｉ，Ｎ．，Ｋｏｄａｍａ，Ｍ．ａｎｄ Ｇａｂｉｕｓ，Ｈ．−Ｊ．（１９９４）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２４２，５６−６５）により、カップリング反応法を用いて行った。すなわち、この反応は２段階化学反応で行い、まずはじめに、実施例３で得られた１０ｍｌのリポソーム膜面上に存在するガングリオシドを１ｍｌのＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ８．４）に溶かしたメタ過ヨウ素酸ナトリウム４３ｍｇを加えて室温で２時間攪拌して過ヨウ素酸酸化した後、ＸＭ３００膜とＰＢＳ緩衝液（ｐＨ８．０）で限外濾過することにより酸化されたリポソーム１０ｍｌを得た。このリポソーム液に、２０ｍｇのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を加えて２５℃で２時間攪拌し、次にＰＢＳ（ｐＨ８．０）に２Ｍ ＮａＢＨ３ＣＮ １００μｌを加えて１０℃で一晩攪拌してリポソーム上のガングリオシドとＨＳＡとのカップリング反応でＨＳＡを結合した。そして、ＸＭ３００膜とＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）で限外濾過をした後、ＨＳＡ結合リポソーム液１０ｍｌを得た。
（６） リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）上へのｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅの結合によるリンカー蛋白質（ＨＳＡ）の親水性化処理
親水性化試料の一つとしてのリポソームを調製するために、（４）で得たリポソーム液の一部分１ｍｌに架橋試薬３，３’−ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ）ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ（ＤＴＳＳＰ；Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｏ．，ＵＳＡ）１ｍｇを加えて２５℃で２時間、続いて７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）で限外濾過してＤＴＳＳＰがリポソーム上のＨＳＡに結合したリンカー蛋白質（ＨＳＡ）の親水性化処理リポソーム１ｍｌを得た。次に、このリポソーム液にｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ（Ｗａｋｏ Ｃｏ．，Ｊａｐａｎ）１３ｍｇを加えて、２５℃で２時間攪拌し、その後７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のＤＴＳＳＰにｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅの結合を行った。その結果、ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅとヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリンカー蛋白質（ＨＳＡ）の親水性化処理をした比較試料としてのリポソー２ｍｌ（総脂質量２ｍｇ、総蛋白量２００μｇ）が得られた。得られた生理食塩懸濁液中（３７℃）のリポソーム粒子の粒子径とゼータ電位をゼータ電位・粒子径・分子量測定装置（Ｍｏｄｅｌ Ｎａｎｏ ＺＳ，Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ．，ＵＫ）により測定した結果、粒子径は５０〜３５０ｎｍ、ゼータ電位は−３０〜−１０ｍＶであった。
（７） リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）上へのセロビオースの結合によるリンカー蛋白質（ＨＳＡ）の親水性化処理
親水性化試料の一つとしてのリポソームを調製するために、（５）で得たリポソーム液の一部分１ｍｌに架橋試薬３，３’−ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ）ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ（ＤＴＳＳＰ；Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｏ．，ＵＳＡ）１ｍｇを加えて２５℃で２時間、続いて７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）で限外濾過してＤＴＳＳＰがリポソーム上のＨＳＡに結合したリンカー蛋白質（ＨＳＡ）の親水性化処理リポソーム１ｍｌを得た。次に、このリポソーム液セロビオース３０ｍｇを加えて、２５℃で２時間攪拌し、その後７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のＤＴＳＳＰにセロビオースの結合を行った。その結果、セロビオースとヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリンカー蛋白質（ＨＳＡ）の親水性化処理をした親水性化試料の一つとしてのリポソーム２ｍｌ（総脂質量２ｍｇ、総蛋白量２００μｇ）が得られた。得られた生理食塩懸濁液中（３７℃）のリポソーム粒子の粒子径とゼータ電位をゼータ電位・粒子径・分子量測定装置（Ｍｏｄｅｌ Ｎａｎｏ ＺＳ，Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ．，ＵＫ）により測定した結果、粒子径は５０〜３５０ｎｍ、ゼータ電位は−３０〜−１０ｍＶであった。
（８） 親水性化処理をしてないリポソームの調製
リポソームはコール酸透析法を用いて調製した。すなわち、ジパルミトイルフォスファチジルコリン、コレステロール、ジセチルフォスフェート、ガングリオシド（糖脂質糖鎖としてＧＴ１ｂを１００％含むもの）をモル比でそれぞれ３５：４５：５：１５の割合で合計脂質量４５．６ｍｇになるように混合し、コール酸ナトリウム４６．９ｍｇ添加し、クロロホルム／メタノール溶液３ｍｌに溶解した。この溶液を蒸発させ、沈殿物を真空中で乾燥させることによって脂質膜を得た。得られた脂質膜をＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ８．４）３ｍｌに懸濁、超音波処理し、透明なミセル懸濁液３ｍｌを得た。このミセル懸濁液にＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）を加えて１０ｍｌにしてから、更にＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ８．４）で３ｍｇ／１ｍｌになるよう完全に溶解したドキソルビシンを攪拌しながらゆっくりと滴下して均一に混合した後、このドキソルビシン入りミセル懸濁液をＰＭ１０膜（ＡｍｉｃｏｎＣｏ．，ＵＳＡ）とＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ８．４）を用いた限外濾過にかけ均一な親水性化処理をしてないリポソーム粒子懸濁液１０ｍｌを調製した。得られた生理食塩懸濁液中（３７℃）の親水性化処理をしてないリポソーム粒子の粒子径とゼータ電位をゼータ電位・粒子径・分子量測定装置（Ｍｏｄｅｌ Ｎａｎｏ ＺＳ，Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ．，ＵＫ）により測定した結果、粒子径は５０〜３５０ｎｍ、ゼータ電位は−３０〜−１０ｍＶであった。
（９） クロラミンＴ法によるリポソームの１２５Ｉ標識
クロラミンＴ（Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｊａｐａｎ）溶液並びに二亜硫酸ナトリウム溶液をそれぞれ３ｍｇ／ｍｌ並びに５ｍｇ／ｍｌとなるように用事調製して用いた。実施例６から８において調製した３種のリポソームとを５０μｌずつ別々にエッペンチューブに入れ、続いて１２５Ｉ−ＮａＩ（ＮＥＮ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｏｄｕｃｔ，Ｉｎｃ．ＵＳＡ）を１５μｌ、クロラミンＴ溶液を１０μｌ加え反応させた。５分ごとにクロラミンＴ溶液１０μｌを加え、この操作を２回繰り返した後１５分後に還元剤として二亜硫酸ナトリウム１００μｌ加え、反応を停止させた。次に、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０（Ｐｈｒａｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｓｗｅｄｅｎ）カラムクロマト上に乗せ、ＰＢＳで溶出、標識体を精製した。最後に、非標識−リポソーム複合体を添加して比活性（４ｘ１０６Ｂｑ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）を調整して３種類の１２５Ｉ標識リポソーム液を得た。
（１０） 各種のリポソームの担癌マウスでの血中濃度の測定
Ｅｈｒｌｉｃｈ ａｓｃｉｔｅｓ ｔｕｍｏｒ（ＥＡＴ）細胞（約２×１０７個）を雄性ｄｄＹマウス（７週齢）大腿部皮下に移植し、癌組織が０．３〜０．６ｇに発育（６〜８日後）したものを本実験に用いた。この担癌マウスに（９）により１２５Ｉ標識した３種のリポソーム複合体０．２ｍｌを脂質量として３０μｇ／一匹の割合となるように尾静脈に注入投与し、５分後に血液を採取し、その放射能をガンマカウンタ（Ａｌｏｋａ ＡＲＣ ３００）で測定した。なお、血液への放射能分布量は、投与全放射能に対する血液１ｍｌ当たりの放射能の割合（％投与量／ｍｌ血液）で表示した。図３５に示すとおり、２種類の親水性化処理により血中滞留性が向上するが、とりわけトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンにより親水性化処理をしたリポソームの血中滞留性の向上が顕著であった。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
産業上の利用の可能性
本発明の炎症性疾患治療用標的指向性リポソームは、炎症性疾患部位に特異的に取り込まれ、リポソームに封入された炎症性疾患治療薬剤を放出する。本発明のリポソームは炎症性疾患に対するドラッグデリバリーシステムのための治療用または診断用薬剤としての効果を有する。
本発明のシアリルルイスＸ糖鎖等の糖鎖を結合したリポソームは、Ｅ，Ｐ−セレクチンを発現する病変部位に特異的に到達し、該部位で医薬効果を有する薬剤を放出するので、炎症性疾患治療用または診断用製剤として利用可能である。
実施例に示すように、本発明の炎症性疾患治療用標的指向性リポソームに抗炎症薬を封入して投与した場合、抗炎症薬を単独投与した場合に比較して、数十倍から数百倍の薬剤が炎症部位に集積し著しい効果を発揮することができる。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖鎖がリポソーム膜に結合されている糖鎖修飾リポソームを含む炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
【請求項２】
リポソームの構成脂質が、フォスファチジルコリン類（モル比０〜７０％）、フォスファチジルエタノールアミン類（モル比０〜３０％）、フォスファチジン酸類、長鎖アルキルリン酸塩類およびジセチルリン酸類からなる群から選択される１種以上の脂質（モル比０〜３０％）、ガングリオシド類、糖脂質類、フォスファチジルグリセロール類およびスフィンゴミエリン類からなる群から選択される１種以上の脂質（モル比０〜４０％）、ならびにコレステロール類（モル比０〜７０％）を含む、請求項１記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
【請求項３】
ガングリオシド類、糖脂質類、フォスファチジルグリセロール類、スフィンゴミエリン類およびコレステロール類からなる群から選択される少なくとも１種の脂質がリポソーム表面上で集合しラフトを形成している請求項２記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
【請求項４】
糖鎖の種類および密度が制御されて結合されている、請求項１から３のいずれか１項に記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
【請求項５】
リポソームの粒径が３０〜５００ｎｍである、請求項１から４のいずれか１項に記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
【請求項６】
リポソームの粒径が５０〜３００ｎｍである、請求項５記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
【請求項７】
リポソームのゼータ電位が−５０〜１０ｍＶである、請求項１から６のいずれか１項記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
【請求項８】
リポソームのゼータ電位が−４０〜０ｍＶである、請求項７記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
【請求項９】
リポソームのゼータ電位が−３０〜−１０ｍＶである、請求項８記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
【請求項１０】
糖鎖がリンカー蛋白質を介してリポソーム膜に結合されている、請求項１から９のいずれか１項に記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
【請求項１１】
リンカー蛋白質が生体由来蛋白質である請求項１０記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
【請求項１２】
リンカー蛋白質がヒト由来蛋白質である請求項１１記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
【請求項１３】
リンカー蛋白質がヒト由来血清蛋白質である請求項１２記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
【請求項１４】
リンカー蛋白質がヒト血清アルブミンまたはウシ血清アルブミンである請求項１０記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
【請求項１５】
リンカー蛋白質がリポソーム表面上に形成されているガングリオシド類、糖脂質類、フォスファチジルグリセロール類、スフィンゴミエリン類およびコレステロール類からなる群から選択される少なくとも１種の脂質からなるラフト上に結合している請求項１から１４のいずれか１項に記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
【請求項１６】
リポソーム膜および／またはリンカー蛋白質に親水性化合物が結合することにより親水性化されている、請求項１から１５のいずれか１項に記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
【請求項１７】
親水性化合物が低分子物質である、請求項１６記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
【請求項１８】
親水性化合物が糖鎖に対する立体障害となりにくく標的細胞膜面上のレクチンによる糖鎖分子認識反応の進行を妨げない、請求項１６または１７記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
【請求項１９】
親水性化合物が水酸基を有する請求項１６から１８のいずれか１項に記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
【請求項２０】
親水性化合物がアミノアルコール類である請求項１６から１９のいずれか１項に記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
【請求項２１】
親水性化合物がリポソーム膜表面に直接結合している請求項１６から２０のいずれか１項に記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
【請求項２２】
親水性化合物により親水性化され、該親水性化合物が、一般式（１）
Ｘ−Ｒ１（Ｒ２ＯＨ）ｎ 式（１）
で示される請求項１６記載の糖鎖修飾リポソームであって、Ｒ１は、Ｃ１からＣ４０の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を示し、Ｒ２は存在しないかもしくはＣ１からＣ４０の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を示し、Ｘはリポソーム脂質またはリンカー蛋白質と直接または架橋用の二価試薬と結合する反応性官能基を示し、ｎは自然数を示す、炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
【請求項２３】
親水性化合物により親水性化され、該親水性化合物が、一般式（２）
Ｈ２Ｎ−Ｒ３−（Ｒ４ＯＨ）ｎ 式（２）
で示される請求項１６記載の糖鎖修飾リポソームであって、Ｒ３は、Ｃ１からＣ４０の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を示し、Ｒ４は存在しないかもしくはＣ１からＣ４０の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を示し、Ｈ２Ｎはリポソーム脂質またはリンカー蛋白質と直接または架橋用の二価試薬と結合する反応性官能基を示し、ｎは自然数を示す、炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
【請求項２４】
親水性化合物により親水性化され、該親水性化合物が、一般式（３）
Ｈ２Ｎ−Ｒ５（ＯＨ）ｎ 式（３）
で示される請求項１６記載の糖鎖修飾リポソームであって、Ｒ５は、Ｃ１からＣ４０の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を示し、Ｈ２Ｎはリポソーム脂質またはリンカー蛋白質と直接または架橋用の二価試薬と結合する反応性官能基を示し、ｎは自然数を示す、炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
【請求項２５】
リポソーム膜および／またはリンカー蛋白質にトリス（ヒドロキシアルキル）アミノアルカンである親水性化合物を共有結合により結合させることによりリポソーム膜および／またはリンカー蛋白質が親水性化されている、請求項１６記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
【請求項２６】
リポソーム膜および／またはリンカー蛋白質にトリス（ヒドロキシメチル）アミノエタン、トリス（ヒドロキシエチル）アミノエタン、トリス（ヒドロキシプロピル）アミノエタン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、トリス（ヒドロキシエチル）アミノメタン、トリス（ヒドロキシプロピル）アミノメタン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノプロパン、トリス（ヒドロキシエチル）アミノプロパン、トリス（ヒドロキシプロピル）アミノプロパンからなる群から選択される親水性化合物を共有結合により結合させることによりリポソーム膜および／またはリンカー蛋白質が親水性化されている、請求項１６記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
【請求項２７】
糖鎖修飾リポソームが、各組織の細胞膜面上に存在するレセプターとしてのセレクチン、ＤＣ−ＳＩＧＮ、ＤＣ−ＳＧＮＲ、コレクチンおよびマンノース結合レクチンを含むＣ−タイプレクチン、シグレックを含むＩタイプレクチン、マンノース−６−リン酸受容体を含むＰタイプレクチン、Ｒタイプレクチン、Ｌタイプレクチン、Ｍタイプレクチン、ガレクチンからなる群から選択されるレクチンを標的とする請求項１から２６のいずれか１項に記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
【請求項２８】
糖鎖修飾リポソームがＥ−セレクチン、Ｐ−セレクチンおよびＬ−セレクチンからなる群から選択されるセレクチンを標的とする請求項２７記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
【請求項２９】
リポソームに結合した糖鎖の結合密度が、リポソームに結合させるリンカー蛋白質１分子当り１〜６０個である、請求項１から２８のいずれか１項に記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
【請求項３０】
リポソームに結合した糖鎖の結合密度が、リンカー蛋白質を用いる場合は、リポソーム１粒子当り１〜３００００個であり、リンカー蛋白質を用いない場合は、リポソーム１粒子当り最高１〜５０００００個である、請求項１から２８のいずれか１項に記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
【請求項３１】
糖鎖がルイスＸ型三糖鎖、シアリルルイスＸ型四糖鎖、３’−シアリルラクトサミン三糖鎖、６’−シアリルラクトサミン三糖鎖、アルファ１，２マンノビオース二糖鎖、アルファ１，３マンノビオース二糖鎖、アルファ１，４マンノビオース二糖鎖、アルファ１，６マンノビオース二糖鎖、アルファ１，３アルファ１，６マンノトリオース三糖鎖、オリゴマンノース３五糖鎖、オリゴマンノース４ｂ六糖鎖、オリゴマンノース５七糖鎖、オリゴマンノース６八糖鎖、オリゴマンノース７九糖鎖、オリゴマンノース８十糖鎖、オリゴマンノース９十一糖鎖、ラクトース二糖鎖、２’−フコシルラクトース三糖鎖、ジフコシルラクトース四糖類、３−フコシルラクトース三糖鎖、３’−シアリルラクトース三糖鎖および６’−シアリルラクトース三糖鎖からなる群から選択される、請求項１から３０のいずれか１項に記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
【請求項３２】
糖鎖修飾リポソームが含む薬剤が、副腎皮質ホルモン、抗炎症薬、免疫抑制剤、抗がん剤、抗菌薬、抗ウイルス薬、血管新生抑制剤、サイトカインやケモカイン、抗サイトカイン抗体や抗ケモカイン抗体、抗サイトカイン・ケモカイン受容体抗体、ｓｉＲＮＡやＤＮＡなどの遺伝子治療関連の核酸製剤、神経保護因子および抗体医薬からなる群から選択される請求項１から３１のいずれか１項に記載の炎症性疾患治療用医薬組成物。
【請求項３３】
糖鎖修飾リポソームが含む薬剤が、副腎皮質ホルモンまたは抗炎症薬である請求項３２記載の炎症性疾患治療用医薬組成物。
【請求項３４】
糖鎖修飾リポソームが含む薬剤がプレドニゾロンである請求項３３記載の炎症性疾患治療用医薬組成物。
【請求項３５】
薬剤が、薬剤を単独投与した場合に比べ、炎症部位に１０倍以上多く集積し得る、請求項３２から３４のいずれか１項に記載の炎症性疾患治療用医薬組成物。
【請求項３６】
炎症性疾患が脳炎、炎症性眼疾患、耳炎、咽頭炎、肺炎、胃炎、腸炎、肝炎、膵炎、腎炎、膀胱炎、尿道炎、子宮体炎、膣炎、関節炎、末梢神経炎、悪性腫瘍、感染性疾患、リウマチ、全身性エリテマトーデス、サルコイドーシスなどの自己免疫疾患、心筋梗塞、脳梗塞などの虚血性疾患、糖尿病、痛風などの代謝性疾患、外傷・熱傷・化学腐食、アルツハイマー病などの神経変性疾患からなる群から選択される、請求項１から３５のいずれか１項に記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
【請求項３７】
炎症性疾患が炎症性眼疾患である請求項３６記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
【請求項３８】
炎症性疾患がリウマチである請求項３６記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
【請求項３９】
炎症性疾患が腸炎である請求項３６記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
【請求項４０】
経口投与用医薬組成物である、請求項１から３９のいずれか１項に記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
【請求項４１】
非経口投与用医薬組成物である、請求項１から３９のいずれか１項に記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
【請求項４２】
リポソーム膜が親水性化されており、表面に糖鎖が結合していないリポソームを含む炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
【請求項４３】
リポソームの構成脂質が、フォスファチジルコリン類（モル比０〜７０％）、フォスファチジルエタノールアミン類（モル比０〜３０％）、フォスファチジン酸類、長鎖アルキルリン酸塩類およびジセチルリン酸類からなる群から選択される１種以上の脂質（モル比０〜３０％）、ガングリオシド類、糖脂質類、フォスファチジルグリセロール類およびスフィンゴミエリン類からなる群から選択される１種以上の脂質（モル比０〜４０％）、ならびにコレステロール類（モル比０〜７０％）を含む、請求項４２記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
【請求項４４】
リポソームが、さらに蛋白質を含む請求項４３記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
【請求項４５】
リポソーム膜および／またはリンカー蛋白質に親水性化合物が結合することにより親水性化されている、請求項４２から４４のいずれか１項に記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
【請求項４６】
親水性化合物が低分子物質である、請求項４５記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
【請求項４７】
親水性化合物が水酸基を有する請求項４５または４６に記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
【請求項４８】
親水性化合物がアミノアルコール類である請求項４５から４７のいずれか１項に記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
【請求項４９】
親水性化合物がリポソーム膜表面に直接結合している請求項４５から４８のいずれか１項に記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
【請求項５０】
親水性化合物により親水性化され、該親水性化合物が、一般式（１）
Ｘ−Ｒ１（Ｒ２ＯＨ）ｎ 式（１）
で示される請求項４５記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物であって、Ｒ１は、Ｃ１からＣ４０の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を示し、Ｒ２は存在しないかもしくはＣ１からＣ４０の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を示し、Ｘはリポソーム脂質またはリンカー蛋白質と直接または架橋用の二価試薬と結合する反応性官能基を示し、ｎは自然数を示す、炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
【請求項５１】
親水性化合物により親水性化され、該親水性化合物が、一般式（２）
Ｈ２Ｎ−Ｒ３−（Ｒ４ＯＨ）ｎ 式（２）
で示される請求項４５記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物であって、Ｒ３は、Ｃ１からＣ４０の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を示し、Ｒ４は存在しないかもしくはＣ１からＣ４０の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を示し、Ｈ２Ｎはリポソーム脂質またはリンカー蛋白質と直接または架橋用の二価試薬と結合する反応性官能基を示し、ｎは自然数を示す、炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
【請求項５２】
親水性化合物により親水性化され、該親水性化合物が、一般式（３）
Ｈ２Ｎ−Ｒ５（ＯＨ）ｎ 式（３）
で示される請求項４５記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物であって、Ｒ５は、Ｃ１からＣ４０の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を示し、Ｈ２Ｎはリポソーム脂質またはリンカー蛋白質と直接または架橋用の二価試薬と結合する反応性官能基を示し、ｎは自然数を示す、炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
【請求項５３】
リポソーム膜および／またはリンカー蛋白質にトリス（ヒドロキシアルキル）アミノアルカンである親水性化合物を共有結合により結合させることによりリポソーム膜および／またはリンカー蛋白質が親水性化されている、請求項４５記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
【請求項５４】
リポソーム膜および／またはリンカー蛋白質にトリス（ヒドロキシメチル）アミノエタン、トリス（ヒドロキシエチル）アミノエタン、トリス（ヒドロキシプロピル）アミノエタン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、トリス（ヒドロキシエチル）アミノメタン、トリス（ヒドロキシプロピル）アミノメタン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノプロパン、トリス（ヒドロキシエチル）アミノプロパン、トリス（ヒドロキシプロピル）アミノプロパンからなる群から選択される親水性化合物を共有結合により結合させることによりリポソーム膜および／またはリンカー蛋白質が親水性化されている、請求項５３記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
【請求項５５】
リポソームが含む薬剤が、副腎皮質ホルモン、抗炎症薬、免疫抑制剤、抗がん剤、抗菌薬、抗ウイルス薬、血管新生抑制剤、サイトカインやケモカイン、抗サイトカイン抗体や抗ケモカイン抗体、抗サイトカイン・ケモカイン受容体抗体、ｓｉＲＮＡやＤＮＡなどの遺伝子治療関連の核酸製剤、神経保護因子および抗体医薬からなる群から選択される請求項４２から５４のいずれか１項に記載の炎症性疾患治療用医薬組成物。
【請求項５６】
リポソームが含む薬剤が、副腎皮質ホルモンまたは抗炎症薬である請求項５５記載の炎症性疾患治療用医薬組成物。
【請求項５７】
リポソームが含む薬剤がプレドニゾロンである請求項５６記載の炎症性疾患治療用医薬組成物。
【請求項５８】
薬剤が、薬剤を単独投与した場合に比べ、炎症部位に１０倍以上多く集積し得る、請求項５５から５７のいずれか１項に記載の炎症性疾患治療用医薬組成物。
【請求項５９】
炎症性疾患が脳炎、炎症性眼疾患、耳炎、咽頭炎、肺炎、胃炎、腸炎、肝炎、膵炎、腎炎、膀胱炎、尿道炎、子宮体炎、膣炎、関節炎、末梢神経炎、悪性腫瘍、感染性疾患、リウマチ、全身性エリテマトーデス、サルコイドーシスなどの自己免疫疾患、心筋梗塞、脳梗塞などの虚血性疾患、糖尿病、痛風などの代謝性疾患、外傷・熱傷・化学腐食、アルツハイマー病などの神経変性疾患からなる群から選択される、請求項４２から５８のいずれか１項に記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
【請求項６０】
炎症性疾患が炎症性眼疾患である請求項５９記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
【請求項６１】
炎症性疾患がリウマチである請求項５９記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
【請求項６２】
炎症性疾患が腸炎である請求項５９記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
【請求項６３】
経口投与用医薬組成物である、請求項４２から６２のいずれか１項に記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
【請求項６４】
非経口投与用医薬組成物である、請求項４２から６２のいずれか１項に記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
【請求項１】
糖鎖がリポソーム膜に結合されている糖鎖修飾リポソームを含む炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
【請求項２】
リポソームの構成脂質が、フォスファチジルコリン類（モル比０〜７０％）、フォスファチジルエタノールアミン類（モル比０〜３０％）、フォスファチジン酸類、長鎖アルキルリン酸塩類およびジセチルリン酸類からなる群から選択される１種以上の脂質（モル比０〜３０％）、ガングリオシド類、糖脂質類、フォスファチジルグリセロール類およびスフィンゴミエリン類からなる群から選択される１種以上の脂質（モル比０〜４０％）、ならびにコレステロール類（モル比０〜７０％）を含む、請求項１記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
【請求項３】
ガングリオシド類、糖脂質類、フォスファチジルグリセロール類、スフィンゴミエリン類およびコレステロール類からなる群から選択される少なくとも１種の脂質がリポソーム表面上で集合しラフトを形成している請求項２記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
【請求項４】
糖鎖の種類および密度が制御されて結合されている、請求項１から３のいずれか１項に記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
【請求項５】
リポソームの粒径が３０〜５００ｎｍである、請求項１から４のいずれか１項に記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
【請求項６】
リポソームの粒径が５０〜３００ｎｍである、請求項５記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
【請求項７】
リポソームのゼータ電位が−５０〜１０ｍＶである、請求項１から６のいずれか１項記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
【請求項８】
リポソームのゼータ電位が−４０〜０ｍＶである、請求項７記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
【請求項９】
リポソームのゼータ電位が−３０〜−１０ｍＶである、請求項８記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
【請求項１０】
糖鎖がリンカー蛋白質を介してリポソーム膜に結合されている、請求項１から９のいずれか１項に記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
【請求項１１】
リンカー蛋白質が生体由来蛋白質である請求項１０記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
【請求項１２】
リンカー蛋白質がヒト由来蛋白質である請求項１１記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
【請求項１３】
リンカー蛋白質がヒト由来血清蛋白質である請求項１２記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
【請求項１４】
リンカー蛋白質がヒト血清アルブミンまたはウシ血清アルブミンである請求項１０記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
【請求項１５】
リンカー蛋白質がリポソーム表面上に形成されているガングリオシド類、糖脂質類、フォスファチジルグリセロール類、スフィンゴミエリン類およびコレステロール類からなる群から選択される少なくとも１種の脂質からなるラフト上に結合している請求項１から１４のいずれか１項に記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
【請求項１６】
リポソーム膜および／またはリンカー蛋白質に親水性化合物が結合することにより親水性化されている、請求項１から１５のいずれか１項に記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
【請求項１７】
親水性化合物が低分子物質である、請求項１６記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
【請求項１８】
親水性化合物が糖鎖に対する立体障害となりにくく標的細胞膜面上のレクチンによる糖鎖分子認識反応の進行を妨げない、請求項１６または１７記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
【請求項１９】
親水性化合物が水酸基を有する請求項１６から１８のいずれか１項に記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
【請求項２０】
親水性化合物がアミノアルコール類である請求項１６から１９のいずれか１項に記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
【請求項２１】
親水性化合物がリポソーム膜表面に直接結合している請求項１６から２０のいずれか１項に記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
【請求項２２】
親水性化合物により親水性化され、該親水性化合物が、一般式（１）
Ｘ−Ｒ１（Ｒ２ＯＨ）ｎ 式（１）
で示される請求項１６記載の糖鎖修飾リポソームであって、Ｒ１は、Ｃ１からＣ４０の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を示し、Ｒ２は存在しないかもしくはＣ１からＣ４０の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を示し、Ｘはリポソーム脂質またはリンカー蛋白質と直接または架橋用の二価試薬と結合する反応性官能基を示し、ｎは自然数を示す、炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
【請求項２３】
親水性化合物により親水性化され、該親水性化合物が、一般式（２）
Ｈ２Ｎ−Ｒ３−（Ｒ４ＯＨ）ｎ 式（２）
で示される請求項１６記載の糖鎖修飾リポソームであって、Ｒ３は、Ｃ１からＣ４０の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を示し、Ｒ４は存在しないかもしくはＣ１からＣ４０の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を示し、Ｈ２Ｎはリポソーム脂質またはリンカー蛋白質と直接または架橋用の二価試薬と結合する反応性官能基を示し、ｎは自然数を示す、炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
【請求項２４】
親水性化合物により親水性化され、該親水性化合物が、一般式（３）
Ｈ２Ｎ−Ｒ５（ＯＨ）ｎ 式（３）
で示される請求項１６記載の糖鎖修飾リポソームであって、Ｒ５は、Ｃ１からＣ４０の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を示し、Ｈ２Ｎはリポソーム脂質またはリンカー蛋白質と直接または架橋用の二価試薬と結合する反応性官能基を示し、ｎは自然数を示す、炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
【請求項２５】
リポソーム膜および／またはリンカー蛋白質にトリス（ヒドロキシアルキル）アミノアルカンである親水性化合物を共有結合により結合させることによりリポソーム膜および／またはリンカー蛋白質が親水性化されている、請求項１６記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
【請求項２６】
リポソーム膜および／またはリンカー蛋白質にトリス（ヒドロキシメチル）アミノエタン、トリス（ヒドロキシエチル）アミノエタン、トリス（ヒドロキシプロピル）アミノエタン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、トリス（ヒドロキシエチル）アミノメタン、トリス（ヒドロキシプロピル）アミノメタン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノプロパン、トリス（ヒドロキシエチル）アミノプロパン、トリス（ヒドロキシプロピル）アミノプロパンからなる群から選択される親水性化合物を共有結合により結合させることによりリポソーム膜および／またはリンカー蛋白質が親水性化されている、請求項１６記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
【請求項２７】
糖鎖修飾リポソームが、各組織の細胞膜面上に存在するレセプターとしてのセレクチン、ＤＣ−ＳＩＧＮ、ＤＣ−ＳＧＮＲ、コレクチンおよびマンノース結合レクチンを含むＣ−タイプレクチン、シグレックを含むＩタイプレクチン、マンノース−６−リン酸受容体を含むＰタイプレクチン、Ｒタイプレクチン、Ｌタイプレクチン、Ｍタイプレクチン、ガレクチンからなる群から選択されるレクチンを標的とする請求項１から２６のいずれか１項に記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
【請求項２８】
糖鎖修飾リポソームがＥ−セレクチン、Ｐ−セレクチンおよびＬ−セレクチンからなる群から選択されるセレクチンを標的とする請求項２７記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
【請求項２９】
リポソームに結合した糖鎖の結合密度が、リポソームに結合させるリンカー蛋白質１分子当り１〜６０個である、請求項１から２８のいずれか１項に記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
【請求項３０】
リポソームに結合した糖鎖の結合密度が、リンカー蛋白質を用いる場合は、リポソーム１粒子当り１〜３００００個であり、リンカー蛋白質を用いない場合は、リポソーム１粒子当り最高１〜５０００００個である、請求項１から２８のいずれか１項に記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
【請求項３１】
糖鎖がルイスＸ型三糖鎖、シアリルルイスＸ型四糖鎖、３’−シアリルラクトサミン三糖鎖、６’−シアリルラクトサミン三糖鎖、アルファ１，２マンノビオース二糖鎖、アルファ１，３マンノビオース二糖鎖、アルファ１，４マンノビオース二糖鎖、アルファ１，６マンノビオース二糖鎖、アルファ１，３アルファ１，６マンノトリオース三糖鎖、オリゴマンノース３五糖鎖、オリゴマンノース４ｂ六糖鎖、オリゴマンノース５七糖鎖、オリゴマンノース６八糖鎖、オリゴマンノース７九糖鎖、オリゴマンノース８十糖鎖、オリゴマンノース９十一糖鎖、ラクトース二糖鎖、２’−フコシルラクトース三糖鎖、ジフコシルラクトース四糖類、３−フコシルラクトース三糖鎖、３’−シアリルラクトース三糖鎖および６’−シアリルラクトース三糖鎖からなる群から選択される、請求項１から３０のいずれか１項に記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
【請求項３２】
糖鎖修飾リポソームが含む薬剤が、副腎皮質ホルモン、抗炎症薬、免疫抑制剤、抗がん剤、抗菌薬、抗ウイルス薬、血管新生抑制剤、サイトカインやケモカイン、抗サイトカイン抗体や抗ケモカイン抗体、抗サイトカイン・ケモカイン受容体抗体、ｓｉＲＮＡやＤＮＡなどの遺伝子治療関連の核酸製剤、神経保護因子および抗体医薬からなる群から選択される請求項１から３１のいずれか１項に記載の炎症性疾患治療用医薬組成物。
【請求項３３】
糖鎖修飾リポソームが含む薬剤が、副腎皮質ホルモンまたは抗炎症薬である請求項３２記載の炎症性疾患治療用医薬組成物。
【請求項３４】
糖鎖修飾リポソームが含む薬剤がプレドニゾロンである請求項３３記載の炎症性疾患治療用医薬組成物。
【請求項３５】
薬剤が、薬剤を単独投与した場合に比べ、炎症部位に１０倍以上多く集積し得る、請求項３２から３４のいずれか１項に記載の炎症性疾患治療用医薬組成物。
【請求項３６】
炎症性疾患が脳炎、炎症性眼疾患、耳炎、咽頭炎、肺炎、胃炎、腸炎、肝炎、膵炎、腎炎、膀胱炎、尿道炎、子宮体炎、膣炎、関節炎、末梢神経炎、悪性腫瘍、感染性疾患、リウマチ、全身性エリテマトーデス、サルコイドーシスなどの自己免疫疾患、心筋梗塞、脳梗塞などの虚血性疾患、糖尿病、痛風などの代謝性疾患、外傷・熱傷・化学腐食、アルツハイマー病などの神経変性疾患からなる群から選択される、請求項１から３５のいずれか１項に記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
【請求項３７】
炎症性疾患が炎症性眼疾患である請求項３６記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
【請求項３８】
炎症性疾患がリウマチである請求項３６記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
【請求項３９】
炎症性疾患が腸炎である請求項３６記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
【請求項４０】
経口投与用医薬組成物である、請求項１から３９のいずれか１項に記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
【請求項４１】
非経口投与用医薬組成物である、請求項１から３９のいずれか１項に記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
【請求項４２】
リポソーム膜が親水性化されており、表面に糖鎖が結合していないリポソームを含む炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
【請求項４３】
リポソームの構成脂質が、フォスファチジルコリン類（モル比０〜７０％）、フォスファチジルエタノールアミン類（モル比０〜３０％）、フォスファチジン酸類、長鎖アルキルリン酸塩類およびジセチルリン酸類からなる群から選択される１種以上の脂質（モル比０〜３０％）、ガングリオシド類、糖脂質類、フォスファチジルグリセロール類およびスフィンゴミエリン類からなる群から選択される１種以上の脂質（モル比０〜４０％）、ならびにコレステロール類（モル比０〜７０％）を含む、請求項４２記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
【請求項４４】
リポソームが、さらに蛋白質を含む請求項４３記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
【請求項４５】
リポソーム膜および／またはリンカー蛋白質に親水性化合物が結合することにより親水性化されている、請求項４２から４４のいずれか１項に記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
【請求項４６】
親水性化合物が低分子物質である、請求項４５記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
【請求項４７】
親水性化合物が水酸基を有する請求項４５または４６に記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
【請求項４８】
親水性化合物がアミノアルコール類である請求項４５から４７のいずれか１項に記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
【請求項４９】
親水性化合物がリポソーム膜表面に直接結合している請求項４５から４８のいずれか１項に記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
【請求項５０】
親水性化合物により親水性化され、該親水性化合物が、一般式（１）
Ｘ−Ｒ１（Ｒ２ＯＨ）ｎ 式（１）
で示される請求項４５記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物であって、Ｒ１は、Ｃ１からＣ４０の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を示し、Ｒ２は存在しないかもしくはＣ１からＣ４０の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を示し、Ｘはリポソーム脂質またはリンカー蛋白質と直接または架橋用の二価試薬と結合する反応性官能基を示し、ｎは自然数を示す、炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
【請求項５１】
親水性化合物により親水性化され、該親水性化合物が、一般式（２）
Ｈ２Ｎ−Ｒ３−（Ｒ４ＯＨ）ｎ 式（２）
で示される請求項４５記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物であって、Ｒ３は、Ｃ１からＣ４０の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を示し、Ｒ４は存在しないかもしくはＣ１からＣ４０の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を示し、Ｈ２Ｎはリポソーム脂質またはリンカー蛋白質と直接または架橋用の二価試薬と結合する反応性官能基を示し、ｎは自然数を示す、炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
【請求項５２】
親水性化合物により親水性化され、該親水性化合物が、一般式（３）
Ｈ２Ｎ−Ｒ５（ＯＨ）ｎ 式（３）
で示される請求項４５記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物であって、Ｒ５は、Ｃ１からＣ４０の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を示し、Ｈ２Ｎはリポソーム脂質またはリンカー蛋白質と直接または架橋用の二価試薬と結合する反応性官能基を示し、ｎは自然数を示す、炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
【請求項５３】
リポソーム膜および／またはリンカー蛋白質にトリス（ヒドロキシアルキル）アミノアルカンである親水性化合物を共有結合により結合させることによりリポソーム膜および／またはリンカー蛋白質が親水性化されている、請求項４５記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
【請求項５４】
リポソーム膜および／またはリンカー蛋白質にトリス（ヒドロキシメチル）アミノエタン、トリス（ヒドロキシエチル）アミノエタン、トリス（ヒドロキシプロピル）アミノエタン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、トリス（ヒドロキシエチル）アミノメタン、トリス（ヒドロキシプロピル）アミノメタン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノプロパン、トリス（ヒドロキシエチル）アミノプロパン、トリス（ヒドロキシプロピル）アミノプロパンからなる群から選択される親水性化合物を共有結合により結合させることによりリポソーム膜および／またはリンカー蛋白質が親水性化されている、請求項５３記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
【請求項５５】
リポソームが含む薬剤が、副腎皮質ホルモン、抗炎症薬、免疫抑制剤、抗がん剤、抗菌薬、抗ウイルス薬、血管新生抑制剤、サイトカインやケモカイン、抗サイトカイン抗体や抗ケモカイン抗体、抗サイトカイン・ケモカイン受容体抗体、ｓｉＲＮＡやＤＮＡなどの遺伝子治療関連の核酸製剤、神経保護因子および抗体医薬からなる群から選択される請求項４２から５４のいずれか１項に記載の炎症性疾患治療用医薬組成物。
【請求項５６】
リポソームが含む薬剤が、副腎皮質ホルモンまたは抗炎症薬である請求項５５記載の炎症性疾患治療用医薬組成物。
【請求項５７】
リポソームが含む薬剤がプレドニゾロンである請求項５６記載の炎症性疾患治療用医薬組成物。
【請求項５８】
薬剤が、薬剤を単独投与した場合に比べ、炎症部位に１０倍以上多く集積し得る、請求項５５から５７のいずれか１項に記載の炎症性疾患治療用医薬組成物。
【請求項５９】
炎症性疾患が脳炎、炎症性眼疾患、耳炎、咽頭炎、肺炎、胃炎、腸炎、肝炎、膵炎、腎炎、膀胱炎、尿道炎、子宮体炎、膣炎、関節炎、末梢神経炎、悪性腫瘍、感染性疾患、リウマチ、全身性エリテマトーデス、サルコイドーシスなどの自己免疫疾患、心筋梗塞、脳梗塞などの虚血性疾患、糖尿病、痛風などの代謝性疾患、外傷・熱傷・化学腐食、アルツハイマー病などの神経変性疾患からなる群から選択される、請求項４２から５８のいずれか１項に記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
【請求項６０】
炎症性疾患が炎症性眼疾患である請求項５９記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
【請求項６１】
炎症性疾患がリウマチである請求項５９記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
【請求項６２】
炎症性疾患が腸炎である請求項５９記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
【請求項６３】
経口投与用医薬組成物である、請求項４２から６２のいずれか１項に記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
【請求項６４】
非経口投与用医薬組成物である、請求項４２から６２のいずれか１項に記載の炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物。
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０１１６３３
【国際公開日】平成１７年２月１０日（２００５．２．１０）
【発行日】平成１８年９月１４日（２００６．９．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５１２６０２（Ｐ２００５−５１２６０２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１１３２９
【国際出願日】平成１６年７月３０日（２００４．７．３０）
【出願人】（３０１０２１５３３）独立行政法人産業技術総合研究所 (6,529)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１７年２月１０日（２００５．２．１０）
【発行日】平成１８年９月１４日（２００６．９．１４）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１１３２９
【国際出願日】平成１６年７月３０日（２００４．７．３０）
【出願人】（３０１０２１５３３）独立行政法人産業技術総合研究所 (6,529)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]