本発明は、正に荷電した部分を含有するポリマー複合体を提供する。また、ポリマー送達システムを作出する方法、およびポリマー送達システムを使用して哺乳動物を治療する方法も開示する。

【発明の詳細な説明】
【関連出願の説明】
【０００１】
本出願は、２００６年９月１５日に出願された米国仮特許出願第６０／８４４，９４４号明細書、２００６年９月１５日に出願された同第６０／８４４，９４５号明細書、２００６年１１月２７日に出願された同第６０／８６１，３４９号明細書、２００６年１１月２７日に出願された同第６０／８６１，３５０号明細書、２００７年４月１３日に出願された同第６０／９１１，７３４号明細書および２００７年８月２０日に出願された同第６０／９５６，８１４号明細書の優先権の利益を主張し、それらのそれぞれの内容は、本明細書において参照により援用される。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、正に荷電した部分を含有するポリマー複合体に関する。また、ポリマー送達システムを作出する方法、およびポリマー送達システムを使用して哺乳動物を治療する方法についても開示する。
【背景技術】
【０００３】
これまでに、タンパク質、ペプチドなどのような生物学的に活性な部分の送達に使用される場合、ポリマーまたはポリマーを含有する複合体の正電荷を増加することが有益であることが分かっている。例えば、本発明の譲受人に譲渡された特許文献１は、単一の第二級または第三級アミン基が結合しているＰＥＧおよび関連ポリアルキレンオキシドについて記載している。組み合わせることの目的は、アミンが導入されたポリマーに、複合体の効果をモジュレートするｐＩおよび／またはｐＨを付与させることであった。それ故、複合体に含まれる生物活性材料の等電点は、所望されるポイントに調整され得る。上記の特許文献１は、従来の活性化されたポリマーで観察される効果を妨害する溶液を提供し、ここで、しばしば、至適活性の損失に至る等電点の偏向が観察された。
【０００４】
数年間の間、いくつかのオリゴヌクレオチド系の治療剤は、ＲＮＡ干渉およびマイクロＲＮＡの発見および開発、ならびにロックされた核酸（ＬＮＡ）構造骨格の使用のような組成設計の改善によって例示されるいくらかの利点から利益を得ている。短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、ほんの数年間の間に、研究用ツールから臨床治験における治療用薬剤にまで発展した。しかし、インビボでの送達がなお、オリゴヌクレオチド系の治療の治療可能性を十分に現実化するのに主な障壁になっている。現在、コンパートメント内直接注入および連続輸注がなお、主な投与経路である。その結果、治療目的で使用されるオリゴヌクレオチドの分野では、薬物送達技術の改善が求められている。
【０００５】
オリゴヌクレオチドの高度に負に荷電した骨格のため、それらが細胞膜を横切り、それらの生物学的活性を示すことは、しばしば困難である。負電荷は、オリゴヌクレオチドが負に荷電した細胞膜に接近することを妨害し、それ故、エンドサイトーシスを減少する。これまでにも、この問題に取り組むために、オリゴヌクレオチドが、正に荷電したペプチド、カチオン性脂質またはカチオン性ポリマーに結合され、またはそれらと複合体化されている。結果は、完全に満足のいくものではなかった。それ故、さらなる改善が所望された。本発明は、このような必要性などに取り組んでいる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第５，７３０，９９０号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記の問題を克服し、薬物送達のための技術を改善するために、正に荷電した骨格を含有する新規のポリマー送達システムが提供される。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の１つの態様では、式（Ｉ）：
【化１】

【０００９】
［式中
各Ｚ₁は、独立して、
【化２】

【００１０】
であり；
各Ｚ₂は、独立して選択されるキャッピング基：
【化３】

【００１１】
であり；
Ｒ₁は、実質的に非抗原性のポリマーであり；
Ｒ₂およびＲ'₂は、独立して選択される正電荷含有ペプチドまたは窒素含有環状炭化水素部分であり；
Ｒ₃およびＲ'₃は、独立して選択される標的化剤であり；
Ｒ₄は、生物学的に活性な部分であり；
Ｂ₁、Ｂ'₁およびＢ''₁は、独立して選択される分岐基であり；
Ｌ₁、Ｌ'₁、Ｌ₁''、Ｌ₁'''およびＬ₁''''は、独立して選択される二官能性リンカーであり；
Ｌ₂、Ｌ'₂およびＬ''₂は、独立して選択される遊離可能なリンカーであり；
（ａ）は、正の整数、好ましくは、１〜約３１、より好ましくは、約３〜約８、および最も好ましくは、１であり；
（ｂ）は、０もしくは正の整数、好ましくは、約０〜約３１、より好ましくは、約３〜約７であり；
（ｃ）、（ｃ'）および（ｃ''）は、独立して０もしくは正の整数、好ましくは、０、１、２もしくは３、およびより好ましくは、０もしくは１であり；
（ｄ）、（ｄ'）、（ｉ）、（ｉ'）および（ｉ''）は、独立して０もしくは正の整数、好ましくは、０、１、２もしくは３、およびより好ましくは、０もしくは１であり；
（ｅ）は、正の整数、好ましくは、１、２もしくは３、およびより好ましくは、１もしくは２であり；
（ｅ'）および（ｅ''）は、独立して０もしくは正の整数、好ましくは、０、１、２もしくは３、およびより好ましくは、０、１もしくは２であり；
（ｆ）および（ｆ'）は、独立して０もしくは正の整数、好ましくは、０、１、もしくは２、およびより好ましくは、０もしくは１であり；
（ｇ）は、正の整数、好ましくは、約１〜約５、およびより好ましくは、１もしくは２であり；
（ｇ'）は、０もしくは正の整数、好ましくは、０もしくは約１〜約５の整数、およびより好ましくは、０、１もしくは２であり；
（ｈ）および（ｈ'）は、独立して選択される正の整数、好ましくは、約１〜約８、より好ましくは、１、２、３もしくは４、および最も好ましくは、１もしくは２であり；
（ｂ）が０ではなく、すべてのＺ_２がキャッピング基、
【化４】

【００１２】
であるか、または組合せである場合、（ｇ'）は正の整数であることを条件とする］
化合物が提供される。
【００１３】
ポリマー化合物の１つの好適な態様では、（ａ）および（ｂ）の合計は、約１〜約３２に等しい。
【００１４】
いくつかの好適な実施形態では、ポリマー化合物には、以下に説明し、例示するような４アーム、８アーム、１６アームおよび３２アームのポリマーを含めることができる。より好ましくは、４アーム化ポリマーは、ポリマーアームの各末端において分岐部分と共に用いることができる。ポリマー化合物上に４アームおよび分岐部分を含有するポリマー化合物は、正に荷電した部分および／または生物学的に活性な部分を充填するための８つまでの官能部位を有することができる。
【００１５】
好適な別の実施形態では、本明細書に記載のマルチアームポリマー化合物は、生物学的に活性な部分に結合した１つのポリマー末端、および正電荷含有部分に結合したそれぞれの他のポリマー末端を含有する。
【００１６】
別の態様では、本明細書に記載のポリマー化合物は、例えば、正に荷電したペプチドおよびピペラジン系の部分を含有する。正電荷含有部分は、実質的に非抗原性のポリマーにさらなる正電荷を付与することが可能である。
【００１７】
別の態様では、正に荷電したペプチドは、ポリマー化合物を細胞膜に透過させるのに役立ち得る。好適な正に荷電したペプチドは、例えば、ＴＡＴのような細胞膜透過性ペプチド（ＣＰＰ）であり得る。
【００１８】
本発明のさらに別の態様では、負に荷電した生物学的に活性な分子を中和し、オリゴヌクレオチド、ロックされた核酸（ＬＮＡ）、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、アプタマー、リボザイム、ＤＮＡデコイなどのような生物学的に活性な部分の細胞内取り込みを改善するための正に荷電した骨格を含有するポリマー複合体が提供される。
【００１９】
本発明のさらに別の態様では、生物学的に活性な部分は、遊離可能なリンカーを介して本明細書に記載の化合物のポリマー部分に結合される。遊離可能なリンカーには、ベンジル基脱離（benzyl elimination）系のリンカー、トリアルキル基ロック（trialkyl lock）系のリンカー、ビシン系のリンカー、ジスルフィド結合、ヒドラゾン含有リンカーおよびチオプロピオネート含有リンカーがあり得る。あるいは、遊離可能なリンカーは、細胞内で不安定なリンカー、細胞外リンカーおよび酸に不安定なリンカーである。
【００２０】
本発明のさらに別の態様では、正に荷電した部分および標的化剤を、恒久的なリンカー（permanent linker）および遊離可能なリンカーを単独でまたは組合せて、これらを介して本明細書に記載の化合物のポリマー部分に連結することができる。好ましくは、恒久的なリンカーを介して、正に荷電したペプチドおよび標的化剤が連結される。インビボにおいて、複合体を目的の組織に誘導するために、ＲＧＤペプチド、葉酸、一本鎖抗体（ＳＣＡ）などのような標的化剤を、本明細書に記載のポリマー化合物に結合させることができる。設計により、インビボでのオリゴヌクレオチドのような負に荷電した分子の標的化された送達のための新規なアプローチが提供され、これらの分子の細胞内取り込みが促進されて、より良好な治療効果を有するようになる。
【００２１】
本発明のいくつかの好適な態様では、正に荷電したペプチドはまた、ＮＧＲ、ＴＮＦαおよびＴＡＴのような標的化された罹患領域に特異的な治療用ペプチドであり得る。当業者は、正電荷を含有し、標的化された領域に特異的に送達することが可能な多様な治療用ペプチドを用いることができる。
【００２２】
他の態様では、細胞透過性ペプチドを、例えば腫瘍部位への標的化された送達を目的として、ＴＡＴ、ＲＧＤ−ＴＡＴおよびＮＧＲなどのさまざまな正に荷電した標的化ペプチドのうちの１つで置換することができる。
【００２３】
正に荷電した骨格を有するＰＥＧリンカーを、オリゴヌクレオチドのような負に荷電した治療用分子と複合体化させる場合、オリゴヌクレオチドの負電荷を中和することができ、複合体の正味の電荷は正であり得る。マルチアームＰＥＧを使用する場合、ＰＥＧ複合体の全体的な形状は球形であり得る。ＰＥＧが水溶液において高度に水和される特性のため、正に荷電した骨格を有するマルチアームＰＥＧ複合体は、中心に包埋されたオリゴヌクレオチドを有する球状の「ミニ−ナノ粒子」の外観を呈する。
【００２４】
負に荷電したオリゴヌクレオチドを中和することが可能な正に荷電した部分は、毒性を減少し、また、その細胞膜を透過することを容易にし、従って、オリゴヌクレオチドの送達を改善し得る。結果として、高度に負に荷電したオリゴヌクレオチドをインビボで送達することができ、毒性もより少ない。
【００２５】
本発明のポリマー複合体の１つの利点は、高度に正に荷電したペプチドおよびＴＡＴのような細胞透過性ペプチドを結合させることによって、細胞内取り込みが改善されることである。さらに、当業者であれば、標的とされるペプチド、アプタマーおよび葉酸類などを結合させることによって、標的機能を達成することができる。
【００２６】
別の利点は、プロドラッグからの負に荷電した分子の放出速度／部位を改変することができることである。本明細書に記載のポリマー化合物に結合した薬物は、改変された速度で放出され得、それ故、当業者が治療用ペプチドおよびオリゴヌクレオチドの所望されるバイオアベイラビリティを達成することを可能にする。負に荷電した治療用薬剤の放出の部位を改変することもでき、即ち、細胞の異なるコンパートメントにおける放出が可能である。それ故、本明細書に記載のポリマー送達システムは、十分量の負に荷電した治療用薬剤を、所望される標的領域、即ち、マクロピノソームおよびエンドソームにおいて選択的に利用可能にする。治療用薬剤の放出の単独および組合せでの時間的および空間的改変は、疾患の治療に有利であり得る。
【００２７】
正に荷電した骨格を有するポリマー化合物は緩衝液の条件下で安定であり、オリゴヌクレオチドまたは他の治療用薬剤が、身体から必要以上に早く排泄されることもない。
【００２８】
本発明のなおさらなる利点は、本明細書に記載の複合体が、トランスフェクション剤の非存在下で、癌細胞における十分に改善された細胞内取り込みおよび特異的ｍＲＮＡダウンレギュレーションを可能にすることである。この技術は、オリゴヌクレオチド薬物のインビボ投与に応用することができる。例えば、本明細書に記載のアンチセンスＢｃｌ２オリゴヌクレオチド、Ｂｃｌ２ ｓｉＲＮＡまたは抗スルビビン(Survivin)ＬＮＡを含むＰＥＧ−オリゴヌクレオチドの細胞内取り込みは、トランスフェクション剤を伴わないヒト肺癌細胞による生来のアンチセンスＢｃｌ２オリゴヌクレオチドまたはＢｃｌ２ ｓｉＲＮＡの細胞内取り込みより大きい。さらに、本明細書に記載の複合体は、トランスフェクション剤によって促進された細胞内取り込みと比較して、トランスフェクション剤の非存在下で、より高い細胞内取り込みを可能にした。
【００２９】
他のおよびさらなる利点については、以下の説明から明らかであろう。
【００３０】
本発明の目的のために、用語「残基」は、この用語が指す化合物の部分であって、即ち、別の化合物との置換反応を経た後に残留するＰＥＧ、オリゴヌクレオチドなどを意味するものと理解されるべきである。
【００３１】
本発明の目的のために、用語「ポリマー残基」または「ＰＥＧ残基」は、他の化合物、部分などとの反応を経た後に残留するポリマーまたはＰＥＧの部分を意味するものと理解されるべきである。
【００３２】
本発明の目的のために、用語「アルキル」は、直鎖の、分岐された、置換された、例えば、ハロ−、アルコキシ−、ニトロ−、Ｃ_1-12、但し、好ましくは、Ｃ_1-4アルキル類、Ｃ_3-8シクロアルキル類または置換シクロアルキル類などを含むものと理解されるべきである。
【００３３】
本発明の目的のために、用語「置換された」は、付加するか、または官能基または化合物内に含有される１つ以上の原子を１つ以上の異なる原子で置換することを含むものと理解されるべきである。
【００３４】
本発明の目的のために、置換アルキル類は、カルボキシアルキル類、アミノアルキル類、ジアルキルアミノ類、ヒドロキシアルキル類およびメルカプトアルキル類を含み；置換アルケニル類は、カルボキシアルケニル類、アミノアルケニル類、ジアルケニルアミノ類、ヒドロキシアルケニル類およびメルカプトアルケニル類を含み；置換アルキニル類は、カルボキシアルキニル類、アミノアルキニル類、ジアルキニルアミノ類、ヒドロキシアルキニル類およびメルカプトアルキニル類を含み；置換シクロアルキル類は、４−クロロシクロヘキシルのような部分を含み；アリール類は、ナフチニルのような部分を含み；置換アリール類は、３−ブロモフェニルのような部分を含み；アラルキル類は、トリルのような部分を含み；ヘテロアルキル類は、エチルチオフェンのような部分を含み；置換へテロアルキル類は、３−メトキシ−チオフェンのような部分を含み；アルコキシは、メトキシのような部分を含み；フェノキシは、３−ニトロフェノキシのような部分を含む。ハロは、フルオロ、クロロ、ヨードおよびブロモを含むものと理解されるべきである。
【００３５】
本発明の目的のために、「核酸」、「ヌクレオチド」または「オリゴヌクレオチド」は、他で特定しない限り、一本鎖または二本鎖であるかどうかにかかわらず、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、およびそれらの任意の化学修飾物を含むものと理解されるべきである。
【００３６】
本発明の目的のために、「正の整数」は、当業者による妥当性の範囲内にあると当業者に理解されるような整数を含むものと理解されるべきである。
【００３７】
本発明の目的のための用語「有効量」および「十分量」は、効果が当業者によって理解されている所望される効果または治療効果を達成する量を意味するべきである。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】実施例１〜３に記載の合成の方法を図式的に示す。
【図２】実施例４〜１３に記載の合成の方法を図式的に示す。
【図３】実施例１４〜２０に記載の合成の方法を図式的に示す。
【図４】実施例２１〜２６に記載の合成の方法を図式的に示す。
【図５】実施例２７〜３１に記載の合成の方法を図式的に示す。
【図６】実施例３２〜３４に記載の合成の方法を図式的に示す。
【図７】実施例３５〜３８に記載の合成の方法を図式的に示す。
【図８】実施例３９〜４１に記載の合成の方法を図式的に示す。
【図９】実施例４２〜４９に記載の合成の方法を図式的に示す。
【図１０】実施例５０〜５３に記載の合成の方法を図式的に示す。
【図１１】実施例５４〜５８に記載の合成の方法を図式的に示す。
【図１２】実施例５９〜６２に記載の合成の方法を図式的に示す。
【図１３】実施例６３に記載の蛍光顕微鏡の画像を示す。
【図１４】実施例６３に記載の共焦点顕微鏡の画像を示す。
【図１５】実施例６４に記載の細胞内取り込みを示す。
【図１６】実施例６５に記載の細胞内取り込みを示す。
【図１７】実施例６６に記載のＢｃｌ２ ｍＲＮＡダウンレギュレーションを示す。
【図１８】実施例６７に記載のスルビビンダウンレギュレーションを示す。
【図１９】実施例６８に記載のスルビビンダウンレギュレーションを示す。
【図２０】実施例６９に記載のスルビビンダウンレギュレーションを示す。
【図２１】実施例７０に記載のスルビビンダウンレギュレーションを示す。
【図２２】実施例７１に記載のスルビビンダウンレギュレーションを示す。
【図２３】実施例７２に記載のスルビビンダウンレギュレーションを示す。
【図２４】実施例７３に記載のインビボでのスルビビンダウンレギュレーションを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
Ａ．概観
本発明の１つの態様では、式（Ｉ）：
【化５】

【００４０】
［式中
各Ｚ_１は、独立して、
【化６】

【００４１】
であり；
各Ｚ_２は、独立して選択されるキャッピング基：
【化７】

【００４２】
であり；
Ｒ₁は、実質的に非抗原性のポリマーであり；
Ｒ₂およびＲ'₂は、独立して選択される正電荷含有ペプチドまたは窒素含有環状炭化水素であり；
Ｒ₃およびＲ'₃は、独立して選択される標的化剤であり；
Ｒ₄は、生物学的に活性な部分であり；
Ｂ₁、Ｂ'₁およびＢ''₁は、独立して選択される分岐基であり；
Ｌ₁、Ｌ'₁、Ｌ₁''、Ｌ₁'''およびＬ₁''''は、独立して選択される二官能性リンカーであり；
Ｌ₂、Ｌ'₂およびＬ''₂は、独立して選択される遊離可能なリンカーであり；
（ａ）は、正の整数、好ましくは、１〜約３１、より好ましくは、約３〜約８、および最も好ましくは、１であり；
（ｂ）は、０もしくは正の整数、好ましくは、０〜約３１、より好ましくは、約３〜約７であり；
（ｃ）、（ｃ'）および（ｃ''）は、独立して０もしくは正の整数、好ましくは、０、１、２もしくは３、およびより好ましくは、０もしくは１であり；
（ｄ）、（ｄ'）、（ｉ）、（ｉ'）および（ｉ''）は、独立して０もしくは正の整数、好ましくは、０、１、２もしくは３、およびより好ましくは、０もしくは１であり；
（ｅ）は、正の整数、好ましくは、１、２もしくは３、およびより好ましくは、１もしくは２であり；
（ｅ'）および（ｅ''）は、独立して０もしくは正の整数、好ましくは、０、１、２もしくは３、およびより好ましくは、０、１もしくは２であり；
（ｆ）および（ｆ'）は、独立して０もしくは正の整数、好ましくは、０、１、もしくは２、およびより好ましくは、０もしくは１であり；
（ｇ）は、正の整数、好ましくは、約１〜約５、およびより好ましくは、１もしくは２であり；
（ｇ'）は、０もしくは正の整数、好ましくは、０もしくは約１〜約５の整数、およびより好ましくは、０、１もしくは２であり；
（ｈ）および（ｈ'）は、独立して選択される正の整数、好ましくは、約１〜約８、より好ましくは、１、２、３もしくは４、および最も好ましくは、１もしくは２であり；
（ｂ）が０ではなく、すべてのＺ₂がキャッピング基、
【化８】

【００４３】
または組合せである場合、（ｇ'）は正の整数であることを条件とする］
のポリマー化合物が提供される。
【００４４】
本発明の目的のために、Ｕ−ＰＥＧまたは（ＰＥＧ）₂−Ｌｙｓ型ＰＥＧが本明細書に記載のポリマー化合物の部分として用いられる場合を例外として、括弧に隣接する反復単位（ａ）および（ｂ）は、括弧内に記載の基に結合したポリマーアームの全数を表すことができる。２ポリマーアームが存在するが、（ａ）および（ｂ）の合計は、用いられるＵ−ＰＥＧに対し１もしくは３であり得る。（ａ）が１であり、（ｂ）が０である場合、本明細書に記載のポリマー化合物は、ｍＰＥＧを含むことができる。ｍＰＥＧのポリマー末端は、正に荷電した部分および生物学的に活性な材料の両方に連結することができる。ビスＰＥＧが本明細書に記載のポリマー化合物において用いられる場合、（ａ）および（ｂ）の合計は２であり、ここで、（ｂ）が１である場合、Ｚ_２はキャッピング基でも、または
【化９】

【００４５】
でもない。
【００４６】
本発明の１つの好適な態様では、（ａ）および（ｂ）の合計は１〜３２に等しく、それ故、ポリマー化合物は、好ましくは、３２ポリマーアームまで、即ち、１、２、３、４、８、１６もしくは３２を含むことができる。本実施形態内において、ポリマー化合物は、好ましくは、１〜８ポリマーアームを含むことができ、ここで、（ａ）および（ｂ）の合計は、１〜８であり得る。より好ましくは、ポリマー部分は４ポリマーアームを含み、ここで、（ａ）および（ｂ）の合計は４である。
【００４７】
さらに別の好適な態様では、本明細書に記載のマルチアームポリマー化合物は、生物学的に活性な部分に結合した１つのポリマー末端、ならびに正電荷含有部分および標的化剤に結合したそれぞれの残りのポリマー末端を含有する。あるいは、ポリマー部分のポリマーアームは、生物学的に活性な部分より正に荷電した部分の方に多く連結される。この特徴により、十分な正電荷を付与して、オリゴヌクレオチドのような生物学的に活性な部分の負電荷を中和することができる。
【００４８】
本発明の目的のために、分岐基が本明細書に記載の化合物内に存在する場合、各ポリマーアームの遠位末端への分岐部分の後に存在する任意の部分は、分岐度によって倍加される（即ち、×２）。（ｈ）および（ｈ'）は、分岐に従って作製される末端の数を表す。１つの実施形態では、（ｈ）および（ｈ'）はそれぞれ２であり得、ここで、アスパラギン酸のような分岐基が用いられる。１つ以上の分岐基を含む他の実施形態では、（ｈ）および（ｈ）'は、２、３、４、６、８、１２、１６、１８、３２もしくはそれ以上であり得る。分岐部分は、少なくとも３つの官能基を含むことができる。アスパラギン酸のような３つの官能基を有する分岐部分がポリマーアームの末端に連結される場合、各ポリマーアームは、ポリマーアームの数の少なくとも２倍の官能部分を提供することができる。多数の分岐部分が、本明細書に記載の化合物内にあるものと考えることができる。別の実施形態では、用いられる分岐基が存在しない場合、（ｈ）および（ｈ'）は１であり得る。
【００４９】
さらに別の好適な実施形態では、４アーム化ポリマーを、ポリマーアームの各末端の分岐部分に連結することができる。ポリマー化合物上に４アームおよびアスパラギン酸のような分岐部分を含有するポリマー化合物は、正に荷電した部分および／または生物学的に活性な部分を充填するための８つの官能部位を有することができる。
【００５０】
キャッピング基は、Ｈ、ＮＨ₂、ＯＨ、ＣＯ₂Ｈ、Ｃ_1-6アルコキシおよびＣ_1-6アルキルの中から選択することができる。好ましくは、ｍＰＥＧのような線状ポリマーが本明細書に記載の化合物に用いられる場合、キャッピング基はメトキシを含有することができる。（ｂ）が０ではなく、すべてのＺ_２部分がキャッピング基、
【化１０】

【００５１】
または組合せである場合、正に荷電した部分および生物学的に活性な部分が同じポリマーアーム上において用いられ得るように、（ｇ'）は少なくとも１である。
【００５２】
本発明の１つの好適な態様では、（ｂ）が０でない場合、各Ｚ_２は
【化１１】

【００５３】
を含み、それ故、本明細書に記載の化合物は、式（ＩＩ）：
【化１２】

【００５４】
で表される。すべてのポリマー末端は、活性化し、キャッピング基または
【化１３】

【００５５】
を含まない正に荷電した部分、標的化剤および／または生物学的に活性な部分に連結することができる。従って、この態様によって考えられるポリマーには、ビスＰＥＧ、Ｕ−ＰＥＧおよびマルチアームＰＥＧが含まれる。
【００５６】
好適な別の実施形態では、（ａ）は１である。（ａ）および（ｂ）の合計は、１〜３１の正の整数、好ましくは、１〜７、および最も好ましくは、４（４アームポリマー）であり得る。さらに別の好適な態様では、より多くのポリマー末端が、生物学的に活性な部分よりも正に荷電した部分を有して、オリゴヌクレオチドのような生物学的に活性な部分の負の電荷を十分に中和することができるように、（ｂ）は（ａ）より大きい。
【００５７】
本発明の目的のために、二官能性リンカー、分岐基、遊離可能なリンカー、正電荷含有部分および標的化剤の値が２に等しいかまたはそれを超える正の整数である場合、同じまたは異なる部分を用いることができる。（ｅ）が２以上である、２つ以上の遊離可能なリンカーを含有する１つの実施形態では、遊離可能なリンカーは、同じであるかまたは異なり得る。特定の実施形態では、ベンジル基脱離系のリンカーは、本明細書に記載の化合物においてヒドラゾン含有リンカーの近接に存在する。別の実施形態では、同じまたは異なる正に荷電したペプチドを、同じポリマー末端において用いることができる。
【００５８】
１つの好適な実施形態では、本明細書に記載の化合物は、式：
【化１４】

【００５９】
［式中
（ｎ）は、約１０〜約２３００の整数であって、ここで、ポリマー部分の総分子量は、約２，０００〜約１００，０００であり；
各Ｚは、Ｚ_１またはＺ_２であって、
ここで、
各Ｚ_１は、独立して、
【化１５】

【００６０】
であり；
各Ｚ_２は、独立して選択されるキャッピング基：
【化１６】

【００６１】
であり；
Ｌ₂、Ｌ'₂およびＬ''₂は、独立して、ジスルフィド、ヒドラゾン含有リンカー、チオプロピオネート含有リンカー、ベンジル基脱離系のリンカー、トリアルキル基ロック系のリンカーおよびビシン系のリンカー、リソソーム切断性ペプチドおよびカテプシンＢ切断性ペプチドの中から選択される遊離可能なリンカーであり；
（ｃ）、（ｃ'）および（ｃ''）は、独立して０もしくは正の整数、好ましくは、０、１、２もしくは３、およびより好ましくは、０もしくは１であり；
（ｄ）、（ｄ'）、（ｉ）、（ｉ'）および（ｉ''）は、独立して０もしくは正の整数、好ましくは、０、１もしくは２であり；
（ｅ）は、正の整数、好ましくは、１もしくは２であり；
（ｅ'）および（ｅ''）は、独立して０もしくは正の整数、好ましくは、０、１もしくは２であり；
（ｆ'）および（ｆ''）は、独立して０もしくは正の整数、好ましくは、０、１もしくは２であり；
（ｇ）は、正の整数、好ましくは、１もしくは２、より好ましくは、１であり；
（ｇ'）は、０もしくは正の整数、好ましくは、０、１もしくは２であり；
（ｈ）および（ｈ'）は、独立して、正の整数、好ましくは、約１〜約８、より好ましくは、１、２、３もしくは４、および最も好ましくは、１もしくは２であり；
他のすべての変数は、先に定義したとおりであり、
すべてのＺ_２がキャッピング基、
【化１７】

【００６２】
または組合せである場合、（ｇ'）は正の整数であることを条件とする］で表される。ポリマー化合物が４ポリマーアームを有する場合、（ｎ）は、４〜約４５５であり得る。当業者は、他のマルチアームポリマーについての任意選択的な（ｎ）の値を理解することができる。好ましくは、すべてのＺ₂部分は、
【化１８】

【００６３】
である。
【００６４】
分岐部分を含む活性化された４アームポリマーを、以下の式（IIIc'）に例示する。
【化１９】

【００６５】
本発明の１つの好適な態様では、マルチアームポリマー複合体は、生物学的に活性な部分に結合した１つのポリマーアーム末端、および正電荷含有基に結合したそれぞれの他のポリマーアーム末端を含有する。
【００６６】
本発明のさらなる態様では、マルチアームポリマー複合体は、生物学的に活性な部分に結合した１つのポリマーアーム末端、ならびに正電荷含有基およびターゲット剤(target agent)に結合したそれぞれの他のポリマーアーム末端を含有する。
【００６７】
Ｂ．実質的に非抗原性のポリマー
本明細書に記載の化合物において用いられるポリマーは、好ましくは、水溶性ポリマーであり、ポリアルキレンオキシド（ＰＡＯ）のように実質的に非抗原性である。
【００６８】
本発明の１つの態様では、本明細書に記載の化合物は、線状、末端分岐またはマルチアーム化ポリアルキレンオキシドを含む。本発明のいくつかの好適な実施形態では、ポリアルキレンオキシドは、ポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコールを含む。
【００６９】
ポリアルキレンオキシドは、約２，０００〜約１００，０００、好ましくは、約２，０００〜約６０，０００の平均分子量を有する。ポリアルキレンオキシドは、より好ましくは、タンパク質またはオリゴヌクレオチドが結合する場合、約５，０００〜約２５，０００、好ましくは、約１２，０００〜約２０，０００であり得、あるいは、医薬的に活性な化合物（１，５００未満の平均分子量を有する小分子）が本明細書に記載の化合物において用いられる場合、約２０，０００〜約４５，０００、好ましくは、約３０，０００〜約４０，０００であり得る。
【００７０】
ポリアルキレンオキシドは、ポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコールを含む。より好ましくは、ポリアルキレンオキシドは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。ＰＥＧは、一般的に、構造：
−Ｏ−(ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ)_n−
［式中、（ｎ）は、約１０〜約２，３００の整数であり、マルチアームポリマーが使用される場合、ポリマーアームの数に依存する］で表される。あるいは、本発明のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）残基部分は、構造：
-Ｙ₇₁-(ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ)_n-ＣＨ₂ＣＨ₂Ｙ₇₁-、
-Ｙ₇₁-(ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ)_n-ＣＨ₂Ｃ(＝Ｙ₂₂)-Ｙ₇₁-、
-Ｙ₇₁-Ｃ(＝Ｙ₇₂)-(ＣＨ₂)_a2-Ｙ₇₃-(ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ)_n-ＣＨ₂ＣＨ₂-Ｙ₇₃-(ＣＨ₂)_a2-Ｃ(＝Ｙ₇₂)-Ｙ₇₁-、および
-Ｙ₇₁-(ＣＲ₇₁Ｒ₇₂)_a2-Ｙ₇₃-(ＣＨ₂)_b2-Ｏ-(ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ)_n-(ＣＨ₂)_b2-Ｙ₇₃-(ＣＲ₇₁Ｒ₇₂)_a2-Ｙ₇₁-
［式中：
Ｙ₇₁およびＹ₇₃は、独立してＯ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ₂、ＮＲ₇₃または結合であり；
Ｙ₇₂は、Ｏ、Ｓ、またはＮＲ₇₄であり；
Ｒ_71-74は、水素、Ｃ_1-6アルキル、Ｃ_2-6アルケニル、Ｃ_2-6アルキニル、Ｃ_3-19分岐アルキル、Ｃ_3-8シクロアルキル、Ｃ_1-6置換アルキル、Ｃ_2-6置換アルケニル、Ｃ_2-6置換アルキニル、Ｃ_3-8置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、Ｃ_1-6ヘテロアルキル、置換Ｃ_1-6ヘテロアルキル、Ｃ_1-6アルコキシ、アリールオキシ、Ｃ_1-6ヘテロアルコキシ、ヘテロアリールオキシ、Ｃ_2-6アルカノイル、アリールカルボニル、Ｃ_2-6アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、Ｃ_2-6アルカノイルオキシ、アリールカルボニルオキシ、Ｃ_2-6置換アルカノイル、置換アリールカルボニル、Ｃ_2-6置換アルカノイルオキシ、置換アリールオキシカルボニル、Ｃ_2-6置換アルカノイルオキシおよび置換アリールカルボニルオキシの中から独立して選択され；
（ａ２）および（ｂ２）は、０もしくは正の整数、好ましくは、０もしくは約１〜約６の整数、およびより好ましくは、１であり；
（ｎ）は、約１０〜約２３００の整数である］
によって表すことができる。
【００７１】
分岐またはＵ−ＰＥＧ誘導体については、米国特許第５，６４３，５７５号明細書、同第５，９１９，４５５号明細書、同第６，１１３，９０６号明細書および同第６，５６６，５０６号明細書に説明されており、それらのそれぞれの開示内容は、本明細書において参照により援用される。そのような化合物の非限定的なリストは、以下の構造：
【化２０−１】

【００７２】
および
【化２０−２】

【００７３】
［式中：
Ｙ_61-62は、独立してＯ、ＳまたはＮＲ₆₁であり；
Ｙ₆₃は、Ｏ、ＮＲ₆₂、Ｓ、ＳＯまたはＳＯ₂であり
（ｗ６２）、（ｗ６３）および（ｗ６４）は、独立して０もしくは正の整数、好ましくは、０もしくは約１〜約３の整数であり；
（ｗ６１）は、０もしくは１であり；
ｍＰＥＧは、メトキシＰＥＧであり
ここで、ＰＥＧは先に定義したとおりであり、ポリマー部分の総分子量は、約２，０００〜約１００，０００であり；
Ｒ₆₁およびＲ₆₂は、独立して、Ｒ₇₃に使用することができる同じ部分である］
で表されるポリマー系（ｉ）〜（ｖｉｉ）に対応する。
【００７４】
さらに別の態様では、ポリマーは、マルチアームＰＥＧ−ＯＨ、または日油株式会社(NOF Corp.)の薬物送達システムカタログ、第８版、２００６年４月（その開示内容は、本明細書において参照により援用される）に記載されるような「スター型ＰＥＧ」製品を含む。マルチアームポリマー複合体は、４以上のポリマーアーム、および好ましくは、４もしくは８ポリマーアームを含有する。
【００７５】
例示および非限定の目的のために、マルチアームポリエチレングリコール（ＰＥＧ）残基は、
【化２１】

【００７６】
［式中：
（ｘ）は０および正の整数、即ち、約０〜約２８であり；
（ｎ）は重合度である］
であり得る。
【００７７】
本発明の１つの特定の実施形態では、マルチアームＰＥＧは、構造：
【化２２】

【００７８】
［式中、（ｎ）は、正の整数である］で表される。本発明の１つの好適な実施形態では、ポリマーは、約５，０００〜約６０，０００、および好ましくは、１２，０００〜４０，０００の総分子量を有する。
【００７９】
さらに別の特定の実施形態では、マルチアームＰＥＧは、構造：
【化２３】

【００８０】
［式中、（ｎ）は、正の整数である］で表される。本発明の１つの好適な実施形態では、マルチアームポリマーの重合度（ｎ）は、約５，０００〜約６０，０００の総分子量を有するポリマーを提供するために約２８〜約３５０であり、および好ましくは、１２，０００〜４５，０００の総分子量を有するポリマーを提供するために約６５〜約２７０である。これは、ポリマー鎖における反復単位の数を表し、ポリマーの分子量に依存する。
【００８１】
ポリマーは、米国特許第５，１２２，６１４号明細書または同第５，８０８，０９６号明細書に記載の活性化技術を使用して、適切に活性化されたポリマーに変換することができる。具体的には、そのようなＰＥＧは、式：
【化２４】

【００８２】
［式中：
（ｕ'）は、約４〜約４５５の整数であり；
残基の３つまでの末端部分がメチルまたは他の低級アルキルでキャップ化される］
であり得る。
【００８３】
いくつかの好適な実施形態では、すべてで４つのＰＥＧアームを、芳香族基への結合を可能にするための適切な活性化基に変換することができる。変換前のそのような化合物として：
【化２５−１】

【化２５−２】

【００８４】
が挙げられる。
【００８５】
本明細書に含まれるポリマー物質は、好ましくは、室温で水溶性である。そのようなポリマーの非限定的なリストには、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコール類、ポリオキシエチレン化ポリオール類のようなポリアルキレンオキシドホモポリマー、それらのコポリマーおよびそれらのブロックコポリマーが含まれるが、但し、ブロックコポリマーの水溶性は維持される。
【００８６】
さらなる実施形態において、およびＰＡＯ系のポリマーの代替物として、デキストラン、ポリビニルアルコール類、炭水化物系のポリマー、ヒドロキシプロピルメタクリルアミド（ＨＰＭＡ）、ポリアルキレンオキシド類、および／またはそれらのコポリマーのような１つ以上の効果的に非抗原性の材料を使用することができる。また、本発明の譲受人に譲渡された米国特許第６，１５３，６５５号明細書（その内容は、本明細書において参照により援用される）を参照のこと。当業者であれば、同じタイプの活性化がＰＥＧのようなＰＡＯについても本明細書に記載のように用いられることを理解するであろう。当業者であれば、上記のリストが単なる例示であること、および本明細書に記載の性質を有するすべてのポリマー材料が考慮されることをさらに理解するであろう。本発明の目的のために、「実質的にまたは効果的に非抗原性の」は、非毒性であり、かつ哺乳動物における免疫原性応答の誘発が認められないことが当該分野において理解されているすべての材料を意味する。
【００８７】
いくつかの態様では、末端アミン基を有するポリマーを用いて、本明細書に記載の化合物を作製することができる。末端アミン類を含有するポリマーを高い純度で調製する方法については、米国特許出願第１１／５０８，５０７号明細書および同第１１／５３７，１７２号明細書（それらのそれぞれの内容は、本明細書において援用される）に記載されている。例えば、アジド類を有するポリマーは、トリフェニルホスフィンのようなホスフィン系の還元剤またはＮａＢＨ₄のようなアルカリ金属ボロハイドライド還元剤と反応する。あるいは、脱離基を含むポリマーは、メチル−ｔｅｒｔ−ブチルイミドジカーボネートのカリウム塩（ＫＮＭｅＢｏｃ）またはジ−ｔｅｒｔ−ブチルイミドジカーボネートのカリウム塩（ＫＮＢｏｃ₂）のような保護されたアミン塩と反応し、続いて、保護されたアミン基を脱保護する。これらのプロセスによって形成される末端アミン類を含有するポリマーの純度は、約９５％より大きく、および好ましくは、９９％より大きい。
【００８８】
別の態様では、末端カルボン酸基を有するポリマーは、本明細書に記載のポリマー送達システムにおいて用いることができる。末端カルボン酸類を有するポリマーを高純度で調製する方法については、米国特許出願第１１／３２８，６６２号明細書（その内容は、本明細書において参照により援用される）に記載されている。方法は、第１に、ポリアルキレンオキシドの第三級アルキルエステルを調製すること、続いて、そのカルボン酸誘導体への変換を含む。プロセスのＰＡＯカルボン酸類の調製の第１の工程は、ポリアルキレンオキシドカルボン酸のｔ−ブチルエステルのような中間体を形成することを含む。この中間体は、カリウムｔ−ブトキシドのような塩基の存在下で、ＰＡＯをハロ酢酸ｔ−ブチルと反応させることによって形成される。一旦、ｔ−ブチルエステル中間体が形成されると、ポリアルキレンオキシドのカルボン酸誘導体は、９２％を超える、好ましくは、９７％を超える、より好ましくは、９９％を超える、および最も好ましくは、９９．５％純度を超える純度で容易に提供することができる。
【００８９】
Ｃ．正電荷含有部分
本明細書に記載のポリマー化合物は、正に荷電したペプチドまたは窒素含有環状炭化水素を含有することができる。正電荷含有部分は、実質的に非抗原性のポリマーにさらなる正電荷を付与することが可能である。
【００９０】
正に荷電したペプチドは、ポリマー化合物を細胞膜に透過させるのに役立ち得る。細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）は、アルギニン、およびリジンのような正に荷電したアミノ酸を含有する。ＣＰＰはまた、本明細書に記載のポリマー化合物の標的化された送達を容易にする。
【００９１】
本発明の１つの態様では、１つ以上のペプチドを、本明細書に記載の化合物において用いることができる。正に荷電したペプチドは、多くの異なる組合せで、化合物において用いることができる。例示および非限定の目的のために、至適な組合せが提供される。１つの実施形態では、２つのＴＡＴ配列のような複数単位のペプチドを、並べて結合させることができる。
【化２６】

【００９２】
［式中、
（ｗ）は、約１〜約１０、好ましくは、約３〜約７の正の整数であり；
（ｙ）は約１〜約７の整数である］。
【００９３】
別の実施形態では、分岐基を介して、２つ以上のペプチドのそれぞれを、ポリマーアーム末端のそれぞれに連結し、細胞内取り込みを促進することができる。
【化２７】

【００９４】
［式中、
（ｗ）は約１〜約１０の整数であり、
（ｙ）は約１〜約７の整数である］。
【００９５】
ペプチドは、約１〜約５０の正に荷電したアミノ酸、好ましくは、約２〜約２０、およびより好ましくは、３〜１０を含有することができる。
【００９６】
１つの好適な実施形態では、正に荷電したペプチドは、ＴＡＴ、ペネトラチン（Penetratin）および（Ａｒｇ）₉のような細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）を含む。Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００６年１０月；６（５）：５０９−１４、「Ｃｅｌｌ−ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｐｅｐｔｉｄｅ，ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ」（その内容は本明細書において参照により援用される）を参照のこと。
【００９７】
１つの態様では、正に荷電したペプチドは、天然に存在するアミノ酸または天然に存在しないアミノ酸を含むことができる。好ましくは、ペプチドは、アルギニン、リジンおよび関連類似体を含む。ペプチドは、アミノ酸の無作為な配列、または天然に存在する細胞透過性ペプチドの部分もしくはそれらの誘導体であり得る。
【００９８】
本発明の目的のために、本明細書に記載のポリマー化合物に考慮されるペプチドとして、ジスルフィド結合をさらに複合体化もしくは誘導するためのペプチドの末端におけるまたはペプチド内のシステインを挙げることができる。
【００９９】
本発明の１つの好適な実施形態は、転写タンパク質のトランス活性化因子（ＴＡＴ）の正に荷電したペプチドを含む。本発明の目的のために、用語「ＴＡＴ」は、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲのペプチド配列を含む転写活性化タンパク質のトランス活性化因子の部分、例えば、ＨＳ−ＣＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−ＣＯＮＨ₂を意味するものと理解することができる。
【０１００】
Ｃ−ＴＡＴ：ＣＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１）
好適な別の実施形態では、正に荷電したペプチドは、（Ａｒｇ）₅のようなポリアルギニン、またはＮＨ（Ｍｅ）−Ｓａｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＣＯＮＨ₂（「Ｓａｒ−（Ａｒｇ）₅」）であり得る。
【０１０１】
Ｃ−（Ａｒｇ）₉：ＣＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号２）
本明細書に含めるのに適切な他のペプチドのグループは当業者に明らかであるが、但し、それらは、十分な数の正に荷電した基を含む。ペプチドの長さもまた、当業者の必要および（アミノ酸によって提供される）所望される正電荷基の数に従って変動する。
【０１０２】
いくつかの好適な実施形態、ペプチドは、その内部に、約１〜約５０、好ましくは、約２〜約２０、およびより好ましくは、約３〜約１０正に荷電したアミノ酸を含有する。また、ツァオ，Ｈ．（Ｚｈａｏ，Ｈ．）ら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，２００５年，１６：７５８−７６６（その内容は本明細書において参照により援用される）を参照のこと。
【０１０３】
正に荷電したペプチドをＳＣＡのような標的部分に結合させる場合、ＳＣＡを正に荷電したペプチドに複合体化するために、リンカーを挿入することができる。当業者に公知のリンカーもまた、本明細書に記載の化合物内にあるものと考えられる。
【０１０４】
別の態様では、正電荷含有部分は、窒素含有環状炭化水素を含む。窒素含有部分は、式：
【化２８】

【０１０５】
［式中、
（ａａ）は、約２〜約１０の正の整数、好ましくは、２または３、およびより好ましくは、２であり；
（ｂｂ）は１、２もしくは３であり；
（ｃｃ）は１もしくは２であり；
（ｄｄ）は、約１〜約５の正の整数、好ましくは、１であり；
Ｒ₁₀₁は、水素、Ｃ_1-6アルキル、Ｃ_2-6アルケニル、Ｃ_2-6アルキニル、Ｃ_3-19分岐アルキル、Ｃ_3-8シクロアルキル、Ｃ_1-6置換アルキル、Ｃ_2-6置換アルケニル、Ｃ_2-6置換アルキニル、Ｃ_3-8置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、Ｃ_1-6ヘテロアルキル、置換Ｃ_1-6ヘテロアルキル、Ｃ_1-6アルコキシ、アリールオキシ、Ｃ_1-6ヘテロアルコキシ、ヘテロアリールオキシ、Ｃ_2-6アルカノイル、アリールカルボニル、Ｃ_2-6アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、Ｃ_2-6アルカノイルオキシ、アリールカルボニルオキシ、Ｃ_2-6置換アルカノイル、置換アリールカルボニル、Ｃ_2-6置換アルカノイルオキシ、置換アリールオキシカルボニル、Ｃ_2-6置換アルカノイルオキシ、および置換アリールカルボニルオキシの中から独立して選択され；
（ｑ）は、約２〜約３０の正の整数である］
に対応する。
【０１０６】
１つの好適な実施形態では、（ｑ）は約３〜約１８であり、それ故、ポリマーアームの各末端は、３〜１８までの環状炭化水素単位を含有する。より好ましくは、（ｑ）は、約３〜９である。
【０１０７】
１つの好適な実施形態では、窒素含有環状炭化水素は：
【化２９】

【０１０８】
の中から選択することができる。窒素含有環状炭化水素部分は、好ましくは、ピペラジンを含有する。
【０１０９】
Ｄ．生物学的に活性な部分
本明細書に記載の化合物は、多様な負に荷電した分子を送達するために使用することができる。ポリマー化合物は、細胞内取り込みならびに負に荷電した分子の生体内分布を改善する。負に荷電した分子として、医薬的に活性な化合物（１，５００未満の平均分子量を有する小さな分子量の化合物）、酵素、タンパク質、オリゴヌクレオチド、抗体、モノクローナル抗体、一本鎖抗体およびペプチドを挙げることができる。生物学的に活性な部分は、−ＮＨ₂含有部分、−ＯＨ含有部分および−ＳＨ含有部分であり得る。
【０１１０】
１つの好適な実施形態では、生物学的に活性な部分は、オリゴヌクレオチドを含む。
【０１１１】
本発明の範囲をより十分に理解するために、以下の用語を定義する。当業者であれば、用語「核酸」または「ヌクレオチド」が、他で特定しない限り、一本鎖または二本鎖であるかどうかにかかわらず、デオキシリボ核酸（「ＤＮＡ」）、リボ核酸（「ＲＮＡ」）、およびそれらの任意の化学修飾物に当てはまることを理解するであろう。「オリゴヌクレオチド」は、一般的に、例えば、約２〜約２００ヌクレオチド、またはより好ましくは、約１０〜約３０ヌクレオチド長のサイズの範囲の比較的短いポリヌクレオチドである。本発明に従うオリゴヌクレオチドは、一般的に、合成核酸であり、他で特定しない限り、一本鎖である。用語「ポリヌクレオチド」および「ポリ核酸」はまた、本明細書において同義語として使用してもよい。
【０１１２】
本明細書において使用する用語「アンチセンス」は、遺伝子産物をコードするかもしくは制御配列をコードする特定のＤＮＡまたはＲＮＡ配列に相補的であるヌクレオチド配列を指す。用語「アンチセンス鎖」は、「センス」鎖に相補的である核酸鎖に関して使用する。細胞の代謝の正常な操作において、ＤＮＡ分子のセンス鎖は、ポリペプチドおよび／または他の遺伝子産物をコードする鎖である。センス鎖は、順に、任意のコードされた遺伝子産物の合成を指令するメッセンジャーＲＮＡ（「ｍＲＮＡ」）転写物（アンチセンス鎖）の合成のためのテンプレートとしての役割を果たす。アンチセンス核酸分子は、相補鎖の合成を可能にするウイルスプロモーターに対して逆方向の配向で目的の遺伝子を連結することによる合成を含む、当該分野において公知の方法によって産生してもよい。いったん、細胞に導入されると、この転写された鎖は、細胞から産生される天然の配列に結合して、二重鎖を形成する。次いで、これらの二重鎖は、その先の転写また翻訳のいずれも阻止する。この様式では、変異表現型を作製してもよい。標示「負」または（−）はまた、アンチセンス鎖を指すことが当該分野において公知であり、「正」または（＋）はまた、センス鎖を指すことが当該分野において公知である。
【０１１３】
１つの好適な実施形態では、コンジュゲーションの選択範囲は、オリゴヌクレオチド（または「ポリヌクレオチド」）であり、コンジュゲーション後、標的をオリゴヌクレオチドの残基と称する。オリゴヌクレオチドは、ホスホロジエステル骨格またはホスホロチオエート骨格を有する既知のオリゴヌクレオチドおよびオリゴデオキシヌクレオチドのいずれかの中から選択することができる。
【０１１４】
オリゴヌクレオチド（類似体）は、オリゴヌクレオチドの単一の種に限定されないが、その代わりに、広範なそのような部分と作用するように設計され、リンカーは、ヌクレオチドの３'−または５'−末端、通常、ＰＯ₄またはＳＯ₄基の１つ以上に結合することができることが理解される。オリゴヌクレオチドとして、アンチセンスオリゴヌクレオチド、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、アプタマーなどが挙げられる。オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド誘導体は、約１０〜約１０００の核酸、および好ましくは、例えば、約２〜約２００ヌクレオチド、またはより好ましくは、約１０〜約３０ヌクレオチド長のサイズの範囲の比較的短いポリヌクレオチドを含むことができる。加えて、オリゴヌクレオチドは、天然のホスホロジエステル骨格もしくはホスホロチオエート骨格またはＬＮＡ（ロックされた核酸）、ＰＮＡ（ペプチド骨格を有する核酸）、トリシクロ−ＤＮＡのような他の任意の改変された骨格；デコイＯＤＮ（二本鎖オリゴヌクレオチド）、ＲＮＡ（触媒ＲＮＡ配列）、リボザイム；Ｔｉｄｅｓ ２００２、「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅｓ」、２００２年５月６〜８日、Ｌａｓ Ｖｅｇａｓ、ネバダ州および「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ＆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ」、２００３年１１月１８日および１９日、Ｈａｍｂｕｒｇ、独国（それらの内容は本明細書において参照により援用される）において開示されたもののようなスピーゲルマー（Ｌ−型オリゴヌクレオチド）、ＣｐＧオリゴマーなどを含有することができる。
【０１１５】
本発明に従うオリゴヌクレオチドはまた、場合により、当該分野において公知の任意の適切なヌクレオチド類似体および誘導体を含むことができ、以下の表１において列挙するものを含む。
【表１】

【０１１６】
本発明において考えられるオリゴヌクレオチドへの改変として、例えば、選択されたヌクレオチドへの付加、または所望のポリマーへのオリゴヌクレオチドの共有結合を可能にする官能基もしくは部分による選択されたヌクレオチドの置換、ならびに／あるいはさらなる電荷、極性、水素結合、静電相互作用、および官能性をオリゴヌクレオチドに組み入れる官能性部分の付加または置換が挙げられる。そのような改変として、２'−位糖改変、５−位ピリミジン改変、８−位プリン改変、環外アミンにおける改変、４−チオウリジンの置換、５−ブロモまたは５−ヨードウラシルの置換、骨格改変、メチル化、イソ塩基、イソシチジンおよびイソグアニジンのような塩基対の組合せ、ならびに類似体の組合せが挙げられるが、これらに限定されない。また、オリゴヌクレオチド改変として、キャッピングのような３'および５'改変を挙げることもできる。例示的なヌクレオシド類似体の構造を以下に提供する。
【化３０】

【０１１７】
フライヤー（Ｆｒｅｉｅｒ）およびアルトマン（Ａｌｔｍａｎｎ）；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１９９７年、２５，４４２９−４４４３およびウールマン（Ｕｈｌｍａｎｎ）；「Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ」、２０００年、３（２），２９３−２１３（それらのそれぞれの内容は本明細書において参照により援用される）に記載のヌクレオシド類似体のさらなる例を参照のこと。
【０１１８】
本発明の１つの好適な態様では、オリゴヌクレオチドは、標的化された腫瘍細胞か、または抗癌治療剤に対する腫瘍細胞の耐性に関係するタンパク質をダウンレギュレートすることに関与する。例えば、癌治療のためのアンチセンスオリゴヌクレオチドによるダウンレギュレーションのためのｂｃｌ−２のような当該分野において公知の任意の細胞タンパク質を、本発明に使用することができる。２００４年４月９日に出願された米国特許出願第１０／８２２，２０５号明細書（その内容は本明細書において参照により援用される）を参照のこと。好適な治療用オリゴヌクレオチドの非限定的リストには、アンチセンスＨＩＦ−１αオリゴヌクレオチドおよびアンチセンススルビビンオリゴヌクレオチドが含まれる。
【０１１９】
オリゴヌクレオチドは、例えば、ジェナセンス（Ｇｅｎａｓｅｎｓｅ）（ゲンタ社（Ｇｅｎｔａ Ｉｎｃ．，米国ニュージャージー州バークリー・ハイツ所在）より製造されるａ／ｋ／ａオブリメルセンナトリウム）と同じまたは実質的に類似のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドであり得る。ジェナセンスは、ヒトｂｃｌ−２ ｍＲＮＡ（ヒトｂｃｌ−２ ｍＲＮＡは当該分野において公知であり、例えば、本明細書において参照により援用される米国特許第６，４１４，１３４号明細書において配列番号１９として記載されている）の開始配列の最初の６コドンに相補的である１８マーのホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチド、ＴＣＴＣＣＣＡＧＣＧＴＧＣＧＣＣＡＴ（配列番号６）である。２０００年８月、米国食品医薬品局（Ｕ．Ｓ．Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）（ＦＤＡ）は、ジェナセンスをオーファンドラッグと認定した。好適な実施形態として：
(i) アンチセンススルビビンＬＮＡ（配列番号３）

【０１２０】
（ここで、大文字はＬＮＡを表し、「ｓ」はホスホロチオエート骨格を表す）；
(ii) アンチセンスＢｃｌ２ ｓｉＲＮＡ；
センス ５'-ＧＣＡＵＧＣＧＧＣＣＵＣＵＧＵＵＵＧＡｄＴｄＴ-３'
（配列番号４）
アンチセンス ３'-ｄＴｄＴＣＧＵＡＣＧＣＣＧＧＡＧＡＣＡＡＡＣＵ-５'
（配列番号５）
（ここで、ｄＴはＤＮＡを表す）；
(iii) ジェナセンス（ホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチド）：
（配列番号６）

【０１２１】
（ここで、小文字はＤＮＡを表し、「ｓ」はホスホロチオエート骨格を表す）；
(iv) アンチセンスＨＩＦ１αＬＮＡ（配列番号７）
５'-_ｓＴ_ｓＧ_ｓＧ_ｓｃ_ｓａ_ｓａ_ｓｇ_ｓｃ_ｓａ_ｓｔ_ｓｃ_ｓｃ_ｓＴ_ｓＧ_ｓＴ_ｓａ-３'
（配列番号７）
（ここで、大文字はＬＮＡを表し、「ｓ」はホスホロチオエート骨格を表す）
が挙げられる。
【０１２２】
ＬＮＡは、以下に示すような２'−Ｏ，４'−Ｃメチレンビシクロヌクレオチドを含む：
【化３１】

【０１２３】
米国特許出願第１１／２７２，１２４号明細書（発明の名称「ＬＮＡオリゴヌクレオチドおよび癌の治療（ＬＮＡ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｔｒｅａｔｍｅｍｔ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ）」）ならびに同第１０／７７６，９３４号明細書（発明の名称「スルビビン発現のモジュレーションのためのオリゴマー化合物（Ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ Ｓｕｒｖｉｖｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」）（それらのそれぞれの内容は本明細書において参照により援用される）において開示されたスルビビンＬＮＡの詳細な説明を参照のこと。また、米国特許出願第１０／４０７，８０７号明細書（発明の名称「ＨＩＦ−１α発現のモジュレーションのためのオリゴマー化合物（Ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ＨＩＦ−１ Ａｌｐｈａ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」）および同第１１／２７１，６８６号明細書（発明の名称「ＨＩＦ−１Ａ発現の阻害のための強力なＬＮＡオリゴヌクレオチド（Ｐｏｔｅｎｔ ＬＮＡ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ＨＩＦ−１Ａ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」）（それらの内容もまた、本明細書において参照により援用される）を参照のこと。
【０１２４】
本明細書に記載の化合物において用いられるオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの５'または３'末端において、（ＣＨ₂）_wアミノリンカーで改変することができ、ここで、この態様における（ｗ）は、好ましくは、約１〜約１０、好ましくは、６の正の整数である。改変されたオリゴヌクレオチドは、以下に示すようなＮＨ−（ＣＨ₂）_w−オリゴヌクレオチドであり得る。
【化３２】

【０１２５】
［式中、（ｙ）は、約１〜約７の整数である］
１つの好適な実施形態では、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の５'末端が改変される。例えば、ポリマー複合体において用いられるｓｉＲＮＡは、５'−Ｃ₆−ＮＨ₂で改変される。本発明の１つの特定の実施形態は、以下の配列を有するＢｃｌ２−ｓｉＲＮＡを用いる。
【０１２６】
センス ５'-(ＮＨ₂-Ｃ₆)ＧＣＡＵＧＣＧＧＣＣＵＣＵＧＵＵＵＧＡｄＴｄＴ-３'
アンチセンス ３'−ｄＴｄＴＣＧＵＡＣＧＣＣＧＧＡＧＡＣＡＡＡＣＵ−５'◎
別の態様では、本明細書に記載の化合物として、ヒンダードエステル含有（ＣＨ₂）_wアミノリンカーで改変されたオリゴヌクレオチドを挙げることができる。米国仮特許出願第６０／８４４，９４２号明細書（発明の名称「ヒンダードエステル系の生分解性リンカーを有するポリアルキレンオキシド（Ｐｏｌｙａｌｋｙｌｅｎｅ Ｏｘｉｄｅｓ Ｈａｖｉｎｇ Ｈｉｎｄｅｒｅｄ Ｅｓｔｅｒ−Ｂａｓｅｄ Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ Ｌｉｎｋｅｒｓ）」）および同第６０／８４５，０２８号明細書（発明の名称「オリゴヌクレオチド送達のためのヒンダードエステル系の生分解性リンカー（Ｈｉｎｄｅｒｅｄ Ｅｓｔｅｒ−Ｂａｓｅｄ Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ Ｌｉｎｋｅｒｓ ｆｏｒ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ）」）（それらのそれぞれの内容は参照により援用される）を参照のこと。ポリマー化合物は、アミノテイルを伴わずにオリゴヌクレオチドを遊離することができる。例えば、オリゴヌクレオチドは、以下の構造を有することができる：
【化３３】

【０１２７】
さらに別の態様では、オリゴヌクレオチドは、(ＣＨ₂)_wスルフヒドリルリンカーで改変することができる（チオオリゴヌクレオチド）。チオオリゴヌクレオチドは、正に荷電したペプチドのシステインに直接、またはマレイミジル基を介して複合体化するために使用することができる。チオオリゴヌクレオチドは、構造ＳＨ−（ＣＨ₂）_w−オリゴヌクレオチドを有することができる。また、チオオリゴヌクレオチドとして、以下の構造を有するヒンダードエステルを挙げることができる：
【化３４】

【０１２８】
オリゴヌクレオチドは、Ｃ₆−ＮＨ₂テイル、Ｃ₆−ＳＨテイルまたはヒンダードエステルテイルで改変することができる。改変されたオリゴヌクレオチドの例として：
（i） Ｃ₆−ＮＨ₂テイルで改変されたジェナセンス：
【化３５】

【０１２９】
（ii） Ｃ₆−ＮＨ₂テイルで改変されたアンチセンスＨＩＦ１αＬＮＡ：
５'-ＮＨ₂-Ｃ₆-_sＴ_sＧ_sＧ_sｃ_sａ_sａ_sｇ_sｃ_sａ_sｔ_sｃ_sｃ_sＴ_sＧ_sＴ_sａ-３'；
（iii） Ｃ₆−ＮＨ₂テイルで改変されたアンチセンススルビビンＬＮＡ：
５'-ＮＨ₂-Ｃ₆-_s^ｍＣ_sＴ_s^ｍＣ_sＡ_sａ_sｔ_sｃ_sｃ_sａ_sｔ_sｇ_sｇ_s^mＣ_sＡ_sＧ_sｃ-３'；
（iv） Ｃ₆−_sＨテイルで改変されたアンチセンススルビビンＬＮＡ：
５'-Ｈ_s-Ｃ₆-_s^mＣ_sＴ_s^mＣ_sＡ_sａ_sｔ_sｃ_sｃ_sａ_sｔ_sｇ_sｇ_s^mＣ_sＡ_sＧ_sｃ-３'；
（ｖ） ヒンダードエステルテイルで改変されたジェナセンス：
【化３６】

【０１３０】
が挙げられる。
【０１３１】
Ｅ．標的化剤
標的化剤を、本明細書に記載のポリマー化合物に結合させて、複合体をインビボで標的領域へ誘導することができる。標的化剤は、オリゴヌクレオチドのような負に荷電した生物学的に活性な部分に、標的領域、即ち、腫瘍部位において治療効果を有するようにする。オリゴヌクレオチドのような負に荷電した分子の標的化された送達は、より良好な治療効果を有するために、これらの分子の細胞内取り込みをインビボで促進する。所定の態様では、腫瘍部位への標的化された送達のために、いくつかの細胞膜透過性ペプチドを、さまざまな標的化ペプチドで置換することができる。
【０１３２】
本発明の１つの好適な態様では、標的部分、例えば、一本鎖抗体（ＳＣＡ）または一本鎖抗原結合抗体、モノクローナル抗体、細胞接着性ペプチド、例えば、ＲＧＤペプチドおよびセレクチン、細胞膜透過性ペプチド（ＣＰＰ）、例えば、ＴＡＴ、ペネトラチンおよび（Ａｒｇ）₉、受容体リガンド、標的炭水化物分子またはレクチン、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド誘導体、例えば、ロックされた核酸（ＬＮＡ）およびアプタマーなどは、細胞毒性薬を標的化された領域に特異的に指向させる。Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ．２００６年９月；９５（９）：１８５６−７２「Ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｆｏｒ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ」（その内容は本明細書において参照により援用される）を参照のこと。
【０１３３】
好適な標的部分として、一本鎖抗体（ＳＣＡ）または抗体の一本鎖可変フラグメント（ｓＦｖ）が挙げられる。ＳＣＡは、標的化している腫瘍細胞の特異的分子に結合するかまたはそれに結合することができる抗体のドメインを含有する。抗原結合部位を維持することに加えて、リンカーを介するＰＥＧ化ＳＣＡは、抗原性を減少し、血流中のＳＣＡの半減期を増加することができる。
【０１３４】
用語「一本鎖抗体」（ＳＣＡ）、「一本鎖抗原結合分子もしくは抗体」または「一本鎖Ｆｖ」（ｓＦｖ）は、同義的に使用される。一本鎖抗体は、抗原に対する結合親和性を有する。一本鎖抗体（ＳＣＡ）または一本鎖Ｆｖｓは、いくらかの方法で構築することができ、また既に構築されている。一本鎖抗原結合タンパク質の理論および産生に関する説明については、本発明の譲受人に譲渡された米国特許出願第１０／９１５，０６９号明細書および米国特許第６，８２４，７８２号明細書（それらのそれぞれの内容は、本明細書において参照により援用される）において見出される。
【０１３５】
典型的に、ＳＣＡまたはＦｖドメインは、２６−１０、ＭＯＰＣ ３１５、７４１Ｆ８、５２０Ｃ９、ＭｃＰＣ６０３、Ｄ１．３、マウスｐｈＯｘ、ヒトｐｈＯｘ、ＲＦＬ３．８ｓＴＣＲ、１Ａ６、Ｓｅ１５５−４、１８−２−３、４−４−２０、７Ａ４−１、Ｂ６．２、ＣＣ４９、３Ｃ２、２ｃ、ＭＡ−１５Ｃ５／Ｋ_１２Ｇ_Ｏ、Ｏｘなどとして文献においてそれらの力小が公知であるモノクローナル抗体の中から選択することができる。（ヒューストン，Ｊ．Ｓ．（Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：５８７９−５８８３（１９８８年）；ヒューストン，Ｊ．Ｓ．（Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊ，Ｓ，）ら、ＳＩＭ Ｎｅｗｓ３８（４）（補遺）：１１（１９８８年）；マッカートニー，Ｊ．（ＭｃＣａｒｔｎｅｙ，Ｊ．）ら、ＩＣＳＵ Ｓｈｏｒｔ Ｒｅｐｏｒｔｓ１０：１１４（１９９０年）；マッカートニー，Ｊ．Ｅ．（ＭｃＣａｒｔｎｅｙ，Ｊ．Ｅ．）ら、結果公表せず（１９９０年）；ネーデルマン，Ｍ．Ａ．（Ｎｅｄｅｌｍａｎ，Ｍ．Ａ．）ら、Ｊ．Ｎｕｃｌｅａｒ Ｍｅｄ．３２（補遺）：１００５（１９９１年）；ヒューストン，Ｊ．Ｓ．（Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．）ら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｍｏｄｅｌｉｎｇ：Ｃｏｎｃｅｐｔｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ｂ部、Ｊ．Ｊ．ランゴン（Ｊ．Ｊ．Ｌａｎｇｏｎｅ）編、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２０３：４６−８８（１９９１年）；ヒューストン，Ｊ．Ｓ．（Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．）ら、「Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ」、エペネトス，Ａ．Ａ．（Ｅｐｅｎｅｔｏｓ，Ａ．Ａ．）（編）、Ｌｏｎｄｏｎ，Ｃｈａｐｍａｎ ＆ Ｈａｌｌ（１９９３年）；バード，Ｒ．Ｅ．（Ｂｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２：４２３−４２６（１９８８年）；ベドジック，Ｗ．Ｄ．（Ｂｅｄｚｙｋ，Ｗ．Ｄ．）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１８６１５−１８６２０（１９９０年）；コルチャー，Ｄ．（Ｃｏｌｃｈｅｒ，Ｄ．）ら、Ｊ．Ｎａｔ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８２：１１９１−１１９７（１９９０年）；ギブス，Ｒ．Ａ．（Ｇｉｂｂｓ，Ｒ．Ａ．）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：４００１−４００４（１９９１年）；ミレニック，Ｄ．Ｅ．（Ｍｉｌｅｎｉｃ，Ｄ．Ｅ．）ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ５１：６３６３−６３７１（１９９１年）；パントリアーノ，Ｍ．Ｗ．（Ｐａｎｔｏｌｉａｎｏ，Ｍ．Ｗ．）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３０：１０１１７−１０１２５（１９９１年）；チャウドハリーＶ．Ｋ．（Ｃｈａｕｄｈａｒｙ，Ｖ．Ｋ．）ら、Ｎａｔｕｒｅ３３９：３９４−３９７（１９８９年）；チャウドハリーＶ．Ｋ．（Ｃｈａｕｄｈａｒｙ，Ｖ．Ｋ．）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７：１０６６−１０７０（１９９０年）；バトラ，Ｊ．Ｋ．（Ｂａｔｒａ，Ｊ．Ｋ．）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１７１：1-6（１９９０年）；バトラ，Ｊ．Ｋ．（Ｂａｔｒａ，Ｊ．Ｋ．）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１５１９８−１５２０２（１９９０年）；チャウドハリーＶ．Ｋ．（Ｃｈａｕｄｈａｒｙ，Ｖ．Ｋ．）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７：９４９１−９４９４（１９９０年）；バトラ，Ｊ．Ｋ．（Ｂａｔｒａ，Ｊ．Ｋ．）ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１：２２００−２２０５（１９９１年）；ブリンクマン，Ｕ．（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ，Ｕ．）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：８６１６−８６２０（１９９１年）；シーサラム，Ｓ．（Ｓｅｅｔｈａｒａｍ，Ｓ．）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１７３７６−１７３８１（１９９１年）；ブリンクマン，Ｕ．（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ，Ｕ．）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：３０７５−３０７９（１９９２年）；グロックスヒューバー，Ｒ．（Ｇｌｏｃｋｓｈｕｂｅｒ，Ｒ．）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２９：１３６２−１３６７（１９９０年）；スケッラ，Ａ．（Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．）ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．９：２７３−２７８（１９９１年）；パック，Ｐ．（Ｐａｃｋ，Ｐ．）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３１：１５７９−１５３４（１９９２年）；クラックソン，Ｔ．（Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ．）ら、Ｎａｔｕｒｅ３５２：６２４−６２８（１９９１年）；マークス，Ｊ．Ｄ．（Ｍａｒｋｓ，Ｊ．Ｄ．）ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９１年）；イベルソン，Ｂ．Ｌ．（Ｉｖｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｌ．）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：６５９−６６２（１９９０年）；ロバーツ，Ｖ．Ａ．（Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｖ．Ａ．）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７：６６５４−６６５８（１９９０年）；コンドラ，Ｊ．Ｈ．（Ｃｏｎｄｒａ，Ｊ．Ｈ．）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：２２９２−２２９５（１９９０年）；ラロシュ，Ｙ．（Ｌａｒｏｃｈｅ，Ｙ．）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１６３４３−１６３４９（１９９１年）；ホルボエト，Ｐ．（Ｈｏｌｖｏｅｔ，Ｐ．）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１９７１７−１９７２４（１９９１年）；アナンド，Ｎ．Ｎ．（Ａｎａｎｄ，Ｎ．Ｎ．）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：２１８７４−２１８７９（１９９１年）；フックス，Ｐ．（Ｆｕｃｈｓ，Ｐ．）ら、Ｂｉｏｌ Ｔｅｃｈｎｏｌ．９：１３６９−１３７２（１９９１年）；ブライトリング，Ｆ．（Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇ，Ｆ．）ら、Ｇｅｎｅ１０４：１０４−１５３（１９９１年）；ゼーハウス，Ｔ．（Ｓｅｅｈａｕｓ，Ｔ．）ら、Ｇｅｎｅ１１４：２３５−２３７（１９９２年）；タッキネン，Ｋ．（Ｔａｋｋｉｎｅｎ，Ｋ．）ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｎｇ．４：８３７−８４１（１９９１年）；ドレーアー，Ｍ．Ｌ．（Ｄｒｅｈｅｒ，Ｍ．Ｌ．）ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ１３９：１９７−２０５（１９９１年）；モッテズ，Ｅ．（Ｍｏｔｔｅｚ，Ｅ．）ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１：４６７−４７１（１９９１年）；トローネッカー，Ａ．（Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ，Ａ．）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：８６４６−８６５０（１９９１年）；トローネッカー，Ａ．（Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ，Ａ．）ら、ＥＭＢＯ Ｊ．１０：３６５５−３６５９（１９９１年）；フー，Ｗ．Ｆ．Ｓ．（Ｈｏｏ，Ｗ．Ｆ．Ｓ．）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：４７５９−４７６３（１９９３年）を参照のこと）。上記の刊行物のそれぞれは、本明細書において参照により援用される。
【０１３６】
標的基の非限定的リストには、血管内皮細胞増殖因子、ＦＧＦ２、ソマトスタチンおよびソマトスタチン類似体、トランスフェリン、メラノトロピン、ＡｐｏＥおよびＡｐｏＥペプチド、フォン・ウィルブランド因子およびフォン・ウィルブランド因子ペプチド、アデノウイルスファイバータンパク質およびアデノウイルスファイバータンパク質ペプチド、ＰＤ１およびＰＤ１ペプチド、ＥＧＦおよびＥＧＦペプチド、ＲＧＤペプチド、葉酸塩などが含まれる。当該分野の当業者によって理解されている他の任意選択的な標的化剤もまた、本明細書に記載の化合物において用いることができる。
【０１３７】
好ましくは、標的化剤には、一本鎖抗体（ＳＣＡ）、ＲＧＤペプチド、セレクチン、ＴＡＴ、ペネトラチン、（Ａｒｇ）₉、葉酸などが含まれ、これらの薬剤の好適な構造のいくつかは、以下のとおりである：
Ｃ−ＴＡＴ： （配列番号１） ＣＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ；
Ｃ−（Ａｒｇ）₉： （配列番号２） ＣＲＲＲＲＲＲＲＲＲ；
ＲＧＤは、直鎖または環状の：
【化３７】

【０１３８】
であり得；
葉酸は、
【化３８】

【０１３９】
の残基である。
【０１４０】
Ａｒｇ₉は、例えば、ＣＲＲＲＲＲＲＲＲＲを複合体化するためのシステインを含むことができ、ＴＡＴは、ＣＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＣのようなペプチドの末端においてさらなるシステインを付加することができる。
【０１４１】
本発明の目的のために、本明細書および図面において使用される略称は、以下の構造を表す：
(i) Ｃ-ジＴＡＴ＝ＣＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ-ＮＨ₂；
(ii) 直鎖ＲＧＤ＝ＲＧＤＣ；
(iii) 環状ＲＧＤ＝ｃ−ＲＧＤｆＣ；
(iv) ＲＧＤ−ＴＡＴ＝ＣＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧＧＧＲＧＤＳ−ＮＨ₂；および
(v) Ａｒｇ₉
【０１４２】
Ｆ．遊離可能なリンカー
本発明の１つの好適な態様では、本明細書に記載の化合物は、遊離可能なリンカーに結合した生物学的に活性な部分を含有する。本発明の１つの利点は、生物学的に活性な部分を、制御された様式で遊離することができることである。
【０１４３】
遊離可能なリンカーの中には、ベンジル基脱離系のリンカー、トリアルキル基ロック系のリンカー（またはトリアルキル基ロックラクトン系）、ビシン系のリンカー、酸に不安定なリンカー、リソソーム切断性ペプチドおよびカテプシンＢ切断性ペプチドがあり得る。酸に不安定なリンカーの中には、ジスルフィド結合、ヒドロゾン(hydrozone)含有リンカーおよびチオプロピオネート含有リンカーがあり得る。あるいは、遊離可能なリンカーは、細胞内で不安定なリンカー、細胞外リンカーおよび酸に不安定なリンカーである。
【０１４４】
遊離可能なリンカーは、式：
【化３９】

【０１４５】
−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−、
−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−、
−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−、
−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−、
【化４０】

【０１４６】
−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−Ｃ(＝Ｏ)−ＣＨ₂ＯＣＨ₂−Ｃ(＝Ｏ)−、
−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−Ｃ(＝Ｏ)−ＣＨ₂ＳＣＨ₂−Ｃ(＝Ｏ)−、および
−ＮＨＣＨ(ＣＨ₃)−Ｃ(＝Ｏ)−ＮＨ(ＣＨ₂)₆−Ｃ(ＣＨ₃)₂−Ｃ(＝Ｏ)−
［式中、
Ｙ_11-19は、独立してＯ、ＳまたはＮＲ₄₈であり；
Ｒ_31-48、Ｒ_50-51およびＡ₅₁は、水素、Ｃ_1-6アルキル類、Ｃ_3-12分岐アルキル類、Ｃ_3-8シクロアルキル類、Ｃ_1-6置換アルキル類、Ｃ_3-8置換シクロアルキル類、アリール類、置換アリール類、アラルキル類、Ｃ_1-6ヘテロアルキル類、置換Ｃ_1-6ヘテロアルキル類、Ｃ_1-6アルコキシ、フェノキシおよびＣ_1-6ヘテロアルコキシの中から選択され；
Ａｒは、アリールまたはヘテロアリール部分であり；
Ｌ_11-15は、独立して選択される二官能性スペーサーであり；
ＪおよびＪ'は、独立して標的細胞に能動的に輸送される部分、疎水性部分、二官能性連結部分およびそれらの組合せから選択され；
（ｃ１１）、（ｈ１１）、（ｋ１１）、（ｌ１１）、（ｍ１１）および（ｎ１１）は、独立して選択される正の整数、好ましくは、１であり；
（ａ１１）、（ｅ１１）、（ｇ１１）、（ｊ１１）、（ｏ１１）および（ｑ１１）は、独立して０もしくは正の整数、好ましくは、１であり；
（ｂ１１）、（ｘ１１）、（ｘ'１１）、（ｆ１１）、（ｉ１１）および（ｐ１１）は、独立して０もしくは１である］
で表される。
【０１４７】
多様な遊離可能なリンカー、ベンジル基脱離系のものまたはトリアルキル基ロック系のものについては、例えば、本発明の譲受人に譲渡された米国特許第６，１８０，０９５号明細書、同第６，７２０，３０６号明細書、同第５，９６５，１１９号明細書、同第６６２４，１４２号明細書および同第６，３０３，５６９号明細書（それらのそれぞれの内容は、本明細書において参照により援用される）に記載されている。ビシン系のリンカーについてもまた、本発明の譲受人に譲渡された米国特許第７，１２２，１８９号明細書および同第７０８７，２２９号明細書ならびに米国特許出願第１０／５５７，５２２号明細書、同第１１／５０２，１０８号明細書、および同第１１／０１１，８１８号明細書（それらのそれぞれの内容は、本明細書において参照により援用される）に記載されている。
【０１４８】
好ましくは、オリゴヌクレオチドは、酸に不安定なリンカーを介して、本明細書に記載の化合物のポリマー部分に連結される。いずれの理論にもとらわれずに述べれば、酸に不安定なリンカーは、細胞内、および特に、リソソーム、エンドソーム、またはマクロピノソームにおける親ポリマー化合物からのオリゴヌクレオチドの遊離を容易にする。
【０１４９】
本発明の別の態様では、正に荷電したペプチドおよび標的化剤はまた、酸に不安定なリンカーのような遊離可能なリンカーを介して本明細書に記載の化合物のポリマー部分に連結することができる。
【０１５０】
Ｇ．二官能性リンカー
本発明の別の態様では、正に荷電したペプチドおよび標的化剤を、恒久的なリンカーおよび遊離可能なリンカーを単独または組合せで介して本明細書に記載の化合物のポリマー部分に連結することができる。好ましくは、恒久的なリンカーを介して、正に荷電したペプチドおよび標的化剤が連結される。
【０１５１】
二官能性リンカーとして、アミノ酸またはアミノ酸誘導体が挙げられる。アミノ酸は、天然に存在するおよび天然に存在しないアミノ酸のものであり得る。天然に存在するアミノ酸の誘導体および類似体、ならびに当該分野において公知の多様な天然に存在しないアミノ酸（ＤもしくはＬ）、疎水性または非疎水性のものもまた、本発明の範囲内にあると考えられる。天然に存在しないアミノ酸の適切な非限定的なリストには、２−アミノアジピン酸、３−アミノアジピン酸、β−アラニン、β−アミノ−プロピオン酸、２−アミノ酪酸、４−アミノ酪酸、ピペリジン酸、６−アミノカプロン酸、２−アミノヘプタン酸、２−アミノイソ酪酸、３−アミノイソ酪酸、２−アミノピメリン酸、２，４−アミノ酪酸、デスモシン、２，２−ジアミノピメリン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸、Ｎ−エチルグリシン、Ｎ−エチルアスパラギン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン、イソデスモシン、アロイソロイシン、Ｎ−メチルグリシン、サルコシン、Ｎ−メチル−イソロイシン、６−Ｎ−メチル−リジン、Ｎ−メチルバリン、ノルバリン、ノルロイシン、およびオルニチンが挙げられる。いくつかの好適なアミノ酸残基として、グリシン、アラニン、メチオニンおよびサルコシンが挙げられる。
【０１５２】
あるいは、二官能性リンカーは、
【化４１−１】

【化４１−２】

【０１５３】
［式中：
Ｒ_21-29は、水素、Ｃ_1-6アルキル類、Ｃ_3-12分岐アルキル類、Ｃ_3-8シクロアルキル類、Ｃ_1-6置換アルキル類、Ｃ_3-8置換シクロアルキル類、アリール類、置換アリール類、アラルキル類、Ｃ_1-6ヘテロアルキル類、置換Ｃ_1-6ヘテロアルキル類、Ｃ_1-6アルコキシ、フェノキシおよびＣ_1-6ヘテロアルコキシの中から選択され；
（ｔ）および（ｔ'）は、独立して０もしくは正の整数、好ましくは、０もしくは約１〜約１２の整数、より好ましくは、約１〜約８の整数、および最も好ましくは、１もしくは２であり；
（ｖ）および（ｖ'）は、独立して０もしくは１である］
の中から選択することができる。
【０１５４】
好ましくは、二官能性リンカーは：
【化４２−１】

【化４２−２】

【０１５５】
［式中、（ｒ）および（ｒ'）は、独立して０もしくは１であり、但し、（ｒ）および（ｒ'）は、両方が同時に０になることはない］
の中から選択することができる。
【０１５６】
本発明のさらなる別の態様では、二官能性リンカーとして：
【化４３】

【０１５７】
が挙げられる。
【０１５８】
これらの二官能基は、第２の因子を直接複合体化させ、従って、第２の因子に複合体化するための官能基に結合する必要性を排除する。
【０１５９】
別の実施形態では、二官能性リンカーは、上記で示した構造に対応する構造を含むが、但し、マレイミジル基の代わりに、ビニルのような基を有し、マレイミジルの代わりに、スルホン、アミノ、カルボキシ、メルカプト、チオプロピオネート、ヒドラジド、カルバゼートなどの残基を有する。
【０１６０】
Ｈ．分岐基
本明細書に記載の化合物のポリマーアーム末端は、生物学的に活性な部分、正に荷電した部分、および／または標的化剤の複数の充填を可能にするために、分岐することができる。好ましくは、分岐基は、正に荷電した部分が利用可能なさらなるポリマーアーム末端を提供する。
【０１６１】
分岐部分は、少なくとも３つの官能部分を有することができる。ポリマーアーム末端の数は、分岐の程度によって倍加される。３つの官能部分を有する分岐基がポリマー化合物に連結される場合、それは、連結のための２つの末端を提供する。分岐基は：
【化４４】

【０１６２】
［式中、
Ｒ₅は、水素、Ｃ_1-6アルキル、Ｃ_2-6アルケニル、Ｃ_2-6アルキニル、Ｃ_3-19分岐アルキル、Ｃ_3-8シクロアルキル、Ｃ_1-6置換アルキル、Ｃ_2-6置換アルケニル、Ｃ_2-6置換アルキニル、Ｃ_3-8置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、Ｃ_1-6ヘテロアルキル、置換Ｃ_1-6ヘテロアルキル、Ｃ_1-6アルコキシ、アリールオキシ、Ｃ_1-6ヘテロアルコキシ、ヘテロアリールオキシ、Ｃ_2-6アルカノイル、アリールカルボニル、Ｃ_2-6アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、Ｃ_2-6アルカノイルオキシ、アリールカルボニルオキシ、Ｃ_2-6置換アルカノイル、置換アリールカルボニル、Ｃ_2-6置換アルカノイルオキシ、置換アリールオキシカルボニル、Ｃ_2-6置換アルカノイルオキシ、および置換アリールカルボニルオキシの中から独立して選択され；
（ｃ１）、（ｃ２）、（ｃ３）、（ｃ４）、（ｃ５）、（ｃ６）、（ｃ'６）、（ｃ''６）、（ｃ７）および（ｃ８）は、独立して０もしくは正の整数、好ましくは、０もしくは約１〜１０の整数、およびより好ましくは、０、１もしくは２であり；
（ｄ１）、（ｄ２）、（ｄ３）、（ｄ４）、（ｄ５）および（ｄ７）は、独立して０もしくは正の整数、好ましくは、０もしくは約１〜約１０の整数、およびより好ましくは、０もしくは約１〜約４の整数である］
の中から選択することができる。
【０１６３】
また、多様な分岐基については、共有の米国特許第６，１５３，６５５号明細書、同第６，３９５，２６６号明細書および同第６，６３８，４９９号明細書（それらのそれぞれの内容は、本明細書において参照により援用される）に記載されている。当業者に公知の他のすべての任意選択的な分岐基もまた、本明細書に記載の化合物内にあるものと考えられる。
【０１６４】
好ましくは、分岐基は：
【化４５】

【０１６５】
を含む。
【０１６６】
より好ましくは、分岐基は、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、およびシステインを含む。
【０１６７】
さらなる態様では、１つ以上の分岐基を、ポリマーアームの各末端において用いることができる。
【０１６８】
Ｉ．式Ｉに対応する好適な実施形態
１つの好適な実施形態では、ポリマー化合物は、以下の式で表される：
【化４６】

【０１６９】
［式中、
（ｅ）は１もしくは２であり；
（ｅ'）は、０、１もしくは２であり；
（ｆ'）は、０もしくは１である］
【化４７】

【０１７０】
［式中、（ｇ'）は、正の整数である］。
【０１７１】
例えば、本発明に従って調製される複合体には、以下のものがある：
【化４８−１】

【化４８−２】

【化４８−３】

【化４８−４】

【０１７２】
［式中、
Ｃ-ＴＡＴは、-Ｓ-ＣＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ-ＣＯＮＨ₂の残基である；
ＮＨ-５'-Ｃ₆-ＧＳは、ジェナセンス、１８量体のホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドＴＣＴＣＣＣＡＧＣＧＴＧＣＧＣＣＡＴ（配列番号１）の誘導体
【化４９】

【０１７３】
であり；
Ｓ-５'-Ｃ₆-ＮＡ-スルビビンは、
【化５０】

【０１７４】
であり；
ＲＧＤは、
【化５１】

【０１７５】
である］。
【０１７６】
本発明の１つの好適な実施形態では、ポリマー化合物は以下を含む：
【０１７７】
ｓｉＲＮＡ二重鎖のセンス鎖の５'末端は、ＰＥＧリンカーに複合体化するためのＣ₆−アミノテイルに改変される。
【０１７８】
Ｊ．ポリマー送達システムの合成
一般的に、複合体は、多官能性リンカーに連続的にポリマー、細胞障害性薬剤、正電荷含有部分、および標的部分を結合させることによって、作製することができる。付加の正確な順序はこの順番に限定されず、当業者に明らかであるように、ＰＥＧが最初に多官能性リンカーに付加され、続いて、遊離可能に結合される細胞毒性薬の付加、続いて、正電荷含有部分およびモノクローナル抗体のような標的化剤の付加が行われる態様も認められる。この実施形態のいくつかの好適な態様に関する詳細を、以下の実施例に提供する。
【０１７９】
本発明の１つの態様では、ＯＨまたは脱離基を含有するポリマー化合物を、最初に、遊離可能なリンカー部分を含有する求核部分と反応させ、次いで、遠位末端において官能基を含有する別の求核部分と反応させることができる。遊離可能なリンカーを、生物学的に活性な化合物と複合体化させることができ、官能基を、正電荷含有部分と連結させることができる。あるいは、生物学的に活性な部分および正電荷含有部分に複合体化したポリマー化合物を、標的部分とさらに反応させて、本発明の３つのすべての成分を含有する最終的なポリマー複合体を調製することができる。例えば、当業者であれば、ポリマー上の脱離基の数と比較して、より少ない等量の求核部分を使用して、リンカーおよび脱離基を含有するポリマー中間体を形成させることができる。この中間体は、正電荷含有部分とさらに反応させるか、あるいは、標的部分とさらに反応させて、生物学的に活性な化合物、正電荷含有部分、および標的化剤で多置換されたポリマー複合体を形成させることができる。
【０１８０】
あるいは、ポリマーを異なる基と反応させて、多様な求核部分に対して異なる化学反応性を提供することができる。例えば、カルボン酸末端のｔｅｒｔ−Ｂｕエステルおよびメチルエステルのような異なる保護基を、選択的かつ段階的に脱保護して、細胞障害性薬剤のような異なる生物学的に活性な薬剤および標的化剤と複合体化すべき多様な程度の活性な基を提供することができる。図１に示すように、マレイミジル基およびスクシンイミジルエステルは、それぞれ、ＳＨまたはＮＨ₂含有部分と選択的に反応することができる。
【０１８１】
本明細書に記載のすべての反応は、当業者に公知の必要な工程および条件による標準的な化学反応である。従って、本明細書に記載の合成反応は、過度の実験を必要としない。
【０１８２】
求核性化合物のＰＥＧまたは他のポリマーへの結合は、当業者に周知の標準的な化学合成技術を使用して行うことができる。ＳＣ−ＰＥＧ、ＰＥＧ−アミン、ＰＥＧ酸などのような活性化されたポリマーは、商業的供給源から得ることができるか、または過度の実験を伴うことなく、当業者によって合成することができる。
【０１８３】
求核性化合物のポリマー部分への結合は、カップリング剤の存在下で代替的に行われる。適切なカップリング剤の非限定的なリストには、例えばシグマ−アルドリッチ・ケミカル（Sigma-Aldrich Chemical）社のような商業的供給源から入手可能であるか、または既知の技術を使用して合成される１，３−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣ）、任意の適切なジアルキルカルボジイミド類、２−ハロ−１−アルキル−ピリジニウムハロゲン化物（向山試薬）、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）、プロパンホスホン酸環状無水物（ＰＰＡＣＡ）およびフェニルジクロロホスホネート類などが含まれる。
【０１８４】
好ましくは、反応は、塩化メチレン、クロロホルム、ＤＭＦまたはそれらの混合物のような不溶性溶媒で行われる。好ましくは、反応は、作製される任意の酸を中和するために、ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）、ジイソプロピルエチルアミン、ピリジン、トリエチルアミンなどのような塩基の存在下で、行うことができる。反応は、約０℃から約２２℃（室温）までの温度で行うことができる。本明細書に記載の方法によって調製されるいくつかの特定の実施形態は、以下を含む：
【０１８５】
１つの態様では、負電荷を中和し、オリゴヌクレオチドのような生物学的に活性な部分の細胞内取り込みを改善するための正に荷電した部分を有するポリマー化合物は、以下の別の態様を有することができる：
(i) オリゴヌクレオチドの５'−または３'−末端において（ＣＨ₂）_wアミノリンカーで改変されたオリゴヌクレオチド；
(ii) オリゴヌクレオチドの５'−または３'−末端において（ＣＨ₂）_wスルフヒドリルリンカーで改変されたオリゴヌクレオチド；
(iii) アミノテイルまたはチオテイルを伴わないオリゴヌクレオチドを遊離することができるヒンダードエステルを含有する（ＣＨ₂）_wアミノリンカーまたは（ＣＨ₂）_wスルフヒドリルリンカーで改変されたオリゴヌクレオチド；
(iv) 細胞内取り込みを促進するために、１つ以上の正に荷電したペプチド、例えば、ＴＡＴ配列のような２つの正に荷電したペプチドを結合させることができる；
(v) １つ以上の遊離可能なリンカーを結合させることができる。
【０１８６】
ヒンダードエステル含有オリゴヌクレオチドの形成に関する説明については、本発明の譲受人に譲渡された米国仮特許出願第６０／８４５，０２８号明細書（発明の名称「オリゴヌクレオチド送達のためのヒンダードエステル系の生分解性リンカー（Ｈｉｎｄｅｒｅｄ Ｅｓｔｅｒ−Ｂａｓｅｄ Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ Ｌｉｎｋｅｒｓ Ｆｏｒ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ）」）（その内容は、本明細書において参照により援用される）に記載されている。図２の反応スキームを参照のこと。
【０１８７】
Ｋ．治療の方法
上記を鑑みると、式（Ｉ）の本発明の化合物を含有する有効量の医薬組成物を、それを必要とする患者に投与することを含んでなる、哺乳動物を治療する方法もまた、提供される。
【０１８８】
本発明の１つの特定の態様では、式（Ｉ）の本発明の化合物を含有する有効量の医薬組成物を、それを必要とする患者に投与することを含んでなる、悪性腫瘍または癌を有する患者を治療する方法もまた、提供される。別の態様では、治療される癌は、次の１つ以上であり得る：固形腫瘍、リンパ腫、小細胞肺癌、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、膵臓癌、神経膠芽腫、卵巣癌、胃癌など。組成物は、新生物疾患を治療する、腫瘍量を減少する、新生物の転移を防止する、および哺乳動物における腫瘍の再発／新生物増殖を防止するのに有用である。
【０１８９】
本発明の別の態様は、哺乳動物における多様な病態の治療の方法を提供する。簡単に説明すると、正に荷電したＰＥＧポリマーに結合することができる任意の生物学的に活性な部分を、そのような治療を必要とする哺乳動物に投与することができる。非複合体の状態で治療効果を有する任意のオリゴヌクレオチドなどは、本明細書に記載のように作製されるその複合体化された形態で使用することができる。
【０１９０】
例えば、投与されるプロドラッグとして使用される組成物の量は、その中に含まれる親分子に依存する。一般的に、治療方法において使用されるプロドラッグの量は、哺乳動物において所望される治療結果を有効に達成する量である。当然ながら、多様なプロドラッグ化合物の用量は、親化合物、インビボでの加水分解の速度、ポリマーの分子量などに依存して、いくらか変動する。
【０１９１】
本発明のさらなる態様では、ポリヌクレオチド（オリゴヌクレオチド）、好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドを哺乳動物細胞に投与する方法が提供される。方法は、本明細書に記載のように調製される有効量の複合体を、治療される症状に送達することを含み、そのような症状に有効なポリヌクレオチドに依存する。例えば、複合体化されていないオリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスＢＣＬ２オリゴヌクレオチド、アンチセンススルビビンオリゴヌクレオチド）が所定の癌または新生物細胞に対して有効性を有する場合、方法は、オリゴヌクレオチドを含有するポリマー複合体を、生来のオリゴヌクレオチドに感受性を有する細胞に送達することを含む。送達は、適切な医薬組成物の部分としてインビボで、またはエクスビボ環境で細胞に直接行うことができる。１つの特定の治療では、オリゴヌクレオチド（配列番号３、配列番号４および５、ならびに配列番号６、および配列番号７）を含むポリマー複合体を使用することができる。
【実施例】
【０１９２】
以下の実施例は、本発明のさらなる理解を提供するために役立つが、決して、本発明の範囲を限定することを意味しない。実施例において説明する太字の番号は、図１〜１２に示す番号に対応する。実施例を通して、ＤＣＭ（ジクロロメタン）、ＤＩＥＡ（ジイソプロピルエチルアミン）、ＤＭＡＰ（４−ジメチルアミノピリジン）、ＤＭＦ（Ｎ，Ｎ'−ジメチルホルムアミド）、ＤＳＣ（ジスクシンイミジルカーボネート）、ＥＤＣ（１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド）、ＩＰＡ（イソプロパノール）、ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）、ＳＣＡ−ＳＨ（一本鎖抗体）、ＳＮ３８（７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトテシン）、ＴＢＤＰＳ（ｔｅｒｔ−ブチル−ジプロピルシリル）、ＴＥＡ（トリエチルアミン）のような略称を使用する。
【０１９３】
一般的手順。すべての反応は、乾燥窒素またはアルゴンの雰囲気下で稼動する。市販の試薬を、さらなる精製を伴わずに使用する。すべてのＰＥＧ化合物を、使用前に、減圧下またはトルエンからの共沸蒸留によって乾燥する。他で特定しない限り、バリアン・マーキュリー（Varian Mercury）３００ＮＭＲ分光計および溶媒として重クロロホルムを使用して、３００ＭＨｚで^１Ｈ ＮＭＲスペクトルおよび７５．４６ＭＨｚで¹³Ｃ ＮＭＲスペクトルを得た。化学シフト（δ）は、テトラメチルシラン（ＴＭＳ）からのダウンフィールドで、百万分率（ｐｐｍ）で報告する。
【０１９４】
ＨＰＬＣ方法。反応混合物ならびに中間体および最終生成物の純度を、ベックマン・コールター・システム・ゴールド（Beckman Coulter System Gold）（登録商標）ＨＰＬＣ機器によってモニターする。それは、０．０５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中アセトニトリルの１０〜９０％の勾配を１ｍＬ／分の流速で使用する、１６８ダイオード・アレイ（Diode Array）ＵＶ検出器を伴う、ＺＯＲＢＡＸ（登録商標）３００ＳＢ Ｃ８逆相カラム（１５０×４．６ｍｍ）またはフェノメックス・ジュピター（Phenomenex Jupiter）（登録商標）３００Ａ Ｃ１８逆相カラム（１５０×４．６ｍｍ）を用いる。
【０１９５】
実施例１．化合物３：
ＰＢＳ緩衝液（５ｍＬ、ｐＨ７．８）中化合物２（１０ｍｇ、１．７μｍｏｌ）の溶液に、ＮＯＦ ｃｏｒｐ．製Ｍａｌ−ＰＥＧ５ｋ−ＮＨＳ（１００ｍｇ、１７μｍｏｌ）を添加し、室温で２時間、撹拌した。反応混合物を、水で２０ｍＬに希釈し、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．０（緩衝液Ａ）で予め平衡化したポロス（Poros）ＨＱ、強力な陰イオン交換カラム（１０ｍｍ×１．５ｍｍ、ベットボリューム、約１６ｍＬ）上に充填した。カラムを３〜４カラム容積の緩衝液Ａで洗浄して、過剰なＰＥＧリンカーを取り出した。次いで、生成物を、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．０、緩衝液Ｂ中０〜１００％１Ｍ ＮａＣｌの勾配で１０分間、続いて、１００％緩衝液Ｂ、１０分間、１０ｍＬ／分の流速で溶出させた。溶出した生成物を、ＨｉＰｒｅｐ脱塩カラム（５０ｍＬ）を使用して脱塩し、凍結乾燥して、化合物３を得た。収量６ｍｇ（オリゴ当量、６０％）。
【０１９６】
実施例２．化合物４：
ＰＢＳ緩衝液（６ｍＬ、ｐＨ７．０）中化合物３の溶液に、ペプチドＣ−Ｔａｔ（５ｍｇ、３μｍｏｌ）を添加し、室温で２時間、撹拌した。反応混合物を、水で２０ｍＬに希釈し、１００ｍＭ Ｋ₂ＨＰＯ₄、５Ｍ尿素緩衝液、ｐＨ６．５（緩衝液Ａ）で予め平衡化したリソース（Resource）Ｓ、強力な陽イオン交換カラム（１０ｍｍ×１．５ｍｍ、ベットボリューム、約１６ｍＬ）上に充填した。カラムを３〜４カラム容積の緩衝液Ａで洗浄して、非反応のＰＥＧ−オリゴ化合物を取り出した。次いで、生成物を、０〜１００％２Ｍ ＫＢｒ（緩衝液Ｂ）の勾配で、１０分間、続いて、１００％緩衝液Ｂで１０分間、１０ｍＬ／分の流速で溶出させた。溶出した生成物を、ＨｉＰｒｅｐ脱塩カラム（５０ｍＬ）を使用して脱塩し、凍結乾燥して、化合物４を得た。収量２ｍｇ（オリゴ当量、３０％）。
【０１９７】
実施例３．化合物５：
ＰＢＳ緩衝液（６ｍＬ、ｐＨ７．０）中化合物３の溶液に、ペプチドＣ−ｄｉＴａｔ（１０ｍｇ、３μｍｏｌ）を添加し、室温で２時間、撹拌した。反応混合物を、水で２０ｍＬに希釈し、１００ｍＭ Ｋ₂ＨＰＯ₄、５Ｍ尿素緩衝液、ｐＨ６．５（緩衝液Ａ）で予め平衡化したリソース（Resource）Ｓ、強力な陽イオン交換カラム（１０ｍｍ×１．５ｍｍ、ベットボリューム、約１６ｍＬ）上に充填した。カラムを３〜４カラム容積の緩衝液Ａで洗浄して、非反応のＰＥＧ−オリゴ化合物を取り出した。次いで、生成物を、０〜１００％２Ｍ ＫＢｒ（緩衝液Ｂ）の勾配で、１０分間、続いて、１００％緩衝液Ｂで１０分間、１０ｍＬ／分の流速で溶出させた。溶出した生成物を、ＨｉＰｒｅｐ脱塩カラム（５０ｍＬ）を使用して脱塩し、凍結乾燥して、化合物５を得た。収量２ｍｇ（オリゴ当量、３０％）。
【０１９８】
実施例４．化合物６：
ブチルリチウム（１．６Ｍ、２００ｍＬ）を、ＴＨＦ（５００ｍＬ）中イソ酪酸エチル（３５ｇ）の溶液に、−７８℃に添加し、溶液を１時間、同じ温度で撹拌した。１，５−ジブロモペンタン（１００ｇ）を添加し、混合物を室温まで加温した。混合物を室温で１時間撹拌し、重炭酸ナトリウム水溶液（５００ｍＬ）に注いだ。有機層をエバポレートした。残渣をシリカゲルカラムによって精製し、ヘキサン中１０％酢酸エチルで溶出させて、液体の化合物６（２９．２ｇ、収量３６．７％）を得た。
【０１９９】
実施例５．化合物７：
エチル７−ブロモ−２，２−ジメチルヘプタノエート（化合物６、２６．５ｇ）を、ＤＭＦ（５００ｍＬ）中アジ化ナトリウム（１３ｇ）と共に１００℃で２時間、加熱した。混合物を濃縮し、残渣をシリカゲルカラムによって精製し、ヘキサン中１０％酢酸エチルで溶出させて、液体の化合物７（２０．５ｇ、収量９０．３％）を得た。
【０２００】
実施例６．化合物８：
エチル７−アジド−２，２−ジメチルヘプタノエート（化合物７、２０．５ｇ）を、エタノール（５００ｍＬ）中水酸化ナトリウム（１０ｇ、８５％）と共に還流下で２時間、加熱した。混合物を濃縮し、水（４００ｍＬ）を添加した。混合物を濃塩酸でｐＨ２まで酸性にし、酢酸エチル（５００ｍＬ）で抽出した。有機層を濃縮し、残渣をシリカゲルカラムによって精製し、ヘキサン中５０％酢酸エチルで溶出させて、液体の化合物８（１７．１ｇ、収量９５％）を得た。
【０２０１】
実施例７．化合物９：
７−アジド−２，２−ジメチルヘプタン酸（化合物８、８ｇ）をジクロロメタン（２００ｍＬ）に溶解した。塩化オキサリル（６．４ｇ）を添加し、混合物を２時間、還流し、エバポレートした。残渣をジクロロメタン（１００ｍＬ）に溶解し、ピリジン（１００ｍＬ）中３'−アセチルチミジン（５．８５ｇ）に溶解した。溶液を室温で２４時間撹拌し、重炭酸ナトリウム水溶液（５００ｍＬ）に注いだ。混合物をジクロロメタン（５００ｍＬ）で抽出し、有機層を濃縮した。残渣をシリカゲルカラムによって精製し、ジクロロメタン中５％メタノールで溶出させて、無色固体の化合物９（５．６ｇ、収量６１％）を得た。
【０２０２】
実施例８．化合物１０：
５'−（７−アジド−２，２−ジメチルヘプタノイル）−３'−アセチルチミジン（化合物９、４．６５ｇ）を、メタノール（２００ｍＬ）中、３０ｐｓｉ下、Ｐｄ／Ｃ（１０％、０．５ｇ）の存在下、１時間で水素化した。混合物をろ過し、ろ過物をエバポレートして、固体の化合物１０（４．４ｇ、収量１００％）を得た。
【０２０３】
実施例９．化合物１１：
５'−（７−アミノ−２，２−ジメチルヘプタノイル）３'−アセチルチミジン（化合物１０、４．４ｇ）、トリエチルアミン（４ｍＬ）および４−メトキシトリチルクロリド（７．５ｇ）を、ピリジン（１００ｍＬ）中で１０時間、撹拌した。メチルアミン（４０％、１０ｍＬ）を添加し、溶液を２時間、撹拌した。混合物を重炭酸ナトリウム水溶液（５００ｍＬ）に注ぎ、ジクロロメタン（５００ｍｌ）で抽出した。有機層を濃縮した。残渣をシリカゲルカラムによって精製し、ジクロロメタン中５％メタノールで溶出させて、無色固体の化合物１１（４．９ｇ、収量７１％）を得た。
【０２０４】
実施例１０．化合物１２：
アセトニトリル（５０ｍＬ）中５'−（７−［（ＭＭＴ−アミノ）−２，２−ジメチルヘプタノイル］チミジン（化合物１１、４．９ｇ）、Ｎ，Ｎ−テトライソプロピル−シアノエチルホスホルアミダイト（３ｇ）およびテトラゾール（０．５ｇ）を、１晩、撹拌した。混合物を重炭酸ナトリウム水溶液（５００ｍｌ）に注ぎ、ジクロロメタン（５００ｍＬ）で抽出した。有機層を濃縮した。残渣をシリカゲルカラムによって精製し、ヘキサン中５０％酢酸エチルで溶出させて、無色固体の化合物１２（４．５ｇ、収量７１％）を得た。
【０２０５】
実施例１１．化合物１４：
化合物１２をトリリンクバイオテクノロジーズ（Ｔｒｉｌｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、カリフォルニア州に移し、オリゴ合成における最後のモノマーとして使用した。合成後、Ｍｍｔ基を脱保護し、ＲＰ−ＨＰＬＣによってオリゴを精製し、ＰＥＧコンジュゲーションのために、遊離アミンとして化合物１４を得た。
【０２０６】
実施例１２．化合物１５：
ＰＢＳ緩衝液（５ｍＬ、ｐＨ７．８）中化合物１４（１０ｍｇ、１．７μｍｏｌ）の溶液に、ｍ３０ｋＳＣＰＥＧ（５２０ｍｇ、１７μｍｏｌ）を添加し、室温で５時間、撹拌した。反応混合物を、水で５０ｍＬに希釈し、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．４（緩衝液Ａ）で予め平衡化したポロス（Poros）ＨＱ、強力な陰イオン交換カラム（１０ｍｍ×１．５ｍｍ、ベットボリューム、約１６ｍＬ）上に充填した。カラムを３〜４カラム容積の緩衝液Ａで洗浄して、過剰なＰＥＧリンカーを取り出した。次いで、生成物を、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．４、緩衝液Ｂ中０〜１００％１Ｍ ＮａＣｌの勾配で１０分間、続いて、１００％緩衝液Ｂ、１０分間、１０ｍＬ／分の流速で溶出させた。溶出した生成物を、ＨｉＰｒｅｐ脱塩カラム（５０ｍＬ）を使用して脱塩し、凍結乾燥して、化合物１５を得た。収量６ｍｇ（オリゴ当量、６０％）。
【０２０７】
実施例１３．化合物１６：
ＰＢＳ緩衝液（５ｍＬ、ｐＨ７．８）中化合物１４（１０ｍｇ、１．７μｍｏｌ）の溶液に、ｍ３０ＰＥＧ−ＲＮＬ８ａ−ＮＨＳ（５２０ｍｇ、１７μｍｏｌ）を添加し、室温で５時間、撹拌した。反応混合物を、水で５０ｍＬに希釈し、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．４（緩衝液Ａ）で予め平衡化したポロス（Poros）ＨＱ、強力な陰イオン交換カラム（１０ｍｍ×１．５ｍｍ、ベットボリューム、約１６ｍＬ）上に充填した。カラムを３〜４カラム容積の緩衝液Ａで洗浄して、過剰なＰＥＧリンカーを取り出した。次いで、生成物を、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．４、緩衝液Ｂ中０〜１００％１Ｍ ＮａＣｌの勾配で１０分間、続いて、１００％緩衝液Ｂ、１０分間、１０ｍＬ／分の流速で溶出させた。溶出した生成物を、ＨｉＰｒｅｐ脱塩カラム（５０ｍＬ）を使用して脱塩し、凍結乾燥して、固体とした。収量５ｍｇ（オリゴ当量、５０％）。
【０２０８】
実施例１４．化合物１７：
Ｂｏｃ−ｅｘｔ−アミン（１．７ｇ、６．４ｍｍｏｌ、１当量）を４ｍＬのＤＭＦに溶解した。この溶液を、１５ｍＬのＮａＨＣＯ₃飽和水溶液に添加し、次いで、０℃まで冷却した。次いで、マレイミド（１ｇ、６．４ｍｍｏｌ、１当量）を添加し、反応混合物を１５分間撹拌し、続いて、３０ｍＬの水を添加した。反応を継続して、２０分間、０℃で撹拌した。Ｈ₂ＳＯ₄の添加によってｐＨを３．５に調整し、続いて、ジクロロメタンで３回抽出を行った。合わせた有機層を０．１Ｎ ＨＣｌで１回洗浄し、次いで、塩水で１回洗浄し、乾燥し、減圧下でエバポレートした。粗生成物を、酢酸エチル／ヘキサン、（８：２，ｖ／ｖ）を伴うカラムクロマトグラフィーによって精製した：¹³Ｃ ＮＭＲ：δ ２８．２８，３６．８６，４０．１９，６７．５８，６９．６７，７０．００，７８．８６，１３３．８９，１５５．６３，１７０．３１。
【０２０９】
実施例１５．化合物１８：
５ｍＬ無水ＤＣＭ中Ｂｏｃ−ｅｘｔ−マレイミド（０．１ｇ）の溶液に、室温でＴＦＡ（２．５ｍＬ）を添加した。反応をＴＬＣによってモニターし、１．５時間後に完了したことが決定された。溶媒を減圧下でエバポレートして、化合物１８を得た：¹³Ｃ ＮＭＲ：δ ３７．２６，３９．９８，６６．１２，６８．３６，６９．７７，６９．８３，１３４．１１，１６０．４４，１７１．０１。
【０２１０】
実施例１６．化合物１９：
５０ｍＬの無水ＤＣＭ中Ｂｓｍｏｃ−Ｇｌｙ（０．５ｇ、１．７ｍｍｏｌ、１当量）および３，５−ジメチル−４−ヒドロキシ−ベンジル−ＯＴＢＳ（０．４４８ｇ、１．７ｍｏｌ、１当量）の溶液に、ＤＭＡＰ（０．０４２ｇ、０．３４ｍｏｌ、５当量）を添加した。次いで、混合物を０℃まで冷却し、次いで、ＥＤＣ（０．４０８ｇ、０．００２１２５ｍｍｏｌ、０．８当量）を添加した。得られた濁った溶液を室温にまで加温し、１晩撹拌した。澄明な反応溶液を０．１Ｎ ＨＣｌおよび水で洗浄した。合わせた有機層をＭｇＳＯ₄上で乾燥し、ろ過し、減圧下でエバポレートして、化合物１９を得た：¹³Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃−ＣＤ₃ＯＤ，１：１，ｖ／ｖ）δ４２．１０，５６．４９，１２０．９３，１２５．２１，１２９．６６，１３０．００，１３０．１８，１３３．６０，１３６．３７，１３８．６３，１５５．７４，１７１．３１。
【０２１１】
実施例１７．化合物２０：
５ｍＬの無水ＤＣＭ中化合物１９（０．０８９ｇ、０．１６３ｍｍｏｌ、１．２当量）の溶液に、４−ピペリジノ−ピペリジン（０．０２４７ｇ、０．１４７ｍｍｏｌ、０．９当量）を室温で添加した。反応をＴＬＣによってモニターし、４時間後、^20k８アーム−ＳＣＰＥＧ（２．７２ｇ、０．１３６ｍｍｏｌ）を添加して、完了した。反応物を室温で１晩、撹拌した。溶媒を減圧下で部分的にエバポレートし、得られた残渣をエーテルから沈殿させ、続いて、ＤＭＦ／ＩＰＡからの固体の再結晶化により、化合物２０を得た：¹³Ｃ ＮＭＲ：δ −５．５３，１６．０２，１８．０５，２５．０４，２５．６２，４２．０１，６３．８７，６３．９５，６７．３１−７２．８５（ＰＥＧ），１２５．６６，１２９．１４，１３８．３６，１４６．０２，１５１．００，１５５．９６，１６７．６５，１６８．１１２。
【０２１２】
実施例１８．化合物２１：
化合物２０（１．０７ｇ、０．０５ｍｍｏｌ、１当量）およびアミノ−３，６−ジオキサオクタン酸マレイミド（amino-3,6-dioxaoctanoic maleimide）（０．６０ｇ、１．７５ｍｍｏｌ、３５当量）を２０ｍＬのＤＣＭに溶解し、続いて、氷浴中で冷却した。ＤＩＰＥＡ（０．６０９ｍＬ、５．５ｍｍｏｌ、７０当量）を、７〜８のｐＨに到達するまで、添加した。反応を室温で６．５時間稼動させ、続いて、溶媒を減圧下で部分的に取り出した。次いで、固体をエーテルによって沈殿させ、フラスコを、冷蔵庫に１晩、貯蔵した。次いで、固体をろ過し、ＤＭＦ／ＩＰＡから再結晶化して、化合物２１を得た：¹³Ｃ ＮＭＲ：δ −５．３０，１６．２８，１８．３２，２５．８６，３６．９０，４０．６７，４２．３０，６３．７２，６４．２７，６７．６４，６９．２３−７１．２８（ＰＥＧ），１２５．９８，１２９．３９，１３３．９２，１３８．７６，１４６．２４，１５６．０８，１６７．７９，１７０．３４。
【０２１３】
実施例１９．化合物２２：
化合物２１（０．９５ｇ）を４ｍＬのＣＨ₃ＣＮおよび２ｍＬの水に溶解し、続いて、１０ｍＬの酢酸を添加した。混合物を１晩、室温で撹拌し、続いて、減圧下で溶媒を取り出した。エーテルで固体を沈殿させ、次いで、ＤＭＦ／ＩＰＡから再結晶化して、アルコールを得た：¹³Ｃ ＮＭＲ：δ １５．９３，３６．５８，４０．３５，４１．９８，６３．３７，６３．６０，６７．３１，６８．２１−７０．８８（ＰＥＧ），１２６．４６，１２９．３１，１３３．６９，１３８．６７，１４６．２７，１５５．７９，１６７．５８，１７０．０５。脱保護したベンジルアルコール（１ｇ、０．０５ｍｍｏｌ、１当量）を２ｍＬのＤＭＦおよび２０ｍＬのＤＣＭに溶解し、続いて、溶液を０℃まで冷却した。ＤＳＣ（０．１０２４ｇ、０．４ｍｍｏｌ、８当量）およびピリジン（０．０２９ｍｌ、０．３６ｍｍｏｌ、７．２当量）を添加した。反応混合物をゆっくりと加温して、１晩で室温にした。溶媒を減圧下で部分的に取り出し、続いて、エーテルで固体を沈殿させた。次いで、粗生成物をＤＭＦ／ＩＰＡから再結晶化した：¹³Ｃ ＮＭＲ：δ １６．１３，２５．２４，３６．７９，４０．５６，４２．２１，６３．６１，６４．１６，６７．５４，６９．５２−７１．２９（ＰＥＧ），１２６．７６，１２８．５６，１３０．４２，１３３．８６，１４８．０１，１５５．９９，１６７．５６，１６８．２０，１７０．２６。
【０２１４】
実施例２０．化合物２３ａ−Ｉ−Ｒ１（ｎ＝８、オリゴＩ＝ｓｉＲＮＡ、Ｒ１＝−Ｃ−ＴＡＴ）：
化合物２２ａ（７３７ｍｇ、０．０３６９ｍｍｏｌ）を、３０ｍＬのｐＨ７．４ １０×ＰＢＳ緩衝液中ｓｉＲＮＡ（５０ｍｇ、０．００３６８ｍｍｏｌ）と反応させた。反応を室温で４時間、稼動させた。粗材料を、移動相Ａ：２０ｍｍｏｌ Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．０およびＢ：２０ｍｍｏｌ Ｔｒｉｓ，２Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０を伴うポロス（Poros）上で精製し、次いで、ｐＨ７．０リン酸緩衝液で脱塩した。収量１６．６ｍｇ（オリゴ当量）。次いで、この材料の１５ｍｇ（オリゴ当量）を、７ｍＬのｐＨ７．０リン酸緩衝液に溶解した。ＳＨ−ＴＡＴ（６４ｍｇ、０．０３９ｍｍｏｌ）を窒素下で添加した。反応を１．５時間、稼動させ、続いて、ソース(Source)１５Ｓ樹脂上で精製した。カラムを、緩衝液Ａ（５Ｍ尿素、１００ｍＭ ＫＨ₂ＰＯ₄、２５％ＣＨ₃ＣＮ、ｐＨ６．５）で平衡化した。生成物を緩衝液Ｂ（２Ｍ ＫＢｒ）で溶出させた。回収した生成物を、水を伴うＨｉＰｒｅｐ脱塩カラム上で脱塩し、凍結乾燥した。収量２．４ｍｇ（オリゴ当量）。
【０２１５】
実施例２０Ａ．化合物２３ａ−ＩＩ−Ｒ１（ｎ＝８、オリゴＩＩ＝ＦＩＴＣ−ジェナセンス、Ｒ１＝−Ｃ−ＴＡＴ）：
化合物２２ａをＦＩＴＣ−ジェナセンスと反応させ、続いて、実施例２０に記載の同じ反応条件でＨＳ−Ｃ−ＴＡＴと反応させて、生成物を得た。
【０２１６】
実施例２０Ｂ．化合物２３ａ−ＩＩ−Ｒ２（ｎ＝８、オリゴＩＩ＝ＦＩＴＣ−ジェナセンス、Ｒ１＝−Ｃ−Ａｒｇ₉）：
化合物２２ａをＦＩＴＣ−ジェナセンスと反応させ、続いて、実施例２０に記載の同じ反応条件でＨＳ−Ｃ−Ａｒｇ₉と反応させて、生成物を得た。
【０２１７】
実施例２１．化合物２４．
８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸トリフルオロ酢酸塩（０．５０ｇ、０．１８ｍｍｏｌ）を、１２ｍＬのアセトニトリル／水（１／１）に溶解した。この溶液のｐＨは約４であった。ＴＥＡを添加して、ｐＨを８〜９の間に調整した。ｐＨを８〜９の間で保持した。Ｂｓｍｏｃ−ＯＳｕ（０．６１ｇ、０．１８ｍｍｏｌ）の添加後、ｐＨを６に降下させた。さらに、ＴＥＡｅを添加して、ｐＨを８〜９に戻した。反応混合物を室温で４５分間、撹拌し、反応終了時にｐＨを８〜９の間に保持した。反応混合物を水（５ｍＬ）で希釈し、ＤＣＭで抽出して、任意の残留している出発物質を取り出した。水性の層を０．１Ｎ ＨＣｌで酸性化し、酢酸エチルで抽出した。有機層を分離し、塩水で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、減圧下でエバポレートして、淡黄色オイルの化合物２４（０．４５ｇ、６５％収量）を得た：¹³Ｃ ＮＭＲ：δ １７３．３，１５６．１，１３９．５，１３７．２，１３４．１，１３０．８，１３０．７，１３４．１，１３０．８，１３０．４，１３０．３，１２５．８，１２１．７，７１．４，７０．４，７０．３，６８．８，５７．１，４１．３，２５．８。
【０２１８】
実施例２２．化合物２５：
４０ｍＬの無水ＤＣＭ（４０ｍＬ）中化合物２４（０．４１ｇ、０．１０７ｍｍｏｌ）および３，５−ジメチル−４−ヒドロキシ−ベンジル−ＯＴＢＳ（０．２８３ｇ、０．１０７ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＭＡＰ（２６ｍｇ、０．０２１ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を０℃まで冷却し、次いで、ＥＤＣ（０．２４５ｇ、０．１２８ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を室温まで加温し、２０時間、撹拌した。混合物を水で希釈し、ＤＣＭで抽出し、硫酸ナトリウム上で乾燥した。溶媒を減圧下でエバポレートして、０．６５ｇの粗生成物を得た。酢酸エチル／ヘキサン（１：１、ｖ／ｖ）で溶出させるシリカゲルカラム上での精製により、化合物２５（０．５９ｇ、８８％収量）を得た：¹³Ｃ ＮＭＲ：δ １６８．２，１５５．４，１４６．２，１３９．５，１３８．９，１３６．９，１２９．４，１２６．２，１２５．２，１２１．３，７０．２，６９．９，６８．１，６４．４，５６．４，４１．１，２６．１，２５．９，１８．５，１６．６，１６．５。
【０２１９】
実施例２３．化合物２６：
２００ｍＬの無水ＤＣＭ中化合物２５（３６３ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ、１．２当量）の溶液に、４−ピペリジノ−ピペリジン（９０．９ｍｇ、０．５４ｍｍｏｌ、０．９当量）を室温で添加した。反応をＴＬＣによってモニターし、４時間後、^20k８アーム−ＳＣＰＥＧ（１０ｇ、０．５ｍｍｏｌ、１当量）を添加して、完了した。反応物を室温で１晩、撹拌した。溶媒を減圧下で部分的にエバポレートし、得られた残渣をエーテルから沈殿させ、続いて、ＤＭＦ／ＩＰＡからの固体の再結晶化により、化合物２６（９．１ｇ）を得た：¹³Ｃ ＮＭＲ（７５．４ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）：δ−５．３５，１６．２８，１８．２６，２５．２５，２５．８０，４０．５６，６１．４０，６３．６６，６４．１６，（６８．０５−７３．６４，ＰＥＧ），１２５．９２，１２９．２６，１３８．６４，１４５．９９，１５１．２１，１５６．０１，１６７．８８，１６８．２０。
【０２２０】
実施例２４．化合物２７：
ＤＩＥＡアミン（５．６ｍＬ、３２．２ｍｍｏｌ、７０当量）を、２００ｍＬの無水ＤＣＭ中化合物２６（９．２ｇ、０．４６ｍｍｏｌ、１当量）およびアミノ−３，６−ジオキサオクタン酸マレイミド（５．５ｇ、１６．１ｍｍｏｌ、３５当量）に、７〜８のｐＨに到達するまで、０℃で添加した。反応を室温で５時間稼動させ、続いて、溶媒を減圧下で部分的に取り出した。次いで、残渣をエチルエーテルの添加によって沈殿させ、フラスコを、冷蔵庫に１晩、貯蔵した。固体をろ過し、ＤＭＦ／ＩＰＡから再結晶化して、化合物２７（７ｇ）を得た：¹³Ｃ ＮＭＲ：δ −５．６９，１５．９０，１７．８７，２５．４５，３６．４４，４０．２０，４２．３０，６３．１９，６４．３６，６７．１４，６８．０５−７２．６８（ＰＥＧ），１２５．５１，１２８．８８，１３３．５７，１３８．１９，１４５．６４，１５５．６４，１６７．４５，１６９．９０。
【０２２１】
実施例２５．化合物２８：
化合物２７（７ｇ）を５０ｍＬのアセトニトリルおよび１１ｍＬの水に溶解し、続いて、２２ｍＬの酢酸を添加した。溶液を１晩、室温で撹拌し、続いて、減圧下で溶媒を取り出した。残渣をエーテルで沈殿させ、次いで、ＤＭＦ／ＩＰＡから再結晶化した：¹³Ｃ ＮＭＲ：δ １５．９７，３６．５８，４０．３３，６３．３５，６３．６０，６７．２９，６９．０８−７１．０６（ＰＥＧ），１２６．５０，１２９．２０，１３３．６８，１３８．７３，１４６．２７，１５５．７６，１６７．５５，１７０．０３。脱保護した化合物（７ｇ、０．３５ｍｍｏｌ、１当量）を１４ｍＬのＤＭＦおよび１４０ｍＬのジクロロメタンに溶解し、続いて、溶液を０℃まで冷却した。ＤＳＣ（７１７ｍｇ、２．８ｍｍｏｌ、８当量）およびピリジン（０．２０４ｍｍｏｌ、２．５２ｍｍｏｌ、７．２当量）を添加した。反応混合物をゆっくりと加温して、１晩で室温にした。溶媒を減圧下で部分的に取り出し、続いて、エチルエーテルで固体を沈殿させた。粗生成物をＤＭＦ／ＩＰＡから再結晶化した：¹³Ｃ ＮＭＲ：δ １６．１３，２２．４０，２５．１８，３６．７３，４０．５０，４２．３２，６３．５４，６７．４７，６９．２４−７１．２０（ＰＥＧ），１２６．７０，１２８．５３，１３０．２７，１３３．８１，１４８．０１，１５５．９３，１６７．５５，１６８．１７，１７０．２０。
【０２２２】
実施例２６．化合物２９：
化合物２８（１．５ｇ、０．０７５ｍｍｏｌ）を、８ｍＬのｐＨ７．８リン酸緩衝液中ＨＩＦ１−α（２０ｍｇ、０．００３６ｍｍｏｌ）と反応させた。反応を室温で２時間、稼動させた。粗材料を、ソース（Source）１５Ｑ樹脂上で精製した。カラムを、緩衝液Ａ（５Ｍ尿素、１００ｍＭ ＫＨ₂ＰＯ₄、２５％ＣＨ₃ＣＮ、ｐＨ６．５）で平衡化する。生成物を緩衝液Ｂ（２Ｍ ＫＢｒ）で溶出させる。回収した生成物を、水を伴うＨｉＰｒｅｐ脱塩カラム上で脱塩し、凍結乾燥した。生成物の収量１７．７ｍｇ（オリゴ当量）。この生成物の８．８５ｍｇ（オリゴ当量）を、５ｍＬのＰＨ７．０リン酸緩衝液中９３ｍｇのＨＳ−ＴＡＴと反応させた。生成物を、ソース（Source）１５Ｓ樹脂上で精製し、脱塩した。収量１．７ｍｇ（オリゴ当量）。
【０２２３】
実施例２７．化合物３０：
ジオキサン（７０ｍＬ）中４Ｎ ＨＣｌの溶液を、ＢｏｃＣｙｓ（Ｎｐｙｓ）−ＯＨ（１、５ｇ、１３．３２ｍｍｏｌ）に添加した。懸濁液を室温で３時間撹拌し、次いで、７００ｍＬのエチルエーテルに注いだ。終了時まで減圧を適用することなく、粗フリット漏斗を介して、固体をろ過した。ケーキをエチルエーテルで洗浄（３×５０ｍＬ）し、次いで、減圧下、室温で１晩、乾燥した。¹Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ₃ＯＤ）δ ８．９３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１．５，４．７Ｈｚ），８．６６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１．５，８．２０Ｈｚ），７．５９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４．７，８．２Ｈｚ），４．２４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４．１，９．４Ｈｚ），３．５８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４．１，１４．９Ｈｚ），３．３６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．４，１５．２Ｈｚ）。¹³Ｃ ＮＭＲ （７５．４ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）：δ １６９．４０，１５６．２７，１５４．６４，１４４．１３，１３５．２４６，１２３．１０，５２．７７，３９．２７。
【０２２４】
実施例２８．化合物３１ａ：
ＤＭＦ／ＤＣＭ（２５ｍＬ／４５ｍＬ）中化合物３０（１．８２ｇ、５．５５ｍｍｏｌ）の溶液に、^20k８アーム−ＰＥＧ−ＳＣ（７．３０ｇ、０．３５ｍｍｏｌ）を添加した。次いで、ＤＩＥＡを添加（３ｍＬ、１６．８ｍｍｏｌ）し、得られた懸濁液を、室温で５時間、撹拌した。反応混合物を減圧下でエバポレートし、次いで、ＤＣＭ／Ｅｔ₂Ｏにより０℃で沈殿させた。固体をろ過し、次いで、８０ｍＬのＤＣＭに溶解した。２０ｍＬの０．１Ｎ ＨＣｌの添加後、混合物を５分間、撹拌し、次いで、分液漏斗に移し、有機層を分別し、再度、０．１Ｎ ＨＣｌ（２０ｍＬ）および塩水（２０ｍＬ）で洗浄した。有機層をＭｇＳＯ₄上で乾燥し、ろ過し、減圧下でエバポレートした。残渣を、ＤＣＭ／Ｅｔ₂Ｏにより０℃で沈殿させた。固体をろ過し、減圧オーブンにおいて、３０℃で少なくとも２時間、乾燥した：¹³Ｃ ＮＭＲ：δ １７０．９０，１５６．６６，１５５．６８，１５３．８６，１４２．４１，１３３．８５，１２１．２４，７２．９６−６９．３０，６４．０８，５３．０１，４１．８２。
【０２２５】
実施例２９．化合物３１ｂ：
ＤＭＦ／ＤＣＭ（２０ｍＬ／４０ｍＬ）中化合物３０（７６５ｍｇ、２．３３ｍｍｏｌ）の溶液に、^20k４アーム−ＰＥＧ−ＳＣ（６．０ｇ、０．２９ｍｍｏｌ）を添加した。次いで、ＤＩＥＡを添加（１．２ｍＬ、６．９６ｍｍｏｌ）し、得られた懸濁液を、室温で５時間、撹拌した。反応混合物を減圧下でエバポレートし、次いで、ＤＣＭ／Ｅｔ₂Ｏにより沈殿させた。固体をろ過し、次いで、６０ｍＬのＤＣＭに溶解した。１５ｍＬの０．１Ｎ ＨＣｌの添加後、混合物を５分間、撹拌し、次いで、分液漏斗に移し、有機層を分別し、再度、０．１Ｎ ＨＣｌ（１５ｍＬ）および塩水（１５ｍＬ）で洗浄した。有機層をＭｇＳＯ₄上で乾燥し、ろ過し、減圧下でエバポレートした。残渣を、ＤＣＭ／Ｅｔ₂Ｏにより沈殿させた。固体をろ過し、減圧オーブンにおいて、３０℃で少なくとも２時間、乾燥した：¹³Ｃ ＮＭＲ：δ １７０．７６，１５６．５３，１５５．５７，１５３．８５，１４２．３７，１３３．７９，１２１．２３，７２．４４−６９．３０，６３．９９，５２．９５，４５．３６，４１．８２。
【０２２６】
実施例３０．化合物３２ａ−Ｉ（ｎ＝４、オリゴＩ＝ＬＮＡスルビビン）：
６０ｍＬのｐＨ６．５リン酸緩衝液中Ｃ₆−チオ−ＬＮＡ−スルビビン（１２０ｍｇ、０．０２１ｍｍｏｌ）の溶液に化合物３１ａ（２．３ｍｇ、０．１０７ｍｍｏｌ）を添加し、溶液を１時間、室温で撹拌した。反応の進行を、陰イオン交換ＨＰＬＣによって確認した。反応混合物を、０．２μｍのフィルターを介してろ過し、ポロス（Poros）陰イオン交換カラムに充填した。生成物を、ｐＨ７．０で緩衝系２０ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ ２Ｍ ＮａＣｌを使用する勾配で溶出させた。脱塩後の収量は８０ｍｇ（オリゴ当量）であった。
【０２２７】
実施例３０Ａ：化合物３２ｂ−Ｉ（ｎ＝４、オリゴＩ＝ＬＮＡスルビビン）：
１５０ｍＬのｐＨ６．５リン酸緩衝液中Ｃ₆−チオ−ＬＮＡ−スルビビン（３００ｍｇ、０．０５４ｍｍｏｌ）の溶液に化合物３１ｂ（４．８ｇ、０．２７３ｍｍｏｌ）を添加し、溶液を１時間、室温で撹拌した。反応の進行を、陰イオン交換ＨＰＬＣによって確認した。反応混合物を、０．２μｍのフィルターを介してろ過し、ポロス（Poros）陰イオン交換カラムに充填した。生成物を、ｐＨ７．０で緩衝系２０ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ ２Ｍ ＮａＣｌを使用する勾配で溶出させた。脱塩後の収量は２２５ｍｇ（オリゴ当量）であった。
【０２２８】
実施例３１．化合物３３ａ−Ｉ−Ｒ１（ｎ＝８、オリゴＩ＝ＬＮＡスルビビン、Ｒ＝Ｒ１＝−Ｃ−ＴＡＴ）：
化合物３２ａ（８０ｍｇオリゴ当量、０．０１４２ｍｍｏｌ）を、２０ｍｌの緩衝液（５Ｍ尿素、１００ｍＭ ＫＨ₂ＰＯ₄）に溶解した。溶液を０℃、窒素下で冷却し、次いで、ペプチドＣ−ＴＡＴ（３２９ｍｇ、０．１９８ｍｍｏｌ）を添加した。濃い黄色が観察された。継続して、反応物を１．５時間、窒素雰囲気下、０℃で撹拌し、次いで、ソース（Source）１５Ｓ樹脂を使用する陽イオン交換クロマトグラフィーによって精製した。カラム（１０ｍｍ×１０ｍｍ）を、３カラム容積の緩衝液Ａ（５Ｍ尿素、１００ｍＭ ＫＨ₂ＰＯ₄、２５％ＣＨ₃ＣＮ、ｐＨ６．５）で平衡化し、次いで、サンプルをカラムに充填した。生成物を緩衝液Ｂ（２Ｍ ＫＢｒ）で溶出させた。回収した生成物を凍結乾燥し、５０ｍＭ ｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液を伴うＨｉＰｒｅｐ脱塩カラム上で脱塩した。次いで、脱塩した溶液を、約１ｍｇ／ｍＬ（オリゴ当量）溶液に濃縮した。生成物の収量２１．７５ｍｇ（オリゴ当量）。
【０２２９】
実施例３１Ａ．化合物３３ａ−Ｉ−Ｒ２（ｎ＝８４、オリゴＩ＝ＬＮＡスルビビン、Ｒ＝Ｒ２＝−Ｃ−Ａｒｇ₉）：
化合物３２ａを、実施例３１に記載の同じ反応条件でＣ−Ａｒｇ₉と反応させて、生成物を得た。
【０２３０】
実施例３１Ｂ．化合物３３ａ−Ｉ−Ｒ３（ｎ＝８４、オリゴＩ＝ＬＮＡスルビビン、Ｒ＝Ｒ３＝−Ｃ−ＴＡＴ−ＲＧＤ）：
化合物３２ａを、実施例３１に記載の同じ反応条件でＣ−ＴＡＴ−ＲＧＤと反応させて、生成物を得た。
【０２３１】
実施例３１Ｃ．化合物３３ｂ−Ｉ−Ｒ_１（ｎ＝４、オリゴＩ、Ｒ＝Ｒ１＝−Ｃ−ＴＡＴ）：
化合物３２ｂ（２０ｍｇオリゴ当量、０．００３５ｍｍｏｌ）を、１０ｍｌの緩衝液（５Ｍ尿素、１００ｍＭ ＫＨ₂ＰＯ₄）に溶解した。溶液を０℃、窒素下で冷却し、次いで、ペプチドＣ−ＴＡＴ（５２ｍｇ、０．０３１５ｍｍｏｌ）を添加した。濃い黄色が観察された。継続して、反応物を１．５時間、窒素雰囲気下、０℃で撹拌し、次いで、ソース（Source）１５Ｓ樹脂を使用する陽イオン交換クロマトグラフィーによって精製した。カラム（１０ｍｍ×１０ｍｍ）を、３カラム容積の緩衝液Ａ（５Ｍ尿素、１００ｍＭ ＫＨ₂ＰＯ₄、２５％ＣＨ₃ＣＮ、ｐＨ６．５）で平衡化し、次いで、サンプルをカラムに充填した。生成物を緩衝液Ｂ（２Ｍ ＫＢｒ）で溶出させた。回収した生成物を凍結乾燥し、５０ｍＭ ｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液を伴うＨｉＰｒｅｐ脱塩カラム上で脱塩した。次いで、脱塩した溶液を、約１ｍｇ／ｍＬ（オリゴ当量）溶液に濃縮した。生成物の収量１２．５ｍｇ（オリゴ当量）。
【０２３２】
実施例３２．化合物３４：
ＤＭＦ中８アーム^20K−ＳＣＰＥＧ（１当量）の溶液に、ペプチド（１６当量）を添加した。次いで、ＤＩＥＡを添加（３２当量）し、得られた懸濁液を、室温で５時間、撹拌する。反応混合物を、ＤＣＭ／Ｅｔ₂Ｏにより０℃で沈殿させる。固体をろ過し、次いで、水に溶解する。粗固体を、Ｃ１８逆相クロマトグラフィーを使用して、精製する。生成物のピークを回収し、凍結乾燥して、固体とする。
【０２３３】
実施例３３．化合物３５：
化合物３４をＤＭＦ中２％ヒドラジンの溶液に添加し、溶液を４時間、室温で撹拌する。反応混合物を逆相カラムに充填し、精製する。生成物のピークを回収し、凍結乾燥する。
【０２３４】
実施例３４．化合物３６：
化合物３５（１当量）を、２０ｍｌの緩衝液（５Ｍ尿素、１００ｍＭ ＫＨ₂ＰＯ₄）に溶解する。溶液を０℃、窒素下で冷却し、次いで、オリゴ（Ｏｌｉｇｏ）−ＳＨ（８当量）を添加する。継続して、反応物を１．５時間、窒素雰囲気下、０℃で撹拌し、次いで、ソース(Source)１５Ｓ樹脂を使用する陽イオン交換クロマトグラフィーによって精製する。カラム（１０ｍｍ×１０ｍｍ）を、３カラム容積の緩衝液Ａ（５Ｍ尿素、１００ｍＭ ＫＨ₂ＰＯ₄、２５％ＣＨ₃ＣＮ、ｐＨ６．５）で平衡化し、次いで、サンプルをカラムに充填する。生成物を緩衝液Ｂ（２Ｍ ＫＢｒ）で溶出させる。回収した生成物を凍結乾燥し、５０ｍＭ ｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液を伴うＨｉＰｒｅｐ脱塩カラム上で脱塩する。次いで、脱塩した溶液を、約１ｍｇ／ｍＬ（オリゴ当量）溶液に濃縮する。
【０２３５】
実施例３５．化合物３７：
ジクロロメタン中^20k８アーム−ＰＥＧスクシンイミジルカーボネート（１当量）の溶液に、Ｈ−Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）−ＯＨ塩酸塩（１当量）およびジイソプロピルエチルアミン（１当量）を添加する。反応物を室温で約５時間、撹拌した。溶媒を部分的に取り出し、続いて、エチルエーテルで沈殿させる。粗生成物をろ過によって回収し、２−プロパノールから結晶化する。
【０２３６】
実施例３６．化合物３８：
化合物３７（１当量）およびアミノ−３，６−ジオキサオクタン酸マレイミド（３５当量）を、ジクロロメタンに溶解し、続いて、氷浴中で溶液を冷却する。７〜８のｐＨに到達するまで、ジイソプロピルエチルアミン（７０当量）を添加する。反応を室温で６．５時間稼動させ、続いて、溶媒を減圧下で部分的に取り出す。次いで、固体をエーテルによって沈殿させ、フラスコを、冷蔵庫に１晩、貯蔵する。次いで、固体をろ過し、ＤＭＦ／ＩＰＡから再結晶化する。
【０２３７】
実施例３７．化合物３９：
化合物３８（２１５ｍｇ、０．０１１ｍｍｏｌ、１当量）を緩衝液（５Ｍ尿素、１００ｍＭ ＫＨ₂ＰＯ₄）に溶解する。溶液を０℃、窒素下で冷却し、次いで、ＳＨ−ＴＡＴ（２５０ｍｇ、１４当量）を添加する。継続して、反応物を１．５時間、窒素下０℃で撹拌し、続いて、ソース(Source)１５Ｓ樹脂上で精製する。カラムを、緩衝液Ａ（５Ｍ尿素、１００ｍＭ ＫＨ₂ＰＯ₄、２５％ＣＨ₃ＣＮ、ｐＨ６．５）で平衡化する。生成物を緩衝液Ｂ（２Ｍ ＫＢｒ）で溶出させる。回収した生成物を凍結乾燥し、５０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を伴うＨｉＰｒｅｐ脱塩カラム上で脱塩する。次いで、脱塩した溶液を、約１ｍｇ／ｍＬ溶液に濃縮する。
【０２３８】
実施例３８．化合物４０：
水中８化合物３９（１当量）の溶液に、ジチオールトレイトール（２当量）を添加する。反応物を室温で２時間、撹拌し、次いで、溶媒を取り出す。粗材料をイソプロパノールから結晶化し、次いで、１００ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ６．５中オリゴ−Ｓ−Ｓ−Ｐｙ（３当量）と、室温で２時間、混合する。反応物をソース（Source）１５Ｓ樹脂上で精製する。カラムを、緩衝液Ａ（５Ｍ尿素、１００ｍＭ ＫＨ₂ＰＯ₄、２５％ＣＨ₃ＣＮ、ｐＨ６．５）で平衡化する。生成物を緩衝液Ｂ（２Ｍ ＫＢｒ）で溶出させる。回収した生成物を凍結乾燥し、５０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を伴うＨｉＰｒｅｐ脱塩カラム上で脱塩した。次いで、脱塩した溶液を、約１ｍｇ／ｍＬ溶液に濃縮する。
【０２３９】
実施例３９．化合物４１：
^20k８アームＰＥＧ−ＯＨ（２．０ｇ、０．１ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２０ｍＬ）に溶解した。ＴＥＡ（１．６２ｇ、１６．０ｍｍｏｌ）を添加した。この溶液を、ＤＣＭ（１０ｍＬ）中アクリロイルクロリド（０．７２４ｇ）に０℃で１時間、添加した。反応混合物を、０℃で１晩、撹拌した。この溶液をＩＰＡ／エーテル（２５０ｍＬ／２５０ｍＬ）に０℃で添加した。形成した固体をろ過した。湿潤固体をＤＣＭに溶解し、０．４Ｎ ＨＣｌで洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、セライトを介してろ過した。溶媒を取り出し、残渣をＤＣＭ／エーテルから再結晶化した。¹³Ｃ ＮＭＲ（７５．４ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）：δ １６５．５，１３０．５，１２７．８，７１．０−６７．１（ＰＥＧ），６３．２。
【０２４０】
実施例４０．化合物４２：
６０ｍＬのｐＨ ８．０リン酸緩衝液中Ｃ₆−チオ−ＬＮＡ−スルビビン（１００ｍｇ、０．０１８ｍｍｏｌ）の溶液に化合物４１（３．６ｇ、０．１８ｍｍｏｌ）を添加し、溶液を１時間、室温で撹拌した。反応の進行を、陰イオン交換ＨＰＬＣによって確認した。反応混合物を、０．２μｍのフィルターを介してろ過し、ポロス（Poros）陰イオン交換カラムに充填した。生成物を、ｐＨ７．０で緩衝系２０ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ ２Ｍ ＮａＣｌを使用する勾配で溶出させた。脱塩後の収量は６０ｍｇ（オリゴ当量）であった。
【０２４１】
実施例４１．化合物４３：
化合物４２（８ｍｇ、０．００１４ｍｍｏｌ、オリゴ当量）を、３ｍＬの緩衝液（５Ｍ尿素、１００ｍＭ ＫＨ₂ＰＯ₄）中ＳＨ−ＴＡＴ−ＲＧＤ（１１１ｍｇ、０．０４９６ｍｍｏｌ）と窒素下で混合した。反応を２時間、稼動させた。粗生成物をソース(Source)１５Ｓ樹脂上で精製した。カラムを、緩衝液Ａ（５Ｍ尿素、１００ｍＭ ＫＨ₂ＰＯ₄、２５％ＣＨ₃ＣＮ、ｐＨ６．５）で平衡化する。生成物を緩衝液Ｂ（２Ｍ ＫＢｒ）で溶出させる。回収した生成物をＨｉＰｒｅｐ脱塩カラム上で脱塩し、凍結乾燥し、５７μｇの収量を得た。
【０２４２】
実施例４２．化合物４６：
５０ｍＬ無水酢酸エチル中１，２−ジ（ピリジン−２−イル）ジスルファン（化合物４４）（８．８ｇ、３９．９ｍｍｏｌ）に、暗所で３−メルカプトプロパン酸（４．２ｇ、３９．９ｍｍｏｌ）を添加し、続いて、１３滴のトリフルオロボランエーテラートを添加した。反応物を５時間、暗所で撹拌し、次いで、ろ過した。次いで、５０ｍＬの冷酢酸エチルを固体に添加した。次いで、ろ過物を回転蒸発（rotovaped）して化合物４５の約５０ｍＬ溶液とした。この溶液に、ｔ−ブチルカルバゼート（４．８ｇ、３６．３ｍｍｏｌ）を添加し、続いて、ＤＣＣ（７．５ｇ、３６．３ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を、１６時間、室温、暗所で撹拌し、次いで、それをろ過し、エバポレートし、ヘキサン類／酢酸エチルの１：１混合物を使用するカラムクロマトグラフィーによって精製して、８．１ｇの生成化合物４６を得た。¹³Ｃ ＮＭＲ：δ １７０．１，１５８．９，１５５．２，１４９．５，１３７．０，１２１．１，１２０．４，８１．５，３４．９，３３．７，２８．２。
【０２４３】
実施例４３．化合物４７：
６４ｍＬのＤＣＭ中ｔｅｒｔ−ブチル２−（３−（ピリジン−２−イルジスルファニル）プロパノイル）ヒドラジンカルボキシレート（化合物４６）（８．１ｇ、２４．６ｍｍｏｌ）に、１６ｍＬのＴＦＡを０℃で添加した。反応物を室温で１時間、撹拌した。反応の完了後、溶媒を回転蒸発し、次いで、残渣を２０／３００ｍＬのＤＣＭ／Ｅｔ₂Ｏから０℃で沈殿させた。固体をろ過し、乾燥して、５．５ｇの化合物４７を得た：¹³Ｃ ＮＭＲ：δ １７３．８，１５９．６，１４７．９，１３８．５，１２１．１，１２０．７，３３．４，３２．２。
【０２４４】
実施例４４．化合物４９：
３０ｍＬのＤＣＭ中３，３−ジエトキシプロパン−１−アミン（化合物４８）（５．２ｇ、３５．３ｍｍｏｌ）に、Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ（２４ｇ、７０．６ｍｍｏｌ）を、０℃で添加し、次いで、室温まで加温した。ＴＬＣによって出発物質が観察されなくなるまで、反応物を２時間、室温で撹拌した。次いで、反応物を３０ｍＬの脱イオン水で希釈した。水層を２×３０ｍＬ ＤＣＭで抽出し、有機層を、無水硫酸マグネシウム上で乾燥し、ろ過し、濃縮した。粗材料を、溶出溶媒としてＤＣＭを使用するカラムクロマトグラフィーによって精製して、５．７ｇの化合物４９を得た：¹³Ｃ ＮＭＲ：δ １５６．２，１４３．９，１４１．２，１２７．５，１２６．９，１２５．０，１１９．８，１０２．２，６６．５，６１．８，４７．３，３７．２，３３．３，１５．４。
【０２４５】
実施例４５．化合物５０：
化合物４９（２００ｍｇ）を、８６％ギ酸（１．１ｍＬ）中、１時間、室温で撹拌した。ロタベイパー（Rotavapor）により室温、減圧下で溶媒を取り出し、残渣をＤＣＭ（３０ｍＬ）に溶解した。溶液を水（３０ｍＬ）で洗浄した。分別した有機層を硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を完全に取り出して、白色固体の化合物５０（１４５ｍｇ）を得た：¹³Ｃ ＮＭＲ：δ １５６．２，１４３．７，１４１．２，１２７．６，１２６．９，１２４．９，１１９．９，６６．７，４７．２，４４．１，３４．５。
【０２４６】
実施例４６．化合物５１：
化合物４７（２５８．３ｍｇ、０．８７４６ｍｍｏｌ）および化合物５０（３００ｍｇ、０．８７４６ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１５ｍＬ）に溶解した。モレキュラーシーブを添加した。反応は１０分間で完了した。反応後、モレキュラーシーブをろ過した。溶媒を取り出し、残渣をエチルエーテルで洗浄して、粗化合物５１（３８５ｍｇ）を得た。
【０２４７】
実施例４７．化合物５２：
さらなる精製を伴わずに、化合物５１（２７０ｍｇ、０．５３ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（５．４ｍＬ）中１０％（ｗ／ｖ）ＤＭＡＰ（０．５４ｇ）で、窒素下室温で８．５時間処置して、化合物５２を得た。^20k８アームＳＣＰＥＧ（６５０ｍｇ、０．０３３ｍｍｏｌ）をその場で(in situ)反応混合物に添加した。反応物を室温で１晩、放置した。溶媒を取り出し、残渣をＤＣＭ／エーテルで沈殿させた。単離した湿潤固体を、アセトニトリル／ＩＰＡから２回再結晶化して、Ｅ異性体およびＺ異性体を伴う化合物１０（６３０ｍｇ）を得た：¹³Ｃ ＮＭＲ：δ １７２．１，１６６．８，１５９．７，１５９．１，１５６．０，１４９．１，１４９．０，１４４．８，１３６．９，１３６．７，１２０．７，１２０．３，１１９．７，１１９．３，７８．０−６９．２（ＰＥＧ），６３．５，３７．６，３７．５，３４．４，３４．１，３３．２，３２．８，３２．４，３２．１。
【０２４８】
実施例４８．化合物５４：
５ｍＬのｐＨ７．０リン酸緩衝液中Ｃ₆−チオ−ＬＮＡ−スルビビン（１０ｍｇ、０．００１８ｍｍｏｌ）の溶液に化合物５３（０．３６ｇ、０．０１８ｍｍｏｌ）を添加し、溶液を１時間、室温で撹拌した。反応の進行を、陰イオン交換ＨＰＬＣによって確認した。反応混合物を、０．２μｍのフィルターを介してろ過し、ポロス（Poros）陰イオン交換カラムに充填した。生成物を、ｐＨ７．０で緩衝系２０ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ ２Ｍ ＮａＣｌを使用する勾配で溶出させた。脱塩後の収量は２ｍｇ（オリゴ当量）であった。
【０２４９】
実施例４９．化合物５５：
化合物５４（３ｍｇ、０．０００５３ｍｍｏｌ、オリゴ当量）を、１ｍＬのｐＨ７．０リン酸緩衝液中ＳＨ−ＴＡＴ−ＲＧＤ（１６．７ｍｇ、０．００７４３ｍｍｏｌ）と窒素下で混合した。反応を２時間、稼動させた。粗生成物をソース(Source)１５Ｓ樹脂上で精製した。カラムを、緩衝液Ａ（５Ｍ尿素、１００ｍＭ ＫＨ₂ＰＯ₄、２５％ＣＨ₃ＣＮ、ｐＨ６．５）で平衡化する。生成物を緩衝液Ｂ（２Ｍ ＫＢｒ）で溶出させる。回収した生成物をＨｉＰｒｅｐ脱塩カラム上で脱塩し、凍結乾燥した。
【０２５０】
実施例５０．化合物５６：
５０ｍＬの無水ＤＣＭ中^20k４アームＰＥＧＮＨＳ（５ｇ、０．２５ｍｍｏｌ）の溶液に、４−アミノプロピオンアルデヒドジエチルアセタール（０．０４ｇ、０．２７５ｍｍｏｌ）を室温で添加した。反応混合物を室温で２０時間、撹拌した。溶媒を減圧下でエバポレートし、粗化合物をアセトニトリル／ＩＰＡで結晶化して、白色固体の化合物５６（４．７ｇ）を得た：¹³Ｃ ＮＭＲ：δ １６８．１７，１５５．８７，１５１．３８，１０１．３７，７０．２１，６９．８９，６３．４６，６１．２９，４５．２２，３６．７８，３３．２４，２５．１９，１５．１２。
【０２５１】
実施例５１．化合物５７：
１０ｍＬの無水ＤＣＭ中化合物３０（０．３６ｇ、０．１１７ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＩＰＥＡ（０．４０ｍＬ、０．２３３ｍｍｏｌ）を室温で添加した。撹拌混合物に、３０ｍＬの無水ＤＣＭ中化合物５６（４．００ｇ、０．０１９４ｍｍｏｌ）の溶液を添加し、続いて、ＤＭＦ（１３ｍＬ）を添加した。反応混合物を室温で５時間、撹拌した。溶媒を減圧下でエバポレートし、得られた残渣を、ＤＣＭ／エチルエーテルで沈殿させた。粗化合物をアセトニトリル／ＩＰＡで再結晶化して、白色固体の化合物５７（３．６ｇ）を得た：¹³Ｃ ＮＭＲ：δ １７０．７４，１５６．５３，１５５．４９，１５３．７５，１４２．２７，１３３．６９，１２１．０８，１０１．４４，７０．６６，６９．７０，６９．１７，６３．８９，６３．５１，６２．７１，６１．３４，５３．３７，５２．９１，４５．２７，４１．７４，３６．８４，３３．２７，２５．１５，１５．１５。
【０２５２】
実施例５２．化合物５８．
クロロホルム中化合物５７（０．７０ｇ、０．０３４ｍｍｏｌ）の溶液に、（８５％）ギ酸（０．１５ｍＬ）を室温で添加した。反応混合物を室温で２０時間、撹拌した。溶媒を減圧下でエバポレートした。粗オイルをエーテルでトリチュレートして、淡黄色固体の化合物５８（０．６５ｇ）を得た：¹³Ｃ ＮＭＲ： δ １７０．７２，１６１．８７，１６０．５９，１５６．５９，５５．５７，１５３．７６，１４２．３３，１３３．７５，１２１．１４，７０．３０，６９．７５，６９．１９，６８．５９，６３．９８，６３．７５，６２．７７，６１．４０，５３．５５，５２．９３，４５．３１，４３．８８，４１．７６，３４．２６。
【０２５３】
実施例５３．化合物５９：
化合物５８（５３ｍｇ、０．０２６ｍｍｏｌ）を、２ｍＬのｐＨ７．０リン酸緩衝液中Ｃ１０−スルビビンヒドラジド（６ｍｇ、０．８８５μｍｏｌ）と反応させた。反応を室温で２時間、稼動させた。粗材料を、移動相Ａ：２０ｍｍｏｌ Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．０およびＢ：２０ｍｍｏｌ Ｔｒｉｓ，２Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０を伴うポロス（Poros）上で精製し、次いで、水で脱塩した。収量１．５ｍｇ（オリゴ当量）。この材料の１．２ｍｇ（オリゴ当量）を、０．５ｍＬの緩衝液（５Ｍ尿素、１００ｍＭ ＫＨ₂ＰＯ₄）に溶解した。ＳＨ−ＴＡＴ（２．３ｍｇ、０．００１３８ｍｍｏｌ）を窒素下で添加した。反応を１．５時間、稼動させ、続いて、ソース(Source)１５Ｓ樹脂上で精製した。カラムを、緩衝液Ａ（５Ｍ尿素、１００ｍＭ ＫＨ₂ＰＯ₄、２５％ＣＨ₃ＣＮ、ｐＨ６．５）で平衡化する。生成物を緩衝液Ｂ（２Ｍ ＫＢｒ）で溶出させる。回収した生成物を、ｐＨ７．４ ＰＢＳを伴うＨｉＰｒｅｐ脱塩カラム上で脱塩し、凍結乾燥した。収量２５０μｇ（オリゴ当量）。
【０２５４】
実施例５４．化合物６０：
無水メタノール（５ｍＬ）中４−ヒドロキシ−３，５−ジメチルベンズアルデヒド（１．３６ｇ、１０ｍｍｏｌ）の溶液に、１．０Ｍリチウムテトラフルオロボレート（０．３ｍＬ）を添加し、続いて、トリメチルオルトホーメート（１．３７８ｇ、１３ｍｍｏｌ）を添加する。反応混合物を３時間、還流し、次いで飽和重炭酸ナトリウム（２０ｍＬ）の添加によって、クエンチする。混合物を酢酸エチルで２回（６０ｍＬ、３０ｍＬ）抽出する。合わせた有機層を飽和塩化ナトリウム（２０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ_４上で乾燥する。ろ過後、溶媒を減圧下でエバポレートして、化合物６０を得る。
【０２５５】
実施例５５．化合物６２：
無水ＤＣＭ（１００ｍＬ）中化合物６１（１０ｇ、０．２５ｍｍｏｌ）の溶液に、化合物６０（５０．０ｍｇ、０．２７５ｍｍｏｌ）を添加し、続いて、ＤＭＡＰ（３３．６ｍｇ、０．２７５ｍｍｏｌ）を添加する。混合物を１晩還流する。溶媒を減圧下でエバポレートし、残渣をＤＣＭ／エーテルで結晶化する。湿潤固体を単離し、ＣＮＣＨ_３／ＩＰＡから再結晶化して、化合物６２を得る。
【０２５６】
実施例５６．化合物６３：
無水ＤＣＭ（１００ｍＬ）中化合物６２（１０ｇ、０．２５ｍｍｏｌ）の溶液に、化合物１８（３４２ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ）を添加し、続いて、ＤＭＡＰ（１８３ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ）を添加する。混合物を１晩還流する。溶媒を減圧下でエバポレートし、残渣をＤＣＭ／エーテルで結晶化する。湿潤固体を単離し、ＣＮＣＨ_３／ＩＰＡから再結晶化して、化合物６３を得る。
【０２５７】
実施例５７．化合物６４：
化合物６３（０．７ｇ、０．０１７５ｍｍｏｌ）をクロロホルム（０．６ｍＬ）に溶解する。ギ酸（８５％、０．１５ｍＬ）を添加する。混合物を１晩撹拌する。溶媒を減圧下でエバポレートし、残渣をＤＣＭ／エーテルで結晶化して、化合物６４を得る。
【０２５８】
実施例５８．化合物６５：
化合物６４を、ｐＨ７．０リン酸緩衝液中ＳＨ−ＴＡＴ−ＲＧＤと窒素下で混合する。反応を２時間、稼動させる。粗生成物をソース(Source)１５Ｓ樹脂上で精製する。カラムを、緩衝液Ａ（５Ｍ尿素、１００ｍＭ ＫＨ₂ＰＯ₄、２５％ＣＨ₃ＣＮ、ｐＨ６．５）で平衡化する。生成物を緩衝液Ｂ（２Ｍ ＫＢｒ）で溶出させる。回収した生成物をＨｉＰｒｅｐ脱塩カラム上で脱塩し、凍結乾燥する。
【０２５９】
実施例５９．化合物６８：
１１５ｍＬの無水ＤＣＭ中８アームＰＥＧ−ＳＣ（５．５ｇ、０．２６ｍｍｏｌ）の溶液に、化合物６６（１１７．２ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ、１．１当量）を添加した。反応混合物を１晩撹拌し、次いで、６０ｍＬのＴＨＦ中化合物６７（１．７５ｇ、４．５２ｍｍｏｌ、１７．５当量）を添加し、混合物を室温で４日間、撹拌した。溶媒を減圧下で取り出し、得られた固体をＩＰＡで２回、再結晶化して、化合物６８（４．４ｇ）を得た：¹³Ｃ ＮＭＲ：δ ２７．９３，３５．１９，３７．２７，５２．５３，５２．８７，５３．０３，５６．２６，５６．６４，６１．０９，６２．７７，６３．６０，６９．３５−７０．５１（ＰＥＧ），１２６．６７，１２７．７８，１２８．７３，１３７．３８，１５５．８７，１６９．４７。
【０２６０】
実施例６０．化合物６９：
化合物６８をＴＦＡ／ＤＣＭ溶媒混合物（５０／１００ｍＬ）に添加し、混合物を室温で１晩、撹拌した。溶媒を減圧下で取り出し、残渣をエチルエーテルの添加によって沈殿させた。固体をろ過し、ＩＰＡで再結晶化して、化合物３のカルボン酸（４．６ｇ）を得た：¹³Ｃ ＮＭＲ：δ ３３．８８，３５．５４，４８．６５，４９．７２，５０．６８，５１．４８，５６．４７，５６．８５，５９．６７，６１．０５，６４．１８，６９．０５−７０．３６（ＰＥＧ），１２８．７９，１２９．８１，１５６．４３，１６９．３０．５２ｍＬの無水ＤＣＭ中カルボン酸（３．３ｇ、０．１４ｍｍｏｌ、１当量）および３，５−ジメチル−４−ヒドロキシ−ベンジル−ＯＴＢＳ（１１４ｍｇ、０．４３ｍｍｏｌ、３当量）の０℃の溶液に、ＤＭＡＰ（１０５ｍｇ、０．８６ｍｍｏｌ、６当量）およびＥＤＣ（１１０ｍｇ、０．５７ｍｍｏｌ、４当量）を添加した。反応混合物を室温で撹拌した。溶媒を減圧下で取り出し、残渣を、ＤＣＭ／エチルエーテルで沈殿させた。得られた固体をろ過し、ＩＰＡから再結晶化して、化合物６９（３ｇ）を得た：¹³Ｃ ＮＭＲ：δ −５．２９，１６．３５，２５．８６，３４．１５，３６．３４，５０．０１，５１．３６，５２．１２，５６．６７，５６．９３，６０．５４，６１．５２，６３．９２，６４．２１，６９．２５−７１．３４（ＰＥＧ），１２５．９８，１２７．８８，１２８．１２，１２８．３６，１２９．２３，１５６．１７，１６９．９０。
【０２６１】
実施例６１．化合物７０：
化合物６９（３ｇ）を１２ｍＬのアセトニトリルおよび６ｍＬの水に溶解し、続いて、３０ｍＬの酢酸を添加した。溶液を１晩、室温で撹拌し、続いて、減圧下で溶媒を取り出した。エーテルで固体を沈殿させ、次いで、ＤＭＦ／ＩＰＡから再結晶化して、脱保護されたアルコールを得た。アルコール（２．７ｇ、０．０８ｍｍｏｌ、１当量）を３ｍＬのＤＭＦおよび３０ｍＬのジクロロメタンに溶解し、続いて、溶液を０℃まで冷却した。ＤＳＣ（１７０ｍｇ、０．６５ｍｍｏｌ、８当量）およびピリジン（４６μＬ、０．５７ｍｍｏｌ、７．２当量）を添加した。反応混合物をゆっくりと加温して、１晩で室温にした。ＤＣＭを減圧下で部分的に取り出し、続いて、エーテルで固体を沈殿させた。次いで、固体を、ＤＭＦ／ＩＰＡから再結晶化して、化合物７０（２．３ｇ）を得た。
【０２６２】
実施例６２．化合物７１：
ＰＢＳ緩衝液（１．５ｍＬ、ｐＨ７．８）中オリゴ−ＮＨ₂（３ｍｇ、０．５μｍｏｌ）の溶液に、化合物７０（１４０ｍｇ、５μｍｏｌ）を添加し、室温で２時間、撹拌した。反応混合物を、水で１０ｍＬに希釈し、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．０（緩衝液Ａ）で予め平衡化したポロス（Poros）ＨＱ、強力な陰イオン交換カラム（１０ｍｍ×１．５ｍｍ、ベットボリューム、約１６ｍＬ）上に充填した。カラムを３〜４カラム容積の緩衝液Ａで洗浄して、過剰なＰＥＧリンカーを取り出した。次いで、生成物を、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．０、緩衝液Ｂ中０〜１００％１Ｍ ＮａＣｌの勾配で１０分間、続いて、１００％緩衝液Ｂ、１０分間、１０ｍＬ／分の流速で溶出させた。溶出した生成物を、ＨｉＰｒｅｐ脱塩カラム（５０ｍＬ）を使用して脱塩し、凍結乾燥して、化合物７１を得た。収量２．２ｍｇ（オリゴ当量、７３％）。
【０２６３】
生物学的データ
実施例６３．化合物２３ａ−ＩＩ−Ｒ１のインビトロでの細胞内取り込み
癌細胞による細胞内取り込みを測定して、正に荷電した部分を含むＰＥＧポリマーへのオリゴヌクレオチドの効果を決定した。本複合体（２３ａ−ＩＩ−Ｒ１）は、Ｃ−ＴＡＴ（配列番号１）に結合した７アームおよび５'アンチセンスＢＣＬ−２オリゴヌクレオチド、ＴＣＴＣＣＣＡＧＣＧＴＧＣＧＣＣＡＴ、（配列番号６）に結合した１アームを含有する。対照複合体は化合物２３ａ−ＩＩ−Ｒ１に類似するが、正に荷電した部分ＴＡＴを含有しない。化合物１０１のオリゴヌクレオチドおよび対照オリゴヌクレオチドの両方とも、供給者によって提供される方法によって、ＦＩＴＣで標識した。
【０２６４】
４枚のウェルプレート中１０％ＦＢＳ増殖培地を伴うＡ５４９ヒト肺癌細胞を、１晩、３７℃でインキュベートした。細胞を試験化合物のそれぞれでトランスフェクトし、ＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳ中５０％グリセロール（２０ｍｌの１００％グリセロール＋２０ｍｌのＰＢＳ）を添加して、スライド上の細胞を覆った。スライドを４℃で１晩貯蔵した。蛍光顕微鏡および共焦点顕微鏡を使用して、ＰＥＧ−オリゴヌクレオチドの細胞内取り込みを示した。試験化合物の細胞内取り込みを、図１３（蛍光顕微鏡画像）および図１４（共焦点顕微鏡画像）に示す。
【０２６５】
データは、癌細胞が、正に荷電したポリマーに複合体化したオリゴヌクレオチドのような負に荷電した治療用薬剤を取り込むことを示す。データは、ポリマーの正電荷骨格は、治療用オリゴヌクレオチドが細胞膜を横切り、腫瘍細胞の標的部位に到達することを可能にすることを示す。
【０２６６】
実施例６４．２３ａ−ＩＩ−Ｒ１の細胞内取り込みの効率
化合物２３ａ−ＩＩ−Ｒ１を使用して、トランスフェクション剤を伴うまたは伴わない化合物の細胞内取り込み効率を示した。６枚のウェルプレート中１０％ＦＢＳ増殖培地を含有する培地において、Ａ５４９ヒト肺癌細胞を、１晩、３７℃でインキュベートした。その後、培地を取り出し、細胞を、試験化合物のそれぞれを含有する１ｍｌ／ウェル１０％ＦＢＳ増殖培地で処置した。対照化合物は、ポリマーにもまた正に荷電した部分にも複合体化していないオリゴヌクレオチド、アンチセンスＢＣＬ−２オリゴヌクレオチド（配列番号７）である。対照および本化合物の両方ともＦＩＴＣで標識して、化合物の細胞内取り込みを示した。
【０２６７】
結果を図１５に示す。化合物２３ａ−ＩＩ−Ｒ１に結合したオリゴヌクレオチドは、トランスフェクション剤を伴わない対照オリゴヌクレオチドよりも多く細胞に採取された。培地がインビボでの環境に類似する血清を含有した場合、正に荷電したポリマーに複合体化したオリゴヌクレオチドの細胞内取り込みは、生来のオリゴヌクレオチドと比較して、有意に改善された。
【０２６８】
結果は、本ポリマーが、オリゴヌクレオチドのような負に荷電した治療用薬剤の標的細胞への送達を増加し、それ故、オリゴヌクレオチドに基づく治療は、この利点から利益を得ることができることを示す。
【０２６９】
実施例６５．２３ａ−ＩＩ−Ｒ１および２３ａ−ＩＩ−Ｒ２の用量依存的細胞内取り込み
フローサイトメトリーを使用して、正に荷電したポリマーに複合体化したオリゴヌクレオチドの細胞内取り込み効率を示した。６枚のウェルプレート中１０％ＦＢＳ増殖培地を含有する培地において、Ａ５４９ヒト肺癌細胞を、１晩、３７℃でインキュベートした。その後、培地を取り出し、細胞を、化合物２３ａ−ＩＩ−Ｒ１および生来のオリゴヌクレオチド（配列番号６）のそれぞれを含有する１ｍｌ／ウェル１０％ＦＢＳ増殖培地で処置した。処置後、細胞を回収し、トリプシン処理し、１％ＢＳＡ ＰＢＳで３回洗浄し、ＦＡＣＳを使用して分析した。化合物１０１のオリゴヌクレオチドおよび対照オリゴヌクレオチドを、ＦＩＴＣで標識した。
【０２７０】
結果を図１６に示した。結果は、ＴＡＴ（２３ａ−ＩＩ−Ｒ１）またはＡｒｇ₉（２３ａ−ＩＩ−Ｒ２）のいずれかを含有する正に荷電したポリマーに複合体化したオリゴヌクレオチドが、用量に依存して細胞に取り込まれたことを示す。臨床従事者は、患者の必要性に依存して治療用オリゴヌクレオチドの用量を調整するため、この特性は癌の治療において有利であり得る。
【０２７１】
実施例６６．２３ａ−Ｉ−Ｒ１のＢＣＬ２ ｍＲＮＡダウンレギュレーション
本研究は、癌細胞に取り込まれるオリゴヌクレオチドが、癌に関与する特異的遺伝子発現をダウンレギュレートするかどうかを決定するために行った。Ａ４３１細胞を、トランスフェクション剤を伴わずに、生来のオリゴヌクレオチドおよび化合物２３ａ−Ｉ−Ｒ１でトランスフェクトした。正に荷電したポリマー複合体は、ＴＡＴおよびＢＣＬ２ ｓｉＲＮＡを含有する。
【０２７２】
ＢＣＬ２ ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析を図１７に示す。これらの結果は、化合物１０２および対照のオリゴヌクレオチドの両方が、ヒト肺癌細胞において、ＢＣＬ２ ｍＲＮＡ発現を用量依存的にダウンレギュレートしたことを示す。正に荷電したポリマーに対するＢＣＬ２ ｓｉＲＮＡ複合体は、生来のＢｃｌ２ ｓｉＲＮＡと比較して、有意に高いＢＣｌ２ ｍＲＮＡ発現のダウンレギュレーションを示した。
【０２７３】
結果は、本明細書に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡを含むＰＥＧ−オリゴヌクレオチド複合体が、治療剤としてのｓｉＲＮＡの使用を可能にすることを示す。
【０２７４】
実施例６７．Ａ５４９細胞モデル（固形腫瘍、肺癌）における［ＲＧＤ−ＴＡＴＣ−Ｓ−Ｓ］₇−^20k８アームＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−アンチセンススルビビンＬＮＡによるスルビビンｍＲＮＡダウンレギュレーション
本研究は、スルビビンｍＲＮＡ発現に対する正に荷電したポリマーの効果を決定するために行った。Ａ５４９ヒト肺細胞を、化合物３３ｂ−Ｉ−Ｒ４、３３ｂ−Ｉ−Ｒ５および３３ａ−Ｉ−Ｒ３のそれぞれにより、１０００ｎＭ、２００ｎＭ、４０ｎＭ、８ｎＭおよび１．６ｎＭの濃度で、トランスフェクトした。化合物３３ｂ−Ｉ−Ｒ４（［線状ＲＧＤ−Ｓ−Ｓ］₃−^20k４アームＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−アンチセンススルビビンＬＮＡ）および３３ｂ−Ｉ−Ｒ５（［環状ＲＧＤ−Ｓ−Ｓ］₃−^20k４アームＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−アンチセンススルビビンＬＮＡ）は両方とも、アンチセンススルビビンＬＮＡを含有するが、正に荷電したペプチド（ＴＡＴ）を含まない。化合物３３ａ−Ｉ−Ｒ３（［ＲＧＤ−ＴＡＴＣ−Ｓ−Ｓ］₇−^20k８アームＰＥＧ−ＳＳ−アンチセンススルビビンＬＮＡ）は、ＴＡＴペプチドおよびアンチセンススルビビンＬＮＡを含む。化合物のそれぞれで処置したＡ５４９細胞におけるスルビビンｍＲＮＡ発現を、処置の翌日にＲＴ−ＰＣＲによって測定した。
【０２７５】
ＴＡＴペプチドを含む化合物は、トランスフェクション剤を伴わずに、スルビビンｍＲＮＡ発現を有意にダウンレギュレートした。ダウンレギュレーションは、用量依存的であった。これらの結果を図１８に示す。ＴＡＴペプチドを伴わない化合物のアンチセンススルビビンＬＮＡも、また生来のアンチセンススルビビンＬＮＡのいずれも、スルビビンｍＲＮＡ発現を阻害しなかった。データは、正に荷電したポリマーが、負に荷電したオリゴヌクレオチドを利用する処置に有益であることを示す。
【０２７６】
実施例６８．ＤＵ１４５細胞モデル（固形腫瘍、前立腺癌）における［ＲＧＤ−ＴＡＴＣ−Ｓ−Ｓ］₇−^20k８アームＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−アンチセンススルビビンＬＮＡによるスルビビンｍＲＮＡダウンレギュレーション
ＤＵ１４５細胞を、実施例６７で使用したのと同じ化合物でトランスフェクトした。実施例６７と同様に、ＴＡＴペプチドを含有する化合物は、スルビビンｍＲＮＡ発現の有意なダウンレギュレーションを示した。生来のアンチセンススルビビンＬＮＡも、また正に荷電したペプチドを伴わない化合物のアンチセンススルビビンＬＮＡのいずれも、ＤＵ１４５細胞においてスルビビンｍＲＮＡ発現をダウンレギュレートしなかった。これらの結果を図１９に示す。データは、正に荷電したポリマーは、多様なタイプの癌の治療に有益であり得ることを示す。スルビビンｍＲＮＡダウンレギュレーションは、ＤＵ１４５細胞における化合物３３ａ−Ｉ−Ｒ１（ＴＡＴＣ−Ｓ−Ｓ）₇−^20k８アームＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−アンチセンススルビビンＬＮＡ）を伴う研究によって同様に観察された。
【０２７７】
実施例６９．Ａ５４９細胞モデルにおける［（Ａｒｇ）₉Ｃ−Ｓ−Ｓ］₇−^20k８アームＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−アンチセンススルビビンＬＮＡによるスルビビンｍＲＮＡダウンレギュレーション
Ａ５４９ヒト肺癌細胞を、化合物３３ａ−Ｉ−Ｒ２および生来のアンチセンススルビビンＬＮＡのぞれぞれでトランスフェクトした。化合物３３ａ−Ｉ−Ｒ２（［（Ａｒｇ）₉Ｃ−Ｓ−Ｓ］₇−^20k８アームＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−アンチセンススルビビンＬＮＡ）は、細胞内で遊離可能なジスルフィド結合を介して、Ｃ（Ａｒｇ）₉に接続された７ポリマーアーム末端およびアンチセンススルビビンＬＮＡに接続された１アーム末端を含む。生来のオリゴヌクレオチド（アンチセンススルビビンＬＮＡ）はまた、トランスフェクション剤リポフェクタミンでトランスフェクトした。
【０２７８】
（Ａｒｇ）₉を含む化合物は、トランスフェクション剤を伴わずに、スルビビンｍＲＮＡ発現を有意にダウンレギュレートした。結果を図２０に示す。データは、ＴＡＴおよび（Ａｒｇ）₉のような正に荷電したペプチドを含有する本ポリマーが、治療用オリゴヌクレオチドを、細胞内の標的部位に送達させることを示す。オリゴヌクレオチド系の抗癌治療は、正に荷電したポリマーから利益を得ることができる。
【０２７９】
実施例７０．細胞内で不安定なリンカーを含有する正に荷電したポリマーによるスルビビンｍＲＮＡダウンレギュレーション
Ａ５４９細胞を、化合物５９およびアンチセンススルビビンＬＮＡダイマーのそれぞれでトランスフェクトした。Ｃ₆−ＳＨテイル（アンチセンススルビビンＬＮＡ−Ｃ₆−Ｓ−Ｓ−Ｃ₆−アンチセンススルビビンＬＮＡ）で改変されたアンチセンススルビビンＬＮＡのダイマーもまた、トランスフェクション剤でトランスフェクトした。化合物５９は、ヒドラゾン系の遊離可能なリンカーを含有する。ｍＲＮＡダウンレギュレーション結果を図２１に示す。
【０２８０】
ヒドラゾンリンカーを介してポリマーに結合されたアンチセンススルビビンＬＮＡは、スルビビンｍＲＮＡ発現をダウンレギュレートした。データは、ヒドラゾンリンカーを介して接続されたアンチセンスオリゴヌクレオチドが、細胞膜を横切った後、細胞内でポリマーから遊離され得ることを示す。それは、ポリマーが、ジスルフィド結合およびヒドラゾンをベースとするリンカーのような多様なタイプの遊離可能なリンカーを用いることができ、ポリマーからのアンチセンスオリゴヌクレオチドの遊離速度および部位を改変することができることを示す。
【０２８１】
実施例７１．Ａ５４９細胞モデルにおける［ＲＧＤ−ＴＡＴＣ−Ｓ−Ｓ］₇−^20k８アームＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−アンチセンススルビビンＬＮＡによるスルビビンｍＲＮＡダウンレギュレーション
本研究は、標的化剤を含有する正に荷電したポリマーが、標的化剤を伴わない正に荷電したポリマーと同様に有効であり、それ故、標的化剤を含有するポリマーは、標的化された送達のために利用することができるかどうかを決定するために行った。Ａ５４９細胞を、化合物３３ａ−Ｉ−Ｒ１（ＴＡＴＣ−Ｓ−Ｓ）_７−^20k８アームＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−アンチセンススルビビンＬＮＡおよび３３ａ−Ｉ−Ｒ３（［ＲＧＤ−ＴＡＴＣ−Ｓ−Ｓ］₇−^20k８アームＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−アンチセンススルビビンＬＮＡ）のそれぞれでトランスフェクトした。化合物３３ａ−Ｉ−Ｒ１および３３ａ−Ｉ−Ｒ３では、７ポリマーアーム末端を、それぞれ、Ｃ−ＴＡＴおよびＣ−ＴＡＴ−ＲＧＤに接続した。細胞はまた、トランスフェクション剤を伴ってまたは伴わずに、ＳＨ−Ｃ₆テイルで改変されたアンチセンススルビビンＬＮＡでトランスフェクトした。標的化剤を伴うまたは伴わないポリマーの両方とも、スルビビンｍＲＮＡ発現をダウンレギュレートした。結果を図２２に示す。正に荷電したポリマーのこのような特徴は、オリゴヌクレオチド治療剤の標的剤指向性送達に有益である。
【０２８２】
実施例７２．スルビビンｍＲＮＡ発現の特異的阻害
本研究は、オリゴヌクレオチドが癌細胞膜を横切った後、遺伝子発現を選択的に阻害するかどうかを決定するために行った。
【０２８３】
Ａ５４９ヒト肺癌細胞を、化合物３３ａ−Ｉ−Ｒ１（ＴＡＴＣ−Ｓ−Ｓ）_７−^20k８アームＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−アンチセンススルビビンＬＮＡ）、化合物３３ａ−ＩＩ−Ｒ１（ＴＡＴＣ−Ｓ−Ｓ）_７−^20k８アームＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−スクランブル化スルビビンＬＮＡ）および生来のアンチセンススルビビンＬＮＡのそれぞれでトランスフェクトした。化合物３３ａ−ＩＩ−Ｒ１は、それがアンチセンススルビビンＬＮＡ内にミスマッチするヌクレオチドを含むことを除いて、化合物３３ａ−Ｉ−Ｒ１に対応する（スクランブル化スルビビンＬＮＡ：５'-_ｓ^ｍＣ_ｓＧ_ｓ^ｍＣ_ｓＡ_ｓｇ_ｓａ_ｓｔ_ｓｔ_ｓａ_ｓｇ_ｓａ_ｓａ_ｓＡ_ｓ^ｍＣ_ｓ^ｍＣ_ｓｔ-３'）。生来のアンチセンススルビビンＬＮＡはまた、トランスフェクション剤でトランスフェクトした。結果を図２３に示す。
【０２８４】
結果は、化合物３３ａ−Ｉ−Ｒ１のアンチセンススルビビンＬＮＡが、化合物３３ａ−ＩＩ−Ｒ１のミスマッチしているアンチセンススルビビンＬＮＡおよび生来のアンチセンススルビビンＬＮＡと比較して、スルビビンｍＲＮＡ発現を有意に阻害したことを示す。ミスマッチしているヌクレオチドを含有するアンチセンススルビビンＬＮＡは、スルビビン遺伝子発現を阻害しなかった。ｍＲＮＡダウンレギュレーションは、特異的阻害である。この特徴は、癌の治療において、所望されない遺伝子発現を選択的にダウンレギュレートさせるのに望ましい。
【０２８５】
実施例７３．Ｃａｌｕ−６腫瘍におけるインビボでのスルビビンダウンレギュレーション
アンチセンススルビビンＬＮＡを含有するＰＥＧの３つの類似体のスルビビンダウンレギュレーション効率を、Ｃａｌｕ６腫瘍細胞を異種移植したマウスで評価した。各グループを、化合物３３ａ−Ｉ−Ｒ１（ＴＡＴＣ−Ｓ−Ｓ）_７−^20k８アームＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−アンチセンススルビビンＬＮＡ）、化合物３３ａ−Ｉ−Ｒ３（［ＲＧＤ−ＴＡＴＣ−Ｓ−Ｓ］₇−^20k８アームＰＥＧ−ＳＳ−アンチセンススルビビンＬＮＡ）または化合物３３ａ−Ｉ−Ｒ２（［（Ａｒｇ）₉Ｃ−Ｓ−Ｓ］₇−^20k８アームＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−アンチセンススルビビンＬＮＡ）で処置した。処置後、マウスを屠殺した時に腫瘍組織を摘出し、スルビビンｍＲＮＡ発現を測定した。アンチセンススルビビンＬＮＡを含むすべての３つのポリマーは、生来のアンチセンススルビビンＬＮＡと比較して、腫瘍組織においてスルビビンｍＲＮＡ発現を有意に阻害した。結果を図２４に示す。結果は、固形腫瘍のような癌の治療において、正に荷電したポリマーに接続されたオリゴヌクレオチドは、生来のアンチセンススルビビンＬＮＡより有意に有効であることを示す。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】

で表される化合物であって、
［式中、
各Ｚ₁は、独立して、
【化２】

であり；
各Ｚ₂は、独立して選択されるキャッピング基：
【化３】

であり；
Ｒ₁は、実質的に非抗原性のポリマーであり；
Ｒ₂およびＲ'₂は、独立して選択される、正電荷含有ペプチドまたは窒素含有環状炭化水素部分であり；
Ｒ₃およびＲ'₃は、独立して選択される標的化剤であり；
Ｒ₄は、生物学的に活性な部分であり；
Ｂ₁、Ｂ'₁およびＢ''₁は、独立して選択される分岐基であり；
Ｌ₁、Ｌ'₁、Ｌ₁''、Ｌ₁'''およびＬ₁''''は、独立して選択される二官能性リンカーであり；
Ｌ₂、Ｌ'₂およびＬ''₂は、独立して選択される遊離可能なリンカーであり；
（ａ）は、正の整数であり；
（ｂ）は、０もしくは正の整数であり；
（ｃ）、（ｃ'）および（ｃ''）は、独立して０もしくは正の整数であり；
（ｄ）、（ｄ'）、（ｉ）、（ｉ'）および（ｉｉ）は、独立して０もしくは正の整数であり；
（ｅ）は、正の整数であり；
（ｅ'）および（ｅ''）は、独立して０もしくは正の整数であり；
（ｆ）および（ｆ'）は、独立して０もしくは正の整数であり；
（ｇ）は、正の整数であり；
（ｇ'）は、０もしくは正の整数であり；
（ｈ）および（ｈ'）は、独立して正の整数であり；
（ｂ）が０ではなく、すべてのＺ₂がキャッピング基：
【化４】

であるか、または組合せである場合、（ｇ'）は正の整数であることを条件とする］、
化合物。
【請求項２】
式：
【化５】

で表されることを特徴とする、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
（ａ）および（ｂ）の合計が約１〜約３２であることを特徴とする、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
（ａ）および（ｂ）の合計が２、３、４、８、１６、もしくは３２であることを特徴とする、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
Ｚ₂がキャッピング基であり、（ａ）および（ｇ'）が１であることを特徴とする、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
（ａ）が１であり、（ｂ）が１〜７の正の整数であることを特徴とする、請求項１に記載の化合物。
【請求項７】
前記生物学的に活性な部分が、−ＮＨ₂含有部分、−ＯＨ含有部分および−ＳＨ含有部分からなる群より選択されることを特徴とする、請求項１に記載の化合物。
【請求項８】
前記生物学的に活性な部分が、医薬的に活性な化合物、酵素、タンパク質、オリゴヌクレオチド、抗体、モノクローナル抗体、一本鎖抗体およびペプチドからなる群より選択されることを特徴とする、請求項１に記載の化合物。
【請求項９】
前記生物学的に活性な部分がオリゴヌクレオチドを含んでなることを特徴とする、請求項１に記載の化合物。
【請求項１０】
前記オリゴヌクレオチドが、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ロックされた核酸（ＬＮＡ）、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、アプタマー、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴヌクレオチド（ＰＭＯ）、トリシクロ−ＤＮＡ、二本鎖オリゴヌクレオチド（デコイＯＤＮ）、触媒ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、スピーゲルマー、ＣｐＧオリゴマーおよびこれらの組合せからなる群より選択されることを特徴とする、請求項７に記載の化合物。
【請求項１１】
前記生物学的に活性な部分が、アンチセンスＢｃｌ−２オリゴヌクレオチド、アンチセンスＨＩＦ−１αオリゴヌクレオチド、およびアンチセンススルビビンオリゴヌクレオチドからなる群より選択されることを特徴とする、請求項１に記載の化合物。
【請求項１２】
前記ペプチドが、約１〜約５０の正に荷電したアミノ酸を含有すること特徴とする、請求項１に記載の化合物。
【請求項１３】
前記ペプチドが、約２〜約２０の正に荷電したアミノ酸を含有すること特徴とする、請求項１に記載の化合物。
【請求項１４】
前記ペプチドが、ＣＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１）またはＣＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号２）を含んでなることを特徴とする、請求項１に記載の化合物。
【請求項１５】
前記窒素含有環状炭化水素が、式：
【化６】

で表され、
［式中
（ａａ）は、約２〜１０の正の整数であり；
（ｂｂ）は１、２もしくは３であり；
（ｃｃ）は１もしくは２であり；
（ｄｄ）は、約１〜約５の正の整数であり；
Ｒ₁₀₁が、水素、Ｃ_1-6アルキル、Ｃ_2-6アルケニル、Ｃ_2-6アルキニル、Ｃ_3-19分岐アルキル、Ｃ_3-8シクロアルキル、Ｃ_1-6置換アルキル、Ｃ_2-6置換アルケニル、Ｃ_2-6置換アルキニル、Ｃ_3-8置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、Ｃ_1-6ヘテロアルキル、置換Ｃ_1-6ヘテロアルキル、Ｃ_1-6アルコキシ、アリールオキシ、Ｃ_1-6ヘテロアルコキシ、ヘテロアリールオキシ、Ｃ_2-6アルカノイル、アリールカルボニル、Ｃ_2-6アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、Ｃ_2-6アルカノイルオキシ、アリールカルボニルオキシ、Ｃ_2-6置換アルカノイル、置換アリールカルボニル、Ｃ_2-6置換アルカノイルオキシ、置換アリールオキシカルボニル、Ｃ_2-6置換アルカノイルオキシ、置換アルカノイルオキシおよびアリールカルボニルオキシからなる群より独立して選択され；
（ｑ）は、約２〜約３０の正の整数である］、
ことを特徴とする、請求項１に記載の化合物。
【請求項１６】
前記窒素含有環状炭化水素が：
【化７】

からなる群より選択されることを特徴とする、請求項１５に記載の化合物。
【請求項１７】
前記標的化剤が、モノクローナル抗体、一本鎖抗体、細胞接着ペプチド、細胞透過性ペプチド、受容体リガンド、標的炭水化物分子またはレクチン、およびオリゴヌクレオチドからなる群より選択されることを特徴とする、請求項１に記載の化合物。
【請求項１８】
前記標的化剤が、ＲＧＤペプチド、セレクチン、ＴＡＴ、ペネトラチン、（Ａｒｇ）₉および葉酸からなる群より選択されることを特徴とする、請求項１に記載の化合物。
【請求項１９】
Ｂ₁およびＢ'₁が、
【化８】

からなる群より独立して選択され、
［式中、
Ｒ₅は、水素、Ｃ_1-6アルキル、Ｃ_2-6アルケニル、Ｃ_2-6アルキニル、Ｃ_3-19分岐アルキル、Ｃ_3-8シクロアルキル、Ｃ_1-6置換アルキル、Ｃ_2-6置換アルケニル、Ｃ_2-6置換アルキニル、Ｃ_3-8置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、Ｃ_1-6ヘテロアルキル、置換Ｃ_1-6ヘテロアルキル、Ｃ_1-6アルコキシ、アリールオキシ、Ｃ_1-6ヘテロアルコキシ、ヘテロアリールオキシ、Ｃ_2-6アルカノイル、アリールカルボニル、Ｃ_2-6アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、Ｃ_2-6アルカノイルオキシ、アリールカルボニルオキシ、Ｃ_2-6置換アルカノイル、置換アリールカルボニル、Ｃ_2-6置換アルカノイルオキシ、置換アリールオキシカルボニル、Ｃ_2-6置換アルカノイルオキシおよび置換アリールカルボニルオキシからなる群より独立して選択され；
（ｃ１）、（ｃ２）、（ｃ３）、（ｃ４）、（ｃ５）、（ｃ６）、（ｃ'６）、（ｃ''６）、（ｃ７）および（ｃ８）は、独立して０もしくは正の整数であり、
（ｄ１）、（ｄ２）、（ｄ３）、（ｄ４）、（ｄ５）および（ｄ７）は、独立して０もしくは正の整数である］、
ことを特徴とする、請求項１に記載の化合物。
【請求項２０】
Ｂ₁およびＢ'₁が、
【化９】

からなる群より独立して選択されることを特徴とする、請求項１９に記載の化合物。
【請求項２１】
Ｌ₁およびＬ'₁が、アミノ酸およびアミノ酸誘導体からなる群より独立して選択されることを特徴とする、請求項１に記載の化合物。
【請求項２２】
Ｌ₁およびＬ'₁が、
【化１０−１】

【化１０−２】

からなる群より独立して選択され、
［式中：
Ｒ_21-29は、水素、Ｃ_1-6アルキル類、Ｃ_3-12分岐アルキル類、Ｃ_3-8シクロアルキル類、Ｃ_1-6置換アルキル類、Ｃ_3-8置換シクロアルキル類、アリール類、置換アリール類、アラルキル類、Ｃ_1-6ヘテロアルキル類、置換Ｃ_1-6ヘテロアルキル類、Ｃ_1-6アルコキシ、フェノキシおよびＣ_1-6ヘテロアルコキシからなる群より独立して選択され；
（ｔ）および（ｔ'）は、独立して０もしくは正の整数であり；
（ｖ）および（ｖ'）は、独立して０もしくは１である］、
ことを特徴とする、請求項１に記載の化合物。
【請求項２３】
Ｌ₁およびＬ'₁が：
【化１１】

からなる群より独立して選択されることを特徴とする、請求項１に記載の化合物。
【請求項２４】
Ｌ₂およびＬ'₂が、ベンジル基脱離系リンカー、トリアルキル基ロック系リンカー、ビシン系リンカー、酸に不安定なリンカー、リソソーム切断性ペプチドおよびカテプシンＢ切断性ペプチドからなる群より独立して選択されることを特徴とする、請求項１に記載の化合物。
【請求項２５】
前記酸に不安定なリンカーが、ジスルフィド、ヒドラゾン含有リンカーおよびチオプロピオネート含有リンカーからなる群より選択されることを特徴とする、請求項２４に記載の化合物。
【請求項２６】
Ｌ₂およびＬ'₂が：
【化１２】

−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−、
−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−、
−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−、
−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−、
【化１３】

-Ｖａｌ-Ｃｉｔ-Ｃ（＝Ｏ）-ＣＨ₂ＯＣＨ₂-Ｃ（＝Ｏ）-、
-Ｖａｌ-Ｃｉｔ-Ｃ（＝Ｏ）-ＣＨ₂ＳＣＨ₂-Ｃ（＝Ｏ）-、および
-ＮＨＣＨ（ＣＨ₃）-Ｃ（＝Ｏ）-ＮＨ（ＣＨ₂）₆-Ｃ（ＣＨ₃）₂-Ｃ（＝Ｏ）-
からなる群より独立して選択され、
［式中、
Ｙ_11-19は、独立してＯ、ＳまたはＮＲ₄₈であり；
Ｒ_31-48、Ｒ_50-51およびＡ₅₁は、水素、Ｃ_1-6アルキル類、Ｃ_3-12分岐アルキル類、Ｃ_3-8シクロアルキル類、Ｃ_1-6置換アルキル類、Ｃ_3-8置換シクロアルキル類、アリール類、置換アリール類、アラルキル類、Ｃ_1-6ヘテロアルキル類、置換Ｃ_1-6ヘテロアルキル類、Ｃ_1-6アルコキシ、フェノキシおよびＣ_1-6ヘテロアルコキシからなる群より独立して選択され；
Ａｒは、アリールまたはヘテロアリール部分であり；
Ｌ_11-15は、独立して選択される二官能性スペーサーであり；
ＪおよびＪ'は、独立して標的細胞に能動的に輸送される部分、疎水性部分、二官能性連結部分およびそれらの組合せの中から選択され；
（ｃ１１）、（ｈ１１）、（ｋ１１）、（ｌ１１）、（ｍ１１）および（ｎ１１）は、独立して選択される正の整数であり；
（ａ１１）、（ｅ１１）、（ｇ１１）、（ｊ１１）、（ｏ１１）および（ｑ１１）は、独立して０もしくは正の整数であり；
（ｂ１１）、（ｘ１１）、（ｘ'１１）、（ｆ１１）、（ｉ１１）および（ｐ１１）は、独立して０もしくは１である］、
ことを特徴とする、請求項２４に記載の化合物。
【請求項２７】
前記キャッピング基が、Ｈ、ＮＨ₂、ＯＨ、ＣＯ₂Ｈ、Ｃ_1-6アルコキシおよびＣ_1-6アルキルからなる群より選択されることを特徴とする、請求項１に記載の化合物。
【請求項２８】
Ｒ₁が、直鎖、分岐鎖またはマルチアーム化ポリアルキレンオキシドを含んでなることを特徴とする、請求項１に記載の化合物。
【請求項２９】
前記ポリアルキレンオキシドが、直鎖、分岐鎖またはマルチアーム化ポリエチレングリコール、および直鎖、分岐鎖またはマルチアーム化ポリプロピレングリコールからなる群より選択されることを特徴とする、請求項２８に記載の化合物。
【請求項３０】
前記ポリアルキレンオキシドが：
-Ｙ₇₁-(ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ)_n-ＣＨ₂ＣＨ₂Ｙ₇₁-、
-Ｙ₇₁-(ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ)_n-ＣＨ₂Ｃ(＝Ｙ₂₂)-Ｙ₇₁-、
-Ｙ₇₁-Ｃ(＝Ｙ₇₂)-(ＣＨ₂)_a2-Ｙ₇₃-(ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ)_n-ＣＨ₂ＣＨ₂-Ｙ₇₃-(ＣＨ₂)_a2-Ｃ(＝Ｙ₇₂)-Ｙ₇₁-、および
-Ｙ₇₁-(ＣＲ₇₁Ｒ₇₂)_a2-Ｙ₇₃-(ＣＨ₂)_b2-Ｏ-(ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ)_n-(ＣＨ₂)_b2-Ｙ₇₃-(ＣＲ₇₁Ｒ₇₂)_a2-Ｙ₇₁-
からなる群より選択され、
［式中：
Ｙ₇₁およびＹ₇₃は、独立してＯ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ₂、ＮＲ₇₃または結合であり；
Ｙ₇₂は、Ｏ、Ｓ、またはＮＲ₇₄であり；
Ｒ₇₁₋₇₃は、水素、Ｃ_1-6アルキル、Ｃ_2-6アルケニル、Ｃ_2-6アルキニル、Ｃ_3-19分岐アルキル、Ｃ_3-8シクロアルキル、Ｃ_1-6置換アルキル、Ｃ_2-6置換アルケニル、Ｃ_2-6置換アルキニル、Ｃ_3-8置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、Ｃ_1-6ヘテロアルキル、置換Ｃ_1-6ヘテロアルキル、Ｃ_1-6アルコキシ、アリールオキシ、Ｃ_1-6ヘテロアルコキシ、ヘテロアリールオキシ、Ｃ_2-6アルカノイル、アリールカルボニル、Ｃ_2-6アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、Ｃ_2-6アルカノイルオキシ、アリールカルボニルオキシ、Ｃ_2-6置換アルカノイル、置換アリールカルボニル、Ｃ_2-6置換アルカノイルオキシ、置換アリールオキシカルボニル、Ｃ_2-6置換アルカノイルオキシおよび置換アリールカルボニルオキシからなる群より独立して選択され；
（ａ２）および（ｂ２）は、独立して０もしくは正の整数であり；
（ｎ）は、約１０〜約２３００の整数である］、
ことを特徴とする、請求項２８に記載の化合物。
【請求項３１】
前記ポリアルキレンオキシドが、式、−Ｏ−（ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ）_n−のポリエチレングリコールを含んでなり、
［式中、（ｎ）は、約１０〜約２，３００の整数である］
ことを特徴とする、請求項２８に記載の化合物。
【請求項３２】
Ｒ₁が、約２，０００〜約１００，０００の平均分子量を有することを特徴とする、請求項１に記載の化合物。
【請求項３３】
Ｒ₁が、約５，０００〜約６０，０００の平均分子量を有することを特徴とする、請求項１に記載の化合物。
【請求項３４】
Ｒ₁が、約５，０００〜約２５，０００または約２０，０００〜約４５，０００の平均分子量を有することを特徴とする、請求項１に記載の化合物。
【請求項３５】
式：
【化１４】

で表され、
［式中、
（ｅ）は、１もしくは２であり；
（ｅ'）は、０、１もしくは２であり；
（ｆ'）は、０もしくは１である］；
【化１５】

［式中、（ｇ'）は、正の整数である］
からなる群より選択されることを特徴とする、請求項１に記載の化合物。
【請求項３６】
式：
【化１６】

［式中
各Ｚは、Ｚ₁またはＺ₂であって、
ここで、
各Ｚ₁は、独立して、
【化１７】

であり；
各Ｚ₂は、独立して選択されるキャッピング基：
【化１８】

であり；
Ｌ₂、Ｌ'₂およびＬ''₂は、独立して、ジスルフィド、ヒドラゾン含有リンカー、チオプロピオネート含有リンカー、ベンジル基脱離系リンカー、トリアルキル基ロック系リンカーおよびビシン系リンカー、リソソーム切断性ペプチドおよびカテプシンＢ切断性ペプチドからなる群より選択される遊離可能なリンカーであり；
（ｃ）、（ｃ'）および（ｃ''）は、独立して０もしくは正の整数であり；
（ｄ）、（ｄ'）、（ｉ）、（ｉ'）および（ｉ''）は、独立して０もしくは正の整数であり；
（ｅ）は、正の整数であり；
（ｅ'）および（ｅ''）は、独立して０もしくは正の整数であり；
（ｆ）および（ｆ'）は、独立して０もしくは正の整数であり；
（ｇ）は、正の整数であり；
（ｇ'）は、０もしくは正の整数であり；
（ｈ）および（ｈ'）は、独立して正の整数であり；
他のすべての変数は、先に定義したとおりであり、
すべてのＺ₂がキャッピング基：
【化１９】

またはこれらの組合せである場合、（ｇ'）は正の整数であることを条件とする］
ことを特徴とする、請求項１に記載の化合物。
【請求項３７】
【化２０−１】

【化２０−２】

【化２０−３】

【化２０−４】

からなる群より選択されることを特徴とする、請求項１に記載の化合物。
【請求項３８】
請求項１に記載の化合物を有効量で、それらを必要とする哺乳動物に投与することを含んでなる、治療方法。
【請求項３９】
有効量の請求項１に記載の化合物を有効量で、それらの治療を必要とする細胞に送達することを含んでなる、ポリヌクレオチドを哺乳動物細胞に投与する方法。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【図１６】

【図１７】

【図１８】

【図１９】

【図２０】

【図２１】

【図２２】

【図２３】

【図２４】

【公表番号】特表２０１０−５０３４１４（Ｐ２０１０−５０３４１４Ａ）
【公表日】平成２２年２月４日（２０１０．２．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５２８５１８（Ｐ２００９−５２８５１８）
【出願日】平成１９年９月１５日（２００７．９．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０７８５９８
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０３４１２３
【国際公開日】平成２０年３月２０日（２００８．３．２０）
【出願人】（５０５３５４８９９）エンゾン　ファーマスーティカルズ　インコーポレイテッド (28)
【氏名又は名称原語表記】ＥＮＺＯＮ　ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ，　ＩＮＣ．
【Ｆターム（参考）】