比表面積を有する銀ナノ粒子、およびその製造方法
乳酸菌属の生体成分の２０〜８０％重量に結合された銀ナノ粒子であって、平均粒径と比表面積（ＢＥＴ）との比率が０．０１５〜０．１５ｎｍ／ｍ２／ｇであることを特徴とする銀ナノ粒子であり；アンモニアおよびアルカリ金属水酸化物の存在下において、Ａｇ０銀ナノ粒子を含む細菌のバイオマスが形成されるまで、少なくとも４ｍＭの銀塩を含む水溶液を用いて乳酸菌属の細菌を培養するステップを含む、銀ナノ粒子の生成方法；および、濃縮アルカリ金属水酸化物または濃縮無機酸または酵素を用いて、上記バイオマスから上記Ａｇ０銀ナノ粒子を抽出するステップをさらに含む方法；有効量の上記銀ナノ粒子を含む抗微生物組成；抗微生物活性を有する物品または組成を製造するための上記銀ナノ粒子の使用；銀ナノ粒子を上記物品または組成に分散させる、または含浸させるステップを含む、抗微生物活性を有する物品または組成の製造方法；および、中に分散された銀ナノ粒子を有する抗微生物特性をもつ物品。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、特定の物理特性、特に比表面積特性および／または等電点を示す銀ナノ粒子に関する。本発明は、銀ナノ粒子、および当該銀ナノ粒子を含む抗菌性組成の新規な製造方法に関する。
【０００２】
〔本発明の背景〕
銀ナノ粒子は、ナノ材料の新興分野における様々な用途に用いられる。例えば、銀ナノ粒子の用途は、配合バイオサイド、抗菌剤、および殺菌剤、電子試薬、銀導電性インク、医療用途、創部の治療、ソーラーパネル、およびスマートグラスを含む。
【０００３】
水溶液および有機溶液中の低濃度の銀ナノ粒子は、（物理）化学的な方法、または光化学的な方法を用いて容易に調製可能であるが、当該粒子のスケールアップを行う際には、バッチ間からの格差を回避するために、実験条件を注意深く制御する必要がある。概して、試薬のモル濃度の上昇に伴い、粒径が増大し、粒子間の凝集が増大する。ナノ粒子の利点はその粒径にあることから、上記結果は不要な特性である。
【０００４】
代表的な化学的製造工程では、銀塩の希釈液、界面活性剤またはキャッピング剤、および還元剤が必要とされる。ナノ粒子が生成される溶媒は、水またはＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）などの有機溶媒であってもよい。殆どの合成において、ナノ粒子の合成のための還元剤に加えて、適した界面キャッピング剤を使用することが記載されている。再乳化ナノ粒子粉末を得るために、ポリマーとともに有機化合物を頻繁に使用することが記載されている。通常、さらに小さい粒子を得るために、物理的テンパリングまたは熱プラズマ処理などの代替技術によって、当該粉末を後処理する。当該方法によって得られる表面積は、代表的には、約２０ｍ２／ｇを超えない範囲内であり、粒径は約３０ｎｍである。
【０００５】
水溶液および有機溶液中の低濃度の銀ナノ粒子を調製することは容易であるが、銀ナノ粒子の大きさを制御し、凝集を回避することを鑑みると、スケールアップは未だ困難である。さらに、重要な分野である配合バイオサイド、抗菌剤、および殺菌剤において銀ナノ粒子を使用することを鑑みると、銀ナノ粒子の抗微生物効率は極めて重要であり、ナノ粒子の物理化学的特性に密接に関係している。
【０００６】
本方法によって生成されたナノ粒子は、一般的に極めて高価であるので、ポリマーの用途は、in situでの銀ナノ粒子の生成に重点を置いている。母材としてのポリマーにおける銀ナノ粒子のin situ合成は、十分に確立されている。ナノ粒子がポリマーに埋め込まれる、あるいは封入される場合、ポリマーは界面キャッピング剤として機能する。ポリ（ビニルアルコール）やポリ（ビニルピロリドン）、ポリスチレン、ポリメタクリル酸、などのポリマーは、文献に記載された全ての適したポリマーである。
【０００７】
しかし、ポリマーマトリックス内で所望の形状、反応性、および粒度分布のゼロ価の銀を得ることは、高い技術を要する。さらに、当該手法には、ポリマーにおける銀ナノ粒子の安定性、およびポリマーの凝集体形成および最小酸化を防止するなどの重要な課題が残っている。したがって、銀ナノ粒子の特定の物理特性、特に比表面特性、および／または、等電点を向上させる技術、および銀ナノ粒子の製造方法を向上させる技術が必要とされている。
【０００８】
〔本発明の要約〕
第一形態では、本発明は銀ナノ粒子に関し、当該銀ナノ粒子において、平均粒径と比表面積（ＢＥＴ）との比率が０．０１５〜０．１５ｎｍ／ｍ２／ｇであり、および／または、銀ナノ粒子が３〜７の等電点を有する。他の形態では、本発明は、少なくとも２０％重量の細菌由来の生体成分から生成された銀ナノ粒子に関し、当該生体成分は、約０．３％重量の硫黄（Ｓ）を含む。
【０００９】
上記説明に係る銀ナノ粒子は、２０〜８０％重量、例えば３０〜７０％重量、または４０〜６０％重量のラクトバチルス属の生体成分と結合していてもよい。上記実施形態において、上記生体成分の重量比は、限定するものではないが、定量的エネルギー分散型Ｘ線分析などのいずれかの定量化手段によって測定されてもよい。本実施形態において、銀ナノ粒子は、細胞外被上または細胞外皮内、あるいは生体成分のＳ−層もしくは糖衣上またはその中に分散されてもよい。
【００１０】
本発明の上記実施形態のいずれかに係る銀ナノ粒子は、好適には、平均粒径が１〜８ｎｍ、例えば２〜６ｎｍである。本発明の上記実施形態のいずれかに係る銀ナノ粒子は、好適には、３０〜９０ｍ２／ｇ、例えば３５〜８５ｍ２／ｇ、または４０〜８０ｍ２／ｇの比表面積（ＢＥＴ）を示す。
【００１１】
第二形態では、本発明は銀ナノ粒子の製造方法に関し、当該方法は、
（ａ）アンモニアおよびアルカリ金属水酸化物の存在下において少なくとも４ｍＭの銀塩を含む水溶液を用いてラクトバチルス属の細菌を培養し、Ａｇ０銀ナノ粒子を含む細菌のバイオマスを形成するステップと、任意に、
（ｂ）濃縮アルカリ金属水酸化物、または濃縮無機酸または酵素を用いて、上記バイオマスからＡｇ０銀ナノ粒子を抽出するステップを含む。
【００１２】
本方法の好適な実施形態では、上記培養ステップ（ａ）に使用される細菌は、（限定するものではないが）例えばＣ／Ｎ比が少なくとも１０：１条件下での発酵、例えば少なくとも２０ｇ／Ｌ、好適には５０ｇ／Ｌを上回る濃度での発酵性糖の存在下での発酵によって前処理し、当該細胞外被内に糖リッチ構造を増大させる。
【００１３】
本方法の好適な実施形態では、上記培養ステップ（ａ）に使用される細菌は、少なくとも約１０時間（例えば少なくとも１５時間、少なくとも２０時間）、および／または、約４℃〜約４０℃の範囲内の温度にて、当該細菌の乾燥重量が少なくとも約２００％、例えば少なくとも３００％に増大するまで発酵させることによって、前処理される。
【００１４】
本方法の他の実施形態では、上記培養ステップ（ａ）に使用される細菌は、糖衣、細胞外被、および／またはＳ−層の酸加水分解によって、例えば約３５℃以上の温度下での酸加水分解によって、前処理される。
【００１５】
本方法の他の実施形態では、上記培養ステップ（ａ）に使用される細菌は、プロバイオティクス細菌であってもよい。本方法に係る代替的実施形態または好適な実施形態の詳細については、添付の請求項に記載する。
【００１６】
〔図面の簡単な説明〕
図１は、複数のＴＥＭマイクロコピー分析から得られた、ラクトバチルス・ファーメンタム(lactobacillus fermentum)から抽出されたバイオナノ銀の粒径分布を表す。
【００１７】
〔発明の詳細な説明〕
従来の製品に対し、本発明の銀ナノ粒子、または本工程によって製造された銀ナノ粒子は、抗菌反応性が高く、分散作用が優れており、粒度分布が限定されており、安定化ポリマーまたは潜在的に有害な有機分子を使用せずに高濃度にて生成することができる。これにより、費用効率が高い方法を提供することができ、当該方法においては、廃棄物の流れについても付加価値がある。
【００１８】
本発明では、銀ナノ粒子の製造工程が提供され、当該工程において、主成分は、好適には、高Ｃ／Ｎ比の特定の条件下にて培養された前処理済みの生体成分（ラクトバチルス・ファーメンタム(lactobacillus fermentum)株 Ｇ２／１０）である。本発明に係る銀ナノ粒子は、細菌細胞の体積に渡ってランダムに分配されるのではなく、異なるが明確な粒径範囲で細胞の特定部位に見られる。本発明を用いて、最も遠位の細胞画分（以下「糖衣」または「Ｓ−層」または「細胞外被」と称する）から明確な粒径範囲（例えば平均粒径が３〜４ｎｍ）が得られる。一方、従来技術の方法では、ラクトバチルス(lactobacillus)株によって生成された銀ナノ粒子について、例えば１５ｎｍ〜５００ｎｍの広範囲の粒子が得られていた。また、従来の方法を用いて、容易にキログラム（乾燥重量）の生体成分当たり１８０ｇのコロイド状銀が製造され得る。一方、他の生物学的方法では、収量は例えばキロ当たり１８ｇなど、ずっと低い。細胞壁、細胞膜および外膜（存在する場合）を合わせて細胞外被と称する。本方法は、限定するものではないが、L. fermentum、L. brevis、L. casei、L. sakei、L. farciminis、およびL. parabuchneri株を含む多数のラクトバチルス類から銀ナノ粒子を生成するように適用可能であることがわかった。
【００１９】
重要なことに、下記例示の実施形態に使用される、プロバイオティックスであるラクトバチルス・ファーメンタム(lactobacillus fermentum)Ｇ２／１０は、発酵装置において、ｍ３当たり約１０キログラム（乾燥重量）の生体成分の濃度で効果的に製造され得る。
【００２０】
以下の処理によって、細胞糖衣、またはＳ−層、または細胞外被における制御可能な粒径分布をもつ微小のＡｇ０ナノ粒子が生成される。すなわち、最終的なＣ源濃度が少なくとも２０ｇ／Ｌの発酵性糖、および好適には５０ｇ／Ｌを上回る（例えば８０ｇ／Ｌ）のグルコースで、Ｃ／Ｎ比が１０：１よりも高い条件下で、適宜低いｐＨでの加水分解ステップを組合わせて、生体成分を増殖させる。そして、低濃度のＮａＯＨでの培養後、この生体成分を後処理する。Ａｇ（ｌ）還元のための還元剤、および生成されたナノ粒子のための安定化剤の両方が、鹸化反応混合液内に存在する。Ａｇ+還元の間、グルコースなどの他の還元剤を添加する必要はない。
【００２１】
グラム陽性菌であるラクトバチルス種の細胞壁は、ペプチドグリカンからなる厚い層を含み、当該層は、リポタイコ酸、テイコ酸、タンパク質、および、多糖によって覆われており、続いて、細胞内の周辺リン脂質含有細胞膜、および細胞質が続く。ペプチドグリカンは、Ｎ−アセチルグルコサミンβ（１→４）Ｎ−アセチルマラミック酸であり、このオリゴ糖は、細胞壁を構成するヘテロ多糖類における長鎖の構成成分である。また、細胞外糖衣、粘性多糖またはポリペプチド粘液が存在する。Ｓ−層または表面層は、タンパク性サブユニットの結晶配列からなる細胞壁の最遠部として規定される。
【００２２】
本発明において、高い効率で、細胞外被、Ｓ−層または糖衣内に、均一形状および１〜８ｎｍの範囲のサイズをもつ銀ナノ粒子を製造することについて説明する。本方法には、３つの重要な特徴がある。
１．細胞外被における糖リッチ構造の数が増大し、より厚い生体成分の細胞外被が得られる。これは、少なくとも１０：１の高Ｃ／Ｎ比の条件下での発酵、例えば８０ｇ／Ｌの最終グルコース濃度を供給する栄養培地において培養することによって、達成される。発酵工程中に、逐次的または段階的にＣ／Ｎ比を増加させることにより、上記が達成される。
２．加熱しながら低濃度のＨＣｌ（例えば６０℃で０．１Ｎ ＨＣｌ）で水で希釈された生体成分を処理することによって、還元糖の相対数をさらに増大させる方法である。その後、その結果、糖衣またはペプチドグリカンにおける多糖とオリゴ糖とのグリコシド結合に酸加水分解が生じ、したがって、アルカリ環境下において遊離アルデヒドまたはケトン基を含む還元糖がより多く生成される。Ｃｕ（ＩＩ）Ｏを含むベネディクト試薬を用いて還元糖の量を測定してもよい。
３．最終ステップでは、培養された生体成分を水によって洗浄し、０．００１〜０．００３Ｎ ＮａＯＨを用いて後処理した。ＮａＯＨまたは他の塩基を用いた反応によって、アルカリ条件下にて、細菌の細胞壁構造における還元単糖のアノマーＣ１原子は、アノマーＣ１周辺の再構築に起因して、Ａｇ+による酸化の影響を受けない。還元糖とは、アルカリ条件下にてＡｇ+によって酸化される糖を指す。生じる反応は、遊離アノマーＣ１アルデヒドまたはケトン基をカルボキシル基に酸化させる反応である。アルカリ条件下にて、Ａｇ+を用いた還元糖のアノマーＣ１アルデヒドの酸化還元反応は、
RCHO + 3 OH- +2 Ag+ => RCOO- + 2 Ag0+ 2 H2O (1)
である。
【００２３】
驚くべきことに、本発明において、上述のように製造および後処理された生体成分に、ＮＨ３に溶解させたＡｇＮＯ３を注入することによって、０．９〜７ｍｍＡｇ０のナノ粒子沈殿物が、糖衣、細胞外被および／またはＳ−層に均一に分散した。簡略化のため、糖衣、細胞外被およびＳ−層を総じて、外細胞区分（Outer Cell Compartment, OCC）とする。ＯＣＣにおいてバイオナノ粒子は、３ヶ月間安定を保ち、さらに、示差分画によって抽出可能である。本方法を用いた同質のＡｇ０の生成は、ＮａＯＨによって促進される。これは、還元糖によるＡｇ+の酸化がアルカリ条件下にて向上し、酸化可能なアノマーアルデヒドまたはケトン基を生成するからである。ケトースは、以下の反応に示すように、エネジオールを介してアルドースに異性化する場合、還元糖であり得る。
【００２４】
【化１】
【００２５】
より多くのアノマーＣ１炭素位は、アノマーＣ１周辺の再構築により環状のアルドースまたはケトースの開環が生じることが原因で、ＮａＯＨ、金属水酸化物、または塩基の存在下において、Ａｇ+の還元が可能となる。したがって、ＮａＯＨによる後処理を行わない同じ乳酸菌におけるＡｇ０の生成と比較して、Ａｇ０の形成部位および核形成部位の数はずっと多く、より均一な方法にてより多くのＡｇ０が沈殿する。これは、電子顕微鏡分析法の比較によって、観察され得る。本願に記載された方法を用いて、細胞外被内部の小さいナノ銀沈殿物が、細胞質内部のより大きいＡｇ０結晶から識別される。ＮａＯＨを用いない従来技術の方法では、細胞外被または糖衣内部の小さいナノ銀粒子の沈殿物は存在しない。また、ＮａＯＨがある場合、リン脂質二重層が鹸化され、より多くの透過性細胞質が生じる。
【００２６】
ＮＨ３中でのＡｇＮＯ３の可溶化は、アルカリ環境下におけるＡｇ２ＯまたはＡｇ（ＯＨ）の即時沈殿を防止する。ＮＨ３がＡｇ+と錯体を形成することで、溶液中にてよりよい状態を維持し、生体成分とのよりよい相互作用を可能にする。
【００２７】
本発明に従って生成される銀ナノ粒子は、生体成分からさらに分離され得る。第一ステップでは、最小のバイオナノ粒子がＯＣＣから抽出され、この画分には、代表的には４ｎｍ未満の銀粒子が少なくとも５５％、２ｎｍ未満の銀粒子が少なくとも１５〜２０％含まれ、これによって、平均粒径が約１〜８ｎｍの群が得られる。上記ＯＣＣの第一抽出ステップの後で、より大きい粒径（＞２０ｎｍ〜２００ｎｍ）のナノ粒子がある細胞内部分は、残留廃棄物の流れにおける生体成分の残留画分とともに残っており、これが製品に付加価値を与える。
【００２８】
本発明によると、所望のサイズ範囲は、鹸化された生体成分の異なる位置から抽出され得る。すなわち、平均サイズが約３〜４ｎｍである小さい銀ナノ粒子は、糖衣、細胞外被、および／またはＳ−層において高濃度に生成されてもよく、これによって、例えば細胞質領域などの細菌細胞の他の部分に配置されたより大きい銀ナノ粒子（２０〜２００ｎｍ）から区別して抽出され得る。例えばラクトバチルス・ファーメンタム(lactobacillus fermentum)などの前処理された生体成分は、還元糖を豊富に含む、厚い糖衣および／または細胞外被を有する。
【００２９】
本発明では、水に縣濁させたラクトバチルス・ファーメンタム(lactobacillus fermentum)を、１５分間、０．０１〜０．０３Ｎ ＮａＯＨで後処理することによって、数時間（例えば０．５〜１６時間）内にＡｇ（ｌ）を金属Ａｇ（０）に還元する高い還元力をもち、Ａｇ（ｌ）からＡｇ（０）への変換効率が８０％（例えば９５％）を上回る鹸化された生体成分が得られる。結果物としての、鹸化された生体成分の糖衣において沈殿されたＡｇ０ナノ粒子は、エネルギー分散型Ｘ線回折（ＥＤＸ）および（ＦＴ）ＩＲ分光分析によって、ＣおよびＯが豊富であり、生物由来のＳおよびＮを含む生物由来の被膜によって安定化されることがわかった。システインやメチオニンなどのアミノ酸残基に存在するチオールなどのＳ−含有リガンドは、下記機構によってＡｇ０形成を助ける。
【００３０】
Ａｇ+によるスルフヒドリル含有生体成分の酸化還元反応の例は、
【００３１】
【化２】
または
【化３】
である。
【００３２】
生体成分のバイオナノ銀におけるＳ対Ａｇのモル比は、１：４〜１：６０の範囲内であり、生体Ａｇ０の一部分のみが反応（２）のようにスルフヒドリルによってＡｇ+の沈殿を生じさせ、Ａｇ０の一部が反応（１）によって生成される。Ａｇ０沈殿の有効性におけるＮａＯＨの効能は、例えばタンパク質の可溶性、または還元糖との反応に関連する。
【００３３】
生成された元素状態で存在する銀Ａｇ０は、配位共有結合によって生体の二硫化物に結合され、Ｓの自由電子を共有する、あるいは、銀イオンがスルフヒドリル基と相互作用し、−ＳＡｇ結合（３）を形成する。このように、本願に係る方法を用いて生成されたナノ銀粒子は、Ａｇ０粒子に結合された或る量の生体の硫黄を常に含み、リガンド形成によって、Ａｇ０分散を安定化させる。
【００３４】
興味深いことに、細菌におけるＳ層と呼ばれる、タンパクまたは糖タンパクサブユニットの表面（Ｓ−）層は、負の電荷を帯びたペプチドグリカンシートを物理的に被覆することができ、例えばバチルス・ステアロテルモフィルス（Bacillus stearothermophilus）にて実証されたように、自動凝集を防止する。殆どの細菌類とは対照的に、乳酸菌におけるＳ−層タンパクは、塩基性が高く、等電点がｐＨ＝９を上回る。したがって、本方法によって生成されたＡｇ０ナノ粒子に結合されたＳ含有官能基の役割は、Ａｇ０粒子における細胞外被または糖衣由来の生体表面の負の電荷を被覆することによって凝集を防止することであってもよい。これによって、ゼータ電位測定によって示されたように、より高いｐＨ領域におけるより高い等電点（ＩＥＰ）が生じる。すなわち、他の方法を用いて調製されるナノ銀と比較して、より少ない陽子で、ここに記載された方法によって生成されたナノ銀からのゼータ電位を負から正に切り替えることができる。バイオナノ銀のＩＥＰは、約ｐＨ４〜５であることがわかり、これは、重要なＳ−層を含むラクトバチルス株からのＩＥＰよりも高い。これは、ナノ銀表面上にＳ層型タンパクが豊富にあることを示しており、定量的ＥＤＸ（表４）によって検出された、ナノ粒子に存在する生体ＳおよびＮの含有量と一致する。ＴＥＭ顕微鏡法（図示せず）によって測定されたように、この有機層がナノ粒子に分散作用を与える可能性があるので、このことは重要である。有機リガンドは、その凝集および凝塊を防止することによって、ナノ粒子の利用を高める。また、これらのリガンドは、重要な認識、輸送、および触媒作用をもたらすことができる。
【００３５】
鹸化による後処理ステップによって、糖衣、細胞外被、および／または、Ｓ−層だけでなく、細胞内の細胞質領域がＡｇ（０）生成および蓄積部位となることがわかった。文献に記載されていることとは対照的に、ＯＣＣにおいて生成された銀ナノ粒子の大きさは、０．９〜７ｎｍの範囲内であり、一方、２０〜２００ｎｍの範囲内のより大きいナノ粒子は、ＯＣＣにおいては発見されず、細胞質において発見されている。ナノ粒子は、例えば酸抽出などによってＯＣＣから任意に抽出され、その結果、平均粒径が３〜４ｎｍのナノ銀生成物が得られる。より大きい粒子、すなわち７ｎｍを上回る粒子は、最大で、当該ＯＣＣ抽出の数パーセントを構成する。本発明のナノ粒子は、４℃にて２ヶ月間保存した後でも、糖衣内で、凝集しない、あるいはクラスターを形成しない。したがって、鹸化による後処理によって、ＯＣＣおよび細胞質領域にＡｇ（ｌ）またはＡｇ（０）を拡散させることが可能となり、そして、ＣおよびＳが豊富な、鹸化後の細胞構成成分は、結晶成長を安定化させ、生物由来の電荷を帯びた有機層によって個々のナノ粒子を保護する可能性がある。ＡｇＮＯ３は、本方法によるナノ銀生成物の銀塩として使用されることが望ましい。本方法によって、１ｍ３バッチへのスケールアップが実行可能であり、費用効果の高い製造工程が可能となることがわかり、少なくとも６ｍＭ、好適には１０ｍＭのＡｇＮＯ３が、本願に記載されたいずれかの特性を備えたＡｇ（０）ナノ粒子に効果的に変換される。ＮＨ４+が存在することによって、Ａｇ（ＮＨ２）+または［Ａｇ（ＮＨ３）２］+銀(I)-アンモニア錯体の形成が可能となり、一方で、Ａｇ（ｌ）とＯＣＣにおける還元基との間の静電相互作用の向上が可能となり、他方では、反応混合液におけるＮａＯＨの存在下でのＡｇ（ｌ）ＯまたはＡｇ（ｌ）ＯＨの形成を防止することができる。アンモニアを反応混合液に加えることにより、通常のＡｇ（ｌ）Ｏ、Ａｇ（ｌ）ＯＨまたは酸化銀を形成せずに、０．２５ｋｇＮＨ３／ｍ３に抑えることができる。
【００３６】
アルギニンおよびヒスチジンなどの陽イオン性アミノ酸とアンモニア銀とを反応させることによって、Ａｇ０の沈殿が増大する。そのようなアルカリアミノ酸は、例えば糖衣、細胞外被またはＳ−層の本質部分であり得る。これらのアミノ酸は、Ａｇ（ｌ）を調整する役割を果たし、それによって、さらに、周囲の還元糖によってＡｇ（０）に還元することができる。
【００３７】
本願明細書では、生成されたナノ銀粒子を効果的な抗菌剤および殺生剤として検査した。例えばＨｙｇａｔｅなどによる近年の産業開発により、多孔性マトリクスに埋め込まれたナノ銀は、イオン性銀が不活性の多孔性マトリクスに埋め込まれたときよりも、ゆっくりと、より制御されて抗菌性のＡｇ+を放出することができる。ポリマーおよびプラスチック合成においても、銀ナノ粒子には利点がある。本願に記載された方法によって生成された銀ナノ粒子は、大きい比表面積を有することにより、より効果的な抗菌作用がより効果的になり、水中または他の溶媒中における分散作用がより優れ、ナノ粒子を埋め込むゼオライトのようなマトリクスとの相互作用が良くなる。抗菌ナノ銀粒子は、例えば医薬用途および水処理フィルタにおける表面被膜に効果的に使用され得る。
【００３８】
本発明に記載されたバイオナノ粒子を、例えばアクリル酸エステル共重合体の水性分散液などの中においてポリマーに合成する利点は、ポリマーにおけるバイオナノ粒子の分散作用が優れており、そのため、ここに記載された方法に起因する粒子表面における表面電位および生体の界面活性剤分子に関係する凝集を防止することができる。表面電位は、粒子表面の等電点に関係する。当該等電点は、ゼータ電位測定によって示されたように、他の方法を用いて生成されたナノ粒子よりもずっと高いｐＨ＞４〜５である。
【００３９】
平均粒径３〜４ｎｍのナノ粒子の水中での分散が優れていることは、水性塗料またはポリマーへの合成において明らかな利点となる。優れた分散の結果、凝集が殆ど見られず、ポリマー内部の銀粒子の総表面領域がより大きいため、抗菌反応がより高くなる。水性ポリマーなどの一例は、アクリルエステルベースのＰｈｏｄｏｐａｓ Ｕｌｔｒａｆｉｎｅ ＰＲ３５００（Phodia，France）である。そのようなアクリルエステルポリマーは、（−ＣＨ２ＣＨＣＯＯ−）ｎの構造式で表される。
【００４０】
凝集が殆どなく、表面電位がより広範囲のｐＨ範囲において正の電荷を帯びることにによる、優れた比表面積および粒子の安定性に伴う抗菌作用の増大による利点は、多孔性ゼオライトとより優れた相互作用を行うことにある。そのようなゼオライトの一例は、Zeolith N（Zeolite Aluminium silicate, Evers E.K., Hopsten, Germany）であり、このとき、バイオナノ粒子はゼオライトマトリクス内にしっかりと保持されており、高濃度の塩分を含んだ水がゼオライト表面を通過した場合であっても、Ａｇ+−ゼオライトの組み合せよりも高い抗菌反応をもたらすことが示された。セライトなどの他の天然の多孔性鉱物についても、本願によって生成されたバイオナノ粒子との組み合せに適する。従って生成されたナノ銀のゼータ電位は、ｐＨ４を上回る場合は負の電荷を帯びることから、高いｐＨおよび中性のｐＨでのイオン交換樹脂におけるナノ銀の保有率が向上する。したがって、イオン交換樹脂は、微分ｐＨでのＡｇ+の配位放出のためのバイオナノ銀とを混合するのに適している。
上記が特定の用途において好適である場合は、糖衣／細胞外被または細菌細胞の他の部位から抽出されたナノ粒子の両方の画分を混合してもよい。
【００４１】
本発明のいくつかの利点を示す。
［１］ポリマー、塗料、織物繊維、または封止剤への合成に使用される多くの銀ベースの殺生剤には、イオン交換樹脂、またはＡｇ+を結合および交換する化合物が使用される。Ａｇ+交換に使用される代表的な市販の化合物はゼオライトである。さらに、そのようなＡｇ+交換システムは、例えば高い陽イオン力をもつ水が当該システムの上を通過する場合、Ａｇ+欠乏に対して極めて感受性が高い。これは、当該システムの耐久性を著しく低下させる。一方で、本発明での使用が想定されている微生物の殆どが、廉価で、かつ容易に大量生産することができるものである。例えば、最も一般的なラクトバチルス菌は、大量生産することができる。本願に記載の方法によって生成されるバイオナノ粒子の大きさは、例えば平均約３〜４ｎｍの狭い範囲内においてのみ生成されるが、さらに制御されたＡｇ+の放出源として使用されてもよく、経時的にポリマー内部、多孔性樹脂もしくは他の化合物、および分散液の両方の内部において、高い抗菌作用を保持することができる。
［２］多数の微生物が、タンパク質を含む、多糖含有率の高い糖衣またはＳ−層を有する。鹸化が微分ナノ粒子生成、並びに細胞糖衣および他の細胞成分内部のサイズ分布に及ぼす影響を発見することで、発酵処理または他の処理によって生成された微生物バイオマスを鹸化による後処理をし、その後、当該バイオマスから示差抽出することにより、微小の銀ナノ粒子を生成するための簡易かつ効果的な方法を提供することができる。
［３］本発明の方法は、銀塩の銀ナノ粒子への変換を著しく向上させる。例えば銀塩に含まれる銀の９５％をナノ粒子に変換する場合、最終反応混合液中において１０００ｍｇのＡｇ+および４６００ｍｇのラクトバチルス菌バイオマス（乾燥重量）の濃度では、２０℃の温度下にて１６時間で完了する。反応条件（反応液の濃度、温度、攪拌などを含む）に応じて、３０分以内に８０％の変換が完了する可能性もある。
［４］結果精製された銀ナノ粒子のサイズ分布は、比較的密集しており、示差抽出によって少なくとも部分的に調整され得る。例えば、糖衣において生成される抽出銀ナノ粒子の大きさは、通常、０．９〜７ｎｍの範囲内である。概して、優れた分散作用をもつ小さいナノ粒子は、殆ど凝集を生じさせない。ナノ粒子が小さくなればなるほど、抗菌特性を得る必要がある銀が少なくなる。
［５］生成および抽出されたバイオナノ粒子は、測定可能な量の、生体のＳ、Ｎ、ＣおよびＯを含有する。生成されたナノ粒子に結合されたこの有機層は、ナノ粒子の表面電位および分散作用をもたらす。さらに、上記有機層は、生体構造への架橋効果を有していてもよい。上記効果の組み合せによって、銀ナノ粒子の抗菌効果が増大する。
［６］糖衣以外の細胞構成成分から抽出されたより大きい銀ナノ粒子（２０〜２００ｎｍ）の画分でも、優れた抗菌効果をもつことがわかった。さらに、これらの粒子は、電子化学用途に適した大きさの範囲であり、当該電子化学用途において、フレキシブル導電性回路線は、構成された導電性ナノ粒子の少なくとも２倍の厚さである。例えば、１２０ｎｍの線は、６０ｎｍの銀ナノ粒子を含む導電性インクを用いてプリントされ得る。興味深いことに、ナノ銀縣濁液を用いてプリントされた銀部分は、特に高いアスペクト比で薄い、あるいは微小な特徴を有する場合、当該銀部分の焼結の品質が著しく向上することがわかった。本発明において、生体成分から抽出されたより大きいバイオナノ銀粒子は、より小さいナノ粒子との融合によって生じた銀の突出を有する、不均一な形状をとる。
これらの不均一性は、（ｉ）より大きい粒子の比表面積を大きくし、ＭＩＣ効率を比較的優れたものにすること（表７ａ参照）、（ｉｉ）迅速な製造または試作におけるミクロ銀粉末との結合の選択性を良くすること、に役立つ。
［７］バイオナノ銀粒子の安定化は、例えば（ｉ）アミノカルボン酸塩（例えばアミノ酸）、（ｉｉ）鹸化されたバイオマスに存在するヒドロキシル基、または（ｉｉｉ）チオールおよび／またはアミンなどのドナーリガンド、によって鹸化されたバイオマスに存在する弱官能基とともに生じ得る。本方法によれば、アミンおよび／またはチオール関連分子が銀ナノ粒子と結合するため、感知できるほどの凝集がなく、銀ナノ粒子を長期間（週単位、または月単位）保存できることがわかった。
［８］バイオナノ銀粒子は、最大４２５ｎｍという高いＵＶ吸収を示すことから、４０ｍｇ／Ｌ Ａｇという低濃度であっても、ＵＶ分光分析は、端的な品質制御パラメータとなる。
［９］バイオナノ銀粒子は、藻類、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌、菌類（カビ菌および酵母菌）に対して極めて優れた殺菌特性を示す。最も小さい粒子は約１ｎｍであり、約１０％のナノ粒子がこの大きさであることから、ＨＩＶ−Ｉおよび他のウイルスに対して優れた殺ウイルス特性を得る。
［１０］イオン交換樹脂由来の制御されたｐＨベースのＡｇ放出を他の銀ナノ粒子と比較した。
【００４２】
例示を目的とし、本発明の範囲を制限する意図のない下記例を参照することで、本発明をよりよく理解できる。
【００４３】
１．鹸化による後処理がされた、ラクトバチルス菌生体成分を用いたバイオ−Ａｇ０ナノ粒子の生成
・ＭＲＳ培養培地でラクトバチルスＧ２／１０株を培養した。
・三角フラスコで、２×１５００ｍｌのＭＲＳ培養培地で、２つの前培養バッチを準備し、１００ｒｐｍ（３０℃）で攪拌した。
・４０Ｌの水中に２４ｋｇのグルコース（０．６ｋｇ／Ｌ）を含む、総容量１００Ｌの供給発酵槽を準備した。
・培養液中での乾燥物を測定するために吸光度分析を使用し、ＭＲＳ培地においてＧ２／１０を含む培養フラスコで較正を行った。
・その後、グルコース濃縮を行い、乳酸塩の分析のためにＨＰＬＣバイアルを準備した。
【００４４】
（酢酸ナトリウムを含まない）ＭＲＳ培養培地を以下のように調製する。
１Ｌに対して、下記の添加物を加える。
９００ｍｌの水に、Organotechnie（La Courneuve, France）製の以下の製品を溶解させた。
【００４５】
【表１】
【００４６】
この溶液をオートクレーブ反応器において滅菌した。１００ｍｌの水に２０ｇのグルコースを加えた。この溶液を濾過により滅菌した。
【００４７】
上記のように調製された９００ｍｌおよび１００ｍｌの溶液を滅菌後に混合し、ｐＨ
を６に調整した。
【００４８】
固形培地を生成するために、１ＬのＭＲＳ培養培地に１５ｇの寒天を加え、場合によっては、指標としてブロモクレゾールパープルを加えた。
【００４９】
１つの前培養バッチ１５００ｍｌを４００Ｌの発酵槽に植菌した。供給発酵槽から４００Ｌの培養発酵槽に０．６ｋｇ／Ｌのグルコース溶液をポンプ注入して、グルコースを加えた。培養発酵槽に２６０ＬのＭＲＳ培養液を加え、培養液を滅菌した。その後、培養発酵槽の中に１０Ｌのグルコース供給溶液をポンプ注入し、培養液にラクトバチルス・ファーメンタム(lactobacillus fermentum)Ｇ２／１０を加え、発酵処理を開始して細菌培養液を成長させた。細菌培養液については以下に詳述する。発酵に関する詳細については、表１ａおよび１ｂに示す。
【００５０】
〔表１ａ〕
ラクトバチルス・ファーメンタム(lactobacillus fermentum)Ｇ２／１０発酵中の技術的パラメータ：酸素移動速度（ｖｖｍ）および攪拌速度（周速度ｍ／ｓ、および回転速度ｒｐｍ）に関する酸素移動係数Ｋｌａ
【００５１】
【表２】
【００５２】
〔表１ｂ〕
４００Ｌ発酵槽中におけるラクトバチルス・ファーメンタム(lactobacillus fermentum)Ｇ２／１０発酵中のグルコース基質濃度、乳酸代謝産物濃度、およびラクトバチルス菌乾燥重量
【００５３】
【表３】
【００５４】
発酵パラメータは、
・温度：３０℃
・攪拌：５０ｒｐｍ
・ｐＨ設定点：６
・エアレーション：設定点０．１ＶＶＭ（毎分の気体体積／液体体積）；部分ＰＯ２圧力は未調整であった
・初期グルコース濃度：２０ｇ／Ｌ
である。
【００５５】
バチルスの増殖に適した他の発酵性糖は、例えばスクロース、マルトース、およびフラクトースであり、例えば成長培地に直接添加されるか、または、多糖類（例えばデンプン）または抽出物（例えばトウモロコシの糖、米の糖、糖蜜、乳清など）の一部として添加されてもよい。
【００５６】
ラクトバチルス菌Ｇ２／１０発酵中の物理化学的パラメータのモニタリングによると、開始から６時間後にｐＯ２の下降が観察され、１２時間まで継続して下降していた。そして、ｐＯ２は３〜４時間の間に６５〜７０％の値まで上昇し、その後再び下降する。この一時的な上昇は、５Ｌのグルコース投与を１４時間延期したことによるものである。１１〜１２時間の培養の間にグルコースを投与することが望ましい。ｐＯ２が最小であった２０時間後に、５Ｌのグルコースの第２自動投与を行った。２０Ｌのグルコースの第３自動投与は、グルコースの完全消費が見られた２３〜２４時間の培養の間に行った。この第３注入の直後に、ラクトバチルス菌が著しく増殖し始めた。実際のところ、３時間未満の間に、バイオマスは１ｇ／Ｌから７ｇ／Ｌに増加した。このとき、最終細菌密度は、４，６Ｅ９ ＣＦＵ／ｍｌ（コロニー形成単位）に到達した。したがって、世代時間は０〜６．５時間の培養の間（誘導期）において１．５時間であり、２４〜２７．５時間の培養の間（対数増殖期）において２．７時間であった。
【００５７】
ラクトバチルス菌が増殖活性が十分であり、残りのグルコース濃度が３０ｇ／Ｌである、２７．５時間の培養後の対数増殖期に、生体成分を採取した。このことは、発酵処理をさらに最適化し、ｐＯ２の急増を防止し、（ヘテロ）発酵環境を維持する場合、生体成分の乾燥物が増える可能性があることを示唆している。２７．５時間後の培地に残っているグルコースから、全てのグルコースがバイオマスに変換されるわけではなく、バイオマスが培地中のほぼ５０ｇ／Ｌのグルコースの影響を受けないことも明らかである。実際のところ、第２および第３のグルコース投与は、第１よりもずっと効果的であった。これは、１５ｋｇのグルコースが２，２５ｋｇの生体成分に消費されることを示しており、その場合、基質の収率はＹｘ／Ｓ＝０．１５である。
【００５８】
発酵終了時では、乳酸塩はほぼ３０ｇ／Ｌに達し、計８．７ｋｇの乳酸塩が得られ、その収率はＹｐ／Ｓ＝０．５７である。乳酸塩の生成は、増殖培地における生体成分の乾燥物と同様の動きを辿る。乳酸の対数増加に伴い、ｐＨ値が約４まで一時的に下降した。
【００５９】
発酵終了時に、遠心分離（連続遠心分離機、Ａｌｐｈａ−Ｌａｖａｌ、５００L/h）を用いて生体成分を採取し、生体成分（乾燥物）で１３．６％重量のクリーム１５Ｌを得た。続いて、このクリームを脱イオン水で２回洗浄し、再度遠心分離にかけた。遠心分離および洗浄の間に、バイオマスの損失が見られ、生体成分（乾燥物）で８％重量の最終洗浄生体成分スラリー１４Ｌを得た。発酵培養培地から９５％以上の生体成分（乾燥物）を回復させるために、遠心分離速度を上げ、濾過（例えばクロスフロー濾過）と組み合わせることによって、上記洗浄ステップおよび生体成分の採取を最適化することができる。
【００６０】
そして、洗浄した１１２０ｇ（乾燥重量）の生体成分Ｇ２／１０から、バイオナノ銀生成を始める。１ｍ３のプラスチック容器内（２×１×０．５ ｌ×ｂ×ｈ）で、この生体成分と２５０Ｌの脱イオン水とを混合した。生体成分の縣濁液に、１０Ｎ ＮａＯＨストック溶液から最終濃度の０．０３Ｎ ＮａＯＨになるようにソーダ水（ＮａＯＨ）を加えた。この溶液のｐＨは１１．５である。この反応液を１５分間よくかき混ぜ、生体成分の鹸化を行った。続いて、３９２．５ｇの硝酸銀（ＡｇＮＯ３）を４１７ｇの１５％ＮＨ３水溶液に溶解させた。さらに、この水溶液を鹸化後の生体成分縣濁液と混合し、緩やかに攪拌させながら２０℃にて１６時間、反応させた。
【００６１】
遠心分離後の乾燥物および浮遊物に対するＩＣＰ−ＭＳ（誘導結合プラズマ質量分析法）およびＸＲＤ分析から、１６時間後には、９８％のＡｇ+がＡｇ０に変換されたことがわかった。混合物を遠心分離（連続遠心分離機、Ａｌｐｈａ−Ｌａｖａｌ、５００Ｌ／ｈ）にかけ、脱イオン水を用いて２回洗浄し、残留硝酸エステル、ソーダ水およびアンモニアを除去した。９３０２ｍｇ／Ｌの最終Ａｇ０濃縮物を含む、１５．２Ｌの最終産物が得られた。この最終産物は、微量の硝酸エステルおよびアンモニアのみを含有しており、イオンクロマトグラフィーおよびＴＡＮ測定によって測定されるように、最大４ｍｇ／Ｌ Ｎである。洗浄および遠心分離によって、約４４％のＡｇ０および乾燥重量の生体成分が損失した。反応混合物において９８％のＡｇ０への変換が測定されているが、反応液に加えられた初期のＡｇ+と比較してＡｇ０の回復は５６％となった。この損失は、高速遠心分離を行わず、遠心分離中に産物を洗い流すことが原因である。後に行う小規模検査では、洗浄および採取中のＡｇナノ粒子の損失を防ぐには、１０，０００ｇの遠心分離または超遠心分離が好適な技術であることがわかった。さらに、濾過についても検査する。
【００６２】
２．バイオナノ銀の抽出
これらの検査の目的は、細菌構造から銀ナノ粒子を遊離させるために、銀を含有する生体成分との反応を設定することにあった。（ｉ）過酸化水素（Ｈ２Ｏ２、水に対し３５容量％）、（ｉｉ）ＮａＯＨ（０．０５〜２Ｎ）、および（ｉｉｉ）Ｈ２ＳＯ４（０．４〜９．８Ｎ）という３つの異なる化学試薬を、上述した方法によって生成されたナノ銀を含む生体成分の量と接触させるという３つの実験を設定した。
【００６３】
銀含有生体成分の水縣濁液に、最終濃度が１５％になるようにＨ２Ｏ２を加えた。反応液は高く発熱し、重い発泡体の形成が起きた。反応の２４時間後、混合物を超音波分解した。本方法を用いて、約１５％の銀重量を生体成分から抽出した。この１５％は、その殆どが、糖衣、細胞外被、および／または、Ｓ−層から生じた１〜７ｎｍの範囲内のナノ銀粒子である。
【００６４】
例えばリゾチームなどの酵素加水分解を用いても、同様の結果が得られる。生体成分におけるナノ銀形状をとる１０００ｍｇ／ＬのＡｇを含む１Ｌの水に４ｇの酵素を加えた直後に、透明な茶色い上澄み液が得られた。
【００６５】
ＮａＯＨおよびＨ２ＳＯ４の抽出液からの結果を表２および３に示す。Ｈ２ＳＯ４を用いた場合の結果が最もよく、０℃の温度下での１０分後、２Ｎ Ｈ２ＳＯ４においても、約１０％の銀重量が生体成分から抽出された。反応液は発熱したが、泡の形成は起こらなかった。
【００６６】
〔表２〕
異なるＮａＯＨ濃度、温度、および反応時間が生体成分の銀マトリクスからのナノ銀の抽出効率に及ぼす影響。ナノ銀として生体成分に結合されたＡｇの初期質量は、５２．４ｍｇであった。
【００６７】
【表４】
【００６８】
〔表３〕
異なるＨ２ＳＯ４濃度、温度が生体成分の銀マトリクスからのナノ銀の抽出効率に及ぼす影響。ナノ銀として生体成分に結合されたＡｇの初期質量は、２６２ｍｇであった。反応時間は１０分間であった。
【００６９】
【表５】
【００７０】
以下の例では、示差抽出および遠心分離ステップに基づき、Ｈ２ＳＯ４濃度を用いた、ナノ銀を含む生体成分の完全抽出、その結果生じたナノ銀の様々な画分について詳述している。最初の画分は、ＯＣＣ由来のものであり、１〜７ｎｍの大きさの銀ナノ粒子を含む。連続した抽出ステップでは、細胞質および他の細胞領域から生じた平均２０ｎｍを上回るナノ粒子を含む画分が抽出された。
【００７１】
本方法によって得られたナノ銀含有生体成分の１５０ｍＬ水縣濁液は、ＩＣＰ−ＭＳ分析による測定により、７３００ｍｇ Ａｇ／Ｌを含んでいた。この１５０ｍＬ水縣濁液に、５０ｍＬのＨ２ＳＯ４（９８％）を加えた。
【００７２】
総量は２００ｍＬ（２５％のＨ２ＳＯ４）となり、５４８０ｍｇ Ａｇ／Ｌを含んでいた。上記混合物を２０℃にて１６時間培養した。
【００７３】
上記混合物を３０分間、１１，８００ｘｇにて遠心分離にかけ、上清１と沈殿物１という２つの画分に分離させた。
【００７４】
上清１は、３４８０ｍｇ Ａｇ／Ｌを含むことがわかった。
【００７５】
２００ｍＬの２５％ Ｈ２ＳＯ４液に１０Ｎ ＮａＯＨを中和滴定することによって上清１中のナノ銀を沈殿させた。ナノ銀を凝集させ、重力沈降、または塩を豊富に含むブラインからの遠心分離によって採取される。これらのフロックを脱イオン水で２回洗浄し、１１，８００ｇの遠心分離によって洗浄水から分離した。洗浄ステップ後、ナノ銀を容易に水に分散させることができ、目に見える凝集なしに安定したコロイド縣濁液を形成することができる。結果生じた「抽出バイオナノ銀」は、大量の有機生物由来材料（表４における「抽出されたバイオナノ銀」の下に示されている）に結合していることがわかった。５分間の３０００ｇにおける画分遠心法によって、（ＩＲ分光分析によって検知可能な）有機材料の有効な生物由来被膜を含む微小の銀ナノ粒子の画分を、有機材料の含有量が少ないナノ粒子画分（洗浄後の抽出バイオナノ銀として表４に示されたもの）から分離した。抽出バイオナノ粒子に連結された材料のＳ含有量は、脱イオン水での洗浄後に比較すると、スフリック（suphuric）酸を用いて抽出ステップを実行した場合とリン酸を用いて実行した場合では、同じであった。これは、抽出画分における生体成分から生じたＳ成分が、（ＦＴ）ＩＲによって測定されたタンパク性物質の一部として抽出されることを示す。
【００７６】
上記のように採取されたナノ銀は、優れた分散特性をもち、０．９〜７ｎｍの範囲内の大きさを有することがわかった（図１）。最終洗浄沈殿物におけるナノ銀は、ＩＲ分光分析によっては、連結された検出可能量の有機材料を生じさせなかったが、ＥＤＸによっては、表４（洗浄後の抽出バイオナノ銀）に示されたような検出可能な有機層が存在した。
【００７７】
電子顕微鏡検査法を用いて、沈殿物において採取された抽出生体成分を検査した。残りのラクトバチルス・ファーメンタム(lactobacillus fermentum)バイオマスのＯＣＣが破裂したことがわかり、ＯＣＣ内部からナノ銀を除去した。
【００７８】
〔表４〕
Lin et al.（２００５）に記載された方法によって生成されたラクトバチルス・ファーメンタム(lactobacillus fermentum)由来のナノ銀と比較した、本方法によって生成されたバイオナノ銀の定量的エネルギー分散型Ｘ線分析
【００７９】
【表６】
【００８０】
残りの生体成分をさらに抽出し、残りの細菌構造（とりわけ、細胞質）から、残留銀ナノ粒子を除去した。
【００８１】
３０１６ｍｇ／Ｌ Ａｇを含む縣濁液に５０ｍＬのＨ２ＳＯ４（９８％）を加え、沈殿物１を均質化した。上記均質化は、２０℃、１６時間の反応で得られる。１１，８００×ｇの遠心分離を３０分間実行した後、上清１および沈殿物１が分離した。電子顕微鏡検査によって、沈殿物１を検査した。２０〜２００ｎｍの大きさの銀ナノ粒子は、生体成分の残留画分間にて凝集した。ＩＲ分光分析によって、これらのナノ粒子の有機結合が確認された。銀質量バランスの観点において、当該実験から以下のスキームを導いた。
【００８２】
【表７】
【００８３】
Ａｇの総重量の約６０％が、２５％のＨ２ＳＯ４中の第一抽出ステップによって回復し、有機残留物と銀ナノ粒子の混合物が生じた。当該ストリームから、微分抽出および上述した脱イオン水による洗浄ステップを用いて銀ナノ粒子をさらに精製した。結果生じた銀ナノ粒子縣濁液は、ＥＤＸ（表４）、電子顕微鏡分析、ゼータ電位、ＵＶ分光分析、ＸＤＲ、比表面積測定（表５）、ＩＲ分光分析、毒性（表６）および抗菌効果（表７）によって特徴づけられた。
【００８４】
１１８００ｇの遠心分離にて、抽出銀ナノ粒子を含む最終縣濁液を例えば１８９３１ｍｇ Ａｇ／Ｌに濃縮させた。
【００８５】
３．定量的エネルギー分散型Ｘ線分析
ＥＤＸ検出器を備え、入射エネルギー２０．０ｋｅＶに相当する１２９．６８ｅＶの ＥＤＸ分解能をもつＦＥＩ ＱＵＡＮＴＡ ２００Ｆ走査電子顕微鏡 （ＥＤＡＸ Ｇｅｎｅｓｉｓ ４０００）を用いて、３０℃の温度下にて乾燥させたバイオナノ銀または生体成分のエネルギー分散型Ｘ線（ＥＤＸ）分析を行った。その結果を表４に示す。
【００８６】
４．（ＦＴ）ＩＲ分光分析
本方法に係る、ラクトバチルス菌生体成分から抽出されたバイオナノ銀の（ＦＴ）ＩＲ分光分析。このバイオナノ銀は、細胞外壁、すなわち糖衣、細胞外被および／またはＳ−層から生じる。有機物に結合され、３，０００×ｇの遠心分離において水中で安定状態である抽出バイオナノ銀を（ＦＴ）ＩＲを用いて分析した。
【００８７】
１６０１ｃｍ−１および１６３３ｃｍ−１の吸収帯は、１５９３ｃｍ−１におけるトランス-[Cu(gly)2]または １６４２ｃｍ−１におけるトランス-[Pd(gly)2]などの金属ビス（アミノ酸）錯体によって配位されたアミノ酸のυ(C=O)特性である。１６０１での帯は、当該金属ビス（アミノ酸）錯体のNH2 架橋δ(NH2)に役立つ。アミノ酸の金属錯体は周知であり、アミノ酸錯体のυ(CO2)は、Ｃ＝Ｏ塩基の配位が隣接した分子に水素結合されるか、または隣接した錯体の金属に弱結合されるので、配位または分子間相互作用の影響を受ける。１４０２ｃｍ−１の帯は、金属において配位されたアミノ酸ＣＯＯ塩基のυ(C-O)についての特徴である。振動帯のいくつかが、略中性ｐＨでのバイオナノ銀の負の電荷により、より低い波数に変化する。
【００８８】
Ｓ−層、糖衣から生じた、または、ペプチドグリカンからの糖タンパクまたはペプチド残基から生じた抽出バイオナノ銀に結合されたアミノ酸およびタンパク質の存在は、脂肪族Ｃ−Ｎ伸縮振動帯である１０３０ｃｍ−１の強帯、および第二アミンの伸縮振動帯である２９２２ｃｍ−１の強帯から導かれる。
【００８９】
これら残りのペプチドまたはアミノ酸は、銀粒子に対して安定化効果を及ぼし、負の電荷を帯びた糖衣材料の中性化によって、より高いｐＨでの等電点に接続された銀表面電荷の測定を助けると考えられる。
抽出ステップの間に、２５％のＨ２ＳＯ４を使用した。最終（洗浄）バイオナノ銀抽出液中にＳＯ４２−が存在しないことがイオンクロマトグラフィー分析によって示されるが、ＦＴ（ＩＲ）スペクトラムから導かれ得る：１１０４ｃｍ−１において結合帯ＳＯ４２−が存在しない。
【００９０】
５．透過電子顕微鏡法
ＴＥＭ分析を用いて薄片を準備するために、２．５％のグルタルアルデヒドおよび２％のホルムアルデヒドを含む０．１Ｍのカカオダイレイト（cacao dylate）にサンプルを固定し、Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ(Ｄｅｔｒｏｉｔ， Ｍｉｃｈｉｇａｎ， ＵＳＡ)製の３％の低濃度の融解アガロースに埋め込んだ。その後、これらのサンプルを１％の四酸化オスミウム中にて固定した。固定化ステップの前後に、サンプルを蒸留水で洗浄した。その後、サンプルをエタノール量の増大、および最後には無水酸化プロピレンにおいて脱水した。Epon-Spurr媒体に埋め込んだ後で、TM６０トリミングユニット（Reichert-Jung A.G.製 オーストリア ウィーン）を用いて標本ブロックを調整し、０．５×１ｍｍ２〜１×２ｍｍ２の切断面を得て、Reichert-Jung A.G.製（オーストリア ウィーン）のUltracutミクロトームを用いて、金からマット銀の色範囲の接触面における超薄切片を切断した。当該切片をピオロフォームおよび炭素被覆した銅グリッド（２００メッシュ）上に配置した。これが完了すると、切片を２％の酢酸ウラニル、さらにクエン酸塩を用いて染色し、細胞の超微細構造を測定した。Ａｇａｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（英国スタンステッド）から化学物質およびグリッドを得た。ＥＭ２０８Ｓ透過型電子顕微鏡（ＦＥＩ製 オランダ エンドホーベン）を８０ｋＶにて動作させて画像化を行った。
【００９１】
ナノ粒子に関して、サンプルをホモ生成ピオロフォームおよび炭素被覆した銅ＥＭグリッド上に配置した。親水性を上げるために、アルシアンブルーを用いてグリッドを前処理しておいた。
【００９２】
Ｂｉｏｔｗｉｎレンズ構造をもつＴｅｃｈｎａｉ １２ Ｓｐｒｉｔ顕微鏡（ＦＥＩ）を用いて、１２０ｋＶおよび倍率４３ｋｘにてサンプルを検査した。倍率４９ｋｘにて、Ｂｏｔｔｏｍ−ｍｏｕｎｔｅｄ Ｅａｇｌｅ４×４Ｋカメラを用いてデジタル顕微鏡写真を作成した。Ａｎａｌｙｓｉｓ ３．２ Ｐｒｏ ｓｏｆｔｗａｒｅを用いてそれらを分析した。マニュアル閾値法を使用した。ボーダー粒子および２５ピクセル未満の粒子を除く粒子を、既定のフレームにおいて検出した。選択された顕微鏡写真におけるフレームを分析し、サンプル毎に＞１００分析粒子が生じた。各粒子について、平均直径、面積、球形度、平均濃淡値、凸状を測定した。
【００９３】
６．ゼータ電位の測定
４つの異なるサンプルについて、ｐＨ範囲を３〜９に設定した。対象サンプルは、
（ｉ）ナノ銀を有するラクトバチルス・ファーメンタム(lactobacillus fermentum)Ｇ２／１０生体成分；
（ｉｉ）０．９〜７ｎｍの範囲内の微小の銀ナノ粒子を含む、上記に詳述した方法に従って生体成分から抽出したナノ粒子；
（ｉｉｉ）２０〜２００ｎｍの範囲内のより大きい銀粒子を含む、抽出後の生体成分の残留画分；および
（ｉｖ）化学的に調製されたナノ銀
であった。
【００９４】
Ｈ２ＳＯ４およびＮａＯＨを強希釈液で使用して、ｐＨ範囲を設定した。第二検査範囲では、推定等電点の周りのより狭いｐＨ範囲を設定した。サンプル間の導電性の差異は、最大１ログユニットであり、常に５０〜５００μＳ／ｃｍの範囲内であることが注意深く決定された。検査を実行して再現性を測定し、結果は良好であった（データは図示せず）。希釈液の効果についても記録した。
【００９５】
異なるサンプルから５ｍｌを注入し、２５℃の温度下にて、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ ＩＩｃ(Ｍａｌｖｅｒｎ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）装置を用いて、それぞれｐＨ３、５、７および９にて測定し、Ｈｅｌｍｈｏｌｔｚ−Ｓｍｏｌｕｃｈｏｕｓｋｉ方程式
【００９６】
【数１】
【００９７】
を用いて２０００Ｖｍ−１の電界強度を印加した。μは、電気泳動移動度（ｍ２ｓ−１Ｖ−１）であり、ε０は真空誘電率（Ｃ２Ｊ−１ｍ−１）であり、εｒは誘電定数であり、ζは、ζ−電位（Ｖ）であり、ηは粘度（ｋｇｍ−１ｓ−１）である。
【００９８】
第三検査では、化学的に調製されたナノ銀のＩＥＰ測定についてｐＨ範囲を３未満に広げた。
【００９９】
粒子が１０ｎｍよりも大きい場合、１．５の補正率を適用した。等電点は、化学的に調製されたナノ銀：１．７５、ＯＣＣから抽出されたナノ銀：４．１であり、より大きいナノ粒子を持つ残りの生体成分：５．３であるように決定された。
【０１００】
７．ＵＶ−ＶＩＳ分光分析
表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）は、変化する電界および磁界放射の適用中における、伝動バンドでの電子振動の周波数である。自由電子をもつ金属（Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕ、およびアルカリ土類金属）のみが、可視領域におけるＳＰＲを示し、その結果強烈な色彩が生じる。粒子形状および粒径の次に、隣接する銀ナノ粒子間の平均距離だけでなく、媒体の屈折率もスペクトル特性に影響を及ぼす。希釈分散における球形粒子のＳＰＲは、Ｍｉｅ理論に基づいて説明される。異方性粒子に関しては、Ｇａｎｓ理論が用いられる。より大きい粒子がより高い波長、および何らかのより広いＳＰＲ範囲への赤方偏移を引き起こす。銀ナノ粒子の量が多いとき、隣接する粒子間の双極子相互作用が生じ、Ｍｉｅ理論はもはや適用されない。安定化剤または界面活性剤は、ＡｇおよびＡｕゾルの粒度分布が同じであっても、吸収スペクトルに影響を及ぼす。
【０１０１】
銀ナノ粒子は、プラスモン共鳴によって電磁スペクトル（３８０〜４５０ｎｍ）の可視領域に吸収される。それによって、強烈な黄褐色の銀ナノ粒子が生じる。
【０１０２】
ＵＶおよび可視光線の吸収スペクトルを異なるナノ銀調製と比較した。サンプルを４０ｍｇＡｇ／Ｌになるように蒸留水で希釈した。Ｕｖｉｋｏｎ９３２スペクトロメータ（Ｋｏｎｔｒｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて、波長走査を行った。データ範囲は１ｎｍであり、走査範囲は２０〜８００ｎｍであり、走査速度は２００ｎｍ／分である。１ｍＬサンプルを含むように石英キュベットを使用した。
【０１０３】
抽出したバイオナノ銀に関して（洗浄後に）ＵＶ−ＶＩＳ吸収スペクトルを分析し、上記に詳述した方法に従ってＧ２／１０生体成分において（１）に従って調製されたナノ銀、Ａｑｕａ Ａｒｇｅｎｔｕｍからの市販サンプル、および従来技術に係る、凝集することがわかっているナノ銀分散液を調製した。全てのサンプルが４０ｍｇＡｇ／ＬのＩＣＰ−ＭＳによって測定された銀濃縮液を含んでいた。
【０１０４】
生体成分におけるナノ銀の吸収スペクトルは、最大吸収４２５ｎｍでの広域の吸収ピーク、および、２６５ｎｍの他の吸収ピークを示す。後者のピークは、核酸、タンパク、および生体成分に存在する様々な有機種に起因する可能性がある。
【０１０５】
抽出されたバイオナノ銀のＵＶ−ＶＩＳ吸収スペクトルは、上述のように調製され、４２８ｎｍにて集められた明確なプラスモン共鳴帯を示す。当該最大値は、２６５ｎｍのピークよりも高い強度をもち、生体成分におけるナノ銀のスペクトルと比較して相対的に少ない面積での様々な有機種の存在を示す。ＳＰＲピークは、生体成分におけるナノ銀のＳＰＲピークの範囲内では、随行せず、より純度が高く、より凝集が少ない製品の指標となった。
【０１０６】
Ａｑｕａ Ａｒｇｅｎｔｕｍサンプルでは、４０ｍｇ／Ｌ Ａｇに関しての測定値は極めて低いもののみであった。最大吸収は、４３９ｎｍにおいて測定された。従来技術に従って調製されたサンプルは、ＳＰＲに関する代表的なＵＶ−ＶＩＳ吸収スペクトルを示さなかった。これは、ナノ銀の大きい凝集体への凝集に関する。結合された有機材料を高濃度含有する画分を洗い流す画分遠心法の前の（２）に記載された方法に係る抽出されたバイオナノ銀のＵＶ−ＶＩＳ吸収において、２１２ｎｍの最大吸収をもつピークが見られ、これは、他の全てのスペクトルには見られなかった。当該ピークは、Ａｇ＋イオンの４ｄ１０および４ｄ９ Ｓ１遷移である可能性がある。当該データは、Ａｇ０ナノ粒子からのＡｇ+希釈液から生じたＡｇ+層に結合されることから、抽出されたバイオナノ銀の高い抗菌効果に相関している可能性がある。
【０１０７】
８．Ｘ線回折分析
３０℃にて乾燥させたバイオナノ銀または生体成分のＸ線回折（ＸＲＤ）は、ＢＲＵＫＥＲ Ｄ８ Ｄｉｓｃｏｖｅｒを用いて実行された。電力１．６ｋＷ（４０ｋＶ、４０ｍＡ）の銅Ｘ線チューブによってＸ線を生成した。波長ＣｕＫαは、１．５４Åに対応していた。１５３．６秒のステップ時間、および０．０２°２θのステップサイズにて、２５〜９０°２−θ間の測定を行った。ＸＲＤスペクトルは、純粋な元素Ａｇ（０）の存在を示した。
【０１０８】
９．比表面積
遠心分離によってバイオナノ銀または生体成分サンプルを水分散から分離させ、エタノールを用いた複数回の洗浄および遠心分離ステップによって残りの水を除去した。その後、アセトン中にてサンプルを再縣濁させた。そして、サンプルをＪｕｗｅ Ｌａｂｏｒｇｅｒａｅｔｅ ＧｍｂＨ（Ｖｉｅｒｓｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）のＢＥＴ−Ａ−ＭＡＴ Ａｒｅａｍｅｔｅｒ ＩＩから目盛り付きガラス容器に移した。容器内のサンプルをさらに９０℃にて乾燥させた。
【０１０９】
サンプルが完全に乾いたら、Ｎ２気体流下にてサンプルを２４時間飽和させた。測定を始める前に、室温に達するまで、２０分間水槽においてサンプルを冷却した。測定開始時に、容器を３分間液体窒素に浸し、粒子表面のＮ２分子を脱着させた。したがって、圧力計を用いて生成された超過気圧を測定し、サンプルの比表面積に変換した。
【０１１０】
表５では、上述した方法に従って生成された抽出バイオナノ銀、および従来技術に基づくＡｇ吸着をもつ全ラクトバチルス・ファーメンタム(lactobacillus fermentum)Ｇ２／１０生体成分の結果について示す。抽出バイオナノ銀は、５８．６ｍ２／ｇの高い比表面積をもつ。文献では、粒径約３０ｎｍのナノ銀について、２０ｍ２／ｇの比表面積が記載されている。興味深いことに、従来技術に係る製品の表面積は、約２０ｍ２／ｇであり、バイオマスの周りに形成されたナノ粒子は、電子顕微鏡法によって観察されたように、ほぼ同じ大きさである。ナノ銀について、例えば１５８ｍ２／ｇなどのより高い比表面積が説明されている。
【０１１１】
〔表５〕
Lin et al.(2005)によるラクトバチルス・ファーメンタム(lactobacillus fermentum)において生成されたナノ銀と比較したときの、本方法によって生成されたバイオナノ銀のBrunauer, Emmett, Teller (BET) N2気体吸収等温法による比表面積測定
【０１１２】
【表８】
【０１１３】
１０．毒性および課題検査
毒性検査では、１５ｍｇ／Ｌ以下のバイオナノ銀（Ａｇ）の濃度では、アルテミア・フランシスカナ（Artemia franciscana）のハッチング、成熟段階への成長および進化を大きく変更させないことがわかった。したがって、アルテミア・フランシスカナ（Artemia franciscana）に対するＭＩＣは、＞１５ｍｇ／Ｌ（検査における最大濃度、表６ａ）であると測定された。
【０１１４】
〔表６ａ〕
甲殻類および植物に対する、本方法によって生成されたバイオナノ銀の最小阻害濃度（成長阻害）として表された毒性データ
【０１１５】
【表９】
【０１１６】
ニコチアナ・タバカム（Nicotiana tabacum）、および感受性双子葉植物における成長阻害を評価するために、タバコ植物の培養地に水を遣るのに使用される水の中での異なる濃度のバイオナノ銀の効果について、種子発芽、および植物の成長への影響という観点から評価した。全ての実験について４つの複製を設定し、５週間観察した（２５℃）。４ｍｇ／Ｌ（検査における最大濃度）以下の濃度のバイオナノ銀を５週間加えた後、タバコ植物の発芽、または大きさに影響はなかった。したがって、ニコチアナ・タバカム（Nicotiana tabacum）に対するＭＩＣは、＞４ｍｇ／Ｌ（表６ａ）であると測定された。
【０１１７】
したがって、バイオナノ銀の重要な利点は、短期間の検査における甲殻類および感受性植物に対するｐｐｍ範囲における毒性が限定的であることにある。さらなる検査では、病原性ビブリオキャンプベリ（campbellii）を用いた検査におけるアルテミア・フランシスカナ（Artemia franciscana）の生存率を向上させるバイオナノ銀の能力を調査した。アルテミア・フランシスカナ（Artemia franciscana）課題検査のために、オートクレーブ反応器にてミリＱ水中で滅菌人工海水（Ａｑｕａｒｉｕｍ ｓｙｓｔｅｍｓ ＵＳＡから入手可能なＩｎｓｔａｎｔ Ｏｃｅａｎ）を調製した。５０ｍＬのファルコンチューブに収容された２０ｍＬアリコートの滅菌人工海水において全処理を設定した。（３回実施された）各処理は、２０ｍＬの人工海水中の２０無菌アルテミア・ノープリウス（Artemia nauplii）からなり、１０５ＣＦＵ／ｍｌ(コロニー形成ユニット) ビブリオ・キャンプベリ（Vibrio campbellii）ＬＭＧ２１６３、および／または、２０ｍｇ Ａｇ／Ｌの最終濃度にて（２）から得られた抽出バイオナノ銀を混合して与えた、または、対照処理においてはそれらを与えず、無菌状態を保った。
【０１１８】
〔表６ｂ〕
本発明に係る２０ｍｇ／Ｌのバイオナノ銀（Ａｇ）による病原性ビブリオ・キャンプベリ（Vibrio campbellii）からのアルテミア・フランシスカナ（Artemia franciscana）の保護（３つの反復における平均＋／−標準偏差）
【０１１９】
【表１０】
【０１２０】
アルテミア・フランシスカナ（Artemia franciscana）に対する病原性ビブリオキャンプベリＬＭＧ２１６３の処理において、平均して７５％以下の死亡率が得られ、これは、対照処理における死亡率よりもずっと高かった（２５％）。２０ｍｇ／Ｌのバイオナノ銀（Ａｇ）を加えることにより、生存率（Ｐ＜０．０５）は７５％から平均３３％に大幅に減少した。
【０１２１】
１１．最小阻害濃度
異なる細菌および菌類に対するナノ銀の最小阻害濃度（ＭＩＣ）、すなわちこれらの微生物の発育阻害を示す最小濃度の測定に関して、以下のプロトコルを使用した。
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ (ＪＡＣ 〔２００１〕 ４８， Ｓｕｐｐｌ． Ｓ１)， Ｍａｒｃｈ ２００６， Ｃｈａｐｔｅｒ ２： Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｎｉｍａｌ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ； Ｍａｃｒｏｄｉｌｕｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ．
スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）, シュードモナス・アエルギノザ（Pseudomonas aeruginosa）およびカンディダ・アルビカンス（Candida albicans）の培養液を一晩成長させ、（６１０ｎｍにて測定された光学密度に基づいて）ｍＬ当たり、１５０×１０６細菌細胞または５×１０６酵母細胞に希釈した。１〜１０および１〜５のステップにおいて、これらの保存溶液をさらに５００倍に希釈した。その後、最終培養液を最終マイクロタイタープレートにおいて２倍に希釈し、１：１０００の最終希釈液を得た。
【０１２２】
０．５〜４７０ｍｇ／Ｌ Ａｇの濃度範囲にて、検査化合物をマイクロタイター培養液に希釈した。その後、マイクロタイタープレートを攪拌器にかけて３０℃にて培養した。２４時間後、プレートを培養オーブンから取り出し、その成長を視覚的、および６１０ｎｍでのＯＤ測定の両方を用いて対照列と比較した。
【０１２３】
アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）について、ＭＥＡ寒天プレートにおいて１週間培養させた培養液を以下のように採取した。黒色胞子を採取するために、１０ｍＬの０．０５％Ｔｗｅｅｎ８０水溶液をプレートに注ぎ、無菌のスパチュラを用いて胞子を注意深く滅菌水と混合した。胞子を菌糸から除去するために、黒色縣濁液をピペットで吸い出してガラスパールを含む滅菌三角フラスコに注入し、１分間ボルテックスさせた。最終縣濁液を５０μｍのカットオフ無菌フィルタを用いて濾過した。顕微分析を行い、全ての菌糸が除去されたことを確認した。胞子培養液の最適密度は、６１０ｎｍにて測定され、５×１０６胞子まで希釈された。そして、当該縣濁液を５０倍に希釈した。その後、最終マイクロタイタープレートにおいて最終培養液を再び２倍に希釈し、最終希釈１：１００を得た。
【０１２４】
バイオナノ銀の除藻特性を以下のように測定した。１０ｍＬ ＢＧ１１培地（Stanier et al. 1971）を含む検査チューブを、活発に発育するクロレラ・ブルガリス（Chlorella vulgaris）の０．５ｍＬの液体ＢＧ１１培養液を接種し、２０℃の温度下で６５％の相対湿度、および１０００Ｌｕｘ（１６時間／日）にて培養させた。分光光度測定を用いて、２週間後の成長を評価した。２０ｍｇ Ａｇ／Ｌ〜０．０１ｍｇ Ａｇ／Ｌの範囲内の異なる濃度のバイオナノ銀製剤を検査チューブにおける用量によって検査した。ＭＩＣ値は、微生物成長の完全な阻害が見られた最低検査濃度である。バイオナノ銀製品のＭＩＣ値を表７ａに示す。
【０１２５】
〔表７ａ〕
従来技術の方法によって化学的に調製されたナノ銀、硝酸銀、および文献に記載されたデータと比較した場合の、本方法によって生成されたバイオナノ銀の異なる画分についての、複数の細菌、酵母およびカビ菌に対する最小阻害濃度（ＭＩＣ）
【０１２６】
【表１１】
【０１２７】
合計５つの異なる銀ベース化合物を検査し、比較した。本発明を用いて得られた３つの異なるナノ銀画分を比較した。
ｉ）抽出前の生体成分におけるナノ銀
ｉｉ）（０．９〜７ｎｍの粒子を含む）生体成分から抽出されたナノ銀
ｉｉｉ）より大きい銀粒子２０〜２００ｎｍを含む抽出後の残留生体成分
上記３つの画分を従来技術の方法を用いて化学的に調製されたナノ銀、および硝酸銀と比較した。従来技術に基づいて調製されたナノ銀は、非常に凝集を生じやすいことがわかった。
【０１２８】
文献に挙げられた値と比較したＭＩＣ検査を表７ａに示す。
【０１２９】
Ｇ２／１０株を用いた従来技術の方法によって調製されたナノ銀のＭＩＣ値は、硝酸銀のＭＩＣ値（結果は図示せず）と大差がないことがわかった。これは、当該製品におけるＸＲＤ分析、電子顕微鏡法、およびＥＤＸ分析と合致しており、小さい画分のＡｇ+のみがＡｇ０に変換されることを示し、ＡｇＮＯ３からのＡｇ+の活動と比較可能であった。
【０１３０】
表７ａの結果から、抽出ナノ銀は生体成分におけるナノ銀よりも反応性が高く、菌類に対するＭＩＣ値は２分の１であるという結論を導くことができる。抽出ナノ銀は、P. aeruginosa、C. albicans、A. nigerに対して硝酸銀よりも反応性が高いが、S. aureusに対してはAgNO3 よりも低い。従来技術に従って調製されたナノ銀は、抗菌作用が極めて低く、これは凝集が原因と考えられる。＞２０ｎｍの銀ナノ粒子を含む抽出後の残留生体成分は、第一抽出ステップから得られたより小さいナノ銀よりも効果的ではないが、微生物に対して極めて効果的であった。
【０１３１】
ナノ銀および銀ベースの活性の抗菌作用に関してよく生じる問題は、概して、菌類に対する易感染性抗微生物効果であり、これは、抗微生物効果よりもずっと低いことが多い。これによって、抗微生物効果に必要な銀の用量よりも酵母菌またはカビ菌に対する抗真菌効果に必要な銀の用量が多くなる。両方の効果を同時に必要とする場合が多いので、銀の総用量は菌類に対する抑制効果によって決定される。また、当該効果は、従来技術の方法によって得られたナノ銀について見られた。このとき、Aspergillus nigerに対するＭＩＣは４００ｍｇ Ａｇ／Ｌを上回っていた。表７ａの結果から、抽出ナノ銀は、ＭＩＣが４．３ｍｇ Ａｇ／Ｌを用いた場合、グラム陽性菌Pseudomonas aeruginosaに対するよりも、カビ菌Aspergillus nigerに対する方が効果的であることが観察された。一方、ＭＩＣ値がそれぞれ１０および１７．３ｍｇ Ａｇ／Ｌである場合、酵母菌Candida albicansに対する効果は、グラム陽性菌Staphycococcus aureusに対する効果よりも高かった。
【０１３２】
１２．ゼオライトを用いた検査
当該技術分野、特にプラスチック、ポリマー、封止剤、織物繊維または塗料における配合された殺生剤として銀ベースの活性剤を使用する分野においてよく生じる問題は、当該製剤からＡｇ+が欠乏することにある。これは、例えば広範囲のＡｇ+にて市販されているＡｇ+ゼオライトなどのＡｇ+ベースのイオン交換担体、ミネラルまたは樹脂に特に当てはまる。製剤からＡｇ+が急速に欠乏すると、製剤の抗菌効果が欠失し、微生物群を完全に破壊するには不十分なＡｇ+が放出される。この微生物群は、Ａｇ+の抵抗性を構築するのに貢献する可能性がある。これは、陽イオン強度の高い溶媒を製剤上に流す場合には特に当てはまり、Ａｇ+が高濃度存在する陽イオンの樹脂または担体から交換される。代表例は、抗微生物塗料を含み、例えば海水などの塩水に曝露されることによる生体劣化または生物付着を防止する。他の例では、長期に渡って人の汗に曝露される抗微生物織物繊維の曝露である。このような場合、Ａｇ+製剤は、Ａｇ+を急速に消費する。より制御されたＡｇ+放出は、銀ナノ粒子の使用によって維持される。ゼオライトを用いた本方法によって得られたバイオナノ銀を混合するという概念について、詳しく検証した。ゼータ電位測定、比表面積、ＥＤＸ、Ｆ（ＦＴ）ＩＲおよび電子顕微鏡法（ＴＥＭ）によって示された比表面特性をもち、菌類、微生物および藻類に対して優れた抗微生物特性をもつバイオナノ銀は、Ｚｅｏｌｉｔｈ Ｎ(Ｚｅｏｌｉｔｅ Ａｌｕｍｉｎｉｕｍ ｓｉｌｉｃａｔｅ， Ｅｖｅｒｓ Ｅ．Ｋ．， Ｈｏｐｓｔｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ)に被覆された。１０，３８５ｍｇ Ａｇ／Ｌの２０ｍＬバイオナノ銀分散液と１０ｇのZeolith Nとを３０分間混合させ、結果得られた縣濁液を１０５℃の温度下のオーブンにおいて乾燥させた。結果得られたゼオライト粉末は、均一的にライトグレイの色であり、水洗浄によってゼオライトマトリクスからバイオナノ銀を除去することができた。当該ゼオライトは、２％重量のＡｇを含んでいた。
【０１３３】
ゼオライトマトリクスからのＡｇ欠乏における陽イオン強度の高い水の効果を検査するため、２８℃にて攪拌することによって、体積１のバイオナノ銀ゼオライトを体積１０の滅菌人工海水（Ａｑｕａｒｉｕｍ ｓｙｓｔｅｍｓ ＵＳＡから入手可能なＩｎｓｔａｎｔ Ｏｃｅａｎ)で洗浄した。バイオナノ銀ゼオライトの遠心分離および再縣濁によって、洗浄水を２４時間毎に入れ替えた。同様の検査を、２％Ａｇ+重量を含むＳａｎｉｔｉｚｅｄ ＡＧ製の市販のＡｇ+ゼオライト混合物に関しても繰り返した。
【０１３４】
カビ菌類Aspergillus nigerに対するＭＩＣ値を人工海水による洗浄前後に測定した。消毒済みのＡｇ+ゼオライトのＭＩＣ値は、複数の洗浄ステップ中に増加し、一方、バイオナノ銀ゼオライトのＭＩＣ値は殆ど変わらないことがわかった。表７ｂに塩水への曝露後７２時間の結果を示す。これらの結果は、バイオナノ銀の抗菌作用が、ゼオライトのような多孔性担体に固定されたとき、高濃度の塩水への曝露に対し優れた効果をもつことを示す。これは、Ａｇ+ゼオライトイオン交換システムと比較したとき、これらの条件下でのＡｇ+放出をより制御でき、イオン交換の効果の制約が少ないからである。
【０１３５】
〔表７ｂ〕
滅菌人工海水（Ａｑｕａｒｉｕｍ ｓｙｓｔｅｍｓ ＵＳＡから入手可能なＩｎｓｔａｎｔ Ｏｃｅａｎ）への曝露前後での、２％のＡｇ添加におけるイオンＡｇ+ゼオライトと比較した場合の、本願に係るゼオライトのバイオナノ銀から得られたＭＩＣ間の比較
【０１３６】
【表１２】
【０１３７】
１３．ポリマーを用いた検査
上述した本発明の方法によって得られるバイオナノ銀を、それぞれ１００ｍｇ／ｋｇおよび１０００ｍｇ／ｋｇの濃度にて水性アクリル酸Ｒｈｏｄｏｐａｓ Ｕｌｔｒａｆｉｎｅ ＰＲ３５００ (Ｒｈｏｄｉａ， Ａｕｂｅｒｖｉｌｌｉｅｒｓ， Ｆｒａｎｃｅ)に分散させた。ナノ銀をもつポリマーは、パッドを５秒間ポリマー溶液に浸し、その後１００℃の温度下のオーブンにて２４時間乾燥させることによって、５ｍｍの厚さの多孔性ポリプロピレン繊維パッドに被覆された。
【０１３８】
（例えばレストランにおける）自動容器の内部に成長するバイオフィルムによるソフトドリンクの汚染は、実務上頻繁に発生する問題であるので、処理パッドと未処理パッドについて、ソフトドリンクの日常的な洗浄によるパッドの微生物汚染を比較した。
【０１３９】
処理および未処理ポリプロピレンパッドを小さいプラスチック漏斗に接着し、１０ｍｍの内径をもつプラスチックチューブによって１Ｌのソフトドリンク容器に接続させた。日常的に、１００ｍＬのソフトドリンクをポリプロピレンパッド上に流し、その後、１００ｍＬの水道水を流した。二日目から、１０ｍＬの水のサンプルを採取し、総微生物数を測定するために、Ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ Ｓｏｙ 寒天プレートに希釈系列を配置した。結果を表８に示す。
【０１４０】
〔表８〕
ソフトドリンクによる洗浄直後の、ＰＲ３５００によって処理されたポリプロピレン繊維パッドにおいて測定された微生物負荷についてのポリマーＲＨＯＤＯＰＡＳ ＰＲ ３５００ (Ｒｈｏｄｉａ， Ｆｒａｎｃｅ)における異なる濃度にて混合されたバイオナノ銀の影響
【０１４１】
【表１３】
【０１４２】
上記結果から、１０００ｐｐｍのバイオナノ銀（Ａｇ）に被覆されたポリプロピレンパッドにはバイオフィルムの形成は見られず、一方、未処理のパッドはソフトドリンクの微生物汚染の発生源となることがわかった。１００ｐｐｍのＡｇで被覆されたパッドは、４日間は無菌状態を保っていたが、未処理の対照パッドと同様に１週間以内に汚染された。これは、バイオナノ銀が富栄養の環境下でもバイオフィルムの形成を抑制し、表面およびアプリケーションにおける衛生状態を向上させることを示す。さらに、結果は、バイオナノ銀はアクリルエステルポリマーにおいても抗微生物活性を保つことを実証する。
【０１４３】
１４．加熱中の低濃度のＨＣｌを用いた生体成分の処理の効果
Ａｇ+からＡｇ０への変換効率において生体成分の酸性加熱分解の効果を算出するために、６０℃にて５分間、０．１Ｎ ＨＣｌを用いてＧ２／１０乾燥重量を処理した。その後、生体成分を５０００ｘｇにて遠心分離し、脱イオン水で洗浄し、（１）に示されたようなＡｇ０生産のために後鹸化および処理した。
【０１４４】
その後、得られたＡｇ+からＡｇ０への変換効率を、同じ生体成分を含むとともに同一の条件下で実施するが、６０℃での０．１Ｎ ＨＣｌを用いた処理を用いた生体の処理を含まない処理と比較した。
【０１４５】
Ａｇ０への変換効率は、反応混合物における残留Ａｇ+の測定によって比較によって決定された。
【０１４６】
各反応液に投与された１０００ｍｇ Ａｇ+／Ｌの濃度から、本方法に係るＡｇ０生成処理後に、６０℃での０．１Ｎ ＨＣｌを用いて生体成分を処理した場合、酸性加熱分解ステップをしないものと反応を比較すると、反応混合物の溶液中の残留が１３８ｍｇＡｇ+／Ｌ少ないことがわかった。これは、鹸化の前に弱酸性の加熱分解ステップによって生体成分を処理する場合、Ａｇ+からＡｇ０への変換効率がより高くなることを示す。
【図面の簡単な説明】
【０１４７】
【図１】複数のＴＥＭマイクロコピー分析から得られた、ラクトバチルス・ファーメンタム(lactobacillus fermentum)から抽出されたバイオナノ銀の粒径分布を表す。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、特定の物理特性、特に比表面積特性および／または等電点を示す銀ナノ粒子に関する。本発明は、銀ナノ粒子、および当該銀ナノ粒子を含む抗菌性組成の新規な製造方法に関する。
【０００２】
〔本発明の背景〕
銀ナノ粒子は、ナノ材料の新興分野における様々な用途に用いられる。例えば、銀ナノ粒子の用途は、配合バイオサイド、抗菌剤、および殺菌剤、電子試薬、銀導電性インク、医療用途、創部の治療、ソーラーパネル、およびスマートグラスを含む。
【０００３】
水溶液および有機溶液中の低濃度の銀ナノ粒子は、（物理）化学的な方法、または光化学的な方法を用いて容易に調製可能であるが、当該粒子のスケールアップを行う際には、バッチ間からの格差を回避するために、実験条件を注意深く制御する必要がある。概して、試薬のモル濃度の上昇に伴い、粒径が増大し、粒子間の凝集が増大する。ナノ粒子の利点はその粒径にあることから、上記結果は不要な特性である。
【０００４】
代表的な化学的製造工程では、銀塩の希釈液、界面活性剤またはキャッピング剤、および還元剤が必要とされる。ナノ粒子が生成される溶媒は、水またはＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）などの有機溶媒であってもよい。殆どの合成において、ナノ粒子の合成のための還元剤に加えて、適した界面キャッピング剤を使用することが記載されている。再乳化ナノ粒子粉末を得るために、ポリマーとともに有機化合物を頻繁に使用することが記載されている。通常、さらに小さい粒子を得るために、物理的テンパリングまたは熱プラズマ処理などの代替技術によって、当該粉末を後処理する。当該方法によって得られる表面積は、代表的には、約２０ｍ２／ｇを超えない範囲内であり、粒径は約３０ｎｍである。
【０００５】
水溶液および有機溶液中の低濃度の銀ナノ粒子を調製することは容易であるが、銀ナノ粒子の大きさを制御し、凝集を回避することを鑑みると、スケールアップは未だ困難である。さらに、重要な分野である配合バイオサイド、抗菌剤、および殺菌剤において銀ナノ粒子を使用することを鑑みると、銀ナノ粒子の抗微生物効率は極めて重要であり、ナノ粒子の物理化学的特性に密接に関係している。
【０００６】
本方法によって生成されたナノ粒子は、一般的に極めて高価であるので、ポリマーの用途は、in situでの銀ナノ粒子の生成に重点を置いている。母材としてのポリマーにおける銀ナノ粒子のin situ合成は、十分に確立されている。ナノ粒子がポリマーに埋め込まれる、あるいは封入される場合、ポリマーは界面キャッピング剤として機能する。ポリ（ビニルアルコール）やポリ（ビニルピロリドン）、ポリスチレン、ポリメタクリル酸、などのポリマーは、文献に記載された全ての適したポリマーである。
【０００７】
しかし、ポリマーマトリックス内で所望の形状、反応性、および粒度分布のゼロ価の銀を得ることは、高い技術を要する。さらに、当該手法には、ポリマーにおける銀ナノ粒子の安定性、およびポリマーの凝集体形成および最小酸化を防止するなどの重要な課題が残っている。したがって、銀ナノ粒子の特定の物理特性、特に比表面特性、および／または、等電点を向上させる技術、および銀ナノ粒子の製造方法を向上させる技術が必要とされている。
【０００８】
〔本発明の要約〕
第一形態では、本発明は銀ナノ粒子に関し、当該銀ナノ粒子において、平均粒径と比表面積（ＢＥＴ）との比率が０．０１５〜０．１５ｎｍ／ｍ２／ｇであり、および／または、銀ナノ粒子が３〜７の等電点を有する。他の形態では、本発明は、少なくとも２０％重量の細菌由来の生体成分から生成された銀ナノ粒子に関し、当該生体成分は、約０．３％重量の硫黄（Ｓ）を含む。
【０００９】
上記説明に係る銀ナノ粒子は、２０〜８０％重量、例えば３０〜７０％重量、または４０〜６０％重量のラクトバチルス属の生体成分と結合していてもよい。上記実施形態において、上記生体成分の重量比は、限定するものではないが、定量的エネルギー分散型Ｘ線分析などのいずれかの定量化手段によって測定されてもよい。本実施形態において、銀ナノ粒子は、細胞外被上または細胞外皮内、あるいは生体成分のＳ−層もしくは糖衣上またはその中に分散されてもよい。
【００１０】
本発明の上記実施形態のいずれかに係る銀ナノ粒子は、好適には、平均粒径が１〜８ｎｍ、例えば２〜６ｎｍである。本発明の上記実施形態のいずれかに係る銀ナノ粒子は、好適には、３０〜９０ｍ２／ｇ、例えば３５〜８５ｍ２／ｇ、または４０〜８０ｍ２／ｇの比表面積（ＢＥＴ）を示す。
【００１１】
第二形態では、本発明は銀ナノ粒子の製造方法に関し、当該方法は、
（ａ）アンモニアおよびアルカリ金属水酸化物の存在下において少なくとも４ｍＭの銀塩を含む水溶液を用いてラクトバチルス属の細菌を培養し、Ａｇ０銀ナノ粒子を含む細菌のバイオマスを形成するステップと、任意に、
（ｂ）濃縮アルカリ金属水酸化物、または濃縮無機酸または酵素を用いて、上記バイオマスからＡｇ０銀ナノ粒子を抽出するステップを含む。
【００１２】
本方法の好適な実施形態では、上記培養ステップ（ａ）に使用される細菌は、（限定するものではないが）例えばＣ／Ｎ比が少なくとも１０：１条件下での発酵、例えば少なくとも２０ｇ／Ｌ、好適には５０ｇ／Ｌを上回る濃度での発酵性糖の存在下での発酵によって前処理し、当該細胞外被内に糖リッチ構造を増大させる。
【００１３】
本方法の好適な実施形態では、上記培養ステップ（ａ）に使用される細菌は、少なくとも約１０時間（例えば少なくとも１５時間、少なくとも２０時間）、および／または、約４℃〜約４０℃の範囲内の温度にて、当該細菌の乾燥重量が少なくとも約２００％、例えば少なくとも３００％に増大するまで発酵させることによって、前処理される。
【００１４】
本方法の他の実施形態では、上記培養ステップ（ａ）に使用される細菌は、糖衣、細胞外被、および／またはＳ−層の酸加水分解によって、例えば約３５℃以上の温度下での酸加水分解によって、前処理される。
【００１５】
本方法の他の実施形態では、上記培養ステップ（ａ）に使用される細菌は、プロバイオティクス細菌であってもよい。本方法に係る代替的実施形態または好適な実施形態の詳細については、添付の請求項に記載する。
【００１６】
〔図面の簡単な説明〕
図１は、複数のＴＥＭマイクロコピー分析から得られた、ラクトバチルス・ファーメンタム(lactobacillus fermentum)から抽出されたバイオナノ銀の粒径分布を表す。
【００１７】
〔発明の詳細な説明〕
従来の製品に対し、本発明の銀ナノ粒子、または本工程によって製造された銀ナノ粒子は、抗菌反応性が高く、分散作用が優れており、粒度分布が限定されており、安定化ポリマーまたは潜在的に有害な有機分子を使用せずに高濃度にて生成することができる。これにより、費用効率が高い方法を提供することができ、当該方法においては、廃棄物の流れについても付加価値がある。
【００１８】
本発明では、銀ナノ粒子の製造工程が提供され、当該工程において、主成分は、好適には、高Ｃ／Ｎ比の特定の条件下にて培養された前処理済みの生体成分（ラクトバチルス・ファーメンタム(lactobacillus fermentum)株 Ｇ２／１０）である。本発明に係る銀ナノ粒子は、細菌細胞の体積に渡ってランダムに分配されるのではなく、異なるが明確な粒径範囲で細胞の特定部位に見られる。本発明を用いて、最も遠位の細胞画分（以下「糖衣」または「Ｓ−層」または「細胞外被」と称する）から明確な粒径範囲（例えば平均粒径が３〜４ｎｍ）が得られる。一方、従来技術の方法では、ラクトバチルス(lactobacillus)株によって生成された銀ナノ粒子について、例えば１５ｎｍ〜５００ｎｍの広範囲の粒子が得られていた。また、従来の方法を用いて、容易にキログラム（乾燥重量）の生体成分当たり１８０ｇのコロイド状銀が製造され得る。一方、他の生物学的方法では、収量は例えばキロ当たり１８ｇなど、ずっと低い。細胞壁、細胞膜および外膜（存在する場合）を合わせて細胞外被と称する。本方法は、限定するものではないが、L. fermentum、L. brevis、L. casei、L. sakei、L. farciminis、およびL. parabuchneri株を含む多数のラクトバチルス類から銀ナノ粒子を生成するように適用可能であることがわかった。
【００１９】
重要なことに、下記例示の実施形態に使用される、プロバイオティックスであるラクトバチルス・ファーメンタム(lactobacillus fermentum)Ｇ２／１０は、発酵装置において、ｍ３当たり約１０キログラム（乾燥重量）の生体成分の濃度で効果的に製造され得る。
【００２０】
以下の処理によって、細胞糖衣、またはＳ−層、または細胞外被における制御可能な粒径分布をもつ微小のＡｇ０ナノ粒子が生成される。すなわち、最終的なＣ源濃度が少なくとも２０ｇ／Ｌの発酵性糖、および好適には５０ｇ／Ｌを上回る（例えば８０ｇ／Ｌ）のグルコースで、Ｃ／Ｎ比が１０：１よりも高い条件下で、適宜低いｐＨでの加水分解ステップを組合わせて、生体成分を増殖させる。そして、低濃度のＮａＯＨでの培養後、この生体成分を後処理する。Ａｇ（ｌ）還元のための還元剤、および生成されたナノ粒子のための安定化剤の両方が、鹸化反応混合液内に存在する。Ａｇ+還元の間、グルコースなどの他の還元剤を添加する必要はない。
【００２１】
グラム陽性菌であるラクトバチルス種の細胞壁は、ペプチドグリカンからなる厚い層を含み、当該層は、リポタイコ酸、テイコ酸、タンパク質、および、多糖によって覆われており、続いて、細胞内の周辺リン脂質含有細胞膜、および細胞質が続く。ペプチドグリカンは、Ｎ−アセチルグルコサミンβ（１→４）Ｎ−アセチルマラミック酸であり、このオリゴ糖は、細胞壁を構成するヘテロ多糖類における長鎖の構成成分である。また、細胞外糖衣、粘性多糖またはポリペプチド粘液が存在する。Ｓ−層または表面層は、タンパク性サブユニットの結晶配列からなる細胞壁の最遠部として規定される。
【００２２】
本発明において、高い効率で、細胞外被、Ｓ−層または糖衣内に、均一形状および１〜８ｎｍの範囲のサイズをもつ銀ナノ粒子を製造することについて説明する。本方法には、３つの重要な特徴がある。
１．細胞外被における糖リッチ構造の数が増大し、より厚い生体成分の細胞外被が得られる。これは、少なくとも１０：１の高Ｃ／Ｎ比の条件下での発酵、例えば８０ｇ／Ｌの最終グルコース濃度を供給する栄養培地において培養することによって、達成される。発酵工程中に、逐次的または段階的にＣ／Ｎ比を増加させることにより、上記が達成される。
２．加熱しながら低濃度のＨＣｌ（例えば６０℃で０．１Ｎ ＨＣｌ）で水で希釈された生体成分を処理することによって、還元糖の相対数をさらに増大させる方法である。その後、その結果、糖衣またはペプチドグリカンにおける多糖とオリゴ糖とのグリコシド結合に酸加水分解が生じ、したがって、アルカリ環境下において遊離アルデヒドまたはケトン基を含む還元糖がより多く生成される。Ｃｕ（ＩＩ）Ｏを含むベネディクト試薬を用いて還元糖の量を測定してもよい。
３．最終ステップでは、培養された生体成分を水によって洗浄し、０．００１〜０．００３Ｎ ＮａＯＨを用いて後処理した。ＮａＯＨまたは他の塩基を用いた反応によって、アルカリ条件下にて、細菌の細胞壁構造における還元単糖のアノマーＣ１原子は、アノマーＣ１周辺の再構築に起因して、Ａｇ+による酸化の影響を受けない。還元糖とは、アルカリ条件下にてＡｇ+によって酸化される糖を指す。生じる反応は、遊離アノマーＣ１アルデヒドまたはケトン基をカルボキシル基に酸化させる反応である。アルカリ条件下にて、Ａｇ+を用いた還元糖のアノマーＣ１アルデヒドの酸化還元反応は、
RCHO + 3 OH- +2 Ag+ => RCOO- + 2 Ag0+ 2 H2O (1)
である。
【００２３】
驚くべきことに、本発明において、上述のように製造および後処理された生体成分に、ＮＨ３に溶解させたＡｇＮＯ３を注入することによって、０．９〜７ｍｍＡｇ０のナノ粒子沈殿物が、糖衣、細胞外被および／またはＳ−層に均一に分散した。簡略化のため、糖衣、細胞外被およびＳ−層を総じて、外細胞区分（Outer Cell Compartment, OCC）とする。ＯＣＣにおいてバイオナノ粒子は、３ヶ月間安定を保ち、さらに、示差分画によって抽出可能である。本方法を用いた同質のＡｇ０の生成は、ＮａＯＨによって促進される。これは、還元糖によるＡｇ+の酸化がアルカリ条件下にて向上し、酸化可能なアノマーアルデヒドまたはケトン基を生成するからである。ケトースは、以下の反応に示すように、エネジオールを介してアルドースに異性化する場合、還元糖であり得る。
【００２４】
【化１】
【００２５】
より多くのアノマーＣ１炭素位は、アノマーＣ１周辺の再構築により環状のアルドースまたはケトースの開環が生じることが原因で、ＮａＯＨ、金属水酸化物、または塩基の存在下において、Ａｇ+の還元が可能となる。したがって、ＮａＯＨによる後処理を行わない同じ乳酸菌におけるＡｇ０の生成と比較して、Ａｇ０の形成部位および核形成部位の数はずっと多く、より均一な方法にてより多くのＡｇ０が沈殿する。これは、電子顕微鏡分析法の比較によって、観察され得る。本願に記載された方法を用いて、細胞外被内部の小さいナノ銀沈殿物が、細胞質内部のより大きいＡｇ０結晶から識別される。ＮａＯＨを用いない従来技術の方法では、細胞外被または糖衣内部の小さいナノ銀粒子の沈殿物は存在しない。また、ＮａＯＨがある場合、リン脂質二重層が鹸化され、より多くの透過性細胞質が生じる。
【００２６】
ＮＨ３中でのＡｇＮＯ３の可溶化は、アルカリ環境下におけるＡｇ２ＯまたはＡｇ（ＯＨ）の即時沈殿を防止する。ＮＨ３がＡｇ+と錯体を形成することで、溶液中にてよりよい状態を維持し、生体成分とのよりよい相互作用を可能にする。
【００２７】
本発明に従って生成される銀ナノ粒子は、生体成分からさらに分離され得る。第一ステップでは、最小のバイオナノ粒子がＯＣＣから抽出され、この画分には、代表的には４ｎｍ未満の銀粒子が少なくとも５５％、２ｎｍ未満の銀粒子が少なくとも１５〜２０％含まれ、これによって、平均粒径が約１〜８ｎｍの群が得られる。上記ＯＣＣの第一抽出ステップの後で、より大きい粒径（＞２０ｎｍ〜２００ｎｍ）のナノ粒子がある細胞内部分は、残留廃棄物の流れにおける生体成分の残留画分とともに残っており、これが製品に付加価値を与える。
【００２８】
本発明によると、所望のサイズ範囲は、鹸化された生体成分の異なる位置から抽出され得る。すなわち、平均サイズが約３〜４ｎｍである小さい銀ナノ粒子は、糖衣、細胞外被、および／またはＳ−層において高濃度に生成されてもよく、これによって、例えば細胞質領域などの細菌細胞の他の部分に配置されたより大きい銀ナノ粒子（２０〜２００ｎｍ）から区別して抽出され得る。例えばラクトバチルス・ファーメンタム(lactobacillus fermentum)などの前処理された生体成分は、還元糖を豊富に含む、厚い糖衣および／または細胞外被を有する。
【００２９】
本発明では、水に縣濁させたラクトバチルス・ファーメンタム(lactobacillus fermentum)を、１５分間、０．０１〜０．０３Ｎ ＮａＯＨで後処理することによって、数時間（例えば０．５〜１６時間）内にＡｇ（ｌ）を金属Ａｇ（０）に還元する高い還元力をもち、Ａｇ（ｌ）からＡｇ（０）への変換効率が８０％（例えば９５％）を上回る鹸化された生体成分が得られる。結果物としての、鹸化された生体成分の糖衣において沈殿されたＡｇ０ナノ粒子は、エネルギー分散型Ｘ線回折（ＥＤＸ）および（ＦＴ）ＩＲ分光分析によって、ＣおよびＯが豊富であり、生物由来のＳおよびＮを含む生物由来の被膜によって安定化されることがわかった。システインやメチオニンなどのアミノ酸残基に存在するチオールなどのＳ−含有リガンドは、下記機構によってＡｇ０形成を助ける。
【００３０】
Ａｇ+によるスルフヒドリル含有生体成分の酸化還元反応の例は、
【００３１】
【化２】
または
【化３】
である。
【００３２】
生体成分のバイオナノ銀におけるＳ対Ａｇのモル比は、１：４〜１：６０の範囲内であり、生体Ａｇ０の一部分のみが反応（２）のようにスルフヒドリルによってＡｇ+の沈殿を生じさせ、Ａｇ０の一部が反応（１）によって生成される。Ａｇ０沈殿の有効性におけるＮａＯＨの効能は、例えばタンパク質の可溶性、または還元糖との反応に関連する。
【００３３】
生成された元素状態で存在する銀Ａｇ０は、配位共有結合によって生体の二硫化物に結合され、Ｓの自由電子を共有する、あるいは、銀イオンがスルフヒドリル基と相互作用し、−ＳＡｇ結合（３）を形成する。このように、本願に係る方法を用いて生成されたナノ銀粒子は、Ａｇ０粒子に結合された或る量の生体の硫黄を常に含み、リガンド形成によって、Ａｇ０分散を安定化させる。
【００３４】
興味深いことに、細菌におけるＳ層と呼ばれる、タンパクまたは糖タンパクサブユニットの表面（Ｓ−）層は、負の電荷を帯びたペプチドグリカンシートを物理的に被覆することができ、例えばバチルス・ステアロテルモフィルス（Bacillus stearothermophilus）にて実証されたように、自動凝集を防止する。殆どの細菌類とは対照的に、乳酸菌におけるＳ−層タンパクは、塩基性が高く、等電点がｐＨ＝９を上回る。したがって、本方法によって生成されたＡｇ０ナノ粒子に結合されたＳ含有官能基の役割は、Ａｇ０粒子における細胞外被または糖衣由来の生体表面の負の電荷を被覆することによって凝集を防止することであってもよい。これによって、ゼータ電位測定によって示されたように、より高いｐＨ領域におけるより高い等電点（ＩＥＰ）が生じる。すなわち、他の方法を用いて調製されるナノ銀と比較して、より少ない陽子で、ここに記載された方法によって生成されたナノ銀からのゼータ電位を負から正に切り替えることができる。バイオナノ銀のＩＥＰは、約ｐＨ４〜５であることがわかり、これは、重要なＳ−層を含むラクトバチルス株からのＩＥＰよりも高い。これは、ナノ銀表面上にＳ層型タンパクが豊富にあることを示しており、定量的ＥＤＸ（表４）によって検出された、ナノ粒子に存在する生体ＳおよびＮの含有量と一致する。ＴＥＭ顕微鏡法（図示せず）によって測定されたように、この有機層がナノ粒子に分散作用を与える可能性があるので、このことは重要である。有機リガンドは、その凝集および凝塊を防止することによって、ナノ粒子の利用を高める。また、これらのリガンドは、重要な認識、輸送、および触媒作用をもたらすことができる。
【００３５】
鹸化による後処理ステップによって、糖衣、細胞外被、および／または、Ｓ−層だけでなく、細胞内の細胞質領域がＡｇ（０）生成および蓄積部位となることがわかった。文献に記載されていることとは対照的に、ＯＣＣにおいて生成された銀ナノ粒子の大きさは、０．９〜７ｎｍの範囲内であり、一方、２０〜２００ｎｍの範囲内のより大きいナノ粒子は、ＯＣＣにおいては発見されず、細胞質において発見されている。ナノ粒子は、例えば酸抽出などによってＯＣＣから任意に抽出され、その結果、平均粒径が３〜４ｎｍのナノ銀生成物が得られる。より大きい粒子、すなわち７ｎｍを上回る粒子は、最大で、当該ＯＣＣ抽出の数パーセントを構成する。本発明のナノ粒子は、４℃にて２ヶ月間保存した後でも、糖衣内で、凝集しない、あるいはクラスターを形成しない。したがって、鹸化による後処理によって、ＯＣＣおよび細胞質領域にＡｇ（ｌ）またはＡｇ（０）を拡散させることが可能となり、そして、ＣおよびＳが豊富な、鹸化後の細胞構成成分は、結晶成長を安定化させ、生物由来の電荷を帯びた有機層によって個々のナノ粒子を保護する可能性がある。ＡｇＮＯ３は、本方法によるナノ銀生成物の銀塩として使用されることが望ましい。本方法によって、１ｍ３バッチへのスケールアップが実行可能であり、費用効果の高い製造工程が可能となることがわかり、少なくとも６ｍＭ、好適には１０ｍＭのＡｇＮＯ３が、本願に記載されたいずれかの特性を備えたＡｇ（０）ナノ粒子に効果的に変換される。ＮＨ４+が存在することによって、Ａｇ（ＮＨ２）+または［Ａｇ（ＮＨ３）２］+銀(I)-アンモニア錯体の形成が可能となり、一方で、Ａｇ（ｌ）とＯＣＣにおける還元基との間の静電相互作用の向上が可能となり、他方では、反応混合液におけるＮａＯＨの存在下でのＡｇ（ｌ）ＯまたはＡｇ（ｌ）ＯＨの形成を防止することができる。アンモニアを反応混合液に加えることにより、通常のＡｇ（ｌ）Ｏ、Ａｇ（ｌ）ＯＨまたは酸化銀を形成せずに、０．２５ｋｇＮＨ３／ｍ３に抑えることができる。
【００３６】
アルギニンおよびヒスチジンなどの陽イオン性アミノ酸とアンモニア銀とを反応させることによって、Ａｇ０の沈殿が増大する。そのようなアルカリアミノ酸は、例えば糖衣、細胞外被またはＳ−層の本質部分であり得る。これらのアミノ酸は、Ａｇ（ｌ）を調整する役割を果たし、それによって、さらに、周囲の還元糖によってＡｇ（０）に還元することができる。
【００３７】
本願明細書では、生成されたナノ銀粒子を効果的な抗菌剤および殺生剤として検査した。例えばＨｙｇａｔｅなどによる近年の産業開発により、多孔性マトリクスに埋め込まれたナノ銀は、イオン性銀が不活性の多孔性マトリクスに埋め込まれたときよりも、ゆっくりと、より制御されて抗菌性のＡｇ+を放出することができる。ポリマーおよびプラスチック合成においても、銀ナノ粒子には利点がある。本願に記載された方法によって生成された銀ナノ粒子は、大きい比表面積を有することにより、より効果的な抗菌作用がより効果的になり、水中または他の溶媒中における分散作用がより優れ、ナノ粒子を埋め込むゼオライトのようなマトリクスとの相互作用が良くなる。抗菌ナノ銀粒子は、例えば医薬用途および水処理フィルタにおける表面被膜に効果的に使用され得る。
【００３８】
本発明に記載されたバイオナノ粒子を、例えばアクリル酸エステル共重合体の水性分散液などの中においてポリマーに合成する利点は、ポリマーにおけるバイオナノ粒子の分散作用が優れており、そのため、ここに記載された方法に起因する粒子表面における表面電位および生体の界面活性剤分子に関係する凝集を防止することができる。表面電位は、粒子表面の等電点に関係する。当該等電点は、ゼータ電位測定によって示されたように、他の方法を用いて生成されたナノ粒子よりもずっと高いｐＨ＞４〜５である。
【００３９】
平均粒径３〜４ｎｍのナノ粒子の水中での分散が優れていることは、水性塗料またはポリマーへの合成において明らかな利点となる。優れた分散の結果、凝集が殆ど見られず、ポリマー内部の銀粒子の総表面領域がより大きいため、抗菌反応がより高くなる。水性ポリマーなどの一例は、アクリルエステルベースのＰｈｏｄｏｐａｓ Ｕｌｔｒａｆｉｎｅ ＰＲ３５００（Phodia，France）である。そのようなアクリルエステルポリマーは、（−ＣＨ２ＣＨＣＯＯ−）ｎの構造式で表される。
【００４０】
凝集が殆どなく、表面電位がより広範囲のｐＨ範囲において正の電荷を帯びることにによる、優れた比表面積および粒子の安定性に伴う抗菌作用の増大による利点は、多孔性ゼオライトとより優れた相互作用を行うことにある。そのようなゼオライトの一例は、Zeolith N（Zeolite Aluminium silicate, Evers E.K., Hopsten, Germany）であり、このとき、バイオナノ粒子はゼオライトマトリクス内にしっかりと保持されており、高濃度の塩分を含んだ水がゼオライト表面を通過した場合であっても、Ａｇ+−ゼオライトの組み合せよりも高い抗菌反応をもたらすことが示された。セライトなどの他の天然の多孔性鉱物についても、本願によって生成されたバイオナノ粒子との組み合せに適する。従って生成されたナノ銀のゼータ電位は、ｐＨ４を上回る場合は負の電荷を帯びることから、高いｐＨおよび中性のｐＨでのイオン交換樹脂におけるナノ銀の保有率が向上する。したがって、イオン交換樹脂は、微分ｐＨでのＡｇ+の配位放出のためのバイオナノ銀とを混合するのに適している。
上記が特定の用途において好適である場合は、糖衣／細胞外被または細菌細胞の他の部位から抽出されたナノ粒子の両方の画分を混合してもよい。
【００４１】
本発明のいくつかの利点を示す。
［１］ポリマー、塗料、織物繊維、または封止剤への合成に使用される多くの銀ベースの殺生剤には、イオン交換樹脂、またはＡｇ+を結合および交換する化合物が使用される。Ａｇ+交換に使用される代表的な市販の化合物はゼオライトである。さらに、そのようなＡｇ+交換システムは、例えば高い陽イオン力をもつ水が当該システムの上を通過する場合、Ａｇ+欠乏に対して極めて感受性が高い。これは、当該システムの耐久性を著しく低下させる。一方で、本発明での使用が想定されている微生物の殆どが、廉価で、かつ容易に大量生産することができるものである。例えば、最も一般的なラクトバチルス菌は、大量生産することができる。本願に記載の方法によって生成されるバイオナノ粒子の大きさは、例えば平均約３〜４ｎｍの狭い範囲内においてのみ生成されるが、さらに制御されたＡｇ+の放出源として使用されてもよく、経時的にポリマー内部、多孔性樹脂もしくは他の化合物、および分散液の両方の内部において、高い抗菌作用を保持することができる。
［２］多数の微生物が、タンパク質を含む、多糖含有率の高い糖衣またはＳ−層を有する。鹸化が微分ナノ粒子生成、並びに細胞糖衣および他の細胞成分内部のサイズ分布に及ぼす影響を発見することで、発酵処理または他の処理によって生成された微生物バイオマスを鹸化による後処理をし、その後、当該バイオマスから示差抽出することにより、微小の銀ナノ粒子を生成するための簡易かつ効果的な方法を提供することができる。
［３］本発明の方法は、銀塩の銀ナノ粒子への変換を著しく向上させる。例えば銀塩に含まれる銀の９５％をナノ粒子に変換する場合、最終反応混合液中において１０００ｍｇのＡｇ+および４６００ｍｇのラクトバチルス菌バイオマス（乾燥重量）の濃度では、２０℃の温度下にて１６時間で完了する。反応条件（反応液の濃度、温度、攪拌などを含む）に応じて、３０分以内に８０％の変換が完了する可能性もある。
［４］結果精製された銀ナノ粒子のサイズ分布は、比較的密集しており、示差抽出によって少なくとも部分的に調整され得る。例えば、糖衣において生成される抽出銀ナノ粒子の大きさは、通常、０．９〜７ｎｍの範囲内である。概して、優れた分散作用をもつ小さいナノ粒子は、殆ど凝集を生じさせない。ナノ粒子が小さくなればなるほど、抗菌特性を得る必要がある銀が少なくなる。
［５］生成および抽出されたバイオナノ粒子は、測定可能な量の、生体のＳ、Ｎ、ＣおよびＯを含有する。生成されたナノ粒子に結合されたこの有機層は、ナノ粒子の表面電位および分散作用をもたらす。さらに、上記有機層は、生体構造への架橋効果を有していてもよい。上記効果の組み合せによって、銀ナノ粒子の抗菌効果が増大する。
［６］糖衣以外の細胞構成成分から抽出されたより大きい銀ナノ粒子（２０〜２００ｎｍ）の画分でも、優れた抗菌効果をもつことがわかった。さらに、これらの粒子は、電子化学用途に適した大きさの範囲であり、当該電子化学用途において、フレキシブル導電性回路線は、構成された導電性ナノ粒子の少なくとも２倍の厚さである。例えば、１２０ｎｍの線は、６０ｎｍの銀ナノ粒子を含む導電性インクを用いてプリントされ得る。興味深いことに、ナノ銀縣濁液を用いてプリントされた銀部分は、特に高いアスペクト比で薄い、あるいは微小な特徴を有する場合、当該銀部分の焼結の品質が著しく向上することがわかった。本発明において、生体成分から抽出されたより大きいバイオナノ銀粒子は、より小さいナノ粒子との融合によって生じた銀の突出を有する、不均一な形状をとる。
これらの不均一性は、（ｉ）より大きい粒子の比表面積を大きくし、ＭＩＣ効率を比較的優れたものにすること（表７ａ参照）、（ｉｉ）迅速な製造または試作におけるミクロ銀粉末との結合の選択性を良くすること、に役立つ。
［７］バイオナノ銀粒子の安定化は、例えば（ｉ）アミノカルボン酸塩（例えばアミノ酸）、（ｉｉ）鹸化されたバイオマスに存在するヒドロキシル基、または（ｉｉｉ）チオールおよび／またはアミンなどのドナーリガンド、によって鹸化されたバイオマスに存在する弱官能基とともに生じ得る。本方法によれば、アミンおよび／またはチオール関連分子が銀ナノ粒子と結合するため、感知できるほどの凝集がなく、銀ナノ粒子を長期間（週単位、または月単位）保存できることがわかった。
［８］バイオナノ銀粒子は、最大４２５ｎｍという高いＵＶ吸収を示すことから、４０ｍｇ／Ｌ Ａｇという低濃度であっても、ＵＶ分光分析は、端的な品質制御パラメータとなる。
［９］バイオナノ銀粒子は、藻類、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌、菌類（カビ菌および酵母菌）に対して極めて優れた殺菌特性を示す。最も小さい粒子は約１ｎｍであり、約１０％のナノ粒子がこの大きさであることから、ＨＩＶ−Ｉおよび他のウイルスに対して優れた殺ウイルス特性を得る。
［１０］イオン交換樹脂由来の制御されたｐＨベースのＡｇ放出を他の銀ナノ粒子と比較した。
【００４２】
例示を目的とし、本発明の範囲を制限する意図のない下記例を参照することで、本発明をよりよく理解できる。
【００４３】
１．鹸化による後処理がされた、ラクトバチルス菌生体成分を用いたバイオ−Ａｇ０ナノ粒子の生成
・ＭＲＳ培養培地でラクトバチルスＧ２／１０株を培養した。
・三角フラスコで、２×１５００ｍｌのＭＲＳ培養培地で、２つの前培養バッチを準備し、１００ｒｐｍ（３０℃）で攪拌した。
・４０Ｌの水中に２４ｋｇのグルコース（０．６ｋｇ／Ｌ）を含む、総容量１００Ｌの供給発酵槽を準備した。
・培養液中での乾燥物を測定するために吸光度分析を使用し、ＭＲＳ培地においてＧ２／１０を含む培養フラスコで較正を行った。
・その後、グルコース濃縮を行い、乳酸塩の分析のためにＨＰＬＣバイアルを準備した。
【００４４】
（酢酸ナトリウムを含まない）ＭＲＳ培養培地を以下のように調製する。
１Ｌに対して、下記の添加物を加える。
９００ｍｌの水に、Organotechnie（La Courneuve, France）製の以下の製品を溶解させた。
【００４５】
【表１】
【００４６】
この溶液をオートクレーブ反応器において滅菌した。１００ｍｌの水に２０ｇのグルコースを加えた。この溶液を濾過により滅菌した。
【００４７】
上記のように調製された９００ｍｌおよび１００ｍｌの溶液を滅菌後に混合し、ｐＨ
を６に調整した。
【００４８】
固形培地を生成するために、１ＬのＭＲＳ培養培地に１５ｇの寒天を加え、場合によっては、指標としてブロモクレゾールパープルを加えた。
【００４９】
１つの前培養バッチ１５００ｍｌを４００Ｌの発酵槽に植菌した。供給発酵槽から４００Ｌの培養発酵槽に０．６ｋｇ／Ｌのグルコース溶液をポンプ注入して、グルコースを加えた。培養発酵槽に２６０ＬのＭＲＳ培養液を加え、培養液を滅菌した。その後、培養発酵槽の中に１０Ｌのグルコース供給溶液をポンプ注入し、培養液にラクトバチルス・ファーメンタム(lactobacillus fermentum)Ｇ２／１０を加え、発酵処理を開始して細菌培養液を成長させた。細菌培養液については以下に詳述する。発酵に関する詳細については、表１ａおよび１ｂに示す。
【００５０】
〔表１ａ〕
ラクトバチルス・ファーメンタム(lactobacillus fermentum)Ｇ２／１０発酵中の技術的パラメータ：酸素移動速度（ｖｖｍ）および攪拌速度（周速度ｍ／ｓ、および回転速度ｒｐｍ）に関する酸素移動係数Ｋｌａ
【００５１】
【表２】
【００５２】
〔表１ｂ〕
４００Ｌ発酵槽中におけるラクトバチルス・ファーメンタム(lactobacillus fermentum)Ｇ２／１０発酵中のグルコース基質濃度、乳酸代謝産物濃度、およびラクトバチルス菌乾燥重量
【００５３】
【表３】
【００５４】
発酵パラメータは、
・温度：３０℃
・攪拌：５０ｒｐｍ
・ｐＨ設定点：６
・エアレーション：設定点０．１ＶＶＭ（毎分の気体体積／液体体積）；部分ＰＯ２圧力は未調整であった
・初期グルコース濃度：２０ｇ／Ｌ
である。
【００５５】
バチルスの増殖に適した他の発酵性糖は、例えばスクロース、マルトース、およびフラクトースであり、例えば成長培地に直接添加されるか、または、多糖類（例えばデンプン）または抽出物（例えばトウモロコシの糖、米の糖、糖蜜、乳清など）の一部として添加されてもよい。
【００５６】
ラクトバチルス菌Ｇ２／１０発酵中の物理化学的パラメータのモニタリングによると、開始から６時間後にｐＯ２の下降が観察され、１２時間まで継続して下降していた。そして、ｐＯ２は３〜４時間の間に６５〜７０％の値まで上昇し、その後再び下降する。この一時的な上昇は、５Ｌのグルコース投与を１４時間延期したことによるものである。１１〜１２時間の培養の間にグルコースを投与することが望ましい。ｐＯ２が最小であった２０時間後に、５Ｌのグルコースの第２自動投与を行った。２０Ｌのグルコースの第３自動投与は、グルコースの完全消費が見られた２３〜２４時間の培養の間に行った。この第３注入の直後に、ラクトバチルス菌が著しく増殖し始めた。実際のところ、３時間未満の間に、バイオマスは１ｇ／Ｌから７ｇ／Ｌに増加した。このとき、最終細菌密度は、４，６Ｅ９ ＣＦＵ／ｍｌ（コロニー形成単位）に到達した。したがって、世代時間は０〜６．５時間の培養の間（誘導期）において１．５時間であり、２４〜２７．５時間の培養の間（対数増殖期）において２．７時間であった。
【００５７】
ラクトバチルス菌が増殖活性が十分であり、残りのグルコース濃度が３０ｇ／Ｌである、２７．５時間の培養後の対数増殖期に、生体成分を採取した。このことは、発酵処理をさらに最適化し、ｐＯ２の急増を防止し、（ヘテロ）発酵環境を維持する場合、生体成分の乾燥物が増える可能性があることを示唆している。２７．５時間後の培地に残っているグルコースから、全てのグルコースがバイオマスに変換されるわけではなく、バイオマスが培地中のほぼ５０ｇ／Ｌのグルコースの影響を受けないことも明らかである。実際のところ、第２および第３のグルコース投与は、第１よりもずっと効果的であった。これは、１５ｋｇのグルコースが２，２５ｋｇの生体成分に消費されることを示しており、その場合、基質の収率はＹｘ／Ｓ＝０．１５である。
【００５８】
発酵終了時では、乳酸塩はほぼ３０ｇ／Ｌに達し、計８．７ｋｇの乳酸塩が得られ、その収率はＹｐ／Ｓ＝０．５７である。乳酸塩の生成は、増殖培地における生体成分の乾燥物と同様の動きを辿る。乳酸の対数増加に伴い、ｐＨ値が約４まで一時的に下降した。
【００５９】
発酵終了時に、遠心分離（連続遠心分離機、Ａｌｐｈａ−Ｌａｖａｌ、５００L/h）を用いて生体成分を採取し、生体成分（乾燥物）で１３．６％重量のクリーム１５Ｌを得た。続いて、このクリームを脱イオン水で２回洗浄し、再度遠心分離にかけた。遠心分離および洗浄の間に、バイオマスの損失が見られ、生体成分（乾燥物）で８％重量の最終洗浄生体成分スラリー１４Ｌを得た。発酵培養培地から９５％以上の生体成分（乾燥物）を回復させるために、遠心分離速度を上げ、濾過（例えばクロスフロー濾過）と組み合わせることによって、上記洗浄ステップおよび生体成分の採取を最適化することができる。
【００６０】
そして、洗浄した１１２０ｇ（乾燥重量）の生体成分Ｇ２／１０から、バイオナノ銀生成を始める。１ｍ３のプラスチック容器内（２×１×０．５ ｌ×ｂ×ｈ）で、この生体成分と２５０Ｌの脱イオン水とを混合した。生体成分の縣濁液に、１０Ｎ ＮａＯＨストック溶液から最終濃度の０．０３Ｎ ＮａＯＨになるようにソーダ水（ＮａＯＨ）を加えた。この溶液のｐＨは１１．５である。この反応液を１５分間よくかき混ぜ、生体成分の鹸化を行った。続いて、３９２．５ｇの硝酸銀（ＡｇＮＯ３）を４１７ｇの１５％ＮＨ３水溶液に溶解させた。さらに、この水溶液を鹸化後の生体成分縣濁液と混合し、緩やかに攪拌させながら２０℃にて１６時間、反応させた。
【００６１】
遠心分離後の乾燥物および浮遊物に対するＩＣＰ−ＭＳ（誘導結合プラズマ質量分析法）およびＸＲＤ分析から、１６時間後には、９８％のＡｇ+がＡｇ０に変換されたことがわかった。混合物を遠心分離（連続遠心分離機、Ａｌｐｈａ−Ｌａｖａｌ、５００Ｌ／ｈ）にかけ、脱イオン水を用いて２回洗浄し、残留硝酸エステル、ソーダ水およびアンモニアを除去した。９３０２ｍｇ／Ｌの最終Ａｇ０濃縮物を含む、１５．２Ｌの最終産物が得られた。この最終産物は、微量の硝酸エステルおよびアンモニアのみを含有しており、イオンクロマトグラフィーおよびＴＡＮ測定によって測定されるように、最大４ｍｇ／Ｌ Ｎである。洗浄および遠心分離によって、約４４％のＡｇ０および乾燥重量の生体成分が損失した。反応混合物において９８％のＡｇ０への変換が測定されているが、反応液に加えられた初期のＡｇ+と比較してＡｇ０の回復は５６％となった。この損失は、高速遠心分離を行わず、遠心分離中に産物を洗い流すことが原因である。後に行う小規模検査では、洗浄および採取中のＡｇナノ粒子の損失を防ぐには、１０，０００ｇの遠心分離または超遠心分離が好適な技術であることがわかった。さらに、濾過についても検査する。
【００６２】
２．バイオナノ銀の抽出
これらの検査の目的は、細菌構造から銀ナノ粒子を遊離させるために、銀を含有する生体成分との反応を設定することにあった。（ｉ）過酸化水素（Ｈ２Ｏ２、水に対し３５容量％）、（ｉｉ）ＮａＯＨ（０．０５〜２Ｎ）、および（ｉｉｉ）Ｈ２ＳＯ４（０．４〜９．８Ｎ）という３つの異なる化学試薬を、上述した方法によって生成されたナノ銀を含む生体成分の量と接触させるという３つの実験を設定した。
【００６３】
銀含有生体成分の水縣濁液に、最終濃度が１５％になるようにＨ２Ｏ２を加えた。反応液は高く発熱し、重い発泡体の形成が起きた。反応の２４時間後、混合物を超音波分解した。本方法を用いて、約１５％の銀重量を生体成分から抽出した。この１５％は、その殆どが、糖衣、細胞外被、および／または、Ｓ−層から生じた１〜７ｎｍの範囲内のナノ銀粒子である。
【００６４】
例えばリゾチームなどの酵素加水分解を用いても、同様の結果が得られる。生体成分におけるナノ銀形状をとる１０００ｍｇ／ＬのＡｇを含む１Ｌの水に４ｇの酵素を加えた直後に、透明な茶色い上澄み液が得られた。
【００６５】
ＮａＯＨおよびＨ２ＳＯ４の抽出液からの結果を表２および３に示す。Ｈ２ＳＯ４を用いた場合の結果が最もよく、０℃の温度下での１０分後、２Ｎ Ｈ２ＳＯ４においても、約１０％の銀重量が生体成分から抽出された。反応液は発熱したが、泡の形成は起こらなかった。
【００６６】
〔表２〕
異なるＮａＯＨ濃度、温度、および反応時間が生体成分の銀マトリクスからのナノ銀の抽出効率に及ぼす影響。ナノ銀として生体成分に結合されたＡｇの初期質量は、５２．４ｍｇであった。
【００６７】
【表４】
【００６８】
〔表３〕
異なるＨ２ＳＯ４濃度、温度が生体成分の銀マトリクスからのナノ銀の抽出効率に及ぼす影響。ナノ銀として生体成分に結合されたＡｇの初期質量は、２６２ｍｇであった。反応時間は１０分間であった。
【００６９】
【表５】
【００７０】
以下の例では、示差抽出および遠心分離ステップに基づき、Ｈ２ＳＯ４濃度を用いた、ナノ銀を含む生体成分の完全抽出、その結果生じたナノ銀の様々な画分について詳述している。最初の画分は、ＯＣＣ由来のものであり、１〜７ｎｍの大きさの銀ナノ粒子を含む。連続した抽出ステップでは、細胞質および他の細胞領域から生じた平均２０ｎｍを上回るナノ粒子を含む画分が抽出された。
【００７１】
本方法によって得られたナノ銀含有生体成分の１５０ｍＬ水縣濁液は、ＩＣＰ−ＭＳ分析による測定により、７３００ｍｇ Ａｇ／Ｌを含んでいた。この１５０ｍＬ水縣濁液に、５０ｍＬのＨ２ＳＯ４（９８％）を加えた。
【００７２】
総量は２００ｍＬ（２５％のＨ２ＳＯ４）となり、５４８０ｍｇ Ａｇ／Ｌを含んでいた。上記混合物を２０℃にて１６時間培養した。
【００７３】
上記混合物を３０分間、１１，８００ｘｇにて遠心分離にかけ、上清１と沈殿物１という２つの画分に分離させた。
【００７４】
上清１は、３４８０ｍｇ Ａｇ／Ｌを含むことがわかった。
【００７５】
２００ｍＬの２５％ Ｈ２ＳＯ４液に１０Ｎ ＮａＯＨを中和滴定することによって上清１中のナノ銀を沈殿させた。ナノ銀を凝集させ、重力沈降、または塩を豊富に含むブラインからの遠心分離によって採取される。これらのフロックを脱イオン水で２回洗浄し、１１，８００ｇの遠心分離によって洗浄水から分離した。洗浄ステップ後、ナノ銀を容易に水に分散させることができ、目に見える凝集なしに安定したコロイド縣濁液を形成することができる。結果生じた「抽出バイオナノ銀」は、大量の有機生物由来材料（表４における「抽出されたバイオナノ銀」の下に示されている）に結合していることがわかった。５分間の３０００ｇにおける画分遠心法によって、（ＩＲ分光分析によって検知可能な）有機材料の有効な生物由来被膜を含む微小の銀ナノ粒子の画分を、有機材料の含有量が少ないナノ粒子画分（洗浄後の抽出バイオナノ銀として表４に示されたもの）から分離した。抽出バイオナノ粒子に連結された材料のＳ含有量は、脱イオン水での洗浄後に比較すると、スフリック（suphuric）酸を用いて抽出ステップを実行した場合とリン酸を用いて実行した場合では、同じであった。これは、抽出画分における生体成分から生じたＳ成分が、（ＦＴ）ＩＲによって測定されたタンパク性物質の一部として抽出されることを示す。
【００７６】
上記のように採取されたナノ銀は、優れた分散特性をもち、０．９〜７ｎｍの範囲内の大きさを有することがわかった（図１）。最終洗浄沈殿物におけるナノ銀は、ＩＲ分光分析によっては、連結された検出可能量の有機材料を生じさせなかったが、ＥＤＸによっては、表４（洗浄後の抽出バイオナノ銀）に示されたような検出可能な有機層が存在した。
【００７７】
電子顕微鏡検査法を用いて、沈殿物において採取された抽出生体成分を検査した。残りのラクトバチルス・ファーメンタム(lactobacillus fermentum)バイオマスのＯＣＣが破裂したことがわかり、ＯＣＣ内部からナノ銀を除去した。
【００７８】
〔表４〕
Lin et al.（２００５）に記載された方法によって生成されたラクトバチルス・ファーメンタム(lactobacillus fermentum)由来のナノ銀と比較した、本方法によって生成されたバイオナノ銀の定量的エネルギー分散型Ｘ線分析
【００７９】
【表６】
【００８０】
残りの生体成分をさらに抽出し、残りの細菌構造（とりわけ、細胞質）から、残留銀ナノ粒子を除去した。
【００８１】
３０１６ｍｇ／Ｌ Ａｇを含む縣濁液に５０ｍＬのＨ２ＳＯ４（９８％）を加え、沈殿物１を均質化した。上記均質化は、２０℃、１６時間の反応で得られる。１１，８００×ｇの遠心分離を３０分間実行した後、上清１および沈殿物１が分離した。電子顕微鏡検査によって、沈殿物１を検査した。２０〜２００ｎｍの大きさの銀ナノ粒子は、生体成分の残留画分間にて凝集した。ＩＲ分光分析によって、これらのナノ粒子の有機結合が確認された。銀質量バランスの観点において、当該実験から以下のスキームを導いた。
【００８２】
【表７】
【００８３】
Ａｇの総重量の約６０％が、２５％のＨ２ＳＯ４中の第一抽出ステップによって回復し、有機残留物と銀ナノ粒子の混合物が生じた。当該ストリームから、微分抽出および上述した脱イオン水による洗浄ステップを用いて銀ナノ粒子をさらに精製した。結果生じた銀ナノ粒子縣濁液は、ＥＤＸ（表４）、電子顕微鏡分析、ゼータ電位、ＵＶ分光分析、ＸＤＲ、比表面積測定（表５）、ＩＲ分光分析、毒性（表６）および抗菌効果（表７）によって特徴づけられた。
【００８４】
１１８００ｇの遠心分離にて、抽出銀ナノ粒子を含む最終縣濁液を例えば１８９３１ｍｇ Ａｇ／Ｌに濃縮させた。
【００８５】
３．定量的エネルギー分散型Ｘ線分析
ＥＤＸ検出器を備え、入射エネルギー２０．０ｋｅＶに相当する１２９．６８ｅＶの ＥＤＸ分解能をもつＦＥＩ ＱＵＡＮＴＡ ２００Ｆ走査電子顕微鏡 （ＥＤＡＸ Ｇｅｎｅｓｉｓ ４０００）を用いて、３０℃の温度下にて乾燥させたバイオナノ銀または生体成分のエネルギー分散型Ｘ線（ＥＤＸ）分析を行った。その結果を表４に示す。
【００８６】
４．（ＦＴ）ＩＲ分光分析
本方法に係る、ラクトバチルス菌生体成分から抽出されたバイオナノ銀の（ＦＴ）ＩＲ分光分析。このバイオナノ銀は、細胞外壁、すなわち糖衣、細胞外被および／またはＳ−層から生じる。有機物に結合され、３，０００×ｇの遠心分離において水中で安定状態である抽出バイオナノ銀を（ＦＴ）ＩＲを用いて分析した。
【００８７】
１６０１ｃｍ−１および１６３３ｃｍ−１の吸収帯は、１５９３ｃｍ−１におけるトランス-[Cu(gly)2]または １６４２ｃｍ−１におけるトランス-[Pd(gly)2]などの金属ビス（アミノ酸）錯体によって配位されたアミノ酸のυ(C=O)特性である。１６０１での帯は、当該金属ビス（アミノ酸）錯体のNH2 架橋δ(NH2)に役立つ。アミノ酸の金属錯体は周知であり、アミノ酸錯体のυ(CO2)は、Ｃ＝Ｏ塩基の配位が隣接した分子に水素結合されるか、または隣接した錯体の金属に弱結合されるので、配位または分子間相互作用の影響を受ける。１４０２ｃｍ−１の帯は、金属において配位されたアミノ酸ＣＯＯ塩基のυ(C-O)についての特徴である。振動帯のいくつかが、略中性ｐＨでのバイオナノ銀の負の電荷により、より低い波数に変化する。
【００８８】
Ｓ−層、糖衣から生じた、または、ペプチドグリカンからの糖タンパクまたはペプチド残基から生じた抽出バイオナノ銀に結合されたアミノ酸およびタンパク質の存在は、脂肪族Ｃ−Ｎ伸縮振動帯である１０３０ｃｍ−１の強帯、および第二アミンの伸縮振動帯である２９２２ｃｍ−１の強帯から導かれる。
【００８９】
これら残りのペプチドまたはアミノ酸は、銀粒子に対して安定化効果を及ぼし、負の電荷を帯びた糖衣材料の中性化によって、より高いｐＨでの等電点に接続された銀表面電荷の測定を助けると考えられる。
抽出ステップの間に、２５％のＨ２ＳＯ４を使用した。最終（洗浄）バイオナノ銀抽出液中にＳＯ４２−が存在しないことがイオンクロマトグラフィー分析によって示されるが、ＦＴ（ＩＲ）スペクトラムから導かれ得る：１１０４ｃｍ−１において結合帯ＳＯ４２−が存在しない。
【００９０】
５．透過電子顕微鏡法
ＴＥＭ分析を用いて薄片を準備するために、２．５％のグルタルアルデヒドおよび２％のホルムアルデヒドを含む０．１Ｍのカカオダイレイト（cacao dylate）にサンプルを固定し、Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ(Ｄｅｔｒｏｉｔ， Ｍｉｃｈｉｇａｎ， ＵＳＡ)製の３％の低濃度の融解アガロースに埋め込んだ。その後、これらのサンプルを１％の四酸化オスミウム中にて固定した。固定化ステップの前後に、サンプルを蒸留水で洗浄した。その後、サンプルをエタノール量の増大、および最後には無水酸化プロピレンにおいて脱水した。Epon-Spurr媒体に埋め込んだ後で、TM６０トリミングユニット（Reichert-Jung A.G.製 オーストリア ウィーン）を用いて標本ブロックを調整し、０．５×１ｍｍ２〜１×２ｍｍ２の切断面を得て、Reichert-Jung A.G.製（オーストリア ウィーン）のUltracutミクロトームを用いて、金からマット銀の色範囲の接触面における超薄切片を切断した。当該切片をピオロフォームおよび炭素被覆した銅グリッド（２００メッシュ）上に配置した。これが完了すると、切片を２％の酢酸ウラニル、さらにクエン酸塩を用いて染色し、細胞の超微細構造を測定した。Ａｇａｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（英国スタンステッド）から化学物質およびグリッドを得た。ＥＭ２０８Ｓ透過型電子顕微鏡（ＦＥＩ製 オランダ エンドホーベン）を８０ｋＶにて動作させて画像化を行った。
【００９１】
ナノ粒子に関して、サンプルをホモ生成ピオロフォームおよび炭素被覆した銅ＥＭグリッド上に配置した。親水性を上げるために、アルシアンブルーを用いてグリッドを前処理しておいた。
【００９２】
Ｂｉｏｔｗｉｎレンズ構造をもつＴｅｃｈｎａｉ １２ Ｓｐｒｉｔ顕微鏡（ＦＥＩ）を用いて、１２０ｋＶおよび倍率４３ｋｘにてサンプルを検査した。倍率４９ｋｘにて、Ｂｏｔｔｏｍ−ｍｏｕｎｔｅｄ Ｅａｇｌｅ４×４Ｋカメラを用いてデジタル顕微鏡写真を作成した。Ａｎａｌｙｓｉｓ ３．２ Ｐｒｏ ｓｏｆｔｗａｒｅを用いてそれらを分析した。マニュアル閾値法を使用した。ボーダー粒子および２５ピクセル未満の粒子を除く粒子を、既定のフレームにおいて検出した。選択された顕微鏡写真におけるフレームを分析し、サンプル毎に＞１００分析粒子が生じた。各粒子について、平均直径、面積、球形度、平均濃淡値、凸状を測定した。
【００９３】
６．ゼータ電位の測定
４つの異なるサンプルについて、ｐＨ範囲を３〜９に設定した。対象サンプルは、
（ｉ）ナノ銀を有するラクトバチルス・ファーメンタム(lactobacillus fermentum)Ｇ２／１０生体成分；
（ｉｉ）０．９〜７ｎｍの範囲内の微小の銀ナノ粒子を含む、上記に詳述した方法に従って生体成分から抽出したナノ粒子；
（ｉｉｉ）２０〜２００ｎｍの範囲内のより大きい銀粒子を含む、抽出後の生体成分の残留画分；および
（ｉｖ）化学的に調製されたナノ銀
であった。
【００９４】
Ｈ２ＳＯ４およびＮａＯＨを強希釈液で使用して、ｐＨ範囲を設定した。第二検査範囲では、推定等電点の周りのより狭いｐＨ範囲を設定した。サンプル間の導電性の差異は、最大１ログユニットであり、常に５０〜５００μＳ／ｃｍの範囲内であることが注意深く決定された。検査を実行して再現性を測定し、結果は良好であった（データは図示せず）。希釈液の効果についても記録した。
【００９５】
異なるサンプルから５ｍｌを注入し、２５℃の温度下にて、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ ＩＩｃ(Ｍａｌｖｅｒｎ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）装置を用いて、それぞれｐＨ３、５、７および９にて測定し、Ｈｅｌｍｈｏｌｔｚ−Ｓｍｏｌｕｃｈｏｕｓｋｉ方程式
【００９６】
【数１】
【００９７】
を用いて２０００Ｖｍ−１の電界強度を印加した。μは、電気泳動移動度（ｍ２ｓ−１Ｖ−１）であり、ε０は真空誘電率（Ｃ２Ｊ−１ｍ−１）であり、εｒは誘電定数であり、ζは、ζ−電位（Ｖ）であり、ηは粘度（ｋｇｍ−１ｓ−１）である。
【００９８】
第三検査では、化学的に調製されたナノ銀のＩＥＰ測定についてｐＨ範囲を３未満に広げた。
【００９９】
粒子が１０ｎｍよりも大きい場合、１．５の補正率を適用した。等電点は、化学的に調製されたナノ銀：１．７５、ＯＣＣから抽出されたナノ銀：４．１であり、より大きいナノ粒子を持つ残りの生体成分：５．３であるように決定された。
【０１００】
７．ＵＶ−ＶＩＳ分光分析
表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）は、変化する電界および磁界放射の適用中における、伝動バンドでの電子振動の周波数である。自由電子をもつ金属（Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕ、およびアルカリ土類金属）のみが、可視領域におけるＳＰＲを示し、その結果強烈な色彩が生じる。粒子形状および粒径の次に、隣接する銀ナノ粒子間の平均距離だけでなく、媒体の屈折率もスペクトル特性に影響を及ぼす。希釈分散における球形粒子のＳＰＲは、Ｍｉｅ理論に基づいて説明される。異方性粒子に関しては、Ｇａｎｓ理論が用いられる。より大きい粒子がより高い波長、および何らかのより広いＳＰＲ範囲への赤方偏移を引き起こす。銀ナノ粒子の量が多いとき、隣接する粒子間の双極子相互作用が生じ、Ｍｉｅ理論はもはや適用されない。安定化剤または界面活性剤は、ＡｇおよびＡｕゾルの粒度分布が同じであっても、吸収スペクトルに影響を及ぼす。
【０１０１】
銀ナノ粒子は、プラスモン共鳴によって電磁スペクトル（３８０〜４５０ｎｍ）の可視領域に吸収される。それによって、強烈な黄褐色の銀ナノ粒子が生じる。
【０１０２】
ＵＶおよび可視光線の吸収スペクトルを異なるナノ銀調製と比較した。サンプルを４０ｍｇＡｇ／Ｌになるように蒸留水で希釈した。Ｕｖｉｋｏｎ９３２スペクトロメータ（Ｋｏｎｔｒｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて、波長走査を行った。データ範囲は１ｎｍであり、走査範囲は２０〜８００ｎｍであり、走査速度は２００ｎｍ／分である。１ｍＬサンプルを含むように石英キュベットを使用した。
【０１０３】
抽出したバイオナノ銀に関して（洗浄後に）ＵＶ−ＶＩＳ吸収スペクトルを分析し、上記に詳述した方法に従ってＧ２／１０生体成分において（１）に従って調製されたナノ銀、Ａｑｕａ Ａｒｇｅｎｔｕｍからの市販サンプル、および従来技術に係る、凝集することがわかっているナノ銀分散液を調製した。全てのサンプルが４０ｍｇＡｇ／ＬのＩＣＰ−ＭＳによって測定された銀濃縮液を含んでいた。
【０１０４】
生体成分におけるナノ銀の吸収スペクトルは、最大吸収４２５ｎｍでの広域の吸収ピーク、および、２６５ｎｍの他の吸収ピークを示す。後者のピークは、核酸、タンパク、および生体成分に存在する様々な有機種に起因する可能性がある。
【０１０５】
抽出されたバイオナノ銀のＵＶ−ＶＩＳ吸収スペクトルは、上述のように調製され、４２８ｎｍにて集められた明確なプラスモン共鳴帯を示す。当該最大値は、２６５ｎｍのピークよりも高い強度をもち、生体成分におけるナノ銀のスペクトルと比較して相対的に少ない面積での様々な有機種の存在を示す。ＳＰＲピークは、生体成分におけるナノ銀のＳＰＲピークの範囲内では、随行せず、より純度が高く、より凝集が少ない製品の指標となった。
【０１０６】
Ａｑｕａ Ａｒｇｅｎｔｕｍサンプルでは、４０ｍｇ／Ｌ Ａｇに関しての測定値は極めて低いもののみであった。最大吸収は、４３９ｎｍにおいて測定された。従来技術に従って調製されたサンプルは、ＳＰＲに関する代表的なＵＶ−ＶＩＳ吸収スペクトルを示さなかった。これは、ナノ銀の大きい凝集体への凝集に関する。結合された有機材料を高濃度含有する画分を洗い流す画分遠心法の前の（２）に記載された方法に係る抽出されたバイオナノ銀のＵＶ−ＶＩＳ吸収において、２１２ｎｍの最大吸収をもつピークが見られ、これは、他の全てのスペクトルには見られなかった。当該ピークは、Ａｇ＋イオンの４ｄ１０および４ｄ９ Ｓ１遷移である可能性がある。当該データは、Ａｇ０ナノ粒子からのＡｇ+希釈液から生じたＡｇ+層に結合されることから、抽出されたバイオナノ銀の高い抗菌効果に相関している可能性がある。
【０１０７】
８．Ｘ線回折分析
３０℃にて乾燥させたバイオナノ銀または生体成分のＸ線回折（ＸＲＤ）は、ＢＲＵＫＥＲ Ｄ８ Ｄｉｓｃｏｖｅｒを用いて実行された。電力１．６ｋＷ（４０ｋＶ、４０ｍＡ）の銅Ｘ線チューブによってＸ線を生成した。波長ＣｕＫαは、１．５４Åに対応していた。１５３．６秒のステップ時間、および０．０２°２θのステップサイズにて、２５〜９０°２−θ間の測定を行った。ＸＲＤスペクトルは、純粋な元素Ａｇ（０）の存在を示した。
【０１０８】
９．比表面積
遠心分離によってバイオナノ銀または生体成分サンプルを水分散から分離させ、エタノールを用いた複数回の洗浄および遠心分離ステップによって残りの水を除去した。その後、アセトン中にてサンプルを再縣濁させた。そして、サンプルをＪｕｗｅ Ｌａｂｏｒｇｅｒａｅｔｅ ＧｍｂＨ（Ｖｉｅｒｓｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）のＢＥＴ−Ａ−ＭＡＴ Ａｒｅａｍｅｔｅｒ ＩＩから目盛り付きガラス容器に移した。容器内のサンプルをさらに９０℃にて乾燥させた。
【０１０９】
サンプルが完全に乾いたら、Ｎ２気体流下にてサンプルを２４時間飽和させた。測定を始める前に、室温に達するまで、２０分間水槽においてサンプルを冷却した。測定開始時に、容器を３分間液体窒素に浸し、粒子表面のＮ２分子を脱着させた。したがって、圧力計を用いて生成された超過気圧を測定し、サンプルの比表面積に変換した。
【０１１０】
表５では、上述した方法に従って生成された抽出バイオナノ銀、および従来技術に基づくＡｇ吸着をもつ全ラクトバチルス・ファーメンタム(lactobacillus fermentum)Ｇ２／１０生体成分の結果について示す。抽出バイオナノ銀は、５８．６ｍ２／ｇの高い比表面積をもつ。文献では、粒径約３０ｎｍのナノ銀について、２０ｍ２／ｇの比表面積が記載されている。興味深いことに、従来技術に係る製品の表面積は、約２０ｍ２／ｇであり、バイオマスの周りに形成されたナノ粒子は、電子顕微鏡法によって観察されたように、ほぼ同じ大きさである。ナノ銀について、例えば１５８ｍ２／ｇなどのより高い比表面積が説明されている。
【０１１１】
〔表５〕
Lin et al.(2005)によるラクトバチルス・ファーメンタム(lactobacillus fermentum)において生成されたナノ銀と比較したときの、本方法によって生成されたバイオナノ銀のBrunauer, Emmett, Teller (BET) N2気体吸収等温法による比表面積測定
【０１１２】
【表８】
【０１１３】
１０．毒性および課題検査
毒性検査では、１５ｍｇ／Ｌ以下のバイオナノ銀（Ａｇ）の濃度では、アルテミア・フランシスカナ（Artemia franciscana）のハッチング、成熟段階への成長および進化を大きく変更させないことがわかった。したがって、アルテミア・フランシスカナ（Artemia franciscana）に対するＭＩＣは、＞１５ｍｇ／Ｌ（検査における最大濃度、表６ａ）であると測定された。
【０１１４】
〔表６ａ〕
甲殻類および植物に対する、本方法によって生成されたバイオナノ銀の最小阻害濃度（成長阻害）として表された毒性データ
【０１１５】
【表９】
【０１１６】
ニコチアナ・タバカム（Nicotiana tabacum）、および感受性双子葉植物における成長阻害を評価するために、タバコ植物の培養地に水を遣るのに使用される水の中での異なる濃度のバイオナノ銀の効果について、種子発芽、および植物の成長への影響という観点から評価した。全ての実験について４つの複製を設定し、５週間観察した（２５℃）。４ｍｇ／Ｌ（検査における最大濃度）以下の濃度のバイオナノ銀を５週間加えた後、タバコ植物の発芽、または大きさに影響はなかった。したがって、ニコチアナ・タバカム（Nicotiana tabacum）に対するＭＩＣは、＞４ｍｇ／Ｌ（表６ａ）であると測定された。
【０１１７】
したがって、バイオナノ銀の重要な利点は、短期間の検査における甲殻類および感受性植物に対するｐｐｍ範囲における毒性が限定的であることにある。さらなる検査では、病原性ビブリオキャンプベリ（campbellii）を用いた検査におけるアルテミア・フランシスカナ（Artemia franciscana）の生存率を向上させるバイオナノ銀の能力を調査した。アルテミア・フランシスカナ（Artemia franciscana）課題検査のために、オートクレーブ反応器にてミリＱ水中で滅菌人工海水（Ａｑｕａｒｉｕｍ ｓｙｓｔｅｍｓ ＵＳＡから入手可能なＩｎｓｔａｎｔ Ｏｃｅａｎ）を調製した。５０ｍＬのファルコンチューブに収容された２０ｍＬアリコートの滅菌人工海水において全処理を設定した。（３回実施された）各処理は、２０ｍＬの人工海水中の２０無菌アルテミア・ノープリウス（Artemia nauplii）からなり、１０５ＣＦＵ／ｍｌ(コロニー形成ユニット) ビブリオ・キャンプベリ（Vibrio campbellii）ＬＭＧ２１６３、および／または、２０ｍｇ Ａｇ／Ｌの最終濃度にて（２）から得られた抽出バイオナノ銀を混合して与えた、または、対照処理においてはそれらを与えず、無菌状態を保った。
【０１１８】
〔表６ｂ〕
本発明に係る２０ｍｇ／Ｌのバイオナノ銀（Ａｇ）による病原性ビブリオ・キャンプベリ（Vibrio campbellii）からのアルテミア・フランシスカナ（Artemia franciscana）の保護（３つの反復における平均＋／−標準偏差）
【０１１９】
【表１０】
【０１２０】
アルテミア・フランシスカナ（Artemia franciscana）に対する病原性ビブリオキャンプベリＬＭＧ２１６３の処理において、平均して７５％以下の死亡率が得られ、これは、対照処理における死亡率よりもずっと高かった（２５％）。２０ｍｇ／Ｌのバイオナノ銀（Ａｇ）を加えることにより、生存率（Ｐ＜０．０５）は７５％から平均３３％に大幅に減少した。
【０１２１】
１１．最小阻害濃度
異なる細菌および菌類に対するナノ銀の最小阻害濃度（ＭＩＣ）、すなわちこれらの微生物の発育阻害を示す最小濃度の測定に関して、以下のプロトコルを使用した。
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ (ＪＡＣ 〔２００１〕 ４８， Ｓｕｐｐｌ． Ｓ１)， Ｍａｒｃｈ ２００６， Ｃｈａｐｔｅｒ ２： Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｎｉｍａｌ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ； Ｍａｃｒｏｄｉｌｕｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ．
スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）, シュードモナス・アエルギノザ（Pseudomonas aeruginosa）およびカンディダ・アルビカンス（Candida albicans）の培養液を一晩成長させ、（６１０ｎｍにて測定された光学密度に基づいて）ｍＬ当たり、１５０×１０６細菌細胞または５×１０６酵母細胞に希釈した。１〜１０および１〜５のステップにおいて、これらの保存溶液をさらに５００倍に希釈した。その後、最終培養液を最終マイクロタイタープレートにおいて２倍に希釈し、１：１０００の最終希釈液を得た。
【０１２２】
０．５〜４７０ｍｇ／Ｌ Ａｇの濃度範囲にて、検査化合物をマイクロタイター培養液に希釈した。その後、マイクロタイタープレートを攪拌器にかけて３０℃にて培養した。２４時間後、プレートを培養オーブンから取り出し、その成長を視覚的、および６１０ｎｍでのＯＤ測定の両方を用いて対照列と比較した。
【０１２３】
アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）について、ＭＥＡ寒天プレートにおいて１週間培養させた培養液を以下のように採取した。黒色胞子を採取するために、１０ｍＬの０．０５％Ｔｗｅｅｎ８０水溶液をプレートに注ぎ、無菌のスパチュラを用いて胞子を注意深く滅菌水と混合した。胞子を菌糸から除去するために、黒色縣濁液をピペットで吸い出してガラスパールを含む滅菌三角フラスコに注入し、１分間ボルテックスさせた。最終縣濁液を５０μｍのカットオフ無菌フィルタを用いて濾過した。顕微分析を行い、全ての菌糸が除去されたことを確認した。胞子培養液の最適密度は、６１０ｎｍにて測定され、５×１０６胞子まで希釈された。そして、当該縣濁液を５０倍に希釈した。その後、最終マイクロタイタープレートにおいて最終培養液を再び２倍に希釈し、最終希釈１：１００を得た。
【０１２４】
バイオナノ銀の除藻特性を以下のように測定した。１０ｍＬ ＢＧ１１培地（Stanier et al. 1971）を含む検査チューブを、活発に発育するクロレラ・ブルガリス（Chlorella vulgaris）の０．５ｍＬの液体ＢＧ１１培養液を接種し、２０℃の温度下で６５％の相対湿度、および１０００Ｌｕｘ（１６時間／日）にて培養させた。分光光度測定を用いて、２週間後の成長を評価した。２０ｍｇ Ａｇ／Ｌ〜０．０１ｍｇ Ａｇ／Ｌの範囲内の異なる濃度のバイオナノ銀製剤を検査チューブにおける用量によって検査した。ＭＩＣ値は、微生物成長の完全な阻害が見られた最低検査濃度である。バイオナノ銀製品のＭＩＣ値を表７ａに示す。
【０１２５】
〔表７ａ〕
従来技術の方法によって化学的に調製されたナノ銀、硝酸銀、および文献に記載されたデータと比較した場合の、本方法によって生成されたバイオナノ銀の異なる画分についての、複数の細菌、酵母およびカビ菌に対する最小阻害濃度（ＭＩＣ）
【０１２６】
【表１１】
【０１２７】
合計５つの異なる銀ベース化合物を検査し、比較した。本発明を用いて得られた３つの異なるナノ銀画分を比較した。
ｉ）抽出前の生体成分におけるナノ銀
ｉｉ）（０．９〜７ｎｍの粒子を含む）生体成分から抽出されたナノ銀
ｉｉｉ）より大きい銀粒子２０〜２００ｎｍを含む抽出後の残留生体成分
上記３つの画分を従来技術の方法を用いて化学的に調製されたナノ銀、および硝酸銀と比較した。従来技術に基づいて調製されたナノ銀は、非常に凝集を生じやすいことがわかった。
【０１２８】
文献に挙げられた値と比較したＭＩＣ検査を表７ａに示す。
【０１２９】
Ｇ２／１０株を用いた従来技術の方法によって調製されたナノ銀のＭＩＣ値は、硝酸銀のＭＩＣ値（結果は図示せず）と大差がないことがわかった。これは、当該製品におけるＸＲＤ分析、電子顕微鏡法、およびＥＤＸ分析と合致しており、小さい画分のＡｇ+のみがＡｇ０に変換されることを示し、ＡｇＮＯ３からのＡｇ+の活動と比較可能であった。
【０１３０】
表７ａの結果から、抽出ナノ銀は生体成分におけるナノ銀よりも反応性が高く、菌類に対するＭＩＣ値は２分の１であるという結論を導くことができる。抽出ナノ銀は、P. aeruginosa、C. albicans、A. nigerに対して硝酸銀よりも反応性が高いが、S. aureusに対してはAgNO3 よりも低い。従来技術に従って調製されたナノ銀は、抗菌作用が極めて低く、これは凝集が原因と考えられる。＞２０ｎｍの銀ナノ粒子を含む抽出後の残留生体成分は、第一抽出ステップから得られたより小さいナノ銀よりも効果的ではないが、微生物に対して極めて効果的であった。
【０１３１】
ナノ銀および銀ベースの活性の抗菌作用に関してよく生じる問題は、概して、菌類に対する易感染性抗微生物効果であり、これは、抗微生物効果よりもずっと低いことが多い。これによって、抗微生物効果に必要な銀の用量よりも酵母菌またはカビ菌に対する抗真菌効果に必要な銀の用量が多くなる。両方の効果を同時に必要とする場合が多いので、銀の総用量は菌類に対する抑制効果によって決定される。また、当該効果は、従来技術の方法によって得られたナノ銀について見られた。このとき、Aspergillus nigerに対するＭＩＣは４００ｍｇ Ａｇ／Ｌを上回っていた。表７ａの結果から、抽出ナノ銀は、ＭＩＣが４．３ｍｇ Ａｇ／Ｌを用いた場合、グラム陽性菌Pseudomonas aeruginosaに対するよりも、カビ菌Aspergillus nigerに対する方が効果的であることが観察された。一方、ＭＩＣ値がそれぞれ１０および１７．３ｍｇ Ａｇ／Ｌである場合、酵母菌Candida albicansに対する効果は、グラム陽性菌Staphycococcus aureusに対する効果よりも高かった。
【０１３２】
１２．ゼオライトを用いた検査
当該技術分野、特にプラスチック、ポリマー、封止剤、織物繊維または塗料における配合された殺生剤として銀ベースの活性剤を使用する分野においてよく生じる問題は、当該製剤からＡｇ+が欠乏することにある。これは、例えば広範囲のＡｇ+にて市販されているＡｇ+ゼオライトなどのＡｇ+ベースのイオン交換担体、ミネラルまたは樹脂に特に当てはまる。製剤からＡｇ+が急速に欠乏すると、製剤の抗菌効果が欠失し、微生物群を完全に破壊するには不十分なＡｇ+が放出される。この微生物群は、Ａｇ+の抵抗性を構築するのに貢献する可能性がある。これは、陽イオン強度の高い溶媒を製剤上に流す場合には特に当てはまり、Ａｇ+が高濃度存在する陽イオンの樹脂または担体から交換される。代表例は、抗微生物塗料を含み、例えば海水などの塩水に曝露されることによる生体劣化または生物付着を防止する。他の例では、長期に渡って人の汗に曝露される抗微生物織物繊維の曝露である。このような場合、Ａｇ+製剤は、Ａｇ+を急速に消費する。より制御されたＡｇ+放出は、銀ナノ粒子の使用によって維持される。ゼオライトを用いた本方法によって得られたバイオナノ銀を混合するという概念について、詳しく検証した。ゼータ電位測定、比表面積、ＥＤＸ、Ｆ（ＦＴ）ＩＲおよび電子顕微鏡法（ＴＥＭ）によって示された比表面特性をもち、菌類、微生物および藻類に対して優れた抗微生物特性をもつバイオナノ銀は、Ｚｅｏｌｉｔｈ Ｎ(Ｚｅｏｌｉｔｅ Ａｌｕｍｉｎｉｕｍ ｓｉｌｉｃａｔｅ， Ｅｖｅｒｓ Ｅ．Ｋ．， Ｈｏｐｓｔｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ)に被覆された。１０，３８５ｍｇ Ａｇ／Ｌの２０ｍＬバイオナノ銀分散液と１０ｇのZeolith Nとを３０分間混合させ、結果得られた縣濁液を１０５℃の温度下のオーブンにおいて乾燥させた。結果得られたゼオライト粉末は、均一的にライトグレイの色であり、水洗浄によってゼオライトマトリクスからバイオナノ銀を除去することができた。当該ゼオライトは、２％重量のＡｇを含んでいた。
【０１３３】
ゼオライトマトリクスからのＡｇ欠乏における陽イオン強度の高い水の効果を検査するため、２８℃にて攪拌することによって、体積１のバイオナノ銀ゼオライトを体積１０の滅菌人工海水（Ａｑｕａｒｉｕｍ ｓｙｓｔｅｍｓ ＵＳＡから入手可能なＩｎｓｔａｎｔ Ｏｃｅａｎ)で洗浄した。バイオナノ銀ゼオライトの遠心分離および再縣濁によって、洗浄水を２４時間毎に入れ替えた。同様の検査を、２％Ａｇ+重量を含むＳａｎｉｔｉｚｅｄ ＡＧ製の市販のＡｇ+ゼオライト混合物に関しても繰り返した。
【０１３４】
カビ菌類Aspergillus nigerに対するＭＩＣ値を人工海水による洗浄前後に測定した。消毒済みのＡｇ+ゼオライトのＭＩＣ値は、複数の洗浄ステップ中に増加し、一方、バイオナノ銀ゼオライトのＭＩＣ値は殆ど変わらないことがわかった。表７ｂに塩水への曝露後７２時間の結果を示す。これらの結果は、バイオナノ銀の抗菌作用が、ゼオライトのような多孔性担体に固定されたとき、高濃度の塩水への曝露に対し優れた効果をもつことを示す。これは、Ａｇ+ゼオライトイオン交換システムと比較したとき、これらの条件下でのＡｇ+放出をより制御でき、イオン交換の効果の制約が少ないからである。
【０１３５】
〔表７ｂ〕
滅菌人工海水（Ａｑｕａｒｉｕｍ ｓｙｓｔｅｍｓ ＵＳＡから入手可能なＩｎｓｔａｎｔ Ｏｃｅａｎ）への曝露前後での、２％のＡｇ添加におけるイオンＡｇ+ゼオライトと比較した場合の、本願に係るゼオライトのバイオナノ銀から得られたＭＩＣ間の比較
【０１３６】
【表１２】
【０１３７】
１３．ポリマーを用いた検査
上述した本発明の方法によって得られるバイオナノ銀を、それぞれ１００ｍｇ／ｋｇおよび１０００ｍｇ／ｋｇの濃度にて水性アクリル酸Ｒｈｏｄｏｐａｓ Ｕｌｔｒａｆｉｎｅ ＰＲ３５００ (Ｒｈｏｄｉａ， Ａｕｂｅｒｖｉｌｌｉｅｒｓ， Ｆｒａｎｃｅ)に分散させた。ナノ銀をもつポリマーは、パッドを５秒間ポリマー溶液に浸し、その後１００℃の温度下のオーブンにて２４時間乾燥させることによって、５ｍｍの厚さの多孔性ポリプロピレン繊維パッドに被覆された。
【０１３８】
（例えばレストランにおける）自動容器の内部に成長するバイオフィルムによるソフトドリンクの汚染は、実務上頻繁に発生する問題であるので、処理パッドと未処理パッドについて、ソフトドリンクの日常的な洗浄によるパッドの微生物汚染を比較した。
【０１３９】
処理および未処理ポリプロピレンパッドを小さいプラスチック漏斗に接着し、１０ｍｍの内径をもつプラスチックチューブによって１Ｌのソフトドリンク容器に接続させた。日常的に、１００ｍＬのソフトドリンクをポリプロピレンパッド上に流し、その後、１００ｍＬの水道水を流した。二日目から、１０ｍＬの水のサンプルを採取し、総微生物数を測定するために、Ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ Ｓｏｙ 寒天プレートに希釈系列を配置した。結果を表８に示す。
【０１４０】
〔表８〕
ソフトドリンクによる洗浄直後の、ＰＲ３５００によって処理されたポリプロピレン繊維パッドにおいて測定された微生物負荷についてのポリマーＲＨＯＤＯＰＡＳ ＰＲ ３５００ (Ｒｈｏｄｉａ， Ｆｒａｎｃｅ)における異なる濃度にて混合されたバイオナノ銀の影響
【０１４１】
【表１３】
【０１４２】
上記結果から、１０００ｐｐｍのバイオナノ銀（Ａｇ）に被覆されたポリプロピレンパッドにはバイオフィルムの形成は見られず、一方、未処理のパッドはソフトドリンクの微生物汚染の発生源となることがわかった。１００ｐｐｍのＡｇで被覆されたパッドは、４日間は無菌状態を保っていたが、未処理の対照パッドと同様に１週間以内に汚染された。これは、バイオナノ銀が富栄養の環境下でもバイオフィルムの形成を抑制し、表面およびアプリケーションにおける衛生状態を向上させることを示す。さらに、結果は、バイオナノ銀はアクリルエステルポリマーにおいても抗微生物活性を保つことを実証する。
【０１４３】
１４．加熱中の低濃度のＨＣｌを用いた生体成分の処理の効果
Ａｇ+からＡｇ０への変換効率において生体成分の酸性加熱分解の効果を算出するために、６０℃にて５分間、０．１Ｎ ＨＣｌを用いてＧ２／１０乾燥重量を処理した。その後、生体成分を５０００ｘｇにて遠心分離し、脱イオン水で洗浄し、（１）に示されたようなＡｇ０生産のために後鹸化および処理した。
【０１４４】
その後、得られたＡｇ+からＡｇ０への変換効率を、同じ生体成分を含むとともに同一の条件下で実施するが、６０℃での０．１Ｎ ＨＣｌを用いた処理を用いた生体の処理を含まない処理と比較した。
【０１４５】
Ａｇ０への変換効率は、反応混合物における残留Ａｇ+の測定によって比較によって決定された。
【０１４６】
各反応液に投与された１０００ｍｇ Ａｇ+／Ｌの濃度から、本方法に係るＡｇ０生成処理後に、６０℃での０．１Ｎ ＨＣｌを用いて生体成分を処理した場合、酸性加熱分解ステップをしないものと反応を比較すると、反応混合物の溶液中の残留が１３８ｍｇＡｇ+／Ｌ少ないことがわかった。これは、鹸化の前に弱酸性の加熱分解ステップによって生体成分を処理する場合、Ａｇ+からＡｇ０への変換効率がより高くなることを示す。
【図面の簡単な説明】
【０１４７】
【図１】複数のＴＥＭマイクロコピー分析から得られた、ラクトバチルス・ファーメンタム(lactobacillus fermentum)から抽出されたバイオナノ銀の粒径分布を表す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２０〜８０重量％のラクトバチルス属の生体成分と結合した銀ナノ粒子であって、平均粒径と比表面積（ＢＥＴ）との比率が０．０１５〜０．１５ｎｍ／ｍ２／ｇであることを特徴とする銀ナノ粒子。
【請求項２】
３〜７の等電点を有する、請求項１に記載の銀ナノ粒子。
【請求項３】
上記生体成分がプロバイオティックスであることを特徴とする請求項１または２に記載の銀ナノ粒子。
【請求項４】
上記生体成分における、細胞外被、もしくはＳ−層、もしくは糖衣の、上または内部に分散している、請求項１〜３のいずれか一項に記載の銀ナノ粒子。
【請求項５】
平均粒径１〜８ｎｍを有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の銀ナノ粒子。
【請求項６】
３０〜９０ｍ２／ｇの比表面積（ＢＥＴ）を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の銀ナノ粒子。
【請求項７】
Ａｇ０銀ナノ粒子を含む細菌のバイオマスが形成されるまで、アンモニアおよびアルカリ金属水酸化物の存在下において、少なくとも４ｍＭの銀塩を含む水溶液でラクトバチルス属の細菌を培養するステップを含む、銀ナノ粒子の製造方法。
【請求項８】
濃縮アルカリ金属水酸化物または濃縮無機酸または酵素を用いて、上記バイオマスから上記Ａｇ０銀ナノ粒子を抽出するステップをさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
上記培養するステップに使用される上記細菌は、当該細菌の細胞外被における糖リッチ構造を増大させるために前処理されることを特徴とする請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
上記培養するステップに使用される上記細菌は、Ｃ／Ｎ比が少なくとも１０：１である発酵によって、前処理されることを特徴とする請求項７〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
上記培養するステップに使用される上記細菌は、少なくとも２０ｇ／Ｌの濃度、好適には５０ｇ／Ｌを上回る濃度の発酵性糖の存在下で発酵することにより、前処理されることを特徴とする請求項７〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
上記培養するステップに使用される上記細菌は、当該細菌の乾燥重量が少なくとも２００％まで増大するまで、発酵によって前処理されることを特徴とする請求項７〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
上記培養するステップに使用される上記細菌は、少なくとも１０時間の発酵によって前処理されることを特徴とする請求項７〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
上記培養するステップに使用される上記細菌は、４℃〜４０℃の範囲内の温度下での発酵によって前処理されることを特徴とする請求項７〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
上記培養するステップに使用される上記細菌は、糖衣、細胞外被、および／またはＳ−層の酸加水分解によって前処理されることを特徴とする請求項７〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
上記培養するステップに使用される上記細菌は、３５℃を上回る温度下での酸加水分解によって前処理されることを特徴とする請求項７〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
上記抽出するステップを少なくとも５分間実行することを特徴とする請求項８〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
上記濃縮アルカリ金属水酸化物が０．０１Ｎ〜２．０Ｎ（好適には０．５〜２．０Ｎ）の水酸化ナトリウムであり、上記抽出するステップ（ｂ）が少なくとも７０℃の温度下にて実行されることを特徴とする請求項７〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
上記濃縮無機強酸が１Ｎ〜１０Ｎの硫酸であり、上記抽出するステップが少なくとも０℃の温度下にて実行されることを特徴とする請求項８〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
上記抽出するステップが１００℃以下の温度下にて実行されることを特徴とする請求項８〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
上記培養するステップが少なくとも１時間実行されることを特徴とする請求項７〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
上記培養するステップが１０〜４０℃の温度下にて実行されることを特徴とする請求項７〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
還元剤またはキャップ剤（例えば界面活性剤）を外部から加えずに上記培養するステップを実行することを特徴とする請求項７〜２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
上記抽出するステップは、抽出された上記Ａｇ０銀ナノ粒子のスラリーの遠心分離または濾過を含むことを特徴とする請求項８〜２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
上記抽出するステップが、（ｉ）平均粒径１〜８ｎｍをもち、上記細菌の上記細胞外被または糖衣、および／またはＳ−層に結合した銀ナノ粒子の第一画分と、（ｉｉ）平均粒径２０〜２００ｎｍをもち、上記細菌の細胞質に結合された銀ナノ粒子の第二画分とを生成することを特徴とする請求項８〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
上記第二画分（ｉｉ）から上記第一画分（ｉ）を分離させるステップをさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
上記第一画分（ｉ）と上記第二画分（ｉｉ）との重量比が、１：１よりも高いことを特徴とする請求項２５または２６に記載の方法。
【請求項２８】
上記第二画分（ｉｉ）が導電性インクまたは触媒成分として注入されることを特徴とする請求項２５〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
上記第一画分（ｉ）および／または上記第二画分（ｉｉ）が抗微生物組成物の成分として注入されることを特徴とする請求項２５〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
請求項８〜２９のいずれか一項に記載の方法によって生成される銀ナノ粒子画分。
【請求項３１】
請求項１〜６、または３０のいずれか一項に記載の銀ナノ粒子の有効量を含む抗微生物組成物。
【請求項３２】
１つ以上の抗微生物剤をさらに含む、請求項３１に記載の抗微生物組成物。
【請求項３３】
上記銀ナノ粒子がゼオライトまたはセライトと混合されることを特徴とする請求項３１または３２に記載の抗微生物組成物。
【請求項３４】
抗微生物活性を有する物品または組成物を製造するための、請求項１〜６、または３０のいずれかに記載の銀ナノ粒子の使用。
【請求項３５】
上記銀ナノ粒子の有効量を上記物品または組成物の中に分散させる、あるいは、上記物品または組成物の中に含浸させることを特徴とする請求項３４に記載の使用。
【請求項３６】
抗微生物活性を有する物品または組成物の製造方法であって、請求項１〜６または３０のいずれか一項に記載の銀ナノ粒子を上記物品または組成物に分散させる、あるいは含浸させるステップを含む方法。
【請求項３７】
請求項１〜６または３０のいずれか一項に記載の銀ナノ粒子が中に分散している、抗微生物特性を有する物品。
【請求項３８】
上記銀ナノ粒子がゼオライトまたはセライトと混合されていることを特徴とする請求項３７に記載の物品。
【請求項１】
２０〜８０重量％のラクトバチルス属の生体成分と結合した銀ナノ粒子であって、平均粒径と比表面積（ＢＥＴ）との比率が０．０１５〜０．１５ｎｍ／ｍ２／ｇであることを特徴とする銀ナノ粒子。
【請求項２】
３〜７の等電点を有する、請求項１に記載の銀ナノ粒子。
【請求項３】
上記生体成分がプロバイオティックスであることを特徴とする請求項１または２に記載の銀ナノ粒子。
【請求項４】
上記生体成分における、細胞外被、もしくはＳ−層、もしくは糖衣の、上または内部に分散している、請求項１〜３のいずれか一項に記載の銀ナノ粒子。
【請求項５】
平均粒径１〜８ｎｍを有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の銀ナノ粒子。
【請求項６】
３０〜９０ｍ２／ｇの比表面積（ＢＥＴ）を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の銀ナノ粒子。
【請求項７】
Ａｇ０銀ナノ粒子を含む細菌のバイオマスが形成されるまで、アンモニアおよびアルカリ金属水酸化物の存在下において、少なくとも４ｍＭの銀塩を含む水溶液でラクトバチルス属の細菌を培養するステップを含む、銀ナノ粒子の製造方法。
【請求項８】
濃縮アルカリ金属水酸化物または濃縮無機酸または酵素を用いて、上記バイオマスから上記Ａｇ０銀ナノ粒子を抽出するステップをさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
上記培養するステップに使用される上記細菌は、当該細菌の細胞外被における糖リッチ構造を増大させるために前処理されることを特徴とする請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
上記培養するステップに使用される上記細菌は、Ｃ／Ｎ比が少なくとも１０：１である発酵によって、前処理されることを特徴とする請求項７〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
上記培養するステップに使用される上記細菌は、少なくとも２０ｇ／Ｌの濃度、好適には５０ｇ／Ｌを上回る濃度の発酵性糖の存在下で発酵することにより、前処理されることを特徴とする請求項７〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
上記培養するステップに使用される上記細菌は、当該細菌の乾燥重量が少なくとも２００％まで増大するまで、発酵によって前処理されることを特徴とする請求項７〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
上記培養するステップに使用される上記細菌は、少なくとも１０時間の発酵によって前処理されることを特徴とする請求項７〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
上記培養するステップに使用される上記細菌は、４℃〜４０℃の範囲内の温度下での発酵によって前処理されることを特徴とする請求項７〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
上記培養するステップに使用される上記細菌は、糖衣、細胞外被、および／またはＳ−層の酸加水分解によって前処理されることを特徴とする請求項７〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
上記培養するステップに使用される上記細菌は、３５℃を上回る温度下での酸加水分解によって前処理されることを特徴とする請求項７〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
上記抽出するステップを少なくとも５分間実行することを特徴とする請求項８〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
上記濃縮アルカリ金属水酸化物が０．０１Ｎ〜２．０Ｎ（好適には０．５〜２．０Ｎ）の水酸化ナトリウムであり、上記抽出するステップ（ｂ）が少なくとも７０℃の温度下にて実行されることを特徴とする請求項７〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
上記濃縮無機強酸が１Ｎ〜１０Ｎの硫酸であり、上記抽出するステップが少なくとも０℃の温度下にて実行されることを特徴とする請求項８〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
上記抽出するステップが１００℃以下の温度下にて実行されることを特徴とする請求項８〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
上記培養するステップが少なくとも１時間実行されることを特徴とする請求項７〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
上記培養するステップが１０〜４０℃の温度下にて実行されることを特徴とする請求項７〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
還元剤またはキャップ剤（例えば界面活性剤）を外部から加えずに上記培養するステップを実行することを特徴とする請求項７〜２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
上記抽出するステップは、抽出された上記Ａｇ０銀ナノ粒子のスラリーの遠心分離または濾過を含むことを特徴とする請求項８〜２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
上記抽出するステップが、（ｉ）平均粒径１〜８ｎｍをもち、上記細菌の上記細胞外被または糖衣、および／またはＳ−層に結合した銀ナノ粒子の第一画分と、（ｉｉ）平均粒径２０〜２００ｎｍをもち、上記細菌の細胞質に結合された銀ナノ粒子の第二画分とを生成することを特徴とする請求項８〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
上記第二画分（ｉｉ）から上記第一画分（ｉ）を分離させるステップをさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
上記第一画分（ｉ）と上記第二画分（ｉｉ）との重量比が、１：１よりも高いことを特徴とする請求項２５または２６に記載の方法。
【請求項２８】
上記第二画分（ｉｉ）が導電性インクまたは触媒成分として注入されることを特徴とする請求項２５〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
上記第一画分（ｉ）および／または上記第二画分（ｉｉ）が抗微生物組成物の成分として注入されることを特徴とする請求項２５〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
請求項８〜２９のいずれか一項に記載の方法によって生成される銀ナノ粒子画分。
【請求項３１】
請求項１〜６、または３０のいずれか一項に記載の銀ナノ粒子の有効量を含む抗微生物組成物。
【請求項３２】
１つ以上の抗微生物剤をさらに含む、請求項３１に記載の抗微生物組成物。
【請求項３３】
上記銀ナノ粒子がゼオライトまたはセライトと混合されることを特徴とする請求項３１または３２に記載の抗微生物組成物。
【請求項３４】
抗微生物活性を有する物品または組成物を製造するための、請求項１〜６、または３０のいずれかに記載の銀ナノ粒子の使用。
【請求項３５】
上記銀ナノ粒子の有効量を上記物品または組成物の中に分散させる、あるいは、上記物品または組成物の中に含浸させることを特徴とする請求項３４に記載の使用。
【請求項３６】
抗微生物活性を有する物品または組成物の製造方法であって、請求項１〜６または３０のいずれか一項に記載の銀ナノ粒子を上記物品または組成物に分散させる、あるいは含浸させるステップを含む方法。
【請求項３７】
請求項１〜６または３０のいずれか一項に記載の銀ナノ粒子が中に分散している、抗微生物特性を有する物品。
【請求項３８】
上記銀ナノ粒子がゼオライトまたはセライトと混合されていることを特徴とする請求項３７に記載の物品。
【図１】
【公表番号】特表２０１１−５１４８８３（Ｐ２０１１−５１４８８３Ａ）
【公表日】平成２３年５月１２日（２０１１．５．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５４１０６５（Ｐ２０１０−５４１０６５）
【出願日】平成２１年１月２日（２００９．１．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５００１９
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０８７１２２
【国際公開日】平成２１年７月１６日（２００９．７．１６）
【出願人】（５１０１８５９５２）ジャンセン ファーマシューティカ ナムローゼ フェンノートシャップ (1)
【氏名又は名称原語表記】Ｊａｎｓｓｅｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ Ｎ．Ｖ．
【住所又は居所原語表記】Ｔｕｒｎｈｏｕｔｓｅｗｅｇ ３０，Ｂ−２３４０ Ｂｅｅｒｓｅ，Ｂｅｌｇｉｕｍ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年５月１２日（２０１１．５．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１月２日（２００９．１．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５００１９
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０８７１２２
【国際公開日】平成２１年７月１６日（２００９．７．１６）
【出願人】（５１０１８５９５２）ジャンセン ファーマシューティカ ナムローゼ フェンノートシャップ (1)
【氏名又は名称原語表記】Ｊａｎｓｓｅｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ Ｎ．Ｖ．
【住所又は居所原語表記】Ｔｕｒｎｈｏｕｔｓｅｗｅｇ ３０，Ｂ−２３４０ Ｂｅｅｒｓｅ，Ｂｅｌｇｉｕｍ
【Ｆターム（参考）】
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