油性酵母（例えばヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ））におけるω脂肪酸に富んだ微生物油の製造で使用するのに適したアシルトランスフェラーゼが提供される。具体的にはジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ１）をコードする遺伝子が、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）およびクサレケカビ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）から単離された。これらの遺伝子は、酵母における油生合成の最終段階に関与する酵素をコードする。それぞれは、油性酵母の油中に生成される多価不飽和脂肪酸量を変更するのに重要な役割を果たすことが期待される。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号１４および１８よりなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする単離された核酸分子、
（ｂ）０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６５℃、および２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄、次いで０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳのハイブリダイゼーション条件下で（ａ）とハイブリダイズする単離された核酸分子、または
（ｃ）（ａ）または（ｂ）と完全に相補である単離された核酸分子
よりなる群から選択される、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ−１酵素をコードする単離された核酸分子。
【請求項２】
配列番号１３および１７よりなる群から選択される請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項３】
請求項１に記載の単離された核酸分子によってコードされるポリペプチド。
【請求項４】
請求項２に記載の単離された核酸分子によってコードされるポリペプチド。
【請求項５】
配列番号１４に記載の配列を有するポリペプチドと比較して、ＢＬＡＳＴＰ法によるアラインメントに基づいて少なくとも７０％の同一性を有する少なくともアミノ酸５２６個のジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ−１酵素をコードする第１のヌクレオチド配列、または
第１のヌクレオチド配列の相補体を含んでなる第２のヌクレオチド配列
を含んでなる単離された核酸分子。
【請求項６】
配列番号１８に記載の配列を有するポリペプチドと比較して、ＢＬＡＳＴＰ法によるアラインメントに基づいて少なくとも７０％の同一性を有する少なくともアミノ酸５２５個のジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ−１酵素をコードする第１のヌクレオチド配列、または
第１のヌクレオチド配列の相補体を含んでなる第２のヌクレオチド配列
を含んでなる単離された核酸分子。
【請求項７】
（ａ）配列番号１６に記載のアミノ酸配列をコードする単離された核酸分子、
（ｂ）０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６５℃、および２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄、次いで０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳのハイブリダイゼーション条件下で（ａ）とハイブリダイズする単離された核酸分子、または
（ｃ）（ａ）または（ｂ）と完全に相補である単離された核酸分子
よりなる群から選択される、アシル−ＣｏＡ：ステロール−アシルトランスフェラーゼをコードする単離された核酸分子。
【請求項８】
配列番号１５よりなる群から選択される請求項７に記載の単離された核酸分子。
【請求項９】
請求項７に記載の単離された核酸分子によってコードされるポリペプチド。
【請求項１０】
請求項８に記載の単離された核酸分子によってコードされるポリペプチド。
【請求項１１】
配列番号１６に記載の配列を有するポリペプチドと比較して、ＢＬＡＳＴＰ法によるアラインメントに基づいて少なくとも７０％の同一性を有する少なくともアミノ酸５４３個のアシル−ＣｏＡ：ステロール−アシルトランスフェラーゼをコードする第１のヌクレオチド配列、または
第１のヌクレオチド配列の相補体を含んでなる第２のヌクレオチド配列
を含んでなる単離された核酸分子。
【請求項１２】
適切な制御配列に作動的に結合した請求項１または７のいずれかに記載の単離された核酸分子を含んでなるキメラ遺伝子。
【請求項１３】
請求項１２に記載のキメラ遺伝子を含んでなる形質転換宿主細胞。
【請求項１４】
藻類、細菌、カビ、真菌、および酵母よりなる群から選択される請求項１３に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項１５】
酵母が油性酵母である請求項１４に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項１６】
油性酵母細胞が、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、およびリポミセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）よりなる群から選択される請求項１５に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項１７】
宿主細胞がヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）である請求項１６に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項１８】
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）が、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃８８６２、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃１８９４４、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃７６９８２、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃９０８１２、およびヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＬＧＡＭＳ（７）１よりなる群から選択される株である請求項１７に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項１９】
ａ）ゲノムライブラリーを請求項１に記載の核酸分子で探索し、
ｂ）請求項１に記載の核酸分子とハイブリダイズするＤＮＡクローンを同定し、
ｃ）ステップ（ｂ）で同定されたクローンを含んでなるゲノム断片を配列決定することを含んでなり、
配列決定されたゲノム断片が、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ−１酵素をコードする、
ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ−１酵素をコードする核酸分子の取得方法。
【請求項２０】
ａ）配列番号１３および１７よりなる群から選択される配列の一部に対応する少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを合成し、
ｂ）ステップ（ａ）のオリゴヌクレオチドプライマーを使用してクローニングベクター中に存在するインサートを増幅させることを含んでなり、
増幅されたインサートが、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ−１をコードするアミノ酸配列の一部をコードする
ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ−１酵素をコードする核酸分子の取得方法。
【請求項２１】
請求項１９または２０に記載の方法の生成物。
【請求項２２】
ａ）配列番号３１、
ｂ）配列番号３２、
ｃ）配列番号３３、
ｄ）配列番号３４、
ｅ）配列番号３５、
ｆ）配列番号３６、
ｇ）配列番号３７、
ｈ）配列番号２３、
ｉ）配列番号２４、
ｊ）配列番号２５、
ｋ）配列番号２６、
ｌ）配列番号２７、
ｍ）配列番号２８、
ｎ）配列番号２９、および
ｏ）配列番号３０よりなる群から選択されるアミノ酸モチーフをコードする単離された核酸分子。
【請求項２３】
ａ）配列番号３１、
ｂ）配列番号３２、
ｃ）配列番号３３、
ｄ）配列番号３４、
ｅ）配列番号３５、
ｆ）配列番号３６、
ｇ）配列番号３７、
ｈ）配列番号２３、
ｉ）配列番号２４、
ｊ）配列番号２５、
ｋ）配列番号２６、
ｌ）配列番号２７、
ｍ）配列番号２８、
ｎ）配列番号２９、および
ｏ）配列番号３０よりなる群から選択されるアミノ酸モチーフ配列。
【請求項２４】
（ａ）（ｉ）適切な制御配列の制御下にある配列番号１４、１８、１９、２０、２１、および２２よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有するジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ−１酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子、および
（ｉｉ）脂肪酸供給源
を含んでなる、形質転換された宿主細胞を準備し、
（ｂ）ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ−１酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子が発現する条件下でステップ（ａ）の細胞を生育させて、脂肪酸をトリアシルグリセロールに転移させ、
（ｃ）ステップ（ｂ）のトリアシルグリセロールを場合により回収すること
を含んでなる形質転換された宿主細胞中のトリアシルグリセロール含量の増大方法。
【請求項２５】
（ａ）（ｉ）機能性ω−３／ω−６脂肪酸生合成経路をコードする遺伝子、
（ｉｉ）適切な制御配列の制御下にある配列番号１４、１８、１９、２０、２１、および２２よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有するジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ−１酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子
を含んでなる形質転換された宿主細胞を準備し、
（ｂ）（ｉ）および（ｉｉ）の遺伝子が発現する条件下でステップ（ａ）の細胞を生育させて、少なくとも１つのω−３またはω−６脂肪酸の生産、およびそのトリアシルグリセロールへの転移がもたらされ、
（ｃ）ステップ（ｂ）のトリアシルグリセロールを場合により回収すること
を含んでなる形質転換された宿主細胞中のトリアシルグリセロールのω−３またはω−６脂肪酸含量の増大方法。
【請求項２６】
（ａ）（ｉ）適切な制御配列の制御下にある、
１）配列番号３１、
２）配列番号３２、
３）配列番号３３、
４）配列番号３４、
５）配列番号３５、
６）配列番号３６、および
７）配列番号３７に記載のアミノ酸モチーフの全てを含んでなる、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ−１酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子、および
（ｉｉ）脂肪酸供給源
を含んでなる形質転換宿主細胞を準備し、
（ｂ）ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ−１酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子が発現し、脂肪酸をトリアシルグリセロールに転移させる条件下で、ステップ（ａ）の細胞を生育させ、
（ｃ）ステップ（ｂ）のトリアシルグリセロールを場合により回収すること
を含んでなる形質転換宿主細胞中のトリアシルグリセロール含量の増大方法。
【請求項２７】
（ａ）（ｉ）適切な制御配列の制御下にある、
１）配列番号２３、
２）配列番号２４、
３）配列番号２５、
４）配列番号２６、
５）配列番号２７、
６）配列番号２８、
７）配列番号２９、および
８）配列番号３０に記載のアミノ酸モチーフの全てを含んでなる、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ−１酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子、および
（ｉｉ）脂肪酸供給源
を含んでなる形質転換宿主細胞を準備し、
（ｂ）ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ−１酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子が発現し、脂肪酸をトリアシルグリセロールに転移させる条件下で、ステップ（ａ）の細胞を生育させ、
（ｃ）ステップ（ｂ）のトリアシルグリセロールを場合により回収すること
を含んでなる形質転換宿主細胞中のトリアシルグリセロール含量の増大方法。
【請求項２８】
（ａ）（ｉ）機能性のω−３／ω−６脂肪酸生合成経路をコードする遺伝子、および
（ｉｉ）適切な制御配列の制御下にある、
１）配列番号３１、
２）配列番号３２、
３）配列番号３３、
４）配列番号３４、
５）配列番号３５、
６）配列番号３６、および
７）配列番号３７に記載のアミノ酸モチーフの全てを含んでなる、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ−１酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子
を含んでなる形質転換宿主細胞を準備し、
（ｂ）（ｉ）および（ｉｉ）の遺伝子が発現し、少なくとも１つのω−３またはω−６脂肪酸の生成、およびそのトリアシルグリセロールへの転移がもたらされる条件下で、ステップ（ａ）の細胞を生育させ、
（ｃ）ステップ（ｂ）のトリアシルグリセロールを場合により回収すること
を含んでなる形質転換宿主細胞中のトリアシルグリセロールのω−３またはω−６脂肪酸含量の増大方法。
【請求項２９】
（ａ）（ｉ）機能性のω−３／ω−６脂肪酸生合成経路をコードする遺伝子、および
（ｉｉ）適切な制御配列の制御下にある、
１）配列番号２３、
２）配列番号２４、
３）配列番号２５、
４）配列番号２６、
５）配列番号２７、
６）配列番号２８、
７）配列番号２９、および
８）配列番号３０に記載のアミノ酸モチーフの全てを含んでなる、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ−１酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子
を含んでなる形質転換宿主細胞を準備し、
（ｂ）（ｉ）および（ｉｉ）の遺伝子が発現し、少なくとも１つのω−３またはω−６脂肪酸の生成、およびそのトリアシルグリセロールへの転移がもたらされる条件下で、ステップ（ａ）の細胞を生育させ、
（ｃ）ステップ（ｂ）のトリアシルグリセロールを場合により回収すること
を含んでなる形質転換宿主細胞中のトリアシルグリセロールのω−３またはω−６脂肪酸含量の増大方法。
【請求項３０】
機能性のω−３／ω−６脂肪酸生合成経路をコードする遺伝子が、デサチュラーゼおよびエロンガーゼよりなる群から選択される請求項２５、２８または２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
デサチュラーゼが、Δ９デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Δ８デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼ、およびΔ４デサチュラーゼよりなる群から選択される請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
宿主細胞が、藻類、細菌、カビ、真菌、および酵母よりなる群から選択される請求項２４〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
宿主細胞が油性酵母である請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
油性酵母が、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、およびリポミセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）よりなる群から選択される属のメンバーである請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
油性酵母がヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）である請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）が、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃８８６２、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃１８９４４、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃７６９８２、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃９０８１２、およびヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＬＧＡＭＳ（７）１よりなる群から選択される株である請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
脂肪酸が、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、γ−リノール酸、ジホモ−γ−リノール酸、アラキドン酸、α−リノール酸、ステアリドン酸、エイコサテトラエン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサペンタエン酸、エイコサジエン酸、およびエイコサトリエン酸よりなる群から選択される請求項２４、２５、２６、２７、２８または２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
（ａ）ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ−１活性を有することが疑われるポリペプチドのアミノ酸配列を得て、
（ｂ）ステップ（ａ）のポリペプチドのアミノ酸配列中で、
１）配列番号３１、
２）配列番号３２、
３）配列番号３３、
４）配列番号３４、
５）配列番号３５、
６）配列番号３６、および
７）配列番号３７に記載のアミノ酸モチーフ配列の全ての存在を同定すること
を含んでなり、
ポリペプチド中のステップ（ａ）のモチーフ配列全ての存在が、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ−１活性の徴候である
ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ−１活性を有するポリペプチドの同定法。
【請求項３９】
（ａ）ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ−１活性を有することが疑われる真菌ポリペプチドのアミノ酸配列を得て、
（ｂ）ステップ（ａ）のポリペプチドのアミノ酸配列中で、
１）配列番号２３、
２）配列番号２４、
３）配列番号２５、
４）配列番号２６、
５）配列番号２７、
６）配列番号２８、
７）配列番号２９、および
８）配列番号３０に記載のアミノ酸モチーフ配列の全ての存在を同定すること
を含んでなり、
ポリペプチド中のステップ（ａ）のモチーフ配列の全ての存在が、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ−１活性の徴候である
ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ−１活性を有する真菌ポリペプチドの同定法。

【図１】

【図２】

【図３Ａ】

【図３Ｂ】

【図３Ｃ】

【図４Ａ】

【図４Ｂ】

【図４Ｃ】

【図４Ｄ】

【図５】

【図６Ａ】

【図６Ｂ】

【図６Ｃ】

【図６Ｄ】

【図６Ｅ】

【図７Ａ】

【図７Ｂ】

【図７Ｃ】

【図７Ｄ】

【図７Ｅ】

【図８Ａ】

【図８Ｂ】

【図８Ｃ】

【図８Ｄ】

【図８Ｅ】

【図８Ｆ】

【図８Ｇ】

【図８Ｈ】

【公表番号】特表２００８−５２４９８４（Ｐ２００８−５２４９８４Ａ）
【公表日】平成２０年７月１７日（２００８．７．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５４０１４５（Ｐ２００７−５４０１４５）
【出願日】平成１７年１１月３日（２００５．１１．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０４０３４５
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０５２９１４
【国際公開日】平成１８年５月１８日（２００６．５．１８）
【出願人】（３９００２３６７４）イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー (2,692)
【氏名又は名称原語表記】Ｅ．Ｉ．ＤＵ　ＰＯＮＴ　ＤＥ　ＮＥＭＯＵＲＳ　ＡＮＤ　ＣＯＭＰＡＮＹ
【Ｆターム（参考）】