治療活性物質の作用を増強するための高分子化環状ニトロキシドラジカル化合物の使用
【課題】生体内標的組織または細胞への治療活性物質のデリバリー効率を高めるかまたは該標的における治療活性物質の有する活性を増強するための製薬学的製剤の提供。
【解決手段】有効成分として、高分子化環状ニトロキシドラジカル化合物（下記一般式（ＩＩ））を含んでなる、製薬学的製剤。
「式中、Ａは、非置換または置換Ｃ１−Ｃ１２アルコキシを表し、Ｌ１は、原子化結合、−（ＣＨ２）ｃＳ−、−ＣＯ（ＣＨ２）ｃＳ−、からなる群より選ばれる連結基を表し、Ｌ２は、メチルイミノ、メチルイミノメチル、メチルオキシ、メチルオキシメチル、メチルエステル及びメチルエステルメチルからなる群より選ばれる連結基を表す。」
【解決手段】有効成分として、高分子化環状ニトロキシドラジカル化合物（下記一般式（ＩＩ））を含んでなる、製薬学的製剤。
「式中、Ａは、非置換または置換Ｃ１−Ｃ１２アルコキシを表し、Ｌ１は、原子化結合、−（ＣＨ２）ｃＳ−、−ＣＯ（ＣＨ２）ｃＳ−、からなる群より選ばれる連結基を表し、Ｌ２は、メチルイミノ、メチルイミノメチル、メチルオキシ、メチルオキシメチル、メチルエステル及びメチルエステルメチルからなる群より選ばれる連結基を表す。」
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高分子化環状ニトロキシドラジカル化合物を有効成分として含有する治療活性物質の作用を増強するための製薬学的製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、抗がん剤をナノカプセルで内包することで副作用を無くすかもしくは低減し、また治療効率を上げられるドラックデリバリーシステムの研究・開発に注目が集まっている。実際に、高分子ミセルを用いた薬剤は、臨床試験まで進んでいる例がある。
【０００３】
一方、抗がん剤の効能を向上せしめる別の方策として、例えば、抗炎症作用、抗アレルギー作用、糖・たんぱく質・資質等の代謝、生体の免疫反応等に影響を及ぼすことの知られているデキサメタゾンを腫瘍に皮下投与することにより、カルボプラチン、ゲムシタビン、アドリアマイシンなどの抗がん剤の効果を向上させ得ることが報告されている（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３）。しかしながら、デキサメタゾンのような低分子化合物は腫瘍近傍への集積効率が悪いことが問題となっている。
【０００４】
このような背景の下、上記のような薬剤に限らず、抗がん剤それら自体を初めとする多種多様な治療活性物質の生体内標的へのデリバリー効率または該標的における所期の活性を増強するための手段の開発ができれば当該技術分野にとって極めて重要な意義を有するであろう。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｌｅｇｇａｓ Ｍ．Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００９；６３（４）：７３１−７４３
【非特許文献２】Ｗａｎｇ Ｈ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００４；１０（５）：１６３３−１６４４５
【非特許文献３】Ｗａｎｇ Ｈ．Ｉｎｔ Ｊ Ｏｎｃｏｌ．２００７；３０（４）：９４７−９５３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、本発明は、多種多様な治療活性物質の生体内標的へのデリバリー効率または該標的において該活性物質が本来有している活性を増強するための手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者等は上記課題を解決するための手段として、本発明者等が先に提案した、高分子化環状ニトロキシドラジカル化合物が効果的に利用できることを、ここに見出し本願発明を完成した。具体的には、該高分子化環状ニトロキシドラジカル化合物は、低分子の、例えば、２，２，６，６−テトラメチルピペリジノオキシラジカル（ＴＥＭＰＯ）を特定のブロック共重合体に共有結合せしめて高分子化した化合物であり、水性媒体中でｎｍオーダーの径をもつ高分子ミセルを形成できる化合物である。かようなナノ粒子中に内包されたＴＥＭＰＯは、低分子のＴＥＭＰＯの血中半減期が約２分であるのに対し、数時間以上と圧倒的な安定性を示した（Ｙｏｓｈｉｔｏｍｉ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ：１０（３），５９６（２００９））。そして、該化合物それ自体が、活
性酸素またはフリーラジカルが関与する疾患または症状、例えば、脳梗塞、心筋梗塞、脳浮腫、神経脱落症状、炎症、高血圧、高脂血症、肥満、脳血管損傷および神経細胞損傷等に有効であることが確認乃至推測されている（ＷＯ２００９／１３３６４７ Ａ１参照）。
【０００８】
これらの環状ニトロキシドラジカル化合物含有ナノ粒子（以下、“ＲＮＰ”と略記する場合あり）は、疎水性コア層に水難溶性薬物を内包できるだけでなく、静電相互作用を利用して遺伝子との複合体を形成することができる。また、このようなＲＮＰは、それらの奏するＥｎｈａｎｃｅｄ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ（ＥＰＲ）効果により腫瘍近傍、または炎症組織へ集積することも明らかとなった。このようなＲＮＰを用いて、抗がん剤との相互作用について調べてみたところ、動物実験で抗がん剤の抗腫瘍活性を向上させることが確認された。さらに、該ＲＮＰは、遺伝子デリバリーの増強効果があることも明らかとなってきた。
【０００９】
したがって、本発明によれば、主たる態様の発明として以下のものが提供される。
【００１０】
生体内標的組織または細胞への治療活性物質のデリバリー効率を高めるかまたは該標的における該治療活性物質の有する活性を増強するための製薬学的製剤であって、有効成分として、高分子化環状ニトロキシドラジカル化合物を含んでなる、該製薬学的製剤。
【００１１】
具体的な態様としては、該治療活性物質が抗腫瘍剤または核酸分子である、前記製薬学的製剤。
【００１２】
高分子化環状ニトロキシドラジカル化合物と抗腫瘍剤または核酸分子とを組み合わせたことを特徴とする抗腫瘍剤または核酸分子で処置することの必要な疾患を予防または治療するための製薬学的製剤。
【００１３】
抗腫瘍剤または核酸分子で治療することの必要な哺乳動物の治療方法であって、該哺乳動物に高分子化環状ニトロキシドラジカル化合物および抗腫瘍剤または核酸分子を、それぞれ前後して、または同時に投与するステップを含んでなる、該治療方法。
【００１４】
前記高分子化環状ニトロキシドラジカル化合物としては、限定されるものでないが、好ましくは、一般式（ＩＩ）
【００１５】
【化１】
【００１６】
式中、Ａは、非置換または置換Ｃ１−Ｃ１２アルコキシを表し、置換されている場合の置換基は、ホルミル基または式Ｒ１Ｒ２ＣＨ−の基を表し、ここで、Ｒ１及びＲ２は独立して、Ｃ１−Ｃ４アルコキシまたはＲ１とＲ２は一緒になって−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ−、−Ｏ（ＣＨ２）３Ｏ−もしくは−Ｏ（ＣＨ２）４Ｏ−を表し、
Ｌ１は、原子化結合、−（ＣＨ２）ｃＳ−、−ＣＯ（ＣＨ２）ｃＳ−、からなる群より
選ばれる連結基を表し、ここでｃは１ないし５、好ましくは２の整数であり、
Ｌ２は、メチルイミノ、メチルイミノメチル、メチルオキシ、メチルオキシメチル、メチルエステル及びメチルエステルメチルからなる群より選ばれる連結基を表し、
Ｒは、Ｒの総数ｎの少なくとも５０％が２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル−４−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−１−オキシル−３−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリン−１−オキシル−３−イル及び２，４，４−トリメチル−１，３−オキサゾリジン−３−オキシル−２−イル、２，４，４−トリメチル−１，３−チアゾリジン−３−オキシル−２−イル及び２，４，４−トリメチル−イミダゾリンジン−３−オキシル−２−イルからなる群より選ばれる環状ニトロキシドラジカル化合物の残基を表し、存在する場合には、残りのＲが水素原子、ハロゲン原子またはヒドロキシ基であり、
ｍは、２０〜５，０００の整数を表し、そして
ｎは、３〜１，０００の整数を表す、
で表される化合物を挙げることができる。
【発明の効果】
【００１７】
本発明に従うＲＮＰは、上述したとおり、Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ（ＥＰＲ）効果により腫瘍近傍へ集積し、細胞の炎症反応を抑制することにより、標的組織または細胞において治療活性物質本来の活性を効率よく発揮できるので、当該活性を増強できる。なお、治療活性物質が核酸分子である場合には、腫瘍、または炎症組織近傍において、その発現効率を高めることもできる。
【発明の詳細な説明】
【００１８】
本発明を規定する用語等について以下、より詳細に説明する。
【００１９】
生体内標的組織または細胞は、治療活性物質をデリバリーするための哺乳動物、好ましくはヒト、の生体の器官もしくは組織、またはそれらの細胞を意味し、前者としては、脳、血液、肺、心臓、肝臓、腎臓、膵臓、脾臓、消化管、皮膚、膀胱やその他器官の腫瘍、炎症組織を挙げることができる。
【００２０】
高分子化環状ニトロキシドラジカル化合物は、ＷＯ２００９／１３３６４７ Ａ１に記載された環状ニトロキシドラジカル化合物の安定化方法にしたがって安定化された化合物であって、本発明の目的に沿うもののすべてをいう（ＷＯ２００９／１３３６４７ Ａ１はここに引用することにより、その内容のすべてが本明細書に組み込まれる）。簡潔に説明すれば、該安定化方法は、環状ニトロキシドラジカル化合物をポリ（エチレングリコール）鎖セグメントと反応性基を担持する疎水性鎖セグメントを含むブロック共重合体に、該化合物のラジカル以外の官能基（例えば、アミノ基、アミノメチル基、ヒドロキシ基、ヒドロキシメチル基、カルボキシル基またはカルボメチル基であり、該反応性基がハロゲン原子、カルボキシル基、イソシアナート残基、イソチオシアナート残基、エステル残基、酸無水物残基、ボロン酸残基、マレイミド残基またはエポキシ基）を介して該共重合体の反応性基と共有結合せしめる工程を含む。
【００２１】
このような安定化方法により得ることのできる高分子化ニトロキシドラジカル化合物は、例えば、好ましくは、エチレングリコールの反復単位が１５〜１０，０００のポリ（エチレングリコール）鎖セグメントとスチレンの反復単位が３〜３，０００のポリ（スチレン）鎖セグメントを含んでなり、かつ、該ポリ（スチレン）鎖セグメントにおけるスチレンの反復単位の少なくとも１０％、好ましくは３０％、より好ましくは５０％、さらにより好ましくは８０％、特に好ましくは１００％がフェニル基の４位において−ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２ＮＨＣＨ２−、−ＣＨ２Ｏ−、−ＣＨ２ＯＣＨ２−、−ＣＨ２ＯＣＯ−及び−ＣＨ２ＯＣＯＣＨ２−からなる群より選ばれる連結基を介して環状ニトロキシドラジカ
ル化合物の残基が共有結合しており、存在するばあいには、該４位の残りがハロゲン原子、水素原子またはヒドロキシル基であり、そして該環状ニトロキシドラジカル化合物の残基が２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル−４−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−１−オキシル−３−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリン−１−オキシル−３−イル及び２，４，４−トリメチル−１，３−オキサゾリジン−３−オキシル−２−イル、２，４，４−トリメチル−１，３−チアゾリジン−３−オキシル−２−イル及び２，４，４−トリメチル−イミダゾリンジン−３−オキシル−２−イルからなる群より選ばれる、化合物を挙げることができる。より具体的には、一般式（ＩＩ）
【００２２】
【化２】
【００２３】
式中、Ａは、非置換または置換Ｃ１−Ｃ１２アルコキシを表し、置換されている場合の置換基は、ホルミル基または式Ｒ１Ｒ２ＣＨ−の基を表し、ここで、Ｒ１及びＲ２は独立して、Ｃ１−Ｃ４アルコキシまたはＲ１とＲ２は一緒になって−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ−、−Ｏ（ＣＨ２）３Ｏ−もしくは−Ｏ（ＣＨ２）４Ｏ−を表し、
Ｌ１は、原子化結合、−（ＣＨ２）ｃＳ−、−ＣＯ（ＣＨ２）ｃＳ−、からなる群より選ばれる連結基を表し、ここでｃは１ないし５、好ましくは２の整数であり、
Ｌ２は、メチルイミノ、メチルイミノメチル、メチルオキシ、メチルオキシメチル、メチルエステル及びメチルエステルメチルからなる群より選ばれる連結基を表し、
Ｒは、Ｒの総数ｎの少なくとも５０％が２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル−４−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−１−オキシル−３−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリン−１−オキシル−３−イル及び２，４，４−トリメチル−１，３−オキサゾリジン−３−オキシル−２−イル、２，４，４−トリメチル−１，３−チアゾリジン−３−オキシル−２−イル及び２，４，４−トリメチル−イミダゾリンジン−３−オキシル−２−イルからなる群より選ばれる環状ニトロキシドラジカル化合物の残基を表し、存在する場合には、残りのＲが水素原子、ハロゲン原子またはヒドロキシ基であり、
ｍは、２０〜５，０００の整数を表し、そして
ｎは、３〜１，０００の整数を表す、
で表される、該高分子化ニトロキシドラジカル化合物を挙げることができる。該化合物の好ましいものとしては、一般式（ＩＩ）における、Ｌ１が原子化結合または−ＣＨ２ＣＨ２Ｓ−であり、Ｌ２がメチルイミノまたはメチルイミノメチルであり、そして
Ｒの全てが、次式
【００２４】
【化３】
【００２５】
式中、Ｒ’はメチル基である，
のいずれかで表される化合物を挙げることができる。
【００２６】
治療活性物質は、主として化学療法上使用されているいずれかの活性物質であり、本発明の目的に沿うものであれば如何なる活性を有する、如何なる分子種の化合物であってもよい。しかし、限定されるものでないが、上記高分子化環状ニトロキシドラジカル化合物がＥＰＲ効果により腫瘍近傍へ集積しやすい傾向を有することや、核酸分子の発現効率を高めることを考慮すれば、抗腫瘍剤および核酸分子を好ましい治療活性物質の具体例として挙げることができる。
【００２７】
抗腫瘍剤としては、限定されるものでないが、例えば、
・抗悪性腫瘍薬（アルキル化薬）：
イホスファミド（ifosfamide）、
シクロホスファミド水和物（cyclophosphamide hydrate）、
ブスルファン（busulfan）、
メルファラン（melphalan）、
ニムスチン塩酸塩（nimustine hydrochloride）、
ラニムスチン（ranimustine）、
ダカルバジン（dacarbazine）、
テモゾロミド（temozolomide）、および
プロカルバジン塩酸塩（procarbazine hydrochloride）、
・代謝拮抗薬：
ペメトレキセドナトリウム水和物（pemetrexed sodium hydrate）、
メトトレキサート（methotrexate）、
エノシタビン（enocitabine）、
カペシタビン（capecitabine）、
ゲムシタビン塩酸塩（gemcitabine hydrochloride）、
シタラビン（cytarabine）、
シタラビン オクホスファード水和物（cytarabine ocfosphate hydrate）、
テガフール（tegafur）、
テガフール・ウラシル（tegafur・uracil）、
テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム
（tegafur・gimeracil oteracil potassium）、
ドキシフルリジン（doxifluridine）、
フルオロウラシル（fluorouracil）、
クラドリビン（cladribine）、
ネララビン（nelarabine）、
フルダラビンリン酸エステル（fludarabine phosphate）、
メルカプトプリン水和物（mercaptopurine hydrate）、および
ヒドロキシカルバミド（hydroxycarbamide）、
・抗癌性抗生物質：
アクラルビシン塩酸塩（aclarubicin hydrochloride）、
アムルビシン塩酸塩（amrubicin hydrochloride）、
イダルビシン塩酸塩（idarubicin hydrochloride）、
エピルビシン塩酸塩（epirubicin hydrochloride）、
ダウノルビシン塩酸塩（daunorubicin hydrochloride）、
ドキソルビシン塩酸塩（doxorubicin hydrochloride）、
ピラルビシン塩酸塩（pirarubicin hydrochloride）、
ミトキサントロン塩酸塩（mitoxantrone hydrochloride）、
ブレオマイシン塩酸塩（bleomycin hydrochloride）、
ペプロマイシン硫酸塩（peplomycine sulfate）、
アクチノマイシンD（actinomycine D）、
ジノスタチンスチマラマー（zinostatin stimalamer）、および
マイトマイシンC（mitomycin C）、
・ＤＮＡトポイソメラーゼ阻害薬：
イリノテカン塩酸塩水和物（irinotecan hydrochloride hydrate）、
エトポシド（etoposide）、
ソブゾキサン（sobuzoxane）および
ノギテカン塩酸塩（nogitecan hydrochloride）、
・白金製剤：
オキサリプラチン（oxaliplatin）、
カルボプラチン（carboplatin）、
シスプラチン（cisplatin）、
ネダプラチン（nedaplatin）、および
ジアミノシクロヘキサン白金(II)(diaminocyclohexane platinum (II))、
・タキソ環類：
ドセタキセル水和物（docetaxel hydrate）、および
パクリタキセル（paclitaxel）、
・ビンカ・アルカロイド：
ビノレルビン酒石酸塩（vinorelbine ditartrate）、
ビンクリスチン硫酸塩（vincristine sufate）、
ビンデシン硫酸塩（vindesine sulfate）、および
ビンブラスチン硫酸塩（vinblastine sulfate）、
・多発性骨髄腫治療薬：
サリドマイド（thalidomide）、
・分子標的治療薬：
ゲムツズマブオゾガマイシン（gemtuzumab ozogamicin）、
セツキシマブ（cetuximab）、
トラスツズマブ（trastuzumab）、
リツキシマブ（rituximab）、
イマチニブメシル酸塩（imatinib mesilate）、
エルロチニブ塩酸塩（erlotinib hydrochloride）、
ゲフィチニブ（gefitinib）、
ダサチニブ水和物（dasatinib hydrate）、
ニロチニブ塩酸塩水和物（nilotinib hydrochloride hydrate）、
スニチニブリンゴ酸塩（sunitinib malate）、
ソラフェニブトシル酸塩（sorafenib tosirate）、
ラパチニブトシル酸塩水和物（lapatinib tosilate hydrate）、
ベバシズマブ（bevacizumab）および
ボルテゾミブ（bortezomib）、
・急性前骨髄球性白血病治療薬：
タミバロテン（tamibarotene）、
トレチノイン（tretinoin）、および
三酸化ヒ素（arsenic trioxide）、
・アロマターゼ阻害薬：
アナストロゾール（anastrozole）、
エキセメスタン（exemestane）、および
レトロゾール（letrozole）、
・抗エストロゲン剤：
タモキシフェンクエン酸塩（tamoxifen citrate）、および
トレミフェンクエン酸塩（toremifene citrate）、
・抗アンドロゲン剤：
ビカルタルド（bicalutamide）、および
フルタミド（flutamide)、
・エストロゲン剤：
エストラムスチンリン酸エステルナトリウム水和物
（estramustine phosphate sodium hydrate）、
・黄体ホルモン：
メドロキシプロゲステロン酢酸エステル（medroxyprogesterone acetate）
・LH−RHアゴニスト：
ゴセレリン酢酸塩（goserelin acetate）および
リュープロレリン酢酸塩（leuprorelin acetate）、
・抗乳腺腫瘍薬：
メピチオスタン（mepitiostane）
・インターフェロンγ製剤：
インターフェロンガンマ-1a（innterferon gamma-1a）、
・インターロイキン‐２製剤：
セルモロイキン（celmoleukin）、および
テセロイキン（teceleukin）、
・抗悪性腫瘍功酵素剤：
L-アスパラギナーゼ（L-asparaginase）、
・その他の腫瘍用薬：
アセグラトン（aceglatone）、
ウベニメクス（ubenimex）、
塩化ストロンチウム（strontium(89Sr) chloride）、
かわらたけ多糖体製剤（obtained from coriolus versicolor）、
シゾフィラン（sizofiran）、
ペントスタチン（pentostatin）、および
ホリナートカルシウム（calcium folinate）、ならびに
・溶連菌抽出物：
レボホリナートカルシウム（levofolinate calcium）、
レンチナン（lentinan）、
タラポルフィンナトリウム（talaporfin sodium）、および
ポルフィマーナトリウム（porfimer sodium）
を挙げることができる。これらのうち、好ましいものとしてドキソルビシン塩酸塩、イダルビシン塩酸塩）、エピルビシン塩酸塩、ピラルビシン塩酸塩、イリノテカン塩酸塩水和物、エトポシド、ソブゾキサン、ノギテカン塩酸塩、カルボプラチン、シスプラチン、ネダプラチン、ジアミノシクロヘキサン白金（ＩＩ）、ドセタキセル水和物、およびパクリタキセル等を挙げることができる。また、これらの抗腫瘍剤は、リポソームに内包されていても、ブロック共重合体とのコンジュゲート等であることもできる。例えば、ドキソルビシンのブロック共重合体コンジュゲートとの例は、ＥＰ０ ３９７ ３０７ Ｂ１に、
ジアミノシクロヘキサン白金（ＩＩ）とブロック共重合体コンジュゲートの例は、ＥＰ１
６９５ ９９１Ｂ１を挙げることができ、これら内容は、これらの特許文献をここで引用することにより本明細書に組み込まれる。
【００２８】
一方、核酸分子としては、所謂、遺伝子療法に使用できる核酸分子、ＤＮＡおよびＲＮＡであって、デリバリー部位のイメージングならびに治療に有効な機能を有するたんぱくを発現もしくは亢進する遺伝子たんぱく質をコードするか、またはアンチセンス鎖、ｓｉＲＮＡによって症状を引き起こしている遺伝子の発現を抑制する制御因子であることができ、これらの核酸分子は、核酸塩基が８〜１０万程度であることができ、かつ、ウイルスベクター：レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス、バキュロウイルス、ヒト単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス（レトロウイルス科）、バルボウイルス、泡沫状ウイルス、シンＳドピスウイルスもしくはアルファウイルスとのコンジュゲートであるか、または非ウイルスベクター：ポリプレックス（カチオン性ポリマー：ポリエチレンイミン、キトサンなど）リポプレックス（カチオン性脂質：リポソーム、リポフェクトアミンなど）カチオン性ペプチド、イムノポーター、リン酸カルシウム、赤血球ゴースト等とのコンプレックスであることができる。
【００２９】
高分子化ニトロキシドラジカル化合物と治療活性物質は、患者に対し、同時にか、またはいずれか一方を投与した後に他方を投与する投与様式で用いることができるが、好ましくは、高分子化ニトロキシドラジカル化合物を投与した後に治療活性物質を投与するのが好ましい。
【００３０】
投与経路は、それぞれ、同一であるか異なっていてよく、経口もしくは非経口であることができる。非経口投与は、静脈内、動脈内、皮下、筋肉内、腹腔内、直腸内への注入であることでき、または病巣内へ埋め込んでもよい。したがって、これらの成分は、それぞれ、化合物それ自体または存在する場合には、それらの生理学的に許容される塩であることができ、さらには、散剤、錠剤、カプセル剤、ゲル剤、点滴剤、坐剤、懸濁剤、溶液剤、等の剤型であることができる。このような剤形を調製する際に、担体、賦形剤、または他の不活性成分を含めることができる。担体または賦形剤は、製薬学的に許容される溶媒、懸濁媒体もしくはいずれかの他の製薬学的に不活性のベヒクルであることができる。賦形剤は液体もしくは固体であってよく、計画された投与様式を念頭におきつつ、高分子化ニトロキシドラジカル化合物または治療活性物質と組み合わせる場合に、所望の嵩、一貫性などを提供するように選択される。典型的な製薬学的担体は、限定されるものでないが、当該技術分野で常用されている、結合剤（例えば、糊化澱粉、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、）増量剤（例えば、乳糖および他の糖、結晶セルロース、ゼラチン、エチルセルロース）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、トウモロコシ澱粉）等であることができる。
【００３１】
高分子化ニトロキシドラジカル化合物と治療活性物質の処方、または用量は、当業者の経験に基づいて決定でき、それぞれ、処置される患者の状態の重傷度および応答性に応じて変動する。一般には、イン・ビトロおよびイン・ビボ動物モデルで有効であることが確認されたＥＣ５０に基づき推定しうる。一般に、それぞれ、体重１ｋｇ当り、０．０μｇから１００ｇまで、好ましくは、０．１μｇから１ｇまで、より好ましくは、１０μｇから１００ｍｇまでであることができる。投与スケジュールは、典型的には、高分子化ニトロキシドラジカル化合物を投与した後、数分から数日（例えば、４〜８日）目に治療活性物質を投与することができる。両者を同時に投与するときには、水難溶性の薬剤であって高分子化合物でない治療活性物質は水性溶媒（例えば、純水、または緩衝化された生理食塩水）中で高分子化ニトロキシドラジカル化合物の高分子ミセルを形成する際に、該高分子ミセルのコア領域に内包せしめ、それらが一体となった組成物として投与してもよい。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】実施例１における細胞実験の結果のグラフ表示である。
【図２】実施例１における動物実験の結果のグラフ表示である。
【図３】実施例２の発現効率のグラフ表示である。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
以下、本発明の具体例を挙げてさらに本発明を具体的に説明するが、本発明をこれらの具体例に限定することを意図するものでない。
【００３４】
製造例：
＜Ｎ−ＲＮＰの作製＞
チオール末端ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）をテローゲンとして用い、クロロメチルスチレン（ＣＭＳ）のラジカルテロメリゼーションによりＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳを製造した。（ＰＥＧは、分子量５，０００のものを使用した。）この側鎖クロロメチル基に４−アミノ−ＴＥＭＰＯを導入した。このようにして得られたＴＥＭＰＯを側鎖に有するブロック共重合体（ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＴＥＭＰＯ（Ｎ），ＰＣＴＥＭＰＯ（Ｎ）の分子量５，０００）は水中で自己会合し、平均直径約４０ｎｍ程度の粒子を形成する。
【００３５】
＜Ｏ−ＲＮＰの作製＞
チオール末端ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）をテローゲンとして用い、クロロメチルスチレン（ＣＭＳ）のラジカルテロメリゼーションによりＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳを製造した。（ＰＥＧは、分子量５，０００のものを使用した。）この側鎖クロロメチル基に４−ヒドロキシ−ＴＥＭＰＯを導入した。このようにして得られたＴＥＭＰＯを側鎖に有するブロック共重合体（ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＴＥＭＰＯ（Ｏ），ＰＣＴＥＭＰＯ（Ｏ）の分子量５，０００）は水中で自己会合し、平均直径約４０ｎｍ程度の粒子を形成する。
【００３６】
実施例１：ドキソルビシン（ＤＯＸ）とＯ−ＲＮＰの相互作用
＜細胞実験＞
９６ｗｅｌｌプレートにｃｏｌｏｎ２６細胞を１×１０５個播種した。４８時間後にＤＯＸ（２μｇ／ｍｌ）を添加し、２４、１２、６、０時間前に濃度を振りＯ−ＲＮＰを添加した。ドキソルビシンを添加して２４時間後に細胞生存率をＷＳＴ−ａｓｓａｙを用いて測定した。コントロールとして、４８時間単独でＯ−ＲＮＰを添加した時の細胞生存率を測定した。
【００３７】
＜実験結果＞
結果を図１に示す。Ｏ−ＲＮＰを単独で４８時間暴露した場合、どの濃度においても毒性は確認されなかった。またＤＯＸを添加する前に、Ｏ−ＲＮＰを前投与すると、Ｏ−ＲＮＰ内のＴＥＭＰＯ濃度依存的に細胞生存率が増加することが明らかとなった。
【００３８】
＜実験動物＞
６週齢、体重３０±２ｇのＢＡＬＢ／ｃマウスを購入し、２−３日間の馴化飼育の後に実験に用いた。ＢＡＬＢ／ｃマウスに結腸癌由来Ｃｏｌｏｎ−２６（１×１０６ｃｅｌｌｓ／１００Ｌ）を皮下投与することで担がんマウスを作製した。はじめに、上記製造例で得られるＯ−ＲＮＰ（３０ｍｇ／ｍｌ，ＴＥＭＰＯ濃度４０ｍＭ，５０μＬ）を担がんマウスに４日間局所投与し、４日目の段階ＤＯＸ（１０ｍｇ／ｋｇ）を尾静脈投与し、その後の腫瘍の大きさを測定した。
【００３９】
＜実験結果＞
結果を図２に示す。
【００４０】
細胞実験では、Ｏ−ＲＮＰをＤＯＸ添加前に投与しておくとＤＯＸの細胞毒性を低減させるという結果であったものの、Ｏ−ＲＮＰを事前にがん組織に局所投与するとＤＯＸ投与後の腫瘍の成長を抑制することが明らかとなった。
なお、図中の各表示は以下の実験系に相当する。
・ＲＮＰ群：Ｏ−ＲＮＰのみを投与した。
・ＤＯＸ＋Ｏ−ＲＮＰ群：Ｏ−ＲＮＰのみを投与し（４日間）、ＤＯＸを投与した。
・ＤＯＸ群：ＰＢＳを４日間投与し、ＤＯＸを投与した
・Ｎ．Ｓ．群：ＰＢＳの４日間投与のみ。
【００４１】
実施例２：ポリエチレンイミンを用いた遺伝子デリバリーとＲＮＰの相互作用
この実験は、Ｎ−ＲＮＰを用いた遺伝子デリバリーにおける発現効率の向上を確認するためのものである。
【００４２】
ｐＤＮＡとしてｐＧＬ３（ルシフェラーゼ遺伝子）、ベクターとしてポリエチレンイミン（ＰＥＩ：ｂｒａｎｃｈｅｄ，Ｍｗ＝２５０００）を用いた。ｐＤＮＡとＰＥＩは（ＰＥＩ中のアミノ基）／（ｐＤＮＡ中のリン酸基）＝Ｎ／Ｐ＝１０となるように混合して複合体（ｐＤＮＡ／ＰＥＩ）を作成した。
【００４３】
ＨｅＬａ細胞を５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで２４ｗｅｌｌプレートに播種し、２４時間後、ｐＤＮＡ／ＰＥＩおよびＮ−ＲＮＰを添加した。ｐＤＮＡは０．２μｇ／ｗｅｌｌを添加した。２４時間後に培地交換を行い、さらに２４時間後にルシフェラーゼアッセイ（発光量の測定）とＢＣＡアッセイ（たんぱく質の定量）を行った。
【００４４】
結果を図３に示す。
【００４５】
図３の縦軸は発光量をたんぱく量で割った値をｐＤＮＡ／ＰＥＩのみの値を１として規格化したものである。Ｎ−ＲＮＰの添加量はＲ１＝３．３×１０−５ｍＭ
Ｎ−ＲＮＰ，Ｒ２＝３．３×１０−４ｍＭ Ｎ−ＲＮＰ，Ｒ３＝３．３×１０−３ｍＭ
Ｎ−ＲＮＰ，Ｒ４＝３．３×１０−２ｍＭ ＲＮＰである。上図よりＮ−ＲＮＰの添加量が増加するにつれルシフェラーゼの発現量が増加していることが分かった。
【００４６】
以上の結果からＮ−ＲＮＰは遺伝子デリバリーにおいてｐＤＮＡ／ＰＥＩのみで用いるよりも遺伝子の発現効率を上げることが示された。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高分子化環状ニトロキシドラジカル化合物を有効成分として含有する治療活性物質の作用を増強するための製薬学的製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、抗がん剤をナノカプセルで内包することで副作用を無くすかもしくは低減し、また治療効率を上げられるドラックデリバリーシステムの研究・開発に注目が集まっている。実際に、高分子ミセルを用いた薬剤は、臨床試験まで進んでいる例がある。
【０００３】
一方、抗がん剤の効能を向上せしめる別の方策として、例えば、抗炎症作用、抗アレルギー作用、糖・たんぱく質・資質等の代謝、生体の免疫反応等に影響を及ぼすことの知られているデキサメタゾンを腫瘍に皮下投与することにより、カルボプラチン、ゲムシタビン、アドリアマイシンなどの抗がん剤の効果を向上させ得ることが報告されている（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３）。しかしながら、デキサメタゾンのような低分子化合物は腫瘍近傍への集積効率が悪いことが問題となっている。
【０００４】
このような背景の下、上記のような薬剤に限らず、抗がん剤それら自体を初めとする多種多様な治療活性物質の生体内標的へのデリバリー効率または該標的における所期の活性を増強するための手段の開発ができれば当該技術分野にとって極めて重要な意義を有するであろう。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｌｅｇｇａｓ Ｍ．Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００９；６３（４）：７３１−７４３
【非特許文献２】Ｗａｎｇ Ｈ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００４；１０（５）：１６３３−１６４４５
【非特許文献３】Ｗａｎｇ Ｈ．Ｉｎｔ Ｊ Ｏｎｃｏｌ．２００７；３０（４）：９４７−９５３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、本発明は、多種多様な治療活性物質の生体内標的へのデリバリー効率または該標的において該活性物質が本来有している活性を増強するための手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者等は上記課題を解決するための手段として、本発明者等が先に提案した、高分子化環状ニトロキシドラジカル化合物が効果的に利用できることを、ここに見出し本願発明を完成した。具体的には、該高分子化環状ニトロキシドラジカル化合物は、低分子の、例えば、２，２，６，６−テトラメチルピペリジノオキシラジカル（ＴＥＭＰＯ）を特定のブロック共重合体に共有結合せしめて高分子化した化合物であり、水性媒体中でｎｍオーダーの径をもつ高分子ミセルを形成できる化合物である。かようなナノ粒子中に内包されたＴＥＭＰＯは、低分子のＴＥＭＰＯの血中半減期が約２分であるのに対し、数時間以上と圧倒的な安定性を示した（Ｙｏｓｈｉｔｏｍｉ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ：１０（３），５９６（２００９））。そして、該化合物それ自体が、活
性酸素またはフリーラジカルが関与する疾患または症状、例えば、脳梗塞、心筋梗塞、脳浮腫、神経脱落症状、炎症、高血圧、高脂血症、肥満、脳血管損傷および神経細胞損傷等に有効であることが確認乃至推測されている（ＷＯ２００９／１３３６４７ Ａ１参照）。
【０００８】
これらの環状ニトロキシドラジカル化合物含有ナノ粒子（以下、“ＲＮＰ”と略記する場合あり）は、疎水性コア層に水難溶性薬物を内包できるだけでなく、静電相互作用を利用して遺伝子との複合体を形成することができる。また、このようなＲＮＰは、それらの奏するＥｎｈａｎｃｅｄ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ（ＥＰＲ）効果により腫瘍近傍、または炎症組織へ集積することも明らかとなった。このようなＲＮＰを用いて、抗がん剤との相互作用について調べてみたところ、動物実験で抗がん剤の抗腫瘍活性を向上させることが確認された。さらに、該ＲＮＰは、遺伝子デリバリーの増強効果があることも明らかとなってきた。
【０００９】
したがって、本発明によれば、主たる態様の発明として以下のものが提供される。
【００１０】
生体内標的組織または細胞への治療活性物質のデリバリー効率を高めるかまたは該標的における該治療活性物質の有する活性を増強するための製薬学的製剤であって、有効成分として、高分子化環状ニトロキシドラジカル化合物を含んでなる、該製薬学的製剤。
【００１１】
具体的な態様としては、該治療活性物質が抗腫瘍剤または核酸分子である、前記製薬学的製剤。
【００１２】
高分子化環状ニトロキシドラジカル化合物と抗腫瘍剤または核酸分子とを組み合わせたことを特徴とする抗腫瘍剤または核酸分子で処置することの必要な疾患を予防または治療するための製薬学的製剤。
【００１３】
抗腫瘍剤または核酸分子で治療することの必要な哺乳動物の治療方法であって、該哺乳動物に高分子化環状ニトロキシドラジカル化合物および抗腫瘍剤または核酸分子を、それぞれ前後して、または同時に投与するステップを含んでなる、該治療方法。
【００１４】
前記高分子化環状ニトロキシドラジカル化合物としては、限定されるものでないが、好ましくは、一般式（ＩＩ）
【００１５】
【化１】
【００１６】
式中、Ａは、非置換または置換Ｃ１−Ｃ１２アルコキシを表し、置換されている場合の置換基は、ホルミル基または式Ｒ１Ｒ２ＣＨ−の基を表し、ここで、Ｒ１及びＲ２は独立して、Ｃ１−Ｃ４アルコキシまたはＲ１とＲ２は一緒になって−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ−、−Ｏ（ＣＨ２）３Ｏ−もしくは−Ｏ（ＣＨ２）４Ｏ−を表し、
Ｌ１は、原子化結合、−（ＣＨ２）ｃＳ−、−ＣＯ（ＣＨ２）ｃＳ−、からなる群より
選ばれる連結基を表し、ここでｃは１ないし５、好ましくは２の整数であり、
Ｌ２は、メチルイミノ、メチルイミノメチル、メチルオキシ、メチルオキシメチル、メチルエステル及びメチルエステルメチルからなる群より選ばれる連結基を表し、
Ｒは、Ｒの総数ｎの少なくとも５０％が２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル−４−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−１−オキシル−３−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリン−１−オキシル−３−イル及び２，４，４−トリメチル−１，３−オキサゾリジン−３−オキシル−２−イル、２，４，４−トリメチル−１，３−チアゾリジン−３−オキシル−２−イル及び２，４，４−トリメチル−イミダゾリンジン−３−オキシル−２−イルからなる群より選ばれる環状ニトロキシドラジカル化合物の残基を表し、存在する場合には、残りのＲが水素原子、ハロゲン原子またはヒドロキシ基であり、
ｍは、２０〜５，０００の整数を表し、そして
ｎは、３〜１，０００の整数を表す、
で表される化合物を挙げることができる。
【発明の効果】
【００１７】
本発明に従うＲＮＰは、上述したとおり、Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ（ＥＰＲ）効果により腫瘍近傍へ集積し、細胞の炎症反応を抑制することにより、標的組織または細胞において治療活性物質本来の活性を効率よく発揮できるので、当該活性を増強できる。なお、治療活性物質が核酸分子である場合には、腫瘍、または炎症組織近傍において、その発現効率を高めることもできる。
【発明の詳細な説明】
【００１８】
本発明を規定する用語等について以下、より詳細に説明する。
【００１９】
生体内標的組織または細胞は、治療活性物質をデリバリーするための哺乳動物、好ましくはヒト、の生体の器官もしくは組織、またはそれらの細胞を意味し、前者としては、脳、血液、肺、心臓、肝臓、腎臓、膵臓、脾臓、消化管、皮膚、膀胱やその他器官の腫瘍、炎症組織を挙げることができる。
【００２０】
高分子化環状ニトロキシドラジカル化合物は、ＷＯ２００９／１３３６４７ Ａ１に記載された環状ニトロキシドラジカル化合物の安定化方法にしたがって安定化された化合物であって、本発明の目的に沿うもののすべてをいう（ＷＯ２００９／１３３６４７ Ａ１はここに引用することにより、その内容のすべてが本明細書に組み込まれる）。簡潔に説明すれば、該安定化方法は、環状ニトロキシドラジカル化合物をポリ（エチレングリコール）鎖セグメントと反応性基を担持する疎水性鎖セグメントを含むブロック共重合体に、該化合物のラジカル以外の官能基（例えば、アミノ基、アミノメチル基、ヒドロキシ基、ヒドロキシメチル基、カルボキシル基またはカルボメチル基であり、該反応性基がハロゲン原子、カルボキシル基、イソシアナート残基、イソチオシアナート残基、エステル残基、酸無水物残基、ボロン酸残基、マレイミド残基またはエポキシ基）を介して該共重合体の反応性基と共有結合せしめる工程を含む。
【００２１】
このような安定化方法により得ることのできる高分子化ニトロキシドラジカル化合物は、例えば、好ましくは、エチレングリコールの反復単位が１５〜１０，０００のポリ（エチレングリコール）鎖セグメントとスチレンの反復単位が３〜３，０００のポリ（スチレン）鎖セグメントを含んでなり、かつ、該ポリ（スチレン）鎖セグメントにおけるスチレンの反復単位の少なくとも１０％、好ましくは３０％、より好ましくは５０％、さらにより好ましくは８０％、特に好ましくは１００％がフェニル基の４位において−ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２ＮＨＣＨ２−、−ＣＨ２Ｏ−、−ＣＨ２ＯＣＨ２−、−ＣＨ２ＯＣＯ−及び−ＣＨ２ＯＣＯＣＨ２−からなる群より選ばれる連結基を介して環状ニトロキシドラジカ
ル化合物の残基が共有結合しており、存在するばあいには、該４位の残りがハロゲン原子、水素原子またはヒドロキシル基であり、そして該環状ニトロキシドラジカル化合物の残基が２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル−４−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−１−オキシル−３−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリン−１−オキシル−３−イル及び２，４，４−トリメチル−１，３−オキサゾリジン−３−オキシル−２−イル、２，４，４−トリメチル−１，３−チアゾリジン−３−オキシル−２−イル及び２，４，４−トリメチル−イミダゾリンジン−３−オキシル−２−イルからなる群より選ばれる、化合物を挙げることができる。より具体的には、一般式（ＩＩ）
【００２２】
【化２】
【００２３】
式中、Ａは、非置換または置換Ｃ１−Ｃ１２アルコキシを表し、置換されている場合の置換基は、ホルミル基または式Ｒ１Ｒ２ＣＨ−の基を表し、ここで、Ｒ１及びＲ２は独立して、Ｃ１−Ｃ４アルコキシまたはＲ１とＲ２は一緒になって−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ−、−Ｏ（ＣＨ２）３Ｏ−もしくは−Ｏ（ＣＨ２）４Ｏ−を表し、
Ｌ１は、原子化結合、−（ＣＨ２）ｃＳ−、−ＣＯ（ＣＨ２）ｃＳ−、からなる群より選ばれる連結基を表し、ここでｃは１ないし５、好ましくは２の整数であり、
Ｌ２は、メチルイミノ、メチルイミノメチル、メチルオキシ、メチルオキシメチル、メチルエステル及びメチルエステルメチルからなる群より選ばれる連結基を表し、
Ｒは、Ｒの総数ｎの少なくとも５０％が２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル−４−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−１−オキシル−３−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリン−１−オキシル−３−イル及び２，４，４−トリメチル−１，３−オキサゾリジン−３−オキシル−２−イル、２，４，４−トリメチル−１，３−チアゾリジン−３−オキシル−２−イル及び２，４，４−トリメチル−イミダゾリンジン−３−オキシル−２−イルからなる群より選ばれる環状ニトロキシドラジカル化合物の残基を表し、存在する場合には、残りのＲが水素原子、ハロゲン原子またはヒドロキシ基であり、
ｍは、２０〜５，０００の整数を表し、そして
ｎは、３〜１，０００の整数を表す、
で表される、該高分子化ニトロキシドラジカル化合物を挙げることができる。該化合物の好ましいものとしては、一般式（ＩＩ）における、Ｌ１が原子化結合または−ＣＨ２ＣＨ２Ｓ−であり、Ｌ２がメチルイミノまたはメチルイミノメチルであり、そして
Ｒの全てが、次式
【００２４】
【化３】
【００２５】
式中、Ｒ’はメチル基である，
のいずれかで表される化合物を挙げることができる。
【００２６】
治療活性物質は、主として化学療法上使用されているいずれかの活性物質であり、本発明の目的に沿うものであれば如何なる活性を有する、如何なる分子種の化合物であってもよい。しかし、限定されるものでないが、上記高分子化環状ニトロキシドラジカル化合物がＥＰＲ効果により腫瘍近傍へ集積しやすい傾向を有することや、核酸分子の発現効率を高めることを考慮すれば、抗腫瘍剤および核酸分子を好ましい治療活性物質の具体例として挙げることができる。
【００２７】
抗腫瘍剤としては、限定されるものでないが、例えば、
・抗悪性腫瘍薬（アルキル化薬）：
イホスファミド（ifosfamide）、
シクロホスファミド水和物（cyclophosphamide hydrate）、
ブスルファン（busulfan）、
メルファラン（melphalan）、
ニムスチン塩酸塩（nimustine hydrochloride）、
ラニムスチン（ranimustine）、
ダカルバジン（dacarbazine）、
テモゾロミド（temozolomide）、および
プロカルバジン塩酸塩（procarbazine hydrochloride）、
・代謝拮抗薬：
ペメトレキセドナトリウム水和物（pemetrexed sodium hydrate）、
メトトレキサート（methotrexate）、
エノシタビン（enocitabine）、
カペシタビン（capecitabine）、
ゲムシタビン塩酸塩（gemcitabine hydrochloride）、
シタラビン（cytarabine）、
シタラビン オクホスファード水和物（cytarabine ocfosphate hydrate）、
テガフール（tegafur）、
テガフール・ウラシル（tegafur・uracil）、
テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム
（tegafur・gimeracil oteracil potassium）、
ドキシフルリジン（doxifluridine）、
フルオロウラシル（fluorouracil）、
クラドリビン（cladribine）、
ネララビン（nelarabine）、
フルダラビンリン酸エステル（fludarabine phosphate）、
メルカプトプリン水和物（mercaptopurine hydrate）、および
ヒドロキシカルバミド（hydroxycarbamide）、
・抗癌性抗生物質：
アクラルビシン塩酸塩（aclarubicin hydrochloride）、
アムルビシン塩酸塩（amrubicin hydrochloride）、
イダルビシン塩酸塩（idarubicin hydrochloride）、
エピルビシン塩酸塩（epirubicin hydrochloride）、
ダウノルビシン塩酸塩（daunorubicin hydrochloride）、
ドキソルビシン塩酸塩（doxorubicin hydrochloride）、
ピラルビシン塩酸塩（pirarubicin hydrochloride）、
ミトキサントロン塩酸塩（mitoxantrone hydrochloride）、
ブレオマイシン塩酸塩（bleomycin hydrochloride）、
ペプロマイシン硫酸塩（peplomycine sulfate）、
アクチノマイシンD（actinomycine D）、
ジノスタチンスチマラマー（zinostatin stimalamer）、および
マイトマイシンC（mitomycin C）、
・ＤＮＡトポイソメラーゼ阻害薬：
イリノテカン塩酸塩水和物（irinotecan hydrochloride hydrate）、
エトポシド（etoposide）、
ソブゾキサン（sobuzoxane）および
ノギテカン塩酸塩（nogitecan hydrochloride）、
・白金製剤：
オキサリプラチン（oxaliplatin）、
カルボプラチン（carboplatin）、
シスプラチン（cisplatin）、
ネダプラチン（nedaplatin）、および
ジアミノシクロヘキサン白金(II)(diaminocyclohexane platinum (II))、
・タキソ環類：
ドセタキセル水和物（docetaxel hydrate）、および
パクリタキセル（paclitaxel）、
・ビンカ・アルカロイド：
ビノレルビン酒石酸塩（vinorelbine ditartrate）、
ビンクリスチン硫酸塩（vincristine sufate）、
ビンデシン硫酸塩（vindesine sulfate）、および
ビンブラスチン硫酸塩（vinblastine sulfate）、
・多発性骨髄腫治療薬：
サリドマイド（thalidomide）、
・分子標的治療薬：
ゲムツズマブオゾガマイシン（gemtuzumab ozogamicin）、
セツキシマブ（cetuximab）、
トラスツズマブ（trastuzumab）、
リツキシマブ（rituximab）、
イマチニブメシル酸塩（imatinib mesilate）、
エルロチニブ塩酸塩（erlotinib hydrochloride）、
ゲフィチニブ（gefitinib）、
ダサチニブ水和物（dasatinib hydrate）、
ニロチニブ塩酸塩水和物（nilotinib hydrochloride hydrate）、
スニチニブリンゴ酸塩（sunitinib malate）、
ソラフェニブトシル酸塩（sorafenib tosirate）、
ラパチニブトシル酸塩水和物（lapatinib tosilate hydrate）、
ベバシズマブ（bevacizumab）および
ボルテゾミブ（bortezomib）、
・急性前骨髄球性白血病治療薬：
タミバロテン（tamibarotene）、
トレチノイン（tretinoin）、および
三酸化ヒ素（arsenic trioxide）、
・アロマターゼ阻害薬：
アナストロゾール（anastrozole）、
エキセメスタン（exemestane）、および
レトロゾール（letrozole）、
・抗エストロゲン剤：
タモキシフェンクエン酸塩（tamoxifen citrate）、および
トレミフェンクエン酸塩（toremifene citrate）、
・抗アンドロゲン剤：
ビカルタルド（bicalutamide）、および
フルタミド（flutamide)、
・エストロゲン剤：
エストラムスチンリン酸エステルナトリウム水和物
（estramustine phosphate sodium hydrate）、
・黄体ホルモン：
メドロキシプロゲステロン酢酸エステル（medroxyprogesterone acetate）
・LH−RHアゴニスト：
ゴセレリン酢酸塩（goserelin acetate）および
リュープロレリン酢酸塩（leuprorelin acetate）、
・抗乳腺腫瘍薬：
メピチオスタン（mepitiostane）
・インターフェロンγ製剤：
インターフェロンガンマ-1a（innterferon gamma-1a）、
・インターロイキン‐２製剤：
セルモロイキン（celmoleukin）、および
テセロイキン（teceleukin）、
・抗悪性腫瘍功酵素剤：
L-アスパラギナーゼ（L-asparaginase）、
・その他の腫瘍用薬：
アセグラトン（aceglatone）、
ウベニメクス（ubenimex）、
塩化ストロンチウム（strontium(89Sr) chloride）、
かわらたけ多糖体製剤（obtained from coriolus versicolor）、
シゾフィラン（sizofiran）、
ペントスタチン（pentostatin）、および
ホリナートカルシウム（calcium folinate）、ならびに
・溶連菌抽出物：
レボホリナートカルシウム（levofolinate calcium）、
レンチナン（lentinan）、
タラポルフィンナトリウム（talaporfin sodium）、および
ポルフィマーナトリウム（porfimer sodium）
を挙げることができる。これらのうち、好ましいものとしてドキソルビシン塩酸塩、イダルビシン塩酸塩）、エピルビシン塩酸塩、ピラルビシン塩酸塩、イリノテカン塩酸塩水和物、エトポシド、ソブゾキサン、ノギテカン塩酸塩、カルボプラチン、シスプラチン、ネダプラチン、ジアミノシクロヘキサン白金（ＩＩ）、ドセタキセル水和物、およびパクリタキセル等を挙げることができる。また、これらの抗腫瘍剤は、リポソームに内包されていても、ブロック共重合体とのコンジュゲート等であることもできる。例えば、ドキソルビシンのブロック共重合体コンジュゲートとの例は、ＥＰ０ ３９７ ３０７ Ｂ１に、
ジアミノシクロヘキサン白金（ＩＩ）とブロック共重合体コンジュゲートの例は、ＥＰ１
６９５ ９９１Ｂ１を挙げることができ、これら内容は、これらの特許文献をここで引用することにより本明細書に組み込まれる。
【００２８】
一方、核酸分子としては、所謂、遺伝子療法に使用できる核酸分子、ＤＮＡおよびＲＮＡであって、デリバリー部位のイメージングならびに治療に有効な機能を有するたんぱくを発現もしくは亢進する遺伝子たんぱく質をコードするか、またはアンチセンス鎖、ｓｉＲＮＡによって症状を引き起こしている遺伝子の発現を抑制する制御因子であることができ、これらの核酸分子は、核酸塩基が８〜１０万程度であることができ、かつ、ウイルスベクター：レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス、バキュロウイルス、ヒト単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス（レトロウイルス科）、バルボウイルス、泡沫状ウイルス、シンＳドピスウイルスもしくはアルファウイルスとのコンジュゲートであるか、または非ウイルスベクター：ポリプレックス（カチオン性ポリマー：ポリエチレンイミン、キトサンなど）リポプレックス（カチオン性脂質：リポソーム、リポフェクトアミンなど）カチオン性ペプチド、イムノポーター、リン酸カルシウム、赤血球ゴースト等とのコンプレックスであることができる。
【００２９】
高分子化ニトロキシドラジカル化合物と治療活性物質は、患者に対し、同時にか、またはいずれか一方を投与した後に他方を投与する投与様式で用いることができるが、好ましくは、高分子化ニトロキシドラジカル化合物を投与した後に治療活性物質を投与するのが好ましい。
【００３０】
投与経路は、それぞれ、同一であるか異なっていてよく、経口もしくは非経口であることができる。非経口投与は、静脈内、動脈内、皮下、筋肉内、腹腔内、直腸内への注入であることでき、または病巣内へ埋め込んでもよい。したがって、これらの成分は、それぞれ、化合物それ自体または存在する場合には、それらの生理学的に許容される塩であることができ、さらには、散剤、錠剤、カプセル剤、ゲル剤、点滴剤、坐剤、懸濁剤、溶液剤、等の剤型であることができる。このような剤形を調製する際に、担体、賦形剤、または他の不活性成分を含めることができる。担体または賦形剤は、製薬学的に許容される溶媒、懸濁媒体もしくはいずれかの他の製薬学的に不活性のベヒクルであることができる。賦形剤は液体もしくは固体であってよく、計画された投与様式を念頭におきつつ、高分子化ニトロキシドラジカル化合物または治療活性物質と組み合わせる場合に、所望の嵩、一貫性などを提供するように選択される。典型的な製薬学的担体は、限定されるものでないが、当該技術分野で常用されている、結合剤（例えば、糊化澱粉、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、）増量剤（例えば、乳糖および他の糖、結晶セルロース、ゼラチン、エチルセルロース）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、トウモロコシ澱粉）等であることができる。
【００３１】
高分子化ニトロキシドラジカル化合物と治療活性物質の処方、または用量は、当業者の経験に基づいて決定でき、それぞれ、処置される患者の状態の重傷度および応答性に応じて変動する。一般には、イン・ビトロおよびイン・ビボ動物モデルで有効であることが確認されたＥＣ５０に基づき推定しうる。一般に、それぞれ、体重１ｋｇ当り、０．０μｇから１００ｇまで、好ましくは、０．１μｇから１ｇまで、より好ましくは、１０μｇから１００ｍｇまでであることができる。投与スケジュールは、典型的には、高分子化ニトロキシドラジカル化合物を投与した後、数分から数日（例えば、４〜８日）目に治療活性物質を投与することができる。両者を同時に投与するときには、水難溶性の薬剤であって高分子化合物でない治療活性物質は水性溶媒（例えば、純水、または緩衝化された生理食塩水）中で高分子化ニトロキシドラジカル化合物の高分子ミセルを形成する際に、該高分子ミセルのコア領域に内包せしめ、それらが一体となった組成物として投与してもよい。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】実施例１における細胞実験の結果のグラフ表示である。
【図２】実施例１における動物実験の結果のグラフ表示である。
【図３】実施例２の発現効率のグラフ表示である。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
以下、本発明の具体例を挙げてさらに本発明を具体的に説明するが、本発明をこれらの具体例に限定することを意図するものでない。
【００３４】
製造例：
＜Ｎ−ＲＮＰの作製＞
チオール末端ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）をテローゲンとして用い、クロロメチルスチレン（ＣＭＳ）のラジカルテロメリゼーションによりＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳを製造した。（ＰＥＧは、分子量５，０００のものを使用した。）この側鎖クロロメチル基に４−アミノ−ＴＥＭＰＯを導入した。このようにして得られたＴＥＭＰＯを側鎖に有するブロック共重合体（ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＴＥＭＰＯ（Ｎ），ＰＣＴＥＭＰＯ（Ｎ）の分子量５，０００）は水中で自己会合し、平均直径約４０ｎｍ程度の粒子を形成する。
【００３５】
＜Ｏ−ＲＮＰの作製＞
チオール末端ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）をテローゲンとして用い、クロロメチルスチレン（ＣＭＳ）のラジカルテロメリゼーションによりＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳを製造した。（ＰＥＧは、分子量５，０００のものを使用した。）この側鎖クロロメチル基に４−ヒドロキシ−ＴＥＭＰＯを導入した。このようにして得られたＴＥＭＰＯを側鎖に有するブロック共重合体（ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＴＥＭＰＯ（Ｏ），ＰＣＴＥＭＰＯ（Ｏ）の分子量５，０００）は水中で自己会合し、平均直径約４０ｎｍ程度の粒子を形成する。
【００３６】
実施例１：ドキソルビシン（ＤＯＸ）とＯ−ＲＮＰの相互作用
＜細胞実験＞
９６ｗｅｌｌプレートにｃｏｌｏｎ２６細胞を１×１０５個播種した。４８時間後にＤＯＸ（２μｇ／ｍｌ）を添加し、２４、１２、６、０時間前に濃度を振りＯ−ＲＮＰを添加した。ドキソルビシンを添加して２４時間後に細胞生存率をＷＳＴ−ａｓｓａｙを用いて測定した。コントロールとして、４８時間単独でＯ−ＲＮＰを添加した時の細胞生存率を測定した。
【００３７】
＜実験結果＞
結果を図１に示す。Ｏ−ＲＮＰを単独で４８時間暴露した場合、どの濃度においても毒性は確認されなかった。またＤＯＸを添加する前に、Ｏ−ＲＮＰを前投与すると、Ｏ−ＲＮＰ内のＴＥＭＰＯ濃度依存的に細胞生存率が増加することが明らかとなった。
【００３８】
＜実験動物＞
６週齢、体重３０±２ｇのＢＡＬＢ／ｃマウスを購入し、２−３日間の馴化飼育の後に実験に用いた。ＢＡＬＢ／ｃマウスに結腸癌由来Ｃｏｌｏｎ−２６（１×１０６ｃｅｌｌｓ／１００Ｌ）を皮下投与することで担がんマウスを作製した。はじめに、上記製造例で得られるＯ−ＲＮＰ（３０ｍｇ／ｍｌ，ＴＥＭＰＯ濃度４０ｍＭ，５０μＬ）を担がんマウスに４日間局所投与し、４日目の段階ＤＯＸ（１０ｍｇ／ｋｇ）を尾静脈投与し、その後の腫瘍の大きさを測定した。
【００３９】
＜実験結果＞
結果を図２に示す。
【００４０】
細胞実験では、Ｏ−ＲＮＰをＤＯＸ添加前に投与しておくとＤＯＸの細胞毒性を低減させるという結果であったものの、Ｏ−ＲＮＰを事前にがん組織に局所投与するとＤＯＸ投与後の腫瘍の成長を抑制することが明らかとなった。
なお、図中の各表示は以下の実験系に相当する。
・ＲＮＰ群：Ｏ−ＲＮＰのみを投与した。
・ＤＯＸ＋Ｏ−ＲＮＰ群：Ｏ−ＲＮＰのみを投与し（４日間）、ＤＯＸを投与した。
・ＤＯＸ群：ＰＢＳを４日間投与し、ＤＯＸを投与した
・Ｎ．Ｓ．群：ＰＢＳの４日間投与のみ。
【００４１】
実施例２：ポリエチレンイミンを用いた遺伝子デリバリーとＲＮＰの相互作用
この実験は、Ｎ−ＲＮＰを用いた遺伝子デリバリーにおける発現効率の向上を確認するためのものである。
【００４２】
ｐＤＮＡとしてｐＧＬ３（ルシフェラーゼ遺伝子）、ベクターとしてポリエチレンイミン（ＰＥＩ：ｂｒａｎｃｈｅｄ，Ｍｗ＝２５０００）を用いた。ｐＤＮＡとＰＥＩは（ＰＥＩ中のアミノ基）／（ｐＤＮＡ中のリン酸基）＝Ｎ／Ｐ＝１０となるように混合して複合体（ｐＤＮＡ／ＰＥＩ）を作成した。
【００４３】
ＨｅＬａ細胞を５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで２４ｗｅｌｌプレートに播種し、２４時間後、ｐＤＮＡ／ＰＥＩおよびＮ−ＲＮＰを添加した。ｐＤＮＡは０．２μｇ／ｗｅｌｌを添加した。２４時間後に培地交換を行い、さらに２４時間後にルシフェラーゼアッセイ（発光量の測定）とＢＣＡアッセイ（たんぱく質の定量）を行った。
【００４４】
結果を図３に示す。
【００４５】
図３の縦軸は発光量をたんぱく量で割った値をｐＤＮＡ／ＰＥＩのみの値を１として規格化したものである。Ｎ−ＲＮＰの添加量はＲ１＝３．３×１０−５ｍＭ
Ｎ−ＲＮＰ，Ｒ２＝３．３×１０−４ｍＭ Ｎ−ＲＮＰ，Ｒ３＝３．３×１０−３ｍＭ
Ｎ−ＲＮＰ，Ｒ４＝３．３×１０−２ｍＭ ＲＮＰである。上図よりＮ−ＲＮＰの添加量が増加するにつれルシフェラーゼの発現量が増加していることが分かった。
【００４６】
以上の結果からＮ−ＲＮＰは遺伝子デリバリーにおいてｐＤＮＡ／ＰＥＩのみで用いるよりも遺伝子の発現効率を上げることが示された。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体内標的組織または細胞への治療活性物質のデリバリー効率を高めるかまたは該標的における治療活性物質の有する活性を増強するための製薬学的製剤であって、有効成分として、高分子化環状ニトロキシドラジカル化合物を含んでなり、該治療活性物質が抗腫瘍剤または核酸分子である、製薬学的製剤。
【請求項２】
高分子化環状ニトロキシドラジカル化合物と抗腫瘍剤または核酸分子とを組み合わせたことを特徴とする抗腫瘍剤または核酸分子で処置することの必要な疾患を予防または治療するための製薬学的製剤。
【請求項３】
高分子化環状ニトロキシドラジカル化合物が、一般式（ＩＩ）
【化１】
式中、Ａは、非置換または置換Ｃ１−Ｃ１２アルコキシを表し、置換されている場合の置換基は、ホルミル基または式Ｒ１Ｒ２ＣＨ−の基を表し、ここで、Ｒ１及びＲ２は独立して、Ｃ１−Ｃ４アルコキシまたはＲ１とＲ２は一緒になって−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ−、−Ｏ（ＣＨ２）３Ｏ−もしくは−Ｏ（ＣＨ２）４Ｏ−を表し、
Ｌ１は、原子化結合、−（ＣＨ２）ｃＳ−、−ＣＯ（ＣＨ２）ｃＳ−、からなる群より選ばれる連結基を表し、ここでｃは１ないし５の整数であり、
Ｌ２は、メチルイミノ、メチルイミノメチル、メチルオキシ、メチルオキシメチル、メチルエステル及びメチルエステルメチルからなる群より選ばれる連結基を表し、
Ｒは、Ｒの総数ｎの少なくとも５０％が２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル−４−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−１−オキシル−３−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリン−１−オキシル−３−イル及び２，４，４−トリメチル−１，３−オキサゾリジン−３−オキシル−２−イル、２，４，４−トリメチル−１，３−チアゾリジン−３−オキシル−２−イル及び２，４，４−トリメチル−イミダゾリンジン−３−オキシル−２−イルからなる群より選ばれる環状ニトロキシドラジカル化合物の残基を表し、存在する場合には、残りのＲが水素原子、ハロゲン原子またはヒドロキシ基であり、
ｍは、２０〜５，０００の整数を表し、そして
ｎは、３〜１，０００の整数を表す、
で表される、請求項１または２記載の製薬学的製剤。
【請求項４】
Ｌ１が原子化結合または−ＣＨ２ＣＨ２Ｓ−であり、Ｌ２がメチルイミノまたはメチルイミノメチルであり、そして
Ｒの全てが、次式
【化２】
式中、Ｒ’はメチル基である，
のいずれかで表される、請求項３記載の製薬学的製剤。
【請求項５】
治療活性物質が抗腫瘍剤であり、かつ、処置することの必要な疾患が癌である、請求項２〜４のいずれかに記載の製薬学的製剤。
【請求項６】
高分子化環状ニトロキシドラジカル化合物が投与された後に、治療活性物質が投与されるものである、請求項２〜５のいずれかに記載の製薬学的製剤。
【請求項７】
抗腫瘍剤が、ドキソルビシン、イダルビシン、エピルビシン、ピラルビシン、イリノテカン、エトポシド、ソブゾキサン、ノギテカン、カルボプラチン、シスプラチン、ネダプラチン、ジアミノシクロヘキサン白金（ＩＩ）、ドセタキセル水和物、およびパクリタキセルからなる群より選ばれる請求項５または６記載の製薬学的製剤。
【請求項８】
治療活性物質が核酸分子である、請求項１または２記載の製薬学的製剤。
【請求項１】
生体内標的組織または細胞への治療活性物質のデリバリー効率を高めるかまたは該標的における治療活性物質の有する活性を増強するための製薬学的製剤であって、有効成分として、高分子化環状ニトロキシドラジカル化合物を含んでなり、該治療活性物質が抗腫瘍剤または核酸分子である、製薬学的製剤。
【請求項２】
高分子化環状ニトロキシドラジカル化合物と抗腫瘍剤または核酸分子とを組み合わせたことを特徴とする抗腫瘍剤または核酸分子で処置することの必要な疾患を予防または治療するための製薬学的製剤。
【請求項３】
高分子化環状ニトロキシドラジカル化合物が、一般式（ＩＩ）
【化１】
式中、Ａは、非置換または置換Ｃ１−Ｃ１２アルコキシを表し、置換されている場合の置換基は、ホルミル基または式Ｒ１Ｒ２ＣＨ−の基を表し、ここで、Ｒ１及びＲ２は独立して、Ｃ１−Ｃ４アルコキシまたはＲ１とＲ２は一緒になって−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ−、−Ｏ（ＣＨ２）３Ｏ−もしくは−Ｏ（ＣＨ２）４Ｏ−を表し、
Ｌ１は、原子化結合、−（ＣＨ２）ｃＳ−、−ＣＯ（ＣＨ２）ｃＳ−、からなる群より選ばれる連結基を表し、ここでｃは１ないし５の整数であり、
Ｌ２は、メチルイミノ、メチルイミノメチル、メチルオキシ、メチルオキシメチル、メチルエステル及びメチルエステルメチルからなる群より選ばれる連結基を表し、
Ｒは、Ｒの総数ｎの少なくとも５０％が２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル−４−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−１−オキシル−３−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリン−１−オキシル−３−イル及び２，４，４−トリメチル−１，３−オキサゾリジン−３−オキシル−２−イル、２，４，４−トリメチル−１，３−チアゾリジン−３−オキシル−２−イル及び２，４，４−トリメチル−イミダゾリンジン−３−オキシル−２−イルからなる群より選ばれる環状ニトロキシドラジカル化合物の残基を表し、存在する場合には、残りのＲが水素原子、ハロゲン原子またはヒドロキシ基であり、
ｍは、２０〜５，０００の整数を表し、そして
ｎは、３〜１，０００の整数を表す、
で表される、請求項１または２記載の製薬学的製剤。
【請求項４】
Ｌ１が原子化結合または−ＣＨ２ＣＨ２Ｓ−であり、Ｌ２がメチルイミノまたはメチルイミノメチルであり、そして
Ｒの全てが、次式
【化２】
式中、Ｒ’はメチル基である，
のいずれかで表される、請求項３記載の製薬学的製剤。
【請求項５】
治療活性物質が抗腫瘍剤であり、かつ、処置することの必要な疾患が癌である、請求項２〜４のいずれかに記載の製薬学的製剤。
【請求項６】
高分子化環状ニトロキシドラジカル化合物が投与された後に、治療活性物質が投与されるものである、請求項２〜５のいずれかに記載の製薬学的製剤。
【請求項７】
抗腫瘍剤が、ドキソルビシン、イダルビシン、エピルビシン、ピラルビシン、イリノテカン、エトポシド、ソブゾキサン、ノギテカン、カルボプラチン、シスプラチン、ネダプラチン、ジアミノシクロヘキサン白金（ＩＩ）、ドセタキセル水和物、およびパクリタキセルからなる群より選ばれる請求項５または６記載の製薬学的製剤。
【請求項８】
治療活性物質が核酸分子である、請求項１または２記載の製薬学的製剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２０１２−６７０２５（Ｐ２０１２−６７０２５Ａ）
【公開日】平成２４年４月５日（２０１２．４．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２１１８２６（Ｐ２０１０−２１１８２６）
【出願日】平成２２年９月２２日（２０１０．９．２２）
【出願人】（５０４１７１１３４）国立大学法人 筑波大学 (510)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年４月５日（２０１２．４．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年９月２２日（２０１０．９．２２）
【出願人】（５０４１７１１３４）国立大学法人 筑波大学 (510)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]