治療的処置
アテローム性動脈硬化症の予防または処置のためのおよび心臓血管イベントの予防のための、カンデサルタン（candesartan）およびロスバスタチン（rosuvastatin）を含む組合せが記載されている。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、カンデサルタン（candesartan）およびロスバスタチン（rosuvastatin）を含む組合せに関する。
本発明は、更に、前述の組合せを含む医薬組成物に関する。本発明は、更に、アテローム性動脈硬化症の予防または処置における、本明細書中の前述の組合せの使用に関する。
【０００２】
アテローム性動脈硬化症は、動脈内に不規則に分布する脂質沈着を引き起こす複雑な病理学的過程によって媒介される状態であり、冠状動脈性心疾患への主な要因である。したがって、アテローム性動脈硬化症の減少は、心臓血管イベント（ｅｖｅｎｔ）、例えば、心筋梗塞、アンギナの悪化、心停止、脳卒中、うっ血性心不全および心臓血管死の数を減少させるための主な標的である。
【０００３】
異常脂肪血症、特に、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）の増加した血漿レベルは、アテローム性動脈硬化症の主な危険因子の一つである。臨床研究は、スタチンとして一般的に知られている３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素Ａ（ＨＭＧ ＣｏＡ）レダクターゼ阻害剤で血漿ＬＤＬレベルを減少させることが、心臓血管イベントの危険を一層少なくするということを示した。
【０００４】
レニン−アンギオテンシン系（ＲＡＳ）の活性化は、アテローム性動脈硬化症の別の重要な危険因子と考えられうる。アンギオテンシン（II）（Ａ（II））の形成でのＲＡＳの活性化と、Ａ（II）受容体の活性化は、アテローム発生、アテローム斑破裂、心筋虚血性機能不全およびうっ血性心不全に関係していた（Singh and Mehta, Arch Intern Med, 2003, vol 163, 1296-1304）。
【０００５】
国際特許出願ＷＯ９５／２６１８８号は、場合により、ＨＭＧＣｏＡレダクターゼ阻害剤と組み合わせた、Ａ（II）受容体遮断薬でのアテローム性動脈硬化症の処置を開示している。国際特許出願ＷＯ０１／７６５７３号は、リストの中にアテローム性動脈硬化症がある状態の予防または進行遅延のための、Ａ（II）アンタゴニスト、ＡＣＥ（アンギオテンシン変換酵素）阻害剤およびＨＭＧＣｏＡレダクターゼ阻害剤の内の少なくとも二つの組合せの使用を開示している。
【０００６】
本発明者は、驚くべきことに、Ａ（II）アンタゴニストであるカンデサルタンと、ＨＭＧ ＣｏＡレダクターゼ阻害剤であるロスバスタチンの組合せが、アテローム性動脈硬化症の減少において共力作用（ｓｙｎｅｒｇｉｃ ｅｆｆｅｃｔ）を有するということを発見した。この共力作用は、ＲＡＳに関与する多数の炎症性メディエーター（例えば、ＣＤ４０、メタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ））の発現の共力的阻害および／または（内皮細胞上の酸化ＬＤＬの受容体である）受容体ＬＯＸ−１の発現の阻害によって生じると考えられる。その共力作用は、アテローム発生におけるＲＡＳと異常脂肪血症との間のクロストークについて強力な証拠を与える。
【０００７】
ＭＭＰの活性は、それらの組織インヒビター（ＴＩＭＰ）によって in-vivo で調節されうるということが理解されるであろう。本発明者は、更に、ＴＩＭＰ−１およびＴＩＭＰ−２の発現が、高コレステロール食によってアップレギュレーションされ、そしてカンデサルタンおよびロスバスタチンの組合せによって著しく減衰するということを示した。これらデータは、ＭＭＰとＴＩＭＰとの間の平衡が、高コレステロール食によって変化するという概念、およびこの不均衡は、Ａ（II）アンタゴニストおよび脂質低下薬（lipid-lowering agent）の組合せによって「正常化（normalized）」することができるという概念を信頼させる。
【０００８】
本発明の一つの側面において、アテローム性動脈硬化症の予防または処置のための、カンデサルタンまたはその薬学的に許容しうる塩およびロスバスタチンまたはその薬学的に許容しうる塩を含む組合せを提供する。
【０００９】
本発明の一つの側面において、心臓血管イベントの予防のための、カンデサルタンまたはその薬学的に許容しうる塩およびロスバスタチンまたはその薬学的に許容しうる塩を含む組合せを提供する。
【００１０】
このような組合せは、これらメディエーター（ｍｅｄｉａｔｏｒ）に関連した他の疾患、例えば、（心臓、脳、腎、肺および肝への）虚血再灌流障害、放射線誘発損傷、熱傷および末梢血管疾患などの炎症性の疾患または状態の処置または予防にも有用でありうる。
【００１１】
カンデサルタンは、好適には、カンデサルタンの形であってよいし、またはカンデサルタン・シレキセチル（candesartan cilexetil）というプロドラッグ形であってよい。これらの形は、ヒドロクロロチアジド（例えば、Atacand PlusＴＭとして市販の）のような利尿薬などの追加の薬剤と一緒に製剤化することができる。
【００１２】
本明細書中でカンデサルタンに言及する場合、これには、カンデサルタンおよびカンデサルタン・シレキセチル双方が含まれる。
ロスバスタチンのカルシウム塩は、ロスバスタチンカルシウムと称されることがありうるが、好ましくは、本発明のいろいろな側面において用いられる。
【００１３】
概して、薬学的に許容しうる塩には、メタンスルホン酸塩、トシラート、α−グリセロリン酸、フマル酸塩、塩酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩および（あまり好ましくはないが）臭化水素酸塩などの酸付加塩が含まれる。薬学的に許容しうる塩には、概して、リン酸および硫酸で形成される塩も含まれる。薬学的に許容しうる塩には、概して、塩基塩であって、アルカリ金属塩、例えば、ナトリウム；アルカリ土類金属塩、例えば、カルシウムまたはマグネシウム；有機アミン塩、例えば、トリエチルアミン、モルホリン、Ｎ−メチルピペリジン、Ｎ−エチルピペリジン、プロカイン、ジベンジルアミン、Ｎ，Ｎ−ジベンジルエチルアミン、トリス−（２−ヒドロキシエチル）アミン、トリス（ヒドロキシメチル）メチルアンモニウム、Ｎ−メチルｄ−グルカミン；およびリシンのようなアミノ酸などのものが含まれる。荷電した官能基の数および陽イオンまたは陰イオンの原子価に依存して、１個より多くの陽イオンまたは陰イオンが存在してよい。
【００１４】
本明細書中で、「組合せ」という用語が用いられる場合、これは、同時の、別々のまたは逐次的な投与を意味するということは理解されるはずである。本発明の一つの側面において、「組合せ」は、同時投与を意味する。本発明の別の側面において、「組合せ」は、別々の投与を意味する。本発明のもう一つの側面において、「組合せ」は、逐次的投与を意味する。投与が、逐次的または別々である場合、二番目の成分を投与する場合の遅れは、双方の薬剤が、その組合せの共力作用を生じるように体内に存在するようにあるべきである。
【００１５】
本発明のもう一つの側面において、アテローム性動脈硬化症の予防または処置に用いるための医薬組成物であって、カンデサルタンまたはその薬学的に許容しうる塩およびロスバスタチンまたはその薬学的に許容しうる塩を、薬学的に許容しうる希釈剤または担体と一緒に含む医薬組成物を提供する。
【００１６】
本発明のもう一つの側面において、心臓血管イベントの予防またはその危険の減少に用いるための医薬組成物であって、カンデサルタンまたはその薬学的に許容しうる塩およびロスバスタチンまたはその薬学的に許容しうる塩を、薬学的に許容しうる希釈剤または担体と一緒に含む医薬組成物を提供する。
【００１７】
本明細書中に記載の組成物は、経口投与に適する形で、例えば、錠剤またはカプセル剤として；非経口注射（静脈内、皮下、筋肉内、脈管内または注入を含めた）には、例えば、滅菌液剤、懸濁剤または乳剤として；局所投与には、例えば、軟膏剤またはクリーム剤として；直腸投与には、例えば、坐剤としてあってよいし、または投与経路は、腫瘍中への直接注射、または限局送達または局部送達によってよい。本発明の他の態様において、組合せ処置の化合物は、内視鏡的に、気管内に、病変内に、経皮的に、静脈内に、皮下に、腹腔内にまたは腫瘍内に送達されてよい。概して、本明細書中に記載の組成物は、当該技術分野において周知である慣用的な賦形剤または担体を用いて慣用的な方式で製造することができる。
【００１８】
錠剤製剤に適する薬学的に許容しうる賦形剤または担体には、例えば、ラクトース、炭酸ナトリウム、リン酸カルシウムまたは炭酸カルシウムなどの不活性賦形剤；トウモロコシデンプンまたはアルギン酸などの造粒剤および崩壊剤；ゼラチンまたはデンプンなどの結合剤；ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルクなどの滑沢剤；４−ヒドロキシ安息香酸エチルまたはプロピルなどの保存剤；およびアスコルビン酸などの酸化防止剤が含まれる。錠剤製剤は、胃腸管内でのそれらの崩壊およびその後の活性成分の吸収を変更するようにかまたはそれらの安定性および／または外観を改善するように、どちらの場合も、当該技術分野において周知の慣用的なコーティング剤および手順を用いてコーティングされていてよいしまたは未コーティングであってよい。
【００１９】
経口使用のための組成物は、活性成分が、不活性固体賦形剤、例えば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウムまたはカオリンと混合されているゼラチン硬カプセル剤の形であってよいし、または活性成分が、ラッカセイ油、流動パラフィンまたはオリーブ油などの油または水と混合されているゼラチン軟カプセル剤としてあってよい。
【００２０】
カンデサルタンは、「AtacandＴＭ」および「Atacand PlusＴＭ」として商業的に入手可能である。ロスバスタチンカルシウムは、「CrestorＴＭ」として商業的に入手可能である。本発明に適する製剤には、商業的に入手可能であるものが含まれる。
【００２１】
組合せの各々の成分の適する投薬量は、市販の商品のものである。或いは、それら成分間の共力作用が、用いられる一方または双方の成分のより少ない投薬量を可能にすることがありうる。例えば、４ｍｇ、８ｍｇ、１６ｍｇ、３２ｍｇの用量または１６０ｍｇまでの用量のカンデサルタンを、８０ｍｇ、４０ｍｇ、２０ｍｇ、１０ｍｇ、５ｍｇまたは２．５ｍｇの用量のロスバスタチンと組み合わせて用いることができる。カンデサルタンの用量のいずれか一つを、ロスバスタチンのいずれか適する用量と組み合わせることができる。
【００２２】
一つの側面において、８０ｍｇのロスバスタチンが用いられる。別の側面において、４０ｍｇのロスバスタチンが用いられる。もう一つの側面において、２０ｍｇのロスバスタチンが用いられる。もう一つの側面において、１０ｍｇのロスバスタチンが用いられる。もう一つの側面において、５ｍｇのロスバスタチンが用いられる。もう一つの側面において、２．５ｍｇのロスバスタチンが用いられる。
【００２３】
一つの側面において、約６４〜１２８ｍｇなどの３２〜１６０ｍｇ、例えば、約６４〜９６ｍｇなどの６４〜１１２ｍｇのカンデサルタンが用いられる。好都合には、約７２ｍｇのカンデサルタンが用いられる。別の側面において、３２ｍｇのカンデサルタンが用いられる。もう一つの側面において、１６ｍｇのカンデサルタンが用いられる。もう一つの側面において、８ｍｇのカンデサルタンが用いられる。もう一つの側面において、４ｍｇのカンデサルタンが用いられる。
【００２４】
本発明による医薬組成物には、カンデサルタンまたはその薬学的に許容しうる塩およびロスバスタチンまたはその薬学的に許容しうる塩、および薬学的に許容しうる賦形剤または担体を含む組成物が含まれるということは理解されるであろう。例えば、このような組成物は、好都合には、単一経口製剤中で、アテローム性動脈硬化症の予防または処置における同時投与のための本発明の治療的組合せ製品を提供する。
【００２５】
好ましくは、その組合せの二つの成分は、双方とも経口投与される。
好ましくは、その組合せの二つの成分は、単一経口製剤として投与される。
好ましくは、その組合せは、１日１回投与用に製剤化される。
【００２６】
好都合には、その組合せは、単一の錠剤またはカプセル剤として製剤化される。
本明細書中の前記の投薬量およびスケジュールは、具体的な病状および患者の全身状態によって異なることがありうる。例えば、毒性を減少させるために、組合せ処置の成分の上述の用量を減少させることが必要であるまたは望まれることがありうる。投薬量およびスケジュールは、本発明の組合せ処置に加えて、一つまたはそれを超える追加の化学療法薬が用いられる場合も、異なることがありうる。スケジュール作成は、いずれか特定の患者を処置している医療の実務家が、職業上の技術および知識を用いて決定することができる。
【００２７】
本発明による医薬組成物には、更に、カンデサルタンまたはその薬学的に許容しうる塩および薬学的に許容しうる賦形剤または担体を含む第一組成物と、ロスバスタチンまたはその薬学的に許容しうる塩および薬学的に許容しうる賦形剤または担体を含む第二組成物を含む別々の組成物が含まれる。このような組成物は、好都合には、アテローム性動脈硬化症の共力的予防または処置における逐次的なまたは別々の投与のための本発明の治療的組合せを提供するが、それら別々の組成物は、同時に投与することもできる。
【００２８】
本発明の別の側面において、アテローム性動脈硬化症の予防または処置用の薬剤として用いるための、カンデサルタンまたはその薬学的に許容しうる塩およびロスバスタチンまたはその薬学的に許容しうる塩を含む組合せを提供する。
【００２９】
本発明の別の側面において、心臓血管イベントの予防用の薬剤として用いるための、カンデサルタンまたはその薬学的に許容しうる塩およびロスバスタチンまたはその薬学的に許容しうる塩を含む組合せを提供する。
【００３０】
本発明の別の側面において、薬剤の製造に用いるための、カンデサルタンまたはその薬学的に許容しうる塩およびロスバスタチンまたはその薬学的に許容しうる塩を含む組合せを提供する。
【００３１】
本発明の別の側面において、アテローム性動脈硬化症の予防または処置用の薬剤の製造に用いるための、カンデサルタンまたはその薬学的に許容しうる塩およびロスバスタチンまたはその薬学的に許容しうる塩を含む組合せを提供する。
【００３２】
本発明の別の側面において、心臓血管イベントの予防用の薬剤の製造に用いるための、カンデサルタンまたはその薬学的に許容しうる塩およびロスバスタチンまたはその薬学的に許容しうる塩を含む組合せを提供する。
【００３３】
本発明のもう一つの側面において、ヒトなどの温血動物のアテローム性動脈硬化症を予防するまたは処置する方法であって、カンデサルタンまたはその薬学的に許容しうる塩およびロスバスタチンまたはその薬学的に許容しうる塩の組合せを投与することを含む方法を提供する。
【００３４】
本発明のもう一つの側面において、ヒトなどの温血動物の心臓血管イベントを予防する方法であって、カンデサルタンまたはその薬学的に許容しうる塩およびロスバスタチンまたはその薬学的に許容しうる塩の組合せを投与することを含む方法を提供する。
【００３５】
本発明のもう一つの側面により、アテローム性動脈硬化症の予防または処置に用いるためのキットであって、カンデサルタンまたはその薬学的に許容しうる塩およびロスバスタチンまたはその薬学的に許容しうる塩の組合せを、場合により、取扱い説明書と一緒に含むキットを提供する。
【００３６】
本発明のもう一つの側面により、アテローム性動脈硬化症の予防または処置に用いるためのキットであって、
（ａ）第一単位剤形のカンデサルタン；
（ｂ）第二単位剤形のロスバスタチン；および
（ｃ）それら第一および第二剤形を含有するための容器手段；そして場合により、
（ｄ）取扱い説明書
を含むキットを提供する。
【００３７】
本発明の別の側面により、ＣＤ４０および／またはメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）の発現を阻害する方法であって、カンデサルタンまたはその薬学的に許容しうる塩およびロスバスタチンまたはその薬学的に許容しうる塩の組合せを投与することによる方法を提供する。
【００３８】
具体的なメタロプロテイナーゼは、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９である。
本発明の別の側面により、ＣＤ４０および／またはメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）の発現の阻害によってアテローム性動脈硬化症患者を処置する方法であって、ＣＤ４０および／またはメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）の発現の阻害に適する量のカンデサルタンまたはその薬学的に許容しうる塩およびロスバスタチンまたはその薬学的に許容しうる塩の組合せを投与することによる方法を提供する。
【００３９】
本発明のもう一つの側面により、ＭＭＰとＴＩＭＰＳとの間の平衡を常態化する方法であって、一定量のカンデサルタンまたはその薬学的に許容しうる塩およびロスバスタチンまたはその薬学的に許容しうる塩の組合せの投与による方法を提供する。
【００４０】
本発明の別の側面により、ＬＯＸ−１の発現を阻害する方法であって、カンデサルタンまたはその薬学的に許容しうる塩およびロスバスタチンまたはその薬学的に許容しうる塩の組合せを投与することによる方法を提供する。
【００４１】
本発明の別の側面により、ＬＯＸ−１の発現の阻害によってアテローム性動脈硬化症患者を処置する方法であって、ＬＯＸ−１の発現の阻害に適する量のカンデサルタンまたはその薬学的に許容しうる塩およびロスバスタチンまたはその薬学的に許容しうる塩の組合せを投与することによる方法を提供する。
【００４２】
材料および方法
動物モデル
５つがいのＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスおよび３つがいのホモ接合アポＥノックアウトマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊバックグラウンドで）を、Jackson Laboratories（Bar Harbor, ME）より入手した。それらを、兄弟姉妹交配によって飼育し、そして６：００ＡＭ〜６：００ＰＭまで照明され且つ２１℃で保持された室中に収容した。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（ｎ＝１０）は、全研究期間を普通食（ｒｅｇｕｌａｒ ｄｉｅｔ）で継続した。アポＥノックアウトマウスは、４群に分けた。１群（ｎ＝１０）被験動物には、高コレステロール食（１％コレステロール）単独を、６週令以降１２週間与え；２群（ｎ＝１０）被験動物には、カンデサルタン（１ｍｇ／ｋｇ／ｄ）を含む高コレステロール食を、６週令以降１２週間与え；３群（ｎ＝１０）被験動物には、ロスバスタチン（１ｍｇ／ｋｇ／ｄ）を含む高コレステロール食を、６週令以降１２週間与え；４群（ｎ＝１０）被験動物には、カンデサルタン（１ｍｇ／ｋｇ／ｄ）およびロスバスタチン（１ｍｇ／ｋｇ／ｄ）を含む高コレステロール食を、６週令以降１２週間与えた。
【００４３】
１２週処置の最後に、それらマウスを屠殺し、下記の研究を行った。実験手順は全て、Institutional Animal Care and Usage Committee of University of Arkansas for Medical Sciences によって承認されたプロトコールにしたがって行った。
【００４４】
アテローム性動脈硬化症斑の定量分析
１２週処置の最後に、各群からの５匹のマウスを安楽死させ、大動脈を周囲組織から分離した。外膜脂肪組織の除去後、大動脈を、大動脈弓から腸骨分岐へと縦に開き、１０％ホルマリン中で２４時間固定した。次に、それら大動脈を、７０％アルコール中で簡単にすすぎ洗浄し、スダンＩＶ溶液で１５分間染色し、８０％アルコール中で２０分間差別化し、そして流水で１時間洗浄した（Russell L. Techniques for studying atherosclerotic lesion, Lab Invest. 1958; 7:42-47）。大動脈を検鏡板に固定し、そして解剖顕微鏡に接続されたカメラで、それらの写真を撮った。それら画像は、ソフトウェア（Image Pro Plus, Media Cybernetics）によって分析した。
【００４５】
ＲＮＡ製造およびＲＴ−ＰＣＲによる分析
１２週処置の最後に、各群からの５匹のマウスを安楽死させ、大動脈（大動脈弓から腸骨分岐まで）を周囲組織から分離し、ドライアイス上で貯蔵した。各々の大動脈を、４部分に切断し、その二つを用いて、初期に記載されたような（２７）ワンステップの酸・グアニジニウムチオシアネート・フェノール・クロロホルム法（single-step acid-guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform method）で、全ＲＮＡを抽出した。１マイクログラムの全ＲＮＡを、オリゴｄＴ（Promega, Madison, WI, U.S.A.）および Maloney ネズミ白血病ウイルス（Ｍ−ＭＬＶ）逆転写（Promega）で、ｃＤＮＡ中に４２℃で１時間逆転写させた。２マイクロリットルの逆転写（ＲＴ）材料を、マウスＬＯＸ−１、ＣＤ４０またはＭＭＰ（ＭＭＰ−１、−２、−９）に特異的なプライマー対および Taq ＤＮＡポリメラーゼ（Promega）で増幅させた。マウスＬＯＸ−１については、順プライマー：５’−ＴＴＡＣＴＣＴＣＣＡＴＧＧＴＧＧＴＧＣＣ−３’、逆プライマー：５’−ＡＧＣＴＴＣＴＴＣＴＧＣＴＴＧＴＴＧＣＣ−３’を用いた。３０サイクルのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を、９４℃４０秒間（変性）、５５℃１分間（アニーリング）、および７２℃１分間（伸長）で行った。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）産物のサイズは、１９３塩基対であった。マウスＣＤ４０については、順プライマー５’−ＧＴＴＴＡＡＡＧＴＣＣＣＧＧＡＴＧＣＧＡ−３’および逆プライマー５’−ＣＴＣＡＡＧＧＣＴＡＴＧＣＴＧＴＣＴＧＴ−３’を用いた。３５サイクルのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を、９４℃１分間（変性）、５５℃１分間（アニーリング）、および７２℃１分間（伸長）で行った。ＰＣＲ産物のサイズは、４０８塩基対であった。マウスＭＭＰ−１については、順プライマー５’−ＧＧＡＣＴＣＴＣＣＣＡＴＴＣＴＴＡＡＴＧＡ Ｔ−３’および逆プライマー５’−ＣＣＴＣＴＴＴＣＴＧＧＡＴＡＡＣＡＴＣＡＴＣＡ ＡＣ−３’を用いた。マウスＭＭＰ−２については、順プライマー５’−ＡＴＣＡＡＧＧＧＧＡＴＣＣＡＧＧＡＧＣ−３’および逆プライマー５’−ＧＣＡＧＣＧＡＴＧＡＡＧ ＡＴＧＡＴＡＧ−３’を用いた。マウスＭＭＰ−９については、順プライマー５’−ＡＧＴＴＴＧＧＴＧＴＣＧＣＧＧＡＧＣＡＣ−３’および逆プライマー５’−ＴＡＣＡＴＧＡＧＣＧＣＴＴＣＣＧＧＣＡＣ−３’を用いた。全てのＭＭＰについて、３５サイクルのＰＣＲを、９４℃１分間（変性）、５８℃１分間（アニーリング）、および７５℃１分間（伸長）で行った。ＰＣＲ産物のサイズは、それぞれ、６２７塩基対、７１８塩基対および７５３塩基対であった。マウスβアクチンに特異的なプライマー対を、ハウスキーピング遺伝子として用いた（順プライマー：５’−ＴＴＣＴＡＣＡＡＴＧＡＧＣＴＧＣＧＴＴＧ−３’、逆プライマー：５’−ＣＡＣＴＧＴＧＴＴＧＧＣＡＴＡＧＡＧＧＴＣ−３’）。３０サイクルを、９４℃３０秒間（変性）、５５℃１分間（アニーリング）、および７２℃１分間（伸長）で用いた。ＰＣＲ産物は、５６０塩基対であった。逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）で増幅された試料を、１．５％アガロースゲル上において臭化エチジウムを用いて可視化した。
【００４６】
タンパク質製造およびウェスタンブロットによる分析
各々のマウス大動脈を、４部分に切断した。それらの二つを用いて、ＲＮＡを抽出し、そして残り二つを用いて、前に記載されたように（１４）タンパク質を抽出した。簡単にいうと、大動脈組織を、溶解緩衝液中で均一化し且つ溶解させた後、４０００ｒｐｍにおいて４℃で１０分間遠心分離した。１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、大動脈からの溶解産物タンパク質（２０μｇ／列）を分離し、ニトロセルロースメンブランに移した。遮断溶液（５％脱脂乳，Sigma）中でインキュベーション後、メンブランを、１：７５０希釈のマウスＬＯＸ−１への単クローン性抗体；１：５００希釈のマウスＣＤ４０への多クローン性抗体（Santa Cruz）；１μｇ／ｍｌ希釈のマウスＭＭＰ−１への単クローン性抗体（Oncogene）；１μｇ／ｍｌ希釈のマウスＭＭＰ−２への単クローン性抗体（Oncogene）；１μｇ／ｍｌ希釈のマウスＭＭＰ−９への単クローン性抗体（Oncogene）；１：５００希釈のマウスＴＩＭＰ−１への多クローン性抗体（Santa Cruz）；１：５００希釈のマウスＴＩＭＰ−２への多クローン性抗体（Santa Cruz）；または１：５０００希釈のマウスβアクチンへの単クローン性抗体（Sigma）と一緒に４℃で一晩インキュベートした。メンブランを洗浄後、１：５０００希釈の特異的二次抗体（Amersham Life Science）と一緒に室温で２時間インキュベートし、それらメンブランを洗浄し、そしてＥＣＬシステム（Amersham Life Science）で検出した。タンパク質バンドの相対強度は、Scan-gel-it ソフトウェアによって分析した（Li DY, Zhang YC, Sawamura T, Mehta JL. Circ Res. 1999; 84:1043-1049）。
【００４７】
データ分析
データは全て、二重反復試験試料の平均である。データは、平均±ＳＤとして表されている。統計的有意性は、独立データ群の中の多数の比較で決定したが、ここにおいて、ＡＮＯＶＡおよびＦ検定は、有意差の存在を示した。Ｐ値＜０．０５を、有意とみなした。
【００４８】
結果
カンデサルタンおよびロスバスタチンの共力的抗アテローム性動脈硬化症作用
対照マウス（普通食を与えられたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス）と比較したところ、高コレステロール食を与えられたアポＥノックアウトマウスは、広範囲にわたるアテローム性動脈硬化症を発症した（対照マウスに対してＰ＜０．０１）。カンデサルタンもロスバスタチンも、単独では、アテローム性動脈硬化症の程度を減少させたが（高コレステロール食単独に対してｐ＜０．０５）、その組合せは、アテローム性動脈硬化症をはるかに大きく減少させた（カンデサルタンまたはロスバスタチン単独＋高コレステロール食に対してＰ＜０．０５）。図１は、それぞれの実験結果と、異なった被験動物群でのアテローム性動脈硬化症の程度（平均±ＳＤ）を示している。
【００４９】
カンデサルタンおよびロスバスタチンは、単独で、アテローム性動脈硬化症を、それぞれ約３５％および２５％減少させた。その組合せは、アテローム性動脈硬化症を７０％減少させ、共力作用を示した。この作用は、図２にグラフで示されている。
【００５０】
ＬＯＸ−１発現に及ぼすカンデサルタンおよびロスバスタチンの共力作用
対照Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおいて、ＬＯＸ−１の発現（ｍＲＮＡおよびタンパク質）は少なかった。対照的に、ＬＯＸ−１発現（ｍＲＮＡおよびタンパク質）は、アポＥノックアウトマウスにおいて高コレステロール食で著しく増加した（対照マウスに対してＰ＜０．０１）。カンデサルタンもロスバスタチンも、単独では、ＬＯＸ−１発現（ｍＲＮＡおよびタンパク質）を、大きくはないが減少させた（高コレステロール食単独に対してＰ＜０．０５）。カンデサルタンおよびロスバスタチンの組合せは、アポＥノックアウトマウスにおいて、ＬＯＸ−１のアップレギュレーション（ｍＲＮＡおよびタンパク質）への劇的な阻害作用を有した（高コレステロール食単独に対してＰ＜０．０１）。
【００５１】
ＣＤ４０発現に及ぼすカンデサルタンおよびロスバスタチンの共力作用
対照Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスでの発現と比較したところ、ＣＤ４０発現（ｍＲＮＡおよびタンパク質）は、高コレステロール食を与えられたアポＥノックアウトマウスにおいて著しく増加した（対照マウスに対してＰ＜０．０１）。カンデサルタンおよびロスバスタチンの単独処置は、ＣＤ４０発現を僅かに減少させたが（高コレステロール食単独に対してＰ＜０．０５）、カンデサルタンおよびロスバスタチンの組合せは、アポＥノックアウトマウスにおいて、ＣＤ４０のアップレギュレーション（ｍＲＮＡおよびタンパク質）への劇的な阻害作用を有した（高コレステロール食単独に対してＰ＜０．０１）。
【００５２】
ＭＭＰ発現に及ぼすカンデサルタンおよびロスバスタチンの共力作用
対照Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスでの発現と比較したところ、ＭＭＰ−１、−２および−９の発現（ｍＲＮＡおよびタンパク質）は、高コレステロール食を与えられたアポＥノックアウトマウスにおいて著しく増加した（対照マウスに対してＰ＜０．０１）。カンデサルタンもロスバスタチンも、単独では、ＭＭＰ−１、−２および−９の発現（ｍＲＮＡおよびタンパク質）を、大きくはないが減少させた（高コレステロール食単独に対してＰ＜０．０５）。カンデサルタンおよびロスバスタチンの組合せは、それらの発現への劇的な阻害作用を有した（高コレステロール食単独に対してＰ＜０．０１）。
【００５３】
ＴＩＭＰ発現に及ぼすカンデサルタンおよびロスバスタチンの作用
ＴＩＭＰ−１およびＴＩＭＰ−２タンパク質発現も、アポＥノックアウトマウスにおいて、高コレステロール食で増加したが（対照マウスに対してＰ＜０．０１）、その増加は、ＭＭＰの場合より少なかった。カンデサルタンもロスバスタチンも、単独では、ＴＩＭＰ−１およびＴＩＭＰ−２の発現を僅かに減少させたが（高コレステロール食単独に対してＰ＜０．０５）、カンデサルタンおよびロスバスタチンの組合せは、それらの発現への一層大きい阻害作用を有した（高コレステロール食単独に対してＰ＜０．０１，カンデサルタンまたはロスバスタチンを含む高コレステロール食に対してＰ＜０．０５）。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】
【図２】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、カンデサルタン（candesartan）およびロスバスタチン（rosuvastatin）を含む組合せに関する。
本発明は、更に、前述の組合せを含む医薬組成物に関する。本発明は、更に、アテローム性動脈硬化症の予防または処置における、本明細書中の前述の組合せの使用に関する。
【０００２】
アテローム性動脈硬化症は、動脈内に不規則に分布する脂質沈着を引き起こす複雑な病理学的過程によって媒介される状態であり、冠状動脈性心疾患への主な要因である。したがって、アテローム性動脈硬化症の減少は、心臓血管イベント（ｅｖｅｎｔ）、例えば、心筋梗塞、アンギナの悪化、心停止、脳卒中、うっ血性心不全および心臓血管死の数を減少させるための主な標的である。
【０００３】
異常脂肪血症、特に、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）の増加した血漿レベルは、アテローム性動脈硬化症の主な危険因子の一つである。臨床研究は、スタチンとして一般的に知られている３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素Ａ（ＨＭＧ ＣｏＡ）レダクターゼ阻害剤で血漿ＬＤＬレベルを減少させることが、心臓血管イベントの危険を一層少なくするということを示した。
【０００４】
レニン−アンギオテンシン系（ＲＡＳ）の活性化は、アテローム性動脈硬化症の別の重要な危険因子と考えられうる。アンギオテンシン（II）（Ａ（II））の形成でのＲＡＳの活性化と、Ａ（II）受容体の活性化は、アテローム発生、アテローム斑破裂、心筋虚血性機能不全およびうっ血性心不全に関係していた（Singh and Mehta, Arch Intern Med, 2003, vol 163, 1296-1304）。
【０００５】
国際特許出願ＷＯ９５／２６１８８号は、場合により、ＨＭＧＣｏＡレダクターゼ阻害剤と組み合わせた、Ａ（II）受容体遮断薬でのアテローム性動脈硬化症の処置を開示している。国際特許出願ＷＯ０１／７６５７３号は、リストの中にアテローム性動脈硬化症がある状態の予防または進行遅延のための、Ａ（II）アンタゴニスト、ＡＣＥ（アンギオテンシン変換酵素）阻害剤およびＨＭＧＣｏＡレダクターゼ阻害剤の内の少なくとも二つの組合せの使用を開示している。
【０００６】
本発明者は、驚くべきことに、Ａ（II）アンタゴニストであるカンデサルタンと、ＨＭＧ ＣｏＡレダクターゼ阻害剤であるロスバスタチンの組合せが、アテローム性動脈硬化症の減少において共力作用（ｓｙｎｅｒｇｉｃ ｅｆｆｅｃｔ）を有するということを発見した。この共力作用は、ＲＡＳに関与する多数の炎症性メディエーター（例えば、ＣＤ４０、メタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ））の発現の共力的阻害および／または（内皮細胞上の酸化ＬＤＬの受容体である）受容体ＬＯＸ−１の発現の阻害によって生じると考えられる。その共力作用は、アテローム発生におけるＲＡＳと異常脂肪血症との間のクロストークについて強力な証拠を与える。
【０００７】
ＭＭＰの活性は、それらの組織インヒビター（ＴＩＭＰ）によって in-vivo で調節されうるということが理解されるであろう。本発明者は、更に、ＴＩＭＰ−１およびＴＩＭＰ−２の発現が、高コレステロール食によってアップレギュレーションされ、そしてカンデサルタンおよびロスバスタチンの組合せによって著しく減衰するということを示した。これらデータは、ＭＭＰとＴＩＭＰとの間の平衡が、高コレステロール食によって変化するという概念、およびこの不均衡は、Ａ（II）アンタゴニストおよび脂質低下薬（lipid-lowering agent）の組合せによって「正常化（normalized）」することができるという概念を信頼させる。
【０００８】
本発明の一つの側面において、アテローム性動脈硬化症の予防または処置のための、カンデサルタンまたはその薬学的に許容しうる塩およびロスバスタチンまたはその薬学的に許容しうる塩を含む組合せを提供する。
【０００９】
本発明の一つの側面において、心臓血管イベントの予防のための、カンデサルタンまたはその薬学的に許容しうる塩およびロスバスタチンまたはその薬学的に許容しうる塩を含む組合せを提供する。
【００１０】
このような組合せは、これらメディエーター（ｍｅｄｉａｔｏｒ）に関連した他の疾患、例えば、（心臓、脳、腎、肺および肝への）虚血再灌流障害、放射線誘発損傷、熱傷および末梢血管疾患などの炎症性の疾患または状態の処置または予防にも有用でありうる。
【００１１】
カンデサルタンは、好適には、カンデサルタンの形であってよいし、またはカンデサルタン・シレキセチル（candesartan cilexetil）というプロドラッグ形であってよい。これらの形は、ヒドロクロロチアジド（例えば、Atacand PlusＴＭとして市販の）のような利尿薬などの追加の薬剤と一緒に製剤化することができる。
【００１２】
本明細書中でカンデサルタンに言及する場合、これには、カンデサルタンおよびカンデサルタン・シレキセチル双方が含まれる。
ロスバスタチンのカルシウム塩は、ロスバスタチンカルシウムと称されることがありうるが、好ましくは、本発明のいろいろな側面において用いられる。
【００１３】
概して、薬学的に許容しうる塩には、メタンスルホン酸塩、トシラート、α−グリセロリン酸、フマル酸塩、塩酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩および（あまり好ましくはないが）臭化水素酸塩などの酸付加塩が含まれる。薬学的に許容しうる塩には、概して、リン酸および硫酸で形成される塩も含まれる。薬学的に許容しうる塩には、概して、塩基塩であって、アルカリ金属塩、例えば、ナトリウム；アルカリ土類金属塩、例えば、カルシウムまたはマグネシウム；有機アミン塩、例えば、トリエチルアミン、モルホリン、Ｎ−メチルピペリジン、Ｎ−エチルピペリジン、プロカイン、ジベンジルアミン、Ｎ，Ｎ−ジベンジルエチルアミン、トリス−（２−ヒドロキシエチル）アミン、トリス（ヒドロキシメチル）メチルアンモニウム、Ｎ−メチルｄ−グルカミン；およびリシンのようなアミノ酸などのものが含まれる。荷電した官能基の数および陽イオンまたは陰イオンの原子価に依存して、１個より多くの陽イオンまたは陰イオンが存在してよい。
【００１４】
本明細書中で、「組合せ」という用語が用いられる場合、これは、同時の、別々のまたは逐次的な投与を意味するということは理解されるはずである。本発明の一つの側面において、「組合せ」は、同時投与を意味する。本発明の別の側面において、「組合せ」は、別々の投与を意味する。本発明のもう一つの側面において、「組合せ」は、逐次的投与を意味する。投与が、逐次的または別々である場合、二番目の成分を投与する場合の遅れは、双方の薬剤が、その組合せの共力作用を生じるように体内に存在するようにあるべきである。
【００１５】
本発明のもう一つの側面において、アテローム性動脈硬化症の予防または処置に用いるための医薬組成物であって、カンデサルタンまたはその薬学的に許容しうる塩およびロスバスタチンまたはその薬学的に許容しうる塩を、薬学的に許容しうる希釈剤または担体と一緒に含む医薬組成物を提供する。
【００１６】
本発明のもう一つの側面において、心臓血管イベントの予防またはその危険の減少に用いるための医薬組成物であって、カンデサルタンまたはその薬学的に許容しうる塩およびロスバスタチンまたはその薬学的に許容しうる塩を、薬学的に許容しうる希釈剤または担体と一緒に含む医薬組成物を提供する。
【００１７】
本明細書中に記載の組成物は、経口投与に適する形で、例えば、錠剤またはカプセル剤として；非経口注射（静脈内、皮下、筋肉内、脈管内または注入を含めた）には、例えば、滅菌液剤、懸濁剤または乳剤として；局所投与には、例えば、軟膏剤またはクリーム剤として；直腸投与には、例えば、坐剤としてあってよいし、または投与経路は、腫瘍中への直接注射、または限局送達または局部送達によってよい。本発明の他の態様において、組合せ処置の化合物は、内視鏡的に、気管内に、病変内に、経皮的に、静脈内に、皮下に、腹腔内にまたは腫瘍内に送達されてよい。概して、本明細書中に記載の組成物は、当該技術分野において周知である慣用的な賦形剤または担体を用いて慣用的な方式で製造することができる。
【００１８】
錠剤製剤に適する薬学的に許容しうる賦形剤または担体には、例えば、ラクトース、炭酸ナトリウム、リン酸カルシウムまたは炭酸カルシウムなどの不活性賦形剤；トウモロコシデンプンまたはアルギン酸などの造粒剤および崩壊剤；ゼラチンまたはデンプンなどの結合剤；ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルクなどの滑沢剤；４−ヒドロキシ安息香酸エチルまたはプロピルなどの保存剤；およびアスコルビン酸などの酸化防止剤が含まれる。錠剤製剤は、胃腸管内でのそれらの崩壊およびその後の活性成分の吸収を変更するようにかまたはそれらの安定性および／または外観を改善するように、どちらの場合も、当該技術分野において周知の慣用的なコーティング剤および手順を用いてコーティングされていてよいしまたは未コーティングであってよい。
【００１９】
経口使用のための組成物は、活性成分が、不活性固体賦形剤、例えば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウムまたはカオリンと混合されているゼラチン硬カプセル剤の形であってよいし、または活性成分が、ラッカセイ油、流動パラフィンまたはオリーブ油などの油または水と混合されているゼラチン軟カプセル剤としてあってよい。
【００２０】
カンデサルタンは、「AtacandＴＭ」および「Atacand PlusＴＭ」として商業的に入手可能である。ロスバスタチンカルシウムは、「CrestorＴＭ」として商業的に入手可能である。本発明に適する製剤には、商業的に入手可能であるものが含まれる。
【００２１】
組合せの各々の成分の適する投薬量は、市販の商品のものである。或いは、それら成分間の共力作用が、用いられる一方または双方の成分のより少ない投薬量を可能にすることがありうる。例えば、４ｍｇ、８ｍｇ、１６ｍｇ、３２ｍｇの用量または１６０ｍｇまでの用量のカンデサルタンを、８０ｍｇ、４０ｍｇ、２０ｍｇ、１０ｍｇ、５ｍｇまたは２．５ｍｇの用量のロスバスタチンと組み合わせて用いることができる。カンデサルタンの用量のいずれか一つを、ロスバスタチンのいずれか適する用量と組み合わせることができる。
【００２２】
一つの側面において、８０ｍｇのロスバスタチンが用いられる。別の側面において、４０ｍｇのロスバスタチンが用いられる。もう一つの側面において、２０ｍｇのロスバスタチンが用いられる。もう一つの側面において、１０ｍｇのロスバスタチンが用いられる。もう一つの側面において、５ｍｇのロスバスタチンが用いられる。もう一つの側面において、２．５ｍｇのロスバスタチンが用いられる。
【００２３】
一つの側面において、約６４〜１２８ｍｇなどの３２〜１６０ｍｇ、例えば、約６４〜９６ｍｇなどの６４〜１１２ｍｇのカンデサルタンが用いられる。好都合には、約７２ｍｇのカンデサルタンが用いられる。別の側面において、３２ｍｇのカンデサルタンが用いられる。もう一つの側面において、１６ｍｇのカンデサルタンが用いられる。もう一つの側面において、８ｍｇのカンデサルタンが用いられる。もう一つの側面において、４ｍｇのカンデサルタンが用いられる。
【００２４】
本発明による医薬組成物には、カンデサルタンまたはその薬学的に許容しうる塩およびロスバスタチンまたはその薬学的に許容しうる塩、および薬学的に許容しうる賦形剤または担体を含む組成物が含まれるということは理解されるであろう。例えば、このような組成物は、好都合には、単一経口製剤中で、アテローム性動脈硬化症の予防または処置における同時投与のための本発明の治療的組合せ製品を提供する。
【００２５】
好ましくは、その組合せの二つの成分は、双方とも経口投与される。
好ましくは、その組合せの二つの成分は、単一経口製剤として投与される。
好ましくは、その組合せは、１日１回投与用に製剤化される。
【００２６】
好都合には、その組合せは、単一の錠剤またはカプセル剤として製剤化される。
本明細書中の前記の投薬量およびスケジュールは、具体的な病状および患者の全身状態によって異なることがありうる。例えば、毒性を減少させるために、組合せ処置の成分の上述の用量を減少させることが必要であるまたは望まれることがありうる。投薬量およびスケジュールは、本発明の組合せ処置に加えて、一つまたはそれを超える追加の化学療法薬が用いられる場合も、異なることがありうる。スケジュール作成は、いずれか特定の患者を処置している医療の実務家が、職業上の技術および知識を用いて決定することができる。
【００２７】
本発明による医薬組成物には、更に、カンデサルタンまたはその薬学的に許容しうる塩および薬学的に許容しうる賦形剤または担体を含む第一組成物と、ロスバスタチンまたはその薬学的に許容しうる塩および薬学的に許容しうる賦形剤または担体を含む第二組成物を含む別々の組成物が含まれる。このような組成物は、好都合には、アテローム性動脈硬化症の共力的予防または処置における逐次的なまたは別々の投与のための本発明の治療的組合せを提供するが、それら別々の組成物は、同時に投与することもできる。
【００２８】
本発明の別の側面において、アテローム性動脈硬化症の予防または処置用の薬剤として用いるための、カンデサルタンまたはその薬学的に許容しうる塩およびロスバスタチンまたはその薬学的に許容しうる塩を含む組合せを提供する。
【００２９】
本発明の別の側面において、心臓血管イベントの予防用の薬剤として用いるための、カンデサルタンまたはその薬学的に許容しうる塩およびロスバスタチンまたはその薬学的に許容しうる塩を含む組合せを提供する。
【００３０】
本発明の別の側面において、薬剤の製造に用いるための、カンデサルタンまたはその薬学的に許容しうる塩およびロスバスタチンまたはその薬学的に許容しうる塩を含む組合せを提供する。
【００３１】
本発明の別の側面において、アテローム性動脈硬化症の予防または処置用の薬剤の製造に用いるための、カンデサルタンまたはその薬学的に許容しうる塩およびロスバスタチンまたはその薬学的に許容しうる塩を含む組合せを提供する。
【００３２】
本発明の別の側面において、心臓血管イベントの予防用の薬剤の製造に用いるための、カンデサルタンまたはその薬学的に許容しうる塩およびロスバスタチンまたはその薬学的に許容しうる塩を含む組合せを提供する。
【００３３】
本発明のもう一つの側面において、ヒトなどの温血動物のアテローム性動脈硬化症を予防するまたは処置する方法であって、カンデサルタンまたはその薬学的に許容しうる塩およびロスバスタチンまたはその薬学的に許容しうる塩の組合せを投与することを含む方法を提供する。
【００３４】
本発明のもう一つの側面において、ヒトなどの温血動物の心臓血管イベントを予防する方法であって、カンデサルタンまたはその薬学的に許容しうる塩およびロスバスタチンまたはその薬学的に許容しうる塩の組合せを投与することを含む方法を提供する。
【００３５】
本発明のもう一つの側面により、アテローム性動脈硬化症の予防または処置に用いるためのキットであって、カンデサルタンまたはその薬学的に許容しうる塩およびロスバスタチンまたはその薬学的に許容しうる塩の組合せを、場合により、取扱い説明書と一緒に含むキットを提供する。
【００３６】
本発明のもう一つの側面により、アテローム性動脈硬化症の予防または処置に用いるためのキットであって、
（ａ）第一単位剤形のカンデサルタン；
（ｂ）第二単位剤形のロスバスタチン；および
（ｃ）それら第一および第二剤形を含有するための容器手段；そして場合により、
（ｄ）取扱い説明書
を含むキットを提供する。
【００３７】
本発明の別の側面により、ＣＤ４０および／またはメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）の発現を阻害する方法であって、カンデサルタンまたはその薬学的に許容しうる塩およびロスバスタチンまたはその薬学的に許容しうる塩の組合せを投与することによる方法を提供する。
【００３８】
具体的なメタロプロテイナーゼは、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９である。
本発明の別の側面により、ＣＤ４０および／またはメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）の発現の阻害によってアテローム性動脈硬化症患者を処置する方法であって、ＣＤ４０および／またはメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）の発現の阻害に適する量のカンデサルタンまたはその薬学的に許容しうる塩およびロスバスタチンまたはその薬学的に許容しうる塩の組合せを投与することによる方法を提供する。
【００３９】
本発明のもう一つの側面により、ＭＭＰとＴＩＭＰＳとの間の平衡を常態化する方法であって、一定量のカンデサルタンまたはその薬学的に許容しうる塩およびロスバスタチンまたはその薬学的に許容しうる塩の組合せの投与による方法を提供する。
【００４０】
本発明の別の側面により、ＬＯＸ−１の発現を阻害する方法であって、カンデサルタンまたはその薬学的に許容しうる塩およびロスバスタチンまたはその薬学的に許容しうる塩の組合せを投与することによる方法を提供する。
【００４１】
本発明の別の側面により、ＬＯＸ−１の発現の阻害によってアテローム性動脈硬化症患者を処置する方法であって、ＬＯＸ−１の発現の阻害に適する量のカンデサルタンまたはその薬学的に許容しうる塩およびロスバスタチンまたはその薬学的に許容しうる塩の組合せを投与することによる方法を提供する。
【００４２】
材料および方法
動物モデル
５つがいのＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスおよび３つがいのホモ接合アポＥノックアウトマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊバックグラウンドで）を、Jackson Laboratories（Bar Harbor, ME）より入手した。それらを、兄弟姉妹交配によって飼育し、そして６：００ＡＭ〜６：００ＰＭまで照明され且つ２１℃で保持された室中に収容した。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（ｎ＝１０）は、全研究期間を普通食（ｒｅｇｕｌａｒ ｄｉｅｔ）で継続した。アポＥノックアウトマウスは、４群に分けた。１群（ｎ＝１０）被験動物には、高コレステロール食（１％コレステロール）単独を、６週令以降１２週間与え；２群（ｎ＝１０）被験動物には、カンデサルタン（１ｍｇ／ｋｇ／ｄ）を含む高コレステロール食を、６週令以降１２週間与え；３群（ｎ＝１０）被験動物には、ロスバスタチン（１ｍｇ／ｋｇ／ｄ）を含む高コレステロール食を、６週令以降１２週間与え；４群（ｎ＝１０）被験動物には、カンデサルタン（１ｍｇ／ｋｇ／ｄ）およびロスバスタチン（１ｍｇ／ｋｇ／ｄ）を含む高コレステロール食を、６週令以降１２週間与えた。
【００４３】
１２週処置の最後に、それらマウスを屠殺し、下記の研究を行った。実験手順は全て、Institutional Animal Care and Usage Committee of University of Arkansas for Medical Sciences によって承認されたプロトコールにしたがって行った。
【００４４】
アテローム性動脈硬化症斑の定量分析
１２週処置の最後に、各群からの５匹のマウスを安楽死させ、大動脈を周囲組織から分離した。外膜脂肪組織の除去後、大動脈を、大動脈弓から腸骨分岐へと縦に開き、１０％ホルマリン中で２４時間固定した。次に、それら大動脈を、７０％アルコール中で簡単にすすぎ洗浄し、スダンＩＶ溶液で１５分間染色し、８０％アルコール中で２０分間差別化し、そして流水で１時間洗浄した（Russell L. Techniques for studying atherosclerotic lesion, Lab Invest. 1958; 7:42-47）。大動脈を検鏡板に固定し、そして解剖顕微鏡に接続されたカメラで、それらの写真を撮った。それら画像は、ソフトウェア（Image Pro Plus, Media Cybernetics）によって分析した。
【００４５】
ＲＮＡ製造およびＲＴ−ＰＣＲによる分析
１２週処置の最後に、各群からの５匹のマウスを安楽死させ、大動脈（大動脈弓から腸骨分岐まで）を周囲組織から分離し、ドライアイス上で貯蔵した。各々の大動脈を、４部分に切断し、その二つを用いて、初期に記載されたような（２７）ワンステップの酸・グアニジニウムチオシアネート・フェノール・クロロホルム法（single-step acid-guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform method）で、全ＲＮＡを抽出した。１マイクログラムの全ＲＮＡを、オリゴｄＴ（Promega, Madison, WI, U.S.A.）および Maloney ネズミ白血病ウイルス（Ｍ−ＭＬＶ）逆転写（Promega）で、ｃＤＮＡ中に４２℃で１時間逆転写させた。２マイクロリットルの逆転写（ＲＴ）材料を、マウスＬＯＸ−１、ＣＤ４０またはＭＭＰ（ＭＭＰ−１、−２、−９）に特異的なプライマー対および Taq ＤＮＡポリメラーゼ（Promega）で増幅させた。マウスＬＯＸ−１については、順プライマー：５’−ＴＴＡＣＴＣＴＣＣＡＴＧＧＴＧＧＴＧＣＣ−３’、逆プライマー：５’−ＡＧＣＴＴＣＴＴＣＴＧＣＴＴＧＴＴＧＣＣ−３’を用いた。３０サイクルのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を、９４℃４０秒間（変性）、５５℃１分間（アニーリング）、および７２℃１分間（伸長）で行った。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）産物のサイズは、１９３塩基対であった。マウスＣＤ４０については、順プライマー５’−ＧＴＴＴＡＡＡＧＴＣＣＣＧＧＡＴＧＣＧＡ−３’および逆プライマー５’−ＣＴＣＡＡＧＧＣＴＡＴＧＣＴＧＴＣＴＧＴ−３’を用いた。３５サイクルのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を、９４℃１分間（変性）、５５℃１分間（アニーリング）、および７２℃１分間（伸長）で行った。ＰＣＲ産物のサイズは、４０８塩基対であった。マウスＭＭＰ−１については、順プライマー５’−ＧＧＡＣＴＣＴＣＣＣＡＴＴＣＴＴＡＡＴＧＡ Ｔ−３’および逆プライマー５’−ＣＣＴＣＴＴＴＣＴＧＧＡＴＡＡＣＡＴＣＡＴＣＡ ＡＣ−３’を用いた。マウスＭＭＰ−２については、順プライマー５’−ＡＴＣＡＡＧＧＧＧＡＴＣＣＡＧＧＡＧＣ−３’および逆プライマー５’−ＧＣＡＧＣＧＡＴＧＡＡＧ ＡＴＧＡＴＡＧ−３’を用いた。マウスＭＭＰ−９については、順プライマー５’−ＡＧＴＴＴＧＧＴＧＴＣＧＣＧＧＡＧＣＡＣ−３’および逆プライマー５’−ＴＡＣＡＴＧＡＧＣＧＣＴＴＣＣＧＧＣＡＣ−３’を用いた。全てのＭＭＰについて、３５サイクルのＰＣＲを、９４℃１分間（変性）、５８℃１分間（アニーリング）、および７５℃１分間（伸長）で行った。ＰＣＲ産物のサイズは、それぞれ、６２７塩基対、７１８塩基対および７５３塩基対であった。マウスβアクチンに特異的なプライマー対を、ハウスキーピング遺伝子として用いた（順プライマー：５’−ＴＴＣＴＡＣＡＡＴＧＡＧＣＴＧＣＧＴＴＧ−３’、逆プライマー：５’−ＣＡＣＴＧＴＧＴＴＧＧＣＡＴＡＧＡＧＧＴＣ−３’）。３０サイクルを、９４℃３０秒間（変性）、５５℃１分間（アニーリング）、および７２℃１分間（伸長）で用いた。ＰＣＲ産物は、５６０塩基対であった。逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）で増幅された試料を、１．５％アガロースゲル上において臭化エチジウムを用いて可視化した。
【００４６】
タンパク質製造およびウェスタンブロットによる分析
各々のマウス大動脈を、４部分に切断した。それらの二つを用いて、ＲＮＡを抽出し、そして残り二つを用いて、前に記載されたように（１４）タンパク質を抽出した。簡単にいうと、大動脈組織を、溶解緩衝液中で均一化し且つ溶解させた後、４０００ｒｐｍにおいて４℃で１０分間遠心分離した。１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、大動脈からの溶解産物タンパク質（２０μｇ／列）を分離し、ニトロセルロースメンブランに移した。遮断溶液（５％脱脂乳，Sigma）中でインキュベーション後、メンブランを、１：７５０希釈のマウスＬＯＸ−１への単クローン性抗体；１：５００希釈のマウスＣＤ４０への多クローン性抗体（Santa Cruz）；１μｇ／ｍｌ希釈のマウスＭＭＰ−１への単クローン性抗体（Oncogene）；１μｇ／ｍｌ希釈のマウスＭＭＰ−２への単クローン性抗体（Oncogene）；１μｇ／ｍｌ希釈のマウスＭＭＰ−９への単クローン性抗体（Oncogene）；１：５００希釈のマウスＴＩＭＰ−１への多クローン性抗体（Santa Cruz）；１：５００希釈のマウスＴＩＭＰ−２への多クローン性抗体（Santa Cruz）；または１：５０００希釈のマウスβアクチンへの単クローン性抗体（Sigma）と一緒に４℃で一晩インキュベートした。メンブランを洗浄後、１：５０００希釈の特異的二次抗体（Amersham Life Science）と一緒に室温で２時間インキュベートし、それらメンブランを洗浄し、そしてＥＣＬシステム（Amersham Life Science）で検出した。タンパク質バンドの相対強度は、Scan-gel-it ソフトウェアによって分析した（Li DY, Zhang YC, Sawamura T, Mehta JL. Circ Res. 1999; 84:1043-1049）。
【００４７】
データ分析
データは全て、二重反復試験試料の平均である。データは、平均±ＳＤとして表されている。統計的有意性は、独立データ群の中の多数の比較で決定したが、ここにおいて、ＡＮＯＶＡおよびＦ検定は、有意差の存在を示した。Ｐ値＜０．０５を、有意とみなした。
【００４８】
結果
カンデサルタンおよびロスバスタチンの共力的抗アテローム性動脈硬化症作用
対照マウス（普通食を与えられたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス）と比較したところ、高コレステロール食を与えられたアポＥノックアウトマウスは、広範囲にわたるアテローム性動脈硬化症を発症した（対照マウスに対してＰ＜０．０１）。カンデサルタンもロスバスタチンも、単独では、アテローム性動脈硬化症の程度を減少させたが（高コレステロール食単独に対してｐ＜０．０５）、その組合せは、アテローム性動脈硬化症をはるかに大きく減少させた（カンデサルタンまたはロスバスタチン単独＋高コレステロール食に対してＰ＜０．０５）。図１は、それぞれの実験結果と、異なった被験動物群でのアテローム性動脈硬化症の程度（平均±ＳＤ）を示している。
【００４９】
カンデサルタンおよびロスバスタチンは、単独で、アテローム性動脈硬化症を、それぞれ約３５％および２５％減少させた。その組合せは、アテローム性動脈硬化症を７０％減少させ、共力作用を示した。この作用は、図２にグラフで示されている。
【００５０】
ＬＯＸ−１発現に及ぼすカンデサルタンおよびロスバスタチンの共力作用
対照Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおいて、ＬＯＸ−１の発現（ｍＲＮＡおよびタンパク質）は少なかった。対照的に、ＬＯＸ−１発現（ｍＲＮＡおよびタンパク質）は、アポＥノックアウトマウスにおいて高コレステロール食で著しく増加した（対照マウスに対してＰ＜０．０１）。カンデサルタンもロスバスタチンも、単独では、ＬＯＸ−１発現（ｍＲＮＡおよびタンパク質）を、大きくはないが減少させた（高コレステロール食単独に対してＰ＜０．０５）。カンデサルタンおよびロスバスタチンの組合せは、アポＥノックアウトマウスにおいて、ＬＯＸ−１のアップレギュレーション（ｍＲＮＡおよびタンパク質）への劇的な阻害作用を有した（高コレステロール食単独に対してＰ＜０．０１）。
【００５１】
ＣＤ４０発現に及ぼすカンデサルタンおよびロスバスタチンの共力作用
対照Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスでの発現と比較したところ、ＣＤ４０発現（ｍＲＮＡおよびタンパク質）は、高コレステロール食を与えられたアポＥノックアウトマウスにおいて著しく増加した（対照マウスに対してＰ＜０．０１）。カンデサルタンおよびロスバスタチンの単独処置は、ＣＤ４０発現を僅かに減少させたが（高コレステロール食単独に対してＰ＜０．０５）、カンデサルタンおよびロスバスタチンの組合せは、アポＥノックアウトマウスにおいて、ＣＤ４０のアップレギュレーション（ｍＲＮＡおよびタンパク質）への劇的な阻害作用を有した（高コレステロール食単独に対してＰ＜０．０１）。
【００５２】
ＭＭＰ発現に及ぼすカンデサルタンおよびロスバスタチンの共力作用
対照Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスでの発現と比較したところ、ＭＭＰ−１、−２および−９の発現（ｍＲＮＡおよびタンパク質）は、高コレステロール食を与えられたアポＥノックアウトマウスにおいて著しく増加した（対照マウスに対してＰ＜０．０１）。カンデサルタンもロスバスタチンも、単独では、ＭＭＰ−１、−２および−９の発現（ｍＲＮＡおよびタンパク質）を、大きくはないが減少させた（高コレステロール食単独に対してＰ＜０．０５）。カンデサルタンおよびロスバスタチンの組合せは、それらの発現への劇的な阻害作用を有した（高コレステロール食単独に対してＰ＜０．０１）。
【００５３】
ＴＩＭＰ発現に及ぼすカンデサルタンおよびロスバスタチンの作用
ＴＩＭＰ−１およびＴＩＭＰ−２タンパク質発現も、アポＥノックアウトマウスにおいて、高コレステロール食で増加したが（対照マウスに対してＰ＜０．０１）、その増加は、ＭＭＰの場合より少なかった。カンデサルタンもロスバスタチンも、単独では、ＴＩＭＰ−１およびＴＩＭＰ−２の発現を僅かに減少させたが（高コレステロール食単独に対してＰ＜０．０５）、カンデサルタンおよびロスバスタチンの組合せは、それらの発現への一層大きい阻害作用を有した（高コレステロール食単独に対してＰ＜０．０１，カンデサルタンまたはロスバスタチンを含む高コレステロール食に対してＰ＜０．０５）。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】
【図２】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アテローム性動脈硬化症の予防または処置のための、カンデサルタン（candesartan）またはその薬学的に許容しうる塩およびロスバスタチン（rosuvastatin）またはその薬学的に許容しうる塩を含む組合せ。
【請求項２】
アテローム性動脈硬化症の予防または処置に用いるための医薬組成物であって、請求項１に記載の組合せを、薬学的に許容しうる希釈剤または担体と一緒に含む医薬組成物。
【請求項３】
心臓血管イベントの予防に用いるための医薬組成物であって、請求項１に記載の組合せを、薬学的に許容しうる希釈剤または担体と一緒に含む医薬組成物。
【請求項４】
アテローム性動脈硬化症の予防または処置用の薬剤の製造に用いるための、請求項１に記載の組合せ。
【請求項５】
心臓血管イベントの予防用の薬剤の製造に用いるための、請求項１に記載の組合せ。
【請求項６】
アテローム性動脈硬化症の予防または処置用の薬剤として用いるための、請求項１に記載の組合せ。
【請求項７】
心臓血管イベントの予防用の薬剤として用いるための、請求項１に記載の組合せ。
【請求項８】
ヒトなどの温血動物のアテローム性動脈硬化症を予防するまたは処置する方法であって、請求項１に記載の組合せを投与することを含む方法。
【請求項９】
ヒトなどの温血動物の心臓血管イベントを予防する方法であって、請求項１に記載の組合せを投与することを含む方法。
【請求項１０】
アテローム性動脈硬化症の予防または処置に用いるためのキットであって、請求項１に記載の組合せを、場合により、取扱い説明書と一緒に含むキット。
【請求項１１】
カンデサルタンが、カンデサルタン・シレキセチル（candesartan cilexetil）の形である、請求項１に記載の組合せ。
【請求項１】
アテローム性動脈硬化症の予防または処置のための、カンデサルタン（candesartan）またはその薬学的に許容しうる塩およびロスバスタチン（rosuvastatin）またはその薬学的に許容しうる塩を含む組合せ。
【請求項２】
アテローム性動脈硬化症の予防または処置に用いるための医薬組成物であって、請求項１に記載の組合せを、薬学的に許容しうる希釈剤または担体と一緒に含む医薬組成物。
【請求項３】
心臓血管イベントの予防に用いるための医薬組成物であって、請求項１に記載の組合せを、薬学的に許容しうる希釈剤または担体と一緒に含む医薬組成物。
【請求項４】
アテローム性動脈硬化症の予防または処置用の薬剤の製造に用いるための、請求項１に記載の組合せ。
【請求項５】
心臓血管イベントの予防用の薬剤の製造に用いるための、請求項１に記載の組合せ。
【請求項６】
アテローム性動脈硬化症の予防または処置用の薬剤として用いるための、請求項１に記載の組合せ。
【請求項７】
心臓血管イベントの予防用の薬剤として用いるための、請求項１に記載の組合せ。
【請求項８】
ヒトなどの温血動物のアテローム性動脈硬化症を予防するまたは処置する方法であって、請求項１に記載の組合せを投与することを含む方法。
【請求項９】
ヒトなどの温血動物の心臓血管イベントを予防する方法であって、請求項１に記載の組合せを投与することを含む方法。
【請求項１０】
アテローム性動脈硬化症の予防または処置に用いるためのキットであって、請求項１に記載の組合せを、場合により、取扱い説明書と一緒に含むキット。
【請求項１１】
カンデサルタンが、カンデサルタン・シレキセチル（candesartan cilexetil）の形である、請求項１に記載の組合せ。
【図１】
【図２】
【図２】
【公表番号】特表２００７−５０６７２０（Ｐ２００７−５０６７２０Ａ）
【公表日】平成１９年３月２２日（２００７．３．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５２７４８８（Ｐ２００６−５２７４８８）
【出願日】平成１６年９月２２日（２００４．９．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００４／００４１２０
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０３０２１５
【国際公開日】平成１７年４月７日（２００５．４．７）
【出願人】（３０００２２１１３）アストラゼネカ・ユーケイ・リミテッド (39)
【氏名又は名称原語表記】ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ ＵＫ Ｌｉｍｉｔｅｄ
【住所又は居所原語表記】１５ Ｓｔａｎｈｏｐｅ Ｇａｔｅ， Ｌｏｎｄｏｎ Ｗ１Ｋ １ＬＮ， Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年３月２２日（２００７．３．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年９月２２日（２００４．９．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００４／００４１２０
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０３０２１５
【国際公開日】平成１７年４月７日（２００５．４．７）
【出願人】（３０００２２１１３）アストラゼネカ・ユーケイ・リミテッド (39)
【氏名又は名称原語表記】ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ ＵＫ Ｌｉｍｉｔｅｄ
【住所又は居所原語表記】１５ Ｓｔａｎｈｏｐｅ Ｇａｔｅ， Ｌｏｎｄｏｎ Ｗ１Ｋ １ＬＮ， Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ
【Ｆターム（参考）】
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