活性の高いケトール酸レダクトイソメラーゼ酵素を用いたイソブタノールの発酵生成
グルコースからイソブタノールへの変換に必要な他の酵素に加えて、活性の高いケトール酸レダクトイソメラーゼ酵素を発現する組換え微生物を発酵成長させることによってイソブタノールを発酵生成するための方法が提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、工業微生物学の分野およびアルコールの生成に関する。より詳細には、イソブタノールが、高い代謝回転数を有する特定のケトール酸レダクトイソメラーゼ（ＫＡＲＩ）酵素を用い、組換え微生物の工業的発酵を経て生成される。本発明はまた、天然微生物由来の高活性のＫＡＲＩ酵素を発見するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ブタノールは、燃料添加剤として、プラスチック産業における化学物質原料として、さらに食品および香料産業における食品等級の抽出剤として有用な重要な産業化学物質である。毎年、１００〜１２０億ポンドのブタノールが石油化学的手段により生産され、この汎用化学製品に対する需要は高まる可能性が高い。
【０００３】
イソブタノールを化学合成するための方法は既知であり、例えば、オキソ合成、一酸化炭素の触媒水素化（非特許文献１およびメタノールとｎ−プロパノールのＧｕｅｒｂｅｔ縮合（非特許文献２）が挙げられる。これらのプロセスでは、石油化学製品に由来する出発原料が使用され、それは一般に高価であり、環境に優しいものではない。植物由来の原料からのイソブタノールの生成であれば、温室効果ガスの排出が最小化され、かつ当該技術分野における進歩が示されることになる。
【０００４】
イソブタノールは、酵母発酵の副産物として生物学的に生成される。それはアミノ酸の真菌のこの基による不完全代謝の結果として形成される「フーゼル油」の成分である。イソブタノールは、詳細にはＬ−バリンの異化から生成される。Ｌ−バリンのアミン基が窒素源として回収された後に得られるα−ケト酸は、いわゆるＥｈｒｌｉｃｈ経路の酵素により脱炭酸化され、イソブタノールに還元される（非特許文献３）。飲料発酵の間に得られるフーゼル油および／またはその成分の収量は典型的には少ない。例えば、ビール発酵中に生成されるイソブタノールの濃度は、１００万分の１６未満であることが報告されている（非特許文献４）。Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎら、上記に記載のように（イソブタノールの収量として３ｇ／Ｌが、発酵における２０ｇ／Ｌの濃度でのＬ−バリンの供給により得られることが報告された）、外因性のＬ−バリンの発酵物への添加によりイソブタノールの収量が増加する。さらに、ｎ−プロパノール、イソブタノールおよびイソアミルアルコールの生成が、アルギン酸カルシウムで固定化されたザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）の細胞により示されている。Ｌ−Ｌｅｕ、Ｌ−Ｉｌｅ、Ｌ−Ｖａｌ、α−ケトイソカプロン酸（α−ＫＣＡ）、α−ケト酪酸（α−ＫＢＡ）またはα−ケトイソ吉草酸（α−ＫＶＡ）のいずれかが補充された１０％グルコースを含有する培地が用いられた（非特許文献５）。α−ＫＣＡによりイソブタノールレベルが増加した。アミノ酸はまた、対応するアルコールを生成したが、ケト酸よりも低レベルであった。アミノ酸のロイシン、イソロイシン、および／またはバリンの窒素源としての成長培地への添加時、炭水化物由来のＣ３〜Ｃ５アルコールの収量の増加が示された（特許文献１）。
【０００５】
上記の方法が生物学的手段を介したイソブタノール生成の可能性を示す一方、これらの方法は工業規模でのイソブタノール生成にとっては莫大なコストがかかる。糖からの直接的なイソブタノールの生合成であれば経済的に実施可能となり、当該技術分野における進歩が示されることになる。しかし、この生成は、アセトラクテートをジヒドロキシ−イソバレレートに変換するイソブタノール経路における第２のステップを触媒する緩徐なケトール酸レダクトイソメラーゼ（ＫＡＲＩ）酵素により著しく阻害される。この酵素は既に高レベルで発現されることから（非特許文献６）、タンパク質の量を増加させる、すなわち酵素の比活性を高めることなくＫＡＲＩの活性を高める必要性が生じている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２００５０４０３９２号パンフレット
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】「Ｕｌｌｍａｎｎ’ｓ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、第６版、２００３年、Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨＶｅｒｌａｇ ＧｍｂＨ ａｎｄ Ｃｏ．（Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、第５巻、７１６−７１９頁）
【非特許文献２】Ｃａｒｌｉｎｉら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｃａｔａｌ．Ａ：Ｃｈｅｍ．２２０、２１５−２２０頁、２００４年
【非特許文献３】Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３、２５７５２−２５７５６頁、１９９８年
【非特許文献４】Ｇａｒｃｉａら、Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２９、３０３−３０９頁、１９９４年
【非特許文献５】Ｏａｘａｃａら、Ａｃｔａ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．；１１、５２３−５３２頁、１９９１年
【非特許文献６】Ｓ．Ｅｐｅｌｂａｕｍら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１８０、４０５６−４０６７頁、１９９８年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
出願人は、イソブタノールの生物学的生成を改善するのに利用可能な高い比活性を有するＫＡＲＩ酵素の発見により、述べられた課題を解決している。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、活性の高いＫＡＲＩ酵素を発現する組換え生物に関する。改変微生物は、有意により高い比活性（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内のＫＡＲＩ酵素の６〜８倍）を有する高レベルの短い形態のＫＡＲＩ酵素を有することになり、イソブタノールの商業的生産において使用可能である。したがって、一実施形態では、本発明は、アセトラクテートをジヒドロキシ−イソバレレートに変換するための方法であって、
ａ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ケトール酸レダクトイソメラーゼの比活性よりも高い比活性のケトール酸レダクトイソメラーゼを有するポリペプチドをコードする遺伝子コンストラクトを含む微生物宿主細胞を提供するステップと、
ｂ）（ａ）の宿主細胞をアセトラクテートと接触させるステップであって、２，３−ジヒドロキシイソバレレートが生成されるステップと、
を含む方法を提供する。
【００１０】
好ましい実施形態では、遺伝子コンストラクトは、以下の条件：
ａ）約７．５のｐＨ、
ｂ）約２２．５℃の温度、および
ｃ）約１０ｍＭ超のカリウム
のもとで行われるＮＡＤＰＨ消費アッセイによって測定される際、精製タンパク質に基づく１．１μモル／分／ｍｇを超える比活性のケトール酸レダクトイソメラーゼを有するポリペプチドをコードする。
【００１１】
別の実施形態では、本発明は、イソブタノールを生成するための方法であって、以下の遺伝子コンストラクト：
ａ）１）ピルベートをアセトラクテートに変換する（経路ステップａ）アセトラクテートシンターゼ酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子コンストラクト；
２）（Ｓ）−アセトラクテートから２，３−ジヒドロキシイソバレレートへの変換（経路ステップｂ）において、以下の条件：
ｉ）約７．５のｐＨ、
ｉｉ）約２２．５℃の温度、および
ｉｉｉ）約１０ｍＭ超のカリウム
のもとで行われるＮＡＤＰＨ消費アッセイによって測定される際、精製タンパク質に基づく１．１μモル／分／ｍｇを超える比活性のケトール酸レダクトイソメラーゼ酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子コンストラクト；
３）２，３−ジヒドロキシイソバレレートをα−ケトイソバレレートに変換する（経路ステップｃ）ためのアセトヒドロキシ酸デヒドラターゼをコードする少なくとも１つの遺伝子コンストラクト；
４）α−ケトイソバレレートをイソブチルアルデヒドに変換する（経路ステップｄ）分岐鎖ケト酸デカルボキシラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子コンストラクト；
５）イソブチルアルデヒドをイソブタノールに変換する（経路ステップｅ）ための分岐鎖アルコールデヒドロゲナーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子コンストラクト；を含む組換え微生物宿主細胞を提供するステップと、
ｂ）（ａ）の宿主細胞をイソブタノールが生成される条件下で成長させるステップと、
を含む、方法を提供する。
【００１２】
別の実施形態では本発明は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ケトール酸レダクトイソメラーゼの比活性よりも高い比活性を有するケトール酸レダクトイソメラーゼ酵素を含む組換え宿主細胞を提供する。
【００１３】
別の実施形態では、本発明は、以下の条件：
ｉ）約７．５のｐＨ、
ｉｉ）約２２．５℃の温度、および
ｉｉｉ）約１０ｍＭ超のカリウム；
のもとで行われるＮＡＤＰＨ消費アッセイによって測定される際、精製タンパク質に基づく１．１μモル／分／ｍｇを超える比活性を有するケトール酸レダクトイソメラーゼ酵素をコードする遺伝子コンストラクトの同定および単離のための方法であって、
ａ）Ｍ９最少培地中で成長される場合、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の倍加時間よりも短い倍加時間を有する細菌種を同定するステップと、
ｂ）（ａ）の細菌種をケトール酸レダクトイソメラーゼ活性についてスクリーニングし、活性細菌種を同定するステップと、
ｃ）（ｂ）の活性細菌種のゲノムＤＮＡを、ケトール酸レダクトイソメラーゼをコードすることで知られる遺伝子コンストラクトに対して相同性を有する核酸配列でプローブし、前記活性細菌種由来のケトール酸レダクトイソメラーゼをコードする遺伝子コンストラクトを同定し、単離するステップと、
ｄ）前記活性細菌種由来のケトール酸レダクトイソメラーゼをコードする遺伝子コンストラクトを増幅し、発現するステップと、
ｅ）ステップ（ｄ）の発現された遺伝子コンストラクトを、以下の条件：
ｉ）約７．５のｐＨ、
ｉｉ）約２２．５℃の温度、および
ｉｉｉ）約１０ｍＭ超のカリウム
のもとで行われるＮＡＤＰＨ消費アッセイによって測定される際、精製タンパク質に基づく１．１μモル／分／ｍｇを超える比活性を有するものについてスクリーニングするステップと、
を含む、方法を提供する。
【００１４】
本発明は、本願の一部を形成する、以下の詳細な説明、図面、および添付の配列記述からより十分に理解可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１Ａ】４つの異なるイソブタノール生合成経路を示す。「ａ」、「ｂ」、「ｃ」、「ｄ」、「ｅ」、「ｆ」、「ｇ」、「ｈ」、「ｉ」、「ｊ」および「ｋ」と称されるステップは、下記の基質から産物への変換を示す。
【図１Ｂ】４つの異なるイソブタノール生合成経路を示す。「ａ」、「ｂ」、「ｃ」、「ｄ」、「ｅ」、「ｆ」、「ｇ」、「ｈ」、「ｉ」、「ｊ」および「ｋ」と称されるステップは、下記の基質から産物への変換を示す。
【００１６】
以下の配列は、米国特許施行規則第１．８２１−１．８２５条（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列開示を有する特許出願の要件−配列の規則（Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ／ｏｒ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅｓ−ｔｈｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｕｌｅｓ）」）に従い、世界知的所有権機関（Ｗｏｒｌｄ Ｉｎｔｅｌｌｅｃｔｕａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｙ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）（ＷＩＰＯ）基準ＳＴ．２５（１９９８年）、ならびにＥＰＯおよびＰＣＴの配列表の要件（規則５．２および４９．５（ａの２）、ならびに実施細則の第２０８節および付録Ｃ）に一致する。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データにおいて用いられる記号および形式は、米国特許施行規則第１．８２２条に示される規則に従う。
【００１７】
【表１】
【００１８】
配列番号１１〜２２は、実施例１におけるコンストラクトの作成に用いられるオリゴヌクレオチドプライマーのヌクレオチド配列である。
【００１９】
配列番号２３〜３０は、実施例２のコンストラクトの作成に用いられるオリゴヌクレオチドプライマーのヌクレオチド配列である。
【００２０】
配列番号１１および１２は、ｉｌｖＣ遺伝子のＰＣＲ増幅のための実施例１で用いられるプライマーのＤＮＡ配列である。
【００２１】
配列番号１３は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内でのｐＢＡＤベクター内のＫＡＲＩ遺伝子のクローン化に用いられるプライマーにおけるフォワードＤＮＡ配列である。
【００２２】
配列番号１４は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内でのｐＢＡＤベクター内のＫＡＲＩ遺伝子のクローン化に用いられるプライマーにおけるリバースＤＮＡ配列である。
【００２３】
配列番号１５は、ＫＡＲＩ遺伝子の増幅に用いられるｉｌｖＣ−ｔｒｃ−ＳａｃＩ−ＦにおけるフォワードＤＮＡ配列である。
【００２４】
配列番号１６は、ＫＡＲＩ遺伝子の増幅に用いられるｉｌｖＣ−ｔｒｃ−ＨｉｎｄＩＩＩ−ＲにおけるリバースＤＮＡ配列である。
【００２５】
配列番号１７〜２２は、ＳａｃＩ消化およびＤＮＡ配列決定による大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｉｌｖＣ挿入物の存在の確認に用いられるオリゴヌクレオチドプライマーのヌクレオチド配列である。
【００２６】
配列番号１７−ｉｌｖＣ−ｔｒｃ−Ｆ３
【００２７】
配列番号１８−ｉｌｖＣ−ｔｒｃ−Ｆ５
【００２８】
配列番号１９−ｉｌｖＣ−ｔｒｃ−Ｒ２
【００２９】
配列番号２０−ｉｌｖＣ−ｔｒｃ−Ｒ４
【００３０】
配列番号２１−ｐＢＡＤ−ｅＦ１
【００３１】
配列番号２２−ＰＡＬＰＫ−Ｒ１
【００３２】
配列番号２３〜２６は、ＰＣＲによる緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（ＰＡＯ１）および蛍光菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）（ＰＦ５）のゲノムＤＮＡからのｉｌｖＣ遺伝子の増幅にフォワードおよびリバース方向で用いられるオリゴヌクレオチドプライマーのヌクレオチド配列である。
【００３３】
配列番号２３−ＰＡＯ１−Ｃ−Ｆ１
【００３４】
配列番号２４−ＰＡＯ１−Ｃ−Ｒ１
【００３５】
配列番号２５−ＰＦ５−Ｃ−Ｆ１
【００３６】
配列番号２６−ＰＦ５−Ｃ−Ｒ１
【００３７】
配列番号２１、２２、２７および２８は、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）のｉｌｖＣ遺伝子を有する陽性クローンのＤＮＡ配列の確認に用いられるオリゴヌクレオチドプライマーのヌクレオチド配列である。
【００３８】
配列番号２７−ＰＦ５−Ｓ−Ｆ２
【００３９】
配列番号２８−ＰＦ５−Ｓ−Ｒ２
【００４０】
以下の配列番号は、本発明で用いられるＫＡＲＩ遺伝子のＤＮＡ配列に対応する。
【００４１】
配列番号２９−大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２−ｉｌｖＣ
【００４２】
配列番号３０−大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）での発現のためのビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）由来のコドン最適化ＫＡＲＩ
【００４３】
配列番号３１−緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）−ＰＡＯ１−ｉｌｖＣ
【００４４】
配列番号３２−蛍光菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）−ＰＦ５−ｉｌｖＣ
【００４５】
以下の配列番号は、それぞれ配列番号２９〜３２に対応するアミノ酸配列である。
【００４６】
配列番号３３−大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２−ｉｌｖＣ−［大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２由来のＫＡＲＩ］
【００４７】
配列番号３４−コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）由来のＫＡＲＩ
【００４８】
配列番号３５−ＰＡＯ１−ｉｌｖＣ（１アミノ酸−３３８アミノ酸）
【００４９】
配列番号３６−ＰＦ５−ｉｌｖＣ（１アミノ酸−３３８アミノ酸）
【００５０】
配列番号３７はフォワードプライマーＰＡＬ−Ｆ１である。
【００５１】
配列番号３８はリバースプライマー（ＰＡＬ−Ｒ１）である。
【００５２】
配列番号３９はフォワードプライマー（ＰＡＬ−ＥｃｏＲ１−Ｆ１）である。
【００５３】
配列番号４０はリバースプライマー（ＰＡＬ−ＥｃｏＲ１−Ｒ１）である。
【発明を実施するための形態】
【００５４】
本発明は、高活性のＫＡＲＩ酵素を有する微生物宿主細胞を用いてアセトラクテートを２，３−ジヒドロキシイソバレレートに変換するための方法に関する。このように形成された２，３−ジヒドロキシ−イソバレレートは、図１に示されるステップを介してイソブタノールにさらに変換される。本発明はまた、より迅速なＫＡＲＩ酵素をその天然宿主微生物内に見出すための方法およびその触媒活性をさらに改善することを目的としたかかる酵素の分子進化について開示する。
【００５５】
発明は多数の商業的かつ産業的な需要を満たす。ブタノールは、種々の用途を有する重要な産業用商品の化学物質であり、その場合、燃料または燃料添加剤としてのその可能性は特に有意である。ブタノールは、４炭素アルコールにすぎなくても、ガソリンの含量に類似のエネルギー含量を有し、任意の化石燃料と混和されうる。ブタノールは、標準の内燃エンジン内で燃焼される場合にＣＯ２のみを生成し、ＳＯＸまたはＮＯＸをほとんど生成しないことから燃料または燃料添加剤として好まれる。さらにブタノールは、今日まで最も好ましい燃料添加剤であるエタノールよりも腐食性が少ない。
【００５６】
ブタノールは、生物燃料または燃料添加剤としてのその有用性に加え、新興の燃料電池産業における水素配給の問題に影響を与える可能性を有する。今日、燃料電池では水素の輸送および配給に関連した安全性の懸念が悩みの種となっている。ブタノールは、その水素含量において容易に改善可能であり、かつ、既存のガソリンスタンドによる、燃料電池または車両のいずれかで要求される純度での配給が可能である。
【００５７】
以下の定義および略語は、特許請求の範囲および明細書の解釈において用いられるものとする。
【００５８】
本明細書で用いられる「発明」または「本発明」という用語は、一般に、提示されるかまたは後に改良され捕捉される特許請求の範囲あるいは本明細書の中に記載される本発明のすべての実施形態に適用することを意味する。
【００５９】
「イソブタノール生合成経路」という用語は、イソブタノールを生成するための酵素経路を示す。好ましいイソブタノール生合成経路は、図１中に図示され、本明細書中に記載される。
【００６０】
「ＮＡＤＰＨ消費アッセイ」という用語は、（Ａｕｌａｂａｕｇｈら；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２９、２８２４−２８３０頁、１９９０年）に記載のように、ＫＡＲＩ共同因子、ＮＡＤＰＨの酵素反応からの消失の測定を含む、ＫＡＲＩ酵素の比活性を判定するための酵素アッセイを示す。
【００６１】
「ＫＡＲＩ」は、酵素ケトール酸レダクトイソメラーゼにおける略語である。
【００６２】
「アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ」および「ケトール酸レダクトイソメラーゼ」という用語は、同義的に用いられ、ＥＣ番号、ＥＣ１．１．１．８６（Ｅｎｚｙｍｅ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ １９９２年、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ））を有する酵素を示すことになる。ケトール酸レダクトイソメラーゼは、下記により十分に記載のように、（Ｓ）−アセトラクテートから２，３−ジヒドロキシイソバレレートへの反応を触媒する。これらの酵素は、限定はされないが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）登録番号ＮＣ＿０００９１３領域：３９５５９９３．．３９５７４６８、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）ジェンバンク登録番号ＮＣ＿００２５０５領域：１５７４４１．．１５８９２５、シュードモナス・エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、ジェンバンク登録番号ＮＣ＿００２５１６領域：５２７２４５５．．５２７３４７１、およびシュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）ジェンバンク登録番号ＮＣ＿００４１２９領域：６０１７３７９．．６０１８３９５を含む多数の供給源から入手可能である。
【００６３】
「アセトラクテートシンターゼ」という用語は、ピルベートからアセトラクテートおよびＣＯ２への変換を触媒する酵素を示す。アセトラクテートは２つの（Ｒ）−および（Ｓ）−立体異性体を有し、酵素には生体系により作製される（Ｓ）−異性体が好ましい。好ましいアセトラクテートシンターゼは、ＥＣ番号２．２．１．６９（Ｅｎｚｙｍｅ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ １９９２年、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ））で知られる。これらの酵素は、限定はされないが、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ジェンバンク番号：ＣＡＢ１５６１８、Ｚ９９１２２、それぞれＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）アミノ酸配列、ＮＣＢＩヌクレオチド配列）、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（ジェンバンク番号：ＡＡＡ２５０７９（配列番号２）、Ｍ７３８４２（配列番号１））、およびラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）（ジェンバンク番号：ＡＡＡ２５１６１、Ｌ１６９７５）を含む多数の供給源から入手可能である。
【００６４】
「アセトヒドロキシ酸デヒドラターゼ」という用語は、２，３−ジヒドロキシイソバレレートからα−ケトイソバレレートへの変換を触媒する酵素を示す。好ましいアセトヒドロキシ酸デヒドラターゼはＥＣ番号４．２．１．９で知られる。これらの酵素は、限定はされないが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ジェンバンク番号：ＹＰ＿０２６２４８（配列番号６）、ＮＣ＿０００９１３（配列番号５））、出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（ジェンバンク番号：ＮＰ＿０１２５５０、ＮＣ＿００１１４２）、メタノコッカス・マリパルディス（Ｍ．ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ）（ジェンバンク番号：ＣＡＦ２９８７４、ＢＸ９５７２１９）、および枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ジェンバンク番号：ＣＡＢ１４１０５、Ｚ９９１１５）を含む膨大な微生物から得られる。
【００６５】
「分岐鎖α−ケト酸デカルボキシラーゼ」という用語は、α−ケトイソバレレートからイソブチルアルデヒドおよびＣＯ２への変換を触媒する酵素を示す。好ましい分岐鎖α−ケト酸デカルボキシラーゼは、ＥＣ番号４．１．１．７２で知られ、限定はされないが、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）（ジェンバンク番号：ＡＡＳ４９１６６、ＡＹ５４８７６０；ＣＡＧ３４２２６（配列番号８）、ＡＪ７４６３６４、サルモネラ・ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）（ジェンバンク番号：ＮＰ＿４６１３４６、ＮＣ＿００３１９７）、およびクロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ジェンバンク番号：ＮＰ＿１４９１８９、ＮＣ＿００１９８８）を含む多数の供給源から得られる。
【００６６】
「分岐鎖アルコールデヒドロゲナーゼ」という用語は、イソブチルアルデヒドからイソブタノールへの変換を触媒する酵素を示す。好ましい分岐鎖アルコールデヒドロゲナーゼは、ＥＣ番号１．１．１．２６５で知られるが、他のアルコールデヒドロゲナーゼ（具体的にはＥＣ１．１．１．１または１．１．１．２）の下でも分類されうる。これらの酵素は、電子供与体としてＮＡＤＨ（還元ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）および／またはＮＡＤＰＨを用い、限定はされないが、出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（ジェンバンク番号：ＮＰ＿０１０６５６、ＮＣ＿００１１３６；ＮＰ＿０１４０５１、ＮＣ＿００１１４５）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ジェンバンク番号：ＮＰ＿４１７４８４（配列番号１０）、ＮＣ＿０００９１３（配列番号９））、およびクロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ジェンバンク番号：ＮＰ＿３４９８９２、ＮＣ＿００３０３０）を含む多数の供給源から得られる。
【００６７】
「分岐鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ」という用語は、電子受容体としてＮＡＤ＋（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）を用いたα−ケトイソバレレートからイソブチリル−ＣｏＡ（イソブチリル−補酵素Ａ）への変換を触媒する酵素を示す。好ましい分岐鎖ケト酸デヒドロゲナーゼはＥＣ番号１．２．４．４で知られる。これらの分岐鎖ケト酸デヒドロゲナーゼは４つのサブユニットからなり、すべてのサブユニット由来の配列は、限定はされないが、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ジェンバンク番号：ＣＡＢ１４３３６、Ｚ９９１１６；ＣＡＢ１４３３５、Ｚ９９１１６；ＣＡＢ１４３３４、Ｚ９９１１６；およびＣＡＢ１４３３７、Ｚ９９１１６）およびシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）（ジェンバンク番号：ＡＡＡ６５６１４、Ｍ５７６１３；ＡＡＡ６５６１５、Ｍ５７６１３；ＡＡＡ６５６１７、Ｍ５７６１３；およびＡＡＡ６５６１８、Ｍ５７６１３）を含む膨大な微生物から得られる。
【００６８】
「炭素基質」または「発酵性炭素基質」という用語は、本発明の宿主生物によって代謝可能な炭素源ならびに特に単糖、オリゴ糖、多糖、およびそれらの１炭素基質または混合物からなる群から選択される炭素源を示す。
【００６９】
「ｋｃａｔ」および「Ｋｍ」という用語は、当業者に既知であり、「Ｅｎｚｙｍｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ」、第２版（Ｆｅｒｓｔ；Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ：ＮＹ、１９８５年；９８−１２０頁）に記載されている。「代謝回転数」と称されることが多い「ｋｃａｔ」という用語は、単位時間当たりの活性部位当たりの産物に変換される基質分子の最大数または酵素が単位時間当たりに代謝回転する回数として定義される。ｋｃａｔ＝Ｖｍａｘ／［Ｅ］（式中、［Ｅ］は酵素濃度（Ｆｅｒｓｔ、上記）である。「全代謝回転」および「全代謝回転数」という用語は、ＫＡＲＩ酵素と基質の反応により形成される産物の量を示すように本明細書中で用いられる。
【００７０】
「触媒効率」という用語は、酵素のｋｃａｔ／ＫＭとして定義される。「触媒効率」は、基質に対する酵素の特異性を定量化するのに用いられる。
【００７１】
「比活性」という用語は、酵素単位が温度、ｐＨ、［Ｓ］などの特定の条件下で形成される産物のモル数／分として定義される場合、酵素単位／ｍｇのタンパク質を意味する。
【００７２】
「緩徐な」または「迅速な」という用語は、酵素活性に関して用いられる場合、酵素の標準に対する代謝回転数に関する。
【００７３】
「単離核酸分子」、「単離核酸断片」および「遺伝子コンストラクト」という用語は、同義的に用いられ、一本鎖または二本鎖であり、場合により合成、非天然または改変ヌクレオチド塩基を有するＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーを意味することになる。ＤＮＡのポリマーの形態での単離核酸断片は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡの１つ以上のセグメントからなりうる。
【００７４】
「遺伝子」という用語は、場合によりコード配列の上流（５’非コード配列）および下流（３’非コード配列）の調節配列を含む、特定のタンパク質として発現可能な核酸断片を示す。「天然遺伝子」は、それ自体の調節配列を有する天然に見出される遺伝子を示す。「キメラ遺伝子」は、天然遺伝子でない任意の遺伝子を示し、天然に見出されることのない調節およびコード配列を含む。したがって、キメラ遺伝子は、異なる供給源に由来する調節配列およびコード配列または同じ供給源に由来する調節配列およびコード配列を含みうるが、天然に見出されるものとは異なる様式で配列されている。「内因性遺伝子」は、生物のゲノム内のその天然の位置における天然遺伝子を示す。「外来」遺伝子は、通常は宿主生物内に見出されることはないが宿主生物に遺伝子導入によって導入される遺伝子を示す。外来遺伝子は、非天然の生物に導入される天然遺伝子またはキメラ遺伝子を含みうる。「トランス遺伝子」は、形質転換手順によりゲノムに導入されている遺伝子である。
【００７５】
本明細書で用いられる「コード配列」という用語は、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を示す。「適切な調節配列」は、上流（５’非コード配列）またはコード配列の下流（３’非コード配列）内に位置するヌクレオチド配列を示し、関連のコード配列の転写、ＲＮＡのプロセシングまたは安定性あるいは翻訳に作用する。調節配列は、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位およびステムループ構造を含みうる。
【００７６】
「プロモーター」という用語は、コード配列または機能ＲＮＡの発現を制御可能なＤＮＡ配列を示す。一般に、コード配列はプロモーター配列の３’側に位置する。プロモーターは、その全体として天然遺伝子に由来するか、または天然に見出される異なるプロモーターに由来する異なる要素から構成されるか、またはさらに合成ＤＮＡセグメントを含む場合がある。異なるプロモーターが異なる組織または細胞種における、あるいは発生の異なる段階で、あるいは異なる環境または生理的状態に応答して遺伝子の発現を誘導可能であることが当業者により理解されている。遺伝子における大部分の細胞種内でほぼ常に発現を誘導するプロモーターが一般に「構成プロモーター」と称される。さらに、ほとんどの場合、調節配列の正確な境界が完全に規定されていないことから、異なる長さのＤＮＡ断片が同一のプロモーター活性を有しうると理解されている。
【００７７】
「作動可能に連結される」という用語は、一方の機能が他方により影響を受けるような核酸配列の単一の核酸断片上への結合を示す。例えば、プロモーターが、そのコード配列の発現に効果を及ぼすことが可能である（すなわちコード配列がプロモーターの転写調節下にある）場合、コード配列に作動可能に連結されている。コード配列は調節配列にセンスまたはアンチセンス方向に作動可能に連結されうる。
【００７８】
本明細書で用いられる「発現」という用語は、本発明の核酸断片に由来するセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定な蓄積を示す。発現はｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳も示しうる。
【００７９】
本明細書で用いられる「形質転換」という用語は、核酸断片の宿主生物のゲノムへの転移を示し、遺伝的に安定な遺伝的形質をもたらす。形質転換された核酸断片を有する宿主生物は、「トランスジェニック」または「組換え」または「形質転換された」生物と称される。
【００８０】
「プラスミド」、「ベクター」および「カセット」という用語は、細胞の中央代謝の一部でない、遺伝子を保有することが多く、通常は環状二本鎖ＤＮＡ断片の形態である余分な染色体要素を示す。かかる要素は、任意の供給源に由来する線状または環状の一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡにおける自己複製配列、ゲノム結合（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ）配列、ファージまたはヌクレオチド配列である場合があり、ここでは多数のヌクレオチド配列が適切な３’未翻訳配列を有する選択された遺伝子産物におけるプロモーター断片およびＤＮＡ配列を細胞に導入可能な固有の作成物に連結されるかまたは組換えられている。「形質転換カセット」は、外来遺伝子を有し、かつ特定の宿主細胞の形質転換を促進する、外来遺伝子に加わる要素を有する特定のベクターを示す。「発現カセット」は、外来遺伝子を有し、かつ外来遺伝子に加え、外来宿主内でのその遺伝子の発現の増大を可能にする因子を有する特定のベクターを示す。
【００８１】
本明細書で用いられる「コドン縮重」という用語は、コードされたポリペプチドのアミノ酸配列に作用することなくヌクレオチド配列の変異を可能にする遺伝子コードにおける性質を示す。当業者は、所定のアミノ酸を特定するための、ヌクレオチドコドンの使用時に特定の宿主細胞により示される「コドンバイアス」について十分に理解している。したがって、宿主細胞内での改善された発現のために遺伝子を合成する場合、遺伝子をそのコドン使用の頻度が宿主細胞での好ましいコドンの使用の頻度に近づくように設計することが望ましい。
【００８２】
「コドンが最適化された」という用語は、様々な宿主の形質転換における核酸分子の遺伝子またはコード領域を示すとき、ＤＮＡによってコードされるポリペプチドを改変することなく宿主生物の典型的なコドンの使用を反映するための核酸分子の遺伝子またはコード領域におけるコドンの改変を示す。
【００８３】
本明細書中で用いられる標準の組換えＤＮＡおよび分子クローン化技術は当該技術分野で周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ、およびＭａｎｉａｔｉｓ、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）、１９８９年）（以降、「Ｍａｎｉａｔｉｓ」）；およびＳｉｌｈａｖｙら（Ｓｉｌｈａｖｙら、「Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）、１９８４年）；およびＡｕｓｕｂｅｌ Ｆ．Ｍ．ら、（Ａｕｓｕｂｅｌら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．およびＷｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅにより発行、１９８７年）による記載がなされている。
【００８４】
本発明は、植物由来の炭素源からイソブタノールを生成し、ブタノール生成における標準的な石油化学プロセスに関連した負の環境影響を回避する。一実施形態では、本発明は、炭水化物からイソブタノールへの変換における律速ステップとしてそれを解消することになる高い触媒効率を有するＫＡＲＩ酵素を同定するための方法を提供する。本方法は、下記に詳述される酵素の比活性を高めるための、当該技術分野で周知の方法を用いた、同定および適切なＫＡＲＩ酵素とその突然変異誘発を含む。
【００８５】
ケト酸レダクトイソメラーゼ（ＫＡＲＩ）酵素
アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼまたはケトール酸レダクトイソメラーゼ（ＫＡＲＩ；ＥＣ１．１．１．８６）は、分岐鎖アミノ酸の生合成における２つのステップを触媒し、その生合成における鍵酵素である。ＫＡＲＩは種々の生物内で見出され、種を通じたアミノ酸配列の比較によると、この酵素には、真菌および大部分の細菌内で見出される短い形態（クラスＩ）および植物に固有の長い形態（クラスＩＩ）という２つのタイプが存在することが示されている。
【００８６】
短い形態のＫＡＲＩは、典型的には３３０〜３４０個のアミノ酸残基を有する。長い形態ＫＡＲＩは、約４９０個のアミノ酸残基を有する。しかし、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）などの一部の細菌は、アミノ酸配列が植物内で見出されるものとかなり異なる場合、長い形態を有する。ＫＡＲＩはｉｌｖＣ遺伝子によりコードされ、最少培地中での大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）および他の細菌の成長のための必須酵素である。ＫＡＲＩは、共同因子としてＮＡＤＰＨを用い、その活性においてＭｇ＋＋などの二価カチオンを必要とする。ＫＡＲＩはまた、バリン経路内でのアセトラクテートの利用に加え、イソロイシン生成経路内でアセトヒドロキシブタノエートをジヒドロキシメチルペンタノエートに変換する。
【００８７】
２．６Åの分解能での大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＫＡＲＩ酵素の結晶構造が解明されている（Ｔｙａｇｉら、Ｐｔｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、１４、３０８９−３１００頁、２００５年）。この酵素は２つのドメインからなり、一方は他のピリジンヌクレオチド依存性のデヒドロゲナーゼ内で見出される場合に類似の混合α／β構造を有する。第２のドメインは主にα−ヘリカルであり、内部重複の強力な証拠を示す。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、およびホウレンソウのＫＡＲＩの活性部位の比較によると、酵素の活性部位内の大部分の残基が保存位置を占めることが示された。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＫＡＲＩがおそらくは有望な生物活性単位である四量体として結晶化された一方、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のＫＡＲＩ（Ａｈｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、３２８、５０５−５１５頁、２００３年）は十二量体を形成し、かつホウレンソウ由来の酵素は二量体を形成した。既知のＫＡＲＩは、アセトラクテートにおいて２ｓ−１（Ａｕｌａｂａｕｇｈら；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２９、２８２４−２８３０頁、１９９０年）または０．１２ｓ−１（Ｒａｎｅら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３３８、８３−８９頁、１９９７年）の代謝回転数（ｋｃａｔ）が報告された緩徐な酵素である。試験によると、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内でのイソロイシン−バリン生合成の遺伝子制御が緑膿菌（Ｐｓ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）内での場合と異なることが示されている（Ｍａｒｉｎｕｓら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、６３、５４７−５６頁、１９６９年）。
【００８８】
高活性ＫＡＲＩ酵素の同定および単離
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）よりも高い倍化速度を有する生物についての再検討が行われた。３種の微生物、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（ＰＡＯ１）、蛍光菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）（ＰＦ５）、およびコレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）（Ｎ１６９６１）が、Ｍ９最少培地中で成長される場合、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）よりも短い倍加時間を有することが同定された。ＫＡＲＩ酵素をコードする遺伝子がこれらの種の各々から単離され、コードされたタンパク質が発現され、部分精製された。高い倍化速度の生物から単離された酵素の比活性が、３４０ｎｍでのアセトラクテートからα，β−ジヒドロキシ−イソバレレートへの酵素的変換の間に共同因子ＮＡＤＰＨの消失を測定するＮＡＤＰＨ消費アッセイ法を用い、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＫＡＲＩのそれと比較された。活性はＮＡＤＰＨにおける６２２０Ｍ−１ｃｍ−１のモル吸光係数を用いて計算され、細胞抽出物中の全タンパク質の１ｍｇ当たり１分当たりに消費されるＮＡＤＰＨのμモルとして報告されている（ＡｕｌａｂａｕｇｈおよびＳｃｈｌｏｓｓ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２９、２８２４−２８３０頁、１９９０年を参照）。
【００８９】
本明細書中に記載のＮＡＤＰＨ消費アッセイに従い、精製タンパク質を用いて測定された、１．１μモル／分／ｍｇを超える比活性のＫＡＲＩを有するＫＡＲＩ酵素を提供することは本発明の目的である。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＫＡＲＩは緩徐な酵素であり、分岐鎖アミノ酸合成経路内で必須である。ＫＡＲＩ（ｉｌｖＣ）をコードする遺伝子は、細胞が高栄養培地中で成長する場合に停止されるが、最少培地中で成長される場合、高レベルで発現される（可溶性タンパク質の約１０％）（Ｓ．Ｅｐｅｌｂａｕｍら、上記）。
【００９０】
適切なＫＡＲＩ酵素の選択のプロセスは２つのアプローチを含んだ。第１は、自然の多様性の中で新規のＫＡＲＩを探索することである。かかる探索は、幅広く他の生物に由来する使用可能な酵素に対する相同体を当該技術分野で周知の技術を用いて単離することを含んだ。この探索は、生物が適切なＫＡＲＩを有する可能性が最も高いのは生物の倍加時間に基づく場合であるという仮定から示された。第２のアプローチは、強力な発現ベクターの作成、突然変異誘発およびＫＡＲＩコード配列の進化、また最終的には改善されたＫＡＲＩ活性を有する変異体の選択により、人工的な多様性を創出し、探索することを含んだ。
【００９１】
上記の方法を用い、ＫＡＲＩ酵素は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から単離されたＫＡＲＩ酵素（配列番号３３［大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２−ｉｌｖＣ］の活性よりも高い比活性を有する蛍光菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）（配列番号３５［ＰＡＯ１−ｉｌｖＣ］配列番号３６［ＰＦ５−ｉｌｖＣ］）およびコレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）（配列番号３４）から単離された。約５〜４０μモル／分／ｍｇの比活性が特に適切である場合、約１．１μモル／分／ｍｇを超える比活性を有するＫＡＲＩ酵素が本発明において好ましい。ＫＡＲＩの比活性が精製タンパク質を用いて測定され、かつ、ＮＡＤＰＨ消費アッセイ（Ａｕｌａｂａｕｇｈ、上記）の導入が２０℃〜２５℃（ここでは約２２．５℃が好ましい）、７．０〜８．０のｐＨ（ここでは約７．５のｐＨが好ましい）、また少なくとも約１０ｍＭのカリウムを有する緩衝液（ここでは少なくとも約１０ｍＭ〜約５０ｍＭが適切である）中で行われる場合が好ましい。本発明において有用な特定の酵素の一部が下の表２中に挙げられる。
【００９２】
【表２】
【００９３】
本発明は、本明細書中に記載の特定のシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）およびビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）酵素に限定されない。例えば、これらのポリペプチドは、類似の活性を有する相同体を見出すための基盤としてまたは突然変異誘発およびタンパク質進化における鋳型として用いられうる。
【００９４】
ＫＡＲＩ相同体の単離
本発明の核酸断片を用い、同じかまたは他の微生物種由来の相同タンパク質をコードする遺伝子の単離が可能である。配列依存性プロトコルを用いた相同ＫＡＲＩ遺伝子の単離は当該技術分野で周知である。配列依存性プロトコルの例として、限定はされないが、核酸ハイブリダイゼーションの方法や、核酸増幅技術、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Ｍｕｌｌｉｓら、米国特許第４，６８３，２０２号明細書）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、（Ｔａｂｏｒら、Ｐｒｏｃ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２、１０７４頁、１９８５年）または鎖置換増幅（ＳＤＡ）（Ｗａｌｋｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８９、３９２頁、１９９２年）の様々な使用により例示されるようなＤＮＡおよびＲＮＡ増幅の方法が挙げられる。
【００９５】
例えば、本発明のタンパク質またはポリペプチドに類似のものをコードする遺伝子であれば、本核酸断片の全部または一部をＤＮＡハイブリダイゼーションプローブとして用いることによって直接単離し、当業者に周知の方法を用いた任意の所望の細菌からのライブラリーのスクリーニングが可能である。本核酸配列に基づく特異的オリゴヌクレオチドプローブについては、当該技術分野で既知の方法による設計および合成が可能である（Ｍａｎｉａｔｉｓ、上記）。さらに、全配列を直接用い、使用可能なインビトロ転写系を用いてのランダムプライマーＤＮＡ標識、ニックトランスレーション、または末端標識技術、またはＲＮＡプローブなどの当業者に既知の方法によるＤＮＡプローブの合成が可能である。さらに、特異的プライマーの設計および使用により、本配列の一部または完全長の増幅が可能である。得られる増幅産物を増幅反応の間に直接標識するかまたは増幅反応後に標識し、またプローブとして用い、適切なストリンジェントな条件下での完全長ＤＮＡ断片の単離が可能である。
【００９６】
典型的には、ＰＣＲタイプの増幅技術では、プライマーは異なる配列を有し、互いに相補的でない。所望の試験条件によると、プライマーの配列は標的核酸の効率的かつ正確な複製をもたらすように設計される必要がある。ＰＣＲプライマーの設計方法は一般的であり、当該技術分野で周知であり、例として、Ｔｈｅｉｎら（Ｔｈｅｉｎら、「Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｐｒｏｂｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｄｉａｇｏｎｏｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ」、Ｋ．Ｅ．Ｄａｖｉｓ編、１９８６年、３３−５０頁、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（Ｈｅｒｎｄｏｎ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ））；およびＲｙｃｈｌｉｋ（Ｒｙｃｈｌｉｋ、１９９３年、Ｉｎ Ｗｈｉｔｅ、Ｂ．Ａ．（編）、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、第１５巻、３１−３９頁、「ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．（Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ））が挙げられる。
【００９７】
一般に本配列の２つの短いセグメントをポリメラーゼ連鎖反応プロトコルで用い、ＤＮＡまたはＲＮＡからの相同遺伝子をコードするより長い核酸断片の増幅が可能である。ポリメラーゼ連鎖反応はまた、クローン化核酸断片のライブラリー上で実施可能であり、ここでは一方のプライマーの配列が本核酸断片に由来し、かつ他方のプライマーの配列が微生物遺伝子をコードするｍＲＮＡ前駆体の３’末端に対するポリアデニル酸領域（ｔｒａｃｔ）の存在を利用する。
【００９８】
あるいは、第２のプライマー配列はクローン化ベクター由来の配列に基づく場合がある。例えば、当業者は、ＲＡＣＥプロトコルに従い（Ｆｒｏｈｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５、８９９８頁，１９８８年）、ＰＣＲを用いてｃＤＮＡを生成し、転写産物内の単一点と３’または５’末端の間の領域のコピーを増幅することができる。３’および５’方向に一致されたプライマーは本配列から設計されうる。市販の３’ＲＡＣＥまたは５’ＲＡＣＥシステム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ））を用い、特定の３’または５’ｃＤＮＡ断片が単離されうる（Ｏｈａｒａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６、５６７３頁、１９８９年；およびＬｏｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４３、２１７−２２０頁、１９８９年）。
【００９９】
あるいは、本配列は、相同体を同定するためのハイブリダイゼーション試薬として用いられうる。核酸ハイブリダイゼーション試験の基本要素は、プローブ、目的の遺伝子または遺伝子断片を含有すると思われる試料、および特異的なハイブリダイゼーション法を含む。本発明のプローブは、典型的には検出されるべき核酸配列に相補的な一本鎖核酸配列である。プローブは、検出されるべき核酸配列に対して「ハイブリダイズ可能」である。プローブ長は５塩基〜数万の塩基分変化する可能性があり、実施されるべき特定の試験に依存することになる。典型的には、約１５塩基〜約３０塩基のプローブ長が適切である。検出されるべき核酸配列に対する相補性が求められるプローブ分子は一部に限られる。さらに、プローブと標的配列の間の相補性は完全である必要はない。ハイブリダイゼーションは不完全に相補的な分子間で特に生じる結果として、ハイブリダイズされた領域内の塩基の特定の画分は適切な相補的塩基と対を形成しない。
【０１００】
ハイブリダイゼーション法は十分に確立されている。典型的には、プローブおよび試料は、核酸ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で混合されなければならない。これは、適切な濃度および温度条件下、無機塩または有機塩の存在下でのプローブと試料との接触を含む。プローブと試料核酸は、プローブと試料核酸の間で考えられる任意のハイブリダイゼーションが生じうるほど十分に長期間接触状態でなければならない。混合物中のプローブまたは標的の濃度は、ハイブリダイゼーションの発生に必要な時間を決定することになる。プローブまたは標的の濃度が高まると、必要なハイブリダイゼーションのインキュベーション時間が短縮される。場合により、カオトロピック剤が添加されうる。カオトロピック剤は、ヌクレアーゼ活性の阻害により核酸を安定化させる。さらに、カオトロピック剤は、室温での短いオリゴヌクレオチドプローブの感度が高くストリンジェントなハイブリダイゼーションを可能にする（Ｖａｎ Ｎｅｓｓら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９、５１４３−５１５１頁、１９９１年）。適切なカオトロピック剤は、特に、塩化グアニジウム、チオシアン酸グアニジン、チオシアン酸ナトリウム、テトラクロロ酢酸リチウム（ｌｉｔｈｉｕｍ ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏａｃｅｔａｔｅ）、過塩素酸ナトリウム、テトラクロロ酢酸ルビジウム（ｒｕｂｉｄｉｕｍ ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏａｃｅｔａｔｅ）、ヨウ化カリウム、およびトリフルオロ酢酸セシウムを含む。典型的には、カオトロピック剤は約３Ｍの最終濃度で存在することになる。必要に応じて、ホルムアミドをハイブリダイゼーション混合物に典型的には３０〜５０％（ｖ／ｖ）添加できる。
【０１０１】
様々なハイブリダイゼーション溶液が用いられうる。典型的には、これらは極性有機溶媒の約２０〜６０％容量、好ましくは３０％を含有する。一般的なハイブリダイゼーション溶液では、約３０〜５０％ｖ／ｖのホルムアミド、約０．１５〜１．０Ｍの塩化ナトリウム、約０．０５〜０．１Ｍの緩衝液、例えばクエン酸ナトリウム、トリス−ＨＣｌ、ＰＩＰＥＳまたはＨＥＰＥＳ（ｐＨ範囲が約６〜９）、約０．０５〜０．２％の洗剤、例えばドデシル硫酸ナトリウム、または０．５〜２０ｍＭのＥＤＴＡ、ＦＩＣＯＬＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｉｎｃ．）（約３００〜５００キロダルトン）、ポリビニルピロリドン（約２５０〜５００キロダルトン）、および血清アルブミンが用いられる。また典型的なハイブリダイゼーション溶液中に、約０．１〜５ｍｇ／ｍＬの未標識担体核酸、断片化核ＤＮＡ、例えば子牛胸腺またはサケ精液ＤＮＡ、または酵母ＲＮＡ、および場合により約０．５〜２％ｗ／ｖのグリシンが含有されることになる。また他の添加剤として、例えば、種々の極性水溶性または膨潤剤（ｓｗｅｌｌａｂｌｅ ａｇｅｎｔｓ）を含む体積排除剤（ｖｏｌｕｍｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ａｇｅｎｔ）、例えばポリエチレングリコール、アニオン性ポリマー、例えばポリアクリレートまたはポリメチルアクリレート、およびアニオン性糖ポリマー、例えば硫酸デキストランが含有されうる。
【０１０２】
核酸ハイブリダイゼーションは、種々のアッセイ形式に適用可能である。最も適切なものの１つがサンドイッチアッセイ形式である。サンドイッチアッセイは、非変性条件下でのハイブリダイゼーションに特に適合可能である。サンドイッチ型アッセイの主要な要素は固体支持体である。固体支持体は、未標識でありかつ配列の一部に相補的である固定化核酸プローブをそれに吸着または共有結合している。
【０１０３】
イソブタノール生合成経路
本発明の高活性ＫＡＲＩ酵素の主な一用途が、イソブタノールの生成にとって有用な代謝経路内の一因子となる。これらの経路の数は解明され、特徴づけられている。
【０１０４】
炭水化物を使用する微生物が、中央代謝経路としてエムデン・マイヤーホフ・パルナス（ＥＭＰ）経路、エントナー−ドドロフ経路およびペントースリン酸回路を用い、成長および維持のためにエネルギーおよび細胞前駆体を生成する。これらの経路は、共通に中間体のグリセルアルデヒド−３−リン酸を有し、最終的にピルベートが直接にかまたはＥＭＰ経路と相まって形成される。次いで、ピルベートが種々の手段を介してアセチル−補酵素Ａ（アセチル−ＣｏＡ）に形質転換される。アセチル−ＣｏＡは、例えば脂肪酸、アミノ酸および二次代謝物質の生成における鍵中間体としての機能を果たす。糖のピルベートへの変換の組み合わされた反応により、エネルギー（例えばアデノシン−５’−３リン酸、ＡＴＰ）および還元等価物（例えば還元されたニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、ＮＡＤＨ、および還元されたニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、ＮＡＤＰＨ）が生成される。ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨはそれらの酸化形態（各々、ＮＡＤ＋およびＮＡＤＰ＋）に再循環されなければならない。無機の電子受容体（例えばＯ２、ＮＯ３−およびＳＯ４２−）の存在下で還元等価物を用いるとエネルギープールが増大しうるか、あるいは還元された炭素副産物が形成されうる。
【０１０５】
図１に示されるように、組換え微生物を用い、炭水化物源からイソブタノールを生成するための４つの有望な経路が存在する。炭水化物からイソブタノールへの変換のためのすべての有望な経路は、所有者共通の（ｃｏｍｍｏｎｌｙ ｏｗｎｅｄ）米国特許出願第１１／５８６３１５号明細書（参照により本明細書中に援用される）中に記載されている。
【０１０６】
ピルベートからイソブタノールへの変換における好ましい経路は、酵素ステップ「ａ」、「ｂ」、「ｃ」、「ｄ」、および「ｅ」からなり（図１）、かつ
ａ）例えばアセトラクテートシンターゼにより触媒される、ピルベートからアセトラクテート
ｂ）例えばアセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼにより触媒される、（Ｓ）−アセトラクテートから２，３−ジヒドロキシイソバレレート
ｃ）例えばアセトヒドロキシ酸デヒドラターゼにより触媒される、２，３−ジヒドロキシイソバレレートからα−ケトイソバレレート
ｄ）例えば分岐鎖ケト酸デカルボキシラーゼにより触媒される、α−ケトイソバレレートからイソブチルアルデヒド、および
ｅ）例えば分岐鎖アルコールデヒドロゲナーゼにより触媒される、イソブチルアルデヒドからイソブタノール
といった基質から産物への変換を含む。
【０１０７】
この経路は、バリン生合成（ピルベートからα−ケトイソバレレートへ）およびバリン異化（α−ケトイソバレレートからイソブタノールへ）における十分に特徴づけられた経路に関与する酵素の組み合わせである。多数のバリン生合成酵素がまたイソロイシン生合成経路内の類似反応を触媒することから、基質特異性は遺伝子源の選択における主要な検討事項である。こういう理由から、アセトラクテートシンターゼ酵素における目的の主な遺伝子はバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（ａｌｓＳ）およびクレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）（ｂｕｄＢ）から得られるものである。これらの特定のアセトラクテートシンターゼは、これらの生物内でのブタンジオール発酵に関与し、ピルベートにおいてはケトブチレートよりも高い親和性を示すことで知られる（Ｇｏｌｌｏｐら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２、３４４４−３４４９頁、１９９０年；およびＨｏｌｔｚｃｌａｗら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１２１、９１７−９２２頁、１９７５年）。第２および第３の経路ステップはそれぞれアセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼおよびデヒドラターゼにより触媒される。これらの酵素は多数の供給源、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から特徴づけられている（Ｃｈｕｎｄｕｒｕら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８、４８６−４９３頁、１９８９年；およびＦｌｉｎｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８、１４７３２−１４７４２頁、１９９３年）。好ましいイソブタノール経路の最終の２つのステップは酵母内で生じることで知られており、そこでは窒素源としてバリンが用いられ、プロセス内でイソブタノールが分泌されうる。α−ケトイソバレレートは、多数のケト酸デカルボキシラーゼ酵素、例えばピルビン酸デカルボキシラーゼによりイソブチルアルデヒドに変換されうる。ピルベートのイソブタノール生成からの方向の誤り（ｍｉｓｄｉｒｅｃｔｉｏｎ）を阻止するには、ピルベートに対する親和性が低下したデカルボキシラーゼが望ましい。これまで、当該技術分野で既知のかかる酵素が２種存在する（Ｓｍｉｔら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７１、３０３−３１１頁、２００５年；およびｄｅ ｌａ Ｐｌａｚａら、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．２３８、３６７−３７４頁、２００４年）。両酵素はラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）の株に由来し、ピルベートよりもケトイソバレレートにおける方が５０〜２００倍好ましい。最後に、多数のアルデヒドレダクターゼが酵母内で同定されており、その多くは基質特異性の重複を有する。アセトアルデヒドよりも分岐鎖基質の方が好ましいことで知られるものには、限定はされないが、アルコールデヒドロゲナーゼＶＩ（ＡＤＨ６）およびＹｐｒ１ｐが含まれ（Ｌａｒｒｏｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３６１、１６３−１７２頁、２００２年；およびＦｏｒｄら、Ｙｅａｓｔ １９、１０８７−１０９６頁、２００２年）、これら双方はＮＡＤＰＨを電子供与体として用いる。分岐鎖基質とともに活性を示すＮＡＤＰＨ依存性のレダクターゼＹｑｈＤはまた、最近、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内で同定されている（Ｓｕｌｚｅｎｂａｃｈｅｒら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４２、４８９−５０２頁、２００４年）。
【０１０８】
イソブタノール生成における他の有望な経路の中の２つはまた、「ａ」、「ｂ」および「ｃ」の３つの初期ステップを有する。一方の経路は、酵素ステップ「ａ」、「ｂ」、「ｃ」、「ｆ」、「ｇ」、「ｅ」からなる。ステップ「ｆ」は、ＥＣ番号１．２．４．４を有する「分岐鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ」を有する。ステップ「ｇ」はＥＣ番号１．２．１．１０および１．２．１．５７を有する「アシル化アルデヒドデヒドロゲナーゼ」を有し、さらにステップ「ｅ」は「分岐鎖アルコールデヒドロゲナーゼ」を有する。他方の有望な経路は、ステップ「ａ」、「ｂ」、「ｃ」、「ｈ」、「ｉ」、「ｊ」、「ｅ」からなる。「トランスアミナーゼ」という用語（ステップ「ｈ」）は、ＥＣ番号２．６．１．４２および２．６．１．６６を有する。ステップ「ｈ」はＥＣ番号１．４．１．８および１．４．１．９を有する「バリンデヒドロゲナーゼ」からなるかまたはステップ「ｉ」はＥＣ番号４．１．１．１４を有する「バリンデカルボキシラーゼ」からなる。最終的に、ステップ「ｊ」ではＥＣ番号２．６．１．１８を有する「ωトランスアミナーゼ」を用いてイソブチルアルデヒドが生成され、それはステップ「ｅ」で還元され、イソブタノールが生成されることになる。ピルベートをイソブタノールに変換するためのすべての有望な経路は図１に示される。
【０１０９】
さらに、多数の生物はブチリル−ＣｏＡ中間体を介してブチレートおよび／またはブタノールを生成することで知られている（Ｄｕｅｒｒｅら、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．１７、２５１−２６２頁、１９９５年；およびＡｂｂａｄ−Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １４２、１１４９−１１５８頁、１９９６年）。したがって、これらの生物内でのイソブタノール生成は、図１中に示されるステップ「ｋ」、「ｇ」および「ｅ」を用いて生じることになる。ステップ「ｋ」は、ＥＣ番号５．４．９９．１３を有する「イソブチリル−ＣｏＡムターゼ」を用いることになる。入れ子構造（ｎｅｓｔ）のステップは、ＥＣ番号１．２．１．１０および１．２．１．５７を有する「アシル化アルデヒドデヒドロゲナーゼ」を用いてイソブチルアルデヒドを生成し、それに続く酵素ステップ「ｅ」によりイソブタノールを生成することを含む。これらの全経路は、所有者共通の米国特許出願第１１／５８６３１５号明細書（その全体が参照により本明細書中に援用される）中に十分に記載されている。
【０１１０】
イソブタノール生成のための微生物宿主
イソブタノール生成のための微生物宿主は、細菌、シアノバクテリア、糸状真菌および酵母から選択されうる。イソブタノール生成に用いられる微生物宿主であれば、収量がブタノールの毒性に制限されないようにイソブタノールに耐性がある必要がある。イソブタノールの高い滴定レベルで代謝活性のある微生物については当該技術分野で周知である。ブタノールに耐性がある突然変異体がソルベントジェニック（ｓｏｌｖｅｎｔｏｇｅｎｉｃ）のクロストリジア（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）から単離されているが、他の潜在的に有用な細菌株のブタノール耐性に関して入手可能な情報はほとんどない。細菌におけるアルコール耐性の比較についての大部分の研究によると、ブタノールがエタノールよりも毒性が高いことが示唆されている（ｄｅ Ｃａｖａｌｈｏら、Ｍｉｃｒｏｓｃ．Ｒｅｓ．Ｔｅｃｈ． ６４：２１５−２２頁（２００４年）およびＫａｂｅｌｉｔｚら、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ． ２２０：２２３−２２７頁（２００３年））。Ｔｏｍａｓら（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８６：２００６−２０１８頁（２００４年））は、クロストリジウム・アセトバティリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）における発酵の間での１−ブタノールの収量がブタノール毒性により制限されうることを報告している。クロストリジウム・アセトバティリカムに対する１−ブタノールの主な効果は膜機能の破壊である（Ｈｅｒｍａｎｎら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ５０：１２３８−１２４３頁（１９８５年））。
【０１１１】
イソブタノールの生成のために選択される微生物宿主であれば、イソブタノールに耐性があり、炭水化物をイソブタノールに変換できる必要がある。適切な微生物宿主の選択における基準は、イソブタノールに対する内在的耐性、高いグルコース利用率、遺伝子操作のための遺伝子ツールの利用可能性、および安定的な染色体変化をもたらす能力を含む。
【０１１２】
イソブタノールに対する耐性を有する適切な宿主株が、株の本質的耐性に基づくスクリーニングにより同定されうる。イソブタノールに対する微生物の本質的耐性は、最少培地内で成長する場合、成長率の５０％の阻害（ＩＣ５０）を担うイソブタノールの濃度を判定することにより測定されうる。ＩＣ５０値は当該技術分野で既知の方法を用いて判定可能である。例えば、目的の微生物は様々な量のイソブタノールの存在下で成長可能であり、成長率が６００ナノメーター（ＯＤ６００）での光学密度の測定により監視可能である。倍加時間は、成長曲線の対数部分から計算可能であり、成長率の測定値として使用可能である。成長の５０％の阻害をもたらすイソブタノールの濃度は、成長の阻害率パーセント対イソブタノール濃度のグラフから判定可能である。好ましくは、宿主株は約０．５％を超えるイソブタノールにおいてＩＣ５０を有する必要がある。
【０１１３】
またイソブタノール生成のための微生物宿主であれば、グルコースを高率で利用する必要がある。大部分の微生物は炭水化物を利用可能である。しかし、特定の環境微生物は炭水化物を高効率で利用できず、従って適切な宿主とならないだろう。
【０１１４】
宿主を遺伝的に改良する能力は組換え微生物の生成にとって必須である。遺伝子導入技術は、エレクトロポレーション、複合、形質導入または自然形質転換によるものでもよい。広範囲の宿主との複合プラスミドおよび薬剤耐性マーカーが使用可能である。クローニングベクターは、宿主生物内で機能しうる抗生物質耐性マーカーの性質に基づいて宿主生物に適合される。
【０１１５】
微生物宿主はまた、様々な遺伝子の欠失により、炭素の流れに対して競合する経路を不活性化するために操作される必要がある。これには、直接的不活性化に対するトランスポゾンまたは染色体組み込みベクターのいずれかの可用性が必要である。さらに、生成宿主は、イソブタノールに対する内在的耐性を改善するための突然変異が得られうるように化学的突然変異原に従う必要がある。
【０１１６】
上記の基準に基づき、イソブタノールの生成に適する微生物宿主は、限定はされないが、クロストリジウム属、ザイモモナス属、エシェリキア属、サルモネラ属、ロドコッカス属、シュードモナス属、バチルス属、ビブリオ属、乳酸桿菌属、腸球菌属、アルカリゲネス属、クレブシエラ属、パエニバチルス属、アースロバクター属、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、ピキア属、カンジダ属、ハンセヌラ属およびサッカロミセス属のメンバーを含む。好ましい宿主は、大腸菌、アルカリゲネス・ユートロファス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、パエニバチルス・マセランス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｃｅｒａｎｓ）、ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）、プランタラム菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）、エンテロコッカス・ガリナリウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｌｌｉｎａｒｉｕｍ）、エンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、枯草菌およびサッカロミケスセレビシエを含む。
【０１１７】
生成宿主の作成
イソブタノールに対する発酵性炭素基質の変換における酵素経路をコードする必須遺伝子を有する組換え生物が、当該技術分野で周知の技術を用いて作成可能である。本発明では、本発明のイソブタノール生合成経路の１つの酵素、例えばアセトラクテートシンターゼ、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ、アセトヒドロキシ酸デヒドラターゼ、分岐鎖α−ケト酸デカルボキシラーゼ、および分岐鎖アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が、上記のように様々な供給源から単離されうる。
【０１１８】
細菌ゲノムから所望の遺伝子を得る方法については一般的であり、かつ分子生物学の技術分野で周知である。例えば、遺伝子の配列が既知である場合、適切なゲノムライブラリーが制限エンドヌクレアーゼ消化により作成され、所望の遺伝子配列に相補的なプローブを用いてスクリーニングされうる。一旦、配列が単離されると、ＤＮＡはポリメラーゼ連鎖反応（米国特許第４，６８３，２０２号明細書）などの標準プライマーに特異的な増幅方法を用いて増幅され、適切なベクターを用いる形質転換に適する量のＤＮＡが得られうる。異種宿主内での発現におけるコドン最適化のためのツールは容易に利用可能である。利用可能なコドン最適化のためのツールには、宿主生物のＧＣ含量に基づくものもある。
【０１１９】
一旦、関連経路の遺伝子が同定されかつ単離されると、それらは当該技術分野で周知の手段により適切な発現宿主に形質転換されうる。種々の宿主細胞の形質転換にとって有用なベクターまたはカセットについては一般的であり、ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ（登録商標）（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）、およびＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）などの企業から市販されている。典型的には、ベクターまたはカセットは、関連遺伝子の転写および翻訳を誘導する配列、選択可能マーカー、および自己複製または染色体組み込みを可能にする配列を有する。適切なベクターは、転写開始制御を有する遺伝子の５’領域および転写終結を制御するＤＮＡ断片の３’領域を含む。両方の制御領域は形質転換された宿主細胞に対して相同な遺伝子から誘導されうるが、かかる制御領域が生成宿主として選択される特定の種に対して天然でない遺伝子からも誘導されることが理解されるべきである。
【０１２０】
所望の宿主細胞内でのコード領域の関連経路の発現を駆動するのに有用な開始制御領域またはプロモーターについては極めて多数存在し、当業者には知られている。仮想的には、これらの遺伝的因子を駆動可能な任意のプロモーターは、本発明に適し、それは、限定はされないが、ＣＹＣ１、ＨＩＳ３、ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＡＤＨ１、ＰＧＫ、ＰＨＯ５、ＧＡＰＤＨ、ＡＤＣ１、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＥＮＯ、ＴＰＩ（サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）内での発現に有用）；ＡＯＸ１（ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）内での発現に有用）；およびｌａｃ、ａｒａ、ｔｅｔ、ｔｒｐ、ｌＰＬ、ｌＰＲ、Ｔ７、ｔａｃ、およびｔｒｃ（大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、およびシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）内での発現に有用）、ならびに枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、およびパエニバチルス・マセランス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｃｅｒａｎｓ）内での発現に有用なａｍｙ、ａｐｒ、ｎｐｒプロモーターおよび様々なファージプロモーターを含む。
【０１２１】
終結制御領域についても好ましい宿主に対して天然の様々な遺伝子から誘導されうる。場合により終結部位は不要でありうるが、含められる場合が最も好ましい。
【０１２２】
特定のベクターが広範囲の宿主細菌内で複製可能であり、かつ複合により導入可能である。ｐＲＫ４０４および３つの関連ベクター：ｐＲＫ４３７、ｐＲＫ４４２、およびｐＲＫ４４２（Ｈ）の完全でかつアノテートされた配列が利用可能である。これらの誘導体はグラム陰性菌における遺伝子操作にとって有用なツールであることが判明している（Ｓｃｏｔｔら、Ｐｌａｓｍｉｄ ５０：７４−７９頁（２００３年））。広範な宿主範囲のＩｎｃ Ｐ４プラスミドＲＳＦ１０１０における数種のプラスミド誘導体についても、グラム陰性菌の範囲内で機能しうるプロモーターとともに利用可能である。プラスミドｐＡＹＣ３６およびｐＡＹＣ３７が複数のクローニング部位とともに活性プロモーターを有し、グラム陰性菌内での異種の遺伝子発現が可能である。
【０１２３】
染色体遺伝子の置換ツールもまた幅広く利用可能である。例えば、広範な宿主範囲のレプリコンｐＷＶ１０１の感熱性の変異体を改良し、遺伝子置換をグラム陽性菌の範囲内で有効にするのに用いられうるプラスミドｐＶＥ６００２が作成されている（Ｍａｇｕｉｎら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７４：５６３３−５６３８頁（１９９２年））。さらに、インビトロでのトランスポゾンは、ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ（登録商標）などの商業的供給源由来の種々のゲノム内でランダム突然変異をもたらすのに使用可能である。
【０１２４】
様々な好ましい微生物宿主内でのイソブタノール生合成経路の発現は下記にさらに詳細に説明される。
【０１２５】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内でのイソブタノール生合成経路の発現
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の形質転換にとって有用なベクターまたはカセットは、一般的であり、上掲の企業から市販されている。例えば、イソブタノール生合成経路の遺伝子は、様々な供給源から単離され、修飾ｐＵＣ１９ベクターにクローン化され、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＮＭ５２２に形質転換されうる。
【０１２６】
ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）内でのイソブタノール生合成経路の発現
限定はされないがｐＲｈＢＲ１７およびｐＤＡ７１を含むロドコッカス・エリスロポリス（Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）内での発現においては、一連の大腸菌−ロドコッカスのシャトルベクターが使用可能である（Ｋｏｓｔｉｃｈｋａら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ６２：６１−６８頁（２００３年））。さらに、一連のプロモーターが、ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）内での異種の遺伝子発現において使用可能である（Ｎａｋａｓｈｉｍａら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７０、５５５７−５５６８頁、２００４年およびＴａｏら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６８、３４６−３５４頁、２００５年）。ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）内での染色体遺伝子の標的遺伝子破壊は、Ｔａｏら、上記およびＢｒａｎｓら（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６６、２０２９−２０３６頁、２０００年）に記載の方法を用いて作成されうる。
【０１２７】
上記のイソブタノールの生成において必要とされる異種遺伝子は、最初にｐＤＡ７１またはｐＲｈＢＲ７１にクローニングされ、大腸菌に形質転換されうる。次いでベクターは、Ｋｏｓｔｉｃｈｋａら、上記に記載のようにエレクトロポレーションによりロドコッカス・エリスロポリスに形質転換されうる。組換え体は、グルコースを含有する合成培地内で成長され、それに続いてイソブタノールの生成が当該技術分野で既知の方法を用いて行われうる。
【０１２８】
枯草菌（Ｂ．Ｓｕｂｔｉｌｉｓ）内でのイソブタノール生合成経路の発現
枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）内での遺伝子発現および突然変異の作成のための方法もまた当該技術分野で周知である。例えば、イソブタノール生合成経路の遺伝子はｍａｙｂｅ様々な供給源から単離され、修飾ｐＵＣ１９ベクターにクローン化され、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＥ１０１０に形質転換されうる。さらに、イソブタノール生合成経路の５種の遺伝子は、発現のために２つのオペロンに分離されうる。経路の３種の遺伝子（ｂｕｂＢ、ｉｌｖＤ、およびｋｉｖＤ）は、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＥ１０１０の染色体に組み込まれうる（Ｐａｙｎｅら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７３、２２７８−２２８２頁、１９９１年）。残存する２種の遺伝子（ｉｌｖＣおよびｂｄｈＢ）は、発現ベクターにクローン化され、組み込まれたイソブタノール遺伝子を有するバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）株に形質転換されうる。
【０１２９】
バチルス・リケニホルムス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）内でのイソブタノール生合成経路の発現
枯草菌内で複製するプラスミドおよびシャトルベクターの大部分を用い、プロトプラスト形質転換またはエレクトロポレーションのいずれかによりバチルス・リケニフォルミスの形質転換が可能である。イソブタノールの生成において必要とされる遺伝子をプラスミドのｐＢＥ２０またはｐＢＥ６０誘導体にクローニング可能である（Ｎａｇａｒａｊａｎら、Ｇｅｎｅ １１４：１２１−１２６頁（１９９２年））。バチルス・リケニフォルミスを形質転換するための方法が当該技術分野で既知である（Ｆｌｅｍｉｎｇら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、６１：３７７５−３７８０頁（１９９５年））。枯草菌内での発現のために作製されたプラスミドをバチルス・リケニフォルミスに形質転換することで、イソブタノールを生成する組換え微生物宿主の生成が可能である。
【０１３０】
パエニバチルス・マセランス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｃｅｒａｎｓ）内でのイソブタノール生合成経路の発現
プラスミドを、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）内での発現にて記載のように作製し、それを用いてパエニバチルス・マセランスをプロトプラスト形質転換により形質転換し、イソブタノールを生成する組換え微生物宿主を生成することが可能である。
【０１３１】
アルカリゲネス・ユートロファス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）（ラルストニア・ユートロファス（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ））内でのイソブタノール生合成経路の発現
アルカリゲネス・ユートロファス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）内での遺伝子発現および突然変異の作成のための方法は当該技術分野で既知である（Ｔａｇｈａｖｉら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、６０、３５８５−３５９１頁、１９９４年）。イソブタノール生合成経路における遺伝子は、上記の広宿主域ベクターのいずれか内でクローン化され、またエレクトロポレートされ、イソブタノールを生成する組み換え体の作成が可能である。アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）内のポリ（ヒドロキシブタノエート）経路は詳述されており、アルカリゲネス・ユートロファス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）ゲノムを修飾するための種々の遺伝子技術は既知であり、それらのツールはイソブタノール生合成経路の改変に適用されうる。
【０１３２】
シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）内でのイソブタノール生合成経路の発現
シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）内での遺伝子発現のための方法は当該技術分野で既知である（例えば、Ｂｅｎ−Ｂａｓｓａｔら、米国特許第６，５８６，２２９号明細書（参照により本明細書中に援用される））。ブタノール経路遺伝子はｐＰＣＵ１８に挿入され、このライゲートされたＤＮＡはエレクトロコンピテントなシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）ＤＯＴ−Ｔ１ Ｃ５ａＡＲ１細胞にエレクトロポレートされ、イソブタノールを生成する組み換え体の作成が可能である。
【０１３３】
サッカロミセス・セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）内でのイソブタノール生合成経路の発現
サッカロミセス・セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）内での遺伝子発現のための方法は当該技術分野で既知である（例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１９４巻、「Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｐａｒｔ Ａ、２００４年、Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ ＧｕｔｈｒｉｅおよびＧｅｒａｌｄ Ｒ．Ｆｉｎｋ編、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ））。酵母内での遺伝子の発現は、典型的にはプロモーター、次いで目的の遺伝子、および転写ターミネーターが必要である。多数の酵母プロモーターは、限定はされないが構成プロモーターＦＢＡ、ＧＰＤ、ＡＤＨ１、およびＧＰＭと、誘導プロモーターＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、およびＣＵＰ１を含む、イソブタノール生合成経路をコードする遺伝子における発現カセットの作成において用いられうる。適切な転写ターミネーターは、限定はされないが、ＦＢＡｔ、ＧＰＤｔ、ＧＰＭｔ、ＥＲＧ１０ｔ、ＧＡＬ１ｔ、ＣＹＣ１、およびＡＤＨ１を含む。例えば、適切なプロモーター、転写ターミネーター、およびイソブタノール生合成経路の遺伝子は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）−酵母シャトルベクターにクローン化されうる。
【０１３４】
ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）内でのイソブタノール生合成経路の発現
乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属はラクトバチルス目（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓ）の科に属し、かつ枯草菌および連鎖球菌の形質転換で用いられる多数のプラスミドおよびベクターが乳酸桿菌において用いられうる。適切なベクターの非限定例には、ｐＡＭβ１およびその誘導体（Ｒｅｎａｕｌｔら、Ｇｅｎｅ １８３：１７５−１８２頁（１９９６年）；およびＯ’Ｓｕｌｌｉｖａｎら、Ｇｅｎｅ １３７：２２７−２３１頁（１９９３年））；ｐＭＢＢ１およびｐＨＷ８００、ｐＭＢＢ１の誘導体（Ｗｙｃｋｏｆｆら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６２：１４８１−１４８６頁（１９９６年））；ｐＭＧ１、複合プラスミド（Ｔａｎｉｍｏｔｏら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４：５８００−５８０４頁（２００２年））；ｐＮＺ９５２０（Ｋｌｅｅｒｅｂｅｚｅｍら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３：４５８１−４５８４頁（１９９７年））；ｐＡＭ４０１（Ｆｕｊｉｍｏｔｏら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６７：１２６２−１２６７頁（２００１年））；ならびにｐＡＴ３９２（Ａｒｔｈｕｒら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３８：１８９９−１９０３頁（１９９４年））が含まれる。プランタラム菌由来の数種のプラスミドが報告されている（ｖａｎ Ｋｒａｎｅｎｂｕｒｇら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７１：１２２３−１２３０頁（２００５年））。
【０１３５】
様々な腸球菌属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）種（フェシウム菌（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）、エンテロコッカス・ガリナラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｉｕｍ）、およびフェカリス菌（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ））内でのイソブタノール生合成経路の発現
腸球菌属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属はラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓ）科に属し、乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）、桿菌（Ｂａｃｉｌｌｉ）および連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）種の形質転換において用いられる多数のプラスミドおよびベクターは腸球菌属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）種において用いられうる。適切なベクターの非限定例として、ｐＡＭβ１およびその誘導体（Ｒｅｎａｕｌｔら、Ｇｅｎｅ １８３、１７５−１８２頁、１９９６年；およびＯ’Ｓｕｌｌｉｖａｎら、Ｇｅｎｅ １３７、２２７−２３１頁、１９９３年）；ｐＭＢＢ１およびｐＨＷ８００、ｐＭＢＢ１の誘導体（Ｗｙｃｋｏｆｆら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６２、１４８１−１４８６頁、１９９６年）；接合性プラスミドｐＭＧ１（Ｔａｎｉｍｏｔｏら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４、５８００−５８０４頁、２００２年）；ｐＮＺ９５２０（Ｋｌｅｅｒｅｂｅｚｅｍら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３、４５８１−４５８４頁、１９９７年）；ｐＡＭ４０１（Ｆｕｊｉｍｏｔｏら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６７、１２６２−１２６７頁、２００１年）；およびｐＡＴ３９２（Ａｒｔｈｕｒら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３８、１８９９−１９０３頁、１９９４年）が挙げられる。ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）由来のｎｉｓＡ遺伝子を用いたエンテロコッカス・フェカーリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）における発現ベクターも用いられうる（エイケンバウム（Ｅｉｃｈｅｎｂａｕｍ）ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ６４：２７６３−２７６９頁（１９９８年））。さらに、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）の染色体における遺伝子置換用のベクターが用いられうる（Ｎａｌｌａａｐａｒｅｄｄｙら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ７２：３３４−３４５頁（２００６年））。
【０１３６】
発酵培地
本発明における発酵培地は、適切な炭素基質を含有する必要がある。適切な基質が、限定はされないが、グルコースおよびフルクトースなどの単糖、乳糖またはスクロースなどのオリゴ糖、デンプンまたはセルロースなどの多糖、あるいはそれらの混合物、ならびに乳清透過液、コーンスティープリカー（ｃｏｒｎｓｔｅｅｐ ｌｉｑｕｏｒ）、砂糖液（ｓｕｇａｒ ｂｅｅｔ ｍｏｌａｓｓｅｓ）、および大麦モルト（ｂａｒｌｅｙ ｍａｌｔ）などの再生可能な原料由来の未精製混合物を含みうる。さらに、炭素基質はまた二酸化炭素または主要な生化学的中間体への代謝変換が実証されているメタノールなどの１炭素基質でありうる。メチロトローフ（ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃ）生物が、１炭素基質および２炭素基質に加え、メチルアミン、グルコサミンおよび代謝活性における種々のアミノ酸などの化合物を含有する他の多数の炭素を用いることでも知られている。例えば、メチロトローフ酵母がメチルアミン由来の炭素を用いてトレハロースまたはグリセロールを形成することで知られている（Ｂｅｌｌｉｏｎら、Ｍｉｃｒｏｂ．Ｇｒｏｗｔｈ Ｃ１ Ｃｏｍｐｄ．、［Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］、７ｔｈ（１９９３年）、４１５−３２頁、Ｍｕｒｒｅｌｌ Ｊ．Ｃｏｌｌｉｎ；Ｋｅｌｌｙ，Ｄｏｎ Ｐ．編、Ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ（Ａｎｄｏｖｅｒ、ＵＫ）発行）。同様に、カンジダの様々な種がアラニンまたはオレイン酸を代謝することになる（Ｓｕｌｔｅｒら、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １５３：４８５−４８９頁（１９９０年））。それ故、本発明で用いられる炭素源が基質を有する多種多様な炭素を包含する場合があり、生物の選択によってのみ限定されうると考えられる。
【０１３７】
上記の炭素基質およびそれらの混合物のすべてが本発明において適切であると考えられるが、好ましい炭素基質はグルコース、フルクトース、およびスクロースである。
【０１３８】
発酵培地は、適切な炭素源に加え、イソブタノールの生成に必要な培養物の成長および酵素経路の促進に適する、当業者に既知の、適切なミネラル、塩、共同因子、緩衝液および他の成分を含有する必要がある。
【０１３９】
培養条件
典型的には細胞が、適切な培地内、約２５℃〜約４０℃の範囲内の温度で成長される。本発明における適切な成長培地は、ルリア・ベルターニ（Ｌｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ）（ＬＢ）培養液、サブロー・デキストロース（Ｓａｂｏｕｒａｕｄ Ｄｅｘｔｒｏｓｅ）（ＳＤ）培養液または酵母培地（ＹＭ）の培養液などの一般的な商業的に調製された培地である。他の限定または合成された成長培地が用いられる場合があり、かつ特定の微生物の成長に適した培地について微生物学または発酵科学に関する当業者は知っているであろう。異化代謝産物抑制を直接的または間接的に調節することで知られる作用物質、例えば環状アデノシン２’：３’一リン酸（ｃＡＭＰ）の使用についても発酵培地内に取り込まれうる。
【０１４０】
発酵に適するｐＨ範囲はｐＨ５．０〜ｐＨ９．０であり、初期条件としてはｐＨ６．０〜ｐＨ８．０が好ましい。
【０１４１】
発酵は好気性または嫌気性条件下で実施可能であり、嫌気性または微好気性条件が好ましい。
【０１４２】
工業用バッチおよび連続発酵
本プロセスには、発酵のバッチ方法が用いられる。従来のバッチ発酵は、培地の組成物が発酵開始時に設定され、発酵の間に人工的な改変が施されることがない閉鎖系である。したがって、発酵開始時に培地に望ましい生物が接種され、系に何も添加しなくても発酵の生成が可能である。しかし、典型的には「バッチ」発酵は炭素源の添加に関連したバッチであり、ｐＨおよび酸素濃度などの要素を制御する試みがなされることが多い。バッチシステムでは、システムの代謝産物およびバイオマス組成物は、最大で発酵が停止する時間まで常時変化する。バッチ培養物内では、細胞が、変化のない誘導期（ｌａｇ ｐｈａｓｅ）から高成長の対数期（ｌｏｇ ｐｈａｓｅ）、最終的に成長率が減少または停止する定常期（ｓｔａｔｉｏｎａｙ ｐｈａｓｅ）にかけて抑制される。定常期における細胞が、未処理の場合、最終的に死滅することになる。対数期における細胞が、一般に最終生成物または中間体の生成の大部分に関与する。
【０１４３】
標準のバッチシステムに対する変形がフェドバッチシステムである。フェドバッチ発酵プロセスは本発明においても適切であり、基質が発酵プロセスごとに添加されること以外では典型的なバッチシステムを含む。フェドバッチシステムは、異化代謝産物抑制が細胞の代謝を阻害する傾向がある場合や培地内に限られた量の基質を有することが望ましい場合に有用である。フェドバッチシステム内での実際の基質濃度の測定は困難であることから、それはｐＨ、溶解酸素およびＣＯ２などの排ガスの分圧などの測定可能な要素の変化に基づいて評価される。バッチおよびフェドバッチ発酵は一般的で、当該技術分野で周知であり、例がＴｈｏｍａｓ Ｄ．「Ｂｒｏｃｋ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」、第２版（１９８９年）Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ、ＭＡ）またはＤｅｓｈｐａｎｄｅ，Ｍｕｋｕｎｄ（Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、３６：２２７頁（１９９２年））（参照により本明細書中に援用される）において見出されうる。
【０１４４】
本発明はバッチモードで実施されるが、本方法は連続発酵方法に適合可能であろうことが考えられる。連続発酵は、限定された発酵培地がバイオリアクターに連続的に添加されかつ等量の条件培地が処理と同時に除去される場合の開放系である。細胞が主に対数増殖（ｌｏｇ ｐｈａｓｅ ｇｒｏｗｔｈ）期にある場合、連続発酵は一般に一定の高密度で培養物を維持する。
【０１４５】
連続発酵では、細胞成長または最終生成物濃度に作用する１つの要素またはいくつかの要素の調節が可能になる。例えば、１つの方法では、炭素源などの限られた栄養素または一定速度での窒素レベルが維持され、あらゆる他のパラメータの抑制が可能になる。他のシステムでは、培地の濁度により測定される細胞濃度が一定に保持される間、成長に作用する多数の要素を連続的に改変することが可能である。連続システムでは、恒常的成長条件を維持するように試みることで、培地の除去（ｄｒａｗｎ ｏｆｆ）に起因する細胞欠損を発酵における細胞成長率に対して均衡させなければならない。連続発酵プロセス用の栄養素および成長因子を調節する方法ならびに生成物形成の速度を最大化するための技術については産業微生物学における当該技術分野で周知であり、かつ種々の方法がＢｒｏｃｋ、上記で詳述されている。
【０１４６】
本発明がバッチ、フェドバッチまたは連続プロセスのいずれかを用いて実施可能であり、かつ発酵における既知のモードであればいずれであっても適することが考えられる。さらに、細胞が細胞触媒全体として基質上に固定化され、かつイソブタノールの生成における発酵条件に従いうることが考えられる。
【０１４７】
発酵培地からイソブタノールを単離するための方法
生物学的に生成されるイソブタノールは、アセトン−ブタノール−エタノール（ＡＢＥ）を発酵するための当該技術分野で既知の方法を用いて発酵培地から単離されうる（例えば、Ｄｕｒｒｅ、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４９、６３９−６４８頁、１９９８年、およびＧｒｏｏｔら、Ｐｒｏｃｅｓｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７、６１−７５頁、１９９２年およびその中の参考文献）。例えば、固体は遠心分離、濾過、デカンテーションにより発酵培地から除去され、イソブタノールは蒸留、共沸蒸留、液体−液体抽出、吸着、ガスストリッピング、膜蒸発、または透析蒸発などの方法を用いて発酵培地から単離されうる。
【実施例】
【０１４８】
本発明はさらに以下の実施例にて定義される。これらの実施例が本発明の好ましい実施形態を示す一方であくまで例示目的で与えられることは理解されるべきである。上記の考察およびこれらの実施例から、当業者は、本発明の本質的な特徴により、その趣旨および範囲から逸脱することなく本発明に対して様々な変更および改良を行うことで、本発明の様々な利用および条件への適合が可能であることが確認できる。
【０１４９】
一般的方法
実施例で用いられる標準の組換えＤＮＡおよび分子クローン化技術は当該技術分野で周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ， Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ， Ｔ．（「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）、１９８９年、ここではＭａｎｉａｔｉｓと称される）およびＭａｎｉａｔｉｓ（上記）と、Ｓｉｌｈａｖｙら（Ｓｉｌｈａｖｙら、「Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）１９８４年）と、Ａｕｓｕｂｅｌら（Ａｕｓｕｂｅｌら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ． ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅにより発行、１９８７年）により記載がなされている。
【０１５０】
細菌培養物の維持および成長に適する材料および方法は当該技術分野で周知である。以下の実施例における使用に適する技術は、「Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ」（Ｐｈｉｌｌｉｐｐら編、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ．）、１９９４年）またはＴｈｏｍａｓ Ｄ．Ｂｒｏｃｋ（Ｂｒｏｃｋ、「Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」、第２版、Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ）（１９８９年）における提示として見出されうる。細菌細胞の成長および維持のために用いられるすべての試薬、制限酵素および材料は、他に特に規定がない限り、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）、ＢＤ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｓｐａｒｋｓ，ＭＤ）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、またはＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手した。
【０１５１】
以下の実施例で用いられるオリゴヌクレオチドプライマーを表３に示す。
【０１５２】
【表３】
【０１５３】
【表４】
【０１５４】
略語の意味は以下の通りである。「ｓｅｃ」は秒を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｈ」は時間を意味し、「ｎｍ」はナノメートルを意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「ｍｇ／ｍＬ」はミリグラム／ミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「ｎｍ」はナノメートルを意味し、「ｍＭ」はミリモル濃度を意味し、「Ｍ」はモル濃度を意味し、「ｍｍｏｌ」はミリモルを意味し、「μｍｏｌ」はマイクロモルを意味し、「ｋｇ」はキログラムを意味し、「ｇ」はグラムを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｎｇ」はナノグラムを意味し、「ＰＣＲ」はポリメラーゼ連鎖反応を意味し、「ＯＤ」は光学密度を意味し、「ＯＤ６００」は６００ｎｍの波長で測定された光学密度を意味し、「ｋＤａ」はキロダルトンを意味し、「ｇ」は重力定数を意味し、「ｂｐ」は塩基対を意味し、「ｋｂｐ」はキロ塩基対を意味し、「ｋｂ」はキロベースを意味し、「％」はパーセントを意味し、「％ｗ／ｖ」は重量／容量パーセントを意味し、「％ｖ／ｖ」は容量／容量パーセントを意味し、「ＨＰＬＣ」は高性能液体クロマトグラフィーを意味し、「ｇ／Ｌ」はグラム／リットルを意味し、「μｇ／Ｌ」はマイクログラム／リットルを意味し、「ｎｇ／μＬ」はナノグラム／マイクロリットルを意味し、「ｐｍｏｌ／μＬ」はピコモル／マイクロリットルを意味し、「ＲＰＭ」は回転／分を意味し、「μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ」はマイクロモル／分／ミリグラムを意味し、「ｗ／ｖ」は重量／容量を意味し、「ｖ／ｖ」は容量／容量を意味する。
【０１５５】
実施例１（比較）
ＫＡＲＩ酵素活性の分析
本実施例では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｉｌｖＣ遺伝子によりコードされたＫＡＲＩ酵素によるＮＡＤＰＨのアセトラクテート依存性の酸化を用いたｉｌｖＣ遺伝子の過剰発現コンストラクトの調製および酵素活性の測定について記載する。
【０１５６】
ｐＢＡＤ−ｉｌｖＣ発現プラスミドの作成−大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からのｉｌｖＣ遺伝子の単離
ｉｌｖＣ遺伝子コード領域を、ＰＣＲを用い、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＦＭ５（ＡＴＣＣ５３９１１）のゲノムＤＮＡから増幅した。細胞を、Ｌｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ Ｉｎｃ．（Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡ））４ｍＬを有する５０ｍＬの培養管内で（３００ＲＰＭで撹拌しながら３７℃で）一晩成長させた。次いで、それらを３分間で１０００×ｇでの遠心分離により回収し、細胞のゲノムＤＮＡを、Ｇｅｎｔｒａ Ｐｕｒｅｇｅｎｅキット（Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）；カタログ番号Ｄ−５０００Ａ）を用い、製造業者の指示書に従って調製した。ｉｌｖＣコード領域ＤＮＡ断片を、鋳型として大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡとプライマーの配列番号１１および１２を用い、ＰＣＲにより調製した。
【０１５７】
ＰＣＲを、Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標） Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ．（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）；カタログ番号Ｆ−５３１）を用い、製造業者のプロトコルに従って行った。増幅を、ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ ＧｅｎｅＡｍｐ ９７００（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ ｃｉｔｙ，ＣＡ））で行った。追加精製を伴わないＰＣＲ産物（０．５μＬ）を、ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、カタログ番号４５−００３１）にライゲートし、化学的コンピテントな（ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）ＴＯＰ１０細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ４４−０３０１）に形質転換した。ライゲーション産物を、ＬＢ培地＋１００μｇ／ｍＬのアンピシリン（Ｔｅｋｎｏｖａ Ｉｎｃ（Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ，ＣＡ）、カタログ番号Ｌ１００４）を有するプレート上にストリークした。ｉｌｖＣ挿入物を有するクローンをＳａｃＩ／ＢａｍＨＩでの制限消化により確認した。消化した４つの中の３つのプラスミドは、想定された１．５ｋｂｐのバンドを有した。得られたクローンをｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ ＴＯＰＯ−ｉｌｖＣと名づけた。
【０１５８】
ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ ＴＯＰＯ−ｉｌｖＣクローン化ベクター由来のｉｌｖＣ断片をＳａｃＩ／ＢａｍＨＩ消化により放出し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ））を用い、ＳａｃＩ／ＢａｍＨＩで消化されたｐＴｒｃ９９Ａ（Ａｍａｎｎら、Ｇｅｎｅ、６９、３０１−３１５頁、１９８８年）にライゲートした。このコンストラクトをエレクトロコンピテントな（ｅｌｅｃｔｒｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ４４−００３５）にエレクトロポレートし、上記のようにＬＢ／アンピシリンプレート上にストリークした。１．５ｋｂの挿入物を有するベクターをｐＴｒｃ９９Ａ−ｉｌｖＣと名づけた。
【０１５９】
クローン化のためのｐＢＡＤベクターの調製
遺伝子の５’末端にＳａｃＩ部位を有するｐＢＡＤ．ＨｉｓＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ベクターの誘導体を、ＳａｃＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を用い、ｉｌｖＣ遺伝子のｐＢＡＤへのクローン化のために作成した。このコンストラクトを３つのステップで作成した。第１に、赤色酵母（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｇｌｕｔｉｎｉｓ）由来のフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ；ＥＣ４．３．１．５）のコード領域をｐＢＡＤ−ＨｉｓＡベクターにクローン化し、ｐＢＡＤ−ＰＡＬを作成した。第２に、ＥｃｏＲＩ部位をｐＢＡＤ−ＰＡＬコンストラクト上の開始コドンの直前の遺伝子の５’末端に付加し、ｐＢＡＤ−ＰＡＬ−ＥｃｏＲＩを作成した。第３に、ｉｌｖＣ遺伝子のクローン化のため、ＥｃｏＲＩ部位をＳａｃＩ部位で置換し、得られたベクターをＳａｃＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ｐＢＡＤ−ＳａｃＩベクターを作成した。まずＰＡＬ遺伝子を、フォワードプライマー（ＰＡＬ−Ｆ１）（配列番号３７）およびリバースプライマー（ＰＡＬ−Ｒ１）（配列番号３８）を用い、ｐＫＫ２２３−ＰＡＬベクター（米国特許第６５２１７４８号明細書）からＰＣＲ増幅した。
【０１６０】
ＰＣＲを、ＴａＫａＲａ Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｐｒｅｍｉｘ（ＴＡＫＡＲＡ Ｂｉｏ ＵＳＡ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、カタログ番号ＴＡＫ＿Ｒ００４Ａ）を用い、製造業者のプロトコルに従い、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＰＣＲ９７００サーモサイクラー（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ ｃｉｔｙ，ＣＡ））で行った。ＰＣＲ産物をＱＩＡＱｕｉｋ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号２８１０６）を用いて部分精製し、ＢｂｓＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した。これにより、５’末端上にオーバーハングしたＮｃｏＩを有する断片が生成された。次いで、消化産物を、ＮｃｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化済みのｐＢＡＤ．ＨｉｓＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ベクターにライゲートした。ライゲーション反応を、製造業者から提供された標準プロトコルに従い、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて行った。ライゲーション産物２μＬを用い、ＴＯＰ１０エレクトロコンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、Ｂｉｏ−ＲＡＤ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ ＩＩ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ））を用い、製造業者の指示書に従って形質転換した。形質転換された細胞を、ＬＢ培地＋１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを有する寒天プレート（Ｔｅｋｎｏｖａ Ｉｎｃ（Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ，ＣＡ）、カタログ番号Ｌ１００４）上にストリークし、３７℃で一晩インキュベートした。ＰＡＬ挿入物を有するクローンをＮｃｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩでの制限消化により確認した。このコンストラクトをｐＢＡＤ−ＰＡＬと名づけた。次いで、ＥｃｏＲＩ部位を、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ ＸＬ部位特異的突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）、カタログ番号２００５２４）を用い、上記コンストラクト内のＰＡＬ遺伝子の５’末端に付加した。フォワードプライマー（ＰＡＬ−ＥｃｏＲＩ−Ｆ１）（配列番号３９）およびリバースプライマー（ＰＡＬ−ＥｃｏＲ１−Ｒ１）（配列番号４０）を設計し、反応混合物を製造業者の指示書に従って調製した。上で調製したｐＢＡＤ−ＰＡＬコンストラクトを下記反応における鋳型として用いた。
【０１６１】
反応混合物５０μＬは、２００μＬの薄壁チューブ内に、５０ｎｇ／μＬの鋳型プラスミド１．０μＬ、１０ｐモル／μＬの各プライマー１．０μＬ、１０×反応緩衝液５μＬ、ｄＮＴＰミックス１．０μＬおよびＱｕｉｋ溶液３μＬ、水３０μＬおよびｐｆｕ−ｕｌｔｒａ ｈｉｇｈ ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ１．０μＬを含有した。この反応で用いたすべての試薬およびポリメラーゼを上記のＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ ＸＬキットで提供した。反応を、以下の条件を用い、ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ ＧｅｎｅＡｍｐ ２４００（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ ｃｉｔｙ，ＣＡ））で行った。開始温度は９６℃で２分間であり、その後、１８回の加熱／冷却サイクルを行った。各サイクルは、９６℃で３０秒間、次いで６０℃で３０秒間、次いで７２℃で１６０秒間からなるものであった。温度サイクルの完了時、試料を７２℃でさらに６００秒間保持し、次いで４℃で試料の回収まで待機した。
【０１６２】
反応の完了後、（上記のキットからの）制限酵素ＤｐｎＩ１．０μＬを反応物に添加後、３７℃で３時間インキュベートし、反応物中の鋳型プラスミドを消化した。
【０１６３】
次いで、ＤｐｎＩで消化した反応産物２．０μＬを、Ｂｉｏ ＲＡＤ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ ＩＩ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ））を用い、製造業者の指示書に従い、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０エレクトロコンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）５０μｌに形質転換した。異なる容量（２．０μＬ、５．０μＬおよび２０μＬ）の形質転換細胞を、ＬＢ培地および１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを有する１０ｃｍの寒天プレート上にストリークし、プレートを３７℃で一晩インキュベートした。３つのクローンを十分に分離されたコロニーを有するプレートから採取した。３つのクローン由来のプラスミドを、Ｑｉａｐｒｅｐ ｓｐｉｎ ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ ＣＡ）、カタログ番号２７１０６）を用い、製造業者の使用説明書に従って精製した。陽性クローンを、１０×反応緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ緩衝液）１．０μＬ、精製プラスミド１．０μＬおよび各制限酵素１．０μＬを脱イオン水６．０μＬ中に入れることによる制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））を用いた制限消化分析により確認した。反応混合物を３７℃で６０分間インキュベートした。各クローンの消化産物を０．８％アガロースＥ ｇｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｇ５０１８−０８）上で分離した。１つの２．１ｋｂｐおよび１つの４．０ｋｂｐのＤＮＡ断片を、コンストラクト内にＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位の双方を有する試料中のゲル上で検出した。次いで、このコンストラクト内のＥｃｏＲＩ部位を、プラスミド鋳型ｐＢＡＤ−ＰＡＬ−ＥｃｏＲＩとプライマーの配列番号１３および１４を伴う上記と同じプロトコルを用いてＳａｃＩ部位で置換した。
【０１６４】
陽性クローンを制限酵素ＳａｃＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ））を用いる制限消化分析により確認した。一旦、陽性クローンが同定されると、上記の制限消化反応を大規模に（５０μＬ）に設定した。消化されたベクターを有する４ｋｂｐの断片を、１％アガロースゲルおよびＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ（ＶａｌｅｎｃｉａＣＡ）、カタログ番号２８７０４）を用い、製造業者のプロトコルに従って混合物からゲル精製した。このコンストラクトをｐＢＡＤ−ＳａｃＩと名づけた。
【０１６５】
ＫＡＲＩの過剰発現に用いる宿主株
ノックアウトされたｉｌｖＣ遺伝子である宿主株大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＢｗ２５１１３（ΔｉｌｖＣ）を、ＫＡＲＩ酵素を過剰発現するコンストラクトの作成に用いた。この株においては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）染色体上のｉｌｖＣ遺伝子全体を、ラムダレッド相同性組換え技術（ＤａｔｓｅｎｋｏおよびＷａｎｎｅｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９７、６６４０−６６４５頁、２０００年）を用い、カナマイシンカセットと置換した。この技術を用いたノックアウト株の作製に必要な株およびベクターのすべてを、Ｐｒｏｆ．Ｂａｒｒｙ Ｗａｎｎｅｒ（Ｐｕｒｄｕｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｗｅｓｔ Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＩＮ））から入手した。
【０１６６】
クローン化のためのｉｌｖＣコード領域の調製
ｉｌｖＣにおけるコード領域を、ｈｉｇｈ ｆｉｄｅｌｉｔｙ ｐｆｕ−ｕｌｔｒａ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ））を用いて増幅するとともに、ＳａｃＩ部位をＡＴＧの直前のフォワードプライマーの５’末端に付加し、かつＨｉｎｄＩＩＩ部位を停止コドンの直後のリバースプライマーの５’末端に付加した。配列番号１５を有するプライマー（フォワード：ｉｌｖｃ−ｔｒｃ−ＳａｃＩ−Ｆ）および配列番号１６を有するプライマー（リバース：ｉｌｖｃ−ｔｒｃ−ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｒ）をこの反応に用いた。ＰＣＲ反応に用いた鋳型は、上記のｐｔｒｃ９９Ａ−ｉｌｖＣコンストラクトであった。
【０１６７】
反応混合物５０μＬは、ｐｆｕ−ｕｌｔｒａ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、５０ｎｇ／μＬの鋳型１．０μＬ、１０ｐモル／μＬのフォワードおよびリバースプライマーの各々１．０μＬ、４０ｍＭ ｄＮＴＰミックス（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ））１．０μＬ、ｐｆｕ−ｕｌｔｒａ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）１．０μＬ、ならびに水３９μＬが供給された１０×反応緩衝液５．０μＬを含有した。この反応混合物を、ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ ＧｅｎｅＡｍｐ ２４００（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ ｃｉｔｙ，ＣＡ））におけるＰＣＲ反応用の２００μＬの薄壁チューブ内に入れた。ＰＣＲ反応を実施するため、以下の条件を用いた。開始温度は９４℃で２分間であった。次いで、３０回の加熱／冷却サイクルを行った。各サイクルは、９４℃で３０秒間、５８℃で３０秒間、次いで６８℃で１分間および４０秒間からなるものであった。温度サイクルの完了時、試料を６０℃でさらに１０分間保持し、次いで４℃で試料の回収まで待機した。
【０１６８】
ＰＣＲ産物をＱＩＡｑｕｉｋ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号２８１０６）を用いて部分精製し、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳａｃＩにより消化し、次いで上記のプロトコルを用いてゲル精製した。消化されたＰＣＲ断片を、同じ酵素セットにより消化されたｐＢＡＤ−ＳａｃＩベクターにライゲートした。ライゲーション反応物２０μＬは、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）１．０μＬ、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを伴う１０×反応緩衝液２．０μＬ、４５ｎｇのベクターと４５ｎｇの挿入物、および脱イオン水を含有した。反応物を、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆサーマルサイクラー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ（Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ））内で、１６℃で一晩インキュベートした。
【０１６９】
ライゲーション産物２μＬを、ＢｉｏＲＡＤ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ ＩＩ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ））を用い、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０エレクトロコンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換した。形質転換クローンを、ＬＢ培地および１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを有する寒天プレート上で選択した。クローン内での大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｉｌｖＣ遺伝子挿入物の存在を、ＳａｃＩでの消化およびプライマーの配列番号１７〜２２を用いたＤＮＡ配列決定により確認した。ｉｌｖＣ遺伝子挿入物を有するコンストラクトをｐＢＡＤ−Ｋ１２−ｉｌｖＣと名づけた。
【０１７０】
ＫＡＲＩ発現の分析のための株の調製
上記ｐＢＡＤ−Ｋ１２−ｉｌｖＣコンストラクトおよびｐＴｒｃ９９Ａ−ｉｌｖＣのプラスミド（双方ともＴＯＰ１０宿主株内）を、Ｑｉａｐｒｅｐ ｓｐｉｎ ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ ＣＡ）、カタログ番号２７１０６）を用い、製造業者の使用説明書に従い、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＬＢ培地中で一晩培養物３ｍＬから調製した。ｐＢＡＤ−Ｋ１２−ｉｌｖＣ１μＬおよびｐＴｒｃ９９Ａ−ｉｌｖＣ１μＬを、Ｂｉｏ ＲＡＤ Ｇｅｎｅ ＰｕｌｓｅｒＩＩ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ））を用い、製造業者の指示書に従い、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｂｗ２５１１３（ΔｉｌｖＣ）エレクトロコンピテント細胞に別々に形質転換した。形質転換細胞をＬＢ培地＋１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを有する寒天プレート上にストリークし、３７℃で一晩インキュベートした。これらのプレート由来のコロニーを無細胞抽出物（ｃｅｌｌ ｆｒｅｅ ｅｘｔｒａｃｔ）の調製に用いた。
【０１７１】
無細胞抽出物の調製
ｐＢＡＤ−Ｋ１２−ｉｌｖＣおよびｐＴｒｃ９９Ａ−ｉｌｖＣを有する細胞を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリン、誘導因子の０．０２％（ｗ／ｖ）アラビノースおよび１ｍＭイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を含有するＬＢ培地３．０ｍＬ中で、２５０ｒｐｍで振とうしながら３７℃でそれぞれ成長させた。細胞を、２２．５℃、６０００×ｇで５分間の遠心分離により回収し、細胞ペレットを１．５ｍＬの微量遠心管内の１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）３００μＬ中に再懸濁し、（容量基準で）４０％の水および６０％の氷で満たした水槽内に入れ、Ｍｉｓｏｎｉｘ ３００ソニケーター（Ｍｉｓｏｎｉｘ（Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ，ＮＹ））を用いて２〜３分間超音波処理した（出力１．０で３．０秒バースト後、３．０秒の停止）。細胞残渣を遠心分離（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ微量遠心管、モデル５４１５Ｄ、２２．５℃、９３００×ｇで５分間）により除去した。
【０１７２】
あるいは、細胞抽出物を、洗剤に基づくタンパク質抽出試薬ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（Ｎｏｖａｇｅｎ、カタログ番号７１４５６）を用いて調製した。培養物３．０ｍＬ由来の細胞ペレットをＢｕｇＢｕｓｔｅｒ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ３００μＬ中に再懸濁し、室温で２０分間インキュベートした。細胞残渣を、２２．５℃、９３００×ｇで５分間の遠心分離（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆｆ微量遠心管モデル５４１５Ｄ）により除去した。
【０１７３】
タンパク質の定量
試料中の全タンパク質濃度を、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｐｌｕｓ（Ｐｉｅｒｃｅ＃２３２３８（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ））を用いたＢｒａｄｆｏｒｄ Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ａｓｓａｙ（ＢＣＡ）により測定した。試料およびタンパク質の標準（ウシ血清アルブミン、ＢＳＡ）を、製造業者のプロトコルに従い、９６ウェルマイクロプレート内で設定した。タンパク質の濃度を、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ））を用い、５９５ｎｍでの吸光度に従って測定した。
【０１７４】
ＫＡＲＩ酵素アッセイプロトコル
アッセイ基質の（Ｒ，Ｓ）−アセトラクテートをＡｕｌａｂａｕｇｈおよびＳｃｈｌｏｓｓ（ＡｕｌａｂａｕｇｈおよびＳｃｈｌｏｓｓ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２９、２８２４−２８３０頁、１９９０年）に記載のように合成した。すなわち、１．０ｇの２−アセトキシ−２−メチル−３−オキソ酪酸エチルエステル（Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ））を１．０ＭのＮａＯＨ１０ｍＬと混合し、室温で撹拌した。溶液ｐＨが中性になったら、追加的なＮａＯＨを徐々に添加し、約８．０のｐＨを維持した。アッセイで用いたすべての他の化学物質をＳｉｇｍａから購入した。
【０１７５】
ＫＡＲＩによるアセトラクテートから２，３−ジヒドロキシイソバレレートへの酵素的変換の後に、共同因子ＮＡＤＰＨの反応物からの消失を分光光度計（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ））を３４０ｎｍで用いて測定した。ＮＡＤＰＨについての活性を６２２０Ｍ−１ｃｍ−１のモル吸光係数を用いて計算した。用いたストック溶液は、ＨＣｌ／ＫＯＨによってｐＨ７．５に調整した１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ−カリウム塩；１．０Ｍ ＭｇＣｌ２；２０ｍＭ ＮＡＤＰＨおよび９０ｍＭアセトラクテートであった。ストック用反応緩衝液混合液４０ｍＬは１００ｍＭ ＨＥＰＥＳストックおよびＭｇＣｌ２ストック４００μＬを含有する。
【０１７６】
反応緩衝液（１９４μＬ）を、プラスチック製使い捨てキュベット（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ＵＶｅｔｔｅ、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ＡＧ（Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ））内でＮＡＤＰＨ（２．０μＬ）ストックおよび細胞抽出物（２．０μＬ）と混合し、２２．５℃、３４０ｎｍでの吸光度を２０秒間記録した。初期のＡ３４０は通常、約０．９〜１．０であった。次いで、アセトラクテート（２．０μＬ）をキュベットに添加し、反応を開始した。アッセイにおける原料の最終濃度は、ｐＨ７．５での１００ｍＭカリウムＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２００μＭ ＮＡＤＰＨおよび９００μＭアセトラクテートであった。この溶液を完全に混合し、３４０ｎｍでのその吸光度をさらに８０秒間記
録した。ここで報告されるＫＡＲＩ活性は、細胞抽出物中の全タンパク質の１ｍｇ当たり、１分当たりに消費されるＮＡＤＰＨのμモルとして定義される。ｐＢＡＤ−Ｋ１２−ｉｌｖＣプラスミドおよびｐｔｒｃ９９Ａ−ｉｌｖＣプラスミドで形質転換した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｂｗ２５１１３（ΔｉｌｖＣ）細胞から調製した細胞抽出物中のタンパク質濃度およびＫＡＲＩ活性の結果を表４に示す。２つの細胞抽出物試料を、ｐＢＡＤ−Ｋ１２−ｉｌｖＣコンストラクト用に、一方は超音波処理、他方はＢｕｇＢｕｓｔｅｒを用いて調製した。ｐＴｒｃ９９Ａ−ｉｌｖＣコンストラクト用の細胞抽出物試料を、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒを用いて調製した。これらの分析によると、ＫＡＲＩタンパク質がｐＢＡＤ−Ｋ１２−ｉｌｖＣプラスミドを有する細胞内の方がｐＴｒｃ９９Ａ−ｉｌｖＣを有する細胞内よりも高レベルに発現されたが、２つの異なる方法により調製した細胞抽出物試料中での酵素比活性は有意に異ならないことが示された。ｐＢＡＤ−ＨｉｓＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で形質転換された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株Ｂｗ２５１１３を陰性対照として用いた。陰性対照におけるＮＡＤＰＨ消費率は極めて低かった（ｐＢＡＤ−Ｋ１２−ｉｌｖＣ遺伝子を有するものについて測定された消費率の約１％〜２％）。
【０１７７】
【表５】
【０１７８】
実施例２
様々な微生物由来の比活性の高い酵素を有するＫＡＲＩの同定
本実施例の目的は、高い比活性を有するＫＡＲＩ酵素を含有する微生物の同定の仕方を説明することである。
【０１７９】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）よりも迅速な倍加時間を有するＫＡＲＩを含有する生物が、最少培地中で成長する間、活性の高いＫＡＲＩ酵素を含有することになると仮定された。緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（ＰＡＯ１）、蛍光菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）（ＰＦ５）、およびコレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）（Ｎ１６９６１）といった３種の微生物が、Ｍ９最少培地中での成長時、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）よりも迅速な倍加時間を有するものとして同定された（下記参照）。これらの生物のゲノムＤＮＡ製剤は市販されている。表５は、Ｍ９最少培地中での成長後の倍加時間のこれらの生物と大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）との比較を示す。
【０１８０】
【表６】
【０１８１】
上記のように、ＫＡＲＩ酵素は異なるクラスに分類されている。シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）ＰＦ５およびＰＡＯ１酵素はクラスＩ ＫＡＲＩ群（同科内の最大の群である）に属する一方、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびコレラ菌（Ｖ．Ｃｈｏｌｅｒａｅ）酵素はクラスＩＩ細菌ＫＡＲＩ群に属する。
【０１８２】
緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（ＰＡＯ１、ＡＴＣＣ ４７０８５）および蛍光菌（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）（ＰＦ５、ＡＴＣＣ ＢＡＡ−４７７）の精製ゲノムＤＮＡをＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ））から購入した。各生物由来のゲノムＤＮＡ（各々１０μｇ）を、ＰＣＲ反応で用いるため、ｐＨ８．５の１０ｍＭトリス−ＨＣｌ１００μＬで再水和した。ＳａｃＩ部位をフォワードプライマー（配列番号２３および２５）に結合させかつＨｉｎｄＩＩＩ部位をリバースプライマー（配列番号２４および２６）に結合させた、プライマー対を用い、ｉｌｖＣ遺伝子コード領域を、ｈｉｇｈ ｆｉｄｅｌｉｔｙ ｐｆｕ−ｕｌｔｒａ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用い、ＰＡＯ１およびＰＦ５のゲノムＤＮＡからＰＣＲで増幅した。プライマーを、これらの生物におけるＰＦ５およびＰＡＯ１ ｉｌｖＣ遺伝子の公的に有益な（ＧｅｎｅＢａｎｋ）配列に基づいて設計した。
【０１８３】
各ＰＣＲ反応物５０μＬは、ゲノムＤＮＡ１．０μＬおよび１０ｐモル／μＬのフォワードおよびリバースプライマーを各遺伝子につき１．０μＬずつ含有した。
【０１８４】
ＰＣＲ反応を、以下の反応条件を用い、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ｍａｓｔｅｒ ｃｙｃｌｅｒｓ ｇｒａｄｉｅｎｔ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ（Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ））で行った。開始温度は２分間で９５℃であった。次いで、５回の加熱／冷却サイクルを行った。各サイクルは、９５℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、および７２℃で１０分間と３０秒間からなるものであった。２５回のさらなる加熱／冷却サイクルを行った。これらの各サイクルは、９５℃で３０秒間、６５℃で３０秒間、および７２℃で１．０分間と３０秒間からなるものであった。これらの温度サイクルの完了時、試料を７２℃でさらに１０分間保持し、次いで４℃で試料の回収まで待機した。
【０１８５】
実施例１に記載の手順を用い、得られたＰＣＲ断片をＨｉｎｄＩＩＩおよびＳａｃＩで消化し、ｐＢＡＤ−ＳａｃＩ発現ベクターにクローン化し、ｉｌｖＣ−ノックアウト株ＢＷ２５１１３（ΔｉｌｖＣ）に形質転換した。陽性クローンを制限酵素消化により同定し、プライマーの配列番号２１（ｐＢＡＤ−ｅＦ１）、配列番号２２（ＰＡＬＰＫ−Ｒ１）、配列番号２７（ＰＦ５−Ｓ−Ｆ２）、および配列番号２８（ＰＦ５−Ｓ−Ｒ２）を用いる完全長ＤＮＡ配列決定により確認し、ここで得られた株をＢＷ２５１１３（ΔｉｌｖＣ）−ＰＡＯ１−ｉｌｖＣおよびＢＷ２５１１３（ΔｉｌｖＣ）−ＰＦ５−ｉｌｖＣと名づけた。
【０１８６】
コレラ菌（Ｖ．Ｃｈｏｌｅｒａｅ）ＶＣ０１６２遺伝子コード領域を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）での発現のために既知のタンパク質配列（登録番号ＮＰ＿２２９８１９．１）に基づいてコドン最適化し、合成的なカスタム遺伝子合成（ＤＮＡ ２．０，Ｉｎｃ．（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡ））により調製した。ＳａｃＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位を遺伝子の末端に結合し、それを調製した。このＤＮＡ断片をまた、ＳａｃＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を用いてｐＢＡＤ−ＳａｃＩ発現ベクターにクローン化し、ｉｌｖＣ−ノックアウト株ＢＷ２５１１３（ΔｉｌｖＣ）に形質転換した。得られた株をＢＷ２５１１３（ΔｉｌｖＣ）−ＶＣｏｐｔ−ＶＣ０１６２と名づけた。コドン最適化されたＶＣ０１６２の配列は配列番号３０で与えられる。
【０１８７】
Ｋ１２、ＰＡＯ１、ＰＦ５およびＶＣ株由来のタンパク質およびＫＡＲＩ活性アッセイ
ＫＡＲＩ酵素を発現するすべての株ＢＷ２５１１３（ΔｉｌｖＣ）−Ｋ１２−ｉｌｖＣ、ＢＷ２５１１３（ΔｉｌｖＣ）−ＰＡＯ１−ｉｌｖＣ．ＢＷ２５１１３（ΔｉｌｖＣ）−ＰＦ５−ｉｌｖＣおよびＢＷ２５１１３（ΔｉｌｖＣ）−ＶＣｏｐｔ−ＶＣ０１６２の無細胞抽出物を、実施例１に記載のようにＢｕｇＢｕｓｔｅｒを用いて調製した。ＫＡＲＩアッセイを、反応緩衝液１８８μＬ、２０ｍＭ ＮＡＤＰＨストック２．０μＬ、アッセイ緩衝液で希釈した２０％細胞抽出物５．０μＬおよび９０ｍＭアセトラクテート５．０μＬを用いて行った。それ故、本実施例で用いる最終のアッセイ溶液は、酵素、１００ｍＭカリウム−ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２，２００μＭ ＮＡＤＰＨおよび２．２５ｍＭアセトラクテートからなるものであった。
【０１８８】
表６は、誘導因子としての０．０２％（ｗ／ｖ）のアラビノースの存在下で一晩成長させた４種の異なる生物のＫＡＲＩ比活性を示す。細胞抽出物中の全タンパク質の量およびＫＡＲＩ活性を上記のように測定した。表６にまとめるように、最少培地中での成長時により迅速な倍加時間を有するものとして同定された生物由来のＫＡＲＩ酵素は（表５）、いずれも大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のＫＡＲＩよりも高い比活性を有する。各抽出物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる推定とほぼ等しいレベルのＫＡＲＩタンパク質の発現を有した（データは示さず）。これらの結果は、最少培地中での成長期間中の倍加時間がより高い比活性を有するＫＡＲＩ酵素を同定するための手段として用いられうるという仮説を支持している。
【０１８９】
【表７】
【０１９０】
実施例３
精製Ｋ１２−ＫＡＲＩおよびＰＦ５−ＫＡＲＩの比活性の分析
実施例２における、粗細胞抽出物で観察されるＫＡＲＩ比活性の増大について一層解明するため、Ｋ１２−ＫＡＲＩおよびＰＦ５−ＫＡＲＩを均質になるまで精製することで各タンパク質の濃度の正確な定量を可能にし、精製ＫＡＲＩ酵素の比活性を測定した。
【０１９１】
Ｋ１２−ＫＡＲＩおよびＰＦ５−ＫＡＲＩの精製
Ｋ１２−ＫＡＲＩおよびＰＦ５−ＫＡＲＩの双方を弱アニオン交換スピンカラムＶｉｖａｐｕｒｅ ＩＥＸ Ｄ、ｍｉｎｉＨ（Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ ＡＧ（Ｈａｎｎｏｖｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ））を用いて精製後、１００ＫＤａの分子量カットオフを有するＭｉｃｒｏｃｏｎ機器（ＹＭ１００、Ｍｉｌｌｐｏｒｅ（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ））で濃縮した。精製手順を室温（２２．５℃）で行った。
【０１９２】
アニオン交換スピンカラムで用いたストック溶液は、ｐＨ７．０での１００ｍＭカリウム−ＨＥＰＥＳ、１．０Ｍ ＭｇＣｌ２、２５０ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％Ｂｒｉｊ３５および２Ｍ ＫＣｌであった。洗浄用緩衝液（ＢｕｆｆｅｒＡ）を、ＭｇＣｌ２ストック５０μＬ、ＥＤＴＡストック２０μＬおよび１０％Ｂｒｉｊ３５ １０μＬの添加とともに、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳストック５．０ｍＬの水１５ｍＬへの添加により作製した。溶出緩衝液＃１（緩衝液Ｂ）を、ＭｇＣｌ２ストック５０μｌ、ＥＤＴＡストック２０μＬおよび１０％Ｂｒｉｊ３５１０μＬの添加とともに、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ５．０ｍｌ、ＫＣｌストック２．０ｍＬの１３ｍＬ水への添加により作製した。溶出緩衝液＃２（緩衝液Ｃ）を、ＭｇＣｌ２ストック５０μＬ、ＥＤＴＡストック２０μＬおよび１０％Ｂｒｉｊ３５１０μＬの添加とともに、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳストック５ｍＬ、ＫＣｌストック５．０ｍＬの１０ｍＬ水への添加により作製した。緩衝液Ｂ中での最終のＫＣｌ濃度は約２００ｍＭであり、緩衝液Ｃ中では約５００ｍＭである。
【０１９３】
株ＢＷ２５１１３（ΔｉｌｖＣ）−Ｋ１２−ｉｌｖＣおよびＢＷ２５１１３（ΔｉｌｖＣ）−ＰＦ５−ｉｌｖＣの無細胞抽出物を、実施例１に記載のようにＢｕｇＢｕｓｔｅｒを用いて調製した。Ｖｉｖａｐｕｒｅ ＩＥＸ Ｄカラムへの装填のために希釈した細胞抽出物を調製するため、二重脱イオン水６００μＬを抽出物２００μＬに添加した。
【０１９４】
Ｖｉｖａｐｕｒｅ ＩＥＸ Ｄカラムを、２０００×ｇで５分間の遠心分離（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ微量遠心管モデル５４１５Ｄ）により緩衝液Ａ４００μＬでまず洗浄した。同一の機器およびプロセスをＶｉｖａｐｕｒｅ ＩＥＸ Ｄ精製手順全体を通じて用いた。希釈した細胞抽出物（上記）をカラムに装填し、４００μＬずつの２つのバッチで遠心分離した。次いで、カラムを緩衝液Ａ４００μＬで（２回）洗浄した。ＰＦ５−ＫＡＲＩ試料においては、緩衝液Ｂ４００μＬを装填し、酵素をカラムから回収用チューブに溶出した。Ｋ１２−ＫＡＲＩ試料においては、代わりに緩衝液Ｃ４００μＬを用いた。
【０１９５】
Ｍｉｃｒｏｃｏｎ ＹＭ１００機器を、１３８００×ｇで５分間の遠心分離（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ微量遠心管モデル５４１５Ｄ）により脱イオン水４００μＬでまず洗浄した。次いで、Ｖｉｖａｐｕｒｅ ＩＥＸ Ｄでの精製から回収した試料を装填し、１３８００×ｇで４分間遠心分離した。流入物（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）を廃棄し、緩衝液Ｂ４００μＬを試料チャンバに添加し、１３８００×ｇで４分間遠心分離した。緩衝液Ｂ２００μＬの試料チャンバへの添加前に、洗浄手順を（２回）繰り返した。試料チャンバを清潔な回収用チューブに反転させ、５０００×ｇで２分間遠心分離し、精製試料を回収した。
【０１９６】
各精製ＫＡＲＩ試料の純度をキャピラリー電気泳動（Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ））により確認した。試料をＰｒｏｔｅｉｎ ２３０試薬キットを用いて調製し、製造業者の使用説明書に従ってＰｒｏｔｅｉｎ Ｌａｂｃｈｉｐ（試薬キットが提供）に適用し、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒにより分析した。バックグラウンドをほとんど伴わない単一のピークが各精製試料における電気記録図上に認められた。
【０１９７】
精製ＫＡＲＩ試料のタンパク質定量
２８０ｎｍでの精製ＫＡＲＩ試料のＵＶ吸収測定を、分光光度計（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ））および１ｃｍの経路長の使い捨てプラスチック製キュベット（ＵＶｅｔｔｅ、ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ））を用いて行い、精製試料中でのＫＡＲＩの量を定量した。ＰＦ５−ＫＡＲＩにおける２８０ｎｍでの吸光係数（１ｍｇ／ｍＬにおいては０．７３）およびＫ１２−ＫＡＲＩにおける２８０ｎｍでの吸光係数（１ｍｇ／ｍＬにおいては０．９８）を、ＥｘＰＡＳｙウェブサイト上で利用可能なプログラムＰｒｏｔｐａｒａｍにより予測した（Ｐａｃｅ Ｃ．Ｎ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．１１、２４１１−２４２３頁、１９９５年）。ＵＶ吸収測定のため、精製試料を緩衝液Ｂ中で２０％（ｖ／ｖ）まで希釈した。希釈したＰＦ５−ＫＡＲＩ試料におけるＡ２８０は０．４１であり、希釈したＫ１２−ＫＡＲＩにおけるＡ２８０は０．３６であった。
【０１９８】
精製ＫＡＲＩにおける活性アッセイ
本実施例で用いられるアッセイ条件は、２０％（ｖ／ｖ）精製試料５μＬを細胞抽出物の代わりに用いたこと以外では実施例２の場合と同じであった。精製試料のタンパク質濃度およびその比活性を表７に示す。試験対象の最速の成長者（ｇｒｏｗｅｒ）である精製ＰＦ５−ＫＡＲＩの比活性は、Ｋ１２−ＫＡＲＩの比活性の２倍であった。これらの結果が実施例２におけるこれら２種の酵素の粗製剤を用いて得られたデータと一致することから、最少培地中での成長の間での倍加時間が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）酵素よりも高い比活性を有するＫＡＲＩ酵素を同定するための手段として用いられうるという仮説に対してさらなる支持が得られる。
【０１９９】
【表８】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、工業微生物学の分野およびアルコールの生成に関する。より詳細には、イソブタノールが、高い代謝回転数を有する特定のケトール酸レダクトイソメラーゼ（ＫＡＲＩ）酵素を用い、組換え微生物の工業的発酵を経て生成される。本発明はまた、天然微生物由来の高活性のＫＡＲＩ酵素を発見するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ブタノールは、燃料添加剤として、プラスチック産業における化学物質原料として、さらに食品および香料産業における食品等級の抽出剤として有用な重要な産業化学物質である。毎年、１００〜１２０億ポンドのブタノールが石油化学的手段により生産され、この汎用化学製品に対する需要は高まる可能性が高い。
【０００３】
イソブタノールを化学合成するための方法は既知であり、例えば、オキソ合成、一酸化炭素の触媒水素化（非特許文献１およびメタノールとｎ−プロパノールのＧｕｅｒｂｅｔ縮合（非特許文献２）が挙げられる。これらのプロセスでは、石油化学製品に由来する出発原料が使用され、それは一般に高価であり、環境に優しいものではない。植物由来の原料からのイソブタノールの生成であれば、温室効果ガスの排出が最小化され、かつ当該技術分野における進歩が示されることになる。
【０００４】
イソブタノールは、酵母発酵の副産物として生物学的に生成される。それはアミノ酸の真菌のこの基による不完全代謝の結果として形成される「フーゼル油」の成分である。イソブタノールは、詳細にはＬ−バリンの異化から生成される。Ｌ−バリンのアミン基が窒素源として回収された後に得られるα−ケト酸は、いわゆるＥｈｒｌｉｃｈ経路の酵素により脱炭酸化され、イソブタノールに還元される（非特許文献３）。飲料発酵の間に得られるフーゼル油および／またはその成分の収量は典型的には少ない。例えば、ビール発酵中に生成されるイソブタノールの濃度は、１００万分の１６未満であることが報告されている（非特許文献４）。Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎら、上記に記載のように（イソブタノールの収量として３ｇ／Ｌが、発酵における２０ｇ／Ｌの濃度でのＬ−バリンの供給により得られることが報告された）、外因性のＬ−バリンの発酵物への添加によりイソブタノールの収量が増加する。さらに、ｎ−プロパノール、イソブタノールおよびイソアミルアルコールの生成が、アルギン酸カルシウムで固定化されたザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）の細胞により示されている。Ｌ−Ｌｅｕ、Ｌ−Ｉｌｅ、Ｌ−Ｖａｌ、α−ケトイソカプロン酸（α−ＫＣＡ）、α−ケト酪酸（α−ＫＢＡ）またはα−ケトイソ吉草酸（α−ＫＶＡ）のいずれかが補充された１０％グルコースを含有する培地が用いられた（非特許文献５）。α−ＫＣＡによりイソブタノールレベルが増加した。アミノ酸はまた、対応するアルコールを生成したが、ケト酸よりも低レベルであった。アミノ酸のロイシン、イソロイシン、および／またはバリンの窒素源としての成長培地への添加時、炭水化物由来のＣ３〜Ｃ５アルコールの収量の増加が示された（特許文献１）。
【０００５】
上記の方法が生物学的手段を介したイソブタノール生成の可能性を示す一方、これらの方法は工業規模でのイソブタノール生成にとっては莫大なコストがかかる。糖からの直接的なイソブタノールの生合成であれば経済的に実施可能となり、当該技術分野における進歩が示されることになる。しかし、この生成は、アセトラクテートをジヒドロキシ−イソバレレートに変換するイソブタノール経路における第２のステップを触媒する緩徐なケトール酸レダクトイソメラーゼ（ＫＡＲＩ）酵素により著しく阻害される。この酵素は既に高レベルで発現されることから（非特許文献６）、タンパク質の量を増加させる、すなわち酵素の比活性を高めることなくＫＡＲＩの活性を高める必要性が生じている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２００５０４０３９２号パンフレット
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】「Ｕｌｌｍａｎｎ’ｓ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、第６版、２００３年、Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨＶｅｒｌａｇ ＧｍｂＨ ａｎｄ Ｃｏ．（Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、第５巻、７１６−７１９頁）
【非特許文献２】Ｃａｒｌｉｎｉら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｃａｔａｌ．Ａ：Ｃｈｅｍ．２２０、２１５−２２０頁、２００４年
【非特許文献３】Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３、２５７５２−２５７５６頁、１９９８年
【非特許文献４】Ｇａｒｃｉａら、Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２９、３０３−３０９頁、１９９４年
【非特許文献５】Ｏａｘａｃａら、Ａｃｔａ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．；１１、５２３−５３２頁、１９９１年
【非特許文献６】Ｓ．Ｅｐｅｌｂａｕｍら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１８０、４０５６−４０６７頁、１９９８年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
出願人は、イソブタノールの生物学的生成を改善するのに利用可能な高い比活性を有するＫＡＲＩ酵素の発見により、述べられた課題を解決している。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、活性の高いＫＡＲＩ酵素を発現する組換え生物に関する。改変微生物は、有意により高い比活性（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内のＫＡＲＩ酵素の６〜８倍）を有する高レベルの短い形態のＫＡＲＩ酵素を有することになり、イソブタノールの商業的生産において使用可能である。したがって、一実施形態では、本発明は、アセトラクテートをジヒドロキシ−イソバレレートに変換するための方法であって、
ａ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ケトール酸レダクトイソメラーゼの比活性よりも高い比活性のケトール酸レダクトイソメラーゼを有するポリペプチドをコードする遺伝子コンストラクトを含む微生物宿主細胞を提供するステップと、
ｂ）（ａ）の宿主細胞をアセトラクテートと接触させるステップであって、２，３−ジヒドロキシイソバレレートが生成されるステップと、
を含む方法を提供する。
【００１０】
好ましい実施形態では、遺伝子コンストラクトは、以下の条件：
ａ）約７．５のｐＨ、
ｂ）約２２．５℃の温度、および
ｃ）約１０ｍＭ超のカリウム
のもとで行われるＮＡＤＰＨ消費アッセイによって測定される際、精製タンパク質に基づく１．１μモル／分／ｍｇを超える比活性のケトール酸レダクトイソメラーゼを有するポリペプチドをコードする。
【００１１】
別の実施形態では、本発明は、イソブタノールを生成するための方法であって、以下の遺伝子コンストラクト：
ａ）１）ピルベートをアセトラクテートに変換する（経路ステップａ）アセトラクテートシンターゼ酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子コンストラクト；
２）（Ｓ）−アセトラクテートから２，３−ジヒドロキシイソバレレートへの変換（経路ステップｂ）において、以下の条件：
ｉ）約７．５のｐＨ、
ｉｉ）約２２．５℃の温度、および
ｉｉｉ）約１０ｍＭ超のカリウム
のもとで行われるＮＡＤＰＨ消費アッセイによって測定される際、精製タンパク質に基づく１．１μモル／分／ｍｇを超える比活性のケトール酸レダクトイソメラーゼ酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子コンストラクト；
３）２，３−ジヒドロキシイソバレレートをα−ケトイソバレレートに変換する（経路ステップｃ）ためのアセトヒドロキシ酸デヒドラターゼをコードする少なくとも１つの遺伝子コンストラクト；
４）α−ケトイソバレレートをイソブチルアルデヒドに変換する（経路ステップｄ）分岐鎖ケト酸デカルボキシラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子コンストラクト；
５）イソブチルアルデヒドをイソブタノールに変換する（経路ステップｅ）ための分岐鎖アルコールデヒドロゲナーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子コンストラクト；を含む組換え微生物宿主細胞を提供するステップと、
ｂ）（ａ）の宿主細胞をイソブタノールが生成される条件下で成長させるステップと、
を含む、方法を提供する。
【００１２】
別の実施形態では本発明は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ケトール酸レダクトイソメラーゼの比活性よりも高い比活性を有するケトール酸レダクトイソメラーゼ酵素を含む組換え宿主細胞を提供する。
【００１３】
別の実施形態では、本発明は、以下の条件：
ｉ）約７．５のｐＨ、
ｉｉ）約２２．５℃の温度、および
ｉｉｉ）約１０ｍＭ超のカリウム；
のもとで行われるＮＡＤＰＨ消費アッセイによって測定される際、精製タンパク質に基づく１．１μモル／分／ｍｇを超える比活性を有するケトール酸レダクトイソメラーゼ酵素をコードする遺伝子コンストラクトの同定および単離のための方法であって、
ａ）Ｍ９最少培地中で成長される場合、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の倍加時間よりも短い倍加時間を有する細菌種を同定するステップと、
ｂ）（ａ）の細菌種をケトール酸レダクトイソメラーゼ活性についてスクリーニングし、活性細菌種を同定するステップと、
ｃ）（ｂ）の活性細菌種のゲノムＤＮＡを、ケトール酸レダクトイソメラーゼをコードすることで知られる遺伝子コンストラクトに対して相同性を有する核酸配列でプローブし、前記活性細菌種由来のケトール酸レダクトイソメラーゼをコードする遺伝子コンストラクトを同定し、単離するステップと、
ｄ）前記活性細菌種由来のケトール酸レダクトイソメラーゼをコードする遺伝子コンストラクトを増幅し、発現するステップと、
ｅ）ステップ（ｄ）の発現された遺伝子コンストラクトを、以下の条件：
ｉ）約７．５のｐＨ、
ｉｉ）約２２．５℃の温度、および
ｉｉｉ）約１０ｍＭ超のカリウム
のもとで行われるＮＡＤＰＨ消費アッセイによって測定される際、精製タンパク質に基づく１．１μモル／分／ｍｇを超える比活性を有するものについてスクリーニングするステップと、
を含む、方法を提供する。
【００１４】
本発明は、本願の一部を形成する、以下の詳細な説明、図面、および添付の配列記述からより十分に理解可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１Ａ】４つの異なるイソブタノール生合成経路を示す。「ａ」、「ｂ」、「ｃ」、「ｄ」、「ｅ」、「ｆ」、「ｇ」、「ｈ」、「ｉ」、「ｊ」および「ｋ」と称されるステップは、下記の基質から産物への変換を示す。
【図１Ｂ】４つの異なるイソブタノール生合成経路を示す。「ａ」、「ｂ」、「ｃ」、「ｄ」、「ｅ」、「ｆ」、「ｇ」、「ｈ」、「ｉ」、「ｊ」および「ｋ」と称されるステップは、下記の基質から産物への変換を示す。
【００１６】
以下の配列は、米国特許施行規則第１．８２１−１．８２５条（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列開示を有する特許出願の要件−配列の規則（Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ／ｏｒ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅｓ−ｔｈｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｕｌｅｓ）」）に従い、世界知的所有権機関（Ｗｏｒｌｄ Ｉｎｔｅｌｌｅｃｔｕａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｙ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）（ＷＩＰＯ）基準ＳＴ．２５（１９９８年）、ならびにＥＰＯおよびＰＣＴの配列表の要件（規則５．２および４９．５（ａの２）、ならびに実施細則の第２０８節および付録Ｃ）に一致する。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データにおいて用いられる記号および形式は、米国特許施行規則第１．８２２条に示される規則に従う。
【００１７】
【表１】
【００１８】
配列番号１１〜２２は、実施例１におけるコンストラクトの作成に用いられるオリゴヌクレオチドプライマーのヌクレオチド配列である。
【００１９】
配列番号２３〜３０は、実施例２のコンストラクトの作成に用いられるオリゴヌクレオチドプライマーのヌクレオチド配列である。
【００２０】
配列番号１１および１２は、ｉｌｖＣ遺伝子のＰＣＲ増幅のための実施例１で用いられるプライマーのＤＮＡ配列である。
【００２１】
配列番号１３は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内でのｐＢＡＤベクター内のＫＡＲＩ遺伝子のクローン化に用いられるプライマーにおけるフォワードＤＮＡ配列である。
【００２２】
配列番号１４は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内でのｐＢＡＤベクター内のＫＡＲＩ遺伝子のクローン化に用いられるプライマーにおけるリバースＤＮＡ配列である。
【００２３】
配列番号１５は、ＫＡＲＩ遺伝子の増幅に用いられるｉｌｖＣ−ｔｒｃ−ＳａｃＩ−ＦにおけるフォワードＤＮＡ配列である。
【００２４】
配列番号１６は、ＫＡＲＩ遺伝子の増幅に用いられるｉｌｖＣ−ｔｒｃ−ＨｉｎｄＩＩＩ−ＲにおけるリバースＤＮＡ配列である。
【００２５】
配列番号１７〜２２は、ＳａｃＩ消化およびＤＮＡ配列決定による大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｉｌｖＣ挿入物の存在の確認に用いられるオリゴヌクレオチドプライマーのヌクレオチド配列である。
【００２６】
配列番号１７−ｉｌｖＣ−ｔｒｃ−Ｆ３
【００２７】
配列番号１８−ｉｌｖＣ−ｔｒｃ−Ｆ５
【００２８】
配列番号１９−ｉｌｖＣ−ｔｒｃ−Ｒ２
【００２９】
配列番号２０−ｉｌｖＣ−ｔｒｃ−Ｒ４
【００３０】
配列番号２１−ｐＢＡＤ−ｅＦ１
【００３１】
配列番号２２−ＰＡＬＰＫ−Ｒ１
【００３２】
配列番号２３〜２６は、ＰＣＲによる緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（ＰＡＯ１）および蛍光菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）（ＰＦ５）のゲノムＤＮＡからのｉｌｖＣ遺伝子の増幅にフォワードおよびリバース方向で用いられるオリゴヌクレオチドプライマーのヌクレオチド配列である。
【００３３】
配列番号２３−ＰＡＯ１−Ｃ−Ｆ１
【００３４】
配列番号２４−ＰＡＯ１−Ｃ−Ｒ１
【００３５】
配列番号２５−ＰＦ５−Ｃ−Ｆ１
【００３６】
配列番号２６−ＰＦ５−Ｃ−Ｒ１
【００３７】
配列番号２１、２２、２７および２８は、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）のｉｌｖＣ遺伝子を有する陽性クローンのＤＮＡ配列の確認に用いられるオリゴヌクレオチドプライマーのヌクレオチド配列である。
【００３８】
配列番号２７−ＰＦ５−Ｓ−Ｆ２
【００３９】
配列番号２８−ＰＦ５−Ｓ−Ｒ２
【００４０】
以下の配列番号は、本発明で用いられるＫＡＲＩ遺伝子のＤＮＡ配列に対応する。
【００４１】
配列番号２９−大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２−ｉｌｖＣ
【００４２】
配列番号３０−大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）での発現のためのビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）由来のコドン最適化ＫＡＲＩ
【００４３】
配列番号３１−緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）−ＰＡＯ１−ｉｌｖＣ
【００４４】
配列番号３２−蛍光菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）−ＰＦ５−ｉｌｖＣ
【００４５】
以下の配列番号は、それぞれ配列番号２９〜３２に対応するアミノ酸配列である。
【００４６】
配列番号３３−大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２−ｉｌｖＣ−［大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２由来のＫＡＲＩ］
【００４７】
配列番号３４−コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）由来のＫＡＲＩ
【００４８】
配列番号３５−ＰＡＯ１−ｉｌｖＣ（１アミノ酸−３３８アミノ酸）
【００４９】
配列番号３６−ＰＦ５−ｉｌｖＣ（１アミノ酸−３３８アミノ酸）
【００５０】
配列番号３７はフォワードプライマーＰＡＬ−Ｆ１である。
【００５１】
配列番号３８はリバースプライマー（ＰＡＬ−Ｒ１）である。
【００５２】
配列番号３９はフォワードプライマー（ＰＡＬ−ＥｃｏＲ１−Ｆ１）である。
【００５３】
配列番号４０はリバースプライマー（ＰＡＬ−ＥｃｏＲ１−Ｒ１）である。
【発明を実施するための形態】
【００５４】
本発明は、高活性のＫＡＲＩ酵素を有する微生物宿主細胞を用いてアセトラクテートを２，３−ジヒドロキシイソバレレートに変換するための方法に関する。このように形成された２，３−ジヒドロキシ−イソバレレートは、図１に示されるステップを介してイソブタノールにさらに変換される。本発明はまた、より迅速なＫＡＲＩ酵素をその天然宿主微生物内に見出すための方法およびその触媒活性をさらに改善することを目的としたかかる酵素の分子進化について開示する。
【００５５】
発明は多数の商業的かつ産業的な需要を満たす。ブタノールは、種々の用途を有する重要な産業用商品の化学物質であり、その場合、燃料または燃料添加剤としてのその可能性は特に有意である。ブタノールは、４炭素アルコールにすぎなくても、ガソリンの含量に類似のエネルギー含量を有し、任意の化石燃料と混和されうる。ブタノールは、標準の内燃エンジン内で燃焼される場合にＣＯ２のみを生成し、ＳＯＸまたはＮＯＸをほとんど生成しないことから燃料または燃料添加剤として好まれる。さらにブタノールは、今日まで最も好ましい燃料添加剤であるエタノールよりも腐食性が少ない。
【００５６】
ブタノールは、生物燃料または燃料添加剤としてのその有用性に加え、新興の燃料電池産業における水素配給の問題に影響を与える可能性を有する。今日、燃料電池では水素の輸送および配給に関連した安全性の懸念が悩みの種となっている。ブタノールは、その水素含量において容易に改善可能であり、かつ、既存のガソリンスタンドによる、燃料電池または車両のいずれかで要求される純度での配給が可能である。
【００５７】
以下の定義および略語は、特許請求の範囲および明細書の解釈において用いられるものとする。
【００５８】
本明細書で用いられる「発明」または「本発明」という用語は、一般に、提示されるかまたは後に改良され捕捉される特許請求の範囲あるいは本明細書の中に記載される本発明のすべての実施形態に適用することを意味する。
【００５９】
「イソブタノール生合成経路」という用語は、イソブタノールを生成するための酵素経路を示す。好ましいイソブタノール生合成経路は、図１中に図示され、本明細書中に記載される。
【００６０】
「ＮＡＤＰＨ消費アッセイ」という用語は、（Ａｕｌａｂａｕｇｈら；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２９、２８２４−２８３０頁、１９９０年）に記載のように、ＫＡＲＩ共同因子、ＮＡＤＰＨの酵素反応からの消失の測定を含む、ＫＡＲＩ酵素の比活性を判定するための酵素アッセイを示す。
【００６１】
「ＫＡＲＩ」は、酵素ケトール酸レダクトイソメラーゼにおける略語である。
【００６２】
「アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ」および「ケトール酸レダクトイソメラーゼ」という用語は、同義的に用いられ、ＥＣ番号、ＥＣ１．１．１．８６（Ｅｎｚｙｍｅ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ １９９２年、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ））を有する酵素を示すことになる。ケトール酸レダクトイソメラーゼは、下記により十分に記載のように、（Ｓ）−アセトラクテートから２，３−ジヒドロキシイソバレレートへの反応を触媒する。これらの酵素は、限定はされないが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）登録番号ＮＣ＿０００９１３領域：３９５５９９３．．３９５７４６８、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）ジェンバンク登録番号ＮＣ＿００２５０５領域：１５７４４１．．１５８９２５、シュードモナス・エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、ジェンバンク登録番号ＮＣ＿００２５１６領域：５２７２４５５．．５２７３４７１、およびシュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）ジェンバンク登録番号ＮＣ＿００４１２９領域：６０１７３７９．．６０１８３９５を含む多数の供給源から入手可能である。
【００６３】
「アセトラクテートシンターゼ」という用語は、ピルベートからアセトラクテートおよびＣＯ２への変換を触媒する酵素を示す。アセトラクテートは２つの（Ｒ）−および（Ｓ）−立体異性体を有し、酵素には生体系により作製される（Ｓ）−異性体が好ましい。好ましいアセトラクテートシンターゼは、ＥＣ番号２．２．１．６９（Ｅｎｚｙｍｅ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ １９９２年、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ））で知られる。これらの酵素は、限定はされないが、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ジェンバンク番号：ＣＡＢ１５６１８、Ｚ９９１２２、それぞれＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）アミノ酸配列、ＮＣＢＩヌクレオチド配列）、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（ジェンバンク番号：ＡＡＡ２５０７９（配列番号２）、Ｍ７３８４２（配列番号１））、およびラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）（ジェンバンク番号：ＡＡＡ２５１６１、Ｌ１６９７５）を含む多数の供給源から入手可能である。
【００６４】
「アセトヒドロキシ酸デヒドラターゼ」という用語は、２，３−ジヒドロキシイソバレレートからα−ケトイソバレレートへの変換を触媒する酵素を示す。好ましいアセトヒドロキシ酸デヒドラターゼはＥＣ番号４．２．１．９で知られる。これらの酵素は、限定はされないが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ジェンバンク番号：ＹＰ＿０２６２４８（配列番号６）、ＮＣ＿０００９１３（配列番号５））、出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（ジェンバンク番号：ＮＰ＿０１２５５０、ＮＣ＿００１１４２）、メタノコッカス・マリパルディス（Ｍ．ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ）（ジェンバンク番号：ＣＡＦ２９８７４、ＢＸ９５７２１９）、および枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ジェンバンク番号：ＣＡＢ１４１０５、Ｚ９９１１５）を含む膨大な微生物から得られる。
【００６５】
「分岐鎖α−ケト酸デカルボキシラーゼ」という用語は、α−ケトイソバレレートからイソブチルアルデヒドおよびＣＯ２への変換を触媒する酵素を示す。好ましい分岐鎖α−ケト酸デカルボキシラーゼは、ＥＣ番号４．１．１．７２で知られ、限定はされないが、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）（ジェンバンク番号：ＡＡＳ４９１６６、ＡＹ５４８７６０；ＣＡＧ３４２２６（配列番号８）、ＡＪ７４６３６４、サルモネラ・ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）（ジェンバンク番号：ＮＰ＿４６１３４６、ＮＣ＿００３１９７）、およびクロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ジェンバンク番号：ＮＰ＿１４９１８９、ＮＣ＿００１９８８）を含む多数の供給源から得られる。
【００６６】
「分岐鎖アルコールデヒドロゲナーゼ」という用語は、イソブチルアルデヒドからイソブタノールへの変換を触媒する酵素を示す。好ましい分岐鎖アルコールデヒドロゲナーゼは、ＥＣ番号１．１．１．２６５で知られるが、他のアルコールデヒドロゲナーゼ（具体的にはＥＣ１．１．１．１または１．１．１．２）の下でも分類されうる。これらの酵素は、電子供与体としてＮＡＤＨ（還元ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）および／またはＮＡＤＰＨを用い、限定はされないが、出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（ジェンバンク番号：ＮＰ＿０１０６５６、ＮＣ＿００１１３６；ＮＰ＿０１４０５１、ＮＣ＿００１１４５）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ジェンバンク番号：ＮＰ＿４１７４８４（配列番号１０）、ＮＣ＿０００９１３（配列番号９））、およびクロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ジェンバンク番号：ＮＰ＿３４９８９２、ＮＣ＿００３０３０）を含む多数の供給源から得られる。
【００６７】
「分岐鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ」という用語は、電子受容体としてＮＡＤ＋（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）を用いたα−ケトイソバレレートからイソブチリル−ＣｏＡ（イソブチリル−補酵素Ａ）への変換を触媒する酵素を示す。好ましい分岐鎖ケト酸デヒドロゲナーゼはＥＣ番号１．２．４．４で知られる。これらの分岐鎖ケト酸デヒドロゲナーゼは４つのサブユニットからなり、すべてのサブユニット由来の配列は、限定はされないが、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ジェンバンク番号：ＣＡＢ１４３３６、Ｚ９９１１６；ＣＡＢ１４３３５、Ｚ９９１１６；ＣＡＢ１４３３４、Ｚ９９１１６；およびＣＡＢ１４３３７、Ｚ９９１１６）およびシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）（ジェンバンク番号：ＡＡＡ６５６１４、Ｍ５７６１３；ＡＡＡ６５６１５、Ｍ５７６１３；ＡＡＡ６５６１７、Ｍ５７６１３；およびＡＡＡ６５６１８、Ｍ５７６１３）を含む膨大な微生物から得られる。
【００６８】
「炭素基質」または「発酵性炭素基質」という用語は、本発明の宿主生物によって代謝可能な炭素源ならびに特に単糖、オリゴ糖、多糖、およびそれらの１炭素基質または混合物からなる群から選択される炭素源を示す。
【００６９】
「ｋｃａｔ」および「Ｋｍ」という用語は、当業者に既知であり、「Ｅｎｚｙｍｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ」、第２版（Ｆｅｒｓｔ；Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ：ＮＹ、１９８５年；９８−１２０頁）に記載されている。「代謝回転数」と称されることが多い「ｋｃａｔ」という用語は、単位時間当たりの活性部位当たりの産物に変換される基質分子の最大数または酵素が単位時間当たりに代謝回転する回数として定義される。ｋｃａｔ＝Ｖｍａｘ／［Ｅ］（式中、［Ｅ］は酵素濃度（Ｆｅｒｓｔ、上記）である。「全代謝回転」および「全代謝回転数」という用語は、ＫＡＲＩ酵素と基質の反応により形成される産物の量を示すように本明細書中で用いられる。
【００７０】
「触媒効率」という用語は、酵素のｋｃａｔ／ＫＭとして定義される。「触媒効率」は、基質に対する酵素の特異性を定量化するのに用いられる。
【００７１】
「比活性」という用語は、酵素単位が温度、ｐＨ、［Ｓ］などの特定の条件下で形成される産物のモル数／分として定義される場合、酵素単位／ｍｇのタンパク質を意味する。
【００７２】
「緩徐な」または「迅速な」という用語は、酵素活性に関して用いられる場合、酵素の標準に対する代謝回転数に関する。
【００７３】
「単離核酸分子」、「単離核酸断片」および「遺伝子コンストラクト」という用語は、同義的に用いられ、一本鎖または二本鎖であり、場合により合成、非天然または改変ヌクレオチド塩基を有するＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーを意味することになる。ＤＮＡのポリマーの形態での単離核酸断片は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡの１つ以上のセグメントからなりうる。
【００７４】
「遺伝子」という用語は、場合によりコード配列の上流（５’非コード配列）および下流（３’非コード配列）の調節配列を含む、特定のタンパク質として発現可能な核酸断片を示す。「天然遺伝子」は、それ自体の調節配列を有する天然に見出される遺伝子を示す。「キメラ遺伝子」は、天然遺伝子でない任意の遺伝子を示し、天然に見出されることのない調節およびコード配列を含む。したがって、キメラ遺伝子は、異なる供給源に由来する調節配列およびコード配列または同じ供給源に由来する調節配列およびコード配列を含みうるが、天然に見出されるものとは異なる様式で配列されている。「内因性遺伝子」は、生物のゲノム内のその天然の位置における天然遺伝子を示す。「外来」遺伝子は、通常は宿主生物内に見出されることはないが宿主生物に遺伝子導入によって導入される遺伝子を示す。外来遺伝子は、非天然の生物に導入される天然遺伝子またはキメラ遺伝子を含みうる。「トランス遺伝子」は、形質転換手順によりゲノムに導入されている遺伝子である。
【００７５】
本明細書で用いられる「コード配列」という用語は、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を示す。「適切な調節配列」は、上流（５’非コード配列）またはコード配列の下流（３’非コード配列）内に位置するヌクレオチド配列を示し、関連のコード配列の転写、ＲＮＡのプロセシングまたは安定性あるいは翻訳に作用する。調節配列は、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位およびステムループ構造を含みうる。
【００７６】
「プロモーター」という用語は、コード配列または機能ＲＮＡの発現を制御可能なＤＮＡ配列を示す。一般に、コード配列はプロモーター配列の３’側に位置する。プロモーターは、その全体として天然遺伝子に由来するか、または天然に見出される異なるプロモーターに由来する異なる要素から構成されるか、またはさらに合成ＤＮＡセグメントを含む場合がある。異なるプロモーターが異なる組織または細胞種における、あるいは発生の異なる段階で、あるいは異なる環境または生理的状態に応答して遺伝子の発現を誘導可能であることが当業者により理解されている。遺伝子における大部分の細胞種内でほぼ常に発現を誘導するプロモーターが一般に「構成プロモーター」と称される。さらに、ほとんどの場合、調節配列の正確な境界が完全に規定されていないことから、異なる長さのＤＮＡ断片が同一のプロモーター活性を有しうると理解されている。
【００７７】
「作動可能に連結される」という用語は、一方の機能が他方により影響を受けるような核酸配列の単一の核酸断片上への結合を示す。例えば、プロモーターが、そのコード配列の発現に効果を及ぼすことが可能である（すなわちコード配列がプロモーターの転写調節下にある）場合、コード配列に作動可能に連結されている。コード配列は調節配列にセンスまたはアンチセンス方向に作動可能に連結されうる。
【００７８】
本明細書で用いられる「発現」という用語は、本発明の核酸断片に由来するセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定な蓄積を示す。発現はｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳も示しうる。
【００７９】
本明細書で用いられる「形質転換」という用語は、核酸断片の宿主生物のゲノムへの転移を示し、遺伝的に安定な遺伝的形質をもたらす。形質転換された核酸断片を有する宿主生物は、「トランスジェニック」または「組換え」または「形質転換された」生物と称される。
【００８０】
「プラスミド」、「ベクター」および「カセット」という用語は、細胞の中央代謝の一部でない、遺伝子を保有することが多く、通常は環状二本鎖ＤＮＡ断片の形態である余分な染色体要素を示す。かかる要素は、任意の供給源に由来する線状または環状の一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡにおける自己複製配列、ゲノム結合（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ）配列、ファージまたはヌクレオチド配列である場合があり、ここでは多数のヌクレオチド配列が適切な３’未翻訳配列を有する選択された遺伝子産物におけるプロモーター断片およびＤＮＡ配列を細胞に導入可能な固有の作成物に連結されるかまたは組換えられている。「形質転換カセット」は、外来遺伝子を有し、かつ特定の宿主細胞の形質転換を促進する、外来遺伝子に加わる要素を有する特定のベクターを示す。「発現カセット」は、外来遺伝子を有し、かつ外来遺伝子に加え、外来宿主内でのその遺伝子の発現の増大を可能にする因子を有する特定のベクターを示す。
【００８１】
本明細書で用いられる「コドン縮重」という用語は、コードされたポリペプチドのアミノ酸配列に作用することなくヌクレオチド配列の変異を可能にする遺伝子コードにおける性質を示す。当業者は、所定のアミノ酸を特定するための、ヌクレオチドコドンの使用時に特定の宿主細胞により示される「コドンバイアス」について十分に理解している。したがって、宿主細胞内での改善された発現のために遺伝子を合成する場合、遺伝子をそのコドン使用の頻度が宿主細胞での好ましいコドンの使用の頻度に近づくように設計することが望ましい。
【００８２】
「コドンが最適化された」という用語は、様々な宿主の形質転換における核酸分子の遺伝子またはコード領域を示すとき、ＤＮＡによってコードされるポリペプチドを改変することなく宿主生物の典型的なコドンの使用を反映するための核酸分子の遺伝子またはコード領域におけるコドンの改変を示す。
【００８３】
本明細書中で用いられる標準の組換えＤＮＡおよび分子クローン化技術は当該技術分野で周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ、およびＭａｎｉａｔｉｓ、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）、１９８９年）（以降、「Ｍａｎｉａｔｉｓ」）；およびＳｉｌｈａｖｙら（Ｓｉｌｈａｖｙら、「Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）、１９８４年）；およびＡｕｓｕｂｅｌ Ｆ．Ｍ．ら、（Ａｕｓｕｂｅｌら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．およびＷｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅにより発行、１９８７年）による記載がなされている。
【００８４】
本発明は、植物由来の炭素源からイソブタノールを生成し、ブタノール生成における標準的な石油化学プロセスに関連した負の環境影響を回避する。一実施形態では、本発明は、炭水化物からイソブタノールへの変換における律速ステップとしてそれを解消することになる高い触媒効率を有するＫＡＲＩ酵素を同定するための方法を提供する。本方法は、下記に詳述される酵素の比活性を高めるための、当該技術分野で周知の方法を用いた、同定および適切なＫＡＲＩ酵素とその突然変異誘発を含む。
【００８５】
ケト酸レダクトイソメラーゼ（ＫＡＲＩ）酵素
アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼまたはケトール酸レダクトイソメラーゼ（ＫＡＲＩ；ＥＣ１．１．１．８６）は、分岐鎖アミノ酸の生合成における２つのステップを触媒し、その生合成における鍵酵素である。ＫＡＲＩは種々の生物内で見出され、種を通じたアミノ酸配列の比較によると、この酵素には、真菌および大部分の細菌内で見出される短い形態（クラスＩ）および植物に固有の長い形態（クラスＩＩ）という２つのタイプが存在することが示されている。
【００８６】
短い形態のＫＡＲＩは、典型的には３３０〜３４０個のアミノ酸残基を有する。長い形態ＫＡＲＩは、約４９０個のアミノ酸残基を有する。しかし、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）などの一部の細菌は、アミノ酸配列が植物内で見出されるものとかなり異なる場合、長い形態を有する。ＫＡＲＩはｉｌｖＣ遺伝子によりコードされ、最少培地中での大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）および他の細菌の成長のための必須酵素である。ＫＡＲＩは、共同因子としてＮＡＤＰＨを用い、その活性においてＭｇ＋＋などの二価カチオンを必要とする。ＫＡＲＩはまた、バリン経路内でのアセトラクテートの利用に加え、イソロイシン生成経路内でアセトヒドロキシブタノエートをジヒドロキシメチルペンタノエートに変換する。
【００８７】
２．６Åの分解能での大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＫＡＲＩ酵素の結晶構造が解明されている（Ｔｙａｇｉら、Ｐｔｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、１４、３０８９−３１００頁、２００５年）。この酵素は２つのドメインからなり、一方は他のピリジンヌクレオチド依存性のデヒドロゲナーゼ内で見出される場合に類似の混合α／β構造を有する。第２のドメインは主にα−ヘリカルであり、内部重複の強力な証拠を示す。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、およびホウレンソウのＫＡＲＩの活性部位の比較によると、酵素の活性部位内の大部分の残基が保存位置を占めることが示された。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＫＡＲＩがおそらくは有望な生物活性単位である四量体として結晶化された一方、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のＫＡＲＩ（Ａｈｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、３２８、５０５−５１５頁、２００３年）は十二量体を形成し、かつホウレンソウ由来の酵素は二量体を形成した。既知のＫＡＲＩは、アセトラクテートにおいて２ｓ−１（Ａｕｌａｂａｕｇｈら；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２９、２８２４−２８３０頁、１９９０年）または０．１２ｓ−１（Ｒａｎｅら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３３８、８３−８９頁、１９９７年）の代謝回転数（ｋｃａｔ）が報告された緩徐な酵素である。試験によると、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内でのイソロイシン−バリン生合成の遺伝子制御が緑膿菌（Ｐｓ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）内での場合と異なることが示されている（Ｍａｒｉｎｕｓら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、６３、５４７−５６頁、１９６９年）。
【００８８】
高活性ＫＡＲＩ酵素の同定および単離
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）よりも高い倍化速度を有する生物についての再検討が行われた。３種の微生物、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（ＰＡＯ１）、蛍光菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）（ＰＦ５）、およびコレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）（Ｎ１６９６１）が、Ｍ９最少培地中で成長される場合、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）よりも短い倍加時間を有することが同定された。ＫＡＲＩ酵素をコードする遺伝子がこれらの種の各々から単離され、コードされたタンパク質が発現され、部分精製された。高い倍化速度の生物から単離された酵素の比活性が、３４０ｎｍでのアセトラクテートからα，β−ジヒドロキシ−イソバレレートへの酵素的変換の間に共同因子ＮＡＤＰＨの消失を測定するＮＡＤＰＨ消費アッセイ法を用い、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＫＡＲＩのそれと比較された。活性はＮＡＤＰＨにおける６２２０Ｍ−１ｃｍ−１のモル吸光係数を用いて計算され、細胞抽出物中の全タンパク質の１ｍｇ当たり１分当たりに消費されるＮＡＤＰＨのμモルとして報告されている（ＡｕｌａｂａｕｇｈおよびＳｃｈｌｏｓｓ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２９、２８２４−２８３０頁、１９９０年を参照）。
【００８９】
本明細書中に記載のＮＡＤＰＨ消費アッセイに従い、精製タンパク質を用いて測定された、１．１μモル／分／ｍｇを超える比活性のＫＡＲＩを有するＫＡＲＩ酵素を提供することは本発明の目的である。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＫＡＲＩは緩徐な酵素であり、分岐鎖アミノ酸合成経路内で必須である。ＫＡＲＩ（ｉｌｖＣ）をコードする遺伝子は、細胞が高栄養培地中で成長する場合に停止されるが、最少培地中で成長される場合、高レベルで発現される（可溶性タンパク質の約１０％）（Ｓ．Ｅｐｅｌｂａｕｍら、上記）。
【００９０】
適切なＫＡＲＩ酵素の選択のプロセスは２つのアプローチを含んだ。第１は、自然の多様性の中で新規のＫＡＲＩを探索することである。かかる探索は、幅広く他の生物に由来する使用可能な酵素に対する相同体を当該技術分野で周知の技術を用いて単離することを含んだ。この探索は、生物が適切なＫＡＲＩを有する可能性が最も高いのは生物の倍加時間に基づく場合であるという仮定から示された。第２のアプローチは、強力な発現ベクターの作成、突然変異誘発およびＫＡＲＩコード配列の進化、また最終的には改善されたＫＡＲＩ活性を有する変異体の選択により、人工的な多様性を創出し、探索することを含んだ。
【００９１】
上記の方法を用い、ＫＡＲＩ酵素は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から単離されたＫＡＲＩ酵素（配列番号３３［大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２−ｉｌｖＣ］の活性よりも高い比活性を有する蛍光菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）（配列番号３５［ＰＡＯ１−ｉｌｖＣ］配列番号３６［ＰＦ５−ｉｌｖＣ］）およびコレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）（配列番号３４）から単離された。約５〜４０μモル／分／ｍｇの比活性が特に適切である場合、約１．１μモル／分／ｍｇを超える比活性を有するＫＡＲＩ酵素が本発明において好ましい。ＫＡＲＩの比活性が精製タンパク質を用いて測定され、かつ、ＮＡＤＰＨ消費アッセイ（Ａｕｌａｂａｕｇｈ、上記）の導入が２０℃〜２５℃（ここでは約２２．５℃が好ましい）、７．０〜８．０のｐＨ（ここでは約７．５のｐＨが好ましい）、また少なくとも約１０ｍＭのカリウムを有する緩衝液（ここでは少なくとも約１０ｍＭ〜約５０ｍＭが適切である）中で行われる場合が好ましい。本発明において有用な特定の酵素の一部が下の表２中に挙げられる。
【００９２】
【表２】
【００９３】
本発明は、本明細書中に記載の特定のシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）およびビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）酵素に限定されない。例えば、これらのポリペプチドは、類似の活性を有する相同体を見出すための基盤としてまたは突然変異誘発およびタンパク質進化における鋳型として用いられうる。
【００９４】
ＫＡＲＩ相同体の単離
本発明の核酸断片を用い、同じかまたは他の微生物種由来の相同タンパク質をコードする遺伝子の単離が可能である。配列依存性プロトコルを用いた相同ＫＡＲＩ遺伝子の単離は当該技術分野で周知である。配列依存性プロトコルの例として、限定はされないが、核酸ハイブリダイゼーションの方法や、核酸増幅技術、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Ｍｕｌｌｉｓら、米国特許第４，６８３，２０２号明細書）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、（Ｔａｂｏｒら、Ｐｒｏｃ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２、１０７４頁、１９８５年）または鎖置換増幅（ＳＤＡ）（Ｗａｌｋｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８９、３９２頁、１９９２年）の様々な使用により例示されるようなＤＮＡおよびＲＮＡ増幅の方法が挙げられる。
【００９５】
例えば、本発明のタンパク質またはポリペプチドに類似のものをコードする遺伝子であれば、本核酸断片の全部または一部をＤＮＡハイブリダイゼーションプローブとして用いることによって直接単離し、当業者に周知の方法を用いた任意の所望の細菌からのライブラリーのスクリーニングが可能である。本核酸配列に基づく特異的オリゴヌクレオチドプローブについては、当該技術分野で既知の方法による設計および合成が可能である（Ｍａｎｉａｔｉｓ、上記）。さらに、全配列を直接用い、使用可能なインビトロ転写系を用いてのランダムプライマーＤＮＡ標識、ニックトランスレーション、または末端標識技術、またはＲＮＡプローブなどの当業者に既知の方法によるＤＮＡプローブの合成が可能である。さらに、特異的プライマーの設計および使用により、本配列の一部または完全長の増幅が可能である。得られる増幅産物を増幅反応の間に直接標識するかまたは増幅反応後に標識し、またプローブとして用い、適切なストリンジェントな条件下での完全長ＤＮＡ断片の単離が可能である。
【００９６】
典型的には、ＰＣＲタイプの増幅技術では、プライマーは異なる配列を有し、互いに相補的でない。所望の試験条件によると、プライマーの配列は標的核酸の効率的かつ正確な複製をもたらすように設計される必要がある。ＰＣＲプライマーの設計方法は一般的であり、当該技術分野で周知であり、例として、Ｔｈｅｉｎら（Ｔｈｅｉｎら、「Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｐｒｏｂｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｄｉａｇｏｎｏｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ」、Ｋ．Ｅ．Ｄａｖｉｓ編、１９８６年、３３−５０頁、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（Ｈｅｒｎｄｏｎ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ））；およびＲｙｃｈｌｉｋ（Ｒｙｃｈｌｉｋ、１９９３年、Ｉｎ Ｗｈｉｔｅ、Ｂ．Ａ．（編）、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、第１５巻、３１−３９頁、「ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．（Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ））が挙げられる。
【００９７】
一般に本配列の２つの短いセグメントをポリメラーゼ連鎖反応プロトコルで用い、ＤＮＡまたはＲＮＡからの相同遺伝子をコードするより長い核酸断片の増幅が可能である。ポリメラーゼ連鎖反応はまた、クローン化核酸断片のライブラリー上で実施可能であり、ここでは一方のプライマーの配列が本核酸断片に由来し、かつ他方のプライマーの配列が微生物遺伝子をコードするｍＲＮＡ前駆体の３’末端に対するポリアデニル酸領域（ｔｒａｃｔ）の存在を利用する。
【００９８】
あるいは、第２のプライマー配列はクローン化ベクター由来の配列に基づく場合がある。例えば、当業者は、ＲＡＣＥプロトコルに従い（Ｆｒｏｈｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５、８９９８頁，１９８８年）、ＰＣＲを用いてｃＤＮＡを生成し、転写産物内の単一点と３’または５’末端の間の領域のコピーを増幅することができる。３’および５’方向に一致されたプライマーは本配列から設計されうる。市販の３’ＲＡＣＥまたは５’ＲＡＣＥシステム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ））を用い、特定の３’または５’ｃＤＮＡ断片が単離されうる（Ｏｈａｒａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６、５６７３頁、１９８９年；およびＬｏｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４３、２１７−２２０頁、１９８９年）。
【００９９】
あるいは、本配列は、相同体を同定するためのハイブリダイゼーション試薬として用いられうる。核酸ハイブリダイゼーション試験の基本要素は、プローブ、目的の遺伝子または遺伝子断片を含有すると思われる試料、および特異的なハイブリダイゼーション法を含む。本発明のプローブは、典型的には検出されるべき核酸配列に相補的な一本鎖核酸配列である。プローブは、検出されるべき核酸配列に対して「ハイブリダイズ可能」である。プローブ長は５塩基〜数万の塩基分変化する可能性があり、実施されるべき特定の試験に依存することになる。典型的には、約１５塩基〜約３０塩基のプローブ長が適切である。検出されるべき核酸配列に対する相補性が求められるプローブ分子は一部に限られる。さらに、プローブと標的配列の間の相補性は完全である必要はない。ハイブリダイゼーションは不完全に相補的な分子間で特に生じる結果として、ハイブリダイズされた領域内の塩基の特定の画分は適切な相補的塩基と対を形成しない。
【０１００】
ハイブリダイゼーション法は十分に確立されている。典型的には、プローブおよび試料は、核酸ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で混合されなければならない。これは、適切な濃度および温度条件下、無機塩または有機塩の存在下でのプローブと試料との接触を含む。プローブと試料核酸は、プローブと試料核酸の間で考えられる任意のハイブリダイゼーションが生じうるほど十分に長期間接触状態でなければならない。混合物中のプローブまたは標的の濃度は、ハイブリダイゼーションの発生に必要な時間を決定することになる。プローブまたは標的の濃度が高まると、必要なハイブリダイゼーションのインキュベーション時間が短縮される。場合により、カオトロピック剤が添加されうる。カオトロピック剤は、ヌクレアーゼ活性の阻害により核酸を安定化させる。さらに、カオトロピック剤は、室温での短いオリゴヌクレオチドプローブの感度が高くストリンジェントなハイブリダイゼーションを可能にする（Ｖａｎ Ｎｅｓｓら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９、５１４３−５１５１頁、１９９１年）。適切なカオトロピック剤は、特に、塩化グアニジウム、チオシアン酸グアニジン、チオシアン酸ナトリウム、テトラクロロ酢酸リチウム（ｌｉｔｈｉｕｍ ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏａｃｅｔａｔｅ）、過塩素酸ナトリウム、テトラクロロ酢酸ルビジウム（ｒｕｂｉｄｉｕｍ ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏａｃｅｔａｔｅ）、ヨウ化カリウム、およびトリフルオロ酢酸セシウムを含む。典型的には、カオトロピック剤は約３Ｍの最終濃度で存在することになる。必要に応じて、ホルムアミドをハイブリダイゼーション混合物に典型的には３０〜５０％（ｖ／ｖ）添加できる。
【０１０１】
様々なハイブリダイゼーション溶液が用いられうる。典型的には、これらは極性有機溶媒の約２０〜６０％容量、好ましくは３０％を含有する。一般的なハイブリダイゼーション溶液では、約３０〜５０％ｖ／ｖのホルムアミド、約０．１５〜１．０Ｍの塩化ナトリウム、約０．０５〜０．１Ｍの緩衝液、例えばクエン酸ナトリウム、トリス−ＨＣｌ、ＰＩＰＥＳまたはＨＥＰＥＳ（ｐＨ範囲が約６〜９）、約０．０５〜０．２％の洗剤、例えばドデシル硫酸ナトリウム、または０．５〜２０ｍＭのＥＤＴＡ、ＦＩＣＯＬＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｉｎｃ．）（約３００〜５００キロダルトン）、ポリビニルピロリドン（約２５０〜５００キロダルトン）、および血清アルブミンが用いられる。また典型的なハイブリダイゼーション溶液中に、約０．１〜５ｍｇ／ｍＬの未標識担体核酸、断片化核ＤＮＡ、例えば子牛胸腺またはサケ精液ＤＮＡ、または酵母ＲＮＡ、および場合により約０．５〜２％ｗ／ｖのグリシンが含有されることになる。また他の添加剤として、例えば、種々の極性水溶性または膨潤剤（ｓｗｅｌｌａｂｌｅ ａｇｅｎｔｓ）を含む体積排除剤（ｖｏｌｕｍｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ａｇｅｎｔ）、例えばポリエチレングリコール、アニオン性ポリマー、例えばポリアクリレートまたはポリメチルアクリレート、およびアニオン性糖ポリマー、例えば硫酸デキストランが含有されうる。
【０１０２】
核酸ハイブリダイゼーションは、種々のアッセイ形式に適用可能である。最も適切なものの１つがサンドイッチアッセイ形式である。サンドイッチアッセイは、非変性条件下でのハイブリダイゼーションに特に適合可能である。サンドイッチ型アッセイの主要な要素は固体支持体である。固体支持体は、未標識でありかつ配列の一部に相補的である固定化核酸プローブをそれに吸着または共有結合している。
【０１０３】
イソブタノール生合成経路
本発明の高活性ＫＡＲＩ酵素の主な一用途が、イソブタノールの生成にとって有用な代謝経路内の一因子となる。これらの経路の数は解明され、特徴づけられている。
【０１０４】
炭水化物を使用する微生物が、中央代謝経路としてエムデン・マイヤーホフ・パルナス（ＥＭＰ）経路、エントナー−ドドロフ経路およびペントースリン酸回路を用い、成長および維持のためにエネルギーおよび細胞前駆体を生成する。これらの経路は、共通に中間体のグリセルアルデヒド−３−リン酸を有し、最終的にピルベートが直接にかまたはＥＭＰ経路と相まって形成される。次いで、ピルベートが種々の手段を介してアセチル−補酵素Ａ（アセチル−ＣｏＡ）に形質転換される。アセチル−ＣｏＡは、例えば脂肪酸、アミノ酸および二次代謝物質の生成における鍵中間体としての機能を果たす。糖のピルベートへの変換の組み合わされた反応により、エネルギー（例えばアデノシン−５’−３リン酸、ＡＴＰ）および還元等価物（例えば還元されたニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、ＮＡＤＨ、および還元されたニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、ＮＡＤＰＨ）が生成される。ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨはそれらの酸化形態（各々、ＮＡＤ＋およびＮＡＤＰ＋）に再循環されなければならない。無機の電子受容体（例えばＯ２、ＮＯ３−およびＳＯ４２−）の存在下で還元等価物を用いるとエネルギープールが増大しうるか、あるいは還元された炭素副産物が形成されうる。
【０１０５】
図１に示されるように、組換え微生物を用い、炭水化物源からイソブタノールを生成するための４つの有望な経路が存在する。炭水化物からイソブタノールへの変換のためのすべての有望な経路は、所有者共通の（ｃｏｍｍｏｎｌｙ ｏｗｎｅｄ）米国特許出願第１１／５８６３１５号明細書（参照により本明細書中に援用される）中に記載されている。
【０１０６】
ピルベートからイソブタノールへの変換における好ましい経路は、酵素ステップ「ａ」、「ｂ」、「ｃ」、「ｄ」、および「ｅ」からなり（図１）、かつ
ａ）例えばアセトラクテートシンターゼにより触媒される、ピルベートからアセトラクテート
ｂ）例えばアセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼにより触媒される、（Ｓ）−アセトラクテートから２，３−ジヒドロキシイソバレレート
ｃ）例えばアセトヒドロキシ酸デヒドラターゼにより触媒される、２，３−ジヒドロキシイソバレレートからα−ケトイソバレレート
ｄ）例えば分岐鎖ケト酸デカルボキシラーゼにより触媒される、α−ケトイソバレレートからイソブチルアルデヒド、および
ｅ）例えば分岐鎖アルコールデヒドロゲナーゼにより触媒される、イソブチルアルデヒドからイソブタノール
といった基質から産物への変換を含む。
【０１０７】
この経路は、バリン生合成（ピルベートからα−ケトイソバレレートへ）およびバリン異化（α−ケトイソバレレートからイソブタノールへ）における十分に特徴づけられた経路に関与する酵素の組み合わせである。多数のバリン生合成酵素がまたイソロイシン生合成経路内の類似反応を触媒することから、基質特異性は遺伝子源の選択における主要な検討事項である。こういう理由から、アセトラクテートシンターゼ酵素における目的の主な遺伝子はバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（ａｌｓＳ）およびクレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）（ｂｕｄＢ）から得られるものである。これらの特定のアセトラクテートシンターゼは、これらの生物内でのブタンジオール発酵に関与し、ピルベートにおいてはケトブチレートよりも高い親和性を示すことで知られる（Ｇｏｌｌｏｐら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２、３４４４−３４４９頁、１９９０年；およびＨｏｌｔｚｃｌａｗら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１２１、９１７−９２２頁、１９７５年）。第２および第３の経路ステップはそれぞれアセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼおよびデヒドラターゼにより触媒される。これらの酵素は多数の供給源、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から特徴づけられている（Ｃｈｕｎｄｕｒｕら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８、４８６−４９３頁、１９８９年；およびＦｌｉｎｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８、１４７３２−１４７４２頁、１９９３年）。好ましいイソブタノール経路の最終の２つのステップは酵母内で生じることで知られており、そこでは窒素源としてバリンが用いられ、プロセス内でイソブタノールが分泌されうる。α−ケトイソバレレートは、多数のケト酸デカルボキシラーゼ酵素、例えばピルビン酸デカルボキシラーゼによりイソブチルアルデヒドに変換されうる。ピルベートのイソブタノール生成からの方向の誤り（ｍｉｓｄｉｒｅｃｔｉｏｎ）を阻止するには、ピルベートに対する親和性が低下したデカルボキシラーゼが望ましい。これまで、当該技術分野で既知のかかる酵素が２種存在する（Ｓｍｉｔら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７１、３０３−３１１頁、２００５年；およびｄｅ ｌａ Ｐｌａｚａら、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．２３８、３６７−３７４頁、２００４年）。両酵素はラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）の株に由来し、ピルベートよりもケトイソバレレートにおける方が５０〜２００倍好ましい。最後に、多数のアルデヒドレダクターゼが酵母内で同定されており、その多くは基質特異性の重複を有する。アセトアルデヒドよりも分岐鎖基質の方が好ましいことで知られるものには、限定はされないが、アルコールデヒドロゲナーゼＶＩ（ＡＤＨ６）およびＹｐｒ１ｐが含まれ（Ｌａｒｒｏｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３６１、１６３−１７２頁、２００２年；およびＦｏｒｄら、Ｙｅａｓｔ １９、１０８７−１０９６頁、２００２年）、これら双方はＮＡＤＰＨを電子供与体として用いる。分岐鎖基質とともに活性を示すＮＡＤＰＨ依存性のレダクターゼＹｑｈＤはまた、最近、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内で同定されている（Ｓｕｌｚｅｎｂａｃｈｅｒら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４２、４８９−５０２頁、２００４年）。
【０１０８】
イソブタノール生成における他の有望な経路の中の２つはまた、「ａ」、「ｂ」および「ｃ」の３つの初期ステップを有する。一方の経路は、酵素ステップ「ａ」、「ｂ」、「ｃ」、「ｆ」、「ｇ」、「ｅ」からなる。ステップ「ｆ」は、ＥＣ番号１．２．４．４を有する「分岐鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ」を有する。ステップ「ｇ」はＥＣ番号１．２．１．１０および１．２．１．５７を有する「アシル化アルデヒドデヒドロゲナーゼ」を有し、さらにステップ「ｅ」は「分岐鎖アルコールデヒドロゲナーゼ」を有する。他方の有望な経路は、ステップ「ａ」、「ｂ」、「ｃ」、「ｈ」、「ｉ」、「ｊ」、「ｅ」からなる。「トランスアミナーゼ」という用語（ステップ「ｈ」）は、ＥＣ番号２．６．１．４２および２．６．１．６６を有する。ステップ「ｈ」はＥＣ番号１．４．１．８および１．４．１．９を有する「バリンデヒドロゲナーゼ」からなるかまたはステップ「ｉ」はＥＣ番号４．１．１．１４を有する「バリンデカルボキシラーゼ」からなる。最終的に、ステップ「ｊ」ではＥＣ番号２．６．１．１８を有する「ωトランスアミナーゼ」を用いてイソブチルアルデヒドが生成され、それはステップ「ｅ」で還元され、イソブタノールが生成されることになる。ピルベートをイソブタノールに変換するためのすべての有望な経路は図１に示される。
【０１０９】
さらに、多数の生物はブチリル−ＣｏＡ中間体を介してブチレートおよび／またはブタノールを生成することで知られている（Ｄｕｅｒｒｅら、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．１７、２５１−２６２頁、１９９５年；およびＡｂｂａｄ−Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １４２、１１４９−１１５８頁、１９９６年）。したがって、これらの生物内でのイソブタノール生成は、図１中に示されるステップ「ｋ」、「ｇ」および「ｅ」を用いて生じることになる。ステップ「ｋ」は、ＥＣ番号５．４．９９．１３を有する「イソブチリル−ＣｏＡムターゼ」を用いることになる。入れ子構造（ｎｅｓｔ）のステップは、ＥＣ番号１．２．１．１０および１．２．１．５７を有する「アシル化アルデヒドデヒドロゲナーゼ」を用いてイソブチルアルデヒドを生成し、それに続く酵素ステップ「ｅ」によりイソブタノールを生成することを含む。これらの全経路は、所有者共通の米国特許出願第１１／５８６３１５号明細書（その全体が参照により本明細書中に援用される）中に十分に記載されている。
【０１１０】
イソブタノール生成のための微生物宿主
イソブタノール生成のための微生物宿主は、細菌、シアノバクテリア、糸状真菌および酵母から選択されうる。イソブタノール生成に用いられる微生物宿主であれば、収量がブタノールの毒性に制限されないようにイソブタノールに耐性がある必要がある。イソブタノールの高い滴定レベルで代謝活性のある微生物については当該技術分野で周知である。ブタノールに耐性がある突然変異体がソルベントジェニック（ｓｏｌｖｅｎｔｏｇｅｎｉｃ）のクロストリジア（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）から単離されているが、他の潜在的に有用な細菌株のブタノール耐性に関して入手可能な情報はほとんどない。細菌におけるアルコール耐性の比較についての大部分の研究によると、ブタノールがエタノールよりも毒性が高いことが示唆されている（ｄｅ Ｃａｖａｌｈｏら、Ｍｉｃｒｏｓｃ．Ｒｅｓ．Ｔｅｃｈ． ６４：２１５−２２頁（２００４年）およびＫａｂｅｌｉｔｚら、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ． ２２０：２２３−２２７頁（２００３年））。Ｔｏｍａｓら（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８６：２００６−２０１８頁（２００４年））は、クロストリジウム・アセトバティリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）における発酵の間での１−ブタノールの収量がブタノール毒性により制限されうることを報告している。クロストリジウム・アセトバティリカムに対する１−ブタノールの主な効果は膜機能の破壊である（Ｈｅｒｍａｎｎら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ５０：１２３８−１２４３頁（１９８５年））。
【０１１１】
イソブタノールの生成のために選択される微生物宿主であれば、イソブタノールに耐性があり、炭水化物をイソブタノールに変換できる必要がある。適切な微生物宿主の選択における基準は、イソブタノールに対する内在的耐性、高いグルコース利用率、遺伝子操作のための遺伝子ツールの利用可能性、および安定的な染色体変化をもたらす能力を含む。
【０１１２】
イソブタノールに対する耐性を有する適切な宿主株が、株の本質的耐性に基づくスクリーニングにより同定されうる。イソブタノールに対する微生物の本質的耐性は、最少培地内で成長する場合、成長率の５０％の阻害（ＩＣ５０）を担うイソブタノールの濃度を判定することにより測定されうる。ＩＣ５０値は当該技術分野で既知の方法を用いて判定可能である。例えば、目的の微生物は様々な量のイソブタノールの存在下で成長可能であり、成長率が６００ナノメーター（ＯＤ６００）での光学密度の測定により監視可能である。倍加時間は、成長曲線の対数部分から計算可能であり、成長率の測定値として使用可能である。成長の５０％の阻害をもたらすイソブタノールの濃度は、成長の阻害率パーセント対イソブタノール濃度のグラフから判定可能である。好ましくは、宿主株は約０．５％を超えるイソブタノールにおいてＩＣ５０を有する必要がある。
【０１１３】
またイソブタノール生成のための微生物宿主であれば、グルコースを高率で利用する必要がある。大部分の微生物は炭水化物を利用可能である。しかし、特定の環境微生物は炭水化物を高効率で利用できず、従って適切な宿主とならないだろう。
【０１１４】
宿主を遺伝的に改良する能力は組換え微生物の生成にとって必須である。遺伝子導入技術は、エレクトロポレーション、複合、形質導入または自然形質転換によるものでもよい。広範囲の宿主との複合プラスミドおよび薬剤耐性マーカーが使用可能である。クローニングベクターは、宿主生物内で機能しうる抗生物質耐性マーカーの性質に基づいて宿主生物に適合される。
【０１１５】
微生物宿主はまた、様々な遺伝子の欠失により、炭素の流れに対して競合する経路を不活性化するために操作される必要がある。これには、直接的不活性化に対するトランスポゾンまたは染色体組み込みベクターのいずれかの可用性が必要である。さらに、生成宿主は、イソブタノールに対する内在的耐性を改善するための突然変異が得られうるように化学的突然変異原に従う必要がある。
【０１１６】
上記の基準に基づき、イソブタノールの生成に適する微生物宿主は、限定はされないが、クロストリジウム属、ザイモモナス属、エシェリキア属、サルモネラ属、ロドコッカス属、シュードモナス属、バチルス属、ビブリオ属、乳酸桿菌属、腸球菌属、アルカリゲネス属、クレブシエラ属、パエニバチルス属、アースロバクター属、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、ピキア属、カンジダ属、ハンセヌラ属およびサッカロミセス属のメンバーを含む。好ましい宿主は、大腸菌、アルカリゲネス・ユートロファス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、パエニバチルス・マセランス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｃｅｒａｎｓ）、ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）、プランタラム菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）、エンテロコッカス・ガリナリウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｌｌｉｎａｒｉｕｍ）、エンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、枯草菌およびサッカロミケスセレビシエを含む。
【０１１７】
生成宿主の作成
イソブタノールに対する発酵性炭素基質の変換における酵素経路をコードする必須遺伝子を有する組換え生物が、当該技術分野で周知の技術を用いて作成可能である。本発明では、本発明のイソブタノール生合成経路の１つの酵素、例えばアセトラクテートシンターゼ、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ、アセトヒドロキシ酸デヒドラターゼ、分岐鎖α−ケト酸デカルボキシラーゼ、および分岐鎖アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が、上記のように様々な供給源から単離されうる。
【０１１８】
細菌ゲノムから所望の遺伝子を得る方法については一般的であり、かつ分子生物学の技術分野で周知である。例えば、遺伝子の配列が既知である場合、適切なゲノムライブラリーが制限エンドヌクレアーゼ消化により作成され、所望の遺伝子配列に相補的なプローブを用いてスクリーニングされうる。一旦、配列が単離されると、ＤＮＡはポリメラーゼ連鎖反応（米国特許第４，６８３，２０２号明細書）などの標準プライマーに特異的な増幅方法を用いて増幅され、適切なベクターを用いる形質転換に適する量のＤＮＡが得られうる。異種宿主内での発現におけるコドン最適化のためのツールは容易に利用可能である。利用可能なコドン最適化のためのツールには、宿主生物のＧＣ含量に基づくものもある。
【０１１９】
一旦、関連経路の遺伝子が同定されかつ単離されると、それらは当該技術分野で周知の手段により適切な発現宿主に形質転換されうる。種々の宿主細胞の形質転換にとって有用なベクターまたはカセットについては一般的であり、ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ（登録商標）（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）、およびＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）などの企業から市販されている。典型的には、ベクターまたはカセットは、関連遺伝子の転写および翻訳を誘導する配列、選択可能マーカー、および自己複製または染色体組み込みを可能にする配列を有する。適切なベクターは、転写開始制御を有する遺伝子の５’領域および転写終結を制御するＤＮＡ断片の３’領域を含む。両方の制御領域は形質転換された宿主細胞に対して相同な遺伝子から誘導されうるが、かかる制御領域が生成宿主として選択される特定の種に対して天然でない遺伝子からも誘導されることが理解されるべきである。
【０１２０】
所望の宿主細胞内でのコード領域の関連経路の発現を駆動するのに有用な開始制御領域またはプロモーターについては極めて多数存在し、当業者には知られている。仮想的には、これらの遺伝的因子を駆動可能な任意のプロモーターは、本発明に適し、それは、限定はされないが、ＣＹＣ１、ＨＩＳ３、ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＡＤＨ１、ＰＧＫ、ＰＨＯ５、ＧＡＰＤＨ、ＡＤＣ１、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＥＮＯ、ＴＰＩ（サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）内での発現に有用）；ＡＯＸ１（ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）内での発現に有用）；およびｌａｃ、ａｒａ、ｔｅｔ、ｔｒｐ、ｌＰＬ、ｌＰＲ、Ｔ７、ｔａｃ、およびｔｒｃ（大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、およびシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）内での発現に有用）、ならびに枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、およびパエニバチルス・マセランス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｃｅｒａｎｓ）内での発現に有用なａｍｙ、ａｐｒ、ｎｐｒプロモーターおよび様々なファージプロモーターを含む。
【０１２１】
終結制御領域についても好ましい宿主に対して天然の様々な遺伝子から誘導されうる。場合により終結部位は不要でありうるが、含められる場合が最も好ましい。
【０１２２】
特定のベクターが広範囲の宿主細菌内で複製可能であり、かつ複合により導入可能である。ｐＲＫ４０４および３つの関連ベクター：ｐＲＫ４３７、ｐＲＫ４４２、およびｐＲＫ４４２（Ｈ）の完全でかつアノテートされた配列が利用可能である。これらの誘導体はグラム陰性菌における遺伝子操作にとって有用なツールであることが判明している（Ｓｃｏｔｔら、Ｐｌａｓｍｉｄ ５０：７４−７９頁（２００３年））。広範な宿主範囲のＩｎｃ Ｐ４プラスミドＲＳＦ１０１０における数種のプラスミド誘導体についても、グラム陰性菌の範囲内で機能しうるプロモーターとともに利用可能である。プラスミドｐＡＹＣ３６およびｐＡＹＣ３７が複数のクローニング部位とともに活性プロモーターを有し、グラム陰性菌内での異種の遺伝子発現が可能である。
【０１２３】
染色体遺伝子の置換ツールもまた幅広く利用可能である。例えば、広範な宿主範囲のレプリコンｐＷＶ１０１の感熱性の変異体を改良し、遺伝子置換をグラム陽性菌の範囲内で有効にするのに用いられうるプラスミドｐＶＥ６００２が作成されている（Ｍａｇｕｉｎら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７４：５６３３−５６３８頁（１９９２年））。さらに、インビトロでのトランスポゾンは、ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ（登録商標）などの商業的供給源由来の種々のゲノム内でランダム突然変異をもたらすのに使用可能である。
【０１２４】
様々な好ましい微生物宿主内でのイソブタノール生合成経路の発現は下記にさらに詳細に説明される。
【０１２５】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内でのイソブタノール生合成経路の発現
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の形質転換にとって有用なベクターまたはカセットは、一般的であり、上掲の企業から市販されている。例えば、イソブタノール生合成経路の遺伝子は、様々な供給源から単離され、修飾ｐＵＣ１９ベクターにクローン化され、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＮＭ５２２に形質転換されうる。
【０１２６】
ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）内でのイソブタノール生合成経路の発現
限定はされないがｐＲｈＢＲ１７およびｐＤＡ７１を含むロドコッカス・エリスロポリス（Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）内での発現においては、一連の大腸菌−ロドコッカスのシャトルベクターが使用可能である（Ｋｏｓｔｉｃｈｋａら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ６２：６１−６８頁（２００３年））。さらに、一連のプロモーターが、ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）内での異種の遺伝子発現において使用可能である（Ｎａｋａｓｈｉｍａら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７０、５５５７−５５６８頁、２００４年およびＴａｏら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６８、３４６−３５４頁、２００５年）。ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）内での染色体遺伝子の標的遺伝子破壊は、Ｔａｏら、上記およびＢｒａｎｓら（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６６、２０２９−２０３６頁、２０００年）に記載の方法を用いて作成されうる。
【０１２７】
上記のイソブタノールの生成において必要とされる異種遺伝子は、最初にｐＤＡ７１またはｐＲｈＢＲ７１にクローニングされ、大腸菌に形質転換されうる。次いでベクターは、Ｋｏｓｔｉｃｈｋａら、上記に記載のようにエレクトロポレーションによりロドコッカス・エリスロポリスに形質転換されうる。組換え体は、グルコースを含有する合成培地内で成長され、それに続いてイソブタノールの生成が当該技術分野で既知の方法を用いて行われうる。
【０１２８】
枯草菌（Ｂ．Ｓｕｂｔｉｌｉｓ）内でのイソブタノール生合成経路の発現
枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）内での遺伝子発現および突然変異の作成のための方法もまた当該技術分野で周知である。例えば、イソブタノール生合成経路の遺伝子はｍａｙｂｅ様々な供給源から単離され、修飾ｐＵＣ１９ベクターにクローン化され、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＥ１０１０に形質転換されうる。さらに、イソブタノール生合成経路の５種の遺伝子は、発現のために２つのオペロンに分離されうる。経路の３種の遺伝子（ｂｕｂＢ、ｉｌｖＤ、およびｋｉｖＤ）は、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＥ１０１０の染色体に組み込まれうる（Ｐａｙｎｅら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７３、２２７８−２２８２頁、１９９１年）。残存する２種の遺伝子（ｉｌｖＣおよびｂｄｈＢ）は、発現ベクターにクローン化され、組み込まれたイソブタノール遺伝子を有するバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）株に形質転換されうる。
【０１２９】
バチルス・リケニホルムス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）内でのイソブタノール生合成経路の発現
枯草菌内で複製するプラスミドおよびシャトルベクターの大部分を用い、プロトプラスト形質転換またはエレクトロポレーションのいずれかによりバチルス・リケニフォルミスの形質転換が可能である。イソブタノールの生成において必要とされる遺伝子をプラスミドのｐＢＥ２０またはｐＢＥ６０誘導体にクローニング可能である（Ｎａｇａｒａｊａｎら、Ｇｅｎｅ １１４：１２１−１２６頁（１９９２年））。バチルス・リケニフォルミスを形質転換するための方法が当該技術分野で既知である（Ｆｌｅｍｉｎｇら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、６１：３７７５−３７８０頁（１９９５年））。枯草菌内での発現のために作製されたプラスミドをバチルス・リケニフォルミスに形質転換することで、イソブタノールを生成する組換え微生物宿主の生成が可能である。
【０１３０】
パエニバチルス・マセランス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｃｅｒａｎｓ）内でのイソブタノール生合成経路の発現
プラスミドを、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）内での発現にて記載のように作製し、それを用いてパエニバチルス・マセランスをプロトプラスト形質転換により形質転換し、イソブタノールを生成する組換え微生物宿主を生成することが可能である。
【０１３１】
アルカリゲネス・ユートロファス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）（ラルストニア・ユートロファス（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ））内でのイソブタノール生合成経路の発現
アルカリゲネス・ユートロファス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）内での遺伝子発現および突然変異の作成のための方法は当該技術分野で既知である（Ｔａｇｈａｖｉら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、６０、３５８５−３５９１頁、１９９４年）。イソブタノール生合成経路における遺伝子は、上記の広宿主域ベクターのいずれか内でクローン化され、またエレクトロポレートされ、イソブタノールを生成する組み換え体の作成が可能である。アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）内のポリ（ヒドロキシブタノエート）経路は詳述されており、アルカリゲネス・ユートロファス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）ゲノムを修飾するための種々の遺伝子技術は既知であり、それらのツールはイソブタノール生合成経路の改変に適用されうる。
【０１３２】
シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）内でのイソブタノール生合成経路の発現
シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）内での遺伝子発現のための方法は当該技術分野で既知である（例えば、Ｂｅｎ−Ｂａｓｓａｔら、米国特許第６，５８６，２２９号明細書（参照により本明細書中に援用される））。ブタノール経路遺伝子はｐＰＣＵ１８に挿入され、このライゲートされたＤＮＡはエレクトロコンピテントなシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）ＤＯＴ−Ｔ１ Ｃ５ａＡＲ１細胞にエレクトロポレートされ、イソブタノールを生成する組み換え体の作成が可能である。
【０１３３】
サッカロミセス・セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）内でのイソブタノール生合成経路の発現
サッカロミセス・セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）内での遺伝子発現のための方法は当該技術分野で既知である（例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１９４巻、「Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｐａｒｔ Ａ、２００４年、Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ ＧｕｔｈｒｉｅおよびＧｅｒａｌｄ Ｒ．Ｆｉｎｋ編、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ））。酵母内での遺伝子の発現は、典型的にはプロモーター、次いで目的の遺伝子、および転写ターミネーターが必要である。多数の酵母プロモーターは、限定はされないが構成プロモーターＦＢＡ、ＧＰＤ、ＡＤＨ１、およびＧＰＭと、誘導プロモーターＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、およびＣＵＰ１を含む、イソブタノール生合成経路をコードする遺伝子における発現カセットの作成において用いられうる。適切な転写ターミネーターは、限定はされないが、ＦＢＡｔ、ＧＰＤｔ、ＧＰＭｔ、ＥＲＧ１０ｔ、ＧＡＬ１ｔ、ＣＹＣ１、およびＡＤＨ１を含む。例えば、適切なプロモーター、転写ターミネーター、およびイソブタノール生合成経路の遺伝子は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）−酵母シャトルベクターにクローン化されうる。
【０１３４】
ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）内でのイソブタノール生合成経路の発現
乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属はラクトバチルス目（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓ）の科に属し、かつ枯草菌および連鎖球菌の形質転換で用いられる多数のプラスミドおよびベクターが乳酸桿菌において用いられうる。適切なベクターの非限定例には、ｐＡＭβ１およびその誘導体（Ｒｅｎａｕｌｔら、Ｇｅｎｅ １８３：１７５−１８２頁（１９９６年）；およびＯ’Ｓｕｌｌｉｖａｎら、Ｇｅｎｅ １３７：２２７−２３１頁（１９９３年））；ｐＭＢＢ１およびｐＨＷ８００、ｐＭＢＢ１の誘導体（Ｗｙｃｋｏｆｆら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６２：１４８１−１４８６頁（１９９６年））；ｐＭＧ１、複合プラスミド（Ｔａｎｉｍｏｔｏら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４：５８００−５８０４頁（２００２年））；ｐＮＺ９５２０（Ｋｌｅｅｒｅｂｅｚｅｍら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３：４５８１−４５８４頁（１９９７年））；ｐＡＭ４０１（Ｆｕｊｉｍｏｔｏら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６７：１２６２−１２６７頁（２００１年））；ならびにｐＡＴ３９２（Ａｒｔｈｕｒら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３８：１８９９−１９０３頁（１９９４年））が含まれる。プランタラム菌由来の数種のプラスミドが報告されている（ｖａｎ Ｋｒａｎｅｎｂｕｒｇら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７１：１２２３−１２３０頁（２００５年））。
【０１３５】
様々な腸球菌属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）種（フェシウム菌（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）、エンテロコッカス・ガリナラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｉｕｍ）、およびフェカリス菌（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ））内でのイソブタノール生合成経路の発現
腸球菌属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属はラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓ）科に属し、乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）、桿菌（Ｂａｃｉｌｌｉ）および連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）種の形質転換において用いられる多数のプラスミドおよびベクターは腸球菌属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）種において用いられうる。適切なベクターの非限定例として、ｐＡＭβ１およびその誘導体（Ｒｅｎａｕｌｔら、Ｇｅｎｅ １８３、１７５−１８２頁、１９９６年；およびＯ’Ｓｕｌｌｉｖａｎら、Ｇｅｎｅ １３７、２２７−２３１頁、１９９３年）；ｐＭＢＢ１およびｐＨＷ８００、ｐＭＢＢ１の誘導体（Ｗｙｃｋｏｆｆら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６２、１４８１−１４８６頁、１９９６年）；接合性プラスミドｐＭＧ１（Ｔａｎｉｍｏｔｏら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４、５８００−５８０４頁、２００２年）；ｐＮＺ９５２０（Ｋｌｅｅｒｅｂｅｚｅｍら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３、４５８１−４５８４頁、１９９７年）；ｐＡＭ４０１（Ｆｕｊｉｍｏｔｏら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６７、１２６２−１２６７頁、２００１年）；およびｐＡＴ３９２（Ａｒｔｈｕｒら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３８、１８９９−１９０３頁、１９９４年）が挙げられる。ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）由来のｎｉｓＡ遺伝子を用いたエンテロコッカス・フェカーリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）における発現ベクターも用いられうる（エイケンバウム（Ｅｉｃｈｅｎｂａｕｍ）ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ６４：２７６３−２７６９頁（１９９８年））。さらに、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）の染色体における遺伝子置換用のベクターが用いられうる（Ｎａｌｌａａｐａｒｅｄｄｙら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ７２：３３４−３４５頁（２００６年））。
【０１３６】
発酵培地
本発明における発酵培地は、適切な炭素基質を含有する必要がある。適切な基質が、限定はされないが、グルコースおよびフルクトースなどの単糖、乳糖またはスクロースなどのオリゴ糖、デンプンまたはセルロースなどの多糖、あるいはそれらの混合物、ならびに乳清透過液、コーンスティープリカー（ｃｏｒｎｓｔｅｅｐ ｌｉｑｕｏｒ）、砂糖液（ｓｕｇａｒ ｂｅｅｔ ｍｏｌａｓｓｅｓ）、および大麦モルト（ｂａｒｌｅｙ ｍａｌｔ）などの再生可能な原料由来の未精製混合物を含みうる。さらに、炭素基質はまた二酸化炭素または主要な生化学的中間体への代謝変換が実証されているメタノールなどの１炭素基質でありうる。メチロトローフ（ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃ）生物が、１炭素基質および２炭素基質に加え、メチルアミン、グルコサミンおよび代謝活性における種々のアミノ酸などの化合物を含有する他の多数の炭素を用いることでも知られている。例えば、メチロトローフ酵母がメチルアミン由来の炭素を用いてトレハロースまたはグリセロールを形成することで知られている（Ｂｅｌｌｉｏｎら、Ｍｉｃｒｏｂ．Ｇｒｏｗｔｈ Ｃ１ Ｃｏｍｐｄ．、［Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］、７ｔｈ（１９９３年）、４１５−３２頁、Ｍｕｒｒｅｌｌ Ｊ．Ｃｏｌｌｉｎ；Ｋｅｌｌｙ，Ｄｏｎ Ｐ．編、Ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ（Ａｎｄｏｖｅｒ、ＵＫ）発行）。同様に、カンジダの様々な種がアラニンまたはオレイン酸を代謝することになる（Ｓｕｌｔｅｒら、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １５３：４８５−４８９頁（１９９０年））。それ故、本発明で用いられる炭素源が基質を有する多種多様な炭素を包含する場合があり、生物の選択によってのみ限定されうると考えられる。
【０１３７】
上記の炭素基質およびそれらの混合物のすべてが本発明において適切であると考えられるが、好ましい炭素基質はグルコース、フルクトース、およびスクロースである。
【０１３８】
発酵培地は、適切な炭素源に加え、イソブタノールの生成に必要な培養物の成長および酵素経路の促進に適する、当業者に既知の、適切なミネラル、塩、共同因子、緩衝液および他の成分を含有する必要がある。
【０１３９】
培養条件
典型的には細胞が、適切な培地内、約２５℃〜約４０℃の範囲内の温度で成長される。本発明における適切な成長培地は、ルリア・ベルターニ（Ｌｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ）（ＬＢ）培養液、サブロー・デキストロース（Ｓａｂｏｕｒａｕｄ Ｄｅｘｔｒｏｓｅ）（ＳＤ）培養液または酵母培地（ＹＭ）の培養液などの一般的な商業的に調製された培地である。他の限定または合成された成長培地が用いられる場合があり、かつ特定の微生物の成長に適した培地について微生物学または発酵科学に関する当業者は知っているであろう。異化代謝産物抑制を直接的または間接的に調節することで知られる作用物質、例えば環状アデノシン２’：３’一リン酸（ｃＡＭＰ）の使用についても発酵培地内に取り込まれうる。
【０１４０】
発酵に適するｐＨ範囲はｐＨ５．０〜ｐＨ９．０であり、初期条件としてはｐＨ６．０〜ｐＨ８．０が好ましい。
【０１４１】
発酵は好気性または嫌気性条件下で実施可能であり、嫌気性または微好気性条件が好ましい。
【０１４２】
工業用バッチおよび連続発酵
本プロセスには、発酵のバッチ方法が用いられる。従来のバッチ発酵は、培地の組成物が発酵開始時に設定され、発酵の間に人工的な改変が施されることがない閉鎖系である。したがって、発酵開始時に培地に望ましい生物が接種され、系に何も添加しなくても発酵の生成が可能である。しかし、典型的には「バッチ」発酵は炭素源の添加に関連したバッチであり、ｐＨおよび酸素濃度などの要素を制御する試みがなされることが多い。バッチシステムでは、システムの代謝産物およびバイオマス組成物は、最大で発酵が停止する時間まで常時変化する。バッチ培養物内では、細胞が、変化のない誘導期（ｌａｇ ｐｈａｓｅ）から高成長の対数期（ｌｏｇ ｐｈａｓｅ）、最終的に成長率が減少または停止する定常期（ｓｔａｔｉｏｎａｙ ｐｈａｓｅ）にかけて抑制される。定常期における細胞が、未処理の場合、最終的に死滅することになる。対数期における細胞が、一般に最終生成物または中間体の生成の大部分に関与する。
【０１４３】
標準のバッチシステムに対する変形がフェドバッチシステムである。フェドバッチ発酵プロセスは本発明においても適切であり、基質が発酵プロセスごとに添加されること以外では典型的なバッチシステムを含む。フェドバッチシステムは、異化代謝産物抑制が細胞の代謝を阻害する傾向がある場合や培地内に限られた量の基質を有することが望ましい場合に有用である。フェドバッチシステム内での実際の基質濃度の測定は困難であることから、それはｐＨ、溶解酸素およびＣＯ２などの排ガスの分圧などの測定可能な要素の変化に基づいて評価される。バッチおよびフェドバッチ発酵は一般的で、当該技術分野で周知であり、例がＴｈｏｍａｓ Ｄ．「Ｂｒｏｃｋ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」、第２版（１９８９年）Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ、ＭＡ）またはＤｅｓｈｐａｎｄｅ，Ｍｕｋｕｎｄ（Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、３６：２２７頁（１９９２年））（参照により本明細書中に援用される）において見出されうる。
【０１４４】
本発明はバッチモードで実施されるが、本方法は連続発酵方法に適合可能であろうことが考えられる。連続発酵は、限定された発酵培地がバイオリアクターに連続的に添加されかつ等量の条件培地が処理と同時に除去される場合の開放系である。細胞が主に対数増殖（ｌｏｇ ｐｈａｓｅ ｇｒｏｗｔｈ）期にある場合、連続発酵は一般に一定の高密度で培養物を維持する。
【０１４５】
連続発酵では、細胞成長または最終生成物濃度に作用する１つの要素またはいくつかの要素の調節が可能になる。例えば、１つの方法では、炭素源などの限られた栄養素または一定速度での窒素レベルが維持され、あらゆる他のパラメータの抑制が可能になる。他のシステムでは、培地の濁度により測定される細胞濃度が一定に保持される間、成長に作用する多数の要素を連続的に改変することが可能である。連続システムでは、恒常的成長条件を維持するように試みることで、培地の除去（ｄｒａｗｎ ｏｆｆ）に起因する細胞欠損を発酵における細胞成長率に対して均衡させなければならない。連続発酵プロセス用の栄養素および成長因子を調節する方法ならびに生成物形成の速度を最大化するための技術については産業微生物学における当該技術分野で周知であり、かつ種々の方法がＢｒｏｃｋ、上記で詳述されている。
【０１４６】
本発明がバッチ、フェドバッチまたは連続プロセスのいずれかを用いて実施可能であり、かつ発酵における既知のモードであればいずれであっても適することが考えられる。さらに、細胞が細胞触媒全体として基質上に固定化され、かつイソブタノールの生成における発酵条件に従いうることが考えられる。
【０１４７】
発酵培地からイソブタノールを単離するための方法
生物学的に生成されるイソブタノールは、アセトン−ブタノール−エタノール（ＡＢＥ）を発酵するための当該技術分野で既知の方法を用いて発酵培地から単離されうる（例えば、Ｄｕｒｒｅ、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４９、６３９−６４８頁、１９９８年、およびＧｒｏｏｔら、Ｐｒｏｃｅｓｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７、６１−７５頁、１９９２年およびその中の参考文献）。例えば、固体は遠心分離、濾過、デカンテーションにより発酵培地から除去され、イソブタノールは蒸留、共沸蒸留、液体−液体抽出、吸着、ガスストリッピング、膜蒸発、または透析蒸発などの方法を用いて発酵培地から単離されうる。
【実施例】
【０１４８】
本発明はさらに以下の実施例にて定義される。これらの実施例が本発明の好ましい実施形態を示す一方であくまで例示目的で与えられることは理解されるべきである。上記の考察およびこれらの実施例から、当業者は、本発明の本質的な特徴により、その趣旨および範囲から逸脱することなく本発明に対して様々な変更および改良を行うことで、本発明の様々な利用および条件への適合が可能であることが確認できる。
【０１４９】
一般的方法
実施例で用いられる標準の組換えＤＮＡおよび分子クローン化技術は当該技術分野で周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ， Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ， Ｔ．（「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）、１９８９年、ここではＭａｎｉａｔｉｓと称される）およびＭａｎｉａｔｉｓ（上記）と、Ｓｉｌｈａｖｙら（Ｓｉｌｈａｖｙら、「Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）１９８４年）と、Ａｕｓｕｂｅｌら（Ａｕｓｕｂｅｌら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ． ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅにより発行、１９８７年）により記載がなされている。
【０１５０】
細菌培養物の維持および成長に適する材料および方法は当該技術分野で周知である。以下の実施例における使用に適する技術は、「Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ」（Ｐｈｉｌｌｉｐｐら編、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ．）、１９９４年）またはＴｈｏｍａｓ Ｄ．Ｂｒｏｃｋ（Ｂｒｏｃｋ、「Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」、第２版、Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ）（１９８９年）における提示として見出されうる。細菌細胞の成長および維持のために用いられるすべての試薬、制限酵素および材料は、他に特に規定がない限り、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）、ＢＤ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｓｐａｒｋｓ，ＭＤ）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、またはＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手した。
【０１５１】
以下の実施例で用いられるオリゴヌクレオチドプライマーを表３に示す。
【０１５２】
【表３】
【０１５３】
【表４】
【０１５４】
略語の意味は以下の通りである。「ｓｅｃ」は秒を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｈ」は時間を意味し、「ｎｍ」はナノメートルを意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「ｍｇ／ｍＬ」はミリグラム／ミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「ｎｍ」はナノメートルを意味し、「ｍＭ」はミリモル濃度を意味し、「Ｍ」はモル濃度を意味し、「ｍｍｏｌ」はミリモルを意味し、「μｍｏｌ」はマイクロモルを意味し、「ｋｇ」はキログラムを意味し、「ｇ」はグラムを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｎｇ」はナノグラムを意味し、「ＰＣＲ」はポリメラーゼ連鎖反応を意味し、「ＯＤ」は光学密度を意味し、「ＯＤ６００」は６００ｎｍの波長で測定された光学密度を意味し、「ｋＤａ」はキロダルトンを意味し、「ｇ」は重力定数を意味し、「ｂｐ」は塩基対を意味し、「ｋｂｐ」はキロ塩基対を意味し、「ｋｂ」はキロベースを意味し、「％」はパーセントを意味し、「％ｗ／ｖ」は重量／容量パーセントを意味し、「％ｖ／ｖ」は容量／容量パーセントを意味し、「ＨＰＬＣ」は高性能液体クロマトグラフィーを意味し、「ｇ／Ｌ」はグラム／リットルを意味し、「μｇ／Ｌ」はマイクログラム／リットルを意味し、「ｎｇ／μＬ」はナノグラム／マイクロリットルを意味し、「ｐｍｏｌ／μＬ」はピコモル／マイクロリットルを意味し、「ＲＰＭ」は回転／分を意味し、「μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ」はマイクロモル／分／ミリグラムを意味し、「ｗ／ｖ」は重量／容量を意味し、「ｖ／ｖ」は容量／容量を意味する。
【０１５５】
実施例１（比較）
ＫＡＲＩ酵素活性の分析
本実施例では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｉｌｖＣ遺伝子によりコードされたＫＡＲＩ酵素によるＮＡＤＰＨのアセトラクテート依存性の酸化を用いたｉｌｖＣ遺伝子の過剰発現コンストラクトの調製および酵素活性の測定について記載する。
【０１５６】
ｐＢＡＤ−ｉｌｖＣ発現プラスミドの作成−大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からのｉｌｖＣ遺伝子の単離
ｉｌｖＣ遺伝子コード領域を、ＰＣＲを用い、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＦＭ５（ＡＴＣＣ５３９１１）のゲノムＤＮＡから増幅した。細胞を、Ｌｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ Ｉｎｃ．（Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡ））４ｍＬを有する５０ｍＬの培養管内で（３００ＲＰＭで撹拌しながら３７℃で）一晩成長させた。次いで、それらを３分間で１０００×ｇでの遠心分離により回収し、細胞のゲノムＤＮＡを、Ｇｅｎｔｒａ Ｐｕｒｅｇｅｎｅキット（Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）；カタログ番号Ｄ−５０００Ａ）を用い、製造業者の指示書に従って調製した。ｉｌｖＣコード領域ＤＮＡ断片を、鋳型として大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡとプライマーの配列番号１１および１２を用い、ＰＣＲにより調製した。
【０１５７】
ＰＣＲを、Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標） Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ．（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）；カタログ番号Ｆ−５３１）を用い、製造業者のプロトコルに従って行った。増幅を、ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ ＧｅｎｅＡｍｐ ９７００（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ ｃｉｔｙ，ＣＡ））で行った。追加精製を伴わないＰＣＲ産物（０．５μＬ）を、ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、カタログ番号４５−００３１）にライゲートし、化学的コンピテントな（ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）ＴＯＰ１０細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ４４−０３０１）に形質転換した。ライゲーション産物を、ＬＢ培地＋１００μｇ／ｍＬのアンピシリン（Ｔｅｋｎｏｖａ Ｉｎｃ（Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ，ＣＡ）、カタログ番号Ｌ１００４）を有するプレート上にストリークした。ｉｌｖＣ挿入物を有するクローンをＳａｃＩ／ＢａｍＨＩでの制限消化により確認した。消化した４つの中の３つのプラスミドは、想定された１．５ｋｂｐのバンドを有した。得られたクローンをｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ ＴＯＰＯ−ｉｌｖＣと名づけた。
【０１５８】
ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ ＴＯＰＯ−ｉｌｖＣクローン化ベクター由来のｉｌｖＣ断片をＳａｃＩ／ＢａｍＨＩ消化により放出し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ））を用い、ＳａｃＩ／ＢａｍＨＩで消化されたｐＴｒｃ９９Ａ（Ａｍａｎｎら、Ｇｅｎｅ、６９、３０１−３１５頁、１９８８年）にライゲートした。このコンストラクトをエレクトロコンピテントな（ｅｌｅｃｔｒｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ４４−００３５）にエレクトロポレートし、上記のようにＬＢ／アンピシリンプレート上にストリークした。１．５ｋｂの挿入物を有するベクターをｐＴｒｃ９９Ａ−ｉｌｖＣと名づけた。
【０１５９】
クローン化のためのｐＢＡＤベクターの調製
遺伝子の５’末端にＳａｃＩ部位を有するｐＢＡＤ．ＨｉｓＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ベクターの誘導体を、ＳａｃＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を用い、ｉｌｖＣ遺伝子のｐＢＡＤへのクローン化のために作成した。このコンストラクトを３つのステップで作成した。第１に、赤色酵母（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｇｌｕｔｉｎｉｓ）由来のフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ；ＥＣ４．３．１．５）のコード領域をｐＢＡＤ−ＨｉｓＡベクターにクローン化し、ｐＢＡＤ−ＰＡＬを作成した。第２に、ＥｃｏＲＩ部位をｐＢＡＤ−ＰＡＬコンストラクト上の開始コドンの直前の遺伝子の５’末端に付加し、ｐＢＡＤ−ＰＡＬ−ＥｃｏＲＩを作成した。第３に、ｉｌｖＣ遺伝子のクローン化のため、ＥｃｏＲＩ部位をＳａｃＩ部位で置換し、得られたベクターをＳａｃＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ｐＢＡＤ−ＳａｃＩベクターを作成した。まずＰＡＬ遺伝子を、フォワードプライマー（ＰＡＬ−Ｆ１）（配列番号３７）およびリバースプライマー（ＰＡＬ−Ｒ１）（配列番号３８）を用い、ｐＫＫ２２３−ＰＡＬベクター（米国特許第６５２１７４８号明細書）からＰＣＲ増幅した。
【０１６０】
ＰＣＲを、ＴａＫａＲａ Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｐｒｅｍｉｘ（ＴＡＫＡＲＡ Ｂｉｏ ＵＳＡ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、カタログ番号ＴＡＫ＿Ｒ００４Ａ）を用い、製造業者のプロトコルに従い、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＰＣＲ９７００サーモサイクラー（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ ｃｉｔｙ，ＣＡ））で行った。ＰＣＲ産物をＱＩＡＱｕｉｋ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号２８１０６）を用いて部分精製し、ＢｂｓＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した。これにより、５’末端上にオーバーハングしたＮｃｏＩを有する断片が生成された。次いで、消化産物を、ＮｃｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化済みのｐＢＡＤ．ＨｉｓＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ベクターにライゲートした。ライゲーション反応を、製造業者から提供された標準プロトコルに従い、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて行った。ライゲーション産物２μＬを用い、ＴＯＰ１０エレクトロコンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、Ｂｉｏ−ＲＡＤ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ ＩＩ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ））を用い、製造業者の指示書に従って形質転換した。形質転換された細胞を、ＬＢ培地＋１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを有する寒天プレート（Ｔｅｋｎｏｖａ Ｉｎｃ（Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ，ＣＡ）、カタログ番号Ｌ１００４）上にストリークし、３７℃で一晩インキュベートした。ＰＡＬ挿入物を有するクローンをＮｃｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩでの制限消化により確認した。このコンストラクトをｐＢＡＤ−ＰＡＬと名づけた。次いで、ＥｃｏＲＩ部位を、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ ＸＬ部位特異的突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）、カタログ番号２００５２４）を用い、上記コンストラクト内のＰＡＬ遺伝子の５’末端に付加した。フォワードプライマー（ＰＡＬ−ＥｃｏＲＩ−Ｆ１）（配列番号３９）およびリバースプライマー（ＰＡＬ−ＥｃｏＲ１−Ｒ１）（配列番号４０）を設計し、反応混合物を製造業者の指示書に従って調製した。上で調製したｐＢＡＤ−ＰＡＬコンストラクトを下記反応における鋳型として用いた。
【０１６１】
反応混合物５０μＬは、２００μＬの薄壁チューブ内に、５０ｎｇ／μＬの鋳型プラスミド１．０μＬ、１０ｐモル／μＬの各プライマー１．０μＬ、１０×反応緩衝液５μＬ、ｄＮＴＰミックス１．０μＬおよびＱｕｉｋ溶液３μＬ、水３０μＬおよびｐｆｕ−ｕｌｔｒａ ｈｉｇｈ ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ１．０μＬを含有した。この反応で用いたすべての試薬およびポリメラーゼを上記のＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ ＸＬキットで提供した。反応を、以下の条件を用い、ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ ＧｅｎｅＡｍｐ ２４００（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ ｃｉｔｙ，ＣＡ））で行った。開始温度は９６℃で２分間であり、その後、１８回の加熱／冷却サイクルを行った。各サイクルは、９６℃で３０秒間、次いで６０℃で３０秒間、次いで７２℃で１６０秒間からなるものであった。温度サイクルの完了時、試料を７２℃でさらに６００秒間保持し、次いで４℃で試料の回収まで待機した。
【０１６２】
反応の完了後、（上記のキットからの）制限酵素ＤｐｎＩ１．０μＬを反応物に添加後、３７℃で３時間インキュベートし、反応物中の鋳型プラスミドを消化した。
【０１６３】
次いで、ＤｐｎＩで消化した反応産物２．０μＬを、Ｂｉｏ ＲＡＤ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ ＩＩ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ））を用い、製造業者の指示書に従い、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０エレクトロコンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）５０μｌに形質転換した。異なる容量（２．０μＬ、５．０μＬおよび２０μＬ）の形質転換細胞を、ＬＢ培地および１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを有する１０ｃｍの寒天プレート上にストリークし、プレートを３７℃で一晩インキュベートした。３つのクローンを十分に分離されたコロニーを有するプレートから採取した。３つのクローン由来のプラスミドを、Ｑｉａｐｒｅｐ ｓｐｉｎ ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ ＣＡ）、カタログ番号２７１０６）を用い、製造業者の使用説明書に従って精製した。陽性クローンを、１０×反応緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ緩衝液）１．０μＬ、精製プラスミド１．０μＬおよび各制限酵素１．０μＬを脱イオン水６．０μＬ中に入れることによる制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））を用いた制限消化分析により確認した。反応混合物を３７℃で６０分間インキュベートした。各クローンの消化産物を０．８％アガロースＥ ｇｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｇ５０１８−０８）上で分離した。１つの２．１ｋｂｐおよび１つの４．０ｋｂｐのＤＮＡ断片を、コンストラクト内にＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位の双方を有する試料中のゲル上で検出した。次いで、このコンストラクト内のＥｃｏＲＩ部位を、プラスミド鋳型ｐＢＡＤ−ＰＡＬ−ＥｃｏＲＩとプライマーの配列番号１３および１４を伴う上記と同じプロトコルを用いてＳａｃＩ部位で置換した。
【０１６４】
陽性クローンを制限酵素ＳａｃＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ））を用いる制限消化分析により確認した。一旦、陽性クローンが同定されると、上記の制限消化反応を大規模に（５０μＬ）に設定した。消化されたベクターを有する４ｋｂｐの断片を、１％アガロースゲルおよびＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ（ＶａｌｅｎｃｉａＣＡ）、カタログ番号２８７０４）を用い、製造業者のプロトコルに従って混合物からゲル精製した。このコンストラクトをｐＢＡＤ−ＳａｃＩと名づけた。
【０１６５】
ＫＡＲＩの過剰発現に用いる宿主株
ノックアウトされたｉｌｖＣ遺伝子である宿主株大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＢｗ２５１１３（ΔｉｌｖＣ）を、ＫＡＲＩ酵素を過剰発現するコンストラクトの作成に用いた。この株においては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）染色体上のｉｌｖＣ遺伝子全体を、ラムダレッド相同性組換え技術（ＤａｔｓｅｎｋｏおよびＷａｎｎｅｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９７、６６４０−６６４５頁、２０００年）を用い、カナマイシンカセットと置換した。この技術を用いたノックアウト株の作製に必要な株およびベクターのすべてを、Ｐｒｏｆ．Ｂａｒｒｙ Ｗａｎｎｅｒ（Ｐｕｒｄｕｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｗｅｓｔ Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＩＮ））から入手した。
【０１６６】
クローン化のためのｉｌｖＣコード領域の調製
ｉｌｖＣにおけるコード領域を、ｈｉｇｈ ｆｉｄｅｌｉｔｙ ｐｆｕ−ｕｌｔｒａ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ））を用いて増幅するとともに、ＳａｃＩ部位をＡＴＧの直前のフォワードプライマーの５’末端に付加し、かつＨｉｎｄＩＩＩ部位を停止コドンの直後のリバースプライマーの５’末端に付加した。配列番号１５を有するプライマー（フォワード：ｉｌｖｃ−ｔｒｃ−ＳａｃＩ−Ｆ）および配列番号１６を有するプライマー（リバース：ｉｌｖｃ−ｔｒｃ−ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｒ）をこの反応に用いた。ＰＣＲ反応に用いた鋳型は、上記のｐｔｒｃ９９Ａ−ｉｌｖＣコンストラクトであった。
【０１６７】
反応混合物５０μＬは、ｐｆｕ−ｕｌｔｒａ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、５０ｎｇ／μＬの鋳型１．０μＬ、１０ｐモル／μＬのフォワードおよびリバースプライマーの各々１．０μＬ、４０ｍＭ ｄＮＴＰミックス（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ））１．０μＬ、ｐｆｕ−ｕｌｔｒａ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）１．０μＬ、ならびに水３９μＬが供給された１０×反応緩衝液５．０μＬを含有した。この反応混合物を、ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ ＧｅｎｅＡｍｐ ２４００（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ ｃｉｔｙ，ＣＡ））におけるＰＣＲ反応用の２００μＬの薄壁チューブ内に入れた。ＰＣＲ反応を実施するため、以下の条件を用いた。開始温度は９４℃で２分間であった。次いで、３０回の加熱／冷却サイクルを行った。各サイクルは、９４℃で３０秒間、５８℃で３０秒間、次いで６８℃で１分間および４０秒間からなるものであった。温度サイクルの完了時、試料を６０℃でさらに１０分間保持し、次いで４℃で試料の回収まで待機した。
【０１６８】
ＰＣＲ産物をＱＩＡｑｕｉｋ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号２８１０６）を用いて部分精製し、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳａｃＩにより消化し、次いで上記のプロトコルを用いてゲル精製した。消化されたＰＣＲ断片を、同じ酵素セットにより消化されたｐＢＡＤ−ＳａｃＩベクターにライゲートした。ライゲーション反応物２０μＬは、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）１．０μＬ、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを伴う１０×反応緩衝液２．０μＬ、４５ｎｇのベクターと４５ｎｇの挿入物、および脱イオン水を含有した。反応物を、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆサーマルサイクラー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ（Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ））内で、１６℃で一晩インキュベートした。
【０１６９】
ライゲーション産物２μＬを、ＢｉｏＲＡＤ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ ＩＩ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ））を用い、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０エレクトロコンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換した。形質転換クローンを、ＬＢ培地および１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを有する寒天プレート上で選択した。クローン内での大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｉｌｖＣ遺伝子挿入物の存在を、ＳａｃＩでの消化およびプライマーの配列番号１７〜２２を用いたＤＮＡ配列決定により確認した。ｉｌｖＣ遺伝子挿入物を有するコンストラクトをｐＢＡＤ−Ｋ１２−ｉｌｖＣと名づけた。
【０１７０】
ＫＡＲＩ発現の分析のための株の調製
上記ｐＢＡＤ−Ｋ１２−ｉｌｖＣコンストラクトおよびｐＴｒｃ９９Ａ−ｉｌｖＣのプラスミド（双方ともＴＯＰ１０宿主株内）を、Ｑｉａｐｒｅｐ ｓｐｉｎ ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ ＣＡ）、カタログ番号２７１０６）を用い、製造業者の使用説明書に従い、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＬＢ培地中で一晩培養物３ｍＬから調製した。ｐＢＡＤ−Ｋ１２−ｉｌｖＣ１μＬおよびｐＴｒｃ９９Ａ−ｉｌｖＣ１μＬを、Ｂｉｏ ＲＡＤ Ｇｅｎｅ ＰｕｌｓｅｒＩＩ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ））を用い、製造業者の指示書に従い、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｂｗ２５１１３（ΔｉｌｖＣ）エレクトロコンピテント細胞に別々に形質転換した。形質転換細胞をＬＢ培地＋１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを有する寒天プレート上にストリークし、３７℃で一晩インキュベートした。これらのプレート由来のコロニーを無細胞抽出物（ｃｅｌｌ ｆｒｅｅ ｅｘｔｒａｃｔ）の調製に用いた。
【０１７１】
無細胞抽出物の調製
ｐＢＡＤ−Ｋ１２−ｉｌｖＣおよびｐＴｒｃ９９Ａ−ｉｌｖＣを有する細胞を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリン、誘導因子の０．０２％（ｗ／ｖ）アラビノースおよび１ｍＭイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を含有するＬＢ培地３．０ｍＬ中で、２５０ｒｐｍで振とうしながら３７℃でそれぞれ成長させた。細胞を、２２．５℃、６０００×ｇで５分間の遠心分離により回収し、細胞ペレットを１．５ｍＬの微量遠心管内の１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）３００μＬ中に再懸濁し、（容量基準で）４０％の水および６０％の氷で満たした水槽内に入れ、Ｍｉｓｏｎｉｘ ３００ソニケーター（Ｍｉｓｏｎｉｘ（Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ，ＮＹ））を用いて２〜３分間超音波処理した（出力１．０で３．０秒バースト後、３．０秒の停止）。細胞残渣を遠心分離（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ微量遠心管、モデル５４１５Ｄ、２２．５℃、９３００×ｇで５分間）により除去した。
【０１７２】
あるいは、細胞抽出物を、洗剤に基づくタンパク質抽出試薬ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（Ｎｏｖａｇｅｎ、カタログ番号７１４５６）を用いて調製した。培養物３．０ｍＬ由来の細胞ペレットをＢｕｇＢｕｓｔｅｒ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ３００μＬ中に再懸濁し、室温で２０分間インキュベートした。細胞残渣を、２２．５℃、９３００×ｇで５分間の遠心分離（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆｆ微量遠心管モデル５４１５Ｄ）により除去した。
【０１７３】
タンパク質の定量
試料中の全タンパク質濃度を、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｐｌｕｓ（Ｐｉｅｒｃｅ＃２３２３８（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ））を用いたＢｒａｄｆｏｒｄ Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ａｓｓａｙ（ＢＣＡ）により測定した。試料およびタンパク質の標準（ウシ血清アルブミン、ＢＳＡ）を、製造業者のプロトコルに従い、９６ウェルマイクロプレート内で設定した。タンパク質の濃度を、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ））を用い、５９５ｎｍでの吸光度に従って測定した。
【０１７４】
ＫＡＲＩ酵素アッセイプロトコル
アッセイ基質の（Ｒ，Ｓ）−アセトラクテートをＡｕｌａｂａｕｇｈおよびＳｃｈｌｏｓｓ（ＡｕｌａｂａｕｇｈおよびＳｃｈｌｏｓｓ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２９、２８２４−２８３０頁、１９９０年）に記載のように合成した。すなわち、１．０ｇの２−アセトキシ−２−メチル−３−オキソ酪酸エチルエステル（Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ））を１．０ＭのＮａＯＨ１０ｍＬと混合し、室温で撹拌した。溶液ｐＨが中性になったら、追加的なＮａＯＨを徐々に添加し、約８．０のｐＨを維持した。アッセイで用いたすべての他の化学物質をＳｉｇｍａから購入した。
【０１７５】
ＫＡＲＩによるアセトラクテートから２，３−ジヒドロキシイソバレレートへの酵素的変換の後に、共同因子ＮＡＤＰＨの反応物からの消失を分光光度計（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ））を３４０ｎｍで用いて測定した。ＮＡＤＰＨについての活性を６２２０Ｍ−１ｃｍ−１のモル吸光係数を用いて計算した。用いたストック溶液は、ＨＣｌ／ＫＯＨによってｐＨ７．５に調整した１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ−カリウム塩；１．０Ｍ ＭｇＣｌ２；２０ｍＭ ＮＡＤＰＨおよび９０ｍＭアセトラクテートであった。ストック用反応緩衝液混合液４０ｍＬは１００ｍＭ ＨＥＰＥＳストックおよびＭｇＣｌ２ストック４００μＬを含有する。
【０１７６】
反応緩衝液（１９４μＬ）を、プラスチック製使い捨てキュベット（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ＵＶｅｔｔｅ、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ＡＧ（Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ））内でＮＡＤＰＨ（２．０μＬ）ストックおよび細胞抽出物（２．０μＬ）と混合し、２２．５℃、３４０ｎｍでの吸光度を２０秒間記録した。初期のＡ３４０は通常、約０．９〜１．０であった。次いで、アセトラクテート（２．０μＬ）をキュベットに添加し、反応を開始した。アッセイにおける原料の最終濃度は、ｐＨ７．５での１００ｍＭカリウムＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２００μＭ ＮＡＤＰＨおよび９００μＭアセトラクテートであった。この溶液を完全に混合し、３４０ｎｍでのその吸光度をさらに８０秒間記
録した。ここで報告されるＫＡＲＩ活性は、細胞抽出物中の全タンパク質の１ｍｇ当たり、１分当たりに消費されるＮＡＤＰＨのμモルとして定義される。ｐＢＡＤ−Ｋ１２−ｉｌｖＣプラスミドおよびｐｔｒｃ９９Ａ−ｉｌｖＣプラスミドで形質転換した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｂｗ２５１１３（ΔｉｌｖＣ）細胞から調製した細胞抽出物中のタンパク質濃度およびＫＡＲＩ活性の結果を表４に示す。２つの細胞抽出物試料を、ｐＢＡＤ−Ｋ１２−ｉｌｖＣコンストラクト用に、一方は超音波処理、他方はＢｕｇＢｕｓｔｅｒを用いて調製した。ｐＴｒｃ９９Ａ−ｉｌｖＣコンストラクト用の細胞抽出物試料を、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒを用いて調製した。これらの分析によると、ＫＡＲＩタンパク質がｐＢＡＤ−Ｋ１２−ｉｌｖＣプラスミドを有する細胞内の方がｐＴｒｃ９９Ａ−ｉｌｖＣを有する細胞内よりも高レベルに発現されたが、２つの異なる方法により調製した細胞抽出物試料中での酵素比活性は有意に異ならないことが示された。ｐＢＡＤ−ＨｉｓＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で形質転換された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株Ｂｗ２５１１３を陰性対照として用いた。陰性対照におけるＮＡＤＰＨ消費率は極めて低かった（ｐＢＡＤ−Ｋ１２−ｉｌｖＣ遺伝子を有するものについて測定された消費率の約１％〜２％）。
【０１７７】
【表５】
【０１７８】
実施例２
様々な微生物由来の比活性の高い酵素を有するＫＡＲＩの同定
本実施例の目的は、高い比活性を有するＫＡＲＩ酵素を含有する微生物の同定の仕方を説明することである。
【０１７９】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）よりも迅速な倍加時間を有するＫＡＲＩを含有する生物が、最少培地中で成長する間、活性の高いＫＡＲＩ酵素を含有することになると仮定された。緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（ＰＡＯ１）、蛍光菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）（ＰＦ５）、およびコレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）（Ｎ１６９６１）といった３種の微生物が、Ｍ９最少培地中での成長時、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）よりも迅速な倍加時間を有するものとして同定された（下記参照）。これらの生物のゲノムＤＮＡ製剤は市販されている。表５は、Ｍ９最少培地中での成長後の倍加時間のこれらの生物と大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）との比較を示す。
【０１８０】
【表６】
【０１８１】
上記のように、ＫＡＲＩ酵素は異なるクラスに分類されている。シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）ＰＦ５およびＰＡＯ１酵素はクラスＩ ＫＡＲＩ群（同科内の最大の群である）に属する一方、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびコレラ菌（Ｖ．Ｃｈｏｌｅｒａｅ）酵素はクラスＩＩ細菌ＫＡＲＩ群に属する。
【０１８２】
緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（ＰＡＯ１、ＡＴＣＣ ４７０８５）および蛍光菌（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）（ＰＦ５、ＡＴＣＣ ＢＡＡ−４７７）の精製ゲノムＤＮＡをＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ））から購入した。各生物由来のゲノムＤＮＡ（各々１０μｇ）を、ＰＣＲ反応で用いるため、ｐＨ８．５の１０ｍＭトリス−ＨＣｌ１００μＬで再水和した。ＳａｃＩ部位をフォワードプライマー（配列番号２３および２５）に結合させかつＨｉｎｄＩＩＩ部位をリバースプライマー（配列番号２４および２６）に結合させた、プライマー対を用い、ｉｌｖＣ遺伝子コード領域を、ｈｉｇｈ ｆｉｄｅｌｉｔｙ ｐｆｕ−ｕｌｔｒａ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用い、ＰＡＯ１およびＰＦ５のゲノムＤＮＡからＰＣＲで増幅した。プライマーを、これらの生物におけるＰＦ５およびＰＡＯ１ ｉｌｖＣ遺伝子の公的に有益な（ＧｅｎｅＢａｎｋ）配列に基づいて設計した。
【０１８３】
各ＰＣＲ反応物５０μＬは、ゲノムＤＮＡ１．０μＬおよび１０ｐモル／μＬのフォワードおよびリバースプライマーを各遺伝子につき１．０μＬずつ含有した。
【０１８４】
ＰＣＲ反応を、以下の反応条件を用い、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ｍａｓｔｅｒ ｃｙｃｌｅｒｓ ｇｒａｄｉｅｎｔ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ（Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ））で行った。開始温度は２分間で９５℃であった。次いで、５回の加熱／冷却サイクルを行った。各サイクルは、９５℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、および７２℃で１０分間と３０秒間からなるものであった。２５回のさらなる加熱／冷却サイクルを行った。これらの各サイクルは、９５℃で３０秒間、６５℃で３０秒間、および７２℃で１．０分間と３０秒間からなるものであった。これらの温度サイクルの完了時、試料を７２℃でさらに１０分間保持し、次いで４℃で試料の回収まで待機した。
【０１８５】
実施例１に記載の手順を用い、得られたＰＣＲ断片をＨｉｎｄＩＩＩおよびＳａｃＩで消化し、ｐＢＡＤ−ＳａｃＩ発現ベクターにクローン化し、ｉｌｖＣ−ノックアウト株ＢＷ２５１１３（ΔｉｌｖＣ）に形質転換した。陽性クローンを制限酵素消化により同定し、プライマーの配列番号２１（ｐＢＡＤ−ｅＦ１）、配列番号２２（ＰＡＬＰＫ−Ｒ１）、配列番号２７（ＰＦ５−Ｓ−Ｆ２）、および配列番号２８（ＰＦ５−Ｓ−Ｒ２）を用いる完全長ＤＮＡ配列決定により確認し、ここで得られた株をＢＷ２５１１３（ΔｉｌｖＣ）−ＰＡＯ１−ｉｌｖＣおよびＢＷ２５１１３（ΔｉｌｖＣ）−ＰＦ５−ｉｌｖＣと名づけた。
【０１８６】
コレラ菌（Ｖ．Ｃｈｏｌｅｒａｅ）ＶＣ０１６２遺伝子コード領域を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）での発現のために既知のタンパク質配列（登録番号ＮＰ＿２２９８１９．１）に基づいてコドン最適化し、合成的なカスタム遺伝子合成（ＤＮＡ ２．０，Ｉｎｃ．（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡ））により調製した。ＳａｃＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位を遺伝子の末端に結合し、それを調製した。このＤＮＡ断片をまた、ＳａｃＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を用いてｐＢＡＤ−ＳａｃＩ発現ベクターにクローン化し、ｉｌｖＣ−ノックアウト株ＢＷ２５１１３（ΔｉｌｖＣ）に形質転換した。得られた株をＢＷ２５１１３（ΔｉｌｖＣ）−ＶＣｏｐｔ−ＶＣ０１６２と名づけた。コドン最適化されたＶＣ０１６２の配列は配列番号３０で与えられる。
【０１８７】
Ｋ１２、ＰＡＯ１、ＰＦ５およびＶＣ株由来のタンパク質およびＫＡＲＩ活性アッセイ
ＫＡＲＩ酵素を発現するすべての株ＢＷ２５１１３（ΔｉｌｖＣ）−Ｋ１２−ｉｌｖＣ、ＢＷ２５１１３（ΔｉｌｖＣ）−ＰＡＯ１−ｉｌｖＣ．ＢＷ２５１１３（ΔｉｌｖＣ）−ＰＦ５−ｉｌｖＣおよびＢＷ２５１１３（ΔｉｌｖＣ）−ＶＣｏｐｔ−ＶＣ０１６２の無細胞抽出物を、実施例１に記載のようにＢｕｇＢｕｓｔｅｒを用いて調製した。ＫＡＲＩアッセイを、反応緩衝液１８８μＬ、２０ｍＭ ＮＡＤＰＨストック２．０μＬ、アッセイ緩衝液で希釈した２０％細胞抽出物５．０μＬおよび９０ｍＭアセトラクテート５．０μＬを用いて行った。それ故、本実施例で用いる最終のアッセイ溶液は、酵素、１００ｍＭカリウム−ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２，２００μＭ ＮＡＤＰＨおよび２．２５ｍＭアセトラクテートからなるものであった。
【０１８８】
表６は、誘導因子としての０．０２％（ｗ／ｖ）のアラビノースの存在下で一晩成長させた４種の異なる生物のＫＡＲＩ比活性を示す。細胞抽出物中の全タンパク質の量およびＫＡＲＩ活性を上記のように測定した。表６にまとめるように、最少培地中での成長時により迅速な倍加時間を有するものとして同定された生物由来のＫＡＲＩ酵素は（表５）、いずれも大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のＫＡＲＩよりも高い比活性を有する。各抽出物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる推定とほぼ等しいレベルのＫＡＲＩタンパク質の発現を有した（データは示さず）。これらの結果は、最少培地中での成長期間中の倍加時間がより高い比活性を有するＫＡＲＩ酵素を同定するための手段として用いられうるという仮説を支持している。
【０１８９】
【表７】
【０１９０】
実施例３
精製Ｋ１２−ＫＡＲＩおよびＰＦ５−ＫＡＲＩの比活性の分析
実施例２における、粗細胞抽出物で観察されるＫＡＲＩ比活性の増大について一層解明するため、Ｋ１２−ＫＡＲＩおよびＰＦ５−ＫＡＲＩを均質になるまで精製することで各タンパク質の濃度の正確な定量を可能にし、精製ＫＡＲＩ酵素の比活性を測定した。
【０１９１】
Ｋ１２−ＫＡＲＩおよびＰＦ５−ＫＡＲＩの精製
Ｋ１２−ＫＡＲＩおよびＰＦ５−ＫＡＲＩの双方を弱アニオン交換スピンカラムＶｉｖａｐｕｒｅ ＩＥＸ Ｄ、ｍｉｎｉＨ（Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ ＡＧ（Ｈａｎｎｏｖｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ））を用いて精製後、１００ＫＤａの分子量カットオフを有するＭｉｃｒｏｃｏｎ機器（ＹＭ１００、Ｍｉｌｌｐｏｒｅ（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ））で濃縮した。精製手順を室温（２２．５℃）で行った。
【０１９２】
アニオン交換スピンカラムで用いたストック溶液は、ｐＨ７．０での１００ｍＭカリウム−ＨＥＰＥＳ、１．０Ｍ ＭｇＣｌ２、２５０ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％Ｂｒｉｊ３５および２Ｍ ＫＣｌであった。洗浄用緩衝液（ＢｕｆｆｅｒＡ）を、ＭｇＣｌ２ストック５０μＬ、ＥＤＴＡストック２０μＬおよび１０％Ｂｒｉｊ３５ １０μＬの添加とともに、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳストック５．０ｍＬの水１５ｍＬへの添加により作製した。溶出緩衝液＃１（緩衝液Ｂ）を、ＭｇＣｌ２ストック５０μｌ、ＥＤＴＡストック２０μＬおよび１０％Ｂｒｉｊ３５１０μＬの添加とともに、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ５．０ｍｌ、ＫＣｌストック２．０ｍＬの１３ｍＬ水への添加により作製した。溶出緩衝液＃２（緩衝液Ｃ）を、ＭｇＣｌ２ストック５０μＬ、ＥＤＴＡストック２０μＬおよび１０％Ｂｒｉｊ３５１０μＬの添加とともに、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳストック５ｍＬ、ＫＣｌストック５．０ｍＬの１０ｍＬ水への添加により作製した。緩衝液Ｂ中での最終のＫＣｌ濃度は約２００ｍＭであり、緩衝液Ｃ中では約５００ｍＭである。
【０１９３】
株ＢＷ２５１１３（ΔｉｌｖＣ）−Ｋ１２−ｉｌｖＣおよびＢＷ２５１１３（ΔｉｌｖＣ）−ＰＦ５−ｉｌｖＣの無細胞抽出物を、実施例１に記載のようにＢｕｇＢｕｓｔｅｒを用いて調製した。Ｖｉｖａｐｕｒｅ ＩＥＸ Ｄカラムへの装填のために希釈した細胞抽出物を調製するため、二重脱イオン水６００μＬを抽出物２００μＬに添加した。
【０１９４】
Ｖｉｖａｐｕｒｅ ＩＥＸ Ｄカラムを、２０００×ｇで５分間の遠心分離（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ微量遠心管モデル５４１５Ｄ）により緩衝液Ａ４００μＬでまず洗浄した。同一の機器およびプロセスをＶｉｖａｐｕｒｅ ＩＥＸ Ｄ精製手順全体を通じて用いた。希釈した細胞抽出物（上記）をカラムに装填し、４００μＬずつの２つのバッチで遠心分離した。次いで、カラムを緩衝液Ａ４００μＬで（２回）洗浄した。ＰＦ５−ＫＡＲＩ試料においては、緩衝液Ｂ４００μＬを装填し、酵素をカラムから回収用チューブに溶出した。Ｋ１２−ＫＡＲＩ試料においては、代わりに緩衝液Ｃ４００μＬを用いた。
【０１９５】
Ｍｉｃｒｏｃｏｎ ＹＭ１００機器を、１３８００×ｇで５分間の遠心分離（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ微量遠心管モデル５４１５Ｄ）により脱イオン水４００μＬでまず洗浄した。次いで、Ｖｉｖａｐｕｒｅ ＩＥＸ Ｄでの精製から回収した試料を装填し、１３８００×ｇで４分間遠心分離した。流入物（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）を廃棄し、緩衝液Ｂ４００μＬを試料チャンバに添加し、１３８００×ｇで４分間遠心分離した。緩衝液Ｂ２００μＬの試料チャンバへの添加前に、洗浄手順を（２回）繰り返した。試料チャンバを清潔な回収用チューブに反転させ、５０００×ｇで２分間遠心分離し、精製試料を回収した。
【０１９６】
各精製ＫＡＲＩ試料の純度をキャピラリー電気泳動（Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ））により確認した。試料をＰｒｏｔｅｉｎ ２３０試薬キットを用いて調製し、製造業者の使用説明書に従ってＰｒｏｔｅｉｎ Ｌａｂｃｈｉｐ（試薬キットが提供）に適用し、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒにより分析した。バックグラウンドをほとんど伴わない単一のピークが各精製試料における電気記録図上に認められた。
【０１９７】
精製ＫＡＲＩ試料のタンパク質定量
２８０ｎｍでの精製ＫＡＲＩ試料のＵＶ吸収測定を、分光光度計（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ））および１ｃｍの経路長の使い捨てプラスチック製キュベット（ＵＶｅｔｔｅ、ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ））を用いて行い、精製試料中でのＫＡＲＩの量を定量した。ＰＦ５−ＫＡＲＩにおける２８０ｎｍでの吸光係数（１ｍｇ／ｍＬにおいては０．７３）およびＫ１２−ＫＡＲＩにおける２８０ｎｍでの吸光係数（１ｍｇ／ｍＬにおいては０．９８）を、ＥｘＰＡＳｙウェブサイト上で利用可能なプログラムＰｒｏｔｐａｒａｍにより予測した（Ｐａｃｅ Ｃ．Ｎ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．１１、２４１１−２４２３頁、１９９５年）。ＵＶ吸収測定のため、精製試料を緩衝液Ｂ中で２０％（ｖ／ｖ）まで希釈した。希釈したＰＦ５−ＫＡＲＩ試料におけるＡ２８０は０．４１であり、希釈したＫ１２−ＫＡＲＩにおけるＡ２８０は０．３６であった。
【０１９８】
精製ＫＡＲＩにおける活性アッセイ
本実施例で用いられるアッセイ条件は、２０％（ｖ／ｖ）精製試料５μＬを細胞抽出物の代わりに用いたこと以外では実施例２の場合と同じであった。精製試料のタンパク質濃度およびその比活性を表７に示す。試験対象の最速の成長者（ｇｒｏｗｅｒ）である精製ＰＦ５−ＫＡＲＩの比活性は、Ｋ１２−ＫＡＲＩの比活性の２倍であった。これらの結果が実施例２におけるこれら２種の酵素の粗製剤を用いて得られたデータと一致することから、最少培地中での成長の間での倍加時間が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）酵素よりも高い比活性を有するＫＡＲＩ酵素を同定するための手段として用いられうるという仮説に対してさらなる支持が得られる。
【０１９９】
【表８】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アセトラクテートをジヒドロキシ−イソバレレートに変換するための方法であって、
ａ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ケトール酸レダクトイソメラーゼの比活性よりも高い比活性のケトール酸レダクトイソメラーゼを有するポリペプチドをコードする遺伝子コンストラクトを含む微生物宿主細胞を提供するステップと、
ｂ）（ａ）の宿主細胞をアセトラクテートと接触させるステップであって、２，３−ジヒドロキシイソバレレートが生成されるステップと、
を含む方法。
【請求項２】
遺伝子コンストラクトが、以下の条件：
ａ）約７．５のｐＨ、
ｂ）約２２．５℃の温度、および
ｃ）約１０ｍＭ超のカリウム
のもとで行われるＮＡＤＰＨ消費アッセイによって測定される際、精製タンパク質に基づく１．１μモル／分／ｍｇを超える比活性のケトール酸レダクトイソメラーゼを有するポリペプチドをコードする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
イソブタノールを生成するための方法であって、
ａ）以下の遺伝子コンストラクト：
１）ピルベートをアセトラクテートに変換する（経路ステップａ）アセトラクテートシンターゼ酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子コンストラクト；
２）（Ｓ）−アセトラクテートから２，３−ジヒドロキシイソバレレートへの変換（経路ステップｂ）において、以下の条件：
ｉ）約７．５のｐＨ、
ｉｉ）約２２．５℃の温度、および
ｉｉｉ）約１０ｍＭ超のカリウム
のもとで行われるＮＡＤＰＨ消費アッセイによって測定される際、精製タンパク質に基づく１．１μモル／分／ｍｇを超える比活性のケトール酸レダクトイソメラーゼ酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子コンストラクト；
３）２，３−ジヒドロキシイソバレレートをα−ケトイソバレレートに変換する（経路ステップｃ）ためのアセトヒドロキシ酸デヒドラターゼをコードする少なくとも１つの遺伝子コンストラクト；
４）α−ケトイソバレレートをイソブチルアルデヒドに変換する（経路ステップｄ）分岐鎖ケト酸デカルボキシラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子コンストラクト；
５）イソブチルアルデヒドをイソブタノールに変換する（経路ステップｅ）ための分岐鎖アルコールデヒドロゲナーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子コンストラクト；
を含む組換え微生物宿主細胞を提供するステップと、
ｂ）（ａ）の宿主細胞をイソブタノールが生成される条件下で成長させるステップと、
を含む方法。
【請求項４】
ケトール酸レダクトイソメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子コンストラクトがシュードモナスから単離される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
宿主細胞が、細菌、シアノバクテリア、糸状菌および酵母からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
宿主細胞が、クロストリジウム、ザイモモナス、エシェリキア、サルモネラ、ロドコッカス、シュードモナス、バチルス、乳酸桿菌、腸球菌、アルカリゲネス、クレブシエラ、
パエニバチルス、アルスロバクター、コリネバクテリウム、ブレビバクテリウム、ピキア、カンジダ、ハンセヌラ、ビブリオおよびサッカロミセスからなる群から選択される属のメンバーである、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
宿主細胞が大腸菌である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
細胞がラクトバチルス・プランタルムである、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
細胞がサッカロミセス・セレビシェである、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
アセトラクテートシンターゼが配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する、請求項３に記載の方法。
【請求項１１】
ケトール酸レダクトイソメラーゼ活性を有するポリペプチドが、配列番号３４、配列番号３５、および配列番号３６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
アセトヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性が配列番号６で示されるアミノ酸配列を有する、請求項３に記載の方法。
【請求項１３】
分岐鎖アルコールデヒドロゲナーゼが配列番号１０で示されるアミノ酸配列を有する、請求項３に記載の方法。
【請求項１４】
分岐鎖α−ケト酸デカルボキシラーゼが配列番号８で示されるアミノ酸配列を有する、請求項３に記載の方法。
【請求項１５】
大腸菌ケトール酸レダクトイソメラーゼの比活性を超える比活性を有するケトール酸レダクトイソメラーゼ酵素を含む組換え宿主細胞。
【請求項１６】
ケトール酸レダクトイソメラーゼ酵素が、以下の条件：
ａ）約７．５のｐＨ、
ｂ）約２２．５℃の温度、および
ｃ）約１０ｍＭ超のカリウム
のもとで行われるＮＡＤＰＨ消費アッセイによって測定される際、精製タンパク質に基づく１．１μモル／分／ｍｇを超える比活性を有する、請求項１５に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１７】
以下の条件：
ｉ）約７．５のｐＨ、
ｉｉ）約２２．５℃の温度、および
ｉｉｉ）約１０ｍＭ超のカリウム；
のもとで行われるＮＡＤＰＨ消費アッセイによって測定される際、精製タンパク質に基づく１．１μモル／分／ｍｇを超える比活性を有するケトール酸レダクトイソメラーゼ酵素をコードする遺伝子コンストラクトの同定および単離のための方法であって、
ａ）Ｍ９最少培地中で成長させる場合、大腸菌の倍加時間よりも短い倍加時間を有する細菌種を同定するステップと、
ｂ）（ａ）の細菌種をケトール酸レダクトイソメラーゼ活性についてスクリーニングし、活性細菌種を同定するステップと、
ｃ）（ｂ）の活性細菌種のゲノムＤＮＡを、ケトール酸レダクトイソメラーゼをコードすることで知られる遺伝子コンストラクトに対して相同性を有する核酸配列でプローブし、前記活性細菌種由来のケトール酸レダクトイソメラーゼをコードする遺伝子コンストラクトを同定し、単離するステップと、
ｄ）前記活性細菌種由来のケトール酸レダクトイソメラーゼをコードする前記遺伝子コンストラクトを増幅し、発現するステップと、
ｅ）ステップ（ｄ）の前記発現された遺伝子コンストラクトを、以下の条件：
ｉ）約７．５のｐＨ、
ｉｉ）約２２．５℃の温度、および
ｉｉｉ）約１０ｍＭ超のカリウム
のもとで行われるＮＡＤＰＨ消費アッセイによって測定される際、精製タンパク質に基づく１．１μモル／分／ｍｇを超える比活性を有するものについてスクリーニングするステップと、
を含む、方法。
【請求項１８】
活性細菌種が、クロストリジウム、ザイモモナス、エシェリキア、サルモネラ、ロドコッカス、シュードモナス、バチルス、ビブリオ、乳酸桿菌、腸球菌、アルカリゲネス、クレブシエラ、パエニバチルス、アルスロバクター、コリネバクテリウム、およびブレビバクテリウムからなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ステップ（ａ）の倍加時間が、Ｍ９最少培地中で成長させる場合、大腸菌の倍加時間の８０％以下である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１】
アセトラクテートをジヒドロキシ−イソバレレートに変換するための方法であって、
ａ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ケトール酸レダクトイソメラーゼの比活性よりも高い比活性のケトール酸レダクトイソメラーゼを有するポリペプチドをコードする遺伝子コンストラクトを含む微生物宿主細胞を提供するステップと、
ｂ）（ａ）の宿主細胞をアセトラクテートと接触させるステップであって、２，３−ジヒドロキシイソバレレートが生成されるステップと、
を含む方法。
【請求項２】
遺伝子コンストラクトが、以下の条件：
ａ）約７．５のｐＨ、
ｂ）約２２．５℃の温度、および
ｃ）約１０ｍＭ超のカリウム
のもとで行われるＮＡＤＰＨ消費アッセイによって測定される際、精製タンパク質に基づく１．１μモル／分／ｍｇを超える比活性のケトール酸レダクトイソメラーゼを有するポリペプチドをコードする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
イソブタノールを生成するための方法であって、
ａ）以下の遺伝子コンストラクト：
１）ピルベートをアセトラクテートに変換する（経路ステップａ）アセトラクテートシンターゼ酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子コンストラクト；
２）（Ｓ）−アセトラクテートから２，３−ジヒドロキシイソバレレートへの変換（経路ステップｂ）において、以下の条件：
ｉ）約７．５のｐＨ、
ｉｉ）約２２．５℃の温度、および
ｉｉｉ）約１０ｍＭ超のカリウム
のもとで行われるＮＡＤＰＨ消費アッセイによって測定される際、精製タンパク質に基づく１．１μモル／分／ｍｇを超える比活性のケトール酸レダクトイソメラーゼ酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子コンストラクト；
３）２，３−ジヒドロキシイソバレレートをα−ケトイソバレレートに変換する（経路ステップｃ）ためのアセトヒドロキシ酸デヒドラターゼをコードする少なくとも１つの遺伝子コンストラクト；
４）α−ケトイソバレレートをイソブチルアルデヒドに変換する（経路ステップｄ）分岐鎖ケト酸デカルボキシラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子コンストラクト；
５）イソブチルアルデヒドをイソブタノールに変換する（経路ステップｅ）ための分岐鎖アルコールデヒドロゲナーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子コンストラクト；
を含む組換え微生物宿主細胞を提供するステップと、
ｂ）（ａ）の宿主細胞をイソブタノールが生成される条件下で成長させるステップと、
を含む方法。
【請求項４】
ケトール酸レダクトイソメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子コンストラクトがシュードモナスから単離される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
宿主細胞が、細菌、シアノバクテリア、糸状菌および酵母からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
宿主細胞が、クロストリジウム、ザイモモナス、エシェリキア、サルモネラ、ロドコッカス、シュードモナス、バチルス、乳酸桿菌、腸球菌、アルカリゲネス、クレブシエラ、
パエニバチルス、アルスロバクター、コリネバクテリウム、ブレビバクテリウム、ピキア、カンジダ、ハンセヌラ、ビブリオおよびサッカロミセスからなる群から選択される属のメンバーである、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
宿主細胞が大腸菌である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
細胞がラクトバチルス・プランタルムである、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
細胞がサッカロミセス・セレビシェである、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
アセトラクテートシンターゼが配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する、請求項３に記載の方法。
【請求項１１】
ケトール酸レダクトイソメラーゼ活性を有するポリペプチドが、配列番号３４、配列番号３５、および配列番号３６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
アセトヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性が配列番号６で示されるアミノ酸配列を有する、請求項３に記載の方法。
【請求項１３】
分岐鎖アルコールデヒドロゲナーゼが配列番号１０で示されるアミノ酸配列を有する、請求項３に記載の方法。
【請求項１４】
分岐鎖α−ケト酸デカルボキシラーゼが配列番号８で示されるアミノ酸配列を有する、請求項３に記載の方法。
【請求項１５】
大腸菌ケトール酸レダクトイソメラーゼの比活性を超える比活性を有するケトール酸レダクトイソメラーゼ酵素を含む組換え宿主細胞。
【請求項１６】
ケトール酸レダクトイソメラーゼ酵素が、以下の条件：
ａ）約７．５のｐＨ、
ｂ）約２２．５℃の温度、および
ｃ）約１０ｍＭ超のカリウム
のもとで行われるＮＡＤＰＨ消費アッセイによって測定される際、精製タンパク質に基づく１．１μモル／分／ｍｇを超える比活性を有する、請求項１５に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１７】
以下の条件：
ｉ）約７．５のｐＨ、
ｉｉ）約２２．５℃の温度、および
ｉｉｉ）約１０ｍＭ超のカリウム；
のもとで行われるＮＡＤＰＨ消費アッセイによって測定される際、精製タンパク質に基づく１．１μモル／分／ｍｇを超える比活性を有するケトール酸レダクトイソメラーゼ酵素をコードする遺伝子コンストラクトの同定および単離のための方法であって、
ａ）Ｍ９最少培地中で成長させる場合、大腸菌の倍加時間よりも短い倍加時間を有する細菌種を同定するステップと、
ｂ）（ａ）の細菌種をケトール酸レダクトイソメラーゼ活性についてスクリーニングし、活性細菌種を同定するステップと、
ｃ）（ｂ）の活性細菌種のゲノムＤＮＡを、ケトール酸レダクトイソメラーゼをコードすることで知られる遺伝子コンストラクトに対して相同性を有する核酸配列でプローブし、前記活性細菌種由来のケトール酸レダクトイソメラーゼをコードする遺伝子コンストラクトを同定し、単離するステップと、
ｄ）前記活性細菌種由来のケトール酸レダクトイソメラーゼをコードする前記遺伝子コンストラクトを増幅し、発現するステップと、
ｅ）ステップ（ｄ）の前記発現された遺伝子コンストラクトを、以下の条件：
ｉ）約７．５のｐＨ、
ｉｉ）約２２．５℃の温度、および
ｉｉｉ）約１０ｍＭ超のカリウム
のもとで行われるＮＡＤＰＨ消費アッセイによって測定される際、精製タンパク質に基づく１．１μモル／分／ｍｇを超える比活性を有するものについてスクリーニングするステップと、
を含む、方法。
【請求項１８】
活性細菌種が、クロストリジウム、ザイモモナス、エシェリキア、サルモネラ、ロドコッカス、シュードモナス、バチルス、ビブリオ、乳酸桿菌、腸球菌、アルカリゲネス、クレブシエラ、パエニバチルス、アルスロバクター、コリネバクテリウム、およびブレビバクテリウムからなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ステップ（ａ）の倍加時間が、Ｍ９最少培地中で成長させる場合、大腸菌の倍加時間の８０％以下である、請求項１７に記載の方法。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｂ】
【公表番号】特表２０１０−５２４４７０（Ｐ２０１０−５２４４７０Ａ）
【公表日】平成２２年７月２２日（２０１０．７．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５０４２１２（Ｐ２０１０−５０４２１２）
【出願日】平成２０年４月１６日（２００８．４．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６０４６６
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１３０９９５
【国際公開日】平成２０年１０月３０日（２００８．１０．３０）
【出願人】（３１００１１３１０）ビュータマックス・アドバンスド・バイオフューエルズ・エルエルシー (24)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年７月２２日（２０１０．７．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年４月１６日（２００８．４．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６０４６６
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１３０９９５
【国際公開日】平成２０年１０月３０日（２００８．１０．３０）
【出願人】（３１００１１３１０）ビュータマックス・アドバンスド・バイオフューエルズ・エルエルシー (24)
【Ｆターム（参考）】
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