活性分子の投与のためのキトサンおよびヒアルロナンのナノ粒子
本発明は、薬理学的に活性な分子のデリバリーに、および特にポリヌクレオチドを細胞へトランスフェクションするのに有用な、ナノ粒子系に関する。ナノ粒子系は低分子量キトサンおよびヒアルロナンのナノ粒子を含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬理学的に活性な分子の放出に有用な、および特にポリヌクレオチドを細胞へトランスフェクションするのに有用なナノ粒子系に関する。本発明は、低分子量キトサンおよびヒアルロナンのナノ粒子を含む系、およびそれらを含む医薬組成物および化粧品組成物、およびそれらの調製のための方法を目的とする。
【背景技術】
【０００２】
治療目的のための生物活性分子の投与は、投与経路および当該分子の物理化学的および形態学的特性に共に依存して、多数の問題を提示する。主な問題は不安定なまたはサイズの大きい活性分子を投与する際に生じることが知られている。生物の内部への高分子の到達は、生体バリアの低い透過性によって限定される。同様に、それらはヒトおよび動物の持つさまざまな防御機構のために分解されやすい。
【０００３】
ナノメートルサイズの系への高分子の組み込みは、高分子が上皮バリアを透過するのを容易にし、および高分子を分解されることから保護することが実証されている。そのため、前記バリアと相互作用できるナノ粒子系の設計が、有効成分の粘膜を通る透過を達成するために有望な戦略として提示される。
【０００４】
これらの系が外部バリアを越えおよび生物の内部に到達する能力は、系のサイズおよび系の組成に共に依存することも知られている。サイズの小さい粒子は、輸送の程度をより大きいサイズのものと比較して高める。直径１μｍ未満のナノ粒子は、この基準に対応する。系が天然および生体適合性起源のポリマーから調製される場合、公知の輸送機構によっておよび上皮生理を変えることなく、系が生物の粘膜を通って自然に輸送される可能性が高まる。
【０００５】
この意味で、キトサンはナノ粒子に正電荷を与え、それが陰イオン性の生体環境を通じた吸収および／または負に荷電した生体膜への吸着を可能にするという事実のため、キトサンがナノ粒子系の処方において天然のおよび生体適合性のポリマーとして使用されている（ＷＯ−Ａ−０１／３２７５１、ＷＯ−Ａ−９９／４７１３０、ＥＳ ２０９８１８８）。
【０００６】
これらの系の作製に使用される別のポリマーが、結合組織の細胞外マトリクスに、および眼球の硝子体に、および関節腔の滑液に存在する天然ポリマーであるヒアルロン酸である。ヒアルロン酸は生分解性および生体適合性ポリマーであり、免疫原性でなく、および粘膜付着性を有する。さらに、ヒアルロナンは、細胞の大多数に存在するＣＤ４４受容体と相互作用する。
【０００７】
このように、文書ＷＯ８９／０３２０７およびベネデッティ（Ｂｅｎｅｄｅｔｔｉ）他による記事Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １３，３３−４１ （１９９０）は、溶媒蒸発法によるヒアルロン酸マイクロスフィアの製造を示す。また、文書ＵＳ６，０６６，３４０は、溶媒抽出法を利用して前記マイクロスフィアを得る可能性に関する。
【０００８】
文書ＵＳ２００１０５３３５９は、さまざまな材料、特にゼラチン、キトサンまたはヒアルロン酸から成るが、その混合物ではない、溶液またはマイクロスフィアの形で与えられる、経鼻投与のための抗ウイルス剤および生体付着材料の組み合わせを提案する。マイクロ粒子は、噴霧および溶媒乳化／蒸発といった標準的な方法で得られる。一旦得られれば、マイクロ粒子は従来の化学架橋法（ジアルデヒドおよびジケトン）によって硬化される。
【０００９】
キトサン（または他の陽イオン性ポリマー）および ヒアルロン酸 の組み合わせは、ヒアルロン酸 の粘膜付着性をキトサンの吸収促進作用と組み合わせる目的で、およびナノ粒子の上皮バリアとの相互作用および吸収を改善するために、マイクロ粒子系およびナノ粒子系で提案されている。マイクロ粒子のこの組み合わせの値は、リム（Ｌｉｍ）他， Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌ．Ｒｅｌ．６６，２０００，２８１−２９２およびリム（Ｌｉｍ）他，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．２３，２００２，７３−８２の研究に反映されている。前の文書と同様に、これらのマイクロ粒子は溶媒乳化−蒸発法によって調製されている。
【００１０】
文書ＵＳ６，１３２，７５０は、少なくとも１種類のタンパク質（コラーゲン、ゼラチン）を含むサイズの小さい粒子（マイクロおよびナノ粒子）の調製に、およびその表面の多糖（キトサンまたは特にヒアルロン酸といったグリコサミノグリカン）に関する。それらは、アミドまたはエステル結合、および任意に無水結合を形成する多官能アシル化剤との界面架橋によって形成される。
【００１１】
文書ＷＯ２００４／１１２７５８は、活性分子の投与のためのナノ粒子系について触れ、当該ナノ粒子は、分子量１２５〜１５０ｋＤａのキトサン、コラーゲンまたはゼラチンおよびヒアルロン酸塩といった陽イオンポリマーを含む網状複合体によって構成される。それらは、異なる電荷を与える両方のポリマーの静電相互作用によって、および架橋剤の存在下でのイオンチャネル型架橋によって形成される。
【００１２】
しかし、これらの系に伴う主な短所は、ナノ粒子が生体環境に一旦組み込まれた際の、生体環境における低い生分解性である。ヒアルロン酸またはその対応する塩はヒアルロニダーゼ酵素によって細胞内で効果的に分解されることがよく知られているが、キトサン生分解性は大きく疑問視され、および活性分子のデリバリーは必要なほど効率的でない。この事実は、ナノ粒子中に存在する活性分子の放出の有効性を顕著に低下させうる。
【００１３】
さらに、これらの系に用いられるキトサンは、６．６〜６．８より高いｐＨでは不溶であり、そのことはＤＮＡといった生物活性分子を投与する際に適用可能性を減じる。
【００１４】
ＤＮＡおよびＲＮＡといったヌクレオチド分子の、遺伝子治療のための細胞へのトランスフェクションの場合には、分子を標的細胞へ効率的に導入でき、毒性が可能な限り低く、およびトランスフェクション効率が高いデリバリー系が必要である。導入される分子が適当に放出されること、およびそれが機能を可能な限り効率的に実施することが重要である。これらの分子を含む系は、患者に受容されるために、安定および容易に投与可能であるべきである。
【００１５】
したがって、生体系への非常に効率的な組み込み、および生体環境におけるナノ粒子の迅速な生分解を可能にする、有効成分の放出のための系を見出すことが非常に望まれる。さらに、これらの系は、容易に製造されおよび保存および輸送に際して安定であるべきである。
【００１６】
遺伝子治療の特定の例では、標的細胞のトランスフェクションに関して可能な限り効率的な、および患者にとって便利な系が必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
発明者らは、キトサンおよびヒアルロナンを含むナノ粒子を含みキトサンの分子量が９０ｋＤａ未満である系は、生物活性分子との効率的な結合に加えて、生体環境におけるナノ粒子の有効なおよび容易な分解を可能にし、それによって活性分子の放出を有利にすることを発見している。本発明の系は、細胞のエンドサイトーシス過程による、およびまた細胞膜の特異的受容体との相互作用による、細胞におけるナノ粒子の効率的な内在化を可能にすることが、ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験で観察されている。
【００１８】
さらに、ｉｎ ｖｉｖｏ試験は、本発明のナノ粒子が非常に有効に上皮細胞、たとえば角膜上皮細胞へ進入、およびＤＮＡプラスミドを配送し、それによって重要なトランスフェクションレベルに達する能力を実証しており、それは本発明の系を、いくつかの疾患の遺伝子治療に向けた新しい戦略にする。このトランスフェクション効率は、ナノ粒子が以前に凍結乾燥過程に供されている場合でさえ観察され、それは本発明の系がその性質および安定性に影響することなく保存されうることを可能にする。
【００１９】
本発明のナノ粒子系は、驚くべきことに、組成物に応じてｐＨ６．４ないし８．０にて安定であり、それは本発明のナノ粒子系を、経鼻、経口投与および局所投与を含むさまざまな投与様式について非常に多用途にし、および血漿のｐＨ７．４でのナノ粒子の安定性を確実にする。この安定性はまた、「ｉｎ ｖｉｔｒｏ」用途において細胞培養をトランスフェクションするために最も重要である。
【００２０】
このように、本発明の目的は、平均サイズ１マイクロメートル未満のナノ粒子を含み、ナノ粒子が
ａ）ヒアルロナンまたはその塩；および
ｂ）キトサンまたはその誘導体、
を含み、キトサンまたはその誘導体の分子量が９０ｋＤａ未満である点で特徴づけられる、生物活性分子の放出のための系に関する。
【００２１】
本発明の別の目的は、さらに生物活性分子を含む、上に記載したような系に関する。特定の一実施形態では、前記生物活性分子は、多糖、タンパク質、ペプチド、脂質、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、核酸およびその混合物から成る群から選択される。
【００２２】
本発明の特定の一実施形態では、ナノ粒子は凍結乾燥形である。
【００２３】
本発明の別の目的は、上で定義されたような系を含む医薬組成物に関する。
【００２４】
本発明の別の目的は、上で定義されたような系を含む化粧品組成物に関する。
【００２５】
本発明の別の目的は、
ａ）ヒアルロナンまたはその塩の水溶液を調製；
ｂ）キトサンまたはその誘導体の水溶液を調製；
ｃ）ヒアルロナンの水溶液へ網状化剤を添加；および
ｄ）ｂ）およびｃ）で得られた溶液を撹拌しながら混合し、ナノ粒子が自然形成；
を含み、任意に、生物活性分子が、ナノ粒子の形成前に前記水溶液ｂ）またはｃ）のいずれかに溶解されるかまたは、段階ｄ）で得られたナノ粒子懸濁液に溶解される、上で定義される系の調製のための方法に関する。
【００２６】
特定の一実施形態では、この方法はさらに、段階ｄ）の後に、ナノ粒子が凍結乾燥される追加の段階を含む。
【００２７】
最後に、本発明の別の目的は、遺伝子治療のための薬剤の調製における、上で定義されたような系の使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】ナノ粒子系におけるプラスミドｐＧＦＰのカプセル化効率。
【図２】プラスミドｐＧＦＰのｉｎ ｖｉｔｒｏ徐放。ポリマー質量比ＨＡ：ＣＳまたはＨＡ：ＣＳＯ １：２；時間：０．５、１、４および２４時間；キトシナーゼ活性：０．１０５Ｕ。
【図３】重量比２：１のキトサン（ＣＳＯ）およびヒアルロン酸（ＨＡ）を含むナノ粒子を３つの異なる細胞株（ＨＥＫ２９３、ＮＨＣおよびＨＣＥ）へ投与した際のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性。
【図４】重量比２：１のキトサン（ＣＳＯ）およびヒアルロン酸（ＨＡまたはＨＡＯ）を含むナノ粒子を投与した際の、ＨＥＫ２９３を細胞株として使用したｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性（１時間インキュベート）。
【図５】重量比２：１のキトサン（ＣＳまたはＣＳＯ）およびヒアルロン酸（ＨＡまたはＨＡＯ））を含むナノ粒子からＨＥＫ２９３細胞株へＤＮＡ−プラスミドｐＧＦＰを配送した際の、２、４、６、８および１０日後の細胞のトランスフェクション効率を示す共焦点顕微鏡像。
【図６】重量比１：１のキトサン（ＣＳ または ＣＳＯ）およびヒアルロン酸（ＨＡまたはＨＡＯ）を含むナノ粒子からＨＥＫ２９３細胞株へＤＮＡ−プラスミドｐＧＦＰを配送した際の細胞のトランスフェクション効率。
【図７】インキュベート１時間および１２時間後のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞取り込みを示す共焦点顕微鏡像。処方：重量比１：２のＨＡＯ：ＣＳＯ；ＨＡＯ：ＣＳおよびＨＡ：ＣＳ、１％のプラスミドｐＧＦＰを負荷。
【図８】細胞株ＨＣＥを用いた細胞によるナノ粒子の内在化を示す共焦点顕微鏡像：ａ）３７℃；ｂ）４℃およびｃ）Ｈｅｒｍｅｓ１抗体でＣＤ４４受容体をブロックした４℃。処方：重量比１：２のＨＡ：ＣＳＯ。
【図９】角膜上皮におけるナノ粒子分解を時間の関数として示す共焦点顕微鏡像（２、４および１２時間）。処方：重量比１：２のＨＡ：ＣＳＯおよびＨＡ：ＣＳ。
【図１０】ウサギの角膜上皮におけるコードされた緑色タンパク質の発現を示す共焦点顕微鏡像。処方：プラスミドｐＥＧＦＰを負荷した重量比１：２のＨＡ：ＣＳＯおよびＨＡ：ＣＳ。
【図１１】ＨＥＫ２９３細胞株へＤＮＡ−プラスミドｐＥＧＦＰを、重量比１：２および２：１のキトサン（分子量１４、３１および４５ｋＤａ）およびヒアルロン酸を含む凍結乾燥ナノ粒子から配送した際の、４日後の細胞トランスフェクション効率を示す共焦点顕微鏡像。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明の系は、生物活性分子を組み込むことができる、構造がヒアルロナン および分子量が ９０ｋＤａ未満のキトサンの網状物であるナノ粒子を含む。構造は電子相互作用によって結合し、その間に共有結合は実質的に無い。
【００３０】
「ナノ粒子」の語で、キトサンおよびヒアルロナンの間の静電相互作用によって、および陰イオン性網状化剤の添加による前記複合体の向イオン性ゲル化によって、形成される構造と理解される。ナノ粒子および続いての網状化の別のポリマー成分の間に生じる静電相互作用は、特徴的な物体を発生させ、その物体は独立しておりおよび観察可能であり、その平均サイズは１μｍ未満、すなわち平均サイズ１ないし９９９ｎｍである。
【００３１】
「平均サイズ」の語で、ポリマー網状構造を含み水系媒体中で一緒に動くナノ粒子集団の平均直径と理解される。これらの系の平均サイズは、当業者に公知でありおよびたとえば下記の実験の部分に記載される標準的な手順を用いて測定されうる。
【００３２】
本発明の系のナノ粒子は、平均粒子サイズ１μｍ未満であり、すなわち平均サイズ１ないし９９９ｎｍ、好ましくは５０ないし５００ｎｍ、さらにより好ましくは１００ないし３００ｎｍである。粒子の平均サイズは主に、ヒアルロナンについてのキトサンの比率によって、キトサン脱アセチル化度によって、およびまた粒子形成条件（キトサンおよびヒアルロナン濃度、網状化剤濃度およびそれらの間の重量比）によって影響される。
【００３３】
ナノ粒子は、ナノ粒子中のキトサンおよびヒアルロナンの割合に依存して変化する、表面電荷（ゼータ電位によって測定される）を有しうる。正電荷への寄与はキトサンのアミン基に起因し、一方、負電荷への寄与はヒアルロナンのカルボキシル基に起因する。キトサン／ヒアルロナン比に依存して、電荷の大きさは−５０ｍＶないし＋５０ｍＶと変化しうる。
【００３４】
しばしば、ナノ粒子と生体表面、特に負に荷電している粘膜表面との間の相互作用を改善するために、表面電荷が陽性であることが関心事である。こうすれば、生物活性分子は標的組織上で有利にふるまう。しかし、一部の場合には、非経口投与後のナノ粒子の安定性を確実にするために、中性電荷がより好ましい可能性がある。負電荷はまた、疎水性および受容体親和性相互作用の存在のため、粘膜表面への投与のために関心が持たれうる。
【００３５】
キトサン
キトサンはキチン（ポリ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン）に由来する天然起源のポリマーであり、Ｎのアセチル基の重要な部分が加水分解によって消去されている。脱アセチル化度は好ましくは４０％より大、より好ましくは６０％より大である。一変形では、脱アセチル化度は６０〜９８％の間である。キトサンはアミノ多糖構造および陽イオン性を有する。キトサンは式（Ｉ）のモノマー単位ｎ個の反復を含み：
ここでｎは整数であり、およびｍ個の単位がアセチル化アミン基を有する。ｎ＋ｍの合計は重合度、すなわちキトサン鎖中のモノマー単位の数を表す。
【００３６】
本発明のナノ粒子を製造するのに用いられるキトサンは、低分子量を有することで特徴づけられ、分子量９０ｋＤａ未満、好ましくは１ないし９０ｋＤａの上記のようなキトサンまたはその誘導体と理解される。好ましい一実施形態では、キトサンの分子量は１ないし７５ｋＤａ、より好ましくは２ないし５０ｋＤａ、さらにより好ましくは２ないし３０ｋＤａから成る。約２ないし約１５ｋＤａの範囲が特に好ましい。この分子量を持つキトサンは、さまざまな割合のＮａＮＯ2を用いたキトサンポリマーの酸化還元といった、当業者によく知られた方法によって得られる。
【００３７】
キトサンの代替として、その誘導体もまた使用でき、１つ以上の水酸基および／または１つ以上のアミン基が、キトサンの溶解性を高めるかまたはその接着性を高める目的で修飾されている、分子量９０ｋＤａ未満のキトサンと理解される。これらの誘導体は、ロバーツ（Ｒｏｂｅｒｔｓ），『キチン化学』（Ｃｈｉｔｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），マクミラン社（Ｍａｃｍｉｌｌａｎ），１９９２，１６６に記載される通り、特に、アセチル化、アルキル化またはスルホン化キトサン、チオール化誘導体を含む。好ましくは、誘導体が使用される場合は、Ｏ−アルキルエーテル、Ｏ−アシルエステル、トリメチルキトサン、ポリエチレングリコールで修飾されたキトサンなどから選択される。他の可能な誘導体は、クエン酸塩、硝酸塩、乳酸塩、リン酸塩、グルタミン酸塩などといった塩である。いずれにしろ、処方の安定性および商業的実行可能性に影響することなく、キトサンに行うことができる修飾を特定する方法は当業者に公知である。
【００３８】
分子量９０ｋＤａ未満のキトサン、またはその誘導体の使用は、本発明の系に特に重要であり、なぜならそれを含むナノ粒子は、生体環境に一旦導入されれば効率的に排出または分解が可能であり、結果として生物活性分子のより効率的なデリバリーを与えるためである。
【００３９】
ヒアルロナン
ヒアルロナンは、結合組織、上皮組織および神経組織の全体にわたって広く分布するグリコサミノグリカンである。ヒアルロナンは細胞外マトリクスの主成分の一つであり、および一般に細胞増殖および遊走に大きく寄与する。
【００４０】
ヒアルロナンは、式（ＩＩ）に示す通り交互のベータ−１，４およびベータ−１，３グリコシド結合で互いに結合した、Ｄ−グルクロン酸およびＤ−Ｎ−アセチルグルコサミンの交互の付加によって形成される二糖構造の反復を含む直鎖ポリマーであり：
ここで整数ｎは、重合度、すなわちヒアルロナン鎖中の二糖単位の数を表す。
【００４１】
両方の糖が空間的にグルコースと近縁であり、グルコースはベータ構造では、かさ高い基のすべて（水酸基、カルボン酸基、および隣接する糖のアノマー炭素）が立体的に有利なエクアトリアル位になることが可能である一方で、すべての小さい水素原子は立体的により不利なアキシアル位を占める。
【００４２】
本発明のナノ粒子を製造するのに用いられるヒアルロナンは、２ｋＤａないし１６０ｋＤａで構成される分子量を有する。本発明の特定の一実施形態では、ヒアルロナンは、２ないし５０ｋＤａ、好ましくは２ないし１０ｋＤａで構成される分子量を有するオリゴマーである。
【００４３】
高分子量のヒアルロナンは市販されており、一方、より低分子量のものは、たとえばヒアルロニダーゼ酵素を用いて、高分子量のヒアルロナンの断片化によって得ることができる。
【００４４】
この説明で使用される「ヒアルロナン」の語は、ヒアルロン酸または、その複合体基材（ヒアルロン酸）のどちらかを含む。この複合体基材は、たとえば、ナトリウム、カリウム、カルシウム、アンモニウム、マグネシウム、アルミニウムおよびリチウム塩といった無機塩、および塩基性アミノ酸塩といった有機塩を含む、ヒアルロン酸のアルカリ塩でありうる。本発明の好ましい一実施形態では、アルカリ塩はヒアルロン酸のナトリウム塩である。
【００４５】
ヒアルロナンは、無毒性、生分解性および生体適合性の天然親水性多糖である。ヒアルロナンは粘膜付着性を有し、および細胞膜に存在するＣＤ４４受容体と特異的に結合し、そのようにして細胞との相互作用に有利に作用する。
【００４６】
本発明の一変形では、系内のヒアルロナン／キトサン重量比は２：１ないし１：１０、好ましくは２：１ないし１：２ 重量：重量で構成される。キトサンのより低い割合は、凝集またはポリマー溶液が得られるため、推奨されない。
【００４７】
ナノ粒子組成（キトサン−ヒアルロナン比およびヒアルロナン、ポリマーまたはオリゴマーの分子量）に関わらず、ナノ粒子サイズは１マイクロメートル未満、好ましくは５００ｎｍ未満、より好ましくは３００ｎｍ未満に維持される。一実施形態ではナノ粒子サイズは２５０ｎｍ未満、より好ましくは２００ｎｍ未満である。このサイズは、ナノ粒子が角膜上皮細胞といった上皮細胞を透過し、および生物活性分子を配送することを可能にする。
【００４８】
本発明の系のナノ粒子は、網状化剤の存在下でキトサン−ヒアルロナン系のイオンチャネル型ゲル化によって形成され、前記網状化剤はイオン性ゲル化を可能にし、ナノ粒子の自然形成を有利にする。特定の一実施形態では、網状化剤は陰イオン塩である。好ましくは、網状化剤はトリポリリン酸であり、トリポリリン酸ナトリウム（ＴＰＰ）の使用がより好ましい。網状化過程は非常に単純であり、および本発明の背景に記載される通り当業者に公知である。
【００４９】
本発明のキトサンおよびヒアルロナンのナノ粒子は、ナノ粒子の中に、またはその表面に吸着される、生物活性分子を結合する高い能力を有する系を適用する。ヒアルロナンの分子量およびキトサン−ヒアルロナン重量比にかかわらず、ナノ粒子は活性分子の結合において９０％を上回る高い効率を示す。したがって、本発明の別の一態様は、生物活性分子をさらに含む、上記のような系に関する。
【００５０】
「生物活性分子」の語は、疾患の治療、治癒、予防または診断に使用されるかまたは、ヒトおよび動物の身体的または精神的福祉を改善するために使用される、任意の物質に関する。本発明によると、ヒアルロナンおよびキトサンのナノ粒子は、その溶解性にかかわらず、生物活性分子を組み込むのに適している。結合容量は、組み込まれた分子に依存するが、しかし一般論として、親水性分子およびまた顕著な疎水性の分子の両方について高くなる。これらの分子は、多糖、タンパク質、ペプチド、脂質、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、核酸およびその混合物を含みうる。本発明の好ましい一実施形態では、生物活性分子はポリヌクレオチドであり、好ましくはｐＥＧＦＰ、ｐＢｇａｌおよびｐＳＥＡＰといったＤＮＡプラスミドである。
【００５１】
本発明の好ましい別の一実施形態では、生物活性分子はヘパリンといった多糖である。
【００５２】
本発明の別の目的は、前に定義されたナノ粒子系を含む医薬組成物である。
【００５３】
医薬組成物の例は、経口、頬側、舌下、局所、眼、経鼻または経膣使用のための任意の液体組成物（すなわち本発明のナノ粒子の懸濁液または分散物）、または、局所、眼、経鼻または経膣投与のためのゲル、軟膏、クリームまたはバームの形の任意の組成物を含む。
【００５４】
本発明の一変形では、組成物は眼投与用である、この場合、負に荷電している粘膜および角膜上皮細胞の表面との相互作用を介して、眼表面へのより良好な吸収をナノ粒子が提供するように、ナノ粒子の表面は正に荷電している。
【００５５】
ナノ粒子に組み込まれている有効成分の割合は、系の総重量に関して重量で最大４０％に達しうる。にもかかわらず、適当な比率は個々の場合で、組み込まれる有効成分、使用される適応、およびデリバリーの効率に依存する。
【００５６】
ＤＮＡプラスミドのようなポリヌクレオチドを有効成分として組み込む具体的な場合には、その前記系中の比率は重量で１％ないし４０％、好ましくは５％ないし２０％となる。
【００５７】
ヘパリンのような多糖が組み込まれる場合、この成分の割合は系に１％ないし４０％、好ましくは１０％ないし３０％で組み込まれる。
【００５８】
本発明の別の目的は、前に定義されたナノ粒子系を含む化粧品組成物に関する。これらの化粧品組成物は、任意の液体組成物（ナノ粒子の懸濁液または分散物）または本発明の系を含みおよび局所投与用のゲル、クリーム、軟膏またはバーム（ｂａｌｍ）の形である任意の組成物を含む。
【００５９】
本発明の一変形では、化粧品組成物はまた、治療効果を何ら有しないが、化粧剤としての性質を持つ、親油性および親水性の活性分子を組み込むことができる。ナノ粒子中に組み込むことができる活性分子の中で特に、皮膚軟化剤、保存料、芳香物質、にきび薬、抗真菌剤、抗酸化剤、消臭剤、制汗剤、ふけ取り剤、脱色剤、抗脂漏剤、色素、日焼けローション、紫外線吸収剤、酵素、芳香物質が挙げられる。
【００６０】
別の一態様では、本発明は、本発明の系の調製のための、および上記のナノ粒子を含む方法に関する。前記方法は、一方で、好ましくは濃度０．１ないし５ｍｇ／ｍＬの、ヒアルロナン水溶液の調製、および他方で、好ましくは濃度０．１ないし５ｍｇ／ｍＬの、キトサン水溶液の調製を含む。
【００６１】
網状化剤の組み込みは、ヒアルロナンの水溶液への、好ましくは濃度０．０１ないし１．０ｍｇ／ｍＬでの溶解によって実施される。その後、一方はヒアルロナンおよび網状化剤を含みおよび他方はキトサンを含む、両方の水溶液を、撹拌しながら混合し、このようにして水系懸濁液中で自然にナノ粒子を得る。
【００６２】
任意に、生物活性分子を、ナノ粒子の内側に組み込むために、キトサンを含む水溶液またはヒアルロナンおよび網状化剤を含む水溶液に溶解する。
【００６３】
別の一実施形態では、ナノ粒子が一旦形成されれば、ナノ粒子表面に吸着される目的で、活性分子を水系懸濁液に溶解できる。
【００６４】
方法の一変形では、生物活性分子が親油性を示す場合、前に定義された水溶液のいずれかに組み込まれる前に、少量の水およびアセトニトリルのような水混和性有機溶媒の好ましくは約１：１の割合の混合物に溶解され、次いで、終濃度中の有機溶媒の重量濃度が常に１０％未満となるように、前記の水溶液のうちの一つに添加される。そのような場合、有機溶媒は、医薬品として許容されない限り、系から除去されなければならない。
【００６５】
本発明のキトサン−ヒアルロナンナノ粒子を調製するための方法は前記ナノ粒子が凍結乾燥される追加の段階をさらに含みうる。医薬の視点からは、凍結乾燥形でナノ粒子を利用可能にすることは重要であり、なぜならこれは保存中の安定性を改善しおよび操作すべき産物の容量を低減するためである。キトサン−ヒアルロナンナノ粒子は、凍結保護剤、濃度１ないし５％の範囲のグルコース、スクロースまたはトレハロースといった凍結保護剤の存在下で凍結乾燥されうる。実際、本発明のナノ粒子は、凍結乾燥前後の粒子サイズが顕著に変わらないという別の長所を有する。すなわち、ナノ粒子は、その性質に変化無しに凍結乾燥および再懸濁されうるという長所を有する。
【００６６】
本発明の系は、高度に効率的なキャリヤーであり、上皮細胞と相互作用することができ、およびポリヌクレオチドの細胞へのトランスフェクションを促進する高い能力を有することが実証されている。系に含まれるナノ粒子は、核酸を基礎とする分子、オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡまたはポリヌクレオチド、好ましくは目的タンパク質をコードするプラスミドＤＮＡといった遺伝物質を細胞へ組み込むことができ、そのようにして遺伝子治療において有望な媒体となる。特定の一実施形態では、プラスミドＤＮＡはｐＥＧＦＰまたはｐＳＥＡＰである。
【００６７】
ＨＥＫ２９３（ヒト胚腎臓細胞株）、ＨＣＥ（ヒト角膜上皮細胞株）およびＮＨＣ（正常ヒト結膜細胞株）といった３つの異なる細胞株でのｉｎ ｖｉｔｒｏ試験、およびある種の動物の眼上皮におけるｉｎ ｖｉｖｏ試験は、本発明の系に含まれるナノ粒子が非常に低い細胞毒性を示すこと、およびナノ粒子が細胞のエンドサイトーシス過程によって、およびまた細胞膜の特異的受容体との相互作用によって、細胞により内在化されうることを示している。ヒアルロナンの生分解による、およびキトサンの排泄または生分解によるナノ粒子の生分解は、ＤＮＡ−プラスミドの非常に効果的な方法でのデリバリーを可能にし、たとえばトランスフェクションされた細胞の２５％超について最大１０日間で、高いおよび低いトランスフェクションレベルに達する。最良のトランスフェクションレベルはナノ粒子の処方に使用されうる低分子量（１０ｋＤａ）ヒアルロナンの場合に得られた。さらに、このトランスフェクション効率はまた、ナノ粒子が凍結乾燥工程に供されている場合にも観察される。
【００６８】
驚くべきことに、キトサンは６．６〜６．８より高いｐＨで不溶であるにもかかわらず、本発明のナノ粒子系はまた、ｐＨ６．４ないし８．０でも安定である。このことは、ナノ粒子系を、経鼻、経口および局所投与を含むさまざまな投与様式について非常に多用途にする。それはまた、血漿のｐＨ７．４にてナノ粒子の安定性を確実にする。さらに、この安定性はまた、ナノ粒子を安定細胞株培養へ、または「ｉｎ ｖｉｖｏ」でトランスフェクションするのが困難な安定培養へ、適用するために興味深い。
【００６９】
したがって、本発明の別の目的は、遺伝子治療用の薬剤の調製における本発明の系の使用に関する。特定の一実施形態ではそれは、治療されている患者の細胞における機能性発現が可能な遺伝子を含むポリヌクレオチドを含む。
【００７０】
この意味で、本発明の系を用いて治療すべき疾患のいくつかの例は、ＶＥＧＦに対するアンチセンスを伴う黄斑変性症、表皮水疱症および嚢胞性線維症である。本発明の系は糖尿病性網膜症および黄斑変性症に特に有用である。それはまた、一過性形質転換図式による創傷の治癒にも使用されうる。
【００７１】
最後に、トランスフェクションの高い効率のために、合成または天然ポリヌクレオチドを含む本発明の系および組成物は、標的細胞、好ましくは哺乳類腫瘍細胞または哺乳類「正常」細胞、および幹細胞または細胞株のトランスフェクションのための使用を可能にする。それはしたがって細胞の遺伝子操作のための有用な道具である。この意味で、本発明はまた、細胞の遺伝子操作のための本発明の系の使用を対象とする。好ましくはそれは、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの拡散のデリバリーのためである。
【００７２】
一実施形態では核酸は、干渉ＲＮＡ（ｉＲＮＡ）または低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）のような、相補ｍＲＮＡと特異的に塩基対形成でき、およびｍＲＮＡ翻訳および対応するタンパク質の産生を阻害できる、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【００７３】
別の一態様によると、本発明は、核酸の組み込みおよびデリバリーのための本発明のナノ粒子の使用に関する。そのようなデリバリーは、哺乳類細胞、細胞株、幹細胞、初代細胞株といった真核細胞を含む標的細胞を対象とし、およびｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ−ｖｉｖｏトランスフェクションまたは細胞形質転換に繋がりうる。したがって、この態様によると、本発明は、本発明のナノ粒子および適当な希釈剤および／または細胞洗浄緩衝液を含む、真核細胞のトランスフェクションのためのキットに関する。
【００７４】
下記に、本発明の特徴および長所を明らかにする、いくつかの例証となる実施例が記載されるが、しかし、それらは請求項に定義される本発明の目的を限定すると解釈されない。
【実施例】
【００７５】
下記に詳細が記載される実施例に共通の過程として、ナノ粒子は、サイズ、ゼータ電位（または表面電荷）およびカプセル化効率の視点から特徴づけられている。
【００７６】
サイズ分布は、光子相関スペクトル法（ＰＣＳ；ゼータサイザー（Ｚｅｔａ Ｓｉｚｅｒ），ナノシリーズ（Ｎａｎｏ ｓｅｒｉｅｓ），ナノＺＳ（Ｎａｎｏ−ＺＳ），マルバーンインスツルメンツ社（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ），英国）を用いて実施され、ナノ粒子集団の平均サイズ値を得ている。
【００７７】
ゼータ電位はレーザードップラー流速計（ＬＤＡ；ゼータサイザー（Ｚｅｔａ Ｓｉｚｅｒ），ナノシリーズ（Ｎａｎｏ ｓｅｒｉｅｓ），ナノＺＳ（Ｎａｎｏ−ＺＳ），マルバーンインスツルメンツ社（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ），英国）を用いて測定されている。電気泳動移動度を測定するために、試料をミリＱ（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ）水で希釈した。
【００７８】
結合効率は、電気泳動ゲルによって、および遊離ｐ−ＤＮＡの正確な定量を可能にするピコグリーン（ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ）（登録商標）によって評価した。
【００７９】
実施例で使用したキトサン（プロタサン（Ｐｒｏｔａｓａｎ）ＵＰ Ｃｌ １１３）はノバマトリクスＦＭＣバイオポリマー社（Ｎｏｖａｍａｔｒｉｘ−ＦＭＣ Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ）製である。このキトサンを、１１、１４、３１、４５および７０ｋＤａの低分子量のキトサンを得るために、さまざまな重量比でＮａＮＯ2を用いた酸化還元に供する（ＣＳ／ＮａＮＯ2０．０１；０．０２；０．０５；０．１）。これらの値はＳＥＣ「サイズ排除クロマトグラフィー」によって光散乱検出器を用いて測定した。
【００８０】
実施例で使用したヒアルロナンはヒアルロン酸のナトリウム塩である。分子量１６０ｋＤａのヒアルロナンはビオイベリカ社（Ｂｉｏｉｂｅｒｉｃａ Ｓ．Ａ．）製であり、および分子量１０ｋＤａ未満のヒアルロナンは、１６０ｋＤａのヒアルロナンのヒアルロニダーゼを用いた断片化および溶液を１０ｋＤａフィルターを通すことによって得られる。
【００８１】
トリポリリン酸ナトリウムはシグマアルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｃｏ．）製であり、ＤＮＡ−プラスミドｐＥＧＦＰ、ｐＢｇａｌおよびｐＳＥＡＰはエリムバイオファーマシューティカル社（Ｅｌｉｍ．Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．）製、および使用したその他の製品はシグマアルドリッチ社製である。
【００８２】
下記の略語が実施例に使用されている。
ＣＳ：分子量１２５ｋＤａのキトサン
ＣＳＯ：１０〜１２、１４、３１、４５および７０ｋＤａの低分子量のキトサン
ＨＡ：分子量１６０ｋＤａのヒアルロン酸ナトリウム
ＨＡＯ：１０ｋＤａ未満の低分子量のヒアルロン酸ナトリウム
ＴＰＰ：トリポリリン酸ナトリウム
ＰＢＳ：リン酸塩緩衝生理食塩水
ＨＢＳＳ：ハンス緩衝塩溶液
【００８３】
実施例１．
ナノ粒子の調製
さまざまな割合のキトサン（ＣＳＯ、１１、１４、３１、４５および７０ｋＤａのさまざまな分子量を有する）およびヒアルロン酸ナトリウム（ＨＡまたはＨＡＯ）でできた、ＤＮＡ−プラスミド（ｐＥＧＦＰ、ｐＢｇａｌまたはｐＳＥＡＰ）が組み込まれたナノ粒子が、イオンチャネル型ゲル化処理によって得られた。
【００８４】
一方は０．６２５ｍｇ／ｍＬ ＣＳＯを含むミリＱ（ｍｉｌｌｉ−Ｑ）水、および他方は０．６２５ ｍｇ／ｍＬ ＨＡまたはＨＡＯ、０．０２５ｍｇ／ｍＬ ＴＰＰおよび対応するプラスミドＤＮＡを重量で５ないし２０％で変動する割合で含む、２つの水溶液を調製した。
【００８５】
比率１：２のヒアルロン酸：キトサンを含むナノ粒子については、０．７５ｍｌの第１の水溶液を０．３７５ｍｌの第２の溶液とマグネティックスターラーで撹拌しながら混合し、それによって水に懸濁したナノ粒子を自然に得た。
【００８６】
比率１：１のヒアルロン酸：キトサンを含むナノ粒子については、０．７５ｍｌの第１の水溶液を０．７５ｍｌの第２の溶液とマグネティックスターラーで撹拌しながら混合し、それによって水に懸濁したナノ粒子を自然に得た。
【００８７】
比率２：１のヒアルロン酸：キトサンを含むナノ粒子については、０．７５ｍｌの第１の水溶液を１．５ｍｌの第２の溶液とマグネティックスターラーで撹拌しながら混合し、それによって水に懸濁したナノ粒子を自然に得た。
【００８８】
比較試験のために、ＣＳＯの代わりにＣＳ（分子量１２５ｋＤａ）を含むナノ粒子もまた、同じ比率のキトサンおよびヒアルロン酸を用いて上記と同じ手順に従って調製した。
【００８９】
表Ｉに見られる通り、ナノ粒子サイズは２５０ｎｍ未満に維持される。にもかかわらず、ゼータ電位値はキトサンおよびヒアルロン酸比に依存し、ナノ粒子中のヒアルロン酸含量の増加につれて陽性が小さくなる（表１）。
【００９０】
【表１】
【００９１】
実施例２
カプセル化効率検定およびｉｎ ｖｉｔｒｏ徐放
実施例１に記載された手順に従って得られたナノ粒子（１０〜１２ｋＤａのＣＳＯまたはＣＳを含むもののどちらか）を３７℃にて緩衝培地中で撹拌しながら、プラスミドを放出させるのに十分な期間インキュベートした。放出量をさまざまな時間に電気泳動ゲルによって評価する。
【００９２】
ナノ粒子が酢酸緩衝液中でインキュベートされる場合、プラスミドの放出は起こらないことが観察される（図１）。さらに、ヒアルロン酸の分子量およびキトサン−ヒアルロン酸重量比にかかわらず、ナノ粒子は８５％を上回る結合効率を示す。
【００９３】
ナノ粒子系を分解しおよびそうして封入された分子の放出を促進するために、ナノ粒子マトリクスを更生するポリマーの分解のための特異的酵素（たとえばキトサナーゼ、０．１０５Ｕ酵素／１７０μＬ処方）を加えることも又可能である。図２は、ナノ粒子の分解後、プラスミドが１時間未満で完全に放出されることを示す。加えて、封入されたプラスミドが一旦放出されれば、その立体構造および構造が完全に維持されることが強調される。
【００９４】
実施例３
Ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性分析
細胞生存能を用量の関数として評価するために、実施例１で得られたナノ粒子懸濁液、特に１０〜１２ｋＤａの低分子量キトサンを含むものから、さまざまなナノ粒子濃度を有するようにさまざまな連続溶液を調製した。
【００９５】
この試験は３つの異なる細胞株で実施した：
・ＨＥＫ２９３（ヒト胚腎臓細胞株）
・ＨＣＥ（ヒト角膜上皮細胞株）
・ＮＨＣ（正常ヒト結膜細胞株）。
【００９６】
細胞生存能を１００％（培地のみが加えられている培養と考えられる）に対して評価するＭＴＳ検定を実施する。細胞を実験前日にウェル当たり細胞３００，０００個の量で平板播種しなければならない。培地を次いで入れ、および細胞培養をＰＢＳで２回洗浄する。その後、ナノ粒子懸濁液を細胞培養に加え、およびＨＢＳＳを１０００μＬとなるまで加える。細胞を１時間３７℃にてインキュベートし、および次いでＨＢＳＳまたはＰＢＳで洗浄する。その後、ＭＴＳ試薬（新規テトラゾリウム化合物３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム、分子内塩、の溶液から成る試薬）を加え（１２０μＬ／ウェル）およびプレートを４９０ｎｍにて３時間後に読み取る。試薬は用時調製する。
【００９７】
ナノ粒子の検定した用量は１６０、８０、４０、２０、１０および５μｇ／ｃｍ2であった。
【００９８】
細胞毒性レベルは細胞株に依存することが観察された（図３）。一般論として、本発明のナノ粒子は非常に低い毒性を示した（図４）。
【００９９】
実施例４
ナノ粒子のトランスフェクション効率のｉｎ ｖｉｔｒｏ試験
ナノ粒子系のトランスフェクション効率を証明するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験を実施例３で使用したのと同一の細胞株で実施した。
【０１００】
１０〜１２ｋＤａのＣＳＯおよびＨＡまたはＨＡＯを含むナノ粒子を、実施例１に前述された方法に従って調製した。比較試験のために、ＣＳ（Ｍw＝１２５ｋＤａ）を含むナノ粒子もまた使用した。
【０１０１】
細胞を実験開始２４時間前にウェル当たり細胞３００，０００個の量で平板播種しなければならない。培地を次いで入れ、および細胞培養をＰＢＳで２回洗浄する。その後、ウェル当たりＨＢＳＳ ３００μＬを加えた。次いで、ナノ粒子懸濁液を、１μｇ ｐＤＮＡ／ウェルが添加されるような量で加えた。細胞を５時間３７℃にてインキュベートし、次いでＨＢＳＳまたはＰＢＳで洗浄し、およびさらなる培地を加えた。この培地は翌日および発現レベルの測定前に毎回交換する。
【０１０２】
タンパク質発現レベルをトランスフェクション後２日目、および１０日間の２日毎に定量した。定量は蛍光顕微鏡法を用いて、および画像の以後の処理はフォトショップエレメンツ（ＰｈｏｔｏｓｈｏｐＥｌｅｍｅｎｔｓ）によって実施する。
【０１０３】
図５および６から、低分子量キトサン（ＣＳＯ：１０〜１２ｋＤａ）を含むナノ粒子は、分子量１２５ｋＤａのキトサンを含むナノ粒子と比較する場合、トランスフェクションされた細胞の２５％超について最大１０日間、より高いおよびより長く続くトランスフェクションレベルを示すことが観察できる。
【０１０４】
実施例５
Ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞取り込み分析
ナノ粒子の細胞系内への内在化を証明するために、細胞株ＨＥＫ２９３を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏ試験を実施した。
【０１０５】
ナノ粒子は共焦点顕微鏡で可視化されうるように調製された。したがって、ヒアルロン酸ナトリウムをフルオレセインで予め標識した。下記のナノ粒子処方を分析した：プラスミド１％を負荷した、比率１：２のＨＡＯ：ＣＳＯ［１０〜１２ｋＤａ］；ＨＡＯ：ＣＳおよびＨＡ：ＣＳ。
【０１０６】
約３００，０００細胞／ウェルを実験の２４時間前に平板播種した。続いて、培地を吸引し、次いでＰＢＳで洗浄し、および最後にナノ粒子を培養に加え、ＨＢＳＳで体積２００μＬとする。
【０１０７】
細胞培養を１または２時間インキュベートする。細胞インキュベート後、細胞核をヨウ化プロピジウムで染色し、および共焦点顕微鏡で観察するために標本を調製する。
【０１０８】
図７で見られる通り、インキュベート１時間後、ナノ粒子処方にかかわらず細胞質に蛍光が観察され、そのためナノ粒子は細胞によって効果的に内在化された。細胞培養を低分子量（１０〜１２ｋＤａ）キトサンナノ粒子［ＣＳＯ：ＨＡＯ］で処理する場合、標識されたナノ粒子は、細胞内および核周囲レベルの空胞に局在化している。この細胞内局在化は、核酸を基礎とする生体分子の細胞内デリバリーキャリヤーとしてのこれらのナノ粒子の可能性を示す。
【０１０９】
実施例６
ＣＤ４４受容体とのナノ粒子相互作用
この実施例では、ナノ粒子が、ヒアルロナンの特異的受容体であるＣＤ４４受容体との相互作用後に内在化されうるかを評価する。ナノ粒子は、ヒアルロン酸がフルオレセインアミンで予め標識されることを除き、実施例１にしたがって調製される。処方は比率１：２のＨＡ：ＣＳＯ［１０〜１２ｋＤａ］であった。
【０１１０】
この試験では、細胞株ＨＣＥを使用し、細胞を異なる温度でインキュベートした（４および３７℃）。図８ａ）およびｂ）で見られる通り、プラスミドおよびヒアルロン酸が細胞内レベルに観察できるため、ナノ粒子は細胞によって内在化される。３７℃にてナノ粒子はエンドサイトーシスによっておよび／またはＣＤ４４との相互作用によって内在化され、一方４℃では、これらのナノ粒子は受容体ＣＤ４４と相互作用する場合だけ内在化される。
【０１１１】
さらに、実験のうちの一つで、受容体ＣＤ４４はＨｅｒｍｅｓ１抗体でブロックされる。図８ｃ）に見られる通り、４℃で、前述している通り、この温度では内在化は受容体の相互作用だけによるため、ナノ粒子が内在化されていないのが観察できる。
【０１１２】
実施例７
ナノ粒子が眼上皮細胞と相互作用する、および細胞内で分解される効率のｉｎ ｖｉｖｏ試験
ナノ粒子の眼粘膜との相互作用を評価するため、比率１：２のＨＡ：ＣＳＯ［１０〜１２ｋＤａ］およびＨＡ：ＣＳの処方を含むナノ粒子を、ヒアルロン酸がフルオレセイン（ＨＡ−ｆｌ）で予め標識された以外、実施例１にしたがって調製した。ＨＡ−ｆｌの溶液を対照として使用した。ナノ粒子を遠心分離によって濃縮し、および続いてミリＱ（ｍｉｌｌｉＱ）水に再懸濁し、ナノ粒子濃度３ｍｇ／ｍＬとした。ナノ粒子０．３ｍｇを２ｋｇのウサギの眼に滴下した。２５μＬの滴下４回を１０ 分毎に実施した。
【０１１３】
動物を滴下２、４または１２時間後に屠殺し、および次いで角膜および結膜を摘出した。新鮮組織を共焦点顕微鏡で観察した。
【０１１４】
図９で見られる通り、ナノ粒子に対応する強い蛍光シグナルが、角膜および結膜の細胞の中に検出された。加えて、蛍光強度が経時的に低下することが観察され、これは分子量１０〜１２ｋＤａのキトサンを含むナノ粒子でより明瞭である。このことは、何らかの形でこれらのナノ粒子が細胞内で吸収または分解されることを示唆する。ヒアルロニダーゼが眼組織におけるヒアルロナンの分解を担うことが知られている。これらの結果は、低分子量キトサンもまた細胞内レベルで高い効率で分解されることを示し、それは上皮細胞内の生物活性分子の効率的なデリバリーを達成するために、分子量９０ｋＤａ未満のキトサンを用いることの長所を実証する。
【０１１５】
実施例８
眼組織をトランスフェクションするためのナノ粒子の効率のｉｎ ｖｉｖｏ試験
本発明のナノ粒子が眼組織を ｉｎ ｖｉｖｏでトランスフェクトする能力を測定する目的で、および眼遺伝子デリバリーのためにこれらのキャリヤーの効率を測定する目的で、実施例７に記載の手順に従って調製した、１０％ｐＧＦＰを負荷したナノ粒子を、下記の用量で２ｋｇの意識のある正常ウサギへ局所投与した：２５、５０および１００μｇ ｐＧＦＰ／眼。処方の１５μＬを１０分毎に投与した（より高い用量には、処方の排液を避けるために、３０分間の中間期間を残して、５０＋５０μＬを投与した）。動物を屠殺し、および次いで角膜および結膜を摘出した。コードされた緑色タンパク質の発現を、摘出した角膜および結膜上皮中で、トランスフェクションの２、４および７日後に、共焦点顕微鏡で観察した。図１０に観察される通り、低分子量キトサン（ＣＳＯ）を含むナノ粒子は、より低い用量でより高いトランスフェクションレベルを与え、およびしたがって遺伝子発現の持続時間を評価するのに使用された。トランスフェクションの４および７日後に、緑色の角膜細胞がまだ撮影された。
【０１１６】
これらの結果が、２５０ｇのＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットの摘出眼における遺伝子発現の評価によって、さらに確認された。この場合、ｐβｇａｌがナノ粒子系に１０％の割合で負荷されたことを除いて、同一のナノ粒子処方を使用した。
【０１１７】
体積５μＬ中のナノ粒子２．５μｇをラットに投与し、および４８時間後に動物を屠殺し、および眼を摘出し、パラホルムアルデヒドで固定し、および最後に、タンパク質の発現を可視化するために、Ｘ−ｇａｌを用いた染色に供した。
【０１１８】
これらの結果は、低分子量キトサンおよびヒアルロナンでできたナノ粒子が角膜上皮細胞に入りおよび細胞の内部で分解され、そのようにしてＤＮＡ−プラスミドを非常に有効な方法で配送し、および重要なトランスフェクションレベルに達する能力の証拠を提供する。したがって、これらのナノ粒子は、いくつかの眼科疾患の治療のためのこの特定の場合に、遺伝子治療のための新しい戦略に相当しうる。
【０１１９】
実施例９
キトサンおよびヒアルロン酸のナノ粒子の凍結乾燥
【０１２０】
実施例１にしたがって得られたナノ粒子、特にＣＳＯ：ＨＡおよびＣＳＯ：ＨＡＯを重量比２：１で含みおよびポリマー総重量に対して７％プラスミドを負荷されたものを、さまざまな凍結保護剤（重量で１および５％のスクロース、トレハロースおよびグルコース）を添加しおよび−８０℃へ冷却（−５０℃にて第１および第２乾燥）することによって凍結乾燥処理に供した。続いて、処方を水に再懸濁し、および粒子サイズを測定した。表２に示す通り、すべての処方は適切に再懸濁され、初期ナノ粒子系を生じた。
【０１２１】
【表２】
【０１２２】
後で、分子量がナノ粒子系の凍結乾燥および再懸濁にどのように影響するかを調べるため、別の凍結乾燥試験をしかし異なる分子量を持つキトサンを用いて実施した。この場合、使用したヒアルロン酸は分子量１６０ｋＤａであり、およびＣＳＯ：ＨＡ比は１：２および２：１であった。
【０１２３】
【表３】
【０１２４】
表３に示す通り、キトサン分子量（１１、１４、３１、４５または７０ｋＤａ）およびＣＳＯ：ＨＡ重量比（２：１または１：２）にかかわらず、すべての系は粒子サイズをナノメートル範囲に維持しながら適当に再懸濁される。
【０１２５】
実施例１０
異なるｐＨでのナノ粒子安定化
ＣＳＯ：ＨＡおよびＣＳＯ：ＨＡＯ（ＭｗＣＳＯ：１１ｋＤａ）を含むナノ粒子系の凍結乾燥および再懸濁後、これらをさまざまなｐＨの緩衝液で希釈した。
【０１２６】
表４から判る通り、ナノ粒子系の安定性は個々の系の組成に依存して変化する。たとえば、ＣＳＯ：ＨＡを含むナノ粒子は、ｐＨ７．４および８．０にて安定であり、一方、ＣＳＯ：ＨＡＯを含むナノ粒子は、ｐＨ６．４および８．０にて安定である。しかし、キトサンは６．６−６．８より高いｐＨでは不溶であることが知られているため、両方の系がｐＨ８．０にて安定であるのは驚くべきことである。結果として、それらのナノ粒子系は、さまざまなｐＨでの安定性のため、ＤＮＡの投与に用途が広い。
【０１２７】
【表４】
【０１２８】
さらに、ナノ粒子の安定性を、分子量４５および７０ｋＤａのキトサンを選び、さまざまなＣＳＯ：ＨＡ比（２：１、１：１、１：２）を用いて分析した。表５に示す通り、ＣＳＯ：ＨＡ重量比にかかわらず、ナノ粒子はｐＨ７．４および８．０にて安定である。
【０１２９】
【表５】
【０１３０】
また、表６から判る通り、ナノ粒子サイズはｐＨ８にて少なくとも１週間、ナノメートル範囲に維持される。
【０１３１】
【表６】
【０１３２】
実施例１１
ＨＥＫ２９３細胞株における凍結乾燥ナノ粒子のｉｎ ｖｉｔｒｏトランスフェクション試験
我々のナノ粒子系が、凍結乾燥後に、細胞培養をトランスフェクションする能力を有するかどうかを調べるために、７％のプラスミドｐＥＧＦＰを負荷したさまざまな処方のＣＳＯおよびＨＡを細胞株ＨＥＫ２９３で分析した（用量：ｐＥＧＦＰ １μｇ）。この実験に使用したキトサンの分子量は１４、３１および４５ｋＤａであり、およびＣＳＯ：ＨＡの重量比は２：１および１：２であった。これらの処方をグルコース１％（ｗ／Ｖ）の存在下で予め凍結乾燥しおよび再懸濁した。
【０１３３】
蛍光顕微鏡で撮影した画像（図１１）は、蛍光タンパク質の細胞内の存在を示し、およびしたがってそれらは、ＣＳＯおよびＨＡを含む凍結乾燥ナノ粒子系がトランスフェクションする能力を示すことを示した。写真は処方を細胞と接触させてから４日後に撮影した。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬理学的に活性な分子の放出に有用な、および特にポリヌクレオチドを細胞へトランスフェクションするのに有用なナノ粒子系に関する。本発明は、低分子量キトサンおよびヒアルロナンのナノ粒子を含む系、およびそれらを含む医薬組成物および化粧品組成物、およびそれらの調製のための方法を目的とする。
【背景技術】
【０００２】
治療目的のための生物活性分子の投与は、投与経路および当該分子の物理化学的および形態学的特性に共に依存して、多数の問題を提示する。主な問題は不安定なまたはサイズの大きい活性分子を投与する際に生じることが知られている。生物の内部への高分子の到達は、生体バリアの低い透過性によって限定される。同様に、それらはヒトおよび動物の持つさまざまな防御機構のために分解されやすい。
【０００３】
ナノメートルサイズの系への高分子の組み込みは、高分子が上皮バリアを透過するのを容易にし、および高分子を分解されることから保護することが実証されている。そのため、前記バリアと相互作用できるナノ粒子系の設計が、有効成分の粘膜を通る透過を達成するために有望な戦略として提示される。
【０００４】
これらの系が外部バリアを越えおよび生物の内部に到達する能力は、系のサイズおよび系の組成に共に依存することも知られている。サイズの小さい粒子は、輸送の程度をより大きいサイズのものと比較して高める。直径１μｍ未満のナノ粒子は、この基準に対応する。系が天然および生体適合性起源のポリマーから調製される場合、公知の輸送機構によっておよび上皮生理を変えることなく、系が生物の粘膜を通って自然に輸送される可能性が高まる。
【０００５】
この意味で、キトサンはナノ粒子に正電荷を与え、それが陰イオン性の生体環境を通じた吸収および／または負に荷電した生体膜への吸着を可能にするという事実のため、キトサンがナノ粒子系の処方において天然のおよび生体適合性のポリマーとして使用されている（ＷＯ−Ａ−０１／３２７５１、ＷＯ−Ａ−９９／４７１３０、ＥＳ ２０９８１８８）。
【０００６】
これらの系の作製に使用される別のポリマーが、結合組織の細胞外マトリクスに、および眼球の硝子体に、および関節腔の滑液に存在する天然ポリマーであるヒアルロン酸である。ヒアルロン酸は生分解性および生体適合性ポリマーであり、免疫原性でなく、および粘膜付着性を有する。さらに、ヒアルロナンは、細胞の大多数に存在するＣＤ４４受容体と相互作用する。
【０００７】
このように、文書ＷＯ８９／０３２０７およびベネデッティ（Ｂｅｎｅｄｅｔｔｉ）他による記事Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １３，３３−４１ （１９９０）は、溶媒蒸発法によるヒアルロン酸マイクロスフィアの製造を示す。また、文書ＵＳ６，０６６，３４０は、溶媒抽出法を利用して前記マイクロスフィアを得る可能性に関する。
【０００８】
文書ＵＳ２００１０５３３５９は、さまざまな材料、特にゼラチン、キトサンまたはヒアルロン酸から成るが、その混合物ではない、溶液またはマイクロスフィアの形で与えられる、経鼻投与のための抗ウイルス剤および生体付着材料の組み合わせを提案する。マイクロ粒子は、噴霧および溶媒乳化／蒸発といった標準的な方法で得られる。一旦得られれば、マイクロ粒子は従来の化学架橋法（ジアルデヒドおよびジケトン）によって硬化される。
【０００９】
キトサン（または他の陽イオン性ポリマー）および ヒアルロン酸 の組み合わせは、ヒアルロン酸 の粘膜付着性をキトサンの吸収促進作用と組み合わせる目的で、およびナノ粒子の上皮バリアとの相互作用および吸収を改善するために、マイクロ粒子系およびナノ粒子系で提案されている。マイクロ粒子のこの組み合わせの値は、リム（Ｌｉｍ）他， Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌ．Ｒｅｌ．６６，２０００，２８１−２９２およびリム（Ｌｉｍ）他，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．２３，２００２，７３−８２の研究に反映されている。前の文書と同様に、これらのマイクロ粒子は溶媒乳化−蒸発法によって調製されている。
【００１０】
文書ＵＳ６，１３２，７５０は、少なくとも１種類のタンパク質（コラーゲン、ゼラチン）を含むサイズの小さい粒子（マイクロおよびナノ粒子）の調製に、およびその表面の多糖（キトサンまたは特にヒアルロン酸といったグリコサミノグリカン）に関する。それらは、アミドまたはエステル結合、および任意に無水結合を形成する多官能アシル化剤との界面架橋によって形成される。
【００１１】
文書ＷＯ２００４／１１２７５８は、活性分子の投与のためのナノ粒子系について触れ、当該ナノ粒子は、分子量１２５〜１５０ｋＤａのキトサン、コラーゲンまたはゼラチンおよびヒアルロン酸塩といった陽イオンポリマーを含む網状複合体によって構成される。それらは、異なる電荷を与える両方のポリマーの静電相互作用によって、および架橋剤の存在下でのイオンチャネル型架橋によって形成される。
【００１２】
しかし、これらの系に伴う主な短所は、ナノ粒子が生体環境に一旦組み込まれた際の、生体環境における低い生分解性である。ヒアルロン酸またはその対応する塩はヒアルロニダーゼ酵素によって細胞内で効果的に分解されることがよく知られているが、キトサン生分解性は大きく疑問視され、および活性分子のデリバリーは必要なほど効率的でない。この事実は、ナノ粒子中に存在する活性分子の放出の有効性を顕著に低下させうる。
【００１３】
さらに、これらの系に用いられるキトサンは、６．６〜６．８より高いｐＨでは不溶であり、そのことはＤＮＡといった生物活性分子を投与する際に適用可能性を減じる。
【００１４】
ＤＮＡおよびＲＮＡといったヌクレオチド分子の、遺伝子治療のための細胞へのトランスフェクションの場合には、分子を標的細胞へ効率的に導入でき、毒性が可能な限り低く、およびトランスフェクション効率が高いデリバリー系が必要である。導入される分子が適当に放出されること、およびそれが機能を可能な限り効率的に実施することが重要である。これらの分子を含む系は、患者に受容されるために、安定および容易に投与可能であるべきである。
【００１５】
したがって、生体系への非常に効率的な組み込み、および生体環境におけるナノ粒子の迅速な生分解を可能にする、有効成分の放出のための系を見出すことが非常に望まれる。さらに、これらの系は、容易に製造されおよび保存および輸送に際して安定であるべきである。
【００１６】
遺伝子治療の特定の例では、標的細胞のトランスフェクションに関して可能な限り効率的な、および患者にとって便利な系が必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
発明者らは、キトサンおよびヒアルロナンを含むナノ粒子を含みキトサンの分子量が９０ｋＤａ未満である系は、生物活性分子との効率的な結合に加えて、生体環境におけるナノ粒子の有効なおよび容易な分解を可能にし、それによって活性分子の放出を有利にすることを発見している。本発明の系は、細胞のエンドサイトーシス過程による、およびまた細胞膜の特異的受容体との相互作用による、細胞におけるナノ粒子の効率的な内在化を可能にすることが、ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験で観察されている。
【００１８】
さらに、ｉｎ ｖｉｖｏ試験は、本発明のナノ粒子が非常に有効に上皮細胞、たとえば角膜上皮細胞へ進入、およびＤＮＡプラスミドを配送し、それによって重要なトランスフェクションレベルに達する能力を実証しており、それは本発明の系を、いくつかの疾患の遺伝子治療に向けた新しい戦略にする。このトランスフェクション効率は、ナノ粒子が以前に凍結乾燥過程に供されている場合でさえ観察され、それは本発明の系がその性質および安定性に影響することなく保存されうることを可能にする。
【００１９】
本発明のナノ粒子系は、驚くべきことに、組成物に応じてｐＨ６．４ないし８．０にて安定であり、それは本発明のナノ粒子系を、経鼻、経口投与および局所投与を含むさまざまな投与様式について非常に多用途にし、および血漿のｐＨ７．４でのナノ粒子の安定性を確実にする。この安定性はまた、「ｉｎ ｖｉｔｒｏ」用途において細胞培養をトランスフェクションするために最も重要である。
【００２０】
このように、本発明の目的は、平均サイズ１マイクロメートル未満のナノ粒子を含み、ナノ粒子が
ａ）ヒアルロナンまたはその塩；および
ｂ）キトサンまたはその誘導体、
を含み、キトサンまたはその誘導体の分子量が９０ｋＤａ未満である点で特徴づけられる、生物活性分子の放出のための系に関する。
【００２１】
本発明の別の目的は、さらに生物活性分子を含む、上に記載したような系に関する。特定の一実施形態では、前記生物活性分子は、多糖、タンパク質、ペプチド、脂質、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、核酸およびその混合物から成る群から選択される。
【００２２】
本発明の特定の一実施形態では、ナノ粒子は凍結乾燥形である。
【００２３】
本発明の別の目的は、上で定義されたような系を含む医薬組成物に関する。
【００２４】
本発明の別の目的は、上で定義されたような系を含む化粧品組成物に関する。
【００２５】
本発明の別の目的は、
ａ）ヒアルロナンまたはその塩の水溶液を調製；
ｂ）キトサンまたはその誘導体の水溶液を調製；
ｃ）ヒアルロナンの水溶液へ網状化剤を添加；および
ｄ）ｂ）およびｃ）で得られた溶液を撹拌しながら混合し、ナノ粒子が自然形成；
を含み、任意に、生物活性分子が、ナノ粒子の形成前に前記水溶液ｂ）またはｃ）のいずれかに溶解されるかまたは、段階ｄ）で得られたナノ粒子懸濁液に溶解される、上で定義される系の調製のための方法に関する。
【００２６】
特定の一実施形態では、この方法はさらに、段階ｄ）の後に、ナノ粒子が凍結乾燥される追加の段階を含む。
【００２７】
最後に、本発明の別の目的は、遺伝子治療のための薬剤の調製における、上で定義されたような系の使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】ナノ粒子系におけるプラスミドｐＧＦＰのカプセル化効率。
【図２】プラスミドｐＧＦＰのｉｎ ｖｉｔｒｏ徐放。ポリマー質量比ＨＡ：ＣＳまたはＨＡ：ＣＳＯ １：２；時間：０．５、１、４および２４時間；キトシナーゼ活性：０．１０５Ｕ。
【図３】重量比２：１のキトサン（ＣＳＯ）およびヒアルロン酸（ＨＡ）を含むナノ粒子を３つの異なる細胞株（ＨＥＫ２９３、ＮＨＣおよびＨＣＥ）へ投与した際のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性。
【図４】重量比２：１のキトサン（ＣＳＯ）およびヒアルロン酸（ＨＡまたはＨＡＯ）を含むナノ粒子を投与した際の、ＨＥＫ２９３を細胞株として使用したｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性（１時間インキュベート）。
【図５】重量比２：１のキトサン（ＣＳまたはＣＳＯ）およびヒアルロン酸（ＨＡまたはＨＡＯ））を含むナノ粒子からＨＥＫ２９３細胞株へＤＮＡ−プラスミドｐＧＦＰを配送した際の、２、４、６、８および１０日後の細胞のトランスフェクション効率を示す共焦点顕微鏡像。
【図６】重量比１：１のキトサン（ＣＳ または ＣＳＯ）およびヒアルロン酸（ＨＡまたはＨＡＯ）を含むナノ粒子からＨＥＫ２９３細胞株へＤＮＡ−プラスミドｐＧＦＰを配送した際の細胞のトランスフェクション効率。
【図７】インキュベート１時間および１２時間後のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞取り込みを示す共焦点顕微鏡像。処方：重量比１：２のＨＡＯ：ＣＳＯ；ＨＡＯ：ＣＳおよびＨＡ：ＣＳ、１％のプラスミドｐＧＦＰを負荷。
【図８】細胞株ＨＣＥを用いた細胞によるナノ粒子の内在化を示す共焦点顕微鏡像：ａ）３７℃；ｂ）４℃およびｃ）Ｈｅｒｍｅｓ１抗体でＣＤ４４受容体をブロックした４℃。処方：重量比１：２のＨＡ：ＣＳＯ。
【図９】角膜上皮におけるナノ粒子分解を時間の関数として示す共焦点顕微鏡像（２、４および１２時間）。処方：重量比１：２のＨＡ：ＣＳＯおよびＨＡ：ＣＳ。
【図１０】ウサギの角膜上皮におけるコードされた緑色タンパク質の発現を示す共焦点顕微鏡像。処方：プラスミドｐＥＧＦＰを負荷した重量比１：２のＨＡ：ＣＳＯおよびＨＡ：ＣＳ。
【図１１】ＨＥＫ２９３細胞株へＤＮＡ−プラスミドｐＥＧＦＰを、重量比１：２および２：１のキトサン（分子量１４、３１および４５ｋＤａ）およびヒアルロン酸を含む凍結乾燥ナノ粒子から配送した際の、４日後の細胞トランスフェクション効率を示す共焦点顕微鏡像。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明の系は、生物活性分子を組み込むことができる、構造がヒアルロナン および分子量が ９０ｋＤａ未満のキトサンの網状物であるナノ粒子を含む。構造は電子相互作用によって結合し、その間に共有結合は実質的に無い。
【００３０】
「ナノ粒子」の語で、キトサンおよびヒアルロナンの間の静電相互作用によって、および陰イオン性網状化剤の添加による前記複合体の向イオン性ゲル化によって、形成される構造と理解される。ナノ粒子および続いての網状化の別のポリマー成分の間に生じる静電相互作用は、特徴的な物体を発生させ、その物体は独立しておりおよび観察可能であり、その平均サイズは１μｍ未満、すなわち平均サイズ１ないし９９９ｎｍである。
【００３１】
「平均サイズ」の語で、ポリマー網状構造を含み水系媒体中で一緒に動くナノ粒子集団の平均直径と理解される。これらの系の平均サイズは、当業者に公知でありおよびたとえば下記の実験の部分に記載される標準的な手順を用いて測定されうる。
【００３２】
本発明の系のナノ粒子は、平均粒子サイズ１μｍ未満であり、すなわち平均サイズ１ないし９９９ｎｍ、好ましくは５０ないし５００ｎｍ、さらにより好ましくは１００ないし３００ｎｍである。粒子の平均サイズは主に、ヒアルロナンについてのキトサンの比率によって、キトサン脱アセチル化度によって、およびまた粒子形成条件（キトサンおよびヒアルロナン濃度、網状化剤濃度およびそれらの間の重量比）によって影響される。
【００３３】
ナノ粒子は、ナノ粒子中のキトサンおよびヒアルロナンの割合に依存して変化する、表面電荷（ゼータ電位によって測定される）を有しうる。正電荷への寄与はキトサンのアミン基に起因し、一方、負電荷への寄与はヒアルロナンのカルボキシル基に起因する。キトサン／ヒアルロナン比に依存して、電荷の大きさは−５０ｍＶないし＋５０ｍＶと変化しうる。
【００３４】
しばしば、ナノ粒子と生体表面、特に負に荷電している粘膜表面との間の相互作用を改善するために、表面電荷が陽性であることが関心事である。こうすれば、生物活性分子は標的組織上で有利にふるまう。しかし、一部の場合には、非経口投与後のナノ粒子の安定性を確実にするために、中性電荷がより好ましい可能性がある。負電荷はまた、疎水性および受容体親和性相互作用の存在のため、粘膜表面への投与のために関心が持たれうる。
【００３５】
キトサン
キトサンはキチン（ポリ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン）に由来する天然起源のポリマーであり、Ｎのアセチル基の重要な部分が加水分解によって消去されている。脱アセチル化度は好ましくは４０％より大、より好ましくは６０％より大である。一変形では、脱アセチル化度は６０〜９８％の間である。キトサンはアミノ多糖構造および陽イオン性を有する。キトサンは式（Ｉ）のモノマー単位ｎ個の反復を含み：
ここでｎは整数であり、およびｍ個の単位がアセチル化アミン基を有する。ｎ＋ｍの合計は重合度、すなわちキトサン鎖中のモノマー単位の数を表す。
【００３６】
本発明のナノ粒子を製造するのに用いられるキトサンは、低分子量を有することで特徴づけられ、分子量９０ｋＤａ未満、好ましくは１ないし９０ｋＤａの上記のようなキトサンまたはその誘導体と理解される。好ましい一実施形態では、キトサンの分子量は１ないし７５ｋＤａ、より好ましくは２ないし５０ｋＤａ、さらにより好ましくは２ないし３０ｋＤａから成る。約２ないし約１５ｋＤａの範囲が特に好ましい。この分子量を持つキトサンは、さまざまな割合のＮａＮＯ2を用いたキトサンポリマーの酸化還元といった、当業者によく知られた方法によって得られる。
【００３７】
キトサンの代替として、その誘導体もまた使用でき、１つ以上の水酸基および／または１つ以上のアミン基が、キトサンの溶解性を高めるかまたはその接着性を高める目的で修飾されている、分子量９０ｋＤａ未満のキトサンと理解される。これらの誘導体は、ロバーツ（Ｒｏｂｅｒｔｓ），『キチン化学』（Ｃｈｉｔｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），マクミラン社（Ｍａｃｍｉｌｌａｎ），１９９２，１６６に記載される通り、特に、アセチル化、アルキル化またはスルホン化キトサン、チオール化誘導体を含む。好ましくは、誘導体が使用される場合は、Ｏ−アルキルエーテル、Ｏ−アシルエステル、トリメチルキトサン、ポリエチレングリコールで修飾されたキトサンなどから選択される。他の可能な誘導体は、クエン酸塩、硝酸塩、乳酸塩、リン酸塩、グルタミン酸塩などといった塩である。いずれにしろ、処方の安定性および商業的実行可能性に影響することなく、キトサンに行うことができる修飾を特定する方法は当業者に公知である。
【００３８】
分子量９０ｋＤａ未満のキトサン、またはその誘導体の使用は、本発明の系に特に重要であり、なぜならそれを含むナノ粒子は、生体環境に一旦導入されれば効率的に排出または分解が可能であり、結果として生物活性分子のより効率的なデリバリーを与えるためである。
【００３９】
ヒアルロナン
ヒアルロナンは、結合組織、上皮組織および神経組織の全体にわたって広く分布するグリコサミノグリカンである。ヒアルロナンは細胞外マトリクスの主成分の一つであり、および一般に細胞増殖および遊走に大きく寄与する。
【００４０】
ヒアルロナンは、式（ＩＩ）に示す通り交互のベータ−１，４およびベータ−１，３グリコシド結合で互いに結合した、Ｄ−グルクロン酸およびＤ−Ｎ−アセチルグルコサミンの交互の付加によって形成される二糖構造の反復を含む直鎖ポリマーであり：
ここで整数ｎは、重合度、すなわちヒアルロナン鎖中の二糖単位の数を表す。
【００４１】
両方の糖が空間的にグルコースと近縁であり、グルコースはベータ構造では、かさ高い基のすべて（水酸基、カルボン酸基、および隣接する糖のアノマー炭素）が立体的に有利なエクアトリアル位になることが可能である一方で、すべての小さい水素原子は立体的により不利なアキシアル位を占める。
【００４２】
本発明のナノ粒子を製造するのに用いられるヒアルロナンは、２ｋＤａないし１６０ｋＤａで構成される分子量を有する。本発明の特定の一実施形態では、ヒアルロナンは、２ないし５０ｋＤａ、好ましくは２ないし１０ｋＤａで構成される分子量を有するオリゴマーである。
【００４３】
高分子量のヒアルロナンは市販されており、一方、より低分子量のものは、たとえばヒアルロニダーゼ酵素を用いて、高分子量のヒアルロナンの断片化によって得ることができる。
【００４４】
この説明で使用される「ヒアルロナン」の語は、ヒアルロン酸または、その複合体基材（ヒアルロン酸）のどちらかを含む。この複合体基材は、たとえば、ナトリウム、カリウム、カルシウム、アンモニウム、マグネシウム、アルミニウムおよびリチウム塩といった無機塩、および塩基性アミノ酸塩といった有機塩を含む、ヒアルロン酸のアルカリ塩でありうる。本発明の好ましい一実施形態では、アルカリ塩はヒアルロン酸のナトリウム塩である。
【００４５】
ヒアルロナンは、無毒性、生分解性および生体適合性の天然親水性多糖である。ヒアルロナンは粘膜付着性を有し、および細胞膜に存在するＣＤ４４受容体と特異的に結合し、そのようにして細胞との相互作用に有利に作用する。
【００４６】
本発明の一変形では、系内のヒアルロナン／キトサン重量比は２：１ないし１：１０、好ましくは２：１ないし１：２ 重量：重量で構成される。キトサンのより低い割合は、凝集またはポリマー溶液が得られるため、推奨されない。
【００４７】
ナノ粒子組成（キトサン−ヒアルロナン比およびヒアルロナン、ポリマーまたはオリゴマーの分子量）に関わらず、ナノ粒子サイズは１マイクロメートル未満、好ましくは５００ｎｍ未満、より好ましくは３００ｎｍ未満に維持される。一実施形態ではナノ粒子サイズは２５０ｎｍ未満、より好ましくは２００ｎｍ未満である。このサイズは、ナノ粒子が角膜上皮細胞といった上皮細胞を透過し、および生物活性分子を配送することを可能にする。
【００４８】
本発明の系のナノ粒子は、網状化剤の存在下でキトサン−ヒアルロナン系のイオンチャネル型ゲル化によって形成され、前記網状化剤はイオン性ゲル化を可能にし、ナノ粒子の自然形成を有利にする。特定の一実施形態では、網状化剤は陰イオン塩である。好ましくは、網状化剤はトリポリリン酸であり、トリポリリン酸ナトリウム（ＴＰＰ）の使用がより好ましい。網状化過程は非常に単純であり、および本発明の背景に記載される通り当業者に公知である。
【００４９】
本発明のキトサンおよびヒアルロナンのナノ粒子は、ナノ粒子の中に、またはその表面に吸着される、生物活性分子を結合する高い能力を有する系を適用する。ヒアルロナンの分子量およびキトサン−ヒアルロナン重量比にかかわらず、ナノ粒子は活性分子の結合において９０％を上回る高い効率を示す。したがって、本発明の別の一態様は、生物活性分子をさらに含む、上記のような系に関する。
【００５０】
「生物活性分子」の語は、疾患の治療、治癒、予防または診断に使用されるかまたは、ヒトおよび動物の身体的または精神的福祉を改善するために使用される、任意の物質に関する。本発明によると、ヒアルロナンおよびキトサンのナノ粒子は、その溶解性にかかわらず、生物活性分子を組み込むのに適している。結合容量は、組み込まれた分子に依存するが、しかし一般論として、親水性分子およびまた顕著な疎水性の分子の両方について高くなる。これらの分子は、多糖、タンパク質、ペプチド、脂質、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、核酸およびその混合物を含みうる。本発明の好ましい一実施形態では、生物活性分子はポリヌクレオチドであり、好ましくはｐＥＧＦＰ、ｐＢｇａｌおよびｐＳＥＡＰといったＤＮＡプラスミドである。
【００５１】
本発明の好ましい別の一実施形態では、生物活性分子はヘパリンといった多糖である。
【００５２】
本発明の別の目的は、前に定義されたナノ粒子系を含む医薬組成物である。
【００５３】
医薬組成物の例は、経口、頬側、舌下、局所、眼、経鼻または経膣使用のための任意の液体組成物（すなわち本発明のナノ粒子の懸濁液または分散物）、または、局所、眼、経鼻または経膣投与のためのゲル、軟膏、クリームまたはバームの形の任意の組成物を含む。
【００５４】
本発明の一変形では、組成物は眼投与用である、この場合、負に荷電している粘膜および角膜上皮細胞の表面との相互作用を介して、眼表面へのより良好な吸収をナノ粒子が提供するように、ナノ粒子の表面は正に荷電している。
【００５５】
ナノ粒子に組み込まれている有効成分の割合は、系の総重量に関して重量で最大４０％に達しうる。にもかかわらず、適当な比率は個々の場合で、組み込まれる有効成分、使用される適応、およびデリバリーの効率に依存する。
【００５６】
ＤＮＡプラスミドのようなポリヌクレオチドを有効成分として組み込む具体的な場合には、その前記系中の比率は重量で１％ないし４０％、好ましくは５％ないし２０％となる。
【００５７】
ヘパリンのような多糖が組み込まれる場合、この成分の割合は系に１％ないし４０％、好ましくは１０％ないし３０％で組み込まれる。
【００５８】
本発明の別の目的は、前に定義されたナノ粒子系を含む化粧品組成物に関する。これらの化粧品組成物は、任意の液体組成物（ナノ粒子の懸濁液または分散物）または本発明の系を含みおよび局所投与用のゲル、クリーム、軟膏またはバーム（ｂａｌｍ）の形である任意の組成物を含む。
【００５９】
本発明の一変形では、化粧品組成物はまた、治療効果を何ら有しないが、化粧剤としての性質を持つ、親油性および親水性の活性分子を組み込むことができる。ナノ粒子中に組み込むことができる活性分子の中で特に、皮膚軟化剤、保存料、芳香物質、にきび薬、抗真菌剤、抗酸化剤、消臭剤、制汗剤、ふけ取り剤、脱色剤、抗脂漏剤、色素、日焼けローション、紫外線吸収剤、酵素、芳香物質が挙げられる。
【００６０】
別の一態様では、本発明は、本発明の系の調製のための、および上記のナノ粒子を含む方法に関する。前記方法は、一方で、好ましくは濃度０．１ないし５ｍｇ／ｍＬの、ヒアルロナン水溶液の調製、および他方で、好ましくは濃度０．１ないし５ｍｇ／ｍＬの、キトサン水溶液の調製を含む。
【００６１】
網状化剤の組み込みは、ヒアルロナンの水溶液への、好ましくは濃度０．０１ないし１．０ｍｇ／ｍＬでの溶解によって実施される。その後、一方はヒアルロナンおよび網状化剤を含みおよび他方はキトサンを含む、両方の水溶液を、撹拌しながら混合し、このようにして水系懸濁液中で自然にナノ粒子を得る。
【００６２】
任意に、生物活性分子を、ナノ粒子の内側に組み込むために、キトサンを含む水溶液またはヒアルロナンおよび網状化剤を含む水溶液に溶解する。
【００６３】
別の一実施形態では、ナノ粒子が一旦形成されれば、ナノ粒子表面に吸着される目的で、活性分子を水系懸濁液に溶解できる。
【００６４】
方法の一変形では、生物活性分子が親油性を示す場合、前に定義された水溶液のいずれかに組み込まれる前に、少量の水およびアセトニトリルのような水混和性有機溶媒の好ましくは約１：１の割合の混合物に溶解され、次いで、終濃度中の有機溶媒の重量濃度が常に１０％未満となるように、前記の水溶液のうちの一つに添加される。そのような場合、有機溶媒は、医薬品として許容されない限り、系から除去されなければならない。
【００６５】
本発明のキトサン−ヒアルロナンナノ粒子を調製するための方法は前記ナノ粒子が凍結乾燥される追加の段階をさらに含みうる。医薬の視点からは、凍結乾燥形でナノ粒子を利用可能にすることは重要であり、なぜならこれは保存中の安定性を改善しおよび操作すべき産物の容量を低減するためである。キトサン−ヒアルロナンナノ粒子は、凍結保護剤、濃度１ないし５％の範囲のグルコース、スクロースまたはトレハロースといった凍結保護剤の存在下で凍結乾燥されうる。実際、本発明のナノ粒子は、凍結乾燥前後の粒子サイズが顕著に変わらないという別の長所を有する。すなわち、ナノ粒子は、その性質に変化無しに凍結乾燥および再懸濁されうるという長所を有する。
【００６６】
本発明の系は、高度に効率的なキャリヤーであり、上皮細胞と相互作用することができ、およびポリヌクレオチドの細胞へのトランスフェクションを促進する高い能力を有することが実証されている。系に含まれるナノ粒子は、核酸を基礎とする分子、オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡまたはポリヌクレオチド、好ましくは目的タンパク質をコードするプラスミドＤＮＡといった遺伝物質を細胞へ組み込むことができ、そのようにして遺伝子治療において有望な媒体となる。特定の一実施形態では、プラスミドＤＮＡはｐＥＧＦＰまたはｐＳＥＡＰである。
【００６７】
ＨＥＫ２９３（ヒト胚腎臓細胞株）、ＨＣＥ（ヒト角膜上皮細胞株）およびＮＨＣ（正常ヒト結膜細胞株）といった３つの異なる細胞株でのｉｎ ｖｉｔｒｏ試験、およびある種の動物の眼上皮におけるｉｎ ｖｉｖｏ試験は、本発明の系に含まれるナノ粒子が非常に低い細胞毒性を示すこと、およびナノ粒子が細胞のエンドサイトーシス過程によって、およびまた細胞膜の特異的受容体との相互作用によって、細胞により内在化されうることを示している。ヒアルロナンの生分解による、およびキトサンの排泄または生分解によるナノ粒子の生分解は、ＤＮＡ−プラスミドの非常に効果的な方法でのデリバリーを可能にし、たとえばトランスフェクションされた細胞の２５％超について最大１０日間で、高いおよび低いトランスフェクションレベルに達する。最良のトランスフェクションレベルはナノ粒子の処方に使用されうる低分子量（１０ｋＤａ）ヒアルロナンの場合に得られた。さらに、このトランスフェクション効率はまた、ナノ粒子が凍結乾燥工程に供されている場合にも観察される。
【００６８】
驚くべきことに、キトサンは６．６〜６．８より高いｐＨで不溶であるにもかかわらず、本発明のナノ粒子系はまた、ｐＨ６．４ないし８．０でも安定である。このことは、ナノ粒子系を、経鼻、経口および局所投与を含むさまざまな投与様式について非常に多用途にする。それはまた、血漿のｐＨ７．４にてナノ粒子の安定性を確実にする。さらに、この安定性はまた、ナノ粒子を安定細胞株培養へ、または「ｉｎ ｖｉｖｏ」でトランスフェクションするのが困難な安定培養へ、適用するために興味深い。
【００６９】
したがって、本発明の別の目的は、遺伝子治療用の薬剤の調製における本発明の系の使用に関する。特定の一実施形態ではそれは、治療されている患者の細胞における機能性発現が可能な遺伝子を含むポリヌクレオチドを含む。
【００７０】
この意味で、本発明の系を用いて治療すべき疾患のいくつかの例は、ＶＥＧＦに対するアンチセンスを伴う黄斑変性症、表皮水疱症および嚢胞性線維症である。本発明の系は糖尿病性網膜症および黄斑変性症に特に有用である。それはまた、一過性形質転換図式による創傷の治癒にも使用されうる。
【００７１】
最後に、トランスフェクションの高い効率のために、合成または天然ポリヌクレオチドを含む本発明の系および組成物は、標的細胞、好ましくは哺乳類腫瘍細胞または哺乳類「正常」細胞、および幹細胞または細胞株のトランスフェクションのための使用を可能にする。それはしたがって細胞の遺伝子操作のための有用な道具である。この意味で、本発明はまた、細胞の遺伝子操作のための本発明の系の使用を対象とする。好ましくはそれは、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの拡散のデリバリーのためである。
【００７２】
一実施形態では核酸は、干渉ＲＮＡ（ｉＲＮＡ）または低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）のような、相補ｍＲＮＡと特異的に塩基対形成でき、およびｍＲＮＡ翻訳および対応するタンパク質の産生を阻害できる、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【００７３】
別の一態様によると、本発明は、核酸の組み込みおよびデリバリーのための本発明のナノ粒子の使用に関する。そのようなデリバリーは、哺乳類細胞、細胞株、幹細胞、初代細胞株といった真核細胞を含む標的細胞を対象とし、およびｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ−ｖｉｖｏトランスフェクションまたは細胞形質転換に繋がりうる。したがって、この態様によると、本発明は、本発明のナノ粒子および適当な希釈剤および／または細胞洗浄緩衝液を含む、真核細胞のトランスフェクションのためのキットに関する。
【００７４】
下記に、本発明の特徴および長所を明らかにする、いくつかの例証となる実施例が記載されるが、しかし、それらは請求項に定義される本発明の目的を限定すると解釈されない。
【実施例】
【００７５】
下記に詳細が記載される実施例に共通の過程として、ナノ粒子は、サイズ、ゼータ電位（または表面電荷）およびカプセル化効率の視点から特徴づけられている。
【００７６】
サイズ分布は、光子相関スペクトル法（ＰＣＳ；ゼータサイザー（Ｚｅｔａ Ｓｉｚｅｒ），ナノシリーズ（Ｎａｎｏ ｓｅｒｉｅｓ），ナノＺＳ（Ｎａｎｏ−ＺＳ），マルバーンインスツルメンツ社（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ），英国）を用いて実施され、ナノ粒子集団の平均サイズ値を得ている。
【００７７】
ゼータ電位はレーザードップラー流速計（ＬＤＡ；ゼータサイザー（Ｚｅｔａ Ｓｉｚｅｒ），ナノシリーズ（Ｎａｎｏ ｓｅｒｉｅｓ），ナノＺＳ（Ｎａｎｏ−ＺＳ），マルバーンインスツルメンツ社（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ），英国）を用いて測定されている。電気泳動移動度を測定するために、試料をミリＱ（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ）水で希釈した。
【００７８】
結合効率は、電気泳動ゲルによって、および遊離ｐ−ＤＮＡの正確な定量を可能にするピコグリーン（ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ）（登録商標）によって評価した。
【００７９】
実施例で使用したキトサン（プロタサン（Ｐｒｏｔａｓａｎ）ＵＰ Ｃｌ １１３）はノバマトリクスＦＭＣバイオポリマー社（Ｎｏｖａｍａｔｒｉｘ−ＦＭＣ Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ）製である。このキトサンを、１１、１４、３１、４５および７０ｋＤａの低分子量のキトサンを得るために、さまざまな重量比でＮａＮＯ2を用いた酸化還元に供する（ＣＳ／ＮａＮＯ2０．０１；０．０２；０．０５；０．１）。これらの値はＳＥＣ「サイズ排除クロマトグラフィー」によって光散乱検出器を用いて測定した。
【００８０】
実施例で使用したヒアルロナンはヒアルロン酸のナトリウム塩である。分子量１６０ｋＤａのヒアルロナンはビオイベリカ社（Ｂｉｏｉｂｅｒｉｃａ Ｓ．Ａ．）製であり、および分子量１０ｋＤａ未満のヒアルロナンは、１６０ｋＤａのヒアルロナンのヒアルロニダーゼを用いた断片化および溶液を１０ｋＤａフィルターを通すことによって得られる。
【００８１】
トリポリリン酸ナトリウムはシグマアルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｃｏ．）製であり、ＤＮＡ−プラスミドｐＥＧＦＰ、ｐＢｇａｌおよびｐＳＥＡＰはエリムバイオファーマシューティカル社（Ｅｌｉｍ．Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．）製、および使用したその他の製品はシグマアルドリッチ社製である。
【００８２】
下記の略語が実施例に使用されている。
ＣＳ：分子量１２５ｋＤａのキトサン
ＣＳＯ：１０〜１２、１４、３１、４５および７０ｋＤａの低分子量のキトサン
ＨＡ：分子量１６０ｋＤａのヒアルロン酸ナトリウム
ＨＡＯ：１０ｋＤａ未満の低分子量のヒアルロン酸ナトリウム
ＴＰＰ：トリポリリン酸ナトリウム
ＰＢＳ：リン酸塩緩衝生理食塩水
ＨＢＳＳ：ハンス緩衝塩溶液
【００８３】
実施例１．
ナノ粒子の調製
さまざまな割合のキトサン（ＣＳＯ、１１、１４、３１、４５および７０ｋＤａのさまざまな分子量を有する）およびヒアルロン酸ナトリウム（ＨＡまたはＨＡＯ）でできた、ＤＮＡ−プラスミド（ｐＥＧＦＰ、ｐＢｇａｌまたはｐＳＥＡＰ）が組み込まれたナノ粒子が、イオンチャネル型ゲル化処理によって得られた。
【００８４】
一方は０．６２５ｍｇ／ｍＬ ＣＳＯを含むミリＱ（ｍｉｌｌｉ−Ｑ）水、および他方は０．６２５ ｍｇ／ｍＬ ＨＡまたはＨＡＯ、０．０２５ｍｇ／ｍＬ ＴＰＰおよび対応するプラスミドＤＮＡを重量で５ないし２０％で変動する割合で含む、２つの水溶液を調製した。
【００８５】
比率１：２のヒアルロン酸：キトサンを含むナノ粒子については、０．７５ｍｌの第１の水溶液を０．３７５ｍｌの第２の溶液とマグネティックスターラーで撹拌しながら混合し、それによって水に懸濁したナノ粒子を自然に得た。
【００８６】
比率１：１のヒアルロン酸：キトサンを含むナノ粒子については、０．７５ｍｌの第１の水溶液を０．７５ｍｌの第２の溶液とマグネティックスターラーで撹拌しながら混合し、それによって水に懸濁したナノ粒子を自然に得た。
【００８７】
比率２：１のヒアルロン酸：キトサンを含むナノ粒子については、０．７５ｍｌの第１の水溶液を１．５ｍｌの第２の溶液とマグネティックスターラーで撹拌しながら混合し、それによって水に懸濁したナノ粒子を自然に得た。
【００８８】
比較試験のために、ＣＳＯの代わりにＣＳ（分子量１２５ｋＤａ）を含むナノ粒子もまた、同じ比率のキトサンおよびヒアルロン酸を用いて上記と同じ手順に従って調製した。
【００８９】
表Ｉに見られる通り、ナノ粒子サイズは２５０ｎｍ未満に維持される。にもかかわらず、ゼータ電位値はキトサンおよびヒアルロン酸比に依存し、ナノ粒子中のヒアルロン酸含量の増加につれて陽性が小さくなる（表１）。
【００９０】
【表１】
【００９１】
実施例２
カプセル化効率検定およびｉｎ ｖｉｔｒｏ徐放
実施例１に記載された手順に従って得られたナノ粒子（１０〜１２ｋＤａのＣＳＯまたはＣＳを含むもののどちらか）を３７℃にて緩衝培地中で撹拌しながら、プラスミドを放出させるのに十分な期間インキュベートした。放出量をさまざまな時間に電気泳動ゲルによって評価する。
【００９２】
ナノ粒子が酢酸緩衝液中でインキュベートされる場合、プラスミドの放出は起こらないことが観察される（図１）。さらに、ヒアルロン酸の分子量およびキトサン−ヒアルロン酸重量比にかかわらず、ナノ粒子は８５％を上回る結合効率を示す。
【００９３】
ナノ粒子系を分解しおよびそうして封入された分子の放出を促進するために、ナノ粒子マトリクスを更生するポリマーの分解のための特異的酵素（たとえばキトサナーゼ、０．１０５Ｕ酵素／１７０μＬ処方）を加えることも又可能である。図２は、ナノ粒子の分解後、プラスミドが１時間未満で完全に放出されることを示す。加えて、封入されたプラスミドが一旦放出されれば、その立体構造および構造が完全に維持されることが強調される。
【００９４】
実施例３
Ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性分析
細胞生存能を用量の関数として評価するために、実施例１で得られたナノ粒子懸濁液、特に１０〜１２ｋＤａの低分子量キトサンを含むものから、さまざまなナノ粒子濃度を有するようにさまざまな連続溶液を調製した。
【００９５】
この試験は３つの異なる細胞株で実施した：
・ＨＥＫ２９３（ヒト胚腎臓細胞株）
・ＨＣＥ（ヒト角膜上皮細胞株）
・ＮＨＣ（正常ヒト結膜細胞株）。
【００９６】
細胞生存能を１００％（培地のみが加えられている培養と考えられる）に対して評価するＭＴＳ検定を実施する。細胞を実験前日にウェル当たり細胞３００，０００個の量で平板播種しなければならない。培地を次いで入れ、および細胞培養をＰＢＳで２回洗浄する。その後、ナノ粒子懸濁液を細胞培養に加え、およびＨＢＳＳを１０００μＬとなるまで加える。細胞を１時間３７℃にてインキュベートし、および次いでＨＢＳＳまたはＰＢＳで洗浄する。その後、ＭＴＳ試薬（新規テトラゾリウム化合物３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム、分子内塩、の溶液から成る試薬）を加え（１２０μＬ／ウェル）およびプレートを４９０ｎｍにて３時間後に読み取る。試薬は用時調製する。
【００９７】
ナノ粒子の検定した用量は１６０、８０、４０、２０、１０および５μｇ／ｃｍ2であった。
【００９８】
細胞毒性レベルは細胞株に依存することが観察された（図３）。一般論として、本発明のナノ粒子は非常に低い毒性を示した（図４）。
【００９９】
実施例４
ナノ粒子のトランスフェクション効率のｉｎ ｖｉｔｒｏ試験
ナノ粒子系のトランスフェクション効率を証明するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験を実施例３で使用したのと同一の細胞株で実施した。
【０１００】
１０〜１２ｋＤａのＣＳＯおよびＨＡまたはＨＡＯを含むナノ粒子を、実施例１に前述された方法に従って調製した。比較試験のために、ＣＳ（Ｍw＝１２５ｋＤａ）を含むナノ粒子もまた使用した。
【０１０１】
細胞を実験開始２４時間前にウェル当たり細胞３００，０００個の量で平板播種しなければならない。培地を次いで入れ、および細胞培養をＰＢＳで２回洗浄する。その後、ウェル当たりＨＢＳＳ ３００μＬを加えた。次いで、ナノ粒子懸濁液を、１μｇ ｐＤＮＡ／ウェルが添加されるような量で加えた。細胞を５時間３７℃にてインキュベートし、次いでＨＢＳＳまたはＰＢＳで洗浄し、およびさらなる培地を加えた。この培地は翌日および発現レベルの測定前に毎回交換する。
【０１０２】
タンパク質発現レベルをトランスフェクション後２日目、および１０日間の２日毎に定量した。定量は蛍光顕微鏡法を用いて、および画像の以後の処理はフォトショップエレメンツ（ＰｈｏｔｏｓｈｏｐＥｌｅｍｅｎｔｓ）によって実施する。
【０１０３】
図５および６から、低分子量キトサン（ＣＳＯ：１０〜１２ｋＤａ）を含むナノ粒子は、分子量１２５ｋＤａのキトサンを含むナノ粒子と比較する場合、トランスフェクションされた細胞の２５％超について最大１０日間、より高いおよびより長く続くトランスフェクションレベルを示すことが観察できる。
【０１０４】
実施例５
Ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞取り込み分析
ナノ粒子の細胞系内への内在化を証明するために、細胞株ＨＥＫ２９３を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏ試験を実施した。
【０１０５】
ナノ粒子は共焦点顕微鏡で可視化されうるように調製された。したがって、ヒアルロン酸ナトリウムをフルオレセインで予め標識した。下記のナノ粒子処方を分析した：プラスミド１％を負荷した、比率１：２のＨＡＯ：ＣＳＯ［１０〜１２ｋＤａ］；ＨＡＯ：ＣＳおよびＨＡ：ＣＳ。
【０１０６】
約３００，０００細胞／ウェルを実験の２４時間前に平板播種した。続いて、培地を吸引し、次いでＰＢＳで洗浄し、および最後にナノ粒子を培養に加え、ＨＢＳＳで体積２００μＬとする。
【０１０７】
細胞培養を１または２時間インキュベートする。細胞インキュベート後、細胞核をヨウ化プロピジウムで染色し、および共焦点顕微鏡で観察するために標本を調製する。
【０１０８】
図７で見られる通り、インキュベート１時間後、ナノ粒子処方にかかわらず細胞質に蛍光が観察され、そのためナノ粒子は細胞によって効果的に内在化された。細胞培養を低分子量（１０〜１２ｋＤａ）キトサンナノ粒子［ＣＳＯ：ＨＡＯ］で処理する場合、標識されたナノ粒子は、細胞内および核周囲レベルの空胞に局在化している。この細胞内局在化は、核酸を基礎とする生体分子の細胞内デリバリーキャリヤーとしてのこれらのナノ粒子の可能性を示す。
【０１０９】
実施例６
ＣＤ４４受容体とのナノ粒子相互作用
この実施例では、ナノ粒子が、ヒアルロナンの特異的受容体であるＣＤ４４受容体との相互作用後に内在化されうるかを評価する。ナノ粒子は、ヒアルロン酸がフルオレセインアミンで予め標識されることを除き、実施例１にしたがって調製される。処方は比率１：２のＨＡ：ＣＳＯ［１０〜１２ｋＤａ］であった。
【０１１０】
この試験では、細胞株ＨＣＥを使用し、細胞を異なる温度でインキュベートした（４および３７℃）。図８ａ）およびｂ）で見られる通り、プラスミドおよびヒアルロン酸が細胞内レベルに観察できるため、ナノ粒子は細胞によって内在化される。３７℃にてナノ粒子はエンドサイトーシスによっておよび／またはＣＤ４４との相互作用によって内在化され、一方４℃では、これらのナノ粒子は受容体ＣＤ４４と相互作用する場合だけ内在化される。
【０１１１】
さらに、実験のうちの一つで、受容体ＣＤ４４はＨｅｒｍｅｓ１抗体でブロックされる。図８ｃ）に見られる通り、４℃で、前述している通り、この温度では内在化は受容体の相互作用だけによるため、ナノ粒子が内在化されていないのが観察できる。
【０１１２】
実施例７
ナノ粒子が眼上皮細胞と相互作用する、および細胞内で分解される効率のｉｎ ｖｉｖｏ試験
ナノ粒子の眼粘膜との相互作用を評価するため、比率１：２のＨＡ：ＣＳＯ［１０〜１２ｋＤａ］およびＨＡ：ＣＳの処方を含むナノ粒子を、ヒアルロン酸がフルオレセイン（ＨＡ−ｆｌ）で予め標識された以外、実施例１にしたがって調製した。ＨＡ−ｆｌの溶液を対照として使用した。ナノ粒子を遠心分離によって濃縮し、および続いてミリＱ（ｍｉｌｌｉＱ）水に再懸濁し、ナノ粒子濃度３ｍｇ／ｍＬとした。ナノ粒子０．３ｍｇを２ｋｇのウサギの眼に滴下した。２５μＬの滴下４回を１０ 分毎に実施した。
【０１１３】
動物を滴下２、４または１２時間後に屠殺し、および次いで角膜および結膜を摘出した。新鮮組織を共焦点顕微鏡で観察した。
【０１１４】
図９で見られる通り、ナノ粒子に対応する強い蛍光シグナルが、角膜および結膜の細胞の中に検出された。加えて、蛍光強度が経時的に低下することが観察され、これは分子量１０〜１２ｋＤａのキトサンを含むナノ粒子でより明瞭である。このことは、何らかの形でこれらのナノ粒子が細胞内で吸収または分解されることを示唆する。ヒアルロニダーゼが眼組織におけるヒアルロナンの分解を担うことが知られている。これらの結果は、低分子量キトサンもまた細胞内レベルで高い効率で分解されることを示し、それは上皮細胞内の生物活性分子の効率的なデリバリーを達成するために、分子量９０ｋＤａ未満のキトサンを用いることの長所を実証する。
【０１１５】
実施例８
眼組織をトランスフェクションするためのナノ粒子の効率のｉｎ ｖｉｖｏ試験
本発明のナノ粒子が眼組織を ｉｎ ｖｉｖｏでトランスフェクトする能力を測定する目的で、および眼遺伝子デリバリーのためにこれらのキャリヤーの効率を測定する目的で、実施例７に記載の手順に従って調製した、１０％ｐＧＦＰを負荷したナノ粒子を、下記の用量で２ｋｇの意識のある正常ウサギへ局所投与した：２５、５０および１００μｇ ｐＧＦＰ／眼。処方の１５μＬを１０分毎に投与した（より高い用量には、処方の排液を避けるために、３０分間の中間期間を残して、５０＋５０μＬを投与した）。動物を屠殺し、および次いで角膜および結膜を摘出した。コードされた緑色タンパク質の発現を、摘出した角膜および結膜上皮中で、トランスフェクションの２、４および７日後に、共焦点顕微鏡で観察した。図１０に観察される通り、低分子量キトサン（ＣＳＯ）を含むナノ粒子は、より低い用量でより高いトランスフェクションレベルを与え、およびしたがって遺伝子発現の持続時間を評価するのに使用された。トランスフェクションの４および７日後に、緑色の角膜細胞がまだ撮影された。
【０１１６】
これらの結果が、２５０ｇのＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットの摘出眼における遺伝子発現の評価によって、さらに確認された。この場合、ｐβｇａｌがナノ粒子系に１０％の割合で負荷されたことを除いて、同一のナノ粒子処方を使用した。
【０１１７】
体積５μＬ中のナノ粒子２．５μｇをラットに投与し、および４８時間後に動物を屠殺し、および眼を摘出し、パラホルムアルデヒドで固定し、および最後に、タンパク質の発現を可視化するために、Ｘ−ｇａｌを用いた染色に供した。
【０１１８】
これらの結果は、低分子量キトサンおよびヒアルロナンでできたナノ粒子が角膜上皮細胞に入りおよび細胞の内部で分解され、そのようにしてＤＮＡ−プラスミドを非常に有効な方法で配送し、および重要なトランスフェクションレベルに達する能力の証拠を提供する。したがって、これらのナノ粒子は、いくつかの眼科疾患の治療のためのこの特定の場合に、遺伝子治療のための新しい戦略に相当しうる。
【０１１９】
実施例９
キトサンおよびヒアルロン酸のナノ粒子の凍結乾燥
【０１２０】
実施例１にしたがって得られたナノ粒子、特にＣＳＯ：ＨＡおよびＣＳＯ：ＨＡＯを重量比２：１で含みおよびポリマー総重量に対して７％プラスミドを負荷されたものを、さまざまな凍結保護剤（重量で１および５％のスクロース、トレハロースおよびグルコース）を添加しおよび−８０℃へ冷却（−５０℃にて第１および第２乾燥）することによって凍結乾燥処理に供した。続いて、処方を水に再懸濁し、および粒子サイズを測定した。表２に示す通り、すべての処方は適切に再懸濁され、初期ナノ粒子系を生じた。
【０１２１】
【表２】
【０１２２】
後で、分子量がナノ粒子系の凍結乾燥および再懸濁にどのように影響するかを調べるため、別の凍結乾燥試験をしかし異なる分子量を持つキトサンを用いて実施した。この場合、使用したヒアルロン酸は分子量１６０ｋＤａであり、およびＣＳＯ：ＨＡ比は１：２および２：１であった。
【０１２３】
【表３】
【０１２４】
表３に示す通り、キトサン分子量（１１、１４、３１、４５または７０ｋＤａ）およびＣＳＯ：ＨＡ重量比（２：１または１：２）にかかわらず、すべての系は粒子サイズをナノメートル範囲に維持しながら適当に再懸濁される。
【０１２５】
実施例１０
異なるｐＨでのナノ粒子安定化
ＣＳＯ：ＨＡおよびＣＳＯ：ＨＡＯ（ＭｗＣＳＯ：１１ｋＤａ）を含むナノ粒子系の凍結乾燥および再懸濁後、これらをさまざまなｐＨの緩衝液で希釈した。
【０１２６】
表４から判る通り、ナノ粒子系の安定性は個々の系の組成に依存して変化する。たとえば、ＣＳＯ：ＨＡを含むナノ粒子は、ｐＨ７．４および８．０にて安定であり、一方、ＣＳＯ：ＨＡＯを含むナノ粒子は、ｐＨ６．４および８．０にて安定である。しかし、キトサンは６．６−６．８より高いｐＨでは不溶であることが知られているため、両方の系がｐＨ８．０にて安定であるのは驚くべきことである。結果として、それらのナノ粒子系は、さまざまなｐＨでの安定性のため、ＤＮＡの投与に用途が広い。
【０１２７】
【表４】
【０１２８】
さらに、ナノ粒子の安定性を、分子量４５および７０ｋＤａのキトサンを選び、さまざまなＣＳＯ：ＨＡ比（２：１、１：１、１：２）を用いて分析した。表５に示す通り、ＣＳＯ：ＨＡ重量比にかかわらず、ナノ粒子はｐＨ７．４および８．０にて安定である。
【０１２９】
【表５】
【０１３０】
また、表６から判る通り、ナノ粒子サイズはｐＨ８にて少なくとも１週間、ナノメートル範囲に維持される。
【０１３１】
【表６】
【０１３２】
実施例１１
ＨＥＫ２９３細胞株における凍結乾燥ナノ粒子のｉｎ ｖｉｔｒｏトランスフェクション試験
我々のナノ粒子系が、凍結乾燥後に、細胞培養をトランスフェクションする能力を有するかどうかを調べるために、７％のプラスミドｐＥＧＦＰを負荷したさまざまな処方のＣＳＯおよびＨＡを細胞株ＨＥＫ２９３で分析した（用量：ｐＥＧＦＰ １μｇ）。この実験に使用したキトサンの分子量は１４、３１および４５ｋＤａであり、およびＣＳＯ：ＨＡの重量比は２：１および１：２であった。これらの処方をグルコース１％（ｗ／Ｖ）の存在下で予め凍結乾燥しおよび再懸濁した。
【０１３３】
蛍光顕微鏡で撮影した画像（図１１）は、蛍光タンパク質の細胞内の存在を示し、およびしたがってそれらは、ＣＳＯおよびＨＡを含む凍結乾燥ナノ粒子系がトランスフェクションする能力を示すことを示した。写真は処方を細胞と接触させてから４日後に撮影した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
平均サイズ１マイクロメートル未満のナノ粒子を含み、ナノ粒子が
ａ）ヒアルロナンまたはその塩；および
ｂ）キトサンまたはその誘導体、
を含む生物活性分子の放出のための系であって、キトサンまたはその誘導体の分子量が９０ｋＤａ未満であることを特徴とする系。
【請求項２】
キトサンまたはその誘導体の分子量が１ないし７５ｋＤａで構成される、請求項１に記載の系。
【請求項３】
キトサンまたはその誘導体の分子量が２ないし５０ｋＤａ、より好ましくは２ないし１５ｋＤａで構成される、請求項１または２に記載の系。
【請求項４】
ヒアルロナンまたはその塩の分子量が２ないし１６０ｋＤａで構成される、請求項１から３のいずれかに記載の系。
【請求項５】
ヒアルロナン／キトサン重量比が２：１ないし１：１０、好ましくは２：１および１：２ｗ：ｗで構成される、請求項１から４のいずれかに記載の系。
【請求項６】
ヒアルロナンがヒアルロン酸のナトリウム塩である、請求項１から５のいずれかに記載の系。
【請求項７】
ナノ粒子が網状化剤によって網状である、請求項１から６のいずれかに記載の系。
【請求項８】
網状化剤がトリポリリン酸塩、好ましくはトリポリリン酸ナトリウムである、請求項７に記載の系。
【請求項９】
ナノ粒子が平均サイズ１ないし９９９ｎｍ、好ましくは５０ないし５００ｎｍ、さらに好ましくは約１００ないし約３００ｎｍである、請求項１から８のいずれかに記載の系。
【請求項１０】
多糖、タンパク質、ペプチド、脂質、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、核酸およびその混合物から成る群から選択される生物活性分子をさらに含む、請求項１から９のいずれかに記載の系。
【請求項１１】
生物活性分子が、核酸を基礎とする分子、オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡまたはポリヌクレオチドであり、好ましくはＤＮＡ−プラスミドである、請求項１０に記載の系。
【請求項１２】
ナノ粒子が凍結乾燥形である、請求項１から１１のいずれかに記載の系。
【請求項１３】
請求項１から１２のいずれかで定義されるような系を含む医薬組成物。
【請求項１４】
凍結乾燥形の、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
眼投与に適した形の、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
請求項１から１２のいずれかで定義されるような系を含む化粧品組成物。
【請求項１７】
皮膚軟化剤、保存料、芳香物質、にきび薬、抗真菌剤、抗酸化剤、消臭剤、制汗剤、ふけ取り剤、脱色剤、抗脂漏剤、色素、日焼けローション、紫外線吸収剤および酵素から選択される化粧剤をさらに含む、請求項１６に記載の化粧品組成物。
【請求項１８】
ａ）ヒアルロナンまたはその塩の水溶液を調製；
ｂ）キトサンまたはその誘導体の水溶液を調製；
ｃ）ヒアルロナンまたはその塩の水溶液へ網状化剤を添加；および
ｄ）ｂ）およびｃ）で得られた溶液を撹拌しながら混合し、ナノ粒子が自然形成
：を含む、請求項１から１２のいずれかに記載の系の調製のための方法。
【請求項１９】
ナノ粒子の形成前に生物活性分子が水溶液ｂ）またはｃ）のいずれかに溶解される、請求項１８で定義される方法。
【請求項２０】
生物活性分子が段階ｄ）で得られるナノ粒子懸濁液に溶解される、請求項１８で定義される方法。
【請求項２１】
段階ｄ）の後に、前記ナノ粒子が凍結乾燥される追加の段階をさらに含む、請求項１８から２０のいずれかで定義される方法。
【請求項２２】
遺伝子治療のための薬剤の調製における、請求項１から１２のいずれかで定義される系の使用。
【請求項１】
平均サイズ１マイクロメートル未満のナノ粒子を含み、ナノ粒子が
ａ）ヒアルロナンまたはその塩；および
ｂ）キトサンまたはその誘導体、
を含む生物活性分子の放出のための系であって、キトサンまたはその誘導体の分子量が９０ｋＤａ未満であることを特徴とする系。
【請求項２】
キトサンまたはその誘導体の分子量が１ないし７５ｋＤａで構成される、請求項１に記載の系。
【請求項３】
キトサンまたはその誘導体の分子量が２ないし５０ｋＤａ、より好ましくは２ないし１５ｋＤａで構成される、請求項１または２に記載の系。
【請求項４】
ヒアルロナンまたはその塩の分子量が２ないし１６０ｋＤａで構成される、請求項１から３のいずれかに記載の系。
【請求項５】
ヒアルロナン／キトサン重量比が２：１ないし１：１０、好ましくは２：１および１：２ｗ：ｗで構成される、請求項１から４のいずれかに記載の系。
【請求項６】
ヒアルロナンがヒアルロン酸のナトリウム塩である、請求項１から５のいずれかに記載の系。
【請求項７】
ナノ粒子が網状化剤によって網状である、請求項１から６のいずれかに記載の系。
【請求項８】
網状化剤がトリポリリン酸塩、好ましくはトリポリリン酸ナトリウムである、請求項７に記載の系。
【請求項９】
ナノ粒子が平均サイズ１ないし９９９ｎｍ、好ましくは５０ないし５００ｎｍ、さらに好ましくは約１００ないし約３００ｎｍである、請求項１から８のいずれかに記載の系。
【請求項１０】
多糖、タンパク質、ペプチド、脂質、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、核酸およびその混合物から成る群から選択される生物活性分子をさらに含む、請求項１から９のいずれかに記載の系。
【請求項１１】
生物活性分子が、核酸を基礎とする分子、オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡまたはポリヌクレオチドであり、好ましくはＤＮＡ−プラスミドである、請求項１０に記載の系。
【請求項１２】
ナノ粒子が凍結乾燥形である、請求項１から１１のいずれかに記載の系。
【請求項１３】
請求項１から１２のいずれかで定義されるような系を含む医薬組成物。
【請求項１４】
凍結乾燥形の、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
眼投与に適した形の、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
請求項１から１２のいずれかで定義されるような系を含む化粧品組成物。
【請求項１７】
皮膚軟化剤、保存料、芳香物質、にきび薬、抗真菌剤、抗酸化剤、消臭剤、制汗剤、ふけ取り剤、脱色剤、抗脂漏剤、色素、日焼けローション、紫外線吸収剤および酵素から選択される化粧剤をさらに含む、請求項１６に記載の化粧品組成物。
【請求項１８】
ａ）ヒアルロナンまたはその塩の水溶液を調製；
ｂ）キトサンまたはその誘導体の水溶液を調製；
ｃ）ヒアルロナンまたはその塩の水溶液へ網状化剤を添加；および
ｄ）ｂ）およびｃ）で得られた溶液を撹拌しながら混合し、ナノ粒子が自然形成
：を含む、請求項１から１２のいずれかに記載の系の調製のための方法。
【請求項１９】
ナノ粒子の形成前に生物活性分子が水溶液ｂ）またはｃ）のいずれかに溶解される、請求項１８で定義される方法。
【請求項２０】
生物活性分子が段階ｄ）で得られるナノ粒子懸濁液に溶解される、請求項１８で定義される方法。
【請求項２１】
段階ｄ）の後に、前記ナノ粒子が凍結乾燥される追加の段階をさらに含む、請求項１８から２０のいずれかで定義される方法。
【請求項２２】
遺伝子治療のための薬剤の調製における、請求項１から１２のいずれかで定義される系の使用。
【図３】
【図１】
【図２】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１】
【図２】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公表番号】特表２００９−５３７６０４（Ｐ２００９−５３７６０４Ａ）
【公表日】平成２１年１０月２９日（２００９．１０．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５１１５１４（Ｐ２００９−５１１５１４）
【出願日】平成１９年５月２３日（２００７．５．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００７／０５４９８３
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１３５１６４
【国際公開日】平成１９年１１月２９日（２００７．１１．２９）
【出願人】（５０８３４６５７２）アドヴァンスド イン ヴィトロ セル テクノロジーズ ソシエダッド アノニマ (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年１０月２９日（２００９．１０．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年５月２３日（２００７．５．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００７／０５４９８３
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１３５１６４
【国際公開日】平成１９年１１月２９日（２００７．１１．２９）
【出願人】（５０８３４６５７２）アドヴァンスド イン ヴィトロ セル テクノロジーズ ソシエダッド アノニマ (1)
【Ｆターム（参考）】
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