活性化レセプタに会合される新しいポリペプチド及びその生物学的応用
【課題】免疫グロブリンタイプ又はレクチンタイプのＫＩＲレセプタ（キラー細胞阻害性レセプタ）の非阻害性対応物であるＫＡＲレセプタ（キラー細胞活性化レセプタ）の異常な又は望ましくない機能を診断し、予防し、矯正し、治療することを可能にする新しい手段を提供する。
【解決手段】特定の配列を含む核酸、該核酸によってエンコードされた単離されたポリペプチド。
【解決手段】特定の配列を含む核酸、該核酸によってエンコードされた単離されたポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、自律したレセプタとしてか又はコレセプタとして機能するクラスＩのＭＨＣ（主要組織適合性遺伝子複合体）の分子に対する活性化レセプタ、及び特にＫＡＲ（キラー細胞活性化レセプタ）に由来するシグナルを形質導入する能力をもつ新しい特殊なポリペプチド。免疫原として役立つ前記ポリペプチドから得られる抗体及び、前記ポリペプチドに対応する核酸に関する。
【０００２】
本発明は同様に、かかるポリペプチドの獲得方法及び前記ポリペプチド，抗体及び核酸の生物学的応用、より特定的には予防、治療及び診断へのその応用に関する。
【背景技術】
【０００３】
生体の一貫性を維持し、無欠性を確保するためには、免疫系は、調整のとれた細胞間連絡系を利用しなければならない。
【０００４】
これらの連絡には異なるタイプのレセプタが関与する。そのうちの３つ、すなわちＢリンパ球抗原に対するレセプタ（ＢＣＲ），Ｔリンパ球抗原に対するレセプタ（ＴＣＲ）及び抗体のＦｃ部分（ＲＦｃ）を認識するレセプタについて今や充分に記述されており、それらの異なる構造は比較的良く知られている。
【０００５】
抗原に対するレセプタでも抗体に対するレセプタでもないその他のレセプタは、記述されてきたものの、その構造及び作用メカニズムはまだよく知られていない。
【０００６】
これらは、ＫＡＲ（キラー細胞活性化レセプタ）及びその阻害性対応物ＫＩＲ（キラー細胞阻害性レセプタ）のようなＭＨＣ（主要組織適合性遺伝子複合体）の分子に対するレセプタである。
【０００７】
ＫＡＲとＫＩＲは、ＮＫ細胞に制限されない：これらは同様に、Ｔ細胞により天然に発現される。
【０００８】
ＫＡＲは、ＫＩＲと高い相同性をもつ（細胞質外レベルでのＫＡＲとＫＩＲの間の相同性は最高９６％）。
【０００９】
しかしながら、ＫＡＲ及びＫＩＲは同じ機能を果たすものではない。すなわち、ＫＩＲは、ＮＫ及びＴ細胞の活性化の負の制御（阻害作用）に関与するのに対し、ＫＡＲはＮＫ及びＴ細胞の活性化の正の制御（刺激作用）に関与する。
【００１０】
細胞質内外及び細胞質内のドメインのレベルでの主たる差異は、活性化同型化（ＫＡＲ）及び阻害性同型体（ＫＩＲ）の間で実証することができた。
【００１１】
実際、ＫＩＲとは異なり、ＫＡＲはその膜内外ドメイン内で荷電アミノ酸残基（リシン）を発現し、その細胞質内ドメイン内にいかなるＩＴＩＭパターン（チロシン残基に基づく免疫レセプタの阻害パターン）も含んでいない。しかし単量体レセプタＫＡＲは、ＩＴＡＭ（チロシン残基に基づく免疫レセプタ活性化パターン）を含んでいない。
【００１２】
ＭＨＣの分子に対する活性化レセプタであり、ＩｇＳＦ（免疫グロブリンの上科）すなわち、それ自体ＩＴＩＭもＩＴＡＭも有さず膜内外荷電アミノ酸（リシン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸）を有するＩＴＩＭ阻害性レセプタの対応物である活性化レセプタの一員であるＫＡＲについて観察された状況は、その他のタイプのレセプタについても観察することができる。かくして、（レクチンタイプのものであり、かつその阻害性対応物がＮＫＧ２Ａ/Ｂである）ＮＫＧ２Ｃ/ＤのようなＭＨＣの分子についての活性化レセプタ（又は少なくとも非阻害性レセプタ）のみならず、そのリガンドがなおも未知である、造血細胞及び非造血性細胞（ＳＩＲＰβ）についてか又はＢ細胞、マクロファージ及び樹枝状細胞（ＩＬＴ１）について記述されたＳＩＲＰβ及びＩＬＴ１のようなその他の非阻害性レセプタについても同様のことがいえる。
【００１３】
ＫＡＲは、特にクラスＩのＭＨＣの分子について、自律性レセプタとして機能することができる。かくして、標的細胞の表面上で発現されたクラスＩのＭＨＣの分子とＫＡＲの係合が、細胞質内Ｃａ２＋の可動化及び標的細胞の溶解の誘発から実証されたようにリンパ球活性化プログラムを開始することがわかっている。
【００１４】
ＭＨＣ分子に対するその自律性レセプタの機能の他に、ＫＡＲは同様に、レセプタＴＣＲ及びＲＦｃのためのコレセプタ機能をも果たすことができる（非特許文献１、２）。
【００１５】
実際、ＣＤ１６（ＲＦｃγIII）のようなレセプタによる免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の定常フラグメント（Ｆｃ) の認識の際及びクラスＩ又はIIのＭＨＣの分子により制限された複合体ＣＤ３/ＴＣＲによる抗原の認識の際には、ＫＡＲはコレセプタの役目を果たし、かくして特に少量の抗原に直面して、細胞応答の強度を増大し、経時的細胞応答を維持し、同様に細胞増殖の刺激のために共働することができる。
【００１６】
ＮＫ及びＴリンパ球下位母集団上で天然に発現されるＫＡＲの役目は、その固有のリガンドすなわちクラスＩのＭＨＣの分子により制限されず、免疫系全般の平衡にまで拡大されている。
【００１７】
かくして天然に発現されたＫＡＲの機能は、ＮＫ及びＴ細胞の増殖、かかる細胞によるサイトカインタイプの物質の産生、有害な、悪性の又はウイルス感染を受けた自己由来細胞、同種異系細胞のような標的細胞の分解のみならず、或る種の抗原に直面した免疫系の寛容に対し影響を及ぼす。
【００１８】
従って、ＫＡＲの全ての無機能又は機能不全は、全て免疫系の機能に関連する、例えば免疫不全疾患、自己免疫疾患（例えば多発性硬化症）、腫瘍、ウイルス感染、細菌感染、寄生虫感染、アレルギー、移植片拒絶のような、さまざまな疾病又は望ましくない反応を導く可能性がある。例えば、ヒトがＫＡＲを発現するリンパ球を平均して１０％未満しか有していないとすると、ＬＤＧＬ（顆粒リンパ球増殖病）にかかった患者のリンパ球のほぼ全てはＫＡＲを発現する。
【非特許文献１】マンデルボイム・オー（Mandelboim O）ら著、「Science」、１９９６年、第２７４巻、ｐ．２０９７
【非特許文献２】カムビアッジ・エイ（Cambiaggi A．）ら著、「Blood」、１９９６年、第８７巻、ｐ．２３６９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
本発明の目的は、ＫＡＲのようなクラスＩのＭＨＣの分子についての活性化レセプタの異常な又は望ましくない機能を診断しその機能を制御することを可能にする手段を提供することにある。
【００２０】
かくして、本発明は、ＫＡＲに由来するシグナルの形質導入に必要な、以下ＫＡＲＡＰ（ＫＡＲ会合タンパク質）と呼ばれる新しいポリペプチド，ならびに、これらの新しいポリペプチドから得られた抗体及び核酸を目的とする。本発明は同様に、前記新しいポリペプチドの獲得方法ならびにその生物学的応用をもその目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
「ＫＡＲレセプタ」というのは、本明細書においては、ＫＡＲｐ５０レセプタ（ＫＩＲ II ＤＳ１〜ＫＩＲ II ＤＳ５）のようなＫＩＲレセプタの非阻害性対応物である免疫グロブリンタイプのヒトレセプタ、ＫＩＲ III ＤＳ１，ならびにこれらのＫＡＲレセプタに類似する構造をもつ非阻害性のあらゆるレセプタ、特に（ＮＫ細胞及びＴ細胞上で天然に発現されている）ＮＫＧ２Ｃ，ＮＫＧ２Ｄのようなレクチンタイプのヒトレセプタ、（骨髄性細胞，Ｂ細胞上で天然に発現されている）pir Ａのような免疫グロブリンタイプのマウスレセプタ、（マスト細胞上で天然に発現されている）ｇｐ４９Ａ，（ＮＫ及びＴ細胞上で天然に発現されている）Ｌｙ４９Ｄ，Ｌｙ４９Ｈのようなレクチンタイプのマウスレセプタを意味している。
【００２２】
従って、ＫＡＲＡＰポリペプチドというのは、それが無い状態では前記ＫＡＲレセプタが天然に、検出可能な活性化シグナルを形質導入する能力をもたないような、単離された全てのポリペプチド（ＫＡＲ以外）のことを意味している。これにより、決定されたＫＡＲＡＰポリペプチドが以上のようなＫＡＲレセプタのみならず、上述のようなＫＡＲの構造に近い構造をもつ活性化又は非阻害性のその他の単量体レセプタにも、そして特に、ＩＬＴ１のようなＬＩＲ/ＭＩＲ/ＩＬＴ系統群の免疫グロブリンタイプのヒト活性化レセプタにも会合（associate）されうるという事実が排除されることはない。
【００２３】
本出願においては、「ポリペプチド」という語は、前記ポリペプチドのみならず、アミノ酸の保存的欠失、挿入、逆位又は置換によって得られるようなこのポリペプチドの相同体及び、プロテアーゼを用いて前記ポリペプチドの加水分解によって得られるようなこのポリペプチドのフラグメントをも含んでおり、これらの相同体又はフラグメントは、ＫＡＲに由来するシグナルを形質導入する能力をもつ。この「ポリペプチド」という語は、本出願において、ポリペプチドと同様タンパク質をも網羅する。
【００２４】
本発明に従ったポリペプチドは、ＫＡＲレセプタにより受理されたシグナルの形質導入に必要なものである：従って、これは、ＫＡＲ活性化不足の回復を可能にする単離されたタンパク質である。一定の与えられた単離されたポリペプチドが、ＫＡＲ活性化不足の回復を可能にするか否かを決定するためには、当業者は、このポリペプチドの不在下で適切な細胞によりそれが発現される場合でも、検出可能な活性化シグナルを形質導入するには至らず、又は目的とされている利用分野にとって満足のいく活性化シグナルを形質導入するには至らないＫＡＲレセプタが存在することを示すことにより作業を進めることができる。この決定の１実施形態が、ＫＡＲｐ５０.２レセプタのみを発現するＲＢＬ−２Ｈ３細胞の活性化能力（セロトニンの塩析）及びＫＡＲｐ５０.２レセプタとそのＫＡＲＡＰポリペプチドを同時に発現するＲＢＬ−２Ｈ３細胞の能力の間での比較により後述の実施例３において提示されている。適切な細胞の例が、後の図５に示されている。
【００２５】
「回復されたＫＡＲ活性化不足( deficient ) 」というのは、有意な活性化シグナルの前記ＫＡＲによる細胞での形質導入が可能であるか場合によっては充分であることを意味する。このことは、特に抗体による細胞刺激を用いてテストされうる。
【００２６】
細胞レベルで、ＫＡＲに由来するシグナルが形質導入されているか否かを決定するため、及び、かかるシグナルが刺激されているか又は阻害されているかを決定するために、当業者は数多くの手段を利用することができる。のような手段の例としては、リガンドによる前記ＫＡＲの刺激及び、分泌されたサイトカイン（例えば、Cambiaggi et al., １９９６，Blood ８７：２３６９参照）、細胞増殖（例えば Mandelboim et al., １９９６年、Science ２７４：２０９７参照）、細胞毒性（例えば後で記述する再誘導された細胞毒性テスト参照）、細胞質内カルシウム可動化（例えば、Blery et al., １９９７，J. Biol. Chem.２７２，８９８９−８９９６参照）、及び/又はリン酸化の誘発（例えば Vivier et al., １９９１. J. Immunol. １４６：２０６参照）の測定が含まれる。
【００２７】
本発明に従ったポリペプチドはさらに、ＫＡＲには会合するもののこのＫＡＲの阻害性対応物には会合しないという能力をもつことを特徴とする。
【００２８】
１つのポリペプチドがＫＡＲに会合するもののこのＫＡＲの阻害性対応物には会合しない（すなわち対応するＫＩＲレセプタに会合しない）能力をもつか否かの決定を可能にする方法は、当業者には周知のものである。かかる方法の一例には、特に次の段階が含まれる：
− 一方ではＫＡＲ＋ＫＩＲ−細胞に、そして他方ではＫＡＲ−ＫＩＲ＋細胞にこのポリペプチドを発現させる段階；
− 少なくとも抗ＫＡＲ及び/又は抗ＫＩＲ抗体を用いてこれらの細胞の溶解産物から単数又は複数のポリペプチド分画を免疫沈降させる段階；
− ＫＡＲ＋ＫＩＲ−細胞に由来する単数又は複数の分画内での前記ポリペプチドの存在及び、ＫＡＲ−ＫＩＲ＋細胞に由来する単数又は複数の分画内でのこの同じポリペプチドの不存在を観察する段階。抗ＫＩＲ及び/又は抗ＫＡＲ抗体の例としては、抗ＣＤ１５８固体、抗ｐ７０/ＮＫＢ１抗体、抗Ｐ１４０抗体そしてより特定的にはＥＢ６，ＧＬ１８３又はＰＡＸ２５０モノクローナル抗体が含まれる。細胞によりこのようなポリペプチドを発現させることを可能にする方法が、後述の実施例３で示されている。
【００２９】
なお本発明に従ったＫＡＲＡＰポリペプチドは、
ｉ． 抗ＣＤ１５８，抗Ｐ７０/ＮＫＢ１，抗Ｐ１４０抗体のような単数又は複数の抗ＫＩＲ及び/又は抗ＫＡＲ抗体，より特定的には、モノクローナル抗体ＥＢ６，ＧＬ１８３又はＰＡＸ２５０を用いて活性化シグナルを形質導入する能力をもつＫＡＲレセプタを発現する細胞溶解産物の単数又は複数のポリペプチド分画の免疫沈降により得られ、
ii． 各ポリペプチド分画は、任意には、これより以前に抗ＣＤ３ζ及び/又は抗ＦｃεＲＩγを用いた免疫沈降された分画の除去により枯渇され得及び/又は新たに抗ＣＤ１５８，抗Ｐ７０/ＮＫＢ１，抗Ｐ１４０抗体のような単数又は複数の抗ＫＩＲ及び/又は抗ＫＡＲ抗体、そしてより特定的にはモノクローナル抗体ＥＢ６，ＧＬ１８３又はＰＡＸ２５０を用いて免疫沈降され得、
iii. その分子量に従った前記単数又は複数のポリペプチド分画のポリペプチドの分解及び約１２±２ｋＤａの分子量に対応するポリペプチドの回収によってか又は、
前記単数又は複数のポリペプチド分画をキナーゼ試験に付した後その分子量に従って前記単数又は複数のポリペプチド分画を分解し、約１２，１４及び/又は１６±２ｋＤａの分子量に対応するリン酸化されたポリペプチドを回収することによっても得られるものであることを特徴とする。
【００３０】
活性化シグナルを形質導入する能力をもつＫＡＲレセプタを発現する前記細胞は、特に、ＮＫ細胞及び/又はＴ細胞及び/又は骨髄性細胞及び/又はＢ細胞及び/又はマスト細胞でありうる。ＫＡＲが、細胞においてシグナルを形質導入する能力を有するか否かを決定する方法が以上で示された。
【００３１】
本発明に従ったＫＡＲＡＰポリペプチドはさらに、そのアミノ酸配列が、
− リン酸化可能なチロシンアミノ酸を少なくとも１つ有し、
− 約１０±２から１６±２ｋＤａの間に含まれる分子質量（特に１０±２ｋＤａの実際の分子質量、リン酸化の程度に応じて１２±２〜１６±２ｋＤａの変性条件下でのポリアクリルアミドゲル上の見かけの分子質量）を有することを特徴とする。
【００３２】
さらにこのポリペプチドは、そのアミノ酸配列が細胞質内領域において少なくとも１つのＩＴＡＭ ＹｘｘＬ/Ｉx6-8ＹｘｘＬ/Ｉパターンを有することを特徴とする。
【００３３】
本発明の１態様に従うと、ＫＡＲＡＰポリペプチドのアミノ酸配列は、細胞質外領域、膜内外領域及び/又は細胞質内領域を含む。特徴的には、この細胞質内領域は、このポリペプチドの配列その他の領域との関係において大半を占めている。細胞質外、膜内外、細胞質内領域を同定するための手段は、当業者には既知のものである（例えば、水治療法アルゴリズム、逆小胞形成）。
【００３４】
本発明のもう１つの態様に従うと、ＫＡＲＡＰポリペプチドのアミノ酸配列は、細胞質外システインアミノ酸を少なくとも１つ有する。
【００３５】
本発明のさらにもう１つの態様に従うと、ＫＡＲＡＰポリペプチドのアミノ酸配列は、少なくとも１つの膜内外荷電アミノ酸（Ｒ，Ｋ，Ｄ，Ｅ）を有する。
【００３６】
本発明に従ったポリペプチドは、少なくとも１つのチロシンのレベルでリン酸化されてもよいし、或いは又リン酸化されなくてもよい。
【００３７】
本発明に従った一実施形態においては、前記ポリペプチドは、ジスルフィド架橋により結合された２量体の形を有している。これらは、クラスＩのＭＨＣの分子のための自律的レセプタとしてか又はＣＤ１６のようなＲＦｃ又はＴＣＲのコレセプタとして機能するＫＡＲに対し、選択的かつ非共有結合的に会合させられる。
【００３８】
本発明の有利な一形態に従うと、ＫＡＲＡＰポリペプチドは、ＺＡＰ−７０，Ｐ７２ＳＹＫ，Ｐ５６ＩＣＫ，Ｐ５９ｆｙｎ，Ｐ６０ｌｙｎ，Ｇｒｂ−２，ＰＰ３６−３８（ｌａｔ），ＰＬＣ−α１，Ｐ８５（ＰＩ−３キナーゼ），ＳｈｃのようなドメインＳＨ２をもつ分子、又はＳｈｃのようなドメインＰＴＢ（ホスホチロシン結合）をもつ分子に結合される能力をもつ。かかる結合は、本発明のポリペプチドをドメインＳＨ２又はＰＴＢをもつ分子と共にインキュベートしプラズモン共鳴を測定することによって観察できる（Olcese et al.,１９９６，The Journal of Immunology １５６：４５３１〜４５３４）。
【００３９】
本発明に従った特定のＫＡＲＡＰポリペプチドは、基本的に配列番号２により構成されたアミノ酸配列を有する。本発明は、同様に、その配列が基本的に配列番号２の細胞質外部分つまり配列番号３によってか又は配列番号２の膜内外部分つまり配列番号４，又は配列番号２の細胞質内部分つまり配列番号５によって構成されているポリペプチドをも目的としている。本発明に従ったその他の特別なＫＡＲＡＰポリペプチドは、基本的に配列番号１１，１２，１３，１４，１５，１７（マウスＣ５７Ｂ１/６のＫＡＲＡＰタンパク質のコンセンサス配列）又は配列番号２８（ゲノミック配列から得られるマウス１２９のＫＡＲＡＰのタンパク質配列）によって構成されている。
【００４０】
かかるポリペプチドは同様に、配列決定の後、化学的合成又は組換え型ＤＮＡ技術を用いて得ることもできる。
【００４１】
前記ＫＡＲＡＰポリペプチドは、細胞質内ＩＴＡＭもＩＴＩＭも有していないものの膜内外アミノ酸残基を有する活性化レセプタＫＡＲに由来するシグナルの形質導入に必要なものである。
【００４２】
有利な配置に従うと、本発明に従ったポリペプチドは、グリコシル化、リン酸化、スルホン化、ビオチニル化、アシル化、エステル化；ホスホン酸塩のようなリン酸塩基のものに近い分子形態をもつ実体の添加、置換又は抑制；ルシフェラーゼ、ＧＦＰ（Green Fluorescence Protein) 又はその類似体のような標識付け試薬の添加；親和性リガンドのような精製用標的の添加；その可溶性を修正する実体の添加；によって修飾される。特に有利な修飾としては、受理したシグナルを形質導入するその能力を阻止又は阻害するような形で前記ポリペプチドを修飾するものが含まれる（負のトランス優性形質の戦略）。このように修飾された形をした本発明に従ったポリペプチドは、特に、一定の与えられた免疫応答特に望ましくない又は異常な免疫応答（例えば自己免疫疾患、アレルギー、移植片拒絶）を負に変調させる（阻害する）ことを目的とする全ての組成物又は方法において利用される。このように適切な修飾としては、前記ポリペプチドのチロシン上でのリン酸化を生物学的条件下で加水分解不能にする（例えばホスホン酸塩の添加により）ような修飾が含まれる。この修飾には同様に、本発明に従ったポリペプチドの機能にとって重要なアミノ酸残基を非機能的にする修飾も含まれる。これは例えば特にＩＴＡＭパターン内に含まれるチロシン残基のようなチロシン残基（Ｙ）をフェニルアラニン残基（Ｆ）に置換又は突然変異させることによる。これにより、こうして修飾された前記ポリペプチドの、ドメインＳＨ２又はＰＴＢをもつタンパク質に対する結合が妨げられる。
【００４３】
もう１つの有利な措置に従うと、本発明のポリペプチド，そのフラグメント，相同体又は修飾された形態は、細胞膜すなわち脂質２層を横断する能力をもつ。
【００４４】
本発明は同様に、本発明に従ったＫＡＲＡＰポリペプチドからの免疫誘発によって得られる、又はかかるポリペプチドのフラグメント，相同体又は修飾された形態から得られるような抗体特にモノクローナル抗体及びかかる抗体のフラグメント特にフラグメントＦｃ，Ｆｖ，Ｆab，Ｆ(ab)'２，ＣＤＲをも目的としている。
【００４５】
本発明の目的は特に、その配列が基本的に本発明に従ったかかるＫＡＲＡＰポリペプチドの細胞質外、細胞質内又は膜内外部分によって構成されているポリペプチドから免疫誘発によって得られるような、かかる抗体のフラグメント特にフラグメント，Ｆｃ，Ｆｖ，Ｆab，Ｆ(ab)'２ ，ＣＤＲにある。本発明は特に、抗原抗体タイプの反応に従って配列番号２，配列番号３，配列番号４，配列番号５，配列番号１１，配列番号１２，配列番号１３，配列番号１４，配列番号１５，配列番号１７及び/又は配列番号２８を認識する能力をもつような抗体、ならびにそのフラグメントを目的とする。
【００４６】
かかる抗体は、基本的に電気泳動バンドの溶出、化学的合成又は可溶性融合タンパク質技術（ＧＳＴ）により得られ、任意には卵白アルブミンのような免疫原に結合された、本発明に従ったポリペプチド，フラグメント，相同体又は修飾形態に対して、ウサギ及びマウスのような動物を免疫化することによって得られる。
【００４７】
このときモノクローナル抗体は、免疫脾細胞のハイブリドーマ融合、スクリーニング及び培養上清の精製によって産生される（Kohler et Milstein, １９７５，Nature ２５６，４９５−４９７；抗体，その実験室マニュアル，１９８８，Harlow 及び David Lane, Ed, Cold Spring Harbor laboratory）。
【００４８】
これらの抗体から、標準的な手順に従ってジ抗体を生成することができる。前記フラグメントは、必要とあらばヒト化構造に挿入又は移植することができる。
【００４９】
本発明は同様に、本発明に従ったポリペプチド，フラグメント又は相同体のアミノ酸配列の世界遺伝子コードに従いこのコードの縮重を考慮に入れた読取り枠読取りに対応する１つの配列ならびにかかる核酸と６０％以上の相同性を有しかつ上述のようなＫＡＲに由来する活性化シグナルの形質導入分子についてコードすることのできる変異体をも目的としている。本発明は、特に、そのＤＮＡが基本的に配列番号１（配列番号２の配列の成熟ＫＡＲＡＰタンパク質のｃＤＮＡ），配列番号６，７，８，９，１０，１６（Ｃ５７Ｂ１/６マウスのＫＡＲＡＰのコンセンサスｃＤＮＡ配列），配列番号２７（ゲノミック配列から得られた１２９マウスのＫＡＲＡＰのｃＤＮＡ），配列番号1８（１２９マウスのＫＡＲＡＰのゲノミック配列）、又は配列番号３１（ヒトＫＡＲＡＰのｃＤＮＡ配列）によって、又はこれらの配列の細胞質外、細胞質内及び/又は膜内外領域に対応するあらゆる部分、又はこれらの配列のエキソン又はイントロンに対応するあらゆる部分によって構成されているようなあらゆる核酸をも目的としている。
【００５０】
本発明は同様に、以下の段階を含む本発明に従ったポリペプチドの獲得方法をも目的としている：
ｉ． 抗ＣＤ１５８，抗Ｐ７０/ＮＫＢ１，抗Ｐ１４０抗体のような単数又は複数の抗ＫＩＲ及び/又は抗ＫＡＲ抗体，より特定的には、モノクローナル抗体ＥＢ６，ＧＬ１８３又はＰＡＸ２５０を用いて機能的ＫＡＲレセプタを発現する細胞（例えばＮＫ細胞及び/又はＴ細胞及び/又は骨髄性細胞及び/又はＢ細胞及び/又はマスト細胞）の溶解産物の単数又は複数のポリペプチド分画を免疫沈降する段階、
ii． 各ポリペプチド分画は、任意には（場合によっては）、これより以前に抗ＣＤ３及び/又は抗ＦｃεＲＩγを用いた免疫沈降された分画の除去により枯渇され得及び/又は新たに抗ＣＤ１５８，抗Ｐ７０/ＮＫＢ１，抗Ｐ１４０抗体のような単数又は複数の抗ＫＩＲ及び/又は抗ＫＡＲ抗体、そしてより特定的にはモノクローナル抗体ＥＢ６，ＧＬ１８３又はＰＡＸ２５０を用いて免疫沈降され得る、
iii. その分子量に従って前記単数又は複数のポリペプチド分画のポリペプチドを分離し約１２±２ｋＤａの分子量に対応するポリペプチドの回収するか、又は
前記単数又は複数のポリペプチド分画をキナーゼ試験に付した後その分子量に従って前記単数又は複数のポリペプチド分画を分離し、約１２，１４及び/又は１６±２ｋＤａの分子量に対応するリン酸化されたポリペプチドを回収する段階。
【００５１】
本出願は同様に、本発明に従った特殊なＫＡＲＡＰポリペプチド配列を得るための方法をも目的としている。後述の実施例２でその一例を記述する（生物情報処理戦略）この方法は、特に、ポリペプチド配列のうち以下の基準を満たすもののスクリーニングを含んで成る：
− リン酸化可能なチロシンアミノ酸を少なくとも１つ有する、
− ５から２５ｋＤａの間の分子質量を有する、
− 細胞質外領域、膜内外領域及び細胞質内領域を有する、
− その細胞質外領域内にシステインアミノ酸を少なくとも１つ有する。
【００５２】
− その膜内外領域内に荷電アミノ酸（Ｒ，Ｋ，Ｄ，Ｅ）を少なくとも１つ有する、及び
− その細胞質内領域内にＩＴＡＭ ＹxxＬ/Ｉx6-8ＹxxＬ/Ｉパターンを少なくとも１つ有する、
− 選択された配列に対応するポリペプチドは、前述のように、ＫＡＲに会合しかつ対応する阻害性対応物レセプタ（ＫＩＲ）には会合しないという能力をもたなくてはならない。
【００５３】
本出願は同様に、候補ポリペプチドが本発明に従ったＫＡＲＡＰポリペプチドに対応するか否かを決定する又は制御するための方法をもその目的としている。かかる方法の一例は、後述の実施例２に示されている。かかる方法は、この候補ポリペプチドの特徴的部分（例えば少なくとも１つのＩＴＡＭパターン又は細胞質外領域を含む細胞質内領域）に対する抗体を産生すること及び１つの細胞上で機能的に発現された場合に前記抗体により抗原抗体タイプの反応に従って認識済みの要素に会合された状態となっているＫＡＲレセプタが存在するか否かを確認することから成る。
【００５４】
本発明に従ったこのＫＡＲＡＰポリペプチド同定方法は、かくして特に、
− 候補ポリペプチド，特にこの候補ポリペプチドの細胞質外領域及び/又は少なくとも１つのＩＴＡＭパターンを含む領域に対して導かれたモノ又はポリクローナル抗体（例えば、以上で同定された配列番号２のマウスＫＡＲＡＰタンパク質の場合には配列番号２の細胞質外部分（配列番号３）又は細胞質内部分（配列番号５）の領域に対し導かれた抗体を産生すること、
− 抗原−抗体タイプの結合反応を可能にする穏やかな条件下で候補ポリペプチドがＫＡＲＡＰを構成すると想定されている対象の活性化又は非阻害性レセプタを、１つの機能的形態にて有する細胞の溶解産物と、この抗体を接触させること、
− 場合によって形成される反応産物の中に、前記活性化又は非阻害性レセプタのものに近い見かけの分子質量（ＫＡＲｐ５０については約５０ｋＤａ）をもつ産物及び候補ポリペプチドのものに近い見かけの分子質量（特に約１０〜１６ｋＤａの間）をもつ産物が存在する場合に、本発明に従ったＫＡＲＡＰ ポリペプチドであるものとしてその候補ポリペプチドを同定すること、
から成る。
【００５５】
本発明に従ったこの同定方法は特に、
− 上述の通りに前記抗体を接触させ、
− 分子複合体を保存する洗剤の穏やかな条件下で（例えば１％のジギトニン、上述の実施例１参照）、場合によって形成された反応産物を沈降させ、
− 例えば、変性条件内でポリアクリルアミドゲル上の分子質量マーカーの存在下での電気泳動遊走により、沈降された産物の分子質量を測定し、
− 上述のとおりの本発明に従ったＫＡＲＡＰポリペプチドであるものとして候補ポリペプチドを同定することによって
実施することができる。
【００５６】
本発明は同様に、薬学的に受容可能なビヒクルと会合した（組み合わせた）形で、本発明に従った少なくとも１つのポリペプチド，ＫＡＲＡＰ，フラグメント，相同体又は修飾された形態、本発明に従った少なくとも１つの抗体又は抗体フラグメント又は、本発明に従った少なくとも１つの核酸又は核酸変異体を有効量含んで成る薬学組成物にも関する。
【００５７】
本発明に従った薬学組成物は、経口投与、非経口投与、局所施用、膣内投与、直腸内投与又は経口及び/又は経鼻吸入のため、固体、液体の形又は懸濁液の形で製剤することができる。
【００５８】
本発明に従った前記薬学組成物は、ＫＡＲの活性を変調させることを目的とする。ＫＡＲの活性を刺激するためには、前記薬学組成物は、例えば、脂質２層を横断する能力をもつ本発明に従った変異体であるポリペプチド，フラグメント，相同体又は核酸のような、前記ＫＡＲに由来するシグナルの形質導入を容易にする作用物質を含むことになる。ＫＡＲの活性を阻害するため、前記薬学組成物は、細胞のＫＡＲＡＰを遮断するような形で脂質２層を横断する能力をもつ本発明に従った抗体フラグメント，又は、ＳＨ２（ＺＡＰ−７０，Ｐ７２ｓｙｋ) 又はＰＴＢドメインをもつタンパク質又は前記ＫＡＲの活性化のあらゆるアダプタ又はエフェクタ分子を遮断するような形で生物学的条件下で加水分解不能のリン酸などでリン酸化された又はされていない本発明に従った修飾済みポリペプチドのような、前記ＫＡＲ由来のシグナルの形質導入を遮断する作用物質を含むことになる。かかる修飾は、特にリン酸塩基の添加及び/又は少なくとも１つのチロシン残基（Ｙ）のフェニルアラニン残基（Ｆ）への突然変異を含む。
【００５９】
従って、本出願は、免疫反応に関与する細胞の異常な又は望ましくない機能の予防、一時的緩和、及び/又は治療を目的とする組成物を目的とする。かかる組成物は、有利には本発明に従ったポリペプチド又は場合によっては修飾済みポリペプチドを含んで成る。
【００６０】
細胞のレベルで、ＫＡＲに由来するシグナルが翻訳されたか否かを決定するため及びかかるシグナルが刺激又は阻害されたか否かを決定するため、当業者は数多くの手段を利用することができる。かかる手段の例が以上で示されてきた。
【００６１】
診断用作用物質としての前記ポリペプチド，抗体及び核酸の利用も又、本発明の範囲内に入る（診断方法及びその利用を可能にする診断用キット）。
【００６２】
本発明は同様に、以下の段階を含む細胞の異常な又は望ましくない機能のインビトロ診断方法をも目的としている。
【００６３】
− 少なくとも１つの細胞又は細胞抽出物を、本発明に従った抗体又はそのフラグメント，又は本発明に従った核酸又はその変異体を接触させる段階、及び
− 場合によって形成された反応産物の存在を明らかにする段階。
【００６４】
接触段階は、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）のような抗原抗体タイプの反応、又は核酸ハイブリダイゼーションタイプの反応及びＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖増幅）の樹立を可能にする、特に接続時間、温度、緩衝液、場合によってはゲル網状化の条件の中で実施される。
【００６５】
場合によって形成される反応産物を明らかにするためには、螢光マーカー、酵素マーカー、放射性マーカー、又は発光マーカーを利用することができる。
【００６６】
本発明に従った前記インビトロ診断方法は、免疫増殖疾患、ＨＩＶ疾患のような免疫不全疾患、顆粒リンパ球増殖疾患のようなガン、リウマチ様多発性関節炎のような自己免疫疾患、マラリアのような感染性疾患、アレルギー応答、移植片拒絶の形で現われうる異常な又は望ましくない細胞機能の診断を可能にする。
【００６７】
本発明は同様に、ＫＡＲの活性化のアダプタまたはエフェクタ分子の同定方法及び、ＫＡＲの活性化の結果としての細胞活性を変調させる能力をもつ分子の同定方法にも関する。
【００６８】
本発明に従ったＫＡＲの活性化のアダプタ又はエフェクタ分子の前記同定方法は、次の段階を含んで成る：
ｉ．本発明に従ったポリペプチド（又はそのフラグメント又はその相同体）と候補分子を接触させる段階、及び
ii. 前記ポリペプチド（又はそのフラグメント）に対する結合が観察される候補分子を選択する段階。
【００６９】
ＫＡＲの活性化のアダプタ又はエフェクタ分子である可能性のある候補分子は、例えばＳＨ２又はＰＴＢドメインをもつ分子の中から選択することができる。これらの分子は、可溶性組換え型形態を有することができる。
【００７０】
接触段階は例えば、ＫＡＲの活性化のアダプタ又はエフェクタ分子である可能性のある可溶性組換え型形態で得られた候補分子を、シンチレーション液の球のような放射能測定を可能にする球にカップリングさせること及び前記球上にトリチウム標識づけされた形の本発明に従ったポリペプチド（又はそのフラグメント又は相同体）を通過させることによって実施することができる。このとき、候補分子のうち、放射能測定（ｃｐｍ）によって前記ポリペプチド，フラグメント又は相同体に対するその結合が観察された候補分子が選定される。
【００７１】
接触段階は同様に、マイクロ支持体ＢＩＡcore(Pharmacia) のようなプラズモン共鳴の測定を可能にするマイクロ担体上の本発明に従ったポリペプチド（又はそのフラグメント又はその相同体）の不動化によって（例えば、Olcese et al.,１９９６，The Journal of Immunology １５６：４５３１−４５３４； Vely et al., Immunology Letters１９９６，vol.５４．ｐ１４５−１５０を参照のこと）又はストレプタビジン球上でリン酸化及びビオチニル化された本発明に従ったポリペプチドの不動化（Vely et al. Eur. J. Immunol.１９９７，２７：１９９４−２０００； Le Drean et al. Eur. J. Immunol. １９９８，２８：２６４−２７６）によって、及び前記マイクロ支持体上の、ＫＡＲの活性化のアダプタ又はエフェクタ分子である可能性のある候補分子の通過によっても実施可能である。このとき、プラズモン共鳴の測定（Resonance Unit) により、候補分子のうち、前記ポリペプチド，フラグメント又は相同体に対するその結合が観察された候補分子が選定される。
【００７２】
ＫＡＲの活性化のアダプタ又はエフェクタ分子のこの同定方法は、その実施様式の如何に関わらず、本発明に従ったＫＡＲの活性化の結果としてもたらされる細胞活性を変調させる能力をもつ分子の同定方法の実施における基準として役立つこともできる。
【００７３】
本発明に従ったＫＡＲの活性化の結果として得られる細胞活性を変調させる能力を有する分子のこの同定方法は、以下の段階を含んで成る：
ｉ．上述の本発明に従った方法によって得られるようなＫＡＲの活性化のアダプタ又はエフェクタ分子、及び本発明に従ったポリペプチド（又はそのフラグメント又は相同体）と、候補分子を接触させる段階、及び
ii. 候補分子のうち、かかる候補分子の不存在下で観察されるような前記ポリペプチド（又はそのフラグメント又は相同体）と前記アダプタ又はエフェクタ分子の間の結合に対し効果を及ぼす候補分子を選択する段階。
【００７４】
ＫＡＲの結果得られた細胞活性を変調する可能性のある候補分子は、天然又は合成の化合物バンク、特に化学的又は組合せバンクの中から選択することができる。前記候補分子は、（例えば本発明に従った抗体のような抗イディオタイプ抗体の誘導体又はフラグメント，触媒抗体の誘導体又はフラグメントのような）タンパク質、炭素質、脂質又は核タイプのものでありうる。
【００７５】
本発明に従ったＫＡＲの活性化の結果としての細胞活性を変調させる能力をもつ分子の同定方法の接触段階は、例えば、本発明に従ったポリペプチド（又はそのフラグメント又は相同体）及び本発明に従った方法によって得られるようなＫＡＲの活性化のアダプタ又はエフェクタ分子を用いて前記候補分子を、例えば、酵素特性、リン酸化又は自己リン酸化特性のような未結合状態の前記アダプタ又はエフェクタ分子の化学特性に基づいて前記ＫＡＲの活性化のアダプタ又はエフェクタ分子と前記ポリペプチドの間の結合率を測定することを可能にするような条件下でインキュベートさせることによって実施することができる。
【００７６】
本発明に従ったＫＡＲの活性化の結果として得られる細胞活性を変調させる能力をもつ分子の同定方法の接触段階は、同様に、それぞれ放射能又は候補分子の不存在下又は存在下での前記アダプタ又はエフェクタ分子と前記ポリペプチドの間の結合の結果として得られるプラズモン共鳴を測定することによる、上述のようなシンチレーション液球又はトリチウム標識づけされたポリペプチドタイプの技術又はマイクロ支持体及びプラズモン共鳴の測定タイプの技術を利用することによって実施可能である。このとき、候補分子のうち、これらの分子の不存在下で前記アダプタ又はエフェクタ分子と前記ポリペプチドの間で測定されるコントロール結合率を統計的に有意な形で増大又は減少させる候補分子が選定される。
【００７７】
本発明に従った方法により同定されるようなＫＡＲの活性化を変調させる能力をもつ分子は、それらを生物学的条件下で加水分解不能にするような形で及び/又はそれらが細胞脂質２層を横断しうるような形で、化学的に修飾されうる。
【００７８】
本発明に従った、ＫＡＲの活性化を変調させる能力をもつ分子は、有利には前記ＫＡＲＡＰとその細胞エフェクタ又はアダプタの間の相互作用を修飾することによって作用する。
【００７９】
このとき、本発明に従ったＫＡＲの活性化の結果としての細胞活性を変調させる能力をもつ前記分子は、例えばリガンドとの接触によりそのＫＡＲが刺激されたリンパ球のようなインビトロで培養された細胞に対して適用することができる。この適用は、例えば、脂質２層を超えることができるようにする化学的修飾又は電気穿刺法による前記細胞内部への進入によって行なわれる。
【００８０】
本発明は、いかなる場合であっても制限的なものとみなされてはならない後述の実施例によって例示されている。
【００８１】
ここでは、以下の２３の図が参考にされている：
【発明を実施するための最良の形態】
【００８２】
実施例１：
１．材料と方法
モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）及び試薬
以下のモノクローナル抗体が利用された：
− ＪＴ３Ａ（Coulter Immunotech 照会番号０１７８），ＫＤ１（Coulter Immunotech照会番号０８１３）及びＴＡ１８１，Ｈ１２（Coulter Immunotech 照会番号１８４４）のようなイソタイプＩｇＧ１の抗ＣＤ３，抗ＣＤ１６及び抗ＣＤ５６抗体、
− ＴＩＡ−２のような抗ＣＤ３ζ抗体（Coulter Immunotech ６６０４５Ｐ２）、
− 抗ＣＤ１５８抗体、すなわちＥＢ６のような抗ｐ５８．１抗体（Coulter Immunotech照会番号１８４７）、ＧＬ１８３のような抗ｐ５８.２抗体（Coulter Immunotech照会番号１８４６）、及び Bottino et al.(Eur. J. Immunol.１９９６，２６，１８１６）内で記述されている ＰＡＸ２５０のような抗ｐ５０.３抗体、
− Jouvin M. H. et al.,１９９４，J. Biol. Chem., ２６９，５９１８−５９２５中に記述された抗血清６６６のようなウサギ抗ＦｃεＲＩγ抗血清、
− Bociano L. K. et al., １９８６，J. Biol. Biochem. ２６１，１１８２３−１１８３１の中で記述されている抗血清ＢＣ４のようなウサギ抗ＦｃεＲＩα抗血清、
− ワサビペルオキシダーゼに複合されたヤギ抗マウス抗血清（Sigma Ａ−２３０４）及びワサビペルオキシダーゼに複合されたヤギ抗ウサギ抗血清（Sigma A-０５４５），
− イソチオシアン酸フルオレセイン（Coulter Immunotech ０８１９Ｆ（ａｂ')２)に複合されたヤギ抗マウス免疫グロブリン（Coulter Immunotech ０８１９Ｆ（ａｂ')２)，
− ＧＬ１８３−フィコエリスリン（ＧＬ１８３−ＰＥ）（Coulter Immunotech ２２７８）（ＥＢ６−フィコエリスリン（ＥＢ６−ＰＥ）モノクローナル抗体（Coulter-Immunotech ２２７７）及びヤギ抗マウスフィコエリスリン免疫グロブリン（抗マウスＰＥ）（Coulter Immunotech ０８５５ Ｆ（ab')２)。
【００８３】
溶解緩衝液は、ｐＨ７.５のトリス−ＨＣｌ ２５０ｍＭ；ＮａＣｌ １５０ｍＭ；ジギトニン１％；オルトバナジン酸ナトリウム１００μＭ；ＮａＦ１０ｍＭ；アプロチニン２μｇ/ｍｌ；ロイペプチン２μｇ/ｍｌを含有し、これらの物質は全て、Sigma 社（ＵＳＡ，ＭＯ，St Louis) から購入された。
【００８４】
キナーゼ緩衝液は、ｐＨ７.２の Hepes ２０ｍＭ；ＮａＣｌ １００ｍＭ；ＭｎＣｌ２ ５ｍＭ；ＭｇＣｌ２ ５ｍＭ；３２γＡＴＰ１０μＣｉ＝３７０ｋＢｑ（Amersham, Buckinghamshire, UK) を含有していた。
【００８５】
薄層電気泳動緩衝液（ＴＬＥ）は、１０％の氷酢酸及び水中１％のピリジン；ｐＨ３.５を含んでいた。
【００８６】
細胞
ＬＤＧＬ患者由来のヒトＮＫ細胞又はＬＤＧＬ細胞
ヒトＮＫ細胞は、ＮＫ細胞系統ＣＤ５６＋，ＣＤ１６＋，ＣＤ３− の顆粒リンパ球増殖性疾患（ＬＤＧＬ，Lymphoproliferative Disease of Granular Lymphocytes)を患う患者から、ヒトＮＫ細胞を得た。末梢血リンパ球（ＰＢＬ，Peripheral Blood Lymphocyte)を、フィコール/ハイパーク勾配に従った遠心分離により、ＬＤＧＬを患う患者の血液標本から単離した。次に、これらのＬＤＧＬ細胞を、照射された異質遺伝子型栄養細胞及び１００Ｕ/ｍｌのｒＩＬ−２の存在下において、１０％ウシ胎児血清及び１０μｇ/ｍｌのペニシリン−ストレプトマイシンにより、ＲＰＭＩ−１６４０培地上で１ｍｌにつき１０６個の細胞の濃度、３７℃の温度で培養した。
【００８７】
トランスフェクションを受けた細胞ＲＴIIＢ．ｐ５０.２＋ の獲得
ＫＡＲ ｐ５０.２を発現するＲＢＬ−２Ｈ３細胞のトランスフェクタント（American Type Culture Collection）（ＲＴIIＢ．５０.２＋細胞）を、Blery et al.，１９９７．J. Biol. Chem., ２７２，８９８９−８９９６に記述された通りに実現した。図６は、概略的に、ＫＩＲｐ５８レセプタ（免疫グロブリンタイプの阻害性ヒトレセプタ）及びＫＡＲｐ５０（ＫＩＲｐ５８レセプタの非阻害性対応物）の構造を表わしている。
【００８８】
簡単に言うと、利用されているＲＴIIＢ細胞は、マウスＣＤ３の完全な細胞質内ドメインに結びつけられたヒトＣＤ２５の完全な膜外及び膜内外ドメインを含むキメラ分子ＣＤ２５/ＣＤ３及びマウスＦｃγＲIIｂ２レセプタを発現するような形でトランスフェクションを受けたＲＢＬ−２Ｈ３細胞であるものとして従来記述されてきた細胞である。
【００８９】
これらのＲＴIIＢ細胞は、さらに、発現ベクターＲＳＶ−５ｇｐｔ上に支持された（ｐ５０.２８３についてコードする）ｃＤＮＡ１８３．Ａｃｔ２の電気穿刺法によるトランスフェクションを受けた。
【００９０】
安定したトランスフェクション済みのＲＴIIＢ．ｐ５０.２＋細胞は、キサンチン（２５０μｇ/ｌ），ハイポキサンチン（１３.６μｇ/ｌ）及びマイコフェノール酸（２μｇ/ｌ）の存在下での培養により樹立された。
【００９１】
細胞溶解試験
ＩＬ−２上で培養されたＬＤＧＬ細胞の細胞溶解活性は、抗ＣＤ１６，抗ＣＤ１５８及び抗ＣＤ５６ｍＡｂｓの不存在下又は存在下で、Ｐ８１５マウス細胞系統（American Type Culture Collection）との関係において測定された。
【００９２】
簡単に言うと、５１Ｃｒで標識づけされた５×１０３個の標的細胞を、４時間，５１Ｃｒの標準遊離試験の開始時点でハイブリドーマの上清モノクローナル抗体５０μｌの存在下でエフェクタ細胞の連続希釈液に添加した（Vivier E. et. al., １９９１. J. Immunol. １４６：２０６）。
【００９３】
放射性ヨウ化
ＰＢＳ（リン酸ナトリウム緩衝液）の中で０.５％のホルムアルデヒドに細胞（１０−５０×１０６）を固定し、その後、Anderson P. et al., １９８９，J. Immunol. １４３：１８９９）によって記述されたようにラクトペルオキシダーゼ（１２５Ｉ，NEN-Dupont Wilmington, DE, USA）を触媒としたヨウ化に先立って、ＰＢＳ中で３０μｇ/ｍｌのジギトニンを用いて５分間、これに透過性を付与した。
【００９４】
細胞を、ジギトニン入り溶解緩衝液中で４℃で３０分間、溶解させた。このとき、予め精製した核後上清を、Ｓ４Ｂ−セファローズ球（Pharmacia, Piscataway, NJ. USA) を被覆する特異的抗体を用いて免疫沈降させた（Vivier Ｅ. et al., １９９１，J. Immunol. １４６：２０６）。免疫沈降物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム及びゲル上の電気泳動によるタンパク質の分解）及びオートラジオグラフィによって分析した。
【００９５】
インビトロキナーゼ試験
１ｍｌの溶解緩衝液（試薬参照）の中に細胞（試料１個あたり１０×１０６個）を溶解させた。予備精製した核後上清を、ＣｎＢｒ(Pharmacia）により活性化させたセファロース４Ｂに共有結合させたモノクローナル抗体を利用して２〜３時間免疫沈降させた。溶解緩衝液中で、免疫複合体を３回洗浄し、そのとき４０μｌのキナーゼ緩衝液（試薬参照）を３７℃で１０分間、免疫沈降物に添加した。試料−ＳＤＳ還元緩衝液を添加することによってキナーゼ反応を停止させた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析及びオートラジオグラフィに先立ち、試料を沸とうさせた。いくつかの実験において、試料を２次元非変性/変性対角線ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。
【００９６】
ＫＡＲＡＰのリン酸化の分析
インビトロでのキナーゼ試験及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離の後、リン酸化したタンパク質を乾燥したゲルから切除し、Centrilutor(Amicon) 又はＰＢＳ（リン酸ナトリウム緩衝液）中０.１％のＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）溶液を利用して溶出させた。溶出したタンパク質を、９０分間１１０℃での２００μｌのＨＣｌ ５.７Ｍ中のインキュベーションに先立ち、２時間４℃で２０％のトリクロロ酢酸中で沈降させた。個々のアミノ酸を次に乾燥させ、標準レフェレンスとして標識づけされていないホスホチロシン、ホスホトレオニン、ホスホセリン（Sigma)の各々を５μｇを含むＴＬＥ緩衝液（試薬）５μｌ中で再び懸濁させた。セルロースプレート（ＤＣ−セルロース１００−μｍ）上に試料を被着させ、Multiphor II (pharmacia)上で４℃で４５分間１５００Ｖで遊走させた。アセトン及び３２Ｐで標識づけされたアミノ酸の中で１％のニンヒドリンを用いて標準レフェレンスを開発した。
【００９７】
免疫トランスファによる分析
免疫沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分解させ、ニトロセルロースフィルタ上に移し、脱脂粉乳５％のＰＢＳ溶液中で希釈された抗ＣＤ３ζ又は抗ＦＣεＲＩγ抗体プローブに対峙させた。ワサビペルオキシターゼ（それぞれ Sigma 照会番号Ａ−２３０４及びＡ−０５４５）に接合されたやぎ抗マウス又は抗ウサギ抗血清及び Amersham(ＲＰＮ２２０９）によって市販されているＥＣＬ検出システムを用いて免疫トランスファを明らかにした。
【００９８】
２．結果
表面表現型
ＬＤＧＬ患者に由来し、ＩＬ−２（インタロイキン−２）上で培養されたＮＫ細胞の表面表現型を間接的免疫螢光でのＦＡＣＳcan（螢光により活性化された細胞の選別）により分析した。
【００９９】
以下で報告するのは、以下のＲ.Ｐ., Ｄ.Ｆ. 及びＭＡＬと呼称するこれらの患者のうちの３名に関する研究の結果である。
【０１００】
前記結果は、ＬＤＧＬ（顆粒リンパ球増殖性疾患）細胞Ｒ.Ｐ., Ｄ.Ｆ. 又はＭＡＬの間接的免疫螢光ＦＡＣＳcan による分析が示されている図１Ａによって例示されている。イソチオシアン酸フルオレセインに接合されたヤギ抗マウス免疫グロブリンが、第２段階の試薬として用いられた。各タイプのＬＤＧＬ（上部水平バンド内に示された分析についてはＬＤＧＬ細胞Ｒ.Ｐ., 中央水平バンドの分析についてはＬＤＧＬ細胞Ｄ.Ｆ., 下部水平バンドの分析についてはＬＤＧＬ細胞ＭＡＬ）及び受けた治療の各々について（左側に示されたグラフについてはコントロール治療し、左から右へ抗ＣＤ３，抗ＣＤ１６，抗ＣＤ１５８ ＥＢ６，抗ＣＤ１５８ ＧＬ１８３，抗ＣＤ１５８ ＰＡＸ２５０という表示されたモノクローナル抗体による治療）、横座標には螢光強度が、又縦座標には、相対的細胞数が報告されている。
【０１０１】
以下のことが観察できる：
− ＮＫ細胞Ｒ.Ｐ., Ｄ.Ｆ. 及びＭＡＬは全てＣＤ３− 及びＣＤ１６＋ である。
【０１０２】
− ＮＫ細胞Ｒ.Ｐ. は、ｐ５０.１＋，ｐ５０.２−，ｐ５０.３− である。これらは、抗ＣＤ１５８ＥＢ６モノクローナル抗体によって認識され、抗ＣＤ１５８ＧＬ１８３及びＰＡＸ２５０モノクローナル抗体によっては認識されない。
【０１０３】
− ＮＫ細胞Ｄ.Ｆ.は、ｐ５０.１−，ｐ５０.２＋，ｐ５０.３− である。これらは、抗ＣＤ１５８ＧＬ１８３モノクローナル抗体によって認識され、抗ＣＤ１５８ＥＢ６及びＰＡＸ２５０モノクローナル抗体によって認識されない。
【０１０４】
− ＮＫ細胞ＭＡＬは、ｐ５０.１−，ｐ５０.２−，ｐ５０.３＋ である。これらは抗ＣＤ１５８ ＰＡＸ２５０モノクローナル抗体によって認識され、抗ＣＤ１５８ ＥＢ６及びＧＬ１８３モノクローナル抗体によっては認識されない。
【０１０５】
従って、ＬＤＧＬを患う３人の患者は、それぞれ抗ＫＩＲ ｐ５８.１（ＥＢ６），抗ＫＩＲ ｐ５８.２（ＧＬ１８３）及び抗ＫＡＲ ｐ５０.３（ＰＡＸ２５０）という抗ＣＤ１５８抗体によって認識されるＮＫ細胞のリンパ球増殖を示した。かくして３つのＮＫ細胞グループ、すなわちＬＤＧＬ Ｒ.Ｐ細胞、ＬＤＧＬ Ｄ.Ｆ細胞及びＬＤＧＬ ＭＡＬ細胞を定義づけすることができた。
【０１０６】
細胞溶解試験
標的細胞ＦｃγＲ＋ としてＰ８１５を利用して再誘導される細胞毒性試験を、ＮＫ細胞Ｒ.Ｐ.ｐ５０.１＋，Ｄ.Ｆ.ｐ５０.２＋ 及びＭＡＬ．ｐ５０.３＋ について実現した。
【０１０７】
結果は、異なるモノクローナル抗体で再誘導された細胞毒性試験を示す図１Ｂに例示されている：表示された供与体（左側のＲ.Ｐ.ｐ５０.１＋，中央のＤ.Ｆ.ｐ５０.２＋ 又は右側のＭＡＬ．ｐ５０.３＋）に由来し、ＩＬ−２上で培養されたＮＫ細胞がエフェクタ細胞として利用された。試験は、抗体無し（白色円）で、又は抗ＣＤ１６モノクローナル抗体（黒色三角形）、抗ＣＤ５６モノクローナル抗体（白色三角形）、抗ＣＤ１５８モノクローナル抗体（Ｒ.ＰについてはＥＢ６，Ｄ.ＦについてはＧＬ１８３，ＭＡＬについてはＰＡＸ２５０）（黒色円）の存在下で実施された。横座標には、エフェクタ細胞と標的細胞の比率（Ｅ：Ｔ比；８：１；４：１；２：１；１：１；０.５：１；０.２５：１）が報告されており、縦座標には、特異的溶解百分率（０〜１２０％の目盛）が報告されている。
【０１０８】
再誘導された細胞毒性試験は、ＫＩＲレセプタの刺激の際に観察されたものとは対照的に、ＮＫ細胞に対する抗ＣＤ１５８抗体の添加が細胞Ｐ８１５の細胞溶解を著しく増大させる（図１Ｂ）ということを示している。
【０１０９】
コントロールとして、抗ＣＤ１６モノクローナル抗体は、イソタイプに対合（match）された抗ＣＤ５６モノクローナル抗体がいかなる効果ももたないのに対し、抗ＣＤ１５８モノクローナル抗体と類似の要領でＰ８１５の自発的細胞溶解を増大させる。
【０１１０】
従って、これらのＮＫ細胞は、その表面において、ＫＩＲの活性化イソタイプの型タンパク質であるＫＡＲを発現する。さらにこれらの結果はｃＤＮＡ ＫＩＲ/ＫＡＲの逆転写酵素を用いてＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖増幅）分析により確認された。
【０１１１】
放射性ヨウ化及び免疫トランスファにより発現されたＫＡＲの分析：ＫＡＲＡＰの同定
ＬＤＧＬ患者由来のＮＫ細胞上で発現されたＫＡＲレセプタを、内部放射性ヨウ化とそれに続く免疫沈降によって分析した。
【０１１２】
結果は図２Ａに例示されており、この図では、１２５Ｉで放射性標識づけされ抗ＣＤ１５８ ＥＢ６モノクローナル抗体を用いて免疫沈降され（トラック１）その後抗ＣＤ３ζ/抗ＦｃεＲＩγモノクローナル抗体を用いて精製され（トラック２〜７）、最後に抗ＣＤ１５８ ＥＢ６ モノクローナル抗体を用いて再度免疫沈降された（トラック８）供与体Ｒ.Ｐ.（ｐ５０.１＋）のＮＫ細胞（１０×１０６ 細胞/トラック）から実施された、変性条件下で１３％のゲル上のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析が示されている。
【０１１３】
同じプロフィールは、供与体Ｄ.Ｆ.（ｐ５０.２＋）及びＭＡＬ.(ｐ５０.３＋）を用いて得られた（データ示さず）。
【０１１４】
ＮＫ細胞の溶解産物から調製された抗ＣＤ１５８抗体の免疫沈降物が、≒５０ｋＤａで観察されたＫＡＲに加えて、約１２±１ｋＤａで遊走するさらに小さい分子質量のバンドを含有することを観察することができる。
【０１１５】
ＫＩＲは、ヒトＮＫ細胞内でポリペプチドＣＤ３ζ及びＦｃεＲＩγと会合することが示された。抗ＣＤ３ζ及び抗ＦｃεＲＩγ抗体を利用した予備枯渇実験により、ＫＡＲに会合した約１２ｋＤａのバンドがＣＤ３ζ又はＦｃεＲＩγであるという可能性（図２Ａ）は無くなっていた。
【０１１６】
この約１２±１ｋＤａのバンドに対応するタンパク質集合体を、ＫＡＲＡＰ（ＫＡＲ−associated proteins, ＫＡＲに会合したタンパク質）と命名した。
【０１１７】
これらの結果は、ＮＫ細胞溶解産物から調製した抗ＣＤ１５８ｍＡｂｓの免疫沈降物中には、抗ＣＤ３ζ抗体の存在下で反応性あるバンドがことごとく存在していないことを明らかにした免疫トランスファ実験になって確認された。
【０１１８】
抗ＣＤ３ζ抗体の存在下で得られたこれらの結果は、変性条件下での１５％のゲル上のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分解及び抗ＣＤ３ζモノクローナル抗体プローブ（右側標識付け矢印）を用いたニトロセルロースフィルタのインキュベートによる、Ｄ.Ｆ.細胞の完全溶解産物及びかかる溶解産物の免疫沈降物の分析を示す図２Ｂによって例示されている。Ｄ.Ｆ.細胞の完全溶解産物（ＬＣＣ）を、トラック１にトラックあたり５×１０６ 個の細胞の割合で被着させ、かかる溶解産物の免疫沈降物をトラック２〜４にトラックあたり１５×１０６ 個の細胞の割合で被着させた。免疫沈降は、コントロールとしてトラック２で抗ＦｃεＲＩαＢＣ４モノクローナル抗体を、トラック３で抗ＣＤ１６モノクローナル抗体を、そしてトラック４で抗ＣＤ１５８ＧＬ１８３モノクローナル抗体を利用して、Ｄ.Ｆ.細胞溶解産物について実施された。
【０１１９】
同じ結果は、抗ＣＤ３ζｍＡｂを用いて細胞Ｒ.Ｐ.及びＭＡＬについても得られた。
【０１２０】
抗ＦｃεＲＩγｍＡｂを用いて得た結果（データ図示せず）は、同じ確認事実をもたらした。
【０１２１】
インビトロキナーゼ試験及び薄層電気泳動（ＴＬＥ）によるＫＡＲＡＰの分析
抗ＣＤ１５８モノクローナル抗体の免疫沈降物について実施されたインビトロキナーゼ試験は、ＫＡＲが、ＮＫ細胞内で約１４±１ｋＤａで遊走する低分子量の支配的なリンタンパク質に会合することを明らかにした。
【０１２２】
結果は、図３Ａに例示されている： ＮＫ細胞ＭＡＬから調製された溶解産物を、インビトロキナーゼ試験に先立ち、表示された抗体（トラック１では抗ＦｃεＲＩα，トラック２では抗ＣＤ１６，トラック３では抗ＣＤ１５８）で免疫沈降させた。リン酸化されたタンパク質を、変性条件下で１５％のゲル上でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。
【０１２３】
これらの結果は、内部ヨウ化によって観察された１２ｋＤａのＫＡＲＡＰのリン酸化された形態について予想された分子質量の変化と一致している。その上、ＮＫ ＫＡＲ＋細胞から調製された抗ＣＤ１５８ｍＡｂｓの免疫沈降物は、（図３Ａに１４ｋＤａでのＫＡＲＡＰの矢印の両側の星印により示された）それぞれ１６±１ｋＤａ及び１２±１ｋＤａで遊走するその他の２つのホスホ−ＫＡＲＡＰを含んでいる。
【０１２４】
リン酸化されたＫＡＲＡＰの類似したグループとＫＡＲの会合は、ＮＫ細胞ＫＡＲ＋クローンのパネルでも観察され、ＮＫ ＫＩＲ＋クローンでは見られなかった。１６，１４及び１２ｋＤａでのホスホ−ＫＡＲＡＰの相対的強度はＮＫ細胞の由来に従って変動しうるということが観察された。
【０１２５】
リン酸化されたアミノ酸の分析は、１４ｋＤａの主要ＫＡＲＡＰが主としてチロシン残基レベルでリン酸化されることを明らかにした。
【０１２６】
結果は、図３Ｃにより例示されている：インビトロキナーゼ試験の後、ＫＡＲＡＰ（左）及びＣＤ３ζ（右）ＫＡＲＡＰバンドを切除し、薄層電気泳動によるリン酸化アミノ酸分析に付した。この実験では、それぞれＮＫ細胞Ｒ.Ｐの溶解産物から調製された抗ＣＤ１５８及び抗ＣＤ１６モノクローナル抗体の免疫沈降物から、ＫＡＲＡＰ及びＣＤ３ζバンドを単離した。
【０１２７】
それでも、トレオニン残基レベルではなくセリン残基レベルでのリン酸化も検出することができる。コントロールとしてリン酸化アミノ酸分析は、チロシン残基のレベルでのみＣＤ３ζのリン酸化を確認した。
【０１２８】
ＫＡＲＡＰ及び活性化シグナルの形質導入（トランスフェクタントＫＡＲ＋）
ＫＩＲｐ５８.２とは対照的に、非リンパ球様の細胞系統ＲＢＬ−２Ｈ３のトランスフェクタント内でのＫＡＲｐ５０.２の発現は、ＫＡＲｐ５０.２の活性化機能の再構築を導くものではない。実際、抗ＣＤ１５８抗体により誘発されるＲＢＬ−２Ｈ３ｐ５０.２＋ 細胞トランスフェクタントの刺激は、細胞質内Ｃａ２＋の検出可能な可動化もセロトニンの検出可能な遊離も全く導かない。驚くべきことに、ＲＢＬ−２Ｈ３ｐ５０.２＋ 細胞トランスフェクタントから調製された抗ＣＤ１５８モノクローナル抗体の免疫沈降物について実施されたインビトロキナーゼ試験は、検出可能なＫＡＲＡＰを全く内含していなかった。
【０１２９】
結果は、図３Ｂによって例示されている：ＲＢＬ−２Ｈ３ｐ５０.２＋ 細胞から調製した溶解産物を、インビトロキナーゼ試験に先立ち、表示された抗体（トラック１では抗ＣＤ３ε，トラック２では抗ＦｃεＲＩα，トラック３では抗ＣＤ１５８）で免疫沈降させた。リン酸化タンパク質を、変性条件下で１５％のゲル上でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。
【０１３０】
ＲＢＬ−２Ｈ３ｐ５０.２＋ 細胞のトランスフェクタント内でのＫＡＲＡＰに対するＫＡＲの会合の欠如は、内部ヨウ化によっても確認された（データ図示せず）。
【０１３１】
従ってＫＡＲＡＰは、選択的にＫＡＲに会合し、ＫＡＲＡＰに対するＫＡＲの会合の欠如は、検出可能な任意の活性化シグナルを形質導入する能力をＫＡＲがもたないことと相関される。
【０１３２】
ＫＡＲ−ＫＡＲＡＰ会合（対角線ゲル）
最終的に、抗ＣＤ１５８モノクローナル抗体の免疫沈降物の対角線２次元ゲル上での分析が、対角線ゲルに沿って約１６，１４及び１２ｋＤａのホスホ−ＫＡＲＡＰが減少することを明らかにした。
【０１３３】
結果は図４に例示されている：ＮＫＲ.Ｐ.細胞の溶解産物から調製された抗ＣＤ１５８モノクローナル抗体の免疫沈降物（ＩＰ）を、非変性/（水平方向）/変性（垂直方向）条件での２次元１３％ゲル上でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析に先立ち、インビトロキナーゼ試験に付した。
【０１３４】
かくしてこれらの結果は、ジスルフィド結合により結合されたＫＡＲＡＰ二量体複合体に対しＮＫ細胞内でＫＡＲが会合させられるということを表わしている。
【０１３５】
３．論述
特にクラスＩのＭＨＣの分子についての自律的活性化レセプタ又はＴＣＲ（Ｔリンパ球レセプタ）又はＲＦｃ（免疫グロブリン定常フラグメントについてのレセプタ）のコレセプタであるＫＡＲは、ＮＫ及びＴ細胞の活性化のための新しい１つの方法を表わしている。
【０１３６】
本発明者は、ＫＡＲが実際ＮＫ細胞内で、ジスルフィド結合によって結合された二量体の形で会合されたＫＡＲＡＰを介入させる多量体複合体の形に集合させられていることを実証した。
【０１３７】
放射性ヨウ化による分析が約１２±１ｋＤａのＫＡＲＡＰを立証したとすると、キナーゼ試験による分析は、約１６，１４，及び１２±１ｋＤａの３つのホスホ−ＫＡＲＡＰを立証した。
【０１３８】
ＫＡＲＡＰに対するＫＡＲの会合と、ＫＡＲの活性化機能の間の相関は、ＫＡＲＡＰが、多量体ＫＡＲ複合体の形質導入サブユニットとして作用することを示唆している。
【０１３９】
しかしながら、ＲＢＬ−２Ｈ３細胞のトランスフェクタントについて観察されたようなＫＡＲＡＰに対するＫＡＲの会合の欠如は、ＩＴＡＭ（チロシン残基に基づく免疫レセプタの活性化パターン）をもつポリペプチドを内含する抗原又は抗体に対する多量体活性化レセプタについて観察されたこととは異なり、細胞表面上のレセプタの発現を妨げるものではない。
【０１４０】
免疫グロブリンの上科の活性化又は少なくとも非阻害性のその他のレセプタは、ＫＡＲｐ５０（免疫グロブリンタイプのヒトＫＡＲ）すなわち：レクチンタイプのヒトＫＡＲレセプタＮＫＧ２Ｃ/Ｄ，免疫グロブリンタイプのマウスＫＡＲレセプタ pirＡ，ｇｐ４９Ａ，レクチンタイプのマウスＫＡＲレセプタＬｙ４９Ｄ，Ｌｙ４９Ｈのみならず、ＩＬＴ１のようなＬＩＲ/ＭＩＲ/ＩＬＴ系統群のヒト活性化レセプタと驚くほどの類似性を示している。
【０１４１】
これらの類似性は、免疫グロブリン上科（ＩｇＳＦ）又はレクチンタイプの活性化又は非阻害性レセプタ又はそれらの阻害性対応物を示している図５によって例示されている。各々のレセプタ対の名称（左から右へ、ｍＰＩＲ−Ｂ−ｍＰＩＲ−Ａ，ＩＬＴ２−ＩＬＴ１，ＳＩＲＰα−ＳＩＲＰβ，ＫＩＲ−ＫＡＲ，ＦｃγＲIIＢ−ＦｃγＲIII, ＮＫＧ２Ａ/Ｂ−ＮＫＧ２Ｃ/Ｄ，ｍＬｙ４９Ａ/Ｂ/Ｃ/Ｅ/Ｆ/Ｇ/Ｉ−ｍＬｙ４９Ｄ/Ｈ）の下には、それらを天然に発現する細胞が表示されている。活性化又は非阻害性レセプタは、ＩＴＩＭ（チロシン残基に基づく免疫レセプタ阻害パターン）もＩＴＡＭ（チロシン残基に基づく免疫レセプタ活性化パターン）も有さず、それらの膜内外（ＴＭ）ドメイン内に荷電アミノ酸を有する（Ｒ＝アルギニン、Ｋ＝リシン、Ｄ＝アスパラギン酸、Ｅ＝グルタミン酸）。阻害性対応物（各対の左側要素）は、その細胞質内（ＩＣ）部分内にＩＴＩＭパターンを有する。各々の活性化又は非阻害性レセプタは、細胞質外（ＥＣ）レベルで、その阻害性対応物との強い相同性を示す。
【０１４２】
実施例２：
ＫＡＲＡＰ分子の生化学的特徴づけ（上述の実施例１参照）により、我々は、特に以下のようなポリペプチドの主要な同定基準を明確にすることができた：すなわち
− ジスルフィド結合の形成を可能にする、細胞質外システインアミノ酸を有するポリペプチド（図４参照）；
− 約１２〜１６ｋＤａの間に含まれるみかけの分子質量をもつポリペプチド；
− リン酸化可能なチロシンアミノ酸を少なくとも１つ有するポリペプチド（図３Ｃ参照）。
【０１４３】
１２，１４及び１６ｋＤａにおいて同定されたＫＡＲＡＰ分子の間に存在する強い類似性のため、我々は、これら３つの分子形態が、１２ｋＤａを超えることのあり得ない分子量をもつ同じＫＡＲＡＰ ポリペプチドの異なるリン酸化度を表わしているということを想定した。
【０１４４】
さらに、ＫＡＲＡＰの主要な特性は、ＫＩＲとではなくＫＡＲとのその選択的会合にある。ＫＩＲとは異なりＫＡＲは、ＫＡＲは膜内外荷電アミノ酸（リシン：Ｋ）を有し、この特殊性は同じく複合体ＣＤ３/ＴＣＲ，ＢＣＲ，ＦｃεＲＩ及びＦｃγＲIIIＡ（ＣＤ１６）の中に存在するＩＴＡＭをもつポリペプチドの会合に基づくものであることから、我々は、ＫＡＲＡＰがＩＴＡＭをもつ膜内外ポリペプチドの系統群の新メンバであることを考慮して我々のＫＡＲＡＰ遺伝子の同定戦略を方向づけした。これらのポリペプチドは、実際ＫＡＲＡＰと、同じ特徴を分ち合っている：すなわち、
− ジスルフィド架橋の形成を可能にする細胞質外システインアミノ酸（Ｃ）を有するポリペプチド，
− ２５ｋＤａを超えない低分子質量のポリペプチド，
− ＹＸＸＬ/ＩＸ６−８ ＹＸＸＬ/Ｉ，のようなＩＴＡＭパターン内に含まれたリン酸化可能なチロシンアミノ酸を少なくとも１つ有するポリペプチド，及び
− 膜内外荷電アミノ酸の存在。
【０１４５】
かくして、我々は、ＥＳＴ，ＧＥＮＢＡＮＫ，ＳＷＩＳＳ ＰＲＯＴ及びＥＭＢＬのような形で入手可能な公共のｃＤＮＡバンクから１つの遺伝子を同定する生物学的情報処理戦略を作り上げた。我々は、次のような異なる２つのアプローチを利用した：
１） 我々は、５０〜２００個のアミノ酸（考慮対象の分子量は５.５〜２２ｋＤａの間に含まれる）をもつペプチドのみをとり上げて、ＥＳＴの集合体を６つの読取り段階に従って翻訳した。 このサブベースに対して、我々は次のような複数の基準を適用した：
− Argos 方法（Rao & Argos,１９８６，Biochem, Biophys. Acta, ８６９，１９７−２１４）に従って、アミノ酸３０の前に始まる、少なくとも１０個のアミノ酸の予測された膜内外領域の存在。実際、ＣＤ３ζ及びＦｃεＲＩγのようなＩＴＡＭをもつポリペプチドとの相同性により、ＫＡＲＡＰ配列の主要な部分は、細胞質内のものであると予測されている。
【０１４６】
膜内外ゾーンのＣ末端位置におけるＩＴＡＭパターン（Ｙ−ｘ−ｘ−〔ＩＬ〕−ｘ（６，８）−Ｙ−ｘ−ｘ〔ＩＬ〕）の探索。
【０１４７】
− 荷電アミノ酸（Ｒ，Ｋ，Ｄ，Ｅ）の膜内外領域内における存在。
【０１４８】
− 膜内外ゾーンのＣ末端位置におけるシステインアミノ酸（Ｃ）の存在。
【０１４９】
２） ＣＤ３Ｚ＿ＨＵＭＡＮ入力との配列相同性を有するＥＳＴ入力の探索（ＥＭＢＬ，ＧＥＮ ＢＡＮＫ及びＳＷＩＳＳ ＰＲＯＴでも同様に行なわれる分析）。利用されるプログラムは、ＴＢＬＡＳＴＮ（１，４，１１バージョン；Altschul, Stephen F., Warren Gish, Webb Miller, Eugene W. Myers, and David J. Lipman, １９９０，J. Mol. Biol. ２１５，４０３−１０）又はＴＢＬＡＳＴＮ（２，０，３バージョン；Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman,１９９７，Nucleic Acids Res.２５，３３８９−３４０２）である。これらの類似入力に対して、我々は次に、第１のアプローチで利用した選択基準を適用した。
【０１５０】
これら２つの生物学的情報処理アプローチを組合せることにより、疎水性プロフィールを用いて連続的に（Genworks プログラム，ＤＮＡ Strider），候補分子のリーダー領域、膜内外領域、細胞質内及び細胞質外領域を決定した後、我々は、潜在的にＫＡＲＡＰのものに対応する配列を多数得た。これらの配列のうち、Genbank 上でＡＡ２４２３１５の受入れ番号に対応する配列が、我々にはマウスのＫＡＲＡＰ遺伝子の配列（Ｃ５７Ｂ１/６マウスｃＤＮＡ 配列番号１）であるように思われた。図７は、本発明に従ったＫＡＲＡＰ ポリペプチドのＤＮＡ配列（ｃＤＮＡ 配列番号１）を表わしている。この配列は、マウスのＫＡＲＡＰ遺伝子の配列に対応する。実際、ヌクレオチド配列の翻訳は、３９６ヌクレオチドの読取り枠（配列番号２）を与える。この結果は、リーダー配列（これを含まず）から停止コドンまでに含まれるＫＡＲＡＰ遺伝子のヌクレオチド配列の一部分（配列番号１）を表わし、かつ同様にこのヌクレオチド配列の下に対応するアミノ酸配列（１文字コード）（配列番号２，３文字コード），すなわち本発明に従った成熟マウスのＫＡＲＡＰタンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）をも表わしている図８によって例示されている。この配列の標準的な分析は、８７個のアミノ酸の成熟タンパク質（９.６ｋＤａの分子質量）、１６アミノ酸の細胞質外部分（Ｑ１〜Ｇ１６），２４アミノ酸の膜内外部分（Ｖ１７−Ｇ４０）及び４７アミノ酸の細胞質内部分（Ｒ４１〜Ｒ８７）を予測している。我々の探索戦略に従うと、細胞質外部分は、少なくとも１つのシステインアミノ酸（実際には２つ、Ｃ８及びＣ１０），膜内外アミノ酸（Ｄ２５）及び細胞質内ＩＴＡＭ（Ｙ６５ＱＥＬＱＧＱＲＨＥＶＹ７６ＳＤＬ）を含む。図９は、以前に記述されたＩＴＡＭを有するポリペプチドとＩＴＡＭパターン（単複）を有する本発明に従ったポリペプチドの間の配列のアラインメントによって行なうことのできる比較を例示し、その結果としてのコンセンサスＩＴＡＭ配列を示す。図９は、ＩＴＡＭをもつポリペプチドのＩＴＡＭ（６個のＣＤ３，１個のＩｇα，１個のＩｇβ，ＦｃεＲＩγ及びＦｃεＲＩβ）及び（この図９に「ＫＡＲＡＰ」と表示された）本発明に従った以上で同定されたマウスのＫＡＲＡＰ ポリペプチド（配列番号２）のＩＴＡＭパターンのアラインメントを表わしている。以前に記されたＩＴＡＭ（図９）とのこの比較に基づいて、我々には、（ＺＡＰ−７０及びｐ７２Ｓｙｋといったような）縦列ＳＨ２基をもつチロシンキナーゼタンパク質とリン酸化されたＫＡＲＡＰの会合を考慮することが可能となった。ＺＡＰ−７０のＳＨ２基に対応する組換え型融合タンパク質（Olcese L., Lang P., Vely F., Cambiaggi A., Marguet D., Blery M., Hippen K. L., Biassoni R., Moretta A., Moretta L., Cambier J. C., Vivier E.１９９６，J. Immunol. １５６：４５３１−４５３４ の中で記述された調製物）とＫＡＲＡＰの会合はインビトロで確認された。これらの実験は、図３Ａ，トラック３に記述されている通りに実施されたが、細胞溶解産物は、抗ＣＤ１５８抗体ではなく ＺＡＰ−７０のＳＨ２基に対応する組換え型融合タンパク質によって吸着された。かくして、ＫＡＲＡＰは、ＫＡＲに会合され、リン酸化されたチロシンの形でＺＡＰ−７０に会合する新しいＩＴＡＭ入り膜内外分子である。従ってＫＡＲＡＰは、Ｔ及びＮＫリンパ球の新たな形質導入要素である。ＫＡＲＡＰ又はＫＡＲＡＰ類似体が同様にＩＴＩＭ含有レセプタの活性化イソ型タンパク質にも会合し、これらの形質導入サブユニットの多分子複合体の中で、レセプタの係合の際に発せられるシグナルとして役立つことも可能である。
【０１５１】
配列がわかっている候補ポリペプチドが本発明に従ったＫＡＲＡＰタンパク質に対応することを決定又は制御するために特に適した方法は、この候補ポリペプチドの特徴的部分（例えば少なくとも１つのＩＴＡＭパターン又は細胞質外領域を含む細胞質内領域）に対する抗体を産生すること及び、この抗体が、機能的細胞上で、例えばその候補ポリペプチドがそのＫＡＲＡＰであると想定されているレセプタに会合した状態にある標的である機能的ＫＡＲ＋ 細胞を認識することを確認すること（すなわち、ＫＡＲ＋ 細胞の場合、抗体が、ＫＡＲレセプタに会合した状態にある標的を認識することを確認すくこと）から成る。
【０１５２】
本発明に従ったこのＫＡＲＡＰ ポリペプチドの同定方法は、かくして以下の段階から成る。
【０１５３】
− 候補ポリペプチド，特にこの候補ポリペプチドの少なくとも１つのＩＴＡＭパターンを含む領域に対して導かれたモノ又はポリクローナル抗体（例えば、以上で同定されたマウスＫＡＲＡＰタンパク質の場合には配列番号２の細胞質外部分（配列番号３）又は細胞質内部分（配列番号５）の領域に対し導かれた抗体）を産生する段階；
− 抗原−抗体タイプの結合反応を可能にする穏やかな条件下で候補ポリペプチドがＫＡＲＡＰを構成すると想定されている対象の活性化又は非阻害性レセプタを、１つの機能的形態にて有する細胞、例えばＮＫ又はＴ細胞のような機能的ＫＡＲ＋ 細胞の溶解産物と、この抗体を接触させる段階、
− 場合によって形成される反応産物の中に、ＫＡＲのものに近い見かけの分子質量（約５０ｋＤａ）をもつ産物及び候補ポリペプチドのものに近い見かけの分子質量（特に約１０〜１６ｋＤａの間）をもつ産物が存在する場合に、本発明に従ったＫＡＲＡＰ ポリペプチドであるものとしてその候補ポリペプチドを同定する段階。
【０１５４】
本発明に従ったこの同定方法は特に、
− 上述の通りに前記抗体を接触させ、
− 分子複合体を保存する洗剤の穏やかな条件下で（例えば１％のジギトニン，上述の実施例１参照），場合によって形成された反応産物を沈降させ、
− 例えば、変性条件内でポリアクリルアミドゲル上の分子質量マーカーの存在下での電気泳動遊走により、沈降された産物の分子質量を測定し
− 上述のとおりの本発明に従ったＫＡＲＡＰポリペプチドであるものとして候補ポリペプチドを同定すること、
によって実施することができる。
【０１５５】
実施例３
１．ＫＡＲＡＰに対応する複数のＥＳＴの同定
上述の実施例２に示されたような生物学的情報処理による我々のマウスＫＡＲＡＰクローニング戦略は、同様に、我々のＫＡＲＡＰの定義に対応する５ＥＳＴ（Expressed Tag Sequences ：発現済みタグ配列）の存在をも明らかにする。つまり、これは、ＥＳＴ ＡＡ２４２３１５，ＡＡ７３４７６９，Ｗ８８１５９，ＡＡ０９８５０６及びＷ４１１４２である。図１０Ａ〜１４Ａは、それぞれ、ＥＳＴ ＡＡ２４２３１５，ＡＡ７３４７６９，Ｗ８８１５９，ＡＡ０９８５０６及びＷ４１１４２のｃＤＮＡ配列を例示している（それぞれ配列番号６〜１０）。図１０Ｂ〜１４Ｂは、それぞれこれらのＥＳＴに対応するタンパク質配列を例示する（それぞれＥＳＴ ＡＡ２４２３１５，ＡＡ７３４７６９，Ｗ８８１５９，ＡＡ０９８５０６ 及び Ｗ４１１４２のタンパク質について配列番号１１〜１５）。これらのＥＳＴは全てＣ５７Ｂ１/６マウス由来の組織から得られ、読取り枠に対応するｃＤＮＡ配列を得るように整列させられたものである。このことは、ＥＳＴ ＡＡ０９８５０６（配列番号９）、ＡＡ２４２３１５（配列番号６）、Ｗ８８１５９（配列番号８）、ＡＡ７３４７６９（配列番号７）及びＷ４１１４２（配列番号１０）の配列のアラインメントを表わし、結果として得られたコンセンサス配列（コンセンサスマウスＫＡＲＡＰｃＤＮＡ：配列番号１６）を示す図１５によって例示されている。
【０１５６】
このことは同様に、ＥＳＴ ＡＡ２４２３１５（配列番号１１），Ｗ８８１５９（配列番号１３），Ｗ４１１４２（配列番号１５），ＡＡ０９８５０６（配列番号１４）及びＡＡ７３４７６９（配列番号１２）のタンパク質配列のアラインメントを表わし、かつ結果として得られるコンセンサス配列（コンセンサス配列ＫＡＲＡＰタンパク質，配列番号１７）を表わす図１６によっても例示されている。これらの図１５及び１６上で、記号「・」は、考慮対象のコンセンサス配列との同一性を表わし、記号「−」は、配列決定データの欠如を表わす。
【０１５７】
２．マウスＫＡＲＡＰのゲノム配列
１２９マウス系統のマウスから単離したゲノミックＤＮＡのライブラリ（ラムダファージ、ＥＭＢＬ３）を、従来の技術に従って ＥＳＴ ＡＡ７３４７６９の配列に対応するｃＤＮＡを用いてスクリーニングした。１８ｋｂのフラグメントを含むファージを、陽性として同定した。一連の制限酵素での切断によりこのファージのカルトグラフィを実施し、ファージから得た９ｋｂのＥcoＲＩ−ＥcoＲＩフラグメントをｐBlue−Scriptクローニングベクター内でクローニングした。これには、マウスＫＡＲＡＰ遺伝子全体（初期ＡＴＧからＳＴＯＰ配列まで）が含まれている。このマウスＫＡＲＡＰ遺伝子の配列は、図１７に示されている（配列番号１８；２８３８ｐｂ）。
【０１５８】
その上、マウスＫＡＲＡＰのゲノム組織を得るべく、オリゴヌクレオチドプライマが生成された。利用されたプライマは以下の表１に示されている（配列番号１９〜２６）。
【表１】
【０１５９】
マウスＫＡＲＡＰのゲノム組織は図１８に示されている。我々はこれらのデータから、１２９系統のマウスのＫＡＲＡＰのｃＤＮＡ配列ひいてはタンパク質配列を得た。このｃＤＮＡ配列（配列番号２７）及びこのタンパク質配列（配列番号２８）は図１９に示されている。
【０１６０】
かくして翻訳されたタンパク質配列は、以下のとおりである。
【０１６１】
（配列） シグナル配列
（配列） 細胞質外ドメイン
（配列） 膜内外ドメイン
（配列） 細胞質内ドメイン
ゲノミックカルトグラフィのこれらの結果全体は、マウスＫＡＲＡＰ遺伝子（初期ＡＴＧからＳＴＯＰ配列まで）が長さ約２.９ｋｂであり、５個のエキソンを含むことを示している。これらの結果は、上から下へ、１２９マウスのマウスＫＡＲＡＰのゲノミックＤＮＡ（黒色：翻訳済みエキソン；水平ハッチング：未翻訳エキソン、白色：イントロン）、対応するタンパク質配列（エキソン１〜エキソン５までの配列番号２８）及びこのタンパク質の異なる領域の性質（ＳＳ＝シグナル配列；ＥＣ＝細胞質外ドメイン；ＴＭ＝膜内外ドメイン；ＩＣ＝細胞質内ドメイン）を表わす図２０によって例示されている。エキソン１は、シグナル配列のＮ末端部分についてコードし、エキソン２はシグナル配列の残りの部分及び細胞質外部分の最初の３つのアミノ酸についてコードし、エキソン３は、細胞質外部分の残りの部分、膜内外部分及び細胞質内部分の最初の９つのアミノ酸についてコードし、エキソン４は、細胞質内部分の１４のアミノ酸についてコードし、エキソン５はタンパク質の残りの部分についてコードする。ＫＡＲＡＰといったようなＩＴＡＭを有するポリペプチドのゲノム組織に期待されるように、ＩＴＡＭは、タイプ０のイントロンによって分離された２つのエキソン（エキソン４及び５）によってコードされる。
【０１６２】
３．ＤＡＰ−１２ヒトＫＡＲＡＰによりＲＢＬ−２Ｈ３の中で発現されるＫＡＲ（ｐ５０.２）の機能的再構築
我々は、マウスＫＡＲＡＰの配列から演繹されるオリゴヌクレオチドプライマを生成することによりＲＴ−ＰＣＲによってヒトＫＡＲＡＰについてコードするｃＤＮＡを得た。利用されたプライマは、以下の表２に示されいる（配列番号２９及び３０）。
【表２】
【０１６３】
得られたｃＤＮＡ配列は図２１に示されている（配列番号３１：ヒトＫＡＲＡＰのｃＤＮＡ）。ＫＡＲ＋ ヒトＮＫクローンから抽出されたＲＮＡは、このｃＤＮＡの生成のベースとして役立った。このｃＤＮＡを、ｐＮＴ−ｎｅｏ 真核生物発現ベクタ内でクローニングし、このヒトＫＡＲＡＰについて安定したトランスフェクタントを、ＲＢＬ−２Ｈ３細胞系統のＫＡＲ＋（ｐ５０.２）トランスフェクタント内で生成した（Blery et al, J. Biol. Chem., １９９７）。ｐ５０.２＋ 及びＫＡＲＡＰ＋ というこのように２重にトランスフェクションを受けたＲＢＬ−２Ｈ３細胞上で発現されたＫＡＲレセプタがもつ活性化シグナルを形質導入する能力を、ｐ５０.２の細胞質外部分に対して導かれた抗体を用いての刺激によって、又トリチウム標識づけされたセロトニンの塩析に従ってテストした。
【０１６４】
このトリチウム標識づけされたセロトニンの塩析実験のために従ったプロトコルは以下のとおりである：
これらの細胞を剥離させ、遠心分離に付し、１ｍｌにつき１×１０６個の細胞という最終濃度でＲＰＭＩ−１０％ＳＶＦの中で再懸濁させる。このとき、細胞を、１時間細胞１ｍｌあたり２μＣｉのトリチウム標識づけ済みセロトニンを用いてインキュベートさせる。細胞を洗浄し、次に、細胞がその原液から余剰のセロトニンを塩析させるべく３７℃で１時間培地の中に戻す。その後、細胞をマウスのＩｇＥ（２６８１−Ｉ）又は抗ｐ５０ＡＣ（ＧＬ１８３）と共に、９６ウェル付き平板（１ウェルあたり細胞２０００００個）の中に分布させる。細胞を１時間付着させその後洗浄する。細胞を１５分間３７℃に戻し、次にＦ(ab') ２Ｇモノクローナル抗体（５０μｇ/ｍｌ）を用いて刺激する。３７℃で３０分間、細胞を放置してそれらがそのセロトニンを遊離させることができるようにする。低温ＨＢＳＳを添加し細胞を氷上に置くことによって反応を終結させる。このとき各ウェルの上清の半分を回収し、１ｍｌのシンチレーション液中に入れる。セロトニンが投入された未刺激の細胞から得られた同量の溶解産物から１００％の脱顆粒化が得られる。このときβカウンタで試料を計数する。
【０１６５】
得られた結果は、ヒトのｐ５０/ＫＡＲＡＰの２重トランスフェクションを受け、横座標に示された抗体（左側：抗体無し；中央：マウスＩｇＥ：ｍＩｇＥ１/５００；右側：ＧＬ１８３ ５μｇ/ｍｌ）による刺激を受けたＲＢＬ−２Ｈ３細胞により上清内で塩析されたセロトニンの％を示す図２２によって例示されている。この図２２に示されているように、ＫＡＲの細胞質外部分と反応する抗体（モノクローナル抗体 ＧＬ１８３）によるＲＢＬ−２Ｈ３中のＫＡＲの係合が細胞の活性化という形で現われないのに対し、ヒトのＫＡＲとＫＡＲＡＰを同時に発現する２重トランスフェクタントＲＢＬ−２Ｈ３でのＧＬ１８３によるＫＡＲの係合は細胞活性化（ここでは細胞からのセロトニンの遊離により表出される）という形で現われる。従ってこのことは、同定されたヒトＫＡＲＡＰ配列がＫＡＲの機能性を再構築するということの明確な証拠である。
【０１６６】
図２３は、ヒトＫＡＲＡＰ遺伝子の組織とマウスＫＡＲＡＰ遺伝子の組織の間の相同性を例示する（Ｅ１〜Ｅ５：エキソン１〜エキソン５；Ｉ１〜Ｉ４：イントロン１〜イントロン４）。ここには、ヒト及びマウスのＫＡＲＡＰ遺伝子の塩基対の番号づけが表示されている。
【０１６７】
（配列表）
【化１】
【化２】
【化３】
【化４】
【化５】
【化６】
【化７】
【化８】
【化９】
【化１０】
【化１１】
【化１２】
【化１３】
【化１４】
【化１５】
【化１６】
【化１７】
【化１８】
【化１９】
【化２０】
【化２１】
【化２２】
【図面の簡単な説明】
【０１６８】
【図１Ａ】Ｒ．Ｐ．，Ｄ．Ｆ., 及びＭＡＬと呼称されるＬＤＧＬ（顆粒リンパ球増殖性疾患）を患う患者に由来しＩＬ−２（インタロイキン２）上で培養された細胞の間接的免疫蛍光検査法でのフラックス白球計算器（Becton-Dickinson の登録商標ＦＡＣＳcan)による分析を示す。
【図１Ｂ】異なる供与体に由来するＩＬ−２上で培養されたＮＫ細胞上で実施された、異なるモノクローナル抗体を用いて再度導かれた細胞毒性試験の結果を示している。
【図２Ａ】抗ＣＤ３ζ/抗ＦｃεＲＩγ抗体を用いてＦｃεＲＩγ及びＣＤ３ζの枯渇前後に、抗ＣＤ１５８ＥＢ６モノクローナル抗体を用いて免疫沈降された、１２５Ｉでの放射性標識づけ済みの供与体Ｒ．Ｐ.(ｐ５０．１＋) のＮＫ細胞から実施されたＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム及びゲル上電気泳動によるタンパク質の分解）分析を示す。
【図２Ｂ】細胞Ｄ．Ｆ．の完全溶解産物及びかかる溶解産物の免疫沈降物の抗ＣＤ３ζ抗体プローブを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示している。
【図３Ａ】ＭＡＬ ＮＫ細胞の溶解産物の免疫沈降物が付されたインビトロキナーゼ試験に由来するリン酸化されたタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【図３Ｂ】図３Ａと同じタイプではあるものの、ＲＢＬ−２Ｈ３ｐ５０．２＋細胞から実施されたＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【図３Ｃ】Ｒ．Ｐ., ＮＫ細胞のそれぞれ抗ＣＤ−１５８及び抗ＣＤ１６免疫沈降物について実施されたインビトロキナーゼ試験後に切除された、ＫＡＲＡＰ及びＣＤ３ζバンドのリン酸化されたアミノ酸の薄層電気泳動（ＴＬＥ）による分析を示している。
【図４】キナーゼ試験を受けたＲ．Ｐ．ＮＫ細胞の溶解産物の抗ＣＤ１５８免疫沈降物の非変性/変性条件での２次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【図５】免疫グロブリン上科又はレクチンタイプの活性化又は非阻害性レセプタ及びそれらの阻害性対応物を示す。
【図６】ＫＩＲ（ｐ５８）及びＫＡＲ（ｐ５０）の概略的構造を表わす。
【図７】本発明に従ったマウスのＫＡＲＡＰポリペプチドのｃＤＮＡ配列を表わす（配列番号１）。
【図８】本発明に従ったＫＡＲＡＰポリペプチドのアミノ酸配列（成熟タンパク質配列番号２）及びヌクレオチド配列（リーダ配列（これを除く）から停止コドンまでに含まれたもの）を表わしている。
【図９】本発明に従ったＫＡＲＡＰポリペプチドのＩＴＡＭ及び複数のＩＴＡＭのアラインメントを表わしている。
【図１０Ａ】ＥＳＴのＡＡ２４２３１５のｃＤＮＡ配列（配列番号６）を例示する。
【図１０Ｂ】ＥＳＴのＡＡ２４２３１５のタンパク質配列（配列番号１１）を例示する。
【図１１Ａ】ＥＳＴのＡＡ７３４７６９のｃＤＮＡ配列（配列番号７）を例示する。
【図１１Ｂ】ＥＳＴのＡＡ７３４７６９のタンパク質配列（配列番号１２）を例示する。
【図１２Ａ】ＥＳＴのＷ８８１５９のｃＤＮＡ配列（配列番号８）を例示する。
【図１２Ｂ】ＥＳＴのＷ８８１５９のタンパク質配列（配列番号１３）を例示する。
【図１３Ａ】ＥＳＴのＡＡ０９８５０６のｃＤＮＡ配列（配列番号９）を例示する。
【図１３Ｂ】ＥＳＴのＡＡ０９８５０６のタンパク質配列（配列番号１４）を例示する。
【図１４Ａ】ＥＳＴのＷ４１１４２のｃＤＮＡ配列（配列番号１０）を例示する。
【図１４Ｂ】ＥＳＴのＷ４１１４２のタンパク質配列（配列番号１５）を例示する。
【図１５Ａ】ＥＳＴ ＡＡ２４２３１５，ＡＡ７３４７６９，Ｗ８８１５９，ＡＡ０９８５０６及びＷ４１１４２のｃＤＮＡ配列のアラインメント及び、結果としてもたらされるコンセンサス配列（配列番号１６：コンセンサスＣ５７Ｂ１/６マウスのＫＡＲＡＰｃＤＮＡ）。
【図１５Ｂ】ＥＳＴ ＡＡ２４２３１５，ＡＡ７３４７６９，Ｗ８８１５９，ＡＡ０９８５０６及びＷ４１１４２のｃＤＮＡ配列のアラインメント及び、結果としてもたらされるコンセンサス配列（配列番号１６：コンセンサスＣ５７Ｂ１/６マウスのＫＡＲＡＰｃＤＮＡ）。
【図１６】ＥＳＴ ＡＡ２４２３１５，ＡＡ７３４７６９，Ｗ８８１９，ＡＡ０９８５０６及びＷ４１１４２のタンパク質配列のアラインメント及び結果として得られるコンセンサス配列（配列番号１７：コンセンサスＣ５７Ｂ１/６マウスのＫＡＲＡＰタンパク質）を表わす。
【図１７Ａ】１２９系統のマウスのＫＡＲＡＰ遺伝子配列（配列番号１８：２８３８ｐｂ）を表わす。
【図１７Ｂ】１２９系統のマウスのＫＡＲＡＰ遺伝子配列（配列番号１８：２８３８ｐｂ）を表わす。
【図１８】１２９系統のマウスのＫＡＲＡＰのゲノム組織を表わす。
【図１９】１２９系統のマウスのＫＡＲＡＰのｃＤＮＡ配列（配列番号２７）及び対応するタンパク質配列（配列番号２８）を表わす。
【図２０】上から下に１２９系統のマウスのＫＡＲＡＰ遺伝子のゲノム組織、対応するタンパク質配列及びこのタンパク質の異なる領域の性質を表わしている。
【図２１】ヒトＫＡＲＡＰのｃＤＮＡ（配列番号３１）を表わす。
【図２２】ヒトｐ５０/ＫＡＲＡＰの２重トランスフェクションを受け横座標に記された抗体（左側：抗体無し；中央：マウスＩｇＥ：ｍＩｇＥ １/５００；右側：ＧＬ１８３ ５μｇ/ｍｌ）による刺激を受けたＲＢＬ−２Ｈ３細胞による、上清中で塩析されたセロトニンの百分率を表わす。
【図２３】ヒトＫＡＲＡＰ遺伝子の組織とマウスＫＡＲＡＰ遺伝子の組織の間の相同性を例示する。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、自律したレセプタとしてか又はコレセプタとして機能するクラスＩのＭＨＣ（主要組織適合性遺伝子複合体）の分子に対する活性化レセプタ、及び特にＫＡＲ（キラー細胞活性化レセプタ）に由来するシグナルを形質導入する能力をもつ新しい特殊なポリペプチド。免疫原として役立つ前記ポリペプチドから得られる抗体及び、前記ポリペプチドに対応する核酸に関する。
【０００２】
本発明は同様に、かかるポリペプチドの獲得方法及び前記ポリペプチド，抗体及び核酸の生物学的応用、より特定的には予防、治療及び診断へのその応用に関する。
【背景技術】
【０００３】
生体の一貫性を維持し、無欠性を確保するためには、免疫系は、調整のとれた細胞間連絡系を利用しなければならない。
【０００４】
これらの連絡には異なるタイプのレセプタが関与する。そのうちの３つ、すなわちＢリンパ球抗原に対するレセプタ（ＢＣＲ），Ｔリンパ球抗原に対するレセプタ（ＴＣＲ）及び抗体のＦｃ部分（ＲＦｃ）を認識するレセプタについて今や充分に記述されており、それらの異なる構造は比較的良く知られている。
【０００５】
抗原に対するレセプタでも抗体に対するレセプタでもないその他のレセプタは、記述されてきたものの、その構造及び作用メカニズムはまだよく知られていない。
【０００６】
これらは、ＫＡＲ（キラー細胞活性化レセプタ）及びその阻害性対応物ＫＩＲ（キラー細胞阻害性レセプタ）のようなＭＨＣ（主要組織適合性遺伝子複合体）の分子に対するレセプタである。
【０００７】
ＫＡＲとＫＩＲは、ＮＫ細胞に制限されない：これらは同様に、Ｔ細胞により天然に発現される。
【０００８】
ＫＡＲは、ＫＩＲと高い相同性をもつ（細胞質外レベルでのＫＡＲとＫＩＲの間の相同性は最高９６％）。
【０００９】
しかしながら、ＫＡＲ及びＫＩＲは同じ機能を果たすものではない。すなわち、ＫＩＲは、ＮＫ及びＴ細胞の活性化の負の制御（阻害作用）に関与するのに対し、ＫＡＲはＮＫ及びＴ細胞の活性化の正の制御（刺激作用）に関与する。
【００１０】
細胞質内外及び細胞質内のドメインのレベルでの主たる差異は、活性化同型化（ＫＡＲ）及び阻害性同型体（ＫＩＲ）の間で実証することができた。
【００１１】
実際、ＫＩＲとは異なり、ＫＡＲはその膜内外ドメイン内で荷電アミノ酸残基（リシン）を発現し、その細胞質内ドメイン内にいかなるＩＴＩＭパターン（チロシン残基に基づく免疫レセプタの阻害パターン）も含んでいない。しかし単量体レセプタＫＡＲは、ＩＴＡＭ（チロシン残基に基づく免疫レセプタ活性化パターン）を含んでいない。
【００１２】
ＭＨＣの分子に対する活性化レセプタであり、ＩｇＳＦ（免疫グロブリンの上科）すなわち、それ自体ＩＴＩＭもＩＴＡＭも有さず膜内外荷電アミノ酸（リシン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸）を有するＩＴＩＭ阻害性レセプタの対応物である活性化レセプタの一員であるＫＡＲについて観察された状況は、その他のタイプのレセプタについても観察することができる。かくして、（レクチンタイプのものであり、かつその阻害性対応物がＮＫＧ２Ａ/Ｂである）ＮＫＧ２Ｃ/ＤのようなＭＨＣの分子についての活性化レセプタ（又は少なくとも非阻害性レセプタ）のみならず、そのリガンドがなおも未知である、造血細胞及び非造血性細胞（ＳＩＲＰβ）についてか又はＢ細胞、マクロファージ及び樹枝状細胞（ＩＬＴ１）について記述されたＳＩＲＰβ及びＩＬＴ１のようなその他の非阻害性レセプタについても同様のことがいえる。
【００１３】
ＫＡＲは、特にクラスＩのＭＨＣの分子について、自律性レセプタとして機能することができる。かくして、標的細胞の表面上で発現されたクラスＩのＭＨＣの分子とＫＡＲの係合が、細胞質内Ｃａ２＋の可動化及び標的細胞の溶解の誘発から実証されたようにリンパ球活性化プログラムを開始することがわかっている。
【００１４】
ＭＨＣ分子に対するその自律性レセプタの機能の他に、ＫＡＲは同様に、レセプタＴＣＲ及びＲＦｃのためのコレセプタ機能をも果たすことができる（非特許文献１、２）。
【００１５】
実際、ＣＤ１６（ＲＦｃγIII）のようなレセプタによる免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の定常フラグメント（Ｆｃ) の認識の際及びクラスＩ又はIIのＭＨＣの分子により制限された複合体ＣＤ３/ＴＣＲによる抗原の認識の際には、ＫＡＲはコレセプタの役目を果たし、かくして特に少量の抗原に直面して、細胞応答の強度を増大し、経時的細胞応答を維持し、同様に細胞増殖の刺激のために共働することができる。
【００１６】
ＮＫ及びＴリンパ球下位母集団上で天然に発現されるＫＡＲの役目は、その固有のリガンドすなわちクラスＩのＭＨＣの分子により制限されず、免疫系全般の平衡にまで拡大されている。
【００１７】
かくして天然に発現されたＫＡＲの機能は、ＮＫ及びＴ細胞の増殖、かかる細胞によるサイトカインタイプの物質の産生、有害な、悪性の又はウイルス感染を受けた自己由来細胞、同種異系細胞のような標的細胞の分解のみならず、或る種の抗原に直面した免疫系の寛容に対し影響を及ぼす。
【００１８】
従って、ＫＡＲの全ての無機能又は機能不全は、全て免疫系の機能に関連する、例えば免疫不全疾患、自己免疫疾患（例えば多発性硬化症）、腫瘍、ウイルス感染、細菌感染、寄生虫感染、アレルギー、移植片拒絶のような、さまざまな疾病又は望ましくない反応を導く可能性がある。例えば、ヒトがＫＡＲを発現するリンパ球を平均して１０％未満しか有していないとすると、ＬＤＧＬ（顆粒リンパ球増殖病）にかかった患者のリンパ球のほぼ全てはＫＡＲを発現する。
【非特許文献１】マンデルボイム・オー（Mandelboim O）ら著、「Science」、１９９６年、第２７４巻、ｐ．２０９７
【非特許文献２】カムビアッジ・エイ（Cambiaggi A．）ら著、「Blood」、１９９６年、第８７巻、ｐ．２３６９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
本発明の目的は、ＫＡＲのようなクラスＩのＭＨＣの分子についての活性化レセプタの異常な又は望ましくない機能を診断しその機能を制御することを可能にする手段を提供することにある。
【００２０】
かくして、本発明は、ＫＡＲに由来するシグナルの形質導入に必要な、以下ＫＡＲＡＰ（ＫＡＲ会合タンパク質）と呼ばれる新しいポリペプチド，ならびに、これらの新しいポリペプチドから得られた抗体及び核酸を目的とする。本発明は同様に、前記新しいポリペプチドの獲得方法ならびにその生物学的応用をもその目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
「ＫＡＲレセプタ」というのは、本明細書においては、ＫＡＲｐ５０レセプタ（ＫＩＲ II ＤＳ１〜ＫＩＲ II ＤＳ５）のようなＫＩＲレセプタの非阻害性対応物である免疫グロブリンタイプのヒトレセプタ、ＫＩＲ III ＤＳ１，ならびにこれらのＫＡＲレセプタに類似する構造をもつ非阻害性のあらゆるレセプタ、特に（ＮＫ細胞及びＴ細胞上で天然に発現されている）ＮＫＧ２Ｃ，ＮＫＧ２Ｄのようなレクチンタイプのヒトレセプタ、（骨髄性細胞，Ｂ細胞上で天然に発現されている）pir Ａのような免疫グロブリンタイプのマウスレセプタ、（マスト細胞上で天然に発現されている）ｇｐ４９Ａ，（ＮＫ及びＴ細胞上で天然に発現されている）Ｌｙ４９Ｄ，Ｌｙ４９Ｈのようなレクチンタイプのマウスレセプタを意味している。
【００２２】
従って、ＫＡＲＡＰポリペプチドというのは、それが無い状態では前記ＫＡＲレセプタが天然に、検出可能な活性化シグナルを形質導入する能力をもたないような、単離された全てのポリペプチド（ＫＡＲ以外）のことを意味している。これにより、決定されたＫＡＲＡＰポリペプチドが以上のようなＫＡＲレセプタのみならず、上述のようなＫＡＲの構造に近い構造をもつ活性化又は非阻害性のその他の単量体レセプタにも、そして特に、ＩＬＴ１のようなＬＩＲ/ＭＩＲ/ＩＬＴ系統群の免疫グロブリンタイプのヒト活性化レセプタにも会合（associate）されうるという事実が排除されることはない。
【００２３】
本出願においては、「ポリペプチド」という語は、前記ポリペプチドのみならず、アミノ酸の保存的欠失、挿入、逆位又は置換によって得られるようなこのポリペプチドの相同体及び、プロテアーゼを用いて前記ポリペプチドの加水分解によって得られるようなこのポリペプチドのフラグメントをも含んでおり、これらの相同体又はフラグメントは、ＫＡＲに由来するシグナルを形質導入する能力をもつ。この「ポリペプチド」という語は、本出願において、ポリペプチドと同様タンパク質をも網羅する。
【００２４】
本発明に従ったポリペプチドは、ＫＡＲレセプタにより受理されたシグナルの形質導入に必要なものである：従って、これは、ＫＡＲ活性化不足の回復を可能にする単離されたタンパク質である。一定の与えられた単離されたポリペプチドが、ＫＡＲ活性化不足の回復を可能にするか否かを決定するためには、当業者は、このポリペプチドの不在下で適切な細胞によりそれが発現される場合でも、検出可能な活性化シグナルを形質導入するには至らず、又は目的とされている利用分野にとって満足のいく活性化シグナルを形質導入するには至らないＫＡＲレセプタが存在することを示すことにより作業を進めることができる。この決定の１実施形態が、ＫＡＲｐ５０.２レセプタのみを発現するＲＢＬ−２Ｈ３細胞の活性化能力（セロトニンの塩析）及びＫＡＲｐ５０.２レセプタとそのＫＡＲＡＰポリペプチドを同時に発現するＲＢＬ−２Ｈ３細胞の能力の間での比較により後述の実施例３において提示されている。適切な細胞の例が、後の図５に示されている。
【００２５】
「回復されたＫＡＲ活性化不足( deficient ) 」というのは、有意な活性化シグナルの前記ＫＡＲによる細胞での形質導入が可能であるか場合によっては充分であることを意味する。このことは、特に抗体による細胞刺激を用いてテストされうる。
【００２６】
細胞レベルで、ＫＡＲに由来するシグナルが形質導入されているか否かを決定するため、及び、かかるシグナルが刺激されているか又は阻害されているかを決定するために、当業者は数多くの手段を利用することができる。のような手段の例としては、リガンドによる前記ＫＡＲの刺激及び、分泌されたサイトカイン（例えば、Cambiaggi et al., １９９６，Blood ８７：２３６９参照）、細胞増殖（例えば Mandelboim et al., １９９６年、Science ２７４：２０９７参照）、細胞毒性（例えば後で記述する再誘導された細胞毒性テスト参照）、細胞質内カルシウム可動化（例えば、Blery et al., １９９７，J. Biol. Chem.２７２，８９８９−８９９６参照）、及び/又はリン酸化の誘発（例えば Vivier et al., １９９１. J. Immunol. １４６：２０６参照）の測定が含まれる。
【００２７】
本発明に従ったポリペプチドはさらに、ＫＡＲには会合するもののこのＫＡＲの阻害性対応物には会合しないという能力をもつことを特徴とする。
【００２８】
１つのポリペプチドがＫＡＲに会合するもののこのＫＡＲの阻害性対応物には会合しない（すなわち対応するＫＩＲレセプタに会合しない）能力をもつか否かの決定を可能にする方法は、当業者には周知のものである。かかる方法の一例には、特に次の段階が含まれる：
− 一方ではＫＡＲ＋ＫＩＲ−細胞に、そして他方ではＫＡＲ−ＫＩＲ＋細胞にこのポリペプチドを発現させる段階；
− 少なくとも抗ＫＡＲ及び/又は抗ＫＩＲ抗体を用いてこれらの細胞の溶解産物から単数又は複数のポリペプチド分画を免疫沈降させる段階；
− ＫＡＲ＋ＫＩＲ−細胞に由来する単数又は複数の分画内での前記ポリペプチドの存在及び、ＫＡＲ−ＫＩＲ＋細胞に由来する単数又は複数の分画内でのこの同じポリペプチドの不存在を観察する段階。抗ＫＩＲ及び/又は抗ＫＡＲ抗体の例としては、抗ＣＤ１５８固体、抗ｐ７０/ＮＫＢ１抗体、抗Ｐ１４０抗体そしてより特定的にはＥＢ６，ＧＬ１８３又はＰＡＸ２５０モノクローナル抗体が含まれる。細胞によりこのようなポリペプチドを発現させることを可能にする方法が、後述の実施例３で示されている。
【００２９】
なお本発明に従ったＫＡＲＡＰポリペプチドは、
ｉ． 抗ＣＤ１５８，抗Ｐ７０/ＮＫＢ１，抗Ｐ１４０抗体のような単数又は複数の抗ＫＩＲ及び/又は抗ＫＡＲ抗体，より特定的には、モノクローナル抗体ＥＢ６，ＧＬ１８３又はＰＡＸ２５０を用いて活性化シグナルを形質導入する能力をもつＫＡＲレセプタを発現する細胞溶解産物の単数又は複数のポリペプチド分画の免疫沈降により得られ、
ii． 各ポリペプチド分画は、任意には、これより以前に抗ＣＤ３ζ及び/又は抗ＦｃεＲＩγを用いた免疫沈降された分画の除去により枯渇され得及び/又は新たに抗ＣＤ１５８，抗Ｐ７０/ＮＫＢ１，抗Ｐ１４０抗体のような単数又は複数の抗ＫＩＲ及び/又は抗ＫＡＲ抗体、そしてより特定的にはモノクローナル抗体ＥＢ６，ＧＬ１８３又はＰＡＸ２５０を用いて免疫沈降され得、
iii. その分子量に従った前記単数又は複数のポリペプチド分画のポリペプチドの分解及び約１２±２ｋＤａの分子量に対応するポリペプチドの回収によってか又は、
前記単数又は複数のポリペプチド分画をキナーゼ試験に付した後その分子量に従って前記単数又は複数のポリペプチド分画を分解し、約１２，１４及び/又は１６±２ｋＤａの分子量に対応するリン酸化されたポリペプチドを回収することによっても得られるものであることを特徴とする。
【００３０】
活性化シグナルを形質導入する能力をもつＫＡＲレセプタを発現する前記細胞は、特に、ＮＫ細胞及び/又はＴ細胞及び/又は骨髄性細胞及び/又はＢ細胞及び/又はマスト細胞でありうる。ＫＡＲが、細胞においてシグナルを形質導入する能力を有するか否かを決定する方法が以上で示された。
【００３１】
本発明に従ったＫＡＲＡＰポリペプチドはさらに、そのアミノ酸配列が、
− リン酸化可能なチロシンアミノ酸を少なくとも１つ有し、
− 約１０±２から１６±２ｋＤａの間に含まれる分子質量（特に１０±２ｋＤａの実際の分子質量、リン酸化の程度に応じて１２±２〜１６±２ｋＤａの変性条件下でのポリアクリルアミドゲル上の見かけの分子質量）を有することを特徴とする。
【００３２】
さらにこのポリペプチドは、そのアミノ酸配列が細胞質内領域において少なくとも１つのＩＴＡＭ ＹｘｘＬ/Ｉx6-8ＹｘｘＬ/Ｉパターンを有することを特徴とする。
【００３３】
本発明の１態様に従うと、ＫＡＲＡＰポリペプチドのアミノ酸配列は、細胞質外領域、膜内外領域及び/又は細胞質内領域を含む。特徴的には、この細胞質内領域は、このポリペプチドの配列その他の領域との関係において大半を占めている。細胞質外、膜内外、細胞質内領域を同定するための手段は、当業者には既知のものである（例えば、水治療法アルゴリズム、逆小胞形成）。
【００３４】
本発明のもう１つの態様に従うと、ＫＡＲＡＰポリペプチドのアミノ酸配列は、細胞質外システインアミノ酸を少なくとも１つ有する。
【００３５】
本発明のさらにもう１つの態様に従うと、ＫＡＲＡＰポリペプチドのアミノ酸配列は、少なくとも１つの膜内外荷電アミノ酸（Ｒ，Ｋ，Ｄ，Ｅ）を有する。
【００３６】
本発明に従ったポリペプチドは、少なくとも１つのチロシンのレベルでリン酸化されてもよいし、或いは又リン酸化されなくてもよい。
【００３７】
本発明に従った一実施形態においては、前記ポリペプチドは、ジスルフィド架橋により結合された２量体の形を有している。これらは、クラスＩのＭＨＣの分子のための自律的レセプタとしてか又はＣＤ１６のようなＲＦｃ又はＴＣＲのコレセプタとして機能するＫＡＲに対し、選択的かつ非共有結合的に会合させられる。
【００３８】
本発明の有利な一形態に従うと、ＫＡＲＡＰポリペプチドは、ＺＡＰ−７０，Ｐ７２ＳＹＫ，Ｐ５６ＩＣＫ，Ｐ５９ｆｙｎ，Ｐ６０ｌｙｎ，Ｇｒｂ−２，ＰＰ３６−３８（ｌａｔ），ＰＬＣ−α１，Ｐ８５（ＰＩ−３キナーゼ），ＳｈｃのようなドメインＳＨ２をもつ分子、又はＳｈｃのようなドメインＰＴＢ（ホスホチロシン結合）をもつ分子に結合される能力をもつ。かかる結合は、本発明のポリペプチドをドメインＳＨ２又はＰＴＢをもつ分子と共にインキュベートしプラズモン共鳴を測定することによって観察できる（Olcese et al.,１９９６，The Journal of Immunology １５６：４５３１〜４５３４）。
【００３９】
本発明に従った特定のＫＡＲＡＰポリペプチドは、基本的に配列番号２により構成されたアミノ酸配列を有する。本発明は、同様に、その配列が基本的に配列番号２の細胞質外部分つまり配列番号３によってか又は配列番号２の膜内外部分つまり配列番号４，又は配列番号２の細胞質内部分つまり配列番号５によって構成されているポリペプチドをも目的としている。本発明に従ったその他の特別なＫＡＲＡＰポリペプチドは、基本的に配列番号１１，１２，１３，１４，１５，１７（マウスＣ５７Ｂ１/６のＫＡＲＡＰタンパク質のコンセンサス配列）又は配列番号２８（ゲノミック配列から得られるマウス１２９のＫＡＲＡＰのタンパク質配列）によって構成されている。
【００４０】
かかるポリペプチドは同様に、配列決定の後、化学的合成又は組換え型ＤＮＡ技術を用いて得ることもできる。
【００４１】
前記ＫＡＲＡＰポリペプチドは、細胞質内ＩＴＡＭもＩＴＩＭも有していないものの膜内外アミノ酸残基を有する活性化レセプタＫＡＲに由来するシグナルの形質導入に必要なものである。
【００４２】
有利な配置に従うと、本発明に従ったポリペプチドは、グリコシル化、リン酸化、スルホン化、ビオチニル化、アシル化、エステル化；ホスホン酸塩のようなリン酸塩基のものに近い分子形態をもつ実体の添加、置換又は抑制；ルシフェラーゼ、ＧＦＰ（Green Fluorescence Protein) 又はその類似体のような標識付け試薬の添加；親和性リガンドのような精製用標的の添加；その可溶性を修正する実体の添加；によって修飾される。特に有利な修飾としては、受理したシグナルを形質導入するその能力を阻止又は阻害するような形で前記ポリペプチドを修飾するものが含まれる（負のトランス優性形質の戦略）。このように修飾された形をした本発明に従ったポリペプチドは、特に、一定の与えられた免疫応答特に望ましくない又は異常な免疫応答（例えば自己免疫疾患、アレルギー、移植片拒絶）を負に変調させる（阻害する）ことを目的とする全ての組成物又は方法において利用される。このように適切な修飾としては、前記ポリペプチドのチロシン上でのリン酸化を生物学的条件下で加水分解不能にする（例えばホスホン酸塩の添加により）ような修飾が含まれる。この修飾には同様に、本発明に従ったポリペプチドの機能にとって重要なアミノ酸残基を非機能的にする修飾も含まれる。これは例えば特にＩＴＡＭパターン内に含まれるチロシン残基のようなチロシン残基（Ｙ）をフェニルアラニン残基（Ｆ）に置換又は突然変異させることによる。これにより、こうして修飾された前記ポリペプチドの、ドメインＳＨ２又はＰＴＢをもつタンパク質に対する結合が妨げられる。
【００４３】
もう１つの有利な措置に従うと、本発明のポリペプチド，そのフラグメント，相同体又は修飾された形態は、細胞膜すなわち脂質２層を横断する能力をもつ。
【００４４】
本発明は同様に、本発明に従ったＫＡＲＡＰポリペプチドからの免疫誘発によって得られる、又はかかるポリペプチドのフラグメント，相同体又は修飾された形態から得られるような抗体特にモノクローナル抗体及びかかる抗体のフラグメント特にフラグメントＦｃ，Ｆｖ，Ｆab，Ｆ(ab)'２，ＣＤＲをも目的としている。
【００４５】
本発明の目的は特に、その配列が基本的に本発明に従ったかかるＫＡＲＡＰポリペプチドの細胞質外、細胞質内又は膜内外部分によって構成されているポリペプチドから免疫誘発によって得られるような、かかる抗体のフラグメント特にフラグメント，Ｆｃ，Ｆｖ，Ｆab，Ｆ(ab)'２ ，ＣＤＲにある。本発明は特に、抗原抗体タイプの反応に従って配列番号２，配列番号３，配列番号４，配列番号５，配列番号１１，配列番号１２，配列番号１３，配列番号１４，配列番号１５，配列番号１７及び/又は配列番号２８を認識する能力をもつような抗体、ならびにそのフラグメントを目的とする。
【００４６】
かかる抗体は、基本的に電気泳動バンドの溶出、化学的合成又は可溶性融合タンパク質技術（ＧＳＴ）により得られ、任意には卵白アルブミンのような免疫原に結合された、本発明に従ったポリペプチド，フラグメント，相同体又は修飾形態に対して、ウサギ及びマウスのような動物を免疫化することによって得られる。
【００４７】
このときモノクローナル抗体は、免疫脾細胞のハイブリドーマ融合、スクリーニング及び培養上清の精製によって産生される（Kohler et Milstein, １９７５，Nature ２５６，４９５−４９７；抗体，その実験室マニュアル，１９８８，Harlow 及び David Lane, Ed, Cold Spring Harbor laboratory）。
【００４８】
これらの抗体から、標準的な手順に従ってジ抗体を生成することができる。前記フラグメントは、必要とあらばヒト化構造に挿入又は移植することができる。
【００４９】
本発明は同様に、本発明に従ったポリペプチド，フラグメント又は相同体のアミノ酸配列の世界遺伝子コードに従いこのコードの縮重を考慮に入れた読取り枠読取りに対応する１つの配列ならびにかかる核酸と６０％以上の相同性を有しかつ上述のようなＫＡＲに由来する活性化シグナルの形質導入分子についてコードすることのできる変異体をも目的としている。本発明は、特に、そのＤＮＡが基本的に配列番号１（配列番号２の配列の成熟ＫＡＲＡＰタンパク質のｃＤＮＡ），配列番号６，７，８，９，１０，１６（Ｃ５７Ｂ１/６マウスのＫＡＲＡＰのコンセンサスｃＤＮＡ配列），配列番号２７（ゲノミック配列から得られた１２９マウスのＫＡＲＡＰのｃＤＮＡ），配列番号1８（１２９マウスのＫＡＲＡＰのゲノミック配列）、又は配列番号３１（ヒトＫＡＲＡＰのｃＤＮＡ配列）によって、又はこれらの配列の細胞質外、細胞質内及び/又は膜内外領域に対応するあらゆる部分、又はこれらの配列のエキソン又はイントロンに対応するあらゆる部分によって構成されているようなあらゆる核酸をも目的としている。
【００５０】
本発明は同様に、以下の段階を含む本発明に従ったポリペプチドの獲得方法をも目的としている：
ｉ． 抗ＣＤ１５８，抗Ｐ７０/ＮＫＢ１，抗Ｐ１４０抗体のような単数又は複数の抗ＫＩＲ及び/又は抗ＫＡＲ抗体，より特定的には、モノクローナル抗体ＥＢ６，ＧＬ１８３又はＰＡＸ２５０を用いて機能的ＫＡＲレセプタを発現する細胞（例えばＮＫ細胞及び/又はＴ細胞及び/又は骨髄性細胞及び/又はＢ細胞及び/又はマスト細胞）の溶解産物の単数又は複数のポリペプチド分画を免疫沈降する段階、
ii． 各ポリペプチド分画は、任意には（場合によっては）、これより以前に抗ＣＤ３及び/又は抗ＦｃεＲＩγを用いた免疫沈降された分画の除去により枯渇され得及び/又は新たに抗ＣＤ１５８，抗Ｐ７０/ＮＫＢ１，抗Ｐ１４０抗体のような単数又は複数の抗ＫＩＲ及び/又は抗ＫＡＲ抗体、そしてより特定的にはモノクローナル抗体ＥＢ６，ＧＬ１８３又はＰＡＸ２５０を用いて免疫沈降され得る、
iii. その分子量に従って前記単数又は複数のポリペプチド分画のポリペプチドを分離し約１２±２ｋＤａの分子量に対応するポリペプチドの回収するか、又は
前記単数又は複数のポリペプチド分画をキナーゼ試験に付した後その分子量に従って前記単数又は複数のポリペプチド分画を分離し、約１２，１４及び/又は１６±２ｋＤａの分子量に対応するリン酸化されたポリペプチドを回収する段階。
【００５１】
本出願は同様に、本発明に従った特殊なＫＡＲＡＰポリペプチド配列を得るための方法をも目的としている。後述の実施例２でその一例を記述する（生物情報処理戦略）この方法は、特に、ポリペプチド配列のうち以下の基準を満たすもののスクリーニングを含んで成る：
− リン酸化可能なチロシンアミノ酸を少なくとも１つ有する、
− ５から２５ｋＤａの間の分子質量を有する、
− 細胞質外領域、膜内外領域及び細胞質内領域を有する、
− その細胞質外領域内にシステインアミノ酸を少なくとも１つ有する。
【００５２】
− その膜内外領域内に荷電アミノ酸（Ｒ，Ｋ，Ｄ，Ｅ）を少なくとも１つ有する、及び
− その細胞質内領域内にＩＴＡＭ ＹxxＬ/Ｉx6-8ＹxxＬ/Ｉパターンを少なくとも１つ有する、
− 選択された配列に対応するポリペプチドは、前述のように、ＫＡＲに会合しかつ対応する阻害性対応物レセプタ（ＫＩＲ）には会合しないという能力をもたなくてはならない。
【００５３】
本出願は同様に、候補ポリペプチドが本発明に従ったＫＡＲＡＰポリペプチドに対応するか否かを決定する又は制御するための方法をもその目的としている。かかる方法の一例は、後述の実施例２に示されている。かかる方法は、この候補ポリペプチドの特徴的部分（例えば少なくとも１つのＩＴＡＭパターン又は細胞質外領域を含む細胞質内領域）に対する抗体を産生すること及び１つの細胞上で機能的に発現された場合に前記抗体により抗原抗体タイプの反応に従って認識済みの要素に会合された状態となっているＫＡＲレセプタが存在するか否かを確認することから成る。
【００５４】
本発明に従ったこのＫＡＲＡＰポリペプチド同定方法は、かくして特に、
− 候補ポリペプチド，特にこの候補ポリペプチドの細胞質外領域及び/又は少なくとも１つのＩＴＡＭパターンを含む領域に対して導かれたモノ又はポリクローナル抗体（例えば、以上で同定された配列番号２のマウスＫＡＲＡＰタンパク質の場合には配列番号２の細胞質外部分（配列番号３）又は細胞質内部分（配列番号５）の領域に対し導かれた抗体を産生すること、
− 抗原−抗体タイプの結合反応を可能にする穏やかな条件下で候補ポリペプチドがＫＡＲＡＰを構成すると想定されている対象の活性化又は非阻害性レセプタを、１つの機能的形態にて有する細胞の溶解産物と、この抗体を接触させること、
− 場合によって形成される反応産物の中に、前記活性化又は非阻害性レセプタのものに近い見かけの分子質量（ＫＡＲｐ５０については約５０ｋＤａ）をもつ産物及び候補ポリペプチドのものに近い見かけの分子質量（特に約１０〜１６ｋＤａの間）をもつ産物が存在する場合に、本発明に従ったＫＡＲＡＰ ポリペプチドであるものとしてその候補ポリペプチドを同定すること、
から成る。
【００５５】
本発明に従ったこの同定方法は特に、
− 上述の通りに前記抗体を接触させ、
− 分子複合体を保存する洗剤の穏やかな条件下で（例えば１％のジギトニン、上述の実施例１参照）、場合によって形成された反応産物を沈降させ、
− 例えば、変性条件内でポリアクリルアミドゲル上の分子質量マーカーの存在下での電気泳動遊走により、沈降された産物の分子質量を測定し、
− 上述のとおりの本発明に従ったＫＡＲＡＰポリペプチドであるものとして候補ポリペプチドを同定することによって
実施することができる。
【００５６】
本発明は同様に、薬学的に受容可能なビヒクルと会合した（組み合わせた）形で、本発明に従った少なくとも１つのポリペプチド，ＫＡＲＡＰ，フラグメント，相同体又は修飾された形態、本発明に従った少なくとも１つの抗体又は抗体フラグメント又は、本発明に従った少なくとも１つの核酸又は核酸変異体を有効量含んで成る薬学組成物にも関する。
【００５７】
本発明に従った薬学組成物は、経口投与、非経口投与、局所施用、膣内投与、直腸内投与又は経口及び/又は経鼻吸入のため、固体、液体の形又は懸濁液の形で製剤することができる。
【００５８】
本発明に従った前記薬学組成物は、ＫＡＲの活性を変調させることを目的とする。ＫＡＲの活性を刺激するためには、前記薬学組成物は、例えば、脂質２層を横断する能力をもつ本発明に従った変異体であるポリペプチド，フラグメント，相同体又は核酸のような、前記ＫＡＲに由来するシグナルの形質導入を容易にする作用物質を含むことになる。ＫＡＲの活性を阻害するため、前記薬学組成物は、細胞のＫＡＲＡＰを遮断するような形で脂質２層を横断する能力をもつ本発明に従った抗体フラグメント，又は、ＳＨ２（ＺＡＰ−７０，Ｐ７２ｓｙｋ) 又はＰＴＢドメインをもつタンパク質又は前記ＫＡＲの活性化のあらゆるアダプタ又はエフェクタ分子を遮断するような形で生物学的条件下で加水分解不能のリン酸などでリン酸化された又はされていない本発明に従った修飾済みポリペプチドのような、前記ＫＡＲ由来のシグナルの形質導入を遮断する作用物質を含むことになる。かかる修飾は、特にリン酸塩基の添加及び/又は少なくとも１つのチロシン残基（Ｙ）のフェニルアラニン残基（Ｆ）への突然変異を含む。
【００５９】
従って、本出願は、免疫反応に関与する細胞の異常な又は望ましくない機能の予防、一時的緩和、及び/又は治療を目的とする組成物を目的とする。かかる組成物は、有利には本発明に従ったポリペプチド又は場合によっては修飾済みポリペプチドを含んで成る。
【００６０】
細胞のレベルで、ＫＡＲに由来するシグナルが翻訳されたか否かを決定するため及びかかるシグナルが刺激又は阻害されたか否かを決定するため、当業者は数多くの手段を利用することができる。かかる手段の例が以上で示されてきた。
【００６１】
診断用作用物質としての前記ポリペプチド，抗体及び核酸の利用も又、本発明の範囲内に入る（診断方法及びその利用を可能にする診断用キット）。
【００６２】
本発明は同様に、以下の段階を含む細胞の異常な又は望ましくない機能のインビトロ診断方法をも目的としている。
【００６３】
− 少なくとも１つの細胞又は細胞抽出物を、本発明に従った抗体又はそのフラグメント，又は本発明に従った核酸又はその変異体を接触させる段階、及び
− 場合によって形成された反応産物の存在を明らかにする段階。
【００６４】
接触段階は、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）のような抗原抗体タイプの反応、又は核酸ハイブリダイゼーションタイプの反応及びＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖増幅）の樹立を可能にする、特に接続時間、温度、緩衝液、場合によってはゲル網状化の条件の中で実施される。
【００６５】
場合によって形成される反応産物を明らかにするためには、螢光マーカー、酵素マーカー、放射性マーカー、又は発光マーカーを利用することができる。
【００６６】
本発明に従った前記インビトロ診断方法は、免疫増殖疾患、ＨＩＶ疾患のような免疫不全疾患、顆粒リンパ球増殖疾患のようなガン、リウマチ様多発性関節炎のような自己免疫疾患、マラリアのような感染性疾患、アレルギー応答、移植片拒絶の形で現われうる異常な又は望ましくない細胞機能の診断を可能にする。
【００６７】
本発明は同様に、ＫＡＲの活性化のアダプタまたはエフェクタ分子の同定方法及び、ＫＡＲの活性化の結果としての細胞活性を変調させる能力をもつ分子の同定方法にも関する。
【００６８】
本発明に従ったＫＡＲの活性化のアダプタ又はエフェクタ分子の前記同定方法は、次の段階を含んで成る：
ｉ．本発明に従ったポリペプチド（又はそのフラグメント又はその相同体）と候補分子を接触させる段階、及び
ii. 前記ポリペプチド（又はそのフラグメント）に対する結合が観察される候補分子を選択する段階。
【００６９】
ＫＡＲの活性化のアダプタ又はエフェクタ分子である可能性のある候補分子は、例えばＳＨ２又はＰＴＢドメインをもつ分子の中から選択することができる。これらの分子は、可溶性組換え型形態を有することができる。
【００７０】
接触段階は例えば、ＫＡＲの活性化のアダプタ又はエフェクタ分子である可能性のある可溶性組換え型形態で得られた候補分子を、シンチレーション液の球のような放射能測定を可能にする球にカップリングさせること及び前記球上にトリチウム標識づけされた形の本発明に従ったポリペプチド（又はそのフラグメント又は相同体）を通過させることによって実施することができる。このとき、候補分子のうち、放射能測定（ｃｐｍ）によって前記ポリペプチド，フラグメント又は相同体に対するその結合が観察された候補分子が選定される。
【００７１】
接触段階は同様に、マイクロ支持体ＢＩＡcore(Pharmacia) のようなプラズモン共鳴の測定を可能にするマイクロ担体上の本発明に従ったポリペプチド（又はそのフラグメント又はその相同体）の不動化によって（例えば、Olcese et al.,１９９６，The Journal of Immunology １５６：４５３１−４５３４； Vely et al., Immunology Letters１９９６，vol.５４．ｐ１４５−１５０を参照のこと）又はストレプタビジン球上でリン酸化及びビオチニル化された本発明に従ったポリペプチドの不動化（Vely et al. Eur. J. Immunol.１９９７，２７：１９９４−２０００； Le Drean et al. Eur. J. Immunol. １９９８，２８：２６４−２７６）によって、及び前記マイクロ支持体上の、ＫＡＲの活性化のアダプタ又はエフェクタ分子である可能性のある候補分子の通過によっても実施可能である。このとき、プラズモン共鳴の測定（Resonance Unit) により、候補分子のうち、前記ポリペプチド，フラグメント又は相同体に対するその結合が観察された候補分子が選定される。
【００７２】
ＫＡＲの活性化のアダプタ又はエフェクタ分子のこの同定方法は、その実施様式の如何に関わらず、本発明に従ったＫＡＲの活性化の結果としてもたらされる細胞活性を変調させる能力をもつ分子の同定方法の実施における基準として役立つこともできる。
【００７３】
本発明に従ったＫＡＲの活性化の結果として得られる細胞活性を変調させる能力を有する分子のこの同定方法は、以下の段階を含んで成る：
ｉ．上述の本発明に従った方法によって得られるようなＫＡＲの活性化のアダプタ又はエフェクタ分子、及び本発明に従ったポリペプチド（又はそのフラグメント又は相同体）と、候補分子を接触させる段階、及び
ii. 候補分子のうち、かかる候補分子の不存在下で観察されるような前記ポリペプチド（又はそのフラグメント又は相同体）と前記アダプタ又はエフェクタ分子の間の結合に対し効果を及ぼす候補分子を選択する段階。
【００７４】
ＫＡＲの結果得られた細胞活性を変調する可能性のある候補分子は、天然又は合成の化合物バンク、特に化学的又は組合せバンクの中から選択することができる。前記候補分子は、（例えば本発明に従った抗体のような抗イディオタイプ抗体の誘導体又はフラグメント，触媒抗体の誘導体又はフラグメントのような）タンパク質、炭素質、脂質又は核タイプのものでありうる。
【００７５】
本発明に従ったＫＡＲの活性化の結果としての細胞活性を変調させる能力をもつ分子の同定方法の接触段階は、例えば、本発明に従ったポリペプチド（又はそのフラグメント又は相同体）及び本発明に従った方法によって得られるようなＫＡＲの活性化のアダプタ又はエフェクタ分子を用いて前記候補分子を、例えば、酵素特性、リン酸化又は自己リン酸化特性のような未結合状態の前記アダプタ又はエフェクタ分子の化学特性に基づいて前記ＫＡＲの活性化のアダプタ又はエフェクタ分子と前記ポリペプチドの間の結合率を測定することを可能にするような条件下でインキュベートさせることによって実施することができる。
【００７６】
本発明に従ったＫＡＲの活性化の結果として得られる細胞活性を変調させる能力をもつ分子の同定方法の接触段階は、同様に、それぞれ放射能又は候補分子の不存在下又は存在下での前記アダプタ又はエフェクタ分子と前記ポリペプチドの間の結合の結果として得られるプラズモン共鳴を測定することによる、上述のようなシンチレーション液球又はトリチウム標識づけされたポリペプチドタイプの技術又はマイクロ支持体及びプラズモン共鳴の測定タイプの技術を利用することによって実施可能である。このとき、候補分子のうち、これらの分子の不存在下で前記アダプタ又はエフェクタ分子と前記ポリペプチドの間で測定されるコントロール結合率を統計的に有意な形で増大又は減少させる候補分子が選定される。
【００７７】
本発明に従った方法により同定されるようなＫＡＲの活性化を変調させる能力をもつ分子は、それらを生物学的条件下で加水分解不能にするような形で及び/又はそれらが細胞脂質２層を横断しうるような形で、化学的に修飾されうる。
【００７８】
本発明に従った、ＫＡＲの活性化を変調させる能力をもつ分子は、有利には前記ＫＡＲＡＰとその細胞エフェクタ又はアダプタの間の相互作用を修飾することによって作用する。
【００７９】
このとき、本発明に従ったＫＡＲの活性化の結果としての細胞活性を変調させる能力をもつ前記分子は、例えばリガンドとの接触によりそのＫＡＲが刺激されたリンパ球のようなインビトロで培養された細胞に対して適用することができる。この適用は、例えば、脂質２層を超えることができるようにする化学的修飾又は電気穿刺法による前記細胞内部への進入によって行なわれる。
【００８０】
本発明は、いかなる場合であっても制限的なものとみなされてはならない後述の実施例によって例示されている。
【００８１】
ここでは、以下の２３の図が参考にされている：
【発明を実施するための最良の形態】
【００８２】
実施例１：
１．材料と方法
モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）及び試薬
以下のモノクローナル抗体が利用された：
− ＪＴ３Ａ（Coulter Immunotech 照会番号０１７８），ＫＤ１（Coulter Immunotech照会番号０８１３）及びＴＡ１８１，Ｈ１２（Coulter Immunotech 照会番号１８４４）のようなイソタイプＩｇＧ１の抗ＣＤ３，抗ＣＤ１６及び抗ＣＤ５６抗体、
− ＴＩＡ−２のような抗ＣＤ３ζ抗体（Coulter Immunotech ６６０４５Ｐ２）、
− 抗ＣＤ１５８抗体、すなわちＥＢ６のような抗ｐ５８．１抗体（Coulter Immunotech照会番号１８４７）、ＧＬ１８３のような抗ｐ５８.２抗体（Coulter Immunotech照会番号１８４６）、及び Bottino et al.(Eur. J. Immunol.１９９６，２６，１８１６）内で記述されている ＰＡＸ２５０のような抗ｐ５０.３抗体、
− Jouvin M. H. et al.,１９９４，J. Biol. Chem., ２６９，５９１８−５９２５中に記述された抗血清６６６のようなウサギ抗ＦｃεＲＩγ抗血清、
− Bociano L. K. et al., １９８６，J. Biol. Biochem. ２６１，１１８２３−１１８３１の中で記述されている抗血清ＢＣ４のようなウサギ抗ＦｃεＲＩα抗血清、
− ワサビペルオキシダーゼに複合されたヤギ抗マウス抗血清（Sigma Ａ−２３０４）及びワサビペルオキシダーゼに複合されたヤギ抗ウサギ抗血清（Sigma A-０５４５），
− イソチオシアン酸フルオレセイン（Coulter Immunotech ０８１９Ｆ（ａｂ')２)に複合されたヤギ抗マウス免疫グロブリン（Coulter Immunotech ０８１９Ｆ（ａｂ')２)，
− ＧＬ１８３−フィコエリスリン（ＧＬ１８３−ＰＥ）（Coulter Immunotech ２２７８）（ＥＢ６−フィコエリスリン（ＥＢ６−ＰＥ）モノクローナル抗体（Coulter-Immunotech ２２７７）及びヤギ抗マウスフィコエリスリン免疫グロブリン（抗マウスＰＥ）（Coulter Immunotech ０８５５ Ｆ（ab')２)。
【００８３】
溶解緩衝液は、ｐＨ７.５のトリス−ＨＣｌ ２５０ｍＭ；ＮａＣｌ １５０ｍＭ；ジギトニン１％；オルトバナジン酸ナトリウム１００μＭ；ＮａＦ１０ｍＭ；アプロチニン２μｇ/ｍｌ；ロイペプチン２μｇ/ｍｌを含有し、これらの物質は全て、Sigma 社（ＵＳＡ，ＭＯ，St Louis) から購入された。
【００８４】
キナーゼ緩衝液は、ｐＨ７.２の Hepes ２０ｍＭ；ＮａＣｌ １００ｍＭ；ＭｎＣｌ２ ５ｍＭ；ＭｇＣｌ２ ５ｍＭ；３２γＡＴＰ１０μＣｉ＝３７０ｋＢｑ（Amersham, Buckinghamshire, UK) を含有していた。
【００８５】
薄層電気泳動緩衝液（ＴＬＥ）は、１０％の氷酢酸及び水中１％のピリジン；ｐＨ３.５を含んでいた。
【００８６】
細胞
ＬＤＧＬ患者由来のヒトＮＫ細胞又はＬＤＧＬ細胞
ヒトＮＫ細胞は、ＮＫ細胞系統ＣＤ５６＋，ＣＤ１６＋，ＣＤ３− の顆粒リンパ球増殖性疾患（ＬＤＧＬ，Lymphoproliferative Disease of Granular Lymphocytes)を患う患者から、ヒトＮＫ細胞を得た。末梢血リンパ球（ＰＢＬ，Peripheral Blood Lymphocyte)を、フィコール/ハイパーク勾配に従った遠心分離により、ＬＤＧＬを患う患者の血液標本から単離した。次に、これらのＬＤＧＬ細胞を、照射された異質遺伝子型栄養細胞及び１００Ｕ/ｍｌのｒＩＬ−２の存在下において、１０％ウシ胎児血清及び１０μｇ/ｍｌのペニシリン−ストレプトマイシンにより、ＲＰＭＩ−１６４０培地上で１ｍｌにつき１０６個の細胞の濃度、３７℃の温度で培養した。
【００８７】
トランスフェクションを受けた細胞ＲＴIIＢ．ｐ５０.２＋ の獲得
ＫＡＲ ｐ５０.２を発現するＲＢＬ−２Ｈ３細胞のトランスフェクタント（American Type Culture Collection）（ＲＴIIＢ．５０.２＋細胞）を、Blery et al.，１９９７．J. Biol. Chem., ２７２，８９８９−８９９６に記述された通りに実現した。図６は、概略的に、ＫＩＲｐ５８レセプタ（免疫グロブリンタイプの阻害性ヒトレセプタ）及びＫＡＲｐ５０（ＫＩＲｐ５８レセプタの非阻害性対応物）の構造を表わしている。
【００８８】
簡単に言うと、利用されているＲＴIIＢ細胞は、マウスＣＤ３の完全な細胞質内ドメインに結びつけられたヒトＣＤ２５の完全な膜外及び膜内外ドメインを含むキメラ分子ＣＤ２５/ＣＤ３及びマウスＦｃγＲIIｂ２レセプタを発現するような形でトランスフェクションを受けたＲＢＬ−２Ｈ３細胞であるものとして従来記述されてきた細胞である。
【００８９】
これらのＲＴIIＢ細胞は、さらに、発現ベクターＲＳＶ−５ｇｐｔ上に支持された（ｐ５０.２８３についてコードする）ｃＤＮＡ１８３．Ａｃｔ２の電気穿刺法によるトランスフェクションを受けた。
【００９０】
安定したトランスフェクション済みのＲＴIIＢ．ｐ５０.２＋細胞は、キサンチン（２５０μｇ/ｌ），ハイポキサンチン（１３.６μｇ/ｌ）及びマイコフェノール酸（２μｇ/ｌ）の存在下での培養により樹立された。
【００９１】
細胞溶解試験
ＩＬ−２上で培養されたＬＤＧＬ細胞の細胞溶解活性は、抗ＣＤ１６，抗ＣＤ１５８及び抗ＣＤ５６ｍＡｂｓの不存在下又は存在下で、Ｐ８１５マウス細胞系統（American Type Culture Collection）との関係において測定された。
【００９２】
簡単に言うと、５１Ｃｒで標識づけされた５×１０３個の標的細胞を、４時間，５１Ｃｒの標準遊離試験の開始時点でハイブリドーマの上清モノクローナル抗体５０μｌの存在下でエフェクタ細胞の連続希釈液に添加した（Vivier E. et. al., １９９１. J. Immunol. １４６：２０６）。
【００９３】
放射性ヨウ化
ＰＢＳ（リン酸ナトリウム緩衝液）の中で０.５％のホルムアルデヒドに細胞（１０−５０×１０６）を固定し、その後、Anderson P. et al., １９８９，J. Immunol. １４３：１８９９）によって記述されたようにラクトペルオキシダーゼ（１２５Ｉ，NEN-Dupont Wilmington, DE, USA）を触媒としたヨウ化に先立って、ＰＢＳ中で３０μｇ/ｍｌのジギトニンを用いて５分間、これに透過性を付与した。
【００９４】
細胞を、ジギトニン入り溶解緩衝液中で４℃で３０分間、溶解させた。このとき、予め精製した核後上清を、Ｓ４Ｂ−セファローズ球（Pharmacia, Piscataway, NJ. USA) を被覆する特異的抗体を用いて免疫沈降させた（Vivier Ｅ. et al., １９９１，J. Immunol. １４６：２０６）。免疫沈降物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム及びゲル上の電気泳動によるタンパク質の分解）及びオートラジオグラフィによって分析した。
【００９５】
インビトロキナーゼ試験
１ｍｌの溶解緩衝液（試薬参照）の中に細胞（試料１個あたり１０×１０６個）を溶解させた。予備精製した核後上清を、ＣｎＢｒ(Pharmacia）により活性化させたセファロース４Ｂに共有結合させたモノクローナル抗体を利用して２〜３時間免疫沈降させた。溶解緩衝液中で、免疫複合体を３回洗浄し、そのとき４０μｌのキナーゼ緩衝液（試薬参照）を３７℃で１０分間、免疫沈降物に添加した。試料−ＳＤＳ還元緩衝液を添加することによってキナーゼ反応を停止させた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析及びオートラジオグラフィに先立ち、試料を沸とうさせた。いくつかの実験において、試料を２次元非変性/変性対角線ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。
【００９６】
ＫＡＲＡＰのリン酸化の分析
インビトロでのキナーゼ試験及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離の後、リン酸化したタンパク質を乾燥したゲルから切除し、Centrilutor(Amicon) 又はＰＢＳ（リン酸ナトリウム緩衝液）中０.１％のＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）溶液を利用して溶出させた。溶出したタンパク質を、９０分間１１０℃での２００μｌのＨＣｌ ５.７Ｍ中のインキュベーションに先立ち、２時間４℃で２０％のトリクロロ酢酸中で沈降させた。個々のアミノ酸を次に乾燥させ、標準レフェレンスとして標識づけされていないホスホチロシン、ホスホトレオニン、ホスホセリン（Sigma)の各々を５μｇを含むＴＬＥ緩衝液（試薬）５μｌ中で再び懸濁させた。セルロースプレート（ＤＣ−セルロース１００−μｍ）上に試料を被着させ、Multiphor II (pharmacia)上で４℃で４５分間１５００Ｖで遊走させた。アセトン及び３２Ｐで標識づけされたアミノ酸の中で１％のニンヒドリンを用いて標準レフェレンスを開発した。
【００９７】
免疫トランスファによる分析
免疫沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分解させ、ニトロセルロースフィルタ上に移し、脱脂粉乳５％のＰＢＳ溶液中で希釈された抗ＣＤ３ζ又は抗ＦＣεＲＩγ抗体プローブに対峙させた。ワサビペルオキシターゼ（それぞれ Sigma 照会番号Ａ−２３０４及びＡ−０５４５）に接合されたやぎ抗マウス又は抗ウサギ抗血清及び Amersham(ＲＰＮ２２０９）によって市販されているＥＣＬ検出システムを用いて免疫トランスファを明らかにした。
【００９８】
２．結果
表面表現型
ＬＤＧＬ患者に由来し、ＩＬ−２（インタロイキン−２）上で培養されたＮＫ細胞の表面表現型を間接的免疫螢光でのＦＡＣＳcan（螢光により活性化された細胞の選別）により分析した。
【００９９】
以下で報告するのは、以下のＲ.Ｐ., Ｄ.Ｆ. 及びＭＡＬと呼称するこれらの患者のうちの３名に関する研究の結果である。
【０１００】
前記結果は、ＬＤＧＬ（顆粒リンパ球増殖性疾患）細胞Ｒ.Ｐ., Ｄ.Ｆ. 又はＭＡＬの間接的免疫螢光ＦＡＣＳcan による分析が示されている図１Ａによって例示されている。イソチオシアン酸フルオレセインに接合されたヤギ抗マウス免疫グロブリンが、第２段階の試薬として用いられた。各タイプのＬＤＧＬ（上部水平バンド内に示された分析についてはＬＤＧＬ細胞Ｒ.Ｐ., 中央水平バンドの分析についてはＬＤＧＬ細胞Ｄ.Ｆ., 下部水平バンドの分析についてはＬＤＧＬ細胞ＭＡＬ）及び受けた治療の各々について（左側に示されたグラフについてはコントロール治療し、左から右へ抗ＣＤ３，抗ＣＤ１６，抗ＣＤ１５８ ＥＢ６，抗ＣＤ１５８ ＧＬ１８３，抗ＣＤ１５８ ＰＡＸ２５０という表示されたモノクローナル抗体による治療）、横座標には螢光強度が、又縦座標には、相対的細胞数が報告されている。
【０１０１】
以下のことが観察できる：
− ＮＫ細胞Ｒ.Ｐ., Ｄ.Ｆ. 及びＭＡＬは全てＣＤ３− 及びＣＤ１６＋ である。
【０１０２】
− ＮＫ細胞Ｒ.Ｐ. は、ｐ５０.１＋，ｐ５０.２−，ｐ５０.３− である。これらは、抗ＣＤ１５８ＥＢ６モノクローナル抗体によって認識され、抗ＣＤ１５８ＧＬ１８３及びＰＡＸ２５０モノクローナル抗体によっては認識されない。
【０１０３】
− ＮＫ細胞Ｄ.Ｆ.は、ｐ５０.１−，ｐ５０.２＋，ｐ５０.３− である。これらは、抗ＣＤ１５８ＧＬ１８３モノクローナル抗体によって認識され、抗ＣＤ１５８ＥＢ６及びＰＡＸ２５０モノクローナル抗体によって認識されない。
【０１０４】
− ＮＫ細胞ＭＡＬは、ｐ５０.１−，ｐ５０.２−，ｐ５０.３＋ である。これらは抗ＣＤ１５８ ＰＡＸ２５０モノクローナル抗体によって認識され、抗ＣＤ１５８ ＥＢ６及びＧＬ１８３モノクローナル抗体によっては認識されない。
【０１０５】
従って、ＬＤＧＬを患う３人の患者は、それぞれ抗ＫＩＲ ｐ５８.１（ＥＢ６），抗ＫＩＲ ｐ５８.２（ＧＬ１８３）及び抗ＫＡＲ ｐ５０.３（ＰＡＸ２５０）という抗ＣＤ１５８抗体によって認識されるＮＫ細胞のリンパ球増殖を示した。かくして３つのＮＫ細胞グループ、すなわちＬＤＧＬ Ｒ.Ｐ細胞、ＬＤＧＬ Ｄ.Ｆ細胞及びＬＤＧＬ ＭＡＬ細胞を定義づけすることができた。
【０１０６】
細胞溶解試験
標的細胞ＦｃγＲ＋ としてＰ８１５を利用して再誘導される細胞毒性試験を、ＮＫ細胞Ｒ.Ｐ.ｐ５０.１＋，Ｄ.Ｆ.ｐ５０.２＋ 及びＭＡＬ．ｐ５０.３＋ について実現した。
【０１０７】
結果は、異なるモノクローナル抗体で再誘導された細胞毒性試験を示す図１Ｂに例示されている：表示された供与体（左側のＲ.Ｐ.ｐ５０.１＋，中央のＤ.Ｆ.ｐ５０.２＋ 又は右側のＭＡＬ．ｐ５０.３＋）に由来し、ＩＬ−２上で培養されたＮＫ細胞がエフェクタ細胞として利用された。試験は、抗体無し（白色円）で、又は抗ＣＤ１６モノクローナル抗体（黒色三角形）、抗ＣＤ５６モノクローナル抗体（白色三角形）、抗ＣＤ１５８モノクローナル抗体（Ｒ.ＰについてはＥＢ６，Ｄ.ＦについてはＧＬ１８３，ＭＡＬについてはＰＡＸ２５０）（黒色円）の存在下で実施された。横座標には、エフェクタ細胞と標的細胞の比率（Ｅ：Ｔ比；８：１；４：１；２：１；１：１；０.５：１；０.２５：１）が報告されており、縦座標には、特異的溶解百分率（０〜１２０％の目盛）が報告されている。
【０１０８】
再誘導された細胞毒性試験は、ＫＩＲレセプタの刺激の際に観察されたものとは対照的に、ＮＫ細胞に対する抗ＣＤ１５８抗体の添加が細胞Ｐ８１５の細胞溶解を著しく増大させる（図１Ｂ）ということを示している。
【０１０９】
コントロールとして、抗ＣＤ１６モノクローナル抗体は、イソタイプに対合（match）された抗ＣＤ５６モノクローナル抗体がいかなる効果ももたないのに対し、抗ＣＤ１５８モノクローナル抗体と類似の要領でＰ８１５の自発的細胞溶解を増大させる。
【０１１０】
従って、これらのＮＫ細胞は、その表面において、ＫＩＲの活性化イソタイプの型タンパク質であるＫＡＲを発現する。さらにこれらの結果はｃＤＮＡ ＫＩＲ/ＫＡＲの逆転写酵素を用いてＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖増幅）分析により確認された。
【０１１１】
放射性ヨウ化及び免疫トランスファにより発現されたＫＡＲの分析：ＫＡＲＡＰの同定
ＬＤＧＬ患者由来のＮＫ細胞上で発現されたＫＡＲレセプタを、内部放射性ヨウ化とそれに続く免疫沈降によって分析した。
【０１１２】
結果は図２Ａに例示されており、この図では、１２５Ｉで放射性標識づけされ抗ＣＤ１５８ ＥＢ６モノクローナル抗体を用いて免疫沈降され（トラック１）その後抗ＣＤ３ζ/抗ＦｃεＲＩγモノクローナル抗体を用いて精製され（トラック２〜７）、最後に抗ＣＤ１５８ ＥＢ６ モノクローナル抗体を用いて再度免疫沈降された（トラック８）供与体Ｒ.Ｐ.（ｐ５０.１＋）のＮＫ細胞（１０×１０６ 細胞/トラック）から実施された、変性条件下で１３％のゲル上のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析が示されている。
【０１１３】
同じプロフィールは、供与体Ｄ.Ｆ.（ｐ５０.２＋）及びＭＡＬ.(ｐ５０.３＋）を用いて得られた（データ示さず）。
【０１１４】
ＮＫ細胞の溶解産物から調製された抗ＣＤ１５８抗体の免疫沈降物が、≒５０ｋＤａで観察されたＫＡＲに加えて、約１２±１ｋＤａで遊走するさらに小さい分子質量のバンドを含有することを観察することができる。
【０１１５】
ＫＩＲは、ヒトＮＫ細胞内でポリペプチドＣＤ３ζ及びＦｃεＲＩγと会合することが示された。抗ＣＤ３ζ及び抗ＦｃεＲＩγ抗体を利用した予備枯渇実験により、ＫＡＲに会合した約１２ｋＤａのバンドがＣＤ３ζ又はＦｃεＲＩγであるという可能性（図２Ａ）は無くなっていた。
【０１１６】
この約１２±１ｋＤａのバンドに対応するタンパク質集合体を、ＫＡＲＡＰ（ＫＡＲ−associated proteins, ＫＡＲに会合したタンパク質）と命名した。
【０１１７】
これらの結果は、ＮＫ細胞溶解産物から調製した抗ＣＤ１５８ｍＡｂｓの免疫沈降物中には、抗ＣＤ３ζ抗体の存在下で反応性あるバンドがことごとく存在していないことを明らかにした免疫トランスファ実験になって確認された。
【０１１８】
抗ＣＤ３ζ抗体の存在下で得られたこれらの結果は、変性条件下での１５％のゲル上のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分解及び抗ＣＤ３ζモノクローナル抗体プローブ（右側標識付け矢印）を用いたニトロセルロースフィルタのインキュベートによる、Ｄ.Ｆ.細胞の完全溶解産物及びかかる溶解産物の免疫沈降物の分析を示す図２Ｂによって例示されている。Ｄ.Ｆ.細胞の完全溶解産物（ＬＣＣ）を、トラック１にトラックあたり５×１０６ 個の細胞の割合で被着させ、かかる溶解産物の免疫沈降物をトラック２〜４にトラックあたり１５×１０６ 個の細胞の割合で被着させた。免疫沈降は、コントロールとしてトラック２で抗ＦｃεＲＩαＢＣ４モノクローナル抗体を、トラック３で抗ＣＤ１６モノクローナル抗体を、そしてトラック４で抗ＣＤ１５８ＧＬ１８３モノクローナル抗体を利用して、Ｄ.Ｆ.細胞溶解産物について実施された。
【０１１９】
同じ結果は、抗ＣＤ３ζｍＡｂを用いて細胞Ｒ.Ｐ.及びＭＡＬについても得られた。
【０１２０】
抗ＦｃεＲＩγｍＡｂを用いて得た結果（データ図示せず）は、同じ確認事実をもたらした。
【０１２１】
インビトロキナーゼ試験及び薄層電気泳動（ＴＬＥ）によるＫＡＲＡＰの分析
抗ＣＤ１５８モノクローナル抗体の免疫沈降物について実施されたインビトロキナーゼ試験は、ＫＡＲが、ＮＫ細胞内で約１４±１ｋＤａで遊走する低分子量の支配的なリンタンパク質に会合することを明らかにした。
【０１２２】
結果は、図３Ａに例示されている： ＮＫ細胞ＭＡＬから調製された溶解産物を、インビトロキナーゼ試験に先立ち、表示された抗体（トラック１では抗ＦｃεＲＩα，トラック２では抗ＣＤ１６，トラック３では抗ＣＤ１５８）で免疫沈降させた。リン酸化されたタンパク質を、変性条件下で１５％のゲル上でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。
【０１２３】
これらの結果は、内部ヨウ化によって観察された１２ｋＤａのＫＡＲＡＰのリン酸化された形態について予想された分子質量の変化と一致している。その上、ＮＫ ＫＡＲ＋細胞から調製された抗ＣＤ１５８ｍＡｂｓの免疫沈降物は、（図３Ａに１４ｋＤａでのＫＡＲＡＰの矢印の両側の星印により示された）それぞれ１６±１ｋＤａ及び１２±１ｋＤａで遊走するその他の２つのホスホ−ＫＡＲＡＰを含んでいる。
【０１２４】
リン酸化されたＫＡＲＡＰの類似したグループとＫＡＲの会合は、ＮＫ細胞ＫＡＲ＋クローンのパネルでも観察され、ＮＫ ＫＩＲ＋クローンでは見られなかった。１６，１４及び１２ｋＤａでのホスホ−ＫＡＲＡＰの相対的強度はＮＫ細胞の由来に従って変動しうるということが観察された。
【０１２５】
リン酸化されたアミノ酸の分析は、１４ｋＤａの主要ＫＡＲＡＰが主としてチロシン残基レベルでリン酸化されることを明らかにした。
【０１２６】
結果は、図３Ｃにより例示されている：インビトロキナーゼ試験の後、ＫＡＲＡＰ（左）及びＣＤ３ζ（右）ＫＡＲＡＰバンドを切除し、薄層電気泳動によるリン酸化アミノ酸分析に付した。この実験では、それぞれＮＫ細胞Ｒ.Ｐの溶解産物から調製された抗ＣＤ１５８及び抗ＣＤ１６モノクローナル抗体の免疫沈降物から、ＫＡＲＡＰ及びＣＤ３ζバンドを単離した。
【０１２７】
それでも、トレオニン残基レベルではなくセリン残基レベルでのリン酸化も検出することができる。コントロールとしてリン酸化アミノ酸分析は、チロシン残基のレベルでのみＣＤ３ζのリン酸化を確認した。
【０１２８】
ＫＡＲＡＰ及び活性化シグナルの形質導入（トランスフェクタントＫＡＲ＋）
ＫＩＲｐ５８.２とは対照的に、非リンパ球様の細胞系統ＲＢＬ−２Ｈ３のトランスフェクタント内でのＫＡＲｐ５０.２の発現は、ＫＡＲｐ５０.２の活性化機能の再構築を導くものではない。実際、抗ＣＤ１５８抗体により誘発されるＲＢＬ−２Ｈ３ｐ５０.２＋ 細胞トランスフェクタントの刺激は、細胞質内Ｃａ２＋の検出可能な可動化もセロトニンの検出可能な遊離も全く導かない。驚くべきことに、ＲＢＬ−２Ｈ３ｐ５０.２＋ 細胞トランスフェクタントから調製された抗ＣＤ１５８モノクローナル抗体の免疫沈降物について実施されたインビトロキナーゼ試験は、検出可能なＫＡＲＡＰを全く内含していなかった。
【０１２９】
結果は、図３Ｂによって例示されている：ＲＢＬ−２Ｈ３ｐ５０.２＋ 細胞から調製した溶解産物を、インビトロキナーゼ試験に先立ち、表示された抗体（トラック１では抗ＣＤ３ε，トラック２では抗ＦｃεＲＩα，トラック３では抗ＣＤ１５８）で免疫沈降させた。リン酸化タンパク質を、変性条件下で１５％のゲル上でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。
【０１３０】
ＲＢＬ−２Ｈ３ｐ５０.２＋ 細胞のトランスフェクタント内でのＫＡＲＡＰに対するＫＡＲの会合の欠如は、内部ヨウ化によっても確認された（データ図示せず）。
【０１３１】
従ってＫＡＲＡＰは、選択的にＫＡＲに会合し、ＫＡＲＡＰに対するＫＡＲの会合の欠如は、検出可能な任意の活性化シグナルを形質導入する能力をＫＡＲがもたないことと相関される。
【０１３２】
ＫＡＲ−ＫＡＲＡＰ会合（対角線ゲル）
最終的に、抗ＣＤ１５８モノクローナル抗体の免疫沈降物の対角線２次元ゲル上での分析が、対角線ゲルに沿って約１６，１４及び１２ｋＤａのホスホ−ＫＡＲＡＰが減少することを明らかにした。
【０１３３】
結果は図４に例示されている：ＮＫＲ.Ｐ.細胞の溶解産物から調製された抗ＣＤ１５８モノクローナル抗体の免疫沈降物（ＩＰ）を、非変性/（水平方向）/変性（垂直方向）条件での２次元１３％ゲル上でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析に先立ち、インビトロキナーゼ試験に付した。
【０１３４】
かくしてこれらの結果は、ジスルフィド結合により結合されたＫＡＲＡＰ二量体複合体に対しＮＫ細胞内でＫＡＲが会合させられるということを表わしている。
【０１３５】
３．論述
特にクラスＩのＭＨＣの分子についての自律的活性化レセプタ又はＴＣＲ（Ｔリンパ球レセプタ）又はＲＦｃ（免疫グロブリン定常フラグメントについてのレセプタ）のコレセプタであるＫＡＲは、ＮＫ及びＴ細胞の活性化のための新しい１つの方法を表わしている。
【０１３６】
本発明者は、ＫＡＲが実際ＮＫ細胞内で、ジスルフィド結合によって結合された二量体の形で会合されたＫＡＲＡＰを介入させる多量体複合体の形に集合させられていることを実証した。
【０１３７】
放射性ヨウ化による分析が約１２±１ｋＤａのＫＡＲＡＰを立証したとすると、キナーゼ試験による分析は、約１６，１４，及び１２±１ｋＤａの３つのホスホ−ＫＡＲＡＰを立証した。
【０１３８】
ＫＡＲＡＰに対するＫＡＲの会合と、ＫＡＲの活性化機能の間の相関は、ＫＡＲＡＰが、多量体ＫＡＲ複合体の形質導入サブユニットとして作用することを示唆している。
【０１３９】
しかしながら、ＲＢＬ−２Ｈ３細胞のトランスフェクタントについて観察されたようなＫＡＲＡＰに対するＫＡＲの会合の欠如は、ＩＴＡＭ（チロシン残基に基づく免疫レセプタの活性化パターン）をもつポリペプチドを内含する抗原又は抗体に対する多量体活性化レセプタについて観察されたこととは異なり、細胞表面上のレセプタの発現を妨げるものではない。
【０１４０】
免疫グロブリンの上科の活性化又は少なくとも非阻害性のその他のレセプタは、ＫＡＲｐ５０（免疫グロブリンタイプのヒトＫＡＲ）すなわち：レクチンタイプのヒトＫＡＲレセプタＮＫＧ２Ｃ/Ｄ，免疫グロブリンタイプのマウスＫＡＲレセプタ pirＡ，ｇｐ４９Ａ，レクチンタイプのマウスＫＡＲレセプタＬｙ４９Ｄ，Ｌｙ４９Ｈのみならず、ＩＬＴ１のようなＬＩＲ/ＭＩＲ/ＩＬＴ系統群のヒト活性化レセプタと驚くほどの類似性を示している。
【０１４１】
これらの類似性は、免疫グロブリン上科（ＩｇＳＦ）又はレクチンタイプの活性化又は非阻害性レセプタ又はそれらの阻害性対応物を示している図５によって例示されている。各々のレセプタ対の名称（左から右へ、ｍＰＩＲ−Ｂ−ｍＰＩＲ−Ａ，ＩＬＴ２−ＩＬＴ１，ＳＩＲＰα−ＳＩＲＰβ，ＫＩＲ−ＫＡＲ，ＦｃγＲIIＢ−ＦｃγＲIII, ＮＫＧ２Ａ/Ｂ−ＮＫＧ２Ｃ/Ｄ，ｍＬｙ４９Ａ/Ｂ/Ｃ/Ｅ/Ｆ/Ｇ/Ｉ−ｍＬｙ４９Ｄ/Ｈ）の下には、それらを天然に発現する細胞が表示されている。活性化又は非阻害性レセプタは、ＩＴＩＭ（チロシン残基に基づく免疫レセプタ阻害パターン）もＩＴＡＭ（チロシン残基に基づく免疫レセプタ活性化パターン）も有さず、それらの膜内外（ＴＭ）ドメイン内に荷電アミノ酸を有する（Ｒ＝アルギニン、Ｋ＝リシン、Ｄ＝アスパラギン酸、Ｅ＝グルタミン酸）。阻害性対応物（各対の左側要素）は、その細胞質内（ＩＣ）部分内にＩＴＩＭパターンを有する。各々の活性化又は非阻害性レセプタは、細胞質外（ＥＣ）レベルで、その阻害性対応物との強い相同性を示す。
【０１４２】
実施例２：
ＫＡＲＡＰ分子の生化学的特徴づけ（上述の実施例１参照）により、我々は、特に以下のようなポリペプチドの主要な同定基準を明確にすることができた：すなわち
− ジスルフィド結合の形成を可能にする、細胞質外システインアミノ酸を有するポリペプチド（図４参照）；
− 約１２〜１６ｋＤａの間に含まれるみかけの分子質量をもつポリペプチド；
− リン酸化可能なチロシンアミノ酸を少なくとも１つ有するポリペプチド（図３Ｃ参照）。
【０１４３】
１２，１４及び１６ｋＤａにおいて同定されたＫＡＲＡＰ分子の間に存在する強い類似性のため、我々は、これら３つの分子形態が、１２ｋＤａを超えることのあり得ない分子量をもつ同じＫＡＲＡＰ ポリペプチドの異なるリン酸化度を表わしているということを想定した。
【０１４４】
さらに、ＫＡＲＡＰの主要な特性は、ＫＩＲとではなくＫＡＲとのその選択的会合にある。ＫＩＲとは異なりＫＡＲは、ＫＡＲは膜内外荷電アミノ酸（リシン：Ｋ）を有し、この特殊性は同じく複合体ＣＤ３/ＴＣＲ，ＢＣＲ，ＦｃεＲＩ及びＦｃγＲIIIＡ（ＣＤ１６）の中に存在するＩＴＡＭをもつポリペプチドの会合に基づくものであることから、我々は、ＫＡＲＡＰがＩＴＡＭをもつ膜内外ポリペプチドの系統群の新メンバであることを考慮して我々のＫＡＲＡＰ遺伝子の同定戦略を方向づけした。これらのポリペプチドは、実際ＫＡＲＡＰと、同じ特徴を分ち合っている：すなわち、
− ジスルフィド架橋の形成を可能にする細胞質外システインアミノ酸（Ｃ）を有するポリペプチド，
− ２５ｋＤａを超えない低分子質量のポリペプチド，
− ＹＸＸＬ/ＩＸ６−８ ＹＸＸＬ/Ｉ，のようなＩＴＡＭパターン内に含まれたリン酸化可能なチロシンアミノ酸を少なくとも１つ有するポリペプチド，及び
− 膜内外荷電アミノ酸の存在。
【０１４５】
かくして、我々は、ＥＳＴ，ＧＥＮＢＡＮＫ，ＳＷＩＳＳ ＰＲＯＴ及びＥＭＢＬのような形で入手可能な公共のｃＤＮＡバンクから１つの遺伝子を同定する生物学的情報処理戦略を作り上げた。我々は、次のような異なる２つのアプローチを利用した：
１） 我々は、５０〜２００個のアミノ酸（考慮対象の分子量は５.５〜２２ｋＤａの間に含まれる）をもつペプチドのみをとり上げて、ＥＳＴの集合体を６つの読取り段階に従って翻訳した。 このサブベースに対して、我々は次のような複数の基準を適用した：
− Argos 方法（Rao & Argos,１９８６，Biochem, Biophys. Acta, ８６９，１９７−２１４）に従って、アミノ酸３０の前に始まる、少なくとも１０個のアミノ酸の予測された膜内外領域の存在。実際、ＣＤ３ζ及びＦｃεＲＩγのようなＩＴＡＭをもつポリペプチドとの相同性により、ＫＡＲＡＰ配列の主要な部分は、細胞質内のものであると予測されている。
【０１４６】
膜内外ゾーンのＣ末端位置におけるＩＴＡＭパターン（Ｙ−ｘ−ｘ−〔ＩＬ〕−ｘ（６，８）−Ｙ−ｘ−ｘ〔ＩＬ〕）の探索。
【０１４７】
− 荷電アミノ酸（Ｒ，Ｋ，Ｄ，Ｅ）の膜内外領域内における存在。
【０１４８】
− 膜内外ゾーンのＣ末端位置におけるシステインアミノ酸（Ｃ）の存在。
【０１４９】
２） ＣＤ３Ｚ＿ＨＵＭＡＮ入力との配列相同性を有するＥＳＴ入力の探索（ＥＭＢＬ，ＧＥＮ ＢＡＮＫ及びＳＷＩＳＳ ＰＲＯＴでも同様に行なわれる分析）。利用されるプログラムは、ＴＢＬＡＳＴＮ（１，４，１１バージョン；Altschul, Stephen F., Warren Gish, Webb Miller, Eugene W. Myers, and David J. Lipman, １９９０，J. Mol. Biol. ２１５，４０３−１０）又はＴＢＬＡＳＴＮ（２，０，３バージョン；Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman,１９９７，Nucleic Acids Res.２５，３３８９−３４０２）である。これらの類似入力に対して、我々は次に、第１のアプローチで利用した選択基準を適用した。
【０１５０】
これら２つの生物学的情報処理アプローチを組合せることにより、疎水性プロフィールを用いて連続的に（Genworks プログラム，ＤＮＡ Strider），候補分子のリーダー領域、膜内外領域、細胞質内及び細胞質外領域を決定した後、我々は、潜在的にＫＡＲＡＰのものに対応する配列を多数得た。これらの配列のうち、Genbank 上でＡＡ２４２３１５の受入れ番号に対応する配列が、我々にはマウスのＫＡＲＡＰ遺伝子の配列（Ｃ５７Ｂ１/６マウスｃＤＮＡ 配列番号１）であるように思われた。図７は、本発明に従ったＫＡＲＡＰ ポリペプチドのＤＮＡ配列（ｃＤＮＡ 配列番号１）を表わしている。この配列は、マウスのＫＡＲＡＰ遺伝子の配列に対応する。実際、ヌクレオチド配列の翻訳は、３９６ヌクレオチドの読取り枠（配列番号２）を与える。この結果は、リーダー配列（これを含まず）から停止コドンまでに含まれるＫＡＲＡＰ遺伝子のヌクレオチド配列の一部分（配列番号１）を表わし、かつ同様にこのヌクレオチド配列の下に対応するアミノ酸配列（１文字コード）（配列番号２，３文字コード），すなわち本発明に従った成熟マウスのＫＡＲＡＰタンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）をも表わしている図８によって例示されている。この配列の標準的な分析は、８７個のアミノ酸の成熟タンパク質（９.６ｋＤａの分子質量）、１６アミノ酸の細胞質外部分（Ｑ１〜Ｇ１６），２４アミノ酸の膜内外部分（Ｖ１７−Ｇ４０）及び４７アミノ酸の細胞質内部分（Ｒ４１〜Ｒ８７）を予測している。我々の探索戦略に従うと、細胞質外部分は、少なくとも１つのシステインアミノ酸（実際には２つ、Ｃ８及びＣ１０），膜内外アミノ酸（Ｄ２５）及び細胞質内ＩＴＡＭ（Ｙ６５ＱＥＬＱＧＱＲＨＥＶＹ７６ＳＤＬ）を含む。図９は、以前に記述されたＩＴＡＭを有するポリペプチドとＩＴＡＭパターン（単複）を有する本発明に従ったポリペプチドの間の配列のアラインメントによって行なうことのできる比較を例示し、その結果としてのコンセンサスＩＴＡＭ配列を示す。図９は、ＩＴＡＭをもつポリペプチドのＩＴＡＭ（６個のＣＤ３，１個のＩｇα，１個のＩｇβ，ＦｃεＲＩγ及びＦｃεＲＩβ）及び（この図９に「ＫＡＲＡＰ」と表示された）本発明に従った以上で同定されたマウスのＫＡＲＡＰ ポリペプチド（配列番号２）のＩＴＡＭパターンのアラインメントを表わしている。以前に記されたＩＴＡＭ（図９）とのこの比較に基づいて、我々には、（ＺＡＰ−７０及びｐ７２Ｓｙｋといったような）縦列ＳＨ２基をもつチロシンキナーゼタンパク質とリン酸化されたＫＡＲＡＰの会合を考慮することが可能となった。ＺＡＰ−７０のＳＨ２基に対応する組換え型融合タンパク質（Olcese L., Lang P., Vely F., Cambiaggi A., Marguet D., Blery M., Hippen K. L., Biassoni R., Moretta A., Moretta L., Cambier J. C., Vivier E.１９９６，J. Immunol. １５６：４５３１−４５３４ の中で記述された調製物）とＫＡＲＡＰの会合はインビトロで確認された。これらの実験は、図３Ａ，トラック３に記述されている通りに実施されたが、細胞溶解産物は、抗ＣＤ１５８抗体ではなく ＺＡＰ−７０のＳＨ２基に対応する組換え型融合タンパク質によって吸着された。かくして、ＫＡＲＡＰは、ＫＡＲに会合され、リン酸化されたチロシンの形でＺＡＰ−７０に会合する新しいＩＴＡＭ入り膜内外分子である。従ってＫＡＲＡＰは、Ｔ及びＮＫリンパ球の新たな形質導入要素である。ＫＡＲＡＰ又はＫＡＲＡＰ類似体が同様にＩＴＩＭ含有レセプタの活性化イソ型タンパク質にも会合し、これらの形質導入サブユニットの多分子複合体の中で、レセプタの係合の際に発せられるシグナルとして役立つことも可能である。
【０１５１】
配列がわかっている候補ポリペプチドが本発明に従ったＫＡＲＡＰタンパク質に対応することを決定又は制御するために特に適した方法は、この候補ポリペプチドの特徴的部分（例えば少なくとも１つのＩＴＡＭパターン又は細胞質外領域を含む細胞質内領域）に対する抗体を産生すること及び、この抗体が、機能的細胞上で、例えばその候補ポリペプチドがそのＫＡＲＡＰであると想定されているレセプタに会合した状態にある標的である機能的ＫＡＲ＋ 細胞を認識することを確認すること（すなわち、ＫＡＲ＋ 細胞の場合、抗体が、ＫＡＲレセプタに会合した状態にある標的を認識することを確認すくこと）から成る。
【０１５２】
本発明に従ったこのＫＡＲＡＰ ポリペプチドの同定方法は、かくして以下の段階から成る。
【０１５３】
− 候補ポリペプチド，特にこの候補ポリペプチドの少なくとも１つのＩＴＡＭパターンを含む領域に対して導かれたモノ又はポリクローナル抗体（例えば、以上で同定されたマウスＫＡＲＡＰタンパク質の場合には配列番号２の細胞質外部分（配列番号３）又は細胞質内部分（配列番号５）の領域に対し導かれた抗体）を産生する段階；
− 抗原−抗体タイプの結合反応を可能にする穏やかな条件下で候補ポリペプチドがＫＡＲＡＰを構成すると想定されている対象の活性化又は非阻害性レセプタを、１つの機能的形態にて有する細胞、例えばＮＫ又はＴ細胞のような機能的ＫＡＲ＋ 細胞の溶解産物と、この抗体を接触させる段階、
− 場合によって形成される反応産物の中に、ＫＡＲのものに近い見かけの分子質量（約５０ｋＤａ）をもつ産物及び候補ポリペプチドのものに近い見かけの分子質量（特に約１０〜１６ｋＤａの間）をもつ産物が存在する場合に、本発明に従ったＫＡＲＡＰ ポリペプチドであるものとしてその候補ポリペプチドを同定する段階。
【０１５４】
本発明に従ったこの同定方法は特に、
− 上述の通りに前記抗体を接触させ、
− 分子複合体を保存する洗剤の穏やかな条件下で（例えば１％のジギトニン，上述の実施例１参照），場合によって形成された反応産物を沈降させ、
− 例えば、変性条件内でポリアクリルアミドゲル上の分子質量マーカーの存在下での電気泳動遊走により、沈降された産物の分子質量を測定し
− 上述のとおりの本発明に従ったＫＡＲＡＰポリペプチドであるものとして候補ポリペプチドを同定すること、
によって実施することができる。
【０１５５】
実施例３
１．ＫＡＲＡＰに対応する複数のＥＳＴの同定
上述の実施例２に示されたような生物学的情報処理による我々のマウスＫＡＲＡＰクローニング戦略は、同様に、我々のＫＡＲＡＰの定義に対応する５ＥＳＴ（Expressed Tag Sequences ：発現済みタグ配列）の存在をも明らかにする。つまり、これは、ＥＳＴ ＡＡ２４２３１５，ＡＡ７３４７６９，Ｗ８８１５９，ＡＡ０９８５０６及びＷ４１１４２である。図１０Ａ〜１４Ａは、それぞれ、ＥＳＴ ＡＡ２４２３１５，ＡＡ７３４７６９，Ｗ８８１５９，ＡＡ０９８５０６及びＷ４１１４２のｃＤＮＡ配列を例示している（それぞれ配列番号６〜１０）。図１０Ｂ〜１４Ｂは、それぞれこれらのＥＳＴに対応するタンパク質配列を例示する（それぞれＥＳＴ ＡＡ２４２３１５，ＡＡ７３４７６９，Ｗ８８１５９，ＡＡ０９８５０６ 及び Ｗ４１１４２のタンパク質について配列番号１１〜１５）。これらのＥＳＴは全てＣ５７Ｂ１/６マウス由来の組織から得られ、読取り枠に対応するｃＤＮＡ配列を得るように整列させられたものである。このことは、ＥＳＴ ＡＡ０９８５０６（配列番号９）、ＡＡ２４２３１５（配列番号６）、Ｗ８８１５９（配列番号８）、ＡＡ７３４７６９（配列番号７）及びＷ４１１４２（配列番号１０）の配列のアラインメントを表わし、結果として得られたコンセンサス配列（コンセンサスマウスＫＡＲＡＰｃＤＮＡ：配列番号１６）を示す図１５によって例示されている。
【０１５６】
このことは同様に、ＥＳＴ ＡＡ２４２３１５（配列番号１１），Ｗ８８１５９（配列番号１３），Ｗ４１１４２（配列番号１５），ＡＡ０９８５０６（配列番号１４）及びＡＡ７３４７６９（配列番号１２）のタンパク質配列のアラインメントを表わし、かつ結果として得られるコンセンサス配列（コンセンサス配列ＫＡＲＡＰタンパク質，配列番号１７）を表わす図１６によっても例示されている。これらの図１５及び１６上で、記号「・」は、考慮対象のコンセンサス配列との同一性を表わし、記号「−」は、配列決定データの欠如を表わす。
【０１５７】
２．マウスＫＡＲＡＰのゲノム配列
１２９マウス系統のマウスから単離したゲノミックＤＮＡのライブラリ（ラムダファージ、ＥＭＢＬ３）を、従来の技術に従って ＥＳＴ ＡＡ７３４７６９の配列に対応するｃＤＮＡを用いてスクリーニングした。１８ｋｂのフラグメントを含むファージを、陽性として同定した。一連の制限酵素での切断によりこのファージのカルトグラフィを実施し、ファージから得た９ｋｂのＥcoＲＩ−ＥcoＲＩフラグメントをｐBlue−Scriptクローニングベクター内でクローニングした。これには、マウスＫＡＲＡＰ遺伝子全体（初期ＡＴＧからＳＴＯＰ配列まで）が含まれている。このマウスＫＡＲＡＰ遺伝子の配列は、図１７に示されている（配列番号１８；２８３８ｐｂ）。
【０１５８】
その上、マウスＫＡＲＡＰのゲノム組織を得るべく、オリゴヌクレオチドプライマが生成された。利用されたプライマは以下の表１に示されている（配列番号１９〜２６）。
【表１】
【０１５９】
マウスＫＡＲＡＰのゲノム組織は図１８に示されている。我々はこれらのデータから、１２９系統のマウスのＫＡＲＡＰのｃＤＮＡ配列ひいてはタンパク質配列を得た。このｃＤＮＡ配列（配列番号２７）及びこのタンパク質配列（配列番号２８）は図１９に示されている。
【０１６０】
かくして翻訳されたタンパク質配列は、以下のとおりである。
【０１６１】
（配列） シグナル配列
（配列） 細胞質外ドメイン
（配列） 膜内外ドメイン
（配列） 細胞質内ドメイン
ゲノミックカルトグラフィのこれらの結果全体は、マウスＫＡＲＡＰ遺伝子（初期ＡＴＧからＳＴＯＰ配列まで）が長さ約２.９ｋｂであり、５個のエキソンを含むことを示している。これらの結果は、上から下へ、１２９マウスのマウスＫＡＲＡＰのゲノミックＤＮＡ（黒色：翻訳済みエキソン；水平ハッチング：未翻訳エキソン、白色：イントロン）、対応するタンパク質配列（エキソン１〜エキソン５までの配列番号２８）及びこのタンパク質の異なる領域の性質（ＳＳ＝シグナル配列；ＥＣ＝細胞質外ドメイン；ＴＭ＝膜内外ドメイン；ＩＣ＝細胞質内ドメイン）を表わす図２０によって例示されている。エキソン１は、シグナル配列のＮ末端部分についてコードし、エキソン２はシグナル配列の残りの部分及び細胞質外部分の最初の３つのアミノ酸についてコードし、エキソン３は、細胞質外部分の残りの部分、膜内外部分及び細胞質内部分の最初の９つのアミノ酸についてコードし、エキソン４は、細胞質内部分の１４のアミノ酸についてコードし、エキソン５はタンパク質の残りの部分についてコードする。ＫＡＲＡＰといったようなＩＴＡＭを有するポリペプチドのゲノム組織に期待されるように、ＩＴＡＭは、タイプ０のイントロンによって分離された２つのエキソン（エキソン４及び５）によってコードされる。
【０１６２】
３．ＤＡＰ−１２ヒトＫＡＲＡＰによりＲＢＬ−２Ｈ３の中で発現されるＫＡＲ（ｐ５０.２）の機能的再構築
我々は、マウスＫＡＲＡＰの配列から演繹されるオリゴヌクレオチドプライマを生成することによりＲＴ−ＰＣＲによってヒトＫＡＲＡＰについてコードするｃＤＮＡを得た。利用されたプライマは、以下の表２に示されいる（配列番号２９及び３０）。
【表２】
【０１６３】
得られたｃＤＮＡ配列は図２１に示されている（配列番号３１：ヒトＫＡＲＡＰのｃＤＮＡ）。ＫＡＲ＋ ヒトＮＫクローンから抽出されたＲＮＡは、このｃＤＮＡの生成のベースとして役立った。このｃＤＮＡを、ｐＮＴ−ｎｅｏ 真核生物発現ベクタ内でクローニングし、このヒトＫＡＲＡＰについて安定したトランスフェクタントを、ＲＢＬ−２Ｈ３細胞系統のＫＡＲ＋（ｐ５０.２）トランスフェクタント内で生成した（Blery et al, J. Biol. Chem., １９９７）。ｐ５０.２＋ 及びＫＡＲＡＰ＋ というこのように２重にトランスフェクションを受けたＲＢＬ−２Ｈ３細胞上で発現されたＫＡＲレセプタがもつ活性化シグナルを形質導入する能力を、ｐ５０.２の細胞質外部分に対して導かれた抗体を用いての刺激によって、又トリチウム標識づけされたセロトニンの塩析に従ってテストした。
【０１６４】
このトリチウム標識づけされたセロトニンの塩析実験のために従ったプロトコルは以下のとおりである：
これらの細胞を剥離させ、遠心分離に付し、１ｍｌにつき１×１０６個の細胞という最終濃度でＲＰＭＩ−１０％ＳＶＦの中で再懸濁させる。このとき、細胞を、１時間細胞１ｍｌあたり２μＣｉのトリチウム標識づけ済みセロトニンを用いてインキュベートさせる。細胞を洗浄し、次に、細胞がその原液から余剰のセロトニンを塩析させるべく３７℃で１時間培地の中に戻す。その後、細胞をマウスのＩｇＥ（２６８１−Ｉ）又は抗ｐ５０ＡＣ（ＧＬ１８３）と共に、９６ウェル付き平板（１ウェルあたり細胞２０００００個）の中に分布させる。細胞を１時間付着させその後洗浄する。細胞を１５分間３７℃に戻し、次にＦ(ab') ２Ｇモノクローナル抗体（５０μｇ/ｍｌ）を用いて刺激する。３７℃で３０分間、細胞を放置してそれらがそのセロトニンを遊離させることができるようにする。低温ＨＢＳＳを添加し細胞を氷上に置くことによって反応を終結させる。このとき各ウェルの上清の半分を回収し、１ｍｌのシンチレーション液中に入れる。セロトニンが投入された未刺激の細胞から得られた同量の溶解産物から１００％の脱顆粒化が得られる。このときβカウンタで試料を計数する。
【０１６５】
得られた結果は、ヒトのｐ５０/ＫＡＲＡＰの２重トランスフェクションを受け、横座標に示された抗体（左側：抗体無し；中央：マウスＩｇＥ：ｍＩｇＥ１/５００；右側：ＧＬ１８３ ５μｇ/ｍｌ）による刺激を受けたＲＢＬ−２Ｈ３細胞により上清内で塩析されたセロトニンの％を示す図２２によって例示されている。この図２２に示されているように、ＫＡＲの細胞質外部分と反応する抗体（モノクローナル抗体 ＧＬ１８３）によるＲＢＬ−２Ｈ３中のＫＡＲの係合が細胞の活性化という形で現われないのに対し、ヒトのＫＡＲとＫＡＲＡＰを同時に発現する２重トランスフェクタントＲＢＬ−２Ｈ３でのＧＬ１８３によるＫＡＲの係合は細胞活性化（ここでは細胞からのセロトニンの遊離により表出される）という形で現われる。従ってこのことは、同定されたヒトＫＡＲＡＰ配列がＫＡＲの機能性を再構築するということの明確な証拠である。
【０１６６】
図２３は、ヒトＫＡＲＡＰ遺伝子の組織とマウスＫＡＲＡＰ遺伝子の組織の間の相同性を例示する（Ｅ１〜Ｅ５：エキソン１〜エキソン５；Ｉ１〜Ｉ４：イントロン１〜イントロン４）。ここには、ヒト及びマウスのＫＡＲＡＰ遺伝子の塩基対の番号づけが表示されている。
【０１６７】
（配列表）
【化１】
【化２】
【化３】
【化４】
【化５】
【化６】
【化７】
【化８】
【化９】
【化１０】
【化１１】
【化１２】
【化１３】
【化１４】
【化１５】
【化１６】
【化１７】
【化１８】
【化１９】
【化２０】
【化２１】
【化２２】
【図面の簡単な説明】
【０１６８】
【図１Ａ】Ｒ．Ｐ．，Ｄ．Ｆ., 及びＭＡＬと呼称されるＬＤＧＬ（顆粒リンパ球増殖性疾患）を患う患者に由来しＩＬ−２（インタロイキン２）上で培養された細胞の間接的免疫蛍光検査法でのフラックス白球計算器（Becton-Dickinson の登録商標ＦＡＣＳcan)による分析を示す。
【図１Ｂ】異なる供与体に由来するＩＬ−２上で培養されたＮＫ細胞上で実施された、異なるモノクローナル抗体を用いて再度導かれた細胞毒性試験の結果を示している。
【図２Ａ】抗ＣＤ３ζ/抗ＦｃεＲＩγ抗体を用いてＦｃεＲＩγ及びＣＤ３ζの枯渇前後に、抗ＣＤ１５８ＥＢ６モノクローナル抗体を用いて免疫沈降された、１２５Ｉでの放射性標識づけ済みの供与体Ｒ．Ｐ.(ｐ５０．１＋) のＮＫ細胞から実施されたＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム及びゲル上電気泳動によるタンパク質の分解）分析を示す。
【図２Ｂ】細胞Ｄ．Ｆ．の完全溶解産物及びかかる溶解産物の免疫沈降物の抗ＣＤ３ζ抗体プローブを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示している。
【図３Ａ】ＭＡＬ ＮＫ細胞の溶解産物の免疫沈降物が付されたインビトロキナーゼ試験に由来するリン酸化されたタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【図３Ｂ】図３Ａと同じタイプではあるものの、ＲＢＬ−２Ｈ３ｐ５０．２＋細胞から実施されたＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【図３Ｃ】Ｒ．Ｐ., ＮＫ細胞のそれぞれ抗ＣＤ−１５８及び抗ＣＤ１６免疫沈降物について実施されたインビトロキナーゼ試験後に切除された、ＫＡＲＡＰ及びＣＤ３ζバンドのリン酸化されたアミノ酸の薄層電気泳動（ＴＬＥ）による分析を示している。
【図４】キナーゼ試験を受けたＲ．Ｐ．ＮＫ細胞の溶解産物の抗ＣＤ１５８免疫沈降物の非変性/変性条件での２次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【図５】免疫グロブリン上科又はレクチンタイプの活性化又は非阻害性レセプタ及びそれらの阻害性対応物を示す。
【図６】ＫＩＲ（ｐ５８）及びＫＡＲ（ｐ５０）の概略的構造を表わす。
【図７】本発明に従ったマウスのＫＡＲＡＰポリペプチドのｃＤＮＡ配列を表わす（配列番号１）。
【図８】本発明に従ったＫＡＲＡＰポリペプチドのアミノ酸配列（成熟タンパク質配列番号２）及びヌクレオチド配列（リーダ配列（これを除く）から停止コドンまでに含まれたもの）を表わしている。
【図９】本発明に従ったＫＡＲＡＰポリペプチドのＩＴＡＭ及び複数のＩＴＡＭのアラインメントを表わしている。
【図１０Ａ】ＥＳＴのＡＡ２４２３１５のｃＤＮＡ配列（配列番号６）を例示する。
【図１０Ｂ】ＥＳＴのＡＡ２４２３１５のタンパク質配列（配列番号１１）を例示する。
【図１１Ａ】ＥＳＴのＡＡ７３４７６９のｃＤＮＡ配列（配列番号７）を例示する。
【図１１Ｂ】ＥＳＴのＡＡ７３４７６９のタンパク質配列（配列番号１２）を例示する。
【図１２Ａ】ＥＳＴのＷ８８１５９のｃＤＮＡ配列（配列番号８）を例示する。
【図１２Ｂ】ＥＳＴのＷ８８１５９のタンパク質配列（配列番号１３）を例示する。
【図１３Ａ】ＥＳＴのＡＡ０９８５０６のｃＤＮＡ配列（配列番号９）を例示する。
【図１３Ｂ】ＥＳＴのＡＡ０９８５０６のタンパク質配列（配列番号１４）を例示する。
【図１４Ａ】ＥＳＴのＷ４１１４２のｃＤＮＡ配列（配列番号１０）を例示する。
【図１４Ｂ】ＥＳＴのＷ４１１４２のタンパク質配列（配列番号１５）を例示する。
【図１５Ａ】ＥＳＴ ＡＡ２４２３１５，ＡＡ７３４７６９，Ｗ８８１５９，ＡＡ０９８５０６及びＷ４１１４２のｃＤＮＡ配列のアラインメント及び、結果としてもたらされるコンセンサス配列（配列番号１６：コンセンサスＣ５７Ｂ１/６マウスのＫＡＲＡＰｃＤＮＡ）。
【図１５Ｂ】ＥＳＴ ＡＡ２４２３１５，ＡＡ７３４７６９，Ｗ８８１５９，ＡＡ０９８５０６及びＷ４１１４２のｃＤＮＡ配列のアラインメント及び、結果としてもたらされるコンセンサス配列（配列番号１６：コンセンサスＣ５７Ｂ１/６マウスのＫＡＲＡＰｃＤＮＡ）。
【図１６】ＥＳＴ ＡＡ２４２３１５，ＡＡ７３４７６９，Ｗ８８１９，ＡＡ０９８５０６及びＷ４１１４２のタンパク質配列のアラインメント及び結果として得られるコンセンサス配列（配列番号１７：コンセンサスＣ５７Ｂ１/６マウスのＫＡＲＡＰタンパク質）を表わす。
【図１７Ａ】１２９系統のマウスのＫＡＲＡＰ遺伝子配列（配列番号１８：２８３８ｐｂ）を表わす。
【図１７Ｂ】１２９系統のマウスのＫＡＲＡＰ遺伝子配列（配列番号１８：２８３８ｐｂ）を表わす。
【図１８】１２９系統のマウスのＫＡＲＡＰのゲノム組織を表わす。
【図１９】１２９系統のマウスのＫＡＲＡＰのｃＤＮＡ配列（配列番号２７）及び対応するタンパク質配列（配列番号２８）を表わす。
【図２０】上から下に１２９系統のマウスのＫＡＲＡＰ遺伝子のゲノム組織、対応するタンパク質配列及びこのタンパク質の異なる領域の性質を表わしている。
【図２１】ヒトＫＡＲＡＰのｃＤＮＡ（配列番号３１）を表わす。
【図２２】ヒトｐ５０/ＫＡＲＡＰの２重トランスフェクションを受け横座標に記された抗体（左側：抗体無し；中央：マウスＩｇＥ：ｍＩｇＥ １/５００；右側：ＧＬ１８３ ５μｇ/ｍｌ）による刺激を受けたＲＢＬ−２Ｈ３細胞による、上清中で塩析されたセロトニンの百分率を表わす。
【図２３】ヒトＫＡＲＡＰ遺伝子の組織とマウスＫＡＲＡＰ遺伝子の組織の間の相同性を例示する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３１の配列を含む核酸。
【請求項２】
請求項１に記載の核酸によってエンコードされた単離されたポリペプチド。
【請求項３】
請求項２に記載のポリペプチド又はそのフラグメント又は相同体であって、前記相同体又はフラグメントはＫＡＲに由来するシグナルを形質導入する能力を有するものであり、
細胞中でＫＡＲ活性化不全の回復を可能にすること、ＫＡＲに会合しかつこのＫＡＲを阻害する相対物には会合しない能力をもつこと、及び
そのアミノ酸配列が、
− リン酸化可能なチロシンアミノ酸を少なくとも１つ有し、
− １０±２から１６±２ｋＤａの間に含まれる分子質量を有し、
− 少なくとも１つのＩＴＡＭ ＹｘｘＬ/Ｉx６−８ＹｘｘＬ/Ｉパターンを有し、
− 細胞質外領域、膜内外領域及び細胞質内領域を含み、
− 少なくとも１つの細胞質外システインアミノ酸を含んで成り、
− 少なくとも１つの膜内外荷電アミノ酸（Ｒ，Ｋ，Ｄ，Ｅ）を有することを特徴とする、ポリペプチド又はそのフラグメント又は相同体。
【請求項４】
前記細胞がＮＫ細胞及び／又はＴ細胞及び／又は骨髄性細胞及び／又はＢ細胞及び／又はマスト細胞であることを特徴とする請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項５】
少なくとも１つのチロシン残基レベルでリン酸化されていることを特徴とする請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項６】
２量体の形を有することを特徴とする請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項７】
ＳＨ２又はＰＴＢドメインをもつ分子に結合されることを特徴とする請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項８】
グリコシル化、リン酸化、スルホン化、ビオチニル化、アシル化、エステル化；ホスホン酸塩のようなリン酸塩基のものに近い分子形態をもつ物質（entity）の添加、置換又は抑制；ルシフェラーゼ、ＧＦＰ（Green Fluorescence Protein) 又はその類似体のような標識付け試薬の添加；親和性リガンドのような精製用標的の添加；その可溶性を修正する物質の添加；によって修飾されることを特徴とする請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項９】
細胞膜を横断する能力を有することを特徴とする請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
シグナルを形質導入するその能力を阻害するように修飾されることを特徴とする請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
特にホスホン酸塩基の添加により生物学的条件下で加水分解不能となるような形で修飾されることを特徴とする請求項１０に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
フェニルアラニン残基によるチロシン残基の置換により修飾されることを特徴とする請求項１０に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
請求項２または３に記載のポリペプチドに結合する抗体又はかかる抗体のフラグメント特にＦｃ，ＦＶ，Ｆａｂ，Ｆ（ａｂ’）２又はＣＤＲフラグメント。
【請求項１４】
請求項３に記載のポリペプチドの獲得方法において、
ｉ． 抗ＣＤ１５８、抗ｐ７０/ＮＫＢ１、抗ｐ１４０抗体、より特定的には、ＥＢ６、ＧＬ１８３またはＰＡＸ２５０モノクローナル抗体のような単数又は複数の抗ＫＩＲ及び/又は抗ＫＡＲ抗体を用いてＫＡＲ＋細胞の細胞溶解産物の単数又は複数のポリペプチド分画の免疫沈降する段階を含み、ここで
ii． 各ポリペプチド分画は、任意には、さらに以前に抗ＣＤ３及び/又は抗ＦｃεＲＩγを用いた免疫沈降された分画の除去により枯渇され得及び/又は新たに抗ＣＤ１５８、抗ｐ７０/ＮＫＢ１または抗ｐ１４０抗体、より特定的には、ＥＢ６、ＧＬ１８３またはＰＡＸ２５０モノクローナル抗体のような単数又は複数の抗ＫＩＲ及び/又は抗ＫＡＲ抗体を用いて免疫沈降され得、
iii. その分子量に従って前記ポリペプチド分画のポリペプチドを分離し１２±２ｋＤａの分子量に対応するポリペプチドを回収するか又は、
前記単数又は複数のポリペプチド分画をキナーゼ試験に付した後その分子量に従って前記ポリペプチド分画のポリペプチドを分離し、１２、１４及び/又は１６±２ｋＤａの分子量に対応するリン酸化されたポリペプチドを回収する段階をも含んで成ることを特徴とする方法。
【請求項１５】
前記ＫＡＲ＋細胞がＮＫ細胞及び/又はＴ細胞及び/又骨髄性細胞及び/又はＢ細胞及び/又はマスト細胞であることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
請求項３に記載のポリペプチドの配列を獲得する方法であって、
− リン酸化可能なチロシンアミノ酸を少なくとも１つ有し、
− ５から２５ｋＤａの間の分子質量を有し、
− 細胞質外領域、膜内外領域及び細胞質内領域を有し、
− その細胞質外領域内にシステインアミノ酸を少なくとも１つ有し、
− その膜内外領域内に荷電アミノ酸（Ｒ，Ｋ，Ｄ，Ｅ）を少なくとも１つ有し、かつ
− その細胞質内領域内にＩＴＡＭ ＹｘｘＬ/Ｉx６−８ＹｘｘＬ/Ｉパターンを少なくとも１つ有するもののみを選択するため候補配列の間でのスクリーニングによって作業を行なうこと及び、選択された配列（単複）に対応するポリペプチド（単複）が、ＫＡＲを阻害する対応物レセプタに会合することなくＫＡＲレセプタに会合する能力を有することを確保することを特徴とする方法。
【請求項１７】
候補ポリペプチドが、請求項３に記載のポリペプチドに対応するか否かを決定するための方法において、
− 候補ポリペプチド、特にこの候補ポリペプチドの細胞質外領域及び/又は少なくとも１つのＩＴＡＭパターンを含む領域に対して導かれたモノ又はポリクローナル抗体を産する段階、
− 抗原−抗体タイプの結合反応を可能にする穏やかな条件下で候補ポリペプチドがＫＡＲＡＰを構成すると想定されている対象の活性化又は非阻害性レセプタを、１つの機能的形態にて有する細胞の溶解産物と、この抗体を接触させる段階、
− 場合によって形成される反応産物の中に、前記活性化又は非阻害性レセプタのものに近い見かけの分子質量をもつ産物及び候補ポリペプチドのものに近い見かけの分子質量をもつ産物が存在する場合に候補ポリペプチドを同定する段階、
を含んで成ることを特徴とする方法。
【請求項１８】
薬学的に受容可能なビヒクルと会合した状態で、有効量の請求項２〜１２のいずれか１つに記載のポリペプチド又はそのフラグメント、又は有効量の請求項１３に記載の抗体またはそのフラグメント、又は有効量の請求項１に記載の核酸又はその変異体を含んで成る薬学組成物。
【請求項１９】
１つの細胞の異常な又は望ましくない機能のインビトロ診断方法において、
− 少なくとも１つの細胞又は細胞抽出物を、請求項１３に記載の抗体又はそのフラグメント、または該抗体またはそのフラグメントと反応するポリペプチドまたはそのフラグメントをエンコードする核酸又はその変異体を接触させる段階、及び
− 形成され得た反応産物の存在を明らかにする段階、
を含んで成ることを特徴とする方法。
【請求項２０】
前記異常な又は望ましくない機能が、免疫増殖疾患、ＨＩＶ疾患のような免疫不全疾患、顆粒リンパ球増殖疾患のようなガン、リウマチ様多発性関節炎のような自己免疫疾患、マラリアのような感染性疾患、アレルギー応答、移植片拒絶の形で現われることを特徴とする請求項１９に記載のインビトロ診断方法。
【請求項２１】
ＫＡＲの活性化のアダプタ分子又はエフェクタ分子の同定方法において、
i．請求項２〜１２のいずれか１つに記載のポリペプチド（又はそのフラグメント）と候補分子を接触させる段階、及び
ii. 前記ポリペプチド（又はそのフラグメント）に対する結合が観察される候補分子を選択する段階、
を含んで成ることを特徴とする方法。
【請求項２２】
ＫＡＲの活性化の結果として得られる細胞活性を変調させる能力を有する分子の同定方法において
i.請求項２１に記載の方法によって得られるようなＫＡＲの活性化のアダプタ又はエフェクタ分子、及び請求項２〜１２のいずれか１つに記載のポリペプチド（又はそのフラグメント）と、候補分子を接触させる段階；及び
ii. 候補分子のうち、かかる候補分子の不存在下で観察されるような前記ポリペプチド（又はそのフラグメント）と前記アダプタ又はエフェクタ分子の間の結合に対し効果を及ぼす候補分子を選択する段階、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１】
配列番号３１の配列を含む核酸。
【請求項２】
請求項１に記載の核酸によってエンコードされた単離されたポリペプチド。
【請求項３】
請求項２に記載のポリペプチド又はそのフラグメント又は相同体であって、前記相同体又はフラグメントはＫＡＲに由来するシグナルを形質導入する能力を有するものであり、
細胞中でＫＡＲ活性化不全の回復を可能にすること、ＫＡＲに会合しかつこのＫＡＲを阻害する相対物には会合しない能力をもつこと、及び
そのアミノ酸配列が、
− リン酸化可能なチロシンアミノ酸を少なくとも１つ有し、
− １０±２から１６±２ｋＤａの間に含まれる分子質量を有し、
− 少なくとも１つのＩＴＡＭ ＹｘｘＬ/Ｉx６−８ＹｘｘＬ/Ｉパターンを有し、
− 細胞質外領域、膜内外領域及び細胞質内領域を含み、
− 少なくとも１つの細胞質外システインアミノ酸を含んで成り、
− 少なくとも１つの膜内外荷電アミノ酸（Ｒ，Ｋ，Ｄ，Ｅ）を有することを特徴とする、ポリペプチド又はそのフラグメント又は相同体。
【請求項４】
前記細胞がＮＫ細胞及び／又はＴ細胞及び／又は骨髄性細胞及び／又はＢ細胞及び／又はマスト細胞であることを特徴とする請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項５】
少なくとも１つのチロシン残基レベルでリン酸化されていることを特徴とする請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項６】
２量体の形を有することを特徴とする請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項７】
ＳＨ２又はＰＴＢドメインをもつ分子に結合されることを特徴とする請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項８】
グリコシル化、リン酸化、スルホン化、ビオチニル化、アシル化、エステル化；ホスホン酸塩のようなリン酸塩基のものに近い分子形態をもつ物質（entity）の添加、置換又は抑制；ルシフェラーゼ、ＧＦＰ（Green Fluorescence Protein) 又はその類似体のような標識付け試薬の添加；親和性リガンドのような精製用標的の添加；その可溶性を修正する物質の添加；によって修飾されることを特徴とする請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項９】
細胞膜を横断する能力を有することを特徴とする請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
シグナルを形質導入するその能力を阻害するように修飾されることを特徴とする請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
特にホスホン酸塩基の添加により生物学的条件下で加水分解不能となるような形で修飾されることを特徴とする請求項１０に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
フェニルアラニン残基によるチロシン残基の置換により修飾されることを特徴とする請求項１０に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
請求項２または３に記載のポリペプチドに結合する抗体又はかかる抗体のフラグメント特にＦｃ，ＦＶ，Ｆａｂ，Ｆ（ａｂ’）２又はＣＤＲフラグメント。
【請求項１４】
請求項３に記載のポリペプチドの獲得方法において、
ｉ． 抗ＣＤ１５８、抗ｐ７０/ＮＫＢ１、抗ｐ１４０抗体、より特定的には、ＥＢ６、ＧＬ１８３またはＰＡＸ２５０モノクローナル抗体のような単数又は複数の抗ＫＩＲ及び/又は抗ＫＡＲ抗体を用いてＫＡＲ＋細胞の細胞溶解産物の単数又は複数のポリペプチド分画の免疫沈降する段階を含み、ここで
ii． 各ポリペプチド分画は、任意には、さらに以前に抗ＣＤ３及び/又は抗ＦｃεＲＩγを用いた免疫沈降された分画の除去により枯渇され得及び/又は新たに抗ＣＤ１５８、抗ｐ７０/ＮＫＢ１または抗ｐ１４０抗体、より特定的には、ＥＢ６、ＧＬ１８３またはＰＡＸ２５０モノクローナル抗体のような単数又は複数の抗ＫＩＲ及び/又は抗ＫＡＲ抗体を用いて免疫沈降され得、
iii. その分子量に従って前記ポリペプチド分画のポリペプチドを分離し１２±２ｋＤａの分子量に対応するポリペプチドを回収するか又は、
前記単数又は複数のポリペプチド分画をキナーゼ試験に付した後その分子量に従って前記ポリペプチド分画のポリペプチドを分離し、１２、１４及び/又は１６±２ｋＤａの分子量に対応するリン酸化されたポリペプチドを回収する段階をも含んで成ることを特徴とする方法。
【請求項１５】
前記ＫＡＲ＋細胞がＮＫ細胞及び/又はＴ細胞及び/又骨髄性細胞及び/又はＢ細胞及び/又はマスト細胞であることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
請求項３に記載のポリペプチドの配列を獲得する方法であって、
− リン酸化可能なチロシンアミノ酸を少なくとも１つ有し、
− ５から２５ｋＤａの間の分子質量を有し、
− 細胞質外領域、膜内外領域及び細胞質内領域を有し、
− その細胞質外領域内にシステインアミノ酸を少なくとも１つ有し、
− その膜内外領域内に荷電アミノ酸（Ｒ，Ｋ，Ｄ，Ｅ）を少なくとも１つ有し、かつ
− その細胞質内領域内にＩＴＡＭ ＹｘｘＬ/Ｉx６−８ＹｘｘＬ/Ｉパターンを少なくとも１つ有するもののみを選択するため候補配列の間でのスクリーニングによって作業を行なうこと及び、選択された配列（単複）に対応するポリペプチド（単複）が、ＫＡＲを阻害する対応物レセプタに会合することなくＫＡＲレセプタに会合する能力を有することを確保することを特徴とする方法。
【請求項１７】
候補ポリペプチドが、請求項３に記載のポリペプチドに対応するか否かを決定するための方法において、
− 候補ポリペプチド、特にこの候補ポリペプチドの細胞質外領域及び/又は少なくとも１つのＩＴＡＭパターンを含む領域に対して導かれたモノ又はポリクローナル抗体を産する段階、
− 抗原−抗体タイプの結合反応を可能にする穏やかな条件下で候補ポリペプチドがＫＡＲＡＰを構成すると想定されている対象の活性化又は非阻害性レセプタを、１つの機能的形態にて有する細胞の溶解産物と、この抗体を接触させる段階、
− 場合によって形成される反応産物の中に、前記活性化又は非阻害性レセプタのものに近い見かけの分子質量をもつ産物及び候補ポリペプチドのものに近い見かけの分子質量をもつ産物が存在する場合に候補ポリペプチドを同定する段階、
を含んで成ることを特徴とする方法。
【請求項１８】
薬学的に受容可能なビヒクルと会合した状態で、有効量の請求項２〜１２のいずれか１つに記載のポリペプチド又はそのフラグメント、又は有効量の請求項１３に記載の抗体またはそのフラグメント、又は有効量の請求項１に記載の核酸又はその変異体を含んで成る薬学組成物。
【請求項１９】
１つの細胞の異常な又は望ましくない機能のインビトロ診断方法において、
− 少なくとも１つの細胞又は細胞抽出物を、請求項１３に記載の抗体又はそのフラグメント、または該抗体またはそのフラグメントと反応するポリペプチドまたはそのフラグメントをエンコードする核酸又はその変異体を接触させる段階、及び
− 形成され得た反応産物の存在を明らかにする段階、
を含んで成ることを特徴とする方法。
【請求項２０】
前記異常な又は望ましくない機能が、免疫増殖疾患、ＨＩＶ疾患のような免疫不全疾患、顆粒リンパ球増殖疾患のようなガン、リウマチ様多発性関節炎のような自己免疫疾患、マラリアのような感染性疾患、アレルギー応答、移植片拒絶の形で現われることを特徴とする請求項１９に記載のインビトロ診断方法。
【請求項２１】
ＫＡＲの活性化のアダプタ分子又はエフェクタ分子の同定方法において、
i．請求項２〜１２のいずれか１つに記載のポリペプチド（又はそのフラグメント）と候補分子を接触させる段階、及び
ii. 前記ポリペプチド（又はそのフラグメント）に対する結合が観察される候補分子を選択する段階、
を含んで成ることを特徴とする方法。
【請求項２２】
ＫＡＲの活性化の結果として得られる細胞活性を変調させる能力を有する分子の同定方法において
i.請求項２１に記載の方法によって得られるようなＫＡＲの活性化のアダプタ又はエフェクタ分子、及び請求項２〜１２のいずれか１つに記載のポリペプチド（又はそのフラグメント）と、候補分子を接触させる段階；及び
ii. 候補分子のうち、かかる候補分子の不存在下で観察されるような前記ポリペプチド（又はそのフラグメント）と前記アダプタ又はエフェクタ分子の間の結合に対し効果を及ぼす候補分子を選択する段階、
を含むことを特徴とする方法。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１３Ａ】
【図１３Ｂ】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図１５Ａ】
【図１５Ｂ】
【図１６】
【図１７Ａ】
【図１７Ｂ】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１３Ａ】
【図１３Ｂ】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図１５Ａ】
【図１５Ｂ】
【図１６】
【図１７Ａ】
【図１７Ｂ】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【公開番号】特開２００９−５６９９（Ｐ２００９−５６９９Ａ）
【公開日】平成２１年１月１５日（２００９．１．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１５３４８５（Ｐ２００８−１５３４８５）
【出願日】平成２０年６月１１日（２００８．６．１１）
【分割の表示】特願平１０−５４６６８７の分割
【原出願日】平成１０年４月３０日（１９９８．４．３０）
【出願人】（５００１８１２７８）アンスティテュ ナシオナル ドゥ ラ サーント エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル （イ エン エス ウ エル エム） (1)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１月１５日（２００９．１．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年６月１１日（２００８．６．１１）
【分割の表示】特願平１０−５４６６８７の分割
【原出願日】平成１０年４月３０日（１９９８．４．３０）
【出願人】（５００１８１２７８）アンスティテュ ナシオナル ドゥ ラ サーント エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル （イ エン エス ウ エル エム） (1)
【Ｆターム（参考）】
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