熱安定ルシフェラーゼと生産方法
【課題】天然ルシフェラーゼまたは変異体ルシフェラーゼに比べて大きく高められた熱安定性を有する変異体ルシフェラーゼ酵素を提供する。
【解決手段】甲虫ルシフェラーゼ遺伝子を用い、ランダム変異誘発の多様な手段、とりわけエラーしがちなポリメラーゼを用いる遺伝子合成に適用して、修飾ルシフェラーゼ遺伝子ライブラリーを作り、大腸菌で発現させ、選択された変異を組み合わせて複合修飾ルシフェラーゼを作った。新しいライブラリーをこの複合修飾ルシフェラーゼからランダム変異誘発により作り、このプロセスを繰り返し選択する回帰変異誘発からなる。
【解決手段】甲虫ルシフェラーゼ遺伝子を用い、ランダム変異誘発の多様な手段、とりわけエラーしがちなポリメラーゼを用いる遺伝子合成に適用して、修飾ルシフェラーゼ遺伝子ライブラリーを作り、大腸菌で発現させ、選択された変異を組み合わせて複合修飾ルシフェラーゼを作った。新しいライブラリーをこの複合修飾ルシフェラーゼからランダム変異誘発により作り、このプロセスを繰り返し選択する回帰変異誘発からなる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、天然ルシフェラーゼまたは変異体ルシフェラーゼが由来するルシフェラーゼに比べて、例えば水溶液中、５０℃で少なくとも２時間の半減期を測定したときに、大きく高められた熱安定性を有する変異体ルシフェラーゼ酵素に関する。また、本発明は新規なルシフェラーゼをコードするポリヌクレオチド、および該ルシフェラーゼを発現するように形質転換された宿主に関する。さらに、本発明は高められた熱安定性を有するルシフェラーゼの生産方法、および以前から公知のルシフェラーゼが従来から使用されている方法を用いてのこれらのルシフェラーゼの使用に関する。これらの使用の一部はキットを用いる。
【０００２】
（発明の背景）
ルシフェラーゼは発光を引き起こすそれらの能力によって特徴づけられる。甲虫ルシフェラーゼは独自の進化的起源と化学的メカニズムを有する独特のクラスを形成する（Ｗｏｏｄ、１９９５）。
【０００３】
甲虫ルシフェラーゼとして知られている酵素は高感度発光アッセイで使用できると広く認識されているが、それらの一般的な有用性は低い熱安定性のために制限されている。発光性甲虫からクローニングされたｃＤＮＡ配列によりコードされるアミノ酸配列を有する甲虫ルシフェラーゼは、穏やかな温度でさえも安定ではない。例えば、ホタルから得られた最も安定なルシフェラーゼであるＬｕｃＰｐｅ２でさえも３７℃の穏やかな温度で非常にわずかな安定性しか有さない。ホタルルシフェラーゼは甲虫ルシフェラーゼのサブグループである。歴史的には、「ホタルルシフェラーゼ」という用語はＰｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓの単一種に由来するＬｕｃＰｐｙ酵素を指した（Ｌｕｃ＋は一異形である）。
【０００４】
ルシフェラーゼをコードする天然のｃＤＮＡ配列を変異させて向上した熱安定性を目指して変異体を選択する試みが報告されている（Ｗｈｉｔｅら、１９９４年、Ｐ．ｐｙｒａｌｉｓ由来のもの、ならびにＫａｊｉｙａｍａおよびＮｅｋａｎｏ、１９９３年、Ｌｕｃｉｏｌａ ｌａｔｅｒａｌｉｓ由来のもの）。しかし、この重要な種類の酵素の特性と多様性を向上させる必要性がなおも存在する。
【０００５】
（発明の要約）
本発明は、水溶液中、５０℃で少なくとも２時間または５０℃で少なくとも５時間の半減期を有する新規で顕著に熱安定なルシフェラーゼに関する。本発明の変異体ルシフェラーゼは室温（２２℃）および少なくとも６５℃もの温度で顕著でこれまで実現されなかった熱安定性を示す。さらに、本発明は新規なルシフェラーゼ酵素をコードする変異体ルシフェラーゼ変異体遺伝子（ｃＤＮＡ）に関する。ここで用いられる用語は、例えば実験９０、プレートナンバー１、ウエルＢ５で単離された変異体に関して、その大腸菌株は９０−１Ｂ５であり、その変異体遺伝子はｌｕｃ９０−１Ｂ５であり、その変異ルシフェラーゼはＬｕｃ９０−１Ｂ５である。
【０００６】
熱安定性とは、溶液中、規定温度で酵素の半減期において測定された酵素活性の損失速度を意味する。好ましくは、甲虫ルシフェラーゼに関して、酵素活性はルシフェリンとＡＴＰの飽和条件下、室温で測定された発光を意味する。熱安定性は半減期（活性の５０％が失われる時間）を用いて定義する。
【０００７】
さらに、本発明は、変異体ルシフェラーゼを含有する発現ベクターおよび他の遺伝子構築物、ならびに該変異体ルシフェラーゼを発現するように形質転換された細菌またはそれ以外の宿主を包含する。また、本発明は新規なルシフェラーゼを含有する組成物およびキット、およびルシフェラーゼが慣用的に用いられる方法でのこれらのルシフェラーゼの使用に関する。
【０００８】
ランダム変異誘発の多様な手段を、ルシフェラーゼ遺伝子（ヌクレオチド配列）、とりわけエラーしがちなポリメラーゼを用いる遺伝子合成に適用して、修飾ルシフェラーゼ遺伝子のライブラリーを作った。このライブラリーは大腸菌のコロニーで発現され、十分な発光を肉眼でスクリーニングして修飾ルシフェラーゼのサブセットライブラリーを選択した。次に、これらの大腸菌株の溶解物を作り、ルシフェラーゼ活性と安定性を定量的に測定した。これから、修飾ルシフェラーゼのさらに小さいサブセットを選択し、これらの選択された変異を組み合わせて複合修飾ルシフェラーゼを作った。新しいライブラリーをこの複合修飾ルシフェラーゼからランダム変異誘発により作り、このプロセスを繰り返した。全体的に最も良い性能を有するルシフェラーゼがこのプロセスの数サイクル後に選択された。
【０００９】
改良ルシフェラーゼの生産方法は、出発（親）配列として最初の甲虫ルシフェラーゼをコードするポリヌクレオチド配列を用いる方向性進化（ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）を行って、酵素の他の特性を維持しながら、最初のルシフェラーゼに比較して高められた熱安定性を有する第二のルシフェラーゼをコードするポリヌクレオチド配列を作る。ｌｕｃｐｐｅ２と命名されたｃＤＮＡは、Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓに由来するＬｕｃＰｐｙと命名された広く利用されているルシフェラーゼに比べて高められた熱安定性を示すＰｈｏｔｕｒｉｓ ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉｃａに由来するホタルルシフェラーゼをコードする。ＬｕｃＰｐｅ２ルシフェラーゼをコードするｃＤＮＡが単離され、配列決定され、クローニングされた（Ｌｅａｃｈら、１９９７年を参照）。この遺伝子の変異体は第一のルシフェラーゼＬｕｃＰｐｅ２［Ｔ２４９Ｍ］をコードする。
【００１０】
変異体ルシフェラーゼの一実施態様において、そのアミノ酸配列は、残基２４９において、Ｌｅａｃｈらにより報告されたＭではなくＴが存在する以外は、図４５に示されたＬｕｃＰｐｅ２のもの（Ｔ２４９Ｍと命名）と同じである。下線を付けた太い残基（２４９）はＴからＭへの変異を示す。この酵素は大腸菌で発現されるとインビボでおよそ５倍の光を作った。二重下線部の残基はオリゴヌクレオチド変異誘発によりランダム化された。
【００１１】
本発明の方法により作られた変異体ルシフェラーゼを発現する組換え大腸菌の希釈抽出物を、光強度、シグナル安定性、基質の利用（Ｋｍ）および熱安定性等の複数の特性について同時にスクリーニングした。全自動化ロボットシステムを用いて、進化の各世代中の多数の変異体をスクリーニングした。変異誘発とスクリーニングの数サイクル後にルシフェラーゼの変異体ライブラリーを作ることにより、約３５℃のＬｕｃＰｐｅ２［Ｔ２４９Ｍ］と比較して高められた熱安定性が、水溶液中、５０℃で２時間、６５℃で５時間、または２２℃で６週間保持された場合に熱安定性を基本的に維持した（わずかに無視できる５％の活性の損失があっただけである）最も安定なクローン［クローンＬｕｃ９０−１Ｂ５］で達成された。
【００１２】
本発明の変異体ルシフェラーゼは、５０℃で少なくとも２時間、好ましくは５０〜６５℃で２〜２４時間の範囲において５０℃で少なくとも５時間高められた熱安定性を示す。特に、本発明は、適当な水溶液に溶解したときに、約５０℃で約２時間を超え、より好ましくは５０℃で約１０時間を超え、さらにより好ましくは５０℃で５時間を超える安定半減期を有する熱安定変異体ルシフェラーゼからなる。また、本発明は、適当な水溶液に溶解したときに、約６０℃で約５時間を超え、より好ましくは６０℃で約１０時間を超え、さらにより好ましくは６０℃で約２４時間を超える安定半減期を有する変異体ルシフェラーゼからなる。さらに、本発明は、適当な水溶液に溶解したときに、約２２℃で約３ヶ月を超える安定半減期、より好ましくは２２℃で少なくとも６ヶ月の半減期安定性を有する変異体ルシフェラーゼからなる。本発明の一実施態様は６５℃で６時間の安定性（２日間の半減期に等しい）を有するルシフェラーゼ変異体である。約５〜６％の活性の損失がわかった。本発明の最も安定なクローンに由来する酵素の半減期は小さな相対的変化を示すデータから外挿すると、６５℃で１２日間（６時間で６％の損失に相応）、および２２℃で２年間（６週間で５％の損失に相応）である。
【００１３】
特に、本発明はここに開示されるアミノ酸配列の実施態様を有するルシフェラーゼ酵素（例えば、Ｌｕｃ４９−７Ｃ６、Ｌｕｃ７８−０Ｂ１０およびＬｕｃ９０−１Ｂ５と命名された変異体ルシフェラーゼ、図２７、３６、４３）ならびに５０℃で少なくとも２時間の半減期が測定された熱安定性を有するすべての他の甲虫ルシフェラーゼからなる。また、本発明は、単一の変異またはここに開示される甲虫ルシフェラーゼをコードする配列の共通領域中のタイプと位置の変異の組合せ、またはそれらの等価物を有するルシフェラーゼ酵素をコードする変異ポリヌクレオチド配列からなる。これらの変異は図２２〜４７の配列で、下線の付けた太い線の残基により示され、図１９の他の甲虫ルシフェラーゼ配列と整合させてある。
【００１４】
甲虫ルシフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は図１９に並べられている。多様な属および属内の種で天然に見られる、ｌｕｃｐｐｅ−２等の１１配列が並べられている。本発明の３変異体ルシフェラーゼをコードするヌクレオチド配列（Ｌｕｃ４９−７Ｃ６； ７８−０Ｂ１０； ９０−１Ｂ５）も並べられている。高まった熱安定性を示す各変異体ルシフェラーゼ中に少なくとも３変異が存在する。一般的に、変異は保存領域には存在しない。保存アミノ酸は図１９で示される位置ですべての天然の種において同一であるものである。共通とは、ＬｕｃＰｐｅ２を除き、図１９で示される配列の５０％を超えて存在する同一のアミノ酸を言う。
【００１５】
（発明の詳細な説明）
本発明は高い熱安定性により特徴付けられ、コード遺伝子中に、通常は反復的変異誘発により作られた変異により創出された甲虫ルシフェラーゼに関する。この改良された熱安定性はその活性を変えることなくルシフェラーゼの保存を可能とし、新しいルシフェラーゼを用いるアッセイの再現性と精度を向上させる。さらに、本発明は、高められた熱安定性を有する変異体ルシフェラーゼをコードする単離ポリヌクレオチド配列（ｃＤＮＡ）、該ポリヌクレオチド配列を含有するベクター、および該ポリヌクレオチド配列を発現するように形質転換された宿主からなる。表１は約２５０クローンの結果および該クローンからのルシフェラーゼの熱安定性等の特性を示す。また、本発明は、ルシフェラーゼが慣用的に使用されている利用における該変異体ルシフェラーゼの使用、およびそのような適用の一部に有用であるキットを包含する。
【００１６】
予期せぬことに、高い熱安定性を求めた甲虫ルシフェラーゼが反復的変異誘発と選択のプロセス（しばしば「方向性進化」と称する）により本発明で達成された。反復的変異誘発および選択の方法は、特に多パラメーター自動化スクリーニングの利用において本発明の一特徴である。よって、熱安定性等の単一の属性のみに関するスクリーニングのかわりに、同時スクリーニングが酵素活性と効率というさらなる特性を求めて行われた。この方法では、一つの性質がもう一つの性質を犠牲にして「進化」することはあまりなく、結果として例えば高められた熱安定性をもたらしたが、減少した活性ももたらした。
【００１７】
表１は異なるルシフェラーゼを出発（親）配列として用いる実験から得られたパラメーター値（Ｔｉ、Ｔａｕ、ＫｍおよびＳ）の例を示す。副題は該パラメーターが測定された出発温度と出発ルシフェラーゼの名称、例えば「３９−５Ｂ１０、５１℃」等を示す。各実験におけるすべてのパラメーターは各出発配列に対する相対値として記録され、例えばどの実験においても出発配列に関するパラメーター値は“１”に等しい（定義に関してはここでの実施例２を参照されたい）。
【００１８】
熱安定性は、好熱性細菌に見られる熱安定アイソザイムによって証拠付けられるように多様な酵素において自然に進化してきた。自然での進化は、ランダム変異誘発（塩基置換、遺伝子欠失、遺伝子挿入）とそれに続く向上特性を有する変異体の選択により働く。このプロセスは時間とともに反復される。天然の熱安定酵素の存在は熱安定性が進化の尺度での変異誘発により達成できることを示唆するが、短期の実験室的方法を用いることにより特定の種類の酵素に所与レベルの熱安定性を達成する可能性は予測できなかった。非常に大きな集団と数百万の世代と遺伝子を通常伴う変異と選択による天然での進化のプロセスは、そのような変異体が作られるまで方向性進化により改良遺伝子を作ろうとする現代の実験室の能力を予想するのに用いることはできない。
【００１９】
そのような成功の後、すべての甲虫ルシフェラーゼの全体的な三次元構造はかなり似通っているので、このクラスの一員について高い熱安定性が達成できることを示すことにより、高い熱安定性が類似の方法により他の甲虫ルシフェラーゼにおいて達成できることを予想可能となる。図１７は甲虫ルシフェラーゼ間の進化的な関係を示す。これらのすべては類似した全体的な構成を有する。甲虫ルシフェラーゼが属する構造クラスは二次構造により決定される（例えば、ヘリックスはシリンダーにより、シートは矢印の集合によりに表わされ、ループはシート構造を有するヘリックスを連結する（図１８Ａ））。図１８Ｂは、小さな螺旋が図１８Ａのシリンダーに対応するＬｕｃＰｐｅ２ルシフェラーゼのアミノ酸を示す（図１８Ｂ）； 図１８Ｃは一般的な甲虫類の構造物がＬｕｃＰｐｅ２のものと一致する（重ねられる）ことを示す。これは、本発明の方法がすべての甲虫ルシフェラーゼにまで一般化できるかもしれないという期待を支持する。
【００２０】
酵素は、ヘリックス、シートおよびループ等の第二要素の三次元配置に基づく異なる構造クラスに属する。熱安定性は、第二要素が三次元構造にいかに効率的に充填されるかによって決定される。各構造クラスについて、熱安定性の理論的限界も存在する。すべての甲虫ルシフェラーゼはそれらの共通する起源（図１７）、相同アミノ酸配列および共通する触媒機構によって明らかであるように共通する構造クラスに属する。
【００２１】
変異誘発による限定された数のアミノ酸置換の適用は全体的な三次元構築物に顕著に影響を与えることは少ない（すなわち、変異体ルシフェラーゼの構造クラスが変化するとは予想されない）。構造クラスに関する熱安定性の理論的限界は知られていないので、甲虫ルシフェラーゼの潜在的熱安定性は本発明が示されるまで知られていなかった。
【００２２】
本発明の目標を達成するにおいて推測される困難性として下記のものが挙げられる。
【００２３】
１．実験室的な方法により作ることのできる変異の種類が限定されている。
【００２４】
ｉ）ランダム点変異により（例えばエラーしがちなＰＣＲにより）、１コドンあたり１塩基を超える変化はまれである。よって、ほとんどの潜在的なアミノ酸変化はまれである。
【００２５】
ｉｉ）他の種類のランダムな遺伝子変化を１００ｂｐを超える領域にわたって達成することは困難である（例えば、ランダムな遺伝子欠失または挿入）。
【００２６】
２．スクリーニングできる可能性のあるルシフェラーゼ変異体の数には限りがある。
【００２７】
ｉ）欠失および挿入を無視しても、天然のルシフェラーゼの配列比較に基づけば、１０１８９を超える機能のある酵素配列が可能でありうる。
【００２８】
ｉｉ）１日につき１００，０００クローンがスクリーニングできるとすれば、同一の変異体が二度スクリーニングされることはないとみなして、すべての変異体をスクリーニングために１０１７９世紀以上かかるだろう（本発明の実際のスクリーニング速度は１日あたり５０００個以内である）。
【００２９】
３．協同的変異を必要とする機能的向上を発見する可能性はまれである（特定の協同的ペアを発見する可能性は１０８クローンあたり１クローンである）。
【００３０】
よって、熱安定性の理論的限界が公知であるとしても、非常にわずかな数の可能性のあるルシフェラーゼ変異体がスクリーニングできるだけなので、そのような熱安定性酵素を発見する推測的可能性は低かった。
【００３１】
しかし、本発明は、高い熱安定性を有する新規な甲虫ルシフェラーゼを作ることが可能であり、実施できることをここで示す。
【００３２】
ａ）最初の配列がＬｕｃＰｐｅ２とＬｕｃＰｐｅに由来する本発明の方法により作られた約２５０変異体は、この酵素のクラスの少なくとも一つのメンバーが高い熱安定性を達成することが可能で、実施できることを示す。
【００３３】
ｂ）ルシフェラーゼは同じ構造クラスに属するために、どの甲虫ルシフェラーゼも同様な手段で改良しなければならない。
【００３４】
ｉ）すべての甲虫ルシフェラーゼは同じ構造クラスに属するので、それらは潜在的に安定化している変異体の同一のプールの一部となる（この結論は、本発明のクローン中に見られる高い比率の安定化変異体が、他の甲虫ルシフェラーゼ中の「共通アミノ酸」、すなわち多数の甲虫ルシフェラーゼ配列に現れるアミノ酸への変換体である（図１９を参照）との観察により支持される）。
【００３５】
ｉｉ）同様な結果は発光甲虫Ｐｙｒｏｐｈｏｒｕｓ ｐｌａｇｉｏｐｈｔｈａｌａｍｕｓに由来する別の甲虫ルシフェラーゼ（ＬｕｃＰｐｌＹＧ）を用いて得られた。この野生型ＬｕｃＰｐｌＹＧは、野生型ＬｕｃＰｐｅ２に対して４８％の配列同一性を有する。このＬｕｃＰｐｌＧＹ変異体の熱安定性はここに記載のＬｕｃＰｐｅ２変異体よりも低いが、これは、それら変異体が少ないサイクル数の方向性進化に供されたからであろう。また、ある場合では、相対的な熱安定性をあまり重要視せずに変異体を選択した。この進化から得られた最も安定なクローン（Ｌｕｃ８０−５Ｅ５）は５０℃でおよそ３．８時間の半減期を有する。
【００３６】
有利な変異に対して予想された多数の有害なランダム変異により引き起こされる統計的な効果を補うために、アッセイ精度を最大化して、新しい置換物において前に選択された変異を再スクリーニングする方法を用いた。アッセイ精度を最大化する方法には、特殊化培地を用いて、成長速度を低下させ、熱移動を調節し、そして培養物の中間対数期増殖からのパラメーターを分析することにより培養条件を緊密に調節し、ロボットスクリーニング法での試料の混合、熱移動および蒸発を調節し；そして空間的に分散されたコントロール試料に対してデータを標準化することである。選択された変異の新しい置換物を校正用ポリメラーゼを用いるＤＮＡシャフリングの方法により作った。
【００３７】
反復法の成果を予想することの困難性は、選択されたルシフェラーゼの他の特性における一定しない成功により例示される。主に酵素の熱安定性に焦点が置かれたが、さらに明るい発光、より十分な基質の利用および長期の発光シグナルを有する変異体の選択も試みられた。それらの定義はここでの等式により与えられる。選択方法は反復法の各反復で親クローンに対する変化により決定された。その変化量はスクリーニングプロセス中に観察されたすべてであった。大腸菌におけるルシフェラーゼの発現は、Ｌｕｃ＋に比較し、ＬｕｃＰｐｅ２に対しては比較的効率が悪かった。他のルシフェラーゼは多様であった（図２１を参照）。
【００３８】
基質利用の全体的な効率を向上させるために、ルシフェリンとＡＴＰの両方に対する複合見掛け利用定数（すなわち、Ｋｍ−［ＡＴＰ＋ルシフェリン］）の減少が求められた。各利用定数の予想されない系統的な変化があったが、全体的な変化はほとんどなかった。最後に、酵素効率を実質的に減少させることなく、発光シグナルのみが適度に影響を受け得た。よって、酵素熱安定性が本発明の方法により大きく高まった一方で、酵素の他の特性はあまり影響を受けなかった。
【００３９】
図４８〜５３は変異体ルシフェラーゼの他の結果を示す。本発明の構成は天然のレベルよりも高い熱安定性を有するルシフェラーゼを包含する。各変異体ルシフェラーゼはその個々の特性が報告されていないために新規である。特定のルシフェラーゼはそれらのタンパク質と遺伝子の両者の配列により知られている。増加した高い熱安定性を有する多くの他のルシフェラーゼが単離されたが、それらの配列は知られていない。これらのルシフェラーゼは方向性進化プロセス中に同定され、それらの酵素学的特性により異なるものであることが認められた。
【００４０】
前述のルシフェラーゼ変異体のいずれよりもさらに安定なルシフェラーゼは変異体Ｌｕｃ９０−１Ｂ５と命名した。新しい熱安定性変異体をこの特別に安定なルシフェラーゼと比較した。本発明の変異体ルシフェラーゼは、２２℃（室温）から少なくとも６５℃もの範囲の温度で、顕著でこれまで実現されなかった熱安定性を示す。
【００４１】
本発明の他の特徴は熱安定性ルシフェラーゼ、特に高い熱安定性を有する甲虫ルシフェラーゼを取り入れる方法を包含する。
【００４２】
本発明のルシフェラーゼの生産
高められた熱安定性を有するルシフェラーゼの製造方法は反復変異とそれに続く選択である。本発明の高く熱安定な変異体ルシフェラーゼの実施態様は、源となるヌクレオチド配列、例えばｃＤＮＡ ＬｕｃＰｐｅ２［Ｔ２４９Ｍ］ｃＤＮＡで始まるランダム点変異の反復プロセスにより作られる。組換え変異誘発は点変異誘発とともに変異誘発法の一部である。組換え変異誘発と点変異誘発の両方を繰り返して実施する。変異プロセスは有性生殖中の遺伝子要素の組換えに類似する方法で個々の変異体の組換えを引き起こすので、このプロセスは有性ポリメラーゼ連鎖反応（ｓＰＣＲ）とも呼ばれる。例えば、１９９７年２月２５日発行のＳｔｅｍｍｅｒの米国特許第５，６０５，７９３号を参照されたい。
【００４３】
ＬｕｃＰｐｅ２ルシフェラーゼｃＤＮＡを出発点として、該遺伝子を、さらに熱安定な変異体ルシフェラーゼを生じるように変異させた。ＬｕｃＰｐｅ２配列に対する単一の点変異は、配列によりＴ２４９Ｍで示されるルシフェラーゼを生じた。この変異体はインビボでおよそＬｕｃＰｐｅ２よりもおよそ５倍明るく、さらなる変異のための鋳型として用いた。ここで記載される他の変異体ルシフェラーゼの熱安定性を測定するためのベースラインとしても用いた。
【００４４】
本発明のルシフェラーゼ配列の実施態様
図４５はＬｕｃＰｐｅ２ルシフェラーゼＴ２４９Ｍのアミノ酸配列を示す。この配列は、Ｌｅａｃｈら（１９９７年）により報告された配列から区別される、Ｔ２４９からＭの位置（下線の太字）での単一塩基対の変異を有する。このクローンは、ＬｅａｃｈのＬｕｃから黄色シフトした５５２ｎｍのスペクトル最大を有する。この変異体は、アッセイによりさらに効率的なスクリーニングを可能としたＬｅａｃｈらにより繰り返された形態よりも、インビボでおよそ５倍明るいために一部の実施例で最初の鋳型として使用するために選択された。これらの配列は太字活字の出発配列（Ｔ２４９−Ｍ）からの変化を示す。配列中の「ｘ」は配列中の不明個所を示すことに注意されたい。
【００４５】
方向性進化（Directed Evolution）、反復法（Recursive Process）
方向性進化は変異誘発により多様性を作り、所望の変化についてスクリーニングする反復法である。複数のアミノ酸の累積作用から生じる酵素学的性質について、方向性進化はこれらの性質を変える手段を提供する。この方法の各工程は典型的には酵素機能の小さな変化を作ることであるが、このプロセスの多くの繰り返しの累積効果は実質的な全体的変化を導きうる。
【００４６】
「熱安定性」という特性は、酵素構造を作りあげる多くのアミノ酸の結合作用により決まるので方向性進化の候補である。ルシフェラーゼの熱安定性を高めるために、発光量と基質結合の効率もスクリーニングした。これは、熱安定性の変化が他の重要な酵素学的性質の望ましくない変化を生じさせないことを確実にするためであった。
【００４７】
有害な変異の頻度は有用な変異よりもさらにかなり高いので、各スクリーニングにおいて本発明の精度制限内で望ましくないクローンが選択されることがあろう。これを補うために、スクリーニング戦略に最初に選択された変異物の複数の再スクリーニングを取り入れた。しかし、再スクリーニング前に、選択された変異物を「シャッフル」して、ランダムな遺伝子内組換え体のライブラリーを作った。このプロセスにより、異なるクローン間の有利な変異が数の少ない共通コード配列中へと組換えられることを可能とし、分離され省略すべき有害な変異をはずす。よって、基本的に同じ一揃いの選択された変異が再びスクリーニングされたが、それらは組換えまたはシャフリングの結果として異なる置換の下でスクリーニングされた。
【００４８】
進化プロセスの各工程の結果は定量的測定によって評価されたが、これらの測定は精製酵素ではなく細胞溶解物で行った。さらに、各工程のみで先の工程に比べた酵素性能の変化を測定したために、酵素機能の全体的な変化を判断することが困難であった。方向性進化の酵素機能に対する影響を評価するために、プロセスの最初、中間および最後からのクローン（表２）を精製し、分析した。この分析で選択されたクローンはＬｕｃ［Ｔ２４９Ｍ］、４９−７Ｃ６および７８−０Ｂ１０であった。その後のオリゴヌクレオチド特異的変異誘発およびスクリーニング戦略により作られたもう一つのクローン９０−１Ｂ５も分析のために精製した。
【００４９】
熱安定性に対する方向性進化の効果は劇的であった。親クローンがほとんど同時に不活化された高温で、その関連クローンに由来する変異酵素は数時間にわたる安定性を示した（表１）。室温でさえも、これらの変異体は親酵素よりも数倍安定である。９０−１Ｂ５のその後の分析は、この酵素が、同じ緩衝液条件下で調べられたときに最も安定で、６５℃で２７時間の半減期を有することを示した。緩衝液条件の最適化の際に、この酵素は６５℃で数時間にわたりごくわずかな活性の損失を示しただけである（クエン酸緩衝液、ｐＨ６．５； 図１Ａ）。このルシフェラーゼはｐＨ６．５でインキュベートした場合、数週間にわたり室温で安定であった（図１Ｂ）。
【００５０】
ＫａｊｉｙａｍａとＮａｋａｍｏ（１９９３）はＬｕｃｉｏｌａ ｌａｔｅｒａｌｉｓに由来するホタルルシフェラーゼがＡ２１７位でのＩ、ＬまたはＶへの単一アミノ酸の置換の存在によってさらに安定化されることを示した。この置換はアラニンからのものであった。ロイシンによる置換は、５０℃で、１時間のインキュベーション後にその活性の７０％を保持するルシフェラーゼを作った。方向性進化により作られた本発明のすべての酵素はこのＬ．ｌａｔｅｒａｌｉｓ変異体よりもさらにかなり安定である。最も安定なクローンである９０−１Ｂ５は同様な条件下（５０℃、２５ｍｏｌ／Ｌクエン酸、ｐＨ６．５、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ、５％グリセロール）での１２０時間（５日間）のインキュベーション後で７５％の活性を保持する。興味深いことに、Ｌｅａｃｈにより報告されたＬｕｃはＬ．ｌａｔｅｒａｌｉｓ変異体について記載された相同位置にイソロイシンを既に有している。
【００５１】
熱安定性は興味のある特性であるが、スクリーニングでは他の酵素学的パラメーターに基づいてクローンを選択した。さらに高い発光発現を有するクローンを選択することにより、大腸菌のコロニーでさらに高い発光強度を生む変異体が発見された。しかし、このプロセスは酵素による発光の動力学的特徴を変更する能力をほとんど示さなかった。これを示さなかったことは、定常状態発光を保つ能力が触媒機構に必須であり、この能力は多くのアミノ酸の累積効果によって容易には影響されないことを示唆する。
【００５２】
基質の結合は、ルシフェリンとＡＴＰに対する見掛け複合Ｋｍ（実施例２を参照）を測定することによりスクリーニングした。見掛け複合Ｋｍは比較的一定に保持されたが、後の分析では個々のＫｍが系統的に変化することを示した。ルシフェリンに対するＫｍが上昇した一方で、ＡＴＰに対するＫｍが低下した（表２）。この変化の理由はわかっていないが、オキシルシフェリンまたはルシフェリン阻害剤のより効率的な除去がさらに速い酵素代謝回転を導き得ることが推測できる。
【００５３】
それ自体に対するそれぞれの点変異は（多かれ少なかれ）変異体酵素の熱安定性を野生型ルシフェラーゼの熱安定性以上まで高める。個々の点変異を組み合わせる累積効果は、しばしばマグニチュード以上のオーダーで野生型よりも大きく高められた熱安定性を有する変異体ルシフェラーゼを生じる。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】本発明のルシフェラーゼの３７℃での安定性を示すグラフである。
【図２】本発明のルシフェラーゼの５０℃での安定性を示すグラフである。
【図３】本発明のルシフェラーゼの６０℃での安定性を示すグラフである。
【図４】本発明のルシフェラーゼの２２℃での安定性を示すグラフである。
【図５】変異体ルシフェラーゼ78-0B10の５０℃における発光と時間の回帰直線を示すグラフである。
【図６】変異体ルシフェラーゼ78-0B10の６０℃における発光と時間の回帰直線を示すグラフである。
【図７】変異体ルシフェラーゼ49-7C6の５０℃における発光と時間の回帰直線を示すグラフである。
【図８】変異体ルシフェラーゼ49-7C6の６０℃における発光と時間の回帰直線を示すグラフである。
【図９】変異体ルシフェラーゼ78-0B10の２２℃における発光と時間の回帰直線を示すグラフである。
【図１０】変異体ルシフェラーゼ49-7C6の２２℃における発光と時間の回帰直線を示すグラフである。
【図１１】変異体ルシフェラーゼ49-7C6の３７℃における発光と時間の回帰直線を示すグラフである。
【図１２】変異体ルシフェラーゼPPE-2の２２℃における発光と時間の回帰直線を示すグラフである。
【図１３】変異体ルシフェラーゼPPE-2の３７℃における発光と時間の回帰直線を示すグラフである。
【図１４】ルシフェラーゼをスクリーニングする方法の概略である。
【図１５】ルシフェラーゼをスクリーニングするためのロボット装置を示す図である。
【図１６】６５℃及び２２℃における発光の経時的変化を示すグラフである。
【図１７】甲虫ルシフェラーゼ間の進化的な関係を示す図である。
【図１８】甲虫ルシフェラーゼの３次元構造を表す図である。
【図１９】甲虫ルシフェラーゼの３次元構造を表す図である。
【図２０】甲虫ルシフェラーゼの３次元構造を表す図である。
【図２１】甲虫ルシフェラーゼのアミノ酸配列を示す図である。
【図２２】甲虫ルシフェラーゼのアミノ酸配列（続き）を示す図である。
【図２３】甲虫ルシフェラーゼのアミノ酸配列（続き）を示す図である。
【図２４】甲虫ルシフェラーゼのアミノ酸配列（続き）を示す図である。
【図２５】図２１〜図２５で使用されている略号の説明である。
【図２６】ベクターの構造を表す図である。
【図２７】変異体ルシフェラーゼの活性を表す図である。
【図２８】変異体ルシフェラーゼをコードするDNA分子の塩基配列を示す図である。
【図２９】変異体ルシフェラーゼをコードするDNA分子の塩基配列を示す図である。
【図３０】変異体ルシフェラーゼをコードするDNA分子の塩基配列を示す図である。
【図３１】変異体ルシフェラーゼをコードするDNA分子の塩基配列を示す図である。
【図３２】変異体ルシフェラーゼをコードするDNA分子の塩基配列を示す図である。
【図３３】変異体ルシフェラーゼのアミノ酸配列を示す図である。
【図３４】変異体ルシフェラーゼのアミノ酸配列を示す図である。
【図３５】変異体ルシフェラーゼのアミノ酸配列を示す図である。
【図３６】変異体ルシフェラーゼのアミノ酸配列を示す図である。
【図３７】変異体ルシフェラーゼのアミノ酸配列を示す図である。
【図３８】変異体ルシフェラーゼをコードするDNA分子の塩基配列を示す図である。
【図３９】変異体ルシフェラーゼをコードするDNA分子の塩基配列を示す図である。
【図４０】変異体ルシフェラーゼをコードするDNA分子の塩基配列を示す図である。
【図４１】変異体ルシフェラーゼをコードするDNA分子の塩基配列を示す図である。
【図４２】変異体ルシフェラーゼのアミノ酸配列を示す図である。
【図４３】変異体ルシフェラーゼのアミノ酸配列塩を示す図である。
【図４４】変異体ルシフェラーゼのアミノ酸配列を示す図である。
【図４５】変異体ルシフェラーゼのアミノ酸配列を示す図である。
【図４６】変異体ルシフェラーゼをコードするDNA分子の塩基配列を示す図である。
【図４７】変異体ルシフェラーゼのアミノ酸配列を示す図である。
【図４８】変異体ルシフェラーゼをコードするDNA分子の塩基配列を示す図である。
【図４９】変異体ルシフェラーゼのアミノ酸配列を示す図である。
【図５０】変異体ルシフェラーゼをコードするDNA分子の塩基配列を示す図である。
【図５１】変異体ルシフェラーゼのアミノ酸配列を示す図である。
【図５２】変異体ルシフェラーゼのアミノ酸配列を示す図である。
【図５３】変異体ルシフェラーゼをコードするDNA分子の塩基配列を示す図である。
【図５４】変異体ルシフェラーゼの６０℃における安定性を示すグラフである。
【図５５】変異体ルシフェラーゼの４℃における安定性を示すグラフである。
【図５６】変異体ルシフェラーゼの５０℃における安定性を示すグラフである。
【図５７】変異体ルシフェラーゼの５０℃における安定性を示すグラフである。
【図５８】変異体ルシフェラーゼの６０℃における安定性を示すグラフである。
【図５９】変異体ルシフェラーゼの２２℃における安定性を示すグラフである。
【実施例】
【００５５】
以下の実施例は本発明の方法と組成物およびそれらの実施態様を示す。
【００５６】
実施例１ 本発明の熱安定性ルシフェラーゼの製造
【００５７】
変異誘発方法
例示的な変異誘発法は以下の通りである。
【００５８】
「最も良い」ルシフェラーゼクローン、すなわち、向上した熱安定性を有し、他のパラメーターについては明らかな減少のない値を有するクローンから、ランダム変異誘発をエラーしがちなＰＣＲの三変法により行った。ランダム変異誘発の各サイクルから、最も良い１８クローンを選択した。ＤＮＡをこれらのクローンから調製して合計５４クローンを作った。これらのクローンは新しい遺伝的多様性を表わす。
【００５９】
これらの５４クローンを組合せて、組換え変異誘発を実施した。この集団から１８個の最も良いクローンを選択した。
【００６０】
これらの１８クローンを前の集団の１８クローンと組合せて、組換え変異誘発を実施した。このスクリーニングから、６グループの機能的性質を表わす１８クローンの新しいルシフェラーゼ集団を選択した。
【００６１】
このスクリーニングにおいて、選択された５４クローンの新しい変異は、それらが元の配列の立体配置にあってもそれらの組換え体にあっても、二回スクリーニングした。各変異を平均約１０回分析した。組換え変異誘発に用いられた９０クローンのうち、少なくとも１０クローンは最も良いクローンと機能的に同等であるようであった。よって、最も良いクローンまたはその組換え体を少なくとも１００回スクリーニングしなければならなかった。これは組換えで用いられたクローンの数よりも多いので、最も良いクローンと他のクローンとの生産的な組換えを発見するという意義深い見込みがあった。
【００６２】
ロボット処理法：
熱移動は、９６ウエルプレートがロボットの腕により配置される多くの位置において厚いアルミニウムを用いることによりロボットプロセス中で調節した。例えば、インキュベーターまたは冷蔵庫中のすべての棚が１／４インチアルミニウムから作られた。特に、室温に置かれた一つの位置は４．５×７×６．５インチの大きさのアルミニウムブロックから作った。９６ウエルプレートを高温（例えば、インキュベーター）または低温（例えば、冷蔵庫）から室温の装置に移したときに、それを温度平衡化のために大きなアルミニウムブロック上に最初に置いた。この手段により、完全なプレートは新しい温度に迅速に達し、温度の違いによるプレート中の多様なウエルの同等でない気化を最小化する。（例えば、大腸菌の一晩成長のために）インキュベーターに置かれた多量の９６ウエルプレートの熱移動を、該プレート間に１ｍｍ厚みのアルミニウムシートを置くことによって調節した。これにより多量のプレートの縁から中心までのより十分な熱移動が可能となった。ロボット法での混合は各試薬を加えた後の数秒間、該プレートをシェーカーに置くことで調節した。
【００６３】
プレートが分析される順番の概略図（図１５）および以下の働きを実施するためにプログラミングできるロボット装置については図１４を参照されたい。
【００６４】
培養希釈法。細胞を含有するプレート（蓋付き）をシェーカーに置き、３〜５分間混合する。
【００６５】
（蓋付きの）プレートを円形コンベヤーから取り出し試薬ディスペンサーに置く。１８０μｌの培地を蓋を取り除いた後に加えてピペッター近くのロケーターに置く。次にプレートをピペッターに置く。
【００６６】
シェーカー上のプレートをピペッターに置き、蓋を外してロケーターに置く。細胞をピペット操作を用いて新しいプレートに移す（「新しい細胞プレートへの細胞の希釈」を参照されたい）。
【００６７】
これらの蓋を両プレートに戻す。この新しいプレートを冷蔵庫に置き、古いプレートを円形コンベヤーに戻す。
【００６８】
発光アッセイ法。細胞を含有するプレートを円形コンベヤーから回収して、シェーカーに３〜５分間置いて細胞を十分に混合する。細胞は放置すると沈殿する傾向がある。
【００６９】
光学密度（Ｏ．Ｄ．）を測定するために、プレートをシェーカーから出してルミノメーターの近くのロケーターに移す； 蓋を外し、プレートをルミノメーターに置く。そのＯ．Ｄ．は６２０ｎｍフィルターを用いて測定する。
【００７０】
それが終わったら、次に該プレートを保存のために冷蔵庫に置く。
【００７１】
上記の工程はその後の処理に進む前にすべてのプレートについて完了する。
【００７２】
細胞溶解物を調製するために、細胞プレートを最初に冷蔵庫から回収し、シェーカーで混合して、細胞を再懸濁する。円形コンベヤーからの蓋なしの新しいプレートを試薬ディスペンサーに置き、２０μｌの緩衝液Ａを各ウエルに加える。これをピペットステーションに置く。
【００７３】
シェーカー中の細胞プレートをピペットステーションに置く。娘プレートをピペット操作を用いて調製し（「溶解プレートへの細胞のピペッティング」を参照）、細胞の娘プレートを調製する。
【００７４】
ピペッティング後、新しい娘細胞を混合のためにシェーカー上に置く。このプレートを円形コンベヤー中の元の位置に戻す。
【００７５】
混合後、溶解物プレートをＣＯ２フリーザーに置いて試料を凍結する。次に、プレートを解凍ブロックに移動させて１０分間解凍する。
【００７６】
次に、プレートを試薬ディスペンサーに移動させて１７５μｌの緩衝液Ｂを加えて、次にシェーカー上で約１５分間以上混合する。凍結／解凍の組合せと緩衝液Ｂは細胞を溶解させる。
【００７７】
円形コンベヤーからの蓋付きの新しいプレートを用いて、すべてのアッセイが得られる希釈プレートを調製する。このプレートを試薬ディスペンサーに置いて、蓋をピペッターに近いロケーターに移す。２８５μｌの緩衝液Ｃを試薬ディスペンサーにより各ウエルに加え、次にプレートをピペットステーションに置く。
【００７８】
シェーカー中の溶解物プレートをピペットステーションに移動させて、ピペット法（「溶解プレートからインキュベーションプレートへの希釈」を参照されたい）を用いる。ピペッティング後、新しい娘細胞を混合のためにシェーカーに置く。溶解物プレートは捨てる。
【００７９】
二枚の白色のアッセイプレートをプレートフィーダーから得て、これをピペッターに置く。シェーカーからのインキュベーションプレートをピペッターに置き、蓋を外して近くのロケーターに置く。二つの娘プレートをピペット法を用いて作る（「インキュベーションプレートからの一対の娘細胞の作成」を参照）。その後、蓋を親プレートに戻し、プレートを高温インキュベーターに置く。［クローンにより３１°〜約６５°までの範囲。］
一つの娘プレートをルミノメーターに置き、１×アッセイ法を用いる。アッセイ後、プレートを周囲（温度）インキュベーターに置き、第二の娘プレートをルミノメーターに置く。第二のプレートに関しては、０．０２×アッセイ法を用いる。このプレートを捨て、第一のプレートをインキュベーターからルミノメーターに戻す。繰返しアッセイ法を用いる（すなわち、試薬を注入しない）。その後、プレートを再び周囲インキュベーターに戻す。
【００８０】
上記の工程を処理に取りかかる前にすべてのプレートについて完了する。
【００８１】
第二組の測定を始めるために、高温インキュベーターからのプレートをシェーカーに置いて混合する。
【００８２】
周囲インキュベーター中のプレートをルミノメーターに戻して、繰り返しアッセイ法を再び用いる。その後、プレートを周囲インキュベーターに移す。
【００８３】
二枚の白色のアッセイプレートを再びプレートフィーダーから得て、ピペッターに置く。シェーカー上のプレートをピペッターに置き、蓋を外して近くのロケーターに置く。二つの娘プレートを再びピペット法を用いて作る（「インキュベーションプレートからの一対の娘細胞の作成）」を参照）。その後、蓋を親プレートに戻し、プレートを高温インキュベーターに置く。
【００８４】
一つの娘プレートをルミノメーターに置き、１×アッセイ法を再び用いる。アッセイ後、プレートを捨てる。次に、第二の娘プレートをルミノメーターに置き、０．０６×アッセイ法を用いる。このプレートもを捨てる。
【００８５】
上記の工程を処理に取りかかる前にすべてのプレートについて完了する。
【００８６】
最終組の測定で、高温インキュベーターからのプレートを再びシェーカーに置いて混合する。
【００８７】
周囲インキュベーター中のプレートをルミノメーターに戻し、繰り返しアッセイ法を再び用いる。その後、プレートを捨てる。
【００８８】
一枚の白色のアッセイプレートをプレートフィーダーから得て、ピペッターに置く。シェーカーからのプレートをピペッターに置き、蓋を外して近くのロケーターに置く。一つの娘プレートをピペット法を用いて作る（「インキュベーションプレートからの単一の娘細胞の作成」を参照）。蓋を親プレートに置き、プレートを捨てる。
【００８９】
娘プレートをルミノメーターに置き、１×アッセイ法を用いる。アッセイ後、プレートを捨てる。
【００９０】
緩衝液：
緩衝液Ａ：
２５ｍＭ Ｋ２ＨＰＯ４
０．５ｍＭ ＣＤＴＡ
０．１％トリトンＸ−１００
緩衝液Ｂ：
×ＣＣＬＲ（Ｐｒｏｍｅｇａ ｅ１５３ａ）
１．２５ｍｇ／ｍｌリゾチーム
０．０４％ゼラチン
緩衝液Ｃ：
１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ
１５０ｍＭ ＮａＣｌ
１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ
５％グリセロール
０．１ｍＭ ＥＤＴＡ
１×アッセイ試薬：
５μＭルシフェリン
１７５μＭ ＡＴＰ
２０ｍＭ Ｔｒｉｃｉｎｅ、ｐＨ８．０
０．１ｍＭ ＥＤＴＡ
０．０２×アッセイ試薬：
１×アッセイ試薬の１：５０希釈物
０．０６×アッセイ試薬：
１×アッセイ試薬の１：１５０希釈物
【００９１】
ピペット操作
溶解プレートへの細胞ピペッティング
固定チップを用いての非無菌操作
【００９２】
ピペッターデッキ上：
− およそ２００μｌ細胞を含有する蓋なしプレートを置く
− ２０μｌの緩衝液Ａを含有する溶解物プレート
操作：
１．チップを洗浄ステーションに移動させ、１ｍｌで洗浄する。
２．細胞プレートに移動させ、６０μｌを取る。
３．溶解物プレートに移動させ、４５μｌを分与する。
４．すべての９６試料について工程１〜３を繰り返す。
５．操作の終わりに、工程１を繰り返してチップを清浄にする。
後処理：
− 溶解物プレートをシェーカーに置く。
− 蓋を細胞を有するプレートに置き、円形コンベヤー上に置く。
− 溶解物プレートをＣＯ２フリーザー中に置く。
【００９３】
溶解プレートからインキュベーションプレートへの希釈
【００９４】
ピペッターデッキ上：
− ２４０μｌの溶解物を含有する溶解物プレート。
− ２８５μｌの緩衝液Ｃを含有する蓋なしのインキュベーションプレート
操作：
１．チップを洗浄ステーションに移動させ、０．５ｍｌで洗浄する。
２．溶解物プレートに移動させ、３０μｌを取る。
３．インキュベーションプレートに移動させ、緩衝液に直接に接触させて１５μｌを分与する。
４．すべての９６試料について工程１〜３を繰り返す。
５．操作の終わりに、工程１を繰り返してチップを清浄にする。
後処理：
− インキュベーションプレートをシェーカーに置く。
− 溶解物プレートを捨てる。
【００９５】
インキュベーションプレートからの娘プレート対の作成
この操作は２回行う。
【００９６】
ピペッターデッキ上：
− １００〜３００μｌの溶液を含む蓋なしのインキュベーションプレート
− 二つの空のアッセイプレート（白）
操作：
１．チップを洗浄ステーションに移動させ、０．５ｍｌで洗浄する。
２．インキュベーションプレートに移動させ、５０μｌを取る。
３．第一のアッセイプレートに移動させ、２０μｌを分与する。
４．第二のアッセイプレートに移動させ、２０μｌを分与する。
５．すべての９６試料について工程１〜４を繰り返す。
６．操作の終わりに、工程１を繰り返してチップを清浄にする。
後処理：
１．蓋をインキュベーションプレートに置く。
２．インキュベーションプレートをインキュベーターに置く。
３．第一のアッセイプレートをルミノメーターに置く。
４．第二のアッセイプレートを円形コンベヤー上に置く。
【００９７】
インキュベーションプレートからの単一の娘プレートの作成
【００９８】
ピペッターデッキ上：
１００〜３００μｌの溶液を含む蓋なしのインキュベーションプレートを置く
空のアッセイプレート（白）
操作：
１．チップを洗浄ステーションに移動させ、０．５ｍｌで洗浄する。
２．インキュベーションプレートに移動させ、４０μｌを取る。
３．アッセイプレートに移動させ、２０μｌを分注する。
４．すべての９６試料について工程１〜３を繰り返す。
５．操作の終わりに、工程１を繰り返してチップを清浄にする。
後処理：
− インキュベーションプレートおよびインキュベーションプレート上の蓋を捨てる。
− アッセイプレートをルミノメーターに置く。
【００９９】
新しい細胞プレートへの細胞の希釈
固定チップを用いる無菌操作
【０１００】
ピペッターデッキ上：
− およそ２００μｌの細胞を含む蓋なしプレート
− １８０μｌの成長培地を含む新しい蓋なし細胞プレート
操作：
１．細胞プレートに動かし、４５μｌを取る。
２．細胞プレートに動かし、２０μｌ容量を直接の液体／液体移動により分与する。
３．廃棄物リザーバーに動かし、過剰の細胞を排出する。
４．イソプロパノール洗浄ステーションに動かし、イソプロパノールを吸引してチップを滅菌する。
５．洗浄ステーションに動かし、イソプロパノールを排除し、チップを洗浄する。
６．すべての９６試料について工程１〜４を繰り返す。
後処理：
１．蓋を元の細胞プレートに戻し、円形コンベヤー上に置く。
【０１０１】
２．蓋を新しい細胞プレートに戻し、冷蔵庫に置く。
注意：
この操作を用いて主要分析操作で用いられる細胞プレートを調製する。
１８０μｌの成長培地を、ピペット操作を始める直前に試薬ディスペンサーによって新しい細胞プレートのそれぞれに加える。
ディスペンサーは、培地を入れる前に７５％イソプロパノールでさっと洗う。
培地は潜在的汚染を減少させるために選択的抗生物質も含有する。
【０１０２】
ルミノメーターの操作
【０１０３】
１×アッセイ法
− プレートをルミノメーターに入れる
１．１００μｌの１×アッセイ試薬を注入する
２．発光を１〜３秒間測定する
３．次のウエルに対して繰り返す
− すべてのウエルが測定されるまで続ける
【０１０４】
０．０２×アッセイ法
− プレートをルミノメーターに入れる
１．１００μｌの０．０２×アッセイ試薬を注入する
２．発光を１〜３秒間測定する
３．次のウエルに対して繰り返す
− すべてのウエルが測定されるまで続ける
【０１０５】
０．０６×アッセイ法
− プレートをルミノメーターに入れる
１．１００μｌの０．０６×アッセイ試薬を注入する
２．発光を１〜３秒間測定する
３．次のウエルに対して繰り返す
− すべてのウエルが測定されるまで続ける
【０１０６】
繰返しアッセイ
− プレートをルミノメーターに入れる
１．発光を１〜３秒間測定する
２．次のウエルに対して繰り返す
− すべてのウエルが測定されるまで続ける
【０１０７】
インビボ選択法
２枚のマイクロプレート（１７６クローン）あたり５〜７枚のニトロセルロースディスク（１枚のディスクあたり２００〜５００個のコロニー（総計１０００〜３５００個のコロニー））をスクリーニングする。これらのクローンを標準的スクリーニング条件を用いて高温でスクリーニングする。
【０１０８】
各マイクロプレート中の８つの位置が、「最も良い」ルシフェラーゼを用いる参照クローン（ランダム変異誘発およびコドン変異誘発用の親クローン）のためにとっておく。保存ウエルの位置は下記で“Ｘ”として示す。
【０１０９】
ＸooooooooooＸ
oooooooooooo
oooＸooooＸooo
oooooooooooo
oooooooooooo
oooＸooooＸooo
oooooooooooo
ＸooooooooooＸ
【０１１０】
親クローンからの形質転換ＤＮＡからのコロニーを参照ウエルに置くことにより参照クローンを作る。（マイクロプレートへの接種前にこれらのウエルを同定するために、ウエルを黒マーカーペンで各ウエルの底にマークする）。
【０１１１】
スクリーングの選択基準
以下のものを用いてスクリーニングした。基準１は手動で行う；基準２〜６に関するデータは機械による分析で作る。すべての基準に関して、記載された最大値を選択する。
【０１１２】
１．インビボスクリーニング。最も明るいクローンを高温で選択する。
【０１１３】
２．発現／比活性。標準化されたルシフェラーゼの値を光学密度に対する発光の比として計算する。その値を参照値を用いた比として報告する。
【０１１４】
３．酵素安定性。インキュベートされた試料（約１５時間にわたって取られた３試料）の標準化された発光の測定をｌｎ（Ｌ）＝ｌｎ（Ｌ０）−（ｔ／τ）（式中、Ｌは標準化された発光であり、ｔは時間である）に代入する。τは酵素安定性の尺度である。その値は参照値を用いた比率として報告し、相関係数を計算する。
【０１１５】
４．基質の結合。１×と０．００２×による標準化発光の測定値が最初の読み組で取られ、１×と０．０６×による測定値を５時間の読み組で取る。０．０２×：１×と０．０６×：１×の比率は０．０２×濃度と０．０６×濃度での相対的発光を与える。１×（すなわち、１）での相対的発光とともにこれらの値をＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋプロットの形にして、基質のＡＴＰ、ルシフェリンおよびＣｏＡに対するＫｍ：ａｐｐ，ｔｏｔａｌを得る。この値を参照値を用いた逆数の比として報告し、相関係数を計算する。
【０１１６】
５．シグナル安定性。最初の１×発光反応の発光を約１５時間にわたってさらに３回再測定する。これらの値をｌｎ（Ｌ）＝ｌｎ（Ｌ０）−（ｔ／τ）に代入し、ｔ（１５時間）にわたる積分を計算する。次に、シグナル安定性をＳ＝（１−ｉｎｔ（Ｌ）／Ｌ０ｔ）２として計算する。その値を参照値を用いた逆数の比として報告し、相関係数を計算する。
【０１１７】
６．合成適合。基準２〜５の値を組み合わせて単一の適合合成値（または商業的有用値）とする。この値は他の基準の相対的重要性の判断に基づく。この判断は下記に与えられる：
基準 相対値
安定性 ５
シグナル安定性 ２
基質の結合 ２
発現／活性 １
【０１１８】
合成、Ｃ＝合計（基準２〜５は相対値により評価された；例えば、安定性が主な目標であったので、それに対してさらに重きがおかれる。）
【０１１９】
実施例２ ソフトウエア
操作： データをＳＱＬデータベースに入れる。ルミノメーター（９６ウエル）（オーストリア、Ａｎｔｈｏｓ）により作られた各ファイルは一つのマイクロプレートからのデータを表わす。これらのファイルはルミノメーターを調節するコンピュータに保存され、ネットワークリンクによりデータベースコンピュータに連結している。試料の各マイクロプレートから、９枚のマイクロプレート（光学密度用のオリジナルのマイクロプレートと発光用の８枚の娘マイクロプレート）がルミノメーターで読まれる。
【０１２０】
合計９０ファイルが作られ、各ファイルが９６試料のデータ組を有する。各データ組は、試料番号、プレートの最初の測定に対する各測定の時間、ルミノメーターの読み、およびバックグラウンドが補正されたルミノメーターの読みを有する。他のファイルヘッダー情報も与えられる。各マイクロプレートが読まれる時間も分析のために必要とされる。これはロボットのログまたはファイル作成時間から得ることができる。ファイルの命名方法は、ＳＱＬによって認識されうるファイル作成中にロボットにより用いられる（例えば、ＹＹＭＭＤＤＰＲ．ＤＡＴ（ここでＹＹは年であり、ＭＭは月であり、ＤＤは日であり、Ｐは最初のプレート［０−９］、およびＲが読み［０−８］である））。
【０１２１】
操作： データの換算と組織化。
− 発光データを標準化する：８枚の娘プレート中の発光の各測定のために、標準化された発光を、最初のプレートの光学密度で割ることにより計算する。標準化発光の値がゼロ未満である場合、０．１ｓＬの値（ここでｓＬは標準化発光の測定用標準偏差である）を割り当てる。
【０１２２】
− 相対的測定時間を計算する：各標準化発光測定のために、測定時間を試料の最初の測定に対して計算する。例えば、プレート７の試料Ｂ６（すなわち、７：Ｂ０６）のすべての発光測定の時間を７：Ｂ０６の最初の読みに対して計算する。この時間の計算は、プレートが読まれる時間と試料がプレート中で読まれる相対的時間の両方を伴うであろう。
【０１２３】
− 酵素安定性（τ）を計算する：各試料に関して、一次回帰を用い、１×基質濃度を用いる３発光測定（プレート１、５、８）を用いてｌｎ（Ｌｌｘ）＝ｌｎ（Ｌ０）−（ｔ／τ）に代入する。回帰係数も計算する。
【０１２４】
− 基質の結合（Ｋｍ：ａｐｐ，ｔｏｔａｌ）を計算する：第一組の読みからのマイクロプレート（プレート１と２）を用いて、０．０２×の基質濃度を用いた測定値を１×の測定値で割ることによりＬ０．２ｘ，ｒｅｌを計算する。同様に、０．０６×の基質濃度を用いた測定値を１×の測定値で割ることにより、第二組の読みのマイクロプレート（プレート５と６）を用いてＬ０．０６ｘ，ｒｅｌを計算する。
【０１２５】
各試料に関して、一次回帰を用い、以下のものを用いて１／Ｌ＝（Ｋｍ：ａｐｐ，ｔｏｔａｌ／Ｌｍａｘ：ａｐｐ）（１［Ｓ］）＋（１／Ｌｍａｘ：ａｐｐ）に代入する。
Ｌ ［Ｓ］
Ｌ０．０２ｘ，ｒｅｌ ０．０２
Ｌ０．０６ｘ，ｒｅｌ ０．０６
１（Ｌｌｘ，ｒｅｌ） １
【０１２６】
Ｋｍ：ａｐｐ，ｔｏｔａｌは傾き／切片として計算する。回帰係数も計算する。
【０１２７】
− シグナル安定性（Ｓ）の計算： 各試料に関して、一次回帰を用い、１×基質濃度を用いる最初のマイクロプレートの４つの発光測定（プレート１、３、４および７）を用いてｌｎ（Ｌ）＝ｌｎ（Ｌ０）−（ｔ／τ）に代入する。回帰係数も計算する。τとＬ０の計算された値から、ｉｎｔ（Ｌ）＝τＬ０（１−ｅｘｐ（−ｔｆ／τ））（式中、ｔｆは最後の測定の平均時間（例えば１５時間）である）により発光の積分を計算する。シグナル安定性はＳ＝（１−ｉｎｔ（Ｌ）／Ｌｉｔｆ）２（式中、Ｌｉは１×基質濃度（プレート１）を用いて標準化された発光の最初の測定値である）として計算する。
［注意： 気化に対する補正のために、式Ｓ＝（１＋Ｋ−ｉｎｔ（Ｌ）／Ｌｉｔｆ）２（式中、１／Ｋ＝２（ｔｆでの液体容量の相対的変化））を用いてよい。］
【０１２８】
− 参照値面を計算する：３次元座標システムは、横座標としてマイクロプレート内の試料の格子位置を用い、縦座標として試料の計算された値（Ｌｉ、Ｋｍ：ａｐｐ，ｔｏｔａｌ τまたはＳ）を用いることにより定義できる。この三次元システムは「プレートマップ」と呼ばれる。参照レベルを表わすプレートマップ上の滑らかな面が各マイクロプレート中の８参照クローンについて決定された値の最小自乗法適合により決定できる。試料の１０個の最初のマイクロプレートのそれぞれに関して、各参照面をＬｉ、τ、Ｋｍ：ａｐｐ，ｔｏｔａｌおよびＳの基準パラメーターについて決定する（合計４０面）。
【０１２９】
最小自乗法適合において、縦座標（すなわち、基準パラメーター）は依存変数であり、横座標は独立変数である。１次面（すなわち、ｚ＝ａｘ＋ｂｙ＋ｃ）を参照クローンの値に適合させる。面を計算した後、各参照クローンの残りを計算する。これらの残りのいずれかが所与の切断範囲の外にある場合、異常な参照クローンを省略して参照面を再度計算する。
【０１３０】
一次面が参照クローンの値を十分に示さない場合、制限された二次面を用いる（すなわち、ｚ＝ａ（ｘ２＋ｋｙ２）＋ｂｘ＋ｃｙ＋ｄ（式中、ｋは定数である））。
【０１３１】
− 参照標準化値を計算する：各試料の基準パラメーターに関して、参照標準化値は各参照値を用いた比または逆数の比を計算することにより決定する。参照標準化値は、Ｌｉ／Ｌｉｒ、τ／τｒ、Ｋｍｒ／Ｋｍ：ａｐｐ，ｔｏｔａｌおよびＳｒ／Ｓ（ここで、参照値は適当な参照面の等式から計算する）である。
【０１３２】
− 合成スコアを計算する：各試料について、Ｃ＝５（τ／τｒ）＋２（Ｓｒ／Ｓ）＋２（Ｋｍｒ／Ｋｍ：ａｐｐ，ｔｏｔａｌ）＋（Ｌｉ／Ｌｉｒ）を計算する。
【０１３３】
− サブグループを決定する：基準パラメーターであるＫｉ、τ、Ｋｍ：ａｐｐ，ｔｏｔａｌ、ＳおよびＣに関して、サブグループに関する境界を定める値（すなわち、ビンサイズ）が、ｇＬ、ｇτ、ｇＫｍ、ｇＳおよびｇＣとして定義される。Ｌｉ、τまたはＣに関する最大値またはＫｍ：ａｐｐ，ｔｏｔａｌまたはＳの最小値から始めて、試料を各規準パラメーターのビンに割り当てる（最初のビンは＃１、等々である）。
− 参照標準化値の分類された表を示す：各列で以下のデータを示す各試料のデータの表を示す：
− 試料同定番号（例えば、７：Ｂ０６）
− 合成スコア（Ｃ）
− 参照標準化酵素安定性（τ／τΓ）
− 酵素安定性の相関係数
− 酵素安定性のビン数
− 参照標準化シグナル安定性（ＳΓ／Ｓ）
− シグナル安定性の相関係数
− シグナル安定性のビン数
− 参照標準化基質結合（ＫｍΓ／Ｋｍ：ａｐｐ，ｔｏｔａｌ）
− 基質結合の相関係数
− 基質結合のビン数
− 参照標準化発現／比活性（Ｌｉ／ＬｉΓ）
− 発現／比活性のビン数
この表は合成スコア（Ｃ）により分類される。
【０１３４】
操作：基準パラメーターの分類された表を示す。
各列で以下のデータを示す各試料のデータの表を示す：
− 試料同定番号
− 合成スコア（Ｃ）
− 酵素安定性（τ）
− 酵素安定性の相関係数
− 酵素安定性のビン数
− シグナル安定性（Ｓ）
− シグナル安定性の相関係数
− シグナル安定性のビン数
− 基質結合（Ｋｍ：ａｐｐ，ｔｏｔａｌ）
− 基質結合の相関係数
− 基質結合のビン数
− 発現／比活性（Ｌｉ）
− 発現／比活性のビン数
【０１３５】
この表は合成スコア（Ｃ）により分類される；参照クローンは表から除外する。上記のように標準偏差による同じエントリーコード。
【０１３６】
操作：参照標準化値の分類された表を示す。
これはデータ換算操作の最終工程と同じ操作である。この表は以下のものを示す：
− 試料同定番号
− 合成スコア（Ｃ）
− 参照標準化酵素安定性（τ／τΓ）
− 酵素安定性の相関係数
− 酵素安定性のビン数
− 参照標準化シグナル安定性（ＳΓ／Ｓ）
− シグナル安定性の相関係数
− シグナル安定性のビン数
− 参照標準化基質結合（ＫｍΓ／Ｋｍ：ａｐｐ，ｔｏｔａｌ）
− 基質結合の相関係数
− 基質結合のビン数
− 参照標準化発現／比活性（Ｌｉ／ＬｉΓ）
− 発現／比活性のビン数
【０１３７】
この表は合成スコア（Ｃ）により分類される； 参照クローンは表から除外する。上記のように標準偏差による同じエントリーコード。
【０１３８】
操作：参照クローンの基準パラメーターの分類された表を示す。
これは、参照クローンのみを除けば、基準パラメーターについて上記した操作と同じである。この表は以下のものを示す：
− 試料同定番号
− 合成スコア（Ｃ）
− 酵素安定性（τ）
− 酵素安定性の相関係数
− 酵素安定性のビン数
− シグナル安定性（Ｓ）
− シグナル安定性の相関係数
− シグナル安定性のビン数
− 基質結合（Ｋｍ：ａｐｐ，ｔｏｔａｌ）
− 基質結合の相関係数
− 基質結合のビン数
− 発現／比活性（Ｌｉ）
− 発現／比活性のビン数
【０１３９】
表は合成スコア（Ｃ）により分類される。上記のように標準偏差による同じエントリーコード。
【０１４０】
操作：参照標準化値の分類された表を示す。
これは、参照クローンのみを除いて標準化値について上記した操作と同じである。この表は下記のものを示す：
− 試料同定番号
− 合成スコア（Ｃ）
− 参照標準化酵素安定性（τ／τΓ）
− 酵素安定性の相関係数
− 酵素安定性のビン数
− 参照標準化シグナル安定性（ＳΓ／Ｓ）
− シグナル安定性の相関係数
− シグナル安定性のビン数
− 参照標準化基質結合（ＫｍΓ／Ｋｍ：ａｐｐ，ｔｏｔａｌ）
− 基質結合の相関係数
− 基質結合のビン数
− 参照標準化発現／比活性（Ｌｉ／ＬｉΓ）
− 発現／比活性のビン数
【０１４１】
表は合成スコア（Ｃ）により分類される。上記のように標準偏差による同じエントリーコード。
【０１４２】
操作：表を分類する。
どの表も一次キーおよび二次キーにより分類してよい。
【０１４３】
操作：表のヒストグラムを示す。
どの表に関しても、ビン数に対する基準パラメーターのヒストグラムをいずれの基準パラメーターに関して示してもよい。
【０１４４】
操作：プレートマップを示す。
どのプレートに関しても、下記の選択を示すプレートを示してよい：
− 発光または光学密度の測定
− Ｌｉ
− Ｌｉ参照面
− Ｌｉ／Ｌｉｒ
− τ
− τ参照面
− τ／τｒ
− τの相関係数
− Ｓ
− Ｓ参照面
− Ｓｒ／Ｓ
− Ｓの相関係数
− Ｋｍ：ａｐｐ，ｔｏｔａｌ
− Ｋｍ参照面
− Ｋｍｒ／Ｋｍ：ａｐｐ，ｔｏｔａｌ
− Ｋｍ：ａｐｐ，ｔｏｔａｌに関する相関係数
− 合成スコア（Ｃ）
【０１４５】
プレートマップは三次元の棒チャートとして示す。好ましくは、参照クローンを示す棒は色または幾つかの他の手段で示す。
【０１４６】
操作：各エントリーのドリルダウン要約を示す。
Ｌｉ、τ、Ｋｍ：ａｐｐ，ｔｏｔａｌおよびＳに関して、表中のエントリー値を選択して、計算値の基礎となる発光および光学密度の読み、および適当であれば曲線適合のグラフ的表現を示す。好ましくは、関係する等式および最終結果および相関係数も示されよう。
【０１４７】
− ＬｉまたはＬｉ／Ｌｒ。プレート０およびプレート１中の選択された試料からの光学密度および発光値を示す。
【０１４８】
− τまたはτ／τｒ。プレート０、プレート１、プレート５およびプレート８中の選択された試料からの光学密度または発光値を示す。データポイントおよび最も良いラインを示すｌｎ（Ｌ１×）対ｔのグラフを示す。
【０１４９】
−ＳまたはＳｒ／Ｓ。プレート０、プレート１、プレート３、プレート４およびプレート７中の選択された試料からの光学密度または発光値を示す。データポイントおよび最も良いラインを示すｌｎ（Ｌ）対ｔのグラフを示す。
【０１５０】
− Ｋｍ：ａｐｐ，ｔｏｔａｌまたはＫｍｒ／Ｋｍ：ａｐｐ，ｔｏｔａｌ。プレート０、プレート１、プレート２、プレート５およびプレート６中の選択された試料からの光学密度または発光値を示す。データポイントおよび最も良いラインを示す１／Ｌ対１／［Ｓ］のグラフを示す。
【０１５１】
実施例３ 新規なルシフェラーゼの調製
図１の遺伝子は２４９位に単一の塩基対変異（ＴからＭ）を有する。このクローンはＬｕｃの配列から黄色シフトした５５２ｎｍにスペクトル最大を有する。この変異体はインビボで約５倍明るく、より効率的なスクリーニングを可能としたのでオリジナルの鋳型として選択した。
【０１５２】
Ｃ末端の変異誘発
パーオキシゾームの標的シグナル（−ＳＫＬ）を除去するために、ＬをＳＴＯＰに変異させて、そのすぐ上流の３コドンをここに記載のオリゴヌクレオチド変異誘発法にしたがってランダム化した。これを達成するために設計された変異誘発オリゴヌクレオチドも独自のＳｐｅＩ部位を導入して、配列決定することなしに変異体の同定を可能とする。変異体はインビボでスクリーニングし、１３コロニーをピックアップし、そのうち１２コロニーがＳｐｅＩ部位を有した。
【０１５３】
Ｎ末端の変異誘発
発現が向上しうるかどうかを調べるために、開始のＭｅｔからすぐ下流の３コドンをここに記載のようにランダム化した。これを達成するように設計された変異誘発オリゴも独自のＡｐａＩ部位を導入して、配列決定することなしに変異体の同定を可能とする。７つのクローンが選択され、単離されたプラスミドのうち６個が変異体であることが確認された。
【０１５４】
ＣおよびＮ末端変異体のシャフリング
ＣおよびＮ末端変異誘発を並べて行った。ＮおよびＣ末端変異物を組み合わせるために、各変異誘発実験からの選択されたクローンをここに記載の組換え変異誘発法による組換え変異誘発の利用を用いて組み合わせた。シャッフルされた変異体をａｍｐＳ ｐＲＡＭ骨格中にサブクローニングして、ＤＨ５ Ｆ’ＩＱにてスクリーニングした［ＢＲＬ、Ｈａｎａｈａｎ、１９８５］。合計２４クローンがピックアップされ、わずかに４クローンのみがＮ末端とＣ末端の変異を有した。これらの４クローンを、遺伝子のシステイン位置のランダム化のための鋳型として用いた。
【０１５５】
システイン位置をランダム化するための変異誘発／Ｌｕｃ遺伝子のランダム変異誘発と組換え変異誘発
Ｐｐｅ−２遺伝子には７つのシステイン位置が存在する。これらの位置はタンパク質の脱安定化を引き起こし得る酸化を受け易い。７個のオリゴヌクレオチドがシステイン位置をランダム化するために作られた。
【０１５６】
これらのオリゴヌクレオチドを、異なるファミリーに由来する他のルシフェラーゼ遺伝子中のシステインの保存に基づき二つのグループにまとめた。グループ１は保存されたシステイン位置のＣ−６０、Ｃ−８０およびＣ−１６２をランダム化した。グループ２は、Ｃ−３８、Ｃ−１２７、Ｃ−２２１およびＣ−２５７の位置で厳密には保存されていないシステインをランダム化する。
【０１５７】
Ｎ末端とＣ末端の変異誘発からの４つの選択した鋳型をアンピシリン感受性骨格中にサブクローニングし、一本鎖ＤＮＡを鋳型のそれぞれについて調製した。これらの鋳型を等量で組合せ、オリゴヌクレオチド変異誘発をここに記載のように成し遂げた。２グループのそれぞれが２×１０４個の独立形質転換体を有することが一晩のインキュベーション前にｍｕｔＳ形質転換のアリコートを塗布することにより決定された。ＭｕｔＳ−ＤＮＡは２グループについて調製され、これを用いてＪＭ１０９細胞を形質転換して、スクリーニングした。グループ１からの変異体をインビボでスクリーニングして、収穫物を全ロボット実験のために作った。向上した特性を有した５クローンが選択された。グループ２からの変異体をインビボでスクリーニングし、収穫物を全ロボット実験のために作った。ロボットの温度インキュベーターはこの組の実験のために３３℃に設定した。向上した特性を有した１０クローンが選択された。
【０１５８】
システイン変異誘発実験の両グループからの１５個の最も良い収穫物をここに記載にようにシャッフルし、最も良いクローンの１８個をロボットプロセスの後に選択した。
【０１５９】
上記の実験（３１−１Ｇ８）からの最も良いクローンをその後の変異誘発の繰り返しの鋳型として選択した。（高温ロボットインキュベータ温度は４２℃に設定した）。もう一つの変異誘発の完全な繰り返しを完了した。
【０１６０】
上記の変異誘発からの１８個の最も良いクローンを採取し、クローン（３９−５Ｂ１０）を最も良いクローンとして選択し、もう一つの変異誘発の繰り返しの鋳型として用いた。（この高温ロボットインキュベーター温度は４９℃に設定した）。
【０１６１】
このサイクル後、最も良いクローンのうち６個を配列決定のために選択した。配列データに基づいて、９つの位置をランダム化のために選択し、７つのオリゴをこれらの位置をカバーするように設計した。ロボットから作られたデータに基づいて、配列決定した６クローンのグループからの最も良いクローンがクローン（４９−７Ｃ６）であることが決定された。このクローンからのルシフェラーゼ遺伝子をアンピシリン感受性ｐＲＡＭ骨格中にサブクローニングし、一本鎖ＤＮＡを調製した。選択された位置のランダム化は上記のオリゴヌクレオチド変異誘発操作にしたがって達成した。
【０１６２】
ランダム化用オリゴを４グループに分け、これらの実験からの形質転換体を採取し、二つのロボット実験を達成した。１０個のクローンをこれらの二実験から選択した。（ロボットの高温ロボットインキュベーターは５６℃に設定した）。
【０１６３】
上記の２実験からの最も良い１０収穫物およびクローンの以前の集団からの最も良い１８収穫物をともにシャッフルした（組換え変異誘発法）。
【０１６４】
最も良い１８個のクローンを選択し、クローン５８−０Ａ５が最も良いクローンであると決定された。次に、このクローンをもう一つの変異誘発の繰り返し用の鋳型として用いた。高温ロボットインキュベーター温度を５６℃に設定した。クローン７１−５０４を新しい模範クローンとして選択し、もう一つの変異誘発の繰り返しを達成した。インキュベーターは６０℃に設定した。
【０１６５】
最も良い１８収穫物を選択し、このグループからの最も良いクローンがクローン７８−０Ｂ１０であると決定された。多様な温度でのクローンの温度安定性を図に示す。
【０１６６】
実施例４ クローン７８−０Ｂ１０から９０−１Ｂ５までの変異誘発方法
１．２８個の位置を共通位置に変えるように２３個のオリゴ（オリゴヌクレオチド）を作った。すべてのオリゴを、鋳型としてクローンｌｕｃ７８−０Ｂ１０からの一本鎖ＤＮＡによるオリゴ特異的変異誘発を用いて個々に調べてどのオリゴが安定性の向上をもたらすかを決定した。変異誘発オリゴを示す表を下記に示す。
【０１６７】
【表１】
＊オリゴ＃６２３４は共通位置を変えないことに注意されたい。このオリゴは２４９位の野生型ＰＰＥ−２コドンへ復帰を引き起こす。この位置の復帰は熱安定性を高めることが示されたが、この位置の復帰は光産出を減少させた。
【０１６８】
２．クローンｌｕｃ７８−０Ｂ１０を鋳型として用いるオリゴヌクレオチド特異的変異誘発：
上記の変異誘発オリゴヌクレオチドを個々に調べた結果に基づいて、３実験を完了し、これらの実験のオリゴを次のように分けた：
ａ．（高められた安定性を与えることが分かった）６２１５、６２３４、６２３６、６２４８
ｂ．（中間または高められた安定性を有することが分かった）
２１５、６２１７、６２１８、６２１９、６２２０、６２２１、６２２２、６２３１、６２３３、６２３４、６２３６、６２３８、６２４７、６２４８、６２４９、６２５１、６２５３。
ｃ．すべての２３オリゴ。
【０１６９】
３．上記の３実験からの選択物をロボットスクリーニング操作によりスクリーニングした（実験８４）。（ｌｕｃ７８−０Ｂ１０をコントロールとして用いた）。
【０１７０】
４．実験８４からの選択物を、組換え変異誘発操作を用いて組換え、次にロボットスクリーニング操作を用いてスクリーニングした（実験８５）。
【０１７１】
５．一本鎖のＤＮＡをｌｕｃ８５−３Ｅ１２、ｌｕｃ８５−４Ｆ１２、ｌｕｃ８５−５Ａ４の３つのクローンから調製した。これらのクローンをオリゴヌクレオチド特異的変異誘発用の鋳型として用いてコドンの利用を向上させた。Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｖｏｌ．１８（増刊号）１９９０、ｐ．２４０２で発表されたコドンの利用に基づいて位置を選択した。下記の表は大腸菌でコドンの利用を向上させるために用いられたオリゴを示す。
【０１７２】
【表２】
【０１７３】
６．最初の実験において、実験８５からの上記の３鋳型を組み合わせて、オリゴヌクレオチド特異的変異誘発用の鋳型として用いた。これらすべてのオリゴを一つの実験で組み合わせて、オリゴヌクレオチド特異的変異誘発から得られたクローンを実験８８と同じロボットスクリーニング操作を用いてスクリーニングした。この実験から得られた発光コロニーは比率が低かったので、これらオリゴヌクレオチドを下記のグループで組み合わせたもう一つのオリゴヌクレオチド特異的変異誘発実験を成し遂げた。
ａ．６２５８、６２７３、６２８０、６２８６
ｂ．６２５９、６２７４、６２８１、６２９３
ｃ．６２６０、６２７５、６２８２、６２９４
ｄ．６２６１、６２７６、６２８３、６３０５
ｅ．６２６２、６２７７、６２８４、９３０６
ｆ．６２６３、６２７９、６２８５
【０１７４】
７．グループｂからの試料は低い量の発光コロニーを有したことがわかり、グループｂのオリゴの一つが問題を引き起こしていると仮定された。実験ｂ除くすべての実験から選択物を作った。次に、試料をロボットスクリーニング操作により実験した（実験８９）。
【０１７５】
８．実験８８と実験８９からの選択物を組換え変異誘発法によりシャッフルして、次にロボットスクリーニング操作によりスクリーニングした（実験９０）。
【０１７６】
材料と方法
Ａ．変異誘発法
ここで開示される変異ルシフェラーゼは、ランダム変異誘発およびそれに続くコードされたルシフェラーゼ遺伝子産物の光産出や熱安定性等の複数の特性についての変異遺伝子のインビボスクリーニングにより作られた。この変異誘発は通常３工程方法にしたがって達成された。
【０１７７】
１．ランダム変異誘発による遺伝的多様性の創出。ここで、Ｌｕｃ等の出発配列のエラーしがちなＰＣＲを用いてヌクレオチド配列中に点変異を作った。エラーしがちなＰＣＲはＤＮＡ配列中にほとんど単一点変異のみを作るので、１ヌクレオチド変異あたり理論的最大の７アミノ酸変化が可能である。しかし、実際は、１ヌクレオチドあたりおよそ６．１アミノ酸変化が達成できる。ルシフェラーゼの５５０個のアミノ酸に関しておよそ３３００変異体が点変異誘発により可能である。
【０１７８】
２．組換え変異誘発による単一点変異の強化。最初の変異誘発により作られる遺伝的多様性をｓＰＣＲによる少数のクローン中に組換える。このプロセスは変異体クローンの数を減少させるのみならず、変異誘発の速度が高いので、陰性変異につながる確率は顕著である。組換え変異誘発は陽性変異を陰性変異から離す。これらの変異は組換え変異誘発により新しい遺伝子に「再結合」されて新しい配置を生む。次に、組換え変異体のスクリーニング後に、「陰性変異」を有する遺伝子配置を選択しないことにより除去する。組換え変異誘発はエラーしがちなＰＣＲにより作られた最初の変異体の第二スクリーニングとしても役立つ。
【０１７９】
３．選択されたコドンのランダム変異誘発による遺伝的多様性の拡大。ランダムな点変異誘発は限定された数のアミノ酸置換を達成できるにすぎないので、選択されたコドンの完全ランダム化はオリゴヌクレオチド変異誘発により達成する。所与の有利な置換について、同じ位置のそれに代わる他のアミノ酸置換がさらに高い有利性を生じさせるとの仮定に基づく先立つ変異誘発法の結果から、変異すべきコドンを選択する。変異すべき位置は選択されたクローンのＤＮＡ配列決定により同定する。
【０１８０】
Ｂ．最初の変異誘発実験
発現を最適化し、パーオキシゾームの標的配列を除去するために、出発配列のＮ末端とＣ末端の両方をオリゴヌクレオチド特異的変異誘発により修飾した。Ｎ末端において、開始コドンの下流の９塩基をＣ末端においてランダム化し、終止コドンの上流の９塩基をランダム化した。変異体はインビボスクリーニングを用いて分析して、結果として発現に顕著な変化はなかった。
【０１８１】
このスクリーニングからの６クローンをプールし、７個のシステインのコドンを変異させるために用いた。これらのコドンはオリゴヌクレオチド特異的変異誘発を用いてランダム化し、変異体をロボットスクリーニング操作を用いてスクリーニングした。このスクリーニングから、１５クローンが方向性進化のために選択された。
【０１８２】
Ｃ．クローンの生産と試験
幾つかの非常に強力で広く知られた手法を用いて本発明のクローンを作成し、調べる。特に記載がなければ、これらの実験室的な操作は当業者によく知られているものである。熟練実施者によく知られているように、Ｍｕｌｌｉｓにより創案されたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および標準的ＰＣＲ法の多様な改良法（エラーしがちなＰＣＲ、ｓＰＣＲ等）、どの方法によってもよいＤＮＡ配列決定法（ＳａｎｇｅｒまたはＭａｘｘａｍとＧｉｌｂｅｒｔの方法）、どの方法によってもよいアミノ酸配列決定法（例えば、Ｅｄｍａｎ分解）、それにポリヌクレオチドおよびポリペプチド／タンパク質の電気泳動による分離が特に挙げられる。
【０１８３】
Ｄ．ベクターの設計
変異誘発操作に用いられる好ましいベクター（ｐＲＡＭ）は、変異誘発技法を効率的に働かせることのできる幾つかの独自の特徴を有する：
ｐＲＡＭベクターは、単一鎖ＤＮＡの生産に必要な繊維ファージ起源のｆｌを有する。
【０１８４】
二つのＳｆｉＩ部位が遺伝子を挟んでいる。これらの部位は、サブクローニングすべき遺伝子が適当な向きでのみ挿入できるように設計された。
【０１８５】
ベクターはｔａｃプロモーターを有する。
【０１８６】
オリゴヌクレオチド変異誘発に用いられる鋳型は、ベクターをアンピシリン感受性にするｂｌａ遺伝子中の４塩基対の欠失を有する。このオリゴヌクレオチド変異誘発操作は、変異体オリゴヌクレオチドならびにｂｌａ遺伝子に対する機能を回復させるアンピシリン修復オリゴヌクレオチドを用いる。これにより高い比率の変異体の選択を可能とする。（選択を用いない場合、高い比率の変異体を得ることは困難である。）
【０１８７】
Ｅ．ルシフェラーゼの使用
本発明の変異体ルシフェラーゼは、下記のものを含めて、既に公知のルシフェラーゼが使用された適用における使用に適する：
ＡＴＰアッセイ。より高い酵素安定性は、ＡＴＰを欠失させるために設計された試薬が高温（例えば、室温）でさらに大きい保存寿命と操作寿命を有することを意味する。従って、高められた熱安定性を有するルシフェラーゼを用いるＡＴＰの検出方法は新規であり、有用である。
【０１８８】
核酸、タンパク質または他の分子用の発光標識。
ＡＴＰアッセイに対する本発明のルシフェラーゼの利点と同じく、それらの高い保存寿命と操作寿命は発光標識の信頼性と再現性に対して有利である。これは、ハイブリゼーション温度が比較的高く（例えば、４０℃以上）なりうるハイブリゼーション操作における核酸の標識に特に有利である。従って、本発明のルシフェラーゼを用いる核酸、タンパク質または他の分子の標識法は新規であり、有用である。
【０１８９】
遺伝子レポーター。レポーターの検出がもう一つの遺伝子の存在または興味のあるプロセスを知るために用いられる、遺伝子レポーターとしてのルシフェラーゼの広汎な利用において、ルシフェラーゼの高められた熱安定性は、生きた細胞と無細胞翻訳と転写／翻訳システムでの発現の温度に対する少ない依存性を提供する。従って、本発明のルシフェラーゼを遺伝子レポーターとして用いる方法は新規であり、有用である。
【０１９０】
酵素の固定化。物理的表面に非常に近接した酵素は該表面との相互作用により変性しうる。強い局所的な発光を提供するために表面へのルシフェラーゼの高密度固定化は高安定性ルシフェラーゼを用いることにより向上する。従って、本発明のルシフェラーゼを用いる固体表面上へのルシフェラーゼの固定化法は新規であり、有用である。
【０１９１】
ハイブリッドタンパク質。ルシフェラーゼをコードする、他の遺伝子との遺伝子融合遺伝子により、または他の化学的結合法により作られたハイブリッドタンパク質はより長い保存寿命と操作寿命を持つので有利である。従って、本発明のルシフェラーゼを用いる遺伝子的手段または化学的結合によるハイブリッドタンパク質の製造方法は新規であり、有用である。
【０１９２】
高温反応。ルシフェラーゼ反応の光強度はルシフェラーゼが変性し始めるまで温度とともに増加する。熱安定性ルシフェラーゼの使用はより高い反応温度での使用を可能とするので、本発明のルシフェラーゼは高温反応を実施するために新規であり、有用である。
【０１９３】
発光溶液。発光は、教育、展示および娯楽目的等の多くの一般的な用途を有する。これらの適用はさらに長い保存寿命および操作寿命を有する酵素を有することから利点が得られる。従って、本発明のルシフェラーゼを用いる発光溶液の製造方法は新規であり、有用である。
【０１９４】
Ｆ．ホタルルシフェラーゼ
方向性進化のために選択されたホタルルシフェラーゼ遺伝子はＰｈｏｔｕｒｉｓ ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉｃａから単離されたＬｕｃであった。このルシフェラーゼはＷｏｏｄらによりメリーランド州で集められたホタルからクローニングされ、後にオクラホマ州で集められたホタルを用いてＬｅａｃｈ博士により独立にクローニングされた（Ｙｅら）（１９７７）。このルシフェラーゼの変異体（Ｔ２４９Ｍ）はＷｏｏｄらにより作られ、本発明で用いられたのは、それが大腸菌で発現されたときにおよそ５倍の光を作ったからである。
【０１９５】
進化法の概観：方向性進化は、各工程が１）ホタルルシフェラーゼの変異ライブラリーの作成およびそれに続く２）所望の複数の酵素学的特性を有する新しい変異体クローンを同定するためのライブラリーのスクリーニングからなる反復方法によりなされた。
【０１９６】
この方法を始めるために、エラーしがちなＰＣＲ（Ｆｒｏｍａｎｔら、１９９５）を用いて３つの変異ライブラリーを作った。各ライブラリーは最初に大腸菌コロニー中の発光の肉眼での評価により（ＷｏｏｄおよびＤｅ Ｌｕｃａ、１９８７）、そして次に大腸菌細胞溶解物中の酵素学的性質の定量的測定によりスクリーニングした。およそ１０，０００個のコロニーを肉眼でのスクリーニングで調べ、それより７０４個を定量的分析のために選択した。それぞれの定量的スクリーニングから１８個のクローンを選択した。
【０１９７】
３組の１８クローンをそれぞれ一緒にプールし、新しい変異ライブラリーをＤＮＡシャフリングを用いて作り、遺伝子内組換えを行った（ｓＰＣＲ； Ｓｔｅｍｍｅｒ、１９９４）。その結果得られたものをスクリーニングしてもう一組の１８クローンを得た。この組の１８クローンを、その前の繰り返しの進化からの１８クローンと組合せて、もう一つの変異ライブラリーをＤＮＡシャフリングにより作り、前と同じようにスクリーニングすることにより全プロセスを達成した。
【０１９８】
スクリーニング法：定性的な肉眼でのスクリーニングにおいて、コロニーを、比較的明るい発光を保持する能力に関してのみ選択した。大腸菌のコロニー内のルシフェラーゼの熱安定性を、スクリーニングの温度を高めることにより連続的な繰り返しの進化により前進的に刺激した。選択されたコロニーは各々が２００μｌの成長培地を含有する９６ウエルプレートのウエルに接種した。
【０１９９】
定量的スクリーニングにおいて、大腸菌培地の溶解物を１）発光活性、２）酵素安定性、３）保持された酵素代謝回転、および４）基質の結合について調べた。
【０２００】
「発光活性」は、細胞培養物の光学的密度に対する発光強度の比として測定した。
【０２０１】
「酵素安定性」は１０時間にわたる細胞溶解物からの活性損失の速度により測定した。進化の連続的な繰り返しにおいて、溶解物のインキュベーション温度を高めた。
【０２０２】
「保持された酵素代謝回転」は室温で１０時間にわたるシグナル酵素反応の発光の損失速度により決定した。「基質の結合」は希釈基質混合物でアッセイしたときの溶解物の相対的活性により測定した。これらの４種類のパラメーターのうち、選択に対して最も高い優先性を熱安定性に置いた。
【０２０３】
ロボット自動化。ロボット自動化を、培養細胞に対する必要とされた多数の定量的アッセイを正確に実施するための定量的スクリーニングに用いた。一晩培養物を最初に新しい培地中に希釈して、３時間生育させて中間対数期増殖の培養物を作った。次に、各培養物の光学密度を測定し、培養物の一部を凍結／溶解およびリゾチームにより溶解した。さらに、得られた溶解物を分析前に希釈して、高温でインキュベートした。多様な時間で取った希釈溶解物の一部からの発光を測定し、分析方法で規定された多様な条件下に測定した（実施例２を参照）。このデータのコンピュータ分析により上記の定量的選択基準を得た。
【０２０４】
進歩的発達の要約：ＮおよびＣ末端の変異誘発とシステインコドンのランダム化後に、１５クローンのプールをここに記載の２回の繰返し方向性進化に供した。この方法から得られた１８クローンのうち５個の配列決定を行って変異を同定した。これらのうち４９−７Ｃ６と命名された１クローンをさらに詳細な分析とさらなる変異誘発のために選択した。このクローンはルシフェラーゼＬｕｃ［Ｔ２４９Ｍ］と比較して１０個の新しいアミノ酸置換を有した。
【０２０５】
これらの置換の部位における他のアミノ酸置換に対する潜在性を評価するために、オリゴヌクレオチド特異的変異誘発を用いてこれらのコドンをランダム化した。得られたクローンをここに記載のようにスクリーニングし、１８個の選択されたクローンを用いて、２回の新しい繰り返しの方向性進化を開始した。この繰り返しの第二組から得られた１８クローンのうち、７８−０Ｂ１０と命名されたクローンをさらなる研究と変異誘発のために選択した。このクローンはＬｕｃ［Ｔ２４９Ｍ］と比較して１６個の新しいアミノ酸置換を有するルシフェラーゼをコードした。
【０２０６】
鋳型として７８−０Ｂ１０を用いるオリゴヌクレオチド特異的変異誘発を用いて、甲虫ルシフェラーゼ間で既に知られている共通アミノ酸に置換するためにコドンを選択した。この変異実験からの選択物を互いにシャッフルして、次に、最も安定であると決定された３クローンを、大腸菌においてコドン利用を向上させるためのオリゴヌクレオチド変異誘発用の鋳型として用いた。この実験から選択された９０−１Ｂ５と命名されたクローンはＬｕｃ［Ｔ２４９Ｍ］に比較して２８個のアミノ酸置換を有した。共通アミノ酸への変化のために選択された２５クローンのうち、１１個を９０−１Ｂ５と命名されたクローン中で置換した。向上したコドン利用のために選択された３０個の位置のうちわずかに５個が置換され、酵素発現に対する効果をほとんど持たなかった。
【０２０７】
タンパク質の精製。ここに記載された４種類の変異体（Ｌｕｃ［Ｔ２４９Ｍ］、４９−７Ｃ６、７８−０Ｂ１０および９０−１Ｂ５）を既に発表された方法を用いて精製した（Ｈａｓｔｉｎｇｓら、１９９６）。
【０２０８】
酵素学的な特性付け。精製されたタンパク質を２５ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．８、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ、１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡで希釈した。酵素の安定性は異なる温度でインキュベートされた希釈タンパク質から決定し、そのアリコートを異なる時点で取った。発光と時間の自然対数の一次回帰を計算した。半減期は回帰のｌｎ（０．５）／傾きとして計算した。
【０２０９】
Ｅ．ＰＣＲ変異誘発法（ランダム変異誘発）：
ＰＣＲ変異誘発反応
１．対象の遺伝子を有するベクターからプラスミドＤＮＡを調製し、ゲルからＤＮＡ濃度を予想する。
【０２１０】
２．一グループあたり二つの５０μｌ反応物を設定する：
異なる勾配ヌクレオチド濃度を用いた３グループの変異誘発条件がある。
【０２１１】
ここに挙げられた条件は、それぞれの作られた親クローンについて表現型のサブクローニングの後に８〜１０％の範囲の野生型Ｌｕｃコロニーを作る。変異誘発速度は変異誘発後に存在する発光コロニーの数により予想する。８〜１０％の範囲で変異させたクローンの結果に基づいて、このレベルの変異誘発速度が１遺伝子あたり平均約２〜３アミノ酸変化を作ることが決定された。変異誘発が１遺伝子あたり平均して１アミノ酸変化が存在するように選択される場合、平均して５０％のクローンは変異を有さないだろう。（Ｂｏｗｉｅら、１９９０）。
【０２１２】
マスター混合物について：ポリメラーゼ以外のすべての混合物を加え、攪拌し、短時間回転させ、ポリメラーゼを加え、静かに混合する。
【０２１３】
【表３】
＊Ｔａｑ．ポリメラーゼはＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒより購入した（Ｎ８０８−０１０１）。
【０２１４】
１０×Ｔａｑポリメラーゼ緩衝液（Ｔａｑのアリコートを１．５ｍｌチューブに入れて−７０℃で保存する）：
− １Ｍ保存液からの１００ｍＭトリス塩酸、ｐＨ８．４
− ５００ｍＭ ＫＣｌ
プライマーを１ｎｍｏｌ／μｌ保存液から２０ｐｍｏｌ／μｌ実施保存液まで希釈する。
ｐＲＡＭｔａｉｌｕｐ： ５’−ｇｔａｃｔｇａｇａｃｇａｃｇｃｃａｇｃｃｃａａｇｃｔｔａｇｇｃｃｔｇａｇｔｇ−３’
ｐＲＡＭｔａｉｌｄｎ： ５’−ｇｇｃａｔｇａｇｃｇｔｇａａｃｔｇａｃｔｇａａｃｔａｇｃｇｇｃｃｇｃｃｇａｇ−３’
°ＭｎＣｌ２とＭｇＣｌ２は１Ｍ保存液から新しく作る。保存液をろ過滅菌し、滅菌水と混合して１０ｍＭと２５ｍＭの保存溶液を作り、これらをポリスチレンＮａｌｇｅｎｅコンテナー中に４℃で保存する。
熱サイクラーでサイクリングを行う：９４℃で１分間（９４℃／１分間、７２℃／１０分間）１０×。
【０２１５】
３．反応生成物をＷｉｚａｒｄ ＰＣＲ精製キット（Ｐｒｏｍｅｇａ社、マジソン、ウイスコンシン州、ｐａｒｔ＃Ａ７１８ｃ）で精製する：
− ＰＣＲ反応物を、Ｐｒｏｍｅｇａ １００μｌ Ｄｉｒｅｃｔ精製緩衝液（Ｐａｒｔ＃Ａ７２４ａ）を含有する新しいチューブに移す
− １ｍｌのＷｉｚａｒｄ ＰＣＲ精製樹脂（ｐａｒｔ＃Ａ７１８ｃ）Ｐｒｏｍｅｇａを加え、室温で１分間インキュベートする
− 樹脂をＷｉｚａｒｄミニカラムを通して引く
− ８０％エタノールで洗浄する
− マイクロ遠心管中で回転させて過剰のエタノールを除去する
− ５０μｌ滅菌ナノ純水中に溶出させる（水を少なくとも１分間カラムに保つ）
【０２１６】
変異誘発反応の増幅１
１．１グループあたり５つの５０ｍｌ反応物を設定する：
− マスター混合物に対して： ポリメラーゼ以外のすべての混合物を加え、攪拌し、短時間回転させ、ポリメラーゼを加え、静かに混合する。
°天然ＰＦＵ用１０×反応緩衝液は２０ｍＭ ＭｇＣｌ２を含有しているために、それ以上のＭｇＣｌ２を加える必要はない
＋プライマー：
ｐＲＡＭ１８ｕｐ−５’ｇｔａｃｔｇａｇａｃｇａｃｇｃｃａｇ−３’
ｐＲＡＭ１９ｄｎ−５’ｇｇｃａｔｇａｇｃｇｔｇａａｃｔｇａｃ−３’
サイクル条件： ９４〜３０秒（９４〜２０秒、６５〜１分、７２〜３分）２５×（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｇｅｎｅ Ａｍｐ（登録商標） ＰＣＲシステム２４００）
２．１μｌをゲルにかけて増幅生成物をチェックする
３．増幅反応生成物をＷｉｚａｒｄ ＰＣＲ精製キット（Ｐｒｏｍｅｇａ社、ｐａｒｔ＃Ａ７１８ｃ）で精製する：
− ＰＣＲ反応物を、１００μｌのＤｉｒｅｃｔ精製緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｐａｒｔ＃Ａ７２４ａ）を有する新しいチューブに移す
− １ｍｌのＷｉｚａｒｄ ＰＣＲ精製樹脂（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｐａｒｔ＃Ａ７１８ｃ）を加え、室温で１分間インキュベートする
− 樹脂をＷｉｚａｒｄミニカラムを通して引く
− ８０％エタノールで洗浄する
− マイクロ遠心管中で回転させて過剰のエタノールを除去する
− ８８μｌ滅菌ナノ純水中に溶出させる（水を少なくとも１分間カラムに保つ）
１ＰＦＵポリメラーゼを用いるこの増幅工程は２つの理由から導入された：
（ａ）多くの形質転換体の生産のためにＤＮＡ収率を増加させること。
（ｂ）変異誘発ＰＣＲ反応から引き継がれる鋳型ＤＮＡの量を減少させること： （第二の増幅反応用プライマーは変異誘発プライマーに繰り込まれる。変異誘発プライマーは上流と下流プライマーのそれぞれ１１と１２塩基の非特異的末尾を用いて設計された。繰り込まれたプライマーは変異誘発プライマーで既に増幅されたＤＮＡを増幅するだろうが、ｐＲＡＭ鋳型ＤＮＡを増幅することはできない）
【０２１７】
増幅ＰＣＲ変異誘発生成物のサブクローニング
１．ＤＮＡをＳｆｉＩで次のように消化する：
− ２μｌのＳｆｉＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｐａｒｔ＃Ｒ６３９ａ）
− １０μｌの１０×緩衝液Ｂ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｐａｒｔ＃Ｒ００２ａ）
− Ｗｉｚａｒｄ ＰＣＲ ｐｒｅｐからの８８μｌのＤＮＡ（［増幅における］工程３を参照）
− 成分を混合し、２滴の鉱油で積層する； ５０℃で１時間インキュベートする
２．Ｗｉｚａｒｄ ＰＣＲ精製キットで塩とＳｆｉ末端をここに記載のように除去し、そして５０μｌ滅菌ナノ純水に溶出する
３．ｐＲＡＭ（＋／ｒ）骨格への連結（１グループにつき４連結反応を設定する）
− ０．０２５ｐｍｏｌのｐＲＡＭ骨格
− ０．０５ｐｍｏｌの挿入物（通常６〜１２μｌの挿入物の範囲）
− １μｌのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｍ１８０ａ）
− ２μｌの１０×リガーゼ緩衝液（Ｃ１２６ｂ、２５μｌのアリコートに分割し、そして２回を超える回数で凍結／溶解しない）
− 水で２０μｌにし
− 室温で２時間連結し
− １５分間７０℃で熱反応させてリガーゼを失活させる
【０２１８】
形質転換と塗布
１．試料をブタノールで析出させて過剰の塩を除去する（ｎ−ブタノール、Ｓｉｇｍａ製、セントルイス、ミズリー州、ｐａｒｔ＃ＢＴ−１０５）：
（エタノール析出がブタノールの代わりに用いられる場合、７０％エタノールで必要なだけ洗浄する）（過剰の塩は、エレクトロポレーション中に反応を失敗させる放電を引き起こすだろう）
− 水を加えて５０μｌに
− ５００μｌのｎ−ブタノールを加える
− ブタノール／連結混合物が透明となるまで混合し、次に２０分間室温でスピンする
− ヒュームフード中の廃液容器にブタノールを排出させる
− １２μｌの水に再懸濁させ、３０秒間全速でスピンする
２．細胞／ＤＮＡ混合物の調製（４形質転換体＋参照クローンＤＮＡを有するものを設定する）；
− ＤＮＡが沈殿している間に、エレクトロポレーションキュベットを氷上に置く
− １５ｍｌのＦａｌｃｏｎスナップキャップチューブに３ｍｌのＳ．Ｏ．Ｃ．培地を充填し氷上に置く
− ＪＭ１０９エレクトロコンピテント細胞を氷上で解凍する（１連結反応あたり５０μｌ）
− 工程１からの１０μｌの底層（または０．５μｌの参照クローンＤＮＡ）をコンピテント細胞にピペットで入れる
（少量のブタノール残量物は形質転換効率に悪影響を及ぼさない）
− 細胞／ＤＮＡ混合物を氷上に置く
３．エレクトロポレーション
− チューブ、キュベットおよび氷上の細胞／ＤＮＡ混合物をエレクトロポレーション装置に移動させる
− 細胞／ＤＮＡ混合物をキュベットおよびｚａｐにピペットで入れる。装置の設定：
キュベットギャップ： ０．２ｃｍ
電圧： ２．５ｋＶ
容量： ２５μＦ
抵抗： ２００オーム
時間定数： ４．５ｍｓｅｃ
− １ｍｌのＳＯＣ（ＫＣｌを含有する； 培地調製物＃ＫＣＬＭ）をキュベットにピペットで入れ、迅速に回収チューブ（形質転換効率は細胞をキュベットに放置すると減少する）に注ぐ
− すべての試料が処理されるまで回収チューブを氷上に置く
− 細胞を３７℃で３０〜６０分間回復させる
− ニトロセルロースフィルターを有するＬＢ＋ａｍｐプレートに置く
（コロニーの＃は、細胞が６０分間回復する場合、おそらく細胞の複製のために〜２０％高くなる。１０１３０５のｐ．６５を参照）
（スクリーニングの最も良いコロニー密度は１プレートあたり５００である。細胞プレートの現在のバッチに関して〜５００から７５０μｌ）
【０２１９】
Ｆ．組換え変異誘発法またはＤＮＡシャフリング：
プラスミドＤＮＡのＤＮａｓｅ Ｉ消化
１．２％低融点ゲルの調製
− ０．８ｇアガロースを４０ｍｌ（ＮｕＳｉｅｖｅ＃５００８２）中に使用
− 大きな調製コームを使用
− 消化前に確実に固体化させる
【０２２０】
２．４μｇのプールされたプラスミドＤＮＡを消化のために調製する。
【０２２１】
３．下記の表にしたがって氷上に１Ｕ／μｌ ＤＮａｓｅ希釈物を調製する。
【０２２２】
【表４】
＋ＤＮａｓｅ Ｉ、シグマ社製（Ｄ５７９１）
＊ゼラチンを加えて、ＤＮａｓｅがチューブの壁に接着しないようにする。
【０２２３】
この希釈物を氷上に少なくとも３０分間活性を失わせずに保つことができる。
【０２２４】
４．消化する（室温に設定する）
１００μｌ反応物あたり、１．０Ｕと１．５ＵのＤＮａｓｅＩによる２種類の消化物を調製する：
− １０μｌの１０×ＤＮａｓｅ Ｉ緩衝液（５００ｍＭトリス、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．８）
− ｘμｌのＤＮＡ（工程２からの２μｇのプールされたプラスミドＤＮＡ）
− １または１．５μｌの１Ｕ／μｌの酵素希釈物
− 滅菌ナノ純水で１００μｌに
− 室温で１０分間インキュベートする
− 反応を１μｌの１００ｍＭ ＣＤＴＡで停止させる
【０２２５】
アガロースゲルからの精製
１．ＤＮａｓｅ消化断片のゲル上での泳動
− １０μｌの１０×ブルージュースを各ＤＮａｓｅ Ｉ消化物に加える
− すべてを２％低融点アガロースゲルにかける
− 約３０分間１２０〜１５０Ｖで泳動する
− ｐＧＥＭ ＤＮＡマーカーを中央レーンにかける
【０２２６】
２．断片の単離
− レーザー刃を用いて６００〜１０００ｂｐの範囲の大きさの断片を有するアガローススライスを切り出す
− 〜０．３ｇの重量の小片に切断
− ゲルスライスを７０℃で溶融
− ３００μｌのフェノール（ＮａＣｌ／トリス平衡化）を溶融アガロースに加え、最大速度で〜１分間攪拌する
− １０分間４℃で回転させる（４℃で行われると界面は動きにくい）
− 上層を、等しい量のフェノール／クロロホルム／イソアミル（３００ｍＭ ＮａＣｌ／１００ｍＭトリス、ｐＨ８．０で飽和したもの）を含有するチューブ中に入れて、攪拌し、室温で５分間回転させる
− 上層を、クロロホルムを含有するチューブに入れて、攪拌し、回転させる
− 上層を、２容量の９５％の冷エタノールを有するチューブに入れる； −７０℃のフリーザー中に１０分間置く（高塩フェノールのためにそれ以上の塩は必要とされない）
− ４℃で１５分間回転させる。
− ７０％エタノールで洗浄し、排出し、〜１０分間風乾する
− ２５〜５０μｌの滅菌ナノ精製水中に再懸濁する
− 使用の準備ができるまで−７０℃で保存する
【０２２７】
アセンブリ反応
４反応を設定し、完了したらプールする
【０２２８】
【表５】
＊この反応のために用いられるＤＮＡは断片化されているので、濃度を予測することは困難である。最も簡単な方法は５μｌのＤＮａｓｅＩ消化ＤＮＡをアガロースゲルにかけて、染料がウエルに入るまで（１〜２分間）泳動する。典型的な２μｇのＤＮＡ消化物からの断片を１００μｇの水に再懸濁し、〜１から１０ｎｇ／μｌのＤＮＡ濃度を与える。この種類のゲルの写真に関して１０１２８４ｐ．３０を参照されたい。
【０２２９】
サイクル条件：９４〜３０秒［９４〜２０秒、６５〜１分、７２〜２分］２５×（プログラム「アセンブリ−６５」、実施〜２．５時間）
【０２３０】
アセンブリの増幅
通常、５増幅反応は全８プレートのロボット実験のために十分なＤＮＡを作るだろう。
【０２３１】
【表６】
＊ プライマーの濃度は典型的な増幅反応の２倍であることに注意。
°ＰＦＵ １０×緩衝液は２０ｍＭのＭｇＣｌ２を含有するので、ＭｇＣｌ２を添加する必要はない。
＋ＰＦＵはＳｔｒａｔａｇｅｎｅ ｐａｒｔ＃６００１３５から注文。
サイクル条件：９４〜３０秒［９４〜２０秒、６５〜１分、７２〜３分］２５×
【０２３２】
アセンブリ増幅のサブクローニング
１．精製生産物をＷｉｚａｒｄ ＰＣＲ精製キットにより精製する：
− ５増幅反応物をプールする
− １００μｌのＤｉｒｅｃｔ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ緩衝液を含有する新しいチューブに移す
− １ｍｌのＷｉｚａｒｄ ＰＣＲ精製樹脂を加え、室温で１分間インキュベートする
− 樹脂をＷｉｚａｒｄミニカラムで引く
− ８０％エタノールで洗浄し、マイクロ遠心管中で回転させて過剰のエタノールを除去する
− ８８μｌの滅菌ナノ純水で溶出させる（水をカラム中に少なくとも１分間保持させる）
【０２３３】
２．ＳｆｉＩによる消化：
− ２μｌのＳｆｉＩ
− １０μｌの１０×緩衝液Ｂ
− Ｗｉｚａｒｄ ＰＣＲ ｐｒｅｐからの８８μｌのＤＮＡ
− 成分を混合し、２滴の鉱油で積層し；５０℃で１時間インキュベートする
【０２３４】
３．バンドの単離
アセンブリー反応の増幅後にしばしば遺伝子サイズの断片よりも小さいバンドが作られる。この小さい断片は、試料がバンド単離されていない場合、遺伝子サイズの断片よりも１０倍も高い頻度でサブクローニングされることが示された。この汚染バンドが存在する場合、ＳｆｉＩ消化後にバンドを単離することが必要である。
【０２３５】
− ＤＮＡを０．７％アガロースゲルにかける
− Ｂｉｏ１０１製のＧｅｎｅ Ｃｌｅａｎキットを用いてバンドの単離と精製を行う
− ５０μｌの滅菌ナノ純水でＤＮＡを溶出し、ゲル上の濃度をチェックする（標準アガロースを用いるこの種類の精製はサブクローニング後に最大数の形質転換体を作った。試みられた他の方法：フェノールクロロホルムによる低融点ゲル、低融点ゲルによるＧｅｎｅ ｃｌｅａｎキット、標準アガロースによるＷｉｚａｒｄ ＰＣＲ樹脂、低融点ゲルを用いるＰｉｅｒｃｅ Ｘｔｒｅｍｅスピンカラム（は標準アガロースで機能しなかった））。
【０２３６】
４．ｐＲＡＭ［＋／ｒ］骨格に連結する：（上記の連結と形質転換法を参照されたい）
【０２３７】
ｐＲＡＭ骨格のラージスケールでの調製
１．ＬＢ ａｍｐプレートにｐＲＡＭＭＣＳ［＋／ｒ］ですじを付ける（このベクターは遺伝子の代りにＳａｃＩＩ部位を有する合成挿入物を有する。それは−７０℃でボックスで挙げたｐＲＡＭグリセロール保存物、ｂ２の位置に見ることができる。このベクターは新しいリボソーム結合部位を有するが、ベクターがＳｆｉＩで消化されるときに切り出されるだろう。
【０２３８】
２．アンピシリンを補充したＬＢで１０ｍｌの一晩培養物を調製する。
【０２３９】
３．翌日、アンピシリンを補充した１ＬのＬＢを接種して、１６〜２０時間生育させる。
【０２４０】
４．ＤＮＡをＷｉｚａｒｄ Ｍａｘｉ Ｐｒｅｐキットを用いて精製する（１Ｌの細胞のために４調製物を用いる）
５．プラスミドをＳｆｉＩで消化する。（１ミリグラムあたり５Ｕを使用）鉱油と重ね合わせて、少なくとも２時間消化する。
【０２４１】
６．エタノール沈殿して塩を除去する。水に再懸濁する。
【０２４２】
７．ＳａｃＩＩで２時間消化する。（消化物の容量を２ｍｌ以下に保つ）。プラスミドの一部が部分消化しうることがありうる。ベクターが、二つのＳｆｉＩ部位に対して内部にある酵素により切断される場合、それは、部分的に消化させた断片を連結反応で結合させないだろう。
【０２４３】
８．全消化物をカラムに乗せる（９を参照）。エタノール沈殿が必要な場合、かける試料の体積は２ｍｌを超えないようにする。
【０２４４】
９．カラムはセファクリルｓ−１０００を有し、２０％エタノールで保存して細菌の汚染を防ぐ。試料をかける前に、カラムを冷たい操作緩衝液で少なくとも２４時間平衡化しなければならない。カラムが２ヶ月を超えて放置されていた場合、カラムを空にして、樹脂を冷たい操作緩衝液中の洗浄液と３〜４回平衡化し、次にカラムに再び注ぐことが必要となろう。カラムを注いだ後、樹脂が完全に充填されるように一晩平衡化しなければならない。
【０２４５】
１０．〜０．５ｍｌのフラクションを集める。典型的には、ＤＮＡはフラクション２５〜５０からのものである。連続したフラクションからの５μｌのアリコートをかけて、どのフラクションが骨格断片を有するのかを決定する。小さい挿入断片は骨格のすべてが溶出する前にカラムから出始めるので、フラクションをプールするときに保存することが必要であろう。この理由から、典型的にはＤＮＡの４０〜６０％がこの工程で失われる。
【０２４６】
１１．骨格を有するフラクションをプールする。
【０２４７】
１２．試料をエタノールで析出させる。〜１０から５０ｎｇ／μｌを作る容積で再懸濁する。
【０２４８】
１３．−７０℃で保存する。
【０２４９】
カラム操作緩衝液：（４℃で保存）
５ｍＭ ＥＤＴＡ
１００ｍＭ ＮａＣｌ
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ塩酸、ｐＨ８．０
１０μｇ／ｍｌ ｔＲＮＡ（Ｒ−８７５９）
【０２５０】
Ｈ．オリゴヌクレオチド変異誘発：
変異すべき鋳型のアンピシリン感受性の一本鎖ＤＮＡを調製する。すべての可能なアミノ酸コドンをランダムに作る変異誘発プライマーを設計する。
【０２５１】
変異誘発反応：
【０２５２】
【表７】
＊アニーリング緩衝液：
− ２００ｍＭトリス塩酸、ｐＨ７．５
− １００ｍＭ ＭｇＣｌ２
− ５００ｍＭ ＮａＣｌ
【０２５３】
６０℃で１５分間の熱反応を行い、その直後に氷上に置く。
【０２５４】
合成反応：
【０２５５】
【表８】
＊合成緩衝液
１００ｍＭトリス塩酸、ｐＨ７．５
５ｍＭ ｄＮＴＰｓ
１０ｍＭ ＡＴＰ
２０ｍＭ ＤＴＴ
３７℃で９０分間インキュベートする。
Ｍｕｔ−Ｓ株ＢＭＨ７１−１８（Ｐｒｏｍｅｇａ株Ｑ６３２１）を形質転換する。
− 合成反応液を１７×１００ｍｍチューブに入れる。
− 氷上で解凍されたＢＭＨ７１−１８コンピテント細胞を合成反応物に加える。
− 氷上で３０分間インキュベートする。
− 細胞に４２℃で９０秒間熱ショックを与える。
− ４ｍｌのＬＢ培地を加えて、細胞を３７℃で１時間生育させる。アンピシリンを最終濃度１．２５μｇ／ｍｌまで加え、次に一晩３７℃で生育させる。
【０２５６】
ＤＮＡをＷｉｚａｒｄ Ｐｌｕｓ精製システム（Ｐｒｏｍｅｇａ ａ７１００）で単離する。
【０２５７】
単離されたＤＮＡを用いてＪＭ１０９のエレクトロコンピテント細胞を形質転換し、ＬＢアンピシリンプレート上で形質転換する。
【０２５８】
Ｉ．スクリーニング法：
（形質転換反応からの）ＪＭ１０９クローンを、１プレートあたり〜５００コロニーのスクリーニング密度でＬＢ ａｍｐプレート上に置かれたニトロセルロースフィルターに塗布する。
【０２５９】
ランダム変異誘発法で挙げられたように、選択すべきクローンの約１０％が、配列決定されるものと同程度に安定であるか、または源よりも良好であるに違いないであろう。または別の言い方をすれば、１枚あたり５０コロニーまでが選択に適するであろう。全８プレートロボット実験に利用可能な７０４ウエルが存在するので、少なくとも１５枚のＬＢ ａｍｐプレートが全ロボット実験に必要とされるだろう。
【０２６０】
３７℃での一晩の生育後、形質転換体をインキュベーターから取り出して室温におく。
【０２６１】
ニトロセルロースフィルターの一側面を上げて、５００μｌの１０ｍＭ ＩＰＴＧを各プレートに加える。次に、フィルターをプレートの裏側に置いて、異なる変異体ルシフェラーゼ遺伝子を有するコロニー中にＩＰＴＧを拡散させる。次に、該プレートを約４時間室温でインキュベートする。
【０２６２】
１ｍｌの溶液は１ｍＭのルシフェリンを含有し、１００ｍＭのクエン酸ナトリウムを５０℃に設定したスライド加温器上にピペットで入れる。変異体ルシフェラーゼコロニーを有し、ＩＰＴＧで処理されたニトロセルロースフィルターを、次にルシフェリ溶液の上部に置く。数分後、最も明るいコロニーを爪楊枝を用いて採取し、これを用いてＭ９最少培地と１％ゼラチンを含有するマイクロタイタープレートのウエルに接種する。
【０２６３】
十分なコロニーを８枚のマイクロタイタープレートに入れた後に、プレートを３５０ｒｐｍで３０℃のインキュベーションのためにインキュベーターに置き、一晩生育させた。
【０２６４】
朝に、一晩プレートをロボット上に置き、細胞希釈操作を行う（この方法は培養物を誘導培地中に１：１０で希釈する）。これらの新しいプレートを３時間、３５０ｒｐｍ、３０℃で生育させる。
【０２６５】
生育後、プレートを主要なアッセイ操作用のロボットにかける。
【０２６６】
最小媒体：
６ｇ／Ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４
３ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４
０．５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ
１ｇ／Ｌ ＮＨ４Ｃｌ
２ｍＭ ＭｇＳＯ４
０．１ｍＭ
１ｍＭチアミン塩酸
０．２％グルコース
１２μｇ／ｍｌテトラサイクリン
１００μｇ／ｍｌアンピシリン
【０２６７】
＊一晩培地は１％ゼラチンを含有する。
＊誘導培地は１ｍＭ ＩＰＴＧを含有し、ゼラチンを含有しない。
Ｓ．Ｏ．Ｃ．培地
−１０ｍＭ ＮａＣｌ
−２．５ｍＭ ＫＣｌ
−２０ｍＭ ＭｇＣｌ
−２０ｍＭグルコース
−２％バクトトリプトン
−０．５％酵母抽出物
【０２６８】
【表９】
【０２６９】
【表１０】
【０２７０】
【表１１】
【０２７１】
【表１２】
【０２７２】
【表１３】
【０２７３】
【表１４】
【０２７４】
【表１５】
【０２７５】
【表１６】
【０２７６】
【表１７】
【０２７７】
【表１８】
【０２７８】
【表１９】
【０２７９】
【表２０】
【０２８０】
【表２１】
【０２８１】
【表２２】
【０２８２】
【表２３】
【０２８３】
【表２４】
【０２８４】
【表２５】
【０２８５】
【表２６】
【０２８６】
【表２７】
【０２８７】
【表２８】
【０２８８】
【表２９】
【０２８９】
【表３０】
【０２９０】
【表３１】
【０２９１】
【表３２】
【０２９２】
【表３３】
【０２９３】
【表３４】
【０２９４】
表５： 進化的発達の要約
(1) ＬｕｃＰｐｅ２［Ｔ２４９Ｍ］から始める
(2) Ｎ末端とＣ末端で３アミノ酸を変異させる
(3) ７個のシステインを変異させる
(4) 進化の二回の反復を実施する → Ｌｕｃ４９−７Ｃ６
(5) 変更されたコドンの変異誘発（９）
(6) 進化の二回の反復 → Ｌｕｃ７８−０Ｂ１０
(7) 共通コドンの変異誘発（２８）
(8) コドン利用性変異誘発（２４）→Ｌｕｃ９０−１Ｂ５。
【０２９５】
【表３５】
【０２９６】
引用文献
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【技術分野】
【０００１】
本発明は、天然ルシフェラーゼまたは変異体ルシフェラーゼが由来するルシフェラーゼに比べて、例えば水溶液中、５０℃で少なくとも２時間の半減期を測定したときに、大きく高められた熱安定性を有する変異体ルシフェラーゼ酵素に関する。また、本発明は新規なルシフェラーゼをコードするポリヌクレオチド、および該ルシフェラーゼを発現するように形質転換された宿主に関する。さらに、本発明は高められた熱安定性を有するルシフェラーゼの生産方法、および以前から公知のルシフェラーゼが従来から使用されている方法を用いてのこれらのルシフェラーゼの使用に関する。これらの使用の一部はキットを用いる。
【０００２】
（発明の背景）
ルシフェラーゼは発光を引き起こすそれらの能力によって特徴づけられる。甲虫ルシフェラーゼは独自の進化的起源と化学的メカニズムを有する独特のクラスを形成する（Ｗｏｏｄ、１９９５）。
【０００３】
甲虫ルシフェラーゼとして知られている酵素は高感度発光アッセイで使用できると広く認識されているが、それらの一般的な有用性は低い熱安定性のために制限されている。発光性甲虫からクローニングされたｃＤＮＡ配列によりコードされるアミノ酸配列を有する甲虫ルシフェラーゼは、穏やかな温度でさえも安定ではない。例えば、ホタルから得られた最も安定なルシフェラーゼであるＬｕｃＰｐｅ２でさえも３７℃の穏やかな温度で非常にわずかな安定性しか有さない。ホタルルシフェラーゼは甲虫ルシフェラーゼのサブグループである。歴史的には、「ホタルルシフェラーゼ」という用語はＰｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓの単一種に由来するＬｕｃＰｐｙ酵素を指した（Ｌｕｃ＋は一異形である）。
【０００４】
ルシフェラーゼをコードする天然のｃＤＮＡ配列を変異させて向上した熱安定性を目指して変異体を選択する試みが報告されている（Ｗｈｉｔｅら、１９９４年、Ｐ．ｐｙｒａｌｉｓ由来のもの、ならびにＫａｊｉｙａｍａおよびＮｅｋａｎｏ、１９９３年、Ｌｕｃｉｏｌａ ｌａｔｅｒａｌｉｓ由来のもの）。しかし、この重要な種類の酵素の特性と多様性を向上させる必要性がなおも存在する。
【０００５】
（発明の要約）
本発明は、水溶液中、５０℃で少なくとも２時間または５０℃で少なくとも５時間の半減期を有する新規で顕著に熱安定なルシフェラーゼに関する。本発明の変異体ルシフェラーゼは室温（２２℃）および少なくとも６５℃もの温度で顕著でこれまで実現されなかった熱安定性を示す。さらに、本発明は新規なルシフェラーゼ酵素をコードする変異体ルシフェラーゼ変異体遺伝子（ｃＤＮＡ）に関する。ここで用いられる用語は、例えば実験９０、プレートナンバー１、ウエルＢ５で単離された変異体に関して、その大腸菌株は９０−１Ｂ５であり、その変異体遺伝子はｌｕｃ９０−１Ｂ５であり、その変異ルシフェラーゼはＬｕｃ９０−１Ｂ５である。
【０００６】
熱安定性とは、溶液中、規定温度で酵素の半減期において測定された酵素活性の損失速度を意味する。好ましくは、甲虫ルシフェラーゼに関して、酵素活性はルシフェリンとＡＴＰの飽和条件下、室温で測定された発光を意味する。熱安定性は半減期（活性の５０％が失われる時間）を用いて定義する。
【０００７】
さらに、本発明は、変異体ルシフェラーゼを含有する発現ベクターおよび他の遺伝子構築物、ならびに該変異体ルシフェラーゼを発現するように形質転換された細菌またはそれ以外の宿主を包含する。また、本発明は新規なルシフェラーゼを含有する組成物およびキット、およびルシフェラーゼが慣用的に用いられる方法でのこれらのルシフェラーゼの使用に関する。
【０００８】
ランダム変異誘発の多様な手段を、ルシフェラーゼ遺伝子（ヌクレオチド配列）、とりわけエラーしがちなポリメラーゼを用いる遺伝子合成に適用して、修飾ルシフェラーゼ遺伝子のライブラリーを作った。このライブラリーは大腸菌のコロニーで発現され、十分な発光を肉眼でスクリーニングして修飾ルシフェラーゼのサブセットライブラリーを選択した。次に、これらの大腸菌株の溶解物を作り、ルシフェラーゼ活性と安定性を定量的に測定した。これから、修飾ルシフェラーゼのさらに小さいサブセットを選択し、これらの選択された変異を組み合わせて複合修飾ルシフェラーゼを作った。新しいライブラリーをこの複合修飾ルシフェラーゼからランダム変異誘発により作り、このプロセスを繰り返した。全体的に最も良い性能を有するルシフェラーゼがこのプロセスの数サイクル後に選択された。
【０００９】
改良ルシフェラーゼの生産方法は、出発（親）配列として最初の甲虫ルシフェラーゼをコードするポリヌクレオチド配列を用いる方向性進化（ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）を行って、酵素の他の特性を維持しながら、最初のルシフェラーゼに比較して高められた熱安定性を有する第二のルシフェラーゼをコードするポリヌクレオチド配列を作る。ｌｕｃｐｐｅ２と命名されたｃＤＮＡは、Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓに由来するＬｕｃＰｐｙと命名された広く利用されているルシフェラーゼに比べて高められた熱安定性を示すＰｈｏｔｕｒｉｓ ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉｃａに由来するホタルルシフェラーゼをコードする。ＬｕｃＰｐｅ２ルシフェラーゼをコードするｃＤＮＡが単離され、配列決定され、クローニングされた（Ｌｅａｃｈら、１９９７年を参照）。この遺伝子の変異体は第一のルシフェラーゼＬｕｃＰｐｅ２［Ｔ２４９Ｍ］をコードする。
【００１０】
変異体ルシフェラーゼの一実施態様において、そのアミノ酸配列は、残基２４９において、Ｌｅａｃｈらにより報告されたＭではなくＴが存在する以外は、図４５に示されたＬｕｃＰｐｅ２のもの（Ｔ２４９Ｍと命名）と同じである。下線を付けた太い残基（２４９）はＴからＭへの変異を示す。この酵素は大腸菌で発現されるとインビボでおよそ５倍の光を作った。二重下線部の残基はオリゴヌクレオチド変異誘発によりランダム化された。
【００１１】
本発明の方法により作られた変異体ルシフェラーゼを発現する組換え大腸菌の希釈抽出物を、光強度、シグナル安定性、基質の利用（Ｋｍ）および熱安定性等の複数の特性について同時にスクリーニングした。全自動化ロボットシステムを用いて、進化の各世代中の多数の変異体をスクリーニングした。変異誘発とスクリーニングの数サイクル後にルシフェラーゼの変異体ライブラリーを作ることにより、約３５℃のＬｕｃＰｐｅ２［Ｔ２４９Ｍ］と比較して高められた熱安定性が、水溶液中、５０℃で２時間、６５℃で５時間、または２２℃で６週間保持された場合に熱安定性を基本的に維持した（わずかに無視できる５％の活性の損失があっただけである）最も安定なクローン［クローンＬｕｃ９０−１Ｂ５］で達成された。
【００１２】
本発明の変異体ルシフェラーゼは、５０℃で少なくとも２時間、好ましくは５０〜６５℃で２〜２４時間の範囲において５０℃で少なくとも５時間高められた熱安定性を示す。特に、本発明は、適当な水溶液に溶解したときに、約５０℃で約２時間を超え、より好ましくは５０℃で約１０時間を超え、さらにより好ましくは５０℃で５時間を超える安定半減期を有する熱安定変異体ルシフェラーゼからなる。また、本発明は、適当な水溶液に溶解したときに、約６０℃で約５時間を超え、より好ましくは６０℃で約１０時間を超え、さらにより好ましくは６０℃で約２４時間を超える安定半減期を有する変異体ルシフェラーゼからなる。さらに、本発明は、適当な水溶液に溶解したときに、約２２℃で約３ヶ月を超える安定半減期、より好ましくは２２℃で少なくとも６ヶ月の半減期安定性を有する変異体ルシフェラーゼからなる。本発明の一実施態様は６５℃で６時間の安定性（２日間の半減期に等しい）を有するルシフェラーゼ変異体である。約５〜６％の活性の損失がわかった。本発明の最も安定なクローンに由来する酵素の半減期は小さな相対的変化を示すデータから外挿すると、６５℃で１２日間（６時間で６％の損失に相応）、および２２℃で２年間（６週間で５％の損失に相応）である。
【００１３】
特に、本発明はここに開示されるアミノ酸配列の実施態様を有するルシフェラーゼ酵素（例えば、Ｌｕｃ４９−７Ｃ６、Ｌｕｃ７８−０Ｂ１０およびＬｕｃ９０−１Ｂ５と命名された変異体ルシフェラーゼ、図２７、３６、４３）ならびに５０℃で少なくとも２時間の半減期が測定された熱安定性を有するすべての他の甲虫ルシフェラーゼからなる。また、本発明は、単一の変異またはここに開示される甲虫ルシフェラーゼをコードする配列の共通領域中のタイプと位置の変異の組合せ、またはそれらの等価物を有するルシフェラーゼ酵素をコードする変異ポリヌクレオチド配列からなる。これらの変異は図２２〜４７の配列で、下線の付けた太い線の残基により示され、図１９の他の甲虫ルシフェラーゼ配列と整合させてある。
【００１４】
甲虫ルシフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は図１９に並べられている。多様な属および属内の種で天然に見られる、ｌｕｃｐｐｅ−２等の１１配列が並べられている。本発明の３変異体ルシフェラーゼをコードするヌクレオチド配列（Ｌｕｃ４９−７Ｃ６； ７８−０Ｂ１０； ９０−１Ｂ５）も並べられている。高まった熱安定性を示す各変異体ルシフェラーゼ中に少なくとも３変異が存在する。一般的に、変異は保存領域には存在しない。保存アミノ酸は図１９で示される位置ですべての天然の種において同一であるものである。共通とは、ＬｕｃＰｐｅ２を除き、図１９で示される配列の５０％を超えて存在する同一のアミノ酸を言う。
【００１５】
（発明の詳細な説明）
本発明は高い熱安定性により特徴付けられ、コード遺伝子中に、通常は反復的変異誘発により作られた変異により創出された甲虫ルシフェラーゼに関する。この改良された熱安定性はその活性を変えることなくルシフェラーゼの保存を可能とし、新しいルシフェラーゼを用いるアッセイの再現性と精度を向上させる。さらに、本発明は、高められた熱安定性を有する変異体ルシフェラーゼをコードする単離ポリヌクレオチド配列（ｃＤＮＡ）、該ポリヌクレオチド配列を含有するベクター、および該ポリヌクレオチド配列を発現するように形質転換された宿主からなる。表１は約２５０クローンの結果および該クローンからのルシフェラーゼの熱安定性等の特性を示す。また、本発明は、ルシフェラーゼが慣用的に使用されている利用における該変異体ルシフェラーゼの使用、およびそのような適用の一部に有用であるキットを包含する。
【００１６】
予期せぬことに、高い熱安定性を求めた甲虫ルシフェラーゼが反復的変異誘発と選択のプロセス（しばしば「方向性進化」と称する）により本発明で達成された。反復的変異誘発および選択の方法は、特に多パラメーター自動化スクリーニングの利用において本発明の一特徴である。よって、熱安定性等の単一の属性のみに関するスクリーニングのかわりに、同時スクリーニングが酵素活性と効率というさらなる特性を求めて行われた。この方法では、一つの性質がもう一つの性質を犠牲にして「進化」することはあまりなく、結果として例えば高められた熱安定性をもたらしたが、減少した活性ももたらした。
【００１７】
表１は異なるルシフェラーゼを出発（親）配列として用いる実験から得られたパラメーター値（Ｔｉ、Ｔａｕ、ＫｍおよびＳ）の例を示す。副題は該パラメーターが測定された出発温度と出発ルシフェラーゼの名称、例えば「３９−５Ｂ１０、５１℃」等を示す。各実験におけるすべてのパラメーターは各出発配列に対する相対値として記録され、例えばどの実験においても出発配列に関するパラメーター値は“１”に等しい（定義に関してはここでの実施例２を参照されたい）。
【００１８】
熱安定性は、好熱性細菌に見られる熱安定アイソザイムによって証拠付けられるように多様な酵素において自然に進化してきた。自然での進化は、ランダム変異誘発（塩基置換、遺伝子欠失、遺伝子挿入）とそれに続く向上特性を有する変異体の選択により働く。このプロセスは時間とともに反復される。天然の熱安定酵素の存在は熱安定性が進化の尺度での変異誘発により達成できることを示唆するが、短期の実験室的方法を用いることにより特定の種類の酵素に所与レベルの熱安定性を達成する可能性は予測できなかった。非常に大きな集団と数百万の世代と遺伝子を通常伴う変異と選択による天然での進化のプロセスは、そのような変異体が作られるまで方向性進化により改良遺伝子を作ろうとする現代の実験室の能力を予想するのに用いることはできない。
【００１９】
そのような成功の後、すべての甲虫ルシフェラーゼの全体的な三次元構造はかなり似通っているので、このクラスの一員について高い熱安定性が達成できることを示すことにより、高い熱安定性が類似の方法により他の甲虫ルシフェラーゼにおいて達成できることを予想可能となる。図１７は甲虫ルシフェラーゼ間の進化的な関係を示す。これらのすべては類似した全体的な構成を有する。甲虫ルシフェラーゼが属する構造クラスは二次構造により決定される（例えば、ヘリックスはシリンダーにより、シートは矢印の集合によりに表わされ、ループはシート構造を有するヘリックスを連結する（図１８Ａ））。図１８Ｂは、小さな螺旋が図１８Ａのシリンダーに対応するＬｕｃＰｐｅ２ルシフェラーゼのアミノ酸を示す（図１８Ｂ）； 図１８Ｃは一般的な甲虫類の構造物がＬｕｃＰｐｅ２のものと一致する（重ねられる）ことを示す。これは、本発明の方法がすべての甲虫ルシフェラーゼにまで一般化できるかもしれないという期待を支持する。
【００２０】
酵素は、ヘリックス、シートおよびループ等の第二要素の三次元配置に基づく異なる構造クラスに属する。熱安定性は、第二要素が三次元構造にいかに効率的に充填されるかによって決定される。各構造クラスについて、熱安定性の理論的限界も存在する。すべての甲虫ルシフェラーゼはそれらの共通する起源（図１７）、相同アミノ酸配列および共通する触媒機構によって明らかであるように共通する構造クラスに属する。
【００２１】
変異誘発による限定された数のアミノ酸置換の適用は全体的な三次元構築物に顕著に影響を与えることは少ない（すなわち、変異体ルシフェラーゼの構造クラスが変化するとは予想されない）。構造クラスに関する熱安定性の理論的限界は知られていないので、甲虫ルシフェラーゼの潜在的熱安定性は本発明が示されるまで知られていなかった。
【００２２】
本発明の目標を達成するにおいて推測される困難性として下記のものが挙げられる。
【００２３】
１．実験室的な方法により作ることのできる変異の種類が限定されている。
【００２４】
ｉ）ランダム点変異により（例えばエラーしがちなＰＣＲにより）、１コドンあたり１塩基を超える変化はまれである。よって、ほとんどの潜在的なアミノ酸変化はまれである。
【００２５】
ｉｉ）他の種類のランダムな遺伝子変化を１００ｂｐを超える領域にわたって達成することは困難である（例えば、ランダムな遺伝子欠失または挿入）。
【００２６】
２．スクリーニングできる可能性のあるルシフェラーゼ変異体の数には限りがある。
【００２７】
ｉ）欠失および挿入を無視しても、天然のルシフェラーゼの配列比較に基づけば、１０１８９を超える機能のある酵素配列が可能でありうる。
【００２８】
ｉｉ）１日につき１００，０００クローンがスクリーニングできるとすれば、同一の変異体が二度スクリーニングされることはないとみなして、すべての変異体をスクリーニングために１０１７９世紀以上かかるだろう（本発明の実際のスクリーニング速度は１日あたり５０００個以内である）。
【００２９】
３．協同的変異を必要とする機能的向上を発見する可能性はまれである（特定の協同的ペアを発見する可能性は１０８クローンあたり１クローンである）。
【００３０】
よって、熱安定性の理論的限界が公知であるとしても、非常にわずかな数の可能性のあるルシフェラーゼ変異体がスクリーニングできるだけなので、そのような熱安定性酵素を発見する推測的可能性は低かった。
【００３１】
しかし、本発明は、高い熱安定性を有する新規な甲虫ルシフェラーゼを作ることが可能であり、実施できることをここで示す。
【００３２】
ａ）最初の配列がＬｕｃＰｐｅ２とＬｕｃＰｐｅに由来する本発明の方法により作られた約２５０変異体は、この酵素のクラスの少なくとも一つのメンバーが高い熱安定性を達成することが可能で、実施できることを示す。
【００３３】
ｂ）ルシフェラーゼは同じ構造クラスに属するために、どの甲虫ルシフェラーゼも同様な手段で改良しなければならない。
【００３４】
ｉ）すべての甲虫ルシフェラーゼは同じ構造クラスに属するので、それらは潜在的に安定化している変異体の同一のプールの一部となる（この結論は、本発明のクローン中に見られる高い比率の安定化変異体が、他の甲虫ルシフェラーゼ中の「共通アミノ酸」、すなわち多数の甲虫ルシフェラーゼ配列に現れるアミノ酸への変換体である（図１９を参照）との観察により支持される）。
【００３５】
ｉｉ）同様な結果は発光甲虫Ｐｙｒｏｐｈｏｒｕｓ ｐｌａｇｉｏｐｈｔｈａｌａｍｕｓに由来する別の甲虫ルシフェラーゼ（ＬｕｃＰｐｌＹＧ）を用いて得られた。この野生型ＬｕｃＰｐｌＹＧは、野生型ＬｕｃＰｐｅ２に対して４８％の配列同一性を有する。このＬｕｃＰｐｌＧＹ変異体の熱安定性はここに記載のＬｕｃＰｐｅ２変異体よりも低いが、これは、それら変異体が少ないサイクル数の方向性進化に供されたからであろう。また、ある場合では、相対的な熱安定性をあまり重要視せずに変異体を選択した。この進化から得られた最も安定なクローン（Ｌｕｃ８０−５Ｅ５）は５０℃でおよそ３．８時間の半減期を有する。
【００３６】
有利な変異に対して予想された多数の有害なランダム変異により引き起こされる統計的な効果を補うために、アッセイ精度を最大化して、新しい置換物において前に選択された変異を再スクリーニングする方法を用いた。アッセイ精度を最大化する方法には、特殊化培地を用いて、成長速度を低下させ、熱移動を調節し、そして培養物の中間対数期増殖からのパラメーターを分析することにより培養条件を緊密に調節し、ロボットスクリーニング法での試料の混合、熱移動および蒸発を調節し；そして空間的に分散されたコントロール試料に対してデータを標準化することである。選択された変異の新しい置換物を校正用ポリメラーゼを用いるＤＮＡシャフリングの方法により作った。
【００３７】
反復法の成果を予想することの困難性は、選択されたルシフェラーゼの他の特性における一定しない成功により例示される。主に酵素の熱安定性に焦点が置かれたが、さらに明るい発光、より十分な基質の利用および長期の発光シグナルを有する変異体の選択も試みられた。それらの定義はここでの等式により与えられる。選択方法は反復法の各反復で親クローンに対する変化により決定された。その変化量はスクリーニングプロセス中に観察されたすべてであった。大腸菌におけるルシフェラーゼの発現は、Ｌｕｃ＋に比較し、ＬｕｃＰｐｅ２に対しては比較的効率が悪かった。他のルシフェラーゼは多様であった（図２１を参照）。
【００３８】
基質利用の全体的な効率を向上させるために、ルシフェリンとＡＴＰの両方に対する複合見掛け利用定数（すなわち、Ｋｍ−［ＡＴＰ＋ルシフェリン］）の減少が求められた。各利用定数の予想されない系統的な変化があったが、全体的な変化はほとんどなかった。最後に、酵素効率を実質的に減少させることなく、発光シグナルのみが適度に影響を受け得た。よって、酵素熱安定性が本発明の方法により大きく高まった一方で、酵素の他の特性はあまり影響を受けなかった。
【００３９】
図４８〜５３は変異体ルシフェラーゼの他の結果を示す。本発明の構成は天然のレベルよりも高い熱安定性を有するルシフェラーゼを包含する。各変異体ルシフェラーゼはその個々の特性が報告されていないために新規である。特定のルシフェラーゼはそれらのタンパク質と遺伝子の両者の配列により知られている。増加した高い熱安定性を有する多くの他のルシフェラーゼが単離されたが、それらの配列は知られていない。これらのルシフェラーゼは方向性進化プロセス中に同定され、それらの酵素学的特性により異なるものであることが認められた。
【００４０】
前述のルシフェラーゼ変異体のいずれよりもさらに安定なルシフェラーゼは変異体Ｌｕｃ９０−１Ｂ５と命名した。新しい熱安定性変異体をこの特別に安定なルシフェラーゼと比較した。本発明の変異体ルシフェラーゼは、２２℃（室温）から少なくとも６５℃もの範囲の温度で、顕著でこれまで実現されなかった熱安定性を示す。
【００４１】
本発明の他の特徴は熱安定性ルシフェラーゼ、特に高い熱安定性を有する甲虫ルシフェラーゼを取り入れる方法を包含する。
【００４２】
本発明のルシフェラーゼの生産
高められた熱安定性を有するルシフェラーゼの製造方法は反復変異とそれに続く選択である。本発明の高く熱安定な変異体ルシフェラーゼの実施態様は、源となるヌクレオチド配列、例えばｃＤＮＡ ＬｕｃＰｐｅ２［Ｔ２４９Ｍ］ｃＤＮＡで始まるランダム点変異の反復プロセスにより作られる。組換え変異誘発は点変異誘発とともに変異誘発法の一部である。組換え変異誘発と点変異誘発の両方を繰り返して実施する。変異プロセスは有性生殖中の遺伝子要素の組換えに類似する方法で個々の変異体の組換えを引き起こすので、このプロセスは有性ポリメラーゼ連鎖反応（ｓＰＣＲ）とも呼ばれる。例えば、１９９７年２月２５日発行のＳｔｅｍｍｅｒの米国特許第５，６０５，７９３号を参照されたい。
【００４３】
ＬｕｃＰｐｅ２ルシフェラーゼｃＤＮＡを出発点として、該遺伝子を、さらに熱安定な変異体ルシフェラーゼを生じるように変異させた。ＬｕｃＰｐｅ２配列に対する単一の点変異は、配列によりＴ２４９Ｍで示されるルシフェラーゼを生じた。この変異体はインビボでおよそＬｕｃＰｐｅ２よりもおよそ５倍明るく、さらなる変異のための鋳型として用いた。ここで記載される他の変異体ルシフェラーゼの熱安定性を測定するためのベースラインとしても用いた。
【００４４】
本発明のルシフェラーゼ配列の実施態様
図４５はＬｕｃＰｐｅ２ルシフェラーゼＴ２４９Ｍのアミノ酸配列を示す。この配列は、Ｌｅａｃｈら（１９９７年）により報告された配列から区別される、Ｔ２４９からＭの位置（下線の太字）での単一塩基対の変異を有する。このクローンは、ＬｅａｃｈのＬｕｃから黄色シフトした５５２ｎｍのスペクトル最大を有する。この変異体は、アッセイによりさらに効率的なスクリーニングを可能としたＬｅａｃｈらにより繰り返された形態よりも、インビボでおよそ５倍明るいために一部の実施例で最初の鋳型として使用するために選択された。これらの配列は太字活字の出発配列（Ｔ２４９−Ｍ）からの変化を示す。配列中の「ｘ」は配列中の不明個所を示すことに注意されたい。
【００４５】
方向性進化（Directed Evolution）、反復法（Recursive Process）
方向性進化は変異誘発により多様性を作り、所望の変化についてスクリーニングする反復法である。複数のアミノ酸の累積作用から生じる酵素学的性質について、方向性進化はこれらの性質を変える手段を提供する。この方法の各工程は典型的には酵素機能の小さな変化を作ることであるが、このプロセスの多くの繰り返しの累積効果は実質的な全体的変化を導きうる。
【００４６】
「熱安定性」という特性は、酵素構造を作りあげる多くのアミノ酸の結合作用により決まるので方向性進化の候補である。ルシフェラーゼの熱安定性を高めるために、発光量と基質結合の効率もスクリーニングした。これは、熱安定性の変化が他の重要な酵素学的性質の望ましくない変化を生じさせないことを確実にするためであった。
【００４７】
有害な変異の頻度は有用な変異よりもさらにかなり高いので、各スクリーニングにおいて本発明の精度制限内で望ましくないクローンが選択されることがあろう。これを補うために、スクリーニング戦略に最初に選択された変異物の複数の再スクリーニングを取り入れた。しかし、再スクリーニング前に、選択された変異物を「シャッフル」して、ランダムな遺伝子内組換え体のライブラリーを作った。このプロセスにより、異なるクローン間の有利な変異が数の少ない共通コード配列中へと組換えられることを可能とし、分離され省略すべき有害な変異をはずす。よって、基本的に同じ一揃いの選択された変異が再びスクリーニングされたが、それらは組換えまたはシャフリングの結果として異なる置換の下でスクリーニングされた。
【００４８】
進化プロセスの各工程の結果は定量的測定によって評価されたが、これらの測定は精製酵素ではなく細胞溶解物で行った。さらに、各工程のみで先の工程に比べた酵素性能の変化を測定したために、酵素機能の全体的な変化を判断することが困難であった。方向性進化の酵素機能に対する影響を評価するために、プロセスの最初、中間および最後からのクローン（表２）を精製し、分析した。この分析で選択されたクローンはＬｕｃ［Ｔ２４９Ｍ］、４９−７Ｃ６および７８−０Ｂ１０であった。その後のオリゴヌクレオチド特異的変異誘発およびスクリーニング戦略により作られたもう一つのクローン９０−１Ｂ５も分析のために精製した。
【００４９】
熱安定性に対する方向性進化の効果は劇的であった。親クローンがほとんど同時に不活化された高温で、その関連クローンに由来する変異酵素は数時間にわたる安定性を示した（表１）。室温でさえも、これらの変異体は親酵素よりも数倍安定である。９０−１Ｂ５のその後の分析は、この酵素が、同じ緩衝液条件下で調べられたときに最も安定で、６５℃で２７時間の半減期を有することを示した。緩衝液条件の最適化の際に、この酵素は６５℃で数時間にわたりごくわずかな活性の損失を示しただけである（クエン酸緩衝液、ｐＨ６．５； 図１Ａ）。このルシフェラーゼはｐＨ６．５でインキュベートした場合、数週間にわたり室温で安定であった（図１Ｂ）。
【００５０】
ＫａｊｉｙａｍａとＮａｋａｍｏ（１９９３）はＬｕｃｉｏｌａ ｌａｔｅｒａｌｉｓに由来するホタルルシフェラーゼがＡ２１７位でのＩ、ＬまたはＶへの単一アミノ酸の置換の存在によってさらに安定化されることを示した。この置換はアラニンからのものであった。ロイシンによる置換は、５０℃で、１時間のインキュベーション後にその活性の７０％を保持するルシフェラーゼを作った。方向性進化により作られた本発明のすべての酵素はこのＬ．ｌａｔｅｒａｌｉｓ変異体よりもさらにかなり安定である。最も安定なクローンである９０−１Ｂ５は同様な条件下（５０℃、２５ｍｏｌ／Ｌクエン酸、ｐＨ６．５、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ、５％グリセロール）での１２０時間（５日間）のインキュベーション後で７５％の活性を保持する。興味深いことに、Ｌｅａｃｈにより報告されたＬｕｃはＬ．ｌａｔｅｒａｌｉｓ変異体について記載された相同位置にイソロイシンを既に有している。
【００５１】
熱安定性は興味のある特性であるが、スクリーニングでは他の酵素学的パラメーターに基づいてクローンを選択した。さらに高い発光発現を有するクローンを選択することにより、大腸菌のコロニーでさらに高い発光強度を生む変異体が発見された。しかし、このプロセスは酵素による発光の動力学的特徴を変更する能力をほとんど示さなかった。これを示さなかったことは、定常状態発光を保つ能力が触媒機構に必須であり、この能力は多くのアミノ酸の累積効果によって容易には影響されないことを示唆する。
【００５２】
基質の結合は、ルシフェリンとＡＴＰに対する見掛け複合Ｋｍ（実施例２を参照）を測定することによりスクリーニングした。見掛け複合Ｋｍは比較的一定に保持されたが、後の分析では個々のＫｍが系統的に変化することを示した。ルシフェリンに対するＫｍが上昇した一方で、ＡＴＰに対するＫｍが低下した（表２）。この変化の理由はわかっていないが、オキシルシフェリンまたはルシフェリン阻害剤のより効率的な除去がさらに速い酵素代謝回転を導き得ることが推測できる。
【００５３】
それ自体に対するそれぞれの点変異は（多かれ少なかれ）変異体酵素の熱安定性を野生型ルシフェラーゼの熱安定性以上まで高める。個々の点変異を組み合わせる累積効果は、しばしばマグニチュード以上のオーダーで野生型よりも大きく高められた熱安定性を有する変異体ルシフェラーゼを生じる。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】本発明のルシフェラーゼの３７℃での安定性を示すグラフである。
【図２】本発明のルシフェラーゼの５０℃での安定性を示すグラフである。
【図３】本発明のルシフェラーゼの６０℃での安定性を示すグラフである。
【図４】本発明のルシフェラーゼの２２℃での安定性を示すグラフである。
【図５】変異体ルシフェラーゼ78-0B10の５０℃における発光と時間の回帰直線を示すグラフである。
【図６】変異体ルシフェラーゼ78-0B10の６０℃における発光と時間の回帰直線を示すグラフである。
【図７】変異体ルシフェラーゼ49-7C6の５０℃における発光と時間の回帰直線を示すグラフである。
【図８】変異体ルシフェラーゼ49-7C6の６０℃における発光と時間の回帰直線を示すグラフである。
【図９】変異体ルシフェラーゼ78-0B10の２２℃における発光と時間の回帰直線を示すグラフである。
【図１０】変異体ルシフェラーゼ49-7C6の２２℃における発光と時間の回帰直線を示すグラフである。
【図１１】変異体ルシフェラーゼ49-7C6の３７℃における発光と時間の回帰直線を示すグラフである。
【図１２】変異体ルシフェラーゼPPE-2の２２℃における発光と時間の回帰直線を示すグラフである。
【図１３】変異体ルシフェラーゼPPE-2の３７℃における発光と時間の回帰直線を示すグラフである。
【図１４】ルシフェラーゼをスクリーニングする方法の概略である。
【図１５】ルシフェラーゼをスクリーニングするためのロボット装置を示す図である。
【図１６】６５℃及び２２℃における発光の経時的変化を示すグラフである。
【図１７】甲虫ルシフェラーゼ間の進化的な関係を示す図である。
【図１８】甲虫ルシフェラーゼの３次元構造を表す図である。
【図１９】甲虫ルシフェラーゼの３次元構造を表す図である。
【図２０】甲虫ルシフェラーゼの３次元構造を表す図である。
【図２１】甲虫ルシフェラーゼのアミノ酸配列を示す図である。
【図２２】甲虫ルシフェラーゼのアミノ酸配列（続き）を示す図である。
【図２３】甲虫ルシフェラーゼのアミノ酸配列（続き）を示す図である。
【図２４】甲虫ルシフェラーゼのアミノ酸配列（続き）を示す図である。
【図２５】図２１〜図２５で使用されている略号の説明である。
【図２６】ベクターの構造を表す図である。
【図２７】変異体ルシフェラーゼの活性を表す図である。
【図２８】変異体ルシフェラーゼをコードするDNA分子の塩基配列を示す図である。
【図２９】変異体ルシフェラーゼをコードするDNA分子の塩基配列を示す図である。
【図３０】変異体ルシフェラーゼをコードするDNA分子の塩基配列を示す図である。
【図３１】変異体ルシフェラーゼをコードするDNA分子の塩基配列を示す図である。
【図３２】変異体ルシフェラーゼをコードするDNA分子の塩基配列を示す図である。
【図３３】変異体ルシフェラーゼのアミノ酸配列を示す図である。
【図３４】変異体ルシフェラーゼのアミノ酸配列を示す図である。
【図３５】変異体ルシフェラーゼのアミノ酸配列を示す図である。
【図３６】変異体ルシフェラーゼのアミノ酸配列を示す図である。
【図３７】変異体ルシフェラーゼのアミノ酸配列を示す図である。
【図３８】変異体ルシフェラーゼをコードするDNA分子の塩基配列を示す図である。
【図３９】変異体ルシフェラーゼをコードするDNA分子の塩基配列を示す図である。
【図４０】変異体ルシフェラーゼをコードするDNA分子の塩基配列を示す図である。
【図４１】変異体ルシフェラーゼをコードするDNA分子の塩基配列を示す図である。
【図４２】変異体ルシフェラーゼのアミノ酸配列を示す図である。
【図４３】変異体ルシフェラーゼのアミノ酸配列塩を示す図である。
【図４４】変異体ルシフェラーゼのアミノ酸配列を示す図である。
【図４５】変異体ルシフェラーゼのアミノ酸配列を示す図である。
【図４６】変異体ルシフェラーゼをコードするDNA分子の塩基配列を示す図である。
【図４７】変異体ルシフェラーゼのアミノ酸配列を示す図である。
【図４８】変異体ルシフェラーゼをコードするDNA分子の塩基配列を示す図である。
【図４９】変異体ルシフェラーゼのアミノ酸配列を示す図である。
【図５０】変異体ルシフェラーゼをコードするDNA分子の塩基配列を示す図である。
【図５１】変異体ルシフェラーゼのアミノ酸配列を示す図である。
【図５２】変異体ルシフェラーゼのアミノ酸配列を示す図である。
【図５３】変異体ルシフェラーゼをコードするDNA分子の塩基配列を示す図である。
【図５４】変異体ルシフェラーゼの６０℃における安定性を示すグラフである。
【図５５】変異体ルシフェラーゼの４℃における安定性を示すグラフである。
【図５６】変異体ルシフェラーゼの５０℃における安定性を示すグラフである。
【図５７】変異体ルシフェラーゼの５０℃における安定性を示すグラフである。
【図５８】変異体ルシフェラーゼの６０℃における安定性を示すグラフである。
【図５９】変異体ルシフェラーゼの２２℃における安定性を示すグラフである。
【実施例】
【００５５】
以下の実施例は本発明の方法と組成物およびそれらの実施態様を示す。
【００５６】
実施例１ 本発明の熱安定性ルシフェラーゼの製造
【００５７】
変異誘発方法
例示的な変異誘発法は以下の通りである。
【００５８】
「最も良い」ルシフェラーゼクローン、すなわち、向上した熱安定性を有し、他のパラメーターについては明らかな減少のない値を有するクローンから、ランダム変異誘発をエラーしがちなＰＣＲの三変法により行った。ランダム変異誘発の各サイクルから、最も良い１８クローンを選択した。ＤＮＡをこれらのクローンから調製して合計５４クローンを作った。これらのクローンは新しい遺伝的多様性を表わす。
【００５９】
これらの５４クローンを組合せて、組換え変異誘発を実施した。この集団から１８個の最も良いクローンを選択した。
【００６０】
これらの１８クローンを前の集団の１８クローンと組合せて、組換え変異誘発を実施した。このスクリーニングから、６グループの機能的性質を表わす１８クローンの新しいルシフェラーゼ集団を選択した。
【００６１】
このスクリーニングにおいて、選択された５４クローンの新しい変異は、それらが元の配列の立体配置にあってもそれらの組換え体にあっても、二回スクリーニングした。各変異を平均約１０回分析した。組換え変異誘発に用いられた９０クローンのうち、少なくとも１０クローンは最も良いクローンと機能的に同等であるようであった。よって、最も良いクローンまたはその組換え体を少なくとも１００回スクリーニングしなければならなかった。これは組換えで用いられたクローンの数よりも多いので、最も良いクローンと他のクローンとの生産的な組換えを発見するという意義深い見込みがあった。
【００６２】
ロボット処理法：
熱移動は、９６ウエルプレートがロボットの腕により配置される多くの位置において厚いアルミニウムを用いることによりロボットプロセス中で調節した。例えば、インキュベーターまたは冷蔵庫中のすべての棚が１／４インチアルミニウムから作られた。特に、室温に置かれた一つの位置は４．５×７×６．５インチの大きさのアルミニウムブロックから作った。９６ウエルプレートを高温（例えば、インキュベーター）または低温（例えば、冷蔵庫）から室温の装置に移したときに、それを温度平衡化のために大きなアルミニウムブロック上に最初に置いた。この手段により、完全なプレートは新しい温度に迅速に達し、温度の違いによるプレート中の多様なウエルの同等でない気化を最小化する。（例えば、大腸菌の一晩成長のために）インキュベーターに置かれた多量の９６ウエルプレートの熱移動を、該プレート間に１ｍｍ厚みのアルミニウムシートを置くことによって調節した。これにより多量のプレートの縁から中心までのより十分な熱移動が可能となった。ロボット法での混合は各試薬を加えた後の数秒間、該プレートをシェーカーに置くことで調節した。
【００６３】
プレートが分析される順番の概略図（図１５）および以下の働きを実施するためにプログラミングできるロボット装置については図１４を参照されたい。
【００６４】
培養希釈法。細胞を含有するプレート（蓋付き）をシェーカーに置き、３〜５分間混合する。
【００６５】
（蓋付きの）プレートを円形コンベヤーから取り出し試薬ディスペンサーに置く。１８０μｌの培地を蓋を取り除いた後に加えてピペッター近くのロケーターに置く。次にプレートをピペッターに置く。
【００６６】
シェーカー上のプレートをピペッターに置き、蓋を外してロケーターに置く。細胞をピペット操作を用いて新しいプレートに移す（「新しい細胞プレートへの細胞の希釈」を参照されたい）。
【００６７】
これらの蓋を両プレートに戻す。この新しいプレートを冷蔵庫に置き、古いプレートを円形コンベヤーに戻す。
【００６８】
発光アッセイ法。細胞を含有するプレートを円形コンベヤーから回収して、シェーカーに３〜５分間置いて細胞を十分に混合する。細胞は放置すると沈殿する傾向がある。
【００６９】
光学密度（Ｏ．Ｄ．）を測定するために、プレートをシェーカーから出してルミノメーターの近くのロケーターに移す； 蓋を外し、プレートをルミノメーターに置く。そのＯ．Ｄ．は６２０ｎｍフィルターを用いて測定する。
【００７０】
それが終わったら、次に該プレートを保存のために冷蔵庫に置く。
【００７１】
上記の工程はその後の処理に進む前にすべてのプレートについて完了する。
【００７２】
細胞溶解物を調製するために、細胞プレートを最初に冷蔵庫から回収し、シェーカーで混合して、細胞を再懸濁する。円形コンベヤーからの蓋なしの新しいプレートを試薬ディスペンサーに置き、２０μｌの緩衝液Ａを各ウエルに加える。これをピペットステーションに置く。
【００７３】
シェーカー中の細胞プレートをピペットステーションに置く。娘プレートをピペット操作を用いて調製し（「溶解プレートへの細胞のピペッティング」を参照）、細胞の娘プレートを調製する。
【００７４】
ピペッティング後、新しい娘細胞を混合のためにシェーカー上に置く。このプレートを円形コンベヤー中の元の位置に戻す。
【００７５】
混合後、溶解物プレートをＣＯ２フリーザーに置いて試料を凍結する。次に、プレートを解凍ブロックに移動させて１０分間解凍する。
【００７６】
次に、プレートを試薬ディスペンサーに移動させて１７５μｌの緩衝液Ｂを加えて、次にシェーカー上で約１５分間以上混合する。凍結／解凍の組合せと緩衝液Ｂは細胞を溶解させる。
【００７７】
円形コンベヤーからの蓋付きの新しいプレートを用いて、すべてのアッセイが得られる希釈プレートを調製する。このプレートを試薬ディスペンサーに置いて、蓋をピペッターに近いロケーターに移す。２８５μｌの緩衝液Ｃを試薬ディスペンサーにより各ウエルに加え、次にプレートをピペットステーションに置く。
【００７８】
シェーカー中の溶解物プレートをピペットステーションに移動させて、ピペット法（「溶解プレートからインキュベーションプレートへの希釈」を参照されたい）を用いる。ピペッティング後、新しい娘細胞を混合のためにシェーカーに置く。溶解物プレートは捨てる。
【００７９】
二枚の白色のアッセイプレートをプレートフィーダーから得て、これをピペッターに置く。シェーカーからのインキュベーションプレートをピペッターに置き、蓋を外して近くのロケーターに置く。二つの娘プレートをピペット法を用いて作る（「インキュベーションプレートからの一対の娘細胞の作成」を参照）。その後、蓋を親プレートに戻し、プレートを高温インキュベーターに置く。［クローンにより３１°〜約６５°までの範囲。］
一つの娘プレートをルミノメーターに置き、１×アッセイ法を用いる。アッセイ後、プレートを周囲（温度）インキュベーターに置き、第二の娘プレートをルミノメーターに置く。第二のプレートに関しては、０．０２×アッセイ法を用いる。このプレートを捨て、第一のプレートをインキュベーターからルミノメーターに戻す。繰返しアッセイ法を用いる（すなわち、試薬を注入しない）。その後、プレートを再び周囲インキュベーターに戻す。
【００８０】
上記の工程を処理に取りかかる前にすべてのプレートについて完了する。
【００８１】
第二組の測定を始めるために、高温インキュベーターからのプレートをシェーカーに置いて混合する。
【００８２】
周囲インキュベーター中のプレートをルミノメーターに戻して、繰り返しアッセイ法を再び用いる。その後、プレートを周囲インキュベーターに移す。
【００８３】
二枚の白色のアッセイプレートを再びプレートフィーダーから得て、ピペッターに置く。シェーカー上のプレートをピペッターに置き、蓋を外して近くのロケーターに置く。二つの娘プレートを再びピペット法を用いて作る（「インキュベーションプレートからの一対の娘細胞の作成）」を参照）。その後、蓋を親プレートに戻し、プレートを高温インキュベーターに置く。
【００８４】
一つの娘プレートをルミノメーターに置き、１×アッセイ法を再び用いる。アッセイ後、プレートを捨てる。次に、第二の娘プレートをルミノメーターに置き、０．０６×アッセイ法を用いる。このプレートもを捨てる。
【００８５】
上記の工程を処理に取りかかる前にすべてのプレートについて完了する。
【００８６】
最終組の測定で、高温インキュベーターからのプレートを再びシェーカーに置いて混合する。
【００８７】
周囲インキュベーター中のプレートをルミノメーターに戻し、繰り返しアッセイ法を再び用いる。その後、プレートを捨てる。
【００８８】
一枚の白色のアッセイプレートをプレートフィーダーから得て、ピペッターに置く。シェーカーからのプレートをピペッターに置き、蓋を外して近くのロケーターに置く。一つの娘プレートをピペット法を用いて作る（「インキュベーションプレートからの単一の娘細胞の作成」を参照）。蓋を親プレートに置き、プレートを捨てる。
【００８９】
娘プレートをルミノメーターに置き、１×アッセイ法を用いる。アッセイ後、プレートを捨てる。
【００９０】
緩衝液：
緩衝液Ａ：
２５ｍＭ Ｋ２ＨＰＯ４
０．５ｍＭ ＣＤＴＡ
０．１％トリトンＸ−１００
緩衝液Ｂ：
×ＣＣＬＲ（Ｐｒｏｍｅｇａ ｅ１５３ａ）
１．２５ｍｇ／ｍｌリゾチーム
０．０４％ゼラチン
緩衝液Ｃ：
１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ
１５０ｍＭ ＮａＣｌ
１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ
５％グリセロール
０．１ｍＭ ＥＤＴＡ
１×アッセイ試薬：
５μＭルシフェリン
１７５μＭ ＡＴＰ
２０ｍＭ Ｔｒｉｃｉｎｅ、ｐＨ８．０
０．１ｍＭ ＥＤＴＡ
０．０２×アッセイ試薬：
１×アッセイ試薬の１：５０希釈物
０．０６×アッセイ試薬：
１×アッセイ試薬の１：１５０希釈物
【００９１】
ピペット操作
溶解プレートへの細胞ピペッティング
固定チップを用いての非無菌操作
【００９２】
ピペッターデッキ上：
− およそ２００μｌ細胞を含有する蓋なしプレートを置く
− ２０μｌの緩衝液Ａを含有する溶解物プレート
操作：
１．チップを洗浄ステーションに移動させ、１ｍｌで洗浄する。
２．細胞プレートに移動させ、６０μｌを取る。
３．溶解物プレートに移動させ、４５μｌを分与する。
４．すべての９６試料について工程１〜３を繰り返す。
５．操作の終わりに、工程１を繰り返してチップを清浄にする。
後処理：
− 溶解物プレートをシェーカーに置く。
− 蓋を細胞を有するプレートに置き、円形コンベヤー上に置く。
− 溶解物プレートをＣＯ２フリーザー中に置く。
【００９３】
溶解プレートからインキュベーションプレートへの希釈
【００９４】
ピペッターデッキ上：
− ２４０μｌの溶解物を含有する溶解物プレート。
− ２８５μｌの緩衝液Ｃを含有する蓋なしのインキュベーションプレート
操作：
１．チップを洗浄ステーションに移動させ、０．５ｍｌで洗浄する。
２．溶解物プレートに移動させ、３０μｌを取る。
３．インキュベーションプレートに移動させ、緩衝液に直接に接触させて１５μｌを分与する。
４．すべての９６試料について工程１〜３を繰り返す。
５．操作の終わりに、工程１を繰り返してチップを清浄にする。
後処理：
− インキュベーションプレートをシェーカーに置く。
− 溶解物プレートを捨てる。
【００９５】
インキュベーションプレートからの娘プレート対の作成
この操作は２回行う。
【００９６】
ピペッターデッキ上：
− １００〜３００μｌの溶液を含む蓋なしのインキュベーションプレート
− 二つの空のアッセイプレート（白）
操作：
１．チップを洗浄ステーションに移動させ、０．５ｍｌで洗浄する。
２．インキュベーションプレートに移動させ、５０μｌを取る。
３．第一のアッセイプレートに移動させ、２０μｌを分与する。
４．第二のアッセイプレートに移動させ、２０μｌを分与する。
５．すべての９６試料について工程１〜４を繰り返す。
６．操作の終わりに、工程１を繰り返してチップを清浄にする。
後処理：
１．蓋をインキュベーションプレートに置く。
２．インキュベーションプレートをインキュベーターに置く。
３．第一のアッセイプレートをルミノメーターに置く。
４．第二のアッセイプレートを円形コンベヤー上に置く。
【００９７】
インキュベーションプレートからの単一の娘プレートの作成
【００９８】
ピペッターデッキ上：
１００〜３００μｌの溶液を含む蓋なしのインキュベーションプレートを置く
空のアッセイプレート（白）
操作：
１．チップを洗浄ステーションに移動させ、０．５ｍｌで洗浄する。
２．インキュベーションプレートに移動させ、４０μｌを取る。
３．アッセイプレートに移動させ、２０μｌを分注する。
４．すべての９６試料について工程１〜３を繰り返す。
５．操作の終わりに、工程１を繰り返してチップを清浄にする。
後処理：
− インキュベーションプレートおよびインキュベーションプレート上の蓋を捨てる。
− アッセイプレートをルミノメーターに置く。
【００９９】
新しい細胞プレートへの細胞の希釈
固定チップを用いる無菌操作
【０１００】
ピペッターデッキ上：
− およそ２００μｌの細胞を含む蓋なしプレート
− １８０μｌの成長培地を含む新しい蓋なし細胞プレート
操作：
１．細胞プレートに動かし、４５μｌを取る。
２．細胞プレートに動かし、２０μｌ容量を直接の液体／液体移動により分与する。
３．廃棄物リザーバーに動かし、過剰の細胞を排出する。
４．イソプロパノール洗浄ステーションに動かし、イソプロパノールを吸引してチップを滅菌する。
５．洗浄ステーションに動かし、イソプロパノールを排除し、チップを洗浄する。
６．すべての９６試料について工程１〜４を繰り返す。
後処理：
１．蓋を元の細胞プレートに戻し、円形コンベヤー上に置く。
【０１０１】
２．蓋を新しい細胞プレートに戻し、冷蔵庫に置く。
注意：
この操作を用いて主要分析操作で用いられる細胞プレートを調製する。
１８０μｌの成長培地を、ピペット操作を始める直前に試薬ディスペンサーによって新しい細胞プレートのそれぞれに加える。
ディスペンサーは、培地を入れる前に７５％イソプロパノールでさっと洗う。
培地は潜在的汚染を減少させるために選択的抗生物質も含有する。
【０１０２】
ルミノメーターの操作
【０１０３】
１×アッセイ法
− プレートをルミノメーターに入れる
１．１００μｌの１×アッセイ試薬を注入する
２．発光を１〜３秒間測定する
３．次のウエルに対して繰り返す
− すべてのウエルが測定されるまで続ける
【０１０４】
０．０２×アッセイ法
− プレートをルミノメーターに入れる
１．１００μｌの０．０２×アッセイ試薬を注入する
２．発光を１〜３秒間測定する
３．次のウエルに対して繰り返す
− すべてのウエルが測定されるまで続ける
【０１０５】
０．０６×アッセイ法
− プレートをルミノメーターに入れる
１．１００μｌの０．０６×アッセイ試薬を注入する
２．発光を１〜３秒間測定する
３．次のウエルに対して繰り返す
− すべてのウエルが測定されるまで続ける
【０１０６】
繰返しアッセイ
− プレートをルミノメーターに入れる
１．発光を１〜３秒間測定する
２．次のウエルに対して繰り返す
− すべてのウエルが測定されるまで続ける
【０１０７】
インビボ選択法
２枚のマイクロプレート（１７６クローン）あたり５〜７枚のニトロセルロースディスク（１枚のディスクあたり２００〜５００個のコロニー（総計１０００〜３５００個のコロニー））をスクリーニングする。これらのクローンを標準的スクリーニング条件を用いて高温でスクリーニングする。
【０１０８】
各マイクロプレート中の８つの位置が、「最も良い」ルシフェラーゼを用いる参照クローン（ランダム変異誘発およびコドン変異誘発用の親クローン）のためにとっておく。保存ウエルの位置は下記で“Ｘ”として示す。
【０１０９】
ＸooooooooooＸ
oooooooooooo
oooＸooooＸooo
oooooooooooo
oooooooooooo
oooＸooooＸooo
oooooooooooo
ＸooooooooooＸ
【０１１０】
親クローンからの形質転換ＤＮＡからのコロニーを参照ウエルに置くことにより参照クローンを作る。（マイクロプレートへの接種前にこれらのウエルを同定するために、ウエルを黒マーカーペンで各ウエルの底にマークする）。
【０１１１】
スクリーングの選択基準
以下のものを用いてスクリーニングした。基準１は手動で行う；基準２〜６に関するデータは機械による分析で作る。すべての基準に関して、記載された最大値を選択する。
【０１１２】
１．インビボスクリーニング。最も明るいクローンを高温で選択する。
【０１１３】
２．発現／比活性。標準化されたルシフェラーゼの値を光学密度に対する発光の比として計算する。その値を参照値を用いた比として報告する。
【０１１４】
３．酵素安定性。インキュベートされた試料（約１５時間にわたって取られた３試料）の標準化された発光の測定をｌｎ（Ｌ）＝ｌｎ（Ｌ０）−（ｔ／τ）（式中、Ｌは標準化された発光であり、ｔは時間である）に代入する。τは酵素安定性の尺度である。その値は参照値を用いた比率として報告し、相関係数を計算する。
【０１１５】
４．基質の結合。１×と０．００２×による標準化発光の測定値が最初の読み組で取られ、１×と０．０６×による測定値を５時間の読み組で取る。０．０２×：１×と０．０６×：１×の比率は０．０２×濃度と０．０６×濃度での相対的発光を与える。１×（すなわち、１）での相対的発光とともにこれらの値をＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋプロットの形にして、基質のＡＴＰ、ルシフェリンおよびＣｏＡに対するＫｍ：ａｐｐ，ｔｏｔａｌを得る。この値を参照値を用いた逆数の比として報告し、相関係数を計算する。
【０１１６】
５．シグナル安定性。最初の１×発光反応の発光を約１５時間にわたってさらに３回再測定する。これらの値をｌｎ（Ｌ）＝ｌｎ（Ｌ０）−（ｔ／τ）に代入し、ｔ（１５時間）にわたる積分を計算する。次に、シグナル安定性をＳ＝（１−ｉｎｔ（Ｌ）／Ｌ０ｔ）２として計算する。その値を参照値を用いた逆数の比として報告し、相関係数を計算する。
【０１１７】
６．合成適合。基準２〜５の値を組み合わせて単一の適合合成値（または商業的有用値）とする。この値は他の基準の相対的重要性の判断に基づく。この判断は下記に与えられる：
基準 相対値
安定性 ５
シグナル安定性 ２
基質の結合 ２
発現／活性 １
【０１１８】
合成、Ｃ＝合計（基準２〜５は相対値により評価された；例えば、安定性が主な目標であったので、それに対してさらに重きがおかれる。）
【０１１９】
実施例２ ソフトウエア
操作： データをＳＱＬデータベースに入れる。ルミノメーター（９６ウエル）（オーストリア、Ａｎｔｈｏｓ）により作られた各ファイルは一つのマイクロプレートからのデータを表わす。これらのファイルはルミノメーターを調節するコンピュータに保存され、ネットワークリンクによりデータベースコンピュータに連結している。試料の各マイクロプレートから、９枚のマイクロプレート（光学密度用のオリジナルのマイクロプレートと発光用の８枚の娘マイクロプレート）がルミノメーターで読まれる。
【０１２０】
合計９０ファイルが作られ、各ファイルが９６試料のデータ組を有する。各データ組は、試料番号、プレートの最初の測定に対する各測定の時間、ルミノメーターの読み、およびバックグラウンドが補正されたルミノメーターの読みを有する。他のファイルヘッダー情報も与えられる。各マイクロプレートが読まれる時間も分析のために必要とされる。これはロボットのログまたはファイル作成時間から得ることができる。ファイルの命名方法は、ＳＱＬによって認識されうるファイル作成中にロボットにより用いられる（例えば、ＹＹＭＭＤＤＰＲ．ＤＡＴ（ここでＹＹは年であり、ＭＭは月であり、ＤＤは日であり、Ｐは最初のプレート［０−９］、およびＲが読み［０−８］である））。
【０１２１】
操作： データの換算と組織化。
− 発光データを標準化する：８枚の娘プレート中の発光の各測定のために、標準化された発光を、最初のプレートの光学密度で割ることにより計算する。標準化発光の値がゼロ未満である場合、０．１ｓＬの値（ここでｓＬは標準化発光の測定用標準偏差である）を割り当てる。
【０１２２】
− 相対的測定時間を計算する：各標準化発光測定のために、測定時間を試料の最初の測定に対して計算する。例えば、プレート７の試料Ｂ６（すなわち、７：Ｂ０６）のすべての発光測定の時間を７：Ｂ０６の最初の読みに対して計算する。この時間の計算は、プレートが読まれる時間と試料がプレート中で読まれる相対的時間の両方を伴うであろう。
【０１２３】
− 酵素安定性（τ）を計算する：各試料に関して、一次回帰を用い、１×基質濃度を用いる３発光測定（プレート１、５、８）を用いてｌｎ（Ｌｌｘ）＝ｌｎ（Ｌ０）−（ｔ／τ）に代入する。回帰係数も計算する。
【０１２４】
− 基質の結合（Ｋｍ：ａｐｐ，ｔｏｔａｌ）を計算する：第一組の読みからのマイクロプレート（プレート１と２）を用いて、０．０２×の基質濃度を用いた測定値を１×の測定値で割ることによりＬ０．２ｘ，ｒｅｌを計算する。同様に、０．０６×の基質濃度を用いた測定値を１×の測定値で割ることにより、第二組の読みのマイクロプレート（プレート５と６）を用いてＬ０．０６ｘ，ｒｅｌを計算する。
【０１２５】
各試料に関して、一次回帰を用い、以下のものを用いて１／Ｌ＝（Ｋｍ：ａｐｐ，ｔｏｔａｌ／Ｌｍａｘ：ａｐｐ）（１［Ｓ］）＋（１／Ｌｍａｘ：ａｐｐ）に代入する。
Ｌ ［Ｓ］
Ｌ０．０２ｘ，ｒｅｌ ０．０２
Ｌ０．０６ｘ，ｒｅｌ ０．０６
１（Ｌｌｘ，ｒｅｌ） １
【０１２６】
Ｋｍ：ａｐｐ，ｔｏｔａｌは傾き／切片として計算する。回帰係数も計算する。
【０１２７】
− シグナル安定性（Ｓ）の計算： 各試料に関して、一次回帰を用い、１×基質濃度を用いる最初のマイクロプレートの４つの発光測定（プレート１、３、４および７）を用いてｌｎ（Ｌ）＝ｌｎ（Ｌ０）−（ｔ／τ）に代入する。回帰係数も計算する。τとＬ０の計算された値から、ｉｎｔ（Ｌ）＝τＬ０（１−ｅｘｐ（−ｔｆ／τ））（式中、ｔｆは最後の測定の平均時間（例えば１５時間）である）により発光の積分を計算する。シグナル安定性はＳ＝（１−ｉｎｔ（Ｌ）／Ｌｉｔｆ）２（式中、Ｌｉは１×基質濃度（プレート１）を用いて標準化された発光の最初の測定値である）として計算する。
［注意： 気化に対する補正のために、式Ｓ＝（１＋Ｋ−ｉｎｔ（Ｌ）／Ｌｉｔｆ）２（式中、１／Ｋ＝２（ｔｆでの液体容量の相対的変化））を用いてよい。］
【０１２８】
− 参照値面を計算する：３次元座標システムは、横座標としてマイクロプレート内の試料の格子位置を用い、縦座標として試料の計算された値（Ｌｉ、Ｋｍ：ａｐｐ，ｔｏｔａｌ τまたはＳ）を用いることにより定義できる。この三次元システムは「プレートマップ」と呼ばれる。参照レベルを表わすプレートマップ上の滑らかな面が各マイクロプレート中の８参照クローンについて決定された値の最小自乗法適合により決定できる。試料の１０個の最初のマイクロプレートのそれぞれに関して、各参照面をＬｉ、τ、Ｋｍ：ａｐｐ，ｔｏｔａｌおよびＳの基準パラメーターについて決定する（合計４０面）。
【０１２９】
最小自乗法適合において、縦座標（すなわち、基準パラメーター）は依存変数であり、横座標は独立変数である。１次面（すなわち、ｚ＝ａｘ＋ｂｙ＋ｃ）を参照クローンの値に適合させる。面を計算した後、各参照クローンの残りを計算する。これらの残りのいずれかが所与の切断範囲の外にある場合、異常な参照クローンを省略して参照面を再度計算する。
【０１３０】
一次面が参照クローンの値を十分に示さない場合、制限された二次面を用いる（すなわち、ｚ＝ａ（ｘ２＋ｋｙ２）＋ｂｘ＋ｃｙ＋ｄ（式中、ｋは定数である））。
【０１３１】
− 参照標準化値を計算する：各試料の基準パラメーターに関して、参照標準化値は各参照値を用いた比または逆数の比を計算することにより決定する。参照標準化値は、Ｌｉ／Ｌｉｒ、τ／τｒ、Ｋｍｒ／Ｋｍ：ａｐｐ，ｔｏｔａｌおよびＳｒ／Ｓ（ここで、参照値は適当な参照面の等式から計算する）である。
【０１３２】
− 合成スコアを計算する：各試料について、Ｃ＝５（τ／τｒ）＋２（Ｓｒ／Ｓ）＋２（Ｋｍｒ／Ｋｍ：ａｐｐ，ｔｏｔａｌ）＋（Ｌｉ／Ｌｉｒ）を計算する。
【０１３３】
− サブグループを決定する：基準パラメーターであるＫｉ、τ、Ｋｍ：ａｐｐ，ｔｏｔａｌ、ＳおよびＣに関して、サブグループに関する境界を定める値（すなわち、ビンサイズ）が、ｇＬ、ｇτ、ｇＫｍ、ｇＳおよびｇＣとして定義される。Ｌｉ、τまたはＣに関する最大値またはＫｍ：ａｐｐ，ｔｏｔａｌまたはＳの最小値から始めて、試料を各規準パラメーターのビンに割り当てる（最初のビンは＃１、等々である）。
− 参照標準化値の分類された表を示す：各列で以下のデータを示す各試料のデータの表を示す：
− 試料同定番号（例えば、７：Ｂ０６）
− 合成スコア（Ｃ）
− 参照標準化酵素安定性（τ／τΓ）
− 酵素安定性の相関係数
− 酵素安定性のビン数
− 参照標準化シグナル安定性（ＳΓ／Ｓ）
− シグナル安定性の相関係数
− シグナル安定性のビン数
− 参照標準化基質結合（ＫｍΓ／Ｋｍ：ａｐｐ，ｔｏｔａｌ）
− 基質結合の相関係数
− 基質結合のビン数
− 参照標準化発現／比活性（Ｌｉ／ＬｉΓ）
− 発現／比活性のビン数
この表は合成スコア（Ｃ）により分類される。
【０１３４】
操作：基準パラメーターの分類された表を示す。
各列で以下のデータを示す各試料のデータの表を示す：
− 試料同定番号
− 合成スコア（Ｃ）
− 酵素安定性（τ）
− 酵素安定性の相関係数
− 酵素安定性のビン数
− シグナル安定性（Ｓ）
− シグナル安定性の相関係数
− シグナル安定性のビン数
− 基質結合（Ｋｍ：ａｐｐ，ｔｏｔａｌ）
− 基質結合の相関係数
− 基質結合のビン数
− 発現／比活性（Ｌｉ）
− 発現／比活性のビン数
【０１３５】
この表は合成スコア（Ｃ）により分類される；参照クローンは表から除外する。上記のように標準偏差による同じエントリーコード。
【０１３６】
操作：参照標準化値の分類された表を示す。
これはデータ換算操作の最終工程と同じ操作である。この表は以下のものを示す：
− 試料同定番号
− 合成スコア（Ｃ）
− 参照標準化酵素安定性（τ／τΓ）
− 酵素安定性の相関係数
− 酵素安定性のビン数
− 参照標準化シグナル安定性（ＳΓ／Ｓ）
− シグナル安定性の相関係数
− シグナル安定性のビン数
− 参照標準化基質結合（ＫｍΓ／Ｋｍ：ａｐｐ，ｔｏｔａｌ）
− 基質結合の相関係数
− 基質結合のビン数
− 参照標準化発現／比活性（Ｌｉ／ＬｉΓ）
− 発現／比活性のビン数
【０１３７】
この表は合成スコア（Ｃ）により分類される； 参照クローンは表から除外する。上記のように標準偏差による同じエントリーコード。
【０１３８】
操作：参照クローンの基準パラメーターの分類された表を示す。
これは、参照クローンのみを除けば、基準パラメーターについて上記した操作と同じである。この表は以下のものを示す：
− 試料同定番号
− 合成スコア（Ｃ）
− 酵素安定性（τ）
− 酵素安定性の相関係数
− 酵素安定性のビン数
− シグナル安定性（Ｓ）
− シグナル安定性の相関係数
− シグナル安定性のビン数
− 基質結合（Ｋｍ：ａｐｐ，ｔｏｔａｌ）
− 基質結合の相関係数
− 基質結合のビン数
− 発現／比活性（Ｌｉ）
− 発現／比活性のビン数
【０１３９】
表は合成スコア（Ｃ）により分類される。上記のように標準偏差による同じエントリーコード。
【０１４０】
操作：参照標準化値の分類された表を示す。
これは、参照クローンのみを除いて標準化値について上記した操作と同じである。この表は下記のものを示す：
− 試料同定番号
− 合成スコア（Ｃ）
− 参照標準化酵素安定性（τ／τΓ）
− 酵素安定性の相関係数
− 酵素安定性のビン数
− 参照標準化シグナル安定性（ＳΓ／Ｓ）
− シグナル安定性の相関係数
− シグナル安定性のビン数
− 参照標準化基質結合（ＫｍΓ／Ｋｍ：ａｐｐ，ｔｏｔａｌ）
− 基質結合の相関係数
− 基質結合のビン数
− 参照標準化発現／比活性（Ｌｉ／ＬｉΓ）
− 発現／比活性のビン数
【０１４１】
表は合成スコア（Ｃ）により分類される。上記のように標準偏差による同じエントリーコード。
【０１４２】
操作：表を分類する。
どの表も一次キーおよび二次キーにより分類してよい。
【０１４３】
操作：表のヒストグラムを示す。
どの表に関しても、ビン数に対する基準パラメーターのヒストグラムをいずれの基準パラメーターに関して示してもよい。
【０１４４】
操作：プレートマップを示す。
どのプレートに関しても、下記の選択を示すプレートを示してよい：
− 発光または光学密度の測定
− Ｌｉ
− Ｌｉ参照面
− Ｌｉ／Ｌｉｒ
− τ
− τ参照面
− τ／τｒ
− τの相関係数
− Ｓ
− Ｓ参照面
− Ｓｒ／Ｓ
− Ｓの相関係数
− Ｋｍ：ａｐｐ，ｔｏｔａｌ
− Ｋｍ参照面
− Ｋｍｒ／Ｋｍ：ａｐｐ，ｔｏｔａｌ
− Ｋｍ：ａｐｐ，ｔｏｔａｌに関する相関係数
− 合成スコア（Ｃ）
【０１４５】
プレートマップは三次元の棒チャートとして示す。好ましくは、参照クローンを示す棒は色または幾つかの他の手段で示す。
【０１４６】
操作：各エントリーのドリルダウン要約を示す。
Ｌｉ、τ、Ｋｍ：ａｐｐ，ｔｏｔａｌおよびＳに関して、表中のエントリー値を選択して、計算値の基礎となる発光および光学密度の読み、および適当であれば曲線適合のグラフ的表現を示す。好ましくは、関係する等式および最終結果および相関係数も示されよう。
【０１４７】
− ＬｉまたはＬｉ／Ｌｒ。プレート０およびプレート１中の選択された試料からの光学密度および発光値を示す。
【０１４８】
− τまたはτ／τｒ。プレート０、プレート１、プレート５およびプレート８中の選択された試料からの光学密度または発光値を示す。データポイントおよび最も良いラインを示すｌｎ（Ｌ１×）対ｔのグラフを示す。
【０１４９】
−ＳまたはＳｒ／Ｓ。プレート０、プレート１、プレート３、プレート４およびプレート７中の選択された試料からの光学密度または発光値を示す。データポイントおよび最も良いラインを示すｌｎ（Ｌ）対ｔのグラフを示す。
【０１５０】
− Ｋｍ：ａｐｐ，ｔｏｔａｌまたはＫｍｒ／Ｋｍ：ａｐｐ，ｔｏｔａｌ。プレート０、プレート１、プレート２、プレート５およびプレート６中の選択された試料からの光学密度または発光値を示す。データポイントおよび最も良いラインを示す１／Ｌ対１／［Ｓ］のグラフを示す。
【０１５１】
実施例３ 新規なルシフェラーゼの調製
図１の遺伝子は２４９位に単一の塩基対変異（ＴからＭ）を有する。このクローンはＬｕｃの配列から黄色シフトした５５２ｎｍにスペクトル最大を有する。この変異体はインビボで約５倍明るく、より効率的なスクリーニングを可能としたのでオリジナルの鋳型として選択した。
【０１５２】
Ｃ末端の変異誘発
パーオキシゾームの標的シグナル（−ＳＫＬ）を除去するために、ＬをＳＴＯＰに変異させて、そのすぐ上流の３コドンをここに記載のオリゴヌクレオチド変異誘発法にしたがってランダム化した。これを達成するために設計された変異誘発オリゴヌクレオチドも独自のＳｐｅＩ部位を導入して、配列決定することなしに変異体の同定を可能とする。変異体はインビボでスクリーニングし、１３コロニーをピックアップし、そのうち１２コロニーがＳｐｅＩ部位を有した。
【０１５３】
Ｎ末端の変異誘発
発現が向上しうるかどうかを調べるために、開始のＭｅｔからすぐ下流の３コドンをここに記載のようにランダム化した。これを達成するように設計された変異誘発オリゴも独自のＡｐａＩ部位を導入して、配列決定することなしに変異体の同定を可能とする。７つのクローンが選択され、単離されたプラスミドのうち６個が変異体であることが確認された。
【０１５４】
ＣおよびＮ末端変異体のシャフリング
ＣおよびＮ末端変異誘発を並べて行った。ＮおよびＣ末端変異物を組み合わせるために、各変異誘発実験からの選択されたクローンをここに記載の組換え変異誘発法による組換え変異誘発の利用を用いて組み合わせた。シャッフルされた変異体をａｍｐＳ ｐＲＡＭ骨格中にサブクローニングして、ＤＨ５ Ｆ’ＩＱにてスクリーニングした［ＢＲＬ、Ｈａｎａｈａｎ、１９８５］。合計２４クローンがピックアップされ、わずかに４クローンのみがＮ末端とＣ末端の変異を有した。これらの４クローンを、遺伝子のシステイン位置のランダム化のための鋳型として用いた。
【０１５５】
システイン位置をランダム化するための変異誘発／Ｌｕｃ遺伝子のランダム変異誘発と組換え変異誘発
Ｐｐｅ−２遺伝子には７つのシステイン位置が存在する。これらの位置はタンパク質の脱安定化を引き起こし得る酸化を受け易い。７個のオリゴヌクレオチドがシステイン位置をランダム化するために作られた。
【０１５６】
これらのオリゴヌクレオチドを、異なるファミリーに由来する他のルシフェラーゼ遺伝子中のシステインの保存に基づき二つのグループにまとめた。グループ１は保存されたシステイン位置のＣ−６０、Ｃ−８０およびＣ−１６２をランダム化した。グループ２は、Ｃ−３８、Ｃ−１２７、Ｃ−２２１およびＣ−２５７の位置で厳密には保存されていないシステインをランダム化する。
【０１５７】
Ｎ末端とＣ末端の変異誘発からの４つの選択した鋳型をアンピシリン感受性骨格中にサブクローニングし、一本鎖ＤＮＡを鋳型のそれぞれについて調製した。これらの鋳型を等量で組合せ、オリゴヌクレオチド変異誘発をここに記載のように成し遂げた。２グループのそれぞれが２×１０４個の独立形質転換体を有することが一晩のインキュベーション前にｍｕｔＳ形質転換のアリコートを塗布することにより決定された。ＭｕｔＳ−ＤＮＡは２グループについて調製され、これを用いてＪＭ１０９細胞を形質転換して、スクリーニングした。グループ１からの変異体をインビボでスクリーニングして、収穫物を全ロボット実験のために作った。向上した特性を有した５クローンが選択された。グループ２からの変異体をインビボでスクリーニングし、収穫物を全ロボット実験のために作った。ロボットの温度インキュベーターはこの組の実験のために３３℃に設定した。向上した特性を有した１０クローンが選択された。
【０１５８】
システイン変異誘発実験の両グループからの１５個の最も良い収穫物をここに記載にようにシャッフルし、最も良いクローンの１８個をロボットプロセスの後に選択した。
【０１５９】
上記の実験（３１−１Ｇ８）からの最も良いクローンをその後の変異誘発の繰り返しの鋳型として選択した。（高温ロボットインキュベータ温度は４２℃に設定した）。もう一つの変異誘発の完全な繰り返しを完了した。
【０１６０】
上記の変異誘発からの１８個の最も良いクローンを採取し、クローン（３９−５Ｂ１０）を最も良いクローンとして選択し、もう一つの変異誘発の繰り返しの鋳型として用いた。（この高温ロボットインキュベーター温度は４９℃に設定した）。
【０１６１】
このサイクル後、最も良いクローンのうち６個を配列決定のために選択した。配列データに基づいて、９つの位置をランダム化のために選択し、７つのオリゴをこれらの位置をカバーするように設計した。ロボットから作られたデータに基づいて、配列決定した６クローンのグループからの最も良いクローンがクローン（４９−７Ｃ６）であることが決定された。このクローンからのルシフェラーゼ遺伝子をアンピシリン感受性ｐＲＡＭ骨格中にサブクローニングし、一本鎖ＤＮＡを調製した。選択された位置のランダム化は上記のオリゴヌクレオチド変異誘発操作にしたがって達成した。
【０１６２】
ランダム化用オリゴを４グループに分け、これらの実験からの形質転換体を採取し、二つのロボット実験を達成した。１０個のクローンをこれらの二実験から選択した。（ロボットの高温ロボットインキュベーターは５６℃に設定した）。
【０１６３】
上記の２実験からの最も良い１０収穫物およびクローンの以前の集団からの最も良い１８収穫物をともにシャッフルした（組換え変異誘発法）。
【０１６４】
最も良い１８個のクローンを選択し、クローン５８−０Ａ５が最も良いクローンであると決定された。次に、このクローンをもう一つの変異誘発の繰り返し用の鋳型として用いた。高温ロボットインキュベーター温度を５６℃に設定した。クローン７１−５０４を新しい模範クローンとして選択し、もう一つの変異誘発の繰り返しを達成した。インキュベーターは６０℃に設定した。
【０１６５】
最も良い１８収穫物を選択し、このグループからの最も良いクローンがクローン７８−０Ｂ１０であると決定された。多様な温度でのクローンの温度安定性を図に示す。
【０１６６】
実施例４ クローン７８−０Ｂ１０から９０−１Ｂ５までの変異誘発方法
１．２８個の位置を共通位置に変えるように２３個のオリゴ（オリゴヌクレオチド）を作った。すべてのオリゴを、鋳型としてクローンｌｕｃ７８−０Ｂ１０からの一本鎖ＤＮＡによるオリゴ特異的変異誘発を用いて個々に調べてどのオリゴが安定性の向上をもたらすかを決定した。変異誘発オリゴを示す表を下記に示す。
【０１６７】
【表１】
＊オリゴ＃６２３４は共通位置を変えないことに注意されたい。このオリゴは２４９位の野生型ＰＰＥ−２コドンへ復帰を引き起こす。この位置の復帰は熱安定性を高めることが示されたが、この位置の復帰は光産出を減少させた。
【０１６８】
２．クローンｌｕｃ７８−０Ｂ１０を鋳型として用いるオリゴヌクレオチド特異的変異誘発：
上記の変異誘発オリゴヌクレオチドを個々に調べた結果に基づいて、３実験を完了し、これらの実験のオリゴを次のように分けた：
ａ．（高められた安定性を与えることが分かった）６２１５、６２３４、６２３６、６２４８
ｂ．（中間または高められた安定性を有することが分かった）
２１５、６２１７、６２１８、６２１９、６２２０、６２２１、６２２２、６２３１、６２３３、６２３４、６２３６、６２３８、６２４７、６２４８、６２４９、６２５１、６２５３。
ｃ．すべての２３オリゴ。
【０１６９】
３．上記の３実験からの選択物をロボットスクリーニング操作によりスクリーニングした（実験８４）。（ｌｕｃ７８−０Ｂ１０をコントロールとして用いた）。
【０１７０】
４．実験８４からの選択物を、組換え変異誘発操作を用いて組換え、次にロボットスクリーニング操作を用いてスクリーニングした（実験８５）。
【０１７１】
５．一本鎖のＤＮＡをｌｕｃ８５−３Ｅ１２、ｌｕｃ８５−４Ｆ１２、ｌｕｃ８５−５Ａ４の３つのクローンから調製した。これらのクローンをオリゴヌクレオチド特異的変異誘発用の鋳型として用いてコドンの利用を向上させた。Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｖｏｌ．１８（増刊号）１９９０、ｐ．２４０２で発表されたコドンの利用に基づいて位置を選択した。下記の表は大腸菌でコドンの利用を向上させるために用いられたオリゴを示す。
【０１７２】
【表２】
【０１７３】
６．最初の実験において、実験８５からの上記の３鋳型を組み合わせて、オリゴヌクレオチド特異的変異誘発用の鋳型として用いた。これらすべてのオリゴを一つの実験で組み合わせて、オリゴヌクレオチド特異的変異誘発から得られたクローンを実験８８と同じロボットスクリーニング操作を用いてスクリーニングした。この実験から得られた発光コロニーは比率が低かったので、これらオリゴヌクレオチドを下記のグループで組み合わせたもう一つのオリゴヌクレオチド特異的変異誘発実験を成し遂げた。
ａ．６２５８、６２７３、６２８０、６２８６
ｂ．６２５９、６２７４、６２８１、６２９３
ｃ．６２６０、６２７５、６２８２、６２９４
ｄ．６２６１、６２７６、６２８３、６３０５
ｅ．６２６２、６２７７、６２８４、９３０６
ｆ．６２６３、６２７９、６２８５
【０１７４】
７．グループｂからの試料は低い量の発光コロニーを有したことがわかり、グループｂのオリゴの一つが問題を引き起こしていると仮定された。実験ｂ除くすべての実験から選択物を作った。次に、試料をロボットスクリーニング操作により実験した（実験８９）。
【０１７５】
８．実験８８と実験８９からの選択物を組換え変異誘発法によりシャッフルして、次にロボットスクリーニング操作によりスクリーニングした（実験９０）。
【０１７６】
材料と方法
Ａ．変異誘発法
ここで開示される変異ルシフェラーゼは、ランダム変異誘発およびそれに続くコードされたルシフェラーゼ遺伝子産物の光産出や熱安定性等の複数の特性についての変異遺伝子のインビボスクリーニングにより作られた。この変異誘発は通常３工程方法にしたがって達成された。
【０１７７】
１．ランダム変異誘発による遺伝的多様性の創出。ここで、Ｌｕｃ等の出発配列のエラーしがちなＰＣＲを用いてヌクレオチド配列中に点変異を作った。エラーしがちなＰＣＲはＤＮＡ配列中にほとんど単一点変異のみを作るので、１ヌクレオチド変異あたり理論的最大の７アミノ酸変化が可能である。しかし、実際は、１ヌクレオチドあたりおよそ６．１アミノ酸変化が達成できる。ルシフェラーゼの５５０個のアミノ酸に関しておよそ３３００変異体が点変異誘発により可能である。
【０１７８】
２．組換え変異誘発による単一点変異の強化。最初の変異誘発により作られる遺伝的多様性をｓＰＣＲによる少数のクローン中に組換える。このプロセスは変異体クローンの数を減少させるのみならず、変異誘発の速度が高いので、陰性変異につながる確率は顕著である。組換え変異誘発は陽性変異を陰性変異から離す。これらの変異は組換え変異誘発により新しい遺伝子に「再結合」されて新しい配置を生む。次に、組換え変異体のスクリーニング後に、「陰性変異」を有する遺伝子配置を選択しないことにより除去する。組換え変異誘発はエラーしがちなＰＣＲにより作られた最初の変異体の第二スクリーニングとしても役立つ。
【０１７９】
３．選択されたコドンのランダム変異誘発による遺伝的多様性の拡大。ランダムな点変異誘発は限定された数のアミノ酸置換を達成できるにすぎないので、選択されたコドンの完全ランダム化はオリゴヌクレオチド変異誘発により達成する。所与の有利な置換について、同じ位置のそれに代わる他のアミノ酸置換がさらに高い有利性を生じさせるとの仮定に基づく先立つ変異誘発法の結果から、変異すべきコドンを選択する。変異すべき位置は選択されたクローンのＤＮＡ配列決定により同定する。
【０１８０】
Ｂ．最初の変異誘発実験
発現を最適化し、パーオキシゾームの標的配列を除去するために、出発配列のＮ末端とＣ末端の両方をオリゴヌクレオチド特異的変異誘発により修飾した。Ｎ末端において、開始コドンの下流の９塩基をＣ末端においてランダム化し、終止コドンの上流の９塩基をランダム化した。変異体はインビボスクリーニングを用いて分析して、結果として発現に顕著な変化はなかった。
【０１８１】
このスクリーニングからの６クローンをプールし、７個のシステインのコドンを変異させるために用いた。これらのコドンはオリゴヌクレオチド特異的変異誘発を用いてランダム化し、変異体をロボットスクリーニング操作を用いてスクリーニングした。このスクリーニングから、１５クローンが方向性進化のために選択された。
【０１８２】
Ｃ．クローンの生産と試験
幾つかの非常に強力で広く知られた手法を用いて本発明のクローンを作成し、調べる。特に記載がなければ、これらの実験室的な操作は当業者によく知られているものである。熟練実施者によく知られているように、Ｍｕｌｌｉｓにより創案されたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および標準的ＰＣＲ法の多様な改良法（エラーしがちなＰＣＲ、ｓＰＣＲ等）、どの方法によってもよいＤＮＡ配列決定法（ＳａｎｇｅｒまたはＭａｘｘａｍとＧｉｌｂｅｒｔの方法）、どの方法によってもよいアミノ酸配列決定法（例えば、Ｅｄｍａｎ分解）、それにポリヌクレオチドおよびポリペプチド／タンパク質の電気泳動による分離が特に挙げられる。
【０１８３】
Ｄ．ベクターの設計
変異誘発操作に用いられる好ましいベクター（ｐＲＡＭ）は、変異誘発技法を効率的に働かせることのできる幾つかの独自の特徴を有する：
ｐＲＡＭベクターは、単一鎖ＤＮＡの生産に必要な繊維ファージ起源のｆｌを有する。
【０１８４】
二つのＳｆｉＩ部位が遺伝子を挟んでいる。これらの部位は、サブクローニングすべき遺伝子が適当な向きでのみ挿入できるように設計された。
【０１８５】
ベクターはｔａｃプロモーターを有する。
【０１８６】
オリゴヌクレオチド変異誘発に用いられる鋳型は、ベクターをアンピシリン感受性にするｂｌａ遺伝子中の４塩基対の欠失を有する。このオリゴヌクレオチド変異誘発操作は、変異体オリゴヌクレオチドならびにｂｌａ遺伝子に対する機能を回復させるアンピシリン修復オリゴヌクレオチドを用いる。これにより高い比率の変異体の選択を可能とする。（選択を用いない場合、高い比率の変異体を得ることは困難である。）
【０１８７】
Ｅ．ルシフェラーゼの使用
本発明の変異体ルシフェラーゼは、下記のものを含めて、既に公知のルシフェラーゼが使用された適用における使用に適する：
ＡＴＰアッセイ。より高い酵素安定性は、ＡＴＰを欠失させるために設計された試薬が高温（例えば、室温）でさらに大きい保存寿命と操作寿命を有することを意味する。従って、高められた熱安定性を有するルシフェラーゼを用いるＡＴＰの検出方法は新規であり、有用である。
【０１８８】
核酸、タンパク質または他の分子用の発光標識。
ＡＴＰアッセイに対する本発明のルシフェラーゼの利点と同じく、それらの高い保存寿命と操作寿命は発光標識の信頼性と再現性に対して有利である。これは、ハイブリゼーション温度が比較的高く（例えば、４０℃以上）なりうるハイブリゼーション操作における核酸の標識に特に有利である。従って、本発明のルシフェラーゼを用いる核酸、タンパク質または他の分子の標識法は新規であり、有用である。
【０１８９】
遺伝子レポーター。レポーターの検出がもう一つの遺伝子の存在または興味のあるプロセスを知るために用いられる、遺伝子レポーターとしてのルシフェラーゼの広汎な利用において、ルシフェラーゼの高められた熱安定性は、生きた細胞と無細胞翻訳と転写／翻訳システムでの発現の温度に対する少ない依存性を提供する。従って、本発明のルシフェラーゼを遺伝子レポーターとして用いる方法は新規であり、有用である。
【０１９０】
酵素の固定化。物理的表面に非常に近接した酵素は該表面との相互作用により変性しうる。強い局所的な発光を提供するために表面へのルシフェラーゼの高密度固定化は高安定性ルシフェラーゼを用いることにより向上する。従って、本発明のルシフェラーゼを用いる固体表面上へのルシフェラーゼの固定化法は新規であり、有用である。
【０１９１】
ハイブリッドタンパク質。ルシフェラーゼをコードする、他の遺伝子との遺伝子融合遺伝子により、または他の化学的結合法により作られたハイブリッドタンパク質はより長い保存寿命と操作寿命を持つので有利である。従って、本発明のルシフェラーゼを用いる遺伝子的手段または化学的結合によるハイブリッドタンパク質の製造方法は新規であり、有用である。
【０１９２】
高温反応。ルシフェラーゼ反応の光強度はルシフェラーゼが変性し始めるまで温度とともに増加する。熱安定性ルシフェラーゼの使用はより高い反応温度での使用を可能とするので、本発明のルシフェラーゼは高温反応を実施するために新規であり、有用である。
【０１９３】
発光溶液。発光は、教育、展示および娯楽目的等の多くの一般的な用途を有する。これらの適用はさらに長い保存寿命および操作寿命を有する酵素を有することから利点が得られる。従って、本発明のルシフェラーゼを用いる発光溶液の製造方法は新規であり、有用である。
【０１９４】
Ｆ．ホタルルシフェラーゼ
方向性進化のために選択されたホタルルシフェラーゼ遺伝子はＰｈｏｔｕｒｉｓ ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉｃａから単離されたＬｕｃであった。このルシフェラーゼはＷｏｏｄらによりメリーランド州で集められたホタルからクローニングされ、後にオクラホマ州で集められたホタルを用いてＬｅａｃｈ博士により独立にクローニングされた（Ｙｅら）（１９７７）。このルシフェラーゼの変異体（Ｔ２４９Ｍ）はＷｏｏｄらにより作られ、本発明で用いられたのは、それが大腸菌で発現されたときにおよそ５倍の光を作ったからである。
【０１９５】
進化法の概観：方向性進化は、各工程が１）ホタルルシフェラーゼの変異ライブラリーの作成およびそれに続く２）所望の複数の酵素学的特性を有する新しい変異体クローンを同定するためのライブラリーのスクリーニングからなる反復方法によりなされた。
【０１９６】
この方法を始めるために、エラーしがちなＰＣＲ（Ｆｒｏｍａｎｔら、１９９５）を用いて３つの変異ライブラリーを作った。各ライブラリーは最初に大腸菌コロニー中の発光の肉眼での評価により（ＷｏｏｄおよびＤｅ Ｌｕｃａ、１９８７）、そして次に大腸菌細胞溶解物中の酵素学的性質の定量的測定によりスクリーニングした。およそ１０，０００個のコロニーを肉眼でのスクリーニングで調べ、それより７０４個を定量的分析のために選択した。それぞれの定量的スクリーニングから１８個のクローンを選択した。
【０１９７】
３組の１８クローンをそれぞれ一緒にプールし、新しい変異ライブラリーをＤＮＡシャフリングを用いて作り、遺伝子内組換えを行った（ｓＰＣＲ； Ｓｔｅｍｍｅｒ、１９９４）。その結果得られたものをスクリーニングしてもう一組の１８クローンを得た。この組の１８クローンを、その前の繰り返しの進化からの１８クローンと組合せて、もう一つの変異ライブラリーをＤＮＡシャフリングにより作り、前と同じようにスクリーニングすることにより全プロセスを達成した。
【０１９８】
スクリーニング法：定性的な肉眼でのスクリーニングにおいて、コロニーを、比較的明るい発光を保持する能力に関してのみ選択した。大腸菌のコロニー内のルシフェラーゼの熱安定性を、スクリーニングの温度を高めることにより連続的な繰り返しの進化により前進的に刺激した。選択されたコロニーは各々が２００μｌの成長培地を含有する９６ウエルプレートのウエルに接種した。
【０１９９】
定量的スクリーニングにおいて、大腸菌培地の溶解物を１）発光活性、２）酵素安定性、３）保持された酵素代謝回転、および４）基質の結合について調べた。
【０２００】
「発光活性」は、細胞培養物の光学的密度に対する発光強度の比として測定した。
【０２０１】
「酵素安定性」は１０時間にわたる細胞溶解物からの活性損失の速度により測定した。進化の連続的な繰り返しにおいて、溶解物のインキュベーション温度を高めた。
【０２０２】
「保持された酵素代謝回転」は室温で１０時間にわたるシグナル酵素反応の発光の損失速度により決定した。「基質の結合」は希釈基質混合物でアッセイしたときの溶解物の相対的活性により測定した。これらの４種類のパラメーターのうち、選択に対して最も高い優先性を熱安定性に置いた。
【０２０３】
ロボット自動化。ロボット自動化を、培養細胞に対する必要とされた多数の定量的アッセイを正確に実施するための定量的スクリーニングに用いた。一晩培養物を最初に新しい培地中に希釈して、３時間生育させて中間対数期増殖の培養物を作った。次に、各培養物の光学密度を測定し、培養物の一部を凍結／溶解およびリゾチームにより溶解した。さらに、得られた溶解物を分析前に希釈して、高温でインキュベートした。多様な時間で取った希釈溶解物の一部からの発光を測定し、分析方法で規定された多様な条件下に測定した（実施例２を参照）。このデータのコンピュータ分析により上記の定量的選択基準を得た。
【０２０４】
進歩的発達の要約：ＮおよびＣ末端の変異誘発とシステインコドンのランダム化後に、１５クローンのプールをここに記載の２回の繰返し方向性進化に供した。この方法から得られた１８クローンのうち５個の配列決定を行って変異を同定した。これらのうち４９−７Ｃ６と命名された１クローンをさらに詳細な分析とさらなる変異誘発のために選択した。このクローンはルシフェラーゼＬｕｃ［Ｔ２４９Ｍ］と比較して１０個の新しいアミノ酸置換を有した。
【０２０５】
これらの置換の部位における他のアミノ酸置換に対する潜在性を評価するために、オリゴヌクレオチド特異的変異誘発を用いてこれらのコドンをランダム化した。得られたクローンをここに記載のようにスクリーニングし、１８個の選択されたクローンを用いて、２回の新しい繰り返しの方向性進化を開始した。この繰り返しの第二組から得られた１８クローンのうち、７８−０Ｂ１０と命名されたクローンをさらなる研究と変異誘発のために選択した。このクローンはＬｕｃ［Ｔ２４９Ｍ］と比較して１６個の新しいアミノ酸置換を有するルシフェラーゼをコードした。
【０２０６】
鋳型として７８−０Ｂ１０を用いるオリゴヌクレオチド特異的変異誘発を用いて、甲虫ルシフェラーゼ間で既に知られている共通アミノ酸に置換するためにコドンを選択した。この変異実験からの選択物を互いにシャッフルして、次に、最も安定であると決定された３クローンを、大腸菌においてコドン利用を向上させるためのオリゴヌクレオチド変異誘発用の鋳型として用いた。この実験から選択された９０−１Ｂ５と命名されたクローンはＬｕｃ［Ｔ２４９Ｍ］に比較して２８個のアミノ酸置換を有した。共通アミノ酸への変化のために選択された２５クローンのうち、１１個を９０−１Ｂ５と命名されたクローン中で置換した。向上したコドン利用のために選択された３０個の位置のうちわずかに５個が置換され、酵素発現に対する効果をほとんど持たなかった。
【０２０７】
タンパク質の精製。ここに記載された４種類の変異体（Ｌｕｃ［Ｔ２４９Ｍ］、４９−７Ｃ６、７８−０Ｂ１０および９０−１Ｂ５）を既に発表された方法を用いて精製した（Ｈａｓｔｉｎｇｓら、１９９６）。
【０２０８】
酵素学的な特性付け。精製されたタンパク質を２５ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．８、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ、１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡで希釈した。酵素の安定性は異なる温度でインキュベートされた希釈タンパク質から決定し、そのアリコートを異なる時点で取った。発光と時間の自然対数の一次回帰を計算した。半減期は回帰のｌｎ（０．５）／傾きとして計算した。
【０２０９】
Ｅ．ＰＣＲ変異誘発法（ランダム変異誘発）：
ＰＣＲ変異誘発反応
１．対象の遺伝子を有するベクターからプラスミドＤＮＡを調製し、ゲルからＤＮＡ濃度を予想する。
【０２１０】
２．一グループあたり二つの５０μｌ反応物を設定する：
異なる勾配ヌクレオチド濃度を用いた３グループの変異誘発条件がある。
【０２１１】
ここに挙げられた条件は、それぞれの作られた親クローンについて表現型のサブクローニングの後に８〜１０％の範囲の野生型Ｌｕｃコロニーを作る。変異誘発速度は変異誘発後に存在する発光コロニーの数により予想する。８〜１０％の範囲で変異させたクローンの結果に基づいて、このレベルの変異誘発速度が１遺伝子あたり平均約２〜３アミノ酸変化を作ることが決定された。変異誘発が１遺伝子あたり平均して１アミノ酸変化が存在するように選択される場合、平均して５０％のクローンは変異を有さないだろう。（Ｂｏｗｉｅら、１９９０）。
【０２１２】
マスター混合物について：ポリメラーゼ以外のすべての混合物を加え、攪拌し、短時間回転させ、ポリメラーゼを加え、静かに混合する。
【０２１３】
【表３】
＊Ｔａｑ．ポリメラーゼはＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒより購入した（Ｎ８０８−０１０１）。
【０２１４】
１０×Ｔａｑポリメラーゼ緩衝液（Ｔａｑのアリコートを１．５ｍｌチューブに入れて−７０℃で保存する）：
− １Ｍ保存液からの１００ｍＭトリス塩酸、ｐＨ８．４
− ５００ｍＭ ＫＣｌ
プライマーを１ｎｍｏｌ／μｌ保存液から２０ｐｍｏｌ／μｌ実施保存液まで希釈する。
ｐＲＡＭｔａｉｌｕｐ： ５’−ｇｔａｃｔｇａｇａｃｇａｃｇｃｃａｇｃｃｃａａｇｃｔｔａｇｇｃｃｔｇａｇｔｇ−３’
ｐＲＡＭｔａｉｌｄｎ： ５’−ｇｇｃａｔｇａｇｃｇｔｇａａｃｔｇａｃｔｇａａｃｔａｇｃｇｇｃｃｇｃｃｇａｇ−３’
°ＭｎＣｌ２とＭｇＣｌ２は１Ｍ保存液から新しく作る。保存液をろ過滅菌し、滅菌水と混合して１０ｍＭと２５ｍＭの保存溶液を作り、これらをポリスチレンＮａｌｇｅｎｅコンテナー中に４℃で保存する。
熱サイクラーでサイクリングを行う：９４℃で１分間（９４℃／１分間、７２℃／１０分間）１０×。
【０２１５】
３．反応生成物をＷｉｚａｒｄ ＰＣＲ精製キット（Ｐｒｏｍｅｇａ社、マジソン、ウイスコンシン州、ｐａｒｔ＃Ａ７１８ｃ）で精製する：
− ＰＣＲ反応物を、Ｐｒｏｍｅｇａ １００μｌ Ｄｉｒｅｃｔ精製緩衝液（Ｐａｒｔ＃Ａ７２４ａ）を含有する新しいチューブに移す
− １ｍｌのＷｉｚａｒｄ ＰＣＲ精製樹脂（ｐａｒｔ＃Ａ７１８ｃ）Ｐｒｏｍｅｇａを加え、室温で１分間インキュベートする
− 樹脂をＷｉｚａｒｄミニカラムを通して引く
− ８０％エタノールで洗浄する
− マイクロ遠心管中で回転させて過剰のエタノールを除去する
− ５０μｌ滅菌ナノ純水中に溶出させる（水を少なくとも１分間カラムに保つ）
【０２１６】
変異誘発反応の増幅１
１．１グループあたり５つの５０ｍｌ反応物を設定する：
− マスター混合物に対して： ポリメラーゼ以外のすべての混合物を加え、攪拌し、短時間回転させ、ポリメラーゼを加え、静かに混合する。
°天然ＰＦＵ用１０×反応緩衝液は２０ｍＭ ＭｇＣｌ２を含有しているために、それ以上のＭｇＣｌ２を加える必要はない
＋プライマー：
ｐＲＡＭ１８ｕｐ−５’ｇｔａｃｔｇａｇａｃｇａｃｇｃｃａｇ−３’
ｐＲＡＭ１９ｄｎ−５’ｇｇｃａｔｇａｇｃｇｔｇａａｃｔｇａｃ−３’
サイクル条件： ９４〜３０秒（９４〜２０秒、６５〜１分、７２〜３分）２５×（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｇｅｎｅ Ａｍｐ（登録商標） ＰＣＲシステム２４００）
２．１μｌをゲルにかけて増幅生成物をチェックする
３．増幅反応生成物をＷｉｚａｒｄ ＰＣＲ精製キット（Ｐｒｏｍｅｇａ社、ｐａｒｔ＃Ａ７１８ｃ）で精製する：
− ＰＣＲ反応物を、１００μｌのＤｉｒｅｃｔ精製緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｐａｒｔ＃Ａ７２４ａ）を有する新しいチューブに移す
− １ｍｌのＷｉｚａｒｄ ＰＣＲ精製樹脂（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｐａｒｔ＃Ａ７１８ｃ）を加え、室温で１分間インキュベートする
− 樹脂をＷｉｚａｒｄミニカラムを通して引く
− ８０％エタノールで洗浄する
− マイクロ遠心管中で回転させて過剰のエタノールを除去する
− ８８μｌ滅菌ナノ純水中に溶出させる（水を少なくとも１分間カラムに保つ）
１ＰＦＵポリメラーゼを用いるこの増幅工程は２つの理由から導入された：
（ａ）多くの形質転換体の生産のためにＤＮＡ収率を増加させること。
（ｂ）変異誘発ＰＣＲ反応から引き継がれる鋳型ＤＮＡの量を減少させること： （第二の増幅反応用プライマーは変異誘発プライマーに繰り込まれる。変異誘発プライマーは上流と下流プライマーのそれぞれ１１と１２塩基の非特異的末尾を用いて設計された。繰り込まれたプライマーは変異誘発プライマーで既に増幅されたＤＮＡを増幅するだろうが、ｐＲＡＭ鋳型ＤＮＡを増幅することはできない）
【０２１７】
増幅ＰＣＲ変異誘発生成物のサブクローニング
１．ＤＮＡをＳｆｉＩで次のように消化する：
− ２μｌのＳｆｉＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｐａｒｔ＃Ｒ６３９ａ）
− １０μｌの１０×緩衝液Ｂ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｐａｒｔ＃Ｒ００２ａ）
− Ｗｉｚａｒｄ ＰＣＲ ｐｒｅｐからの８８μｌのＤＮＡ（［増幅における］工程３を参照）
− 成分を混合し、２滴の鉱油で積層する； ５０℃で１時間インキュベートする
２．Ｗｉｚａｒｄ ＰＣＲ精製キットで塩とＳｆｉ末端をここに記載のように除去し、そして５０μｌ滅菌ナノ純水に溶出する
３．ｐＲＡＭ（＋／ｒ）骨格への連結（１グループにつき４連結反応を設定する）
− ０．０２５ｐｍｏｌのｐＲＡＭ骨格
− ０．０５ｐｍｏｌの挿入物（通常６〜１２μｌの挿入物の範囲）
− １μｌのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｍ１８０ａ）
− ２μｌの１０×リガーゼ緩衝液（Ｃ１２６ｂ、２５μｌのアリコートに分割し、そして２回を超える回数で凍結／溶解しない）
− 水で２０μｌにし
− 室温で２時間連結し
− １５分間７０℃で熱反応させてリガーゼを失活させる
【０２１８】
形質転換と塗布
１．試料をブタノールで析出させて過剰の塩を除去する（ｎ−ブタノール、Ｓｉｇｍａ製、セントルイス、ミズリー州、ｐａｒｔ＃ＢＴ−１０５）：
（エタノール析出がブタノールの代わりに用いられる場合、７０％エタノールで必要なだけ洗浄する）（過剰の塩は、エレクトロポレーション中に反応を失敗させる放電を引き起こすだろう）
− 水を加えて５０μｌに
− ５００μｌのｎ−ブタノールを加える
− ブタノール／連結混合物が透明となるまで混合し、次に２０分間室温でスピンする
− ヒュームフード中の廃液容器にブタノールを排出させる
− １２μｌの水に再懸濁させ、３０秒間全速でスピンする
２．細胞／ＤＮＡ混合物の調製（４形質転換体＋参照クローンＤＮＡを有するものを設定する）；
− ＤＮＡが沈殿している間に、エレクトロポレーションキュベットを氷上に置く
− １５ｍｌのＦａｌｃｏｎスナップキャップチューブに３ｍｌのＳ．Ｏ．Ｃ．培地を充填し氷上に置く
− ＪＭ１０９エレクトロコンピテント細胞を氷上で解凍する（１連結反応あたり５０μｌ）
− 工程１からの１０μｌの底層（または０．５μｌの参照クローンＤＮＡ）をコンピテント細胞にピペットで入れる
（少量のブタノール残量物は形質転換効率に悪影響を及ぼさない）
− 細胞／ＤＮＡ混合物を氷上に置く
３．エレクトロポレーション
− チューブ、キュベットおよび氷上の細胞／ＤＮＡ混合物をエレクトロポレーション装置に移動させる
− 細胞／ＤＮＡ混合物をキュベットおよびｚａｐにピペットで入れる。装置の設定：
キュベットギャップ： ０．２ｃｍ
電圧： ２．５ｋＶ
容量： ２５μＦ
抵抗： ２００オーム
時間定数： ４．５ｍｓｅｃ
− １ｍｌのＳＯＣ（ＫＣｌを含有する； 培地調製物＃ＫＣＬＭ）をキュベットにピペットで入れ、迅速に回収チューブ（形質転換効率は細胞をキュベットに放置すると減少する）に注ぐ
− すべての試料が処理されるまで回収チューブを氷上に置く
− 細胞を３７℃で３０〜６０分間回復させる
− ニトロセルロースフィルターを有するＬＢ＋ａｍｐプレートに置く
（コロニーの＃は、細胞が６０分間回復する場合、おそらく細胞の複製のために〜２０％高くなる。１０１３０５のｐ．６５を参照）
（スクリーニングの最も良いコロニー密度は１プレートあたり５００である。細胞プレートの現在のバッチに関して〜５００から７５０μｌ）
【０２１９】
Ｆ．組換え変異誘発法またはＤＮＡシャフリング：
プラスミドＤＮＡのＤＮａｓｅ Ｉ消化
１．２％低融点ゲルの調製
− ０．８ｇアガロースを４０ｍｌ（ＮｕＳｉｅｖｅ＃５００８２）中に使用
− 大きな調製コームを使用
− 消化前に確実に固体化させる
【０２２０】
２．４μｇのプールされたプラスミドＤＮＡを消化のために調製する。
【０２２１】
３．下記の表にしたがって氷上に１Ｕ／μｌ ＤＮａｓｅ希釈物を調製する。
【０２２２】
【表４】
＋ＤＮａｓｅ Ｉ、シグマ社製（Ｄ５７９１）
＊ゼラチンを加えて、ＤＮａｓｅがチューブの壁に接着しないようにする。
【０２２３】
この希釈物を氷上に少なくとも３０分間活性を失わせずに保つことができる。
【０２２４】
４．消化する（室温に設定する）
１００μｌ反応物あたり、１．０Ｕと１．５ＵのＤＮａｓｅＩによる２種類の消化物を調製する：
− １０μｌの１０×ＤＮａｓｅ Ｉ緩衝液（５００ｍＭトリス、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．８）
− ｘμｌのＤＮＡ（工程２からの２μｇのプールされたプラスミドＤＮＡ）
− １または１．５μｌの１Ｕ／μｌの酵素希釈物
− 滅菌ナノ純水で１００μｌに
− 室温で１０分間インキュベートする
− 反応を１μｌの１００ｍＭ ＣＤＴＡで停止させる
【０２２５】
アガロースゲルからの精製
１．ＤＮａｓｅ消化断片のゲル上での泳動
− １０μｌの１０×ブルージュースを各ＤＮａｓｅ Ｉ消化物に加える
− すべてを２％低融点アガロースゲルにかける
− 約３０分間１２０〜１５０Ｖで泳動する
− ｐＧＥＭ ＤＮＡマーカーを中央レーンにかける
【０２２６】
２．断片の単離
− レーザー刃を用いて６００〜１０００ｂｐの範囲の大きさの断片を有するアガローススライスを切り出す
− 〜０．３ｇの重量の小片に切断
− ゲルスライスを７０℃で溶融
− ３００μｌのフェノール（ＮａＣｌ／トリス平衡化）を溶融アガロースに加え、最大速度で〜１分間攪拌する
− １０分間４℃で回転させる（４℃で行われると界面は動きにくい）
− 上層を、等しい量のフェノール／クロロホルム／イソアミル（３００ｍＭ ＮａＣｌ／１００ｍＭトリス、ｐＨ８．０で飽和したもの）を含有するチューブ中に入れて、攪拌し、室温で５分間回転させる
− 上層を、クロロホルムを含有するチューブに入れて、攪拌し、回転させる
− 上層を、２容量の９５％の冷エタノールを有するチューブに入れる； −７０℃のフリーザー中に１０分間置く（高塩フェノールのためにそれ以上の塩は必要とされない）
− ４℃で１５分間回転させる。
− ７０％エタノールで洗浄し、排出し、〜１０分間風乾する
− ２５〜５０μｌの滅菌ナノ精製水中に再懸濁する
− 使用の準備ができるまで−７０℃で保存する
【０２２７】
アセンブリ反応
４反応を設定し、完了したらプールする
【０２２８】
【表５】
＊この反応のために用いられるＤＮＡは断片化されているので、濃度を予測することは困難である。最も簡単な方法は５μｌのＤＮａｓｅＩ消化ＤＮＡをアガロースゲルにかけて、染料がウエルに入るまで（１〜２分間）泳動する。典型的な２μｇのＤＮＡ消化物からの断片を１００μｇの水に再懸濁し、〜１から１０ｎｇ／μｌのＤＮＡ濃度を与える。この種類のゲルの写真に関して１０１２８４ｐ．３０を参照されたい。
【０２２９】
サイクル条件：９４〜３０秒［９４〜２０秒、６５〜１分、７２〜２分］２５×（プログラム「アセンブリ−６５」、実施〜２．５時間）
【０２３０】
アセンブリの増幅
通常、５増幅反応は全８プレートのロボット実験のために十分なＤＮＡを作るだろう。
【０２３１】
【表６】
＊ プライマーの濃度は典型的な増幅反応の２倍であることに注意。
°ＰＦＵ １０×緩衝液は２０ｍＭのＭｇＣｌ２を含有するので、ＭｇＣｌ２を添加する必要はない。
＋ＰＦＵはＳｔｒａｔａｇｅｎｅ ｐａｒｔ＃６００１３５から注文。
サイクル条件：９４〜３０秒［９４〜２０秒、６５〜１分、７２〜３分］２５×
【０２３２】
アセンブリ増幅のサブクローニング
１．精製生産物をＷｉｚａｒｄ ＰＣＲ精製キットにより精製する：
− ５増幅反応物をプールする
− １００μｌのＤｉｒｅｃｔ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ緩衝液を含有する新しいチューブに移す
− １ｍｌのＷｉｚａｒｄ ＰＣＲ精製樹脂を加え、室温で１分間インキュベートする
− 樹脂をＷｉｚａｒｄミニカラムで引く
− ８０％エタノールで洗浄し、マイクロ遠心管中で回転させて過剰のエタノールを除去する
− ８８μｌの滅菌ナノ純水で溶出させる（水をカラム中に少なくとも１分間保持させる）
【０２３３】
２．ＳｆｉＩによる消化：
− ２μｌのＳｆｉＩ
− １０μｌの１０×緩衝液Ｂ
− Ｗｉｚａｒｄ ＰＣＲ ｐｒｅｐからの８８μｌのＤＮＡ
− 成分を混合し、２滴の鉱油で積層し；５０℃で１時間インキュベートする
【０２３４】
３．バンドの単離
アセンブリー反応の増幅後にしばしば遺伝子サイズの断片よりも小さいバンドが作られる。この小さい断片は、試料がバンド単離されていない場合、遺伝子サイズの断片よりも１０倍も高い頻度でサブクローニングされることが示された。この汚染バンドが存在する場合、ＳｆｉＩ消化後にバンドを単離することが必要である。
【０２３５】
− ＤＮＡを０．７％アガロースゲルにかける
− Ｂｉｏ１０１製のＧｅｎｅ Ｃｌｅａｎキットを用いてバンドの単離と精製を行う
− ５０μｌの滅菌ナノ純水でＤＮＡを溶出し、ゲル上の濃度をチェックする（標準アガロースを用いるこの種類の精製はサブクローニング後に最大数の形質転換体を作った。試みられた他の方法：フェノールクロロホルムによる低融点ゲル、低融点ゲルによるＧｅｎｅ ｃｌｅａｎキット、標準アガロースによるＷｉｚａｒｄ ＰＣＲ樹脂、低融点ゲルを用いるＰｉｅｒｃｅ Ｘｔｒｅｍｅスピンカラム（は標準アガロースで機能しなかった））。
【０２３６】
４．ｐＲＡＭ［＋／ｒ］骨格に連結する：（上記の連結と形質転換法を参照されたい）
【０２３７】
ｐＲＡＭ骨格のラージスケールでの調製
１．ＬＢ ａｍｐプレートにｐＲＡＭＭＣＳ［＋／ｒ］ですじを付ける（このベクターは遺伝子の代りにＳａｃＩＩ部位を有する合成挿入物を有する。それは−７０℃でボックスで挙げたｐＲＡＭグリセロール保存物、ｂ２の位置に見ることができる。このベクターは新しいリボソーム結合部位を有するが、ベクターがＳｆｉＩで消化されるときに切り出されるだろう。
【０２３８】
２．アンピシリンを補充したＬＢで１０ｍｌの一晩培養物を調製する。
【０２３９】
３．翌日、アンピシリンを補充した１ＬのＬＢを接種して、１６〜２０時間生育させる。
【０２４０】
４．ＤＮＡをＷｉｚａｒｄ Ｍａｘｉ Ｐｒｅｐキットを用いて精製する（１Ｌの細胞のために４調製物を用いる）
５．プラスミドをＳｆｉＩで消化する。（１ミリグラムあたり５Ｕを使用）鉱油と重ね合わせて、少なくとも２時間消化する。
【０２４１】
６．エタノール沈殿して塩を除去する。水に再懸濁する。
【０２４２】
７．ＳａｃＩＩで２時間消化する。（消化物の容量を２ｍｌ以下に保つ）。プラスミドの一部が部分消化しうることがありうる。ベクターが、二つのＳｆｉＩ部位に対して内部にある酵素により切断される場合、それは、部分的に消化させた断片を連結反応で結合させないだろう。
【０２４３】
８．全消化物をカラムに乗せる（９を参照）。エタノール沈殿が必要な場合、かける試料の体積は２ｍｌを超えないようにする。
【０２４４】
９．カラムはセファクリルｓ−１０００を有し、２０％エタノールで保存して細菌の汚染を防ぐ。試料をかける前に、カラムを冷たい操作緩衝液で少なくとも２４時間平衡化しなければならない。カラムが２ヶ月を超えて放置されていた場合、カラムを空にして、樹脂を冷たい操作緩衝液中の洗浄液と３〜４回平衡化し、次にカラムに再び注ぐことが必要となろう。カラムを注いだ後、樹脂が完全に充填されるように一晩平衡化しなければならない。
【０２４５】
１０．〜０．５ｍｌのフラクションを集める。典型的には、ＤＮＡはフラクション２５〜５０からのものである。連続したフラクションからの５μｌのアリコートをかけて、どのフラクションが骨格断片を有するのかを決定する。小さい挿入断片は骨格のすべてが溶出する前にカラムから出始めるので、フラクションをプールするときに保存することが必要であろう。この理由から、典型的にはＤＮＡの４０〜６０％がこの工程で失われる。
【０２４６】
１１．骨格を有するフラクションをプールする。
【０２４７】
１２．試料をエタノールで析出させる。〜１０から５０ｎｇ／μｌを作る容積で再懸濁する。
【０２４８】
１３．−７０℃で保存する。
【０２４９】
カラム操作緩衝液：（４℃で保存）
５ｍＭ ＥＤＴＡ
１００ｍＭ ＮａＣｌ
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ塩酸、ｐＨ８．０
１０μｇ／ｍｌ ｔＲＮＡ（Ｒ−８７５９）
【０２５０】
Ｈ．オリゴヌクレオチド変異誘発：
変異すべき鋳型のアンピシリン感受性の一本鎖ＤＮＡを調製する。すべての可能なアミノ酸コドンをランダムに作る変異誘発プライマーを設計する。
【０２５１】
変異誘発反応：
【０２５２】
【表７】
＊アニーリング緩衝液：
− ２００ｍＭトリス塩酸、ｐＨ７．５
− １００ｍＭ ＭｇＣｌ２
− ５００ｍＭ ＮａＣｌ
【０２５３】
６０℃で１５分間の熱反応を行い、その直後に氷上に置く。
【０２５４】
合成反応：
【０２５５】
【表８】
＊合成緩衝液
１００ｍＭトリス塩酸、ｐＨ７．５
５ｍＭ ｄＮＴＰｓ
１０ｍＭ ＡＴＰ
２０ｍＭ ＤＴＴ
３７℃で９０分間インキュベートする。
Ｍｕｔ−Ｓ株ＢＭＨ７１−１８（Ｐｒｏｍｅｇａ株Ｑ６３２１）を形質転換する。
− 合成反応液を１７×１００ｍｍチューブに入れる。
− 氷上で解凍されたＢＭＨ７１−１８コンピテント細胞を合成反応物に加える。
− 氷上で３０分間インキュベートする。
− 細胞に４２℃で９０秒間熱ショックを与える。
− ４ｍｌのＬＢ培地を加えて、細胞を３７℃で１時間生育させる。アンピシリンを最終濃度１．２５μｇ／ｍｌまで加え、次に一晩３７℃で生育させる。
【０２５６】
ＤＮＡをＷｉｚａｒｄ Ｐｌｕｓ精製システム（Ｐｒｏｍｅｇａ ａ７１００）で単離する。
【０２５７】
単離されたＤＮＡを用いてＪＭ１０９のエレクトロコンピテント細胞を形質転換し、ＬＢアンピシリンプレート上で形質転換する。
【０２５８】
Ｉ．スクリーニング法：
（形質転換反応からの）ＪＭ１０９クローンを、１プレートあたり〜５００コロニーのスクリーニング密度でＬＢ ａｍｐプレート上に置かれたニトロセルロースフィルターに塗布する。
【０２５９】
ランダム変異誘発法で挙げられたように、選択すべきクローンの約１０％が、配列決定されるものと同程度に安定であるか、または源よりも良好であるに違いないであろう。または別の言い方をすれば、１枚あたり５０コロニーまでが選択に適するであろう。全８プレートロボット実験に利用可能な７０４ウエルが存在するので、少なくとも１５枚のＬＢ ａｍｐプレートが全ロボット実験に必要とされるだろう。
【０２６０】
３７℃での一晩の生育後、形質転換体をインキュベーターから取り出して室温におく。
【０２６１】
ニトロセルロースフィルターの一側面を上げて、５００μｌの１０ｍＭ ＩＰＴＧを各プレートに加える。次に、フィルターをプレートの裏側に置いて、異なる変異体ルシフェラーゼ遺伝子を有するコロニー中にＩＰＴＧを拡散させる。次に、該プレートを約４時間室温でインキュベートする。
【０２６２】
１ｍｌの溶液は１ｍＭのルシフェリンを含有し、１００ｍＭのクエン酸ナトリウムを５０℃に設定したスライド加温器上にピペットで入れる。変異体ルシフェラーゼコロニーを有し、ＩＰＴＧで処理されたニトロセルロースフィルターを、次にルシフェリ溶液の上部に置く。数分後、最も明るいコロニーを爪楊枝を用いて採取し、これを用いてＭ９最少培地と１％ゼラチンを含有するマイクロタイタープレートのウエルに接種する。
【０２６３】
十分なコロニーを８枚のマイクロタイタープレートに入れた後に、プレートを３５０ｒｐｍで３０℃のインキュベーションのためにインキュベーターに置き、一晩生育させた。
【０２６４】
朝に、一晩プレートをロボット上に置き、細胞希釈操作を行う（この方法は培養物を誘導培地中に１：１０で希釈する）。これらの新しいプレートを３時間、３５０ｒｐｍ、３０℃で生育させる。
【０２６５】
生育後、プレートを主要なアッセイ操作用のロボットにかける。
【０２６６】
最小媒体：
６ｇ／Ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４
３ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４
０．５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ
１ｇ／Ｌ ＮＨ４Ｃｌ
２ｍＭ ＭｇＳＯ４
０．１ｍＭ
１ｍＭチアミン塩酸
０．２％グルコース
１２μｇ／ｍｌテトラサイクリン
１００μｇ／ｍｌアンピシリン
【０２６７】
＊一晩培地は１％ゼラチンを含有する。
＊誘導培地は１ｍＭ ＩＰＴＧを含有し、ゼラチンを含有しない。
Ｓ．Ｏ．Ｃ．培地
−１０ｍＭ ＮａＣｌ
−２．５ｍＭ ＫＣｌ
−２０ｍＭ ＭｇＣｌ
−２０ｍＭグルコース
−２％バクトトリプトン
−０．５％酵母抽出物
【０２６８】
【表９】
【０２６９】
【表１０】
【０２７０】
【表１１】
【０２７１】
【表１２】
【０２７２】
【表１３】
【０２７３】
【表１４】
【０２７４】
【表１５】
【０２７５】
【表１６】
【０２７６】
【表１７】
【０２７７】
【表１８】
【０２７８】
【表１９】
【０２７９】
【表２０】
【０２８０】
【表２１】
【０２８１】
【表２２】
【０２８２】
【表２３】
【０２８３】
【表２４】
【０２８４】
【表２５】
【０２８５】
【表２６】
【０２８６】
【表２７】
【０２８７】
【表２８】
【０２８８】
【表２９】
【０２８９】
【表３０】
【０２９０】
【表３１】
【０２９１】
【表３２】
【０２９２】
【表３３】
【０２９３】
【表３４】
【０２９４】
表５： 進化的発達の要約
(1) ＬｕｃＰｐｅ２［Ｔ２４９Ｍ］から始める
(2) Ｎ末端とＣ末端で３アミノ酸を変異させる
(3) ７個のシステインを変異させる
(4) 進化の二回の反復を実施する → Ｌｕｃ４９−７Ｃ６
(5) 変更されたコドンの変異誘発（９）
(6) 進化の二回の反復 → Ｌｕｃ７８−０Ｂ１０
(7) 共通コドンの変異誘発（２８）
(8) コドン利用性変異誘発（２４）→Ｌｕｃ９０−１Ｂ５。
【０２９５】
【表３５】
【０２９６】
引用文献
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Ｓｔｅｍｍｅｒ， ＷＰ， ＤＮＡ （１９９４） ９１：１０７４７−５１．
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Ｓａｉｋｉ ＲＫ， Ｇｅｆａｎｄ ＤＨ， Ｓｔｏｆｆｅｌ Ｓ， Ｓｃｈａｒｆ ＳＪ， Ｈｉｇｕｃｈｉ Ｒ， Ｍｕｌｌｉｓ ＫＢ， Ｅｒｌｉｃｈ ＨＡ， Ｓｃｉｅｎｃｅ （１９８８） ２３９：４８７−９１．
【特許請求の範囲】
【請求項１】
５０℃の水溶液中で２時間後にその活性の少なくとも５０％を保持するように熱安定である合成甲虫ルシフェラーゼであって、配列番号２５のアミノ酸配列から成るＬｕｃＰｐｅ２［Ｔ２４９Ｍ］に関して２、１７、２５、２７、３６、９１、１０１、１０５、１２５、１４０、１４４、１４５、１８３、１９５、２０３、２０４、２２０、２２１、２６２、２６６、２７０、２９４、３５３、３５４、３５５、３８６、３９４、３９９、４１２、４１３、４９９、５００および５０２位の位置のうち少なくとも３つにおいて置換を有することを特徴とする前記合成甲虫ルシフェラーゼ。
【請求項２】
約６０℃の水溶液中で５時間後にその活性の少なくとも５０％を保持する請求項１に記載の合成甲虫ルシフェラーゼ。
【請求項３】
約６０℃の水溶液中で１０時間後にその活性の少なくとも５０％を保持する請求項１に記載の合成甲虫ルシフェラーゼ。
【請求項４】
約６０℃の水溶液中で２４時間後にその活性の少なくとも５０％を保持する請求項１に記載の合成甲虫ルシフェラーゼ。
【請求項５】
２２℃の水溶液中で３ヶ月後にその活性の少なくとも５０％を保持する請求項１に記載の合成甲虫ルシフェラーゼ。
【請求項６】
２２℃の水溶液中で６ヶ月後にその活性の少なくとも５０％を保持する請求項１に記載の合成甲虫ルシフェラーゼ。
【請求項７】
甲虫ルシフェラーゼアミノ酸配列の共通部位に少なくとも一つの変異を有する請求項１に記載のＰｐｅ２以外の合成甲虫ルシフェラーゼであって、当該甲虫ルシフェラーゼアミノ酸配列の共通部位が、以下に示す配列の５０％より多くにおいて同じアミノ酸が存在する部位である前記合成甲虫ルシフェラーゼ。
【化１】
【請求項８】
甲虫ルシフェラーゼアミノ酸配列の共通部位に一つの変異を有する請求項７に記載のＰｐｅ２以外の合成甲虫ルシフェラーゼであって、当該甲虫ルシフェラーゼアミノ酸配列の共通部位が、以下に示す配列の５０％より多くにおいて同じアミノ酸が存在する部位である前記合成甲虫ルシフェラーゼ。
【化２】
【請求項９】
各変異が元のアミノ酸を共通アミノ酸に変化させる請求項７に記載の合成甲虫ルシフェラーゼであって、共通アミノ酸が、以下に示す配列の５０％より多くにおいて共通部位に存在するアミノ酸である前記合成甲虫ルシフェラーゼ。
【化３】
【請求項１０】
ＦＩＧＵＲＥ２７（配列番号１４）、ＦＩＧＵＲＥ２８（配列番号１５）、ＦＩＧＵＲＥ２９（配列番号１６）、ＦＩＧＵＲＥ３０（配列番号１７）、ＦＩＧＵＲＥ３１（配列番号１８）、ＦＩＧＵＲＥ３６（配列番号１９）、ＦＩＧＵＲＥ３７（配列番号２０）、ＦＩＧＵＲＥ３８（配列番号２１）、ＦＩＧＵＲＥ３９（配列番号２２）、ＦＩＧＵＲＥ４１（配列番号２３）、ＦＩＧＵＲＥ４３（配列番号２４）およびＦＩＧＵＲＥ４６（配列番号２６）からなる群から選択される図に示されるアミノ酸配列を有する請求項１に記載の合成甲虫ルシフェラーゼ。
【請求項１１】
ＦＩＧＵＲＥ２７（配列番号１４）、ＦＩＧＵＲＥ３６（配列番号１９）、ＦＩＧＵＲＥ４３（配列番号２４）およびＦＩＧＵＲＥ４６（配列番号２６）からなる群から選択される図に示されるアミノ酸配列を有する請求項１０に記載の合成甲虫ルシフェラーゼ。
【請求項１２】
合成ホタルルシフェラーゼである請求項１に記載の合成甲虫ルシフェラーゼ。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の甲虫ルシフェラーゼをコードするポリヌクレオチド。
【請求項１４】
ＤＮＡである請求項１３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１５】
ＦＩＧＵＲＥ２２（配列番号１）、ＦＩＧＵＲＥ２３（配列番号２）、ＦＩＧＵＲＥ２４（配列番号３）、ＦＩＧＵＲＥ２５（配列番号４）、ＦＩＧＵＲＥ２６（配列番号５）、ＦＩＧＵＲＥ３２（配列番号６）、ＦＩＧＵＲＥ３３（配列番号７）、ＦＩＧＵＲＥ３４（配列番号８）、ＦＩＧＵＲＥ３５（配列番号９）、ＦＩＧＵＲＥ４０（配列番号１０）、ＦＩＧＵＲＥ４２（配列番号１１）およびＦＩＧＵＲＥ４７（配列番号１３）からなる群から選択される図に示される配列を有する請求項１３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１６】
請求項１３ないし１５のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１７】
請求項１３ないし１５のいずれかに記載のポリヌクレオチドを発現するように形質転換された宿主細胞。
【請求項１８】
大腸菌である請求項１７に記載の宿主細胞。
【請求項１９】
ＦＩＧＵＲＥ２２（配列番号１）、ＦＩＧＵＲＥ２３（配列番号２）、ＦＩＧＵＲＥ２４（配列番号３）、ＦＩＧＵＲＥ２５（配列番号４）、ＦＩＧＵＲＥ２６（配列番号５）、ＦＩＧＵＲＥ３２（配列番号６）、ＦＩＧＵＲＥ３３（配列番号７）、ＦＩＧＵＲＥ３４（配列番号８）、ＦＩＧＵＲＥ３５（配列番号９）、ＦＩＧＵＲＥ４０（配列番号１０）、ＦＩＧＵＲＥ４２（配列番号１１）およびＦＩＧＵＲＥ４７（配列番号１３）からなる群から選択される図に示されるポリヌクレオチドにコードされる合成甲虫ルシフェラーゼをコードする請求項１７に記載の宿主細胞から得られた合成甲虫ルシフェラーゼ。
【請求項２０】
請求項１５に記載のポリヌクレオチドにコードされる合成甲虫ルシフェラーゼ。
【請求項２１】
ＡＴＰを検出するための請求項１〜１２、１９および２０のいずれか１項に記載の合成ルシフェラーゼの使用。
【請求項２２】
分子を標識するための請求項１〜１２、１９および２０のいずれか１項に記載の合成ルシフェラーゼの使用。
【請求項２３】
遺伝子レポーターとしての請求項１〜１２、１９および２０のいずれか１項に記載の合成ルシフェラーゼの使用。
【請求項２４】
固体表面へ固定化するための請求項１〜１２、１９および２０のいずれか１項に記載の合成ルシフェラーゼの使用。
【請求項２５】
ハイブリッドタンパク質を作るための請求項１３ないし１５のいずれかに記載のポリヌクレオチドの使用。
【請求項２６】
高温反応のための請求項１〜１２、１９および２０のいずれか１項に記載の合成ルシフェラーゼの使用。
【請求項２７】
発光溶液を作るための請求項１〜１２、１９および２０のいずれか１項に記載の合成ルシフェラーゼの使用。
【請求項２８】
請求項１〜１２、１９および２０のいずれかに記載の合成ルシフェラーゼを含むハイブリッドタンパク質。
【請求項２９】
下記の工程：
（ａ）甲虫ルシフェラーゼをコードする出発ポリヌクレオチド配列を変異させて、それぞれが異なる第二の甲虫ルシフェラーゼをコードする第二のポリヌクレオチド配列の少なくとも一つのライブラリーを作り；
（ｂ）各選択された第二のポリヌクレオチドが好ましい範囲で一つ以上の所望の特性を有する第二のルシフェラーゼをコードするように一つ以上の第二のポリヌクレオチド配列を選択し；そして
（ｃ）最終ルシフェラーゼが５０℃の水溶液中で２時間後にその活性の少なくとも５０％を保持するように熱安定であるように最終ルシフェラーゼが作られるまで、（ａ）での出発ポリヌクレオチドとして第二の選択されたヌクレオチドのそれぞれを各回利用して（ａ）と（ｂ）を繰り返す
ことからなる、熱安定変異体ルシフェラーゼの製造方法であって、当該最終ルシフェラーゼが配列番号２５のアミノ酸配列から成るＬｕｃＰｐｅ２［Ｔ２４９Ｍ］に関して２、１７、２５、２７、３６、９１、１０１、１０５、１２５、１４０、１４４、１４５、１８３、１９５、２０３、２０４、２２０、２２１、２６２、２６６、２７０、２９４、３５３、３５４、３５５、３８６、３９４、３９９、４１２、４１３、４９９、５００および５０２位の２以上の位置に置換を有する前記方法。
【請求項３０】
特性が、熱安定性に加え、発光強度、シグナル安定性および基質の利用を含む群から選ばれる少なくとも二つの別の特性を含む請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
（ａ）がさらに組換え変異誘発と点変異誘発の利用を含む請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
（ｂ）が自動化多パラメータースクリーニング法により実施される請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
出発ポリヌクレオチド配列が配列番号１２に示される配列である請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
出発ポリヌクレオチドがホタルルシフェラーゼをコードする請求項２９に記載の方法。
【請求項３５】
請求項１〜１２、１９および２０のいずれかに記載の合成ルシフェラーゼが得られるように請求項１７に記載の宿主を培養することを含む、合成ルシフェラーゼの製造方法。
【請求項３６】
サンプルを請求項１〜１２、１９および２０のいずれかに記載の合成ルシフェラーゼと接触させ、サンプル中のルシフェラーゼの存在またはその量を検出することにより、サンプル中のＡＴＰの存在またはその量を検出することを含む、ＡＴＰの検出方法。
【請求項３７】
対象となる分子を請求項１〜１２、１９および２０のいずれかに記載の合成ルシフェラーゼまたはその基質に結合させ、合成ルシフェラーゼまたは基質を含む分子を得ることを含む、分子の標識方法。
【請求項３８】
分子が核酸分子またはタンパク質である請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
請求項１６に記載のベクターによりコードされるルシフェラーゼのサンプル中における存在またはその量を検出することを含む、ルシフェラーゼの検出方法。
【請求項４０】
サンプルが細胞または細胞ライセートを含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
固体表面上に請求項１〜１２、１９および２０のいずれかに記載の合成ルシフェラーゼを固定することを含む、ルシフェラーゼの固定方法。
【請求項４２】
請求項１３ないし１５のいずれかに記載のポリヌクレオチドおよび合成ルシフェラーゼ以外のタンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドを含むベクターを発現させ、合成ルシフェラーゼおよび合成ルシフェラーゼ以外のタンパク質を含むハイブリッドタンパク質を合成することを含む、ハイブリッドタンパク質の合成方法。
【請求項４３】
請求項１〜１２、１９および２０のいずれかに記載の合成ルシフェラーゼを、４０℃を超える温度においてルミネッセンス反応用試薬と接触させることを含む、高温においてルミネッセンスを検出する方法。
【請求項４４】
請求項１〜１２、１９および２０のいずれかに記載の合成ルシフェラーゼを１以上の他の試薬と組合わせることを含む、ルミネッセンス用溶液の製造方法。
【請求項４５】
２、２７、３６、９１、１４４、１８３、２２０、２２１、２６２、２９４、３５３、３５４、３５５、３８６、３９４、３９９、４１２、４１３および４９９位のうち複数の位置において置換を有する請求項１に記載の合成甲虫ルシフェラーゼ。
【請求項４６】
９１、１８３、２２０、２２１、２６２、２９４、３５３、３５４および３９９位のうち複数の位置において置換を有する請求項１に記載の合成甲虫ルシフェラーゼ。
【請求項４７】
置換位置を除いて配列番号２５のアミノ酸配列から成るＬｕｃＰｐｅ２［Ｔ２４９Ｍ］または２４９位においてＭｅｔにかえてＴｈｒを有する配列番号２５のアミノ酸配列から成るＬｕｃＰｐｅ２の配列を有する請求項１、４３または４４に記載の合成甲虫ルシフェラーゼ。
【請求項４８】
甲虫ルシフェラーゼをコードする第１のポリヌクレオチドにＬｕｃ配列番号２５のアミノ酸配列から成るＰｅｐ２［Ｔ２４９Ｍ］に関して２、１７、２５、２７、３６、９１、１０１、１０５、１２５、１４０、１４４、１４５、１８３、１９５、２０３、２０４、２２０、２２１、２６２、２６６、２７０、２９４、３５３、３５４、３５５、３８６、３９４、３９９、４１２、４１３、４９９、５００および５０２位の位置において少なくとも３つの置換を導入し、５０℃の水溶液中で２時間後にその活性の少なくとも５０％を保持するように熱安定性である合成甲虫ルシフェラーゼをコードする第２のポリヌクレオチドを調製することを含む、熱安定性甲虫ルシフェラーゼの調製方法。
【請求項１】
５０℃の水溶液中で２時間後にその活性の少なくとも５０％を保持するように熱安定である合成甲虫ルシフェラーゼであって、配列番号２５のアミノ酸配列から成るＬｕｃＰｐｅ２［Ｔ２４９Ｍ］に関して２、１７、２５、２７、３６、９１、１０１、１０５、１２５、１４０、１４４、１４５、１８３、１９５、２０３、２０４、２２０、２２１、２６２、２６６、２７０、２９４、３５３、３５４、３５５、３８６、３９４、３９９、４１２、４１３、４９９、５００および５０２位の位置のうち少なくとも３つにおいて置換を有することを特徴とする前記合成甲虫ルシフェラーゼ。
【請求項２】
約６０℃の水溶液中で５時間後にその活性の少なくとも５０％を保持する請求項１に記載の合成甲虫ルシフェラーゼ。
【請求項３】
約６０℃の水溶液中で１０時間後にその活性の少なくとも５０％を保持する請求項１に記載の合成甲虫ルシフェラーゼ。
【請求項４】
約６０℃の水溶液中で２４時間後にその活性の少なくとも５０％を保持する請求項１に記載の合成甲虫ルシフェラーゼ。
【請求項５】
２２℃の水溶液中で３ヶ月後にその活性の少なくとも５０％を保持する請求項１に記載の合成甲虫ルシフェラーゼ。
【請求項６】
２２℃の水溶液中で６ヶ月後にその活性の少なくとも５０％を保持する請求項１に記載の合成甲虫ルシフェラーゼ。
【請求項７】
甲虫ルシフェラーゼアミノ酸配列の共通部位に少なくとも一つの変異を有する請求項１に記載のＰｐｅ２以外の合成甲虫ルシフェラーゼであって、当該甲虫ルシフェラーゼアミノ酸配列の共通部位が、以下に示す配列の５０％より多くにおいて同じアミノ酸が存在する部位である前記合成甲虫ルシフェラーゼ。
【化１】
【請求項８】
甲虫ルシフェラーゼアミノ酸配列の共通部位に一つの変異を有する請求項７に記載のＰｐｅ２以外の合成甲虫ルシフェラーゼであって、当該甲虫ルシフェラーゼアミノ酸配列の共通部位が、以下に示す配列の５０％より多くにおいて同じアミノ酸が存在する部位である前記合成甲虫ルシフェラーゼ。
【化２】
【請求項９】
各変異が元のアミノ酸を共通アミノ酸に変化させる請求項７に記載の合成甲虫ルシフェラーゼであって、共通アミノ酸が、以下に示す配列の５０％より多くにおいて共通部位に存在するアミノ酸である前記合成甲虫ルシフェラーゼ。
【化３】
【請求項１０】
ＦＩＧＵＲＥ２７（配列番号１４）、ＦＩＧＵＲＥ２８（配列番号１５）、ＦＩＧＵＲＥ２９（配列番号１６）、ＦＩＧＵＲＥ３０（配列番号１７）、ＦＩＧＵＲＥ３１（配列番号１８）、ＦＩＧＵＲＥ３６（配列番号１９）、ＦＩＧＵＲＥ３７（配列番号２０）、ＦＩＧＵＲＥ３８（配列番号２１）、ＦＩＧＵＲＥ３９（配列番号２２）、ＦＩＧＵＲＥ４１（配列番号２３）、ＦＩＧＵＲＥ４３（配列番号２４）およびＦＩＧＵＲＥ４６（配列番号２６）からなる群から選択される図に示されるアミノ酸配列を有する請求項１に記載の合成甲虫ルシフェラーゼ。
【請求項１１】
ＦＩＧＵＲＥ２７（配列番号１４）、ＦＩＧＵＲＥ３６（配列番号１９）、ＦＩＧＵＲＥ４３（配列番号２４）およびＦＩＧＵＲＥ４６（配列番号２６）からなる群から選択される図に示されるアミノ酸配列を有する請求項１０に記載の合成甲虫ルシフェラーゼ。
【請求項１２】
合成ホタルルシフェラーゼである請求項１に記載の合成甲虫ルシフェラーゼ。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の甲虫ルシフェラーゼをコードするポリヌクレオチド。
【請求項１４】
ＤＮＡである請求項１３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１５】
ＦＩＧＵＲＥ２２（配列番号１）、ＦＩＧＵＲＥ２３（配列番号２）、ＦＩＧＵＲＥ２４（配列番号３）、ＦＩＧＵＲＥ２５（配列番号４）、ＦＩＧＵＲＥ２６（配列番号５）、ＦＩＧＵＲＥ３２（配列番号６）、ＦＩＧＵＲＥ３３（配列番号７）、ＦＩＧＵＲＥ３４（配列番号８）、ＦＩＧＵＲＥ３５（配列番号９）、ＦＩＧＵＲＥ４０（配列番号１０）、ＦＩＧＵＲＥ４２（配列番号１１）およびＦＩＧＵＲＥ４７（配列番号１３）からなる群から選択される図に示される配列を有する請求項１３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１６】
請求項１３ないし１５のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１７】
請求項１３ないし１５のいずれかに記載のポリヌクレオチドを発現するように形質転換された宿主細胞。
【請求項１８】
大腸菌である請求項１７に記載の宿主細胞。
【請求項１９】
ＦＩＧＵＲＥ２２（配列番号１）、ＦＩＧＵＲＥ２３（配列番号２）、ＦＩＧＵＲＥ２４（配列番号３）、ＦＩＧＵＲＥ２５（配列番号４）、ＦＩＧＵＲＥ２６（配列番号５）、ＦＩＧＵＲＥ３２（配列番号６）、ＦＩＧＵＲＥ３３（配列番号７）、ＦＩＧＵＲＥ３４（配列番号８）、ＦＩＧＵＲＥ３５（配列番号９）、ＦＩＧＵＲＥ４０（配列番号１０）、ＦＩＧＵＲＥ４２（配列番号１１）およびＦＩＧＵＲＥ４７（配列番号１３）からなる群から選択される図に示されるポリヌクレオチドにコードされる合成甲虫ルシフェラーゼをコードする請求項１７に記載の宿主細胞から得られた合成甲虫ルシフェラーゼ。
【請求項２０】
請求項１５に記載のポリヌクレオチドにコードされる合成甲虫ルシフェラーゼ。
【請求項２１】
ＡＴＰを検出するための請求項１〜１２、１９および２０のいずれか１項に記載の合成ルシフェラーゼの使用。
【請求項２２】
分子を標識するための請求項１〜１２、１９および２０のいずれか１項に記載の合成ルシフェラーゼの使用。
【請求項２３】
遺伝子レポーターとしての請求項１〜１２、１９および２０のいずれか１項に記載の合成ルシフェラーゼの使用。
【請求項２４】
固体表面へ固定化するための請求項１〜１２、１９および２０のいずれか１項に記載の合成ルシフェラーゼの使用。
【請求項２５】
ハイブリッドタンパク質を作るための請求項１３ないし１５のいずれかに記載のポリヌクレオチドの使用。
【請求項２６】
高温反応のための請求項１〜１２、１９および２０のいずれか１項に記載の合成ルシフェラーゼの使用。
【請求項２７】
発光溶液を作るための請求項１〜１２、１９および２０のいずれか１項に記載の合成ルシフェラーゼの使用。
【請求項２８】
請求項１〜１２、１９および２０のいずれかに記載の合成ルシフェラーゼを含むハイブリッドタンパク質。
【請求項２９】
下記の工程：
（ａ）甲虫ルシフェラーゼをコードする出発ポリヌクレオチド配列を変異させて、それぞれが異なる第二の甲虫ルシフェラーゼをコードする第二のポリヌクレオチド配列の少なくとも一つのライブラリーを作り；
（ｂ）各選択された第二のポリヌクレオチドが好ましい範囲で一つ以上の所望の特性を有する第二のルシフェラーゼをコードするように一つ以上の第二のポリヌクレオチド配列を選択し；そして
（ｃ）最終ルシフェラーゼが５０℃の水溶液中で２時間後にその活性の少なくとも５０％を保持するように熱安定であるように最終ルシフェラーゼが作られるまで、（ａ）での出発ポリヌクレオチドとして第二の選択されたヌクレオチドのそれぞれを各回利用して（ａ）と（ｂ）を繰り返す
ことからなる、熱安定変異体ルシフェラーゼの製造方法であって、当該最終ルシフェラーゼが配列番号２５のアミノ酸配列から成るＬｕｃＰｐｅ２［Ｔ２４９Ｍ］に関して２、１７、２５、２７、３６、９１、１０１、１０５、１２５、１４０、１４４、１４５、１８３、１９５、２０３、２０４、２２０、２２１、２６２、２６６、２７０、２９４、３５３、３５４、３５５、３８６、３９４、３９９、４１２、４１３、４９９、５００および５０２位の２以上の位置に置換を有する前記方法。
【請求項３０】
特性が、熱安定性に加え、発光強度、シグナル安定性および基質の利用を含む群から選ばれる少なくとも二つの別の特性を含む請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
（ａ）がさらに組換え変異誘発と点変異誘発の利用を含む請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
（ｂ）が自動化多パラメータースクリーニング法により実施される請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
出発ポリヌクレオチド配列が配列番号１２に示される配列である請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
出発ポリヌクレオチドがホタルルシフェラーゼをコードする請求項２９に記載の方法。
【請求項３５】
請求項１〜１２、１９および２０のいずれかに記載の合成ルシフェラーゼが得られるように請求項１７に記載の宿主を培養することを含む、合成ルシフェラーゼの製造方法。
【請求項３６】
サンプルを請求項１〜１２、１９および２０のいずれかに記載の合成ルシフェラーゼと接触させ、サンプル中のルシフェラーゼの存在またはその量を検出することにより、サンプル中のＡＴＰの存在またはその量を検出することを含む、ＡＴＰの検出方法。
【請求項３７】
対象となる分子を請求項１〜１２、１９および２０のいずれかに記載の合成ルシフェラーゼまたはその基質に結合させ、合成ルシフェラーゼまたは基質を含む分子を得ることを含む、分子の標識方法。
【請求項３８】
分子が核酸分子またはタンパク質である請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
請求項１６に記載のベクターによりコードされるルシフェラーゼのサンプル中における存在またはその量を検出することを含む、ルシフェラーゼの検出方法。
【請求項４０】
サンプルが細胞または細胞ライセートを含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
固体表面上に請求項１〜１２、１９および２０のいずれかに記載の合成ルシフェラーゼを固定することを含む、ルシフェラーゼの固定方法。
【請求項４２】
請求項１３ないし１５のいずれかに記載のポリヌクレオチドおよび合成ルシフェラーゼ以外のタンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドを含むベクターを発現させ、合成ルシフェラーゼおよび合成ルシフェラーゼ以外のタンパク質を含むハイブリッドタンパク質を合成することを含む、ハイブリッドタンパク質の合成方法。
【請求項４３】
請求項１〜１２、１９および２０のいずれかに記載の合成ルシフェラーゼを、４０℃を超える温度においてルミネッセンス反応用試薬と接触させることを含む、高温においてルミネッセンスを検出する方法。
【請求項４４】
請求項１〜１２、１９および２０のいずれかに記載の合成ルシフェラーゼを１以上の他の試薬と組合わせることを含む、ルミネッセンス用溶液の製造方法。
【請求項４５】
２、２７、３６、９１、１４４、１８３、２２０、２２１、２６２、２９４、３５３、３５４、３５５、３８６、３９４、３９９、４１２、４１３および４９９位のうち複数の位置において置換を有する請求項１に記載の合成甲虫ルシフェラーゼ。
【請求項４６】
９１、１８３、２２０、２２１、２６２、２９４、３５３、３５４および３９９位のうち複数の位置において置換を有する請求項１に記載の合成甲虫ルシフェラーゼ。
【請求項４７】
置換位置を除いて配列番号２５のアミノ酸配列から成るＬｕｃＰｐｅ２［Ｔ２４９Ｍ］または２４９位においてＭｅｔにかえてＴｈｒを有する配列番号２５のアミノ酸配列から成るＬｕｃＰｐｅ２の配列を有する請求項１、４３または４４に記載の合成甲虫ルシフェラーゼ。
【請求項４８】
甲虫ルシフェラーゼをコードする第１のポリヌクレオチドにＬｕｃ配列番号２５のアミノ酸配列から成るＰｅｐ２［Ｔ２４９Ｍ］に関して２、１７、２５、２７、３６、９１、１０１、１０５、１２５、１４０、１４４、１４５、１８３、１９５、２０３、２０４、２２０、２２１、２６２、２６６、２７０、２９４、３５３、３５４、３５５、３８６、３９４、３９９、４１２、４１３、４９９、５００および５０２位の位置において少なくとも３つの置換を導入し、５０℃の水溶液中で２時間後にその活性の少なくとも５０％を保持するように熱安定性である合成甲虫ルシフェラーゼをコードする第２のポリヌクレオチドを調製することを含む、熱安定性甲虫ルシフェラーゼの調製方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３６】
【図３７】
【図３８】
【図３９】
【図４０】
【図４１】
【図４２】
【図４３】
【図４４】
【図４５】
【図４６】
【図４７】
【図４８】
【図４９】
【図５０】
【図５１】
【図５２】
【図５３】
【図５４】
【図５５】
【図５６】
【図５７】
【図５８】
【図５９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３６】
【図３７】
【図３８】
【図３９】
【図４０】
【図４１】
【図４２】
【図４３】
【図４４】
【図４５】
【図４６】
【図４７】
【図４８】
【図４９】
【図５０】
【図５１】
【図５２】
【図５３】
【図５４】
【図５５】
【図５６】
【図５７】
【図５８】
【図５９】
【公開番号】特開２０１０−１０４３７７（Ｐ２０１０−１０４３７７Ａ）
【公開日】平成２２年５月１３日（２０１０．５．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−６９９９（Ｐ２０１０−６９９９）
【出願日】平成２２年１月１５日（２０１０．１．１５）
【分割の表示】特願２０００−５１１８７４（Ｐ２０００−５１１８７４）の分割
【原出願日】平成１０年９月１８日（１９９８．９．１８）
【出願人】（５００１２２９９４）プロメガ・コーポレイシヨン (2)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年５月１３日（２０１０．５．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１月１５日（２０１０．１．１５）
【分割の表示】特願２０００−５１１８７４（Ｐ２０００−５１１８７４）の分割
【原出願日】平成１０年９月１８日（１９９８．９．１８）
【出願人】（５００１２２９９４）プロメガ・コーポレイシヨン (2)
【Ｆターム（参考）】
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