生体適合性高速ゲル化ハイドロゲルおよびその噴霧剤の調製方法
本発明は、（１）生体適合性高分子チオール化誘導体を含む溶液（成分Ａ）と、生体適合性チオール基反応性架橋剤（成分Ｂ）とを相互に混合して、特定の架橋条件を有する反応性混合物を形成するステップと、（２）反応性混合物を反応させてハイドロゲルを形成するステップとを含む、複数の活性化合物成分を特定の条件下で混合および化学架橋反応させ、高速化学架橋によりハイドロゲルを形成する、生体適合性高速ゲル化ハイドロゲルの調製方法を開示する。本発明はさらに、新規の高速ゲル化ハイドロゲル噴霧剤の調製方法およびその医学分野での応用を開示する。本発明は、生体適合性が良好である、副産物を発生せず、安定性が良好であり、使用上便利であり、原料の用量が少なく、様々な医学的用途に適合する等の多くの長所を有する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はハイドロゲルの調製方法に関し、特に、生体適合性高速ゲル化ハイドロゲルの調製方法に関する。本発明はさらに、生体適合性高速ゲル化ハイドロゲル噴霧剤の調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ハイドロゲル、特に細胞間質基質から調製されたハイドロゲルは、生物医薬分野において非常に広く応用されている。合成材料から調製されたハイドロゲルと比べて、細胞間質基質から調製されたハイドロゲルは、生物体内の自然環境をシミュレーションでき、含水量が高く、透過性が良好であり、生体適合性がより良好であり、酵素分解性が調節可能である等、多くの長所を有する（非特許文献１及び２）。さらに重要な点は、細胞間質基質は生体誘導作用を有し、組織特異的な修復を誘導・誘発することが可能なことである。例えば、ヒアルロン酸ナトリウムは天然細胞間質基質高分子であり、細胞の接着や移動の管理、細胞の分裂および分化を調節する等の生物学的機能を有する。高分子ヒアルロン酸ナトリウムは、ニワトリ胎生の肢幹骨髄幹細胞の軟骨細胞への分化を誘発することが可能である（非特許文献３）。そのため、細胞間質基質から調製されたハイドロゲルは生物医薬（特に組織工学）分野においてますます重視されている。
【０００３】
多くの生物医薬の応用において、ハイドロゲルには、使用時には液体であるが、指定部位に到達した後は、速やかにゲルを形成して、流動性を失うことが求められる。このような高速ゲル化ハイドロゲルには、複雑な形状の全ての立体的な傷口にも適合でき、傷口に良好に接着でき、内視鏡方式で使用できるため開腹式手術を回避できる、等の極めて大きな利点が認められる。現在までに、研究者はハイドロゲルの高速ゲル化を実現するための各種の方式を考察してきた。例えば、水溶性ポリエチレングリコールの不飽和誘導体を光誘発により架橋してゲルを調製すること、特定の組成のポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールの３ブロック共重合体（Pluronic poloxamer）溶液が温度変化に誘発されてゲル化する性質を有すること（非特許文献４）、シアノアクリル酸塩が重合架橋によりゲルを形成し、組織接着に用いられること、およびゼラチンのグルタルアルデヒド架橋材料等である。一般に、上記のハイドロゲルには、生体適合性が低く、生分解性が低い等、各種の欠陥が存在する。通常、高速ゲル化には、高活性の架橋剤が必要であるが、これらの化合物は強い毒性、副作用を有する。
【０００４】
チオール基は、生物体内に自然に存在する、良好な生体適合性を有する官能基である。チオール基は良好な反応活性を有し、同一の条件下では、通常、その反応活性はアミノ基より数桁高い。従って、高速ゲル化を実現するために必要な高速化学架橋を提供する場合には、相対的に不活性なアミノ基の架橋には高活性の架橋剤（アルデヒド類等）が必要となる。しかしながら、この種の架橋剤は大きな毒性を有し、組織の炎症等の副作用を招きうる。それに対し、チオール基の架橋は、活性の低い生体適合性架橋剤を選択することが可能なため、調製されるハイドロゲルはより良好な生体適合性を有する。Wallaceらは、多分岐（四分岐または十二分岐）ポリエチレングリコールチオール基誘導体（分子量１０，０００）を０．３ｍｏｌ／Ｌのリン酸ナトリウム／炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）に溶解し、多分岐（四分岐または十二分岐）ポリエチレングリコールスクシンイミド活性誘導体（分子量１０，０００）を０．０００５ｍｏｌ／Ｌのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解し、上記二種類の溶液を混合することによりハイドロゲルを調製した。その生体適合性は、対応するポリエチレングリコールアミノ基誘導体を用いて調製したハイドロゲルより大きく向上した（特許文献１）。
【０００５】
Wallaceらにより開示された方法は高速ゲル化ハイドロゲルを調製する比較的良好な方法ではあるが、依然として多くの欠陥が存在する（特許文献１）。第一に、多分岐ポリエチレングリコールチオール基誘導体と多分岐ポリエチレングリコールスクシンイミド活性誘導体の化学架橋反応では、ある程度の毒性、副作用を有するＮ‐ヒドロキシルスクシンイミド副生成物が生成する。第二に、Wallaceらが用いた多分岐ポリエチレングリコールスクシンイミド活性誘導体の溶液と多分岐ポリエチレングリコールチオール基誘導体の溶液はともに不安定で、両者とも用時調製する必要があり、かつ、前者の溶液は一時間以内に使い終える必要があり、後者は空気に触れると活性を失いやすいため、使用上不便である。第三に、多分岐ポリエチレングリコールチオール基誘導体と多分岐ポリエチレングリコールスクシンイミド活性誘導体はともに高価であり、これら二種類の化合物の濃度がそれぞれ１０％ ｗ／ｖ以上（通常は２０％ ｗ／ｖ）に達したときにはじめて高速ゲル化を実現できるため、高コストである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第６，６２４，２４５号明細書（Wallace et al）
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Silva et al，Curr Top Dev Biol，64, 181，2004
【非特許文献２】Drury et al，Biomaterials，24, 4337，2003
【非特許文献３】Kujawa et al.Develop Biol，114，519， 1986
【非特許文献４】Leach et al，Am J ObstetGynecol 162,1317,1990
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明が解決しようとする技術的課題の第一は、新規の生体適合性高速ゲル化ハイドロゲルの調製方法を提供することである。
【０００９】
本発明が解決しようとする技術的課題の第二は、新規の生体適合性高速ゲル化ハイドロゲルの噴霧剤の調製方法を提供することである。
【００１０】
本発明において用いる一部の技術用語について、以下のように定義する。
【００１１】
生体適合性高分子チオール化誘導体とは、生体適合性高分子をチオール基により変性させて得られる産物である。上記生体適合性高分子チオール化誘導体は、少なくとも三つのチオール基を含み、分子量は１，０００〜１０，０００，０００である。
【００１２】
生体適合性高分子とは、多糖類（コンドロイチン硫酸、ヘパリン、ヘパラン、アルギン酸、ヒアルロン酸、デルマタン、デルマタン硫酸、ペクチン、カルボキシメチルセルロース、キトサン等）、それらの塩（ナトリウム塩、カリウム塩等）および変性体（カルボキシメチル化変性、疎水化変性等）；タンパク質（アルカリ性ゼラチンタンパク質、酸性ゼラチンタンパク質、アルカリ性遺伝子組換えゼラチンタンパク質、酸性遺伝子組換えゼラチンタンパク質等）およびそれらの変性体（アミノ基のカルボキシル化変性、疎水化変性等）；合成高分子（ポリアクリル酸、ポリアスパラギン酸、ポリ酒石酸、ポリグルタミン酸、ポリフマル酸等）、それらの塩（ナトリウム塩、カリウム塩等）および変性体（カルボキシメチル化変性、疎水化変性等）である。上記コンドロイチン硫酸には、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型等の各種形式が含まれる。上記生体適合性高分子は、ポリエチレングリコールおよびその誘導体や、システイン含有オリゴペプチド等を含まない（Lutolf et al，Biomacromolecules，4，713，2003）。
【００１３】
チオール化変性とは、遊離チオール基を導入する化学反応過程であり、通常は以下の反応ステップを含む：生体適合性高分子の側鎖カルボキシル基を、カルボジイミドの活性下で、ジスルフィド結合を含むジアミンまたはジヒドラジドと反応させて中間産物を生成し、その後ジスルフィド結合をチオール基に還元して、生体適合性高分子チオール化誘導体を得るステップ；または、上記の生体適合性高分子を含む側鎖アミノ基を化学反応により直接チオール基に変性するステップ。
【００１４】
化学架橋反応とは、チオール基とチオール基反応性官能基との間での、求核付加反応および求核置換反応である。
【００１５】
ハイドロゲルとは、大量の水を含有する、三次元架橋網状構造を有する物質であり、液体と固体の間の状態で、流動性はない。ゲル化とは、流動性を有する液体状態から流動性を失ったハイドロゲルになるまでの過程であり、ゲル化時間とは、流動性を有する液体状態から流動性を失ったハイドロゲルになるまでの時間である。
【００１６】
アルキレン基とは、-（ＣＨ２)ｎ-（ｎは１〜１５の整数）である。好ましくは、ｎは１〜８の整数である。
【００１７】
置換アルキレン基とは、少なくとも１つの水素原子が、アルキル基、ヒドロキシル基、アミノ基、アルコキシ基、フェニル基、エステル基等の基に置換されたアルキレン基である。
【００１８】
アリール基とは、芳香族のフェニル基、ナフチル基等である。好ましくはフェニル基である。
【００１９】
ポリエーテル基とは、‐[（ＣＨＲ)ｎＯ]ｍ‐であり、Ｒはアルキル基、ｎは１〜１０の整数、ｍは１〜５００の整数である。好ましくは、Ｒは水素原子であり、ｎはそれぞれ２、３、４である。
【００２０】
アルキル基とは、１〜１５個の炭素原子を有する、直鎖または分岐鎖のアルキル基である。例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ-ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ペンチル基、ネオペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、等である。好ましくは、１〜１０個の炭素原子を有する、直鎖または分岐鎖のアルキル基であり、特に好ましくは、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基である。
【００２１】
アルコキシ基とは、１〜６個の炭素原子を有する、直鎖または分岐鎖のアルコキシ基である。例えば、メトキシ基、エトキシ基、プロピルオキシ基、イソプロピルオキシ基、ブトキシ基、イソブトキシ基、ｔｅｒｔ-ブトキシ基、ｓｅｃ−ブトキシ基、ペンチルオキシ基、ネオペンチルオキシ基、ヘキシルオキシ基等である。好ましくは、１〜４個の炭素原子を有する、直鎖または分岐鎖のアルコキシ基であり、特に好ましくは、メトキシ基およびエトキシ基である。
【００２２】
エステル基とは、‐Ｃ（Ｏ)ＯＲであり、Ｒは上記の低級アルキル基である。好ましくは、メチルエステル基、エチルエステル基、プロピルエステル基、ブチルエステル基である。
【００２３】
カルボキシル基とは、カルボキシル基（‐ＣＯＯＨ）と、カルボキシル基がアルカリで中和されたカルボン酸塩（‐ＣＯＯ−Ａ＋）であり、Ａ＋にはナトリウムイオン、カリウムイオン、リチウムイオン、アンモニアイオン等が含まれる。好ましくは、カルボキシル基、カルボン酸ナトリウム塩またはカルボン酸カリウム塩である。
【００２４】
一つのアシルアミド結合を含む連結基とは、−Ｒ’−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ’’−または−Ｒ’−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−Ｒ’’−であり、式中、Ｒ’およびはＲ’’、上記のアルキレン基、置換アルキレン基、アリール基またはポリエーテル基である。ポリアミド基とは、ジアシドおよびジアミンから生成される基である。
【課題を解決するための手段】
【００２５】
本発明の生体適合性高速ゲル化ハイドロゲルの調製方法のプロセスは、以下のステップを含む:
（１）成分Ａと成分Ｂとを相互に混合して、特定の架橋条件を有する反応性混合物を調製するステップ。ここで、成分Ａは生体適合性高分子チオール化誘導体を含む溶液であり、成分Ｂは生体適合性チオール基反応性架橋剤である。生体適合性高分子チオール化誘導体は、生体適合性高分子がチオール化により変性されることにより調製される。成分Ａの濃度は８％ ｗ／ｖ未満であり、成分ＡのｐＨ値は８．５未満であり、成分ＢのｐＨ値は成分ＡのｐＨ値より大きい。成分Ａ中のチオール基と成分Ｂ中のチオール基反応性官能基とは化学架橋反応を生じる。上記反応性混合物中の生体適合性高分子チオール化誘導体と生体適合性チオール基反応性架橋剤の濃度の和は６％ ｗ／ｖ未満である。上記特定の架橋条件とは、反応性混合物溶液のｐＨ値が７．０より大きいことである。
（２）反応性混合物を反応させてハイドロゲルを形成するステップ。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】FibriJetシリーズの複数成分混合反応気体補助式噴霧装置の部分的な構成を示す模式図。１はシリンジプランジャクリップ、２はシリンジ、３はシリンジホルダ、４は４ウェイアプリケータ、５は圧縮気体吸気管である。
【図２】図１の４ウェイアプリケータの構成を示す模式図。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明の生体適合性ハイドロゲルの調製方法の基本的な化学原理は、特定条件下でのチオール基と生体適合性チオール基反応性官能基との間の高速化学架橋反応である。本発明においては、通常、生体適合性高分子チオール化誘導体溶液（成分Ａ）および生体適合性チオール基反応性架橋剤（成分Ｂ）という二つの活性成分を使用する。少なくとも三つのチオール基を有する生体適合性高分子チオール化誘導体を含む成分Ａと、少なくとも二つのチオール基反応性官能基を有する生体適合性チオール基反応性架橋剤を含む成分Ｂとを特定条件下で相互に混合して化学架橋させることにより、本発明を実現することが可能である。本発明は生体適合性が良好であり、副生成物を発生せず、安定性が良好であり、使用が便利であり、低コストである、等の多くの長所を有する。
【００２８】
本発明において、成分Ａとは、生体適合性高分子チオール化誘導体の溶液である。上記溶液は水を主要な溶剤とし、溶液浸透圧を調節し溶液ｐＨ値を安定させる等の機能を有する若干の塩成分（塩化ナトリウム、ｐＨ緩衝塩成分等）を含んでいてもよい。また、その他の若干の極性及び水溶性の成分（エタノール等）を含んでいてもよい。
【００２９】
本発明において用いられる生体適合性高分子チオール化誘導体は、生体適合性高分子側鎖カルボキシル基やアミノ基等の官能基を直接チオール化変性する等の、生体適合性高分子のチオール化変性により調製することができる。その他、生体適合性高分子の側鎖アミノ基、ヒドロキシル基等の官能基は、まずカルボキシル化変性により新たな生体適合性高分子を得た後に、カルボキシル基のチオール化変性を行ってもよい。一般に、生体適合性高分子のチオール化変性には、常用される以下の数種の方法が含まれる。
【００３０】
方法１は、側鎖カルボキシル基のアミノ基（ヒドラジド）／カルボジイミドカップリング化学法である。好ましい形態としては、カルボキシル基がカルボジイミドの活性下で中間産物を形成し、ジスルフィド結合を含むジアミンまたはジヒドラジドが求核置換により中間産物を生成し、最後にジスルフィド結合をチオール基に還元すれば、生体適合性高分子チオール化誘導体が得られる（Shu et al， Biomacromolecules，3，1304，2002；Aeschlimann et al，US 7,196,180 B1）。また、ジスルフィド結合を含むジアミンまたはジヒドラジドに代えて、チオール基保護１級アミノ基を用いてもよく、得られる中間産物からチオール基の保護基を除去すれば、生体適合性高分子チオール化誘導体が得られる（Gianolio et al，Bioconjugate Chemistry，16，1512，2005）。上記のカルボジイミドは、通常は１-エチル-３-(３-ジメチルアミンプロピル)カルボジイミド塩酸塩をいう。用いられるジスルフィド結合を含むアミンまたはヒドラジドの例の構造を以下に示す。
【００３１】
【化１】
【００３２】
ここで、（１）はシスタミン、（２）はシスチンエステル、（３）はジチオジアニリン、（４）はジチオジエチルジヒドラジド、（５）はジチオジプロピルジヒドラジド、（６）はジチオジブチルジヒドラジド、（７）はジチオジプロピオン酸ジアシルグリシンジヒドラジド、（８）はジチオジプロピオン酸ジアシルアラニンジヒドラジド、（９）はジチオジプロピオン酸ジアシル（ヒドロキシ）アミノ酢酸ジヒドラジド、（１０）はジチオジプロピオン酸ジアシルアミノプロピオン酸ジヒドラジド、（１１）はジチオジプロピオン酸ジアシルアミノブチル酸ジヒドラジド、（１２）はジチオジブチル酸ジアシルグリシンジヒドラジド、（１３）はジチオジブチル酸ジアシルアミノプロピオン酸ジヒドラジド、（１４）はジマロン酸ジアシルシスタミノジヒドラジド、（１５）はジコハク酸ジアシルシスタミノジヒドラジド、（１６）はジ（メチル）コハク酸ジアシルシスタミノジヒドラジド、（１７）はジグルタミン酸ジアシルシスタミノジヒドラジド、（１８）はジヘキシル酸ジアシルシスタミノジヒドラジド、（１９）はジヘプチル酸ジアシルシスタミノジヒドラジド、である。
【００３３】
このような方式により調製した高分子チオール化変性誘導体は、通常、以下の一般式（Ｉ）または一般式（ＩＩ）に示す構造を有する（Shu et al， Biomacromolecules，3，1304，2002；Prestwich et al，WO 2004/03716；宋ら，中国特許出願第200610119414.1号明細書）。
【００３４】
【化２】
式中、Ｒ１およびＲ２は、アルキレン基、置換アルキレン基、アリール基、ポリエーテル基、アシルアミノ基、ポリアミド基等を含む。
【００３５】
方法２は、側鎖カルボキシル基を、ジスルフィド結合を含むカルボジイミド（２，２’−ジチオ‐ジ（Ｎ‐エチル（Ｎ’‐エチルカルボジイミド））等）と直接反応させて調製する方法である。調製された生体適合性高分子チオール化変性誘導体は、以下の一般式（III）に示す構造を有する（Bulpitt et al，US 6884788）。
【００３６】
【化３】
式中、Ｒ３はアルキレン基、置換アルキレン基、アリーレン基等である。
【００３７】
方法３は側鎖アミノ基の変性であり、一般に直接変性と間接変性の二種類の方式に分けられる。直接変性方式とは、側鎖アミノ基を直接修飾して、チオール基を導入することである。例えば、ジコハク酸ジアシルシスタミノジカルボニルジイミダゾール活性エステルによる、コラーゲンアミノ基のチオール化変性である（Yamauchi et al，Biomaterials，22，855，2001；Nicolas et al，Biomaterials，18，807，1997）。直接変性方式により調製された高分子チオール化誘導体は、通常、以下の一般式（ＩV）に示す構造または一般式（ＩV）に類似した構造を有する。
【００３８】
【化４】
式中、Ｒ４は、アルキレン基、置換アルキレン基、アリール基、ポリエーテル基、アシルアミノ基、ポリアミド基等である。
【００３９】
方法３におけるアミノ基の間接チオール化変性の方式は、一般に二つのステップに分けられる。第一ステップは、アミノ基のカルボキシル化であり、第二ステップはカルボキシル基のチオール化変性である。ここで、第二ステップのカルボキシル基のチオール化変性は、前述した方法１および方法２と同様である。調製された生体適合性高分子チオール化誘導体は、通常、以下の一般式（V）または一般式（VI）に示す構造を有する。
【００４０】
【化５】
式中、Ｒ１およびＲ２の定義は前述の通りであり、Ｒ５はアルキレン基、置換アルキレン基等の基である。
【００４１】
側鎖カルボキシル基とアミノ基とを同時に有する生体適合性高分子については、そのチオール化誘導体はカルボキシル基チオール化変性構造（一般式（I）または（II）等）とアミノ基の直接または間接チオール化変性構造（一般式（III）、（IV）、（V）または（VI）等）とを同時に有する（宋ら，中国特許出願第200710036276.5号明細書）。
【００４２】
方法４は側鎖ヒドロキシル基の変性である。通常の方法は、ヒドロキシル基を強アルカリ条件下でカルボキシル化し、その後カルボキシル基を前述の方法１および方法２によりチオール化する。例えば、セルロース、ヒアルロン酸、キチンおよびキトサン等の高分子側鎖ヒドロキシル基はいずれもカルボキシメチル化することができ、その後アミノ基（ヒドラジド）／カルボジイミド化学反応を用いてチオール化変性を行う。調製された生体適合性高分子チオール化誘導体は、通常、以下の一般式（VII）または（VIII）に示す構造を有する。
【００４３】
【化６】
式中、Ｒ１およびＲ２の定義は前述の通りであり、Ｒ6はアルキレン基、置換アルキレン基等の基である。
【００４４】
カルボキシル基とヒドロキシル基とを同時に有する生体適合性高分子については、そのチオール化誘導体はカルボキシル基のチオール化変性構造（一般式（I）または（II）等）とヒドロキシル基のチオール化変性構造（一般式（VII）または（VIII）等）とを同時に有しうる。
【００４５】
上記の一般式（I）〜（VIII）において、Ｐは生体適合性高分子の残基であり、そのうち少なくとも二つの生体適合性高分子化合物の側鎖カルボキシル基、アミノ基またはヒドロキシル基が、直接または間接的にチオール基に変性される。Ｐの分子量は通常１，０００〜１０，０００，０００である。生体適合性高分子の定義は前述の通りである。
【００４６】
上記の一般式（I）〜（VIII）において、Ｒ１の好ましい構造は、アルキレン基−（ＣＨ２）ｍ−、アシルアミノ基−（ＣＨ２）ｉ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）ｊ−、および−（ＣＨ２）ｉ−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ２）ｊ−であり、式中、ｍ、ｉおよびｊはいずれも１〜１５の整数である。ｍが１〜３の整数、ｉが１〜５の整数、ｊが２および３のときが、Ｒ１の特に好ましい構造である。
【００４７】
上記の一般式（I）〜（VIII）において、Ｒ２の好ましい構造は、アリール基、アルキレン基−（ＣＨ２）ｍ−および置換アルキレン基−ＣＨ−（Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ）−ＣＨ２−であり、式中、ｍは１〜１５の整数であり、Ｒはメチル基、エチル基、プロピル基およびブチル基である。Ｒ２の特に好ましい構造は、炭素数２のアルキレン基、Ｒがメチル基およびエチル基の上記置換アルキレン基である。
【００４８】
上記の一般式（I）〜（VIII）において、Ｒ３の好ましい構造は、アリール基およびアルキレン基−（ＣＨ２）ｍ−であり、式中、ｍは１〜１５の整数である。Ｒ３の特に好ましい構造は、炭素数２のアルキレン基である。
【００４９】
上記の一般式（I）〜（VIII）において、Ｒ４の好ましい構造は、アルキレン基−（ＣＨ２）ｍ−、アシルアミノ基−（ＣＨ２）ｉ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）ｊ−および（ＣＨ２）ｉ−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ２）ｊ−であり、式中、ｍ、ｉおよびｊはいずれも１〜１５の整数である。ｍが１〜３の整数、ｉが１〜５の整数、ｊが２および３のときが、Ｒ４の特に好ましい構造である。
【００５０】
上記の一般式（I）〜（VIII）において、Ｒ５の好ましい構造は、アルキレン基−（ＣＨ２）ｍ−であり、式中、ｍは１〜１５の整数である。ｍが１〜８の整数のときが、Ｒ５の特に好ましい構造である。
【００５１】
上記の一般式（I）〜（VIII）において、Ｒ６の好ましい構造は、アルキレン基であり、ｍは１〜１５の整数である。ｍが１〜５の整数のときが、Ｒ６の特に好ましい構造である。
【００５２】
本発明に用いられる生体適合性高分子チオール化誘導体の特に好ましい一部の化学構造を以下に示す。
【００５３】
【化７】
【００５４】
【化８】
【００５５】
このうち、構造式（１）、（２）および（３）は、一般式（I）の特に好ましい生体適合性高分子チオール化誘導体に属する。構造式（４）は、一般式（II）の特に好ましい生体適合性高分子チオール化誘導体に属する。構造式（５）は、一般式（III）の特に好ましい生体適合性高分子チオール化誘導体に属する。構造式（６）は、一般式（IV）の特に好ましい生体適合性高分子チオール化誘導体に属する。構造式（７）、（８）および（９）は、一般式（V）の特に好ましい生体適合性高分子チオール化誘導体に属する。構造式（１０）は、一般式（VI）の特に好ましい生体適合性高分子チオール化誘導体に属する。構造式（１１）、（１２）および（１３）は、一般式（VII）の特に好ましい生体適合性高分子チオール化誘導体に属する。構造式（１４）は、一般式（VIII）の特に好ましい生体適合性高分子チオール化誘導体に属する。
【００５６】
カルボキシル基、アミノ基、ヒドロキシル基を同時に有する生体適合性高分子により調製される生体適合性チオール化誘導体の特に好ましい構造は、上記構造式（１）〜（１４）のうちの一種類以上の構造を有しうる。例えば、ヒアルロン酸はカルボキシル基とヒドロキシル基を同時に有し、ヒドロキシル基をカルボキシメチル化してカルボキシル基を導入し、その後アミノ基（ヒドラジド）／カルボジイミド化学反応を用いてチオール化変性を行うことができる。調製されるヒアルロン酸チオール化誘導体は、同時に構造式（１）、（２）または（３）の構造と、構造式（１１）、（１２）または（１３）の構造とを有する（Prestwich et al，PCT Int. Appl. WO 2005/056608）。ゼラチンはカルボキシル基とアミノ基を同時に有し、アミノ基を無水酸と反応させてカルボキシル基を導入し、その後ヒドラジド／カルボジイミド化学反応を用いてチオール化変性を行うことができる。調製されるゼラチンチオール化誘導体は、同時に構造式（１）、（２）または（３）の構造と、構造式（７）、（８）または（９）の構造とを有する（宋ら，中国特許出願第200710036276.5号明細書）。
【００５７】
本発明に用いられる成分Ｂは、生体適合性チオール基反応性架橋剤であり、少なくとも二つのチオール基反応性官能基を有する。通常、チオール基反応性官能基には、マレイミド、ビニルスルホン、α，β不飽和アクリレート、α，β不飽和メタクリレート、ハロプロピオネート、ハロプロピオンアミド、ジチオヒリジン、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステル等が含まれる。このうち、マレイミド、ビニルスルホン、ヨードプロピオネート、ヨードプロピオンアミド、ジチオヒリジン等の官能基は高いチオール基反応活性を有する。上記の官能基とチオール基の反応は三種類に分けられる。（１）チオール基と活性不飽和二重結合の付加反応。この種の反応に属する官能基には、マレイミド、ビニルスルホン、α，β不飽和アクリレート、α，β不飽和メタクリレート等が含まれる。（２）チオール基の置換反応。この種の反応に属する官能基には、ヨードプロピオネート、ブロモプロピオネート、クロロプロピオネート、ヨードプロピオンアミド、ブロモプロピオンアミド、クロロプロピオンアミド、ジチオヒリジン等が含まれる。（３）チオエステル化反応。この種の反応に属する官能基には、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステル等の各種カルボン酸活性エステルが含まれる。チオール基と上記チオール基反応性官能基との反応式を以下に示す。
【００５８】
【化９】
【００５９】
上記チオール基反応性官能基のうち、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステルは反応活性が強く、アミノ基およびチオール基の双方と反応可能で選択性を持たないため、相当の毒性、副作用を有する。また、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステルは、チオール基との反応時にさらに副生成物としてＮ−ヒドロキシスクシンイミドを生成するため、毒性、副作用を生じうる。なお、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステルとチオール基の反応により形成されるチオエステル結合は不安定で加水分解しやすく、医薬分野での応用には多くの制限がある。Wallenceらはポリエチレングリコールスクシンイミド活性エステル誘導体をポリエチレングリコールチオール基誘導体の架橋に用いているが（特許文献１）、上記の重大な欠陥が存在するため、本発明ではチオール基反応性官能基としてＮ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステルを用いない。ジチオピリジンとチオール基の反応でも副生成物が生じ、毒性、副作用を生じうるため、同様に本発明では用いない。
【００６０】
本発明で用いるチオール基反応性官能基には、マレイミド、ビニルスルホン、α，β不飽和アクリレート、α，β不飽和メタクリレート、α，β不飽和アクリルアミド、α，β不飽和メタクリルアミド、ヨードプロピオネート、ブロモプロピオネート、クロロプロピオネート、ヨードプロピオンアミド、ブロモプロピオンアミド、クロロプロピオンアミド等が含まれる。ヨードプロピオネート、ブロモプロピオネート、クロロプロピオネート、ヨードプロピオンアミド、ブロモプロピオンアミド、クロロプロピオンアミド等の官能基も、チオール基との反応時に副生成物を生じるものの、これらの副生成物はハロゲノ酸であり、生理条件下で塩素イオン、臭素イオンまたはヨウ素イオンを形成するため、良好な生体適合性を有する。ここで、ハロプロピオネートは、対応するハロプロピオンアミドよりも良好なチオール基反応活性を有するが、安定性にやや欠ける。ヨードプロピオネート（またはヨードプロピオンアミド）は、対応するブロモ基よりも良好なチオール基反応活性を有するが、安定性にやや欠ける。クロロプロピオネート（またはクロロプロピオンアミド）のチオール基反応活性は最も低いものの、安定性は良好である。
【００６１】
本発明の好ましいチオール基反応性官能基は、マレイミド、ビニルスルホン、α，β不飽和アクリレート、α，β不飽和メタクリレート、α，β不飽和アクリルアミド、α，β不飽和メタクリルアミド等である。これらの官能基は良好な生体適合性を有するばかりでなく、チオール基との反応時に副生成物を生じることもない。本発明の特に好ましいチオール基反応性官能基は、ビニルスルホン、α，β不飽和アクリレート、α，β不飽和メタクリレート、α，β不飽和アクリルアミド、α，β不飽和メタクリルアミド等であり、これらは良好な生体適合性を有するばかりでなく、安定性もＮ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステルより大幅に向上している。
【００６２】
本発明に用いられる一つ以上のチオール基反応性官能基を含む成分Ｂは、通常、前述のチオール基反応性官能基を少なくとも二つ含むポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の誘導体であり、二分岐、三分岐、四分岐、八分岐またはさらに多分岐のポリエチレングリコール誘導体であって、以下のような典型的な化学構造を有する。
【００６３】
【化１０】
【００６４】
式中、Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４、Ｆ５、Ｆ６、Ｆ７およびＦ８は、前述のマレイミド、ビニルスルホン、α，β不飽和アクリレート、α，β不飽和メタクリレート、α，β不飽和アクリルアミド、α，β不飽和メタクリルアミド、ヨードプロピオネート、ブロモプロピオネート、クロロプロピオネート、ヨードプロピオンアミド、ブロモプロピオンアミド、クロロプロピオンアミド等のチオール基反応性官能基であり、これらは全て同じ、一部同じ、または全て異なる化学構造を有しうる。ＰＥＧとは、分子量が１００〜１，０００，０００で、ＣＨ２ＣＨ２Ｏの繰返し単位を有するセグメントである。Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４、Ｆ５、Ｆ６、Ｆ７およびＦ８は、好ましくはマレイミド、ビニルスルホン、α，β不飽和アクリレート、α，β不飽和メタクリレート、α，β不飽和アクリルアミド、α，β不飽和メタクリルアミド等の官能基であり、特に好ましくは、ビニルスルホン、α，β不飽和アクリレート、α，β不飽和メタクリレート、α，β不飽和アクリルアミド、α，β不飽和メタクリルアミド等の官能基である。
【００６５】
二分岐のポリエチレングリコールを例に、本発明に用いられる一般的な架橋剤には、ポリエチレングリコールジマレイミド、ポリエチレングリコールジビニルスルホン、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリルアミド、ポリエチレングリコールジハロプロピオネート、ポリエチレングリコールジハロプロピオンアミド等が含まれる。化学構造式を以下に示す。
【００６６】
【化１１】
【００６７】
上記本発明の生体適合性高速ゲル化ハイドロゲルの調製方法のプロセスにおける第一ステップは、特定の架橋条件を有する反応性混合物溶液の調製である。ここでの特定の架橋条件としては、成分Ａおよび成分Ｂの性質を調節することにより、反応性混合物溶液のｐＨ値を弱アルカリ性またはアルカリ性にすることが肝要である。反応性混合物溶液のｐＨ値は、好ましくは８．０〜１２．０であり、特に好ましくは８．５〜１０．５である。
【００６８】
前述の通り、本発明で選択される成分Ａおよび成分Ｂはいずれも良好な生体適合性を有するとともに、チオール基とチオール基反応性官能基との間の化学架橋反応も良好な生体適合性を有する。このことは本発明の生体適合性が良好であるための確実な根拠となっている。さらに、高速ゲル化を実現するために、成分Ａおよび成分Ｂの濃度、溶液のｐＨ値、温度等のその他の重要なパラメータを最適化する必要がある。
【００６９】
本発明で用いられる温度は、通常は０〜５０℃である。化学架橋反応温度を高めると、ゲル化の速度を加速することができる。実際の使用過程では、好ましい温度は通常は１０〜４０℃の間である。本発明で最も常用される温度は室温であり、通常は２５℃前後である。
【００７０】
Wallaceらにより開示された高速ゲル化ゲルの調製方法において、高速ゲル化を実現するためには、使用される多分岐ポリエチレングリコールチオール基誘導体溶液のｐＨ値は強アルカリ性（通常、ｐＨ値は９．６）でなければならず、濃度は１０％ ｗ／ｖ以上でなければならない（特許文献１）。しかしながら、チオール基は、アルカリ性、特に強アルカリ性の条件下では不安定であり、ジスルフィド結合を形成して反応活性を失いやすい。そのため、多分岐ポリエチレングリコールチオール基誘導体は用時調製されなければならず、空気に触れると活性を失いやすいため、使用上不便である。本発明では、使用の便宜上、成分Ａ溶液は用時調製が不要であり、通常は、生体適合性高分子チオール化誘導体はまず成分Ａ溶液として調製し、滅菌後に低温で凍結保存し、使用前に解凍すればよい。Wallaceら（特許文献１）により用いられる多分岐ポリエチレングリコールチオール基誘導体（分子量１０，０００、最多で１２個のチオール基／１０，０００分子量セグメント）とは異なり、本発明に用いられる生体適合性高分子チオール化誘導体は、通常、より高い分子量（通常は１０，０００〜１，０００，０００の間）とより多くのチオール基含有量（１００個以上のチオール基／１０，０００分子量セグメント）とを有する（Shu et al，Biomacromolecules，3，1304，2002）。従って、本発明における成分Ａは強アルカリ性の条件下では非常に不安定であり、Wallaceらにより開示された方法（特許文献１）によって高速ゲル化を実現することはできない。
【００７１】
チオール化誘導体が強アルカリ性の条件下で不安定であるという欠陥を克服するために、本発明で用いられる成分Ａの溶液のｐＨ値は通常８．５以下、好ましくはｐＨ値≦７．０であり、この場合に溶液は一定の安定性を有する。より好ましいｐＨ値の範囲は２．５〜７．０であって、この場合に溶液は良好な安定性を有する。零下３０℃では一年以上保存でき、室温では、溶液が空気に触れた場合には２時間以上保存でき、空気に触れなければ５時間以上保存できる。特に好ましいｐＨ値の範囲は３．５〜６．０であって、この条件下ではチオール基は安定しており、また、酸による生体適合性高分子チオール基誘導体の加水分解作用を基本的に回避している。この特に好ましい条件下で、本発明に用いられる成分Ａの安定性はWallaceら（特許文献１）により用いられた不活性化しやすい多分岐ポリエチレングリコールチオール基誘導体溶液と比較して実質的に向上しており、零下３０℃以下では二年以上保存でき、室温で溶液が空気に触れた場合でも２４時間以上保存できる。
【００７２】
本発明では、成分Ａは上記の条件下で長期保存と使用前の良好な安定性が保証されている。成分Ａと成分Ｂを混合する前に、上記成分Ａ中にアルカリ性溶液またはアルカリ性物質を加えて成分ＡのｐＨ値を高め（８．５より大きくする等）、即座に成分Ｂと混合してハイドロゲルを調製してもよい。
【００７３】
本発明では、成分Ａ中の生体適合性チオール基変性高分子の濃度は通常８．０％ ｗ／ｖ以下であり、好ましい濃度は０．５〜５．０％ ｗ／ｖ、特に好ましい濃度は０．８〜３．０％ ｗ／ｖである。Wallaceらにより開示された高速ゲル化ゲルの調製方法において、高速ゲル化を実現するためには、使用される多分岐ポリエチレングリコールチオール基誘導体溶液の濃度は１０％ ｗ／ｖ以上（通常は２０％ ｗ／ｖ）でなければならない（特許文献１）。成分Ａの濃度が特に好ましい濃度である場合に、本発明における生体適合性チオール基変性高分子の用量を８０〜９０％減らすことができ、コストを大幅に削減している。
【００７４】
本発明では、成分Ａは水を溶剤とすることができるが、塩化ナトリウム、緩衝塩およびその他の成分を加えてもよい。通常は、低濃度の緩衝塩（例えば、弱酸性の０．０００５ｍｏｌ／Ｌのリン酸ナトリウム緩衝液）を用いて溶液のｐＨ値を安定させる。塩化ナトリウム等は溶液の浸透圧を調節することができる。
【００７５】
本発明では、用いられる生体適合性チオール基反応性架橋剤は、固体状態の場合に低温で安定しており、通常、零下３０℃以下で長期保存（二年以上）できる。また、これらは溶解しやすいため、成分Ｂは用時調製することが可能である。成分ＢのｐＨ値は成分ＡのｐＨ値より大きい。成分ＢのｐＨ値は通常８．０より大きく、通常は≧８．５である。室温での安定時間は一般に２時間以上である。例えば、本発明に用いられるポリエチレングリコールジアクリレート溶液（ｐＨ９．６）を室温で４時間保存した場合、ゲル化時間には影響しない。また、同様の条件下で、本発明に用いられる、ポリエチレングリコールジメタクリレート溶液、ポリエチレングリコールジアクリルアミド溶液、ポリエチレングリコールジメタクリルアミド溶液、の順に安定性が向上し、いずれもポリエチレングリコールジアクリレート溶液よりも安定している。本発明では、成分ＢのｐＨ値は、好ましくは８．０〜１２．０であり、特に好ましくは８．５〜１０．５である。
【００７６】
本発明に用いられる成分Ｂは大きな利点を有する。Wallaceらにより開示された高速ゲル化ゲルの調製方法では、用いられる架橋剤（多分岐ポリエチレングリコールスクシンイミド活性誘導体）は、酸性およびアルカリ性のいずれの条件下でも不安定であり、０．０００５ｍｏｌ／Ｌのリン酸ナトリウム緩衝液に溶解して弱酸性溶液（ｐＨ６．０）を得なければならない。しかしながら、この最適な条件でも、溶液の安定性は劣っており、用時調製しなければならず、また、一時間以内に使い終えなければならない。
【００７７】
本発明では、成分Ｂ中の生体適合性チオール基反応性架橋剤の濃度は通常１０％ ｗ／ｖ以下であり、好ましい濃度は０．５〜８．０％ ｗ／ｖ、特に好ましい濃度は０．８〜４．０％ ｗ／ｖである。それに対し、Wallaceらにより開示された方法では、高速ゲル化を実現するためには、使用される架橋剤（多分岐ポリエチレングリコールスクシンイミド活性誘導体）溶液の濃度は１０％ ｗ／ｖ以上（通常は２０％ ｗ／ｖ）でなければならない（特許文献１）。本発明では、成分Ｂの濃度が特に好ましい濃度である場合に、架橋剤の用量を６０〜９６％減らすことができ、コストを大幅に削減している。
【００７８】
本発明では、成分Ｂは通常は溶剤としてアルカリ性の緩衝溶液を用いるが、塩化ナトリウムおよび他の成分を加えて溶液の浸透圧を調節してもよい。用いられる緩衝溶液は、通常、０．３ｍｏｌ／Ｌのリン酸ナトリウム／炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０〜１０．０）（０．３ｍｏｌ／Ｌのリン酸二水素ナトリウム溶液に、０．３ｍｏｌ／Ｌの炭酸ナトリウム溶液を所定のｐＨ値となるまで加える）等のように濃度が高い。成分Ｂ中の生体適合性架橋剤は、通常、溶液のｐＨを変えないため、緩衝溶液のｐＨが成分Ｂの溶液のｐＨ値を決定している。
【００７９】
成分Ａと成分Ｂとを相互に混合すると、特定の架橋条件を有する反応性混合物が形成される。室温条件下では、基本的に反応性混合物溶液のｐＨ値が化学架橋速度およびゲル化速度を決定しており、ｐＨ値が向上すると、化学架橋およびゲル化の過程が加速される。反応性混合物溶液のｐＨ値は、通常は７．０以上であり、好ましくは８．０〜１２．０、特に好ましくは８．５〜１０．５である。
【００８０】
反応性混合物のｐＨ値は、成分Ａと成分Ｂとの混合時に決定される。あるいは、酸又はアルカリ溶液を加えて調節してもよい。反応性混合物溶液のｐＨ値は、初期の成分Ａおよび成分Ｂの性質（溶剤の類型、緩衝溶液の濃度、ｐＨ値等）により決定される。成分Ａの溶液および成分Ｂの溶液は、異なる濃度のｐＨ値緩衝物質を含んでもよく、ｐＨ値緩衝物質を含まなくてもよい。またその他の極性及び親水性物質を添加してもよい。初期の成分Ａの溶液および成分Ｂの溶液の性質を調節すれば、反応性混合物溶液のｐＨを調節して特定のｐＨ値とすることができる。例えば、成分ＡがｐＨ６．０の水溶液であり、成分ＢがｐＨ９．６の０．３ｍｏｌ／Ｌのリン酸ナトリウム／炭酸ナトリウム緩衝液である場合に、成分Ａと成分Ｂとの反応性混合物溶液はアルカリ性であり、ｐＨ値は通常、９．０〜９．６の間である。成分Ｂの溶剤のｐＨ値を高くすれば、反応性混合物溶液のｐＨ値を高くすることができ、逆であれば反応性混合物溶液のｐＨ値は低くなる。
【００８１】
本発明ではさらに、反応性混合物溶液中に、混合前の成分Ａまたは成分Ｂに、または成分Ａと成分Ｂとの混合時に、所定濃度の酸又はアルカリ溶液（０．２ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム溶液等）を加え、反応性混合溶液のｐＨを調節して特定の値とすることができ、これにより適切なゲル化速度とすることができる。しかしながら、通常の状況ではこのステップは不要であり、初期の成分Ａの溶液および成分Ｂの溶液の性質を調節すれば本発明を実現することができる。
【００８２】
本発明では、生体適合性高分子チオール化誘導体および生体適合性チオール基反応性架橋剤の使用量が少ない。反応性混合物中の両者の濃度の合計は一般に６％ ｗ／ｖ未満であり、通常は０．８〜３．０％ ｗ／ｖである。
【００８３】
適切な生体適合性チオール化変性高分子および生体適合性チオール基反応性架橋剤を選択し、成分Ａの溶液および成分Ｂの溶液の性質を調節し、酸アルカリを選択的に加えて反応性混合物溶液のｐＨ値をさらに調節すれば、数秒間から数分間（ひいては数十分間）という時間範囲内でゲル化時間を調節することができる。このため、様々な医学的用途に適している。例えば、本発明は、高速ゲル化ハイドロゲル噴霧剤に簡便に用いることができ、術後の癒着合併症の治療に用いることができ、一分間未満というゲル化時間を実現する。
【００８４】
本発明の生体適合性高速ゲル化ハイドロゲルの調製方法の他のプロセスは、以下の三つの工程を含む：
（１）成分Ａと成分Ｂとを相互に混合して、特定の架橋条件を有する反応性混合物を形成するステップ。成分Ａは生体適合性高分子チオール化誘導体を含む溶液であり、成分Ｂは生体適合性チオール基反応性架橋剤である。成分Ｂは固体または溶液である。生体適合性高分子チオール化誘導体は、生体適合性高分子がチオール化変性されて調製される。成分Ａの濃度は８％ ｗ／ｖ未満であり、成分ＡのｐＨ値は８．５未満である。成分Ａ中のチオール基と成分Ｂ中のチオール基反応性官能基とは化学架橋反応を生じる。上記特定の架橋条件とは、反応性混合物溶液のｐＨ値が７．０以下であることである。
（２）反応性混合物溶液のｐＨ値を特定のアルカリ性の範囲に調節するステップ。
（３）反応性混合物を反応させてハイドロゲルを形成するステップ。
【００８５】
この方法の第一ステップは、良好な安定性を有する反応性混合物溶液を調製することであり、反応性混合物溶液のｐＨ値を弱酸性に制御することが肝要である。この方法の前述の方法との相違は、生体適合性架橋剤（成分Ｂ）が、固体でも、弱アルカリ性、中性または弱酸性の液体でもよく、かつ、成分Ａと成分Ｂとを相互に混合して形成される反応性混合物溶液のｐＨ値が７．０以下であることである。より好ましいｐＨ値の範囲は２．５〜６．０であり、このとき、反応性混合物溶液は良好な安定性を有し、室温で空気に接触した状態で１時間以上保存することができる。特に好ましいｐＨ値の範囲は３．５〜５．０であり、このとき、反応性混合物溶液は良好な安定性を有し、室温で空気に接触した状態で４時間以上保存することができる。
【００８６】
この方法の第二ステップは、良好な安定性を有する反応性混合物溶液中にアルカリまたはアルカリ性緩衝溶液（０．２ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム溶液／水酸化カリウム溶液、ｐＨ値９．０〜１２．０のリン酸塩や炭酸塩の緩衝液等）を加えて溶液のｐＨ値を弱アルカリ性またはアルカリ性に調節することであり、好ましいｐＨ値は８．０〜１２．０、特に好ましい溶液のｐＨ値は８．５〜１０．５である。
【００８７】
この方法の第三ステップは、上記の条件の下で反応性混合物の成分Ａと成分Ｂとを反応させてハイドロゲルを速やかに形成することである。この方法で用いられる生体適合性高分子チオール化誘導体および生体適合性チオール基反応性架橋剤は前述の方法と同様であり、この方法のその他の条件は前述の方法と同様である。
【００８８】
本発明では、適切な生体適合性チオール化変性高分子および生体適合性チオール基反応性架橋剤を選択し、成分Ａおよび成分Ｂの性質を調節し、反応性混合物溶液のｐＨ値を特定の値に調節すれば、数秒間から数分間（ひいては数十分間）という時間範囲内でゲル化時間を調節することができる。このため、様々な医学的用途に適している。例えば、本発明は、高速ゲル化ハイドロゲル噴霧剤に簡便に用いることができ、術後の癒着合併症の治療に用いることができ、一分間未満というゲル化時間を実現する。
【００８９】
本発明に用いられる成分Ａ中の生体適合性チオール化変性高分子は、通常、高い分子量とチオール基含有量を有し、分子量は、通常、１０，０００〜１，０００，０００の間であり、チオール基含有量は１００個以上のチオール基／１０，０００分子量セグメントである。つまり、分子量５０，０００の生体適合性チオール化変性高分子ごとに５００個のチオール基を有する。開示されたポリエチレングリコールチオール化誘導体およびシステインを含むオリゴペプチド等（特許文献１；Gravett et al，US2004/0225077A1；Qiu et al，Biomaterials，24，11，2003；Hubbell et al，US2003/0220245A1；Lutolf et al，Biomacromolecules，4，713，2003）と比較して、本発明に用いられる生体適合性チオール化変性高分子のチオール基含有量は８倍以上に向上しており、分子量も大幅に向上している。従って、同じ条件の下では、本発明に用いられる生体適合性チオール化変性高分子の化学架橋によりゲルを形成する能力は大幅に向上しており、ゲルの性能（機械的強度、安定性、透過性等）も大幅に向上している。上記のポリエチレングリコールチオール化誘導体およびシステイン含有オリゴペプチド等についての報告では、高い濃度（通常は１０％ ｗ／ｖ以上）の場合にはじめて高速架橋ゲル化を実現でき、その溶液は弱アルカリ性であるか、または必ずアルカリ性でなければならず、安定性に劣り、用時調製が必要で、空気に触れてはならない。また、用いられる架橋剤の濃度も高く（通常は１０％ ｗ／ｖ以上）、調製されるハイドロゲル中の含水量は一般に９０％以下で、通常は８０％前後である。これとは逆に、本発明では、生体適合性チオール化変性高分子および生体適合性チオール基反応性架橋剤の用量は少量で高速ゲル化を実現でき、調製されるハイドロゲル中の含水量は一般に９４％以上で、通常は９７％以上であり、より良好な透過性および生体適合性を有する。また、本発明に用いられる成分Ａ中の生体適合性チオール化変性高分子は、通常は細胞間質物質（ヒアルロン酸等）により調製され、創傷の治癒を促進することが可能な点、組織特異的な修復を誘導・誘発することが可能な点等、細胞間質物質に特有の生物学的機能を保っている。
【００９０】
本発明に用いられる成分Ａ中の生体適合性チオール化変性高分子は、強アルカリ性の条件下では非常に不安定であり、Wallaceらにより開示された方法（特許文献１）によって高速ゲル化を実現することはできない。例えば、ヒアルロン酸チオール化誘導体は、強アルカリ性の条件下では極めてジスルフィド結合を形成しやすく、活性を失う（Shu et al， Bio macromolecules，3，1304，2002）。一般に、本発明における成分ＡのｐＨ値が８．５より大きい場合には、溶液は不安定で使用上不便であり、実用的な価値を失う。従って、本発明では、通常、成分Ａを中性に近い条件または弱酸性の条件下で保存することにより、成分Ａの長期保存の安定性および使用時の安定性を著しく高めている。しかしながら一方で、高速ゲル化の実現は反応性混合物が高いｐＨ値（強アルカリ性）を有することにも依存している。従って、本発明の一つのプロセスでは、成分Ｂは通常強いアルカリ性を有し、成分ＢのｐＨ値が成分ＡのｐＨ値より大きいことが必須となる。このような成分Ａと成分Ｂとの反応性混合物こそが、高いｐＨ値（強アルカリ性）を有することができる。同時に、本発明で用いられる成分Ｂ中の生体適合性チオール基反応性架橋剤は、各種条件（強アルカリ性を含む）下で良好な安定性を有していなければならない。成分Ａの溶液および成分Ｂの溶液の性質を調節し、および酸アルカリを選択的に加えて反応性混合物溶液のｐＨ値をさらに調節すれば、本発明が実現される。
【００９１】
本発明の他のプロセスでは、成分Ａの溶液および成分Ｂの溶液の性質を調節して成分Ａと成分Ｂとの反応性混合物を弱酸性条件におくことにより、成分Ａおよび成分Ｂの長期保存の安定性および使用時の安定性を保証することができるとともに、反応性混合物の使用時の安定性を著しく高めることができ、その後アルカリを加えて反応性混合物溶液のｐＨ値をさらに調節して強アルカリ性とすることにより、高速ゲル化を実現する。
【００９２】
現在、すでに一部の報告により、ポリエチレングリコールジアクリレート（またはポリエチレングリコールジビニルスルホン）架橋による、ヒアルロン酸チオール化誘導体、コンドロイチン硫酸チオール化誘導体、およびゼラチンチオール化誘導体について開示されている。用いられる方法はいずれも、ポリエチレングリコールジアクリレート（またはポリエチレングリコールジビニルスルホン）とチオール化誘導体とをそれぞれ緩衝溶液に溶解し、二種類の溶液を中性付近の同程度のｐＨ値（通常は７．４）になるようにそれぞれ調節して、その後二種類の溶液を混合してハイドロゲルを調製するというものである。しかしながら、このような方法では、高速ゲル化の実現は困難である。二種類の溶液のｐＨ値を同時に高めれば（例えば、８．５以上）、ゲル化過程を加速することはできるものの、この場合チオール化誘導体溶液は不安定で、室温で、仮に空気に触れない条件下であっても、数時間（通常は約０．５〜４時間）後には活性を失う。長期保存が困難で大規模工業的生産が難しく、使用上も不便である。例えば、Ｌｉｕら（Liu et al，Fertility & Sterility， 87，940， 2007）は、Carbylan-SX（ポリエチレングリコールジアクリレート架橋による変性ヒアルロン酸チオール化誘導体）ハイドロゲルの噴霧剤を術後の癒着の防止に用いることを報告した。用いられる方法は、ポリエチレングリコールジアクリレートと変性ヒアルロン酸チオール化誘導体をそれぞれ緩衝溶液に溶解し、二種類の溶液のｐＨ値を７．４にそれぞれ調節し、ろ過滅菌した後に二種類の溶液を混合する。約５分間に混合溶液の粘度は徐々に高まり、噴霧装置を介して傷口組織の表面に噴霧されるというものである。しかしながら、この方法には、ゲル化時間が長くかつゲル化の過程が制御しにくい、噴霧のタイミングが把握しにくいといった多くの著しい欠陥が存在する。噴霧は、混合溶液の粘度は高いが流動性を失ってはいない、という短い時間範囲内に実現しなければならず、混合溶液の粘度が不十分であれば、噴霧後に溶液が傷口組織の表面から流失しやすく、混合溶液の粘度が大きすぎれば噴霧が難しく、ひいては噴霧不能となる。Connorsらも上記と同様のCarbylan-SXおよびその調製方法を術後の心膜癒着の防止に用いているが（Connors et al，J Surg Res， 140，237，2007）、同様に上記の欠陥が存在する。
【００９３】
また、本発明はさらに、新規の生体適合性高速ゲル化ハイドロゲルの噴霧剤の調製方法を提供する。これは、前述の本発明の高速ゲル化ハイドロゲルの調製方法を高速ゲル化ハイドロゲルの噴霧剤に応用した方法である。
【００９４】
当該方法においては、複数成分の混合反応に適用される複数種類の噴霧装置を用いることが可能である。常用される噴霧装置には、Spray Set for TISSEEL Fibrin Sealant (Baxter AG，米国)や、FibriJet (Micromedics, inc. 米国)等が含まれる。FibriJetシリーズには、通常噴霧化装置と気体補助式噴霧化装置が含まれる。FibriJetシリーズの通常噴霧化装置は、低粘度溶液に適し、ノズルが詰まりやすく、使用上不便である。FibriJetシリーズの気体補助式霧化装置の構成は図１に模式的に示す通りであり、シリンジ２Ａ、２Ｂと、シリンジプランジャクリップ１と、シリンジホルダ３と、４ウェイアプリケータ４と、圧縮気体吸気管５とを含む。シリンジ２Ａ、２Ｂのそれぞれは二つの成分を装入するために用いられ、４ウェイアプリケータ４を介してそれぞれ押し出された後に噴霧化、混合され（または、押し出され、混合された後に噴霧化され）、物体表面（例えば、創傷表面）に塗布された後、ゲルを形成する。４ウェイアプリケータ４と接続するノズルを加えて、噴霧化効果を向上させてもよい。
【００９５】
FibriJetシリーズの気体補助式噴霧化装置の主要構成要件は、４ウェイアプリケータ（図２）である。二つの吸入口のそれぞれは二つのシリンジ２Ａ、２Ｂに接続され、二つの成分を装入するために用いられる。一つの吸入口（圧縮気体吸気管５）は圧縮気体（空気または他の気体）に接続される。二つの成分のそれぞれは排出口に押し出され、圧縮気体の作用下で噴霧化、混合され、物体表面に塗布された後、ゲルを形成する。使用される気体の圧力が高いほど、噴霧化効果は良好であるが、気体圧力が高すぎると人体を傷つけるおそれがある。通常、使用される気体の圧力の範囲は１〜１０気圧の間である。気体圧力が低く、１気圧に近い場合には、噴霧化が不十分となり、大きな液体粒子を形成して、混合が十分に均一にならない。気体圧力を１．７気圧前後に高めれば、ごく微小な液体に噴霧化することができ、混合が均一になる。本発明の生体適合性高速ゲル化ハイドロゲルの調製方法の一のプロセスにおける成分Ａおよび成分Ｂのそれぞれが二つのシリンジに装入されて、高速ゲル化ハイドロゲル噴霧剤が調製される。本発明の生体適合性高速ゲル化ハイドロゲルの調製方法の他のプロセスによって噴霧を実現してもよい。この場合、成分Ａと成分Ｂとを混合して形成された反応性混合物を一つのシリンジに装入し、アルカリまたはアルカリ性緩衝溶液を第二のシリンジに装入した後に、両者をそれぞれ排出口から押し出し、圧力気体の作用下で噴霧化、混合すれば、高速ゲル化ハイドロゲル噴霧剤を調製することができる。
【００９６】
以下の実施例により、当業者は本発明をより全面的に理解することができるが、いかなる方式によっても本発明を限定するものではない。
【００９７】
実施例１ チオール化変性ヒアルロン酸（ＨＡ−ＤＴＰＨ）の調製
Shuら（Shu et al， Biomacromolecules，3，1304，2002）により報告された方法を用いて調製した。
【００９８】
ヒアルロン酸ナトリウム（分子量約１５０万）２０ｇを２Ｌの蒸留水中に溶解し、濃塩酸を加えて溶液のｐＨ値を約０．５に調節した後、３７℃、１５０回転／分の回転培養器で２４時間切断させた。透析精製し凍結乾燥して、低分子ヒアルロン酸が得られた（重量平均分子量２４．６万、数平均分子量１２万）。
【００９９】
上記の低分子ヒアルロン酸２０ｇを２Ｌの蒸留水に溶解した。上記の溶液中にジチオジプロピルジヒドラジド（ShuらがBiomacromolecules，3，1304，2002において開示した方法により調製）２３．８ｇを加え、攪拌して溶解した。そして、０．１ｍｏｌ／Ｌの塩酸を用いて溶液のｐＨ値が４．７５になるまで調節し、１‐エチル‐３‐（３‐ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（Aldrich，米国）１９．２ｇを加え、マグネチックスターラーで攪拌した。上記の溶液中に適量の０．１ｍｏｌ／Ｌの塩酸を断続的に添加して、溶液のｐＨ値を４．７５に維持した。１．０ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム溶液をｐＨ７．０になるまで加えて反応を終了させた。その後、ジチオスレイトール（Diagnostic Chemical Limited，米国）１００ｇおよび１．０ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム溶液適量を加えて攪拌した。溶液のｐＨ値を８．５に調整した。室温でマグネチックスターラーで攪拌し、２４時間反応させた。その後、上記の溶液中に１ｍｏｌ／Ｌの塩酸をｐＨが約３．５になるまで加えた。上記の溶液を透析管（カットオフ分子量3500，Sigma，米国）に装入し、大量の０．０００３ｍｏｌ／Ｌの塩酸と０．１ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム溶液を用いて、８時間ごとに透析液を交換しながら５日間透析した。その後さらに、大量の０．０００３ｍｏｌ／Ｌの塩酸溶液を用いて、８時間ごとに透析液を交換しながら３日間透析した。最後に、透析管内の溶液を収集し、凍結乾燥して白色綿状固体（ＨＡ−ＤＴＰＨ）が得られた。
【０１００】
上記のＨＡ−ＤＴＰＨを蒸留水中に溶解して１．０〜２．５％ ｗ／ｖ溶液を得て、溶液のｐＨ値を２．０〜７．０に調節し、ろ過して除菌した後、凍結保存（通常は零下２０℃以下）した。あるいは、上記の調製過程において、透析精製後の溶液を再度透析カラムに通して適切な濃度（通常は１．０〜２．５％ ｗ／ｖ）になるまで脱水濃縮し、溶液のｐＨ値を２．０〜７．０に調節し、ろ過滅菌した後、凍結保存（通常は零下２０℃以下）した。
【０１０１】
プロトン核磁気共鳴検査（１Ｈ‐ＮＭＲ）（溶剤はＤ２Ｏ）によれば、ＨＡ−ＤＴＰＨの側鎖チオール基の置換度は４２／１００二糖繰返し単位であった。分子量およびその分布（ＧＰＣにより測定）は、重量平均分子量が１３．６万、数平均分子量が６．１万であった。
【０１０２】
実施例２ チオール基反応性生体適合性架橋剤の調製
ポリエチレングリコールジアクリレート、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールジアクリルアミドおよびポリエチレングリコールジ（メタ）アクリルアミドを、対応するポリエチレングリコール（分子量３，４００または１０，０００，Sigma-Aldrich，米国）およびポリエチレングリコールジアミン（分子量３４００，Nektar Therapeutics，米国）により調製し、多分岐（四分岐または八分岐）のポリエチレングリコールアクリレートおよびポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレートを、対応する多分岐ポリエチレングリコール（分子量１０，０００）から調製した。調製の一般的な過程は、ポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコールジアミンを、トリエチルアミンの作用下でアクリロイルクロリドまたはメタアクリロイルクロリドと反応させ、精製し、反応物を得る。詳細な過程についてはShu et al， Biomaterials，25，1339，2004を参照。
【０１０３】
対応するアクリロイルクロリドに代えてハロアシルハライド（ヨードプロピオニルクロリド、ブロモプロピオニルクロリド等）を用いれば、上記と同様の過程を用いて、ポリエチレングリコールジヨードプロピオネート、ポリエチレングリコールジブロモプロピオネート、ポリエチレングリコールジクロロプロピオネート、ポリエチレングリコールジヨードプロピオンアミド、ポリエチレングリコールジブロモプロピオンアミド、ポリエチレングリコールジクロロプロピオンアミド等のチオール基反応性架橋剤を調製することができる。
【０１０４】
実施例３ 生体適合性高速ゲル化ハイドロゲルの調製
実施例１で調製したＨＡ−ＤＴＰＨ溶液（２．０％ ｗ／ｖ，ｐＨ５．０）を室温で解凍した。ポリエチレングリコールジアクリレート（分子量３４００，Nektar Therapeutics，米国）を０．３ｍｏｌ／Ｌのリン酸ナトリウム／炭酸ナトリウム緩衝液に溶解して２．０％ ｗ／ｖの溶液（ｐＨ９．６）を得て、ろ過滅菌した。マグネチックスターラーで攪拌しながら、上記の一方の溶液（５ｍｌ）を速やかに他方の溶液（５ｍｌ）に加え、３秒間攪拌し続けた後に停止した。反応性混合物のｐＨ値は約９．４であり、混合溶液は約１７秒後に流動性を失ってゲルを形成した。
【０１０５】
実施例４ 生体適合性高速ゲル化ハイドロゲルの調製
実施例１で調製したＨＡ−ＤＴＰＨ溶液（１．５％ ｗ／ｖ，ｐＨ６．０）を室温で解凍した。ポリエチレングリコールジアクリレート（分子量３４００，Nektar Therapeutics，米国）を０．１５ｍｏｌ／Ｌのリン酸ナトリウム／炭酸ナトリウム緩衝液に溶解して１．５％ ｗ／ｖの溶液（ｐＨ９．６）を得て、ろ過滅菌した。マグネチックスターラーで攪拌しながら、上記の一方の溶液（５ｍｌ）を速やかに他方の溶液（５ｍｌ）に加え、３秒間攪拌し続けた後に停止した。反応性混合物のｐＨ値は約９．３であり、混合溶液は約２７秒後に流動性を失ってゲルを形成した。
【０１０６】
実施例５ 生体適合性高速ゲル化ハイドロゲルの調製
実施例１で調製したＨＡ−ＤＴＰＨ溶液（１．５％ ｗ／ｖ，ｐＨ３．０）を室温で解凍した。ポリエチレングリコールジアクリレート（分子量３４００，Nektar Therapeutics，米国）を０．３ｍｏｌ／Ｌのホウ酸／水酸化ナトリウム緩衝液に溶解して１．５％ ｗ／ｖの溶液（ｐＨ１１．０）を得て、ろ過滅菌した。マグネチックスターラーで攪拌しながら、上記の一方の溶液（５ｍｌ）を速やかに他方の溶液（５ｍｌ）に加え、３秒間攪拌し続けた後に停止した。反応性混合物のｐＨ値は１０．５より大きく、混合溶液が流動性を失ってゲルを形成するまでの時間は１０秒未満であった。
【０１０７】
実施例６ 生体適合性高速ゲル化ハイドロゲルの調製
実施例１で調製したＨＡ−ＤＴＰＨ溶液（１．０％ ｗ／ｖ，ｐＨ５．０）を室温で解凍した。ポリエチレングリコールジビニルスルホン（分子量３４００，Nektar Therapeutics，米国）を０．３ｍｏｌ／Ｌのリン酸ナトリウム／炭酸ナトリウム緩衝液に溶解して１．０％ ｗ／ｖの溶液（ｐＨ９．６）を得て、ろ過滅菌した。マグネチックスターラーで攪拌しながら、上記の一方の溶液（５ｍｌ）を速やかに他方の溶液（５ｍｌ）に加え、３秒間攪拌し続けた後に停止した。反応性混合物のｐＨ値は約９．４であり、混合溶液は約４８秒後に流動性を失ってゲルを形成した。
【０１０８】
実施例７ 生体適合性高速ゲル化ハイドロゲルの調製
実施例１で調製したＨＡ−ＤＴＰＨ溶液（２．５％ ｗ／ｖ，ｐＨ５．０）を室温で解凍した。ポリエチレングリコールジビニルスルホン（分子量３４００，Nektar Therapeutics，米国）を０．３ｍｏｌ／Ｌのリン酸塩緩衝液に溶解して２．０％ ｗ／ｖの溶液（ｐＨ７．４）を得て、ろ過滅菌した。マグネチックスターラーで攪拌しながら、上記の一方の溶液（５ｍｌ）を速やかに他方の溶液（５ｍｌ）に加え、３秒間攪拌し続けた後に停止した。反応性混合物のｐＨ値は約７．２であり、混合溶液は約５分後に流動性を失ってゲルを形成した。
【０１０９】
実施例８ 生体適合性高速ゲル化ハイドロゲルの調製
実施例１で調製したＨＡ−ＤＴＰＨ溶液（２．０％ ｗ／ｖ，ｐＨ６．０）を室温で解凍した。ポリエチレングリコールジブロモプロピオネート（分子量３４００，Nektar Therapeutics，米国）を０．１５ｍｏｌ／Ｌのリン酸塩緩衝液に溶解して２．０％ ｗ／ｖの溶液（ｐＨ７．４）を得て、ろ過滅菌した。マグネチックスターラーで攪拌しながら、上記の一方の溶液（５ｍｌ）を速やかに他方の溶液（５ｍｌ）に加え、３秒間攪拌し続けた後に停止した。反応性混合物のｐＨ値は約７．２であり、混合溶液は約５分後に流動性を失ってゲルを形成した。
【０１１０】
実施例９ 生体適合性高速ゲル化ハイドロゲルの調製
実施例１で調製したＨＡ−ＤＴＰＨ溶液（２．０％ ｗ／ｖ，ｐＨ７．０）を室温で解凍した。ポリエチレングリコールジビニルスルホン（分子量３４００，Nektar Therapeutics，米国）を０．１５ｍｏｌ／Ｌのリン酸塩緩衝液に溶解して２．０％ ｗ／ｖの溶液（ｐＨ８．２）を得て、ろ過滅菌した。マグネチックスターラーで攪拌しながら、上記の一方の溶液（５ｍｌ）を速やかに他方の溶液（５ｍｌ）に加え、３秒間攪拌し続けた後に停止した。反応性混合物のｐＨ値は約８．０であり、混合溶液は約２分後に流動性を失ってゲルを形成した。
【０１１１】
実施例１０ 生体適合性高速ゲル化ハイドロゲルの調製
実施例１で調製したＨＡ−ＤＴＰＨ溶液（２．０％ ｗ／ｖ，ｐＨ５．０）を室温で解凍した。ポリエチレングリコールジアクリレート（分子量３４００，Nektar Therapeutics，米国）を０．０００５ｍｏｌ／Ｌのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解して８．０％ ｗ／ｖの溶液を得て、ろ過滅菌した。マグネチックスターラーで攪拌しながら、ポリエチレングリコールジアクリレート溶液（１ｍｌ）を速やかにＨＡ−ＤＴＰＨ溶液（４ｍｌ）に加えた。反応性混合物のｐＨ値は約５．４であった。その後、０．３ｍｏｌ／Ｌのリン酸ナトリウム／炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）５ｍｌを加え、３秒間攪拌し続けた後に停止した。反応性混合物のｐＨ値は約９．３であり、混合溶液は約２１秒後に流動性を失ってゲルを形成した。
【０１１２】
実施例１１ 生体適合性高速ゲル化ハイドロゲルの調製
実施例１で調製したＨＡ−ＤＴＰＨ溶液（２．０％ ｗ／ｖ，ｐＨ３．０）を室温で解凍した。ポリエチレングリコールジアクリレート（分子量３４００，Nektar Therapeutics，米国）を０．００１ｍｏｌ／Ｌの塩酸溶液に溶解して８．０％ ｗ／ｖの溶液を得て、ろ過滅菌した。マグネチックスターラーで攪拌しながら、ポリエチレングリコールジアクリレート溶液（１ｍｌ）を速やかにＨＡ−ＤＴＰＨ溶液（４ｍｌ）に加えた。反応性混合物のｐＨ値は約３．０であった。その後、マグネチックスターラーで攪拌しながら、０．１ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム溶液を適量加え、上記反応性混合物のｐＨ値を７．２に調節した。混合溶液は約６分後に流動性を失ってゲルを形成した。
【０１１３】
実施例１２ 生体適合性高速ゲル化ハイドロゲルの調製
実施例１で調製したＨＡ−ＤＴＰＨ溶液（２．０％ ｗ／ｖ，ｐＨ３．０）を室温で解凍した。ポリエチレングリコールジアクリレート（分子量３４００，Nektar Therapeutics，米国）を０．００１ｍｏｌ／Ｌの塩酸溶液に溶解して８．０％ ｗ／ｖの溶液を得て、ろ過滅菌した。マグネチックスターラーで攪拌しながら、ポリエチレングリコールジアクリレート溶液（１ｍｌ）を速やかにＨＡ−ＤＴＰＨ溶液（４ｍｌ）に加えた。反応性混合物のｐＨ値は約３．０であった。その後、マグネチックスターラーで攪拌しながら、０．１ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム溶液を適量加え、上記反応性混合物のｐＨ値を８．０に調節した。混合溶液は約２分後に流動性を失ってゲルを形成した。
【０１１４】
実施例１３ 生体適合性高速ゲル化ハイドロゲルの調製
実施例１で調製したＨＡ−ＤＴＰＨ溶液（２．０％ ｗ／ｖ，ｐＨ４．０）を室温で解凍した。実施例２で調製したポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート（分子量10,000）を０．０００１ｍｏｌ／Ｌの塩酸溶液に溶解して８．０％ ｗ／ｖの溶液を得て、ろ過滅菌した。マグネチックスターラーで攪拌しながら、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート溶液（１ｍｌ）を速やかにＨＡ−ＤＴＰＨ溶液（４ｍｌ）に加えた。反応性混合物のｐＨ値は約４．０であった。その後、マグネチックスターラーで攪拌しながら、０．１ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム溶液を適量加え、上記反応性混合物のｐＨ値を約１１．３に調節した。混合溶液は約３９秒後に流動性を失ってゲルを形成した。
【０１１５】
実施例１４ 生体適合性高速ゲル化ハイドロゲルの調製
実施例１で調製したＨＡ−ＤＴＰＨ溶液（１．５％ ｗ／ｖ，ｐＨ４．０）を室温で解凍した。その後、上記の溶液５ｍｌ中にポリエチレングリコールジアクリレート（分子量３４００，Nektar Therapeutics，米国）７５ｍｇを加え、手動で溶解して混合溶液を得た。マグネチックスターラーで攪拌しながら、０．３ｍｏｌ／Ｌのリン酸ナトリウム／炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）５ｍｌを上記の混合溶液に速やかに加え、３秒間攪拌し続けた後に停止した。反応性混合物のｐＨ値は約９．３であり、溶液は３７秒後に流動性を失ってゲルを形成した。
【０１１６】
実施例１５ 高速ゲル化ハイドロゲル噴霧剤の調製
実施例１で調製したＨＡ−ＤＴＰＨ溶液（１．５％ ｗ／ｖ，ｐＨ５．０）を室温で解凍した。ポリエチレングリコールジアクリレート（分子量３４００，Nektar Therapeutics，米国）を０．３ｍｏｌ／Ｌのリン酸ナトリウム／炭酸ナトリウム緩衝液に溶解して１．５％ ｗ／ｖの溶液（ｐＨ９．６）を得て、ろ過滅菌した。上記二種類の溶液をそれぞれ５ｍｌ取ってFibriJet気体補助式噴霧装置（型番：ＳＡ−６１１０，Micromedics, inc. 米国）に装入し、その後、１．５気圧の窒素の作用下で噴霧化し、垂直に立てたガラス板に塗布した。ガラス板に塗布された混合溶液はほとんど流れることなく、均一なゲル薄膜をガラス板表面に速やかに形成した。
【０１１７】
実施例１６ 高速ゲル化ハイドロゲル噴霧剤の調製
実施例１で調製したＨＡ−ＤＴＰＨ溶液（１．５％ ｗ／ｖ，ｐＨ４．０）を室温で解凍した。その後、上記の溶液５ｍｌ中にポリエチレングリコールジアクリレート（分子量３４００，Nektar Therapeutics，米国）７５ｍｇを加え、手動で溶解して混合溶液を得た。上記の混合溶液と０．３ｍｏｌ／Ｌの炭酸塩緩衝液（ｐＨ１０．５）を５ｍｌ取ってそれぞれFibriJet気体補助式噴霧装置（型番：ＳＡ−６１１０，Micromedics, inc. 米国）に装入し、その後、約３気圧の空気の作用下で噴霧化し、垂直に立てたガラス板に塗布した。ガラス板に塗布された混合溶液はほとんど流れることなく、均一なゲル薄膜をガラス板表面に速やかに形成した。
【０１１８】
実施例１７ 高速ゲル化ハイドロゲル噴霧剤の調製
実施例１で調製したＨＡ−ＤＴＰＨ溶液（１．５％ ｗ／ｖ，ｐＨ５．０）を室温で解凍した。ポリエチレングリコールジビニルスルホン（分子量３４００，Nektar Therapeutics，米国）を０．３ｍｏｌ／Ｌのリン酸ナトリウム／炭酸ナトリウム緩衝液に溶解して１．５％ ｗ／ｖの溶液（ｐＨ１０．０）を得て、ろ過滅菌した。上記二種類の溶液をそれぞれ５ｍｌ取ってFibriJet気体補助式噴霧装置（型番：ＳＡ−６１１０，Micromedics, inc. 米国）に装入し、その後、１．５気圧の窒素の作用下で噴霧化し、垂直に立てたガラス板に塗布した。ガラス板に塗布された混合溶液はほとんど流れることなく、均一なゲル薄膜をガラス板表面に速やかに形成した。
【０１１９】
実施例１８ 高速ゲル化ハイドロゲル噴霧剤の調製
実施例１で調製したＨＡ−ＤＴＰＨ溶液（１．５％ ｗ／ｖ，ｐＨ５．０）を室温で解凍した。実施例１で調製したポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート（分子量3,400）を０．３ｍｏｌ／Ｌのリン酸二水素ナトリウム／水酸化ナトリウム緩衝液に溶解して１．５％ ｗ／ｖの溶液（ｐＨ１２．０）を得て、ろ過滅菌した。上記二種類の溶液をそれぞれ５ｍｌ取ってFibriJet気体補助式噴霧装置（型番：ＳＡ−６１１０，Micromedics, inc. 米国）に装入し、その後、５気圧の窒素の作用下で噴霧化し、垂直に立てたガラス板に塗布した。ガラス板に塗布された混合溶液はほとんど流れることなく、均一なゲル薄膜をガラス板表面に速やかに形成した。
【０１２０】
実施例１９ 高速ゲル化ハイドロゲル噴霧剤の調製
実施例１で調製したＨＡ−ＤＴＰＨ溶液（２．５％ ｗ／ｖ，ｐＨ５．０）を室温で解凍した。実施例２で調製したポリエチレングリコールジアクリルアミド（分子量3,400）を０．３ｍｏｌ／Ｌのリン酸二水素ナトリウム／水酸化ナトリウム緩衝液に溶解して２．５％ ｗ／ｖの溶液（ｐＨ１２．０）を得て、ろ過滅菌した。上記二種類の溶液をそれぞれ５ｍｌ取ってFibriJet気体補助式噴霧装置（型番：ＳＡ−６１１０，Micromedics, inc. 米国）に装入し、その後、５気圧の窒素の作用下で噴霧化し、垂直に立てたガラス板に塗布した。ガラス板に塗布された混合溶液はほとんど流れることなく、均一なゲル薄膜をガラス板表面に速やかに形成した。
【０１２１】
実施例２０ ジコハク酸ジアシルシスタミノジヒドラジド（略称ＤＳＣＤＨ）の合成
シスタミノジヒドロクロリド塩（Aldrich，米国）１００ｇを１５００ｍｌの蒸留水に溶解し、清澄で透明な溶液を得た。上記の溶液中に、溶液のｐＨ値が１０になるまで４ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウムを加えた。その後、マグネチックスターラーで攪拌しながら、無水コハク酸（Aldrich，米国）１３３ｇを加えるとともに、４ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウムを断続的に添加して、溶液のｐＨ値を７〜１０に維持した。室温で２時間反応させた後、溶液中に６ｍｏｌ／Ｌの塩酸を加えた。白色沈殿産物をろ過して収集し、蒸留水２０００ｍｌを用いて２回洗浄した。その後、真空減圧乾燥し、白色固形物を得てジコハク酸ジアシルシスタミノジアシド（略称ＤＳＣ）約１５０ｇを合成した。収率は９０％を超えた。
【０１２２】
２５０ｍｌの三口フラスコ中にＤＳＣ１００ｇを加え、無水アルコール１２００ｍｌと濃塩酸１００滴を加えた。窒素保護下で２時間還流した後、２００ｍｌ未満になるまで減圧濃縮した。残余の溶液を２５００ｍｌの分液漏斗に移した後、酢酸エチル６００ｍｌを加えた。有機相を水５００ｍｌを用いて３回洗浄し、水相を除いて有機相を減圧蒸留して、白色蝋状の固形物であるジコハク酸ジアシルシスタミノジエチルエステル（略称ＤＳＣＤＥ）約９３ｇが得られた。収率は８０％を超えた。
【０１２３】
１５０ｍｌのビーカー中にＤＳＣＤＥ１０ｇとアルコール８０ｍｌを加えた。室温で攪拌して溶解後、さらに抱水ヒドラジン（Aldrich，米国）１０ｍｌを加え、一晩反応させた。白色沈殿産物をろ過して収集し、その後４０ｍｌのアルコールを用いて４回エリューションした。室温通風炉内で有機溶剤を揮発させた後、真空減圧乾燥させて、白色固形物のＤＳＣＤＨ約８ｇを得た。調製率は７５％を超えた。
【０１２４】
実施例２１ チオール化変性ヒアルロン酸（ＨＡ−ＤＳＣＤＨ）の調製
ヒアルロン酸ナトリウム（分子量６２万〜１１５万，NovaMatrix FMC BIOPOLYMER，米国）１０ｇを蒸留水２０００ｍｌ中に溶解し、清澄で透明な溶液を得た。上記の溶液中に実施例２０で調製したＤＳＣＤＨ９．５ｇを加え、攪拌して溶解した。そして、１ｍｏｌ／Ｌの塩酸を用いて溶液のｐＨ値が４．７５になるまで調節し、１‐エチル‐３‐（３‐ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（Aldrich，米国）２．８８ｇを加え、マグネチックスターラーで攪拌した。上記の溶液に適量の０．１ｍｏｌ／Ｌの塩酸を断続的に添加して、溶液のｐＨ値を４．７５に維持した。溶液の粘度は増加し続け、１０分間前後でゲルを形成した。ゲルの形成後、室温で静置して２時間反応させた。その後、ジチオスレイトール（Diagnostic Chemical Limited，米国）１００ｇおよび1ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム溶液少量を加えて攪拌した。ゲルを徐々に溶解させるとともに、１ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム溶液を断続的に添加して溶液のｐＨ値を８．５に維持した。ゲルが全て溶解した後、室温でマグネチックスターラーで攪拌して２４時間反応させた。その後、上記の溶液中に６ｍｏｌ／Ｌの塩酸をｐＨが約３．０になるまで加えた。上記の溶液を透析管（カットオフ分子量3500，Sigma，米国）に装入し、２０Ｌの０．００１ｍｏｌ／Ｌの塩酸と０．３ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム溶液を用いて、８時間ごとに透析液を交換しながら５日間透析した。その後さらに、２０Ｌの０．００１ｍｏｌ／Ｌの塩酸溶液を用いて、８時間ごとに透析液を交換しながら３日間透析した。最後に、透析管内の溶液を透析カラムに通して所定の濃度（０．８〜１．５％ ｗ／ｖ）になるまで脱水濃縮し、溶液のｐＨ値を３．０〜８．５に調節し、ろ過滅菌した後、凍結保存（通常は零下２０℃以下）した。
【０１２５】
ShuらがBiomacromolecules，3，1304，2002において報告した、改良Ellman法を用いてＨＡ−ＤＳＣＤＨの活性チオール基含有量を測定したところ、３９．１チオール基／１００ヒアルロン酸二糖繰返し単位であり、プロトン核磁気共鳴検査の結果と基本的に適合した。
【０１２６】
実施例２２ 高速ゲル化ハイドロゲルの調製
実施例２１で調製したＨＡ−ＤＳＣＤＨ溶液（０．８％ ｗ／ｖ，ｐＨ値は４．０）を室温で解凍した。実施例２で調製した四分岐ポリエチレングリコールアクリレート（平均３．６個のアクリレート官能基／四分岐ポリエチレングリコール分子，分子量１０，０００）を０．３ｍｏｌ／Ｌのリン酸ナトリウム／炭酸ナトリウム緩衝液に溶解して１．０％ ｗ／ｖの溶液（ｐＨ９．６）を得て、ろ過滅菌した。マグネチックスターラーで攪拌しながら、ＨＡ−ＤＳＣＤＨ溶液５ｍｌを速やかに四分岐ポリエチレングリコールアクリレート溶液５ｍｌに加え、３秒間攪拌し続けた後に停止した。反応性混合物のｐＨ値は約９．３であり、反応性混合溶液は約４７秒後に流動性を失ってゲルを形成した。
【０１２７】
実施例２３ 高速ゲル化ハイドロゲルの調製
実施例２１で調製したＨＡ−ＤＳＣＤＨ溶液（０．５％ ｗ／ｖ，ｐＨ値は７．０）を室温で解凍した。実施例２で調製した四分岐ポリエチレングリコールアクリレート（平均３．６個のアクリレート官能基／四分岐ポリエチレングリコール分子，分子量１０，０００）を０．３ｍｏｌ／Ｌのリン酸二水素ナトリウム／水酸化ナトリウム緩衝溶液に溶解して０．８％ ｗ／ｖの溶液（ｐＨ１２．０）を得て、ろ過滅菌した。マグネチックスターラーで攪拌しながら、ＨＡ−ＤＳＣＤＨ溶液５ｍｌを速やかに四分岐ポリエチレングリコールアクリレート溶液５ｍｌに加え、３秒間攪拌し続けた後に停止した。反応性混合物のｐＨ値は約１２．０であり、反応性混合溶液は約17秒後に流動性を失ってゲルを形成した。
【０１２８】
実施例２４ 高速ゲル化ハイドロゲルの調製
実施例２１で調製したＨＡ−ＤＳＣＤＨ溶液（１．２％ ｗ／ｖ，ｐＨ値は３．５）を室温で解凍した。実施例２で調製した四分岐ポリエチレングリコールアクリレート（平均３．６個のアクリレート官能基／四分岐ポリエチレングリコール分子，分子量１０，０００）を０．１５ｍｏｌ／Ｌのリン酸塩／炭酸塩緩衝溶液に溶解して１．２％ ｗ／ｖの溶液（ｐＨ９．６）を得て、ろ過滅菌した。マグネチックスターラーで攪拌しながら、ＨＡ−ＤＳＣＤＨ溶液５ｍｌを速やかに四分岐ポリエチレングリコールアクリレート溶液５ｍｌに加え、３秒間攪拌し続けた後に停止した。反応性混合物のｐＨ値は約９．２であり、反応性混合溶液は約２９秒後に流動性を失ってゲルを形成した。
【０１２９】
実施例２５ 高速ゲル化ハイドロゲルの調製
実施例２１で調製したＨＡ−ＤＳＣＤＨ溶液（１．２％ ｗ／ｖ，ｐＨ値は７．０）を室温で解凍した。実施例２で調製した四分岐ポリエチレングリコールアクリレート（平均３．６個のアクリレート官能基／四分岐ポリエチレングリコール分子，分子量１０，０００）を０．３０ｍｏｌ／Ｌの炭酸塩緩衝溶液に溶解して０．５％ ｗ／ｖの溶液（ｐＨ８．５）を得て、ろ過滅菌した。マグネチックスターラーで攪拌しながら、ＨＡ−ＤＳＣＤＨ溶液５ｍｌを速やかに四分岐ポリエチレングリコールアクリレート溶液５ｍｌに加え、３秒間攪拌し続けた後に停止した。反応性混合物のｐＨ値は約８．５であり、反応性混合溶液は約３分後に流動性を失ってゲルを形成した。
【０１３０】
実施例２６ 高速ゲル化ハイドロゲルの調製
実施例２１で調製したＨＡ−ＤＳＣＤＨ溶液（１．２％ ｗ／ｖ，ｐＨ値は７．０）を室温で解凍した。実施例２で調製した四分岐ポリエチレングリコールアクリレート（平均３．６個のアクリレート官能基／四分岐ポリエチレングリコール分子，分子量１０，０００）を０．３０ｍｏｌ／Ｌのリン酸塩緩衝溶液に溶解して１．２％ ｗ／ｖの溶液（ｐＨ８．０）を得て、ろ過滅菌した。マグネチックスターラーで攪拌しながら、ＨＡ−ＤＳＣＤＨ溶液５ｍｌを速やかに四分岐ポリエチレングリコールアクリレート溶液５ｍｌに加え、３秒間攪拌し続けた後に停止した。反応性混合物のｐＨ値は約８．０であり、反応性混合溶液は約４分後に流動性を失ってゲルを形成した。
【０１３１】
実施例２７ 高速ゲル化ハイドロゲルの調製
実施例２１で調製したＨＡ−ＤＳＣＤＨ溶液（１．２％ ｗ／ｖ，ｐＨ値は２．５）を室温で解凍した。実施例２で調製した四分岐ポリエチレングリコールアクリレート（平均３．６個のアクリレート官能基／四分岐ポリエチレングリコール分子，分子量１０，０００）を０．３ｍｏｌ／Ｌのリン酸塩／炭酸塩緩衝溶液に溶解して１．０％ ｗ／ｖの溶液（ｐＨ９．６）を得て、ろ過滅菌した。マグネチックスターラーで攪拌しながら、ＨＡ−ＤＳＣＤＨ溶液５ｍｌを速やかに四分岐ポリエチレングリコールアクリレート溶液５ｍｌに加え、３秒間攪拌し続けた後に停止した。反応性混合物のｐＨ値は約９．２であり、反応性混合溶液は約３２秒後に流動性を失ってゲルを形成した。
【０１３２】
実施例２８ 高速ゲル化ハイドロゲルの調製
実施例２１で調製したＨＡ−ＤＳＣＤＨ溶液（１．２％ ｗ／ｖ，ｐＨ値は２．５）を室温で解凍した。実施例２で調製した四分岐ポリエチレングリコールアクリレート（平均３．６個のアクリレート官能基／四分岐ポリエチレングリコール分子，分子量１０，０００）をｐＨ２．５の塩酸溶液に溶解して１．０％ ｗ／ｖの溶液を得て、ろ過滅菌した。マグネチックスターラーで攪拌しながら、ＨＡ−ＤＳＣＤＨ溶液５ｍｌを速やかに四分岐ポリエチレングリコールアクリレート溶液５ｍｌに加えた。反応性混合物のｐＨ値は約２．５であった。マグネチックスターラーで攪拌しながら、０．１ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム溶液を適量加え、反応性混合物のｐＨ値を１０．５に調節した。反応性混合溶液は速やかに流動性を失ってゲルを形成した（１０秒未満）。
【０１３３】
実施例２９ 高速ゲル化ハイドロゲルの調製
実施例２１で調製したＨＡ−ＤＳＣＤＨ溶液（１．２％ ｗ／ｖ，ｐＨ値は３．５）を室温で解凍した。実施例２で調製した四分岐ポリエチレングリコールアクリレート（平均３．６個のアクリレート官能基／四分岐ポリエチレングリコール分子，分子量１０，０００）をｐＨ３．５の塩酸溶液に溶解して１．０％ ｗ／ｖの溶液を得て、ろ過滅菌した。マグネチックスターラーで攪拌しながら、ＨＡ−ＤＳＣＤＨ溶液５ｍｌを速やかに四分岐ポリエチレングリコールアクリレート溶液５ｍｌに加えた。反応性混合物のｐＨ値は約３．５であった。マグネチックスターラーで攪拌しながら、０．３ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム溶液を適量加え、反応性混合物のｐＨ値を1２に調節した。反応性混合溶液は数秒以内に即座に流動性を失ってゲルを形成した。
【０１３４】
実施例３０ 高速ゲル化ハイドロゲル噴霧剤の調製
実施例２１で調製したＨＡ−ＤＳＣＤＨ溶液（１．０％ ｗ／ｖ，ｐＨ値は８．０）を室温で解凍した。実施例２で調製した四分岐ポリエチレングリコールアクリレート（平均３．６個のアクリレート官能基／四分岐ポリエチレングリコール分子，分子量１０，０００）を０．３ｍｏｌ／Ｌの炭酸塩緩衝液に溶解して１．０％ ｗ／ｖの溶液（ｐＨ１０．５）を得て、ろ過滅菌した。ＨＡ−ＤＳＣＤＨ溶液および四分岐ポリエチレングリコールアクリレート溶液をそれぞれ５ｍｌ取ってFibriJet気体補助式噴霧装置（型番：ＳＡ−６１１０，Micromedics, inc. 米国）に装入し、その後、４気圧の窒素の作用下で噴霧化し、垂直に立てたガラス板に塗布した。ガラス板に塗布された混合溶液はほとんど流れることなく、均一なゲル薄膜をガラス板表面に速やかに形成した。
【０１３５】
実施例３１ チオール化変性コンドロイチン硫酸（ＣＳ−ＤＳＣＤＨ）の合成および特性解析
コンドロイチン硫酸（ｃ型，サメ軟骨由来，Sigma, 米国）１ｇを蒸留水１００ｍｌ中に溶解し、清澄で透明な溶液を得た。上記の溶液中に実施例２０で調製したＤＳＣＤＨ０．７０４ｇを加え、攪拌して溶解した。そして、０．１ｍｏｌ／Ｌの塩酸を用いて溶液のｐＨ値が４．７５になるまで調節し、１‐エチル‐３‐（３‐ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（Aldrich，米国）０．１９２ｇを加え、マグネチックスターラーで攪拌した。上記の溶液中に適量の０．１ｍｏｌ／Ｌの塩酸を断続的に添加して、溶液のｐＨ値を４．７５に保ち、室温でマグネチックスターラーで攪拌して２時間反応させた。その後、ジチオスレイトール（Diagnostic Chemical Limited，米国）１０ｇおよび０．１ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム溶液少量を加えて攪拌した。ゲルを徐々に溶解させるとともに、０．１ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム溶液を断続的に添加して溶液のｐＨ値を８．５に維持した。ゲルが全て溶解した後、室温でマグネチックスターラーで攪拌して２４時間反応させた。その後、上記の溶液中に６ｍｏｌ／Ｌの塩酸をｐＨが約３．０になるまで加えた。上記の溶液を透析管（カットオフ分子量3500，Sigma，米国）に装入し、１０Ｌの０．００１ｍｏｌ／Ｌの塩酸と０．３ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム溶液を用いて、８時間ごとに透析液を交換しながら５日間透析した。その後さらに、１０Ｌの０．００１ｍｏｌ／Ｌの塩酸溶液を用いて、８時間ごとに透析液を交換しながら３日間透析した。最後に、透析管内の溶液を透析カラムに通して所定の濃度（３．０〜６．０％ ｗ／ｖ）になるまで脱水濃縮し、溶液のｐＨ値を３．０〜８．５に調節し、ろ過滅菌した後、凍結保存（通常は零下２０℃以下）した。
【０１３６】
コンドロイチン硫酸のアセチル基の特性であるメチル吸収ピークを内標準とし、吸収ピークの面積から算出した、合成されたＣＳ−ＤＧＤＴＰＤＨの側鎖置換度は４７％であった。
【０１３７】
ＧＰＣを用いて分子量およびその分布を測定したところ、重量平均分子量は３．８万、数平均分子量は１．７万、分子量分布は２．２３であった。
【０１３８】
ShuらがBiomacromolecules，3，1304，2002において報告した、改良Ellman法を用いてＣＳ−ＤＳＣＤＨの活性チオール基含有量を測定したところ、４４．２チオール基／１００コンドロイチン硫酸二糖繰返し単位であった。
【０１３９】
実施例３２ 高速ゲル化ハイドロゲルの調製
実施例３１で調製したＣＳ−ＤＳＣＤＨ溶液（６．０％ ｗ／ｖ，ｐＨ５．０）の室温の溶液を準備した。実施例２で調製した四分岐ポリエチレングリコールアクリレート（平均３．６個のアクリレート官能基／四分岐ポリエチレングリコール分子，分子量１０，０００）を０．３ｍｏｌ／Ｌの炭酸塩緩衝液に溶解して６．０％ ｗ／ｖの溶液（ｐＨ１０．５）を得て、ろ過滅菌した。マグネチックスターラーで攪拌しながら、上記の一方の溶液（５ｍｌ）を速やかに他方の溶液（５ｍｌ）に加え、３秒間攪拌し続けた後に停止した。反応性混合溶液は１０秒以内に流動性を失ってゲルを形成した。
【０１４０】
実施例３３ 高速ゲル化ハイドロゲルの調製
実施例３１で調製したＣＳ−ＤＳＣＤＨ溶液（３．０％ ｗ／ｖ，ｐＨ７．０）の室温の溶液を準備した。実施例２で調製した四分岐ポリエチレングリコールアクリレート（平均３．６個のアクリレート官能基／四分岐ポリエチレングリコール分子，分子量１０，０００）を０．００５ｍｏｌ／Ｌのリン酸塩緩衝液に溶解して３．０％ ｗ／ｖの溶液（ｐＨ７．０）を得て、ろ過滅菌した。マグネチックスターラーで攪拌しながら、上記の一方の溶液（５ｍｌ）を速やかに他方の溶液（５ｍｌ）に加えた。反応性混合物のｐＨ値は７．０であった。マグネチックスターラーで攪拌しながら、０．３ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム溶液を適量加え、反応性混合物のｐＨ値を1０．５に調節した。反応性混合溶液は即座に流動性を失ってゲルを形成した（１０秒未満）。
【０１４１】
実施例３４ 高速ゲル化ハイドロゲルの調製
実施例３１で調製したＣＳ−ＤＳＣＤＨ溶液（３．０％ ｗ／ｖ，ｐＨ４．０）の室温の溶液を準備した。実施例２で調製した四分岐ポリエチレングリコールアクリレート（平均３．６個のアクリレート官能基／四分岐ポリエチレングリコール分子，分子量１０，０００）を０．３ｍｏｌ／Ｌのホウ酸／水酸化ナトリウム緩衝液に溶解して３．０％ ｗ／ｖの溶液（ｐＨ１１．０）を得て、ろ過滅菌した。マグネチックスターラーで攪拌しながら、ＣＳ−ＤＳＣＤＨ溶液のｐＨ値をアルカリを用いて８．５に調節した後、速やかに四分岐ポリエチレングリコールアクリレート溶液（５ｍｌ）に加えた。反応性混合物のｐＨ値は約１１．０であり、反応性混合溶液は即座に流動性を失ってゲルを形成した。
【０１４２】
実施例３５ 高速ゲル化ハイドロゲル噴霧剤の調製
実施例３１で調製したＣＳ−ＤＳＣＤＨ溶液（４．０％ ｗ／ｖ，ｐＨ８．０）の室温の溶液を準備した。実施例２で調製した四分岐ポリエチレングリコールアクリレート（平均３．６個のアクリレート官能基／四分岐ポリエチレングリコール分子，分子量１０，０００）を０．３ｍｏｌ／Ｌの炭酸塩緩衝液に溶解して４．０％ ｗ／ｖの溶液（ｐＨ１０．５）を得て、ろ過滅菌した。上記二種類の溶液をそれぞれ５ｍｌ取ってFibriJet気体補助式噴霧装置（型番：ＳＡ−６１１０，Micromedics, inc. 米国）に装入し、その後、２気圧の窒素の作用下で噴霧化し、垂直に立てたガラス板に塗布した。ガラス板に塗布された混合溶液はほとんど流れることなく、均一なゲル薄膜をガラス板表面に速やかに形成した。
【０１４３】
実施例３６ チオール化変性ゼラチンの調製
（１）ゼラチンのスクシニルカルボキシル化変性
ゼラチン（B型，ブタ皮由来，Sigma, 米国）１ｇを蒸留水１００ｍｌ中（約３０℃）に溶解し、清澄で透明な溶液を得た。１．０ｍｏｌ／Lの水酸化ナトリウム溶液を用いて、溶液のｐＨ値を約９．５に調節し、その後、マグネチックスターラーで攪拌しながら無水コハク酸（分析級）を０．０５ｇ加え、適量の１．０ｍｏｌ／Lの水酸化ナトリウム溶液を断続的に添加して、溶液のｐＨ値を弱アルカリ性（通常は８．０〜９．５）に保持した。約３０℃で攪拌して１時間反応させた。その後、上記の溶液を透析管（カットオフ分子量3500，Fisher，米国）に装入し、蒸留水を用いて、８時間ごとに透析液を交換しながら透析した。透析は、液体クロマトグラフィー（GPC）（純水を移動相とし、紫外線波長２１０ｎｍにおける吸収に基づく検出）により、溶出液のスペクトルに小分子不純物のピークが示されなくなるまで行った。最後に、透析管内の溶液を収集し、凍結乾燥して白色綿状固体（スクシニルカルボキシル化ゼラチン）約０．７ｇが得られた。
【０１４４】
（２）スクシニルカルボキシル化ゼラチンのチオール化変性
上記のスクシニルカルボキシル化ゼラチン０．５ｇを取り、蒸留水５０ｍｌ中に溶解した（約３０℃）。上記の溶液中にジチオジプロピオン酸ヒドラジド（ShuらがBiomacromolecules，3，1304，2002において開示した方法により調製）１．２ｇを加え、攪拌して溶解した。そして、０．１ｍｏｌ／Ｌの塩酸を用いて溶液のｐＨ値が４．７５になるまで調節し、１‐エチル‐３‐（３‐ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（Aldrich，米国）０．７５ｇを加え、マグネチックスターラーで攪拌した。上記の溶液に適量の０．１ｍｏｌ／Ｌの塩酸を断続的に添加して、溶液のｐＨ値を４．７５に維持した。マグネチックスターラーで攪拌して２時間反応させた後、ジチオスレイトール（Diagnostic Chemical Limited，米国）５ｇおよび０．１ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム溶液を加えて攪拌し、溶液のｐＨ値を８．５に調節した。その後、室温でマグネチックスターラーで攪拌して２４時間反応させた後、上記の溶液中に６ｍｏｌ／Ｌの塩酸をｐＨ値が約３．０になるまで加えた。上記の溶液を透析管（カットオフ分子量3500，Sigma，米国）に装入し、１０Ｌの０．００１ｍｏｌ／Ｌの塩酸と０．３ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム溶液を用いて、８時間ごとに透析液を交換しながら５日間透析した。その後、１０Ｌの０．００１ｍｏｌ／Ｌの塩酸溶液を用いて、８時間ごとに透析液を交換しながら３日間透析した。透析は、GPC（純水を移動相とし、紫外線波長２１０ｎｍにおける吸収に基づく検出）により、溶出液のスペクトルに小分子不純物のピークが示されなくなるまで行った。最後に、透析管内の溶液を収集し、凍結乾燥して白色綿状固体約０．３３ｇが得られた。上記の生成物を蒸留水中に溶解して３．０〜５．０％ ｗ／ｖ溶液を得て、溶液のｐＨ値を２．０〜７．０に調節し、ろ過滅菌した後、凍結保存（通常は零下２０℃以下）した。
【０１４５】
２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（TNBS）試薬を用いてスクシニルカルボキシル化ゼラチンの側鎖アミノ基を測定したところ、約４５％のアミノ基がスクシニルカルボキシル化変性されていた。
【０１４６】
ShuらがBiomacromolecules，3，1304，2002において報告した、改良Ellman法を用いてスクシニルカルボキシル化およびチオール化ゼラチン多重変性誘導体の活性チオール基含有量を測定したところ、０．８７ｍｍｏｌチオール基／gであった。
【０１４７】
実施例３７ 高速ゲル化ハイドロゲルの調製
実施例３６で調製したチオール化変性ゼラチン溶液（５．０％ ｗ／ｖ，ｐＨ値７．０）を準備した。実施例２で調製した四分岐ポリエチレングリコールアクリレート（平均３．６個のアクリレート官能基／四分岐ポリエチレングリコール分子，分子量１０，０００）を０．３ｍｏｌ／Ｌのホウ酸／水酸化ナトリウム緩衝液に溶解して４．０％ ｗ／ｖの溶液（ｐＨ１１．０）を得た。マグネチックスターラーで攪拌しながら、上記の一方の溶液（５ｍｌ）を速やかに他方の溶液（５ｍｌ）に加え、３秒間攪拌し続けた後に停止した。反応性混合溶液は１２秒以内に流動性を失ってゲルを形成した。
【０１４８】
実施例３８ 高速ゲル化ハイドロゲル噴霧剤の術後癒着防止への応用
Dunnらにより報告されたラット盲腸モデル（Dunn et al，Fertility & Sterility，75，411，2001）を用いた。その過程の概要は以下の通りである。１２匹のラットの盲腸の側面および腹側面を、無菌ガーゼを用いて表面が出血するまでかき取り、対応する腹壁１×２ｃｍの面積を、表面が出血するまでメスでかき取った。実施例１５で調製した高速ゲル化ハイドロゲル噴霧剤を６匹のラットの傷口および腹腔全体に塗布し、最後にラットの体表の傷口を縫合した。二週間後にラットを絶命させ、解剖して癒着の状況を観察した。各ラットのハイドロゲル使用量は約１．５ｍｌであり、残余の未治療ラット６匹を対照グループとした。二週間後にラットを解剖した結果、対照グループのラットはすべて緊密な癒着を形成していたのに対し、治療グループではいかなる癒着も認められなかった。
【産業上の利用可能性】
【０１４９】
本発明の生体適合性高速ゲル化ハイドロゲルの調製方法の有益な効果としては、生体適合性が良好であり、副生成物または有毒副作用のある副生成物を生成せず、使用される各成分の安定性が良好であり、用量が少なく、低コストであり、使用上便利で高速ゲル化を実現しやすく、高速ゲル化噴霧剤の調製を実現しやすく、様々な医学的用途に適合する、等の多くの長所がある。Wallaceらによって開示された方法（特許文献１）と比較して、本発明には副生成物または有毒副作用のある副生成物を生成せず、生体適合性がより良好であり、架橋化学結合がより安定しており、使用される活性成分の安定性がより良好であり、活性成分の使用量がより少なく、より低コストである、等の多くの長所がある。
【０１５０】
本発明の生体適合性高速ゲル化ハイドロゲルの調製方法の有益な効果には、さらに、工業的大量生産が容易であるということが含まれる。前述の通り、本発明に用いられる成分Ａ中の生体適合性チオール化変性高分子は、強アルカリ性の条件下では非常に不安定である。従って、本発明に用いられる生体適合性チオール化変性高分子の溶液は、強アルカリ性の場合には活性を失いやすく、工業的大量生産には適さない。本発明においては、生体適合性チオール化変性高分子を含む成分ＡのｐＨ値は８．５未満であり、通常は弱酸性であって、安定性が良好であり、工業的大量生産時の滅菌、充填、包装、保存等の多くの工程を簡便に完了できる。また、本発明に用いられる成分Ａは、生体適合性チオール化変性高分子調製の精製工程後に、凍結乾燥の必要がなく、直接次の工程に進むか、濃縮または希釈して所定の濃度にした後に次の工程に進む。このように、凍結乾燥という時間や労力を要する煩瑣な工程を回避している。
【０１５１】
本発明の生体適合性高速ゲル化ハイドロゲル噴霧剤の調製方法は、前述の本発明の高速ゲル化ハイドロゲルの調製方法の長所を有するとともに、簡便で、使用しやすく、術後の癒着合併症の治療のような様々な医学的用途に適用される、という長所がある。また、気体補助式霧化噴霧剤の調製方法は、さらに、噴霧化条件下の混合を用いており、ノズルが詰まることなく複数回使用することが可能である。
【技術分野】
【０００１】
本発明はハイドロゲルの調製方法に関し、特に、生体適合性高速ゲル化ハイドロゲルの調製方法に関する。本発明はさらに、生体適合性高速ゲル化ハイドロゲル噴霧剤の調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ハイドロゲル、特に細胞間質基質から調製されたハイドロゲルは、生物医薬分野において非常に広く応用されている。合成材料から調製されたハイドロゲルと比べて、細胞間質基質から調製されたハイドロゲルは、生物体内の自然環境をシミュレーションでき、含水量が高く、透過性が良好であり、生体適合性がより良好であり、酵素分解性が調節可能である等、多くの長所を有する（非特許文献１及び２）。さらに重要な点は、細胞間質基質は生体誘導作用を有し、組織特異的な修復を誘導・誘発することが可能なことである。例えば、ヒアルロン酸ナトリウムは天然細胞間質基質高分子であり、細胞の接着や移動の管理、細胞の分裂および分化を調節する等の生物学的機能を有する。高分子ヒアルロン酸ナトリウムは、ニワトリ胎生の肢幹骨髄幹細胞の軟骨細胞への分化を誘発することが可能である（非特許文献３）。そのため、細胞間質基質から調製されたハイドロゲルは生物医薬（特に組織工学）分野においてますます重視されている。
【０００３】
多くの生物医薬の応用において、ハイドロゲルには、使用時には液体であるが、指定部位に到達した後は、速やかにゲルを形成して、流動性を失うことが求められる。このような高速ゲル化ハイドロゲルには、複雑な形状の全ての立体的な傷口にも適合でき、傷口に良好に接着でき、内視鏡方式で使用できるため開腹式手術を回避できる、等の極めて大きな利点が認められる。現在までに、研究者はハイドロゲルの高速ゲル化を実現するための各種の方式を考察してきた。例えば、水溶性ポリエチレングリコールの不飽和誘導体を光誘発により架橋してゲルを調製すること、特定の組成のポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールの３ブロック共重合体（Pluronic poloxamer）溶液が温度変化に誘発されてゲル化する性質を有すること（非特許文献４）、シアノアクリル酸塩が重合架橋によりゲルを形成し、組織接着に用いられること、およびゼラチンのグルタルアルデヒド架橋材料等である。一般に、上記のハイドロゲルには、生体適合性が低く、生分解性が低い等、各種の欠陥が存在する。通常、高速ゲル化には、高活性の架橋剤が必要であるが、これらの化合物は強い毒性、副作用を有する。
【０００４】
チオール基は、生物体内に自然に存在する、良好な生体適合性を有する官能基である。チオール基は良好な反応活性を有し、同一の条件下では、通常、その反応活性はアミノ基より数桁高い。従って、高速ゲル化を実現するために必要な高速化学架橋を提供する場合には、相対的に不活性なアミノ基の架橋には高活性の架橋剤（アルデヒド類等）が必要となる。しかしながら、この種の架橋剤は大きな毒性を有し、組織の炎症等の副作用を招きうる。それに対し、チオール基の架橋は、活性の低い生体適合性架橋剤を選択することが可能なため、調製されるハイドロゲルはより良好な生体適合性を有する。Wallaceらは、多分岐（四分岐または十二分岐）ポリエチレングリコールチオール基誘導体（分子量１０，０００）を０．３ｍｏｌ／Ｌのリン酸ナトリウム／炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）に溶解し、多分岐（四分岐または十二分岐）ポリエチレングリコールスクシンイミド活性誘導体（分子量１０，０００）を０．０００５ｍｏｌ／Ｌのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解し、上記二種類の溶液を混合することによりハイドロゲルを調製した。その生体適合性は、対応するポリエチレングリコールアミノ基誘導体を用いて調製したハイドロゲルより大きく向上した（特許文献１）。
【０００５】
Wallaceらにより開示された方法は高速ゲル化ハイドロゲルを調製する比較的良好な方法ではあるが、依然として多くの欠陥が存在する（特許文献１）。第一に、多分岐ポリエチレングリコールチオール基誘導体と多分岐ポリエチレングリコールスクシンイミド活性誘導体の化学架橋反応では、ある程度の毒性、副作用を有するＮ‐ヒドロキシルスクシンイミド副生成物が生成する。第二に、Wallaceらが用いた多分岐ポリエチレングリコールスクシンイミド活性誘導体の溶液と多分岐ポリエチレングリコールチオール基誘導体の溶液はともに不安定で、両者とも用時調製する必要があり、かつ、前者の溶液は一時間以内に使い終える必要があり、後者は空気に触れると活性を失いやすいため、使用上不便である。第三に、多分岐ポリエチレングリコールチオール基誘導体と多分岐ポリエチレングリコールスクシンイミド活性誘導体はともに高価であり、これら二種類の化合物の濃度がそれぞれ１０％ ｗ／ｖ以上（通常は２０％ ｗ／ｖ）に達したときにはじめて高速ゲル化を実現できるため、高コストである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第６，６２４，２４５号明細書（Wallace et al）
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Silva et al，Curr Top Dev Biol，64, 181，2004
【非特許文献２】Drury et al，Biomaterials，24, 4337，2003
【非特許文献３】Kujawa et al.Develop Biol，114，519， 1986
【非特許文献４】Leach et al，Am J ObstetGynecol 162,1317,1990
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明が解決しようとする技術的課題の第一は、新規の生体適合性高速ゲル化ハイドロゲルの調製方法を提供することである。
【０００９】
本発明が解決しようとする技術的課題の第二は、新規の生体適合性高速ゲル化ハイドロゲルの噴霧剤の調製方法を提供することである。
【００１０】
本発明において用いる一部の技術用語について、以下のように定義する。
【００１１】
生体適合性高分子チオール化誘導体とは、生体適合性高分子をチオール基により変性させて得られる産物である。上記生体適合性高分子チオール化誘導体は、少なくとも三つのチオール基を含み、分子量は１，０００〜１０，０００，０００である。
【００１２】
生体適合性高分子とは、多糖類（コンドロイチン硫酸、ヘパリン、ヘパラン、アルギン酸、ヒアルロン酸、デルマタン、デルマタン硫酸、ペクチン、カルボキシメチルセルロース、キトサン等）、それらの塩（ナトリウム塩、カリウム塩等）および変性体（カルボキシメチル化変性、疎水化変性等）；タンパク質（アルカリ性ゼラチンタンパク質、酸性ゼラチンタンパク質、アルカリ性遺伝子組換えゼラチンタンパク質、酸性遺伝子組換えゼラチンタンパク質等）およびそれらの変性体（アミノ基のカルボキシル化変性、疎水化変性等）；合成高分子（ポリアクリル酸、ポリアスパラギン酸、ポリ酒石酸、ポリグルタミン酸、ポリフマル酸等）、それらの塩（ナトリウム塩、カリウム塩等）および変性体（カルボキシメチル化変性、疎水化変性等）である。上記コンドロイチン硫酸には、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型等の各種形式が含まれる。上記生体適合性高分子は、ポリエチレングリコールおよびその誘導体や、システイン含有オリゴペプチド等を含まない（Lutolf et al，Biomacromolecules，4，713，2003）。
【００１３】
チオール化変性とは、遊離チオール基を導入する化学反応過程であり、通常は以下の反応ステップを含む：生体適合性高分子の側鎖カルボキシル基を、カルボジイミドの活性下で、ジスルフィド結合を含むジアミンまたはジヒドラジドと反応させて中間産物を生成し、その後ジスルフィド結合をチオール基に還元して、生体適合性高分子チオール化誘導体を得るステップ；または、上記の生体適合性高分子を含む側鎖アミノ基を化学反応により直接チオール基に変性するステップ。
【００１４】
化学架橋反応とは、チオール基とチオール基反応性官能基との間での、求核付加反応および求核置換反応である。
【００１５】
ハイドロゲルとは、大量の水を含有する、三次元架橋網状構造を有する物質であり、液体と固体の間の状態で、流動性はない。ゲル化とは、流動性を有する液体状態から流動性を失ったハイドロゲルになるまでの過程であり、ゲル化時間とは、流動性を有する液体状態から流動性を失ったハイドロゲルになるまでの時間である。
【００１６】
アルキレン基とは、-（ＣＨ２)ｎ-（ｎは１〜１５の整数）である。好ましくは、ｎは１〜８の整数である。
【００１７】
置換アルキレン基とは、少なくとも１つの水素原子が、アルキル基、ヒドロキシル基、アミノ基、アルコキシ基、フェニル基、エステル基等の基に置換されたアルキレン基である。
【００１８】
アリール基とは、芳香族のフェニル基、ナフチル基等である。好ましくはフェニル基である。
【００１９】
ポリエーテル基とは、‐[（ＣＨＲ)ｎＯ]ｍ‐であり、Ｒはアルキル基、ｎは１〜１０の整数、ｍは１〜５００の整数である。好ましくは、Ｒは水素原子であり、ｎはそれぞれ２、３、４である。
【００２０】
アルキル基とは、１〜１５個の炭素原子を有する、直鎖または分岐鎖のアルキル基である。例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ-ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ペンチル基、ネオペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、等である。好ましくは、１〜１０個の炭素原子を有する、直鎖または分岐鎖のアルキル基であり、特に好ましくは、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基である。
【００２１】
アルコキシ基とは、１〜６個の炭素原子を有する、直鎖または分岐鎖のアルコキシ基である。例えば、メトキシ基、エトキシ基、プロピルオキシ基、イソプロピルオキシ基、ブトキシ基、イソブトキシ基、ｔｅｒｔ-ブトキシ基、ｓｅｃ−ブトキシ基、ペンチルオキシ基、ネオペンチルオキシ基、ヘキシルオキシ基等である。好ましくは、１〜４個の炭素原子を有する、直鎖または分岐鎖のアルコキシ基であり、特に好ましくは、メトキシ基およびエトキシ基である。
【００２２】
エステル基とは、‐Ｃ（Ｏ)ＯＲであり、Ｒは上記の低級アルキル基である。好ましくは、メチルエステル基、エチルエステル基、プロピルエステル基、ブチルエステル基である。
【００２３】
カルボキシル基とは、カルボキシル基（‐ＣＯＯＨ）と、カルボキシル基がアルカリで中和されたカルボン酸塩（‐ＣＯＯ−Ａ＋）であり、Ａ＋にはナトリウムイオン、カリウムイオン、リチウムイオン、アンモニアイオン等が含まれる。好ましくは、カルボキシル基、カルボン酸ナトリウム塩またはカルボン酸カリウム塩である。
【００２４】
一つのアシルアミド結合を含む連結基とは、−Ｒ’−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ’’−または−Ｒ’−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−Ｒ’’−であり、式中、Ｒ’およびはＲ’’、上記のアルキレン基、置換アルキレン基、アリール基またはポリエーテル基である。ポリアミド基とは、ジアシドおよびジアミンから生成される基である。
【課題を解決するための手段】
【００２５】
本発明の生体適合性高速ゲル化ハイドロゲルの調製方法のプロセスは、以下のステップを含む:
（１）成分Ａと成分Ｂとを相互に混合して、特定の架橋条件を有する反応性混合物を調製するステップ。ここで、成分Ａは生体適合性高分子チオール化誘導体を含む溶液であり、成分Ｂは生体適合性チオール基反応性架橋剤である。生体適合性高分子チオール化誘導体は、生体適合性高分子がチオール化により変性されることにより調製される。成分Ａの濃度は８％ ｗ／ｖ未満であり、成分ＡのｐＨ値は８．５未満であり、成分ＢのｐＨ値は成分ＡのｐＨ値より大きい。成分Ａ中のチオール基と成分Ｂ中のチオール基反応性官能基とは化学架橋反応を生じる。上記反応性混合物中の生体適合性高分子チオール化誘導体と生体適合性チオール基反応性架橋剤の濃度の和は６％ ｗ／ｖ未満である。上記特定の架橋条件とは、反応性混合物溶液のｐＨ値が７．０より大きいことである。
（２）反応性混合物を反応させてハイドロゲルを形成するステップ。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】FibriJetシリーズの複数成分混合反応気体補助式噴霧装置の部分的な構成を示す模式図。１はシリンジプランジャクリップ、２はシリンジ、３はシリンジホルダ、４は４ウェイアプリケータ、５は圧縮気体吸気管である。
【図２】図１の４ウェイアプリケータの構成を示す模式図。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明の生体適合性ハイドロゲルの調製方法の基本的な化学原理は、特定条件下でのチオール基と生体適合性チオール基反応性官能基との間の高速化学架橋反応である。本発明においては、通常、生体適合性高分子チオール化誘導体溶液（成分Ａ）および生体適合性チオール基反応性架橋剤（成分Ｂ）という二つの活性成分を使用する。少なくとも三つのチオール基を有する生体適合性高分子チオール化誘導体を含む成分Ａと、少なくとも二つのチオール基反応性官能基を有する生体適合性チオール基反応性架橋剤を含む成分Ｂとを特定条件下で相互に混合して化学架橋させることにより、本発明を実現することが可能である。本発明は生体適合性が良好であり、副生成物を発生せず、安定性が良好であり、使用が便利であり、低コストである、等の多くの長所を有する。
【００２８】
本発明において、成分Ａとは、生体適合性高分子チオール化誘導体の溶液である。上記溶液は水を主要な溶剤とし、溶液浸透圧を調節し溶液ｐＨ値を安定させる等の機能を有する若干の塩成分（塩化ナトリウム、ｐＨ緩衝塩成分等）を含んでいてもよい。また、その他の若干の極性及び水溶性の成分（エタノール等）を含んでいてもよい。
【００２９】
本発明において用いられる生体適合性高分子チオール化誘導体は、生体適合性高分子側鎖カルボキシル基やアミノ基等の官能基を直接チオール化変性する等の、生体適合性高分子のチオール化変性により調製することができる。その他、生体適合性高分子の側鎖アミノ基、ヒドロキシル基等の官能基は、まずカルボキシル化変性により新たな生体適合性高分子を得た後に、カルボキシル基のチオール化変性を行ってもよい。一般に、生体適合性高分子のチオール化変性には、常用される以下の数種の方法が含まれる。
【００３０】
方法１は、側鎖カルボキシル基のアミノ基（ヒドラジド）／カルボジイミドカップリング化学法である。好ましい形態としては、カルボキシル基がカルボジイミドの活性下で中間産物を形成し、ジスルフィド結合を含むジアミンまたはジヒドラジドが求核置換により中間産物を生成し、最後にジスルフィド結合をチオール基に還元すれば、生体適合性高分子チオール化誘導体が得られる（Shu et al， Biomacromolecules，3，1304，2002；Aeschlimann et al，US 7,196,180 B1）。また、ジスルフィド結合を含むジアミンまたはジヒドラジドに代えて、チオール基保護１級アミノ基を用いてもよく、得られる中間産物からチオール基の保護基を除去すれば、生体適合性高分子チオール化誘導体が得られる（Gianolio et al，Bioconjugate Chemistry，16，1512，2005）。上記のカルボジイミドは、通常は１-エチル-３-(３-ジメチルアミンプロピル)カルボジイミド塩酸塩をいう。用いられるジスルフィド結合を含むアミンまたはヒドラジドの例の構造を以下に示す。
【００３１】
【化１】
【００３２】
ここで、（１）はシスタミン、（２）はシスチンエステル、（３）はジチオジアニリン、（４）はジチオジエチルジヒドラジド、（５）はジチオジプロピルジヒドラジド、（６）はジチオジブチルジヒドラジド、（７）はジチオジプロピオン酸ジアシルグリシンジヒドラジド、（８）はジチオジプロピオン酸ジアシルアラニンジヒドラジド、（９）はジチオジプロピオン酸ジアシル（ヒドロキシ）アミノ酢酸ジヒドラジド、（１０）はジチオジプロピオン酸ジアシルアミノプロピオン酸ジヒドラジド、（１１）はジチオジプロピオン酸ジアシルアミノブチル酸ジヒドラジド、（１２）はジチオジブチル酸ジアシルグリシンジヒドラジド、（１３）はジチオジブチル酸ジアシルアミノプロピオン酸ジヒドラジド、（１４）はジマロン酸ジアシルシスタミノジヒドラジド、（１５）はジコハク酸ジアシルシスタミノジヒドラジド、（１６）はジ（メチル）コハク酸ジアシルシスタミノジヒドラジド、（１７）はジグルタミン酸ジアシルシスタミノジヒドラジド、（１８）はジヘキシル酸ジアシルシスタミノジヒドラジド、（１９）はジヘプチル酸ジアシルシスタミノジヒドラジド、である。
【００３３】
このような方式により調製した高分子チオール化変性誘導体は、通常、以下の一般式（Ｉ）または一般式（ＩＩ）に示す構造を有する（Shu et al， Biomacromolecules，3，1304，2002；Prestwich et al，WO 2004/03716；宋ら，中国特許出願第200610119414.1号明細書）。
【００３４】
【化２】
式中、Ｒ１およびＲ２は、アルキレン基、置換アルキレン基、アリール基、ポリエーテル基、アシルアミノ基、ポリアミド基等を含む。
【００３５】
方法２は、側鎖カルボキシル基を、ジスルフィド結合を含むカルボジイミド（２，２’−ジチオ‐ジ（Ｎ‐エチル（Ｎ’‐エチルカルボジイミド））等）と直接反応させて調製する方法である。調製された生体適合性高分子チオール化変性誘導体は、以下の一般式（III）に示す構造を有する（Bulpitt et al，US 6884788）。
【００３６】
【化３】
式中、Ｒ３はアルキレン基、置換アルキレン基、アリーレン基等である。
【００３７】
方法３は側鎖アミノ基の変性であり、一般に直接変性と間接変性の二種類の方式に分けられる。直接変性方式とは、側鎖アミノ基を直接修飾して、チオール基を導入することである。例えば、ジコハク酸ジアシルシスタミノジカルボニルジイミダゾール活性エステルによる、コラーゲンアミノ基のチオール化変性である（Yamauchi et al，Biomaterials，22，855，2001；Nicolas et al，Biomaterials，18，807，1997）。直接変性方式により調製された高分子チオール化誘導体は、通常、以下の一般式（ＩV）に示す構造または一般式（ＩV）に類似した構造を有する。
【００３８】
【化４】
式中、Ｒ４は、アルキレン基、置換アルキレン基、アリール基、ポリエーテル基、アシルアミノ基、ポリアミド基等である。
【００３９】
方法３におけるアミノ基の間接チオール化変性の方式は、一般に二つのステップに分けられる。第一ステップは、アミノ基のカルボキシル化であり、第二ステップはカルボキシル基のチオール化変性である。ここで、第二ステップのカルボキシル基のチオール化変性は、前述した方法１および方法２と同様である。調製された生体適合性高分子チオール化誘導体は、通常、以下の一般式（V）または一般式（VI）に示す構造を有する。
【００４０】
【化５】
式中、Ｒ１およびＲ２の定義は前述の通りであり、Ｒ５はアルキレン基、置換アルキレン基等の基である。
【００４１】
側鎖カルボキシル基とアミノ基とを同時に有する生体適合性高分子については、そのチオール化誘導体はカルボキシル基チオール化変性構造（一般式（I）または（II）等）とアミノ基の直接または間接チオール化変性構造（一般式（III）、（IV）、（V）または（VI）等）とを同時に有する（宋ら，中国特許出願第200710036276.5号明細書）。
【００４２】
方法４は側鎖ヒドロキシル基の変性である。通常の方法は、ヒドロキシル基を強アルカリ条件下でカルボキシル化し、その後カルボキシル基を前述の方法１および方法２によりチオール化する。例えば、セルロース、ヒアルロン酸、キチンおよびキトサン等の高分子側鎖ヒドロキシル基はいずれもカルボキシメチル化することができ、その後アミノ基（ヒドラジド）／カルボジイミド化学反応を用いてチオール化変性を行う。調製された生体適合性高分子チオール化誘導体は、通常、以下の一般式（VII）または（VIII）に示す構造を有する。
【００４３】
【化６】
式中、Ｒ１およびＲ２の定義は前述の通りであり、Ｒ6はアルキレン基、置換アルキレン基等の基である。
【００４４】
カルボキシル基とヒドロキシル基とを同時に有する生体適合性高分子については、そのチオール化誘導体はカルボキシル基のチオール化変性構造（一般式（I）または（II）等）とヒドロキシル基のチオール化変性構造（一般式（VII）または（VIII）等）とを同時に有しうる。
【００４５】
上記の一般式（I）〜（VIII）において、Ｐは生体適合性高分子の残基であり、そのうち少なくとも二つの生体適合性高分子化合物の側鎖カルボキシル基、アミノ基またはヒドロキシル基が、直接または間接的にチオール基に変性される。Ｐの分子量は通常１，０００〜１０，０００，０００である。生体適合性高分子の定義は前述の通りである。
【００４６】
上記の一般式（I）〜（VIII）において、Ｒ１の好ましい構造は、アルキレン基−（ＣＨ２）ｍ−、アシルアミノ基−（ＣＨ２）ｉ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）ｊ−、および−（ＣＨ２）ｉ−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ２）ｊ−であり、式中、ｍ、ｉおよびｊはいずれも１〜１５の整数である。ｍが１〜３の整数、ｉが１〜５の整数、ｊが２および３のときが、Ｒ１の特に好ましい構造である。
【００４７】
上記の一般式（I）〜（VIII）において、Ｒ２の好ましい構造は、アリール基、アルキレン基−（ＣＨ２）ｍ−および置換アルキレン基−ＣＨ−（Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ）−ＣＨ２−であり、式中、ｍは１〜１５の整数であり、Ｒはメチル基、エチル基、プロピル基およびブチル基である。Ｒ２の特に好ましい構造は、炭素数２のアルキレン基、Ｒがメチル基およびエチル基の上記置換アルキレン基である。
【００４８】
上記の一般式（I）〜（VIII）において、Ｒ３の好ましい構造は、アリール基およびアルキレン基−（ＣＨ２）ｍ−であり、式中、ｍは１〜１５の整数である。Ｒ３の特に好ましい構造は、炭素数２のアルキレン基である。
【００４９】
上記の一般式（I）〜（VIII）において、Ｒ４の好ましい構造は、アルキレン基−（ＣＨ２）ｍ−、アシルアミノ基−（ＣＨ２）ｉ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）ｊ−および（ＣＨ２）ｉ−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ２）ｊ−であり、式中、ｍ、ｉおよびｊはいずれも１〜１５の整数である。ｍが１〜３の整数、ｉが１〜５の整数、ｊが２および３のときが、Ｒ４の特に好ましい構造である。
【００５０】
上記の一般式（I）〜（VIII）において、Ｒ５の好ましい構造は、アルキレン基−（ＣＨ２）ｍ−であり、式中、ｍは１〜１５の整数である。ｍが１〜８の整数のときが、Ｒ５の特に好ましい構造である。
【００５１】
上記の一般式（I）〜（VIII）において、Ｒ６の好ましい構造は、アルキレン基であり、ｍは１〜１５の整数である。ｍが１〜５の整数のときが、Ｒ６の特に好ましい構造である。
【００５２】
本発明に用いられる生体適合性高分子チオール化誘導体の特に好ましい一部の化学構造を以下に示す。
【００５３】
【化７】
【００５４】
【化８】
【００５５】
このうち、構造式（１）、（２）および（３）は、一般式（I）の特に好ましい生体適合性高分子チオール化誘導体に属する。構造式（４）は、一般式（II）の特に好ましい生体適合性高分子チオール化誘導体に属する。構造式（５）は、一般式（III）の特に好ましい生体適合性高分子チオール化誘導体に属する。構造式（６）は、一般式（IV）の特に好ましい生体適合性高分子チオール化誘導体に属する。構造式（７）、（８）および（９）は、一般式（V）の特に好ましい生体適合性高分子チオール化誘導体に属する。構造式（１０）は、一般式（VI）の特に好ましい生体適合性高分子チオール化誘導体に属する。構造式（１１）、（１２）および（１３）は、一般式（VII）の特に好ましい生体適合性高分子チオール化誘導体に属する。構造式（１４）は、一般式（VIII）の特に好ましい生体適合性高分子チオール化誘導体に属する。
【００５６】
カルボキシル基、アミノ基、ヒドロキシル基を同時に有する生体適合性高分子により調製される生体適合性チオール化誘導体の特に好ましい構造は、上記構造式（１）〜（１４）のうちの一種類以上の構造を有しうる。例えば、ヒアルロン酸はカルボキシル基とヒドロキシル基を同時に有し、ヒドロキシル基をカルボキシメチル化してカルボキシル基を導入し、その後アミノ基（ヒドラジド）／カルボジイミド化学反応を用いてチオール化変性を行うことができる。調製されるヒアルロン酸チオール化誘導体は、同時に構造式（１）、（２）または（３）の構造と、構造式（１１）、（１２）または（１３）の構造とを有する（Prestwich et al，PCT Int. Appl. WO 2005/056608）。ゼラチンはカルボキシル基とアミノ基を同時に有し、アミノ基を無水酸と反応させてカルボキシル基を導入し、その後ヒドラジド／カルボジイミド化学反応を用いてチオール化変性を行うことができる。調製されるゼラチンチオール化誘導体は、同時に構造式（１）、（２）または（３）の構造と、構造式（７）、（８）または（９）の構造とを有する（宋ら，中国特許出願第200710036276.5号明細書）。
【００５７】
本発明に用いられる成分Ｂは、生体適合性チオール基反応性架橋剤であり、少なくとも二つのチオール基反応性官能基を有する。通常、チオール基反応性官能基には、マレイミド、ビニルスルホン、α，β不飽和アクリレート、α，β不飽和メタクリレート、ハロプロピオネート、ハロプロピオンアミド、ジチオヒリジン、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステル等が含まれる。このうち、マレイミド、ビニルスルホン、ヨードプロピオネート、ヨードプロピオンアミド、ジチオヒリジン等の官能基は高いチオール基反応活性を有する。上記の官能基とチオール基の反応は三種類に分けられる。（１）チオール基と活性不飽和二重結合の付加反応。この種の反応に属する官能基には、マレイミド、ビニルスルホン、α，β不飽和アクリレート、α，β不飽和メタクリレート等が含まれる。（２）チオール基の置換反応。この種の反応に属する官能基には、ヨードプロピオネート、ブロモプロピオネート、クロロプロピオネート、ヨードプロピオンアミド、ブロモプロピオンアミド、クロロプロピオンアミド、ジチオヒリジン等が含まれる。（３）チオエステル化反応。この種の反応に属する官能基には、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステル等の各種カルボン酸活性エステルが含まれる。チオール基と上記チオール基反応性官能基との反応式を以下に示す。
【００５８】
【化９】
【００５９】
上記チオール基反応性官能基のうち、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステルは反応活性が強く、アミノ基およびチオール基の双方と反応可能で選択性を持たないため、相当の毒性、副作用を有する。また、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステルは、チオール基との反応時にさらに副生成物としてＮ−ヒドロキシスクシンイミドを生成するため、毒性、副作用を生じうる。なお、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステルとチオール基の反応により形成されるチオエステル結合は不安定で加水分解しやすく、医薬分野での応用には多くの制限がある。Wallenceらはポリエチレングリコールスクシンイミド活性エステル誘導体をポリエチレングリコールチオール基誘導体の架橋に用いているが（特許文献１）、上記の重大な欠陥が存在するため、本発明ではチオール基反応性官能基としてＮ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステルを用いない。ジチオピリジンとチオール基の反応でも副生成物が生じ、毒性、副作用を生じうるため、同様に本発明では用いない。
【００６０】
本発明で用いるチオール基反応性官能基には、マレイミド、ビニルスルホン、α，β不飽和アクリレート、α，β不飽和メタクリレート、α，β不飽和アクリルアミド、α，β不飽和メタクリルアミド、ヨードプロピオネート、ブロモプロピオネート、クロロプロピオネート、ヨードプロピオンアミド、ブロモプロピオンアミド、クロロプロピオンアミド等が含まれる。ヨードプロピオネート、ブロモプロピオネート、クロロプロピオネート、ヨードプロピオンアミド、ブロモプロピオンアミド、クロロプロピオンアミド等の官能基も、チオール基との反応時に副生成物を生じるものの、これらの副生成物はハロゲノ酸であり、生理条件下で塩素イオン、臭素イオンまたはヨウ素イオンを形成するため、良好な生体適合性を有する。ここで、ハロプロピオネートは、対応するハロプロピオンアミドよりも良好なチオール基反応活性を有するが、安定性にやや欠ける。ヨードプロピオネート（またはヨードプロピオンアミド）は、対応するブロモ基よりも良好なチオール基反応活性を有するが、安定性にやや欠ける。クロロプロピオネート（またはクロロプロピオンアミド）のチオール基反応活性は最も低いものの、安定性は良好である。
【００６１】
本発明の好ましいチオール基反応性官能基は、マレイミド、ビニルスルホン、α，β不飽和アクリレート、α，β不飽和メタクリレート、α，β不飽和アクリルアミド、α，β不飽和メタクリルアミド等である。これらの官能基は良好な生体適合性を有するばかりでなく、チオール基との反応時に副生成物を生じることもない。本発明の特に好ましいチオール基反応性官能基は、ビニルスルホン、α，β不飽和アクリレート、α，β不飽和メタクリレート、α，β不飽和アクリルアミド、α，β不飽和メタクリルアミド等であり、これらは良好な生体適合性を有するばかりでなく、安定性もＮ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステルより大幅に向上している。
【００６２】
本発明に用いられる一つ以上のチオール基反応性官能基を含む成分Ｂは、通常、前述のチオール基反応性官能基を少なくとも二つ含むポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の誘導体であり、二分岐、三分岐、四分岐、八分岐またはさらに多分岐のポリエチレングリコール誘導体であって、以下のような典型的な化学構造を有する。
【００６３】
【化１０】
【００６４】
式中、Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４、Ｆ５、Ｆ６、Ｆ７およびＦ８は、前述のマレイミド、ビニルスルホン、α，β不飽和アクリレート、α，β不飽和メタクリレート、α，β不飽和アクリルアミド、α，β不飽和メタクリルアミド、ヨードプロピオネート、ブロモプロピオネート、クロロプロピオネート、ヨードプロピオンアミド、ブロモプロピオンアミド、クロロプロピオンアミド等のチオール基反応性官能基であり、これらは全て同じ、一部同じ、または全て異なる化学構造を有しうる。ＰＥＧとは、分子量が１００〜１，０００，０００で、ＣＨ２ＣＨ２Ｏの繰返し単位を有するセグメントである。Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４、Ｆ５、Ｆ６、Ｆ７およびＦ８は、好ましくはマレイミド、ビニルスルホン、α，β不飽和アクリレート、α，β不飽和メタクリレート、α，β不飽和アクリルアミド、α，β不飽和メタクリルアミド等の官能基であり、特に好ましくは、ビニルスルホン、α，β不飽和アクリレート、α，β不飽和メタクリレート、α，β不飽和アクリルアミド、α，β不飽和メタクリルアミド等の官能基である。
【００６５】
二分岐のポリエチレングリコールを例に、本発明に用いられる一般的な架橋剤には、ポリエチレングリコールジマレイミド、ポリエチレングリコールジビニルスルホン、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリルアミド、ポリエチレングリコールジハロプロピオネート、ポリエチレングリコールジハロプロピオンアミド等が含まれる。化学構造式を以下に示す。
【００６６】
【化１１】
【００６７】
上記本発明の生体適合性高速ゲル化ハイドロゲルの調製方法のプロセスにおける第一ステップは、特定の架橋条件を有する反応性混合物溶液の調製である。ここでの特定の架橋条件としては、成分Ａおよび成分Ｂの性質を調節することにより、反応性混合物溶液のｐＨ値を弱アルカリ性またはアルカリ性にすることが肝要である。反応性混合物溶液のｐＨ値は、好ましくは８．０〜１２．０であり、特に好ましくは８．５〜１０．５である。
【００６８】
前述の通り、本発明で選択される成分Ａおよび成分Ｂはいずれも良好な生体適合性を有するとともに、チオール基とチオール基反応性官能基との間の化学架橋反応も良好な生体適合性を有する。このことは本発明の生体適合性が良好であるための確実な根拠となっている。さらに、高速ゲル化を実現するために、成分Ａおよび成分Ｂの濃度、溶液のｐＨ値、温度等のその他の重要なパラメータを最適化する必要がある。
【００６９】
本発明で用いられる温度は、通常は０〜５０℃である。化学架橋反応温度を高めると、ゲル化の速度を加速することができる。実際の使用過程では、好ましい温度は通常は１０〜４０℃の間である。本発明で最も常用される温度は室温であり、通常は２５℃前後である。
【００７０】
Wallaceらにより開示された高速ゲル化ゲルの調製方法において、高速ゲル化を実現するためには、使用される多分岐ポリエチレングリコールチオール基誘導体溶液のｐＨ値は強アルカリ性（通常、ｐＨ値は９．６）でなければならず、濃度は１０％ ｗ／ｖ以上でなければならない（特許文献１）。しかしながら、チオール基は、アルカリ性、特に強アルカリ性の条件下では不安定であり、ジスルフィド結合を形成して反応活性を失いやすい。そのため、多分岐ポリエチレングリコールチオール基誘導体は用時調製されなければならず、空気に触れると活性を失いやすいため、使用上不便である。本発明では、使用の便宜上、成分Ａ溶液は用時調製が不要であり、通常は、生体適合性高分子チオール化誘導体はまず成分Ａ溶液として調製し、滅菌後に低温で凍結保存し、使用前に解凍すればよい。Wallaceら（特許文献１）により用いられる多分岐ポリエチレングリコールチオール基誘導体（分子量１０，０００、最多で１２個のチオール基／１０，０００分子量セグメント）とは異なり、本発明に用いられる生体適合性高分子チオール化誘導体は、通常、より高い分子量（通常は１０，０００〜１，０００，０００の間）とより多くのチオール基含有量（１００個以上のチオール基／１０，０００分子量セグメント）とを有する（Shu et al，Biomacromolecules，3，1304，2002）。従って、本発明における成分Ａは強アルカリ性の条件下では非常に不安定であり、Wallaceらにより開示された方法（特許文献１）によって高速ゲル化を実現することはできない。
【００７１】
チオール化誘導体が強アルカリ性の条件下で不安定であるという欠陥を克服するために、本発明で用いられる成分Ａの溶液のｐＨ値は通常８．５以下、好ましくはｐＨ値≦７．０であり、この場合に溶液は一定の安定性を有する。より好ましいｐＨ値の範囲は２．５〜７．０であって、この場合に溶液は良好な安定性を有する。零下３０℃では一年以上保存でき、室温では、溶液が空気に触れた場合には２時間以上保存でき、空気に触れなければ５時間以上保存できる。特に好ましいｐＨ値の範囲は３．５〜６．０であって、この条件下ではチオール基は安定しており、また、酸による生体適合性高分子チオール基誘導体の加水分解作用を基本的に回避している。この特に好ましい条件下で、本発明に用いられる成分Ａの安定性はWallaceら（特許文献１）により用いられた不活性化しやすい多分岐ポリエチレングリコールチオール基誘導体溶液と比較して実質的に向上しており、零下３０℃以下では二年以上保存でき、室温で溶液が空気に触れた場合でも２４時間以上保存できる。
【００７２】
本発明では、成分Ａは上記の条件下で長期保存と使用前の良好な安定性が保証されている。成分Ａと成分Ｂを混合する前に、上記成分Ａ中にアルカリ性溶液またはアルカリ性物質を加えて成分ＡのｐＨ値を高め（８．５より大きくする等）、即座に成分Ｂと混合してハイドロゲルを調製してもよい。
【００７３】
本発明では、成分Ａ中の生体適合性チオール基変性高分子の濃度は通常８．０％ ｗ／ｖ以下であり、好ましい濃度は０．５〜５．０％ ｗ／ｖ、特に好ましい濃度は０．８〜３．０％ ｗ／ｖである。Wallaceらにより開示された高速ゲル化ゲルの調製方法において、高速ゲル化を実現するためには、使用される多分岐ポリエチレングリコールチオール基誘導体溶液の濃度は１０％ ｗ／ｖ以上（通常は２０％ ｗ／ｖ）でなければならない（特許文献１）。成分Ａの濃度が特に好ましい濃度である場合に、本発明における生体適合性チオール基変性高分子の用量を８０〜９０％減らすことができ、コストを大幅に削減している。
【００７４】
本発明では、成分Ａは水を溶剤とすることができるが、塩化ナトリウム、緩衝塩およびその他の成分を加えてもよい。通常は、低濃度の緩衝塩（例えば、弱酸性の０．０００５ｍｏｌ／Ｌのリン酸ナトリウム緩衝液）を用いて溶液のｐＨ値を安定させる。塩化ナトリウム等は溶液の浸透圧を調節することができる。
【００７５】
本発明では、用いられる生体適合性チオール基反応性架橋剤は、固体状態の場合に低温で安定しており、通常、零下３０℃以下で長期保存（二年以上）できる。また、これらは溶解しやすいため、成分Ｂは用時調製することが可能である。成分ＢのｐＨ値は成分ＡのｐＨ値より大きい。成分ＢのｐＨ値は通常８．０より大きく、通常は≧８．５である。室温での安定時間は一般に２時間以上である。例えば、本発明に用いられるポリエチレングリコールジアクリレート溶液（ｐＨ９．６）を室温で４時間保存した場合、ゲル化時間には影響しない。また、同様の条件下で、本発明に用いられる、ポリエチレングリコールジメタクリレート溶液、ポリエチレングリコールジアクリルアミド溶液、ポリエチレングリコールジメタクリルアミド溶液、の順に安定性が向上し、いずれもポリエチレングリコールジアクリレート溶液よりも安定している。本発明では、成分ＢのｐＨ値は、好ましくは８．０〜１２．０であり、特に好ましくは８．５〜１０．５である。
【００７６】
本発明に用いられる成分Ｂは大きな利点を有する。Wallaceらにより開示された高速ゲル化ゲルの調製方法では、用いられる架橋剤（多分岐ポリエチレングリコールスクシンイミド活性誘導体）は、酸性およびアルカリ性のいずれの条件下でも不安定であり、０．０００５ｍｏｌ／Ｌのリン酸ナトリウム緩衝液に溶解して弱酸性溶液（ｐＨ６．０）を得なければならない。しかしながら、この最適な条件でも、溶液の安定性は劣っており、用時調製しなければならず、また、一時間以内に使い終えなければならない。
【００７７】
本発明では、成分Ｂ中の生体適合性チオール基反応性架橋剤の濃度は通常１０％ ｗ／ｖ以下であり、好ましい濃度は０．５〜８．０％ ｗ／ｖ、特に好ましい濃度は０．８〜４．０％ ｗ／ｖである。それに対し、Wallaceらにより開示された方法では、高速ゲル化を実現するためには、使用される架橋剤（多分岐ポリエチレングリコールスクシンイミド活性誘導体）溶液の濃度は１０％ ｗ／ｖ以上（通常は２０％ ｗ／ｖ）でなければならない（特許文献１）。本発明では、成分Ｂの濃度が特に好ましい濃度である場合に、架橋剤の用量を６０〜９６％減らすことができ、コストを大幅に削減している。
【００７８】
本発明では、成分Ｂは通常は溶剤としてアルカリ性の緩衝溶液を用いるが、塩化ナトリウムおよび他の成分を加えて溶液の浸透圧を調節してもよい。用いられる緩衝溶液は、通常、０．３ｍｏｌ／Ｌのリン酸ナトリウム／炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０〜１０．０）（０．３ｍｏｌ／Ｌのリン酸二水素ナトリウム溶液に、０．３ｍｏｌ／Ｌの炭酸ナトリウム溶液を所定のｐＨ値となるまで加える）等のように濃度が高い。成分Ｂ中の生体適合性架橋剤は、通常、溶液のｐＨを変えないため、緩衝溶液のｐＨが成分Ｂの溶液のｐＨ値を決定している。
【００７９】
成分Ａと成分Ｂとを相互に混合すると、特定の架橋条件を有する反応性混合物が形成される。室温条件下では、基本的に反応性混合物溶液のｐＨ値が化学架橋速度およびゲル化速度を決定しており、ｐＨ値が向上すると、化学架橋およびゲル化の過程が加速される。反応性混合物溶液のｐＨ値は、通常は７．０以上であり、好ましくは８．０〜１２．０、特に好ましくは８．５〜１０．５である。
【００８０】
反応性混合物のｐＨ値は、成分Ａと成分Ｂとの混合時に決定される。あるいは、酸又はアルカリ溶液を加えて調節してもよい。反応性混合物溶液のｐＨ値は、初期の成分Ａおよび成分Ｂの性質（溶剤の類型、緩衝溶液の濃度、ｐＨ値等）により決定される。成分Ａの溶液および成分Ｂの溶液は、異なる濃度のｐＨ値緩衝物質を含んでもよく、ｐＨ値緩衝物質を含まなくてもよい。またその他の極性及び親水性物質を添加してもよい。初期の成分Ａの溶液および成分Ｂの溶液の性質を調節すれば、反応性混合物溶液のｐＨを調節して特定のｐＨ値とすることができる。例えば、成分ＡがｐＨ６．０の水溶液であり、成分ＢがｐＨ９．６の０．３ｍｏｌ／Ｌのリン酸ナトリウム／炭酸ナトリウム緩衝液である場合に、成分Ａと成分Ｂとの反応性混合物溶液はアルカリ性であり、ｐＨ値は通常、９．０〜９．６の間である。成分Ｂの溶剤のｐＨ値を高くすれば、反応性混合物溶液のｐＨ値を高くすることができ、逆であれば反応性混合物溶液のｐＨ値は低くなる。
【００８１】
本発明ではさらに、反応性混合物溶液中に、混合前の成分Ａまたは成分Ｂに、または成分Ａと成分Ｂとの混合時に、所定濃度の酸又はアルカリ溶液（０．２ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム溶液等）を加え、反応性混合溶液のｐＨを調節して特定の値とすることができ、これにより適切なゲル化速度とすることができる。しかしながら、通常の状況ではこのステップは不要であり、初期の成分Ａの溶液および成分Ｂの溶液の性質を調節すれば本発明を実現することができる。
【００８２】
本発明では、生体適合性高分子チオール化誘導体および生体適合性チオール基反応性架橋剤の使用量が少ない。反応性混合物中の両者の濃度の合計は一般に６％ ｗ／ｖ未満であり、通常は０．８〜３．０％ ｗ／ｖである。
【００８３】
適切な生体適合性チオール化変性高分子および生体適合性チオール基反応性架橋剤を選択し、成分Ａの溶液および成分Ｂの溶液の性質を調節し、酸アルカリを選択的に加えて反応性混合物溶液のｐＨ値をさらに調節すれば、数秒間から数分間（ひいては数十分間）という時間範囲内でゲル化時間を調節することができる。このため、様々な医学的用途に適している。例えば、本発明は、高速ゲル化ハイドロゲル噴霧剤に簡便に用いることができ、術後の癒着合併症の治療に用いることができ、一分間未満というゲル化時間を実現する。
【００８４】
本発明の生体適合性高速ゲル化ハイドロゲルの調製方法の他のプロセスは、以下の三つの工程を含む：
（１）成分Ａと成分Ｂとを相互に混合して、特定の架橋条件を有する反応性混合物を形成するステップ。成分Ａは生体適合性高分子チオール化誘導体を含む溶液であり、成分Ｂは生体適合性チオール基反応性架橋剤である。成分Ｂは固体または溶液である。生体適合性高分子チオール化誘導体は、生体適合性高分子がチオール化変性されて調製される。成分Ａの濃度は８％ ｗ／ｖ未満であり、成分ＡのｐＨ値は８．５未満である。成分Ａ中のチオール基と成分Ｂ中のチオール基反応性官能基とは化学架橋反応を生じる。上記特定の架橋条件とは、反応性混合物溶液のｐＨ値が７．０以下であることである。
（２）反応性混合物溶液のｐＨ値を特定のアルカリ性の範囲に調節するステップ。
（３）反応性混合物を反応させてハイドロゲルを形成するステップ。
【００８５】
この方法の第一ステップは、良好な安定性を有する反応性混合物溶液を調製することであり、反応性混合物溶液のｐＨ値を弱酸性に制御することが肝要である。この方法の前述の方法との相違は、生体適合性架橋剤（成分Ｂ）が、固体でも、弱アルカリ性、中性または弱酸性の液体でもよく、かつ、成分Ａと成分Ｂとを相互に混合して形成される反応性混合物溶液のｐＨ値が７．０以下であることである。より好ましいｐＨ値の範囲は２．５〜６．０であり、このとき、反応性混合物溶液は良好な安定性を有し、室温で空気に接触した状態で１時間以上保存することができる。特に好ましいｐＨ値の範囲は３．５〜５．０であり、このとき、反応性混合物溶液は良好な安定性を有し、室温で空気に接触した状態で４時間以上保存することができる。
【００８６】
この方法の第二ステップは、良好な安定性を有する反応性混合物溶液中にアルカリまたはアルカリ性緩衝溶液（０．２ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム溶液／水酸化カリウム溶液、ｐＨ値９．０〜１２．０のリン酸塩や炭酸塩の緩衝液等）を加えて溶液のｐＨ値を弱アルカリ性またはアルカリ性に調節することであり、好ましいｐＨ値は８．０〜１２．０、特に好ましい溶液のｐＨ値は８．５〜１０．５である。
【００８７】
この方法の第三ステップは、上記の条件の下で反応性混合物の成分Ａと成分Ｂとを反応させてハイドロゲルを速やかに形成することである。この方法で用いられる生体適合性高分子チオール化誘導体および生体適合性チオール基反応性架橋剤は前述の方法と同様であり、この方法のその他の条件は前述の方法と同様である。
【００８８】
本発明では、適切な生体適合性チオール化変性高分子および生体適合性チオール基反応性架橋剤を選択し、成分Ａおよび成分Ｂの性質を調節し、反応性混合物溶液のｐＨ値を特定の値に調節すれば、数秒間から数分間（ひいては数十分間）という時間範囲内でゲル化時間を調節することができる。このため、様々な医学的用途に適している。例えば、本発明は、高速ゲル化ハイドロゲル噴霧剤に簡便に用いることができ、術後の癒着合併症の治療に用いることができ、一分間未満というゲル化時間を実現する。
【００８９】
本発明に用いられる成分Ａ中の生体適合性チオール化変性高分子は、通常、高い分子量とチオール基含有量を有し、分子量は、通常、１０，０００〜１，０００，０００の間であり、チオール基含有量は１００個以上のチオール基／１０，０００分子量セグメントである。つまり、分子量５０，０００の生体適合性チオール化変性高分子ごとに５００個のチオール基を有する。開示されたポリエチレングリコールチオール化誘導体およびシステインを含むオリゴペプチド等（特許文献１；Gravett et al，US2004/0225077A1；Qiu et al，Biomaterials，24，11，2003；Hubbell et al，US2003/0220245A1；Lutolf et al，Biomacromolecules，4，713，2003）と比較して、本発明に用いられる生体適合性チオール化変性高分子のチオール基含有量は８倍以上に向上しており、分子量も大幅に向上している。従って、同じ条件の下では、本発明に用いられる生体適合性チオール化変性高分子の化学架橋によりゲルを形成する能力は大幅に向上しており、ゲルの性能（機械的強度、安定性、透過性等）も大幅に向上している。上記のポリエチレングリコールチオール化誘導体およびシステイン含有オリゴペプチド等についての報告では、高い濃度（通常は１０％ ｗ／ｖ以上）の場合にはじめて高速架橋ゲル化を実現でき、その溶液は弱アルカリ性であるか、または必ずアルカリ性でなければならず、安定性に劣り、用時調製が必要で、空気に触れてはならない。また、用いられる架橋剤の濃度も高く（通常は１０％ ｗ／ｖ以上）、調製されるハイドロゲル中の含水量は一般に９０％以下で、通常は８０％前後である。これとは逆に、本発明では、生体適合性チオール化変性高分子および生体適合性チオール基反応性架橋剤の用量は少量で高速ゲル化を実現でき、調製されるハイドロゲル中の含水量は一般に９４％以上で、通常は９７％以上であり、より良好な透過性および生体適合性を有する。また、本発明に用いられる成分Ａ中の生体適合性チオール化変性高分子は、通常は細胞間質物質（ヒアルロン酸等）により調製され、創傷の治癒を促進することが可能な点、組織特異的な修復を誘導・誘発することが可能な点等、細胞間質物質に特有の生物学的機能を保っている。
【００９０】
本発明に用いられる成分Ａ中の生体適合性チオール化変性高分子は、強アルカリ性の条件下では非常に不安定であり、Wallaceらにより開示された方法（特許文献１）によって高速ゲル化を実現することはできない。例えば、ヒアルロン酸チオール化誘導体は、強アルカリ性の条件下では極めてジスルフィド結合を形成しやすく、活性を失う（Shu et al， Bio macromolecules，3，1304，2002）。一般に、本発明における成分ＡのｐＨ値が８．５より大きい場合には、溶液は不安定で使用上不便であり、実用的な価値を失う。従って、本発明では、通常、成分Ａを中性に近い条件または弱酸性の条件下で保存することにより、成分Ａの長期保存の安定性および使用時の安定性を著しく高めている。しかしながら一方で、高速ゲル化の実現は反応性混合物が高いｐＨ値（強アルカリ性）を有することにも依存している。従って、本発明の一つのプロセスでは、成分Ｂは通常強いアルカリ性を有し、成分ＢのｐＨ値が成分ＡのｐＨ値より大きいことが必須となる。このような成分Ａと成分Ｂとの反応性混合物こそが、高いｐＨ値（強アルカリ性）を有することができる。同時に、本発明で用いられる成分Ｂ中の生体適合性チオール基反応性架橋剤は、各種条件（強アルカリ性を含む）下で良好な安定性を有していなければならない。成分Ａの溶液および成分Ｂの溶液の性質を調節し、および酸アルカリを選択的に加えて反応性混合物溶液のｐＨ値をさらに調節すれば、本発明が実現される。
【００９１】
本発明の他のプロセスでは、成分Ａの溶液および成分Ｂの溶液の性質を調節して成分Ａと成分Ｂとの反応性混合物を弱酸性条件におくことにより、成分Ａおよび成分Ｂの長期保存の安定性および使用時の安定性を保証することができるとともに、反応性混合物の使用時の安定性を著しく高めることができ、その後アルカリを加えて反応性混合物溶液のｐＨ値をさらに調節して強アルカリ性とすることにより、高速ゲル化を実現する。
【００９２】
現在、すでに一部の報告により、ポリエチレングリコールジアクリレート（またはポリエチレングリコールジビニルスルホン）架橋による、ヒアルロン酸チオール化誘導体、コンドロイチン硫酸チオール化誘導体、およびゼラチンチオール化誘導体について開示されている。用いられる方法はいずれも、ポリエチレングリコールジアクリレート（またはポリエチレングリコールジビニルスルホン）とチオール化誘導体とをそれぞれ緩衝溶液に溶解し、二種類の溶液を中性付近の同程度のｐＨ値（通常は７．４）になるようにそれぞれ調節して、その後二種類の溶液を混合してハイドロゲルを調製するというものである。しかしながら、このような方法では、高速ゲル化の実現は困難である。二種類の溶液のｐＨ値を同時に高めれば（例えば、８．５以上）、ゲル化過程を加速することはできるものの、この場合チオール化誘導体溶液は不安定で、室温で、仮に空気に触れない条件下であっても、数時間（通常は約０．５〜４時間）後には活性を失う。長期保存が困難で大規模工業的生産が難しく、使用上も不便である。例えば、Ｌｉｕら（Liu et al，Fertility & Sterility， 87，940， 2007）は、Carbylan-SX（ポリエチレングリコールジアクリレート架橋による変性ヒアルロン酸チオール化誘導体）ハイドロゲルの噴霧剤を術後の癒着の防止に用いることを報告した。用いられる方法は、ポリエチレングリコールジアクリレートと変性ヒアルロン酸チオール化誘導体をそれぞれ緩衝溶液に溶解し、二種類の溶液のｐＨ値を７．４にそれぞれ調節し、ろ過滅菌した後に二種類の溶液を混合する。約５分間に混合溶液の粘度は徐々に高まり、噴霧装置を介して傷口組織の表面に噴霧されるというものである。しかしながら、この方法には、ゲル化時間が長くかつゲル化の過程が制御しにくい、噴霧のタイミングが把握しにくいといった多くの著しい欠陥が存在する。噴霧は、混合溶液の粘度は高いが流動性を失ってはいない、という短い時間範囲内に実現しなければならず、混合溶液の粘度が不十分であれば、噴霧後に溶液が傷口組織の表面から流失しやすく、混合溶液の粘度が大きすぎれば噴霧が難しく、ひいては噴霧不能となる。Connorsらも上記と同様のCarbylan-SXおよびその調製方法を術後の心膜癒着の防止に用いているが（Connors et al，J Surg Res， 140，237，2007）、同様に上記の欠陥が存在する。
【００９３】
また、本発明はさらに、新規の生体適合性高速ゲル化ハイドロゲルの噴霧剤の調製方法を提供する。これは、前述の本発明の高速ゲル化ハイドロゲルの調製方法を高速ゲル化ハイドロゲルの噴霧剤に応用した方法である。
【００９４】
当該方法においては、複数成分の混合反応に適用される複数種類の噴霧装置を用いることが可能である。常用される噴霧装置には、Spray Set for TISSEEL Fibrin Sealant (Baxter AG，米国)や、FibriJet (Micromedics, inc. 米国)等が含まれる。FibriJetシリーズには、通常噴霧化装置と気体補助式噴霧化装置が含まれる。FibriJetシリーズの通常噴霧化装置は、低粘度溶液に適し、ノズルが詰まりやすく、使用上不便である。FibriJetシリーズの気体補助式霧化装置の構成は図１に模式的に示す通りであり、シリンジ２Ａ、２Ｂと、シリンジプランジャクリップ１と、シリンジホルダ３と、４ウェイアプリケータ４と、圧縮気体吸気管５とを含む。シリンジ２Ａ、２Ｂのそれぞれは二つの成分を装入するために用いられ、４ウェイアプリケータ４を介してそれぞれ押し出された後に噴霧化、混合され（または、押し出され、混合された後に噴霧化され）、物体表面（例えば、創傷表面）に塗布された後、ゲルを形成する。４ウェイアプリケータ４と接続するノズルを加えて、噴霧化効果を向上させてもよい。
【００９５】
FibriJetシリーズの気体補助式噴霧化装置の主要構成要件は、４ウェイアプリケータ（図２）である。二つの吸入口のそれぞれは二つのシリンジ２Ａ、２Ｂに接続され、二つの成分を装入するために用いられる。一つの吸入口（圧縮気体吸気管５）は圧縮気体（空気または他の気体）に接続される。二つの成分のそれぞれは排出口に押し出され、圧縮気体の作用下で噴霧化、混合され、物体表面に塗布された後、ゲルを形成する。使用される気体の圧力が高いほど、噴霧化効果は良好であるが、気体圧力が高すぎると人体を傷つけるおそれがある。通常、使用される気体の圧力の範囲は１〜１０気圧の間である。気体圧力が低く、１気圧に近い場合には、噴霧化が不十分となり、大きな液体粒子を形成して、混合が十分に均一にならない。気体圧力を１．７気圧前後に高めれば、ごく微小な液体に噴霧化することができ、混合が均一になる。本発明の生体適合性高速ゲル化ハイドロゲルの調製方法の一のプロセスにおける成分Ａおよび成分Ｂのそれぞれが二つのシリンジに装入されて、高速ゲル化ハイドロゲル噴霧剤が調製される。本発明の生体適合性高速ゲル化ハイドロゲルの調製方法の他のプロセスによって噴霧を実現してもよい。この場合、成分Ａと成分Ｂとを混合して形成された反応性混合物を一つのシリンジに装入し、アルカリまたはアルカリ性緩衝溶液を第二のシリンジに装入した後に、両者をそれぞれ排出口から押し出し、圧力気体の作用下で噴霧化、混合すれば、高速ゲル化ハイドロゲル噴霧剤を調製することができる。
【００９６】
以下の実施例により、当業者は本発明をより全面的に理解することができるが、いかなる方式によっても本発明を限定するものではない。
【００９７】
実施例１ チオール化変性ヒアルロン酸（ＨＡ−ＤＴＰＨ）の調製
Shuら（Shu et al， Biomacromolecules，3，1304，2002）により報告された方法を用いて調製した。
【００９８】
ヒアルロン酸ナトリウム（分子量約１５０万）２０ｇを２Ｌの蒸留水中に溶解し、濃塩酸を加えて溶液のｐＨ値を約０．５に調節した後、３７℃、１５０回転／分の回転培養器で２４時間切断させた。透析精製し凍結乾燥して、低分子ヒアルロン酸が得られた（重量平均分子量２４．６万、数平均分子量１２万）。
【００９９】
上記の低分子ヒアルロン酸２０ｇを２Ｌの蒸留水に溶解した。上記の溶液中にジチオジプロピルジヒドラジド（ShuらがBiomacromolecules，3，1304，2002において開示した方法により調製）２３．８ｇを加え、攪拌して溶解した。そして、０．１ｍｏｌ／Ｌの塩酸を用いて溶液のｐＨ値が４．７５になるまで調節し、１‐エチル‐３‐（３‐ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（Aldrich，米国）１９．２ｇを加え、マグネチックスターラーで攪拌した。上記の溶液中に適量の０．１ｍｏｌ／Ｌの塩酸を断続的に添加して、溶液のｐＨ値を４．７５に維持した。１．０ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム溶液をｐＨ７．０になるまで加えて反応を終了させた。その後、ジチオスレイトール（Diagnostic Chemical Limited，米国）１００ｇおよび１．０ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム溶液適量を加えて攪拌した。溶液のｐＨ値を８．５に調整した。室温でマグネチックスターラーで攪拌し、２４時間反応させた。その後、上記の溶液中に１ｍｏｌ／Ｌの塩酸をｐＨが約３．５になるまで加えた。上記の溶液を透析管（カットオフ分子量3500，Sigma，米国）に装入し、大量の０．０００３ｍｏｌ／Ｌの塩酸と０．１ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム溶液を用いて、８時間ごとに透析液を交換しながら５日間透析した。その後さらに、大量の０．０００３ｍｏｌ／Ｌの塩酸溶液を用いて、８時間ごとに透析液を交換しながら３日間透析した。最後に、透析管内の溶液を収集し、凍結乾燥して白色綿状固体（ＨＡ−ＤＴＰＨ）が得られた。
【０１００】
上記のＨＡ−ＤＴＰＨを蒸留水中に溶解して１．０〜２．５％ ｗ／ｖ溶液を得て、溶液のｐＨ値を２．０〜７．０に調節し、ろ過して除菌した後、凍結保存（通常は零下２０℃以下）した。あるいは、上記の調製過程において、透析精製後の溶液を再度透析カラムに通して適切な濃度（通常は１．０〜２．５％ ｗ／ｖ）になるまで脱水濃縮し、溶液のｐＨ値を２．０〜７．０に調節し、ろ過滅菌した後、凍結保存（通常は零下２０℃以下）した。
【０１０１】
プロトン核磁気共鳴検査（１Ｈ‐ＮＭＲ）（溶剤はＤ２Ｏ）によれば、ＨＡ−ＤＴＰＨの側鎖チオール基の置換度は４２／１００二糖繰返し単位であった。分子量およびその分布（ＧＰＣにより測定）は、重量平均分子量が１３．６万、数平均分子量が６．１万であった。
【０１０２】
実施例２ チオール基反応性生体適合性架橋剤の調製
ポリエチレングリコールジアクリレート、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールジアクリルアミドおよびポリエチレングリコールジ（メタ）アクリルアミドを、対応するポリエチレングリコール（分子量３，４００または１０，０００，Sigma-Aldrich，米国）およびポリエチレングリコールジアミン（分子量３４００，Nektar Therapeutics，米国）により調製し、多分岐（四分岐または八分岐）のポリエチレングリコールアクリレートおよびポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレートを、対応する多分岐ポリエチレングリコール（分子量１０，０００）から調製した。調製の一般的な過程は、ポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコールジアミンを、トリエチルアミンの作用下でアクリロイルクロリドまたはメタアクリロイルクロリドと反応させ、精製し、反応物を得る。詳細な過程についてはShu et al， Biomaterials，25，1339，2004を参照。
【０１０３】
対応するアクリロイルクロリドに代えてハロアシルハライド（ヨードプロピオニルクロリド、ブロモプロピオニルクロリド等）を用いれば、上記と同様の過程を用いて、ポリエチレングリコールジヨードプロピオネート、ポリエチレングリコールジブロモプロピオネート、ポリエチレングリコールジクロロプロピオネート、ポリエチレングリコールジヨードプロピオンアミド、ポリエチレングリコールジブロモプロピオンアミド、ポリエチレングリコールジクロロプロピオンアミド等のチオール基反応性架橋剤を調製することができる。
【０１０４】
実施例３ 生体適合性高速ゲル化ハイドロゲルの調製
実施例１で調製したＨＡ−ＤＴＰＨ溶液（２．０％ ｗ／ｖ，ｐＨ５．０）を室温で解凍した。ポリエチレングリコールジアクリレート（分子量３４００，Nektar Therapeutics，米国）を０．３ｍｏｌ／Ｌのリン酸ナトリウム／炭酸ナトリウム緩衝液に溶解して２．０％ ｗ／ｖの溶液（ｐＨ９．６）を得て、ろ過滅菌した。マグネチックスターラーで攪拌しながら、上記の一方の溶液（５ｍｌ）を速やかに他方の溶液（５ｍｌ）に加え、３秒間攪拌し続けた後に停止した。反応性混合物のｐＨ値は約９．４であり、混合溶液は約１７秒後に流動性を失ってゲルを形成した。
【０１０５】
実施例４ 生体適合性高速ゲル化ハイドロゲルの調製
実施例１で調製したＨＡ−ＤＴＰＨ溶液（１．５％ ｗ／ｖ，ｐＨ６．０）を室温で解凍した。ポリエチレングリコールジアクリレート（分子量３４００，Nektar Therapeutics，米国）を０．１５ｍｏｌ／Ｌのリン酸ナトリウム／炭酸ナトリウム緩衝液に溶解して１．５％ ｗ／ｖの溶液（ｐＨ９．６）を得て、ろ過滅菌した。マグネチックスターラーで攪拌しながら、上記の一方の溶液（５ｍｌ）を速やかに他方の溶液（５ｍｌ）に加え、３秒間攪拌し続けた後に停止した。反応性混合物のｐＨ値は約９．３であり、混合溶液は約２７秒後に流動性を失ってゲルを形成した。
【０１０６】
実施例５ 生体適合性高速ゲル化ハイドロゲルの調製
実施例１で調製したＨＡ−ＤＴＰＨ溶液（１．５％ ｗ／ｖ，ｐＨ３．０）を室温で解凍した。ポリエチレングリコールジアクリレート（分子量３４００，Nektar Therapeutics，米国）を０．３ｍｏｌ／Ｌのホウ酸／水酸化ナトリウム緩衝液に溶解して１．５％ ｗ／ｖの溶液（ｐＨ１１．０）を得て、ろ過滅菌した。マグネチックスターラーで攪拌しながら、上記の一方の溶液（５ｍｌ）を速やかに他方の溶液（５ｍｌ）に加え、３秒間攪拌し続けた後に停止した。反応性混合物のｐＨ値は１０．５より大きく、混合溶液が流動性を失ってゲルを形成するまでの時間は１０秒未満であった。
【０１０７】
実施例６ 生体適合性高速ゲル化ハイドロゲルの調製
実施例１で調製したＨＡ−ＤＴＰＨ溶液（１．０％ ｗ／ｖ，ｐＨ５．０）を室温で解凍した。ポリエチレングリコールジビニルスルホン（分子量３４００，Nektar Therapeutics，米国）を０．３ｍｏｌ／Ｌのリン酸ナトリウム／炭酸ナトリウム緩衝液に溶解して１．０％ ｗ／ｖの溶液（ｐＨ９．６）を得て、ろ過滅菌した。マグネチックスターラーで攪拌しながら、上記の一方の溶液（５ｍｌ）を速やかに他方の溶液（５ｍｌ）に加え、３秒間攪拌し続けた後に停止した。反応性混合物のｐＨ値は約９．４であり、混合溶液は約４８秒後に流動性を失ってゲルを形成した。
【０１０８】
実施例７ 生体適合性高速ゲル化ハイドロゲルの調製
実施例１で調製したＨＡ−ＤＴＰＨ溶液（２．５％ ｗ／ｖ，ｐＨ５．０）を室温で解凍した。ポリエチレングリコールジビニルスルホン（分子量３４００，Nektar Therapeutics，米国）を０．３ｍｏｌ／Ｌのリン酸塩緩衝液に溶解して２．０％ ｗ／ｖの溶液（ｐＨ７．４）を得て、ろ過滅菌した。マグネチックスターラーで攪拌しながら、上記の一方の溶液（５ｍｌ）を速やかに他方の溶液（５ｍｌ）に加え、３秒間攪拌し続けた後に停止した。反応性混合物のｐＨ値は約７．２であり、混合溶液は約５分後に流動性を失ってゲルを形成した。
【０１０９】
実施例８ 生体適合性高速ゲル化ハイドロゲルの調製
実施例１で調製したＨＡ−ＤＴＰＨ溶液（２．０％ ｗ／ｖ，ｐＨ６．０）を室温で解凍した。ポリエチレングリコールジブロモプロピオネート（分子量３４００，Nektar Therapeutics，米国）を０．１５ｍｏｌ／Ｌのリン酸塩緩衝液に溶解して２．０％ ｗ／ｖの溶液（ｐＨ７．４）を得て、ろ過滅菌した。マグネチックスターラーで攪拌しながら、上記の一方の溶液（５ｍｌ）を速やかに他方の溶液（５ｍｌ）に加え、３秒間攪拌し続けた後に停止した。反応性混合物のｐＨ値は約７．２であり、混合溶液は約５分後に流動性を失ってゲルを形成した。
【０１１０】
実施例９ 生体適合性高速ゲル化ハイドロゲルの調製
実施例１で調製したＨＡ−ＤＴＰＨ溶液（２．０％ ｗ／ｖ，ｐＨ７．０）を室温で解凍した。ポリエチレングリコールジビニルスルホン（分子量３４００，Nektar Therapeutics，米国）を０．１５ｍｏｌ／Ｌのリン酸塩緩衝液に溶解して２．０％ ｗ／ｖの溶液（ｐＨ８．２）を得て、ろ過滅菌した。マグネチックスターラーで攪拌しながら、上記の一方の溶液（５ｍｌ）を速やかに他方の溶液（５ｍｌ）に加え、３秒間攪拌し続けた後に停止した。反応性混合物のｐＨ値は約８．０であり、混合溶液は約２分後に流動性を失ってゲルを形成した。
【０１１１】
実施例１０ 生体適合性高速ゲル化ハイドロゲルの調製
実施例１で調製したＨＡ−ＤＴＰＨ溶液（２．０％ ｗ／ｖ，ｐＨ５．０）を室温で解凍した。ポリエチレングリコールジアクリレート（分子量３４００，Nektar Therapeutics，米国）を０．０００５ｍｏｌ／Ｌのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解して８．０％ ｗ／ｖの溶液を得て、ろ過滅菌した。マグネチックスターラーで攪拌しながら、ポリエチレングリコールジアクリレート溶液（１ｍｌ）を速やかにＨＡ−ＤＴＰＨ溶液（４ｍｌ）に加えた。反応性混合物のｐＨ値は約５．４であった。その後、０．３ｍｏｌ／Ｌのリン酸ナトリウム／炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）５ｍｌを加え、３秒間攪拌し続けた後に停止した。反応性混合物のｐＨ値は約９．３であり、混合溶液は約２１秒後に流動性を失ってゲルを形成した。
【０１１２】
実施例１１ 生体適合性高速ゲル化ハイドロゲルの調製
実施例１で調製したＨＡ−ＤＴＰＨ溶液（２．０％ ｗ／ｖ，ｐＨ３．０）を室温で解凍した。ポリエチレングリコールジアクリレート（分子量３４００，Nektar Therapeutics，米国）を０．００１ｍｏｌ／Ｌの塩酸溶液に溶解して８．０％ ｗ／ｖの溶液を得て、ろ過滅菌した。マグネチックスターラーで攪拌しながら、ポリエチレングリコールジアクリレート溶液（１ｍｌ）を速やかにＨＡ−ＤＴＰＨ溶液（４ｍｌ）に加えた。反応性混合物のｐＨ値は約３．０であった。その後、マグネチックスターラーで攪拌しながら、０．１ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム溶液を適量加え、上記反応性混合物のｐＨ値を７．２に調節した。混合溶液は約６分後に流動性を失ってゲルを形成した。
【０１１３】
実施例１２ 生体適合性高速ゲル化ハイドロゲルの調製
実施例１で調製したＨＡ−ＤＴＰＨ溶液（２．０％ ｗ／ｖ，ｐＨ３．０）を室温で解凍した。ポリエチレングリコールジアクリレート（分子量３４００，Nektar Therapeutics，米国）を０．００１ｍｏｌ／Ｌの塩酸溶液に溶解して８．０％ ｗ／ｖの溶液を得て、ろ過滅菌した。マグネチックスターラーで攪拌しながら、ポリエチレングリコールジアクリレート溶液（１ｍｌ）を速やかにＨＡ−ＤＴＰＨ溶液（４ｍｌ）に加えた。反応性混合物のｐＨ値は約３．０であった。その後、マグネチックスターラーで攪拌しながら、０．１ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム溶液を適量加え、上記反応性混合物のｐＨ値を８．０に調節した。混合溶液は約２分後に流動性を失ってゲルを形成した。
【０１１４】
実施例１３ 生体適合性高速ゲル化ハイドロゲルの調製
実施例１で調製したＨＡ−ＤＴＰＨ溶液（２．０％ ｗ／ｖ，ｐＨ４．０）を室温で解凍した。実施例２で調製したポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート（分子量10,000）を０．０００１ｍｏｌ／Ｌの塩酸溶液に溶解して８．０％ ｗ／ｖの溶液を得て、ろ過滅菌した。マグネチックスターラーで攪拌しながら、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート溶液（１ｍｌ）を速やかにＨＡ−ＤＴＰＨ溶液（４ｍｌ）に加えた。反応性混合物のｐＨ値は約４．０であった。その後、マグネチックスターラーで攪拌しながら、０．１ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム溶液を適量加え、上記反応性混合物のｐＨ値を約１１．３に調節した。混合溶液は約３９秒後に流動性を失ってゲルを形成した。
【０１１５】
実施例１４ 生体適合性高速ゲル化ハイドロゲルの調製
実施例１で調製したＨＡ−ＤＴＰＨ溶液（１．５％ ｗ／ｖ，ｐＨ４．０）を室温で解凍した。その後、上記の溶液５ｍｌ中にポリエチレングリコールジアクリレート（分子量３４００，Nektar Therapeutics，米国）７５ｍｇを加え、手動で溶解して混合溶液を得た。マグネチックスターラーで攪拌しながら、０．３ｍｏｌ／Ｌのリン酸ナトリウム／炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）５ｍｌを上記の混合溶液に速やかに加え、３秒間攪拌し続けた後に停止した。反応性混合物のｐＨ値は約９．３であり、溶液は３７秒後に流動性を失ってゲルを形成した。
【０１１６】
実施例１５ 高速ゲル化ハイドロゲル噴霧剤の調製
実施例１で調製したＨＡ−ＤＴＰＨ溶液（１．５％ ｗ／ｖ，ｐＨ５．０）を室温で解凍した。ポリエチレングリコールジアクリレート（分子量３４００，Nektar Therapeutics，米国）を０．３ｍｏｌ／Ｌのリン酸ナトリウム／炭酸ナトリウム緩衝液に溶解して１．５％ ｗ／ｖの溶液（ｐＨ９．６）を得て、ろ過滅菌した。上記二種類の溶液をそれぞれ５ｍｌ取ってFibriJet気体補助式噴霧装置（型番：ＳＡ−６１１０，Micromedics, inc. 米国）に装入し、その後、１．５気圧の窒素の作用下で噴霧化し、垂直に立てたガラス板に塗布した。ガラス板に塗布された混合溶液はほとんど流れることなく、均一なゲル薄膜をガラス板表面に速やかに形成した。
【０１１７】
実施例１６ 高速ゲル化ハイドロゲル噴霧剤の調製
実施例１で調製したＨＡ−ＤＴＰＨ溶液（１．５％ ｗ／ｖ，ｐＨ４．０）を室温で解凍した。その後、上記の溶液５ｍｌ中にポリエチレングリコールジアクリレート（分子量３４００，Nektar Therapeutics，米国）７５ｍｇを加え、手動で溶解して混合溶液を得た。上記の混合溶液と０．３ｍｏｌ／Ｌの炭酸塩緩衝液（ｐＨ１０．５）を５ｍｌ取ってそれぞれFibriJet気体補助式噴霧装置（型番：ＳＡ−６１１０，Micromedics, inc. 米国）に装入し、その後、約３気圧の空気の作用下で噴霧化し、垂直に立てたガラス板に塗布した。ガラス板に塗布された混合溶液はほとんど流れることなく、均一なゲル薄膜をガラス板表面に速やかに形成した。
【０１１８】
実施例１７ 高速ゲル化ハイドロゲル噴霧剤の調製
実施例１で調製したＨＡ−ＤＴＰＨ溶液（１．５％ ｗ／ｖ，ｐＨ５．０）を室温で解凍した。ポリエチレングリコールジビニルスルホン（分子量３４００，Nektar Therapeutics，米国）を０．３ｍｏｌ／Ｌのリン酸ナトリウム／炭酸ナトリウム緩衝液に溶解して１．５％ ｗ／ｖの溶液（ｐＨ１０．０）を得て、ろ過滅菌した。上記二種類の溶液をそれぞれ５ｍｌ取ってFibriJet気体補助式噴霧装置（型番：ＳＡ−６１１０，Micromedics, inc. 米国）に装入し、その後、１．５気圧の窒素の作用下で噴霧化し、垂直に立てたガラス板に塗布した。ガラス板に塗布された混合溶液はほとんど流れることなく、均一なゲル薄膜をガラス板表面に速やかに形成した。
【０１１９】
実施例１８ 高速ゲル化ハイドロゲル噴霧剤の調製
実施例１で調製したＨＡ−ＤＴＰＨ溶液（１．５％ ｗ／ｖ，ｐＨ５．０）を室温で解凍した。実施例１で調製したポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート（分子量3,400）を０．３ｍｏｌ／Ｌのリン酸二水素ナトリウム／水酸化ナトリウム緩衝液に溶解して１．５％ ｗ／ｖの溶液（ｐＨ１２．０）を得て、ろ過滅菌した。上記二種類の溶液をそれぞれ５ｍｌ取ってFibriJet気体補助式噴霧装置（型番：ＳＡ−６１１０，Micromedics, inc. 米国）に装入し、その後、５気圧の窒素の作用下で噴霧化し、垂直に立てたガラス板に塗布した。ガラス板に塗布された混合溶液はほとんど流れることなく、均一なゲル薄膜をガラス板表面に速やかに形成した。
【０１２０】
実施例１９ 高速ゲル化ハイドロゲル噴霧剤の調製
実施例１で調製したＨＡ−ＤＴＰＨ溶液（２．５％ ｗ／ｖ，ｐＨ５．０）を室温で解凍した。実施例２で調製したポリエチレングリコールジアクリルアミド（分子量3,400）を０．３ｍｏｌ／Ｌのリン酸二水素ナトリウム／水酸化ナトリウム緩衝液に溶解して２．５％ ｗ／ｖの溶液（ｐＨ１２．０）を得て、ろ過滅菌した。上記二種類の溶液をそれぞれ５ｍｌ取ってFibriJet気体補助式噴霧装置（型番：ＳＡ−６１１０，Micromedics, inc. 米国）に装入し、その後、５気圧の窒素の作用下で噴霧化し、垂直に立てたガラス板に塗布した。ガラス板に塗布された混合溶液はほとんど流れることなく、均一なゲル薄膜をガラス板表面に速やかに形成した。
【０１２１】
実施例２０ ジコハク酸ジアシルシスタミノジヒドラジド（略称ＤＳＣＤＨ）の合成
シスタミノジヒドロクロリド塩（Aldrich，米国）１００ｇを１５００ｍｌの蒸留水に溶解し、清澄で透明な溶液を得た。上記の溶液中に、溶液のｐＨ値が１０になるまで４ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウムを加えた。その後、マグネチックスターラーで攪拌しながら、無水コハク酸（Aldrich，米国）１３３ｇを加えるとともに、４ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウムを断続的に添加して、溶液のｐＨ値を７〜１０に維持した。室温で２時間反応させた後、溶液中に６ｍｏｌ／Ｌの塩酸を加えた。白色沈殿産物をろ過して収集し、蒸留水２０００ｍｌを用いて２回洗浄した。その後、真空減圧乾燥し、白色固形物を得てジコハク酸ジアシルシスタミノジアシド（略称ＤＳＣ）約１５０ｇを合成した。収率は９０％を超えた。
【０１２２】
２５０ｍｌの三口フラスコ中にＤＳＣ１００ｇを加え、無水アルコール１２００ｍｌと濃塩酸１００滴を加えた。窒素保護下で２時間還流した後、２００ｍｌ未満になるまで減圧濃縮した。残余の溶液を２５００ｍｌの分液漏斗に移した後、酢酸エチル６００ｍｌを加えた。有機相を水５００ｍｌを用いて３回洗浄し、水相を除いて有機相を減圧蒸留して、白色蝋状の固形物であるジコハク酸ジアシルシスタミノジエチルエステル（略称ＤＳＣＤＥ）約９３ｇが得られた。収率は８０％を超えた。
【０１２３】
１５０ｍｌのビーカー中にＤＳＣＤＥ１０ｇとアルコール８０ｍｌを加えた。室温で攪拌して溶解後、さらに抱水ヒドラジン（Aldrich，米国）１０ｍｌを加え、一晩反応させた。白色沈殿産物をろ過して収集し、その後４０ｍｌのアルコールを用いて４回エリューションした。室温通風炉内で有機溶剤を揮発させた後、真空減圧乾燥させて、白色固形物のＤＳＣＤＨ約８ｇを得た。調製率は７５％を超えた。
【０１２４】
実施例２１ チオール化変性ヒアルロン酸（ＨＡ−ＤＳＣＤＨ）の調製
ヒアルロン酸ナトリウム（分子量６２万〜１１５万，NovaMatrix FMC BIOPOLYMER，米国）１０ｇを蒸留水２０００ｍｌ中に溶解し、清澄で透明な溶液を得た。上記の溶液中に実施例２０で調製したＤＳＣＤＨ９．５ｇを加え、攪拌して溶解した。そして、１ｍｏｌ／Ｌの塩酸を用いて溶液のｐＨ値が４．７５になるまで調節し、１‐エチル‐３‐（３‐ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（Aldrich，米国）２．８８ｇを加え、マグネチックスターラーで攪拌した。上記の溶液に適量の０．１ｍｏｌ／Ｌの塩酸を断続的に添加して、溶液のｐＨ値を４．７５に維持した。溶液の粘度は増加し続け、１０分間前後でゲルを形成した。ゲルの形成後、室温で静置して２時間反応させた。その後、ジチオスレイトール（Diagnostic Chemical Limited，米国）１００ｇおよび1ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム溶液少量を加えて攪拌した。ゲルを徐々に溶解させるとともに、１ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム溶液を断続的に添加して溶液のｐＨ値を８．５に維持した。ゲルが全て溶解した後、室温でマグネチックスターラーで攪拌して２４時間反応させた。その後、上記の溶液中に６ｍｏｌ／Ｌの塩酸をｐＨが約３．０になるまで加えた。上記の溶液を透析管（カットオフ分子量3500，Sigma，米国）に装入し、２０Ｌの０．００１ｍｏｌ／Ｌの塩酸と０．３ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム溶液を用いて、８時間ごとに透析液を交換しながら５日間透析した。その後さらに、２０Ｌの０．００１ｍｏｌ／Ｌの塩酸溶液を用いて、８時間ごとに透析液を交換しながら３日間透析した。最後に、透析管内の溶液を透析カラムに通して所定の濃度（０．８〜１．５％ ｗ／ｖ）になるまで脱水濃縮し、溶液のｐＨ値を３．０〜８．５に調節し、ろ過滅菌した後、凍結保存（通常は零下２０℃以下）した。
【０１２５】
ShuらがBiomacromolecules，3，1304，2002において報告した、改良Ellman法を用いてＨＡ−ＤＳＣＤＨの活性チオール基含有量を測定したところ、３９．１チオール基／１００ヒアルロン酸二糖繰返し単位であり、プロトン核磁気共鳴検査の結果と基本的に適合した。
【０１２６】
実施例２２ 高速ゲル化ハイドロゲルの調製
実施例２１で調製したＨＡ−ＤＳＣＤＨ溶液（０．８％ ｗ／ｖ，ｐＨ値は４．０）を室温で解凍した。実施例２で調製した四分岐ポリエチレングリコールアクリレート（平均３．６個のアクリレート官能基／四分岐ポリエチレングリコール分子，分子量１０，０００）を０．３ｍｏｌ／Ｌのリン酸ナトリウム／炭酸ナトリウム緩衝液に溶解して１．０％ ｗ／ｖの溶液（ｐＨ９．６）を得て、ろ過滅菌した。マグネチックスターラーで攪拌しながら、ＨＡ−ＤＳＣＤＨ溶液５ｍｌを速やかに四分岐ポリエチレングリコールアクリレート溶液５ｍｌに加え、３秒間攪拌し続けた後に停止した。反応性混合物のｐＨ値は約９．３であり、反応性混合溶液は約４７秒後に流動性を失ってゲルを形成した。
【０１２７】
実施例２３ 高速ゲル化ハイドロゲルの調製
実施例２１で調製したＨＡ−ＤＳＣＤＨ溶液（０．５％ ｗ／ｖ，ｐＨ値は７．０）を室温で解凍した。実施例２で調製した四分岐ポリエチレングリコールアクリレート（平均３．６個のアクリレート官能基／四分岐ポリエチレングリコール分子，分子量１０，０００）を０．３ｍｏｌ／Ｌのリン酸二水素ナトリウム／水酸化ナトリウム緩衝溶液に溶解して０．８％ ｗ／ｖの溶液（ｐＨ１２．０）を得て、ろ過滅菌した。マグネチックスターラーで攪拌しながら、ＨＡ−ＤＳＣＤＨ溶液５ｍｌを速やかに四分岐ポリエチレングリコールアクリレート溶液５ｍｌに加え、３秒間攪拌し続けた後に停止した。反応性混合物のｐＨ値は約１２．０であり、反応性混合溶液は約17秒後に流動性を失ってゲルを形成した。
【０１２８】
実施例２４ 高速ゲル化ハイドロゲルの調製
実施例２１で調製したＨＡ−ＤＳＣＤＨ溶液（１．２％ ｗ／ｖ，ｐＨ値は３．５）を室温で解凍した。実施例２で調製した四分岐ポリエチレングリコールアクリレート（平均３．６個のアクリレート官能基／四分岐ポリエチレングリコール分子，分子量１０，０００）を０．１５ｍｏｌ／Ｌのリン酸塩／炭酸塩緩衝溶液に溶解して１．２％ ｗ／ｖの溶液（ｐＨ９．６）を得て、ろ過滅菌した。マグネチックスターラーで攪拌しながら、ＨＡ−ＤＳＣＤＨ溶液５ｍｌを速やかに四分岐ポリエチレングリコールアクリレート溶液５ｍｌに加え、３秒間攪拌し続けた後に停止した。反応性混合物のｐＨ値は約９．２であり、反応性混合溶液は約２９秒後に流動性を失ってゲルを形成した。
【０１２９】
実施例２５ 高速ゲル化ハイドロゲルの調製
実施例２１で調製したＨＡ−ＤＳＣＤＨ溶液（１．２％ ｗ／ｖ，ｐＨ値は７．０）を室温で解凍した。実施例２で調製した四分岐ポリエチレングリコールアクリレート（平均３．６個のアクリレート官能基／四分岐ポリエチレングリコール分子，分子量１０，０００）を０．３０ｍｏｌ／Ｌの炭酸塩緩衝溶液に溶解して０．５％ ｗ／ｖの溶液（ｐＨ８．５）を得て、ろ過滅菌した。マグネチックスターラーで攪拌しながら、ＨＡ−ＤＳＣＤＨ溶液５ｍｌを速やかに四分岐ポリエチレングリコールアクリレート溶液５ｍｌに加え、３秒間攪拌し続けた後に停止した。反応性混合物のｐＨ値は約８．５であり、反応性混合溶液は約３分後に流動性を失ってゲルを形成した。
【０１３０】
実施例２６ 高速ゲル化ハイドロゲルの調製
実施例２１で調製したＨＡ−ＤＳＣＤＨ溶液（１．２％ ｗ／ｖ，ｐＨ値は７．０）を室温で解凍した。実施例２で調製した四分岐ポリエチレングリコールアクリレート（平均３．６個のアクリレート官能基／四分岐ポリエチレングリコール分子，分子量１０，０００）を０．３０ｍｏｌ／Ｌのリン酸塩緩衝溶液に溶解して１．２％ ｗ／ｖの溶液（ｐＨ８．０）を得て、ろ過滅菌した。マグネチックスターラーで攪拌しながら、ＨＡ−ＤＳＣＤＨ溶液５ｍｌを速やかに四分岐ポリエチレングリコールアクリレート溶液５ｍｌに加え、３秒間攪拌し続けた後に停止した。反応性混合物のｐＨ値は約８．０であり、反応性混合溶液は約４分後に流動性を失ってゲルを形成した。
【０１３１】
実施例２７ 高速ゲル化ハイドロゲルの調製
実施例２１で調製したＨＡ−ＤＳＣＤＨ溶液（１．２％ ｗ／ｖ，ｐＨ値は２．５）を室温で解凍した。実施例２で調製した四分岐ポリエチレングリコールアクリレート（平均３．６個のアクリレート官能基／四分岐ポリエチレングリコール分子，分子量１０，０００）を０．３ｍｏｌ／Ｌのリン酸塩／炭酸塩緩衝溶液に溶解して１．０％ ｗ／ｖの溶液（ｐＨ９．６）を得て、ろ過滅菌した。マグネチックスターラーで攪拌しながら、ＨＡ−ＤＳＣＤＨ溶液５ｍｌを速やかに四分岐ポリエチレングリコールアクリレート溶液５ｍｌに加え、３秒間攪拌し続けた後に停止した。反応性混合物のｐＨ値は約９．２であり、反応性混合溶液は約３２秒後に流動性を失ってゲルを形成した。
【０１３２】
実施例２８ 高速ゲル化ハイドロゲルの調製
実施例２１で調製したＨＡ−ＤＳＣＤＨ溶液（１．２％ ｗ／ｖ，ｐＨ値は２．５）を室温で解凍した。実施例２で調製した四分岐ポリエチレングリコールアクリレート（平均３．６個のアクリレート官能基／四分岐ポリエチレングリコール分子，分子量１０，０００）をｐＨ２．５の塩酸溶液に溶解して１．０％ ｗ／ｖの溶液を得て、ろ過滅菌した。マグネチックスターラーで攪拌しながら、ＨＡ−ＤＳＣＤＨ溶液５ｍｌを速やかに四分岐ポリエチレングリコールアクリレート溶液５ｍｌに加えた。反応性混合物のｐＨ値は約２．５であった。マグネチックスターラーで攪拌しながら、０．１ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム溶液を適量加え、反応性混合物のｐＨ値を１０．５に調節した。反応性混合溶液は速やかに流動性を失ってゲルを形成した（１０秒未満）。
【０１３３】
実施例２９ 高速ゲル化ハイドロゲルの調製
実施例２１で調製したＨＡ−ＤＳＣＤＨ溶液（１．２％ ｗ／ｖ，ｐＨ値は３．５）を室温で解凍した。実施例２で調製した四分岐ポリエチレングリコールアクリレート（平均３．６個のアクリレート官能基／四分岐ポリエチレングリコール分子，分子量１０，０００）をｐＨ３．５の塩酸溶液に溶解して１．０％ ｗ／ｖの溶液を得て、ろ過滅菌した。マグネチックスターラーで攪拌しながら、ＨＡ−ＤＳＣＤＨ溶液５ｍｌを速やかに四分岐ポリエチレングリコールアクリレート溶液５ｍｌに加えた。反応性混合物のｐＨ値は約３．５であった。マグネチックスターラーで攪拌しながら、０．３ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム溶液を適量加え、反応性混合物のｐＨ値を1２に調節した。反応性混合溶液は数秒以内に即座に流動性を失ってゲルを形成した。
【０１３４】
実施例３０ 高速ゲル化ハイドロゲル噴霧剤の調製
実施例２１で調製したＨＡ−ＤＳＣＤＨ溶液（１．０％ ｗ／ｖ，ｐＨ値は８．０）を室温で解凍した。実施例２で調製した四分岐ポリエチレングリコールアクリレート（平均３．６個のアクリレート官能基／四分岐ポリエチレングリコール分子，分子量１０，０００）を０．３ｍｏｌ／Ｌの炭酸塩緩衝液に溶解して１．０％ ｗ／ｖの溶液（ｐＨ１０．５）を得て、ろ過滅菌した。ＨＡ−ＤＳＣＤＨ溶液および四分岐ポリエチレングリコールアクリレート溶液をそれぞれ５ｍｌ取ってFibriJet気体補助式噴霧装置（型番：ＳＡ−６１１０，Micromedics, inc. 米国）に装入し、その後、４気圧の窒素の作用下で噴霧化し、垂直に立てたガラス板に塗布した。ガラス板に塗布された混合溶液はほとんど流れることなく、均一なゲル薄膜をガラス板表面に速やかに形成した。
【０１３５】
実施例３１ チオール化変性コンドロイチン硫酸（ＣＳ−ＤＳＣＤＨ）の合成および特性解析
コンドロイチン硫酸（ｃ型，サメ軟骨由来，Sigma, 米国）１ｇを蒸留水１００ｍｌ中に溶解し、清澄で透明な溶液を得た。上記の溶液中に実施例２０で調製したＤＳＣＤＨ０．７０４ｇを加え、攪拌して溶解した。そして、０．１ｍｏｌ／Ｌの塩酸を用いて溶液のｐＨ値が４．７５になるまで調節し、１‐エチル‐３‐（３‐ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（Aldrich，米国）０．１９２ｇを加え、マグネチックスターラーで攪拌した。上記の溶液中に適量の０．１ｍｏｌ／Ｌの塩酸を断続的に添加して、溶液のｐＨ値を４．７５に保ち、室温でマグネチックスターラーで攪拌して２時間反応させた。その後、ジチオスレイトール（Diagnostic Chemical Limited，米国）１０ｇおよび０．１ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム溶液少量を加えて攪拌した。ゲルを徐々に溶解させるとともに、０．１ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム溶液を断続的に添加して溶液のｐＨ値を８．５に維持した。ゲルが全て溶解した後、室温でマグネチックスターラーで攪拌して２４時間反応させた。その後、上記の溶液中に６ｍｏｌ／Ｌの塩酸をｐＨが約３．０になるまで加えた。上記の溶液を透析管（カットオフ分子量3500，Sigma，米国）に装入し、１０Ｌの０．００１ｍｏｌ／Ｌの塩酸と０．３ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム溶液を用いて、８時間ごとに透析液を交換しながら５日間透析した。その後さらに、１０Ｌの０．００１ｍｏｌ／Ｌの塩酸溶液を用いて、８時間ごとに透析液を交換しながら３日間透析した。最後に、透析管内の溶液を透析カラムに通して所定の濃度（３．０〜６．０％ ｗ／ｖ）になるまで脱水濃縮し、溶液のｐＨ値を３．０〜８．５に調節し、ろ過滅菌した後、凍結保存（通常は零下２０℃以下）した。
【０１３６】
コンドロイチン硫酸のアセチル基の特性であるメチル吸収ピークを内標準とし、吸収ピークの面積から算出した、合成されたＣＳ−ＤＧＤＴＰＤＨの側鎖置換度は４７％であった。
【０１３７】
ＧＰＣを用いて分子量およびその分布を測定したところ、重量平均分子量は３．８万、数平均分子量は１．７万、分子量分布は２．２３であった。
【０１３８】
ShuらがBiomacromolecules，3，1304，2002において報告した、改良Ellman法を用いてＣＳ−ＤＳＣＤＨの活性チオール基含有量を測定したところ、４４．２チオール基／１００コンドロイチン硫酸二糖繰返し単位であった。
【０１３９】
実施例３２ 高速ゲル化ハイドロゲルの調製
実施例３１で調製したＣＳ−ＤＳＣＤＨ溶液（６．０％ ｗ／ｖ，ｐＨ５．０）の室温の溶液を準備した。実施例２で調製した四分岐ポリエチレングリコールアクリレート（平均３．６個のアクリレート官能基／四分岐ポリエチレングリコール分子，分子量１０，０００）を０．３ｍｏｌ／Ｌの炭酸塩緩衝液に溶解して６．０％ ｗ／ｖの溶液（ｐＨ１０．５）を得て、ろ過滅菌した。マグネチックスターラーで攪拌しながら、上記の一方の溶液（５ｍｌ）を速やかに他方の溶液（５ｍｌ）に加え、３秒間攪拌し続けた後に停止した。反応性混合溶液は１０秒以内に流動性を失ってゲルを形成した。
【０１４０】
実施例３３ 高速ゲル化ハイドロゲルの調製
実施例３１で調製したＣＳ−ＤＳＣＤＨ溶液（３．０％ ｗ／ｖ，ｐＨ７．０）の室温の溶液を準備した。実施例２で調製した四分岐ポリエチレングリコールアクリレート（平均３．６個のアクリレート官能基／四分岐ポリエチレングリコール分子，分子量１０，０００）を０．００５ｍｏｌ／Ｌのリン酸塩緩衝液に溶解して３．０％ ｗ／ｖの溶液（ｐＨ７．０）を得て、ろ過滅菌した。マグネチックスターラーで攪拌しながら、上記の一方の溶液（５ｍｌ）を速やかに他方の溶液（５ｍｌ）に加えた。反応性混合物のｐＨ値は７．０であった。マグネチックスターラーで攪拌しながら、０．３ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム溶液を適量加え、反応性混合物のｐＨ値を1０．５に調節した。反応性混合溶液は即座に流動性を失ってゲルを形成した（１０秒未満）。
【０１４１】
実施例３４ 高速ゲル化ハイドロゲルの調製
実施例３１で調製したＣＳ−ＤＳＣＤＨ溶液（３．０％ ｗ／ｖ，ｐＨ４．０）の室温の溶液を準備した。実施例２で調製した四分岐ポリエチレングリコールアクリレート（平均３．６個のアクリレート官能基／四分岐ポリエチレングリコール分子，分子量１０，０００）を０．３ｍｏｌ／Ｌのホウ酸／水酸化ナトリウム緩衝液に溶解して３．０％ ｗ／ｖの溶液（ｐＨ１１．０）を得て、ろ過滅菌した。マグネチックスターラーで攪拌しながら、ＣＳ−ＤＳＣＤＨ溶液のｐＨ値をアルカリを用いて８．５に調節した後、速やかに四分岐ポリエチレングリコールアクリレート溶液（５ｍｌ）に加えた。反応性混合物のｐＨ値は約１１．０であり、反応性混合溶液は即座に流動性を失ってゲルを形成した。
【０１４２】
実施例３５ 高速ゲル化ハイドロゲル噴霧剤の調製
実施例３１で調製したＣＳ−ＤＳＣＤＨ溶液（４．０％ ｗ／ｖ，ｐＨ８．０）の室温の溶液を準備した。実施例２で調製した四分岐ポリエチレングリコールアクリレート（平均３．６個のアクリレート官能基／四分岐ポリエチレングリコール分子，分子量１０，０００）を０．３ｍｏｌ／Ｌの炭酸塩緩衝液に溶解して４．０％ ｗ／ｖの溶液（ｐＨ１０．５）を得て、ろ過滅菌した。上記二種類の溶液をそれぞれ５ｍｌ取ってFibriJet気体補助式噴霧装置（型番：ＳＡ−６１１０，Micromedics, inc. 米国）に装入し、その後、２気圧の窒素の作用下で噴霧化し、垂直に立てたガラス板に塗布した。ガラス板に塗布された混合溶液はほとんど流れることなく、均一なゲル薄膜をガラス板表面に速やかに形成した。
【０１４３】
実施例３６ チオール化変性ゼラチンの調製
（１）ゼラチンのスクシニルカルボキシル化変性
ゼラチン（B型，ブタ皮由来，Sigma, 米国）１ｇを蒸留水１００ｍｌ中（約３０℃）に溶解し、清澄で透明な溶液を得た。１．０ｍｏｌ／Lの水酸化ナトリウム溶液を用いて、溶液のｐＨ値を約９．５に調節し、その後、マグネチックスターラーで攪拌しながら無水コハク酸（分析級）を０．０５ｇ加え、適量の１．０ｍｏｌ／Lの水酸化ナトリウム溶液を断続的に添加して、溶液のｐＨ値を弱アルカリ性（通常は８．０〜９．５）に保持した。約３０℃で攪拌して１時間反応させた。その後、上記の溶液を透析管（カットオフ分子量3500，Fisher，米国）に装入し、蒸留水を用いて、８時間ごとに透析液を交換しながら透析した。透析は、液体クロマトグラフィー（GPC）（純水を移動相とし、紫外線波長２１０ｎｍにおける吸収に基づく検出）により、溶出液のスペクトルに小分子不純物のピークが示されなくなるまで行った。最後に、透析管内の溶液を収集し、凍結乾燥して白色綿状固体（スクシニルカルボキシル化ゼラチン）約０．７ｇが得られた。
【０１４４】
（２）スクシニルカルボキシル化ゼラチンのチオール化変性
上記のスクシニルカルボキシル化ゼラチン０．５ｇを取り、蒸留水５０ｍｌ中に溶解した（約３０℃）。上記の溶液中にジチオジプロピオン酸ヒドラジド（ShuらがBiomacromolecules，3，1304，2002において開示した方法により調製）１．２ｇを加え、攪拌して溶解した。そして、０．１ｍｏｌ／Ｌの塩酸を用いて溶液のｐＨ値が４．７５になるまで調節し、１‐エチル‐３‐（３‐ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（Aldrich，米国）０．７５ｇを加え、マグネチックスターラーで攪拌した。上記の溶液に適量の０．１ｍｏｌ／Ｌの塩酸を断続的に添加して、溶液のｐＨ値を４．７５に維持した。マグネチックスターラーで攪拌して２時間反応させた後、ジチオスレイトール（Diagnostic Chemical Limited，米国）５ｇおよび０．１ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム溶液を加えて攪拌し、溶液のｐＨ値を８．５に調節した。その後、室温でマグネチックスターラーで攪拌して２４時間反応させた後、上記の溶液中に６ｍｏｌ／Ｌの塩酸をｐＨ値が約３．０になるまで加えた。上記の溶液を透析管（カットオフ分子量3500，Sigma，米国）に装入し、１０Ｌの０．００１ｍｏｌ／Ｌの塩酸と０．３ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム溶液を用いて、８時間ごとに透析液を交換しながら５日間透析した。その後、１０Ｌの０．００１ｍｏｌ／Ｌの塩酸溶液を用いて、８時間ごとに透析液を交換しながら３日間透析した。透析は、GPC（純水を移動相とし、紫外線波長２１０ｎｍにおける吸収に基づく検出）により、溶出液のスペクトルに小分子不純物のピークが示されなくなるまで行った。最後に、透析管内の溶液を収集し、凍結乾燥して白色綿状固体約０．３３ｇが得られた。上記の生成物を蒸留水中に溶解して３．０〜５．０％ ｗ／ｖ溶液を得て、溶液のｐＨ値を２．０〜７．０に調節し、ろ過滅菌した後、凍結保存（通常は零下２０℃以下）した。
【０１４５】
２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（TNBS）試薬を用いてスクシニルカルボキシル化ゼラチンの側鎖アミノ基を測定したところ、約４５％のアミノ基がスクシニルカルボキシル化変性されていた。
【０１４６】
ShuらがBiomacromolecules，3，1304，2002において報告した、改良Ellman法を用いてスクシニルカルボキシル化およびチオール化ゼラチン多重変性誘導体の活性チオール基含有量を測定したところ、０．８７ｍｍｏｌチオール基／gであった。
【０１４７】
実施例３７ 高速ゲル化ハイドロゲルの調製
実施例３６で調製したチオール化変性ゼラチン溶液（５．０％ ｗ／ｖ，ｐＨ値７．０）を準備した。実施例２で調製した四分岐ポリエチレングリコールアクリレート（平均３．６個のアクリレート官能基／四分岐ポリエチレングリコール分子，分子量１０，０００）を０．３ｍｏｌ／Ｌのホウ酸／水酸化ナトリウム緩衝液に溶解して４．０％ ｗ／ｖの溶液（ｐＨ１１．０）を得た。マグネチックスターラーで攪拌しながら、上記の一方の溶液（５ｍｌ）を速やかに他方の溶液（５ｍｌ）に加え、３秒間攪拌し続けた後に停止した。反応性混合溶液は１２秒以内に流動性を失ってゲルを形成した。
【０１４８】
実施例３８ 高速ゲル化ハイドロゲル噴霧剤の術後癒着防止への応用
Dunnらにより報告されたラット盲腸モデル（Dunn et al，Fertility & Sterility，75，411，2001）を用いた。その過程の概要は以下の通りである。１２匹のラットの盲腸の側面および腹側面を、無菌ガーゼを用いて表面が出血するまでかき取り、対応する腹壁１×２ｃｍの面積を、表面が出血するまでメスでかき取った。実施例１５で調製した高速ゲル化ハイドロゲル噴霧剤を６匹のラットの傷口および腹腔全体に塗布し、最後にラットの体表の傷口を縫合した。二週間後にラットを絶命させ、解剖して癒着の状況を観察した。各ラットのハイドロゲル使用量は約１．５ｍｌであり、残余の未治療ラット６匹を対照グループとした。二週間後にラットを解剖した結果、対照グループのラットはすべて緊密な癒着を形成していたのに対し、治療グループではいかなる癒着も認められなかった。
【産業上の利用可能性】
【０１４９】
本発明の生体適合性高速ゲル化ハイドロゲルの調製方法の有益な効果としては、生体適合性が良好であり、副生成物または有毒副作用のある副生成物を生成せず、使用される各成分の安定性が良好であり、用量が少なく、低コストであり、使用上便利で高速ゲル化を実現しやすく、高速ゲル化噴霧剤の調製を実現しやすく、様々な医学的用途に適合する、等の多くの長所がある。Wallaceらによって開示された方法（特許文献１）と比較して、本発明には副生成物または有毒副作用のある副生成物を生成せず、生体適合性がより良好であり、架橋化学結合がより安定しており、使用される活性成分の安定性がより良好であり、活性成分の使用量がより少なく、より低コストである、等の多くの長所がある。
【０１５０】
本発明の生体適合性高速ゲル化ハイドロゲルの調製方法の有益な効果には、さらに、工業的大量生産が容易であるということが含まれる。前述の通り、本発明に用いられる成分Ａ中の生体適合性チオール化変性高分子は、強アルカリ性の条件下では非常に不安定である。従って、本発明に用いられる生体適合性チオール化変性高分子の溶液は、強アルカリ性の場合には活性を失いやすく、工業的大量生産には適さない。本発明においては、生体適合性チオール化変性高分子を含む成分ＡのｐＨ値は８．５未満であり、通常は弱酸性であって、安定性が良好であり、工業的大量生産時の滅菌、充填、包装、保存等の多くの工程を簡便に完了できる。また、本発明に用いられる成分Ａは、生体適合性チオール化変性高分子調製の精製工程後に、凍結乾燥の必要がなく、直接次の工程に進むか、濃縮または希釈して所定の濃度にした後に次の工程に進む。このように、凍結乾燥という時間や労力を要する煩瑣な工程を回避している。
【０１５１】
本発明の生体適合性高速ゲル化ハイドロゲル噴霧剤の調製方法は、前述の本発明の高速ゲル化ハイドロゲルの調製方法の長所を有するとともに、簡便で、使用しやすく、術後の癒着合併症の治療のような様々な医学的用途に適用される、という長所がある。また、気体補助式霧化噴霧剤の調製方法は、さらに、噴霧化条件下の混合を用いており、ノズルが詰まることなく複数回使用することが可能である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）成分Ａと成分Ｂとを相互に混合して、特定の架橋条件を有する反応性混合物を調製するステップと、
（２）前記反応性混合物を反応させてハイドロゲルを形成するステップと、を含み、
成分Ａは生体適合性高分子チオール化誘導体を含む溶液であり、成分Ｂは生体適合性チオール基反応性架橋剤であり、成分Ｂは固体または溶液であり、
前記生体適合性高分子チオール化誘導体は、生体適合性高分子をチオール化変性することにより調製され、
成分Ａの濃度は８％ ｗ／ｖ未満、成分ＡのｐＨ値は８．５未満であり、
成分Ａ中のチオール基と成分Ｂ中のチオール基反応性官能基は化学架橋反応を生じ、
前記反応性混合物中の生体適合性高分子チオール化誘導体と生体適合性チオール基反応性架橋剤の濃度の和は６％ ｗ／ｖ未満であり、
前記特定の架橋条件とは、前記反応性混合物溶液のｐＨ値が７．０より大きいことか、またはｐＨ値が７．０以下であることであり、
前記反応性混合物のｐＨ値が７．０より大きい場合には、成分ＢのｐＨ値は成分ＡのｐＨ値より大きい、生体適合性高速ゲル化ハイドロゲルの調製方法。
【請求項２】
前記生体適合性高分子チオール化誘導体は、少なくとも三つのチオール基を含み、分子量は１，０００〜１０，０００，０００である、請求項１に記載の生体適合性高速ゲル化ハイドロゲルの調製方法。
【請求項３】
前記生体適合性高分子には、多糖類、またはそれらの塩もしくは変性体；タンパク質、またはそれらの変性体；または、合成高分子、またはそれらの塩もしくは変性体が含まれる、請求項１に記載の生体適合性高速ゲル化ハイドロゲルの調製方法。
【請求項４】
前記多糖類、またはそれらの塩もしくは変性体には、コンドロイチン硫酸、ヘパリン、ヘパラン、アルギン酸、ヒアルロン酸、デルマタン、デルマタン硫酸、ペクチン、カルボキシメチルセルロース、キトサン、または、それらのナトリウム塩、カリウム塩、カルボキシメチル変性体もしくは疎水化変性体が含まれ、
前記タンパク質またはそれらの変性体には、アルカリ性ゼラチンタンパク質、酸性ゼラチンタンパク質、アルカリ性遺伝子組換えゼラチンタンパク質、酸性遺伝子組換えゼラチンタンパク質、または、それらのアミノ基のカルボキシル変性体もしくは疎水化変性体が含まれ、
前記合成高分子、またはそれらの塩もしくは変性体には、ポリアクリル酸、ポリアスパラギン酸、ポリ酒石酸、ポリグルタミン酸、ポリフマル酸、または、それらのナトリウム塩、カリウム塩、カルボキシメチル変性体もしくは疎水化変体が含まれる、請求項３に記載の生体適合性高速ゲル化ハイドロゲルの調製方法。
【請求項５】
前記チオール化変性は、生体適合性高分子の側鎖カルボキシル基を、カルボジイミドの活性下で、ジスルフィド結合を含むジアミンまたはジヒドラジドと反応させて中間産物を生成するステップと、
前記ジスルフィド結合をチオール基に還元して、生体適合性高分子チオール化誘導体を得るステップとを含む化学反応工程を含む、請求項１に記載の生体適合性高速ゲル化ハイドロゲルの調製方法。
【請求項６】
前記生体適合性高分子には、ヒアルロン酸、カルボキシメチルヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、アルカリ性および酸性ゼラチンタンパク質、アルカリ性および酸性遺伝子組換えゼラチンタンパク質、ポリアスパラギン酸、または、ポリグルタミン酸が含まれ、
前記カルボジイミドは１‐エチル‐３‐（３‐ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩であり、
前記ジスルフィド結合を含むジアミンまたはジヒドラジドには、シスタミン、システィンジメチルエステル、システィンジエチルエステル、ジチオジフェニルアミン、ジチオジプロピルジヒドラジド、ジチオジブチルジヒドラジド、ジチオジプロピオン酸ジアシルアラニンジヒドラジド、ジチオジプロピオン酸ジアシル（ヒドロキシ）アミノ酢酸ジヒドラジド、ジチオジプロピオン酸ジアシルアミノプロピオン酸ジヒドラジド、ジチオジプロピオン酸ジアシルアミノブチル酸ジヒドラジド、ジチオジブチル酸ジアシルグリシンジヒドラジド、ジチオジブチル酸ジアシルアミノプロピオン酸ジヒドラジド、ジマロン酸ジアシルシスタミノジヒドラジド、ジコハク酸ジアシルシスタミノジヒドラジド、ジ（メチル）コハク酸ジアシルシスタミノジヒドラジド、ジグルタミン酸ジアシルシスタミノジヒドラジド、ジヘキシル酸ジアシルシスタミノジヒドラジド、または、ジヘプチル酸ジアシルシスタミノジヒドラジドが含まれる、請求項５に記載の生体適合性高速ゲル化ハイドロゲルの調製方法。
【請求項７】
前記チオール化変性は、前記生体適合性高分子の側鎖アミノ基を化学反応により直接チオール基に変性するステップ含む、請求項１に記載の生体適合性高速ゲル化ハイドロゲルの調製方法。
【請求項８】
前記成分Ａの濃度は０．５〜５．０％ ｗ／ｖであり、ｐＨ値は２．５〜７．０である、請求項１に記載の生体適合性高速ゲル化ハイドロゲルの調製方法。
【請求項９】
前記成分Ａの濃度は０．８〜３．０％ ｗ／ｖであり、ｐＨ値は３．５〜６．０である、請求項８に記載の生体適合性高速ゲル化ハイドロゲルの調製方法。
【請求項１０】
前記生体適合性チオール基反応性架橋剤は、少なくとも二つの同じまたは異なるチオール基反応性官能基を含む、二分岐、三分岐またはさらに多分岐のポリエチレングリコール誘導体であり、
前記ポリエチレングリコール誘導体の分子量は１００〜１，０００，０００であり、
前記チオール基反応性官能基は、マレイミド、ビニルスルホン、α，β不飽和アクリレート、α，β不飽和メタクリレート、α，β不飽和アクリルアミド、α，β不飽和メタクリルアミド、ヨードプロピオネート、ブロモプロピオネート、クロロプロピオネート、ヨードプロピオンアミド、ブロモプロピオンアミド、クロロプロピオンアミドである、請求項１に記載の生体適合性高速ゲル化ハイドロゲルの調製方法。
【請求項１１】
前記成分Ａおよび成分Ｂは、異なる濃度のｐＨ値緩衝物質または他の極性及び親水性の物質を含む、請求項１に記載の生体適合性高速ゲル化ハイドロゲルの調製方法。
【請求項１２】
前記反応性混合物のｐＨ値が７．０より大きい場合には、成分Ｂの濃度は０．５〜８．０％ ｗ／ｖであり、ｐＨ値は８．０〜１２．０である、請求項１に記載の生体適合性高速ゲル化ハイドロゲルの調製方法。
【請求項１３】
前記成分Ｂの濃度は０．８〜４．０％ ｗ／ｖであり、ｐＨ値は８．５〜１０．５である、請求項１２に記載の生体適合性高速ゲル化ハイドロゲルの調製方法。
【請求項１４】
前記化学架橋反応は、チオール基とチオール基反応性官能基との間での、求核付加反応および求核置換反応である、請求項１に記載の生体適合性高速ゲル化ハイドロゲルの調製方法。
【請求項１５】
前記反応性混合物のｐＨ値が７．０より大きい場合には、成分Ｂは生体適合性チオール基反応性架橋剤を含む溶液である、請求項１に記載の生体適合性高速ゲル化ハイドロゲルの調製方法。
【請求項１６】
前記反応性混合物のｐＨ値が７．０より大きく、成分ＡのｐＨ値が７．０より大きくかつ８．５未満の場合には、成分Ｂは生体適合性チオール基反応性架橋剤を含む溶液であって、ｐＨ値が８．５以上である、請求項１５に記載の生体適合性高速ゲル化ハイドロゲルの調製方法。
【請求項１７】
前記反応性混合物のｐＨ値が７．０より大きく、成分ＡのｐＨ値が７．０以下である場合には、成分Ｂは生体適合性チオール基反応性架橋剤を含む溶液であって、成分ＢのｐＨ値は成分ＡのｐＨ値より大きい、請求項１５に記載の生体適合性高速ゲル化ハイドロゲルの調製方法。
【請求項１８】
前記反応性混合物のｐＨ値が７．０より大きく、成分ＡのｐＨ値が７．０以下である場合には、成分Ｂは生体適合性チオール基反応性架橋剤を含む溶液であって、成分ＢのｐＨ値は８．５以上である、請求項１７に記載の生体適合性高速ゲル化ハイドロゲルの調製方法。
【請求項１９】
前記反応性混合物のｐＨ値は８．０〜１２．０であり、成分Ｂは生体適合性チオール基反応性架橋剤を含む溶液であって、ｐＨ値は８．５〜１２．０である、請求項１５に記載の生体適合性高速ゲル化ハイドロゲルの調製方法。
【請求項２０】
前記反応性混合物のｐＨ値は８．５〜１０．５である、請求項１９に記載の生体適合性高速ゲル化ハイドロゲルの調製方法。
【請求項２１】
前記反応性混合物のｐＨ値が７．０より大きい場合には、前記反応性混合物のｐＨ値は、前記成分Ａおよび成分Ｂの混合時に決定されるか、あるいは、酸又はアルカリ溶液を、混合前に成分Ａおよび成分Ｂ中に加えるか、混合後又は混合中の反応性混合物中に加えることにより調節することにより決定される、請求項１に記載の生体適合性高速ゲル化ハイドロゲルの調製方法。
【請求項２２】
前記反応性混合物により形成されるハイドロゲルは、１分間以内にハイドロゲルを形成する、請求項１に記載の生体適合性高速ゲル化ハイドロゲルの調製方法。
【請求項２３】
前記反応性混合物のｐＨ値が７．０以下の場合には、成分Ｂは生体適合性架橋剤の溶液または固体であり、
この場合、ステップ（１）とステップ（２）との間に、前記反応性混合物中にアルカリまたはアルカリ性緩衝溶液を加えて溶液のｐＨ値を特定のアルカリ性の範囲に調節するステップをさらに含む、請求項１に記載の生体適合性高速ゲル化ハイドロゲルの調製方法。
【請求項２４】
前記反応性混合物溶液のｐＨ値は２．５〜６．０の間である、請求項２３に記載の生体適合性高速ゲル化ハイドロゲルの調製方法。
【請求項２５】
前記反応性混合物溶液のｐＨ値は３．５〜５．０の間である、請求項２４に記載の生体適合性高速ゲル化ハイドロゲルの調製方法。
【請求項２６】
前記特定のアルカリ性の範囲はｐＨ値が８．０〜１２．０の間である、請求項２３に記載の生体適合性高速ゲル化ハイドロゲルの調製方法。
【請求項２７】
前記特定のアルカリ性の範囲はｐＨ値が８．５〜１０．５の間である、請求項２６に記載の生体適合性高速ゲル化ハイドロゲルの調製方法。
【請求項２８】
前記アルカリまたはアルカリ性緩衝溶液には、水酸化ナトリウム溶液、水酸化カリウム溶液、炭酸ナトリウム溶液、リン酸ナトリウム溶液、または、それらのアルカリ性緩衝溶液が含まれる、請求項２３に記載の生体適合性高速ゲル化ハイドロゲルの調製方法。
【請求項２９】
請求項１５に記載の成分Ａおよび成分Ｂを、複数成分混合反応噴霧装置のシリンジＡおよびシリンジＢにそれぞれ装入し、その後４ウェイアプリケータにより押し出し、１〜１０気圧の空気またはその他の気体の作用下で噴霧化、混合し、物体表面に塗布した後にゲルを形成するステップ、あるいは、
請求項２３に記載の成分Ａおよび成分Ｂを混合して形成された安定した反応性混合物を、複数成分混合反応噴霧装置の一つのシリンジに装入し、アルカリまたはアルカリ性緩衝溶液を第二のシリンジに装入し、その後４ウェイアプリケータにより両者を押し出し、１〜１０気圧の空気またはその他の気体の作用下で噴霧化、混合し、物体表面に塗布した後にゲルを形成するステップを含む、生体適合性高速ゲル化ハイドロゲル噴霧剤の調製方法。
【請求項１】
（１）成分Ａと成分Ｂとを相互に混合して、特定の架橋条件を有する反応性混合物を調製するステップと、
（２）前記反応性混合物を反応させてハイドロゲルを形成するステップと、を含み、
成分Ａは生体適合性高分子チオール化誘導体を含む溶液であり、成分Ｂは生体適合性チオール基反応性架橋剤であり、成分Ｂは固体または溶液であり、
前記生体適合性高分子チオール化誘導体は、生体適合性高分子をチオール化変性することにより調製され、
成分Ａの濃度は８％ ｗ／ｖ未満、成分ＡのｐＨ値は８．５未満であり、
成分Ａ中のチオール基と成分Ｂ中のチオール基反応性官能基は化学架橋反応を生じ、
前記反応性混合物中の生体適合性高分子チオール化誘導体と生体適合性チオール基反応性架橋剤の濃度の和は６％ ｗ／ｖ未満であり、
前記特定の架橋条件とは、前記反応性混合物溶液のｐＨ値が７．０より大きいことか、またはｐＨ値が７．０以下であることであり、
前記反応性混合物のｐＨ値が７．０より大きい場合には、成分ＢのｐＨ値は成分ＡのｐＨ値より大きい、生体適合性高速ゲル化ハイドロゲルの調製方法。
【請求項２】
前記生体適合性高分子チオール化誘導体は、少なくとも三つのチオール基を含み、分子量は１，０００〜１０，０００，０００である、請求項１に記載の生体適合性高速ゲル化ハイドロゲルの調製方法。
【請求項３】
前記生体適合性高分子には、多糖類、またはそれらの塩もしくは変性体；タンパク質、またはそれらの変性体；または、合成高分子、またはそれらの塩もしくは変性体が含まれる、請求項１に記載の生体適合性高速ゲル化ハイドロゲルの調製方法。
【請求項４】
前記多糖類、またはそれらの塩もしくは変性体には、コンドロイチン硫酸、ヘパリン、ヘパラン、アルギン酸、ヒアルロン酸、デルマタン、デルマタン硫酸、ペクチン、カルボキシメチルセルロース、キトサン、または、それらのナトリウム塩、カリウム塩、カルボキシメチル変性体もしくは疎水化変性体が含まれ、
前記タンパク質またはそれらの変性体には、アルカリ性ゼラチンタンパク質、酸性ゼラチンタンパク質、アルカリ性遺伝子組換えゼラチンタンパク質、酸性遺伝子組換えゼラチンタンパク質、または、それらのアミノ基のカルボキシル変性体もしくは疎水化変性体が含まれ、
前記合成高分子、またはそれらの塩もしくは変性体には、ポリアクリル酸、ポリアスパラギン酸、ポリ酒石酸、ポリグルタミン酸、ポリフマル酸、または、それらのナトリウム塩、カリウム塩、カルボキシメチル変性体もしくは疎水化変体が含まれる、請求項３に記載の生体適合性高速ゲル化ハイドロゲルの調製方法。
【請求項５】
前記チオール化変性は、生体適合性高分子の側鎖カルボキシル基を、カルボジイミドの活性下で、ジスルフィド結合を含むジアミンまたはジヒドラジドと反応させて中間産物を生成するステップと、
前記ジスルフィド結合をチオール基に還元して、生体適合性高分子チオール化誘導体を得るステップとを含む化学反応工程を含む、請求項１に記載の生体適合性高速ゲル化ハイドロゲルの調製方法。
【請求項６】
前記生体適合性高分子には、ヒアルロン酸、カルボキシメチルヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、アルカリ性および酸性ゼラチンタンパク質、アルカリ性および酸性遺伝子組換えゼラチンタンパク質、ポリアスパラギン酸、または、ポリグルタミン酸が含まれ、
前記カルボジイミドは１‐エチル‐３‐（３‐ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩であり、
前記ジスルフィド結合を含むジアミンまたはジヒドラジドには、シスタミン、システィンジメチルエステル、システィンジエチルエステル、ジチオジフェニルアミン、ジチオジプロピルジヒドラジド、ジチオジブチルジヒドラジド、ジチオジプロピオン酸ジアシルアラニンジヒドラジド、ジチオジプロピオン酸ジアシル（ヒドロキシ）アミノ酢酸ジヒドラジド、ジチオジプロピオン酸ジアシルアミノプロピオン酸ジヒドラジド、ジチオジプロピオン酸ジアシルアミノブチル酸ジヒドラジド、ジチオジブチル酸ジアシルグリシンジヒドラジド、ジチオジブチル酸ジアシルアミノプロピオン酸ジヒドラジド、ジマロン酸ジアシルシスタミノジヒドラジド、ジコハク酸ジアシルシスタミノジヒドラジド、ジ（メチル）コハク酸ジアシルシスタミノジヒドラジド、ジグルタミン酸ジアシルシスタミノジヒドラジド、ジヘキシル酸ジアシルシスタミノジヒドラジド、または、ジヘプチル酸ジアシルシスタミノジヒドラジドが含まれる、請求項５に記載の生体適合性高速ゲル化ハイドロゲルの調製方法。
【請求項７】
前記チオール化変性は、前記生体適合性高分子の側鎖アミノ基を化学反応により直接チオール基に変性するステップ含む、請求項１に記載の生体適合性高速ゲル化ハイドロゲルの調製方法。
【請求項８】
前記成分Ａの濃度は０．５〜５．０％ ｗ／ｖであり、ｐＨ値は２．５〜７．０である、請求項１に記載の生体適合性高速ゲル化ハイドロゲルの調製方法。
【請求項９】
前記成分Ａの濃度は０．８〜３．０％ ｗ／ｖであり、ｐＨ値は３．５〜６．０である、請求項８に記載の生体適合性高速ゲル化ハイドロゲルの調製方法。
【請求項１０】
前記生体適合性チオール基反応性架橋剤は、少なくとも二つの同じまたは異なるチオール基反応性官能基を含む、二分岐、三分岐またはさらに多分岐のポリエチレングリコール誘導体であり、
前記ポリエチレングリコール誘導体の分子量は１００〜１，０００，０００であり、
前記チオール基反応性官能基は、マレイミド、ビニルスルホン、α，β不飽和アクリレート、α，β不飽和メタクリレート、α，β不飽和アクリルアミド、α，β不飽和メタクリルアミド、ヨードプロピオネート、ブロモプロピオネート、クロロプロピオネート、ヨードプロピオンアミド、ブロモプロピオンアミド、クロロプロピオンアミドである、請求項１に記載の生体適合性高速ゲル化ハイドロゲルの調製方法。
【請求項１１】
前記成分Ａおよび成分Ｂは、異なる濃度のｐＨ値緩衝物質または他の極性及び親水性の物質を含む、請求項１に記載の生体適合性高速ゲル化ハイドロゲルの調製方法。
【請求項１２】
前記反応性混合物のｐＨ値が７．０より大きい場合には、成分Ｂの濃度は０．５〜８．０％ ｗ／ｖであり、ｐＨ値は８．０〜１２．０である、請求項１に記載の生体適合性高速ゲル化ハイドロゲルの調製方法。
【請求項１３】
前記成分Ｂの濃度は０．８〜４．０％ ｗ／ｖであり、ｐＨ値は８．５〜１０．５である、請求項１２に記載の生体適合性高速ゲル化ハイドロゲルの調製方法。
【請求項１４】
前記化学架橋反応は、チオール基とチオール基反応性官能基との間での、求核付加反応および求核置換反応である、請求項１に記載の生体適合性高速ゲル化ハイドロゲルの調製方法。
【請求項１５】
前記反応性混合物のｐＨ値が７．０より大きい場合には、成分Ｂは生体適合性チオール基反応性架橋剤を含む溶液である、請求項１に記載の生体適合性高速ゲル化ハイドロゲルの調製方法。
【請求項１６】
前記反応性混合物のｐＨ値が７．０より大きく、成分ＡのｐＨ値が７．０より大きくかつ８．５未満の場合には、成分Ｂは生体適合性チオール基反応性架橋剤を含む溶液であって、ｐＨ値が８．５以上である、請求項１５に記載の生体適合性高速ゲル化ハイドロゲルの調製方法。
【請求項１７】
前記反応性混合物のｐＨ値が７．０より大きく、成分ＡのｐＨ値が７．０以下である場合には、成分Ｂは生体適合性チオール基反応性架橋剤を含む溶液であって、成分ＢのｐＨ値は成分ＡのｐＨ値より大きい、請求項１５に記載の生体適合性高速ゲル化ハイドロゲルの調製方法。
【請求項１８】
前記反応性混合物のｐＨ値が７．０より大きく、成分ＡのｐＨ値が７．０以下である場合には、成分Ｂは生体適合性チオール基反応性架橋剤を含む溶液であって、成分ＢのｐＨ値は８．５以上である、請求項１７に記載の生体適合性高速ゲル化ハイドロゲルの調製方法。
【請求項１９】
前記反応性混合物のｐＨ値は８．０〜１２．０であり、成分Ｂは生体適合性チオール基反応性架橋剤を含む溶液であって、ｐＨ値は８．５〜１２．０である、請求項１５に記載の生体適合性高速ゲル化ハイドロゲルの調製方法。
【請求項２０】
前記反応性混合物のｐＨ値は８．５〜１０．５である、請求項１９に記載の生体適合性高速ゲル化ハイドロゲルの調製方法。
【請求項２１】
前記反応性混合物のｐＨ値が７．０より大きい場合には、前記反応性混合物のｐＨ値は、前記成分Ａおよび成分Ｂの混合時に決定されるか、あるいは、酸又はアルカリ溶液を、混合前に成分Ａおよび成分Ｂ中に加えるか、混合後又は混合中の反応性混合物中に加えることにより調節することにより決定される、請求項１に記載の生体適合性高速ゲル化ハイドロゲルの調製方法。
【請求項２２】
前記反応性混合物により形成されるハイドロゲルは、１分間以内にハイドロゲルを形成する、請求項１に記載の生体適合性高速ゲル化ハイドロゲルの調製方法。
【請求項２３】
前記反応性混合物のｐＨ値が７．０以下の場合には、成分Ｂは生体適合性架橋剤の溶液または固体であり、
この場合、ステップ（１）とステップ（２）との間に、前記反応性混合物中にアルカリまたはアルカリ性緩衝溶液を加えて溶液のｐＨ値を特定のアルカリ性の範囲に調節するステップをさらに含む、請求項１に記載の生体適合性高速ゲル化ハイドロゲルの調製方法。
【請求項２４】
前記反応性混合物溶液のｐＨ値は２．５〜６．０の間である、請求項２３に記載の生体適合性高速ゲル化ハイドロゲルの調製方法。
【請求項２５】
前記反応性混合物溶液のｐＨ値は３．５〜５．０の間である、請求項２４に記載の生体適合性高速ゲル化ハイドロゲルの調製方法。
【請求項２６】
前記特定のアルカリ性の範囲はｐＨ値が８．０〜１２．０の間である、請求項２３に記載の生体適合性高速ゲル化ハイドロゲルの調製方法。
【請求項２７】
前記特定のアルカリ性の範囲はｐＨ値が８．５〜１０．５の間である、請求項２６に記載の生体適合性高速ゲル化ハイドロゲルの調製方法。
【請求項２８】
前記アルカリまたはアルカリ性緩衝溶液には、水酸化ナトリウム溶液、水酸化カリウム溶液、炭酸ナトリウム溶液、リン酸ナトリウム溶液、または、それらのアルカリ性緩衝溶液が含まれる、請求項２３に記載の生体適合性高速ゲル化ハイドロゲルの調製方法。
【請求項２９】
請求項１５に記載の成分Ａおよび成分Ｂを、複数成分混合反応噴霧装置のシリンジＡおよびシリンジＢにそれぞれ装入し、その後４ウェイアプリケータにより押し出し、１〜１０気圧の空気またはその他の気体の作用下で噴霧化、混合し、物体表面に塗布した後にゲルを形成するステップ、あるいは、
請求項２３に記載の成分Ａおよび成分Ｂを混合して形成された安定した反応性混合物を、複数成分混合反応噴霧装置の一つのシリンジに装入し、アルカリまたはアルカリ性緩衝溶液を第二のシリンジに装入し、その後４ウェイアプリケータにより両者を押し出し、１〜１０気圧の空気またはその他の気体の作用下で噴霧化、混合し、物体表面に塗布した後にゲルを形成するステップを含む、生体適合性高速ゲル化ハイドロゲル噴霧剤の調製方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公表番号】特表２０１０−５３２３９６（Ｐ２０１０−５３２３９６Ａ）
【公表日】平成２２年１０月７日（２０１０．１０．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５１３６１８（Ｐ２０１０−５１３６１８）
【出願日】平成２０年６月１０日（２００８．６．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＮ２００８／００１１２０
【国際公開番号】ＷＯ２００９／００６７８０
【国際公開日】平成２１年１月１５日（２００９．１．１５）
【出願人】（５０９１６４００５）常州百瑞吉生物医▲薬▼有限公司 (3)
【氏名又は名称原語表記】ＢＩＯＲＥＧＥＮ ＢＩＯＭＥＤＩＣＡＬ （ＣＨＡＮＧＺＨＯＵ） ＣＯ．， ＬＴＤ．
【住所又は居所原語表記】Ｎｏ． １６５ Ｅａｓｔ Ｅａｓｔ Ｒｄ．， Ｃｈａｎｇｚｈｏｕ， Ｊｉａｎｇｓｕ ２１３０２５ ＣＨＩＮＡ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年１０月７日（２０１０．１０．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年６月１０日（２００８．６．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＮ２００８／００１１２０
【国際公開番号】ＷＯ２００９／００６７８０
【国際公開日】平成２１年１月１５日（２００９．１．１５）
【出願人】（５０９１６４００５）常州百瑞吉生物医▲薬▼有限公司 (3)
【氏名又は名称原語表記】ＢＩＯＲＥＧＥＮ ＢＩＯＭＥＤＩＣＡＬ （ＣＨＡＮＧＺＨＯＵ） ＣＯ．， ＬＴＤ．
【住所又は居所原語表記】Ｎｏ． １６５ Ｅａｓｔ Ｅａｓｔ Ｒｄ．， Ｃｈａｎｇｚｈｏｕ， Ｊｉａｎｇｓｕ ２１３０２５ ＣＨＩＮＡ
【Ｆターム（参考）】
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