生物活性組成物をミトコンドリアへ標的化導入することにより、有機組織に作用する方法、該方法を行うための医薬組成物、及びそのために用いられる化合物
本発明は、生物学および医学に関し、特に、ミトコンドリアへ生物活性物質を標的化導入するための医薬組成物を調製するのに医学において有用とすることができ、かかる導入はプロトン電気化学ポテンシャルにより行われる。また、本発明は、ミトコンドリアへ生物活性物質を標的化導入することにより、有機組織に作用する方法に関する。該方法は、ミトコンドリアの通常の作用ではない病気又は疾患、特に、フリーラジカル及び活性酸素種の増大した産生に伴う病気の処置に有用とすることができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学および医学に関し、特に、ミトコンドリアへ生物活性物質を標的化導入するための医薬組成物を調製するのに医学において有用であり、かかる導入は、プロトン電気化学ポテンシャルにより行われる。また、本発明は、有機組織に作用する方法に関し、該方法は、必要とされる生物活性物質をミトコンドリアへ導入することを有する。
【発明の背景】
【０００２】
ミトコンドリアは、多くの重大な細胞内プロセス、例えば、細胞におけるエネルギー代謝（ミトコンドリアの主な機能は、細胞にエネルギーを提供することであるから）、ある物質（例えば、脂肪酸）の代謝などにおいて重要な役割を果たす。ミトコンドリアはまた、フリーラジカル（ＦＲ）および活性酸素種（ＲＯＳ）（生きている細胞における多くのプロセスに影響を及ぼし得る非常に反応性の高い部分）の形成および利用に直接関与する。最後に、最近、ミトコンドリアはプログラム化された細胞死のプロセスにおいて重要な役割を果たすことが証明された。
【０００３】
多くの疾患は、ミトコンドリアの機能障害に関連することが知られている。このカテゴリーには、ＦＲおよびＲＯＳの増大した形成、組織または器官内の細胞の単独または集団死、プログラム化された細胞死メカニズム（アポトーシス）における異常、脂肪酸代謝における異常などに関連する全ての障害が含まれる。
【０００４】
ミトコンドリアに対して作用することにより、細胞および全有機組織の生命活動の最も多様な態様に影響を及ぼすことが可能であるという仮説が立てられる。
本発明の構成内において、これらの小器官における様々な生物活性物質を標的化導入し且つ蓄積することによって、生きている細胞におけるミトコンドリアに対して作用するための新規技術が提案されている。
【０００５】
この方法は、明らかな利点を提供する。物質を標的化導入することにより、その適用の有効性が増大し、全体的な投与量が減少し（細胞の標的区画内部に物質が繰り返し蓄積するために物質の有効濃度が達成されるため）、副作用の可能性および強度を減少させることができる。
【０００６】
ミトコンドリア自体の構造機構は、ターゲティングについてのまたとない機会を提供し、機能するミトコンドリアは、そのマトリックスから細胞質中へプロトンを活発に排出する。このプロセスは、ミトコンドリアの内膜上に水素イオンの非常に高い電気化学ポテンシャル（プロトンポテンシャル）を形成する。
【０００７】
生体エネルギー研究の結果、プロトンポテンシャルに依存した方法で、ミトコンドリア膜を貫通しミトコンドリア内部に活発に蓄積することができる多くの化合物が見いだされている。これらの物質は、「スクラチェフ（Skulachev）イオン」（Green D.E., "The electromechanochemical model for energy coupling in mitochondria", 1974, Biochem. Biophys. Acta., 346: 27-780）と命名された。かかるイオンは通常、顕著な生物活性を示さない。本発明の主な考えは、スクラチェフイオン以外に、たとえば、ミトコンドリア中へ送達されるべき別の望ましい物質（本発明においては、エフェクタ（effector）部分、またはエフェクタと称する）を含む新規化合物を形成するためにスクラチェフイオンを使用することにある。
【０００８】
非常に限定された数のミトコンドリア標的化生物活性物質しか現在のところ知られていない。いくつかの関連する物質が、US6,331,532およびEP 1 047 701（ミトキノール（ＭｉｔｏＱ）、ミトビタミンＥ（ＭｉｔｏＶｉｔＥ））およびEP 1 534 720（トリフェニルホスホニウムと結合したスーパーオキシド・ジスムダーゼおよびグルタチオン・ペルオキシダーゼ模倣物）に記載されている。これらの化合物のいくつかおよびその活性は、以下に記載される論文において検討されている。
【０００９】
スーパーオキシド・ジスムダーゼおよびグルタチオン・ペルオキシダーゼ模倣物を含む化合物は、EP 1 534 720において、酸化的ストレスなどが原因の疾患を処置するために適した、ミトコンドリア標的化抗酸化物質として権利請求されている。この発明を例示する実験例において、EP 1 534 720のデータは、これらの模倣物のミトコンドリアへの浸透能ならびに溶液中および単離されたミトコンドリアとの相互作用におけるその抗酸化作用について、提示されている。これらの化合物の細胞または有機組織全体に対する作用についてのデータは提示されていない。しかし、同時に、タンパク質のスルフヒドリル基に関して望ましい模倣物の高い反応性についてのデータがある。かかる反応性は、Filipovska A., Kelso G.F., Brown S.E., Beer S.M., Smith R.A., Murphy M.P., J Biol. Chem. 2005, 280(25): 24113-26により示されるように、スーパーオキシド・ジスムダーゼまたはグルタチオン・ペルオキシダーゼ（エブセレン）の模倣物を含有するミトコンドリア標的化抗酸化物質の有効性を急速に減少させ、適用の可能性を著しく限定するはずである。この研究は、ミトコンドリア−ターゲティング部分と共有結合したエブセレン（全化合物はミトエブセレンと称する）が従来のエブセレンと同じ抗酸化効果を有することを証明した。換言すると、ミトエブセレンタイプの化合物のターゲティングは、これがその抗酸化作用を向上させるとしても、この利点は、ミトエブセレンの望ましくない副作用により減少する。
【００１０】
別のミトコンドリア標的化抗酸化物質はＭｉｔｏＶｉｔＥ、すなわちターゲティング部分としてトリフェニルホスホニウム、および抗酸化物質としてビタミンＥを含む化合物である。この発明の明細書において、EP 1 047 701のデータは、ラット脳ホモジネートにおけるこの化合物の抗酸化活性、及びＭｉｔｏＶｉｔＥの、培養物中の単離ミトコンドリアおよび生きている細胞への浸透能について、提示している。最高１０μＭまでの濃度において、ＭｉｔｏＶｉｔＥは、培養物における細胞の生存能力に影響を及ぼさず、その間、ＭｉｔｏＶｉｔＥのさらなる増加は、細胞の生存性の減少につながることも示されている。しかしながら、ＭｉｔｏＶｉｔＥの個々の細胞、組織、器官または有機組織全体に対する抗酸化活性は証明されなかった。ＭｉｔｏｖｉｔＥの培養物中の細胞に対する効果は、刊行物Jauslin M.L., Meier T., Smith R.A., Murphy M.P., FASEB J. 2003 17(13): 1972-4において記載されている。この論文から、ＭｉｔｏＶｉｔＥがプログラム化された細胞死を防止する能力は、アンカプラーＦＣＣＰ（3-フルオロメチル−カルボニルシアニドフェニルヒドラゾン）にもかかわらず、すなわち、目的とされるＭｉｔｏｖｉｔＥのミトコンドリアにおける蓄積が可能でない状況下で、消滅しないということになる。これらのデータは、ＭｉｔｏＶｉｔＥのミトコンドリアターゲティングが起こる場合でさえも、かかるターゲティングがこの化合物の生物学的作用において決定的役割を果たさないことを示す。
【００１１】
ミトコンドリア標的化抗酸化物質ＭｉｔｏＱおよびその変異体（ＭｉｔｏＱ５、ＭｉｔｏＱ３）は、Ｃ−１０リンカー（適宜、Ｃ５、Ｃ３）によりトリフェニルホスホニウムと結合したユビキノン（還元された形態におけるユビキノール）を有する。この発明US6,331,532号の明細書において、ＭｉｔｏＱは、酸化的ストレスと関連する疾患の処置または予防を目的とする組成物における活性化合物として権利請求されている。この発明の明細書において提示される実験において、溶液におけるＭｉｔｏＱの抗酸化特性、この化合物の単離ミトコンドリアへの浸透能、単離ミトコンドリアの呼吸効率に対する影響が示されている。しかしながら、生きている細胞、組織、有機組織全体の器官、毒性の存在または不在に対するＭｉｔｏＱの効果についてのデータはこの文書においては提示されていない。
【００１２】
ＭｉｔｏＱ活性に対するさらなるデータは、同じ発明者らのWO2005/019233号（この中で、発明者らは、単離ミトコンドリアに対する脂質過酸化反応を防止するためのＭｉｔｏＱの能力を示している）において見出すことができ、さらにAdlam V.J., Harrison J.C., Porteous C.M., James A.M., Smith R.A., Murphy M.P., Sammut I.A., 2005, FASEB J. 19: 1088-95による刊行物においても見出すことができる。この論文において、著者らは、ＭｉｔｏＱを給餌されたラットの実験と、それに続くラゲンドルフ（Lagendorff）システム（ラゲンドルフ（Lagendorff）潅流心臓調製物）を用いたラットの心臓機能の研究において有機組織に対するＭｉｔｏＱの作用の現在のところ公知である唯一の例を提示した。報告されたデータは、ＭｉｔｏＱを虚血性心筋障害の予防または処置のために使用できるという概念を間接的に裏付ける。しかしながら、この研究のいくつかの不正確で異論のある点のために、かかる記載事項を納得できるように証明することができない。このように、著者らにより使用されるモデル（３０分の正常温度の虚血と、それに続く潅流）は、心筋の虚血性障害を研究するためにしばしば使用されるモデルである。しかしながら、この方法の主な欠点は、潅流中の単離された心臓の電気的不安定性である。ある数の心臓は、周期的または不変細動のためにその機能を全く回復することができず、周期的不整脈はこのような一連のほとんどすべての実験において起こることが知られている。記載された論文において、細動も不整脈も指摘されていない。したがって、著者により得られる平均値が実験の全群または不整脈があまりはっきりしないこれらの実験のみを特性化するかどうかははっきりしないままである。その上、上記理由を考慮して、各実験群における動物の数（６）は所与のモデルについて明らかに十分でないことは明らかである。
【００１３】
上記論文の著者により得られたデータは正しくないという仮定は、必然的に心筋細胞の死が続いて起こる潅流条件下でのコントロールおよび実験シリーズの両方における収縮機能の有意な増加のかなり奇妙な観察により部分的に立証される。収縮機能の計算が、「スイッチオフされた」不安定なものを排除した活動的な心臓のみを用いて行われるならば、この結果を得ることができ、一方、潅流の速度は全ての心臓を用いて計算された。このような方法は明らかに不正確である。ＭｉｔｏＱ処置群における任意の潅流期間についての平均データはコントロール調製物で処置された群においてよりも高いが、これらの群を互いに比較し、従ってこれらの差の有意性は明らかでない。
【００１４】
従って、ＭｉｔｏＱが唯一の心臓保護化合物であるという著者らによりなされた主な結論は、十分な説得力はないようである。このような見解は、ミトコンドリアの超微細構造の調査の結果が無いこと、乳酸デヒドロゲナーゼ、シトクロムＣ、カスパーゼ３、コンプレックス１の生成およびコントロール物質で処置された群におけるミトコンドリア中のアコニターゼの作用により裏付けられる。
【００１５】
全体として、上記開示の詳細な分析により、得られた結果の選択および分析の段階で非常に弱い点が明らかになる。上記論文の著者らは、用いたモデルの対処に関する経験が豊富でない可能性がある。したがって、ＭｉｔｏＱの心臓保護作用が立証されていないままであると断言することができる。
【００１６】
ＭｉｔｏＱの細胞培養物に対する作用に関する非常に有望な結果にもかかわらず、この化合物の実際の適用の可能性を疑ういくつかの観察および計算があることに注目すべきである。例えば、ＭｉｔｏＱが培地中約１μＭの濃度でその抗酸化および抗アポトーシス効果をもたらすことが、細胞培養物に関する実験において示された。現在のところ、これらの条件下で、ミトコンドリア中のＭｉｔｏＱ濃度は１ｍＭに達し得ることが証明されたと考えられる。一方、Smith R.A., Porteous C.M., Gane A.M., Murphy M.P., Proc Natl Acad Sci USA, 2003, 100(9): 5407-12により、ＭｉｔｏＱが実験動物に給餌される場合、ＭｉｔｏＱの最も酸化的ストレス感受性の高い組織（脳および心筋）における蓄積は、合計で、生体重１グラムあたり１００ピコモルの最大濃度になることが示された。計算により、ミトコンドリアで最大飽和された組織（心筋）中のこのようなＭｉｔｏＱ濃度に関して、ミトコンドリア内部のＭｉｔｏＱ濃度は１００ナノモルを超えないことが示される。これは、細胞培養実験において有効であることが証明された濃度よりも１０００倍以上低い。実験動物に投与される用量を少なくとも１０倍増加させることは、調製物の毒性のためにできない。
【００１７】
従って、当分野の現状は、１種類のみのミトコンドリア標的化化合物、ミトコンドリア標的化抗酸化物質として権利主張される物質を開示する。データには他のミトコンドリア標的化生物活性化化合物は記載されていない。ミトコンドリア標的化抗酸化物質として権利主張される、すでに開示された物質は、その生物活性が非常に不十分に記載され、権利主張される目的についてのその実用化の見込みは不明確であるので、課された問題を解決しないことに注目すべきである。加えて、開示された化合物の大部分について、その効率の悪さはすでに証明されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
本発明は、水素イオンおよびスクラチェフイオンの電気化学ポテンシャルのエネルギーの使用による、生きた細胞のミトコンドリア中の生物活性物質の濃度の原則に基づく。このような方法は、意外にも、用いられる生物活性物質の用量の数倍の減少、つまり最も重要な細胞内プロセスにおける重要な要素である、目的とされるミトコンドリアに対する有効な作用を達成することを可能にする。このように、望ましくない副作用の可能性および強度の何倍もの減少の機会が提供される。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
したがって、本発明の一つの態様は、水素イオンの電気化学ポテンシャルのエネルギーを犠牲にして、生物活性物質をミトコンドリアへ標的化導入することにより、有機組織に対して作用する方法を提供することにある。
【００２０】
本発明の他の態様は、細胞のミトコンドリアへ生物活性物質を標的化導入するための組成物を提供することにあり、該組成物は、化合物全体をミトコンドリア中へ導入するためのターゲティング部分、リンカー基、およびエフェクタ（必要とされる生物活性を有する物質）からなる化合物を含有する。全体として、かかる化合物は、下記一般式で表すことができる。
【００２１】
【化１】
【００２２】
式中、Ａは、以下のａ）〜ｅ）を有するエフェクタ基（effector group）である。
ａ）抗酸化物質（ＩＩ）および／またはその還元体。
【００２３】
【化２】
【００２４】
式中、ｍは１〜３の整数であり、各Ｙは、低級アルキル、低級アルコキシからなる同じか又は異なる置換基を表すか、または隣接する２つのＹは連結して下記構造および／またはその還元体を形成する。
【００２５】
【化３】
【００２６】
式中、Ｒ１およびＲ２は同じか又は異なる置換基であり、それぞれは独立して、低級アルキルまたは低級アルコキシである。
ｂ）酸化促進物質（pro-oxidant）；
ｃ）アポトーシス誘導物質；
ｄ）ミトコンドリア局在の抗アポトーシスタンパク質の阻害物質；
ｅ）光増感剤。
本発明のこの態様において、
抗酸化物質は、ＦＲおよびＲＯＳと反応することができ、その危険な性質を中和する化合物である。そのラジカル形態における前記抗酸化物質は、ミトコンドリアの呼吸鎖と反応することができ、かくして、その後のＦＲまたはＲＯＳとの反応のためにその抗酸化特性を回復することができることが好ましい。構造（ＩＩ）に対応する好ましい抗酸化物質は、２，３−ジメチル−１，４−ベンゾキノール（プラストキノールの残基、つまり、プロトプラストのチラコイドから得られる最も強力な抗酸化物質の残基、すなわち、活発な性質のＦＲ−およびＲＯＳ−飽和部位のうちの１つの残基）。
【００２７】
酸化促進物質は、細胞中に侵入した際に、フリーラジカルおよび／または活性酸素種を形成することができるか及び／又はその形成を刺激することができる化合物、パラコート、メナジオン、有機ヒドロペルオキシドである。
【００２８】
アポトーシス誘導物質は、ミトコンドリア中に送達されると、何らかの形で活性化する、即ちプログラム化された細胞死（アポトーシス）を促す化合物である。化合物（Ｉ）の構成における好ましいアポトーシス誘導物質は、フェニルアルセンオキシド（phenyl arsene oxide）であり、現在のところ、ミトコンドリアの孔形成の最も有効な誘導物質と見なされる。
【００２９】
ミトコンドリア局在のタンパク質の抗アポトーシスタンパク質の阻害物質は、ミトコンドリアにおいて局在する１つ又は複数の抗アポトーシスタンパク質（膜抗アポトーシスタンパク質を含む）と相互作用でき、その活性を抑制できる化合物である。ミトコンドリア局在抗アポトーシスタンパク質の好ましい阻害物質はＡＢＴ７３７である。これらの化合物は、アポトーシス誘導を促進する化学療法剤と組み合わせた場合に特に有用であると考えられる。
【００３０】
光増感剤は、一重項酸素または他の活性酸素種またはフリーラジカルを照明下で産生することができる化合物である。好ましい光増感剤は、金属置換基およびその錯体を任意に含むフタロシアニン、ポルフィリンおよびその誘導体、特にＢＤＰ−ＭａＣまたはＢＤＰ−ＭａＤ；もしくはフォスキャン（ｆｏｓｃａｎ）（ｍＴＨＰＣ）である。
【００３１】
Ｌは、ａ）１以上の置換基で任意に置換されていてもよく、１以上の二重結合または三重結合を任意に含んでもよい直鎖状または分岐状炭化水素鎖；
ｂ）天然イソプレン鎖、
を有するリンカー基である。
ｎは１〜２０の整数である。
Ｂは、ａ）スクラチェフイオンＳｋ、
Ｓｋ＋Ｚ−
（式中、Ｓｋは脂溶性カチオンであり、Ｚは薬理学上許容可能なアニオンである）。
ｂ）１−２０アミノ酸を含有する荷電疎水性ペプチド、
を有するターゲティング基（targeting group）である。
【００３２】
ただし、構造（Ｉ）の化合物において、Ａはユビキノン（例えば、２−メチル−４，５−ジメトキシ−３，６−ジオキソ−１，４−シクロヘキサジエニル）でも、トコフェロールでもない化合物またはスーパーオキシド・ジスムダーゼまたはエブセレンの模倣物でもない。ここで、Ｌは二価デシルまたは二価ペンチルまたは二価プロピルラジカルであり、Ｂはトリフェニルホスホニウムである）。
ならびにその溶媒和物、異性体、プロドラッグおよび医薬上許容可能な担体。
【００３３】
本発明のさらなる態様は、ミトコンドリア標的化抗酸化物質を活用して、別個の細胞、組織、部位、器官または有機組織全体におけるフリーラジカルまたは活性酸素種の量を減少させることにより、治癒、予防または軽減できる疾患の処置において有用な、治療剤または予防剤−構造（Ｉ）に対応する化合物−を提供することである。本発明のこの態様に関連して、
−ヒトまたは動物の寿命を延ばすための、構造（Ｉ）に対応するミトコンドリア標的化抗酸化物質の使用、
−疾患が有機組織の老化および酸化的ストレスの増大により引き起こされる場合に有効な治療薬または予防薬の使用、
−特に、酸化的ストレスおよび／または視覚を与えるプロセスに関与する網膜細胞の大量死により引き起こされる眼科疾患を治療するため、白内障を治療するため、網膜黄斑変性を治療するための、ミトコンドリア標的化抗酸化物質の使用、
−組織および器官における大量のプログラム化された細胞死により引き起こされる疾患および／または損傷組織においてプログラム化された細胞死を開始するシグナルの伝播に関連する疾患の処置または予防のための、構造（Ｉ）に対応するミトコンドリア標的化抗酸化物質の使用、
−プログラム化された細胞死、アポトーシスまたは壊死が重要な役割を果たす場合に、心臓血管疾患を処置および／または予防するため；心臓麻痺、発作を処置および／または予防するため；再酸素化の悪影響を予防するため；の、構造（Ｉ）に対応するミトコンドリア標的化抗酸化物質の使用、
−正常組織を損傷から保護するための外科手術の際の構造（Ｉ）に対応するミトコンドリア標的化抗酸化物質の使用、
−移植の際の移植された物質の拒絶反応の予防のため；ならびに移植物質の保存のため；の、構造（Ｉ）に対応するミトコンドリア標的化抗酸化物質の使用、
−熱傷の痕跡を克服するため、外科縫合を含む創傷の治癒を刺激するための、構造（Ｉ）に対応するミトコンドリア標的化抗酸化物質の美容術における使用、
−構造（Ｉ）に対応するミトコンドリア標的化抗酸化物質の抗炎症剤としての使用、
が提案される。
【００３４】
本発明のさらに別の態様は、腫瘍性疾患を治療または予防するための構造（Ｉ）に対応する治療薬または予防薬を提供することである。本発明のこの態様に関連して次のものが提案される。
−転移の形成、血管形成に対抗するため；ならびに目的とされる癌細胞におけるプログラム化された細胞死の開始のため；の、ミトコンドリア標的化抗ガン剤の使用、
−構造（Ｉ）に対応するミトコンドリア標的化酸化促進物質の、ミトコンドリア標的化抗ガン製剤、好ましくはミトコンドリア標的化パラコート、ミトコンドリア標的化メナジオン、またはミトコンドリア標的化抗酸化物質であって、ミトコンドリア呼吸鎖により回復（還元）できず、したがって、酸化促進特性を示すもの（例えば、化合物ＤＭＭＱ）としての使用、
−構造（Ｉ）に対応するミトコンドリア標的化アポトーシスの誘導物質の、ミトコンドリア標的化抗ガン製剤としての使用。ミトコンドリアはプログラム化された細胞死のひきがねになる可能性を多数提供するので、このような方法は従来のアポトーシス誘導物質の使用よりも好ましい。このような開始の好ましい方法の一つは、ミトコンドリア膜タンパク質のスルフヒドリル基の、ミトコンドリア標的化アポトーシス誘導物質のエフェクタ基を介した化学結合である。このような化合物の好ましいエフェクタ基はフェニルアルセンオキシドである。
−ミトコンドリア局在の抗アポトーシスタンパク質のミトコンドリア標的化阻害物質の、構造（Ｉ）に対応するミトコンドリア標的化抗ガン製剤としての使用。好ましいタンパク質であって、その活性がかかる製剤により阻害されるべきものは、ｂｃｌ−２および同類のタンパク質である。最も好ましい阻害物質の一つはＡＢＴ７３７である。
【００３５】
ミトコンドリア標的化抗ガン製剤として、ミトコンドリア局在の抗アポトーシスタンパク質のミトコンドリア標的化阻害物質およびガン細胞のプログラム化された死を誘導する従来の製剤を含有する組成物を使用することも本発明の一つの態様である。
【００３６】
本発明のさらに別の態様は、ミトコンドリア標的化抗ガン製剤としての、構造（Ｉ）に対応するミトコンドリア標的化抗酸化物質およびガン細胞のプログラム化された死を誘導する従来の製剤を含有する組成物の使用である。本発明のこの態様において、ガン細胞において、脂溶性カチオンをポンプ排出できる酵素（複数の薬剤耐性の原因である酵素）の活性が大きく増加することが観察されるので、脂溶性カチオンと結合する抗酸化物質の適用が好ましい。したがって、ミトコンドリア標的化抗酸化物質は、正常細胞において主に蓄積され、その結果、抗ガン治療中のその主な生存は、該治療の望ましくない副作用の強度を減少させる。
−癌の化学療法または放射線療法の有効性を増大させるための、ミトコンドリア標的化抗酸化物質の使用、
−ミトコンドリア標的化光増感剤の、ミトコンドリア標的化抗ガン製剤としての使用、
−アポトーシスのミトコンドリア誘導を許容する、癌の光線力学療法におけるミトコンドリア標的化光増感剤の使用。この方法は、（ａ）壊死（多くの望ましくない結果と関連する）ではなく、プログラム化された細胞死を活用して、癌細胞の除去を可能にし、（ｂ）用いられる光増感剤の量を本質的に減少させ、これにより望ましくない副作用の発生の可能性および強度が低下するので、従来の光線力学療法よりも本質的に優れた利点を数多く提供する。
−ミトコンドリア標的化抗酸化物質ＳｋＱ１の好ましい抗ガン剤としての使用。
【００３７】
本発明のさらに別の態様は、代謝に関連する疾患、糖尿病を処置するための構造（ＩＩＩ）の残基をターゲティング基（targeting group）として含む、ミトコンドリア標的化抗酸化物質の使用である。
【００３８】
フリーラジカルを活用して、組織、血液または細胞および細胞要素を含む他の物質を消毒する方法を提供することも本発明の一つの態様である。本方法の構成内で、所望の細胞および細胞要素は、ミトコンドリア標的化抗酸化物質により酸化的ストレスから保護される一方、全ての病原体はフリーラジカルにより破壊される。
【００３９】
本発明のさらに別の態様は、研究または技術目的のために、細胞培養におけるヒトまたは動物細胞の生存能力を向上させるためのバイオテクノロジーにおけるミトコンドリア標的化抗酸化物質の使用である。本発明のこの態様は、多くの場合において、細胞培地中の酸素濃度が本質的に組織中の酸素濃度を超え、これにより細胞中の酸化的ストレスの可能性が急増し、このことは次にアポトーシスまたは壊死の可能性がより高くなることにつながり、かかる細胞の生存能力を低下させるという事実に基づく。細胞をミトコンドリア標的化抗酸化物質で処置することにより、酸化的ストレスの激しさが急激に減少する。細胞をミトコンドリア標的化抗酸化物質で処置することはまた、細胞のバイオマスを著しく増大させ、かくしてその産生力を上昇させる。本発明のこの態様に関連して、次のものがある。
−医薬品、タンパク質、抗体を産生するための培養において、ヒト、動物、植物または真菌細胞の産生力を増大させるためのミトコンドリア標的化抗酸化物質の使用、
−医薬品、タンパク質、抗体を産生するために使用される場合、植物全体の産生力を増大させるための、ミトコンドリア標的化抗酸化物質の使用、
−医薬品、タンパク質、抗体を産生するために使用される場合、細胞培養において、酵母またはサッカロミセス（Saccharomyces）、ピヒア（Pichia）、ハンセヌラ（Hansenula）、エンドミケス（Endomyces）、ヤロウィア（Yarrowia）属の他の真菌の細胞の産生力を増大させるための、ミトコンドリア標的化抗酸化物質の使用、
−医薬品、タンパク質、抗体を産生するため、ならびに遺伝子組み換え植物を産生するために使用される場合、細胞培養における植物プロトプラストの生存能力を増大させるための、ミトコンドリア標的化抗酸化物質の使用、
−再生植物、カルス細胞の生存能力を増大させるための、トランスジェニック植物を産生するための、ミトコンドリア標的化抗酸化物質の使用、
−病原菌、原生動物、真菌、細菌を対処するための、ミトコンドリア標的化酸化促進物質の使用。
【００４０】
本発明の次の態様は、ターゲティング部分として脂溶性カチオンを使用して、ミトコンドリア標的化抗酸化物質を合成する方法を提供することである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４１】
次の実験例は、本発明を行う可能性、特に、構造（Ｉ）に対応する本発明の化合物の作用を例示するために提示される。これらの実施例は、特許請求の範囲の有効性をサポートするためのものであり、本発明の用途または使用の範囲を制限するものと理解すべきではない。
【実施例１】
【００４２】
構造（Ｉ）の化合物−ローダミンＧ ２，３−ジメチル−１，４−ベンゾキノン−５−デシルエステル−の合成
化合物ＳｋＱＲ１を合成した。この化合物は、構造（Ｉ）に対応し、プラストキノンはプロトプラスト、即ち、活性化された性質のほとんどのＦＲ−およびＲＯＳ−飽和部位のうちの１つのチラコイド中に存在する天然の抗酸化物質であるので、ターゲティング基としてローダミンＧおよび抗酸化エフェクタ基としてプラストキノン残基を有する。
【００４３】
【化４】
【００４４】
次の試薬および溶媒を研究では用いた。２，３−ジメチルヒドロキノン、１１−ブロモウンデカン酸、ローダミンＧ、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド、臭素酸カリウム、硝酸銀、過硫酸アンモニウム、炭酸セシウム（Fluka、Aldrich、SigmaまたはMerckから購入）；カラムクロマトグラフィは、シリカゲル「Silicagel 60」（０．０６３〜０．２ＭＭ）（Merck）上で行った。ジメチルホルムアミド、ジクロロメタン、ベンゼン、アセトニトリルおよび他の溶媒は国内で製造された。
【００４５】
ＴＬＣを「Kieselgel 60 F２５４」プレート（Ｍｅｒｃｋ）上で行った。ＵＶ領域において吸収する基を含む化合物を、ブルームバーグ（Brumberg）ケミスコープ（Chemiscope）を活用して検出した。キノン環を含む化合物はアンモニア蒸気中で検出された。ローダミン含有化合物を視覚的に検出した。
ＵＶ吸収スペクトルを＜Cary 50 Bio＞分光計（Varian）で記録した。
ＨＰＬＣ分析および精製を、Adjilent 1100装置で、１０ｍＭ Ｈ３ＰＯ４中アセトニトリル勾配において行った。
【００４６】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦおよびＥＳＩ質量スペクトルを、３３７ｎｍレーザを備えたUltraflexまたはAutoflex質量分析計（Bruker Daltonics、Germany）で実施した。
赤外スペクトルをSpecord 40上のフィルム上で記録した。
１Ｈ−および１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを、Bruker Avance-400分光計を用いて、３０３Ｋで記録した。
ＳｋＱＲ１の合成をスキーム１において示す。
【００４７】
【化５】
【００４８】
２，３−ジメチル−１，４−ベンゾキノン（２）の合成
２，３−ジメチルヒドロキノン０．８３ｇ（６ｍｍｏｌ）を、臭素酸カリウム０．３４ｇ（２ｍｍｏｌ）のＨ２Ｏ（６ｍｌ）および５Ｎ硫酸（０．３ｍｌ）の溶液に添加した。混合物を６０℃に加熱し、撹拌した。その後、反応温度を次に８０℃にした。反応が完了したら、混合物を室温に冷却し、エーテルで抽出した。合わせた有機層をＨ２Ｏで逆洗し、無水ＣａＣｌ２で乾燥し、濾過し、濾液を真空中で蒸発させて、粗生成物０．７４ｇ（９０％）を得た。標記化合物をエーテル（２０ｍｌ）に溶解し、シリカゲル層に通した（３０×３０ｍｍ）。シリカゲルをエーテルで数回洗浄し、エーテルを真空除去して、２，３−ジメチル−１，４−ベンゾキノン（ＨＰＬＣ純度９９．３７％）０．６７ｇを得た。
TLC: Rf 0.46 (クロロホルム); HPLC: τ = 17.6 min (0-90% B for 26.4 min; A: 10 mM H3PO4; B: アセトニトリル); M.p. 6O℃; UV (メタノール): λmax209 nm, 256 nm, 344 nm。
【００４９】
２，３−ジメチル−５−（１０’−ブロモデシル）−１，４−ベンゾキノン（３）の合成
２，３−ジメチル−１，４−ベンゾキノン（２）１３６ｍｇ（１ｍｍｏｌ）を、アセトニトリルおよびＨ２Ｏの混合物（１０ｍｌ、（１：１））に溶解した。得られた溶液に、１１−ブロモウンデカン酸２９２ｍｇ（１．１ｍｍｏｌ）および硝酸銀（１７０ｍｇ、１ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を６０〜７０℃に加熱し、過硫酸アンモニウム（２２８ｍｇ、１ｍｍｏｌ）のＨ２Ｏ（１０ｍｌ）溶液を滴下した。加熱をさらに１時間継続し、次に反応混合物を冷却し、エーテルで抽出した。合わせたエーテル層を５％重炭酸ナトリウム溶液で逆洗し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、溶媒を真空除去した。残留物をシリカゲル上フラッシュクロマトグラフィにより精製した。標記化合物（３）を暗赤色油状物（７０％収率）として得た。
TLC: Rf 0.62 (クロロホルム); HPLC: τ = 23 min (79 -90% B for 26.4 min; A: 10 mM H3PO4; B: アセトニトリル); UV (メタノール): λmax 207 nm, 258 nm, 344 nm; MALDI-TOF MS: calc. for C18H27O2Br: 355.3; found m/z 356.1 (MH+; 100%); IR: 2928, 2336, 1600, 1496, 1304 cm−１。
【００５０】
ローダミンＧセシウム塩（４）の合成
２Ｍ炭酸セシウム水溶液１ｍｌを、ローダミンＧ（２００ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ）のメタノール（６ｍｌ）溶液に添加した。生成物を濾過し、エーテルで洗浄し、真空中、６０℃で乾燥した。標記化合物（４）２１０ｍｇ（８０％）を暗紫色結晶性固体として得た。
Ｍ．ｐ．＞２５０℃（分解）
【００５１】
10-（2',3'-ジメチル-1',4'-ベンゾキノン-5'-デカノイル）ローダミンＧの合成
化合物（４）（１９０ｍｇ）をＤＭＦＡ（５ｍｌ）中に懸濁させ、化合物（３）（２００ｍｇ、０．５６ｍｍｏｌ）をこれに添加した。反応混合物を５０℃に加熱し、４８時間撹拌し、次に真空濃縮した。残留物をクロロホルム−メタノール系（４：１）、シリカゲルでカラムクロマトグラフィにより精製した。標記化合物を含むフラクションを蒸発乾固した。乾燥残留物に、５Ｎ ＨＣｌ（１５０μｌ）のジオキサン溶液を添加し、次に再度蒸発させ、ベンゼン下で結晶化させて、標記化合物１６０ｍｇ（６５％）を得た。
TLC: Rf 0.68 (クロロホルム−メタノール, 4:1); Rf 0.80 (クロロホルム−メタノール−水, 65:25:4);
HPLC: τ = 23.9 min (0 -90 % B for 26.4 min; A: 1OmM H3PO4; B: アセトニトリル);
M.p. 178-180℃ (分解);
UV (メタノール): λmax 250, 350, 535 mm, ε535 = 80000;
質量分析: calc. for C44H53ClN2O5: C, 72.86; H, 7.36; Cl, 4.89; N, 3.86; found: C, 72.53; H, 7.21; Cl, 4.22; N, 3.61;
ES MS: calc. for C44H5１N2O5 688,89; found m/z 689,4 (MH+; 100%);
IR. (film): 3200, 2928, 2336, 1700, 1685, 1600, 1496, 1304 cm−１;
【００５２】
【化６】
【００５３】
1H-NMR (400 MHz; DMSO-d6; 構造式の原子の番号付けは上記の通り): 0.95-1.25 ppm (br. m, 14H, 2", 3", 4", 5", 6", 7", 8" - (CH2)?); 1.24 ppm (t, 6H, J= 6,8 Hz, 2"", 2"" -(CH3)2); 1.41 ppm (q, 2H, J = 7,5 Hz); 1.92 and 1.94 (each - s, 3H, 4'", 5"' - (CH3)2); 2.09 ppm (s, 6H, 2,7 -(CH3)2); 3.48 ppm (q, 4H, - 1"", 1"" -(CH2)2); 3.85 ppm (t, 2H, J = 6,3 Hz, 1" -CH2); 6.57 ppm (s, 1H, H3’); 6.80 and 6.91 (each - s, 3H, H1, H５ and H4, H8); 7.44 ppm (dd, IH; J1 = 7,8, J2= 1 Hz; H6’”); 7.74 ppm (t, 2H, J = 5,8 Hz; 3,6 -NH); 8.60 -8.70 ppm (m, 2H, H4”’ and H５’”); 8,22 (dd, IH, Ji= 8,2; J2 = 1,1 Hz, H3”’)。
13C-NMR (400 MHz; DMSO-d6): 11.59 and 11.98 ppm (4"', 5"' -(CH3)2); 13.45 ppm (2"" and 2'"" -(CH3)2); 17.29 ppm (2,7 -(CH3)2); 25.07, 27.29, 27.57, 28.25, 28.39, 28.51, 28.55, 28.56 and 28.65 (2", 3", 4", 5", 6", 7", 8", 9", 10" -(CH2)9); 37.86 (1"", 1'"" - (N-CH2)2); 64.96 (1" -CH2); 93.45 (C4 and C5); 112.78 (C1 and C8); 125.32 (C4'); 128.38 (C５’); 129.78 and 130.75 (C１’ and C2’); 130.20 and 130.22 (C５’, C8a and C９a); 131.77 (C2); 132.85 (C9’”); 132.88 (C3'); 139.79 and 140.36 (C4"' and C5"'); 148.40 (C1"'); 155.71 and 156.6 (C4a - C10a and C3"'- C6"'); 164.98 (COOR); 186.91 and 187.00 (C3"' and C6"')。
【００５４】
同様の手順に従って、構造（Ｉ）に対応するもう一つ別の化合物−２，３−ジメチル−，４−ベンゾキノン−５−デシル−トリフェニルホスホニウムブロミド−を調製した。この化合物は、これにおいて用いられるターゲティング基がトリフェニルホスホニウムである点で、前述のＳｋＱＲ１と異なる。エフェクタ基およびリンカー基は、前述の化合物と同じである。
ミトコンドリア標的化抗酸化物質ＳｋＱ１の合成をスキーム２において示す。
【００５５】
【化７】
【００５６】
合成は次の工程を含む。
１．２，３−ジメチルヒドロキノン（１）の臭素酸カリウムによる、対応する２，３−ジメチル−１，４−ベンゾキノン（２）への酸化。
２．硝酸銀および過硫酸ナトリウムの存在下、１１−ブロモウンデカン酸（３）を、得られた２，３−ジメチル−１，４−ベンゾキノン（２）へ添加。
３．トリフェニルホスフィンとの酸素雰囲気中での反応による、目標化合物（５）の形成。
得られた化合物は、黄色がかった茶色の吸湿性の高い固体である。
ＮＭＲ、ＨＰＬＣおよびＭＳ技術により目標化合物の構造を調べた結果から、得られた化合物の構造は、所定の式と同一であることが立証された。サンプルの純度は９８．５％以上であった。
【００５７】
生成物純度制御は、２つの方法、高圧ＨＰＬＣおよび高分解能ＰＭＲ（５００ＭＨｚ）により行われた。ＳｋＱ１生成物の純度を記録する２つの方法は、この化合物の顕著な界面活性剤特性と関連する必要があり、これは、クロマトグラフィプロセスを困難にする。
得られた調製物中のＳｋＱ１濃度は、ＨＰＬＣにより測定すると、９８．５５％である。ＮＭＲデータを以下に提示する。
【００５８】
【化８】
【００５９】
1H-NMR (CDCl3; δ, ppm; 構造式の原子の番号付けは上記の通り): 7.82-7.58 (m, 15H, aromatics); 6.38 (s, 1H, H-5); 3.6 (m, 2H, CH2P(Ph)3); 2.25 (m, 2H, CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2P(Ph)3); 1.90 (br s, 6H, CH3); 1.55, 1.32, 1.15 (3m, 6H, 3CH2)。
HQSC (DMSO; δ, ppm): 8.15 (br s, 1H, tautomeric OH), 7.88-7.20 (m, 15H, aromatics); 7.08 (br s, IH, tautomeric OH), 6.38 (s, 1H, H-5); 3.55 (m, 2H, CH2P(Ph)3); 2.4 (m, 2H, CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2P(Ph)3); 2.05, 1.90 (2s, each of 3H, CH3); 1.5 (m, 6H3 3CH2)。
13C-NMR (DMSO; δ, ppm): 147.83, 144.65 (C-1, C-4); 134.75-129.97 (Ph); 113.01 CH2P(Ph)3; 12.72, 11.89 (CH3)。
ESI-MS (m/z): [M]+ calc. 537.7, found 537.4。
【００６０】
さらに、同様の手順に従うことにより、構造（Ｉ）に対応する化合物を合成した。１０−（２−メチル−５−メトキシ−３，６−ジオキソ−１，４−シクロヘキサジエニル）−デシル−トリフェニルホスホニウムブロミド（ＤＭＭＱ）。この化合物において、デメトキシユビキノンをエフェクタ基として使用する。この化合物は、フリーラジカル、活性酸素種および酸素と相互作用できるが、その構造から判断し、ミトコンドリアの機能の現在の知識から進んで、該化合物はミトコンドリアの呼吸鎖により還元されず、その結果、酸化促進物質、細胞毒性作用を示すと推測される。
【００６１】
【化９】
【実施例２】
【００６２】
「構造（Ｉ）に対応する化合物の平面脂質膜を超えた移動」
構造（Ｉ）に対応する試験化合物（化合物ＳｋＱ１を使用した）は、平面リン脂質二分子膜を貫通して浸透し、濃度勾配に沿って移動し、ネルンスト（Nernst）式に従って膜全体にわたって分布することが証明された。したがって、ＳｋＱ１は透過カチオンである。
【００６３】
実験手順は、異なるイオンが平面脂質二分子膜を貫通して浸透する能力を調査することを目的とする実験において以前に数回使用され、Starkov A.A., Bloch D.A., Chernyak B.V., Dedukhova V.I., Mansurova S.A., Symonyan R.A., Vygodina T.V., Skulachev V.P., 1997, Biochem. Biophys. Acta, 1318, 159-172により詳細に記載されている。この方法は、水系溶液で満たされ、二分子膜により隔てられた２つのチャンバを用いること、及び１つのチャンバから別のチャンバへ、かかる膜を横切って透過できる荷電化合物の移動の電気測定記録を含む。
【００６４】
我々の実験において、膜は、デカン中に溶解させたホスファチジルコリンおよびジフィトネイルの混合物から調製され、両チャンバは、１０−７Ｍ ＳｋＱ１を含む、５０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ ７．４で満たされていた。
【００６５】
ＳｋＱ１を１０−７Ｍから１０−５Ｍの濃度で滴定した。４・１０−６Ｍから４・１０−５Ｍの範囲内で、ＳｋＱｌの分布は、理想的な膜透過カチオンについてのネルンスト式に従うことが証明された。低い濃度では、ネルンスト式は満たされない（結果を図１に示す）。
【００６６】
結果として、化合物ＳｋＱ１（２，３−ジメチル−１，４−ベンゾキノン−５−デシル−トリフェニルホスホニウム）は、カチオン形態において生体膜を横切って透過できる脂溶性物質である。
【実施例３】
【００６７】
「構造（Ｉ）に対応する化合物の抗酸化特性」
構造（Ｉ）に対応する試験化合物−ミトコンドリア抗酸化物質ＳｋＱ１−は最も強力な抗酸化物質であって、刊行物において以前に記載され、米国特許第6,331,532号において「ミトコンドリア標的化」として権利主張されている抗酸化物質（化合物ＭｉｔｏＱ）よりも活性において勝っていることが証明された。
【００６８】
ＳｋＱ１およびＭｉｔｏＱの還元（キノール）体の好気性条件下での長時間にわたる安定性を、２４０から３１０ｎｍの範囲のこれらの化合物の絶対吸収スペクトルを、複光束Pye Unicam SP1100分光光度計（England）を用いて分析することにより調べた。２０ｍＭ ＭＯＰＳ−ＫＯＨを含有する測定培地（ｐＨ＝７．６）中、キノン誘導体をテトラヒドロホウ酸ナトリウムで還元した。コントロールキュベットはＳｋＱ１またはＭｉｔｏＱを含有せず、還元剤を両キュベットに添加し、水素の発生が止まった直後に測定を行った。キノンの還元の程度を、ピーク面積のサイズから、これを２６７ｎｍでの絶対吸収値（最大吸収）に対して比較検討することにより評価した。図２において提示されたデータからわかるように、ＳｋＱ１の還元（キノール）体は、ＭｉｔｏＱよりも空気による酸化に対して耐性である。
【００６９】
還元体の抗酸化活性を比較するために、本発明者らはキサンチンオキシダーゼ／ハイポキサンチン系において生成するスーパーオキシド−アニオンラジカルによりキノールの酸化率を測定した。図３ａに示される、得られたデータは、ＳｋＱ１の酸化率がＭｉｔｏＱの約２倍であることを示す。このことは、ＳｋＱｌが抗酸化物質としてより活性が高く、その還元（活性）体は、ＭｉｔｏＱよりも空気の酸素による自然酸化に対して耐性であり、スーパーオキシドラジカルについてより高い親和力を有することを示唆する。図３ｂは、空気の酸素による酸化より低い、還元キノール体のスーパーオキシドラジカルによる酸化率を示す。ＳｋＱ１がスーパーオキシドラジカルと、ＭｉｔｏＱよりも良好に相互作用することは簡単にわかる。
【００７０】
上記実験は、ＳｋＱ１がその類似体よりも強力な抗酸化特性を有することを納得できる例示である。溶液において、ＳｋＱ１はＲＯＳと有効に相互作用し、これらを中和することができる。この抗酸化物質の本質的な利点は、通常の酸素に対するその低い反応性、したがって、その低い酸化促進特性（prooxidant properties）である。
【実施例４】
【００７１】
「構造（Ｉ）に対応する化合物のミトコンドリアとの相互作用の調査」
本発明の構成内で提案されるミトコンドリア標的化抗酸化物質の重要な利点は、ミトコンドリアの呼吸鎖により還元されるその能力である。この特性は、これらの化合物が従来の抗酸化物質とは根本的に違う点；即ち、本発明の化合物のラジカル体の安全な中和の可能性と、従って本発明の化合物のラジカル形態の安全な中和の可能性ならびにＦＲおよびＲＯＳの中和のためのその反復使用；である。
【００７２】
試験化合物（ＳｋＱ１およびその類似体ＭｉｔｏＱ）がミトコンドリアの呼吸鎖により還元され得るかどうかを調べるために、試験化合物の酸化体と還元体間の比の変化率を、呼吸物質の存在下、ラット肝臓ミトコンドリアの単離に使用される培地中で測定した。測定は、ミトコンドリア（タンパク質濃度０．２ｍｇ／ｍｌ）の存在下で行った。
【００７３】
得られたデータ（図４、５）から、両試験化合物が、活性化ミトコンドリアにより、同じ速度で、容易に還元され、その結果、自然酸化（空気酸素による）の速度よりもずっと高速で酸化されることがわかる。
【００７４】
この実験例は、ＳｋＱ１がミトコンドリア呼吸を１０μＭまでの濃度で抑制しないが、ミトコンドリアの「共役」呼吸、即ち、その通常の機能を刺激することを示唆する。ＳｋＱ１がインキュベーション条件下、生体媒質中で実験の期間（数十分）に対応する時間、安定であることも証明された。この実験は、生成したＲＯＳ（キサンタンオキシダーゼ反応におけるスーパーオキシドラジカル）の仲介でミトコンドリアにより還元されたキノールの酸化を誘発するインビトロ実験におけるＳｋＱ１が、ＲＯＳについての親和力および長期間にわたる安定性に関して、ＭｉｔｏＱよりも明らかな利点を示すことを裏付ける。
【実施例５】
【００７５】
「培養における細胞の異なるミトコンドリア抗酸化物質の毒性の比較」
この実験例において、先行技術において開示されているミトコンドリア抗酸化物質ＭｉｔｏＱの毒性レベルを本発明の構成内で提案される化合物ＳｋＱ１の毒性と比較する。
【００７６】
実験の過程において、ＳｋＱ１およびＭｉｔｏＱを等濃度で細胞培養物に添加し、生きている細胞のパーセンテージを２時間のインキュベーション後に計算した。図６に示す、得られた結果は、ＳｋＱ１が実質的に低い毒性を有することを明確に示す。したがって、ＳｋＱのＬＤ５０（５０％細胞が死亡する濃度）は２０μＭである一方、ＭｉｔｏＱについては、ＬＤ５０は３倍以上少なく、約７μＭである。これらの結果は、ＳｋＱおよびＭｉｔｏＱの過酸化水素（５０、１００および２００μＭの濃度）の存在下での細胞に対する毒性効果を検討する別の実験によっても確認された。従来の場合と同様に、ＭｉｔｏＱはより毒性の高い化合物であることが証明された。１００μＭ過酸化水素のバックグラウンドに対するＭｉｔｏＱのＬＤ５０は４μＭである一方、ＳｋＱは２０μＭであった。即ち、純粋な調製物のＬＤ５０と違わなかった。従って強力な酸化的ストレスのバックグラウンドに対して、ＳｋＱの毒性はＭｉｔｏＱの毒性よりも５倍以上低い。
【００７７】
よって、本発明により提供される構造（Ｉ）に対応するミトコンドリア抗酸化物質は、最先端の技術において開示され、ミトコンドリア抗酸化物質として権利主張されている物質よりも本質的に低い毒性を有することが断言できる。この違いは、ＭｉｔｏＱと比較して、ＳｋＱ１のより高い抗酸化性およびあまりはっきりしない酸化促進性が示される実施例３において得られた結果を考慮して容易に説明できる。
【実施例６】
【００７８】
「異なる種類のヒト細胞に対する、構造（Ｉ）に対応する化合物の保護効果」
この実施例において、本発明者らは、抗酸化機能を有する、構造（Ｉ）に対応する化合物（ミトコンドリア標的化抗酸化物質）が、Ｈ２Ｏ２により引き起こされる酸化的ストレスから培養物中の細胞を保護することを立証した。
【００７９】
ヒトの皮膚および肺から得られる通常の２媒体線維芽細胞、ヒトの子宮癌細胞（ＨｅＬａ細胞）およびヒトリンパ腫細胞（Ｕ９３７株）をこの実験において使用した。細胞を標準培地（ＤＭＥＭまたはＲＰＭＩ）中、１０％胎児血清の存在下、３７℃で５％ＣＯ２の雰囲気中で培養した。３０〜５０％コンフルーエンスまで増殖させた培養物に関して実験を行った。Ｈ２Ｏ２を１回添加し、細胞を添加後１８−２４時間、分析した。細胞をHoechst 33342（１μｇ／ｍｌ、１５分）で染色した後、クロマチン凝縮および核の細分化により、アポトーシス死をモニターした。３００〜５００個の細胞を各調製物から考慮に入れ、データを３〜５の独立した実験について平均した。核をヨウ化プロピジウムで染色することにより（２μｇ／ｍｌ、５分）、壊死を測定した。
【００８０】
予備実験において、異なる種々の細胞種において検出可能な壊死がなく多量のアポトーシス（６０〜８０％）を引き起こすＨ２Ｏ２の濃度は５０〜２００μＭと測定された。全ての場合におけるアポトーシスは、ミトコンドリア膜ポテンシャルの減少、シトクロムｃのミトコンドリアから細胞質中への放出およびカスパーゼ（caspases）の活性化を伴うことが確認された。
【００８１】
抗酸化物質ＳｋＱ１を用いた実験において、本発明者らは、保護的抗アポトーシス効果の最適条件を決定した。細胞を２０ｎＭ ＳｋＱ１とともに６日間インキュベーションすることにより、細胞のＨ２Ｏ２に対する耐性がはっきりと増加することがわかった。Ｈ２Ｏ２を用いたインキュベーションの培地において抗酸化物質が存在する必要は無く、この存在自体は保護効果を向上させなかった。特に、ヒト肺線維芽細胞を用いた実験において、１００μＭ Ｈ２Ｏ２は細胞集団の６０＋／−５％アポトーシスを引き起こす一方、２０ｎＭ ＳｋＱ１を用いたプレインキュベーション後に、各数値は７＋／−３％であった。ほとんど完全な保護が、２００μＭの濃度のＨ２Ｏ２でも観察された（コントロールにおいて８０＋／−５％アポトーシス、２０ｎＭ ＳｋＱ１を用いたプレインキュベーション後に１２＋／−５％アポトーシス）。ＳｋＱ１の保護効果は、Ｈ２Ｏ２の濃度が５００μＭまで増加した場合に保持されたが、一方、かかる条件下で壊死による細胞の全体的な死が見られた。同様の結果が他の種類の細胞に関して得られた。
【００８２】
したがって、非常に低い濃度でのＳｋＱ１タイプの抗酸化物質は、種々の種類の細胞を酸化的ストレスにより引き起こされるアポトーシスから効果的に保護する。よって、かかる化合物およびこれに基づく組成物は、異なる組織、器官、有機組織そのものにおけるプログラム化された細胞死の予防に有効であるはずである。ＳｋＱのこの見出された性質を、酸化的ストレスの減少および／またはプログラム化された細胞死のブロックが有効な治療法である疾患の処置および予防に用いることができる。
【実施例７】
【００８３】
「構造（Ｉ）に対応する化合物によるアポトーシスシグナル伝播の予防」
細胞間のアポトーシスシグナルの長距離伝送は、ＳｋＱ１タイプの抗酸化物質によりブロックされる。
【００８４】
これらの実験において、ＨｅＬａ系細胞を使用した。スライドガラス上で成長させた細胞を、種々のアポトーシス誘導物質（腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、スタウロスポリン、Ｈ２Ｏ２）で３時間処理した。次に、細胞（誘発物質）を有するスライドガラスを洗浄して、これらの試薬を除去し、ペトリ皿中に入れて、スライドガラス（受容体）を任意のアポトーシス誘導物質の不在下で成長させた細胞と接触させた。その後、１６〜１８時間一緒に成長させ、前述のHoechst 33342で細胞を染色した後、両スライドガラス上のアポトーシスを分析した。
【００８５】
予備実験により、誘発物質スライド上のアポトーシスが８０〜９０％である場合、受容体スライド上の細胞の３０〜５０％もアポトーシス形態を示すことが示された。コントロール実験により、このモデルにおいて、初期アポトーシス誘導物質の受容体細胞への伝送はなかったことが示された。アポトーシスシグナルの伝送は、細胞の直接接触を必要とせず、インキュベーション培地の体積が増加すると弱くなった。合同インキュベーションのためにカタラーゼ（２５００Ｅ／ｍｌ）を培地中に添加すると、受容体細胞のアポトーシスが防止され、同時に、誘発細胞のアポトーシス（ＴＮＦまたはスタウロスポリンにより引き起こされる）には著しい影響を及ぼさなかった。よって、アポトーシスシグナルの主なメディエータはＨ２Ｏ２であった。
【００８６】
誘発細胞を２０ｎＭ ＳｋＱ１とともに６日間インキュベーションすることにより、ＴＮＦ（１０〜５０ｎｇ／ｍｌ、１μＭエメチンを添加）またはスタウロスポリン（２μＭ）により引き起こされるアポトーシスは防止されなかった。両スライドガラスを接触させ、次に一緒にインキュベーションした後、誘発スライド上のＴＮＦにより引き起こされるアポトーシスは、コントロールにおいて９５＋／−５％、ＳｋＱ１とのインキュベーション後に９０＋／−５％であった。受容体スライド上のアポトーシスは、コントロールにおいて３７＋／−４％、ＳｋＱ１との誘発物質のプレインキュベーション後に１７＋／−３％であった。ＴＮＦを含まないコントロール実験におけるアポトーシスは、エメチンの毒性効果のために、両スライド上で１２＋／−３％であることを考慮すべきである。したがって、ＳｋＱ１の保護効果はほぼ１００％であった。受容細胞をＳｋＱ１とともにプレインキュベーションすることにより、同様の結果が得られた。この場合、アポトーシスはｌ６＋／−４％に低下した。同様の保護効果がスタウロスポリンでのアポトーシスの誘導に際しても観察された。
【００８７】
測定により、誘発細胞（ＴＮＦで前処理）および受容細胞の合同インキュベーションの結果、スライドを接触させてすでに２〜３時間後の培地中のＨ２Ｏ２濃度が（未処理細胞をインキュベートしたコントロールと比較して）著しく増加したことが示された。２４時間後に測定されたＨ２Ｏ２濃度は１４０＋／−２０ｎＭである一方、誘発細胞がＳｋＱ１とともにプレインキュベートされたならば、わずかに４０＋／−１０ｎＭであった。受容細胞をＳｋＱ１とともにプレインキュベーションすることにより、Ｈ２Ｏ２濃度の減少には至らなかった。
【００８８】
したがって、非常に低濃度のＳｋＱ１タイプの抗酸化物質は、異なる性質を有するアポトーシス誘導物質で処置された細胞によるアポトーシスシグナルの生成をブロックする。同じ抗酸化物質は、誘発細胞からの培地を通って伝送されるシグナルにより引き起こされるアポトーシスから受容細胞を効果的に保護する。
【００８９】
アポトーシスシグナルの伝送は、損傷を受けた組織部分がアポトーシス細胞の広がった部分により取り囲まれている疾患（梗塞、発作、外傷後病変）の発病機序の根底にある。
【実施例８】
【００９０】
「構造（Ｉ）に対応する化合物の、細胞の光力学的損傷に対する保護効果」
ＳｋＱ１タイプの抗酸化物質は、光増感剤の光活性化において生成する一重項酸素の毒性効果を阻害し、ミトコンドリアの光力学的処置により引き起こされる壊死性の細胞死を防止する。
【００９１】
一重項酸素の損傷効果からの保護を、グラミシジンおよびフタロシアニン光増感剤を含むモデル脂質膜において分析した。グラミシジンチャネルを通るイオン流の測定は、短閃光による光増感剤の活性化の結果、チャネルの急速な不活性化が起こることを示した。この効果は、アジ化ナトリウムにより完全にブロックされ、一重項酸素がグラミシジンの不活性化における主な要因であることを示す。
【００９２】
ＨｅＬａ細胞の培養物を用いて、光力学作用からの保護を検討した。細胞を、ミトコンドリア中に選択的に蓄積する光増感剤クロロメチル−Ｘ−ロサミン（０．５μＭ、１５分）とともにインキュベートした。細胞を、Axiovert 200M顕微鏡（Zeiss、独）の対物レンズを通して緑色光（５８０ｎＭの光増感剤の吸収最大値）で１〜２分照射し、５時間後に分析した。壊死がヨウ化プロピジウム（２μｇ／ｍｌ、５分）で染色した核から検出された。
【００９３】
ＳｋＱ１は、１μＭの濃度で、フタロシアニン光増感剤を含むモデル脂質膜におけるグラミシジンの光依存性不活性化を完全に予防することが見出された。
１００％壊死性細胞死が、細胞の光力学処置後に観察された。一方、細胞が２０ｎＭ ＳｋＱ１とともに６日間プレインキュベートされたならば、光力学的処置後の壊死は、２５＋／−５％であった。１μＭ ＳｋＱ１を、照射の１時間前に添加された場合、壊死性細胞死は１５＋／−５％であった。ＳｋＱ１濃度の増加は、さらなる保護を提供しないが、０．５μＭに減少させると、効果を顕著に低くすることとなった。
【００９４】
得られた結果から、非常に低い濃度のＳｋＱ１タイプの酸化剤は、光増感剤の照射に際して生成する一重項酸素の損傷効果を予防するという結論を引き出すことができる。このような抗酸化物質は、光増感剤がミトコンドリア内に局在するならば、細胞を光力学的処置により引き起こされる壊死から効果的に保護する。
【実施例９】
【００９５】
「構造（Ｉ）に対応する化合物の、加齢に伴う白内障および黄斑変性に対する保護効果」
先進国における平均的なヒトの寿命の増加することにより、世界の人口の高齢化をもたらし、加齢に伴う疾患の罹患率の増加を伴う。この疾患のうち、ＷＨＯ／ＯＭＳの最近の報告によると、黄斑変性および白内障は癌および骨粗鬆症に次いで第三位を占めるという。白内障および黄斑変性は高齢者の失明の主な要因であり、これらの疾患の危険因子の判定および信頼できる予防的処置の発達は、経済的に非常に重要である。白内障および黄斑変性の発達の対する食餌療法の効果は、文献において活発に議論されてきた。加齢に伴う眼疾患の疫学的研究により、抗酸化物質を長期間受容した患者における、加齢に伴う黄斑変性の相対的危険性の顕著な減少が明らかになった。しかしながら、抗酸化物質を活用した白内障および黄斑変性の発達を遅らせる試みは、決して必ずしもうまくいくとは限らない。
【００９６】
抗酸化特性を有する、宣伝されている医薬品および生物活性な栄養物の数は増大しているが、その有効性の客観的評価は、一般に行われていない。そして当然、予防的治療の結果の正しい評価は、これらの疾患の発病の検出の遅れおよび個々の特性により実質的に妨害される。このような状況において、動物モデルを再分類するのが通例であり、本発明により示されるように、視覚器の老化の普遍的モデルとしての働きをすることができる老化促進ＯＸＹＳラット種により、製剤の有効性を評価するためのめったにない機会を得ることができる。ＯＸＹＳ種のラットは、ガラクトースの白内障効果を受けやすいWistar系ラットの選択および同型交配により得た。ＯＸＹＳラットの酸化的ストレスに対する減少した耐性において発現される遺伝的に調整された代謝障害は、老化促進症候群と見なすことができるその有機組織における変化につながる。ＯＸＹＳラットの水晶体における病原性変化は、２月齢で起こり、６月齢で、白内障が１００％のＯＸＹＳラット（Wistarラットの５％に対して）において検出され、１２月齢で、白内障は両目を冒す。検眼鏡、生体顕微鏡および形態学的データによると、ＯＸＹＳラットにおける白内障はヒト老人性白内障に対応し、進行性黄斑変性の背景に対して発達する。疾患の最初の兆候は６週齢で現れ、４〜６月齢までに、病状は顕著な段階に達する。特性の発現により、ＯＸＹＳラットにおける眼に基づく病変のパターンは、黄斑変性、例えば、中心退縮脈絡網膜変性を有するヒト患者において観察される網膜の変化に対応する。
【００９７】
本発明のこの部分の目標は、ＳｋＱ製剤の、ＯＸＹＳラットにおける白内障および黄斑変性の発生に対する効果を調査することである。
【００９８】
研究は、合計１２０匹のオスＯＸＹＳおよびWistarラットを用いて行われた。動物をそれぞれ５匹の群で自然照明条件下に置いた。ただし、標準的粒状食餌および水を自由に与えた。１．５月齢で、１％トロピカミド点眼液で予備瞳孔拡張後、「ベッタ」（"Betta"）直接検眼鏡（独）を用いた検眼鏡検査にラットを付した。ＯＸＹＳラットの視覚器における顕著な変化の発達に重要である１．５〜３ヶ月の期間、動物にＳｋＱ１（体重１ｋｇあたり５０ナノモル）、またはＫＢｒ（体重１ｋｇあたり５０ナノモル）またはビタミンＥ（酢酸α−トコフェロール（ウラルビオファーム"Uralbiofarm"）、２０ｍｇ／ｋｇ）のいずれかを投与した。後者は、参考基準として本発明者らにより以前から使用されている。動物は、通常の食餌前に乾燥パンの小片上の化合物を摂取し、無処理群は、同様の乾燥パンの小片のみを摂取した。抗酸化物質を用いたコースが完了したら、動物を再検査した。製剤摂取の結果の評価において主観性を排除するために、動物が飼育されていたケージからすべての識別書を事前に取り除いた。
【００９９】
水晶体の状態を臨床診療において採用される採点システムにしたがって、０〜３のポイントで評価した。０−水晶体は透明である、１−斑点状の弱い混濁、２−複数点の混濁、および３−水晶体皮質または水晶体核の強い混濁。黄斑領域における斑点状変化の存在および程度を一般に採用される分類に従って評価した。０−変化無し、１−「ドルーゼ」と呼ばれる小さな黄色沈着物が水晶体の後極において出現する病状の第一期、２−第二期、０．５から１のサイズのディスク直径を有する境界鮮明な顕著な黄色斑点の発達（着色された網膜剥離の滲出性剥離作用）、および３−黄斑領域中への広範な出血を伴う第三期。
【０１００】
結果
検眼鏡検査は、１．５および３月齢のWistarラットにおける水晶体および網膜の黄斑領域における変化を明らかにしなかった。ＯＸＹＳラットにおいては、逆に、初期の白内障（得点１）が事例の２０％において観察され、第一期の黄斑変性が１．５月齢の事例の１１０％において観察された。
ＯＸＹＳラットの無処理群におけるコントロールにおいて３月齢で、水晶体の病理変化が調査された眼の９０％において観察され、例えば、眼の３５％が白内障の第二期であった。黄斑変性は動物のコントロール群の眼の８５％において観察され、その１６％はこの病状の第二期に相当した（図８）。
【０１０１】
ＫＢｒを摂取したＯＸＹＳラットの群において、水晶体変化は、９３％の眼において観察され、眼の合計数の５７％が第二期の白内障を有していた。網膜の黄斑領域における変化は、この群からの動物の眼の８７％において観察され、これらの変化の１３％は疾患の第二期に相当した。
ＳｋＱ１を摂取した動物において、いくつかの水晶体変化を事例の４６％において記録し、これらは全て白内障の第一期に相当した。この群のＯＸＹＳラットにおける網膜の黄斑領域における変化が事例の３８％において明らかになり、黄斑変性の第一期に相当した。
【０１０２】
ビタミンＥを摂取したラットにおいて、３月齢で、水晶体変化が事例の５８％において記録され、変化の１２％は白内障の第二期に相当した。網膜の黄斑領域における変化は、この群からのＯＸＹＳラットの５４％で明らかになり、８％は黄斑変性の第二期に相当する。これらの実験の結果を図７〜１２にグラフにより示す。
よって、本実施例は、老化に伴う眼疾患の予防におけるＳｋＱ１適用の有効性、よって酸化的ストレスに関連する疾患を対処するための、構造（Ｉ）に対応するミトコンドリア抗酸化物質の有効性を納得できるように例示する。
【実施例１０】
【０１０３】
「心筋に対するミトコンドリア抗酸化物質ＳｋＱ１の保護作用」
活性酸素種（ＲＯＳ）がその濃度に応じて、心筋に対して調節または毒性効果を有することは公知である。ＳｋＱ１製剤を試験する場合、ＲＯＳ作用を調節するその能力が見出された。ＳｋＱ１製剤を静脈内または食品とともに（５０μｇ／ｋｇ）投与されたラットの単離された心臓に関して実験を行った。製剤の静脈内投与後２時間、または食品とともに投与した２週間後に、心臓を摘出した。心臓の逆行性潅流は、クレブス（Krebs）溶液を一定割合で用いて従来の手順に従った。記録された潅流圧（ＰＰ）は冠状血管の緊張を特徴づけた。自然な心拍数および左心室における等容性圧も測定した。１５０μＭ Ｈ２Ｏ２、標準的ＲＯＳ生成剤の４０分投与に際して、これらのパラメータにおける変化を記録した。
【０１０４】
ＳｋＱ１静脈内投与を１回行った一連の実験において、潅流速度の２倍の増加に続いて、両群において、適切に等しい潅流圧上昇（１２０〜１２５ｍｍＨｇ）が起こった。Ｈ２Ｏ２ を導入することにより、通常の２相効果が得られた。すなわち、初期ＰＰ減少に続いて増加した。コントロール群において、最小ＰＰ量は９５＋５ｍｍＨｇであり、一方、ＳｋＱ１を受容した動物群においては、７７＋２ｍｍＨｇ（ｐ＜０．０２）であった。Ｈ２Ｏ２導入前の初期レベルと比較した最大ＰＰ減少は、平均でそれぞれ−２８＋３ｍｍＨｇおよび−４３＋５ｍｍＨｇであった（ｐ＜０．０５）。ＳｋＱ１摂取が延長された一連の実験において、コントロール群における最大ＰＰ減少は平均で−２１＋５ｍｍＨｇであり、一方、ＳｋＱ１を受容した動物の群においては、−３８＋５ｍｍＨｇ（ｐ＜０．０３）であった。群間の顕著な違いは、Ｈ２Ｏ２導入の最後で、それぞれ、−５＋６ｍｍＨｇおよび−２９＋６ｍｍＨｇのままであった（ｐ＜０．０３）。従って、１回または長期のＳｋＱ１投与はどちらも、Ｈ２Ｏ２の初期血管拡張効果を促進した。加えて、ＳｋＱ１の長期投与に際して、Ｈ２Ｏ２の冠状血管に対する毒性効果は減少した。
【０１０５】
よって、ＳｋＱ１製剤は、調節を促進し、単離された心臓の冠状血管に対するＲＯＳの毒性効果を減少させると結論づけることが可能である。ＳｋＱ１のこの効果は、心臓血管疾患を対処するために使用できる。
【実施例１１】
【０１０６】
「構造（Ｉ）に対応する化合物の、正常および腫瘍細胞の形態および移動度に対する効果」
ＳｋＱ１タイプの抗酸化物質は、培養物中の細胞の形態学的変化を引き起こし、この変化は、その移動度の減少および基体と細胞の接着の強化を伴う。
【０１０７】
ヒト皮膚および肺の正常線維芽細胞およびＨｅＬａ細胞を低細胞密度（２０〜３０％コンフルーエンス）で培養した。その面積、分散および伸長を測定することにより、細胞の形態計測を行った。ファロイジン−ローダミン（アクチンフィラメント）、チューブリン（微小管）に対する抗体およびビンキュリン（基体と接触する）で固定細胞調製物を染色することにより細胞骨格構造を検討した。マイクロビデオカメラを用いて細胞の移動度を検討した。
【０１０８】
２０ｎＭ ＳｋＱ１とともに６日間プレインキュベートされた線維芽細胞は形態が急変した。細胞の平均面積は２．９倍高く、拡散指数は２．４倍低下し、伸長指数は２．３４から０．６９に減少した。アクチンフィラメントの含量は、３．７倍増加し、従って、その単位面積あたりの密度はコントロールの１３６％になった。アクチンフィラメントを大きな束（ストレス・フィブリル）にした。基体との接触数は大きく増加した。線維芽細胞の移動度は急落した。全ての観察された変化は線維芽細胞増殖速度を減少させなかった。ＨｅＬａ細胞に関して行われた同様の測定は、その平均面積が２．６倍増加し（分散および伸長パラメータにおいては変化無し）、アクチンフィラメントの含量は増加するので、平均密度は変わらないままであることを示した。
【０１０９】
したがって、ＳｋＱ１タイプの抗酸化物質での処置に応答した細胞の形態変化およびその移動度の減少は、細胞の増殖および転移の可能性の減少を暗示する。
【実施例１２】
【０１１０】
「構造（Ｉ）に対応する化合物の腫瘍細胞に対する細胞傷害効果」
構造（Ｉ）に対応し、酸化促進物質およびタンパク質修飾機能を有する化合物は、ミトコンドリア中に非選択的孔の開口、ミトコンドリアの膨潤、シトクロムｃの膜間腔から細胞質中への放出、およびアポトーシスを誘発する。抗アポトーシスタンパク質のミトコンドリア標的化阻害物質は、当分野において公知のこれらの化合物および化学療法薬により引き起こされるアポトーシスを促進することができる。
【０１１１】
隣接するジチオール（フェニルアルセンオキシド、ＰＡＯ）と架橋する酸化促進物質および化合物は、無細胞系および細胞中の双方において、非選択的孔の開口およびミトコンドリアの膨潤を誘発することがわかった。特に、胸腺リンパ球に関する実験において、ＰＡＯを用いたミトコンドリア孔の誘発は、Ｃａ２＋イオンをミトコンドリアから細胞質へ放出することにつながった。電子顕微鏡を用いることにより、膨潤したマトリックスを有するミトコンドリアがこれらの細胞において観察された。ＰＡＯは高い非特異性毒性を有し、これは、シトクロムｃ放出のメカニズムおよび関連するアポトーシスの調査においてＰＡＯの使用を許容しない。いくつかの細胞モデルにおいて、孔開口を誘発する化学物質も、シトクロムｃの細胞質への放出およびアポトーシスを促進することがわかった。ＰＡＯおよび類似化合物をミトコンドリアへ標的化導入することにより、その非特異性毒性を減少させ、標的細胞におけるアポトーシスの誘導を許容すると仮定することができる。正電荷を有する化合物（ホスホニウムおよびローダミン誘導体）は、正常細胞のミトコンドリアにおけるよりも、はるかに有効に、速く成長する腫瘍細胞のミトコンドリアにおいて蓄積し、保持されることが以前に示された。上記情報は、有効かつ選択的な抗癌製剤が、構造（Ｉ）に対応する化合物に基づいて産生されるであろうことを予想する根拠となる。
【実施例１３】
【０１１２】
「構造（Ｉ）に対応する化合物の腹水癌の場合における抗癌効果」
構造（Ｉ）の化合物が腫瘍性疾患の処置において有用であり得るかどうかを調べるために、本発明者らは、エールリヒ（Ehrlich）腹水癌が人工的に誘発されたマウスに対するＳｋＱ１の効果を試験した（急性腫瘍性疾患の発達の標準的モデル）。
ＮＭＲＩ系マウスにＳｋＱ１を様々な濃度、１０、１または０．１μＭの濃度で、飲料水と共に投与した。その結果（エールリヒ腹水癌が事前に誘発されたマウスの生存率）を図１３に示す。この実験のネガティブコントロールは水である一方、ポジティブコントロールは周知の抗ガン剤シスプラチンであった。
得られた結果は、構造（Ｉ）に対応するミトコンドリア標的化抗ガン製剤の抗腫瘍効果を示す。
【実施例１４】
【０１１３】
「選択的ミトコンドリア標的化化合物の光力学作用」
構造（Ｉ）に対応し、光増感機能を果たす化合物は、シトクロムｃの膜間腔から細胞質中への放出およびアポトーシスを誘発できる。
【０１１４】
正電荷を有する光増感剤（ローダミン類、クロロメチル−Ｘ−ロサミン）のプロトタイプは、ミトコンドリア中に蓄積し、中程度の照射に付された、種々の腫瘍細胞においてアポトーシスを引き起こす。類似の非ミトコンドリア標的化分子は、照射下（光線力学療法において潜在的な炎症性合併症をもたらし得る）で主に壊死性細胞死を引き起こす。今日まで研究されたプロトタイプ光増感剤は、その低い量子効率およびスペクトル緑色領域の最大吸収のために、実際に使用されない。臨床診療において使用されるプロトポルフィンおよびフタロシアニン誘導体ベースの光増感剤は、高い量子効率、スペクトルの赤色領域における最大の吸収（これは綿密な組織の治療有効性を改善する）を有するが、これらは主にリソソームにおいて蓄積し、壊死を誘発する。構造（Ｉ）に対応する化合物の処方中のかかる分子のミトコンドリアターゲティングは、スペクトルの赤色領域における低強度照射により腫瘍細胞のアポトーシスを誘発させる。
【０１１５】
正電荷を有する化合物（ローダミンおよびホスホニウム誘導体）は、急速に成長する腫瘍のミトコンドリアにおいて、正常組織の細胞におけるよりも大幅に蓄積し、保持されることがわかった。構造（Ｉ）に対応する化合物ベースの光増感剤は、腫瘍において選択的に蓄積し、これにより光線力学療法において使用される場合にその有効性が増大するであろうことが推測される。
【実施例１５】
【０１１６】
「酵母ヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）の細胞に関して実証された、真菌細胞に対するミトコンドリア抗酸化物質ＳｋＱ１の保護効果」
本発明者らは、構造（Ｉ）に対応するミトコンドリア抗酸化物質ＳｋＱ１が１０ｍＭ過酸化水素により引き起こされるヤロウィア・リポリティカの細胞死を部分的に予防することを示した。
【０１１７】
図１４からわかるように、シクロヘキシミドＤ、トコフェロールおよびＳｋＱ１の効果は非常に類似している。シクロヘキシミドの効果は本発明者らにより以前に例証された。この効果は、アポトーシスの細胞におけるタンパク質合成の正常な機能の必要性により説明される。α−トコフェロールの濃度を２５μＭに等しくした。その理由は、この特定の濃度がサッカロミセス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）細胞についてフェロモンおよびアミオダロンにより誘発されるプログラム化された細胞死に対して最大の保護効果を提供するためである（Pozniakovsky A.I., Knorre D.A., Markova O.V., Hyman A.A., Skulachev V.P., Severin F.F., 2005、J. Cell. Biol. 168(2): 257-69）。この濃度は、ＳｋＱ１の１０倍低い濃度と同程度に有効であることが証明された。これらの結果は、ミトコンドリア標的化抗酸化物質が真菌細胞に対して有用であり、ＳｋＱ１タイプの化合物を酵母、他の真菌および微生物の工業的培養物の保護に使用できることを示す。
【実施例１６】
【０１１８】
「高等植物の発育におけるミトコンドリア抗酸化物質ＳｋＱ１の効果」
挿し木を人工寒天化ＭＳ培地上で、１μＭ ＳｋＱ１（３植物）を添加して、またコントロールとしてＳｋＱ１を添加しない（３植物）で成長させた。挿し木を５０ｍｌ透明試験管中に入れ、人工気象室中、３週間、２７℃で、定期的に照射しながら（明所で１４時間、暗所で１０時間）成長させた。次に、植物を暗ストレスに付した。即ち、完全な暗所中で７日間成長させた。
【０１１９】
結果として、コントロール植物は無色になった一方、ＳｋＱ１の存在下で成長させた植物はその緑色を保持していた。次に、植物を通常の照明条件に戻し、さらに２０日間成長させた。かかる処置後、ＳｋＱ１の存在下で成長させた植物はコントロール植物よりも３倍大きくなった。
【０１２０】
この実験例は、ミトコンドリア標的化抗酸化物質の植物全体に対して好ましい効果を例示する。結局、このような化合物は、人工培地（遺伝子組み換え植物の産生において必要な段階）上で植物を生長させるため、植物細胞培養物の生存能力を増大させるため、および農業において作物の生存能力を増加させるために使用できる。
【０１２１】
当業者は、上記実施例および明細書に基づいて明らかな追加または変更をなすことができ、これにより、本発明の目的に関して有用な、請求の範囲に記載されているすべての化合物および組成物を得ることが可能になる。すべてのこのような追加および修正は、記載される本発明の請求の範囲内に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１２２】
【図１】人工膜を通るＳｋＱ１の透過を示す図である。
【図２】キノール誘導体ＭｉｔｏＱおよびＳｋＱ１の自然酸化を示す図である。
【図３】スーパーオキシドラジカルを系中に導入するための「ＭｉｔｏＱ」および「ＳｋＱ１」キノール誘導体の酸化速度の増加を示す図である。ａは空気の酸素およびスーパーオキシドラジカルの両方により還元された形態の酸化速度であり、ｂはスーパーオキシドラジカルのみにより還元された形態の酸化速度である。
【図４】サクシネート（５ｍＭ）により活性化された、２μＭロテノンの存在下でのラット肝臓ミトコンドリア（０．２ｍｇ／ｍｌタンパク質）の呼吸鎖による「ＭｉｔｏＱ」および「ＳｋＱ１」の還元を示す図である。
【図５】２μＭロテノンの存在下、スクシネート（５ｍＭ）により活性化されたラット肝臓ミトコンドリアの呼吸鎖によるキノール「ＭｉｔｏＱ」および「ＳｋＱ１」の酸化を説明する図である。キノール誘導体の還元が完了した後、呼吸鎖を２５ｍＭマロネートでブロックし、「ＭｉｔｏＱ」および「ＳｋＱ１」の再酸化速度を測定した。
【図６】「ＭｉｔｏＱ」および「ＳｋＱ１」のＨｅｌａ細胞に対する細胞傷害効果を示す図である。生きている細胞のパーセンテージはＭＴＴ−ホルマザンのＯ．Ｄ．（４９２ｎｍ）に比例する。
【図７】ＳｋＱおよびいくつかの他の製剤の、ＯＸＹＳラットにおける網膜変性の発達に対する影響を示す図である。網膜の黄斑部において変性変化を有する目のパーセンテージをＹ軸に沿ってプロットする。
【図８】第二期の斑状変化を有する目のパーセンテージを示す図である。ＳｋＱ１の投与は、黄斑変性の罹患率を減少させるだけでなく、斑状変化の程度も実質的に減少させた。第二期の黄斑変性を有する目のパーセンテージをＹ軸に沿ってプロットする。
【図９】投与前およびＫＢｒ、ＳｋＱ１またはビタミンＥの４５日コース後の、ＯＸＹＳラットにおける網膜の黄斑部における変性変化を示す図である。
【図１０】ＯＸＹＳラットにおける白内障罹患率に対する、ＳｋＱ１およびいくつかの他の製剤の影響を説明する図である。水晶体の変化を有する目のパーセンテージをＹ軸に沿ってプロットする。
【図１１】第二期の水晶体変化を有する目のパーセンテージを示す図である。ＳｋＱ１の投与は、罹患率を減少させるだけでなく、白内障の程度も実質的に軽減した。疾患の第二期に対応する変化を有する目のパーセンテージをＹ軸に沿ってプロットする。
【図１２】投与前およびＫＢｒ、ＳｋＱ１およびビタミンＥの４５日コース後のＯＸＹＳラットにおける水晶体の状態を示す図である。
【図１３】エールリヒ腹水癌が移植されたマウスの生存率に対する３つの異なる濃度のＳｋＱ１の影響を示す図である。
【図１４】タンパク質、合成阻害物質、シクロヘキシミドＤ（ＣｈＤ）および抗酸化物質の、５ｍＭ過酸化水素で処理されたヤロウィア・リポリティカの細胞に対する影響を示す図である。生存率は、固体培地の成長したコロニー数を用いて評価した。細胞を３時間のインキュベーション後に固体培地上に移した。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学および医学に関し、特に、ミトコンドリアへ生物活性物質を標的化導入するための医薬組成物を調製するのに医学において有用であり、かかる導入は、プロトン電気化学ポテンシャルにより行われる。また、本発明は、有機組織に作用する方法に関し、該方法は、必要とされる生物活性物質をミトコンドリアへ導入することを有する。
【発明の背景】
【０００２】
ミトコンドリアは、多くの重大な細胞内プロセス、例えば、細胞におけるエネルギー代謝（ミトコンドリアの主な機能は、細胞にエネルギーを提供することであるから）、ある物質（例えば、脂肪酸）の代謝などにおいて重要な役割を果たす。ミトコンドリアはまた、フリーラジカル（ＦＲ）および活性酸素種（ＲＯＳ）（生きている細胞における多くのプロセスに影響を及ぼし得る非常に反応性の高い部分）の形成および利用に直接関与する。最後に、最近、ミトコンドリアはプログラム化された細胞死のプロセスにおいて重要な役割を果たすことが証明された。
【０００３】
多くの疾患は、ミトコンドリアの機能障害に関連することが知られている。このカテゴリーには、ＦＲおよびＲＯＳの増大した形成、組織または器官内の細胞の単独または集団死、プログラム化された細胞死メカニズム（アポトーシス）における異常、脂肪酸代謝における異常などに関連する全ての障害が含まれる。
【０００４】
ミトコンドリアに対して作用することにより、細胞および全有機組織の生命活動の最も多様な態様に影響を及ぼすことが可能であるという仮説が立てられる。
本発明の構成内において、これらの小器官における様々な生物活性物質を標的化導入し且つ蓄積することによって、生きている細胞におけるミトコンドリアに対して作用するための新規技術が提案されている。
【０００５】
この方法は、明らかな利点を提供する。物質を標的化導入することにより、その適用の有効性が増大し、全体的な投与量が減少し（細胞の標的区画内部に物質が繰り返し蓄積するために物質の有効濃度が達成されるため）、副作用の可能性および強度を減少させることができる。
【０００６】
ミトコンドリア自体の構造機構は、ターゲティングについてのまたとない機会を提供し、機能するミトコンドリアは、そのマトリックスから細胞質中へプロトンを活発に排出する。このプロセスは、ミトコンドリアの内膜上に水素イオンの非常に高い電気化学ポテンシャル（プロトンポテンシャル）を形成する。
【０００７】
生体エネルギー研究の結果、プロトンポテンシャルに依存した方法で、ミトコンドリア膜を貫通しミトコンドリア内部に活発に蓄積することができる多くの化合物が見いだされている。これらの物質は、「スクラチェフ（Skulachev）イオン」（Green D.E., "The electromechanochemical model for energy coupling in mitochondria", 1974, Biochem. Biophys. Acta., 346: 27-780）と命名された。かかるイオンは通常、顕著な生物活性を示さない。本発明の主な考えは、スクラチェフイオン以外に、たとえば、ミトコンドリア中へ送達されるべき別の望ましい物質（本発明においては、エフェクタ（effector）部分、またはエフェクタと称する）を含む新規化合物を形成するためにスクラチェフイオンを使用することにある。
【０００８】
非常に限定された数のミトコンドリア標的化生物活性物質しか現在のところ知られていない。いくつかの関連する物質が、US6,331,532およびEP 1 047 701（ミトキノール（ＭｉｔｏＱ）、ミトビタミンＥ（ＭｉｔｏＶｉｔＥ））およびEP 1 534 720（トリフェニルホスホニウムと結合したスーパーオキシド・ジスムダーゼおよびグルタチオン・ペルオキシダーゼ模倣物）に記載されている。これらの化合物のいくつかおよびその活性は、以下に記載される論文において検討されている。
【０００９】
スーパーオキシド・ジスムダーゼおよびグルタチオン・ペルオキシダーゼ模倣物を含む化合物は、EP 1 534 720において、酸化的ストレスなどが原因の疾患を処置するために適した、ミトコンドリア標的化抗酸化物質として権利請求されている。この発明を例示する実験例において、EP 1 534 720のデータは、これらの模倣物のミトコンドリアへの浸透能ならびに溶液中および単離されたミトコンドリアとの相互作用におけるその抗酸化作用について、提示されている。これらの化合物の細胞または有機組織全体に対する作用についてのデータは提示されていない。しかし、同時に、タンパク質のスルフヒドリル基に関して望ましい模倣物の高い反応性についてのデータがある。かかる反応性は、Filipovska A., Kelso G.F., Brown S.E., Beer S.M., Smith R.A., Murphy M.P., J Biol. Chem. 2005, 280(25): 24113-26により示されるように、スーパーオキシド・ジスムダーゼまたはグルタチオン・ペルオキシダーゼ（エブセレン）の模倣物を含有するミトコンドリア標的化抗酸化物質の有効性を急速に減少させ、適用の可能性を著しく限定するはずである。この研究は、ミトコンドリア−ターゲティング部分と共有結合したエブセレン（全化合物はミトエブセレンと称する）が従来のエブセレンと同じ抗酸化効果を有することを証明した。換言すると、ミトエブセレンタイプの化合物のターゲティングは、これがその抗酸化作用を向上させるとしても、この利点は、ミトエブセレンの望ましくない副作用により減少する。
【００１０】
別のミトコンドリア標的化抗酸化物質はＭｉｔｏＶｉｔＥ、すなわちターゲティング部分としてトリフェニルホスホニウム、および抗酸化物質としてビタミンＥを含む化合物である。この発明の明細書において、EP 1 047 701のデータは、ラット脳ホモジネートにおけるこの化合物の抗酸化活性、及びＭｉｔｏＶｉｔＥの、培養物中の単離ミトコンドリアおよび生きている細胞への浸透能について、提示している。最高１０μＭまでの濃度において、ＭｉｔｏＶｉｔＥは、培養物における細胞の生存能力に影響を及ぼさず、その間、ＭｉｔｏＶｉｔＥのさらなる増加は、細胞の生存性の減少につながることも示されている。しかしながら、ＭｉｔｏＶｉｔＥの個々の細胞、組織、器官または有機組織全体に対する抗酸化活性は証明されなかった。ＭｉｔｏｖｉｔＥの培養物中の細胞に対する効果は、刊行物Jauslin M.L., Meier T., Smith R.A., Murphy M.P., FASEB J. 2003 17(13): 1972-4において記載されている。この論文から、ＭｉｔｏＶｉｔＥがプログラム化された細胞死を防止する能力は、アンカプラーＦＣＣＰ（3-フルオロメチル−カルボニルシアニドフェニルヒドラゾン）にもかかわらず、すなわち、目的とされるＭｉｔｏｖｉｔＥのミトコンドリアにおける蓄積が可能でない状況下で、消滅しないということになる。これらのデータは、ＭｉｔｏＶｉｔＥのミトコンドリアターゲティングが起こる場合でさえも、かかるターゲティングがこの化合物の生物学的作用において決定的役割を果たさないことを示す。
【００１１】
ミトコンドリア標的化抗酸化物質ＭｉｔｏＱおよびその変異体（ＭｉｔｏＱ５、ＭｉｔｏＱ３）は、Ｃ−１０リンカー（適宜、Ｃ５、Ｃ３）によりトリフェニルホスホニウムと結合したユビキノン（還元された形態におけるユビキノール）を有する。この発明US6,331,532号の明細書において、ＭｉｔｏＱは、酸化的ストレスと関連する疾患の処置または予防を目的とする組成物における活性化合物として権利請求されている。この発明の明細書において提示される実験において、溶液におけるＭｉｔｏＱの抗酸化特性、この化合物の単離ミトコンドリアへの浸透能、単離ミトコンドリアの呼吸効率に対する影響が示されている。しかしながら、生きている細胞、組織、有機組織全体の器官、毒性の存在または不在に対するＭｉｔｏＱの効果についてのデータはこの文書においては提示されていない。
【００１２】
ＭｉｔｏＱ活性に対するさらなるデータは、同じ発明者らのWO2005/019233号（この中で、発明者らは、単離ミトコンドリアに対する脂質過酸化反応を防止するためのＭｉｔｏＱの能力を示している）において見出すことができ、さらにAdlam V.J., Harrison J.C., Porteous C.M., James A.M., Smith R.A., Murphy M.P., Sammut I.A., 2005, FASEB J. 19: 1088-95による刊行物においても見出すことができる。この論文において、著者らは、ＭｉｔｏＱを給餌されたラットの実験と、それに続くラゲンドルフ（Lagendorff）システム（ラゲンドルフ（Lagendorff）潅流心臓調製物）を用いたラットの心臓機能の研究において有機組織に対するＭｉｔｏＱの作用の現在のところ公知である唯一の例を提示した。報告されたデータは、ＭｉｔｏＱを虚血性心筋障害の予防または処置のために使用できるという概念を間接的に裏付ける。しかしながら、この研究のいくつかの不正確で異論のある点のために、かかる記載事項を納得できるように証明することができない。このように、著者らにより使用されるモデル（３０分の正常温度の虚血と、それに続く潅流）は、心筋の虚血性障害を研究するためにしばしば使用されるモデルである。しかしながら、この方法の主な欠点は、潅流中の単離された心臓の電気的不安定性である。ある数の心臓は、周期的または不変細動のためにその機能を全く回復することができず、周期的不整脈はこのような一連のほとんどすべての実験において起こることが知られている。記載された論文において、細動も不整脈も指摘されていない。したがって、著者により得られる平均値が実験の全群または不整脈があまりはっきりしないこれらの実験のみを特性化するかどうかははっきりしないままである。その上、上記理由を考慮して、各実験群における動物の数（６）は所与のモデルについて明らかに十分でないことは明らかである。
【００１３】
上記論文の著者により得られたデータは正しくないという仮定は、必然的に心筋細胞の死が続いて起こる潅流条件下でのコントロールおよび実験シリーズの両方における収縮機能の有意な増加のかなり奇妙な観察により部分的に立証される。収縮機能の計算が、「スイッチオフされた」不安定なものを排除した活動的な心臓のみを用いて行われるならば、この結果を得ることができ、一方、潅流の速度は全ての心臓を用いて計算された。このような方法は明らかに不正確である。ＭｉｔｏＱ処置群における任意の潅流期間についての平均データはコントロール調製物で処置された群においてよりも高いが、これらの群を互いに比較し、従ってこれらの差の有意性は明らかでない。
【００１４】
従って、ＭｉｔｏＱが唯一の心臓保護化合物であるという著者らによりなされた主な結論は、十分な説得力はないようである。このような見解は、ミトコンドリアの超微細構造の調査の結果が無いこと、乳酸デヒドロゲナーゼ、シトクロムＣ、カスパーゼ３、コンプレックス１の生成およびコントロール物質で処置された群におけるミトコンドリア中のアコニターゼの作用により裏付けられる。
【００１５】
全体として、上記開示の詳細な分析により、得られた結果の選択および分析の段階で非常に弱い点が明らかになる。上記論文の著者らは、用いたモデルの対処に関する経験が豊富でない可能性がある。したがって、ＭｉｔｏＱの心臓保護作用が立証されていないままであると断言することができる。
【００１６】
ＭｉｔｏＱの細胞培養物に対する作用に関する非常に有望な結果にもかかわらず、この化合物の実際の適用の可能性を疑ういくつかの観察および計算があることに注目すべきである。例えば、ＭｉｔｏＱが培地中約１μＭの濃度でその抗酸化および抗アポトーシス効果をもたらすことが、細胞培養物に関する実験において示された。現在のところ、これらの条件下で、ミトコンドリア中のＭｉｔｏＱ濃度は１ｍＭに達し得ることが証明されたと考えられる。一方、Smith R.A., Porteous C.M., Gane A.M., Murphy M.P., Proc Natl Acad Sci USA, 2003, 100(9): 5407-12により、ＭｉｔｏＱが実験動物に給餌される場合、ＭｉｔｏＱの最も酸化的ストレス感受性の高い組織（脳および心筋）における蓄積は、合計で、生体重１グラムあたり１００ピコモルの最大濃度になることが示された。計算により、ミトコンドリアで最大飽和された組織（心筋）中のこのようなＭｉｔｏＱ濃度に関して、ミトコンドリア内部のＭｉｔｏＱ濃度は１００ナノモルを超えないことが示される。これは、細胞培養実験において有効であることが証明された濃度よりも１０００倍以上低い。実験動物に投与される用量を少なくとも１０倍増加させることは、調製物の毒性のためにできない。
【００１７】
従って、当分野の現状は、１種類のみのミトコンドリア標的化化合物、ミトコンドリア標的化抗酸化物質として権利主張される物質を開示する。データには他のミトコンドリア標的化生物活性化化合物は記載されていない。ミトコンドリア標的化抗酸化物質として権利主張される、すでに開示された物質は、その生物活性が非常に不十分に記載され、権利主張される目的についてのその実用化の見込みは不明確であるので、課された問題を解決しないことに注目すべきである。加えて、開示された化合物の大部分について、その効率の悪さはすでに証明されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
本発明は、水素イオンおよびスクラチェフイオンの電気化学ポテンシャルのエネルギーの使用による、生きた細胞のミトコンドリア中の生物活性物質の濃度の原則に基づく。このような方法は、意外にも、用いられる生物活性物質の用量の数倍の減少、つまり最も重要な細胞内プロセスにおける重要な要素である、目的とされるミトコンドリアに対する有効な作用を達成することを可能にする。このように、望ましくない副作用の可能性および強度の何倍もの減少の機会が提供される。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
したがって、本発明の一つの態様は、水素イオンの電気化学ポテンシャルのエネルギーを犠牲にして、生物活性物質をミトコンドリアへ標的化導入することにより、有機組織に対して作用する方法を提供することにある。
【００２０】
本発明の他の態様は、細胞のミトコンドリアへ生物活性物質を標的化導入するための組成物を提供することにあり、該組成物は、化合物全体をミトコンドリア中へ導入するためのターゲティング部分、リンカー基、およびエフェクタ（必要とされる生物活性を有する物質）からなる化合物を含有する。全体として、かかる化合物は、下記一般式で表すことができる。
【００２１】
【化１】
【００２２】
式中、Ａは、以下のａ）〜ｅ）を有するエフェクタ基（effector group）である。
ａ）抗酸化物質（ＩＩ）および／またはその還元体。
【００２３】
【化２】
【００２４】
式中、ｍは１〜３の整数であり、各Ｙは、低級アルキル、低級アルコキシからなる同じか又は異なる置換基を表すか、または隣接する２つのＹは連結して下記構造および／またはその還元体を形成する。
【００２５】
【化３】
【００２６】
式中、Ｒ１およびＲ２は同じか又は異なる置換基であり、それぞれは独立して、低級アルキルまたは低級アルコキシである。
ｂ）酸化促進物質（pro-oxidant）；
ｃ）アポトーシス誘導物質；
ｄ）ミトコンドリア局在の抗アポトーシスタンパク質の阻害物質；
ｅ）光増感剤。
本発明のこの態様において、
抗酸化物質は、ＦＲおよびＲＯＳと反応することができ、その危険な性質を中和する化合物である。そのラジカル形態における前記抗酸化物質は、ミトコンドリアの呼吸鎖と反応することができ、かくして、その後のＦＲまたはＲＯＳとの反応のためにその抗酸化特性を回復することができることが好ましい。構造（ＩＩ）に対応する好ましい抗酸化物質は、２，３−ジメチル−１，４−ベンゾキノール（プラストキノールの残基、つまり、プロトプラストのチラコイドから得られる最も強力な抗酸化物質の残基、すなわち、活発な性質のＦＲ−およびＲＯＳ−飽和部位のうちの１つの残基）。
【００２７】
酸化促進物質は、細胞中に侵入した際に、フリーラジカルおよび／または活性酸素種を形成することができるか及び／又はその形成を刺激することができる化合物、パラコート、メナジオン、有機ヒドロペルオキシドである。
【００２８】
アポトーシス誘導物質は、ミトコンドリア中に送達されると、何らかの形で活性化する、即ちプログラム化された細胞死（アポトーシス）を促す化合物である。化合物（Ｉ）の構成における好ましいアポトーシス誘導物質は、フェニルアルセンオキシド（phenyl arsene oxide）であり、現在のところ、ミトコンドリアの孔形成の最も有効な誘導物質と見なされる。
【００２９】
ミトコンドリア局在のタンパク質の抗アポトーシスタンパク質の阻害物質は、ミトコンドリアにおいて局在する１つ又は複数の抗アポトーシスタンパク質（膜抗アポトーシスタンパク質を含む）と相互作用でき、その活性を抑制できる化合物である。ミトコンドリア局在抗アポトーシスタンパク質の好ましい阻害物質はＡＢＴ７３７である。これらの化合物は、アポトーシス誘導を促進する化学療法剤と組み合わせた場合に特に有用であると考えられる。
【００３０】
光増感剤は、一重項酸素または他の活性酸素種またはフリーラジカルを照明下で産生することができる化合物である。好ましい光増感剤は、金属置換基およびその錯体を任意に含むフタロシアニン、ポルフィリンおよびその誘導体、特にＢＤＰ−ＭａＣまたはＢＤＰ−ＭａＤ；もしくはフォスキャン（ｆｏｓｃａｎ）（ｍＴＨＰＣ）である。
【００３１】
Ｌは、ａ）１以上の置換基で任意に置換されていてもよく、１以上の二重結合または三重結合を任意に含んでもよい直鎖状または分岐状炭化水素鎖；
ｂ）天然イソプレン鎖、
を有するリンカー基である。
ｎは１〜２０の整数である。
Ｂは、ａ）スクラチェフイオンＳｋ、
Ｓｋ＋Ｚ−
（式中、Ｓｋは脂溶性カチオンであり、Ｚは薬理学上許容可能なアニオンである）。
ｂ）１−２０アミノ酸を含有する荷電疎水性ペプチド、
を有するターゲティング基（targeting group）である。
【００３２】
ただし、構造（Ｉ）の化合物において、Ａはユビキノン（例えば、２−メチル−４，５−ジメトキシ−３，６−ジオキソ−１，４−シクロヘキサジエニル）でも、トコフェロールでもない化合物またはスーパーオキシド・ジスムダーゼまたはエブセレンの模倣物でもない。ここで、Ｌは二価デシルまたは二価ペンチルまたは二価プロピルラジカルであり、Ｂはトリフェニルホスホニウムである）。
ならびにその溶媒和物、異性体、プロドラッグおよび医薬上許容可能な担体。
【００３３】
本発明のさらなる態様は、ミトコンドリア標的化抗酸化物質を活用して、別個の細胞、組織、部位、器官または有機組織全体におけるフリーラジカルまたは活性酸素種の量を減少させることにより、治癒、予防または軽減できる疾患の処置において有用な、治療剤または予防剤−構造（Ｉ）に対応する化合物−を提供することである。本発明のこの態様に関連して、
−ヒトまたは動物の寿命を延ばすための、構造（Ｉ）に対応するミトコンドリア標的化抗酸化物質の使用、
−疾患が有機組織の老化および酸化的ストレスの増大により引き起こされる場合に有効な治療薬または予防薬の使用、
−特に、酸化的ストレスおよび／または視覚を与えるプロセスに関与する網膜細胞の大量死により引き起こされる眼科疾患を治療するため、白内障を治療するため、網膜黄斑変性を治療するための、ミトコンドリア標的化抗酸化物質の使用、
−組織および器官における大量のプログラム化された細胞死により引き起こされる疾患および／または損傷組織においてプログラム化された細胞死を開始するシグナルの伝播に関連する疾患の処置または予防のための、構造（Ｉ）に対応するミトコンドリア標的化抗酸化物質の使用、
−プログラム化された細胞死、アポトーシスまたは壊死が重要な役割を果たす場合に、心臓血管疾患を処置および／または予防するため；心臓麻痺、発作を処置および／または予防するため；再酸素化の悪影響を予防するため；の、構造（Ｉ）に対応するミトコンドリア標的化抗酸化物質の使用、
−正常組織を損傷から保護するための外科手術の際の構造（Ｉ）に対応するミトコンドリア標的化抗酸化物質の使用、
−移植の際の移植された物質の拒絶反応の予防のため；ならびに移植物質の保存のため；の、構造（Ｉ）に対応するミトコンドリア標的化抗酸化物質の使用、
−熱傷の痕跡を克服するため、外科縫合を含む創傷の治癒を刺激するための、構造（Ｉ）に対応するミトコンドリア標的化抗酸化物質の美容術における使用、
−構造（Ｉ）に対応するミトコンドリア標的化抗酸化物質の抗炎症剤としての使用、
が提案される。
【００３４】
本発明のさらに別の態様は、腫瘍性疾患を治療または予防するための構造（Ｉ）に対応する治療薬または予防薬を提供することである。本発明のこの態様に関連して次のものが提案される。
−転移の形成、血管形成に対抗するため；ならびに目的とされる癌細胞におけるプログラム化された細胞死の開始のため；の、ミトコンドリア標的化抗ガン剤の使用、
−構造（Ｉ）に対応するミトコンドリア標的化酸化促進物質の、ミトコンドリア標的化抗ガン製剤、好ましくはミトコンドリア標的化パラコート、ミトコンドリア標的化メナジオン、またはミトコンドリア標的化抗酸化物質であって、ミトコンドリア呼吸鎖により回復（還元）できず、したがって、酸化促進特性を示すもの（例えば、化合物ＤＭＭＱ）としての使用、
−構造（Ｉ）に対応するミトコンドリア標的化アポトーシスの誘導物質の、ミトコンドリア標的化抗ガン製剤としての使用。ミトコンドリアはプログラム化された細胞死のひきがねになる可能性を多数提供するので、このような方法は従来のアポトーシス誘導物質の使用よりも好ましい。このような開始の好ましい方法の一つは、ミトコンドリア膜タンパク質のスルフヒドリル基の、ミトコンドリア標的化アポトーシス誘導物質のエフェクタ基を介した化学結合である。このような化合物の好ましいエフェクタ基はフェニルアルセンオキシドである。
−ミトコンドリア局在の抗アポトーシスタンパク質のミトコンドリア標的化阻害物質の、構造（Ｉ）に対応するミトコンドリア標的化抗ガン製剤としての使用。好ましいタンパク質であって、その活性がかかる製剤により阻害されるべきものは、ｂｃｌ−２および同類のタンパク質である。最も好ましい阻害物質の一つはＡＢＴ７３７である。
【００３５】
ミトコンドリア標的化抗ガン製剤として、ミトコンドリア局在の抗アポトーシスタンパク質のミトコンドリア標的化阻害物質およびガン細胞のプログラム化された死を誘導する従来の製剤を含有する組成物を使用することも本発明の一つの態様である。
【００３６】
本発明のさらに別の態様は、ミトコンドリア標的化抗ガン製剤としての、構造（Ｉ）に対応するミトコンドリア標的化抗酸化物質およびガン細胞のプログラム化された死を誘導する従来の製剤を含有する組成物の使用である。本発明のこの態様において、ガン細胞において、脂溶性カチオンをポンプ排出できる酵素（複数の薬剤耐性の原因である酵素）の活性が大きく増加することが観察されるので、脂溶性カチオンと結合する抗酸化物質の適用が好ましい。したがって、ミトコンドリア標的化抗酸化物質は、正常細胞において主に蓄積され、その結果、抗ガン治療中のその主な生存は、該治療の望ましくない副作用の強度を減少させる。
−癌の化学療法または放射線療法の有効性を増大させるための、ミトコンドリア標的化抗酸化物質の使用、
−ミトコンドリア標的化光増感剤の、ミトコンドリア標的化抗ガン製剤としての使用、
−アポトーシスのミトコンドリア誘導を許容する、癌の光線力学療法におけるミトコンドリア標的化光増感剤の使用。この方法は、（ａ）壊死（多くの望ましくない結果と関連する）ではなく、プログラム化された細胞死を活用して、癌細胞の除去を可能にし、（ｂ）用いられる光増感剤の量を本質的に減少させ、これにより望ましくない副作用の発生の可能性および強度が低下するので、従来の光線力学療法よりも本質的に優れた利点を数多く提供する。
−ミトコンドリア標的化抗酸化物質ＳｋＱ１の好ましい抗ガン剤としての使用。
【００３７】
本発明のさらに別の態様は、代謝に関連する疾患、糖尿病を処置するための構造（ＩＩＩ）の残基をターゲティング基（targeting group）として含む、ミトコンドリア標的化抗酸化物質の使用である。
【００３８】
フリーラジカルを活用して、組織、血液または細胞および細胞要素を含む他の物質を消毒する方法を提供することも本発明の一つの態様である。本方法の構成内で、所望の細胞および細胞要素は、ミトコンドリア標的化抗酸化物質により酸化的ストレスから保護される一方、全ての病原体はフリーラジカルにより破壊される。
【００３９】
本発明のさらに別の態様は、研究または技術目的のために、細胞培養におけるヒトまたは動物細胞の生存能力を向上させるためのバイオテクノロジーにおけるミトコンドリア標的化抗酸化物質の使用である。本発明のこの態様は、多くの場合において、細胞培地中の酸素濃度が本質的に組織中の酸素濃度を超え、これにより細胞中の酸化的ストレスの可能性が急増し、このことは次にアポトーシスまたは壊死の可能性がより高くなることにつながり、かかる細胞の生存能力を低下させるという事実に基づく。細胞をミトコンドリア標的化抗酸化物質で処置することにより、酸化的ストレスの激しさが急激に減少する。細胞をミトコンドリア標的化抗酸化物質で処置することはまた、細胞のバイオマスを著しく増大させ、かくしてその産生力を上昇させる。本発明のこの態様に関連して、次のものがある。
−医薬品、タンパク質、抗体を産生するための培養において、ヒト、動物、植物または真菌細胞の産生力を増大させるためのミトコンドリア標的化抗酸化物質の使用、
−医薬品、タンパク質、抗体を産生するために使用される場合、植物全体の産生力を増大させるための、ミトコンドリア標的化抗酸化物質の使用、
−医薬品、タンパク質、抗体を産生するために使用される場合、細胞培養において、酵母またはサッカロミセス（Saccharomyces）、ピヒア（Pichia）、ハンセヌラ（Hansenula）、エンドミケス（Endomyces）、ヤロウィア（Yarrowia）属の他の真菌の細胞の産生力を増大させるための、ミトコンドリア標的化抗酸化物質の使用、
−医薬品、タンパク質、抗体を産生するため、ならびに遺伝子組み換え植物を産生するために使用される場合、細胞培養における植物プロトプラストの生存能力を増大させるための、ミトコンドリア標的化抗酸化物質の使用、
−再生植物、カルス細胞の生存能力を増大させるための、トランスジェニック植物を産生するための、ミトコンドリア標的化抗酸化物質の使用、
−病原菌、原生動物、真菌、細菌を対処するための、ミトコンドリア標的化酸化促進物質の使用。
【００４０】
本発明の次の態様は、ターゲティング部分として脂溶性カチオンを使用して、ミトコンドリア標的化抗酸化物質を合成する方法を提供することである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４１】
次の実験例は、本発明を行う可能性、特に、構造（Ｉ）に対応する本発明の化合物の作用を例示するために提示される。これらの実施例は、特許請求の範囲の有効性をサポートするためのものであり、本発明の用途または使用の範囲を制限するものと理解すべきではない。
【実施例１】
【００４２】
構造（Ｉ）の化合物−ローダミンＧ ２，３−ジメチル−１，４−ベンゾキノン−５−デシルエステル−の合成
化合物ＳｋＱＲ１を合成した。この化合物は、構造（Ｉ）に対応し、プラストキノンはプロトプラスト、即ち、活性化された性質のほとんどのＦＲ−およびＲＯＳ−飽和部位のうちの１つのチラコイド中に存在する天然の抗酸化物質であるので、ターゲティング基としてローダミンＧおよび抗酸化エフェクタ基としてプラストキノン残基を有する。
【００４３】
【化４】
【００４４】
次の試薬および溶媒を研究では用いた。２，３−ジメチルヒドロキノン、１１−ブロモウンデカン酸、ローダミンＧ、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド、臭素酸カリウム、硝酸銀、過硫酸アンモニウム、炭酸セシウム（Fluka、Aldrich、SigmaまたはMerckから購入）；カラムクロマトグラフィは、シリカゲル「Silicagel 60」（０．０６３〜０．２ＭＭ）（Merck）上で行った。ジメチルホルムアミド、ジクロロメタン、ベンゼン、アセトニトリルおよび他の溶媒は国内で製造された。
【００４５】
ＴＬＣを「Kieselgel 60 F２５４」プレート（Ｍｅｒｃｋ）上で行った。ＵＶ領域において吸収する基を含む化合物を、ブルームバーグ（Brumberg）ケミスコープ（Chemiscope）を活用して検出した。キノン環を含む化合物はアンモニア蒸気中で検出された。ローダミン含有化合物を視覚的に検出した。
ＵＶ吸収スペクトルを＜Cary 50 Bio＞分光計（Varian）で記録した。
ＨＰＬＣ分析および精製を、Adjilent 1100装置で、１０ｍＭ Ｈ３ＰＯ４中アセトニトリル勾配において行った。
【００４６】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦおよびＥＳＩ質量スペクトルを、３３７ｎｍレーザを備えたUltraflexまたはAutoflex質量分析計（Bruker Daltonics、Germany）で実施した。
赤外スペクトルをSpecord 40上のフィルム上で記録した。
１Ｈ−および１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを、Bruker Avance-400分光計を用いて、３０３Ｋで記録した。
ＳｋＱＲ１の合成をスキーム１において示す。
【００４７】
【化５】
【００４８】
２，３−ジメチル−１，４−ベンゾキノン（２）の合成
２，３−ジメチルヒドロキノン０．８３ｇ（６ｍｍｏｌ）を、臭素酸カリウム０．３４ｇ（２ｍｍｏｌ）のＨ２Ｏ（６ｍｌ）および５Ｎ硫酸（０．３ｍｌ）の溶液に添加した。混合物を６０℃に加熱し、撹拌した。その後、反応温度を次に８０℃にした。反応が完了したら、混合物を室温に冷却し、エーテルで抽出した。合わせた有機層をＨ２Ｏで逆洗し、無水ＣａＣｌ２で乾燥し、濾過し、濾液を真空中で蒸発させて、粗生成物０．７４ｇ（９０％）を得た。標記化合物をエーテル（２０ｍｌ）に溶解し、シリカゲル層に通した（３０×３０ｍｍ）。シリカゲルをエーテルで数回洗浄し、エーテルを真空除去して、２，３−ジメチル−１，４−ベンゾキノン（ＨＰＬＣ純度９９．３７％）０．６７ｇを得た。
TLC: Rf 0.46 (クロロホルム); HPLC: τ = 17.6 min (0-90% B for 26.4 min; A: 10 mM H3PO4; B: アセトニトリル); M.p. 6O℃; UV (メタノール): λmax209 nm, 256 nm, 344 nm。
【００４９】
２，３−ジメチル−５−（１０’−ブロモデシル）−１，４−ベンゾキノン（３）の合成
２，３−ジメチル−１，４−ベンゾキノン（２）１３６ｍｇ（１ｍｍｏｌ）を、アセトニトリルおよびＨ２Ｏの混合物（１０ｍｌ、（１：１））に溶解した。得られた溶液に、１１−ブロモウンデカン酸２９２ｍｇ（１．１ｍｍｏｌ）および硝酸銀（１７０ｍｇ、１ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を６０〜７０℃に加熱し、過硫酸アンモニウム（２２８ｍｇ、１ｍｍｏｌ）のＨ２Ｏ（１０ｍｌ）溶液を滴下した。加熱をさらに１時間継続し、次に反応混合物を冷却し、エーテルで抽出した。合わせたエーテル層を５％重炭酸ナトリウム溶液で逆洗し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、溶媒を真空除去した。残留物をシリカゲル上フラッシュクロマトグラフィにより精製した。標記化合物（３）を暗赤色油状物（７０％収率）として得た。
TLC: Rf 0.62 (クロロホルム); HPLC: τ = 23 min (79 -90% B for 26.4 min; A: 10 mM H3PO4; B: アセトニトリル); UV (メタノール): λmax 207 nm, 258 nm, 344 nm; MALDI-TOF MS: calc. for C18H27O2Br: 355.3; found m/z 356.1 (MH+; 100%); IR: 2928, 2336, 1600, 1496, 1304 cm−１。
【００５０】
ローダミンＧセシウム塩（４）の合成
２Ｍ炭酸セシウム水溶液１ｍｌを、ローダミンＧ（２００ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ）のメタノール（６ｍｌ）溶液に添加した。生成物を濾過し、エーテルで洗浄し、真空中、６０℃で乾燥した。標記化合物（４）２１０ｍｇ（８０％）を暗紫色結晶性固体として得た。
Ｍ．ｐ．＞２５０℃（分解）
【００５１】
10-（2',3'-ジメチル-1',4'-ベンゾキノン-5'-デカノイル）ローダミンＧの合成
化合物（４）（１９０ｍｇ）をＤＭＦＡ（５ｍｌ）中に懸濁させ、化合物（３）（２００ｍｇ、０．５６ｍｍｏｌ）をこれに添加した。反応混合物を５０℃に加熱し、４８時間撹拌し、次に真空濃縮した。残留物をクロロホルム−メタノール系（４：１）、シリカゲルでカラムクロマトグラフィにより精製した。標記化合物を含むフラクションを蒸発乾固した。乾燥残留物に、５Ｎ ＨＣｌ（１５０μｌ）のジオキサン溶液を添加し、次に再度蒸発させ、ベンゼン下で結晶化させて、標記化合物１６０ｍｇ（６５％）を得た。
TLC: Rf 0.68 (クロロホルム−メタノール, 4:1); Rf 0.80 (クロロホルム−メタノール−水, 65:25:4);
HPLC: τ = 23.9 min (0 -90 % B for 26.4 min; A: 1OmM H3PO4; B: アセトニトリル);
M.p. 178-180℃ (分解);
UV (メタノール): λmax 250, 350, 535 mm, ε535 = 80000;
質量分析: calc. for C44H53ClN2O5: C, 72.86; H, 7.36; Cl, 4.89; N, 3.86; found: C, 72.53; H, 7.21; Cl, 4.22; N, 3.61;
ES MS: calc. for C44H5１N2O5 688,89; found m/z 689,4 (MH+; 100%);
IR. (film): 3200, 2928, 2336, 1700, 1685, 1600, 1496, 1304 cm−１;
【００５２】
【化６】
【００５３】
1H-NMR (400 MHz; DMSO-d6; 構造式の原子の番号付けは上記の通り): 0.95-1.25 ppm (br. m, 14H, 2", 3", 4", 5", 6", 7", 8" - (CH2)?); 1.24 ppm (t, 6H, J= 6,8 Hz, 2"", 2"" -(CH3)2); 1.41 ppm (q, 2H, J = 7,5 Hz); 1.92 and 1.94 (each - s, 3H, 4'", 5"' - (CH3)2); 2.09 ppm (s, 6H, 2,7 -(CH3)2); 3.48 ppm (q, 4H, - 1"", 1"" -(CH2)2); 3.85 ppm (t, 2H, J = 6,3 Hz, 1" -CH2); 6.57 ppm (s, 1H, H3’); 6.80 and 6.91 (each - s, 3H, H1, H５ and H4, H8); 7.44 ppm (dd, IH; J1 = 7,8, J2= 1 Hz; H6’”); 7.74 ppm (t, 2H, J = 5,8 Hz; 3,6 -NH); 8.60 -8.70 ppm (m, 2H, H4”’ and H５’”); 8,22 (dd, IH, Ji= 8,2; J2 = 1,1 Hz, H3”’)。
13C-NMR (400 MHz; DMSO-d6): 11.59 and 11.98 ppm (4"', 5"' -(CH3)2); 13.45 ppm (2"" and 2'"" -(CH3)2); 17.29 ppm (2,7 -(CH3)2); 25.07, 27.29, 27.57, 28.25, 28.39, 28.51, 28.55, 28.56 and 28.65 (2", 3", 4", 5", 6", 7", 8", 9", 10" -(CH2)9); 37.86 (1"", 1'"" - (N-CH2)2); 64.96 (1" -CH2); 93.45 (C4 and C5); 112.78 (C1 and C8); 125.32 (C4'); 128.38 (C５’); 129.78 and 130.75 (C１’ and C2’); 130.20 and 130.22 (C５’, C8a and C９a); 131.77 (C2); 132.85 (C9’”); 132.88 (C3'); 139.79 and 140.36 (C4"' and C5"'); 148.40 (C1"'); 155.71 and 156.6 (C4a - C10a and C3"'- C6"'); 164.98 (COOR); 186.91 and 187.00 (C3"' and C6"')。
【００５４】
同様の手順に従って、構造（Ｉ）に対応するもう一つ別の化合物−２，３−ジメチル−，４−ベンゾキノン−５−デシル−トリフェニルホスホニウムブロミド−を調製した。この化合物は、これにおいて用いられるターゲティング基がトリフェニルホスホニウムである点で、前述のＳｋＱＲ１と異なる。エフェクタ基およびリンカー基は、前述の化合物と同じである。
ミトコンドリア標的化抗酸化物質ＳｋＱ１の合成をスキーム２において示す。
【００５５】
【化７】
【００５６】
合成は次の工程を含む。
１．２，３−ジメチルヒドロキノン（１）の臭素酸カリウムによる、対応する２，３−ジメチル−１，４−ベンゾキノン（２）への酸化。
２．硝酸銀および過硫酸ナトリウムの存在下、１１−ブロモウンデカン酸（３）を、得られた２，３−ジメチル−１，４−ベンゾキノン（２）へ添加。
３．トリフェニルホスフィンとの酸素雰囲気中での反応による、目標化合物（５）の形成。
得られた化合物は、黄色がかった茶色の吸湿性の高い固体である。
ＮＭＲ、ＨＰＬＣおよびＭＳ技術により目標化合物の構造を調べた結果から、得られた化合物の構造は、所定の式と同一であることが立証された。サンプルの純度は９８．５％以上であった。
【００５７】
生成物純度制御は、２つの方法、高圧ＨＰＬＣおよび高分解能ＰＭＲ（５００ＭＨｚ）により行われた。ＳｋＱ１生成物の純度を記録する２つの方法は、この化合物の顕著な界面活性剤特性と関連する必要があり、これは、クロマトグラフィプロセスを困難にする。
得られた調製物中のＳｋＱ１濃度は、ＨＰＬＣにより測定すると、９８．５５％である。ＮＭＲデータを以下に提示する。
【００５８】
【化８】
【００５９】
1H-NMR (CDCl3; δ, ppm; 構造式の原子の番号付けは上記の通り): 7.82-7.58 (m, 15H, aromatics); 6.38 (s, 1H, H-5); 3.6 (m, 2H, CH2P(Ph)3); 2.25 (m, 2H, CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2P(Ph)3); 1.90 (br s, 6H, CH3); 1.55, 1.32, 1.15 (3m, 6H, 3CH2)。
HQSC (DMSO; δ, ppm): 8.15 (br s, 1H, tautomeric OH), 7.88-7.20 (m, 15H, aromatics); 7.08 (br s, IH, tautomeric OH), 6.38 (s, 1H, H-5); 3.55 (m, 2H, CH2P(Ph)3); 2.4 (m, 2H, CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2P(Ph)3); 2.05, 1.90 (2s, each of 3H, CH3); 1.5 (m, 6H3 3CH2)。
13C-NMR (DMSO; δ, ppm): 147.83, 144.65 (C-1, C-4); 134.75-129.97 (Ph); 113.01 CH2P(Ph)3; 12.72, 11.89 (CH3)。
ESI-MS (m/z): [M]+ calc. 537.7, found 537.4。
【００６０】
さらに、同様の手順に従うことにより、構造（Ｉ）に対応する化合物を合成した。１０−（２−メチル−５−メトキシ−３，６−ジオキソ−１，４−シクロヘキサジエニル）−デシル−トリフェニルホスホニウムブロミド（ＤＭＭＱ）。この化合物において、デメトキシユビキノンをエフェクタ基として使用する。この化合物は、フリーラジカル、活性酸素種および酸素と相互作用できるが、その構造から判断し、ミトコンドリアの機能の現在の知識から進んで、該化合物はミトコンドリアの呼吸鎖により還元されず、その結果、酸化促進物質、細胞毒性作用を示すと推測される。
【００６１】
【化９】
【実施例２】
【００６２】
「構造（Ｉ）に対応する化合物の平面脂質膜を超えた移動」
構造（Ｉ）に対応する試験化合物（化合物ＳｋＱ１を使用した）は、平面リン脂質二分子膜を貫通して浸透し、濃度勾配に沿って移動し、ネルンスト（Nernst）式に従って膜全体にわたって分布することが証明された。したがって、ＳｋＱ１は透過カチオンである。
【００６３】
実験手順は、異なるイオンが平面脂質二分子膜を貫通して浸透する能力を調査することを目的とする実験において以前に数回使用され、Starkov A.A., Bloch D.A., Chernyak B.V., Dedukhova V.I., Mansurova S.A., Symonyan R.A., Vygodina T.V., Skulachev V.P., 1997, Biochem. Biophys. Acta, 1318, 159-172により詳細に記載されている。この方法は、水系溶液で満たされ、二分子膜により隔てられた２つのチャンバを用いること、及び１つのチャンバから別のチャンバへ、かかる膜を横切って透過できる荷電化合物の移動の電気測定記録を含む。
【００６４】
我々の実験において、膜は、デカン中に溶解させたホスファチジルコリンおよびジフィトネイルの混合物から調製され、両チャンバは、１０−７Ｍ ＳｋＱ１を含む、５０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ ７．４で満たされていた。
【００６５】
ＳｋＱ１を１０−７Ｍから１０−５Ｍの濃度で滴定した。４・１０−６Ｍから４・１０−５Ｍの範囲内で、ＳｋＱｌの分布は、理想的な膜透過カチオンについてのネルンスト式に従うことが証明された。低い濃度では、ネルンスト式は満たされない（結果を図１に示す）。
【００６６】
結果として、化合物ＳｋＱ１（２，３−ジメチル−１，４−ベンゾキノン−５−デシル−トリフェニルホスホニウム）は、カチオン形態において生体膜を横切って透過できる脂溶性物質である。
【実施例３】
【００６７】
「構造（Ｉ）に対応する化合物の抗酸化特性」
構造（Ｉ）に対応する試験化合物−ミトコンドリア抗酸化物質ＳｋＱ１−は最も強力な抗酸化物質であって、刊行物において以前に記載され、米国特許第6,331,532号において「ミトコンドリア標的化」として権利主張されている抗酸化物質（化合物ＭｉｔｏＱ）よりも活性において勝っていることが証明された。
【００６８】
ＳｋＱ１およびＭｉｔｏＱの還元（キノール）体の好気性条件下での長時間にわたる安定性を、２４０から３１０ｎｍの範囲のこれらの化合物の絶対吸収スペクトルを、複光束Pye Unicam SP1100分光光度計（England）を用いて分析することにより調べた。２０ｍＭ ＭＯＰＳ−ＫＯＨを含有する測定培地（ｐＨ＝７．６）中、キノン誘導体をテトラヒドロホウ酸ナトリウムで還元した。コントロールキュベットはＳｋＱ１またはＭｉｔｏＱを含有せず、還元剤を両キュベットに添加し、水素の発生が止まった直後に測定を行った。キノンの還元の程度を、ピーク面積のサイズから、これを２６７ｎｍでの絶対吸収値（最大吸収）に対して比較検討することにより評価した。図２において提示されたデータからわかるように、ＳｋＱ１の還元（キノール）体は、ＭｉｔｏＱよりも空気による酸化に対して耐性である。
【００６９】
還元体の抗酸化活性を比較するために、本発明者らはキサンチンオキシダーゼ／ハイポキサンチン系において生成するスーパーオキシド−アニオンラジカルによりキノールの酸化率を測定した。図３ａに示される、得られたデータは、ＳｋＱ１の酸化率がＭｉｔｏＱの約２倍であることを示す。このことは、ＳｋＱｌが抗酸化物質としてより活性が高く、その還元（活性）体は、ＭｉｔｏＱよりも空気の酸素による自然酸化に対して耐性であり、スーパーオキシドラジカルについてより高い親和力を有することを示唆する。図３ｂは、空気の酸素による酸化より低い、還元キノール体のスーパーオキシドラジカルによる酸化率を示す。ＳｋＱ１がスーパーオキシドラジカルと、ＭｉｔｏＱよりも良好に相互作用することは簡単にわかる。
【００７０】
上記実験は、ＳｋＱ１がその類似体よりも強力な抗酸化特性を有することを納得できる例示である。溶液において、ＳｋＱ１はＲＯＳと有効に相互作用し、これらを中和することができる。この抗酸化物質の本質的な利点は、通常の酸素に対するその低い反応性、したがって、その低い酸化促進特性（prooxidant properties）である。
【実施例４】
【００７１】
「構造（Ｉ）に対応する化合物のミトコンドリアとの相互作用の調査」
本発明の構成内で提案されるミトコンドリア標的化抗酸化物質の重要な利点は、ミトコンドリアの呼吸鎖により還元されるその能力である。この特性は、これらの化合物が従来の抗酸化物質とは根本的に違う点；即ち、本発明の化合物のラジカル体の安全な中和の可能性と、従って本発明の化合物のラジカル形態の安全な中和の可能性ならびにＦＲおよびＲＯＳの中和のためのその反復使用；である。
【００７２】
試験化合物（ＳｋＱ１およびその類似体ＭｉｔｏＱ）がミトコンドリアの呼吸鎖により還元され得るかどうかを調べるために、試験化合物の酸化体と還元体間の比の変化率を、呼吸物質の存在下、ラット肝臓ミトコンドリアの単離に使用される培地中で測定した。測定は、ミトコンドリア（タンパク質濃度０．２ｍｇ／ｍｌ）の存在下で行った。
【００７３】
得られたデータ（図４、５）から、両試験化合物が、活性化ミトコンドリアにより、同じ速度で、容易に還元され、その結果、自然酸化（空気酸素による）の速度よりもずっと高速で酸化されることがわかる。
【００７４】
この実験例は、ＳｋＱ１がミトコンドリア呼吸を１０μＭまでの濃度で抑制しないが、ミトコンドリアの「共役」呼吸、即ち、その通常の機能を刺激することを示唆する。ＳｋＱ１がインキュベーション条件下、生体媒質中で実験の期間（数十分）に対応する時間、安定であることも証明された。この実験は、生成したＲＯＳ（キサンタンオキシダーゼ反応におけるスーパーオキシドラジカル）の仲介でミトコンドリアにより還元されたキノールの酸化を誘発するインビトロ実験におけるＳｋＱ１が、ＲＯＳについての親和力および長期間にわたる安定性に関して、ＭｉｔｏＱよりも明らかな利点を示すことを裏付ける。
【実施例５】
【００７５】
「培養における細胞の異なるミトコンドリア抗酸化物質の毒性の比較」
この実験例において、先行技術において開示されているミトコンドリア抗酸化物質ＭｉｔｏＱの毒性レベルを本発明の構成内で提案される化合物ＳｋＱ１の毒性と比較する。
【００７６】
実験の過程において、ＳｋＱ１およびＭｉｔｏＱを等濃度で細胞培養物に添加し、生きている細胞のパーセンテージを２時間のインキュベーション後に計算した。図６に示す、得られた結果は、ＳｋＱ１が実質的に低い毒性を有することを明確に示す。したがって、ＳｋＱのＬＤ５０（５０％細胞が死亡する濃度）は２０μＭである一方、ＭｉｔｏＱについては、ＬＤ５０は３倍以上少なく、約７μＭである。これらの結果は、ＳｋＱおよびＭｉｔｏＱの過酸化水素（５０、１００および２００μＭの濃度）の存在下での細胞に対する毒性効果を検討する別の実験によっても確認された。従来の場合と同様に、ＭｉｔｏＱはより毒性の高い化合物であることが証明された。１００μＭ過酸化水素のバックグラウンドに対するＭｉｔｏＱのＬＤ５０は４μＭである一方、ＳｋＱは２０μＭであった。即ち、純粋な調製物のＬＤ５０と違わなかった。従って強力な酸化的ストレスのバックグラウンドに対して、ＳｋＱの毒性はＭｉｔｏＱの毒性よりも５倍以上低い。
【００７７】
よって、本発明により提供される構造（Ｉ）に対応するミトコンドリア抗酸化物質は、最先端の技術において開示され、ミトコンドリア抗酸化物質として権利主張されている物質よりも本質的に低い毒性を有することが断言できる。この違いは、ＭｉｔｏＱと比較して、ＳｋＱ１のより高い抗酸化性およびあまりはっきりしない酸化促進性が示される実施例３において得られた結果を考慮して容易に説明できる。
【実施例６】
【００７８】
「異なる種類のヒト細胞に対する、構造（Ｉ）に対応する化合物の保護効果」
この実施例において、本発明者らは、抗酸化機能を有する、構造（Ｉ）に対応する化合物（ミトコンドリア標的化抗酸化物質）が、Ｈ２Ｏ２により引き起こされる酸化的ストレスから培養物中の細胞を保護することを立証した。
【００７９】
ヒトの皮膚および肺から得られる通常の２媒体線維芽細胞、ヒトの子宮癌細胞（ＨｅＬａ細胞）およびヒトリンパ腫細胞（Ｕ９３７株）をこの実験において使用した。細胞を標準培地（ＤＭＥＭまたはＲＰＭＩ）中、１０％胎児血清の存在下、３７℃で５％ＣＯ２の雰囲気中で培養した。３０〜５０％コンフルーエンスまで増殖させた培養物に関して実験を行った。Ｈ２Ｏ２を１回添加し、細胞を添加後１８−２４時間、分析した。細胞をHoechst 33342（１μｇ／ｍｌ、１５分）で染色した後、クロマチン凝縮および核の細分化により、アポトーシス死をモニターした。３００〜５００個の細胞を各調製物から考慮に入れ、データを３〜５の独立した実験について平均した。核をヨウ化プロピジウムで染色することにより（２μｇ／ｍｌ、５分）、壊死を測定した。
【００８０】
予備実験において、異なる種々の細胞種において検出可能な壊死がなく多量のアポトーシス（６０〜８０％）を引き起こすＨ２Ｏ２の濃度は５０〜２００μＭと測定された。全ての場合におけるアポトーシスは、ミトコンドリア膜ポテンシャルの減少、シトクロムｃのミトコンドリアから細胞質中への放出およびカスパーゼ（caspases）の活性化を伴うことが確認された。
【００８１】
抗酸化物質ＳｋＱ１を用いた実験において、本発明者らは、保護的抗アポトーシス効果の最適条件を決定した。細胞を２０ｎＭ ＳｋＱ１とともに６日間インキュベーションすることにより、細胞のＨ２Ｏ２に対する耐性がはっきりと増加することがわかった。Ｈ２Ｏ２を用いたインキュベーションの培地において抗酸化物質が存在する必要は無く、この存在自体は保護効果を向上させなかった。特に、ヒト肺線維芽細胞を用いた実験において、１００μＭ Ｈ２Ｏ２は細胞集団の６０＋／−５％アポトーシスを引き起こす一方、２０ｎＭ ＳｋＱ１を用いたプレインキュベーション後に、各数値は７＋／−３％であった。ほとんど完全な保護が、２００μＭの濃度のＨ２Ｏ２でも観察された（コントロールにおいて８０＋／−５％アポトーシス、２０ｎＭ ＳｋＱ１を用いたプレインキュベーション後に１２＋／−５％アポトーシス）。ＳｋＱ１の保護効果は、Ｈ２Ｏ２の濃度が５００μＭまで増加した場合に保持されたが、一方、かかる条件下で壊死による細胞の全体的な死が見られた。同様の結果が他の種類の細胞に関して得られた。
【００８２】
したがって、非常に低い濃度でのＳｋＱ１タイプの抗酸化物質は、種々の種類の細胞を酸化的ストレスにより引き起こされるアポトーシスから効果的に保護する。よって、かかる化合物およびこれに基づく組成物は、異なる組織、器官、有機組織そのものにおけるプログラム化された細胞死の予防に有効であるはずである。ＳｋＱのこの見出された性質を、酸化的ストレスの減少および／またはプログラム化された細胞死のブロックが有効な治療法である疾患の処置および予防に用いることができる。
【実施例７】
【００８３】
「構造（Ｉ）に対応する化合物によるアポトーシスシグナル伝播の予防」
細胞間のアポトーシスシグナルの長距離伝送は、ＳｋＱ１タイプの抗酸化物質によりブロックされる。
【００８４】
これらの実験において、ＨｅＬａ系細胞を使用した。スライドガラス上で成長させた細胞を、種々のアポトーシス誘導物質（腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、スタウロスポリン、Ｈ２Ｏ２）で３時間処理した。次に、細胞（誘発物質）を有するスライドガラスを洗浄して、これらの試薬を除去し、ペトリ皿中に入れて、スライドガラス（受容体）を任意のアポトーシス誘導物質の不在下で成長させた細胞と接触させた。その後、１６〜１８時間一緒に成長させ、前述のHoechst 33342で細胞を染色した後、両スライドガラス上のアポトーシスを分析した。
【００８５】
予備実験により、誘発物質スライド上のアポトーシスが８０〜９０％である場合、受容体スライド上の細胞の３０〜５０％もアポトーシス形態を示すことが示された。コントロール実験により、このモデルにおいて、初期アポトーシス誘導物質の受容体細胞への伝送はなかったことが示された。アポトーシスシグナルの伝送は、細胞の直接接触を必要とせず、インキュベーション培地の体積が増加すると弱くなった。合同インキュベーションのためにカタラーゼ（２５００Ｅ／ｍｌ）を培地中に添加すると、受容体細胞のアポトーシスが防止され、同時に、誘発細胞のアポトーシス（ＴＮＦまたはスタウロスポリンにより引き起こされる）には著しい影響を及ぼさなかった。よって、アポトーシスシグナルの主なメディエータはＨ２Ｏ２であった。
【００８６】
誘発細胞を２０ｎＭ ＳｋＱ１とともに６日間インキュベーションすることにより、ＴＮＦ（１０〜５０ｎｇ／ｍｌ、１μＭエメチンを添加）またはスタウロスポリン（２μＭ）により引き起こされるアポトーシスは防止されなかった。両スライドガラスを接触させ、次に一緒にインキュベーションした後、誘発スライド上のＴＮＦにより引き起こされるアポトーシスは、コントロールにおいて９５＋／−５％、ＳｋＱ１とのインキュベーション後に９０＋／−５％であった。受容体スライド上のアポトーシスは、コントロールにおいて３７＋／−４％、ＳｋＱ１との誘発物質のプレインキュベーション後に１７＋／−３％であった。ＴＮＦを含まないコントロール実験におけるアポトーシスは、エメチンの毒性効果のために、両スライド上で１２＋／−３％であることを考慮すべきである。したがって、ＳｋＱ１の保護効果はほぼ１００％であった。受容細胞をＳｋＱ１とともにプレインキュベーションすることにより、同様の結果が得られた。この場合、アポトーシスはｌ６＋／−４％に低下した。同様の保護効果がスタウロスポリンでのアポトーシスの誘導に際しても観察された。
【００８７】
測定により、誘発細胞（ＴＮＦで前処理）および受容細胞の合同インキュベーションの結果、スライドを接触させてすでに２〜３時間後の培地中のＨ２Ｏ２濃度が（未処理細胞をインキュベートしたコントロールと比較して）著しく増加したことが示された。２４時間後に測定されたＨ２Ｏ２濃度は１４０＋／−２０ｎＭである一方、誘発細胞がＳｋＱ１とともにプレインキュベートされたならば、わずかに４０＋／−１０ｎＭであった。受容細胞をＳｋＱ１とともにプレインキュベーションすることにより、Ｈ２Ｏ２濃度の減少には至らなかった。
【００８８】
したがって、非常に低濃度のＳｋＱ１タイプの抗酸化物質は、異なる性質を有するアポトーシス誘導物質で処置された細胞によるアポトーシスシグナルの生成をブロックする。同じ抗酸化物質は、誘発細胞からの培地を通って伝送されるシグナルにより引き起こされるアポトーシスから受容細胞を効果的に保護する。
【００８９】
アポトーシスシグナルの伝送は、損傷を受けた組織部分がアポトーシス細胞の広がった部分により取り囲まれている疾患（梗塞、発作、外傷後病変）の発病機序の根底にある。
【実施例８】
【００９０】
「構造（Ｉ）に対応する化合物の、細胞の光力学的損傷に対する保護効果」
ＳｋＱ１タイプの抗酸化物質は、光増感剤の光活性化において生成する一重項酸素の毒性効果を阻害し、ミトコンドリアの光力学的処置により引き起こされる壊死性の細胞死を防止する。
【００９１】
一重項酸素の損傷効果からの保護を、グラミシジンおよびフタロシアニン光増感剤を含むモデル脂質膜において分析した。グラミシジンチャネルを通るイオン流の測定は、短閃光による光増感剤の活性化の結果、チャネルの急速な不活性化が起こることを示した。この効果は、アジ化ナトリウムにより完全にブロックされ、一重項酸素がグラミシジンの不活性化における主な要因であることを示す。
【００９２】
ＨｅＬａ細胞の培養物を用いて、光力学作用からの保護を検討した。細胞を、ミトコンドリア中に選択的に蓄積する光増感剤クロロメチル−Ｘ−ロサミン（０．５μＭ、１５分）とともにインキュベートした。細胞を、Axiovert 200M顕微鏡（Zeiss、独）の対物レンズを通して緑色光（５８０ｎＭの光増感剤の吸収最大値）で１〜２分照射し、５時間後に分析した。壊死がヨウ化プロピジウム（２μｇ／ｍｌ、５分）で染色した核から検出された。
【００９３】
ＳｋＱ１は、１μＭの濃度で、フタロシアニン光増感剤を含むモデル脂質膜におけるグラミシジンの光依存性不活性化を完全に予防することが見出された。
１００％壊死性細胞死が、細胞の光力学処置後に観察された。一方、細胞が２０ｎＭ ＳｋＱ１とともに６日間プレインキュベートされたならば、光力学的処置後の壊死は、２５＋／−５％であった。１μＭ ＳｋＱ１を、照射の１時間前に添加された場合、壊死性細胞死は１５＋／−５％であった。ＳｋＱ１濃度の増加は、さらなる保護を提供しないが、０．５μＭに減少させると、効果を顕著に低くすることとなった。
【００９４】
得られた結果から、非常に低い濃度のＳｋＱ１タイプの酸化剤は、光増感剤の照射に際して生成する一重項酸素の損傷効果を予防するという結論を引き出すことができる。このような抗酸化物質は、光増感剤がミトコンドリア内に局在するならば、細胞を光力学的処置により引き起こされる壊死から効果的に保護する。
【実施例９】
【００９５】
「構造（Ｉ）に対応する化合物の、加齢に伴う白内障および黄斑変性に対する保護効果」
先進国における平均的なヒトの寿命の増加することにより、世界の人口の高齢化をもたらし、加齢に伴う疾患の罹患率の増加を伴う。この疾患のうち、ＷＨＯ／ＯＭＳの最近の報告によると、黄斑変性および白内障は癌および骨粗鬆症に次いで第三位を占めるという。白内障および黄斑変性は高齢者の失明の主な要因であり、これらの疾患の危険因子の判定および信頼できる予防的処置の発達は、経済的に非常に重要である。白内障および黄斑変性の発達の対する食餌療法の効果は、文献において活発に議論されてきた。加齢に伴う眼疾患の疫学的研究により、抗酸化物質を長期間受容した患者における、加齢に伴う黄斑変性の相対的危険性の顕著な減少が明らかになった。しかしながら、抗酸化物質を活用した白内障および黄斑変性の発達を遅らせる試みは、決して必ずしもうまくいくとは限らない。
【００９６】
抗酸化特性を有する、宣伝されている医薬品および生物活性な栄養物の数は増大しているが、その有効性の客観的評価は、一般に行われていない。そして当然、予防的治療の結果の正しい評価は、これらの疾患の発病の検出の遅れおよび個々の特性により実質的に妨害される。このような状況において、動物モデルを再分類するのが通例であり、本発明により示されるように、視覚器の老化の普遍的モデルとしての働きをすることができる老化促進ＯＸＹＳラット種により、製剤の有効性を評価するためのめったにない機会を得ることができる。ＯＸＹＳ種のラットは、ガラクトースの白内障効果を受けやすいWistar系ラットの選択および同型交配により得た。ＯＸＹＳラットの酸化的ストレスに対する減少した耐性において発現される遺伝的に調整された代謝障害は、老化促進症候群と見なすことができるその有機組織における変化につながる。ＯＸＹＳラットの水晶体における病原性変化は、２月齢で起こり、６月齢で、白内障が１００％のＯＸＹＳラット（Wistarラットの５％に対して）において検出され、１２月齢で、白内障は両目を冒す。検眼鏡、生体顕微鏡および形態学的データによると、ＯＸＹＳラットにおける白内障はヒト老人性白内障に対応し、進行性黄斑変性の背景に対して発達する。疾患の最初の兆候は６週齢で現れ、４〜６月齢までに、病状は顕著な段階に達する。特性の発現により、ＯＸＹＳラットにおける眼に基づく病変のパターンは、黄斑変性、例えば、中心退縮脈絡網膜変性を有するヒト患者において観察される網膜の変化に対応する。
【００９７】
本発明のこの部分の目標は、ＳｋＱ製剤の、ＯＸＹＳラットにおける白内障および黄斑変性の発生に対する効果を調査することである。
【００９８】
研究は、合計１２０匹のオスＯＸＹＳおよびWistarラットを用いて行われた。動物をそれぞれ５匹の群で自然照明条件下に置いた。ただし、標準的粒状食餌および水を自由に与えた。１．５月齢で、１％トロピカミド点眼液で予備瞳孔拡張後、「ベッタ」（"Betta"）直接検眼鏡（独）を用いた検眼鏡検査にラットを付した。ＯＸＹＳラットの視覚器における顕著な変化の発達に重要である１．５〜３ヶ月の期間、動物にＳｋＱ１（体重１ｋｇあたり５０ナノモル）、またはＫＢｒ（体重１ｋｇあたり５０ナノモル）またはビタミンＥ（酢酸α−トコフェロール（ウラルビオファーム"Uralbiofarm"）、２０ｍｇ／ｋｇ）のいずれかを投与した。後者は、参考基準として本発明者らにより以前から使用されている。動物は、通常の食餌前に乾燥パンの小片上の化合物を摂取し、無処理群は、同様の乾燥パンの小片のみを摂取した。抗酸化物質を用いたコースが完了したら、動物を再検査した。製剤摂取の結果の評価において主観性を排除するために、動物が飼育されていたケージからすべての識別書を事前に取り除いた。
【００９９】
水晶体の状態を臨床診療において採用される採点システムにしたがって、０〜３のポイントで評価した。０−水晶体は透明である、１−斑点状の弱い混濁、２−複数点の混濁、および３−水晶体皮質または水晶体核の強い混濁。黄斑領域における斑点状変化の存在および程度を一般に採用される分類に従って評価した。０−変化無し、１−「ドルーゼ」と呼ばれる小さな黄色沈着物が水晶体の後極において出現する病状の第一期、２−第二期、０．５から１のサイズのディスク直径を有する境界鮮明な顕著な黄色斑点の発達（着色された網膜剥離の滲出性剥離作用）、および３−黄斑領域中への広範な出血を伴う第三期。
【０１００】
結果
検眼鏡検査は、１．５および３月齢のWistarラットにおける水晶体および網膜の黄斑領域における変化を明らかにしなかった。ＯＸＹＳラットにおいては、逆に、初期の白内障（得点１）が事例の２０％において観察され、第一期の黄斑変性が１．５月齢の事例の１１０％において観察された。
ＯＸＹＳラットの無処理群におけるコントロールにおいて３月齢で、水晶体の病理変化が調査された眼の９０％において観察され、例えば、眼の３５％が白内障の第二期であった。黄斑変性は動物のコントロール群の眼の８５％において観察され、その１６％はこの病状の第二期に相当した（図８）。
【０１０１】
ＫＢｒを摂取したＯＸＹＳラットの群において、水晶体変化は、９３％の眼において観察され、眼の合計数の５７％が第二期の白内障を有していた。網膜の黄斑領域における変化は、この群からの動物の眼の８７％において観察され、これらの変化の１３％は疾患の第二期に相当した。
ＳｋＱ１を摂取した動物において、いくつかの水晶体変化を事例の４６％において記録し、これらは全て白内障の第一期に相当した。この群のＯＸＹＳラットにおける網膜の黄斑領域における変化が事例の３８％において明らかになり、黄斑変性の第一期に相当した。
【０１０２】
ビタミンＥを摂取したラットにおいて、３月齢で、水晶体変化が事例の５８％において記録され、変化の１２％は白内障の第二期に相当した。網膜の黄斑領域における変化は、この群からのＯＸＹＳラットの５４％で明らかになり、８％は黄斑変性の第二期に相当する。これらの実験の結果を図７〜１２にグラフにより示す。
よって、本実施例は、老化に伴う眼疾患の予防におけるＳｋＱ１適用の有効性、よって酸化的ストレスに関連する疾患を対処するための、構造（Ｉ）に対応するミトコンドリア抗酸化物質の有効性を納得できるように例示する。
【実施例１０】
【０１０３】
「心筋に対するミトコンドリア抗酸化物質ＳｋＱ１の保護作用」
活性酸素種（ＲＯＳ）がその濃度に応じて、心筋に対して調節または毒性効果を有することは公知である。ＳｋＱ１製剤を試験する場合、ＲＯＳ作用を調節するその能力が見出された。ＳｋＱ１製剤を静脈内または食品とともに（５０μｇ／ｋｇ）投与されたラットの単離された心臓に関して実験を行った。製剤の静脈内投与後２時間、または食品とともに投与した２週間後に、心臓を摘出した。心臓の逆行性潅流は、クレブス（Krebs）溶液を一定割合で用いて従来の手順に従った。記録された潅流圧（ＰＰ）は冠状血管の緊張を特徴づけた。自然な心拍数および左心室における等容性圧も測定した。１５０μＭ Ｈ２Ｏ２、標準的ＲＯＳ生成剤の４０分投与に際して、これらのパラメータにおける変化を記録した。
【０１０４】
ＳｋＱ１静脈内投与を１回行った一連の実験において、潅流速度の２倍の増加に続いて、両群において、適切に等しい潅流圧上昇（１２０〜１２５ｍｍＨｇ）が起こった。Ｈ２Ｏ２ を導入することにより、通常の２相効果が得られた。すなわち、初期ＰＰ減少に続いて増加した。コントロール群において、最小ＰＰ量は９５＋５ｍｍＨｇであり、一方、ＳｋＱ１を受容した動物群においては、７７＋２ｍｍＨｇ（ｐ＜０．０２）であった。Ｈ２Ｏ２導入前の初期レベルと比較した最大ＰＰ減少は、平均でそれぞれ−２８＋３ｍｍＨｇおよび−４３＋５ｍｍＨｇであった（ｐ＜０．０５）。ＳｋＱ１摂取が延長された一連の実験において、コントロール群における最大ＰＰ減少は平均で−２１＋５ｍｍＨｇであり、一方、ＳｋＱ１を受容した動物の群においては、−３８＋５ｍｍＨｇ（ｐ＜０．０３）であった。群間の顕著な違いは、Ｈ２Ｏ２導入の最後で、それぞれ、−５＋６ｍｍＨｇおよび−２９＋６ｍｍＨｇのままであった（ｐ＜０．０３）。従って、１回または長期のＳｋＱ１投与はどちらも、Ｈ２Ｏ２の初期血管拡張効果を促進した。加えて、ＳｋＱ１の長期投与に際して、Ｈ２Ｏ２の冠状血管に対する毒性効果は減少した。
【０１０５】
よって、ＳｋＱ１製剤は、調節を促進し、単離された心臓の冠状血管に対するＲＯＳの毒性効果を減少させると結論づけることが可能である。ＳｋＱ１のこの効果は、心臓血管疾患を対処するために使用できる。
【実施例１１】
【０１０６】
「構造（Ｉ）に対応する化合物の、正常および腫瘍細胞の形態および移動度に対する効果」
ＳｋＱ１タイプの抗酸化物質は、培養物中の細胞の形態学的変化を引き起こし、この変化は、その移動度の減少および基体と細胞の接着の強化を伴う。
【０１０７】
ヒト皮膚および肺の正常線維芽細胞およびＨｅＬａ細胞を低細胞密度（２０〜３０％コンフルーエンス）で培養した。その面積、分散および伸長を測定することにより、細胞の形態計測を行った。ファロイジン−ローダミン（アクチンフィラメント）、チューブリン（微小管）に対する抗体およびビンキュリン（基体と接触する）で固定細胞調製物を染色することにより細胞骨格構造を検討した。マイクロビデオカメラを用いて細胞の移動度を検討した。
【０１０８】
２０ｎＭ ＳｋＱ１とともに６日間プレインキュベートされた線維芽細胞は形態が急変した。細胞の平均面積は２．９倍高く、拡散指数は２．４倍低下し、伸長指数は２．３４から０．６９に減少した。アクチンフィラメントの含量は、３．７倍増加し、従って、その単位面積あたりの密度はコントロールの１３６％になった。アクチンフィラメントを大きな束（ストレス・フィブリル）にした。基体との接触数は大きく増加した。線維芽細胞の移動度は急落した。全ての観察された変化は線維芽細胞増殖速度を減少させなかった。ＨｅＬａ細胞に関して行われた同様の測定は、その平均面積が２．６倍増加し（分散および伸長パラメータにおいては変化無し）、アクチンフィラメントの含量は増加するので、平均密度は変わらないままであることを示した。
【０１０９】
したがって、ＳｋＱ１タイプの抗酸化物質での処置に応答した細胞の形態変化およびその移動度の減少は、細胞の増殖および転移の可能性の減少を暗示する。
【実施例１２】
【０１１０】
「構造（Ｉ）に対応する化合物の腫瘍細胞に対する細胞傷害効果」
構造（Ｉ）に対応し、酸化促進物質およびタンパク質修飾機能を有する化合物は、ミトコンドリア中に非選択的孔の開口、ミトコンドリアの膨潤、シトクロムｃの膜間腔から細胞質中への放出、およびアポトーシスを誘発する。抗アポトーシスタンパク質のミトコンドリア標的化阻害物質は、当分野において公知のこれらの化合物および化学療法薬により引き起こされるアポトーシスを促進することができる。
【０１１１】
隣接するジチオール（フェニルアルセンオキシド、ＰＡＯ）と架橋する酸化促進物質および化合物は、無細胞系および細胞中の双方において、非選択的孔の開口およびミトコンドリアの膨潤を誘発することがわかった。特に、胸腺リンパ球に関する実験において、ＰＡＯを用いたミトコンドリア孔の誘発は、Ｃａ２＋イオンをミトコンドリアから細胞質へ放出することにつながった。電子顕微鏡を用いることにより、膨潤したマトリックスを有するミトコンドリアがこれらの細胞において観察された。ＰＡＯは高い非特異性毒性を有し、これは、シトクロムｃ放出のメカニズムおよび関連するアポトーシスの調査においてＰＡＯの使用を許容しない。いくつかの細胞モデルにおいて、孔開口を誘発する化学物質も、シトクロムｃの細胞質への放出およびアポトーシスを促進することがわかった。ＰＡＯおよび類似化合物をミトコンドリアへ標的化導入することにより、その非特異性毒性を減少させ、標的細胞におけるアポトーシスの誘導を許容すると仮定することができる。正電荷を有する化合物（ホスホニウムおよびローダミン誘導体）は、正常細胞のミトコンドリアにおけるよりも、はるかに有効に、速く成長する腫瘍細胞のミトコンドリアにおいて蓄積し、保持されることが以前に示された。上記情報は、有効かつ選択的な抗癌製剤が、構造（Ｉ）に対応する化合物に基づいて産生されるであろうことを予想する根拠となる。
【実施例１３】
【０１１２】
「構造（Ｉ）に対応する化合物の腹水癌の場合における抗癌効果」
構造（Ｉ）の化合物が腫瘍性疾患の処置において有用であり得るかどうかを調べるために、本発明者らは、エールリヒ（Ehrlich）腹水癌が人工的に誘発されたマウスに対するＳｋＱ１の効果を試験した（急性腫瘍性疾患の発達の標準的モデル）。
ＮＭＲＩ系マウスにＳｋＱ１を様々な濃度、１０、１または０．１μＭの濃度で、飲料水と共に投与した。その結果（エールリヒ腹水癌が事前に誘発されたマウスの生存率）を図１３に示す。この実験のネガティブコントロールは水である一方、ポジティブコントロールは周知の抗ガン剤シスプラチンであった。
得られた結果は、構造（Ｉ）に対応するミトコンドリア標的化抗ガン製剤の抗腫瘍効果を示す。
【実施例１４】
【０１１３】
「選択的ミトコンドリア標的化化合物の光力学作用」
構造（Ｉ）に対応し、光増感機能を果たす化合物は、シトクロムｃの膜間腔から細胞質中への放出およびアポトーシスを誘発できる。
【０１１４】
正電荷を有する光増感剤（ローダミン類、クロロメチル−Ｘ−ロサミン）のプロトタイプは、ミトコンドリア中に蓄積し、中程度の照射に付された、種々の腫瘍細胞においてアポトーシスを引き起こす。類似の非ミトコンドリア標的化分子は、照射下（光線力学療法において潜在的な炎症性合併症をもたらし得る）で主に壊死性細胞死を引き起こす。今日まで研究されたプロトタイプ光増感剤は、その低い量子効率およびスペクトル緑色領域の最大吸収のために、実際に使用されない。臨床診療において使用されるプロトポルフィンおよびフタロシアニン誘導体ベースの光増感剤は、高い量子効率、スペクトルの赤色領域における最大の吸収（これは綿密な組織の治療有効性を改善する）を有するが、これらは主にリソソームにおいて蓄積し、壊死を誘発する。構造（Ｉ）に対応する化合物の処方中のかかる分子のミトコンドリアターゲティングは、スペクトルの赤色領域における低強度照射により腫瘍細胞のアポトーシスを誘発させる。
【０１１５】
正電荷を有する化合物（ローダミンおよびホスホニウム誘導体）は、急速に成長する腫瘍のミトコンドリアにおいて、正常組織の細胞におけるよりも大幅に蓄積し、保持されることがわかった。構造（Ｉ）に対応する化合物ベースの光増感剤は、腫瘍において選択的に蓄積し、これにより光線力学療法において使用される場合にその有効性が増大するであろうことが推測される。
【実施例１５】
【０１１６】
「酵母ヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）の細胞に関して実証された、真菌細胞に対するミトコンドリア抗酸化物質ＳｋＱ１の保護効果」
本発明者らは、構造（Ｉ）に対応するミトコンドリア抗酸化物質ＳｋＱ１が１０ｍＭ過酸化水素により引き起こされるヤロウィア・リポリティカの細胞死を部分的に予防することを示した。
【０１１７】
図１４からわかるように、シクロヘキシミドＤ、トコフェロールおよびＳｋＱ１の効果は非常に類似している。シクロヘキシミドの効果は本発明者らにより以前に例証された。この効果は、アポトーシスの細胞におけるタンパク質合成の正常な機能の必要性により説明される。α−トコフェロールの濃度を２５μＭに等しくした。その理由は、この特定の濃度がサッカロミセス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）細胞についてフェロモンおよびアミオダロンにより誘発されるプログラム化された細胞死に対して最大の保護効果を提供するためである（Pozniakovsky A.I., Knorre D.A., Markova O.V., Hyman A.A., Skulachev V.P., Severin F.F., 2005、J. Cell. Biol. 168(2): 257-69）。この濃度は、ＳｋＱ１の１０倍低い濃度と同程度に有効であることが証明された。これらの結果は、ミトコンドリア標的化抗酸化物質が真菌細胞に対して有用であり、ＳｋＱ１タイプの化合物を酵母、他の真菌および微生物の工業的培養物の保護に使用できることを示す。
【実施例１６】
【０１１８】
「高等植物の発育におけるミトコンドリア抗酸化物質ＳｋＱ１の効果」
挿し木を人工寒天化ＭＳ培地上で、１μＭ ＳｋＱ１（３植物）を添加して、またコントロールとしてＳｋＱ１を添加しない（３植物）で成長させた。挿し木を５０ｍｌ透明試験管中に入れ、人工気象室中、３週間、２７℃で、定期的に照射しながら（明所で１４時間、暗所で１０時間）成長させた。次に、植物を暗ストレスに付した。即ち、完全な暗所中で７日間成長させた。
【０１１９】
結果として、コントロール植物は無色になった一方、ＳｋＱ１の存在下で成長させた植物はその緑色を保持していた。次に、植物を通常の照明条件に戻し、さらに２０日間成長させた。かかる処置後、ＳｋＱ１の存在下で成長させた植物はコントロール植物よりも３倍大きくなった。
【０１２０】
この実験例は、ミトコンドリア標的化抗酸化物質の植物全体に対して好ましい効果を例示する。結局、このような化合物は、人工培地（遺伝子組み換え植物の産生において必要な段階）上で植物を生長させるため、植物細胞培養物の生存能力を増大させるため、および農業において作物の生存能力を増加させるために使用できる。
【０１２１】
当業者は、上記実施例および明細書に基づいて明らかな追加または変更をなすことができ、これにより、本発明の目的に関して有用な、請求の範囲に記載されているすべての化合物および組成物を得ることが可能になる。すべてのこのような追加および修正は、記載される本発明の請求の範囲内に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１２２】
【図１】人工膜を通るＳｋＱ１の透過を示す図である。
【図２】キノール誘導体ＭｉｔｏＱおよびＳｋＱ１の自然酸化を示す図である。
【図３】スーパーオキシドラジカルを系中に導入するための「ＭｉｔｏＱ」および「ＳｋＱ１」キノール誘導体の酸化速度の増加を示す図である。ａは空気の酸素およびスーパーオキシドラジカルの両方により還元された形態の酸化速度であり、ｂはスーパーオキシドラジカルのみにより還元された形態の酸化速度である。
【図４】サクシネート（５ｍＭ）により活性化された、２μＭロテノンの存在下でのラット肝臓ミトコンドリア（０．２ｍｇ／ｍｌタンパク質）の呼吸鎖による「ＭｉｔｏＱ」および「ＳｋＱ１」の還元を示す図である。
【図５】２μＭロテノンの存在下、スクシネート（５ｍＭ）により活性化されたラット肝臓ミトコンドリアの呼吸鎖によるキノール「ＭｉｔｏＱ」および「ＳｋＱ１」の酸化を説明する図である。キノール誘導体の還元が完了した後、呼吸鎖を２５ｍＭマロネートでブロックし、「ＭｉｔｏＱ」および「ＳｋＱ１」の再酸化速度を測定した。
【図６】「ＭｉｔｏＱ」および「ＳｋＱ１」のＨｅｌａ細胞に対する細胞傷害効果を示す図である。生きている細胞のパーセンテージはＭＴＴ−ホルマザンのＯ．Ｄ．（４９２ｎｍ）に比例する。
【図７】ＳｋＱおよびいくつかの他の製剤の、ＯＸＹＳラットにおける網膜変性の発達に対する影響を示す図である。網膜の黄斑部において変性変化を有する目のパーセンテージをＹ軸に沿ってプロットする。
【図８】第二期の斑状変化を有する目のパーセンテージを示す図である。ＳｋＱ１の投与は、黄斑変性の罹患率を減少させるだけでなく、斑状変化の程度も実質的に減少させた。第二期の黄斑変性を有する目のパーセンテージをＹ軸に沿ってプロットする。
【図９】投与前およびＫＢｒ、ＳｋＱ１またはビタミンＥの４５日コース後の、ＯＸＹＳラットにおける網膜の黄斑部における変性変化を示す図である。
【図１０】ＯＸＹＳラットにおける白内障罹患率に対する、ＳｋＱ１およびいくつかの他の製剤の影響を説明する図である。水晶体の変化を有する目のパーセンテージをＹ軸に沿ってプロットする。
【図１１】第二期の水晶体変化を有する目のパーセンテージを示す図である。ＳｋＱ１の投与は、罹患率を減少させるだけでなく、白内障の程度も実質的に軽減した。疾患の第二期に対応する変化を有する目のパーセンテージをＹ軸に沿ってプロットする。
【図１２】投与前およびＫＢｒ、ＳｋＱ１およびビタミンＥの４５日コース後のＯＸＹＳラットにおける水晶体の状態を示す図である。
【図１３】エールリヒ腹水癌が移植されたマウスの生存率に対する３つの異なる濃度のＳｋＱ１の影響を示す図である。
【図１４】タンパク質、合成阻害物質、シクロヘキシミドＤ（ＣｈＤ）および抗酸化物質の、５ｍＭ過酸化水素で処理されたヤロウィア・リポリティカの細胞に対する影響を示す図である。生存率は、固体培地の成長したコロニー数を用いて評価した。細胞を３時間のインキュベーション後に固体培地上に移した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞ミトコンドリアへ生物活性物質を標的化導入するための、治療上有効量の構造式（Ｉ）の化合物、その溶媒和物、異性体、プロドラッグ、および医薬上許容可能な担体を含む医薬組成物：
【化１】
（式中、Ａは、以下のａ）〜ｄ）を有するエフェクタ基（effector group）であって、
ａ）抗酸化物質（ＩＩ）および／またはその還元体
【化２】
（式中、ｍは１から３の整数であり、各Ｙは、低級アルキルまたは低級アルコキシを含む同じか又は異なる置換基を表すか、または隣接する２つのＹは相互結合して下記構造および／またはその還元体を形成する
【化３】
（式中、Ｒ１およびＲ２は同じか又は異なり、独立して、低級アルキルまたは低級アルコキシを表す））；
ｂ）酸化促進物質（pro-oxidant）；
ｃ）アポトーシス誘導物質またはミトコンドリア局在の抗アポトーシスタンパク質の阻害物質；
ｄ）光増感剤；
であり；
Ｌは、
ａ）１以上の置換基で任意に置換され、１以上の二重結合または三重結合を任意に含有する直鎖状または分岐鎖状炭化水素鎖、
ｂ）天然イソプレン鎖、
を含むリンカー基であり；
ｎは１から２０の整数であり；
Ｂは、
ａ）スクラチェフ（Skulachev）イオンＳｋ、
Ｓｋ＋Ｚ−
（式中、Ｓｋは脂溶性カチオンであり、Ｚは医薬上許容可能なアニオンである）；
ｂ）１〜２０のアミノ酸を含む荷電疎水性ペプチド、
を含むターゲティング基（targeting group）である；
ただし、構造（Ｉ）の化合物において、Ａがユビキノン（すなわち、２−メチル−４，５−ジメトキシ−３，６−ジオキソ−１，４−シクロヘキサジエニル）もしくはトコフェロールまたはスーパーオキシド・ジスムターゼまたはエブセレンの模倣物である場合は除外され、その場合、Ｌは二価デシルまたは二価ペンチルまたは二価プロピルラジカルであり、Ｂはトリフェニルホスホニウムである）。
【請求項２】
抗酸化物質が、２，３−ジメチル−１，４−ベンゾキノール（プラストキノン）またはその還元体（プラストキノール）である請求項１記載の組成物。
【請求項３】
アポトーシス誘導物質がフェニルアルセンオキシドである請求項１記載の組成物。
【請求項４】
ミトコンドリア局在の抗アポトーシスタンパク質の阻害物質がＡＢＴ７３７である請求項１記載の組成物。
【請求項５】
酸化促進物質がパラコート、メナジオンまたは有機ヒドロペルオキシドである請求項１記載の組成物。
【請求項６】
光増感剤が、金属置換基およびその錯体を任意に含むフタロシアニン、ポルフィリンおよびその誘導体、特に、ＢＤＰ−ＭａＣまたはＢＤＰ−ＭａＤ；もしくはフォスキャン（ｆｏｓｃａｎ）（ｍＴＨＰＣ）である請求項１記載の組成物。
【請求項７】
前記Ｓｋ（脂溶性カチオン）が、トリフェニルホスホニウム、トリフェニルアンモニウム、トリブチルアンモニウムである請求項１記載の組成物。
【請求項８】
前記ＳｋがローダミンＧである請求項１記載の組成物。
【請求項９】
細胞中のフリーラジカルおよび活性酸素種の量を減少させるための、請求項１〜８のいずれか１項記載の組成物の使用。
【請求項１０】
前記細胞が、人体または他の哺乳動物の有機組織内であり；遺伝子組み換え植物を含む、その任意の発育段階での植物の細胞であり；培養物中の細胞または植物細胞またはプロトプラストであり；真菌細胞および／または真菌細胞の培養物における細胞であり；製剤、薬理学上許容可能なタンパク質、ペプチド、抗体の産生を行う細胞の生存能力および／または生産力を増加させるための使用を含む、請求項９記載の組成物の使用。
【請求項１１】
前記細胞が、正常細胞、または癌細胞、またはヒトをはじめとする哺乳動物の幹細胞、正常細胞、ガン細胞、幹細胞の培養物を包含する細胞の培養物におけるものである場合の組成物の使用であって、製剤、薬理学上許容可能なタンパク質、ペプチド、抗体の産生を行う細胞の生存能力および／または生産力を増加させるための使用を含む、請求項９記載の組成物の使用。
【請求項１２】
前記有機組織のフリーラジカルおよび活性酸素種の濃度の低下から恩恵を受けるヒトまたは動物患者を処置するための、請求項９〜１１のいずれか１項記載の使用。
【請求項１３】
癌の化学療法、放射線療法または光線力学療法の際；フリーラジカル、活性酸素種またはこれらを生成する物質を活用した、血液または正常細胞要素を含む他の物質の殺菌の際；損傷から正常細胞を保護するための、請求項９〜１１のいずれか１項記載の使用。
【請求項１４】
化粧用、外科縫合の治癒用、外科手術中の正常組織の損傷の予防用、組織の熱傷の治癒用または予防用、炎症に対して、移植物質の保存用、移植された組織および器官の拒絶の対処用の、請求項９〜１１のいずれか１項記載の使用。
【請求項１５】
腫瘍疾患の対処用、転移および血管形成を抑制および予防用、癌細胞の排除用、癌の化学療法または光線力学療法においての使用のため、他の化学療法および光線力学療法製剤と組み合わせての使用のため、癌放射線療法と組み合わせての使用のための、請求項１〜８のいずれか１項記載の組成物の使用。
【請求項１６】
必要なときにはいつでも、アポトーシスを誘導するか又は誘導を刺激するため、癌細胞内の、もしくは癌または他の腫瘍細胞、ならびに他の細胞の、アポトーシス誘導物質に対する感受性を増大させる、請求項１５記載の使用。
【請求項１７】
有機組織の寿命を延ばすため；老化を防止するための組成物の使用であって、ホルモン療法との組み合わせ、特にジヒドロエピアンドロステロン、メラトニンとの組み合わせでの使用を含む、骨端ホルモン、甲状腺ホルモンとの組み合わせにおける使用を含む、請求項１〜８のいずれか１項記載の使用。
【請求項１８】
一般式（Ｉ）の化合物、その溶媒和物、異性体、プロドラッグおよび医薬上許容可能な担体：
【化４】
（式中、Ａは、下記ａ）〜ｄ）を含むエフェクタ基（effector group）であり
ａ）抗酸化物質および／またはその還元体
【化５】
（式中、ｍは１から３の整数であり、各Ｙは、低級アルキルまたは低級アルコキシを含む同じか又は異なる置換基を表すか、または隣接する２つのＹは相互結合して下記構造および／またはその還元体を形成する
【化６】
（式中、Ｒ１およびＲ２は同じか又は異なり、独立して、低級アルキルまたは低級アルコキシを表す））、
ｂ）酸化促進物質（pro-oxidant）、
ｃ）アポトーシス誘導物質またはミトコンドリア局在の抗アポトーシスタンパク質の阻害物質、
ｄ）光増感剤、
であり；
Ｌは、
ａ）１以上の置換基で任意に置換され、１以上の二重結合または三重結合を任意に含有する直鎖状または分岐鎖状炭化水素鎖、
ｂ）天然イソプレン鎖、
を含むリンカー基であり；
ｎは１から２０の整数であり；
Ｂは、
ａ）スクラチェフ（Skulachev）イオンＳｋ、
Ｓｋ＋Ｚ−
（式中、Ｓｋは脂溶性カチオンであり、
Ｚは医薬上許容可能なアニオンである）。
ｂ）１−２０のアミノ酸を含有する荷電疎水性ペプチド、
である。
ただし、Ａがユビキノン（すなわち、２−メチル−４，５−ジメトキシ−３，６−ジオキソ−１，４−シクロヘキサジエニル）もしくはトコフェロールまたはスーパーオキシド・ジスムターゼまたはエブセレンの模倣物である化合物は除外し、その場合、Ｌは二価デシルまたは二価ペンチルまたは二価プロピルラジカルであり、Ｂはトリフェニルホスホニウムである）。
【請求項１９】
アポトーシス誘導物質がフェニルアルセンオキシドであり、ミトコンドリア局在の抗アポトーシスタンパク質の阻害物質がＡＢＴ７３７である請求項１８記載の化合物。
【請求項２０】
光増感剤が、金属置換基およびその錯体を任意に含むフタロシアニン、ポルフィリンおよびその誘導体、特に、ＢＤＰ−ＭａＣまたはＢＤＰ−ＭａＤ；もしくはフォスキャン（ｆｏｓｃａｎ）（ｍＴＨＰＣ）である請求項１８記載の化合物。
【請求項２１】
前記Ｓｋ（脂溶性カチオン）がローダミンＧ、トリフェニルホスホニウムまたはトリフェニルアンモニウムである請求項１８記載の化合物。
【請求項２２】
Ａが一般式（ＩＩ）（式中、Ｙはメチルであり、ｍは３であり、Ｌ、ｎ、Ｂは請求項１において定義されたとおりである）のプラストキノン残基である、請求項１８記載の化合物、ならびにその溶媒和物、異性体、プロドラッグおよび医薬混合物。
【化７】
【請求項２３】
Ｌが二価デシルラジカルである請求項１８記載の化合物。
【請求項２４】
Ｌが二価ペンチルラジカルである請求項１８記載の化合物。
【請求項２５】
ＳｋがローダミンＧ部分である請求項１８記載の化合物。
【請求項２６】
ａ）ヒドロキノン（Ｉ．１）を好適な酸化物質で酸化して、ベンゾキノン（Ｉ．２）を得る工程；
【化８】
ｂ）誘導体（Ｉ．３）を形成する工程；及び
【化９】
ｃ）Ｂ−Ｍ残基を化合物（Ｉ．３）とカップリングして、目標生成物ＩＡを得る工程；
【化１０】
（式中、Ｙ、Ｌ、Ｂ、Ｒａ１、ｍ、ｎは前記定義のとおりであり、ＶはＢｒ、Ｃｌ、ＩまたはＯＨであり、Ｍは脱離基である）
を有する請求項１８記載の化合物の合成方法。
【請求項１】
細胞ミトコンドリアへ生物活性物質を標的化導入するための、治療上有効量の構造式（Ｉ）の化合物、その溶媒和物、異性体、プロドラッグ、および医薬上許容可能な担体を含む医薬組成物：
【化１】
（式中、Ａは、以下のａ）〜ｄ）を有するエフェクタ基（effector group）であって、
ａ）抗酸化物質（ＩＩ）および／またはその還元体
【化２】
（式中、ｍは１から３の整数であり、各Ｙは、低級アルキルまたは低級アルコキシを含む同じか又は異なる置換基を表すか、または隣接する２つのＹは相互結合して下記構造および／またはその還元体を形成する
【化３】
（式中、Ｒ１およびＲ２は同じか又は異なり、独立して、低級アルキルまたは低級アルコキシを表す））；
ｂ）酸化促進物質（pro-oxidant）；
ｃ）アポトーシス誘導物質またはミトコンドリア局在の抗アポトーシスタンパク質の阻害物質；
ｄ）光増感剤；
であり；
Ｌは、
ａ）１以上の置換基で任意に置換され、１以上の二重結合または三重結合を任意に含有する直鎖状または分岐鎖状炭化水素鎖、
ｂ）天然イソプレン鎖、
を含むリンカー基であり；
ｎは１から２０の整数であり；
Ｂは、
ａ）スクラチェフ（Skulachev）イオンＳｋ、
Ｓｋ＋Ｚ−
（式中、Ｓｋは脂溶性カチオンであり、Ｚは医薬上許容可能なアニオンである）；
ｂ）１〜２０のアミノ酸を含む荷電疎水性ペプチド、
を含むターゲティング基（targeting group）である；
ただし、構造（Ｉ）の化合物において、Ａがユビキノン（すなわち、２−メチル−４，５−ジメトキシ−３，６−ジオキソ−１，４−シクロヘキサジエニル）もしくはトコフェロールまたはスーパーオキシド・ジスムターゼまたはエブセレンの模倣物である場合は除外され、その場合、Ｌは二価デシルまたは二価ペンチルまたは二価プロピルラジカルであり、Ｂはトリフェニルホスホニウムである）。
【請求項２】
抗酸化物質が、２，３−ジメチル−１，４−ベンゾキノール（プラストキノン）またはその還元体（プラストキノール）である請求項１記載の組成物。
【請求項３】
アポトーシス誘導物質がフェニルアルセンオキシドである請求項１記載の組成物。
【請求項４】
ミトコンドリア局在の抗アポトーシスタンパク質の阻害物質がＡＢＴ７３７である請求項１記載の組成物。
【請求項５】
酸化促進物質がパラコート、メナジオンまたは有機ヒドロペルオキシドである請求項１記載の組成物。
【請求項６】
光増感剤が、金属置換基およびその錯体を任意に含むフタロシアニン、ポルフィリンおよびその誘導体、特に、ＢＤＰ−ＭａＣまたはＢＤＰ−ＭａＤ；もしくはフォスキャン（ｆｏｓｃａｎ）（ｍＴＨＰＣ）である請求項１記載の組成物。
【請求項７】
前記Ｓｋ（脂溶性カチオン）が、トリフェニルホスホニウム、トリフェニルアンモニウム、トリブチルアンモニウムである請求項１記載の組成物。
【請求項８】
前記ＳｋがローダミンＧである請求項１記載の組成物。
【請求項９】
細胞中のフリーラジカルおよび活性酸素種の量を減少させるための、請求項１〜８のいずれか１項記載の組成物の使用。
【請求項１０】
前記細胞が、人体または他の哺乳動物の有機組織内であり；遺伝子組み換え植物を含む、その任意の発育段階での植物の細胞であり；培養物中の細胞または植物細胞またはプロトプラストであり；真菌細胞および／または真菌細胞の培養物における細胞であり；製剤、薬理学上許容可能なタンパク質、ペプチド、抗体の産生を行う細胞の生存能力および／または生産力を増加させるための使用を含む、請求項９記載の組成物の使用。
【請求項１１】
前記細胞が、正常細胞、または癌細胞、またはヒトをはじめとする哺乳動物の幹細胞、正常細胞、ガン細胞、幹細胞の培養物を包含する細胞の培養物におけるものである場合の組成物の使用であって、製剤、薬理学上許容可能なタンパク質、ペプチド、抗体の産生を行う細胞の生存能力および／または生産力を増加させるための使用を含む、請求項９記載の組成物の使用。
【請求項１２】
前記有機組織のフリーラジカルおよび活性酸素種の濃度の低下から恩恵を受けるヒトまたは動物患者を処置するための、請求項９〜１１のいずれか１項記載の使用。
【請求項１３】
癌の化学療法、放射線療法または光線力学療法の際；フリーラジカル、活性酸素種またはこれらを生成する物質を活用した、血液または正常細胞要素を含む他の物質の殺菌の際；損傷から正常細胞を保護するための、請求項９〜１１のいずれか１項記載の使用。
【請求項１４】
化粧用、外科縫合の治癒用、外科手術中の正常組織の損傷の予防用、組織の熱傷の治癒用または予防用、炎症に対して、移植物質の保存用、移植された組織および器官の拒絶の対処用の、請求項９〜１１のいずれか１項記載の使用。
【請求項１５】
腫瘍疾患の対処用、転移および血管形成を抑制および予防用、癌細胞の排除用、癌の化学療法または光線力学療法においての使用のため、他の化学療法および光線力学療法製剤と組み合わせての使用のため、癌放射線療法と組み合わせての使用のための、請求項１〜８のいずれか１項記載の組成物の使用。
【請求項１６】
必要なときにはいつでも、アポトーシスを誘導するか又は誘導を刺激するため、癌細胞内の、もしくは癌または他の腫瘍細胞、ならびに他の細胞の、アポトーシス誘導物質に対する感受性を増大させる、請求項１５記載の使用。
【請求項１７】
有機組織の寿命を延ばすため；老化を防止するための組成物の使用であって、ホルモン療法との組み合わせ、特にジヒドロエピアンドロステロン、メラトニンとの組み合わせでの使用を含む、骨端ホルモン、甲状腺ホルモンとの組み合わせにおける使用を含む、請求項１〜８のいずれか１項記載の使用。
【請求項１８】
一般式（Ｉ）の化合物、その溶媒和物、異性体、プロドラッグおよび医薬上許容可能な担体：
【化４】
（式中、Ａは、下記ａ）〜ｄ）を含むエフェクタ基（effector group）であり
ａ）抗酸化物質および／またはその還元体
【化５】
（式中、ｍは１から３の整数であり、各Ｙは、低級アルキルまたは低級アルコキシを含む同じか又は異なる置換基を表すか、または隣接する２つのＹは相互結合して下記構造および／またはその還元体を形成する
【化６】
（式中、Ｒ１およびＲ２は同じか又は異なり、独立して、低級アルキルまたは低級アルコキシを表す））、
ｂ）酸化促進物質（pro-oxidant）、
ｃ）アポトーシス誘導物質またはミトコンドリア局在の抗アポトーシスタンパク質の阻害物質、
ｄ）光増感剤、
であり；
Ｌは、
ａ）１以上の置換基で任意に置換され、１以上の二重結合または三重結合を任意に含有する直鎖状または分岐鎖状炭化水素鎖、
ｂ）天然イソプレン鎖、
を含むリンカー基であり；
ｎは１から２０の整数であり；
Ｂは、
ａ）スクラチェフ（Skulachev）イオンＳｋ、
Ｓｋ＋Ｚ−
（式中、Ｓｋは脂溶性カチオンであり、
Ｚは医薬上許容可能なアニオンである）。
ｂ）１−２０のアミノ酸を含有する荷電疎水性ペプチド、
である。
ただし、Ａがユビキノン（すなわち、２−メチル−４，５−ジメトキシ−３，６−ジオキソ−１，４−シクロヘキサジエニル）もしくはトコフェロールまたはスーパーオキシド・ジスムターゼまたはエブセレンの模倣物である化合物は除外し、その場合、Ｌは二価デシルまたは二価ペンチルまたは二価プロピルラジカルであり、Ｂはトリフェニルホスホニウムである）。
【請求項１９】
アポトーシス誘導物質がフェニルアルセンオキシドであり、ミトコンドリア局在の抗アポトーシスタンパク質の阻害物質がＡＢＴ７３７である請求項１８記載の化合物。
【請求項２０】
光増感剤が、金属置換基およびその錯体を任意に含むフタロシアニン、ポルフィリンおよびその誘導体、特に、ＢＤＰ−ＭａＣまたはＢＤＰ−ＭａＤ；もしくはフォスキャン（ｆｏｓｃａｎ）（ｍＴＨＰＣ）である請求項１８記載の化合物。
【請求項２１】
前記Ｓｋ（脂溶性カチオン）がローダミンＧ、トリフェニルホスホニウムまたはトリフェニルアンモニウムである請求項１８記載の化合物。
【請求項２２】
Ａが一般式（ＩＩ）（式中、Ｙはメチルであり、ｍは３であり、Ｌ、ｎ、Ｂは請求項１において定義されたとおりである）のプラストキノン残基である、請求項１８記載の化合物、ならびにその溶媒和物、異性体、プロドラッグおよび医薬混合物。
【化７】
【請求項２３】
Ｌが二価デシルラジカルである請求項１８記載の化合物。
【請求項２４】
Ｌが二価ペンチルラジカルである請求項１８記載の化合物。
【請求項２５】
ＳｋがローダミンＧ部分である請求項１８記載の化合物。
【請求項２６】
ａ）ヒドロキノン（Ｉ．１）を好適な酸化物質で酸化して、ベンゾキノン（Ｉ．２）を得る工程；
【化８】
ｂ）誘導体（Ｉ．３）を形成する工程；及び
【化９】
ｃ）Ｂ−Ｍ残基を化合物（Ｉ．３）とカップリングして、目標生成物ＩＡを得る工程；
【化１０】
（式中、Ｙ、Ｌ、Ｂ、Ｒａ１、ｍ、ｎは前記定義のとおりであり、ＶはＢｒ、Ｃｌ、ＩまたはＯＨであり、Ｍは脱離基である）
を有する請求項１８記載の化合物の合成方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【公表番号】特表２００９−５１１６２６（Ｐ２００９−５１１６２６Ａ）
【公表日】平成２１年３月１９日（２００９．３．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５３６５３５（Ｐ２００８−５３６５３５）
【出願日】平成１８年７月２４日（２００６．７．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＲＵ２００６／０００３９４
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０４６７２９
【国際公開日】平成１９年４月２６日（２００７．４．２６）
【出願人】（５０８１１５１７４）リミテッド ライアビリティ カンパニー ”ミトテクノロジー” (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年３月１９日（２００９．３．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年７月２４日（２００６．７．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＲＵ２００６／０００３９４
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０４６７２９
【国際公開日】平成１９年４月２６日（２００７．４．２６）
【出願人】（５０８１１５１７４）リミテッド ライアビリティ カンパニー ”ミトテクノロジー” (1)
【Ｆターム（参考）】
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