生理活性多糖類およびその利用
【課題】 キノコに含まれる新たな多糖類を探索し、このものが有する生理活性を見出してこれを医薬品あるいは健康食品等として利用すること。
【解決手段】 構成糖のモル比として、グルコースを０．５〜３.０、ガラクトースを０.７〜１.５、グルクロン酸を０.１〜１.０、６−ディオキシ−Ｄ−アルトロースを０.２〜１.５、マンノースを０.０５〜０.５で含有することを特徴とする新規生理活性多糖類。
【解決手段】 構成糖のモル比として、グルコースを０．５〜３.０、ガラクトースを０.７〜１.５、グルクロン酸を０.１〜１.０、６−ディオキシ−Ｄ−アルトロースを０.２〜１.５、マンノースを０.０５〜０.５で含有することを特徴とする新規生理活性多糖類。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規生理活性多糖類に関し、更に詳細には、ハツタケ（Lactariu hatsudake Tanaka またはアカハツ(Lactarius akahatsu Tanaka)から得られる新規生理活性多糖類およびこれを利用する医薬品あるいは健康食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
キノコに含まれる多糖類には様々な生理活性能を持つことが明らかにされており、抗腫瘍活性や、免疫賦活活性、生活習慣病の予防、改善、生体調節機能などが知られている（非特許文献１ないし５）。
【０００３】
また、キノコから得られる糖には糖タンパクとして、あるいは何らかの形で糖にタンパク質が付随するものがあり、上記と同様に優れた生理活性能が報告されている（非特許文献６および７）。
【０００４】
しかしながら、キノコに含まれる多糖類は、その起源となるキノコにより組成が異なるものであることが予想され、当然これらの生理活性も異なると考えられている。
【０００５】
そこで、種々のキノコについて、これが含有する多糖類を見出し、その有する生理活性を明らかにすることが強く求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】「キノコの生理活性と機能」、第６８９頁等、（２００５）、 シーエムシー出版発行
【非特許文献２】「きのこ健康読本」、第９６〜１０２頁、（２００２）、 東洋医学舎発行
【非特許文献３】「キノコ博物館」、第１１〜５６頁、（２００３）、 八坂書房出版発行
【非特許文献４】“CancerLetters”,p.1-10,(2006)
【非特許文献５】“Immunopharmacology”,Vol.35,p.255-263,(1997)
【非特許文献６】“GeneralPharmacology”,Vol.27,p.621-624(1996)
【非特許文献７】“Biomedicine& Pharmacotherapy”,Vol.58,p.226-230(2004)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って本発明は、キノコに含まれる新たな多糖類を探索し、このものが有する生理活性を見出してこれを医薬あるいは健康食品等として利用することをその課題とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、種々のキノコについて、これに含まれる多糖類を分離し、その生理活性を調べていたところ、ハツタケおよびアカハツの熱水抽出物中等に含まれる多糖類は、新規な糖組成を有し、しかも白血病細胞障害活性を有することを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち本発明は、構成糖のモル比として、グルコースを０．５〜３.０、ガラクトースを０.７〜１．５、グルクロン酸を０.１〜１.０、６−ディオキシ−Ｄ−アルトロースを０.２〜１.５、マンノースを０.０５〜０.５で含有することを特徴とする新規生理活性多糖類である。
【００１０】
また本発明は、構成糖のモル比として、グルコースを１.５〜３.０、ガラクトースを０.７〜１.５、グルクロン酸を０.３〜１.０、６−ディオキシ−Ｄ−アルトロースを０.２〜１.０、マンノースを０.１〜０.５で含有することを特徴とする新規生理活性多糖類である。
【００１１】
また本発明は、ハツタケ子実体および／または菌糸体を熱水、アルカリ水もしくはシュウ酸アンモニウム溶液で抽出することを特徴とする上記生理活性多糖類の製造方法を提供するものである。
【００１２】
さらに本発明は、構成糖のモル比として、グルコースを０．５〜２．５、ガラクトースを０．７〜１．５、グルクロン酸を０.１〜１.０、６−ディオキシ−Ｄ−アルトロースを０.２〜１.５、マンノースを０.０５〜０．５で含有することを特徴とする新規生理活性多糖類である。
【００１３】
また本発明は、アカハツ子実体および／または菌糸体を熱水、アルカリ水もしくはシュウ酸アンモニウム溶液で抽出することを特徴とする上記生理活性多糖類の製造方法を提供するものである。
【００１４】
さらに、上記６−ディオキシ−Ｄ−アルトロースを製造する製造方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、長く食用に供されたハツタケまたはアカハツから、生理活性多糖類を得ることができ、このものは、医薬品あるいは健康補助食品として利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明ハツタケ精製多糖類のＩＲスペクトルを示す図面である。
【図２】本発明ハツタケ精製多糖類の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図面である。
【図３】本発明ハツタケ精製多糖類の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図面である。
【図４】本発明ハツタケ精製多糖類のＧＣ／ＭＳスペクトルを示す図面である。
【図５】本発明ハツタケ精製多糖類濃度と、Ｕ９３７細胞の生存率の関係を示す図面である。
【図６】本発明ハツタケ精製多糖類濃度と、培養上澄中に含まれているＮＯ量の関係を示す図面である。
【図７】６−ディオキシ−Ｄ−アルトロースの１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図面である。
【図８】６−ディオキシ−Ｄ−アルトロースの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図面である。
【図９】本発明アカハツ精製多糖類のペーパークロマトグラフィーによるクロマトグラムを示す図面である。
【図１０】本発明アカハツ精製多糖類濃度と、Ｕ９３７細胞の生存率の関係を示す図面である。
【図１１】本発明アカハツ精製多糖類濃度と、培養上澄中に含まれているＮＯ量の関係を示す図面である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明の生理活性多糖類は、ハツタケを原料として製造することができるものである。原料であるハツタケ（Lactariu hatsudake TanakaまたはLactarius lividatus Tanaka）は、日本、韓国、中国等に分布する担子菌の一種であり、日本では夏から秋にかけてアカマツ、クロマツなどの林内地上に群生または単生し、広く食用にされてきたキノコである。
【００１８】
このハツタケから本発明の生理活性多糖類を得るには、ハツタケ（子実体や菌糸体）を、熱水、アルカリ溶液またはシュウ酸アンモニウム溶液により抽出し、この抽出物を精製すればよい。
【００１９】
より具体的には、熱水を用いる場合は、採取したハツタケを必要により乾燥した後、細断ないしは破砕し、更に必要によりこれを脱脂した後、１００ないし８０℃程度の熱水により、３ないし５時間程度抽出操作を行えばよい。
【００２０】
抽出の際の、原料ハツタケ（乾燥）に対する熱水の量は、ハツタケ１に対し、３０ないし６０重量部程度であり、好ましくは、４０ないし５０重量部である。
【００２１】
また、アルカリ溶液を用いる場合は、上記と同様に調製したハツタケ原料を、４％ないし２４％程度のアルカリ溶液中、室温で、１０ないし１５時間程度抽出すればよい。
【００２２】
このアルカリ溶液の調製に使用されるアルカリ物質としては、ＮａＯＨ、ＫＯＨ等を挙げることができ、抽出の際の、原料ハツタケ（乾燥）に対するアルカリ溶液の量は、ハツタケ１に対し、３０ないし６０重量部程度であり、好ましくは、４０ないし５０重量部である。
【００２３】
更に、シュウ酸アンモニウム溶液を用いる場合は、上記と同様に調製したハツタケ原料を、０．５％ないし１．０％程度のシュウ酸アンモニウム溶液中、７０ないし８０℃の温度で、３ないし５時間程度抽出すればよい。
【００２４】
抽出の際の、原料ハツタケ（乾燥）に対するシュウ酸アンモニウム溶液の量は、ハツタケ１に対し、３０ないし６０重量部程度であり、好ましくは、４０ないし５０重量部である。
【００２５】
このようにして得られたハツタケからの各抽出物は、そのまま生理活性多糖類として利用することもできるが、更にこれを公知の精製手段を用いて精製し、精製生理活性多糖類として用いることが好ましい。
【００２６】
また、本発明の生理活性多糖類は、アカハツ（Lactarius akahatsu Tanaka、Lactarius hatsudake Tanaka var.akahatsu Kawam、Lactarius deliciosus (L.) S.F. Gray、または f. virescens Imai）を原料として製造することもできる。アカハツもハツタケと同様に日本では夏から秋にかけてアカマツ、クロマツなどの林内地上に群生または単生し、広く食用にされてきたキノコである。アカハツから本発明の生理活性多糖類を製造するための条件等は、上記ハツタケの場合と同様である。
【００２７】
かくして得られる本発明の生理活性多糖類は、高速液体クロマトグラフィー、ペーパークロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー等による分析から、構成糖のモル比として、グルコースを０．５〜３.０、ガラクトースを０.７〜１.５、グルクロン酸を０.１〜１.０、６−ディオキシ−Ｄ−アルトロースを０.２〜１.５、マンノースを０.０５〜０.５で含有するものである。
【００２８】
ハツタケから得られる生理活性多糖類は、構成糖モル比としてグルコースを０．５〜３.０、ガラクトースを０.７〜１.５、グルクロン酸を０.１〜１.０、６−ディオキシ−Ｄ−アルトロースを０.２〜１.５、マンノースを０.０５〜０.５で含有するものであり、好ましくは、グルコースを１.５〜３.０、ガラクトースを０.７〜１.５、グルクロン酸を０.３〜１.０、６−ディオキシ−Ｄ−アルトロースを０.２〜１.０、マンノースを０.１〜０.５で含有するものであり、より好ましくはグルコースを１.８〜２．７、ガラクトースを０.８〜１．２、グルクロン酸を０.３〜１.０、６−ディオキシ−Ｄ−アルトロースを０.２〜１.０、マンノースを０.１〜０.３で含有するものである。
【００２９】
またアカハツから得られる生理活性多糖類は、構成糖モル比としてグルコースを０．５〜３．０、ガラクトースを０.７〜１.５、グルクロン酸を０.１〜１.０、６−ディオキシ−Ｄ−アルトロースを０.２〜１.５、マンノースを０.０５〜０.５で含有するものであり、好ましくはグルコースを０．５〜２．５、ガラクトースを０．７〜１．５、グルクロン酸を０.１〜１.０、６−ディオキシ−Ｄ−アルトロースを０.２〜１.５、マンノースを０.０５〜０.５で含有するものであり、より好ましくは、グルコースを１．０〜２．０、ガラクトースを０．８〜１．２、グルクロン酸を０.２〜０．８、６−ディオキシ−Ｄ−アルトロースを０.５〜１.３、マンノースを０.０６〜０.３で含有するものである。
【００３０】
なお、上記生理活性多糖類のうち６−ディオキシ−Ｄ−アルトロースは、自然界では未だに発見されていない新規の糖である。
【００３１】
以上説明した本発明の生理活性多糖類は、医薬品あるいは健康補助食品として利用可能である。
【００３２】
本発明の生理活性多糖類を医薬品あるいは健康補助食品として利用する場合は、これを、種々の担体、賦形剤、矯味剤、香料等の薬学的に許容される任意成分と組み合わせ、粉剤、錠剤、カプセル剤、液剤、ドリンク剤等の形態とすればよい。
【００３３】
この際の摂取量としては特に制約はないが、精製生理活性多糖類として、大人一人一日当たり５０ないし１００ｍｇ程度の量であり、これを１回または数回に分けて摂取すれば良い。
【実施例】
【００３４】
次に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例に何ら制約されるものではない。
【００３５】
実 施 例 １
ハツタケ多糖の取得（１）：
原料ハツタケ（Lactarius lividatus）は、沖縄県国頭郡国頭村与那の琉球大学農学部付属亜熱帯フィールド科学教育研究センター与那フィールドで収穫した子実体を使用した。この収穫したハツタケ子実体１０２１.７ｇを通風乾燥させることにより、乾燥ハツタケ１３２.１ｇ（１２.９％）が得られた。この乾燥ハツタケをミキサーで粉砕した後、エタノールを加え、６時間攪拌して脱色を行い、上澄みを取り除いた後に、さらにアセトンを加えて６時間攪拌して、脱脂したものを実験に供した。
【００３６】
この乾燥粉末１０ｇに蒸留水３００ｍｌを加え、９０℃の沸騰湯浴中で３時間攪拌後、吸引濾過を行った。濾液を１０,０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、上澄みを濃縮、透析後、４倍容量のエタノールを加えて沈殿させた。沈殿を再度蒸留水に溶解させ、凍結乾燥を行って粗多糖を得た。
【００３７】
得られた粗多糖を、蒸留水に溶解させ、６０℃の湯浴中、３％酢酸亜鉛水溶液を加えてタンパク質を沈殿させた。１０,０００ｒｐｍ、３０分間の遠心分離により、上清のみを回収した。得られた溶液を陽イオン交換樹脂（Amberlite IR-120）に通した後、室温で２４時間透析し、凍結乾燥を行なって精製多糖を得た。
【００３８】
上記工程での、脱脂、脱色した乾燥ハツタケ子実体１０ｇから熱水３００ｍｌにて抽出した粗多糖の収量は２１４.２ｍｇ（対乾燥子実体２.１４％）で、これを精製した精製多糖の収量は１００.３ｍｇ（対乾燥子実体１.０３％）であった。
【００３９】
実 施 例 ２
ハツタケ多糖の化学組成分析：
実施例１で得た粗多糖および精製多糖について、下記方法で全糖量、ウロン酸含量およびタンパク質含量を測定した。この結果も表１に示す。
【００４０】
（１）全糖量
全糖量はフェノール硫酸法により定量した。すなわち、試料を蒸留水に溶解させ、１ｍｇ／ｍｌ濃度に調製して供試した。試料０.５ｍｌを試験管にとり、５％フェノール溶液０.５ｍｌを加え、これに濃硫酸２.５ｍｌを速やかに液面に直接滴下するように加え、よく攪拌し、室温に１０分間放置した。液温が室温（２０〜３０℃）まで下がったのを確認した後、４９０ｎｍの波長で吸光度を測定することにより、全糖量を求めた。
【００４１】
（２）ウロン酸含量
ウロン酸含量はカルバゾール硫酸法により定量した。すなわち、試料を蒸留水に溶解させ、１ｍｇ／ｍｌに調製して供試した。あらかじめ氷冷しておいたホウ酸ナトリウム溶液２.５ｍｌに、調製した試料０.５ｍｌを静かに加え重層し、室温以上にならないように静かによく攪拌した。試験管の口にガラス玉を置き、沸騰湯浴中で１０分間加熱し、水冷して室温に戻した。次にカルバゾールエタノール溶液０.１ｍｌを加えてよく攪拌し、更に沸騰湯浴中で１５分間加熱して発色させた。水冷して室温にまで戻した後、５３０ｎｍの波長で吸光度を測定することにより、ウロン酸含量を求めた。
【００４２】
（３）タンパク質含量
タンパク質含量は、ＤＣ−プロテインアッセイキット（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用い、Ｌｏｗｒｙ法を改変した方法により定量した。すなわち、試料を蒸留水に溶解させ１ｍｇ／ｍｌ溶液に調製した。この溶液２００μｌに、ワーキング・リージェント（working regent）１００μｌを加えた後、リージェントＢ（Regent B）８００μｌを加えてよく攪拌し、室温で１５分間静置して７５０ｎｍの波長で吸光度を測定することにより、蛋白質含量を求めた。
【００４３】
【表１】
【００４４】
この結果から明らかなように、全糖量、ウロン酸含量およびタンパク質含量はそれぞれ、粗多糖で６１.７％、９.３％、２１.３％、精製多糖では７４.２％、１２.５％および０.５％であった。
【００４５】
実 施 例 ３
ハツタケ多糖の構成糖分析：
ハツタケの精製多糖について、その構成糖を、下記の(１)高速液体クロマトグラフィー
、(２)ペーパークロマトグラフィーおよび(３)ガスクロマトグラフィーにより分析した。
【００４６】
（１）高速液体クロマトグラフィー
試料５０ｍｇを蒸留水２０ｍｌに溶解させ、濃硫酸を加えて１.０Ｎ硫酸になるように調製して、沸騰湯浴中で１００℃、２時間加熱して加水分解を行った。加水分解液は炭酸バリウム（ＢａＣＯ３）で中和し、沈殿物を除去して高速液体クロマトグラフィー（日本ダイオネクス株式会社、ＤＸ−５００）を用いて構成糖を同定し、その面積比より構成糖比を算出した。
【００４７】
精製多糖の加水分分解物の高速液体クロマトグラムの結果から、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−グルコース、Ｄ−マンノースが検出され、その構成糖比はＤ−グルコース：Ｄ−ガラクトース：Ｄ−マンノース＝２.０７：１.００：０.１２と算出された（表２）。
【００４８】
（２）ペーパークロマトグラフィー
上記（１）での加水分解物を、アドバンテック トーヨー（ADVANTEC TOYO）Ｎｏ５０の濾紙を使用して、ペーパークロマトグラフィーを行った。展開溶媒にはブタノール：エタノール：水＝４：１：５を使用した。発色剤はアニリン−フタル酸を使用し、上昇法で展開を行った。
【００４９】
この結果、Ｄ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−マンノースのＲｆ値と一致するスポットが認められた。またフコース、ラムノースよりも高いＲｆ値にメチル化糖である６−ディオキシ−Ｄ−アルトロースと思われるスポットが認められた。
【００５０】
（３）ガスクロマトグラフィー
ハツタケ精製多糖５ｍｇを試料として蒸留水２ｍｌに溶解させ、これにトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を加え、多糖溶液の終濃度が２Ｍになるように試料溶液を調製した。この試料溶液を、乾熱器にて１００℃で、２時間加熱して加水分解し、窒素ガス雰囲気下、４０℃で濃縮乾固して加水分解物を得た。
【００５１】
加水分解物を、１Ｎ−ＮａＢＨ４溶液に溶解し、室温で１時間反応させ、酢酸を１滴加えて攪拌した後、窒素ガス雰囲気下、４０℃で乾固させアルジトールを得た。続いて酢酸エタノール溶液（酢酸：メタノール＝１：９）２ｍｌを加え、４０℃で濃縮乾固させる作業を３回繰り返した。続いて１００％メタノールを２ｍｌ加え、４０℃で濃縮乾固させる作業を４回繰り返した。最後に、無水酢酸溶液（無水酢酸：ピリジン＝１：１）０.５ｍｌを加え、１２１℃で、２０分反応させることによりアセチル化した。
【００５２】
このアセチル化物５ｍｇにトルエン１ｍｌを加え、４０℃で濃縮乾固し、クロロホルム溶液（クロロホルム：蒸留水＝１：１）を２ｍｌ加えた。溶解した後、クロロホルム層のみを回収し、４０℃で乾固させてアルジトールアセテートを得た。得られたアルジトールアセテート５ｍｇをアセトン０.５ｍｌに溶解させ、ガスクロマトグラフィー（ＳＨＩＭＡＺＵ、ＧＣ−１７Ａ）に供試した。カラムはｓｐ２３３０を使用し、１７０℃（２分間保持）より４℃／ｍｉｎで昇温、２３５℃（１５分間保持）の条件で解析を行った。
【００５３】
精製多糖のガスクロマトグラムの結果から、Ｄ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−マンノースおよび６−ディオキシ−Ｄ−アルトロースが検出され、その構成糖比はＤ−グルコース：Ｄ−ガラクトース：Ｄ−マンノース：６−ディオキシ−Ｄ−アルトロース＝１.８０：１.００：０.０７：０.３と算出された（表２）。
【００５４】
【表２】
【００５５】
実 施 例 ４
ハツタケ精製多糖の分子量測定：
試料を高速液体クロマトグラム（ＲＩＤ−６Ａ；ＳＨＩＭＡＤＺＵ）に付し、分子量を測定した。標準曲線は、ショーデックス スタンダード（Shodex STANDARD）Ｐ−８２（プルラン：Ｐ−４００、Ｐ−１００、Ｐ−２０、Ｐ−５：昭和電工株式会社）を用いて作成した。また、分析条件は以下の通りである。
【００５６】
分析カラム： ＴＳＫｇｅｌＧ４０００ＰＷＸＬ
緩 衝 液： ０.０５Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７.２）＋０.１５Ｍ
食塩
流 速 ： ０.３ｍｌ／ｍｉｎ
【００５７】
この結果、ハツタケ精製多糖の分子量は、約２４０,０００と算出された。
【００５８】
実 施 例 ５
ハツタケ精製多糖の赤外吸収スペクトル測定：
ハツタケ精製多糖の赤外吸収スペクトルは、フーリエ変換赤外分光光度計バイオ−ラッド メリーン（Bio-Rad Merlin）を用い、ＫＢｒ法で測定した。この結果を図１に示した。ＯＨおよびＣＨ基に由来する吸収が３４００および２９００ｃｍ−１に認められた。また、ウロン酸に由来する吸収が１６２０ｃｍ−１に認められた。
【００５９】
実 施 例 ６
ハツタケ精製多糖の旋光度測定：
ハツタケ精製多糖の旋光度は、試料を蒸留水に溶解させて０.２（ｗ／ｖ）％溶液を作成し、自動旋光度計ＤＩＰ−１８０（日本分光）を用い、５８９ｎｍで測定した。旋光度の測定は６０℃から徐々に温度を低下させながら行った。この結果を表３に示すが、旋光度は６０℃で−０.０５５°を有しており、温度の低下に伴って徐々に減少し、１０℃では−０.０３５°を有していた。
【００６０】
【表３】
【００６１】
実 施 例 ７
ハツタケ精製多糖のＮＭＲ分析：
ハツタケ精製多糖の１３Ｃおよび１Ｈ−ＮＭＲスペクトルは、ＦＴ−ＮＭＲスペクトロメーター（ＪＮＭ―α５００、ＪＥＯＬ）を用いてそれぞれ１２５ＭＨｚ、５００ＭＨｚで測定した。ハツタケ精製多糖を試料として重水に溶解させ、１.０％溶液を作成し、６０℃で測定した。内部標準としては、３−（トリメチルシリル）プロピオニック−２,２,３,３,−ｄ４アシッド ソルト（ＴＳＰ、０.００ｐｐｍ）を用い、結果は化学シフト（ｐｐｍ）で表示した。
【００６２】
（１）１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル
精製多糖の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを図２に示した。２０.３２２ｐｐｍのシグナルは、ディオキシ−アルトロースのメチル基に由来するものである。６３.４８６〜７９.９０５ｐｐｍは環状炭素によるものであるが、重複が激しいために詳しい解析は困難であった。１００.８０８〜１０２.９３１ｐｐｍの範囲に確認されたシグナルはアノメリック炭素によるものと思われるが、重複が激しいため、どの構成糖に起因するものか判断ができる情報は得られなかった。また、１８７.９９２ｐｐｍのピークはウロン酸由来のシグナルであることが分かった。
【００６３】
（２）１Ｈ−ＮＭＲスペクトル
精製多糖の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図３に示した。メチル基のプロトンによるシグナルが１.３２８ｐｐｍで観測された。また、５.３７７ｐｐｍ、５.１１５ｐｐｍ、５.０１９ｐｐｍの３つのシグナルが観測された。これらはアノメリックプロトンのピークである。１３Ｃ−ＮＭＲの結果に加えて、ここでも重複するシグナルが多いため、構造解析の手段として決定的な情報を得られず解析は困難であった。
【００６４】
実 施 例 ８
ハツタケ精製多糖のメチル化分析：
箱守法を改変した方法を用いて、精製多糖のメチル化を行った。すなわち、窒素ガス雰囲気下、ハツタケ精製多糖２ｍｇに、ジメチルスルホキシド５００μｌを加え、３時間攪拌して溶解させた。次いで、窒素ガス充填バッグ内で、粉末水酸化ナトリウム２５ｍｇを加え、２時間攪拌した後、氷冷しながらヨウ化メチル２５０μｌを加えて更に１時間攪拌して反応させた。さらに蒸留水５００μｌを加え、白濁した溶液が透明になるまで窒素ガスによるバブリングを行った。
【００６５】
固層抽出カートリッジ（Ｓｅｐ−Ｐａｋ ｐｌｕｓＣ１８ ｃａｒｔｒｉｄｅｓ；ウォータ社製）をメタノール５ｍｌで４回、アセトニトリル２ｍｌで２回、蒸留水５ｍｌで２回洗浄し、糖液を注入してメチル化糖をカートリッジ内に吸着させた。その後、蒸留水４ｍｌを２回注入した後、アセトニトリル溶液（アセトニトリル：水＝１：４）で非吸着画分を排除した後、１００％アセトニトリル１ｍｌを２回通してメチル化糖を溶出させ、窒素ガスで濃縮乾固してメチル化糖を得た。得られたメチル化糖を２Ｍ−トリフルオロ酢酸溶液（ＴＦＡ）を用い、１２１℃で、１時間で加水分解し、窒素ガス雰囲気下、４０℃で乾固させて加水分解物を得た。これにメタノール溶液（メタノール：水＝１：１）２２０μｌ、ＮａＢＤ４溶液２００μｌを加え、室温で１時間反応させ、酢酸５０μｌを加えてよく攪拌した。
【００６６】
更に、酢酸メタノール溶液（酢酸：メタノール＝１：９）２００μｌを加えて攪拌、窒素ガス雰囲気下で乾固する作業を２回、１００％エタノール２００μｌを加えて窒素乾固する作業を４回繰り返した。続いて無水酢酸５０μｌを加え乾熱機で１２１℃、３時間反応させた後、蒸留水５００μｌを加え、炭酸ナトリウムで中和し、クロロホルム５００μｌを加え、攪拌、遠心分離し、下層のクロロホルム層のみを回収した。
【００６７】
得られたクロロホルム層を窒素ガスで乾固させ、これを完全メチル化アルジトールアセテートとし、アセトン５００μｌに溶解させてＧＣ／ＭＳ（ＳＨＩＭＡＤＺＵ、ＱＰ２０１０、ＧＣ２０１０）に供試した。カラムはｓｐ２３３０を使用し、１７０℃（２分間保持）より４℃／ｍｉｎで昇温、２３５℃（１５分間保持）の条件で解析を行った。
【００６８】
メチル化分析によるＧＣ／ＭＳスペクトルの結果を図４に示した。メチル化分析により得られたＧＣ／ＭＳのマススペクトルの解析から、２，３，４−トリ−Ｏ−メチル−Ｄ−グルクロン酸、２，３，４−トリ−Ｏ−メチル−Ｄ−６−ディオキシ−Ｄ−アルトロース、２，３，６−トリ−Ｏ−メチル−Ｄ−グルコース、２，４−ジ−Ｏ−メチル−Ｄ−ガラクトース、２，３−ジ−Ｏ−メチル−Ｄ−ガラクトースの５つの主要なマススペクトルが得られ、それぞれ１：１：３：１：１で構成される糖鎖構造を有することが分かった。
【００６９】
実 施 例 ９
アルカリ溶液を用いたハツタケ多糖の取得（２）：
４％ＫＯＨに実施例１で得たハツタケ乾燥粉末１０ｇを分散させ室温で１２時間攪拌した溶液を濾過し、得られた濾過液を０．１Ｍ ＨＣｌで中和し濃縮した後、透析し２倍量のエタノールで沈殿させて多糖を得た。このようにして得た多糖を常法により加水分解し構成多糖を分析した結果、その構成糖比は、Ｄ−グルコース：Ｄ−ガラクトース：Ｄ−マンノース：６−ディオキシ−Ｄ−アルトロース：Ｄ−グルクロン酸＝２．７：１．０：０．０５：０．７：０．２であった。
【００７０】
実 施 例 １０
ハツタケ多糖の取得（３）：
０．５％ショウ酸アンモニウムに実施例１で得たハツタケ乾燥粉末１０ｇを分散させ８０℃で３時間攪拌した溶液を濾過した後、得られた濾過液に２倍量のエタノールで沈殿させて多糖を得た。このようにして得た多糖を常法により加水分解し構成多糖を分析した結果、その構成糖比は、Ｄ−グルコース：Ｄ−ガラクトース：Ｄ−マンノース：６−ディオキシ−Ｄ−アルトロース：Ｄ−グルクロン酸＝２．３：１．０：０．０８：０．８：０．３であった。
【００７１】
実 施 例 １１
細胞障害活性試験：
実施例２で得たハツタケ精製多糖の細胞障害活性を、ヒト骨髄性白血病細胞株（Ｕ−９３７；ヒューマンサイエンス研究資源バンクより入手）を用いて調べた。
【００７２】
まず、上記細胞を、１０％非動化済み牛胎児血清（fetal bovine serum；ＦＢＳ）、ペニシリン１００ＩＵ／ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌを添加したＲＰＭＩ１６４０培地（またはＲＰＭＩ１６４０−ＭＥＭ混合培地）にそれぞれ分散させ、３７℃、５％ＣＯ２−空気気相下で培養した。継代は５日毎に細胞がコンフルエントになる前に行った。
【００７３】
細胞障害活性は、セル・カウンティングキット−８を用いた細胞数測定法で行った。すなわち、９６ウェルマイクロプレートに、１.０×１０５細胞／ｍｌになるように上記白血病細胞を播き、２４時間の前培養を行った。その後、所定の濃度になるように精製多糖を添加し、７２時間後にＣＣＫ−８溶液を各ウェルに１０μｌ添加し、更に４時間、３７℃、５％ＣＯ２−空気気相下でインキュベートを行った。その後、マイクロプレートリーダー（Model650；Bio-RadLaboratories）で吸光度（測定波長４５０ｎｍ、参照波長６２０ｎｍ）を測定した。細胞障害活性性は対照群の吸密度に対する、サンプル添加による吸密度を比較することで評価した。この結果を図５に示す。
【００７４】
この結果、ハツタケ精製多糖は、Ｕ９３７細胞に対し、１ｍｇ／ｍｌ濃度において約７０％の細胞障害活性を示した。またその細胞障害活性は、Ｕ９３７細胞に対し、濃度依存的であった。
【００７５】
実 施 例 １２
免疫賦活活性試験：
実施例２で得たハツタケ精製多糖の免疫賦活活性を、マウス腹腔マクロファージ細胞株（ＲＡＷ２６４.７細胞）を用い、酸化窒素（ＮＯ）産生を指標として評価した。
【００７６】
まず、マウス腹腔マクロファージ細胞株を、１０％牛胎児血清、１００ＵＩ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＤＥＭＥ培地に分散し、３７℃、５％ＣＯ２−空気の条件で培養した。継代は５日毎に行った。
【００７７】
上記のようにして培養したマウス腹腔マクロファージ細胞株を、５.０×１０５cell／ｍｌとなるように調製し、４８ウエルプレート中で培養した。２４時間培養後、ハツタケ精製多糖を所定量加え、更に２４時間培養した。
【００７８】
培養後、培養上澄を回収し、その中に含まれているＮＯ量をグリエス（Griess）法で測定した。この結果を図６に示す。ハツタケ精製多糖濃度の増大と共にＮＯ生産量が増大し、マクロファージ活性が促進されたこと、すなわち免疫賦活活性が向上したことが示された。
【００７９】
実 施 例 １３
６−ディオキシ−Ｄ−アルトロースの製造
ハツタケ菌糸体または子実体を酸に分散させ抽出液を濾過後アルカリで中和を行い、透析あるいは電気透析処理したもの（液体）、あるいは連続遠心機で不溶物を除去した溶液をアルコールまたはスプレードライしたエキス（粉体）を塩酸、硫酸、またはシュウ酸等の酸溶液に溶解後、加熱により加水分解を行い、アルカリで中和後充填剤としてシリカゲル、活性炭または両者を混合したカラムクロマトグラフィー等で６−ディオキシ−Ｄ−アルトロースを分離、濃縮およびアルコール等で結晶化させる。６−ディオキシ−Ｄ−アルトロースの比旋光度［α］は、＋１４．２〜＋１７．５°であった。
【００８０】
実 施 例 １４
アカハツ多糖の取得：
原料アカハツ（Lactarius akahatsu）は沖縄県国頭郡国頭村与那の琉球大学農学部附属亜熱帯フィールド教育研究センター与那フィールドで収穫した子実体を使用した。収穫した子実体９００ｇを４０℃で２４時間通風乾燥させることにより、乾燥アカハツ９５ｇが得られた。乾燥アカハツを粉砕器で粉砕後、エタノールで脱色し、次いでアセトンで脱脂を行ったものを使用した。
【００８１】
粉末１０ｇに蒸留水３００ｍｌを加え、１００℃で３時間攪拌後吸引濾過を行った。濾液を遠心分離後、上清を濃縮、エタノールで沈澱させ、粗多糖を得た。
【００８２】
得られた粗多糖を蒸留水に溶解させ、６０℃に加熱して３％酢酸鉛初溶液を滴下してタンパク質を沈澱させた。遠心分離により上清みを回収した。得られた溶液を陽イオン交換樹脂（Amberlite IR-120）を通した後、水酸化ナトリウムで中和後透析を行い（室温、２４時間）、濃縮後、凍結乾燥して精製多糖を得た。１０ｇの子実体から２３０．３ｍｇの粗多糖を得、１０３．５ｍｇの精製多糖を得た。
【００８３】
実 施 例 １５
アカハツ多糖の化学組成分析：
実施例１４で得た粗多糖および精製多糖について、下記方法で全糖量、ウロン酸含量およびタンパク質含量を測定した。この結果を表４に示す。
【００８４】
（１）全糖量
全糖量はフェノール硫酸法により定量した。すなわち、試料を蒸留水に溶解させ、１ｍｇ／ｍｌ濃度に調製して供試した。試料０.５ｍｌを試験管にとり、５％フェノール溶液０.５ｍｌを加え、これに濃硫酸２.５ｍｌを速やかに液面に直接滴下するように加え、よく攪拌し、室温に１０分間放置した。液温が室温（２０〜３０℃）まで下がったのを確認した後、４９０ｎｍの波長で吸光度を測定することにより、全糖量を求めた。
【００８５】
（２）ウロン酸含量
ウロン酸含量はカルバゾール硫酸法により定量した。すなわち、試料を蒸留水に溶解させ、１ｍｇ／ｍｌに調製して供試した。あらかじめ氷冷しておいたホウ酸ナトリウム溶液２.５ｍｌに、調製した試料０.５ｍｌを静かに加え重層し、室温以上にならないように静かによく攪拌した。試験管の口にガラス玉を置き、沸騰湯浴中で１０分間加熱し、水冷して室温に戻した。次にカルバゾールエタノール溶液０.１ｍｌを加えてよく攪拌し、更に沸騰湯浴中で１５分間加熱して発色させた。水冷して室温にまで戻した後、５３０ｎｍの波長で吸光度を測定することにより、ウロン酸含量を求めた。
【００８６】
（３）タンパク質含量
タンパク質含量は、ＤＣ−プロテインアッセイキット（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用い、Ｌｏｗｒｙ法を改変した方法により定量した。すなわち、試料を蒸留水に溶解させ１ｍｇ／ｍｌ溶液に調製した。この溶液２００μｌに、ワーキング・リージェント（working regent）１００μｌを加えた後、リージェントＢ（Regent B）８００μｌを加えてよく攪拌し、室温で１５分間静置して７５０ｎｍの波長で吸光度を測定することにより、蛋白質含量を求めた。
【００８７】
【表４】
【００８８】
実 施 例 １６
アカハツ多糖の構成糖分析
アカハツの精製多糖について、その構成糖を、下記の(１)高速液体クロマトグラフィー
、(２)ペーパークロマトグラフィーおよび(３)ガスクロマトグラフィーにより分析した。
【００８９】
（１）高速液体クロマトグラフィー
試料５０ｍｇを蒸留水２０ｍｌに溶解させ、濃硫酸を加えて１.０Ｎ硫酸になるように調製して、沸騰湯浴中で１００℃、２時間加熱して加水分解を行った。加水分解液は炭酸バリウム（ＢａＣＯ３）で中和し、沈殿物を除去して高速液体クロマトグラフィー（日本ダイオネクス株式会社、ＤＸ−５００）を用いて構成糖を同定し、その面積比より構成糖比を算出した。
【００９０】
精製多糖の加水分分解物の高速液体クロマトグラムの結果から、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−グルコース、Ｄ−マンノースが検出され、その構成糖比はＤ−グルコース：Ｄ−ガラクトース：Ｄ−マンノース＝１．３：２．０：０．２と算出された。
【００９１】
（２）ペーパークロマトグラフィー
上記（１）での加水分解物を、アドバンテック トーヨー（ADVANTEC TOYO）Ｎｏ５０の濾紙を使用して、ペーパークロマトグラフィーを行った。展開溶媒にはブタノール：エタノール：水＝４：１：５を使用した。発色剤はアニリン−フタル酸を使用し、上昇法で展開を行った。結果を図９に示す。
【００９２】
図９から、６―ディオキシ−Ｄ−アルトロース、Ｄ−グルコース、Ｄ―ガラクトースを同定した。
【００９３】
（３）ガスクロマトグラフィー
アカハツ精製多糖５ｍｇを試料として蒸留水２ｍｌに溶解させ、これにトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を加え、多糖溶液の終濃度が２Ｍになるように試料溶液を調製した。この試料溶液を、乾熱器にて１００℃で、２時間加熱して加水分解し、窒素ガス雰囲気下、４０℃で濃縮乾固して加水分解物を得た。
【００９４】
加水分解物を、１Ｎ−ＮａＢＨ４溶液に溶解し、室温で１時間反応させ、酢酸を１滴加えて攪拌した後、窒素ガス雰囲気下、４０℃で乾固させアルジトールを得た。続いて酢酸エタノール溶液（酢酸：メタノール＝１：９）２ｍｌを加え、４０℃で濃縮乾固させる作業を３回繰り返した。続いて１００％メタノールを２ｍｌ加え、４０℃で濃縮乾固させる作業を４回繰り返した。最後に、無水酢酸溶液（無水酢酸：ピリジン＝１：１）０.５ｍｌを加え、１２１℃で、２０分反応させることによりアセチル化した。
【００９５】
このアセチル化物５ｍｇにトルエン１ｍｌを加え、４０℃で濃縮乾固し、クロロホルム溶液（クロロホルム：蒸留水＝１：１）を２ｍｌ加えた。溶解した後、クロロホルム層のみを回収し、４０℃で乾固させてアルジトールアセテートを得た。得られたアルジトールアセテート５ｍｇをアセトン０.５ｍｌに溶解させ、ガスクロマトグラフィー（ＳＨＩＭＡＺＵ、ＧＣ−１７Ａ）に供試した。カラムはｓｐ２３３０を使用し、１７０℃（２分間保持）より４℃／ｍｉｎで昇温、２３５℃（１５分間保持）の条件で解析を行った。
【００９６】
精製多糖のガスクロマトグラムの結果から、Ｄ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−マンノースおよび６−ディオキシ−Ｄ−アルトロースが検出され、その構成糖比はＤ−グルコース：Ｄ−ガラクトース：Ｄ−マンノース：６−ディオキシ−Ｄ−アルトロース＝１．６：１．０：０．０８：１．０と算出された。
【００９７】
実 施 例 １７
アカハツ精製多糖のメチル化分析：
箱守法を改変した方法を用いて、精製多糖のメチル化を行った。すなわち、窒素ガス雰囲気下、アカハツ精製多糖２ｍｇに、ジメチルスルホキシド５００μｌを加え、３時間攪拌して溶解させた。次いで、窒素ガス充填バッグ内で、粉末水酸化ナトリウム２５ｍｇを加え、２時間攪拌した後、氷冷しながらヨウ化メチル２５０μｌを加えて更に１時間攪拌して反応させた。さらに蒸留水５００μｌを加え、白濁した溶液が透明になるまで窒素ガスによるバブリングを行った。
【００９８】
固層抽出カートリッジ（Ｓｅｐ−Ｐａｋ ｐｌｕｓＣ１８ ｃａｒｔｒｉｄｅｓ；ウォータ社製）をメタノール５ｍｌで４回、アセトニトリル２ｍｌで２回、蒸留水５ｍｌで２回洗浄し、糖液を注入してメチル化糖をカートリッジ内に吸着させた。その後、蒸留水４ｍｌを２回注入した後、アセトニトリル溶液（アセトニトリル：水＝１：４）で非吸着画分を排除した後、１００％アセトニトリル１ｍｌを２回通してメチル化糖を溶出させ、窒素ガスで濃縮乾固してメチル化糖を得た。得られたメチル化糖を２Ｍ−トリフルオロ酢酸溶液（ＴＦＡ）を用い、１２１℃で、１時間で加水分解し、窒素ガス雰囲気下、４０℃で乾固させて加水分解物を得た。これにメタノール溶液（メタノール：水＝１：１）２２０μｌ、ＮａＢＤ４溶液２００μｌを加え、室温で１時間反応させ、酢酸５０μｌを加えてよく攪拌した。
【００９９】
更に、酢酸メタノール溶液（酢酸：メタノール＝１：９）２００μｌを加えて攪拌、窒素ガス雰囲気下で乾固する作業を２回、１００％エタノール２００μｌを加えて窒素乾固する作業を４回繰り返した。続いて無水酢酸５０μｌを加え乾熱機で１２１℃、３時間反応させた後、蒸留水５００μｌを加え、炭酸ナトリウムで中和し、クロロホルム５００μｌを加え、攪拌、遠心分離し、下層のクロロホルム層のみを回収した。
【０１００】
得られたクロロホルム層を窒素ガスで乾固させ、これを完全メチル化アルジトールアセテートとし、アセトン５００μｌに溶解させてＧＣ／ＭＳ（ＳＨＩＭＡＤＺＵ、ＱＰ２０１０、ＧＣ２０１０）に供試した。カラムはｓｐ２３３０を使用し、１７０℃（２分間保持）より４℃／ｍｉｎで昇温、２３５℃（１５分間保持）の条件で解析を行った。
【０１０１】
メチル化分析により得られたＧＣ／ＭＳのマススペクトルの解析から、１，５−Ｏ−アセチル−２，３，４−トリ−Ｏ−メチル−Ｄ−グルクロン酸、１，５−Ｏ−アセチル−６―ディオキシ−２，３，４−トリ−Ｏ−メチル−Ｄ−アルトロース、１，４，５−Ｏ−アセチル−２，３，６−ト−Ｏ−メチル−Ｄ−グルコース、１，３，５，６−アセチル−２，４−ジ−Ｏメチル−Ｄ−ガラクトース及び１，４，５，６−Ｏアセチル−２，３−ジ−Ｏ−メチル−Ｄ−ガラクトースの５つの主要なマススペクトルが得られ、それぞれのモル比は１：１：３：１：１であった。
【０１０２】
実 施 例 １８
細胞障害活性試験：
実施例１４で得たアカハツ精製多糖の細胞障害活性を、ヒト骨髄性白血病細胞株（Ｕ−９３７；ヒューマンサイエンス研究資源バンクより入手）を用いて調べた。
【０１０３】
まず、上記細胞を、１０％非動化済み牛胎児血清（fetal bovine serum；ＦＢＳ）、ペニシリン１００ＩＵ／ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌを添加したＲＰＭＩ１６４０培地（またはＲＰＭＩ１６４０−ＭＥＭ混合培地）にそれぞれ分散させ、３７℃、５％ＣＯ２−空気気相下で培養した。継代は５日毎に細胞がコンフルエントになる前に行った。
【０１０４】
細胞障害活性は、セル・カウンティングキット−８を用いた細胞数測定法で行った。すなわち、９６ウェルマイクロプレートに、１.０×１０５細胞／ｍｌになるように上記白血病細胞を播き、２４時間の前培養を行った。その後、所定の濃度になるように精製多糖を添加し、７２時間後にＣＣＫ−８溶液を各ウェルに１０μｌ添加し、更に４時間、３７℃、５％ＣＯ２−空気気相下でインキュベートを行った。その後、マイクロプレートリーダー（Model650；Bio-RadLaboratories）で吸光度（測定波長４５０ｎｍ、参照波長６２０ｎｍ）を測定した。細胞障害活性性は対照群の吸密度に対する、サンプル添加による吸密度を比較することで評価した。この結果を図１０に示す。
【０１０５】
この結果、ハツタケ精製多糖は、Ｕ９３７細胞に対し、１ｍｇ／ｍｌ濃度において約７０％の細胞障害活性を示した。またその細胞障害活性は、Ｕ９３７細胞に対し、濃度依存的であった。
【０１０６】
実 施 例 １９
免疫賦活活性試験：
実施例１４で得たアカハツ精製多糖の免疫賦活活性を、マウス腹腔マクロファージ細胞株（ＲＡＷ２６４.７細胞）を用い、酸化窒素（ＮＯ）産生を指標として評価した。
【０１０７】
まず、マウス腹腔マクロファージ細胞株を、１０％牛胎児血清、１００ＵＩ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＤＥＭＥ培地に分散し、３７℃、５％ＣＯ２−空気の条件で培養した。継代は５日毎に行った。
【０１０８】
上記のようにして培養したマウス腹腔マクロファージ細胞株を、５.０×１０５cell／ｍｌとなるように調製し、４８ウエルプレート中で培養した。２４時間培養後、ハツタケ精製多糖を所定量加え、更に２４時間培養した。
【０１０９】
培養後、培養上澄を回収し、その中に含まれているＮＯ量をグリエス（Griess）法で測定した。この結果を図１１に示す。アカハツ精製多糖濃度の増大と共にＮＯ生産量が増大し、マクロファージ活性が促進されたこと、すなわち免疫賦活活性が向上したことが示された。
【０１１０】
実 施 例 ２０
アカハツからの６−ディオキシ−Ｄ−アルトロースの製造
アカハツ菌糸体または子実体を酸に分散させ抽出液を濾過後アルカリで中和を行い、透析あるいは電気透析処理したもの（液体）、あるいは連続遠心機で不溶物を除去した溶液をアルコールまたはスプレードライしたエキス（粉体）を塩酸、硫酸、またはシュウ酸等の酸溶液に溶解後、加熱により加水分解を行い、アルカリで中和後充填剤としてシリカゲル、活性炭または両者を混合したカラムクロマトグラフィー等で６−ディオキシ−Ｄ−アルトロースを分離、濃縮およびアルコール等で結晶化させる。６−ディオキシ−Ｄ−アルトロースの比旋光度［α］は、＋１４．２〜＋１７．５°であった。
【産業上の利用可能性】
【０１１１】
本発明では、タンパク質を含んだ粗多糖およびタンパク質を取り除いた精製多糖について細胞障害活性の検討を行ったが、精製多糖に白血病細胞（Ｕ９３７細胞）に対する細胞障害活性が認められた。
【０１１２】
従って、本発明のハツタケまたはアカハツからの多糖類は、その生理活性を医薬品あるいは健康補助食品として利用することが可能である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規生理活性多糖類に関し、更に詳細には、ハツタケ（Lactariu hatsudake Tanaka またはアカハツ(Lactarius akahatsu Tanaka)から得られる新規生理活性多糖類およびこれを利用する医薬品あるいは健康食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
キノコに含まれる多糖類には様々な生理活性能を持つことが明らかにされており、抗腫瘍活性や、免疫賦活活性、生活習慣病の予防、改善、生体調節機能などが知られている（非特許文献１ないし５）。
【０００３】
また、キノコから得られる糖には糖タンパクとして、あるいは何らかの形で糖にタンパク質が付随するものがあり、上記と同様に優れた生理活性能が報告されている（非特許文献６および７）。
【０００４】
しかしながら、キノコに含まれる多糖類は、その起源となるキノコにより組成が異なるものであることが予想され、当然これらの生理活性も異なると考えられている。
【０００５】
そこで、種々のキノコについて、これが含有する多糖類を見出し、その有する生理活性を明らかにすることが強く求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】「キノコの生理活性と機能」、第６８９頁等、（２００５）、 シーエムシー出版発行
【非特許文献２】「きのこ健康読本」、第９６〜１０２頁、（２００２）、 東洋医学舎発行
【非特許文献３】「キノコ博物館」、第１１〜５６頁、（２００３）、 八坂書房出版発行
【非特許文献４】“CancerLetters”,p.1-10,(2006)
【非特許文献５】“Immunopharmacology”,Vol.35,p.255-263,(1997)
【非特許文献６】“GeneralPharmacology”,Vol.27,p.621-624(1996)
【非特許文献７】“Biomedicine& Pharmacotherapy”,Vol.58,p.226-230(2004)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って本発明は、キノコに含まれる新たな多糖類を探索し、このものが有する生理活性を見出してこれを医薬あるいは健康食品等として利用することをその課題とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、種々のキノコについて、これに含まれる多糖類を分離し、その生理活性を調べていたところ、ハツタケおよびアカハツの熱水抽出物中等に含まれる多糖類は、新規な糖組成を有し、しかも白血病細胞障害活性を有することを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち本発明は、構成糖のモル比として、グルコースを０．５〜３.０、ガラクトースを０.７〜１．５、グルクロン酸を０.１〜１.０、６−ディオキシ−Ｄ−アルトロースを０.２〜１.５、マンノースを０.０５〜０.５で含有することを特徴とする新規生理活性多糖類である。
【００１０】
また本発明は、構成糖のモル比として、グルコースを１.５〜３.０、ガラクトースを０.７〜１.５、グルクロン酸を０.３〜１.０、６−ディオキシ−Ｄ−アルトロースを０.２〜１.０、マンノースを０.１〜０.５で含有することを特徴とする新規生理活性多糖類である。
【００１１】
また本発明は、ハツタケ子実体および／または菌糸体を熱水、アルカリ水もしくはシュウ酸アンモニウム溶液で抽出することを特徴とする上記生理活性多糖類の製造方法を提供するものである。
【００１２】
さらに本発明は、構成糖のモル比として、グルコースを０．５〜２．５、ガラクトースを０．７〜１．５、グルクロン酸を０.１〜１.０、６−ディオキシ−Ｄ−アルトロースを０.２〜１.５、マンノースを０.０５〜０．５で含有することを特徴とする新規生理活性多糖類である。
【００１３】
また本発明は、アカハツ子実体および／または菌糸体を熱水、アルカリ水もしくはシュウ酸アンモニウム溶液で抽出することを特徴とする上記生理活性多糖類の製造方法を提供するものである。
【００１４】
さらに、上記６−ディオキシ−Ｄ−アルトロースを製造する製造方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、長く食用に供されたハツタケまたはアカハツから、生理活性多糖類を得ることができ、このものは、医薬品あるいは健康補助食品として利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明ハツタケ精製多糖類のＩＲスペクトルを示す図面である。
【図２】本発明ハツタケ精製多糖類の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図面である。
【図３】本発明ハツタケ精製多糖類の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図面である。
【図４】本発明ハツタケ精製多糖類のＧＣ／ＭＳスペクトルを示す図面である。
【図５】本発明ハツタケ精製多糖類濃度と、Ｕ９３７細胞の生存率の関係を示す図面である。
【図６】本発明ハツタケ精製多糖類濃度と、培養上澄中に含まれているＮＯ量の関係を示す図面である。
【図７】６−ディオキシ−Ｄ−アルトロースの１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図面である。
【図８】６−ディオキシ−Ｄ−アルトロースの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図面である。
【図９】本発明アカハツ精製多糖類のペーパークロマトグラフィーによるクロマトグラムを示す図面である。
【図１０】本発明アカハツ精製多糖類濃度と、Ｕ９３７細胞の生存率の関係を示す図面である。
【図１１】本発明アカハツ精製多糖類濃度と、培養上澄中に含まれているＮＯ量の関係を示す図面である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明の生理活性多糖類は、ハツタケを原料として製造することができるものである。原料であるハツタケ（Lactariu hatsudake TanakaまたはLactarius lividatus Tanaka）は、日本、韓国、中国等に分布する担子菌の一種であり、日本では夏から秋にかけてアカマツ、クロマツなどの林内地上に群生または単生し、広く食用にされてきたキノコである。
【００１８】
このハツタケから本発明の生理活性多糖類を得るには、ハツタケ（子実体や菌糸体）を、熱水、アルカリ溶液またはシュウ酸アンモニウム溶液により抽出し、この抽出物を精製すればよい。
【００１９】
より具体的には、熱水を用いる場合は、採取したハツタケを必要により乾燥した後、細断ないしは破砕し、更に必要によりこれを脱脂した後、１００ないし８０℃程度の熱水により、３ないし５時間程度抽出操作を行えばよい。
【００２０】
抽出の際の、原料ハツタケ（乾燥）に対する熱水の量は、ハツタケ１に対し、３０ないし６０重量部程度であり、好ましくは、４０ないし５０重量部である。
【００２１】
また、アルカリ溶液を用いる場合は、上記と同様に調製したハツタケ原料を、４％ないし２４％程度のアルカリ溶液中、室温で、１０ないし１５時間程度抽出すればよい。
【００２２】
このアルカリ溶液の調製に使用されるアルカリ物質としては、ＮａＯＨ、ＫＯＨ等を挙げることができ、抽出の際の、原料ハツタケ（乾燥）に対するアルカリ溶液の量は、ハツタケ１に対し、３０ないし６０重量部程度であり、好ましくは、４０ないし５０重量部である。
【００２３】
更に、シュウ酸アンモニウム溶液を用いる場合は、上記と同様に調製したハツタケ原料を、０．５％ないし１．０％程度のシュウ酸アンモニウム溶液中、７０ないし８０℃の温度で、３ないし５時間程度抽出すればよい。
【００２４】
抽出の際の、原料ハツタケ（乾燥）に対するシュウ酸アンモニウム溶液の量は、ハツタケ１に対し、３０ないし６０重量部程度であり、好ましくは、４０ないし５０重量部である。
【００２５】
このようにして得られたハツタケからの各抽出物は、そのまま生理活性多糖類として利用することもできるが、更にこれを公知の精製手段を用いて精製し、精製生理活性多糖類として用いることが好ましい。
【００２６】
また、本発明の生理活性多糖類は、アカハツ（Lactarius akahatsu Tanaka、Lactarius hatsudake Tanaka var.akahatsu Kawam、Lactarius deliciosus (L.) S.F. Gray、または f. virescens Imai）を原料として製造することもできる。アカハツもハツタケと同様に日本では夏から秋にかけてアカマツ、クロマツなどの林内地上に群生または単生し、広く食用にされてきたキノコである。アカハツから本発明の生理活性多糖類を製造するための条件等は、上記ハツタケの場合と同様である。
【００２７】
かくして得られる本発明の生理活性多糖類は、高速液体クロマトグラフィー、ペーパークロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー等による分析から、構成糖のモル比として、グルコースを０．５〜３.０、ガラクトースを０.７〜１.５、グルクロン酸を０.１〜１.０、６−ディオキシ−Ｄ−アルトロースを０.２〜１.５、マンノースを０.０５〜０.５で含有するものである。
【００２８】
ハツタケから得られる生理活性多糖類は、構成糖モル比としてグルコースを０．５〜３.０、ガラクトースを０.７〜１.５、グルクロン酸を０.１〜１.０、６−ディオキシ−Ｄ−アルトロースを０.２〜１.５、マンノースを０.０５〜０.５で含有するものであり、好ましくは、グルコースを１.５〜３.０、ガラクトースを０.７〜１.５、グルクロン酸を０.３〜１.０、６−ディオキシ−Ｄ−アルトロースを０.２〜１.０、マンノースを０.１〜０.５で含有するものであり、より好ましくはグルコースを１.８〜２．７、ガラクトースを０.８〜１．２、グルクロン酸を０.３〜１.０、６−ディオキシ−Ｄ−アルトロースを０.２〜１.０、マンノースを０.１〜０.３で含有するものである。
【００２９】
またアカハツから得られる生理活性多糖類は、構成糖モル比としてグルコースを０．５〜３．０、ガラクトースを０.７〜１.５、グルクロン酸を０.１〜１.０、６−ディオキシ−Ｄ−アルトロースを０.２〜１.５、マンノースを０.０５〜０.５で含有するものであり、好ましくはグルコースを０．５〜２．５、ガラクトースを０．７〜１．５、グルクロン酸を０.１〜１.０、６−ディオキシ−Ｄ−アルトロースを０.２〜１.５、マンノースを０.０５〜０.５で含有するものであり、より好ましくは、グルコースを１．０〜２．０、ガラクトースを０．８〜１．２、グルクロン酸を０.２〜０．８、６−ディオキシ−Ｄ−アルトロースを０.５〜１.３、マンノースを０.０６〜０.３で含有するものである。
【００３０】
なお、上記生理活性多糖類のうち６−ディオキシ−Ｄ−アルトロースは、自然界では未だに発見されていない新規の糖である。
【００３１】
以上説明した本発明の生理活性多糖類は、医薬品あるいは健康補助食品として利用可能である。
【００３２】
本発明の生理活性多糖類を医薬品あるいは健康補助食品として利用する場合は、これを、種々の担体、賦形剤、矯味剤、香料等の薬学的に許容される任意成分と組み合わせ、粉剤、錠剤、カプセル剤、液剤、ドリンク剤等の形態とすればよい。
【００３３】
この際の摂取量としては特に制約はないが、精製生理活性多糖類として、大人一人一日当たり５０ないし１００ｍｇ程度の量であり、これを１回または数回に分けて摂取すれば良い。
【実施例】
【００３４】
次に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例に何ら制約されるものではない。
【００３５】
実 施 例 １
ハツタケ多糖の取得（１）：
原料ハツタケ（Lactarius lividatus）は、沖縄県国頭郡国頭村与那の琉球大学農学部付属亜熱帯フィールド科学教育研究センター与那フィールドで収穫した子実体を使用した。この収穫したハツタケ子実体１０２１.７ｇを通風乾燥させることにより、乾燥ハツタケ１３２.１ｇ（１２.９％）が得られた。この乾燥ハツタケをミキサーで粉砕した後、エタノールを加え、６時間攪拌して脱色を行い、上澄みを取り除いた後に、さらにアセトンを加えて６時間攪拌して、脱脂したものを実験に供した。
【００３６】
この乾燥粉末１０ｇに蒸留水３００ｍｌを加え、９０℃の沸騰湯浴中で３時間攪拌後、吸引濾過を行った。濾液を１０,０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、上澄みを濃縮、透析後、４倍容量のエタノールを加えて沈殿させた。沈殿を再度蒸留水に溶解させ、凍結乾燥を行って粗多糖を得た。
【００３７】
得られた粗多糖を、蒸留水に溶解させ、６０℃の湯浴中、３％酢酸亜鉛水溶液を加えてタンパク質を沈殿させた。１０,０００ｒｐｍ、３０分間の遠心分離により、上清のみを回収した。得られた溶液を陽イオン交換樹脂（Amberlite IR-120）に通した後、室温で２４時間透析し、凍結乾燥を行なって精製多糖を得た。
【００３８】
上記工程での、脱脂、脱色した乾燥ハツタケ子実体１０ｇから熱水３００ｍｌにて抽出した粗多糖の収量は２１４.２ｍｇ（対乾燥子実体２.１４％）で、これを精製した精製多糖の収量は１００.３ｍｇ（対乾燥子実体１.０３％）であった。
【００３９】
実 施 例 ２
ハツタケ多糖の化学組成分析：
実施例１で得た粗多糖および精製多糖について、下記方法で全糖量、ウロン酸含量およびタンパク質含量を測定した。この結果も表１に示す。
【００４０】
（１）全糖量
全糖量はフェノール硫酸法により定量した。すなわち、試料を蒸留水に溶解させ、１ｍｇ／ｍｌ濃度に調製して供試した。試料０.５ｍｌを試験管にとり、５％フェノール溶液０.５ｍｌを加え、これに濃硫酸２.５ｍｌを速やかに液面に直接滴下するように加え、よく攪拌し、室温に１０分間放置した。液温が室温（２０〜３０℃）まで下がったのを確認した後、４９０ｎｍの波長で吸光度を測定することにより、全糖量を求めた。
【００４１】
（２）ウロン酸含量
ウロン酸含量はカルバゾール硫酸法により定量した。すなわち、試料を蒸留水に溶解させ、１ｍｇ／ｍｌに調製して供試した。あらかじめ氷冷しておいたホウ酸ナトリウム溶液２.５ｍｌに、調製した試料０.５ｍｌを静かに加え重層し、室温以上にならないように静かによく攪拌した。試験管の口にガラス玉を置き、沸騰湯浴中で１０分間加熱し、水冷して室温に戻した。次にカルバゾールエタノール溶液０.１ｍｌを加えてよく攪拌し、更に沸騰湯浴中で１５分間加熱して発色させた。水冷して室温にまで戻した後、５３０ｎｍの波長で吸光度を測定することにより、ウロン酸含量を求めた。
【００４２】
（３）タンパク質含量
タンパク質含量は、ＤＣ−プロテインアッセイキット（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用い、Ｌｏｗｒｙ法を改変した方法により定量した。すなわち、試料を蒸留水に溶解させ１ｍｇ／ｍｌ溶液に調製した。この溶液２００μｌに、ワーキング・リージェント（working regent）１００μｌを加えた後、リージェントＢ（Regent B）８００μｌを加えてよく攪拌し、室温で１５分間静置して７５０ｎｍの波長で吸光度を測定することにより、蛋白質含量を求めた。
【００４３】
【表１】
【００４４】
この結果から明らかなように、全糖量、ウロン酸含量およびタンパク質含量はそれぞれ、粗多糖で６１.７％、９.３％、２１.３％、精製多糖では７４.２％、１２.５％および０.５％であった。
【００４５】
実 施 例 ３
ハツタケ多糖の構成糖分析：
ハツタケの精製多糖について、その構成糖を、下記の(１)高速液体クロマトグラフィー
、(２)ペーパークロマトグラフィーおよび(３)ガスクロマトグラフィーにより分析した。
【００４６】
（１）高速液体クロマトグラフィー
試料５０ｍｇを蒸留水２０ｍｌに溶解させ、濃硫酸を加えて１.０Ｎ硫酸になるように調製して、沸騰湯浴中で１００℃、２時間加熱して加水分解を行った。加水分解液は炭酸バリウム（ＢａＣＯ３）で中和し、沈殿物を除去して高速液体クロマトグラフィー（日本ダイオネクス株式会社、ＤＸ−５００）を用いて構成糖を同定し、その面積比より構成糖比を算出した。
【００４７】
精製多糖の加水分分解物の高速液体クロマトグラムの結果から、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−グルコース、Ｄ−マンノースが検出され、その構成糖比はＤ−グルコース：Ｄ−ガラクトース：Ｄ−マンノース＝２.０７：１.００：０.１２と算出された（表２）。
【００４８】
（２）ペーパークロマトグラフィー
上記（１）での加水分解物を、アドバンテック トーヨー（ADVANTEC TOYO）Ｎｏ５０の濾紙を使用して、ペーパークロマトグラフィーを行った。展開溶媒にはブタノール：エタノール：水＝４：１：５を使用した。発色剤はアニリン−フタル酸を使用し、上昇法で展開を行った。
【００４９】
この結果、Ｄ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−マンノースのＲｆ値と一致するスポットが認められた。またフコース、ラムノースよりも高いＲｆ値にメチル化糖である６−ディオキシ−Ｄ−アルトロースと思われるスポットが認められた。
【００５０】
（３）ガスクロマトグラフィー
ハツタケ精製多糖５ｍｇを試料として蒸留水２ｍｌに溶解させ、これにトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を加え、多糖溶液の終濃度が２Ｍになるように試料溶液を調製した。この試料溶液を、乾熱器にて１００℃で、２時間加熱して加水分解し、窒素ガス雰囲気下、４０℃で濃縮乾固して加水分解物を得た。
【００５１】
加水分解物を、１Ｎ−ＮａＢＨ４溶液に溶解し、室温で１時間反応させ、酢酸を１滴加えて攪拌した後、窒素ガス雰囲気下、４０℃で乾固させアルジトールを得た。続いて酢酸エタノール溶液（酢酸：メタノール＝１：９）２ｍｌを加え、４０℃で濃縮乾固させる作業を３回繰り返した。続いて１００％メタノールを２ｍｌ加え、４０℃で濃縮乾固させる作業を４回繰り返した。最後に、無水酢酸溶液（無水酢酸：ピリジン＝１：１）０.５ｍｌを加え、１２１℃で、２０分反応させることによりアセチル化した。
【００５２】
このアセチル化物５ｍｇにトルエン１ｍｌを加え、４０℃で濃縮乾固し、クロロホルム溶液（クロロホルム：蒸留水＝１：１）を２ｍｌ加えた。溶解した後、クロロホルム層のみを回収し、４０℃で乾固させてアルジトールアセテートを得た。得られたアルジトールアセテート５ｍｇをアセトン０.５ｍｌに溶解させ、ガスクロマトグラフィー（ＳＨＩＭＡＺＵ、ＧＣ−１７Ａ）に供試した。カラムはｓｐ２３３０を使用し、１７０℃（２分間保持）より４℃／ｍｉｎで昇温、２３５℃（１５分間保持）の条件で解析を行った。
【００５３】
精製多糖のガスクロマトグラムの結果から、Ｄ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−マンノースおよび６−ディオキシ−Ｄ−アルトロースが検出され、その構成糖比はＤ−グルコース：Ｄ−ガラクトース：Ｄ−マンノース：６−ディオキシ−Ｄ−アルトロース＝１.８０：１.００：０.０７：０.３と算出された（表２）。
【００５４】
【表２】
【００５５】
実 施 例 ４
ハツタケ精製多糖の分子量測定：
試料を高速液体クロマトグラム（ＲＩＤ−６Ａ；ＳＨＩＭＡＤＺＵ）に付し、分子量を測定した。標準曲線は、ショーデックス スタンダード（Shodex STANDARD）Ｐ−８２（プルラン：Ｐ−４００、Ｐ−１００、Ｐ−２０、Ｐ−５：昭和電工株式会社）を用いて作成した。また、分析条件は以下の通りである。
【００５６】
分析カラム： ＴＳＫｇｅｌＧ４０００ＰＷＸＬ
緩 衝 液： ０.０５Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７.２）＋０.１５Ｍ
食塩
流 速 ： ０.３ｍｌ／ｍｉｎ
【００５７】
この結果、ハツタケ精製多糖の分子量は、約２４０,０００と算出された。
【００５８】
実 施 例 ５
ハツタケ精製多糖の赤外吸収スペクトル測定：
ハツタケ精製多糖の赤外吸収スペクトルは、フーリエ変換赤外分光光度計バイオ−ラッド メリーン（Bio-Rad Merlin）を用い、ＫＢｒ法で測定した。この結果を図１に示した。ＯＨおよびＣＨ基に由来する吸収が３４００および２９００ｃｍ−１に認められた。また、ウロン酸に由来する吸収が１６２０ｃｍ−１に認められた。
【００５９】
実 施 例 ６
ハツタケ精製多糖の旋光度測定：
ハツタケ精製多糖の旋光度は、試料を蒸留水に溶解させて０.２（ｗ／ｖ）％溶液を作成し、自動旋光度計ＤＩＰ−１８０（日本分光）を用い、５８９ｎｍで測定した。旋光度の測定は６０℃から徐々に温度を低下させながら行った。この結果を表３に示すが、旋光度は６０℃で−０.０５５°を有しており、温度の低下に伴って徐々に減少し、１０℃では−０.０３５°を有していた。
【００６０】
【表３】
【００６１】
実 施 例 ７
ハツタケ精製多糖のＮＭＲ分析：
ハツタケ精製多糖の１３Ｃおよび１Ｈ−ＮＭＲスペクトルは、ＦＴ−ＮＭＲスペクトロメーター（ＪＮＭ―α５００、ＪＥＯＬ）を用いてそれぞれ１２５ＭＨｚ、５００ＭＨｚで測定した。ハツタケ精製多糖を試料として重水に溶解させ、１.０％溶液を作成し、６０℃で測定した。内部標準としては、３−（トリメチルシリル）プロピオニック−２,２,３,３,−ｄ４アシッド ソルト（ＴＳＰ、０.００ｐｐｍ）を用い、結果は化学シフト（ｐｐｍ）で表示した。
【００６２】
（１）１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル
精製多糖の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを図２に示した。２０.３２２ｐｐｍのシグナルは、ディオキシ−アルトロースのメチル基に由来するものである。６３.４８６〜７９.９０５ｐｐｍは環状炭素によるものであるが、重複が激しいために詳しい解析は困難であった。１００.８０８〜１０２.９３１ｐｐｍの範囲に確認されたシグナルはアノメリック炭素によるものと思われるが、重複が激しいため、どの構成糖に起因するものか判断ができる情報は得られなかった。また、１８７.９９２ｐｐｍのピークはウロン酸由来のシグナルであることが分かった。
【００６３】
（２）１Ｈ−ＮＭＲスペクトル
精製多糖の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図３に示した。メチル基のプロトンによるシグナルが１.３２８ｐｐｍで観測された。また、５.３７７ｐｐｍ、５.１１５ｐｐｍ、５.０１９ｐｐｍの３つのシグナルが観測された。これらはアノメリックプロトンのピークである。１３Ｃ−ＮＭＲの結果に加えて、ここでも重複するシグナルが多いため、構造解析の手段として決定的な情報を得られず解析は困難であった。
【００６４】
実 施 例 ８
ハツタケ精製多糖のメチル化分析：
箱守法を改変した方法を用いて、精製多糖のメチル化を行った。すなわち、窒素ガス雰囲気下、ハツタケ精製多糖２ｍｇに、ジメチルスルホキシド５００μｌを加え、３時間攪拌して溶解させた。次いで、窒素ガス充填バッグ内で、粉末水酸化ナトリウム２５ｍｇを加え、２時間攪拌した後、氷冷しながらヨウ化メチル２５０μｌを加えて更に１時間攪拌して反応させた。さらに蒸留水５００μｌを加え、白濁した溶液が透明になるまで窒素ガスによるバブリングを行った。
【００６５】
固層抽出カートリッジ（Ｓｅｐ−Ｐａｋ ｐｌｕｓＣ１８ ｃａｒｔｒｉｄｅｓ；ウォータ社製）をメタノール５ｍｌで４回、アセトニトリル２ｍｌで２回、蒸留水５ｍｌで２回洗浄し、糖液を注入してメチル化糖をカートリッジ内に吸着させた。その後、蒸留水４ｍｌを２回注入した後、アセトニトリル溶液（アセトニトリル：水＝１：４）で非吸着画分を排除した後、１００％アセトニトリル１ｍｌを２回通してメチル化糖を溶出させ、窒素ガスで濃縮乾固してメチル化糖を得た。得られたメチル化糖を２Ｍ−トリフルオロ酢酸溶液（ＴＦＡ）を用い、１２１℃で、１時間で加水分解し、窒素ガス雰囲気下、４０℃で乾固させて加水分解物を得た。これにメタノール溶液（メタノール：水＝１：１）２２０μｌ、ＮａＢＤ４溶液２００μｌを加え、室温で１時間反応させ、酢酸５０μｌを加えてよく攪拌した。
【００６６】
更に、酢酸メタノール溶液（酢酸：メタノール＝１：９）２００μｌを加えて攪拌、窒素ガス雰囲気下で乾固する作業を２回、１００％エタノール２００μｌを加えて窒素乾固する作業を４回繰り返した。続いて無水酢酸５０μｌを加え乾熱機で１２１℃、３時間反応させた後、蒸留水５００μｌを加え、炭酸ナトリウムで中和し、クロロホルム５００μｌを加え、攪拌、遠心分離し、下層のクロロホルム層のみを回収した。
【００６７】
得られたクロロホルム層を窒素ガスで乾固させ、これを完全メチル化アルジトールアセテートとし、アセトン５００μｌに溶解させてＧＣ／ＭＳ（ＳＨＩＭＡＤＺＵ、ＱＰ２０１０、ＧＣ２０１０）に供試した。カラムはｓｐ２３３０を使用し、１７０℃（２分間保持）より４℃／ｍｉｎで昇温、２３５℃（１５分間保持）の条件で解析を行った。
【００６８】
メチル化分析によるＧＣ／ＭＳスペクトルの結果を図４に示した。メチル化分析により得られたＧＣ／ＭＳのマススペクトルの解析から、２，３，４−トリ−Ｏ−メチル−Ｄ−グルクロン酸、２，３，４−トリ−Ｏ−メチル−Ｄ−６−ディオキシ−Ｄ−アルトロース、２，３，６−トリ−Ｏ−メチル−Ｄ−グルコース、２，４−ジ−Ｏ−メチル−Ｄ−ガラクトース、２，３−ジ−Ｏ−メチル−Ｄ−ガラクトースの５つの主要なマススペクトルが得られ、それぞれ１：１：３：１：１で構成される糖鎖構造を有することが分かった。
【００６９】
実 施 例 ９
アルカリ溶液を用いたハツタケ多糖の取得（２）：
４％ＫＯＨに実施例１で得たハツタケ乾燥粉末１０ｇを分散させ室温で１２時間攪拌した溶液を濾過し、得られた濾過液を０．１Ｍ ＨＣｌで中和し濃縮した後、透析し２倍量のエタノールで沈殿させて多糖を得た。このようにして得た多糖を常法により加水分解し構成多糖を分析した結果、その構成糖比は、Ｄ−グルコース：Ｄ−ガラクトース：Ｄ−マンノース：６−ディオキシ−Ｄ−アルトロース：Ｄ−グルクロン酸＝２．７：１．０：０．０５：０．７：０．２であった。
【００７０】
実 施 例 １０
ハツタケ多糖の取得（３）：
０．５％ショウ酸アンモニウムに実施例１で得たハツタケ乾燥粉末１０ｇを分散させ８０℃で３時間攪拌した溶液を濾過した後、得られた濾過液に２倍量のエタノールで沈殿させて多糖を得た。このようにして得た多糖を常法により加水分解し構成多糖を分析した結果、その構成糖比は、Ｄ−グルコース：Ｄ−ガラクトース：Ｄ−マンノース：６−ディオキシ−Ｄ−アルトロース：Ｄ−グルクロン酸＝２．３：１．０：０．０８：０．８：０．３であった。
【００７１】
実 施 例 １１
細胞障害活性試験：
実施例２で得たハツタケ精製多糖の細胞障害活性を、ヒト骨髄性白血病細胞株（Ｕ−９３７；ヒューマンサイエンス研究資源バンクより入手）を用いて調べた。
【００７２】
まず、上記細胞を、１０％非動化済み牛胎児血清（fetal bovine serum；ＦＢＳ）、ペニシリン１００ＩＵ／ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌを添加したＲＰＭＩ１６４０培地（またはＲＰＭＩ１６４０−ＭＥＭ混合培地）にそれぞれ分散させ、３７℃、５％ＣＯ２−空気気相下で培養した。継代は５日毎に細胞がコンフルエントになる前に行った。
【００７３】
細胞障害活性は、セル・カウンティングキット−８を用いた細胞数測定法で行った。すなわち、９６ウェルマイクロプレートに、１.０×１０５細胞／ｍｌになるように上記白血病細胞を播き、２４時間の前培養を行った。その後、所定の濃度になるように精製多糖を添加し、７２時間後にＣＣＫ−８溶液を各ウェルに１０μｌ添加し、更に４時間、３７℃、５％ＣＯ２−空気気相下でインキュベートを行った。その後、マイクロプレートリーダー（Model650；Bio-RadLaboratories）で吸光度（測定波長４５０ｎｍ、参照波長６２０ｎｍ）を測定した。細胞障害活性性は対照群の吸密度に対する、サンプル添加による吸密度を比較することで評価した。この結果を図５に示す。
【００７４】
この結果、ハツタケ精製多糖は、Ｕ９３７細胞に対し、１ｍｇ／ｍｌ濃度において約７０％の細胞障害活性を示した。またその細胞障害活性は、Ｕ９３７細胞に対し、濃度依存的であった。
【００７５】
実 施 例 １２
免疫賦活活性試験：
実施例２で得たハツタケ精製多糖の免疫賦活活性を、マウス腹腔マクロファージ細胞株（ＲＡＷ２６４.７細胞）を用い、酸化窒素（ＮＯ）産生を指標として評価した。
【００７６】
まず、マウス腹腔マクロファージ細胞株を、１０％牛胎児血清、１００ＵＩ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＤＥＭＥ培地に分散し、３７℃、５％ＣＯ２−空気の条件で培養した。継代は５日毎に行った。
【００７７】
上記のようにして培養したマウス腹腔マクロファージ細胞株を、５.０×１０５cell／ｍｌとなるように調製し、４８ウエルプレート中で培養した。２４時間培養後、ハツタケ精製多糖を所定量加え、更に２４時間培養した。
【００７８】
培養後、培養上澄を回収し、その中に含まれているＮＯ量をグリエス（Griess）法で測定した。この結果を図６に示す。ハツタケ精製多糖濃度の増大と共にＮＯ生産量が増大し、マクロファージ活性が促進されたこと、すなわち免疫賦活活性が向上したことが示された。
【００７９】
実 施 例 １３
６−ディオキシ−Ｄ−アルトロースの製造
ハツタケ菌糸体または子実体を酸に分散させ抽出液を濾過後アルカリで中和を行い、透析あるいは電気透析処理したもの（液体）、あるいは連続遠心機で不溶物を除去した溶液をアルコールまたはスプレードライしたエキス（粉体）を塩酸、硫酸、またはシュウ酸等の酸溶液に溶解後、加熱により加水分解を行い、アルカリで中和後充填剤としてシリカゲル、活性炭または両者を混合したカラムクロマトグラフィー等で６−ディオキシ−Ｄ−アルトロースを分離、濃縮およびアルコール等で結晶化させる。６−ディオキシ−Ｄ−アルトロースの比旋光度［α］は、＋１４．２〜＋１７．５°であった。
【００８０】
実 施 例 １４
アカハツ多糖の取得：
原料アカハツ（Lactarius akahatsu）は沖縄県国頭郡国頭村与那の琉球大学農学部附属亜熱帯フィールド教育研究センター与那フィールドで収穫した子実体を使用した。収穫した子実体９００ｇを４０℃で２４時間通風乾燥させることにより、乾燥アカハツ９５ｇが得られた。乾燥アカハツを粉砕器で粉砕後、エタノールで脱色し、次いでアセトンで脱脂を行ったものを使用した。
【００８１】
粉末１０ｇに蒸留水３００ｍｌを加え、１００℃で３時間攪拌後吸引濾過を行った。濾液を遠心分離後、上清を濃縮、エタノールで沈澱させ、粗多糖を得た。
【００８２】
得られた粗多糖を蒸留水に溶解させ、６０℃に加熱して３％酢酸鉛初溶液を滴下してタンパク質を沈澱させた。遠心分離により上清みを回収した。得られた溶液を陽イオン交換樹脂（Amberlite IR-120）を通した後、水酸化ナトリウムで中和後透析を行い（室温、２４時間）、濃縮後、凍結乾燥して精製多糖を得た。１０ｇの子実体から２３０．３ｍｇの粗多糖を得、１０３．５ｍｇの精製多糖を得た。
【００８３】
実 施 例 １５
アカハツ多糖の化学組成分析：
実施例１４で得た粗多糖および精製多糖について、下記方法で全糖量、ウロン酸含量およびタンパク質含量を測定した。この結果を表４に示す。
【００８４】
（１）全糖量
全糖量はフェノール硫酸法により定量した。すなわち、試料を蒸留水に溶解させ、１ｍｇ／ｍｌ濃度に調製して供試した。試料０.５ｍｌを試験管にとり、５％フェノール溶液０.５ｍｌを加え、これに濃硫酸２.５ｍｌを速やかに液面に直接滴下するように加え、よく攪拌し、室温に１０分間放置した。液温が室温（２０〜３０℃）まで下がったのを確認した後、４９０ｎｍの波長で吸光度を測定することにより、全糖量を求めた。
【００８５】
（２）ウロン酸含量
ウロン酸含量はカルバゾール硫酸法により定量した。すなわち、試料を蒸留水に溶解させ、１ｍｇ／ｍｌに調製して供試した。あらかじめ氷冷しておいたホウ酸ナトリウム溶液２.５ｍｌに、調製した試料０.５ｍｌを静かに加え重層し、室温以上にならないように静かによく攪拌した。試験管の口にガラス玉を置き、沸騰湯浴中で１０分間加熱し、水冷して室温に戻した。次にカルバゾールエタノール溶液０.１ｍｌを加えてよく攪拌し、更に沸騰湯浴中で１５分間加熱して発色させた。水冷して室温にまで戻した後、５３０ｎｍの波長で吸光度を測定することにより、ウロン酸含量を求めた。
【００８６】
（３）タンパク質含量
タンパク質含量は、ＤＣ−プロテインアッセイキット（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用い、Ｌｏｗｒｙ法を改変した方法により定量した。すなわち、試料を蒸留水に溶解させ１ｍｇ／ｍｌ溶液に調製した。この溶液２００μｌに、ワーキング・リージェント（working regent）１００μｌを加えた後、リージェントＢ（Regent B）８００μｌを加えてよく攪拌し、室温で１５分間静置して７５０ｎｍの波長で吸光度を測定することにより、蛋白質含量を求めた。
【００８７】
【表４】
【００８８】
実 施 例 １６
アカハツ多糖の構成糖分析
アカハツの精製多糖について、その構成糖を、下記の(１)高速液体クロマトグラフィー
、(２)ペーパークロマトグラフィーおよび(３)ガスクロマトグラフィーにより分析した。
【００８９】
（１）高速液体クロマトグラフィー
試料５０ｍｇを蒸留水２０ｍｌに溶解させ、濃硫酸を加えて１.０Ｎ硫酸になるように調製して、沸騰湯浴中で１００℃、２時間加熱して加水分解を行った。加水分解液は炭酸バリウム（ＢａＣＯ３）で中和し、沈殿物を除去して高速液体クロマトグラフィー（日本ダイオネクス株式会社、ＤＸ−５００）を用いて構成糖を同定し、その面積比より構成糖比を算出した。
【００９０】
精製多糖の加水分分解物の高速液体クロマトグラムの結果から、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−グルコース、Ｄ−マンノースが検出され、その構成糖比はＤ−グルコース：Ｄ−ガラクトース：Ｄ−マンノース＝１．３：２．０：０．２と算出された。
【００９１】
（２）ペーパークロマトグラフィー
上記（１）での加水分解物を、アドバンテック トーヨー（ADVANTEC TOYO）Ｎｏ５０の濾紙を使用して、ペーパークロマトグラフィーを行った。展開溶媒にはブタノール：エタノール：水＝４：１：５を使用した。発色剤はアニリン−フタル酸を使用し、上昇法で展開を行った。結果を図９に示す。
【００９２】
図９から、６―ディオキシ−Ｄ−アルトロース、Ｄ−グルコース、Ｄ―ガラクトースを同定した。
【００９３】
（３）ガスクロマトグラフィー
アカハツ精製多糖５ｍｇを試料として蒸留水２ｍｌに溶解させ、これにトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を加え、多糖溶液の終濃度が２Ｍになるように試料溶液を調製した。この試料溶液を、乾熱器にて１００℃で、２時間加熱して加水分解し、窒素ガス雰囲気下、４０℃で濃縮乾固して加水分解物を得た。
【００９４】
加水分解物を、１Ｎ−ＮａＢＨ４溶液に溶解し、室温で１時間反応させ、酢酸を１滴加えて攪拌した後、窒素ガス雰囲気下、４０℃で乾固させアルジトールを得た。続いて酢酸エタノール溶液（酢酸：メタノール＝１：９）２ｍｌを加え、４０℃で濃縮乾固させる作業を３回繰り返した。続いて１００％メタノールを２ｍｌ加え、４０℃で濃縮乾固させる作業を４回繰り返した。最後に、無水酢酸溶液（無水酢酸：ピリジン＝１：１）０.５ｍｌを加え、１２１℃で、２０分反応させることによりアセチル化した。
【００９５】
このアセチル化物５ｍｇにトルエン１ｍｌを加え、４０℃で濃縮乾固し、クロロホルム溶液（クロロホルム：蒸留水＝１：１）を２ｍｌ加えた。溶解した後、クロロホルム層のみを回収し、４０℃で乾固させてアルジトールアセテートを得た。得られたアルジトールアセテート５ｍｇをアセトン０.５ｍｌに溶解させ、ガスクロマトグラフィー（ＳＨＩＭＡＺＵ、ＧＣ−１７Ａ）に供試した。カラムはｓｐ２３３０を使用し、１７０℃（２分間保持）より４℃／ｍｉｎで昇温、２３５℃（１５分間保持）の条件で解析を行った。
【００９６】
精製多糖のガスクロマトグラムの結果から、Ｄ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−マンノースおよび６−ディオキシ−Ｄ−アルトロースが検出され、その構成糖比はＤ−グルコース：Ｄ−ガラクトース：Ｄ−マンノース：６−ディオキシ−Ｄ−アルトロース＝１．６：１．０：０．０８：１．０と算出された。
【００９７】
実 施 例 １７
アカハツ精製多糖のメチル化分析：
箱守法を改変した方法を用いて、精製多糖のメチル化を行った。すなわち、窒素ガス雰囲気下、アカハツ精製多糖２ｍｇに、ジメチルスルホキシド５００μｌを加え、３時間攪拌して溶解させた。次いで、窒素ガス充填バッグ内で、粉末水酸化ナトリウム２５ｍｇを加え、２時間攪拌した後、氷冷しながらヨウ化メチル２５０μｌを加えて更に１時間攪拌して反応させた。さらに蒸留水５００μｌを加え、白濁した溶液が透明になるまで窒素ガスによるバブリングを行った。
【００９８】
固層抽出カートリッジ（Ｓｅｐ−Ｐａｋ ｐｌｕｓＣ１８ ｃａｒｔｒｉｄｅｓ；ウォータ社製）をメタノール５ｍｌで４回、アセトニトリル２ｍｌで２回、蒸留水５ｍｌで２回洗浄し、糖液を注入してメチル化糖をカートリッジ内に吸着させた。その後、蒸留水４ｍｌを２回注入した後、アセトニトリル溶液（アセトニトリル：水＝１：４）で非吸着画分を排除した後、１００％アセトニトリル１ｍｌを２回通してメチル化糖を溶出させ、窒素ガスで濃縮乾固してメチル化糖を得た。得られたメチル化糖を２Ｍ−トリフルオロ酢酸溶液（ＴＦＡ）を用い、１２１℃で、１時間で加水分解し、窒素ガス雰囲気下、４０℃で乾固させて加水分解物を得た。これにメタノール溶液（メタノール：水＝１：１）２２０μｌ、ＮａＢＤ４溶液２００μｌを加え、室温で１時間反応させ、酢酸５０μｌを加えてよく攪拌した。
【００９９】
更に、酢酸メタノール溶液（酢酸：メタノール＝１：９）２００μｌを加えて攪拌、窒素ガス雰囲気下で乾固する作業を２回、１００％エタノール２００μｌを加えて窒素乾固する作業を４回繰り返した。続いて無水酢酸５０μｌを加え乾熱機で１２１℃、３時間反応させた後、蒸留水５００μｌを加え、炭酸ナトリウムで中和し、クロロホルム５００μｌを加え、攪拌、遠心分離し、下層のクロロホルム層のみを回収した。
【０１００】
得られたクロロホルム層を窒素ガスで乾固させ、これを完全メチル化アルジトールアセテートとし、アセトン５００μｌに溶解させてＧＣ／ＭＳ（ＳＨＩＭＡＤＺＵ、ＱＰ２０１０、ＧＣ２０１０）に供試した。カラムはｓｐ２３３０を使用し、１７０℃（２分間保持）より４℃／ｍｉｎで昇温、２３５℃（１５分間保持）の条件で解析を行った。
【０１０１】
メチル化分析により得られたＧＣ／ＭＳのマススペクトルの解析から、１，５−Ｏ−アセチル−２，３，４−トリ−Ｏ−メチル−Ｄ−グルクロン酸、１，５−Ｏ−アセチル−６―ディオキシ−２，３，４−トリ−Ｏ−メチル−Ｄ−アルトロース、１，４，５−Ｏ−アセチル−２，３，６−ト−Ｏ−メチル−Ｄ−グルコース、１，３，５，６−アセチル−２，４−ジ−Ｏメチル−Ｄ−ガラクトース及び１，４，５，６−Ｏアセチル−２，３−ジ−Ｏ−メチル−Ｄ−ガラクトースの５つの主要なマススペクトルが得られ、それぞれのモル比は１：１：３：１：１であった。
【０１０２】
実 施 例 １８
細胞障害活性試験：
実施例１４で得たアカハツ精製多糖の細胞障害活性を、ヒト骨髄性白血病細胞株（Ｕ−９３７；ヒューマンサイエンス研究資源バンクより入手）を用いて調べた。
【０１０３】
まず、上記細胞を、１０％非動化済み牛胎児血清（fetal bovine serum；ＦＢＳ）、ペニシリン１００ＩＵ／ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌを添加したＲＰＭＩ１６４０培地（またはＲＰＭＩ１６４０−ＭＥＭ混合培地）にそれぞれ分散させ、３７℃、５％ＣＯ２−空気気相下で培養した。継代は５日毎に細胞がコンフルエントになる前に行った。
【０１０４】
細胞障害活性は、セル・カウンティングキット−８を用いた細胞数測定法で行った。すなわち、９６ウェルマイクロプレートに、１.０×１０５細胞／ｍｌになるように上記白血病細胞を播き、２４時間の前培養を行った。その後、所定の濃度になるように精製多糖を添加し、７２時間後にＣＣＫ−８溶液を各ウェルに１０μｌ添加し、更に４時間、３７℃、５％ＣＯ２−空気気相下でインキュベートを行った。その後、マイクロプレートリーダー（Model650；Bio-RadLaboratories）で吸光度（測定波長４５０ｎｍ、参照波長６２０ｎｍ）を測定した。細胞障害活性性は対照群の吸密度に対する、サンプル添加による吸密度を比較することで評価した。この結果を図１０に示す。
【０１０５】
この結果、ハツタケ精製多糖は、Ｕ９３７細胞に対し、１ｍｇ／ｍｌ濃度において約７０％の細胞障害活性を示した。またその細胞障害活性は、Ｕ９３７細胞に対し、濃度依存的であった。
【０１０６】
実 施 例 １９
免疫賦活活性試験：
実施例１４で得たアカハツ精製多糖の免疫賦活活性を、マウス腹腔マクロファージ細胞株（ＲＡＷ２６４.７細胞）を用い、酸化窒素（ＮＯ）産生を指標として評価した。
【０１０７】
まず、マウス腹腔マクロファージ細胞株を、１０％牛胎児血清、１００ＵＩ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＤＥＭＥ培地に分散し、３７℃、５％ＣＯ２−空気の条件で培養した。継代は５日毎に行った。
【０１０８】
上記のようにして培養したマウス腹腔マクロファージ細胞株を、５.０×１０５cell／ｍｌとなるように調製し、４８ウエルプレート中で培養した。２４時間培養後、ハツタケ精製多糖を所定量加え、更に２４時間培養した。
【０１０９】
培養後、培養上澄を回収し、その中に含まれているＮＯ量をグリエス（Griess）法で測定した。この結果を図１１に示す。アカハツ精製多糖濃度の増大と共にＮＯ生産量が増大し、マクロファージ活性が促進されたこと、すなわち免疫賦活活性が向上したことが示された。
【０１１０】
実 施 例 ２０
アカハツからの６−ディオキシ−Ｄ−アルトロースの製造
アカハツ菌糸体または子実体を酸に分散させ抽出液を濾過後アルカリで中和を行い、透析あるいは電気透析処理したもの（液体）、あるいは連続遠心機で不溶物を除去した溶液をアルコールまたはスプレードライしたエキス（粉体）を塩酸、硫酸、またはシュウ酸等の酸溶液に溶解後、加熱により加水分解を行い、アルカリで中和後充填剤としてシリカゲル、活性炭または両者を混合したカラムクロマトグラフィー等で６−ディオキシ−Ｄ−アルトロースを分離、濃縮およびアルコール等で結晶化させる。６−ディオキシ−Ｄ−アルトロースの比旋光度［α］は、＋１４．２〜＋１７．５°であった。
【産業上の利用可能性】
【０１１１】
本発明では、タンパク質を含んだ粗多糖およびタンパク質を取り除いた精製多糖について細胞障害活性の検討を行ったが、精製多糖に白血病細胞（Ｕ９３７細胞）に対する細胞障害活性が認められた。
【０１１２】
従って、本発明のハツタケまたはアカハツからの多糖類は、その生理活性を医薬品あるいは健康補助食品として利用することが可能である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
構成糖のモル比として、グルコースを０．５〜３.０、ガラクトースを０.７〜１．５、グルクロン酸を０.１〜１.０、６−ディオキシ−Ｄ−アルトロースを０.２〜１.５、マンノースを０.０５〜０.５で含有することを特徴とする新規生理活性多糖類。
【請求項２】
構成糖のモル比として、グルコースを１.５〜３.０、ガラクトースを０.７〜１.５、グルクロン酸を０.３〜１.０、６−ディオキシ−Ｄ−アルトロースを０.２〜１.０、マンノースを０.１〜０.５で含有することを特徴とする請求項１記載の新規生理活性多糖類。
【請求項３】
請求項第２項記載の新規生理活性多糖類を含有する医薬品。
【請求項４】
請求項第２項記載の新規生理活性多糖類を含有する健康食品。
【請求項５】
ハツタケ子実体および／または菌糸体を熱水、アルカリ溶液、またはシュウ酸アンモニウム溶液で抽出することを特徴とする請求項第２項記載の新規生理活性多糖類の製造方法。
【請求項６】
ハツタケまたはアカハツ粉体を熱水、ショウ酸、ショウ酸アンモニウム、炭酸カルシウム、アルカリで抽出し、塩酸、硫酸またはショウ酸を加えて加水分解を行いアルカリで中和後、分離、濃縮およびアルコールで結晶化させることを特徴とする６−ディオキシ−Ｄ−アルトロースの製造方法。
【請求項７】
構成糖のモル比として、グルコースを０．５〜２．５、ガラクトースを０．７〜１．５、グルクロン酸を０.１〜１.０、６−ディオキシ−Ｄ−アルトロースを０.２〜１.５、マンノースを０.０５〜０．５で含有することを特徴とする請求項１記載の新規生理活性多糖類。
【請求項８】
請求項第７項記載の新規生理活性多糖類を含有する医薬品。
【請求項９】
請求項第７項記載の新規生理活性多糖類を含有する健康食品。
【請求項１０】
アカハツ子実体および／または菌糸体を熱水、アルカリ溶液、またはシュウ酸アンモニウム溶液で抽出することを特徴とする請求項第７項記載の新規生理活性多糖類の製造方法。
【請求項１】
構成糖のモル比として、グルコースを０．５〜３.０、ガラクトースを０.７〜１．５、グルクロン酸を０.１〜１.０、６−ディオキシ−Ｄ−アルトロースを０.２〜１.５、マンノースを０.０５〜０.５で含有することを特徴とする新規生理活性多糖類。
【請求項２】
構成糖のモル比として、グルコースを１.５〜３.０、ガラクトースを０.７〜１.５、グルクロン酸を０.３〜１.０、６−ディオキシ−Ｄ−アルトロースを０.２〜１.０、マンノースを０.１〜０.５で含有することを特徴とする請求項１記載の新規生理活性多糖類。
【請求項３】
請求項第２項記載の新規生理活性多糖類を含有する医薬品。
【請求項４】
請求項第２項記載の新規生理活性多糖類を含有する健康食品。
【請求項５】
ハツタケ子実体および／または菌糸体を熱水、アルカリ溶液、またはシュウ酸アンモニウム溶液で抽出することを特徴とする請求項第２項記載の新規生理活性多糖類の製造方法。
【請求項６】
ハツタケまたはアカハツ粉体を熱水、ショウ酸、ショウ酸アンモニウム、炭酸カルシウム、アルカリで抽出し、塩酸、硫酸またはショウ酸を加えて加水分解を行いアルカリで中和後、分離、濃縮およびアルコールで結晶化させることを特徴とする６−ディオキシ−Ｄ−アルトロースの製造方法。
【請求項７】
構成糖のモル比として、グルコースを０．５〜２．５、ガラクトースを０．７〜１．５、グルクロン酸を０.１〜１.０、６−ディオキシ−Ｄ−アルトロースを０.２〜１.５、マンノースを０.０５〜０．５で含有することを特徴とする請求項１記載の新規生理活性多糖類。
【請求項８】
請求項第７項記載の新規生理活性多糖類を含有する医薬品。
【請求項９】
請求項第７項記載の新規生理活性多糖類を含有する健康食品。
【請求項１０】
アカハツ子実体および／または菌糸体を熱水、アルカリ溶液、またはシュウ酸アンモニウム溶液で抽出することを特徴とする請求項第７項記載の新規生理活性多糖類の製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公開番号】特開２０１０−１８６０７（Ｐ２０１０−１８６０７Ａ）
【公開日】平成２２年１月２８日（２０１０．１．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１３９０８０（Ｐ２００９−１３９０８０）
【出願日】平成２１年６月１０日（２００９．６．１０）
【出願人】（５０４１４５３０８）国立大学法人 琉球大学 (100)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１月２８日（２０１０．１．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年６月１０日（２００９．６．１０）
【出願人】（５０４１４５３０８）国立大学法人 琉球大学 (100)
【Ｆターム（参考）】
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