癌の検出および処置
本発明は、メラノーマおよび皮膚癌の検出および処置のための方法および組成物に関する。更に詳しくは、本発明は、メラノーマおよび皮膚癌細胞においてＢＣＳＣ−１発現が変化しており、これがこのような状態のための有効な検出方法およびキットのデザインを可能とする、ということを開示する。本発明は、メラノーマおよび皮膚癌細胞におけるＢＣＳＣ−１の回復または増加する発現は、腫瘍形成性を抑制しそしてメラノーマおよび皮膚癌の処置のための新規で有効なアプローチを表すことも示す。本発明は、メラノーマおよび皮膚癌の存在、段階またはタイプを検出するためならびにそれらへのいかなる素因も検出するために使用されうる。本発明は、任意の哺乳動物被検体、特にヒト被検体において使用されうる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メラノーマおよび皮膚癌の検出および処置のための方法および組成物に関する。更に詳しくは、本発明は、メラノーマおよび皮膚癌細胞においてＢＣＳＣ−１発現が変化しており、これがこのような状態（conditions）のための検出方法およびキットのデザインを可能とする、ということを開示する。本発明は、メラノーマおよび皮膚癌細胞におけるＢＣＳＣ−１の回復または増加する発現は、腫瘍形成性（tumorigenicity）を抑制しそしてメラノーマおよび皮膚癌の処置のための新規なかつ有効なアプローチを表すことも示す。本発明は、メラノーマおよび皮膚癌の存在、段階またはタイプを検出するたためならびにそれらへのいかなる素因も検出するために使用されうる。本発明は、任意の哺乳動物被検体、特にヒト被検体において使用されうる。
【０００２】
メラノーマは、広範囲に及ぶ転移疾患を引き起こす傾向を有する進行性癌である。診断は早期の段階で必須である。何故ならば、今日まで唯一の成功する処置は、まだ皮膚に制限されているときに腫瘍を切除することであるからである。都合の悪いことに、メラノーマは、慣用の化学療法に対して大いに抵抗性であり、そして転移メラノーマに対する新規な処置が緊急に必要とされる。
【０００３】
着色した皮膚病変（pigmented skin lesions）およびメラノーマの遺伝子発現プロファイリングを研究するために、良性の母斑および転移メラノーマの選択的スプライシングの全体的解析を、ＤＡＴＡＳ技術を使用して研究した。良性母斑と転移メラノーマ間の２１７のディファレンシャルに発現されたクローンを含む良性母斑〜転移メラノーマのためのＤＡＴＡＳライブラリーをこの方法により発生させた。アポトーシス、細胞サイクル、代謝等におけるそれらの関与に基づいてメラノーマ進行に関与することができるいくつかのクローンがリアルタイムＰＣＲによりスクリーニングされた。これらの遺伝子の中でも、本発明者等は、ＢＣＳＣ−１（Martin et al. PNAS 2003）が転移メラノーマを有する患者において一貫してダウンレギュレーシヨンされることを確認した。
【０００４】
本発明者等は、更に良性母斑、異形母斑（atypical nevus）、原発性メラノーマ（primary melanoma）または転移メラノーマを有する患者からの７０の皮膚生検のコホートにおいてリアルタイムＰＣＲによりＢＣＳＣ−１の発現を調査した。結果は、ＢＣＳＣ−１発現が健康なドナーと比較してすべてのメラノーマ患者において減少することを示した。これらの結果は、解析されたメラノーマ細胞系およびすべてのメラノーマ患者において確かめられた。
【０００５】
重要なことに、ＢＣＳＣ−１遺伝子がメラノーマ細胞系において異所性に（ectopically）発現されたとき、メラノーマ細胞は、増殖を停止しそしてアポトーシスを受けた。これらの細胞におけるＢＣＳＣタンパク質の発現はウエスタンブロットにより確かめられた。
【０００６】
更に、本発明者等は、インビボ（in vivo）注入されると、ＢＣＳＣ−１は転移メラノーマのマウスモデルにおける肺転移の数を減少させることも示した。
【０００７】
結論として、本発明は、ＢＣＳＣ−１が皮膚癌においてダウンレギュレーションされることおよび該癌細胞におけるＢＣＳＣ−１発現の誘導が腫瘍進行の阻害をもたらすことを示す。これらのデータは、ＢＣＳＣ−１がメラノーマおよび皮膚癌の病原において極めて重大な役割を演じそして新規な予後マーカーおよびメラノーマおよび皮膚癌のための薬物開発のための価値あるターゲットを表すことを示す。
【０００８】
本発明の第１の目的は、被検体におけるメラノーマまたは皮膚癌の存在、段階またはタイプを検出するための方法であって、被検体からのサンプルにおける変化したＢＣＳＣ−１遺伝子発現の存在をインビトロ（in vitro）またはエキソビボ（ex vivo）で検出し、このような変化したＢＣＳＣ−１遺伝子発現の存在は該被検体におけるメラノーマまたは皮膚癌癌の存在、段階またはタイプを示すことを含む方法にある。
【０００９】
この方法の特定の態様に従えば、変化した発現は、上記サンプルにおけるＢＣＳＣ−１遺伝子の減少した発現、なお更に好ましくは該サンプルにおけるＢＣＳＣ−１遺伝子の長いアイソフォームの減少した発現である。
【００１０】
本発明の他の目的は、被検体における癌の存在、段階またはタイプを検出するための方法であって、被検体からのサンプルにおけるＢＣＳＣ−１遺伝子またはタンパク質の長いアイソフォームの（相対的）量をインビトロまたはエキソビボで決定し、このような量が該被検体における癌の存在、段階またはタイプを示すことを含む方法にある。特定の態様においては、決定された量を、コントロールもしくは平均値と比較するかまたはコントロールサンプルにおいて測定された値と比較する。他の態様においては、ＢＣＳＣ−１の長いアイソフォーム／ＢＣＳＣ−１の短いアイソフォームの比が決定され、そしてこのような比の任意の減少は、このような癌の存在を示す。このような方法は、任意の癌、特に充実性癌（solid cancers）を検出するのに使用されうる。
【００１１】
これについて、本発明の他の目的は、被検体における癌の存在、段階またはタイプを検出するための方法であって、ＢＣＳＣ−１の長いアイソフォーム／ＢＣＳＣ−１の短いアイソフォームの比をインビトロまたはエキソビボで決定し、コントロールの状態または参照もしくは平均値と比較してこのような比の減少が、このような癌の存在を示すことを含む方法にある。このような方法は、任意の癌、特に充実性癌を検出するのに使用されうる。
【００１２】
本発明の他の目的は、被検体における癌の存在、段階またはタイプを検出するための方法であって、被検体に由来する流体サンプルにおけるＢＣＳＣ−１タンパク質の（相対的）量をインビトロまたはエキソビボで決定し、このような量は該被検体における癌の存在、段階またはタイプを示すことを含む方法にある。典型的には、ＢＣＳＣ−１タンパク質の長いアイソフォームの（相対的）量を決定し、コントロールもしくは参照値と比較してこのような量の減少は癌の存在を示す。典型的な態様においては、流体サンプルは、全血、血清、血漿、尿等に由来する（例えば希釈、濃縮、精製、分離等により）。このような方法は、任意の癌、特に充実性癌を検出するのに使用されうる。
【００１３】
本発明の更なる目的は、被検体におけるメラノーマおよび皮膚癌の処置の有効性を評価する方法であって、該処置の前および後の被検体からのサンプルにおけるＢＣＳＣ−１遺伝子発現を比較し（インビトロまたはエキソビボ）、増加した発現は処置に対するポジティブな応答を示すことを含む方法にある。
【００１４】
本発明は、メラノーマまたは皮膚癌を処置するための医薬の製造のためのＢＣＳＣ−１タンパク質またはＢＣＳＣ−１タンパク質をコードする核酸の使用、および対応する処置方法にも関する。
【００１５】
本発明は、メラノーマまたは皮膚癌を処置するための医薬組成物の製造のためのＢＣＳＣ−１アゴニストの使用、および対応する処置方法にも関する。
【００１６】
本発明の更なる局面は、メラノーマまたは皮膚癌を処置するための医薬組成物の製造のためのＢＣＳＣ−１遺伝子発現を刺激する化合物の使用、および対応する処置方法にある。
【００１７】
本発明は、メラノーマまたは皮膚癌を処置することを必要としている被検体においてメラノーマまたは皮膚癌を処置する方法であって、有効量の上記した化合物を該被検体に投与することを含む方法にもある。好ましい態様においては、被検体は、変化したＢＣＳＣ−１遺伝子発現を有する。
【００１８】
本発明は、更にメラノーマまたは皮膚癌に対する生物学的に活性な化合物を選択する方法であって、ＢＣＳＣ−１発現または活性を模倣するか（mimic）または刺激する化合物を選択する工程を含む方法に関する。
【００１９】
特定の態様においては、前記方法は、試験化合物を、レポーター構築物を含む組換え宿主細胞と接触させ、該レポーター構築物はＢＣＳＣ−１遺伝子プロモーターのコントロール下のレポーター遺伝子を含んでおり、そしてレポーター遺伝子の発現を刺激する試験化合物を選択することを含む。
【００２０】
皮膚癌は、基底細胞癌、扁平上皮細胞癌、メルケル癌（Merkel carcinoma）、原発性皮膚リンパ腫、および皮膚または関連した表面組織の任意の他の細胞増殖疾患から選ばれうる。
【００２１】
ＢＣＳＣ−１遺伝子発現は、配列決定、選択的ハイブリダイゼーション、選択的増幅および／または特異的リガンド結合によるなどの当技術分野でそれ自体既知の任意の技術により検出されうる。特定の態様においては、本発明は、ＢＣＳＣ−１の長いアイソフォームの検出、または長いアイソフォームと短いアイソフォームの識別または長いアイソフォーム／短いアイソフォームの比の測定を可能とする試薬および／または技術を使用する。
【００２２】
本発明の更なる局面は、ＢＣＳＣ−１の長いアイソフォームの（特異的）増幅を可能とするかまたは長いアイソフォームと短いアイソフォームを識別することを可能とする核酸プライマーにある。
【００２３】
本発明の更なる局面は、ＢＣＳＣ−１の長いアイソフォームに（特異的に）ハイブリダイゼーションするかまたは長いアイソフォームと短いアイソフォームを識別することを可能とする核酸プローブにある。
【００２４】
本発明の更なる局面は、ＢＣＳＣ−１タンパク質の長いアイソフォームに（特異的に）結合するかまたは長いアイソフォームと短いアイソフォームを識別することを可能とする抗体（その誘導体およびハイブリドーマを産生する誘導体を含む）にある。
【００２５】
本発明は、更に、上記したプライマー、プローブまたは抗体を含むキットに関する。このようなキットは、容器または支持体、および／または増幅、ハイブリダイゼーションもしくは結合反応を行うための試薬を含むことができる。
【００２６】
本発明の特定の局面は、ＢＣＳＣ−１の少なくとも1つの長いアイソフォームを特異的に検出するようにデザインされる、プライマー、プローブおよび／または抗体を含む物質の組成物にある。
【００２７】
発明の詳細な説明
メラノーマの発生は増加している。それは広範囲に及び疾患を引き起こす傾向を有する進行性の癌である。全体的な遺伝子発現の研究に基づく新規な方法が、メラノーマ発癌性の基礎をなす事象を理解するために必要である。
【００２８】
図１に開示されたとおり、良性母斑（左）、形成異常母斑（dysplastic naevus）（中心）および悪性メラノーマ（右）間の移行を、形態学技術を使用して解析することができる。しかしながら、これらの移行を支配する分子事象については部分的にしか理解されていない。
【００２９】
良性母斑とメラノーマ間の移行を支配する分子事象を同定するために、本発明者等は、ＤＡＴＳ（選択的スプライシングによる転写物のディファレンシャル解析）と呼ばれる遺伝子プロファイリング技術を使用して着色したメラノーマにおける選択的スプライシングを研究することを選んだ。この全体的な遺伝子発現解析によって、本発明者等は、腫瘍関連スプライシング事象から生じる新規な配列を導いた。良性母斑（ネガティブコントロール）および異なる段階の着色した皮膚病変の生検を含む総計７０人の患者の生検から抽出されたＲＮＡのリアルタイム半定量的ＲＴ−ＰＣＲを使用して、本発明者等は、転移疾患を有する患者からのＢＣＳＣ−１は選択的にダウンレギュレーションされることを示すことができた。
【００３０】
更に、本発明者等は、ＢＣＳＣ−１の長いアイソフォームは、メラノーマにおいて選択的にダウンレギュレーションされ、一方短いアイソフォームは実質的に影響を受けないということを確かめることができた。
【００３１】
更に、メラノーマ細胞系においてＨＡでタグ付けされたＢＣＳＣ−１をコードするレンチウイルスベクターからの異所発現は、これらの細胞の増殖の強い減少を誘導した。
【００３２】
総合すると、本発明者等の結果は、メラノーマおよび皮膚癌において選択的にダウンレギュレーションされる新規な遺伝子（ＢＣＳＣ−１）を同定する。この遺伝子の選択された「長い」アイソフォーム（ｃ．ｆ）のみが転移メラノーマにおいてダウンレギュレーションされたが、「短い」アイソフォームは影響を受けず、転移腫瘍における紛失しているアイソフォームを検出するためのより特異的な診断ツールを開発する可能性を開く。最後に、異所発現は、転移メラノーマ細胞系の細胞増殖を遅くしたが、これはＢＣＳＣ−１が転移疾患進行における機能的な役割を有することを示唆する。
【００３３】
したがって、本発明は、メラノーマおよび皮膚癌の診断および処置のためならびに治療的に活性な薬物のスクリーニングのためにＢＣＳＣ−１遺伝子および対応する発現産物を使用することを提唱する。本発明は、種々の被検体、特に成人および子供を含むヒトにおいて使用することができる。
【００３４】
定義
本発明に関連して、用語「ＢＣＳＣ−１遺伝子」は、コード配列、非コード配列、転写および／または翻訳をコントロールする調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター等）ならびにすべての対応する発現産物、例えばＲＮＡｓ（例えば、ｍＲＮＡｓ）を含む、細胞または生物におけるすべてのＢＣＳＣ−１ヌクレオチド配列を表す。用語「遺伝子」は、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、相補性ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、合成もしくは半合成ＤＮＡを含む任意タイプのコード核酸、ならびに任意の形態の対応するＲＮＡを含むとみなされるべきである。用語遺伝子は、特に組換え核酸、即ち、例えば配列をアセンブリング、切断、ライゲーションまたは増幅することにより人工的に創生された任意の非天然に存在する核酸分子を含む。遺伝子は、一本鎖などの他の形態を意図することができるけれども、典型的には二本鎖である。遺伝子は、種々のソースから得ることができ、そしてＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによりまたは種々の天然のソースからの増幅によるなどの当技術分野で知られている種々の技術に従って得られうる。組換え核酸は、化学合成、遺伝子工学、酵素技術またはその組み合わせを含む慣用の技術により調製されうる。
【００３５】
ＢＣＳＣ−１遺伝子配列は、NM_014622およびNM_198315などの遺伝子バンクに見出されうる。エキソン境界が太字で表わされておりそして開始コドンおよび停止コドンが下線を引かれている配列番号１４も参照されたい。
【００３６】
用語「ＢＣＳＣ−１遺伝子」は、上記した任意のコード配列の任意の変異体、フラグメントまたはアナログを含む。このような変異体は、例えば個体間のアレル変動（例えば多形）、突然変異したアレル、選択的スプライシング形態等による天然に存在する変異体を含む。用語変異体は、他のソースまたは生物からのＢＣＳＣ−１遺伝子配列も含む。変異体は、好ましくは上記したコード配列と実質的に相同性である、即ち、上記したコード配列と少なくとも約６５％、典型的には少なくとも約７５％、好ましくは少なくとも約８５％、さらに好ましくは少なくとも約９５％のヌクレオチド配列同一性を示す。ＢＣＳＣ−１遺伝子の変異体およびアナログは、典型的にはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下に上記した配列（またはその相補性鎖）にハイブリダイゼーションする核酸配列を含む。
【００３７】
典型的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、３０℃以上、好ましくは３５℃以上、更に好ましくは４２℃以上の温度および／または約５００mM未満、好ましくは２００mM未満の塩度を含む。ハイブリダイゼーション条件は、温度、塩度および／またはＳＤＳ、ＳＳＣなどの他の試薬の濃度等を改変することにより当業者により調節されうる。
【００３８】
ＢＣＳＣ−１遺伝子のフラグメントは、上記した配列の少なくとも約８個の連続したヌクレオチド、好ましくは少なくとも約１５、更に好ましくは少なくとも約２０のヌクレオチド、更に好ましくは少なくとも３０のヌクレオチドの任意の部分を表す。フラグメントは、８〜１００のヌクレオチド、好ましくは１５〜１００ヌクレオチド、更に好ましくは２０〜１００ヌクレオチドのすべての可能なヌクレオチド長さを含む。
【００３９】
選択的スプライシングから生じるＢＣＳＣ−１遺伝子のいくつかのアイソフォームが存在する。この点で、ＢＣＳＣ−１の長いアイソフォームおよび短いアイソフォームは、それらが保持しているエキソン（の数）に依存して定義されうる。更に詳しくは、ＢＣＳＣ−１ゲノムＤＮＡは、選択的にスプライシングされうる１８のエキソンを含む。各エキソンの位置は、配列番号１４に示されそして下記の表により要約されており、この表において位置は配列番号１４のｃＤＮＡ配列に関して与えられる。
【００４０】
【表１】
【００４１】
本発明に関連して、長いＢＣＳＣ−１アイソフォームは、エキソン１３〜１８の少なくとも１つのヌクレオチド配列または対応するアミノ酸配列を含むアイソフォームである。短いＢＣＳＣ−１アイソフォームは、エキソン１３〜１８のいずれか１つのヌクレオチド配列または対応するアミノ酸配列を含まないアイソフォームである。長いＢＣＳＣ−１アイソフォームの例は、エキソン１〜１３、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１７または１〜１８のヌクレオチド配列または対応するアミノ酸配列を含む。これに関して、長いアイソフォームは、エキソン１１〜１８のすべてを含有するNM_014622において表わされる。同様に、エキソン８〜１６の欠失を含むがエキソン１８を含有するAY366504およびAY366507において表されたアイソフォームは、本発明の文脈では、長いアイソフォームである。長いアイソフォームの他の例はAY366508に開示されている。
【００４２】
ＢＣＳＣ−１タンパク質は、上記したＢＣＳＣ−１遺伝子によりコードされている任意のタンパク質またはポリペプチドを表す。用語「ポリペプチド」は、アミノ酸のストレッチを含む任意の分子を指す。この用語は、ペプチドおよびタンパク質などの種々の長さの分子を含む。ポリペプチドは、グリコシル化および／またはアセチル化および／または化学反応またはカップリングなどにより改変され得、そして１つまたは複数の非天然または合成アミノ酸を含有することができる。ＢＣＳＣ−１ポリペプチドの特定の例は、NM_014622またはNM_198315において表された配列のすべてまたは一部を含む（配列番号１３参照）。
【００４３】
検出／診断
本発明は、今や被検体におけるＢＣＳＣ−１遺伝子アイソフォームの監視に基づく診断を提供する。本発明に関連して、用語「診断」は、成人または子供における早期段階、前兆段階および後期段階を含む種々の段階での検出、監視、投薬、比較等を含む。診断は、典型的には、予後、発生の素因または危険の評価、最も適切な処置を規定するための被検体の特徴付け（薬理遺伝学）等を含む。
【００４４】
本発明の一般的目的は、被検体における癌の存在、段階またはタイプを検出するための方法であって、被検体からのサンプルにおける変化した長いアイソフォームＢＣＳＣ−１遺伝子発現の存在をインビトロまたはエキソビボで検出し、このような変化した長いアイソフォームＢＣＳＣ−１遺伝子発現の存在が該被検体における癌の存在、段階またはタイプを示すことを含む方法にある。
【００４５】
本発明の更なる一般的局面は、被検体における癌、特に充実性癌を検出する方法であって、被検体からのサンプルにおけるＢＣＳＣ−１の長いアイソフォームを検出し、その減少した発現は癌の存在、段階またはタイプを示すことを含む方法である。
【００４６】
本発明の特定の目的は、被検体におけるメラノーマまたは皮膚癌の存在、段階またはタイプを検出するための方法であって、被検体からのサンプルにおける変化したＢＣＳＣ−１遺伝子発現の存在をインビトロまたはエキソビボで検出し、このような変化したＢＣＳＣ−１遺伝子発現の存在が該被検体におけるメラノーマまたは皮膚癌の存在、段階またはタイプを示すことを含む方法にある。
【００４７】
本発明の更なる目的は、被検体からのサンプルを提供する第１工程を含む上記した方法である。
【００４８】
処置もしくは薬物に対する応答または処置もしくは薬物に対する副作用を解析しそして予測する診断は、個体が特定の処置薬物により処置されるべきであるかどうかを決定するのに使用されうる。例えば、個体が特定の薬物による処置にポジティブに応答する可能性を診断が示すならば、その薬物を個体に投与することができる。反対に、個体が特定の薬物による処置にネガティブに応答しそうであることを診断が示すならば、別のコースの処置を処方することができる。ネガティブな応答は有効な応答の不存在または毒性副作用の存在として定義されうる。
【００４９】
変化したＢＣＳＣ−１発現は、例えばＲＮＡまたはポリペプチドのレベルで、当技術分野でそれ自体既知の任意の技術により決定されうる。
【００５０】
本発明に開示されたとおり、ＢＣＳＣ−１発現は、メラノーマまたは皮膚癌細胞において変化する。更に詳しくは、ＢＣＳＣ−１の発現レベルは、非癌性皮膚細胞または平均値と比較して、メラノーマまたは皮膚癌細胞において減少する。なお更に詳しくは、長いＢＣＳＣ−１アイソフォームの発現レベルは、非癌性細胞または平均値と比較して、癌細胞において減少する。したがって、好ましい態様においては、本発明の方法は、ＢＣＳＣ−１遺伝子、特にその長いアイソフォームの発現レベルの減少を検出する工程を含む。典型的な態様においては、この方法は、サンプル中のＢＣＳＣ−１ＲＮＡまたはポリペプチド種、特にサンプル中のＢＣＳＣ−１ＲＮＡまたはポリペプチドの長いアイソフォームの（相対的）量を決定する段階と、該量を、参照もしくは平均値またはコントロール組織（例えば、非癌性細胞）において測定した値と比較する工程を含み、より低い値は癌を示す。更なる特定の態様においては、この方法は、それぞれ、長いＢＣＳＣ−１ＲＮＡまたはタンパク質アイソフォーム／短いＢＣＳＣ−１ＲＮＡまたはタンパク質アイソフォームの比を決定することを含み、コントロール／参照値またはサンプルに比較してこのような比の任意の変異は癌の存在を示す。いくつかの長いアイソフォームの（相対的）量を決定することができるけれども、１つのみの長いアイソフォームの量を測定するかまたは１つの長いアイソフォーム／１つの短いアイソフォームの比を決定すれば十分である。このような測定は、例えば対応するプローブもしくはプライマーを使用するエキソン１３、１４、１５、１６、１７もしくは１８の検出または下記するとおりその特異的リガンドを使用するコードされているアミノ酸残基の検出に基づくことができる。
【００５１】
更に、本発明は、ＢＣＳＣ−１遺伝子のまたはポリペプチド内の癌関連の構造的変化の検出も包含する。ＢＣＳＣ−１遺伝子またはポリペプチドのこのような変化は、単独のまたは種々の組み合わせにおける、コード領域および／または非コード領域における任意の形態の突然変異、欠失、転位および／または挿入であることができる。更に詳しくは、突然変異は、点突然変異を含む。欠失は、遺伝子のコード部分または非コード部分における2つ以上の残基の任意の領域、例えば２残基から全体の遺伝子までの領域を包含することができる。より大きい欠失も起こりうるけれども、典型的な欠失は、約50未満の連続した塩基対のドメイン（イントロン）または反復配列またはフラグメントなどのより小さい領域に影響を与える。挿入は、遺伝子のコード部分または非コード部分におけ1つまたは複数の残基の付加を包含することができる。挿入は、典型的には、遺伝子における１〜５０塩基対の付加を含むことができる。転位は、配列の反転を含む。ＢＣＳＣ−１の構造的変化は、停止コドンの創生、フレームシフト突然変異、アミノ酸置換、特定のＲＮＡスプライシングもしくはプロセシング、産物不安定性、トランケーションされたポリペプチド産生等をもたらすことができる。この変化は、変化した、機能、安定性、ターゲティングまたは構造を伴うＢＣＳＣ−１ポリペプチドの産生をもたらすことができる。
【００５２】
配列決定、ハイブリダイゼーション、増幅および／または特異的リガンド（抗体など）への結合を含む当技術分野で知られている種々の技術を、変化したＢＣＳＣ−１発現を検出または定量するのに使用することができる。他の適当な方法は、アレル特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、アレル特異的増幅、サザーンブロット（ＤＮＡｓについて）、ノーザンブロット（ＲＮＡｓについて）、一本鎖コンフォメーション解析（ＳＳＣＡ）、ＰＦＧＥ、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、ゲル移動、クランプド変性ゲル電気泳動（clamped denaturing gel electrophoresis）、ヘテロ二本鎖解析、ＲＮａｓｅ保護、化学的ミスマッチ開裂、ＦＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）および免疫酵素アッセイ（ＩＥＭＡ）を含む。
【００５３】
増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）および核酸配列をベースとする増幅（ＮＡＳＢＡ）によるなどの当技術分野で知られている種々の技術に従って行うことができる。これらの技術は、市販の試薬およびプロトコールを使用して行うことができる。好ましい技術は、アレル特異的ＰＣＲまたはＰＣＲ−ＳＳＣＰを使用する。増幅は、通常反応を開始するために特異的核酸プライマーの使用を必要とする。
【００５４】
ＢＣＳＣ−１遺伝子またはＲＮＡからの配列を増幅するために有用な核酸プライマーは、ＢＣＳＣ−１遺伝子またはＲＮＡの一部に対して相補性でありそして特異的にハイブリダイゼーションする。ＢＣＳＣ−１遺伝子またはＲＮＡのすべてまたは一部に対して使用されうるプライマーは、ＢＣＳＣ−１自体の配列に基づいてデザインされうる。
【００５５】
本発明で使用するための最も好ましいプライマーは、ＢＣＳＣ−１の長いアイソフォームの増幅を可能とする、即ち、ＢＣＳＣ−１遺伝子またはＲＮＡエキキソン１３〜１８のいずれか１つ内に位置した配列に対して相補性でありそして特異的にハイブリダイゼーションする配列を含有する。
【００５６】
これに関して、本発明は、核酸プライマーであって、ＢＣＳＣ−１遺伝子またはＲＮＡのエキソン１３〜１８のいずれか１つ内に位置した配列に対して相補性でありそして特異的にハイブリダイゼーションする核酸プライマーにも関する。このようなプライマーの使用は、サンプル中のＢＣＳＣ−１またはＲＮＡの長いアイソフォームの検出を可能とする。
【００５７】
本発明の典型的なプライマーは、長さ約５〜６０ヌクレオチド、更に好ましくは長さが約８〜約２５ヌクレオチドの一本鎖核酸分子である。配列は、ＢＣＳＣ−１遺伝子の配列から直接誘導されうる。高い特異性を確実にするために、完全な相補性が好ましい。しかしながら、あるミスマッチは許容されうる。
【００５８】
このようなプライマーの特定の例は、実験の部において表１に開示されている（配列番号１〜１２）。
【００５９】
本発明は、被検体における癌の存在もしくは癌への素因を検出する方法または癌の処置に対する被検体の応答を評価する方法における上記した核酸プライマーまたは核酸プライマーの対の使用にも関する。
【００６０】
他の態様において、検出は選択的ハイブリダイゼーションを使用する技術により行われる。
【００６１】
特定の検出技術は、ＢＣＳＣ−１遺伝子またはＲＮＡに対して特異的な核酸プローブの使用、次いでハイブリッドの存在および／または（相対的）量の検出を含む。プローブは、懸濁しているかまたは基材もしくは支持体に固定化される（核酸アレイまたはチップ技術におけるように）ことができる。プローブは、典型的にはハイブリッドの検出を容易にするために標識される。
【００６２】
これについて、本発明の特定の態様は、被検体からのサンプルを、ＢＣＳＣ−１の長いアイソフォームに対して特異的な核酸プローブと接触させ、そしてハイブリッドの形成を評価することを含む。特定の態様においては、この方法は、サンプルを、それぞれ、ＢＣＳＣ−１の種々の長いアイソフォームに対して特異的なプローブの組と、同時に接触させることを含む。
【００６３】
本発明の状況において、プローブは、ＢＣＳＣ−１遺伝子もしくはＲＮＡ（のターゲット部分）に対して相補性でありそしてＢＣＳＣ−１もしくはＲＮＡ（のターゲット部分）と特異的ハイブリダイゼーションすることができそしてサンプル中のその存在もしくはその（相対的）量を検出するために適当なポリヌクレオチド配列を指す。プローブは、好ましくはＢＣＳＣ−１またはＲＮＡの配列に対して完全に相補性である。プローブは、典型的には、長さが８〜１０００ヌクレオチド、例えば１０〜８００、更に好ましくは１５〜７００、典型的には２０〜５００の一本鎖核酸を含む。より長いプローブも使用することができることは理解されるべきである。本発明の好ましいプローブは、ＢＣＳＣ−１遺伝子またはＲＮＡのエキソン１３〜１８のいずれか１つ内に含有されている領域に特異的にハイブリダイゼーションすることができる長さが８〜５００ヌクレオチドの一本鎖核酸分子である。
【００６４】
特異性は、ターゲット配列に対するハイブリダイゼーションが、非特異的ハイブリダイゼーションにより発生されるシグナルとは区別されうる特異的シグナルを発生することを示す。完全に相補性の配列は、本発明に従うプローブをデザインするのに好ましい。しかしながら、ある程度のミスマッチは、特異的シグナルが非特異的ハイブリダイゼーションから識別されうる限り許容されうることは理解されるべきである。
【００６５】
プローブの配列は、本願で提供されたＢＣＳＣ−１およびＲＮＡの配列に由来することができる。プローブのヌクレオチド置換および化学的改変を行うことができる。このような化学的改変は、ハイブリッドの安定性を増加させるため（例えば、インターカレーティング基）またはプローブを標識するために行うことができる。標識の典型的な例は、放射能、蛍光、ルミネセンス、酵素標識等を含むがこれらに限定されない。
【００６６】
本発明は、被検体における癌の進行の存在、タイプまたは段階を検出する方法または癌処置に対する被検体の応答を評価する方法において上記した核酸プローブの使用にも関する。
【００６７】
本発明は、上記したプローブを含む核酸チップにも関する。このようなチップは、当技術分野で知られた技術によりｉｎ ｓｉｔｕでまたはクローンを堆積することにより作成することができ、そして典型的には（ガラス、ポリマー、金属等）スライドなどのマトリックス上にディスプレイされている核酸のアレイを含む。
【００６８】
上記したとおり、ＢＣＳＣ−１遺伝子発現の変化は、ＢＣＳＣ−１ポリペプチドの存在または（相対的）量を検出することにより検出することもできる。これに関して、本発明の特定の態様は、サンプル（血液、血漿、血清等などの生物学的流体を含むことができる）を、ＢＣＳＣ−１ポリペプチドに対して特異的なリガンドと接触させそして複合体の形成を決定することを含む。
【００６９】
特異的抗体などの異なるタイプのリガンドを使用することができる。特定の態様においては、サンプルをＢＣＳＣ−１ポリペプチドに対して特異的な抗体と接触させそして免疫複合体の形成が決定される。ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）および免疫酵素アッセイ（ＩＥＭＡ）などの免疫複合体を検出するための種々の方法を使用することができる。
【００７０】
本発明の状況において、抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体および実質的に同じ抗原特異性を有するその任意のフラグメントまたは誘導体を表す。フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’２、ＣＤＲ領域等を含む。誘導体は一本鎖抗体、ヒト化抗体、多官能性抗体等を含む。
【００７１】
最も好ましいリガンドは、ＢＣＳＣ−１の長いアイソフォームに対して特異的であり、即ち、エキソン１３〜１８のいずれか１つによりコードされたアミノ酸配列内に含有されたエピトープに結合する。
【００７２】
ＢＣＳＣ−１ポリペプチドに対して特異的な抗体は、ＢＣＳＣ−１ポリペプチドに選択的に結合する抗体を表す。更に詳しくは、それはＢＣＳＣ−１ポリペプチドまたはそのエピトープ含有フラグメントに対して生じた抗体を表す。他の抗原に対する非特異的結合が起こりうるけれども、ターゲットＢＣＳＣ−１ポリペプチドへの結合がより高いアフィニティーで起こりそして非特異的結合から信頼可能に識別されうる。
【００７３】
特定の態様においては、この方法は、被検体からのサンプルをＢＣＳＣ−１ポリペプチドに対して特異的な抗体（でコーティングされた支持体）と接触させそして免疫複合体の存在を決定することを含む。特定の態様においては、サンプルを、異なるＢＣＳＣ−１アイソフォームに対して特異的な種々の抗体（でコーティングされた支持体）と、同時にまたは並行してまたは順次に接触させることができる。
【００７４】
他の特異的態様においては、本発明は、被検体における癌の存在または癌の素因を検出する方法であって、被検体からのサンプル（血液、血漿、血清等などの生物学的流体を含むことができる）をＢＣＳＣ−１ポリペプチドの長いアイソフォームに対して特異的なリガンドとインビトロまたはエキソビボで接触させそして形成された複合体の（相対的）量を決定し、このような量は癌の存在または癌への素因を示すことを含む方法に関する。
【００７５】
本発明は、被検体における癌の存在、段階またはタイプを検出する方法または癌処置に対する被検体の応答を評価する方法におけるリガンド、好ましくは抗体、上記したそのフラグメントまたは誘導体の使用にも関する。
【００７６】
本発明は、被検体からのサンプルにおいてＢＣＳＣ−１遺伝子、ＲＮＡまたはポリペプチドの存在または（相対的）量を検出するための製品および試薬を含む診断キットにも関する。本発明に従う該診断キットは、本発明に記載された任意のプライマー、任意のプライマーの対、任意の核酸プローブ、および／または任意のリガンド、好ましくは抗体を含む。本発明に従う該診断キットは、更にハイブリダイゼーション、増幅または抗原−抗体免疫反応を行うための試薬および／またはプロトコールを含むことができる。
【００７７】
本発明の診断方法は、インビトロ、エキソビボまたはインビボで、好ましくはインビトロまたはエキソビボで行うことができる。それらは、被検体からのサンプルを使用してＢＣＳＣ−１遺伝子発現の任意の変化を評価する。サンプルは、核酸またはポリペプチドを含有する被検体に由来する任意の生物学的サンプルであることができる。このようなサンプルの例は、流体、組織、細胞サンプル、器官、生検等を含む。最も好ましいサンプルは、組織生検、例えば皮膚癌細胞、組織またはサンプルである。サンプルは、慣用の技術に従って採集され得そして診断のために直接使用されるかまたは貯蔵されうる。サンプルは、試験するための核酸またはポリペプチドの利用性を確実にするかまたは改良するために、本方法を行う前に処理されうる。処理は、例えば、溶解（例えば機械的、物理的、化学的等）、遠心等を含む。また、核酸および／またはポリペプチドは、慣用の技術により予備精製または濃縮されることができおよび／または複雑さを減少させることができる。核酸およびポリペプチドを、酵素、または他の化学的もしくは物理的処理により処理してそのフラグメントを産生させることもできる。特許請求の範囲に記載の方法の高い感度を考慮すると、非常に少量のサンプルがアッセイを行うのに十分である。
【００７８】
示されたとおり、サンプルを、好ましくは、プローブ、プライマーまたはリガンドなどの試薬と接触させて、ＢＣＳＣ−１遺伝子またはＲＮＡまたはポリペプチドの存在および／または（相対的）量を評価する。接触は、プレート、チューブ、ウエル、ガラス等などの任意の適当な装置において行うことができる。特定の態様においては、接触は、核酸７アレイもしくは特異的リガンドアレイなどの試薬でコーティングされた基材上で行われる。基材は、固体または半固体基材、例えばガラス、プラスチック、ナイロン、紙、金属、ポリマー等を含む任意の支持体であることができる。基材は、スライド、膜、ビーズ、カラム、ゲル等などの種々の形態およびサイズであることができる。接触は、試薬とサンプルの核酸またはポリペプチド間で複合体が形成されるための適当な条件下になされうる。
【００７９】
サンプル中の変化したＢＣＳＣ−１発現の発見は、メラノーマまたは皮膚癌の進行の存在、タイプまたは段階を示す。変化したＢＣＳＣ−１発現の存在の決定は、より効果的でかつ特注の適切な治療介入のデザインも可能とする。前兆レベルでのこの決定は、予防治療方式が適用されることを可能とする。
【００８０】
薬物スクリーニング
本発明は、薬物候補またはリードのスクリーニングのための新規なターゲットおよび方法も提供する。この方法は、結合アッセイおよび／または機能的アッセイを含み、そしてインビトロ、細胞系、動物等において行うことができる。
【００８１】
これに関して、本発明の目的は、メラノーマまたは皮膚癌に対する生物学的に活性な化合物を選択する方法であって、ＢＣＳＣ−１発現または活性を模倣するかまたは刺激する化合物を選択する工程を含む方法にある。
【００８２】
本発明の更なる目的は、メラノーマまたは皮膚癌に対する生物学的に活性な化合物を選択する方法であって、試験化合物をレポーター構築物を含む組換え宿主細胞と接触させ、該レポーター構築物はＢＣＳＣ−１遺伝子プロモーターのコントロール下のレポーター遺伝子を含み、そしてレポーター遺伝子の発現を刺激する試験化合物を選択することを含む方法である。
【００８３】
本発明の特定の目的は、メラノーマまたは皮膚癌に対して活性な化合物を選択する方法であって、試験化合物をＢＣＳＣ−１遺伝子またはポリペプチドとインビトロで接触させ、そしてそれぞれ該試験化合物の該ＢＣＳＣ−１遺伝子またはポリペプチドに結合する能力を決定することを含む方法にある。該遺伝子またはポリペプチドへの結合は、化合物の、前記標的の活性をモデュレーションする能力、従ってメラノーマまたは皮膚癌に導く経路に影響を与える能力に関する指示を与える。好ましくは、ＢＣＳＣ−１ポリペプチドは長いアイソフォームである。
【００８４】
結合の決定は、試験化合物の標識、標識された参照リガンドとの競合等によるなどの種々の技術により行うことができる。
【００８５】
本発明の更なる目的は、メラノーマまたは皮膚癌に対して活性な化合物を選択する方法であって、試験化合物をＢＣＳＣ−１ポリペプチドとインビトロで接触させそして該試験化合物の該ポリペプチドの活性をモデュレーションする能力を決定することを含む方法にある。好ましくは、ＢＣＳＣ−１ポリペプチドは長いアイソフォームである。
【００８６】
本発明の更なる目的は、生物学的に活性な化合物を選択する方法であって、試験化合物をＢＣＳＣ−１遺伝子とインビトロで接触させ、そして該試験化合物の該遺伝子の長いアイソフォームの発現をモデュレーションする能力を決定することを含む、方法にある。
【００８７】
スクリーニングする特定の態様において、モデュレーションは活性化である。
【００８８】
上記スクリーニングアッセイは、プレート、チューブ、ディッシュ、フラスコ等などの任意の適当な装置において行うことができる。典型的には、アッセイをマルチウエルプレートにおいて行う。いくつかの試験化合物を並行してアッセイすることができる。更に、試験化合物は、種々の起源、性質および組成であることができる。それは、単離されているかまたは他の物質との混合物中の任意の有機または無機物質、例えば脂質、ペプチド、ポリペプチド、核酸、小分子等であることができる。化合物は、例えば、産物のコンビナトリアルライブラリーのすべてまたは一部であることができる。
【００８９】
医薬組成物、治療
本発明の更なる目的は、（ｉ）ＢＣＳＣ−１ポリペプチドの長いアイソフォームまたはそれをコードする核酸または、下記するベクターもしくは組換え宿主細胞および（ｉｉ）薬学的に許容されうる担体またはビヒクルを含む医薬組成物である。
【００９０】
本発明は、被検体におけるメラノーマまたは皮膚癌を処置する方法であって、該被検体に上記した組成物を投与することを含む、方法にも関する。
【００９１】
本発明は、被検体におけるメラノーマまたは皮膚癌を処置する方法であって、該被検体に有効量のＢＣＳＣ−１ポリペプチドの長いアイソフォームを投与することを含む、方法にも関する。
【００９２】
本発明は、メラノーマまたは皮膚癌を処置するための医薬の製造のためのＢＣＳＣ−１タンパク質またはＢＣＳＣ−１タンパク質をコードする核酸の使用にも関する。好ましくは、ＢＣＳＣ−１タンパク質は長いアイソフォームである。
【００９３】
本発明は、癌を処置するための医薬の製造のための長いＢＣＳＣ−１タンパク質アイソフォームの使用にも関する。
【００９４】
本発明は、メラノーマまたは皮膚癌を処置するための医薬組成物の製造のためのＢＣＳＣ−１アゴニストの使用にも関する。
【００９５】
本発明は、メラノーマまたは皮膚癌を処置するための医薬組成物の製造のためのＢＣＳＣ−１遺伝子発現を刺激する化合物の使用を更に包含する。
【００９６】
本発明の状況において、用語「処置」は、腫瘍進行の阻害、腫瘍増殖の阻害、腫瘍サイズの減少、腫瘍細胞の腫瘍形成性の抑制、疾患の進行の遅延を含む。
【００９７】
皮膚癌は、基底細胞癌、扁平上皮細胞癌、メルケル癌、原発性皮膚リンパ腫（primary cutaneous lymphoma）および皮膚または関連した表面組織の任意の他の細胞増殖疾患から選択されうる。
【００９８】
実験の部に示されたとおり、皮膚癌細胞にＢＣＳＣ−１の長いアイソフォームを供給すると、腫瘍増殖が抑制される。被検体へのこのような機能の供給は、遺伝子もしくはタンパク質治療によりまたはＢＣＳＣ−１ポリペプチド活性をモデュレーションするかまたは模倣する化合物（例えば、上記スクリーニングアッセイにおいて同定されたアゴニスト）を投与することにより達成されうる。特に、ＢＣＳＣ−１遺伝子は、例えばウイルスベクターまたはプラスミドを使用してそれを必要としている被検体の細胞に導入されうる。アデノウイルス、ＡＡＶ、ヘルペスウイルスおよびレンチウイルスを含むレトロウイルスなどの種々のウイルスをベースとするビヒクルを使用することができる。例えば、US Patents 6,069,134および6,143,290は、癌抑制遺伝子を癌性細胞に移行および発現させるためのヒトアデノウイルスの使用を説明する。遺伝子は、裸のＤＮＡとして導入されることもできる。遺伝子は、レシピエント宿主細胞のゲノムに組み込まれるようにまたは染色体外に残るように与えられうる。組み込みは、ランダムにまたは正確に規定された部位で、例えば相同的組み換えにより行うことができる。更に、技術は、遺伝子ガン、リポソーム媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション等を含む。遺伝子治療は、直接遺伝子注入によりまたは機能的ＢＣＳＣ−１タンパク質ポリペプチドを発現するエキソビボで調製された遺伝的に改変された細胞を投与することにより達成されうる。タンパク質治療は、当技術分野でそれ自体既知の技術に従って達成されることもできる。このようなタンパク質治療は、ＢＣＳＣ−１が分泌されたタンパク質であることを考慮すると特に適している。遺伝子治療の目的で、ＢＣＳＣ−１遺伝子の典型的な用量は、１０４〜１０９ＢＣＳＣ−１発現ベクター間に含まれる。タンパク質治療の目的で、ＢＣＳＣ−１タンパク質の典型的な用量は、用量当たり１ｎｇ〜１００mg間に含まれる。一般に、疾患にかかった細胞内の細胞増殖の減少または阻害を達成するために、治療的有効量が投与される。用量は、病態の重篤さ、プロトコール、患者等に基づいて医師により調節されうることは理解されるべきである。
【００９９】
ＢＣＳＣ−１タンパク質およびＢＣＳＣ−１発現ベクターまたは細胞は、経口的、全身的、局所的および非経口的（例えば、皮下に、腹腔内に、血管内に等）を含むがそれらに限定されない種々の方法において投与されうる。１つの態様において、化合物は、腫瘍の部位または付近に（除去された腫瘍の部位に）直接に、例えば術中にまたは腫瘍への直接アクセスを可能とする他の手段（例えばカテーテル）により、適用される。
【０１００】
ベクターおよび組換え細胞
本発明の更なる局面は、診断、治療またはスクリーニングにおいて使用するための新規な産物にある。
【０１０１】
更に詳しくは、本発明の更なる目的は、ＢＣＳＣ−１ポリペプチド、好ましくはその長いアイソフォームをコードする核酸を含むベクターである。このベクターは、クローニングベクター、または更に好ましくは発現ベクター、即ち、コンピテントな宿主細胞において該ベクターからのＢＣＳＣ−１ポリペプチドの発現を引き起こす調節配列を含むベクターであることができる。
【０１０２】
これらのベクターは、インビトロ、エキソビボまたはインビボでＢＣＳＣ−１ポリペプチドを発現するため、トランスジェニックまたは「ノックアウト」非ヒト動物を創生するため、核酸を増幅するため、アンチセンスＲＮＡｓを発現するため等に使用されうる。
【０１０３】
本発明のベクターは、典型的には、調節配列、例えばプロモーター、ｐｏｌｙＡ等に作用可能に連結された（operably linked）本発明に従うＢＣＳＣ−１コード配列を含む。用語「作用可能に連結された」は、調節配列がコード配列の発現（例えば転写）を引き起こすようにコード配列と調節配列が機能的に関連していることを示す。ベクターは、１つまたは複数の複製起点および／または選択可能なマーカーを更に含むことができる。プロモーター領域は、コード配列に対して同種であるか異種であることができ、そして任意の適切な宿主細胞において、インビボ使用のためを含む、遍在性、構成的、調節されたおよび／または組織特異的発現を与えることができる。プロモーターの例は、バクテリアプロモーター（Ｔ７、ｐＴＡＣ、Ｔｒｐプロモーター等）、ウイルスプロモーター（ＬＴＲ、ＴＫ、ＣＭＶ−ＩＥ等）、哺乳動物遺伝子プロモーター（アルブミン、ＰＧＫ等）等を含む。
【０１０４】
ベクターは、プラスミド、ウイルス、コスミド、ファージ、ＢＡＣ、ＹＡＣ等であることができる。プラスミドベクターは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＵＣ、ｐＢＲ等などの市販のベクターから作成されうる。ウイルスベクターは、当技術分野で知られている組換えＤＮＡ技術に従って、バキュロウイルス、レトロウイルス（例えば、レンチウイルス）、アデノウイルス、ＡＡＶｓ等から産生されうる。
【０１０５】
組換えウイルスは、好ましくは複製欠損性であり、なお更に好ましくは、Ｅ１欠損および／またはＥ４欠損アデノウイルス、Ｇａｇ欠損、ｐｏｌ欠損および／またはｅｎｖ欠損レトロウイルス、Ｒｅｐ欠損および／またはＣａｐ欠損ＡＡＶｓから選ばれる。このような組換えウイルスは、当技術分野で知られている技術により、例えばパッケージング細胞をトランスフェクションすることによりまたはヘルパープラスミドまたはウイルスによる一過性トランスフェクションにより産生されうる。ウイルスパッケージング細胞の典型的な例は、ＰＡ３１７細胞、ＰｓｉＣＲＩＰ細胞、ＧＰｅｎｖ＋細胞、２９３細胞等を含む。このような複製欠損組換えウイルスを産生するための詳細なプロトコールは、例えばWO95/14785、WO96/22378、US5,882,877、US6,013,516、US4,861,719、US5,278,056、WO94/19478において見出されうる。
【０１０６】
本発明の更なる目的は、上記した組換えＢＣＳＣ−１遺伝子またはベクターを含む組換え宿主細胞にある。適当な宿主細胞は、原核細胞（例えばバクテリア）および真核細胞（例えば酵母細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等）を含むが、それらに限定されない。特定の例は、Ｅ．ｃｏｌｉ、ＫｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓもしくはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ酵母、哺乳動物細胞系（例えば、Ｖｅｒｏ細胞、ＣＨＯ細胞、３Ｔ３細胞、ＣＯＳ細胞等）ならびに一次もしくは樹立された哺乳動物細胞培養物（例えば繊維芽細胞、胚細胞、上皮細胞、神経細胞、脂肪細胞等から作製された）を含む。
【０１０７】
本発明は、本発明に従ってＢＣＳＣ−１ポリペプチドを発現する組換え宿主細胞を作製するための方法であって、（ｉ）コンピテント宿主細胞に上記した組換え核酸またはベクターをインビトロまたはエキソビボで導入し、（ｉｉ）得られた組換え宿主細胞をインビトロまたはエキソビボで培養し、そして（ｉｉｉ）場合により、ＢＣＳＣ−１ポリペプチドを発現する細胞を選択することを含む、方法にも関する。
【０１０８】
このような組換え宿主細胞は、ＢＣＳＣ−１ポリペプチドの産生のためおよび下記する活性分子のスクリーニングのために使用されうる。このような細胞は皮膚癌研究のためのモデル系としても使用できる。このような細胞は、適当な培養装置（プレート、フラスコ、ディッシュ、チューブ、パウチ等）において、適当な培養培地、例えばＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ、ＨＡＭ等内に維持することができる。
【０１０９】
本発明の更なる局面および利点は、下記の実験の部に開示されるであろう。これらは説明しているものとみなされるべきであり、本願の範囲を限定するものではない。
【０１１０】
実験の部
物質および方法
１．ＲＮＡ抽出およびｃＤＮＡ合成
全ＲＮＡをメラノーマの異なる段階のメラノーマを有する７０人の患者からの凍結させた皮膚組織および正常な母斑組織から単離した。全ＲＮＡ１μgを使用して、供給者の教示に従ってランダムヘキサマーおよびＳｕｐｅｒｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素（Invitrogen）を使用してｃＤＮＡを合成した。
【０１１１】
２．リアルタイム半定量的ＲＴ−ＰＣＲ
プライマーの異なる組み合わせを使用してＢＣＳＣ−１の異なるエキソンについてｃＤＮＡを増幅した。アンプリコンは、可能な場合にはエキソン境界にわたって設計されそして、配列はＢＬＡＳＴによりヒトゲノムに対してアライメントされて、それらが試験されるべき遺伝子に対して特異的であることを確実にする。使用されたプライマーの配列は、表１に示される。各設計の有効性は、ｃＤＮＡの逐次希釈により試験された。オリゴヌクレオチドＰＣＲ反応（１０ul容積）は、希釈されたｃＤＮＡ、２×ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Applied Biosystem）、３００nMのフォアードプライマーおよびリバースプライマーを含有していた。ＰＣＲを、下記のパラメーター：５０℃で２分間、９５℃で１０分間、および４０サイクルの９５℃１５秒−６０℃１分、によりＳＤＳ７９００ＨＴ機器（Applied Biosystems）で行った。各反応を３８４ウエルプレートで６回反復して行った。生のＣｔ値（raw Ct values）はＳＤＳ２．２（Applied Biosystems） で得られた。４つの異なるハウスキーピング遺伝子を、ＧｅｎＮｏｒｍソフトウエアで行われる正規化のために使用した。相対的発現を、正常な組織（良性母斑）における平均発現と比較して腫瘍における発現の比として計算した。
【０１１２】
下記はＢＣＳＣ−１研究に使用されたオリゴヌクレオチドである。
【０１１３】
【表２】
【０１１４】
３．ＢＣＳＣ−１をコードするレンチウイルスベクターの構築および作製
ＨＡタンパク質配列でタグ付けされたＢＣＳＣ−１のアイソフォームＦの完全なコード配列を、２つの異なるレンチウイルスベクター（D.Trono, EPFL, Epalinges, Switzerlandからの寄贈品）に挿入しそしてＰＧＫ ＩＲＥＳ ＮｅｏおよびＰＷＩＲ ＧＦＰプラスミドから改変した（Naldini et al., 1996; Salmon et al., 2000）。２９３Ｔ細胞系およびＨｅｌａ細胞系を、１０％ＦＣＳを補充されたダルベッコの改変イーグル培地で培養した。標準プロトコールに従って２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクションにより、組換えレンチウイルスを産生した。簡単に言えば、サブコンフルーエントな（subconfluent）２９３Ｔ細胞を、リン酸カルシウム沈殿により、プラスミドベクター（ＰＧＫ ＢＣＳＣ Ｉｒｅｓ Ｎｅｏ／ＰＷＩＲ ＢＣＳＣ ＧＦＰ）２０μg、ｐＣＭＶ−デルタＲ８．９１、１５μgおよびｐＭＤ２Ｇ−ＶＳＶＧ５μgでコトランスフェクションした。１６時間後に、培地を変え、そして組換えレンチウイルスベクターを２４時間後に回収した。すべての試験ＦＡＣＳ、ウエスタンブロットおよび細胞トランスダクションは以前に記載されたのと同様であった（Arrighi et al., 2004）。
【０１１５】
Ｂ−実施例
実施例１−ＢＣＳＣ−１発現が皮膚癌において変化しているということの同定
遺伝子プロファイリング技術ＤＡＴＡＳ（選択的スプライシングによる転写物のディファレンシャル解析（Differential Analysis of Transcripts with Alternative Splicing）（Schweighoffer et al., 2000））は、２つの条件間でディファレンシャルに発現される選択的にスプライシングされた配列のライブラリーの単離を可能とし、該ライブラリーは次いでアレイを構築するためまたはターゲット遺伝子を単離するために使用されうる。
【０１１６】
ＤＡＴＡＳは、２つの異なる集団（良性母斑対転移メラノーマ）からの全ＲＮＡを抽出し、次いでメッセンジャーＲＮＡを単離する（Dynabeads oligodT-Dynalを使用して）ことにより達成される。ビオチニル化オリゴヌクレオチドｄＴを使用してｍＲＮＡに対して逆転写を行って、第１鎖ｃＤＮＡを発生させる。１つの集団からのｍＲＮＡと他の集団からのｃＤＮＡとのクロスハイブリダイゼーションは、ヘテロ二本鎖（heteroduplex）を生じさせ、これをストレプトアビジンコーティングされたビーズを使用して単離する。ＲＮａｓｅＨ処置を使用して、ヘテロ二本鎖におけるｃＤＮＡにハイブリダイゼーションしないｍＲＮＡのループを開放する。選択的にスプライシングされた配列をコードするこれらのｍＲＮＡループを５つの縮重プライマーによるＲＴ−ＰＣＲに付し、次いでＡＴクローニングベクター（TOPO, Incitrogen）においてＰＣＲ産物をクローニングする。すべてのクローンにおけるｃＤＮＡインサートは、Ｔ７プライマーを使用するＰＣＲにより増幅される。最終の結果は、所与の条件に対して独特の選択的にスプライシングされたｍＲＮＡ配列のライブラリーである。配列決定の後にＤＡＴＡＳクローンをバイオインフォマチック解析に付してそれらの元の遺伝子を同定する。これは、高い正確度でもって、あるタイプのスプライシング事象（エキソンスキッピング、イントロン保持、新規なエキソンの存在、選択的スプライシング部位使用）の解析を可能とする。
【０１１７】
本発明者等は、良性母斑を提示している健康な患者の集団および転移メラノーマに罹患している患者の集団から得られた組織に関してＤＡＴＡＳプロファイリングアッセイを行った。本発明者等は、良性母斑グループからの１１人の患者および転移メラノーマグループからの１０人の患者を使用して組織に関するＤＡＴＡＳライブラリーを構築した。８０μgの全ＲＮＡのプールが、各集団について利用可能であり、それからｍＲＮＡ １．６μgを抽出した：８００ngはcDNA合成のために使用されそして８００ngはｍＲＮＡとして保持された。すべてのＲＮＡ組織サンプルの質および量は、Agilant Bioanalyserを使用して決定された。良好な品質の全ＲＮＡサンプルのみがＤＡＴＡＳのために使用された。
【０１１８】
総計７５５のクローンが組織ＲＮＡに関するＤＡＴＡＳから得られた。クローンの約２５％は、状態ｍＲＮＡ転移メラノーマ／ｃＤＮＡ良性母斑から得られ、クローンの残りの７５％は状態ｍＲＮＡ良性母斑／ｃＤＮＡ転移メラノーマから得られた。インサートの平均サイズは、３００ｂｐと５００ｂｐの間にある。配列決定の後に、個々のクローンを前記のとおりにプロセシングしそして解析した。配列決定された７５５クローンの内、２１７フラグメントが非重複性でありそして未知の遺伝子配列を含有していた。
【０１１９】
本発明者等がＤＡＴＡＳ解析から得た２１７クローンから、本発明者等は、潜在的に関心のある性質を有するそれらの約１０を選択しそしてメラノーマ細胞性病変からの生検から抽出されたＲＮＡに関するリアルタイム半定量的ＲＴ−ＰＣＲを行った。この第２スクリーンから、本発明者等は潜在的に興味深い候補としてＢＣＳＣ−１を同定した。
【０１２０】
実施例２：ＢＣＳＣ−１発現はメラノーマ患者においてダウンレギュレーションされる
ＢＣＳＣ−１の遺伝子発現を、良性母斑（ネガティブコントロール）および異なる段階の着色した皮膚病変の生検を含む総計７０人の患者の生検から抽出されたＲＮＡのリアルタイム半定量的ＲＴ−ＰＣＲにより決定した。結果は、転移メラノーマを有するすべての患者は、良性母斑サンプルにおけるＢＣＳＣの平均発現と比較して有意なより低い発現を有することを示した（図２）。ある転移生検において、ＢＣＳＣの発現は良性母斑の平均発現の値より２０倍低い値に達する。異形母斑の生検は、良性母斑より高いＢＣＳＣの発現を示し、そして原発性メラノーマおよびリンパ節からの生検の両方共良性母斑よりも類似したＢＣＳＣの発現を示した。
【０１２１】
実施例３：ＢＣＳＣ−１の長いアイソフォームはメラノーマにおいて選択的にダウンレギュレーションされる
７つの異なるアイソフォームがＢＣＳＣ−１遺伝子について記載された（図３Ａ参照）。本発明者等は、プライマーの異なる組み合わせを使用してＢＣＳＣ−１発現の更に特異的な解析を行って、どのアイソフォームがダウンレギュレーションされたかを決定した。結果は、同じタンパク質をコードするより長いアイソフォームｃおよびｆが、メラノーマ患者において選択的にダウンレギュレーションされることを示した（図３Ｂ）。
【０１２２】
実施例４：ＢＣＳＣ−１発現は、メラノーマ患者およびメラノーマ細胞系においてダウンレギュレーションされる
先の結果を確かめるために、皮膚病変からの生検のより大きいコホートにおいて新たなリアルタイムＰＣＲ実験を行った。先の結果と一致して、転移病変を有するすべての患者は、健康なドナーにおける平均発現と比較してＢＣＳＣ−１のより低い発現を有していた（図４Ａ）。
更に、メラノーマ細胞のいくつかの細胞系を、ＢＣＳＣ−１の発現について試験した（図４Ｂ）。結果は、すべてのメラノーマ細胞系が健康なドナーより有意に低い発現を有することを示した。ＳＫ−Ｍｅｌ２３（Ｌ１）などのいくらかの細胞系において、ＢＣＳＣ−１の発現は検出できず、そして試験された原発性メラノーマの２つの細胞系のみが良性母斑よりも類似したＢＣＳＣ−１の発現を示す。
【０１２３】
実施例５：ＢＣＳＣ−１の異所発現は、メラノーマ細胞増殖を減少させる
ＰＧＫ ＢＣＳＣ Ｉｒｅｓ ＮｅｏまたはＰＷＩＲ ＢＣＳＣ ＧＦＰベクターを使用してＳＫ−Ｍｅｌ２３およびＨｅｌａ細胞をトランスダクションしてＢＣＳＣ−１の発現を誘導した。更に、対応する空のベクターでトランスダクションされた細胞をネガティブコントロールとして使用した。
【０１２４】
結果は、メラノーマ細胞系ＳＫ−Ｍｅｌ２３におけるＢＣＳＣ−１の異所発現は、細胞の増殖を顕著に減少させることを示した（図５）。ＢＣＳＣ−１の発現は、抗ＨＡ抗体を使用してウエスタンブロットおよびリアルタイムＰＣＲ（図６）により確かめた。ＢＣＳＣ−１の異所発現のこの効果はＨｅｌａなどの他の非メラノーマ細胞系においては観察されなかった。
【０１２５】
実施例６：ＢＣＳＣ−１の異所発現は、メラノーマ細胞増殖を妨害する
メラノーマ細胞系をレンチベクターでトランスダクションしてＢＣＳＣ−１遺伝子の長いアイソフォーム（Ｉｓｏ Ｆ）の異所発現を誘導した。図７に示された結果は、トランスダクションされた転移メラノーマ細胞ＭｅｗｏおよびＳＫ２３（図７Ａ）および原発性メラノーマ細胞Ｍｅ２５７（図７Ｂ）は、ネガティブコントロールおよび空のベクターまたはＢＣＳＣ−１の短いアイソフォーム（Ｉｓｏ Ａ）でトランスダクションされた細胞と比較して増殖を停止または顕著に減少させることを示す。この効果は、空のベクターまたはＢＣＳＣ−１の短いアイソフォームでトランスダクションされた細胞においては観察されなかった。
【０１２６】
実施例７：ＢＣＳＣ−１は、細胞サイクルのＧ２−Ｍ相においてメラノーマ細胞を妨害する
本発明者等は、ＢＣＳＣ−１の抗増殖効果は、トランスダクションされた細胞の細胞サイクルの妨害によるものでありうるかどうかを調べた。ＢｒｄＵおよび７−ＡＡＤ染色を使用して、本発明者等は、細胞サイクルのＧ０／Ｇ１（Ｒ３）、Ｓ（Ｒ４）、Ｇ２−Ｍ（Ｒ５）相における細胞の百分率およびアポトーシス細胞（Ｒ６）の百分率を決定することができた。ＦＡＣＳプロフィルは、図８Ａに示されそして百分率値は図８Ｂに示される。結果は、ＢＣＳＣ−１の長いアイソフォーム（ｉｓｏ Ｆ）でトランスダクションされた細胞はＧ２−Ｍ相において妨害することを示す。この効果は、トランスダクションされていない細胞および空のベクターまたはＢＣＳＣ−１の短いアイソフォーム（ｉｓｏ Ａ）でトランスダクションされた細胞においては観察されず、その場合に細胞は細胞サイクルのＧ０／Ｇ１およびＳ相に主として分布している。
【０１２７】
実施例８：ＢＣＳＣ−１をコードするＨｅｌａは、細胞サイクルのＧ２およびＭ相において阻止される
本発明者等は、ＤＡＰＩおよびチューブリン抗体による免疫蛍光染色を行って、Ｇ２−Ｍのどの段階でＢＣＳＣ−１の異所発現により誘導される細胞サイクルの妨害が生じるかを決定した。本発明者等は、トランスダクションされていない細胞または空のベクターもしくはＢＣＳＣ−１の短いアイソフォームでトランスダクションされた細胞において、クロマチンの凝縮を伴うおよび有糸分裂の異なる相にある細胞の高い百分率の存在を観察した（図９Ａ）。しかしながら、本発明者等は、細胞がＢＣＳＣ−１の長いアイソフォームでトランスダクションされたとき有糸分裂における細胞を観察しなかった（図９Ｂ）。本発明者等は、ＢＣＳＣ−１の異所発現が細胞サイクルのＧ２およびＭ相の間で妨害を誘導し、細胞における有糸分裂を回避すると結論付けることができる。
【０１２８】
実施例９：ＢＣＳＣ−１は転移メラノーマのマウスモデルにおいて肺転移の数を減少させる
ＢＣＳＣ−１のインビボ効果を調べるために、本発明者等は、空のベクターまたは長いアイソフォームＢＣＳＣ−１ベクター（１０４〜１０７細胞について約５００ngのウイルス粒子）でトランスダクションされたＢ１６メラノーマ細胞を静脈内に注入した。１５日後、これらの細胞は、肺において転移を生じ、そして転移は数えることができる（図１０Ａ）。空のベクターでトランスダクションされたＢ１６を注入されたマウス（ｎ＝１０）または長いＢＣＳＣ−１ベクターでトランスダクションされたＢ１６を注入されたマウス（ｎ＝６）からの肺による転移の数は図１０Ｂに示される。本発明者等は、空のトランスダクションされた細胞を注入されたマウスと比較して、ＢＣＳＣ−１でトランスダクションされた細胞を注入されたマウスにおける肺転移の数の減少を観察した。
【０１２９】
ＢＣＳＣ−１のタンパク質配列（配列番号１３）
【表３】
ＢＣＳＣ−１のｃＤＮＡ配列（ＮＭ ０１４６２２）−配列番号１４
【表４】
【０１３０】
【表５】
【図面の簡単な説明】
【０１３１】
【図１】着色した皮膚病変の進行モデルを示す。
【図２】ＢＣＳＣ−１発現はメラノーマ患者においてダウンレギュレーションされる。良性母斑またはメラノーマ皮膚病変を有する患者からの皮膚生検におけるＢＣＳＣ−１遺伝子のリアルタイムＰＣＲによるＲＮＡ発現。ゼロ値は、良性母斑を有する患者（健康なドナー）におけるこの遺伝子の平均発現を表す。転移メラノーマを有するすべての患者は、健康なドナーの平均発現値と比較してより低い発現（２０倍以下低い）を示す。
【図３Ａ】ＢＣＳＣ−１の長いアイソフォームは、メラノーマ患者において選択的にダウンレギュレーションされる。ＢＣＳＣ−１遺伝子のいくつかのアイソフォームが記載されている。異なるエキソンのリアルタイムＰＣＲ解析は、長いアイソフォームに専ら存在するエキソン（エキソン１３〜１８）は、メラノーマ患者において減少したエキソンであることを示す。
【図３Ｂ】ＢＣＳＣ−１の長いアイソフォームは、メラノーマ患者において選択的にダウンレギュレーションされる。ＢＣＳＣ−１遺伝子のいくつかのアイソフォームが記載されている。異なるエキソンのリアルタイムＰＣＲ解析は、長いアイソフォームに専ら存在するエキソン（エキソン１３〜１８）は、メラノーマ患者において減少したエキソンであることを示す。
【図４Ａ】ＢＣＳＣ−１発現は、メラノーマ患者およびメラノーマ細胞系においてダウンレギュレーションされる。結果は、患者のより大きいコホートにおいておよびメラノーマ細胞系においても確かめられた。ＢＣＳＣ−１遺伝子のより長いアイソフォームの発現はメラノーマ患者およびメラノーマ細胞系において顕著に減少する。
【図４Ｂ】ＢＣＳＣ−１発現は、メラノーマ患者およびメラノーマ細胞系においてダウンレギュレーションされる。結果は、患者のより大きいコホートにおいておよびメラノーマ細胞系においても確かめられた。ＢＣＳＣ−１遺伝子のより長いアイソフォームの発現はメラノーマ患者およびメラノーマ細胞系において顕著に減少する。
【図５】ＢＣＳＣ−１の異所発現は、メラノーマ細胞増殖を減少させる。メラノーマ細胞系は、ＢＣＳＣ−１をコードするレンチベクターでトランスダクションされた。ＢＣＳＣ−１を発現するメラノーマ細胞は、ネガティブコントロールと比較してそれらの増殖を停止するかまたは顕著に減少させる。この効果は、やはりＢＣＳＣベクターでトランスダクションされた非メラノーマ細胞系（Ｈｅｌａ）においては観察されない。
【図６】ＢＣＳＣ−１の異所発現は、ウエスタンブロットおよびリアルタイムＰＣＲにより確認される。（左）ＢＣＳＣ−１タンパク質の産生は、１２日目に、ＢＣＳＣ−１をコードするレンチウイルスベクターの増加する用量（２および２０μl）でトランスダクションされたＳＫ−Ｍｅｌ２３細胞において抗ＨＡ抗体を使用するウエスタンブロットにより確認されるが、空のベクター（Ｃ−）でトランスダクションされた細胞においては確認されない。ＢＣＳＣ−１の長いアイソフォームおよび短いアイソフォームの両ベクターでトランスフェクションされた２９３Ｔ細胞をポジティブコントロールとして使用して、やはり抗ＨＡ抗体によりＢＣＳＣ−１を検出する。（右）リアルタイムＰＣＲは、ＳＫ−Ｍｅｌ２３細胞が、トランスダクションの前およびそれらが空のベクターでトランスダクションされるとき８日目に、ＢＣＳＣ−１の検出可能なレベルを発現しないことを示した。しかしながら、ＢＣＳＣ−１ベクターでトランスダクションされたＳＫ−Ｍｅｌ２３細胞は高いレベルのＢＣＳＣ−１ｍＲＮＡを発現する。
【図７】ＢＣＳＣ−１の異所発現はメラノーマ細胞系増殖を妨害する。
【図８】ＢＣＳＣ−１は、細胞サイクルのＧ２−Ｍ相においてメラノーマ細胞を妨害する。
【図９】ＢＣＳＣ−１をコードするＨｅｌａは、細胞サイクルのＧ２およびＭ相において阻止される。Ａ）ＢＣＳＣ−１の短いアイソフォームでトランスダクションされたＨｅｌａ細胞；Ｂ）ＢＣＳＣ−１の長いアイソフォームでトランスダクションされたＨｅｌａ細胞。
【図１０】ＢＣＳＣ−１は、転移メラノーマのマウスモデルにおいて肺転移の数を減少させる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メラノーマおよび皮膚癌の検出および処置のための方法および組成物に関する。更に詳しくは、本発明は、メラノーマおよび皮膚癌細胞においてＢＣＳＣ−１発現が変化しており、これがこのような状態（conditions）のための検出方法およびキットのデザインを可能とする、ということを開示する。本発明は、メラノーマおよび皮膚癌細胞におけるＢＣＳＣ−１の回復または増加する発現は、腫瘍形成性（tumorigenicity）を抑制しそしてメラノーマおよび皮膚癌の処置のための新規なかつ有効なアプローチを表すことも示す。本発明は、メラノーマおよび皮膚癌の存在、段階またはタイプを検出するたためならびにそれらへのいかなる素因も検出するために使用されうる。本発明は、任意の哺乳動物被検体、特にヒト被検体において使用されうる。
【０００２】
メラノーマは、広範囲に及ぶ転移疾患を引き起こす傾向を有する進行性癌である。診断は早期の段階で必須である。何故ならば、今日まで唯一の成功する処置は、まだ皮膚に制限されているときに腫瘍を切除することであるからである。都合の悪いことに、メラノーマは、慣用の化学療法に対して大いに抵抗性であり、そして転移メラノーマに対する新規な処置が緊急に必要とされる。
【０００３】
着色した皮膚病変（pigmented skin lesions）およびメラノーマの遺伝子発現プロファイリングを研究するために、良性の母斑および転移メラノーマの選択的スプライシングの全体的解析を、ＤＡＴＡＳ技術を使用して研究した。良性母斑と転移メラノーマ間の２１７のディファレンシャルに発現されたクローンを含む良性母斑〜転移メラノーマのためのＤＡＴＡＳライブラリーをこの方法により発生させた。アポトーシス、細胞サイクル、代謝等におけるそれらの関与に基づいてメラノーマ進行に関与することができるいくつかのクローンがリアルタイムＰＣＲによりスクリーニングされた。これらの遺伝子の中でも、本発明者等は、ＢＣＳＣ−１（Martin et al. PNAS 2003）が転移メラノーマを有する患者において一貫してダウンレギュレーシヨンされることを確認した。
【０００４】
本発明者等は、更に良性母斑、異形母斑（atypical nevus）、原発性メラノーマ（primary melanoma）または転移メラノーマを有する患者からの７０の皮膚生検のコホートにおいてリアルタイムＰＣＲによりＢＣＳＣ−１の発現を調査した。結果は、ＢＣＳＣ−１発現が健康なドナーと比較してすべてのメラノーマ患者において減少することを示した。これらの結果は、解析されたメラノーマ細胞系およびすべてのメラノーマ患者において確かめられた。
【０００５】
重要なことに、ＢＣＳＣ−１遺伝子がメラノーマ細胞系において異所性に（ectopically）発現されたとき、メラノーマ細胞は、増殖を停止しそしてアポトーシスを受けた。これらの細胞におけるＢＣＳＣタンパク質の発現はウエスタンブロットにより確かめられた。
【０００６】
更に、本発明者等は、インビボ（in vivo）注入されると、ＢＣＳＣ−１は転移メラノーマのマウスモデルにおける肺転移の数を減少させることも示した。
【０００７】
結論として、本発明は、ＢＣＳＣ−１が皮膚癌においてダウンレギュレーションされることおよび該癌細胞におけるＢＣＳＣ−１発現の誘導が腫瘍進行の阻害をもたらすことを示す。これらのデータは、ＢＣＳＣ−１がメラノーマおよび皮膚癌の病原において極めて重大な役割を演じそして新規な予後マーカーおよびメラノーマおよび皮膚癌のための薬物開発のための価値あるターゲットを表すことを示す。
【０００８】
本発明の第１の目的は、被検体におけるメラノーマまたは皮膚癌の存在、段階またはタイプを検出するための方法であって、被検体からのサンプルにおける変化したＢＣＳＣ−１遺伝子発現の存在をインビトロ（in vitro）またはエキソビボ（ex vivo）で検出し、このような変化したＢＣＳＣ−１遺伝子発現の存在は該被検体におけるメラノーマまたは皮膚癌癌の存在、段階またはタイプを示すことを含む方法にある。
【０００９】
この方法の特定の態様に従えば、変化した発現は、上記サンプルにおけるＢＣＳＣ−１遺伝子の減少した発現、なお更に好ましくは該サンプルにおけるＢＣＳＣ−１遺伝子の長いアイソフォームの減少した発現である。
【００１０】
本発明の他の目的は、被検体における癌の存在、段階またはタイプを検出するための方法であって、被検体からのサンプルにおけるＢＣＳＣ−１遺伝子またはタンパク質の長いアイソフォームの（相対的）量をインビトロまたはエキソビボで決定し、このような量が該被検体における癌の存在、段階またはタイプを示すことを含む方法にある。特定の態様においては、決定された量を、コントロールもしくは平均値と比較するかまたはコントロールサンプルにおいて測定された値と比較する。他の態様においては、ＢＣＳＣ−１の長いアイソフォーム／ＢＣＳＣ−１の短いアイソフォームの比が決定され、そしてこのような比の任意の減少は、このような癌の存在を示す。このような方法は、任意の癌、特に充実性癌（solid cancers）を検出するのに使用されうる。
【００１１】
これについて、本発明の他の目的は、被検体における癌の存在、段階またはタイプを検出するための方法であって、ＢＣＳＣ−１の長いアイソフォーム／ＢＣＳＣ−１の短いアイソフォームの比をインビトロまたはエキソビボで決定し、コントロールの状態または参照もしくは平均値と比較してこのような比の減少が、このような癌の存在を示すことを含む方法にある。このような方法は、任意の癌、特に充実性癌を検出するのに使用されうる。
【００１２】
本発明の他の目的は、被検体における癌の存在、段階またはタイプを検出するための方法であって、被検体に由来する流体サンプルにおけるＢＣＳＣ−１タンパク質の（相対的）量をインビトロまたはエキソビボで決定し、このような量は該被検体における癌の存在、段階またはタイプを示すことを含む方法にある。典型的には、ＢＣＳＣ−１タンパク質の長いアイソフォームの（相対的）量を決定し、コントロールもしくは参照値と比較してこのような量の減少は癌の存在を示す。典型的な態様においては、流体サンプルは、全血、血清、血漿、尿等に由来する（例えば希釈、濃縮、精製、分離等により）。このような方法は、任意の癌、特に充実性癌を検出するのに使用されうる。
【００１３】
本発明の更なる目的は、被検体におけるメラノーマおよび皮膚癌の処置の有効性を評価する方法であって、該処置の前および後の被検体からのサンプルにおけるＢＣＳＣ−１遺伝子発現を比較し（インビトロまたはエキソビボ）、増加した発現は処置に対するポジティブな応答を示すことを含む方法にある。
【００１４】
本発明は、メラノーマまたは皮膚癌を処置するための医薬の製造のためのＢＣＳＣ−１タンパク質またはＢＣＳＣ−１タンパク質をコードする核酸の使用、および対応する処置方法にも関する。
【００１５】
本発明は、メラノーマまたは皮膚癌を処置するための医薬組成物の製造のためのＢＣＳＣ−１アゴニストの使用、および対応する処置方法にも関する。
【００１６】
本発明の更なる局面は、メラノーマまたは皮膚癌を処置するための医薬組成物の製造のためのＢＣＳＣ−１遺伝子発現を刺激する化合物の使用、および対応する処置方法にある。
【００１７】
本発明は、メラノーマまたは皮膚癌を処置することを必要としている被検体においてメラノーマまたは皮膚癌を処置する方法であって、有効量の上記した化合物を該被検体に投与することを含む方法にもある。好ましい態様においては、被検体は、変化したＢＣＳＣ−１遺伝子発現を有する。
【００１８】
本発明は、更にメラノーマまたは皮膚癌に対する生物学的に活性な化合物を選択する方法であって、ＢＣＳＣ−１発現または活性を模倣するか（mimic）または刺激する化合物を選択する工程を含む方法に関する。
【００１９】
特定の態様においては、前記方法は、試験化合物を、レポーター構築物を含む組換え宿主細胞と接触させ、該レポーター構築物はＢＣＳＣ−１遺伝子プロモーターのコントロール下のレポーター遺伝子を含んでおり、そしてレポーター遺伝子の発現を刺激する試験化合物を選択することを含む。
【００２０】
皮膚癌は、基底細胞癌、扁平上皮細胞癌、メルケル癌（Merkel carcinoma）、原発性皮膚リンパ腫、および皮膚または関連した表面組織の任意の他の細胞増殖疾患から選ばれうる。
【００２１】
ＢＣＳＣ−１遺伝子発現は、配列決定、選択的ハイブリダイゼーション、選択的増幅および／または特異的リガンド結合によるなどの当技術分野でそれ自体既知の任意の技術により検出されうる。特定の態様においては、本発明は、ＢＣＳＣ−１の長いアイソフォームの検出、または長いアイソフォームと短いアイソフォームの識別または長いアイソフォーム／短いアイソフォームの比の測定を可能とする試薬および／または技術を使用する。
【００２２】
本発明の更なる局面は、ＢＣＳＣ−１の長いアイソフォームの（特異的）増幅を可能とするかまたは長いアイソフォームと短いアイソフォームを識別することを可能とする核酸プライマーにある。
【００２３】
本発明の更なる局面は、ＢＣＳＣ−１の長いアイソフォームに（特異的に）ハイブリダイゼーションするかまたは長いアイソフォームと短いアイソフォームを識別することを可能とする核酸プローブにある。
【００２４】
本発明の更なる局面は、ＢＣＳＣ−１タンパク質の長いアイソフォームに（特異的に）結合するかまたは長いアイソフォームと短いアイソフォームを識別することを可能とする抗体（その誘導体およびハイブリドーマを産生する誘導体を含む）にある。
【００２５】
本発明は、更に、上記したプライマー、プローブまたは抗体を含むキットに関する。このようなキットは、容器または支持体、および／または増幅、ハイブリダイゼーションもしくは結合反応を行うための試薬を含むことができる。
【００２６】
本発明の特定の局面は、ＢＣＳＣ−１の少なくとも1つの長いアイソフォームを特異的に検出するようにデザインされる、プライマー、プローブおよび／または抗体を含む物質の組成物にある。
【００２７】
発明の詳細な説明
メラノーマの発生は増加している。それは広範囲に及び疾患を引き起こす傾向を有する進行性の癌である。全体的な遺伝子発現の研究に基づく新規な方法が、メラノーマ発癌性の基礎をなす事象を理解するために必要である。
【００２８】
図１に開示されたとおり、良性母斑（左）、形成異常母斑（dysplastic naevus）（中心）および悪性メラノーマ（右）間の移行を、形態学技術を使用して解析することができる。しかしながら、これらの移行を支配する分子事象については部分的にしか理解されていない。
【００２９】
良性母斑とメラノーマ間の移行を支配する分子事象を同定するために、本発明者等は、ＤＡＴＳ（選択的スプライシングによる転写物のディファレンシャル解析）と呼ばれる遺伝子プロファイリング技術を使用して着色したメラノーマにおける選択的スプライシングを研究することを選んだ。この全体的な遺伝子発現解析によって、本発明者等は、腫瘍関連スプライシング事象から生じる新規な配列を導いた。良性母斑（ネガティブコントロール）および異なる段階の着色した皮膚病変の生検を含む総計７０人の患者の生検から抽出されたＲＮＡのリアルタイム半定量的ＲＴ−ＰＣＲを使用して、本発明者等は、転移疾患を有する患者からのＢＣＳＣ−１は選択的にダウンレギュレーションされることを示すことができた。
【００３０】
更に、本発明者等は、ＢＣＳＣ−１の長いアイソフォームは、メラノーマにおいて選択的にダウンレギュレーションされ、一方短いアイソフォームは実質的に影響を受けないということを確かめることができた。
【００３１】
更に、メラノーマ細胞系においてＨＡでタグ付けされたＢＣＳＣ−１をコードするレンチウイルスベクターからの異所発現は、これらの細胞の増殖の強い減少を誘導した。
【００３２】
総合すると、本発明者等の結果は、メラノーマおよび皮膚癌において選択的にダウンレギュレーションされる新規な遺伝子（ＢＣＳＣ−１）を同定する。この遺伝子の選択された「長い」アイソフォーム（ｃ．ｆ）のみが転移メラノーマにおいてダウンレギュレーションされたが、「短い」アイソフォームは影響を受けず、転移腫瘍における紛失しているアイソフォームを検出するためのより特異的な診断ツールを開発する可能性を開く。最後に、異所発現は、転移メラノーマ細胞系の細胞増殖を遅くしたが、これはＢＣＳＣ−１が転移疾患進行における機能的な役割を有することを示唆する。
【００３３】
したがって、本発明は、メラノーマおよび皮膚癌の診断および処置のためならびに治療的に活性な薬物のスクリーニングのためにＢＣＳＣ−１遺伝子および対応する発現産物を使用することを提唱する。本発明は、種々の被検体、特に成人および子供を含むヒトにおいて使用することができる。
【００３４】
定義
本発明に関連して、用語「ＢＣＳＣ−１遺伝子」は、コード配列、非コード配列、転写および／または翻訳をコントロールする調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター等）ならびにすべての対応する発現産物、例えばＲＮＡｓ（例えば、ｍＲＮＡｓ）を含む、細胞または生物におけるすべてのＢＣＳＣ−１ヌクレオチド配列を表す。用語「遺伝子」は、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、相補性ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、合成もしくは半合成ＤＮＡを含む任意タイプのコード核酸、ならびに任意の形態の対応するＲＮＡを含むとみなされるべきである。用語遺伝子は、特に組換え核酸、即ち、例えば配列をアセンブリング、切断、ライゲーションまたは増幅することにより人工的に創生された任意の非天然に存在する核酸分子を含む。遺伝子は、一本鎖などの他の形態を意図することができるけれども、典型的には二本鎖である。遺伝子は、種々のソースから得ることができ、そしてＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによりまたは種々の天然のソースからの増幅によるなどの当技術分野で知られている種々の技術に従って得られうる。組換え核酸は、化学合成、遺伝子工学、酵素技術またはその組み合わせを含む慣用の技術により調製されうる。
【００３５】
ＢＣＳＣ−１遺伝子配列は、NM_014622およびNM_198315などの遺伝子バンクに見出されうる。エキソン境界が太字で表わされておりそして開始コドンおよび停止コドンが下線を引かれている配列番号１４も参照されたい。
【００３６】
用語「ＢＣＳＣ−１遺伝子」は、上記した任意のコード配列の任意の変異体、フラグメントまたはアナログを含む。このような変異体は、例えば個体間のアレル変動（例えば多形）、突然変異したアレル、選択的スプライシング形態等による天然に存在する変異体を含む。用語変異体は、他のソースまたは生物からのＢＣＳＣ−１遺伝子配列も含む。変異体は、好ましくは上記したコード配列と実質的に相同性である、即ち、上記したコード配列と少なくとも約６５％、典型的には少なくとも約７５％、好ましくは少なくとも約８５％、さらに好ましくは少なくとも約９５％のヌクレオチド配列同一性を示す。ＢＣＳＣ−１遺伝子の変異体およびアナログは、典型的にはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下に上記した配列（またはその相補性鎖）にハイブリダイゼーションする核酸配列を含む。
【００３７】
典型的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、３０℃以上、好ましくは３５℃以上、更に好ましくは４２℃以上の温度および／または約５００mM未満、好ましくは２００mM未満の塩度を含む。ハイブリダイゼーション条件は、温度、塩度および／またはＳＤＳ、ＳＳＣなどの他の試薬の濃度等を改変することにより当業者により調節されうる。
【００３８】
ＢＣＳＣ−１遺伝子のフラグメントは、上記した配列の少なくとも約８個の連続したヌクレオチド、好ましくは少なくとも約１５、更に好ましくは少なくとも約２０のヌクレオチド、更に好ましくは少なくとも３０のヌクレオチドの任意の部分を表す。フラグメントは、８〜１００のヌクレオチド、好ましくは１５〜１００ヌクレオチド、更に好ましくは２０〜１００ヌクレオチドのすべての可能なヌクレオチド長さを含む。
【００３９】
選択的スプライシングから生じるＢＣＳＣ−１遺伝子のいくつかのアイソフォームが存在する。この点で、ＢＣＳＣ−１の長いアイソフォームおよび短いアイソフォームは、それらが保持しているエキソン（の数）に依存して定義されうる。更に詳しくは、ＢＣＳＣ−１ゲノムＤＮＡは、選択的にスプライシングされうる１８のエキソンを含む。各エキソンの位置は、配列番号１４に示されそして下記の表により要約されており、この表において位置は配列番号１４のｃＤＮＡ配列に関して与えられる。
【００４０】
【表１】
【００４１】
本発明に関連して、長いＢＣＳＣ−１アイソフォームは、エキソン１３〜１８の少なくとも１つのヌクレオチド配列または対応するアミノ酸配列を含むアイソフォームである。短いＢＣＳＣ−１アイソフォームは、エキソン１３〜１８のいずれか１つのヌクレオチド配列または対応するアミノ酸配列を含まないアイソフォームである。長いＢＣＳＣ−１アイソフォームの例は、エキソン１〜１３、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１７または１〜１８のヌクレオチド配列または対応するアミノ酸配列を含む。これに関して、長いアイソフォームは、エキソン１１〜１８のすべてを含有するNM_014622において表わされる。同様に、エキソン８〜１６の欠失を含むがエキソン１８を含有するAY366504およびAY366507において表されたアイソフォームは、本発明の文脈では、長いアイソフォームである。長いアイソフォームの他の例はAY366508に開示されている。
【００４２】
ＢＣＳＣ−１タンパク質は、上記したＢＣＳＣ−１遺伝子によりコードされている任意のタンパク質またはポリペプチドを表す。用語「ポリペプチド」は、アミノ酸のストレッチを含む任意の分子を指す。この用語は、ペプチドおよびタンパク質などの種々の長さの分子を含む。ポリペプチドは、グリコシル化および／またはアセチル化および／または化学反応またはカップリングなどにより改変され得、そして１つまたは複数の非天然または合成アミノ酸を含有することができる。ＢＣＳＣ−１ポリペプチドの特定の例は、NM_014622またはNM_198315において表された配列のすべてまたは一部を含む（配列番号１３参照）。
【００４３】
検出／診断
本発明は、今や被検体におけるＢＣＳＣ−１遺伝子アイソフォームの監視に基づく診断を提供する。本発明に関連して、用語「診断」は、成人または子供における早期段階、前兆段階および後期段階を含む種々の段階での検出、監視、投薬、比較等を含む。診断は、典型的には、予後、発生の素因または危険の評価、最も適切な処置を規定するための被検体の特徴付け（薬理遺伝学）等を含む。
【００４４】
本発明の一般的目的は、被検体における癌の存在、段階またはタイプを検出するための方法であって、被検体からのサンプルにおける変化した長いアイソフォームＢＣＳＣ−１遺伝子発現の存在をインビトロまたはエキソビボで検出し、このような変化した長いアイソフォームＢＣＳＣ−１遺伝子発現の存在が該被検体における癌の存在、段階またはタイプを示すことを含む方法にある。
【００４５】
本発明の更なる一般的局面は、被検体における癌、特に充実性癌を検出する方法であって、被検体からのサンプルにおけるＢＣＳＣ−１の長いアイソフォームを検出し、その減少した発現は癌の存在、段階またはタイプを示すことを含む方法である。
【００４６】
本発明の特定の目的は、被検体におけるメラノーマまたは皮膚癌の存在、段階またはタイプを検出するための方法であって、被検体からのサンプルにおける変化したＢＣＳＣ−１遺伝子発現の存在をインビトロまたはエキソビボで検出し、このような変化したＢＣＳＣ−１遺伝子発現の存在が該被検体におけるメラノーマまたは皮膚癌の存在、段階またはタイプを示すことを含む方法にある。
【００４７】
本発明の更なる目的は、被検体からのサンプルを提供する第１工程を含む上記した方法である。
【００４８】
処置もしくは薬物に対する応答または処置もしくは薬物に対する副作用を解析しそして予測する診断は、個体が特定の処置薬物により処置されるべきであるかどうかを決定するのに使用されうる。例えば、個体が特定の薬物による処置にポジティブに応答する可能性を診断が示すならば、その薬物を個体に投与することができる。反対に、個体が特定の薬物による処置にネガティブに応答しそうであることを診断が示すならば、別のコースの処置を処方することができる。ネガティブな応答は有効な応答の不存在または毒性副作用の存在として定義されうる。
【００４９】
変化したＢＣＳＣ−１発現は、例えばＲＮＡまたはポリペプチドのレベルで、当技術分野でそれ自体既知の任意の技術により決定されうる。
【００５０】
本発明に開示されたとおり、ＢＣＳＣ−１発現は、メラノーマまたは皮膚癌細胞において変化する。更に詳しくは、ＢＣＳＣ−１の発現レベルは、非癌性皮膚細胞または平均値と比較して、メラノーマまたは皮膚癌細胞において減少する。なお更に詳しくは、長いＢＣＳＣ−１アイソフォームの発現レベルは、非癌性細胞または平均値と比較して、癌細胞において減少する。したがって、好ましい態様においては、本発明の方法は、ＢＣＳＣ−１遺伝子、特にその長いアイソフォームの発現レベルの減少を検出する工程を含む。典型的な態様においては、この方法は、サンプル中のＢＣＳＣ−１ＲＮＡまたはポリペプチド種、特にサンプル中のＢＣＳＣ−１ＲＮＡまたはポリペプチドの長いアイソフォームの（相対的）量を決定する段階と、該量を、参照もしくは平均値またはコントロール組織（例えば、非癌性細胞）において測定した値と比較する工程を含み、より低い値は癌を示す。更なる特定の態様においては、この方法は、それぞれ、長いＢＣＳＣ−１ＲＮＡまたはタンパク質アイソフォーム／短いＢＣＳＣ−１ＲＮＡまたはタンパク質アイソフォームの比を決定することを含み、コントロール／参照値またはサンプルに比較してこのような比の任意の変異は癌の存在を示す。いくつかの長いアイソフォームの（相対的）量を決定することができるけれども、１つのみの長いアイソフォームの量を測定するかまたは１つの長いアイソフォーム／１つの短いアイソフォームの比を決定すれば十分である。このような測定は、例えば対応するプローブもしくはプライマーを使用するエキソン１３、１４、１５、１６、１７もしくは１８の検出または下記するとおりその特異的リガンドを使用するコードされているアミノ酸残基の検出に基づくことができる。
【００５１】
更に、本発明は、ＢＣＳＣ−１遺伝子のまたはポリペプチド内の癌関連の構造的変化の検出も包含する。ＢＣＳＣ−１遺伝子またはポリペプチドのこのような変化は、単独のまたは種々の組み合わせにおける、コード領域および／または非コード領域における任意の形態の突然変異、欠失、転位および／または挿入であることができる。更に詳しくは、突然変異は、点突然変異を含む。欠失は、遺伝子のコード部分または非コード部分における2つ以上の残基の任意の領域、例えば２残基から全体の遺伝子までの領域を包含することができる。より大きい欠失も起こりうるけれども、典型的な欠失は、約50未満の連続した塩基対のドメイン（イントロン）または反復配列またはフラグメントなどのより小さい領域に影響を与える。挿入は、遺伝子のコード部分または非コード部分におけ1つまたは複数の残基の付加を包含することができる。挿入は、典型的には、遺伝子における１〜５０塩基対の付加を含むことができる。転位は、配列の反転を含む。ＢＣＳＣ−１の構造的変化は、停止コドンの創生、フレームシフト突然変異、アミノ酸置換、特定のＲＮＡスプライシングもしくはプロセシング、産物不安定性、トランケーションされたポリペプチド産生等をもたらすことができる。この変化は、変化した、機能、安定性、ターゲティングまたは構造を伴うＢＣＳＣ−１ポリペプチドの産生をもたらすことができる。
【００５２】
配列決定、ハイブリダイゼーション、増幅および／または特異的リガンド（抗体など）への結合を含む当技術分野で知られている種々の技術を、変化したＢＣＳＣ−１発現を検出または定量するのに使用することができる。他の適当な方法は、アレル特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、アレル特異的増幅、サザーンブロット（ＤＮＡｓについて）、ノーザンブロット（ＲＮＡｓについて）、一本鎖コンフォメーション解析（ＳＳＣＡ）、ＰＦＧＥ、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、ゲル移動、クランプド変性ゲル電気泳動（clamped denaturing gel electrophoresis）、ヘテロ二本鎖解析、ＲＮａｓｅ保護、化学的ミスマッチ開裂、ＦＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）および免疫酵素アッセイ（ＩＥＭＡ）を含む。
【００５３】
増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）および核酸配列をベースとする増幅（ＮＡＳＢＡ）によるなどの当技術分野で知られている種々の技術に従って行うことができる。これらの技術は、市販の試薬およびプロトコールを使用して行うことができる。好ましい技術は、アレル特異的ＰＣＲまたはＰＣＲ−ＳＳＣＰを使用する。増幅は、通常反応を開始するために特異的核酸プライマーの使用を必要とする。
【００５４】
ＢＣＳＣ−１遺伝子またはＲＮＡからの配列を増幅するために有用な核酸プライマーは、ＢＣＳＣ−１遺伝子またはＲＮＡの一部に対して相補性でありそして特異的にハイブリダイゼーションする。ＢＣＳＣ−１遺伝子またはＲＮＡのすべてまたは一部に対して使用されうるプライマーは、ＢＣＳＣ−１自体の配列に基づいてデザインされうる。
【００５５】
本発明で使用するための最も好ましいプライマーは、ＢＣＳＣ−１の長いアイソフォームの増幅を可能とする、即ち、ＢＣＳＣ−１遺伝子またはＲＮＡエキキソン１３〜１８のいずれか１つ内に位置した配列に対して相補性でありそして特異的にハイブリダイゼーションする配列を含有する。
【００５６】
これに関して、本発明は、核酸プライマーであって、ＢＣＳＣ−１遺伝子またはＲＮＡのエキソン１３〜１８のいずれか１つ内に位置した配列に対して相補性でありそして特異的にハイブリダイゼーションする核酸プライマーにも関する。このようなプライマーの使用は、サンプル中のＢＣＳＣ−１またはＲＮＡの長いアイソフォームの検出を可能とする。
【００５７】
本発明の典型的なプライマーは、長さ約５〜６０ヌクレオチド、更に好ましくは長さが約８〜約２５ヌクレオチドの一本鎖核酸分子である。配列は、ＢＣＳＣ−１遺伝子の配列から直接誘導されうる。高い特異性を確実にするために、完全な相補性が好ましい。しかしながら、あるミスマッチは許容されうる。
【００５８】
このようなプライマーの特定の例は、実験の部において表１に開示されている（配列番号１〜１２）。
【００５９】
本発明は、被検体における癌の存在もしくは癌への素因を検出する方法または癌の処置に対する被検体の応答を評価する方法における上記した核酸プライマーまたは核酸プライマーの対の使用にも関する。
【００６０】
他の態様において、検出は選択的ハイブリダイゼーションを使用する技術により行われる。
【００６１】
特定の検出技術は、ＢＣＳＣ−１遺伝子またはＲＮＡに対して特異的な核酸プローブの使用、次いでハイブリッドの存在および／または（相対的）量の検出を含む。プローブは、懸濁しているかまたは基材もしくは支持体に固定化される（核酸アレイまたはチップ技術におけるように）ことができる。プローブは、典型的にはハイブリッドの検出を容易にするために標識される。
【００６２】
これについて、本発明の特定の態様は、被検体からのサンプルを、ＢＣＳＣ−１の長いアイソフォームに対して特異的な核酸プローブと接触させ、そしてハイブリッドの形成を評価することを含む。特定の態様においては、この方法は、サンプルを、それぞれ、ＢＣＳＣ−１の種々の長いアイソフォームに対して特異的なプローブの組と、同時に接触させることを含む。
【００６３】
本発明の状況において、プローブは、ＢＣＳＣ−１遺伝子もしくはＲＮＡ（のターゲット部分）に対して相補性でありそしてＢＣＳＣ−１もしくはＲＮＡ（のターゲット部分）と特異的ハイブリダイゼーションすることができそしてサンプル中のその存在もしくはその（相対的）量を検出するために適当なポリヌクレオチド配列を指す。プローブは、好ましくはＢＣＳＣ−１またはＲＮＡの配列に対して完全に相補性である。プローブは、典型的には、長さが８〜１０００ヌクレオチド、例えば１０〜８００、更に好ましくは１５〜７００、典型的には２０〜５００の一本鎖核酸を含む。より長いプローブも使用することができることは理解されるべきである。本発明の好ましいプローブは、ＢＣＳＣ−１遺伝子またはＲＮＡのエキソン１３〜１８のいずれか１つ内に含有されている領域に特異的にハイブリダイゼーションすることができる長さが８〜５００ヌクレオチドの一本鎖核酸分子である。
【００６４】
特異性は、ターゲット配列に対するハイブリダイゼーションが、非特異的ハイブリダイゼーションにより発生されるシグナルとは区別されうる特異的シグナルを発生することを示す。完全に相補性の配列は、本発明に従うプローブをデザインするのに好ましい。しかしながら、ある程度のミスマッチは、特異的シグナルが非特異的ハイブリダイゼーションから識別されうる限り許容されうることは理解されるべきである。
【００６５】
プローブの配列は、本願で提供されたＢＣＳＣ−１およびＲＮＡの配列に由来することができる。プローブのヌクレオチド置換および化学的改変を行うことができる。このような化学的改変は、ハイブリッドの安定性を増加させるため（例えば、インターカレーティング基）またはプローブを標識するために行うことができる。標識の典型的な例は、放射能、蛍光、ルミネセンス、酵素標識等を含むがこれらに限定されない。
【００６６】
本発明は、被検体における癌の進行の存在、タイプまたは段階を検出する方法または癌処置に対する被検体の応答を評価する方法において上記した核酸プローブの使用にも関する。
【００６７】
本発明は、上記したプローブを含む核酸チップにも関する。このようなチップは、当技術分野で知られた技術によりｉｎ ｓｉｔｕでまたはクローンを堆積することにより作成することができ、そして典型的には（ガラス、ポリマー、金属等）スライドなどのマトリックス上にディスプレイされている核酸のアレイを含む。
【００６８】
上記したとおり、ＢＣＳＣ−１遺伝子発現の変化は、ＢＣＳＣ−１ポリペプチドの存在または（相対的）量を検出することにより検出することもできる。これに関して、本発明の特定の態様は、サンプル（血液、血漿、血清等などの生物学的流体を含むことができる）を、ＢＣＳＣ−１ポリペプチドに対して特異的なリガンドと接触させそして複合体の形成を決定することを含む。
【００６９】
特異的抗体などの異なるタイプのリガンドを使用することができる。特定の態様においては、サンプルをＢＣＳＣ−１ポリペプチドに対して特異的な抗体と接触させそして免疫複合体の形成が決定される。ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）および免疫酵素アッセイ（ＩＥＭＡ）などの免疫複合体を検出するための種々の方法を使用することができる。
【００７０】
本発明の状況において、抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体および実質的に同じ抗原特異性を有するその任意のフラグメントまたは誘導体を表す。フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’２、ＣＤＲ領域等を含む。誘導体は一本鎖抗体、ヒト化抗体、多官能性抗体等を含む。
【００７１】
最も好ましいリガンドは、ＢＣＳＣ−１の長いアイソフォームに対して特異的であり、即ち、エキソン１３〜１８のいずれか１つによりコードされたアミノ酸配列内に含有されたエピトープに結合する。
【００７２】
ＢＣＳＣ−１ポリペプチドに対して特異的な抗体は、ＢＣＳＣ−１ポリペプチドに選択的に結合する抗体を表す。更に詳しくは、それはＢＣＳＣ−１ポリペプチドまたはそのエピトープ含有フラグメントに対して生じた抗体を表す。他の抗原に対する非特異的結合が起こりうるけれども、ターゲットＢＣＳＣ−１ポリペプチドへの結合がより高いアフィニティーで起こりそして非特異的結合から信頼可能に識別されうる。
【００７３】
特定の態様においては、この方法は、被検体からのサンプルをＢＣＳＣ−１ポリペプチドに対して特異的な抗体（でコーティングされた支持体）と接触させそして免疫複合体の存在を決定することを含む。特定の態様においては、サンプルを、異なるＢＣＳＣ−１アイソフォームに対して特異的な種々の抗体（でコーティングされた支持体）と、同時にまたは並行してまたは順次に接触させることができる。
【００７４】
他の特異的態様においては、本発明は、被検体における癌の存在または癌の素因を検出する方法であって、被検体からのサンプル（血液、血漿、血清等などの生物学的流体を含むことができる）をＢＣＳＣ−１ポリペプチドの長いアイソフォームに対して特異的なリガンドとインビトロまたはエキソビボで接触させそして形成された複合体の（相対的）量を決定し、このような量は癌の存在または癌への素因を示すことを含む方法に関する。
【００７５】
本発明は、被検体における癌の存在、段階またはタイプを検出する方法または癌処置に対する被検体の応答を評価する方法におけるリガンド、好ましくは抗体、上記したそのフラグメントまたは誘導体の使用にも関する。
【００７６】
本発明は、被検体からのサンプルにおいてＢＣＳＣ−１遺伝子、ＲＮＡまたはポリペプチドの存在または（相対的）量を検出するための製品および試薬を含む診断キットにも関する。本発明に従う該診断キットは、本発明に記載された任意のプライマー、任意のプライマーの対、任意の核酸プローブ、および／または任意のリガンド、好ましくは抗体を含む。本発明に従う該診断キットは、更にハイブリダイゼーション、増幅または抗原−抗体免疫反応を行うための試薬および／またはプロトコールを含むことができる。
【００７７】
本発明の診断方法は、インビトロ、エキソビボまたはインビボで、好ましくはインビトロまたはエキソビボで行うことができる。それらは、被検体からのサンプルを使用してＢＣＳＣ−１遺伝子発現の任意の変化を評価する。サンプルは、核酸またはポリペプチドを含有する被検体に由来する任意の生物学的サンプルであることができる。このようなサンプルの例は、流体、組織、細胞サンプル、器官、生検等を含む。最も好ましいサンプルは、組織生検、例えば皮膚癌細胞、組織またはサンプルである。サンプルは、慣用の技術に従って採集され得そして診断のために直接使用されるかまたは貯蔵されうる。サンプルは、試験するための核酸またはポリペプチドの利用性を確実にするかまたは改良するために、本方法を行う前に処理されうる。処理は、例えば、溶解（例えば機械的、物理的、化学的等）、遠心等を含む。また、核酸および／またはポリペプチドは、慣用の技術により予備精製または濃縮されることができおよび／または複雑さを減少させることができる。核酸およびポリペプチドを、酵素、または他の化学的もしくは物理的処理により処理してそのフラグメントを産生させることもできる。特許請求の範囲に記載の方法の高い感度を考慮すると、非常に少量のサンプルがアッセイを行うのに十分である。
【００７８】
示されたとおり、サンプルを、好ましくは、プローブ、プライマーまたはリガンドなどの試薬と接触させて、ＢＣＳＣ−１遺伝子またはＲＮＡまたはポリペプチドの存在および／または（相対的）量を評価する。接触は、プレート、チューブ、ウエル、ガラス等などの任意の適当な装置において行うことができる。特定の態様においては、接触は、核酸７アレイもしくは特異的リガンドアレイなどの試薬でコーティングされた基材上で行われる。基材は、固体または半固体基材、例えばガラス、プラスチック、ナイロン、紙、金属、ポリマー等を含む任意の支持体であることができる。基材は、スライド、膜、ビーズ、カラム、ゲル等などの種々の形態およびサイズであることができる。接触は、試薬とサンプルの核酸またはポリペプチド間で複合体が形成されるための適当な条件下になされうる。
【００７９】
サンプル中の変化したＢＣＳＣ−１発現の発見は、メラノーマまたは皮膚癌の進行の存在、タイプまたは段階を示す。変化したＢＣＳＣ−１発現の存在の決定は、より効果的でかつ特注の適切な治療介入のデザインも可能とする。前兆レベルでのこの決定は、予防治療方式が適用されることを可能とする。
【００８０】
薬物スクリーニング
本発明は、薬物候補またはリードのスクリーニングのための新規なターゲットおよび方法も提供する。この方法は、結合アッセイおよび／または機能的アッセイを含み、そしてインビトロ、細胞系、動物等において行うことができる。
【００８１】
これに関して、本発明の目的は、メラノーマまたは皮膚癌に対する生物学的に活性な化合物を選択する方法であって、ＢＣＳＣ−１発現または活性を模倣するかまたは刺激する化合物を選択する工程を含む方法にある。
【００８２】
本発明の更なる目的は、メラノーマまたは皮膚癌に対する生物学的に活性な化合物を選択する方法であって、試験化合物をレポーター構築物を含む組換え宿主細胞と接触させ、該レポーター構築物はＢＣＳＣ−１遺伝子プロモーターのコントロール下のレポーター遺伝子を含み、そしてレポーター遺伝子の発現を刺激する試験化合物を選択することを含む方法である。
【００８３】
本発明の特定の目的は、メラノーマまたは皮膚癌に対して活性な化合物を選択する方法であって、試験化合物をＢＣＳＣ−１遺伝子またはポリペプチドとインビトロで接触させ、そしてそれぞれ該試験化合物の該ＢＣＳＣ−１遺伝子またはポリペプチドに結合する能力を決定することを含む方法にある。該遺伝子またはポリペプチドへの結合は、化合物の、前記標的の活性をモデュレーションする能力、従ってメラノーマまたは皮膚癌に導く経路に影響を与える能力に関する指示を与える。好ましくは、ＢＣＳＣ−１ポリペプチドは長いアイソフォームである。
【００８４】
結合の決定は、試験化合物の標識、標識された参照リガンドとの競合等によるなどの種々の技術により行うことができる。
【００８５】
本発明の更なる目的は、メラノーマまたは皮膚癌に対して活性な化合物を選択する方法であって、試験化合物をＢＣＳＣ−１ポリペプチドとインビトロで接触させそして該試験化合物の該ポリペプチドの活性をモデュレーションする能力を決定することを含む方法にある。好ましくは、ＢＣＳＣ−１ポリペプチドは長いアイソフォームである。
【００８６】
本発明の更なる目的は、生物学的に活性な化合物を選択する方法であって、試験化合物をＢＣＳＣ−１遺伝子とインビトロで接触させ、そして該試験化合物の該遺伝子の長いアイソフォームの発現をモデュレーションする能力を決定することを含む、方法にある。
【００８７】
スクリーニングする特定の態様において、モデュレーションは活性化である。
【００８８】
上記スクリーニングアッセイは、プレート、チューブ、ディッシュ、フラスコ等などの任意の適当な装置において行うことができる。典型的には、アッセイをマルチウエルプレートにおいて行う。いくつかの試験化合物を並行してアッセイすることができる。更に、試験化合物は、種々の起源、性質および組成であることができる。それは、単離されているかまたは他の物質との混合物中の任意の有機または無機物質、例えば脂質、ペプチド、ポリペプチド、核酸、小分子等であることができる。化合物は、例えば、産物のコンビナトリアルライブラリーのすべてまたは一部であることができる。
【００８９】
医薬組成物、治療
本発明の更なる目的は、（ｉ）ＢＣＳＣ−１ポリペプチドの長いアイソフォームまたはそれをコードする核酸または、下記するベクターもしくは組換え宿主細胞および（ｉｉ）薬学的に許容されうる担体またはビヒクルを含む医薬組成物である。
【００９０】
本発明は、被検体におけるメラノーマまたは皮膚癌を処置する方法であって、該被検体に上記した組成物を投与することを含む、方法にも関する。
【００９１】
本発明は、被検体におけるメラノーマまたは皮膚癌を処置する方法であって、該被検体に有効量のＢＣＳＣ−１ポリペプチドの長いアイソフォームを投与することを含む、方法にも関する。
【００９２】
本発明は、メラノーマまたは皮膚癌を処置するための医薬の製造のためのＢＣＳＣ−１タンパク質またはＢＣＳＣ−１タンパク質をコードする核酸の使用にも関する。好ましくは、ＢＣＳＣ−１タンパク質は長いアイソフォームである。
【００９３】
本発明は、癌を処置するための医薬の製造のための長いＢＣＳＣ−１タンパク質アイソフォームの使用にも関する。
【００９４】
本発明は、メラノーマまたは皮膚癌を処置するための医薬組成物の製造のためのＢＣＳＣ−１アゴニストの使用にも関する。
【００９５】
本発明は、メラノーマまたは皮膚癌を処置するための医薬組成物の製造のためのＢＣＳＣ−１遺伝子発現を刺激する化合物の使用を更に包含する。
【００９６】
本発明の状況において、用語「処置」は、腫瘍進行の阻害、腫瘍増殖の阻害、腫瘍サイズの減少、腫瘍細胞の腫瘍形成性の抑制、疾患の進行の遅延を含む。
【００９７】
皮膚癌は、基底細胞癌、扁平上皮細胞癌、メルケル癌、原発性皮膚リンパ腫（primary cutaneous lymphoma）および皮膚または関連した表面組織の任意の他の細胞増殖疾患から選択されうる。
【００９８】
実験の部に示されたとおり、皮膚癌細胞にＢＣＳＣ−１の長いアイソフォームを供給すると、腫瘍増殖が抑制される。被検体へのこのような機能の供給は、遺伝子もしくはタンパク質治療によりまたはＢＣＳＣ−１ポリペプチド活性をモデュレーションするかまたは模倣する化合物（例えば、上記スクリーニングアッセイにおいて同定されたアゴニスト）を投与することにより達成されうる。特に、ＢＣＳＣ−１遺伝子は、例えばウイルスベクターまたはプラスミドを使用してそれを必要としている被検体の細胞に導入されうる。アデノウイルス、ＡＡＶ、ヘルペスウイルスおよびレンチウイルスを含むレトロウイルスなどの種々のウイルスをベースとするビヒクルを使用することができる。例えば、US Patents 6,069,134および6,143,290は、癌抑制遺伝子を癌性細胞に移行および発現させるためのヒトアデノウイルスの使用を説明する。遺伝子は、裸のＤＮＡとして導入されることもできる。遺伝子は、レシピエント宿主細胞のゲノムに組み込まれるようにまたは染色体外に残るように与えられうる。組み込みは、ランダムにまたは正確に規定された部位で、例えば相同的組み換えにより行うことができる。更に、技術は、遺伝子ガン、リポソーム媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション等を含む。遺伝子治療は、直接遺伝子注入によりまたは機能的ＢＣＳＣ−１タンパク質ポリペプチドを発現するエキソビボで調製された遺伝的に改変された細胞を投与することにより達成されうる。タンパク質治療は、当技術分野でそれ自体既知の技術に従って達成されることもできる。このようなタンパク質治療は、ＢＣＳＣ−１が分泌されたタンパク質であることを考慮すると特に適している。遺伝子治療の目的で、ＢＣＳＣ−１遺伝子の典型的な用量は、１０４〜１０９ＢＣＳＣ−１発現ベクター間に含まれる。タンパク質治療の目的で、ＢＣＳＣ−１タンパク質の典型的な用量は、用量当たり１ｎｇ〜１００mg間に含まれる。一般に、疾患にかかった細胞内の細胞増殖の減少または阻害を達成するために、治療的有効量が投与される。用量は、病態の重篤さ、プロトコール、患者等に基づいて医師により調節されうることは理解されるべきである。
【００９９】
ＢＣＳＣ−１タンパク質およびＢＣＳＣ−１発現ベクターまたは細胞は、経口的、全身的、局所的および非経口的（例えば、皮下に、腹腔内に、血管内に等）を含むがそれらに限定されない種々の方法において投与されうる。１つの態様において、化合物は、腫瘍の部位または付近に（除去された腫瘍の部位に）直接に、例えば術中にまたは腫瘍への直接アクセスを可能とする他の手段（例えばカテーテル）により、適用される。
【０１００】
ベクターおよび組換え細胞
本発明の更なる局面は、診断、治療またはスクリーニングにおいて使用するための新規な産物にある。
【０１０１】
更に詳しくは、本発明の更なる目的は、ＢＣＳＣ−１ポリペプチド、好ましくはその長いアイソフォームをコードする核酸を含むベクターである。このベクターは、クローニングベクター、または更に好ましくは発現ベクター、即ち、コンピテントな宿主細胞において該ベクターからのＢＣＳＣ−１ポリペプチドの発現を引き起こす調節配列を含むベクターであることができる。
【０１０２】
これらのベクターは、インビトロ、エキソビボまたはインビボでＢＣＳＣ−１ポリペプチドを発現するため、トランスジェニックまたは「ノックアウト」非ヒト動物を創生するため、核酸を増幅するため、アンチセンスＲＮＡｓを発現するため等に使用されうる。
【０１０３】
本発明のベクターは、典型的には、調節配列、例えばプロモーター、ｐｏｌｙＡ等に作用可能に連結された（operably linked）本発明に従うＢＣＳＣ−１コード配列を含む。用語「作用可能に連結された」は、調節配列がコード配列の発現（例えば転写）を引き起こすようにコード配列と調節配列が機能的に関連していることを示す。ベクターは、１つまたは複数の複製起点および／または選択可能なマーカーを更に含むことができる。プロモーター領域は、コード配列に対して同種であるか異種であることができ、そして任意の適切な宿主細胞において、インビボ使用のためを含む、遍在性、構成的、調節されたおよび／または組織特異的発現を与えることができる。プロモーターの例は、バクテリアプロモーター（Ｔ７、ｐＴＡＣ、Ｔｒｐプロモーター等）、ウイルスプロモーター（ＬＴＲ、ＴＫ、ＣＭＶ−ＩＥ等）、哺乳動物遺伝子プロモーター（アルブミン、ＰＧＫ等）等を含む。
【０１０４】
ベクターは、プラスミド、ウイルス、コスミド、ファージ、ＢＡＣ、ＹＡＣ等であることができる。プラスミドベクターは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＵＣ、ｐＢＲ等などの市販のベクターから作成されうる。ウイルスベクターは、当技術分野で知られている組換えＤＮＡ技術に従って、バキュロウイルス、レトロウイルス（例えば、レンチウイルス）、アデノウイルス、ＡＡＶｓ等から産生されうる。
【０１０５】
組換えウイルスは、好ましくは複製欠損性であり、なお更に好ましくは、Ｅ１欠損および／またはＥ４欠損アデノウイルス、Ｇａｇ欠損、ｐｏｌ欠損および／またはｅｎｖ欠損レトロウイルス、Ｒｅｐ欠損および／またはＣａｐ欠損ＡＡＶｓから選ばれる。このような組換えウイルスは、当技術分野で知られている技術により、例えばパッケージング細胞をトランスフェクションすることによりまたはヘルパープラスミドまたはウイルスによる一過性トランスフェクションにより産生されうる。ウイルスパッケージング細胞の典型的な例は、ＰＡ３１７細胞、ＰｓｉＣＲＩＰ細胞、ＧＰｅｎｖ＋細胞、２９３細胞等を含む。このような複製欠損組換えウイルスを産生するための詳細なプロトコールは、例えばWO95/14785、WO96/22378、US5,882,877、US6,013,516、US4,861,719、US5,278,056、WO94/19478において見出されうる。
【０１０６】
本発明の更なる目的は、上記した組換えＢＣＳＣ−１遺伝子またはベクターを含む組換え宿主細胞にある。適当な宿主細胞は、原核細胞（例えばバクテリア）および真核細胞（例えば酵母細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等）を含むが、それらに限定されない。特定の例は、Ｅ．ｃｏｌｉ、ＫｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓもしくはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ酵母、哺乳動物細胞系（例えば、Ｖｅｒｏ細胞、ＣＨＯ細胞、３Ｔ３細胞、ＣＯＳ細胞等）ならびに一次もしくは樹立された哺乳動物細胞培養物（例えば繊維芽細胞、胚細胞、上皮細胞、神経細胞、脂肪細胞等から作製された）を含む。
【０１０７】
本発明は、本発明に従ってＢＣＳＣ−１ポリペプチドを発現する組換え宿主細胞を作製するための方法であって、（ｉ）コンピテント宿主細胞に上記した組換え核酸またはベクターをインビトロまたはエキソビボで導入し、（ｉｉ）得られた組換え宿主細胞をインビトロまたはエキソビボで培養し、そして（ｉｉｉ）場合により、ＢＣＳＣ−１ポリペプチドを発現する細胞を選択することを含む、方法にも関する。
【０１０８】
このような組換え宿主細胞は、ＢＣＳＣ−１ポリペプチドの産生のためおよび下記する活性分子のスクリーニングのために使用されうる。このような細胞は皮膚癌研究のためのモデル系としても使用できる。このような細胞は、適当な培養装置（プレート、フラスコ、ディッシュ、チューブ、パウチ等）において、適当な培養培地、例えばＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ、ＨＡＭ等内に維持することができる。
【０１０９】
本発明の更なる局面および利点は、下記の実験の部に開示されるであろう。これらは説明しているものとみなされるべきであり、本願の範囲を限定するものではない。
【０１１０】
実験の部
物質および方法
１．ＲＮＡ抽出およびｃＤＮＡ合成
全ＲＮＡをメラノーマの異なる段階のメラノーマを有する７０人の患者からの凍結させた皮膚組織および正常な母斑組織から単離した。全ＲＮＡ１μgを使用して、供給者の教示に従ってランダムヘキサマーおよびＳｕｐｅｒｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素（Invitrogen）を使用してｃＤＮＡを合成した。
【０１１１】
２．リアルタイム半定量的ＲＴ−ＰＣＲ
プライマーの異なる組み合わせを使用してＢＣＳＣ−１の異なるエキソンについてｃＤＮＡを増幅した。アンプリコンは、可能な場合にはエキソン境界にわたって設計されそして、配列はＢＬＡＳＴによりヒトゲノムに対してアライメントされて、それらが試験されるべき遺伝子に対して特異的であることを確実にする。使用されたプライマーの配列は、表１に示される。各設計の有効性は、ｃＤＮＡの逐次希釈により試験された。オリゴヌクレオチドＰＣＲ反応（１０ul容積）は、希釈されたｃＤＮＡ、２×ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Applied Biosystem）、３００nMのフォアードプライマーおよびリバースプライマーを含有していた。ＰＣＲを、下記のパラメーター：５０℃で２分間、９５℃で１０分間、および４０サイクルの９５℃１５秒−６０℃１分、によりＳＤＳ７９００ＨＴ機器（Applied Biosystems）で行った。各反応を３８４ウエルプレートで６回反復して行った。生のＣｔ値（raw Ct values）はＳＤＳ２．２（Applied Biosystems） で得られた。４つの異なるハウスキーピング遺伝子を、ＧｅｎＮｏｒｍソフトウエアで行われる正規化のために使用した。相対的発現を、正常な組織（良性母斑）における平均発現と比較して腫瘍における発現の比として計算した。
【０１１２】
下記はＢＣＳＣ−１研究に使用されたオリゴヌクレオチドである。
【０１１３】
【表２】
【０１１４】
３．ＢＣＳＣ−１をコードするレンチウイルスベクターの構築および作製
ＨＡタンパク質配列でタグ付けされたＢＣＳＣ−１のアイソフォームＦの完全なコード配列を、２つの異なるレンチウイルスベクター（D.Trono, EPFL, Epalinges, Switzerlandからの寄贈品）に挿入しそしてＰＧＫ ＩＲＥＳ ＮｅｏおよびＰＷＩＲ ＧＦＰプラスミドから改変した（Naldini et al., 1996; Salmon et al., 2000）。２９３Ｔ細胞系およびＨｅｌａ細胞系を、１０％ＦＣＳを補充されたダルベッコの改変イーグル培地で培養した。標準プロトコールに従って２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクションにより、組換えレンチウイルスを産生した。簡単に言えば、サブコンフルーエントな（subconfluent）２９３Ｔ細胞を、リン酸カルシウム沈殿により、プラスミドベクター（ＰＧＫ ＢＣＳＣ Ｉｒｅｓ Ｎｅｏ／ＰＷＩＲ ＢＣＳＣ ＧＦＰ）２０μg、ｐＣＭＶ−デルタＲ８．９１、１５μgおよびｐＭＤ２Ｇ−ＶＳＶＧ５μgでコトランスフェクションした。１６時間後に、培地を変え、そして組換えレンチウイルスベクターを２４時間後に回収した。すべての試験ＦＡＣＳ、ウエスタンブロットおよび細胞トランスダクションは以前に記載されたのと同様であった（Arrighi et al., 2004）。
【０１１５】
Ｂ−実施例
実施例１−ＢＣＳＣ−１発現が皮膚癌において変化しているということの同定
遺伝子プロファイリング技術ＤＡＴＡＳ（選択的スプライシングによる転写物のディファレンシャル解析（Differential Analysis of Transcripts with Alternative Splicing）（Schweighoffer et al., 2000））は、２つの条件間でディファレンシャルに発現される選択的にスプライシングされた配列のライブラリーの単離を可能とし、該ライブラリーは次いでアレイを構築するためまたはターゲット遺伝子を単離するために使用されうる。
【０１１６】
ＤＡＴＡＳは、２つの異なる集団（良性母斑対転移メラノーマ）からの全ＲＮＡを抽出し、次いでメッセンジャーＲＮＡを単離する（Dynabeads oligodT-Dynalを使用して）ことにより達成される。ビオチニル化オリゴヌクレオチドｄＴを使用してｍＲＮＡに対して逆転写を行って、第１鎖ｃＤＮＡを発生させる。１つの集団からのｍＲＮＡと他の集団からのｃＤＮＡとのクロスハイブリダイゼーションは、ヘテロ二本鎖（heteroduplex）を生じさせ、これをストレプトアビジンコーティングされたビーズを使用して単離する。ＲＮａｓｅＨ処置を使用して、ヘテロ二本鎖におけるｃＤＮＡにハイブリダイゼーションしないｍＲＮＡのループを開放する。選択的にスプライシングされた配列をコードするこれらのｍＲＮＡループを５つの縮重プライマーによるＲＴ−ＰＣＲに付し、次いでＡＴクローニングベクター（TOPO, Incitrogen）においてＰＣＲ産物をクローニングする。すべてのクローンにおけるｃＤＮＡインサートは、Ｔ７プライマーを使用するＰＣＲにより増幅される。最終の結果は、所与の条件に対して独特の選択的にスプライシングされたｍＲＮＡ配列のライブラリーである。配列決定の後にＤＡＴＡＳクローンをバイオインフォマチック解析に付してそれらの元の遺伝子を同定する。これは、高い正確度でもって、あるタイプのスプライシング事象（エキソンスキッピング、イントロン保持、新規なエキソンの存在、選択的スプライシング部位使用）の解析を可能とする。
【０１１７】
本発明者等は、良性母斑を提示している健康な患者の集団および転移メラノーマに罹患している患者の集団から得られた組織に関してＤＡＴＡＳプロファイリングアッセイを行った。本発明者等は、良性母斑グループからの１１人の患者および転移メラノーマグループからの１０人の患者を使用して組織に関するＤＡＴＡＳライブラリーを構築した。８０μgの全ＲＮＡのプールが、各集団について利用可能であり、それからｍＲＮＡ １．６μgを抽出した：８００ngはcDNA合成のために使用されそして８００ngはｍＲＮＡとして保持された。すべてのＲＮＡ組織サンプルの質および量は、Agilant Bioanalyserを使用して決定された。良好な品質の全ＲＮＡサンプルのみがＤＡＴＡＳのために使用された。
【０１１８】
総計７５５のクローンが組織ＲＮＡに関するＤＡＴＡＳから得られた。クローンの約２５％は、状態ｍＲＮＡ転移メラノーマ／ｃＤＮＡ良性母斑から得られ、クローンの残りの７５％は状態ｍＲＮＡ良性母斑／ｃＤＮＡ転移メラノーマから得られた。インサートの平均サイズは、３００ｂｐと５００ｂｐの間にある。配列決定の後に、個々のクローンを前記のとおりにプロセシングしそして解析した。配列決定された７５５クローンの内、２１７フラグメントが非重複性でありそして未知の遺伝子配列を含有していた。
【０１１９】
本発明者等がＤＡＴＡＳ解析から得た２１７クローンから、本発明者等は、潜在的に関心のある性質を有するそれらの約１０を選択しそしてメラノーマ細胞性病変からの生検から抽出されたＲＮＡに関するリアルタイム半定量的ＲＴ−ＰＣＲを行った。この第２スクリーンから、本発明者等は潜在的に興味深い候補としてＢＣＳＣ−１を同定した。
【０１２０】
実施例２：ＢＣＳＣ−１発現はメラノーマ患者においてダウンレギュレーションされる
ＢＣＳＣ−１の遺伝子発現を、良性母斑（ネガティブコントロール）および異なる段階の着色した皮膚病変の生検を含む総計７０人の患者の生検から抽出されたＲＮＡのリアルタイム半定量的ＲＴ−ＰＣＲにより決定した。結果は、転移メラノーマを有するすべての患者は、良性母斑サンプルにおけるＢＣＳＣの平均発現と比較して有意なより低い発現を有することを示した（図２）。ある転移生検において、ＢＣＳＣの発現は良性母斑の平均発現の値より２０倍低い値に達する。異形母斑の生検は、良性母斑より高いＢＣＳＣの発現を示し、そして原発性メラノーマおよびリンパ節からの生検の両方共良性母斑よりも類似したＢＣＳＣの発現を示した。
【０１２１】
実施例３：ＢＣＳＣ−１の長いアイソフォームはメラノーマにおいて選択的にダウンレギュレーションされる
７つの異なるアイソフォームがＢＣＳＣ−１遺伝子について記載された（図３Ａ参照）。本発明者等は、プライマーの異なる組み合わせを使用してＢＣＳＣ−１発現の更に特異的な解析を行って、どのアイソフォームがダウンレギュレーションされたかを決定した。結果は、同じタンパク質をコードするより長いアイソフォームｃおよびｆが、メラノーマ患者において選択的にダウンレギュレーションされることを示した（図３Ｂ）。
【０１２２】
実施例４：ＢＣＳＣ−１発現は、メラノーマ患者およびメラノーマ細胞系においてダウンレギュレーションされる
先の結果を確かめるために、皮膚病変からの生検のより大きいコホートにおいて新たなリアルタイムＰＣＲ実験を行った。先の結果と一致して、転移病変を有するすべての患者は、健康なドナーにおける平均発現と比較してＢＣＳＣ−１のより低い発現を有していた（図４Ａ）。
更に、メラノーマ細胞のいくつかの細胞系を、ＢＣＳＣ−１の発現について試験した（図４Ｂ）。結果は、すべてのメラノーマ細胞系が健康なドナーより有意に低い発現を有することを示した。ＳＫ−Ｍｅｌ２３（Ｌ１）などのいくらかの細胞系において、ＢＣＳＣ−１の発現は検出できず、そして試験された原発性メラノーマの２つの細胞系のみが良性母斑よりも類似したＢＣＳＣ−１の発現を示す。
【０１２３】
実施例５：ＢＣＳＣ−１の異所発現は、メラノーマ細胞増殖を減少させる
ＰＧＫ ＢＣＳＣ Ｉｒｅｓ ＮｅｏまたはＰＷＩＲ ＢＣＳＣ ＧＦＰベクターを使用してＳＫ−Ｍｅｌ２３およびＨｅｌａ細胞をトランスダクションしてＢＣＳＣ−１の発現を誘導した。更に、対応する空のベクターでトランスダクションされた細胞をネガティブコントロールとして使用した。
【０１２４】
結果は、メラノーマ細胞系ＳＫ−Ｍｅｌ２３におけるＢＣＳＣ−１の異所発現は、細胞の増殖を顕著に減少させることを示した（図５）。ＢＣＳＣ−１の発現は、抗ＨＡ抗体を使用してウエスタンブロットおよびリアルタイムＰＣＲ（図６）により確かめた。ＢＣＳＣ−１の異所発現のこの効果はＨｅｌａなどの他の非メラノーマ細胞系においては観察されなかった。
【０１２５】
実施例６：ＢＣＳＣ−１の異所発現は、メラノーマ細胞増殖を妨害する
メラノーマ細胞系をレンチベクターでトランスダクションしてＢＣＳＣ−１遺伝子の長いアイソフォーム（Ｉｓｏ Ｆ）の異所発現を誘導した。図７に示された結果は、トランスダクションされた転移メラノーマ細胞ＭｅｗｏおよびＳＫ２３（図７Ａ）および原発性メラノーマ細胞Ｍｅ２５７（図７Ｂ）は、ネガティブコントロールおよび空のベクターまたはＢＣＳＣ−１の短いアイソフォーム（Ｉｓｏ Ａ）でトランスダクションされた細胞と比較して増殖を停止または顕著に減少させることを示す。この効果は、空のベクターまたはＢＣＳＣ−１の短いアイソフォームでトランスダクションされた細胞においては観察されなかった。
【０１２６】
実施例７：ＢＣＳＣ−１は、細胞サイクルのＧ２−Ｍ相においてメラノーマ細胞を妨害する
本発明者等は、ＢＣＳＣ−１の抗増殖効果は、トランスダクションされた細胞の細胞サイクルの妨害によるものでありうるかどうかを調べた。ＢｒｄＵおよび７−ＡＡＤ染色を使用して、本発明者等は、細胞サイクルのＧ０／Ｇ１（Ｒ３）、Ｓ（Ｒ４）、Ｇ２−Ｍ（Ｒ５）相における細胞の百分率およびアポトーシス細胞（Ｒ６）の百分率を決定することができた。ＦＡＣＳプロフィルは、図８Ａに示されそして百分率値は図８Ｂに示される。結果は、ＢＣＳＣ−１の長いアイソフォーム（ｉｓｏ Ｆ）でトランスダクションされた細胞はＧ２−Ｍ相において妨害することを示す。この効果は、トランスダクションされていない細胞および空のベクターまたはＢＣＳＣ−１の短いアイソフォーム（ｉｓｏ Ａ）でトランスダクションされた細胞においては観察されず、その場合に細胞は細胞サイクルのＧ０／Ｇ１およびＳ相に主として分布している。
【０１２７】
実施例８：ＢＣＳＣ−１をコードするＨｅｌａは、細胞サイクルのＧ２およびＭ相において阻止される
本発明者等は、ＤＡＰＩおよびチューブリン抗体による免疫蛍光染色を行って、Ｇ２−Ｍのどの段階でＢＣＳＣ−１の異所発現により誘導される細胞サイクルの妨害が生じるかを決定した。本発明者等は、トランスダクションされていない細胞または空のベクターもしくはＢＣＳＣ−１の短いアイソフォームでトランスダクションされた細胞において、クロマチンの凝縮を伴うおよび有糸分裂の異なる相にある細胞の高い百分率の存在を観察した（図９Ａ）。しかしながら、本発明者等は、細胞がＢＣＳＣ−１の長いアイソフォームでトランスダクションされたとき有糸分裂における細胞を観察しなかった（図９Ｂ）。本発明者等は、ＢＣＳＣ−１の異所発現が細胞サイクルのＧ２およびＭ相の間で妨害を誘導し、細胞における有糸分裂を回避すると結論付けることができる。
【０１２８】
実施例９：ＢＣＳＣ−１は転移メラノーマのマウスモデルにおいて肺転移の数を減少させる
ＢＣＳＣ−１のインビボ効果を調べるために、本発明者等は、空のベクターまたは長いアイソフォームＢＣＳＣ−１ベクター（１０４〜１０７細胞について約５００ngのウイルス粒子）でトランスダクションされたＢ１６メラノーマ細胞を静脈内に注入した。１５日後、これらの細胞は、肺において転移を生じ、そして転移は数えることができる（図１０Ａ）。空のベクターでトランスダクションされたＢ１６を注入されたマウス（ｎ＝１０）または長いＢＣＳＣ−１ベクターでトランスダクションされたＢ１６を注入されたマウス（ｎ＝６）からの肺による転移の数は図１０Ｂに示される。本発明者等は、空のトランスダクションされた細胞を注入されたマウスと比較して、ＢＣＳＣ−１でトランスダクションされた細胞を注入されたマウスにおける肺転移の数の減少を観察した。
【０１２９】
ＢＣＳＣ−１のタンパク質配列（配列番号１３）
【表３】
ＢＣＳＣ−１のｃＤＮＡ配列（ＮＭ ０１４６２２）−配列番号１４
【表４】
【０１３０】
【表５】
【図面の簡単な説明】
【０１３１】
【図１】着色した皮膚病変の進行モデルを示す。
【図２】ＢＣＳＣ−１発現はメラノーマ患者においてダウンレギュレーションされる。良性母斑またはメラノーマ皮膚病変を有する患者からの皮膚生検におけるＢＣＳＣ−１遺伝子のリアルタイムＰＣＲによるＲＮＡ発現。ゼロ値は、良性母斑を有する患者（健康なドナー）におけるこの遺伝子の平均発現を表す。転移メラノーマを有するすべての患者は、健康なドナーの平均発現値と比較してより低い発現（２０倍以下低い）を示す。
【図３Ａ】ＢＣＳＣ−１の長いアイソフォームは、メラノーマ患者において選択的にダウンレギュレーションされる。ＢＣＳＣ−１遺伝子のいくつかのアイソフォームが記載されている。異なるエキソンのリアルタイムＰＣＲ解析は、長いアイソフォームに専ら存在するエキソン（エキソン１３〜１８）は、メラノーマ患者において減少したエキソンであることを示す。
【図３Ｂ】ＢＣＳＣ−１の長いアイソフォームは、メラノーマ患者において選択的にダウンレギュレーションされる。ＢＣＳＣ−１遺伝子のいくつかのアイソフォームが記載されている。異なるエキソンのリアルタイムＰＣＲ解析は、長いアイソフォームに専ら存在するエキソン（エキソン１３〜１８）は、メラノーマ患者において減少したエキソンであることを示す。
【図４Ａ】ＢＣＳＣ−１発現は、メラノーマ患者およびメラノーマ細胞系においてダウンレギュレーションされる。結果は、患者のより大きいコホートにおいておよびメラノーマ細胞系においても確かめられた。ＢＣＳＣ−１遺伝子のより長いアイソフォームの発現はメラノーマ患者およびメラノーマ細胞系において顕著に減少する。
【図４Ｂ】ＢＣＳＣ−１発現は、メラノーマ患者およびメラノーマ細胞系においてダウンレギュレーションされる。結果は、患者のより大きいコホートにおいておよびメラノーマ細胞系においても確かめられた。ＢＣＳＣ−１遺伝子のより長いアイソフォームの発現はメラノーマ患者およびメラノーマ細胞系において顕著に減少する。
【図５】ＢＣＳＣ−１の異所発現は、メラノーマ細胞増殖を減少させる。メラノーマ細胞系は、ＢＣＳＣ−１をコードするレンチベクターでトランスダクションされた。ＢＣＳＣ−１を発現するメラノーマ細胞は、ネガティブコントロールと比較してそれらの増殖を停止するかまたは顕著に減少させる。この効果は、やはりＢＣＳＣベクターでトランスダクションされた非メラノーマ細胞系（Ｈｅｌａ）においては観察されない。
【図６】ＢＣＳＣ−１の異所発現は、ウエスタンブロットおよびリアルタイムＰＣＲにより確認される。（左）ＢＣＳＣ−１タンパク質の産生は、１２日目に、ＢＣＳＣ−１をコードするレンチウイルスベクターの増加する用量（２および２０μl）でトランスダクションされたＳＫ−Ｍｅｌ２３細胞において抗ＨＡ抗体を使用するウエスタンブロットにより確認されるが、空のベクター（Ｃ−）でトランスダクションされた細胞においては確認されない。ＢＣＳＣ−１の長いアイソフォームおよび短いアイソフォームの両ベクターでトランスフェクションされた２９３Ｔ細胞をポジティブコントロールとして使用して、やはり抗ＨＡ抗体によりＢＣＳＣ−１を検出する。（右）リアルタイムＰＣＲは、ＳＫ−Ｍｅｌ２３細胞が、トランスダクションの前およびそれらが空のベクターでトランスダクションされるとき８日目に、ＢＣＳＣ−１の検出可能なレベルを発現しないことを示した。しかしながら、ＢＣＳＣ−１ベクターでトランスダクションされたＳＫ−Ｍｅｌ２３細胞は高いレベルのＢＣＳＣ−１ｍＲＮＡを発現する。
【図７】ＢＣＳＣ−１の異所発現はメラノーマ細胞系増殖を妨害する。
【図８】ＢＣＳＣ−１は、細胞サイクルのＧ２−Ｍ相においてメラノーマ細胞を妨害する。
【図９】ＢＣＳＣ−１をコードするＨｅｌａは、細胞サイクルのＧ２およびＭ相において阻止される。Ａ）ＢＣＳＣ−１の短いアイソフォームでトランスダクションされたＨｅｌａ細胞；Ｂ）ＢＣＳＣ−１の長いアイソフォームでトランスダクションされたＨｅｌａ細胞。
【図１０】ＢＣＳＣ−１は、転移メラノーマのマウスモデルにおいて肺転移の数を減少させる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検体におけるメラノーマまたは皮膚癌の存在、段階またはタイプを検出するための方法であって、被検体からのサンプルにおける変化したＢＣＳＣ−１遺伝子発現の存在をインビトロまたはエキソビボで検出し、このような変化したＢＣＳＣ−１遺伝子発現の存在が該被検体におけるメラノーマまたは皮膚癌の存在、段階またはタイプを示すことを含む方法。
【請求項２】
前記サンプルにおけるＢＣＳＣ−１遺伝子の減少した発現が、前記被検体におけるメラノーマまたは皮膚癌の存在、段階またはタイプを示す、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記サンプルにおけるＢＣＳＣ−１遺伝子の長いアイソフォームの減少した発現が、前記被検体におけるメラノーマまたは皮膚癌の存在、段階またはタイプを示す、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
長いアイソフォームがエキソン１３、１４、１５、１６、１７または１８を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
被検体におけるメラノーマおよび皮膚癌の処置の有効性を評価する方法であって、該処置の前および後の被検体からのサンプルにおけるＢＣＳＣ−１遺伝子発現を比較し、増加した発現は処置に対するポジティブな応答を示すことを含む方法。
【請求項６】
ＢＣＳＣ−１遺伝子発現を、配列決定、選択的ハイブリダイゼーション、選択的増幅および／または特異的リガンド結合により検出する、請求項１〜５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項７】
癌が、基底細胞癌、扁平上皮細胞癌、メルケル癌、メラノーマである、請求項１〜６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項８】
ＢＣＳＣ−１の長いアイソフォームの増幅を可能とする核酸プライマー。
【請求項９】
ＢＣＳＣ−１の長いアイソフォームに特異的に結合する核酸プローブ。
【請求項１０】
ＢＣＳＣ−１タンパク質の長いアイソフォームに特異的に結合する抗体。
【請求項１１】
それぞれ、請求項８〜１０のいずれか１つに記載のプライマー、プローブまたは抗体を含むキット。
【請求項１２】
メラノーマまたは皮膚癌を処置するための医薬の製造のためのＢＣＳＣ−１タンパク質またはＢＣＳＣ−１タンパク質をコードする核酸の使用。
【請求項１３】
メラノーマまたは皮膚癌を処置するための医薬組成物の製造のためのＢＣＳＣ−１アゴニストの使用。
【請求項１４】
メラノーマまたは皮膚癌を処置するための医薬組成物の製造のためのＢＣＳＣ−１遺伝子発現を刺激する化合物の使用。
【請求項１５】
メラノーマまたは皮膚癌に対する生物学的に活性な化合物を選択する方法であって、ＢＣＳＣ−１発現または活性を模倣するかまたは刺激する化合物を選択する工程を含む方法。
【請求項１６】
メラノーマまたは皮膚癌に対する生物学的に活性な化合物を選択する方法であって、試験化合物を、レポーター構築物を含む組換え宿主細胞と接触させ、該レポーター構築物はＢＣＳＣ−１遺伝子プロモーターのコントロール下のレポーター遺伝子を含んでおり、そしてレポーター遺伝子の発現を刺激する試験化合物を選択することを含む方法。
【請求項１７】
被検体における癌の存在、段階またはタイプを検出するための方法であって、被検体からのサンプルにおけるＢＣＳＣ−１遺伝子またはタンパク質の長いアイソフォームの（相対的）量をインビトロまたはエキソビボで決定し、このような量が該被検体における癌の存在、段階またはタイプを示すことを含む方法。
【請求項１８】
被検体における癌の存在、段階またはタイプを検出するための方法であって、被検体に由来する流体サンプルにおけるＢＣＳＣ−１タンパク質の（相対的）量をインビトロまたはエキソビボで決定し、このような量が該被検体における癌の存在、段階またはタイプを示すことを含む方法。
【請求項１】
被検体におけるメラノーマまたは皮膚癌の存在、段階またはタイプを検出するための方法であって、被検体からのサンプルにおける変化したＢＣＳＣ−１遺伝子発現の存在をインビトロまたはエキソビボで検出し、このような変化したＢＣＳＣ−１遺伝子発現の存在が該被検体におけるメラノーマまたは皮膚癌の存在、段階またはタイプを示すことを含む方法。
【請求項２】
前記サンプルにおけるＢＣＳＣ−１遺伝子の減少した発現が、前記被検体におけるメラノーマまたは皮膚癌の存在、段階またはタイプを示す、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記サンプルにおけるＢＣＳＣ−１遺伝子の長いアイソフォームの減少した発現が、前記被検体におけるメラノーマまたは皮膚癌の存在、段階またはタイプを示す、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
長いアイソフォームがエキソン１３、１４、１５、１６、１７または１８を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
被検体におけるメラノーマおよび皮膚癌の処置の有効性を評価する方法であって、該処置の前および後の被検体からのサンプルにおけるＢＣＳＣ−１遺伝子発現を比較し、増加した発現は処置に対するポジティブな応答を示すことを含む方法。
【請求項６】
ＢＣＳＣ−１遺伝子発現を、配列決定、選択的ハイブリダイゼーション、選択的増幅および／または特異的リガンド結合により検出する、請求項１〜５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項７】
癌が、基底細胞癌、扁平上皮細胞癌、メルケル癌、メラノーマである、請求項１〜６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項８】
ＢＣＳＣ−１の長いアイソフォームの増幅を可能とする核酸プライマー。
【請求項９】
ＢＣＳＣ−１の長いアイソフォームに特異的に結合する核酸プローブ。
【請求項１０】
ＢＣＳＣ−１タンパク質の長いアイソフォームに特異的に結合する抗体。
【請求項１１】
それぞれ、請求項８〜１０のいずれか１つに記載のプライマー、プローブまたは抗体を含むキット。
【請求項１２】
メラノーマまたは皮膚癌を処置するための医薬の製造のためのＢＣＳＣ−１タンパク質またはＢＣＳＣ−１タンパク質をコードする核酸の使用。
【請求項１３】
メラノーマまたは皮膚癌を処置するための医薬組成物の製造のためのＢＣＳＣ−１アゴニストの使用。
【請求項１４】
メラノーマまたは皮膚癌を処置するための医薬組成物の製造のためのＢＣＳＣ−１遺伝子発現を刺激する化合物の使用。
【請求項１５】
メラノーマまたは皮膚癌に対する生物学的に活性な化合物を選択する方法であって、ＢＣＳＣ−１発現または活性を模倣するかまたは刺激する化合物を選択する工程を含む方法。
【請求項１６】
メラノーマまたは皮膚癌に対する生物学的に活性な化合物を選択する方法であって、試験化合物を、レポーター構築物を含む組換え宿主細胞と接触させ、該レポーター構築物はＢＣＳＣ−１遺伝子プロモーターのコントロール下のレポーター遺伝子を含んでおり、そしてレポーター遺伝子の発現を刺激する試験化合物を選択することを含む方法。
【請求項１７】
被検体における癌の存在、段階またはタイプを検出するための方法であって、被検体からのサンプルにおけるＢＣＳＣ−１遺伝子またはタンパク質の長いアイソフォームの（相対的）量をインビトロまたはエキソビボで決定し、このような量が該被検体における癌の存在、段階またはタイプを示すことを含む方法。
【請求項１８】
被検体における癌の存在、段階またはタイプを検出するための方法であって、被検体に由来する流体サンプルにおけるＢＣＳＣ−１タンパク質の（相対的）量をインビトロまたはエキソビボで決定し、このような量が該被検体における癌の存在、段階またはタイプを示すことを含む方法。
【図３Ａ】
【図７】
【図１】
【図２】
【図３Ｂ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５】
【図６】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図７】
【図１】
【図２】
【図３Ｂ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５】
【図６】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公表番号】特表２００９−５２９８６９（Ｐ２００９−５２９８６９Ａ）
【公表日】平成２１年８月２７日（２００９．８．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５５８９４２（Ｐ２００８−５５８９４２）
【出願日】平成１９年３月１５日（２００７．３．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００７／００１７２１
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１０５１１４
【国際公開日】平成１９年９月２０日（２００７．９．２０）
【出願人】（５９９０２２２７０）エグゾニ・テラピューティック・ソシエテ・アノニム (12)
【氏名又は名称原語表記】ＥＸＯＮＨＩＴ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ ＳＡ
【出願人】（５０８２７８２４０）オピトー・ユニヴェルシテール・ドゥ・ジュネーブ (1)
【氏名又は名称原語表記】ＨＯＰＩＴＡＵＸ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＡＩＲＥＳ ＤＥ ＧＥＮＥＶＥ
【出願人】（５０２１５１９５６）ユニヴェルシテ・ドゥ・ジュネーブ (5)
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥ ＤＥ ＧＥＮＥＶＥ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年８月２７日（２００９．８．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年３月１５日（２００７．３．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００７／００１７２１
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１０５１１４
【国際公開日】平成１９年９月２０日（２００７．９．２０）
【出願人】（５９９０２２２７０）エグゾニ・テラピューティック・ソシエテ・アノニム (12)
【氏名又は名称原語表記】ＥＸＯＮＨＩＴ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ ＳＡ
【出願人】（５０８２７８２４０）オピトー・ユニヴェルシテール・ドゥ・ジュネーブ (1)
【氏名又は名称原語表記】ＨＯＰＩＴＡＵＸ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＡＩＲＥＳ ＤＥ ＧＥＮＥＶＥ
【出願人】（５０２１５１９５６）ユニヴェルシテ・ドゥ・ジュネーブ (5)
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥ ＤＥ ＧＥＮＥＶＥ
【Ｆターム（参考）】
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