癌治療薬
【課題】 主に膵臓癌に対してより優れた治療効果を示す癌治療薬を提供する。
【解決手段】 本発明に係る癌治療薬は、シチジン２リン酸からデオキシシチジン２リン酸への還元を触媒するリボヌクレオチドリダクターゼの活性を阻害する作用を備える第１化合物たるジェムシタビンと、前記リボヌクレオチドリダクターゼの分解を亢進させる作用を備える第２化合物たるトラニラストとを組み合わせて構成してある。
【解決手段】 本発明に係る癌治療薬は、シチジン２リン酸からデオキシシチジン２リン酸への還元を触媒するリボヌクレオチドリダクターゼの活性を阻害する作用を備える第１化合物たるジェムシタビンと、前記リボヌクレオチドリダクターゼの分解を亢進させる作用を備える第２化合物たるトラニラストとを組み合わせて構成してある。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は癌治療薬、主に膵臓癌の治療に用いる治療薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
膵臓癌は、腹腔内の深部に位置するため早期発見が困難であるのに加え、充実性の腫瘤を形成して浸潤及び転移を起こし易く、また、外科手術により切除可能な場合であっても早期に再発する割合が高い難治癌であるため、膵臓癌に対しては化学療法による治療が重要な役割を果たしている。
【０００３】
かかる化学療法に用いる治療薬としては多くの場合、ジェムシタビンが選択されているが、更に有効な治療薬の開発が要求されている。
これに対して、後述する特許文献１には、例えばジェムシタビンとアセチルジナリン（ＣＩ−９９４）とを組み合わせた治療薬が開示されている。
【特許文献１】特表２００２−５２５３２０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、アセチルジナリン（ＣＩ−９９４）は臨床試験中の癌治療剤であるので、どのような副作用を招来するのか不明であるのに加え、前記特許文献１には膵臓癌に対する試験結果が示されておらず、ジェムシタビンとアセチルジナリン（ＣＩ−９９４）とを組み合わせた治療薬が膵臓癌に対してどの程度の治療効果をもたらすのかが不明であるという問題があった。
【０００５】
本発明は、斯かる事情に鑑みてなされたものであって、主に膵臓癌に対してより優れた治療効果を示す癌治療薬を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（１） 本発明に係る癌治療薬は、シチジン２リン酸（ＣＤＰ）からデオキシシチジン２リン酸（ｄＣＤＰ）への還元を触媒するリボヌクレオチドリダクターゼの活性を阻害する作用を備える第１化合物と、前記リボヌクレオチドリダクターゼの分解を亢進させる作用を備える第２化合物とを組み合わせてなることを特徴とする。
【０００７】
（２） 本発明に係る癌治療薬は必要に応じて、前記第１化合物はジェムシタビンであることを特徴とする。
【０００８】
（３） また、本発明に係る癌治療薬は必要に応じて、前記第２化合物はトラニラストであることを特徴とする。
【０００９】
（４） 更に、本発明に係る癌治療薬は必要に応じて、治療対象の癌は膵臓癌であることを特徴とする。
【００１０】
本発明者は、市販されている複数の治療薬について鋭意検討した結果、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、及びケロイド等の治療に用いられているトラニラストと前述したジェムシタビンとを組み合わせてなる治療薬が膵臓癌に対して相乗的な治療効果を奏するという知見を得て本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明者はトラニラストとジェムシタビンとの相乗効果が奏されるのが以下の理由によることが解明された。
【００１１】
図１は、ジェムシタビン（ＧＥＭ）による抗癌作用機序を説明する説明図である。
図１に示したように、細胞内では、デオキシシチジン（ｄＣｙｄ）からデオキシシチジン１リン酸（ｄＣＭＰ）が生成され、ｄＣＭＰからデオキシシチジン２リン酸（ｄＣＤＰ）が生成される。一方、ｄＣＤＰは、シチジン２リン酸（ＣＤＰ）からリボヌクレオチドリダクターゼサブユニットＭ１（ＲＲＭ１）による還元触媒作用によっても生成されており、両経路で生成されたｄＣＤＰから生成されたデオキシシチジン３リン酸（ｄＣＴＰ）を用いてＤＮＡが構築・複製される。
【００１２】
ところで、ジェムシタビン（ｄＦｄＣ）が細胞内に滲入すると、当該ｄＦｄＣからジェムシタビン１リン酸（ｄＦｄＣＭＰ）が生成され、ｄＦｄＣＭＰからジェムシタビン２リン酸（ｄＦｄＣＤＰ）が生成される。
このｄＦｄＣＤＰは、前述したＲＲＭ１の酵素活性を阻害するのでｄＣＤＰの生成量が減少する。
【００１３】
一方、ｄＦｄＣＤＰからはジェムシタビン３リン酸（ｄＦｄＣＴＰ）が生成されるようになっているので、細胞内におけるｄＦｄＣＴＰとｄＣＴＰとの濃度比は次第にｄＦｄＣＴＰの値が大きくなる方向へ傾き、ＤＮＡが複製する際にｄＣＴＰに代えてｄＦｄＣＴＰが取り込まれる。これによって当該細胞が死滅し、抗癌作用が奏されるのである。
ここで、本発明者は新たに、トラニラストは、前述したＲＲＭ１の分解能を備えるプロテアソームによるＲＲＭ１の分解を亢進させる作用を有するという知見を得た。
【００１４】
従って、トラニラストが滲入した細胞内では、プロテアソームによるＲＲＭ１の分解が亢進されてジェムシタビンの標的酵素であるＲＲＭ１の総量が減少し、残存するＲＲＭ１の酵素活性もジェムシタビンの代謝産物であるｄＦｄＣＤＰによって阻害されるのである。しかも、ＲＲＭ１の総量が減少しているため、ＲＲＭ１に対するｄＦｄＣＤＰの相対濃度が高くなり、当該酵素に対する酵素阻害作用が増大する。
【００１５】
このようにして、シチジン２リン酸（ＣＤＰ）からデオキシシチジン２リン酸（ｄＣＤＰ）への還元を触媒するリボヌクレオチドリダクターゼの活性を阻害する作用を備える第１化合物、例えばジェムシタビンと、前記リボヌクレオチドリダクターゼの分解を亢進させる作用を備える第２化合物、例えばトラニラストとの相乗効果が奏されるのである。
【００１６】
以上のような作用機序により両化合物による相乗効果が奏されるため、両化合物を組み合わせてなる癌治療薬は、正常細胞より活発な増殖性を示す略全ての種類の癌細胞に対して相乗的な抗癌作用を奏する。
特に膵臓癌については、両化合物による相乗的な抗癌作用が確認された。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
（本発明の実施形態）
以下、本発明に係る癌治療薬について詳述する。
癌の化学療法剤として既に市販されているジェムシタビン、パクリタキセル、ＣＰＴ−１１（塩酸イリノテカン）、及び５−ＦＵ（５−Fluorouracil）と、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、及びケロイド等の治療剤として既に市販されているトラニラストとをそれぞれ組み合わせて癌細胞に対する作用をｉｎ ｖｉｔｒｏ試験により検討した。
【００１８】
その結果、パクリタキセルとトラニラストとを組み合わせた癌治療薬、ＣＰＴ−１１とトラニラストとを組み合わせた癌治療薬、及び５−ＦＵとトラニラストとを組み合わせた癌治療薬ではいずれも、パクリタキセル、ＣＰＴ−１１、及び５−ＦＵをそれぞれ単独で用いた場合と比べて、癌細胞増殖抑制効果に変化は認められなかった。
しかし、ジェムシタビンとトラニラストとを組み合わせた癌治療薬を用いた場合、ジェムシタビンを単独で用いた場合に比べて、癌細胞増殖抑制効果が増大していた。
【００１９】
一方、トラニラストを単独で用いた場合には癌細胞増殖抑制効果は認められなかった。
つまり、ジェムシタビンとトラニラストとを組み合わせた癌治療薬を用いた場合、相乗的な癌細胞増殖抑制効果が奏されていた。
【００２０】
図１に示したように、ジェムシタビンによる癌細胞増殖抑制作用は、癌細胞内でジェムシタビン（ｄＦｄＣ）から代謝生成されたジェムシタビン２リン酸（ｄＦｄＣＤＰ）が、ＣＤＰからｄＣＤＰへの還元を触媒するリボヌクレオチドリダクターゼサブユニットＭ１（ＲＲＭ１）の酵素活性阻害するとともに、ｄＦｄＣＤＰから代謝生成されたｄＦｄＣＴＰがＤＮＡに取り込まれることによって惹起されることが知られている。
【００２１】
一方、本発明者が新たにトラニラストの作用機序について検討したところ、トラニラストはプロテアソームによるＲＲＭ１の分解を亢進させる作用を有していることが解明された。
【００２２】
従って、トラニラストのプロテアソームによるＲＲＭ１の分解亢進作用によって癌細胞内におけるＲＲＭ１の総量が減少する一方、前述したようにジェムシタビンの代謝生成物であるｄＦｄＣＤＰによって癌細胞中に残存するＲＲＭ１の酵素活性も阻害されるため、トラニラストとジェムシタビンとの相乗作用が奏されるのである。
【００２３】
ところで、これらジェムシタビン及びトラニラストは既に市販されており、それぞれ用法、用量、及び副作用等も既知である。よって、ジェムシタビンとトラニラストとを組み合わせて癌治療薬として用いる場合であっても、当該癌治療薬を安全に用いることができる。
【００２４】
ここで、ｉｎ ｖｉｔｒｏにあっては、ジェムシタビンが１００ｎＭ〜１００μＭの濃度であり、トラニラストが２５μＭ〜１００μＭの濃度になるように組み合わせた場合に癌細胞に対する相乗効果が認められ、より好ましくはジェムシタビンが１μＭ〜１００μＭの濃度であり、トラニラストが５０μＭ〜１００μＭの濃度になるように組み合わせた場合に癌細胞に対する相乗効果が更に認められた。
【００２５】
ここで、ジェムシタビンは、通常１０００ｍｇ／ｍ2の投与量で３０分間程度、点滴静注するが、直後の血中濃度は約６５μＭで半減期は１９分、２時間後には略１／１００の６５０ｎＭに減少する。従って１００ｎＭ〜１００μＭに設定したジェムシタビン濃度は妥当である。
【００２６】
一方、トラニラストは経口内服薬であり、３００ｍｇ／日（１００ｍｇ／回×３回）服用する。服用中のトラニラストの血中濃度は１００μＭ以上であることが報告されているため、２５〜１００μＭに設定したトラニラスト濃度は臨床使用量および血中濃度との対比においても妥当性がある。
【実施例１】
【００２７】
ジェムシタビン（ＧＥＭ）とトラニラストとを組み合わせてなる癌治療薬について説明する。
図２は、膵臓癌細胞株ＫＰ４のＧＥＭ及びトラニラストに対する感受性を試験した結果を示すグラフであり、縦軸は生細胞率を、また横軸はＧＥＭの濃度をそれぞれ示している。
【００２８】
かかる感受性試験は次のようにして行った。
膵臓癌細胞株ＫＰ４（独立行政法人 理化学研究所より入手）を培養液に所要細胞密度になるよう懸濁させ、マイクロプレート（９６穴）の各穴内に１×１０4細胞／穴となるようように分注し、ＣＯ2インキュベーター内、３７℃で１晩、静置培養した。
ここで、培養液には、ＲＰＭＩ１６４０（シグマ社製）にウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（シグマ社製）を１０％（容量／容量）になるように添加した溶液を用いた。
【００２９】
このようにしてＫＰ４が培養された各穴を６つのグループに分け、その内の５つのグループにはそれぞれＧＥＭ（イーライ・リリー社製）を１０ｎＭ、１００ｎＭ、１μＭ、１０μＭ、及び１００μＭになるように培養液に添加した。なお、残りの１グループの培養液にはＧＥＭは添加していない。更に、これら６グループをそれぞれ５つのサブグループに分け、その内の４サブグループにそれぞれにトラニラスト（キッセイ薬品工業株式会社製）を各グループ別に２５μＭ、５０μＭ、７５μＭ、及び１００μＭになるように培養液に添加した。なお、残りの１サブグループの培養液にはトラニラストは添加していない。
【００３０】
各穴内のＫＰ４を更に４８時間培養した後、各穴内のＫＰ４の生細胞数をＭＴＴ法により求めた。そして、ＧＥＭ及びトラニラストを添加していない場合のＭＴＴ法による測定値に対する、ＧＥＭ及び／又はトラニラストを添加した場合のＭＴＴ法による測定値を求めることによって、生細胞率とした。
なお、ＭＴＴ法による生細胞数の検出は、ＭＴＴキット（プロメガ社製）を用い、ＯＤ590nmを測定した。
【００３１】
また、図中、白抜き四角印はトラニラストを添加していない場合を、白抜き三角印はトラニラストを２５μＭになるように添加した場合を、黒丸印はトラニラストを５０μＭになるように添加した場合を、黒四角印はトラニラストを７５μＭになるように添加した場合を、白抜き丸印はトラニラストを１００μＭになるように添加した場合を、それぞれ示している。
【００３２】
その結果、図２に示した如く、いずれの場合もＧＥＭを添加した濃度が高くなるに従ってＫＰ４の生細胞率は低下していたが、トラニラスト添加群においてトラニラスト５０μＭ以上（黒丸印、黒四角印、白抜き丸印）では、ＧＥＭ１０μＭの場合で、ＫＰ４の生細胞率は略０．４であり、トラニラスト無添加群（白抜き四角印）の略０．８より低い値を示していた。
【００３３】
そこで、生細胞率を７０％になすに要するＧＥＭの濃度（ＩＣ70）を図２に基づいて計算した。その結果、トラニラストが添加されていない場合では６５．１μＭであったのに対し、トラニラストが５０μＭの場合では４．４９μＭであり、ＧＥＭとトラニラストとを組み合わせてなる本発明に係る癌治療薬にあっては、ＧＥＭのＩＣ70が略１／１４に低減されていた。
つまり、トラニラストを５０μＭとなるように添加した本発明に係る癌治療薬にあっては、ＧＥＭの効果が略１４倍増強されることが認められた。
【００３４】
図３は、ＧＥＭ、トラニラスト、並びにＧＥＭ及びトラニラストを組み合わせてなる本発明に係る癌治療薬の膵臓癌細胞に対する影響を示すヒストグラムであり、縦軸は生細胞率を示している。なお、各数値は図２の対応する数値による。
【００３５】
図中、（ａ）はＧＥＭ及びトラニラストを添加していないコントロールであり、（ｂ）はトラニラストのみを５０μＭになるように添加した場合を示しており、（ｃ）はＧＥＭのみを１０μＭになるように添加した場合を示している。また、（ｄ）は本発明に係る癌治療薬の一例を示しており、ＧＥＭが１０μＭでありトラニラストが５０μＭになるように添加してある。
【００３６】
図３から明らかなように、（ｂ）に示したトラニラストを単独で添加した場合は、（ａ）に示したコントロールとほぼ同じ値を示し、細胞増殖に何ら影響しなかった。一方、（ｃ）に示したＧＥＭを単独で添加した場合の生細胞率は略０．７９であり、（ｄ）に示した本発明に係る癌治療薬を添加した場合の生細胞率は略０．４２であり、後者の生細胞率は前者の生細胞率に比べて半数値程度まで有意に減少していた。
これらの結果は、トラニラストがＫＰ４のジェムシタビンに対する感受性を相乗的に増強することを示している。
【実施例２】
【００３７】
次に、５−ＦＵとトラニラストとを組み合わせてなる癌治療薬について説明する。
図４は、膵臓癌細胞株ＫＰ４の５−ＦＵ及びトラニラストに対する感受性を試験した結果を示すグラフであり、縦軸は生細胞率を、また横軸は５−ＦＵの濃度をそれぞれ示している。
【００３８】
かかる感受性試験は、５−ＦＵ（協和発酵工業株式会社製）の添加濃度を１００ｎＭ、１μＭ、１０μＭ、１００μＭ、及び１ｍＭとした以外は、実施例１で説明した方法と同様にして行った。
【００３９】
なお、図中、白抜き四角印はトラニラストを添加していない場合を、白抜き三角印はトラニラストを２５μＭになるように添加した場合を、黒丸印はトラニラストを５０μＭになるように添加した場合を、黒四角印はトラニラストを７５μＭになるように添加した場合を、白抜き丸印はトラニラストを１００μＭになるように添加した場合をそれぞれ示している。
その結果、図４に示した如く、トラニラストを添加した濃度に拘りなく、５−ＦＵを添加した濃度が高くなるに従ってＫＰ４の生細胞率が低下していた。
【００４０】
図５は、５−ＦＵ、トラニラスト、並びに５−ＦＵ及びトラニラストを組み合わせてなる癌治療薬の膵臓癌細胞に対する影響を示すヒストグラムであり、縦軸は生細胞率を示している。なお、各数値は図４の対応する数値による。
【００４１】
図中、（ａ）は５−ＦＵ及びトラニラストを添加していないコントロールであり、（ｂ）はトラニラストのみを５０μＭになるように添加した場合を示しており、（ｃ）は５−ＦＵのみを１００μＭになるように添加した場合を示している。また、（ｄ）は本発明に係る癌治療薬の一例を示しており、５−ＦＵが１００μＭでありトラニラストが５０μＭになるように添加してある。
【００４２】
図５から明らかなように、５−ＦＵを単独で添加した場合の生細胞率は約０．６２であり、５−ＦＵ及びトラニラストを組み合わせた癌治療薬を添加した場合の生細胞率も約０．６４であり、両者の生細胞率に有意差は認められなかった。
【実施例３】
【００４３】
次に、ＣＰＴ−１１とトラニラストとを組み合わせてなる癌治療薬について説明する。
図６は、膵臓癌細胞株ＫＰ４のＣＰＴ−１１及びトラニラストに対する感受性を試験した結果を示すグラフであり、縦軸は生細胞率を、また横軸はＣＰＴ−１１の濃度をそれぞれ示している。
【００４４】
かかる感受性試験は、実施例１で説明した方法と同様にして行った。
なお、図中、白抜き四角印はトラニラストを添加していない場合を、白抜き三角印はトラニラストを２５μＭになるように添加した場合を、黒丸印はトラニラストを５０μＭになるように添加した場合を、黒四角印はトラニラストを７５μＭになるように添加した場合を、白抜き丸印はトラニラストを１００μＭになるように添加した場合をそれぞれ示している。
その結果、図６に示した如く、トラニラストを添加した濃度に拘りなく、ＣＰＴ−１１（株式会社ヤクルト本社製）を添加した濃度が高くなるに従ってＫＰ４の生細胞率が低下していた。
【００４５】
図７は、ＣＰＴ−１１、トラニラスト、並びにＣＰＴ−１１及びトラニラストを組み合わせてなる癌治療薬の膵臓癌細胞に対する影響を示すヒストグラムであり、縦軸は生細胞率を示している。なお、各数値は図６の対応する数値による。
【００４６】
図中、（ａ）はＣＰＴ−１１及びトラニラストを添加していないコントロールであり、（ｂ）はトラニラストのみを５０μＭになるように添加した場合を示しており、（ｃ）はＣＰＴ−１１のみを１０μＭになるように添加した場合を示している。また、（ｄ）は本発明に係る癌治療薬の一例を示しており、ＣＰＴ−１１が１０μＭでありトラニラストが５０μＭになるように添加してある。
【００４７】
図７から明らかなように、ＣＰＴ−１１を単独で添加した場合の生細胞率は約０．８３であり、ＣＰＴ−１１及びトラニラストを組み合わせた癌治療薬を添加した場合の生細胞率は約０．８２であり、両者の生細胞率に有意差は認められなかった。
【実施例４】
【００４８】
次に、パクリタキセルとトラニラストとを組み合わせてなる癌治療薬について説明する。
図８は、膵臓癌細胞株ＫＰ４のパクリタキセル及びトラニラストに対する感受性を試験した結果を示すグラフであり、縦軸は生細胞率を、また横軸はパクリタキセルの濃度をそれぞれ示している。
【００４９】
かかる感受性試験は、パクリタキセル（ブリストル・マイヤーズ社製）の添加濃度を１００ｐＭ、１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ、及び１μＭとした以外は、実施例１で説明した方法と同様にして行った。
【００５０】
なお、図中、白抜き四角印はトラニラストを添加していない場合を、白抜き三角印はトラニラストを２５μＭになるように添加した場合を、黒丸印はトラニラストを５０μＭになるように添加した場合を、黒四角印はトラニラストを７５μＭになるように添加した場合を、白抜き丸印はトラニラストを１００μＭになるように添加した場合をそれぞれ示している。
その結果、図８に示した如く、トラニラストを添加した濃度に拘りなく、パクリタキセルを添加した濃度が高くなるに従ってＫＰ４の生細胞率が低下していた。
【００５１】
図９は、パクリタキセル、トラニラスト、並びにパクリタキセル及びトラニラストを組み合わせてなる癌治療薬の膵臓癌細胞に対する影響を示すヒストグラムであり、縦軸は生細胞率を示している。なお、各数値は図８の対応する数値による。
【００５２】
図中、（ａ）はパクリタキセル及びトラニラストを添加していないコントロールであり、（ｂ）はトラニラストのみを５０μＭになるように添加した場合を示しており、（ｃ）はパクリタキセルのみを１００μＭになるように添加した場合を示している。また、（ｄ）は本発明に係る癌治療薬の一例を示しており、パクリタキセルが１００μＭでありトラニラストが５０μＭになるように添加してある。
【００５３】
図９から明らかなように、パクリタキセルを単独で添加した場合の生細胞率は約０．８４であり、パクリタキセル及びトラニラストを組み合わせた癌治療薬を添加した場合の生細胞率は約０．８２であり、両者の生細胞率に有意差は認められなかった。
【実施例５】
【００５４】
次に、トラニラストの作用起序について検討した結果について説明する。
まず、細胞内におけるＲＲＭ１の濃度に及ぼすトラニラストの影響について検討した。
図１０は、細胞内におけるＲＲＭ１の濃度に及ぼすトラニラストの影響について検討した結果（上段）を、比較例として細胞内におけるβ−アクチンの濃度に及ぼすトラニラストの影響を検討した結果（下段）とともに示す写真図である。
【００５５】
前述した培養液を適量ずつ６穴プレート（ファルコン社）に備えられた４穴に分注し、各穴内にＫＰ４をそれぞれ略１×１０5 細胞／穴となるように懸濁した後、各穴内の培養液にトラニラストを５０μＭ、１００μＭ、２００μＭになるように添加した。なお、残りの培養器にはコントロールとしてトラニラストの添加は行っていない。
【００５６】
このプレートを３７℃で４８時間、ＣＯ2インキュベータ内にて静置培養した。そして、各穴別にＫＰ４の細胞抽出液を調整し、得られた各細胞培養液を共試液としてトリスグリシンゲル（インビトロジェン社）で電気泳動し、ＲＲＭ１抗体及びβ−アクチン抗体を用いたウェスタン・ブロッド法によりＲＲＭ１およびβ−アクチンの発現を解析した。
【００５７】
なお、ＲＲＭ１の解析に用いる一次抗体には、マウスＲＲＭ１モノクローナル抗体（ケミコン社製）を用い、同二次抗体には、抗マウスＩＧｇ抗体（サンタクルス社製）を用いた。また、発色にはＥＣＬシステム（アマシャム・バイオサイエンス社製）を用いた。
【００５８】
図１０から明らかなように、構造タンパク質の原料であるβ−アクチンについては、添加したトラニラストの濃度に拘らず全てコントロールと同程度の発色を示しており、細胞内におけるβ−アクチンの濃度に対してトラニラストはなにも影響を及ぼしてなかった。
【００５９】
これに対して、前述したようにＧＥＭの標的酵素であるＲＲＭ１については、トラニラストを添加した場合の発色程度はコントロールの発色程度に比べて総じて弱く、しかもその発色程度はトラニラストの添加濃度が高くなるに従い、弱くなっていた。
つまり、トラニラストの添加量が多くなるに従って細胞内におけるＲＲＭ１の濃度は低下していた。
【００６０】
次に、このようなトラニラスト（Ｔｒａｎｉｌａｓｔ）の添加によるＲＲＭ１濃度の低下の機序について検討した。
図１１は、トラニラスト及びＭＧ１３２の添加量を種々変更した場合の細胞内におけるＲＲＭ１の濃度について検討した結果（上段）を、比較例として細胞内におけるβ−アクチンの濃度について検討した結果（下段）とともに示す写真図である。なお、ＭＧ１３２は、細胞内でＲＲＭ１を分解するプロテアソームの活性を阻害する薬剤である。
【００６１】
図１１から明らかなように、β−アクチンについては、添加したトラニラストの濃度及びＭＧ１３２の添加の有無に拘らず全てコントロールと同程度の発色を示していた。
これに対してＲＲＭ１については、ＭＧ１３２を添加していない場合は、前同様、トラニラストの添加量が多くなるに従って細胞内におけるＲＲＭ１の濃度は低下していたが、ＭＧ１３２を添加した場合はトラニラストの添加濃度に拘らず、ＭＧ１３２のみを添加した場合と略同程度の発色を示していた。
つまり、ＭＧ１３２によってプロテアソームの活性が阻害された場合、トラニラストはＲＲＭ１発現には、なんら影響を及ぼさなかったのである。
【００６２】
以上の検討結果より、トラニラストはＧＥＭの標的酵素であるＲＲＭ１を分解するプロテアソームによるＲＲＭ１の分解を亢進していることが判明した。
これによって、ＧＥＭ及びトラニラストを併用した場合、ＧＥＭを単独で用いた場合に比べて抗癌作用が相乗的に増大するのである。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】ジェムシタビン（ＧＥＭ）による抗癌作用機序を説明する説明図である。
【図２】膵臓癌細胞株ＫＰ４のＧＥＭ及びトラニラストに対する感受性を試験した結果を示すグラフである。
【図３】ＧＥＭ、トラニラスト、並びにＧＥＭ及びトラニラストを組み合わせてなる本発明に係る癌治療薬の膵臓癌細胞に対する影響を示すヒストグラムである。
【図４】膵臓癌細胞株ＫＰ４の５−ＦＵ及びトラニラストに対する感受性を試験した結果を示すグラフである。
【図５】５−ＦＵ、トラニラスト、並びに５−ＦＵ及びトラニラストを組み合わせてなる癌治療薬の膵臓癌細胞に対する影響を示すヒストグラムである。
【図６】膵臓癌細胞株ＫＰ４のＣＰＴ−１１及びトラニラストに対する感受性を試験した結果を示すグラフである。
【図７】ＣＰＴ−１１、トラニラスト、並びにＣＰＴ−１１及びトラニラストを組み合わせてなる癌治療薬の膵臓癌細胞に対する影響を示すヒストグラムである。
【図８】膵臓癌細胞株ＫＰ４のパクリタキセル及びトラニラストに対する感受性を試験した結果を示すグラフである。
【図９】パクリタキセル、トラニラスト、並びにパクリタキセル及びトラニラストを組み合わせてなる癌治療薬の膵臓癌細胞に対する影響を示すヒストグラムである。
【図１０】細胞内におけるＲＲＭ１発現に及ぼすトラニラストの影響について検討したウエスタンブロット解析の結果（上段）を、比較例として細胞内におけるβ−アクチン発現に及ぼすトラニラストの影響を検討した結果（下段）とともに示す写真図である。
【図１１】トラニラスト及びＭＧ１３２の添加量を種々変更した場合の細胞内におけるＲＲＭ１の発現について検討した結果（上段）を、比較例として細胞内におけるβ−アクチンの発現について検討した結果（下段）とともに示す写真図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は癌治療薬、主に膵臓癌の治療に用いる治療薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
膵臓癌は、腹腔内の深部に位置するため早期発見が困難であるのに加え、充実性の腫瘤を形成して浸潤及び転移を起こし易く、また、外科手術により切除可能な場合であっても早期に再発する割合が高い難治癌であるため、膵臓癌に対しては化学療法による治療が重要な役割を果たしている。
【０００３】
かかる化学療法に用いる治療薬としては多くの場合、ジェムシタビンが選択されているが、更に有効な治療薬の開発が要求されている。
これに対して、後述する特許文献１には、例えばジェムシタビンとアセチルジナリン（ＣＩ−９９４）とを組み合わせた治療薬が開示されている。
【特許文献１】特表２００２−５２５３２０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、アセチルジナリン（ＣＩ−９９４）は臨床試験中の癌治療剤であるので、どのような副作用を招来するのか不明であるのに加え、前記特許文献１には膵臓癌に対する試験結果が示されておらず、ジェムシタビンとアセチルジナリン（ＣＩ−９９４）とを組み合わせた治療薬が膵臓癌に対してどの程度の治療効果をもたらすのかが不明であるという問題があった。
【０００５】
本発明は、斯かる事情に鑑みてなされたものであって、主に膵臓癌に対してより優れた治療効果を示す癌治療薬を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（１） 本発明に係る癌治療薬は、シチジン２リン酸（ＣＤＰ）からデオキシシチジン２リン酸（ｄＣＤＰ）への還元を触媒するリボヌクレオチドリダクターゼの活性を阻害する作用を備える第１化合物と、前記リボヌクレオチドリダクターゼの分解を亢進させる作用を備える第２化合物とを組み合わせてなることを特徴とする。
【０００７】
（２） 本発明に係る癌治療薬は必要に応じて、前記第１化合物はジェムシタビンであることを特徴とする。
【０００８】
（３） また、本発明に係る癌治療薬は必要に応じて、前記第２化合物はトラニラストであることを特徴とする。
【０００９】
（４） 更に、本発明に係る癌治療薬は必要に応じて、治療対象の癌は膵臓癌であることを特徴とする。
【００１０】
本発明者は、市販されている複数の治療薬について鋭意検討した結果、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、及びケロイド等の治療に用いられているトラニラストと前述したジェムシタビンとを組み合わせてなる治療薬が膵臓癌に対して相乗的な治療効果を奏するという知見を得て本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明者はトラニラストとジェムシタビンとの相乗効果が奏されるのが以下の理由によることが解明された。
【００１１】
図１は、ジェムシタビン（ＧＥＭ）による抗癌作用機序を説明する説明図である。
図１に示したように、細胞内では、デオキシシチジン（ｄＣｙｄ）からデオキシシチジン１リン酸（ｄＣＭＰ）が生成され、ｄＣＭＰからデオキシシチジン２リン酸（ｄＣＤＰ）が生成される。一方、ｄＣＤＰは、シチジン２リン酸（ＣＤＰ）からリボヌクレオチドリダクターゼサブユニットＭ１（ＲＲＭ１）による還元触媒作用によっても生成されており、両経路で生成されたｄＣＤＰから生成されたデオキシシチジン３リン酸（ｄＣＴＰ）を用いてＤＮＡが構築・複製される。
【００１２】
ところで、ジェムシタビン（ｄＦｄＣ）が細胞内に滲入すると、当該ｄＦｄＣからジェムシタビン１リン酸（ｄＦｄＣＭＰ）が生成され、ｄＦｄＣＭＰからジェムシタビン２リン酸（ｄＦｄＣＤＰ）が生成される。
このｄＦｄＣＤＰは、前述したＲＲＭ１の酵素活性を阻害するのでｄＣＤＰの生成量が減少する。
【００１３】
一方、ｄＦｄＣＤＰからはジェムシタビン３リン酸（ｄＦｄＣＴＰ）が生成されるようになっているので、細胞内におけるｄＦｄＣＴＰとｄＣＴＰとの濃度比は次第にｄＦｄＣＴＰの値が大きくなる方向へ傾き、ＤＮＡが複製する際にｄＣＴＰに代えてｄＦｄＣＴＰが取り込まれる。これによって当該細胞が死滅し、抗癌作用が奏されるのである。
ここで、本発明者は新たに、トラニラストは、前述したＲＲＭ１の分解能を備えるプロテアソームによるＲＲＭ１の分解を亢進させる作用を有するという知見を得た。
【００１４】
従って、トラニラストが滲入した細胞内では、プロテアソームによるＲＲＭ１の分解が亢進されてジェムシタビンの標的酵素であるＲＲＭ１の総量が減少し、残存するＲＲＭ１の酵素活性もジェムシタビンの代謝産物であるｄＦｄＣＤＰによって阻害されるのである。しかも、ＲＲＭ１の総量が減少しているため、ＲＲＭ１に対するｄＦｄＣＤＰの相対濃度が高くなり、当該酵素に対する酵素阻害作用が増大する。
【００１５】
このようにして、シチジン２リン酸（ＣＤＰ）からデオキシシチジン２リン酸（ｄＣＤＰ）への還元を触媒するリボヌクレオチドリダクターゼの活性を阻害する作用を備える第１化合物、例えばジェムシタビンと、前記リボヌクレオチドリダクターゼの分解を亢進させる作用を備える第２化合物、例えばトラニラストとの相乗効果が奏されるのである。
【００１６】
以上のような作用機序により両化合物による相乗効果が奏されるため、両化合物を組み合わせてなる癌治療薬は、正常細胞より活発な増殖性を示す略全ての種類の癌細胞に対して相乗的な抗癌作用を奏する。
特に膵臓癌については、両化合物による相乗的な抗癌作用が確認された。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
（本発明の実施形態）
以下、本発明に係る癌治療薬について詳述する。
癌の化学療法剤として既に市販されているジェムシタビン、パクリタキセル、ＣＰＴ−１１（塩酸イリノテカン）、及び５−ＦＵ（５−Fluorouracil）と、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、及びケロイド等の治療剤として既に市販されているトラニラストとをそれぞれ組み合わせて癌細胞に対する作用をｉｎ ｖｉｔｒｏ試験により検討した。
【００１８】
その結果、パクリタキセルとトラニラストとを組み合わせた癌治療薬、ＣＰＴ−１１とトラニラストとを組み合わせた癌治療薬、及び５−ＦＵとトラニラストとを組み合わせた癌治療薬ではいずれも、パクリタキセル、ＣＰＴ−１１、及び５−ＦＵをそれぞれ単独で用いた場合と比べて、癌細胞増殖抑制効果に変化は認められなかった。
しかし、ジェムシタビンとトラニラストとを組み合わせた癌治療薬を用いた場合、ジェムシタビンを単独で用いた場合に比べて、癌細胞増殖抑制効果が増大していた。
【００１９】
一方、トラニラストを単独で用いた場合には癌細胞増殖抑制効果は認められなかった。
つまり、ジェムシタビンとトラニラストとを組み合わせた癌治療薬を用いた場合、相乗的な癌細胞増殖抑制効果が奏されていた。
【００２０】
図１に示したように、ジェムシタビンによる癌細胞増殖抑制作用は、癌細胞内でジェムシタビン（ｄＦｄＣ）から代謝生成されたジェムシタビン２リン酸（ｄＦｄＣＤＰ）が、ＣＤＰからｄＣＤＰへの還元を触媒するリボヌクレオチドリダクターゼサブユニットＭ１（ＲＲＭ１）の酵素活性阻害するとともに、ｄＦｄＣＤＰから代謝生成されたｄＦｄＣＴＰがＤＮＡに取り込まれることによって惹起されることが知られている。
【００２１】
一方、本発明者が新たにトラニラストの作用機序について検討したところ、トラニラストはプロテアソームによるＲＲＭ１の分解を亢進させる作用を有していることが解明された。
【００２２】
従って、トラニラストのプロテアソームによるＲＲＭ１の分解亢進作用によって癌細胞内におけるＲＲＭ１の総量が減少する一方、前述したようにジェムシタビンの代謝生成物であるｄＦｄＣＤＰによって癌細胞中に残存するＲＲＭ１の酵素活性も阻害されるため、トラニラストとジェムシタビンとの相乗作用が奏されるのである。
【００２３】
ところで、これらジェムシタビン及びトラニラストは既に市販されており、それぞれ用法、用量、及び副作用等も既知である。よって、ジェムシタビンとトラニラストとを組み合わせて癌治療薬として用いる場合であっても、当該癌治療薬を安全に用いることができる。
【００２４】
ここで、ｉｎ ｖｉｔｒｏにあっては、ジェムシタビンが１００ｎＭ〜１００μＭの濃度であり、トラニラストが２５μＭ〜１００μＭの濃度になるように組み合わせた場合に癌細胞に対する相乗効果が認められ、より好ましくはジェムシタビンが１μＭ〜１００μＭの濃度であり、トラニラストが５０μＭ〜１００μＭの濃度になるように組み合わせた場合に癌細胞に対する相乗効果が更に認められた。
【００２５】
ここで、ジェムシタビンは、通常１０００ｍｇ／ｍ2の投与量で３０分間程度、点滴静注するが、直後の血中濃度は約６５μＭで半減期は１９分、２時間後には略１／１００の６５０ｎＭに減少する。従って１００ｎＭ〜１００μＭに設定したジェムシタビン濃度は妥当である。
【００２６】
一方、トラニラストは経口内服薬であり、３００ｍｇ／日（１００ｍｇ／回×３回）服用する。服用中のトラニラストの血中濃度は１００μＭ以上であることが報告されているため、２５〜１００μＭに設定したトラニラスト濃度は臨床使用量および血中濃度との対比においても妥当性がある。
【実施例１】
【００２７】
ジェムシタビン（ＧＥＭ）とトラニラストとを組み合わせてなる癌治療薬について説明する。
図２は、膵臓癌細胞株ＫＰ４のＧＥＭ及びトラニラストに対する感受性を試験した結果を示すグラフであり、縦軸は生細胞率を、また横軸はＧＥＭの濃度をそれぞれ示している。
【００２８】
かかる感受性試験は次のようにして行った。
膵臓癌細胞株ＫＰ４（独立行政法人 理化学研究所より入手）を培養液に所要細胞密度になるよう懸濁させ、マイクロプレート（９６穴）の各穴内に１×１０4細胞／穴となるようように分注し、ＣＯ2インキュベーター内、３７℃で１晩、静置培養した。
ここで、培養液には、ＲＰＭＩ１６４０（シグマ社製）にウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（シグマ社製）を１０％（容量／容量）になるように添加した溶液を用いた。
【００２９】
このようにしてＫＰ４が培養された各穴を６つのグループに分け、その内の５つのグループにはそれぞれＧＥＭ（イーライ・リリー社製）を１０ｎＭ、１００ｎＭ、１μＭ、１０μＭ、及び１００μＭになるように培養液に添加した。なお、残りの１グループの培養液にはＧＥＭは添加していない。更に、これら６グループをそれぞれ５つのサブグループに分け、その内の４サブグループにそれぞれにトラニラスト（キッセイ薬品工業株式会社製）を各グループ別に２５μＭ、５０μＭ、７５μＭ、及び１００μＭになるように培養液に添加した。なお、残りの１サブグループの培養液にはトラニラストは添加していない。
【００３０】
各穴内のＫＰ４を更に４８時間培養した後、各穴内のＫＰ４の生細胞数をＭＴＴ法により求めた。そして、ＧＥＭ及びトラニラストを添加していない場合のＭＴＴ法による測定値に対する、ＧＥＭ及び／又はトラニラストを添加した場合のＭＴＴ法による測定値を求めることによって、生細胞率とした。
なお、ＭＴＴ法による生細胞数の検出は、ＭＴＴキット（プロメガ社製）を用い、ＯＤ590nmを測定した。
【００３１】
また、図中、白抜き四角印はトラニラストを添加していない場合を、白抜き三角印はトラニラストを２５μＭになるように添加した場合を、黒丸印はトラニラストを５０μＭになるように添加した場合を、黒四角印はトラニラストを７５μＭになるように添加した場合を、白抜き丸印はトラニラストを１００μＭになるように添加した場合を、それぞれ示している。
【００３２】
その結果、図２に示した如く、いずれの場合もＧＥＭを添加した濃度が高くなるに従ってＫＰ４の生細胞率は低下していたが、トラニラスト添加群においてトラニラスト５０μＭ以上（黒丸印、黒四角印、白抜き丸印）では、ＧＥＭ１０μＭの場合で、ＫＰ４の生細胞率は略０．４であり、トラニラスト無添加群（白抜き四角印）の略０．８より低い値を示していた。
【００３３】
そこで、生細胞率を７０％になすに要するＧＥＭの濃度（ＩＣ70）を図２に基づいて計算した。その結果、トラニラストが添加されていない場合では６５．１μＭであったのに対し、トラニラストが５０μＭの場合では４．４９μＭであり、ＧＥＭとトラニラストとを組み合わせてなる本発明に係る癌治療薬にあっては、ＧＥＭのＩＣ70が略１／１４に低減されていた。
つまり、トラニラストを５０μＭとなるように添加した本発明に係る癌治療薬にあっては、ＧＥＭの効果が略１４倍増強されることが認められた。
【００３４】
図３は、ＧＥＭ、トラニラスト、並びにＧＥＭ及びトラニラストを組み合わせてなる本発明に係る癌治療薬の膵臓癌細胞に対する影響を示すヒストグラムであり、縦軸は生細胞率を示している。なお、各数値は図２の対応する数値による。
【００３５】
図中、（ａ）はＧＥＭ及びトラニラストを添加していないコントロールであり、（ｂ）はトラニラストのみを５０μＭになるように添加した場合を示しており、（ｃ）はＧＥＭのみを１０μＭになるように添加した場合を示している。また、（ｄ）は本発明に係る癌治療薬の一例を示しており、ＧＥＭが１０μＭでありトラニラストが５０μＭになるように添加してある。
【００３６】
図３から明らかなように、（ｂ）に示したトラニラストを単独で添加した場合は、（ａ）に示したコントロールとほぼ同じ値を示し、細胞増殖に何ら影響しなかった。一方、（ｃ）に示したＧＥＭを単独で添加した場合の生細胞率は略０．７９であり、（ｄ）に示した本発明に係る癌治療薬を添加した場合の生細胞率は略０．４２であり、後者の生細胞率は前者の生細胞率に比べて半数値程度まで有意に減少していた。
これらの結果は、トラニラストがＫＰ４のジェムシタビンに対する感受性を相乗的に増強することを示している。
【実施例２】
【００３７】
次に、５−ＦＵとトラニラストとを組み合わせてなる癌治療薬について説明する。
図４は、膵臓癌細胞株ＫＰ４の５−ＦＵ及びトラニラストに対する感受性を試験した結果を示すグラフであり、縦軸は生細胞率を、また横軸は５−ＦＵの濃度をそれぞれ示している。
【００３８】
かかる感受性試験は、５−ＦＵ（協和発酵工業株式会社製）の添加濃度を１００ｎＭ、１μＭ、１０μＭ、１００μＭ、及び１ｍＭとした以外は、実施例１で説明した方法と同様にして行った。
【００３９】
なお、図中、白抜き四角印はトラニラストを添加していない場合を、白抜き三角印はトラニラストを２５μＭになるように添加した場合を、黒丸印はトラニラストを５０μＭになるように添加した場合を、黒四角印はトラニラストを７５μＭになるように添加した場合を、白抜き丸印はトラニラストを１００μＭになるように添加した場合をそれぞれ示している。
その結果、図４に示した如く、トラニラストを添加した濃度に拘りなく、５−ＦＵを添加した濃度が高くなるに従ってＫＰ４の生細胞率が低下していた。
【００４０】
図５は、５−ＦＵ、トラニラスト、並びに５−ＦＵ及びトラニラストを組み合わせてなる癌治療薬の膵臓癌細胞に対する影響を示すヒストグラムであり、縦軸は生細胞率を示している。なお、各数値は図４の対応する数値による。
【００４１】
図中、（ａ）は５−ＦＵ及びトラニラストを添加していないコントロールであり、（ｂ）はトラニラストのみを５０μＭになるように添加した場合を示しており、（ｃ）は５−ＦＵのみを１００μＭになるように添加した場合を示している。また、（ｄ）は本発明に係る癌治療薬の一例を示しており、５−ＦＵが１００μＭでありトラニラストが５０μＭになるように添加してある。
【００４２】
図５から明らかなように、５−ＦＵを単独で添加した場合の生細胞率は約０．６２であり、５−ＦＵ及びトラニラストを組み合わせた癌治療薬を添加した場合の生細胞率も約０．６４であり、両者の生細胞率に有意差は認められなかった。
【実施例３】
【００４３】
次に、ＣＰＴ−１１とトラニラストとを組み合わせてなる癌治療薬について説明する。
図６は、膵臓癌細胞株ＫＰ４のＣＰＴ−１１及びトラニラストに対する感受性を試験した結果を示すグラフであり、縦軸は生細胞率を、また横軸はＣＰＴ−１１の濃度をそれぞれ示している。
【００４４】
かかる感受性試験は、実施例１で説明した方法と同様にして行った。
なお、図中、白抜き四角印はトラニラストを添加していない場合を、白抜き三角印はトラニラストを２５μＭになるように添加した場合を、黒丸印はトラニラストを５０μＭになるように添加した場合を、黒四角印はトラニラストを７５μＭになるように添加した場合を、白抜き丸印はトラニラストを１００μＭになるように添加した場合をそれぞれ示している。
その結果、図６に示した如く、トラニラストを添加した濃度に拘りなく、ＣＰＴ−１１（株式会社ヤクルト本社製）を添加した濃度が高くなるに従ってＫＰ４の生細胞率が低下していた。
【００４５】
図７は、ＣＰＴ−１１、トラニラスト、並びにＣＰＴ−１１及びトラニラストを組み合わせてなる癌治療薬の膵臓癌細胞に対する影響を示すヒストグラムであり、縦軸は生細胞率を示している。なお、各数値は図６の対応する数値による。
【００４６】
図中、（ａ）はＣＰＴ−１１及びトラニラストを添加していないコントロールであり、（ｂ）はトラニラストのみを５０μＭになるように添加した場合を示しており、（ｃ）はＣＰＴ−１１のみを１０μＭになるように添加した場合を示している。また、（ｄ）は本発明に係る癌治療薬の一例を示しており、ＣＰＴ−１１が１０μＭでありトラニラストが５０μＭになるように添加してある。
【００４７】
図７から明らかなように、ＣＰＴ−１１を単独で添加した場合の生細胞率は約０．８３であり、ＣＰＴ−１１及びトラニラストを組み合わせた癌治療薬を添加した場合の生細胞率は約０．８２であり、両者の生細胞率に有意差は認められなかった。
【実施例４】
【００４８】
次に、パクリタキセルとトラニラストとを組み合わせてなる癌治療薬について説明する。
図８は、膵臓癌細胞株ＫＰ４のパクリタキセル及びトラニラストに対する感受性を試験した結果を示すグラフであり、縦軸は生細胞率を、また横軸はパクリタキセルの濃度をそれぞれ示している。
【００４９】
かかる感受性試験は、パクリタキセル（ブリストル・マイヤーズ社製）の添加濃度を１００ｐＭ、１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ、及び１μＭとした以外は、実施例１で説明した方法と同様にして行った。
【００５０】
なお、図中、白抜き四角印はトラニラストを添加していない場合を、白抜き三角印はトラニラストを２５μＭになるように添加した場合を、黒丸印はトラニラストを５０μＭになるように添加した場合を、黒四角印はトラニラストを７５μＭになるように添加した場合を、白抜き丸印はトラニラストを１００μＭになるように添加した場合をそれぞれ示している。
その結果、図８に示した如く、トラニラストを添加した濃度に拘りなく、パクリタキセルを添加した濃度が高くなるに従ってＫＰ４の生細胞率が低下していた。
【００５１】
図９は、パクリタキセル、トラニラスト、並びにパクリタキセル及びトラニラストを組み合わせてなる癌治療薬の膵臓癌細胞に対する影響を示すヒストグラムであり、縦軸は生細胞率を示している。なお、各数値は図８の対応する数値による。
【００５２】
図中、（ａ）はパクリタキセル及びトラニラストを添加していないコントロールであり、（ｂ）はトラニラストのみを５０μＭになるように添加した場合を示しており、（ｃ）はパクリタキセルのみを１００μＭになるように添加した場合を示している。また、（ｄ）は本発明に係る癌治療薬の一例を示しており、パクリタキセルが１００μＭでありトラニラストが５０μＭになるように添加してある。
【００５３】
図９から明らかなように、パクリタキセルを単独で添加した場合の生細胞率は約０．８４であり、パクリタキセル及びトラニラストを組み合わせた癌治療薬を添加した場合の生細胞率は約０．８２であり、両者の生細胞率に有意差は認められなかった。
【実施例５】
【００５４】
次に、トラニラストの作用起序について検討した結果について説明する。
まず、細胞内におけるＲＲＭ１の濃度に及ぼすトラニラストの影響について検討した。
図１０は、細胞内におけるＲＲＭ１の濃度に及ぼすトラニラストの影響について検討した結果（上段）を、比較例として細胞内におけるβ−アクチンの濃度に及ぼすトラニラストの影響を検討した結果（下段）とともに示す写真図である。
【００５５】
前述した培養液を適量ずつ６穴プレート（ファルコン社）に備えられた４穴に分注し、各穴内にＫＰ４をそれぞれ略１×１０5 細胞／穴となるように懸濁した後、各穴内の培養液にトラニラストを５０μＭ、１００μＭ、２００μＭになるように添加した。なお、残りの培養器にはコントロールとしてトラニラストの添加は行っていない。
【００５６】
このプレートを３７℃で４８時間、ＣＯ2インキュベータ内にて静置培養した。そして、各穴別にＫＰ４の細胞抽出液を調整し、得られた各細胞培養液を共試液としてトリスグリシンゲル（インビトロジェン社）で電気泳動し、ＲＲＭ１抗体及びβ−アクチン抗体を用いたウェスタン・ブロッド法によりＲＲＭ１およびβ−アクチンの発現を解析した。
【００５７】
なお、ＲＲＭ１の解析に用いる一次抗体には、マウスＲＲＭ１モノクローナル抗体（ケミコン社製）を用い、同二次抗体には、抗マウスＩＧｇ抗体（サンタクルス社製）を用いた。また、発色にはＥＣＬシステム（アマシャム・バイオサイエンス社製）を用いた。
【００５８】
図１０から明らかなように、構造タンパク質の原料であるβ−アクチンについては、添加したトラニラストの濃度に拘らず全てコントロールと同程度の発色を示しており、細胞内におけるβ−アクチンの濃度に対してトラニラストはなにも影響を及ぼしてなかった。
【００５９】
これに対して、前述したようにＧＥＭの標的酵素であるＲＲＭ１については、トラニラストを添加した場合の発色程度はコントロールの発色程度に比べて総じて弱く、しかもその発色程度はトラニラストの添加濃度が高くなるに従い、弱くなっていた。
つまり、トラニラストの添加量が多くなるに従って細胞内におけるＲＲＭ１の濃度は低下していた。
【００６０】
次に、このようなトラニラスト（Ｔｒａｎｉｌａｓｔ）の添加によるＲＲＭ１濃度の低下の機序について検討した。
図１１は、トラニラスト及びＭＧ１３２の添加量を種々変更した場合の細胞内におけるＲＲＭ１の濃度について検討した結果（上段）を、比較例として細胞内におけるβ−アクチンの濃度について検討した結果（下段）とともに示す写真図である。なお、ＭＧ１３２は、細胞内でＲＲＭ１を分解するプロテアソームの活性を阻害する薬剤である。
【００６１】
図１１から明らかなように、β−アクチンについては、添加したトラニラストの濃度及びＭＧ１３２の添加の有無に拘らず全てコントロールと同程度の発色を示していた。
これに対してＲＲＭ１については、ＭＧ１３２を添加していない場合は、前同様、トラニラストの添加量が多くなるに従って細胞内におけるＲＲＭ１の濃度は低下していたが、ＭＧ１３２を添加した場合はトラニラストの添加濃度に拘らず、ＭＧ１３２のみを添加した場合と略同程度の発色を示していた。
つまり、ＭＧ１３２によってプロテアソームの活性が阻害された場合、トラニラストはＲＲＭ１発現には、なんら影響を及ぼさなかったのである。
【００６２】
以上の検討結果より、トラニラストはＧＥＭの標的酵素であるＲＲＭ１を分解するプロテアソームによるＲＲＭ１の分解を亢進していることが判明した。
これによって、ＧＥＭ及びトラニラストを併用した場合、ＧＥＭを単独で用いた場合に比べて抗癌作用が相乗的に増大するのである。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】ジェムシタビン（ＧＥＭ）による抗癌作用機序を説明する説明図である。
【図２】膵臓癌細胞株ＫＰ４のＧＥＭ及びトラニラストに対する感受性を試験した結果を示すグラフである。
【図３】ＧＥＭ、トラニラスト、並びにＧＥＭ及びトラニラストを組み合わせてなる本発明に係る癌治療薬の膵臓癌細胞に対する影響を示すヒストグラムである。
【図４】膵臓癌細胞株ＫＰ４の５−ＦＵ及びトラニラストに対する感受性を試験した結果を示すグラフである。
【図５】５−ＦＵ、トラニラスト、並びに５−ＦＵ及びトラニラストを組み合わせてなる癌治療薬の膵臓癌細胞に対する影響を示すヒストグラムである。
【図６】膵臓癌細胞株ＫＰ４のＣＰＴ−１１及びトラニラストに対する感受性を試験した結果を示すグラフである。
【図７】ＣＰＴ−１１、トラニラスト、並びにＣＰＴ−１１及びトラニラストを組み合わせてなる癌治療薬の膵臓癌細胞に対する影響を示すヒストグラムである。
【図８】膵臓癌細胞株ＫＰ４のパクリタキセル及びトラニラストに対する感受性を試験した結果を示すグラフである。
【図９】パクリタキセル、トラニラスト、並びにパクリタキセル及びトラニラストを組み合わせてなる癌治療薬の膵臓癌細胞に対する影響を示すヒストグラムである。
【図１０】細胞内におけるＲＲＭ１発現に及ぼすトラニラストの影響について検討したウエスタンブロット解析の結果（上段）を、比較例として細胞内におけるβ−アクチン発現に及ぼすトラニラストの影響を検討した結果（下段）とともに示す写真図である。
【図１１】トラニラスト及びＭＧ１３２の添加量を種々変更した場合の細胞内におけるＲＲＭ１の発現について検討した結果（上段）を、比較例として細胞内におけるβ−アクチンの発現について検討した結果（下段）とともに示す写真図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
シチジン２リン酸からデオキシシチジン２リン酸への還元を触媒するリボヌクレオチドリダクターゼの活性を阻害する作用を備える第１化合物と、前記リボヌクレオチドリダクターゼの分解を亢進させる作用を備える第２化合物とを組み合わせてなる癌治療薬。
【請求項２】
前記第１化合物はジェムシタビンである請求項１記載の癌治療薬。
【請求項３】
前記第２化合物はトラニラストである請求項１又は２記載の癌治療薬。
【請求項４】
治療対象の癌は膵臓癌である請求項１から３のいずれかに記載の癌治療薬。
【請求項１】
シチジン２リン酸からデオキシシチジン２リン酸への還元を触媒するリボヌクレオチドリダクターゼの活性を阻害する作用を備える第１化合物と、前記リボヌクレオチドリダクターゼの分解を亢進させる作用を備える第２化合物とを組み合わせてなる癌治療薬。
【請求項２】
前記第１化合物はジェムシタビンである請求項１記載の癌治療薬。
【請求項３】
前記第２化合物はトラニラストである請求項１又は２記載の癌治療薬。
【請求項４】
治療対象の癌は膵臓癌である請求項１から３のいずれかに記載の癌治療薬。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公開番号】特開２００９−７３７５５（Ｐ２００９−７３７５５Ａ）
【公開日】平成２１年４月９日（２００９．４．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２４３７９２（Ｐ２００７−２４３７９２）
【出願日】平成１９年９月２０日（２００７．９．２０）
【出願人】（５０４２０９６５５）国立大学法人佐賀大学 (176)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年４月９日（２００９．４．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年９月２０日（２００７．９．２０）
【出願人】（５０４２０９６５５）国立大学法人佐賀大学 (176)
【Ｆターム（参考）】
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