発酵によるチアミン産生
本発明は、チアミン産物を過剰産生させそしてチアミン産物を培地中に放出させる突然変異を含む微生物を使用して、チアミン産物を産生させる方法を提供する。この突然変異を含む微生物の生物学的に純粋な培養物及びこの突然変異を含む単離されたポリヌクレオチドも提供される。更に、臨床サンプル中の病原性微生物を検出する方法、抗生物質を同定するためのアッセイ、並びにこのようなアッセイにより同定された抗生物質が提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、チアミン産物を産生する方法に関する。更に詳細には、本発明は、チアミン産物を過剰産生しそして培地中に放出することを引起す突然変異を含む微生物を使用してチアミン産物を産生させる方法に関する。該微生物の生物学的に純粋な培養物及び突然変異を含む単離されたポリヌクレオチドも提供される。更に、臨床サンプル中の病原性微生物を検出する方法、抗生物質を同定するためのアッセイ及びこのようなアッセイを使用して同定された抗生物質も提供される。
【０００２】
ビタミンＢ１としても知られているチアミンは、ビタミンの水溶性Ｂ−複合体の構成員でありそして哺乳動物のための栄養要件である。チアミンのピロリン酸形態は、例えば、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ又はトランスケトラーゼにより異化される代謝経路のように、多くの炭水化物及びアミノ酸代謝経路における補酵素としてｉｎ ｖｉｖｏで作用する。他のビタミン生合成経路（例えば、リボフラビン及びビオチン）と違って、チアミンは新規（ｄｅ ｎｏｖｏ）経路の一部ではなくて、実際には再利用（ｓａｌｖａｇｅ）経路の一部であることに留意することは重要である。
【０００３】
チアミン生合成における大抵の酵素による工程及び中間体は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて研究されそしてSalmonella typhimurium及びRhizobiumにおいてより少ない程度に研究されている（概説については、Brown and Williamson(1987)pp.528-532, In F.C.Neidhart et al.(ed.)Escherichia coli and Salmonella typhimurium:Cellular and Molecular Biology, vol.1.American Society for Microbiology, Washington, D.C.;White and Spenser(1996)pp.680-686, In F.C.Neidhardt et al.(ed.)Escherichia coli and Salmonella typhimurium:Cellular and Molecular Biology, vol.2.American Society for Microbiology, Washington, D.C.;Begley et al.(1999)Arch.Microbiol.171:293-300参照）．チアミン経路における工程をコードするＥ．ｃｏｌｉ遺伝子は、染色体上の４つの異なる部位に位置している：即ち、９０”におけるｔｈｉＣＥＦＳＧＨオペロン、４６”におけるｔｈｉＭＤオペロン（それぞれｔｈｉＪ及びｔｈｉＬ遺伝子は９．５”付近においてクラスターされている）及び２５”におけるｔｈｉＫ。これらの遺伝子のすべては、クローニングされ、配列決定され、そしてこれらの遺伝子によりコードされた酵素の多くは、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて過剰産生されそしてそれらの酵素活性が決定された。
【０００４】
ピリミジン部分、４−アミノ−５−ヒドロキシメチル−２−メチルピリミジンリン酸（ＨＭＰ−Ｐ）は、新規なプリン生合成経路における中間体、５−アミノイミダゾールリボチド（ＡＩＲ）から誘導される。グラム陰性菌では、ＡＩＲのＨＭＰ−Ｐへの転換は、ｔｈｉＣ遺伝子産物により触媒される。次いでＨＭＰ−Ｐは、ＴｈｉＤキナーゼによりＨＭＰ−ＰＰにリン酸化され、次いでチアゾール単位とカップリングする。
【０００５】
チアゾール部分、５−（２−ヒドロキシエチル）−４−メチルチアゾールリン酸（ＨＥＴ−Ｐ）は、Ｌ−チロシン及び１−デオキシ−Ｄ−キシルロースリン酸（ＤＸＰ）から誘導され、硫黄原子は、おそらくＬ−システインに由来する。この反応は、少なくとも５つの遺伝子ｔｈｉＦ、ｔｈｉＳ、ｔｈｉＧ、ｔｈｉＨ及びｔｈｉＩの発現を必要とする。
【０００６】
ＨＭＰ−ＰＰとＨＥＴ−Ｐとのカップリングは、ｔｈｉＥによりコードされたチアミンリン酸ピロホスホリラーゼにより触媒されて、チアミン一リン酸（ＴＭＰ）を生じさせる。次いでＴＭＰを、ｔｈｉＬによりコードされたチアミン一リン酸キナーゼの作用によってリン酸化してチアミンピロリン酸（ＴＰＰ）を形成する。チアミンは新規経路（de novo pathway）の一部ではないので、Ｅ．ｃｏｌｉは、外因性チアミンをＴＭＰに転換するために、ｔｈｉＫによりコードされた再利用酵素、チアミンキナーゼを必要とする。
【０００７】
B.subtilisにおけるチアミンの合成は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて見出されたのと同じ酵素及び中間体を利用するようである（例えば、Perkins and Pero(2001)pp.271-286, In Sonenshein et al, (ed.) Bacillus subtilis and its relatives:from genes to cells, American Society for Microbiology, Washington, D.C.参照）。しかしながら、重要な差がある。従来の遺伝子名称は、Ｅ．ｃｏｌｉ及びB.subtilisにおいて異なっている。第一に、Ｅ．ｃｏｌｉからのＨＭＰ生合成酵素ＴｈｉＣ、チアミンリン酸ピロホスフェートＴｈｉＥ及びヒドロキシエチルチアゾールキナーゼＴｈｉＭは、それぞれ、ＴｈｉＡ、ＴｈｉＣ及びＴｈｉＫという名称のそれらの対応物（counterparts）を有する。第二に、知られているB.subtilisチアミン生合成遺伝子は、３つのクラスター：ｔｈｉＡ遺伝子のみからなるｔｈｉＡ遺伝子座、遺伝子ｔｈｉＯＳＦＧＤ１からなるｔｈｉＢ遺伝子座並びにｔｈｉＫ及びｔｈｉＣ遺伝子からなるｔｈｉＣ遺伝子座として、異なって構成される。第三に、チアゾール生合成における少なくとも１つの酵素工程は異なる。B.subtilisゲノムは、ｔｈｉＨオーソログ（thiH ortholog）を含有しない。その代わりに、ｔｈｉＯ（ｔｈｉＢ遺伝子座におけるｙｊｂＲ）は、チアゾール生合成に関与するオキシダーゼ活性をコードすることが予測される。この遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉゲノム内には存在せず、それはＴｈｉＨに対するアミノ酸相同性を示さない。それは、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｅｔｌｉからのｔｈｉ遺伝子と関連した遺伝子（ｔｈｉＯ）の１つに対して相同性である。第四に、Ｅ．ｃｏｌｉ ｔｈｉＤの２つのオーソログ、ｙｊｂＶ（ｔｈｉＤ１）及びｙｗｄＢ（ｔｈｉＤ２）がB.subtilisにおいて見出され、これらは、生合成及び再利用ＨＭＰキナーゼをコードすることができる。最後に、ｔｈｉＣ遺伝子座は、未知の遺伝子、転写調節因子のｌｙｓＲファミリーに対する強い類似性を示すｙｗｂＩを含有する。
【０００８】
本発明は、バチルス科（Bacillaceae）、ラクトバチルス科（Lactobacillaceae）、ストレプトコッカス科（Streptococcaceae）、コリネバクテリア科（Corynebacteriaceae）及びブレビバクテリア科（Brevibacteriaceae）よりなる群から選ばれる微生物であって、チアミン産生を脱調節しそしてチアミン産物を細胞から放出させる突然変異を含有する微生物を提供する。
【０００９】
「チアミン産物」は、チアミン、チアミン一リン酸（ＴＭＰ）及び／又はチアミンピロリン酸（ＴＰＰ）の単独又はいかなる組み合わせも意味する。
【００１０】
本発明に使用される微生物は、該微生物の「生物学的に純粋な培養物」、即ち、微生物が自然において通常会合している成分、細胞及び他の成分から分離されている微生物を意味することは理解される。
【００１１】
下記の材料は、Ａmerican Type Culture Collection(ATCC), P.O.Box 1549, Manassas, VA20108 USAに２００３年５月１２日に、及びDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen(DSMZ), Mascheroder Weg 1B, D-38124 Braunschweig, Germanyに２００４年４月５日に、ブタペスト条約の規約に従って下記するとおりの対応する受託番号：Bacillus subtilis TH95(ATCC PTA-5221)、Bacillus subtilis TH101(ATCC PTA-5222)、Bacillus subtilis TH115(ATCC PTA-5223)、Bacillus subtilis TH116(ATCC PTA-5224)、Bacillus subtilis TH404(DSM 16333)、及びBacillus subtilis TH405(DSM 16334)により、寄託された。
【００１２】
「突然変異」は、本明細書では修飾と相互交換可能に使用されて、例えば、いかなる機構によっても細胞内における又は細胞からのチアミン又はチアミン産物の増加又は減少を可能とする野生型微生物と比べて微生物に表現型の変化を伝える、バクテリアの如き微生物の野生型ＤＮＡ配列の変化を意味する。突然変異は、ナンセンス突然変異（アンバー（ＵＡＧ）、オーカー（Ｔ／ＵＡＡ）及びオパール（Ｔ／ＵＧＡ）を含む、１つ以上のフレームシフト、置換、挿入及び／又は欠失を含む種々の方法において引起すことができる。欠失は、単一のヌクレオチドの欠失、又は全体の遺伝子の欠失を含めて、１つより多くのヌクレオチドの欠失であることができる。
【００１３】
「アミノ酸置換」は、一対一対応のアミノ酸置換を意味する。このような置換は、置換されたアミノ酸が同様な構造的及び／又は化学的性質を有する場合には、事実上保存性である。保存性置換の例は、ロイシンのイソロイシン若しくはバリンによる置換、アスパルギン酸のグルタミン酸による置換、又はトレオニンのセリンによる置換を含む。本発明の範囲内の非保存性置換は、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の芳香族側鎖を有するアミノ酸による置換、例えば、ロイシンのフェニルアラニンによる置換を含む。
【００１４】
アミノ酸「挿入」又は「欠失」は、アミノ酸配列に対する変化又はアミノ酸配列内の変化を意味する。それらは、典型的には、約１〜５アミノ酸の範囲に入る。特定のアミノ酸配列において許容された変化は、ペプチドを合成的に製造すること又は組換えＤＮＡ技術を使用して配列におけるヌクレオチドの挿入、欠失若しくは置換を系統的に行うことにより実験的に決定することができる。
【００１５】
「脱調節する」又は「脱調節」は、酵素／タンパク質のレベル又は活性が変えられるか又は変更されるような、生合成経路における酵素／タンパク質をコードする遺伝子の発現の変化又は変更であって、チアミン産物の産生の増加、又は例えば分泌、流出等による細胞からのチアミン産物の放出をもたらす（それらに限定はされない）変化又は変更を意味する。遺伝子発現の変化又は変更は、遺伝子自体のＤＮＡ配列の変化、又は非タンパク質コードＤＮＡ領域を含む遺伝子の外側の領域のＤＮＡ配列の変化により行うことができる。「脱調節する」又は「脱調節」は、チアミン産物の産生の増加又はチアミン産物の放出の増加が起こるような、細胞の生合成遺伝子の発現を変化させる代謝物の細胞内レベルのいかなる乱れ（perturbation）も意味することができる。
【００１６】
１つの態様では、上記した微生物におけるチアミン産生を脱調節する突然変異は、ΔｔｈｉＬ、ｔｘ１、ｔｘ２６及びそれらの組み合わせからなる群より選ばれる。このような突然変異は、ｔｘ１と組み合わせたΔｔｈｉＬ、ｔｘ２６と組み合わせたΔｔｈｉＬ、ｔｘ２６と組み合わせたｔｘ１、並びにｔｘ１及びｔｘ２６の両方と組み合わせたΔｔｈｉＬを含む。３つの突然変異、ΔｔｈｉＬ、ｔｘ１及びｔｘ２６のすべてを含む微生物が好ましい。
【００１７】
好ましい態様では、微生物は、バチルス属（Bacillus）、ラクトバチルス属（Lactobacillus）、ラクトコッカス属（lactococcus）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）及びブレビバクテリウム属（Brevibacterium）及びよりなる群から選ばれる。更に好ましくは、微生物は、バチルス（Bacillus）属から選ばれ、最も好ましくは、それはB.subtilis細胞である。
【００１８】
１つの態様では、上記した突然変異を含有する微生物はB.subtilis ＴＨ９５である。
【００１９】
１つの態様では、本発明は、ΔｔｈｉＬ、ｔｘ１、ｔｘ２６及びそれらの組み合わせからなる群より選ばれる突然変異を含有し、更にｔｈｉＡ遺伝子産物をコードするポリヌクレオチド配列の少なくとも１つのコピーを含有するＤＮＡカセットを含み、該ポリヌクレオチド配列が強い構成的プロモーターにより作動的に制御されている、上記した微生物を提供する。好ましい微生物は、B.subtilis ＴＨ１１６である。
【００２０】
更なる態様では、本発明は、ΔｔｈｉＬ、ｔｘ１、ｔｘ２６及びそれらの組み合わせからなる群より選ばれる突然変異を含有し、更にｔｈｉＫＣオペロンからの遺伝子産物をコードするポリヌクレオチド配列の少なくとも１つのコピーを含有するＤＮＡカセットを含み、該ポリヌクレオチド配列が強い構成的プロモーターにより作動的に制御されている、上記した微生物を提供する。好ましい微生物は、B.subtilis ＴＨ１１５である。
【００２１】
更なる態様では、本発明は、ΔｔｈｉＬ、ｔｘ１、ｔｘ２６及びそれらの組み合わせからなる群より選ばれる突然変異を含有し、更にｔｅｎＡｌ−ｔｈｉＯＳＧＦＤオペロンの遺伝子産物をコードするポリヌクレオチド配列を含有するＤＮＡカセットを含み、該ポリヌクレオチド配列が強い構成的プロモーターにより作動的に制御されている、上記した微生物を提供する。好ましい微生物は、B.subtilis ＴＨ４０４である。
【００２２】
更なる態様では、本発明は、ΔｔｈｉＬ、ｔｘ１、ｔｘ２６及びそれらの組み合わせからなる群より選ばれる突然変異を含有し、更に（ａ）ｔｅｎＡｌ−ｔｈｉＯＳＧＦＤオペロンの遺伝子産物をコードするポリヌクレオチド配列を含有するＤＮＡカセット及び（ｂ）ｔｈｉＡ遺伝子産物をコードするポリヌクレオチド配列の少なくとも１つのコピーを含有するＤＮＡカセットを含み、該ポリヌクレオチド配列が強い構成的プロモーターにより作動的に制御されている、上記した微生物を提供する。好ましい微生物は、B.subtilis ＴＨ４０５である。
【００２３】
本発明では、「ＤＮＡカセット」は、定められた制限部位でベクターに挿入されうる発現産物をコードするＤＮＡのＤＮＡコード配列又はセグメントを意味する。カセット制限部位は、正しいリーディングフレームにおけるカセットの挿入を確実にするようにデザインされる。一般に、外来ＤＮＡは、ベクターＤＮＡの１つ以上の制限部位で挿入され、次いで伝達性ベクターＤＮＡと共に宿主細胞中にベクターにより運ばれる。ＤＮＡ断片は， 線状化されたベクターＤＮＡの端部に結合したトポイソメラーゼの使用により制限酵素なしにベクターＤＮＡに挿入することもでき；これは、ＰＣＲで調製されたＤＮＡ断片の直接クローニングのために特に有用である。挿入され若しくは付加されたＤＮＡを有するＤＮＡのセグメント又は配列、例えば、発現ベクターは、「ＤＮＡ構築物」と呼ぶこともできる。普通の型のベクターは、「プラスミド」であり、これは、追加の（外来）ＤＮＡを容易に受け入れることができそして適当な宿主細胞に容易に導入されうる通常バクテリア起源の一般に二本鎖ＤＮＡの内蔵分子（self-contained molecule）である。プラスミドはしばしばコードＤＮＡ及びプロモーターＤＮＡも含有しそして外来ＤＮＡを挿入するための適当な１つ以上の制限部位を有する。「コードＤＮＡ」は、特定のタンパク質又は酵素のための特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列である。ＤＮＡカセットは、特定のヌクレオチド配列に加えて、特定のヌクレオチド配列の転写を制御するためにエンハンサー及びプロモーターを含む追加の転写制御エレメントを含有することができる。「プロモーターＤＮＡ」は、コードＤＮＡの発現を開始し、調節し、又はコードＤＮＡの発現を媒介又は制御するＤＮＡ配列である。プロモーターＤＮＡ及びコードＤＮＡは、同じ遺伝子又は異なる遺伝子からのものであることができそして同じもしくは異なる生物からのものであることができる。種々の真核生物宿主及び原核生物宿主における複製及び／又は発現のためのプラスミド及び真菌ベクターを含む多数のベクターが記載されている。非限定的例は、実施例に特定的に記載されたこれら、及びｐＫＫプラスミド（Clonetech）、ｐＵＣプラスミド、ｐＥＴプラスミド（Novagen, Inc., Madison, WI）、ｐＲＳＥＴ若しくはｐＲＥＰプラスミド（Invitrogen, San Diego, CA）、又はｐＭＡＬプラスミド（New England Biolabs, Beverly, MA）、ｐＣＲ２．１Ｔｏｐｏ（Invitrogen, San Diego, CA）、ｐＸＬＴｏｐｏ（Invitrogen, San Diego, CA）、及び本明細書に開示され若しくは引用された方法又は当業者に知られた他の方法を使用する、多くの適切な宿主細胞を含む。組換えクローニングベクターは、クローニング若しくは発現のための１つ以上の複製システム、宿主における選択のための１つ以上のマーカー、例えば、抗生物質耐性及び１つ以上の発現カセットをしばしば含むであろう。
【００２４】
ＤＮＡカセットは、コードＤＮＡの１つ以上のコピー、例えば、配列の１〜５０コピー、好ましくは、１〜２５コピー、例えば、１〜５、１〜１０、１〜１５及び１〜２０コピーを含有することができる。配列は、例えば、タンデムに、即ち、ヘッド−ツー−テイル配置（head-to-tail arrangement）を含む、いかなる順序ででも配置されうる。
【００２５】
「作動的に制御されている」は、コードＤＮＡの転写が、例えば、プロモーター又は転写エンハンサーにより制御されるか又は媒介されることを意味する。このようなプロモーター又は転写エンハンサーは、コードＤＮＡに隣接していることができ、又はコードＤＮＡから上流若しくは下流に位置することができる。
【００２６】
「強い構成的プロモーター」は、ネイティブ宿主細胞に比べて高い頻度でｍＲＮＡｓを開始させるプロモーターである。強い構成的プロモーターは、周知でありそして適切なプロモーターは、宿主細胞において制御されるべき特定の配列に従って選ばれうる。グラム＋微生物からのこのような強い構成的プロモーターの例は、ＳＰ０１−２６、ＳＰ０１−１５、ｖｅｇ、ｐｙｃ（ピルビン酸カルボキシラーゼプロモーター）及びａｍｙＥを含むが、それらに限定はされない。グラム陰性微生物からのプロモーターの例は、ｔａｃ、ｔｅｔ、ｔｒｐ−ｔｅｔ、ｌｐｐ、ｌａｃ、ｌｐｐ−ｌａｃ、ｌａｃＩｑ、Ｔ７、Ｔ５、Ｔ３、ｇａｌ、ｔｒｃ、ａｒａ、ＳＰ６、λ−ＰＲ及びλ−ＰＬを含むが、それらに限定はされない。
【００２７】
他の観点では、本発明は、ΔｔｈｉＬ、ｔｘ１、ｔｘ２６及びそれらの組み合わせからなる群より選ばれる突然変異を含有し、更に（ａ）B.subtilisのプリンオペロンの発現を脱調節する第１突然変異及び（ｂ）５−アミノイミダゾールリボチド（ＡＩＲ）のカルボキシアミノイミダゾールリボチド（ＣＡＩＲ）への転換を阻止する第２突然変異を含む上記した微生物を提供する。好ましい態様では、第１突然変異は、ｐｕｒオペロンのリーダー領域内の突然変異を含み、そして第２突然変異は、ホスホリボシルアミノイミダゾールカルボキシラーゼＩをコードするｐｕｒＥ遺伝子内の突然変異を含む。更に好ましくは、微生物は、B.subtilis ＴＨ１０１である。
【００２８】
「転換を阻止する」という用語は、細胞機械（cellular machinery）がＡＩＲをＣＡＩＲに転換するのを、突然変異が阻止することを意味する。本発明では、ＡＩＲのＣＡＩＲへの転換が完全に阻止されるのが好ましいが、７５％より高い、例えば８５〜９０％より高い転換の阻止も許容されうる。
【００２９】
１つの態様では、本発明は、チアミン産物を産生させる方法又はプロセスである。この方法は、チアミン産物を過剰産生させそしてそれらを培地中に放出させるΔｔｈｉＬ、ｔｘ１、ｔｘ２６及びそれらの組み合わせからなる群より選ばれる突然変異を含有する上記した微生物を、適当な培地中で培養することを含む。次いでチアミン産物を培地から回収する。
【００３０】
「過剰産生する」は、本発明の微生物（１種若しくは複数種）又は本発明の方法で使用される微生物（１種若しくは複数種）が、実施例に記載の方法のいずれかにより測定して、ネイティブ微生物が産生するよりも過剰の１種以上のチアミン産物を産生するように工学的に作られることを意味する。このようなチアミン産物の実質的量が、例えば、分泌若しくは流出により培養培地中に放出される。本明細書で使用した、「実質的量」とは、細胞により産生されたチアミン産物の７５％より多く、好ましくは８５％より多く、例えば、９０〜９５％が培地中に放出されることを意味する。
【００３１】
「チアミン産物」に関して使用される「回収する」とは、チアミン産物を培地から分離し及び／又は回収されたチアミン産物を純粋な若しくは半純粋な形態に単離することを意味する。例えば、発酵培養液からチアミン産物を回収するためのいかなる慣用の方法も本発明において使用することができる。回収は、ＨＰＬＣの使用によるチアミン産物の単離も意味することができる。
【００３２】
１つの観点では、上記した方法は、チアミン前駆体の存在下に該微生物を培養することを更に含む。好ましい前駆体は、４−アミノ−５−ヒドロキシメチル−２−メチルピリミジン（ＨＭＰ）、５−（２−ヒドロキシエチル）−４−メチルチアゾール（ＨＥＴ）及びそれらの組み合わせよりなる群から選ばれる。
【００３３】
上記したチアミン産物を産生するための方法において、該微生物が、上記したB.subtilisのプリンオペロンの発現を脱調節する突然変異を更に含むならば、該微生物を、チアミン前駆体及びプリン供給源の存在下に培養する方法を提供することが、本発明の他の観点である。好ましい態様では、チアミン前駆体はＨＥＴであり、そしてプリン供給源はキサンチンである。
【００３４】
他の観点では、上記した方法は、ＨＥＴ経路の前駆体の存在下に該微生物を培養することを更に含む。「ＨＥＴ経路の前駆体」は、５−（２−ヒドロキシエチル）−４−メチルチアゾール（ＨＥＴ）を産生するのに使用される炭素含有化合物を意味する。このような前駆体は、好ましくは、グリシン、システイン、イソロイシン、トレオニン及びそれらの組み合わせよりなる群から選ばれる。
【００３５】
他の観点では、上記した方法は、ＨＭＰ経路の前駆体又はＨＭＰの誘導体の存在下に該微生物を培養することを更に含む。「ＨＭＰ経路の前駆体」は、４−アミノ−５−ヒドロキシメチル−２−メチルピリミジン（ＨＭＰ）を産生するのに使用される炭素含有化合物を意味する。このような前駆体の非限定的例は、５−アミノイミダゾールリボチド（ＡＩＲ）を含む。「ＨＭＰの誘導体」は、４−アミノ−２−メチル−５−ピリミジンメタンアミン（Grewe Diamibe）と同じ方法で機能するＨＭＰのいかなる化学的に修飾された変異体も意味する。
【００３６】
かくして、本発明は、（ａ）チアミン産生物を培地中に過剰産生させる突然変異を含有する、バチルス科（Bacillaceae）、ラクトバチルス科（Lactobacillaceae）、ストレプトコッカス科（Streptococcaceae）、コリネバクテリア科（Corynebacteriaceae）及びブレビバクテリア科（Brevibacteriaceae）よりなる群から選ばれる微生物を適当な培地中で培養し、そして（ｂ）チアミン産物を回収することを含む、チアミン産物を産生する方法を指向する。
【００３７】
１つの態様では、本発明は、微生物が、ΔｔｈｉＬ、ｔｘ１及びｔｘ２６を含む突然変異を含有する、上記した方法を指向する。
【００３８】
１つの態様では、本発明は、微生物が、ｔｈｉＡ遺伝子産物をコードするポリヌクレオチド配列の少なくとも１つのコピーを含有するＤＮＡカセットを更にも含み、該ポリヌクレオチド配列が強い構成的プロモーターにより作動的に制御されている、上記した方法を指向する。
【００３９】
１つの態様では、本発明は、微生物が、Ｂ．スブチリス（B.subtilis）のプリンオペロンの発現を脱調節する突然変異及び５−アミノイミダゾールリボチド（ＡＩＲ）のカルボキシアミノイミダゾールリボチド（ＣＡＩＲ）への転換を阻止する突然変異を更に含む、上記した方法を指向する。
【００４０】
１つの態様では、本発明は、微生物が、ｔｈｉＫＣオペロンからの遺伝子産物をコードするポリヌクレオチド配列の少なくとも１つのコピーを含有するＤＮＡカセットを更に含み、該ポリヌクレオチド配列が強い構成的プロモーターにより作動的に制御される、上記した方法を指向する。
【００４１】
１つの態様では、本発明は、微生物が、ｔｅｎＡｌ−ｔｈｉＯＳＧＦＤオペロンの遺伝子産生物をコードするポリヌクレオチド配列の少なくとも１つのコピーを含有するＤＮＡカセットを更に含み、該ポリヌクレオチド配列が強い構成的プロモーターにより作動的に制御される、上記した方法を指向する。
【００４２】
１つの態様では、本発明は、微生物が、（ａ）ｔｅｎＡｌ−ｔｈｉＯＳＧＦＤオペロンの遺伝子産生物をコードするポリヌクレオチド配列の少なくとも１つのコピーを含有するＤＮＡカセット及び（ｂ）ｔｈｉＡ遺伝子産物をコードするポリヌクレオチド配列の少なくとも１つのコピーを含有するＤＮＡカセットを更に含み、該ポリヌクレオチド配列が強い構成的プロモーターにより作動的に制御される、上記した方法を指向する。
【００４３】
他の態様では、本発明は、ｔｘ１突然変異を含む単離されたポリヌクレオチド配列である。このような突然変異は、チアミン産生を脱調節しそしてチアミン産物を培養培地中に放出させる突然変異を含有する、チアミンの産生を増加させる組換え微生物、例えば、バチルス属（Bacillaceae）、ラクトバチルス属（Lactobacillaceae）、ストレプトコッカス属（Streptococcaceae）、コリネバクテリア属（Corynebacteriaceae）及びブレビバクテリア属（Brevibacteriaceae）よりなる群から選ばれる微生物の構築のために有用である。アミノ酸残基１１６におけるロイシンのフェニルアラニンへの置換を生じさせる突然変異が好ましい（野生型ＹｌｏＳ配列番号３２に比べて位置１１６におけるＬｅｕのＰｈｅへの置換を有するアミノ酸配列のコピーについて配列番号３１参照）。
【００４４】
本明細書で使用された、「単離された」ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ又は混合ポリマー）又はポリペプチドは、その自然の状態においてそれに伴っている成分から実質的に分離されたことを意味する。ポリヌクレオチドの場合に、「単離された」とは、天然にネイティブ配列に伴う他の細胞成分、例えば、リボソーム、ポリメラーゼ、多くの他のゲノム配列及びタンパク質から分離されたということを意味する。この用語は、その天然に存在する環境から取り出されたポリヌクレオチドを包含し、そして組換えＤＮＡ又はクローニングされたＤＮＡ単離体及び化学的に合成された類似体又は異種システムにより生物学的に合成された類似体を含む。ポリペプチドに関して、「単離された」という用語は、その自然の状態でそれに伴っている成分から分離されたタンパク質又はポリペプチドを意味する。単量体のタンパク質は、サンプルの少なくとも約６０〜７５％が単一のポリペプチド配列を示す場合に単離されている。単離されたタンパク質は、典型的には、タンパク質サンプルの約６０〜９０％重量／重量、更に通常約９５％を含み、好ましくは約９９％以上の純度であろう。タンパク質純度又は等質性は、当該技術分野で周知の多数の手段、例えば、タンパク質サンプルのポリアクリルアミドゲル電気泳動、続いてゲルを染色して単一のポリペプチドバンドを可視化することにより示すことができる。ある目的には、ＨＰＬＣ又は当該技術分野で周知の他の手段を使用して、精製のためのより高い解像力を提供することができる。
【００４５】
１つの態様では、上記した単離されたポリヌクレオチド配列は、配列番号３０であるか又はストリンジェントな条件下に配列番号３０にハイブリダイズするポリヌクレオチド配列であり、そして微生物中に存在するとき、チアミン産物の脱調節を引起す。
【００４６】
本明細書で同定されたポリヌクレオチド配列に「ストリンジェントな条件」下にハイブリダイズしそして同じ機能を保持する、即ち、適切な細胞に導入されるとき、チアミン産生の脱調節を引起す核酸は、本発明の範囲内にある。「ストリンジェントな条件」は、当該技術分野で知られている：例えば、Maniatis et al., Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 2d Edition, 1989, and Short Protocols in Molecular Biology, ed.Ausubel, et al., 参照。これらの両方共参照により本明細書に組み込まれる。ストリンジェントな条件は、配列依存性でありそして異なる環境において異なるであろう。より長い配列は、特により高い温度でハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションへの広汎なガイドは、Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Acid Probes, “Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays”(1993）に見出される。一般に、ストリンジェントな条件は、既定されたイオン強度pHにおいて特定の配列についての熱的融点（thermal melting point）（Ｔｍ）より約５〜１０℃低いように選ばれる。Ｔｍは、標的に対して相補的なプローブの５０％が平衡において標的配列にハイブリダイズする温度（規定されたイオン強度、pH及び核酸濃度下に）である（標的配列はＴｍにおいて過剰に存在するので、平衡においてプローブの５０％が占められる）。ストリンジェントな条件は、塩濃度が、pH７．０〜８．３において約１．０Ｍナトリウムイオンより少なく、典型的には、約０．０１〜１．０Ｍナトリウムイオン濃度（又は他の塩）であり、そして温度は、短いプローブ（例えば１０〜５０ヌクレオチド）では少なくとも約３０℃でありそして長いプローブ（例えば５０ヌクレオチドより長い）では少なくとも約６０℃である、ストリンジェントな条件である。ストリンジェントな条件は、脱安定化剤、例えばホルムアミドの添加によっても達成されうる。この開示の目的には、このようなハイブリダイゼーションのための適当な「ストリンジェントな条件」は、４０％ホルムアミド、１ＭＮａＣｌ、１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の緩衝液中で３７℃でのハイブリダイゼーション及び少なくとも約５０℃、通常約５５℃〜約６０℃の温度で２０分間０．２ＸＳＳＣ中での少なくとも１回の洗浄、又は同等な条件を含む、ストリンジェントな条件である。ポジティブなハイブリダイゼーションは、バックグラウンドのレベルより少なくとも２倍高い。当業者は、別のハイブリダイゼーション及び洗浄条件を使用して同様なストリンジェンシーの条件を与えることができることを容易に認識するであろう。
【００４７】
「核酸配列」というフレーズは、５’から３’端部へと読まれるデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド塩基の一本鎖又は二本鎖ポリマーを意味する。それは、染色体ＤＮＡ、自己複製性プラスミド、ＤＮＡ若しくはＲＮＡの感染性ポリマー及び主として構造的役割を行うＤＮＡ若しくはＲＮＡを含む。特に限定されない限り、この用語は、参照核酸と同様な結合性を有しそして天然に存在するヌクレオチドと同様に代謝される天然のヌクレオチドの既知の類似体を含有する核酸を包含する。特記されない限り、特定の核酸配列は、その保存的に修飾された変異体（例えば、縮重コドン置換）及び相補性配列並びに明白に示された配列も暗黙のうちに包含する。特に、縮重コドン置換は、１つ以上の選ばれた（又はすべての）コドンの第３の位置が混合塩基及び／又はデオキシイノシン残基で置換されている配列を発生させることにより達成されうる（Batzer et al., Nucleic Acid Res.19:5081(1991);Ohtsuka et al, J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985);Cassol et al, 1992;Rossolini et al., Mol.Cell.Probes 8:91-98(1994)。
【００４８】
他の態様では、本発明は、２つの連鎖していない突然変異、即ち、第１の突然変異ｔｘ２６−１及び第２突然変異ｔｘ２６−２を含む単離されたポリヌクレオチド配列であって、チアミン産生性微生物における両突然変異の存在がチアミン産生の脱調節を引起す、ポリヌクレオチド配列である。第１の突然変異、ｔｘ２６−１は、ΔｙｕｆＲ：：Ｔｎ９１７（ＢＧＳＣ＃１Ａ６４２）に対する７０％連鎖（linkage）を示し、そして第２の突然変異、ｔｘ２６−２は、ΩｍｏｔＡ：：Ｔｎ９１７（ＢＧＳＣ＃１Ａ６３１）に対する５９％連鎖を示す。かくして、本発明は、ΔｙｕｆＲ：：Ｔｎ９１７に対する７０％連鎖を有する第１突然変異（ｔｘ２６−１）及びΩｍｏｔＡ：：Ｔｎ９１７に対する５９％連鎖を有する第２突然変異（ｔｘ２６−２）を含む単離されたポリヌクレオチド配列であって、チアミン産生性微生物における該突然変異の両方の存在がチアミン産生の脱調節を引起す、単離されたポリヌクレオチド配列を指向する。
【００４９】
好ましくは、ｔｘ２６−１突然変異は、配列番号３３であるポリヌクレオチド配列又はストリンジェントな条件下に配列番号３３にハイブリダイズするポリヌクレオチド配列によりコードされており、そしてｔｘ２６−２突然変異との組み合わせにおいて微生物中に存在するとき、チアミン産生の脱調節を引起す。
【００５０】
好ましくは、ｔｘ２６−２突然変異は、配列番号３６であるポリヌクレオチド配列又はストリンジェントな条件下に配列番号３６にハイブリダイズするポリヌクレオチド配列によりコードされており、そしてｔｘ２６−１突然変異との組み合わせにおいて微生物中に存在するとき、チアミン産生の脱調節を引起す。
【００５１】
更に、上記した１種以上のポリヌクレオチド、即ち、（ａ）第１突然変異ｔｘ２６−１及び第２突然変異ｔｘ２６−２を含む単離されたポリヌクレオチド配列又は（ｂ）ｔｘ１突然変異を含む単離されたポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡカセット並びにこのようなＤＮＡカセットを含有する微生物が本発明により提供される。
【００５２】
更なる態様は、患者からの臨床サンプル中の病原性微生物を検出する方法である。この方法は、グラム＋（Ｇｒａｍ＋）微生物がサンプル中に存在するかどうかを決定すること、微生物がｙｌｏＳオーソログ（ortholog）を含有するかどうかを決定すること、及び微生物がｔｈｉＬオーソログを含有するかどうかを決定することを含み、グラム＋微生物中のｙｌｏＳオーソログの存在及びｔｈｉＬオーソログの不存在により、微生物が病原性であることを示す。
【００５３】
「臨床サンプル」は、哺乳動物、好ましくは、ヒト又は食用動物である患者から採取したいかなるアッセイ可能な検査試料も意味する。アッセイ可能な検査試料は、血液、尿、糞便、喀痰、組織又は他の生物学的供給源から選ぶことができ、それから、微生物を、もし存在すれば、実施例に開示されたとおり同定しそして特徴付けることができる。
【００５４】
上記した患者からの臨床サンプル中に検出される微生物は、好ましくは、リステリア属（Listeria）、スタフィロコッカス属（Staphylococcus）、クロストリジウム属（Clostridium）、エンテロコッカス属（Enterococcus）、及びストレプトコッカス属（Streptococcus）よりなる群から選ばれ、最も好ましくは、リステリアモノシトゲネス（Listeria monocytogenes）、スタフィロコッカスアウレウス（Staphylococcus aureus）、スタフィロコッカスエピダーミディス（Staphylococcus epidermidis）、クロストリジウムテタニ（Clostridium tetani）、クロストリジウムパーフリンゲンス（Clostridium perfringens）、エンテロコッカス（Enterococcus）属の種（Enterococcu sp）、ストレプトコッカスアガラクティエ（Streptococcus agalactiae）、ストレプトコッカスピロゲネス（Streptococcus pyogenes）及びストレプトコッカスニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）よりなる群から選ばれる。
【００５５】
ＹｌｏＳタンパク質は、殺菌化合物を同定するための価値ある標的である。何故ならば、ｙｌｏＳオーソログのみを含有しそしてｔｈｉＬオーソログを含有しない多くのグラム＋菌は既知の病原体であるからである。従って、本発明は、ＹｌｏＳに結合するか又は、例えばｙｌｏＳ発現若しくはＹｌｏＳ活性に対して刺激作用若しくは抑制作用を有するモジュレーター（modulators）、即ち、候補若しくは試験化合物又は作用物質（例えば、ペプチド、ペプチド擬似体（peptidomimetics）、小分子又は他の薬物）を同定するためのスクリーニングアッセイ（又は方法）も提供する。
【００５６】
１つの態様では、（ａ）ＹｌｏＳタンパク質を含むアッセイ組成物を試験化合物と接触させ、そして（ｂ）試験化合物がＹｌｏＳタンパク質活性を阻害するかどうかを決定することを含み、該化合物がＹｌｏＳタンパク質活性の活性を阻害する能力に基づいて該化合物を抗生物質として同定する、抗生物質を同定するためのアッセイが提供される。好ましくは、このアッセイは、精製されたＹｌｏＳタンパク質、部分的に精製されたＹｌｏＳタンパク質、ＹｌｏＳタンパク質を産生する細胞からの粗細胞抽出物を含み、又はＹｌｏＳタンパク質は、リステリア属（Listeria）、スタフィロコッカス属（Staphylococcus）、クロストリジウム属（Clostridium）、エンテロコッカス属（Enterococcus）、及びストレプトコッカス属（Streptococcus）よりなる群から選ばれる病原性微生物に由来するポリヌクレオチドによりコードされている。このような病原性微生物は、リステリアモノシトゲネス（Listeria monocytogenes）、スタフィロコッカスアウレウス（Staphylococcus aureus）、スタフィロコッカスエピダーミディス（Staphylococcus epidermidis）、クロストリジウムテタニ（Clostridium tetani）、クロストリジウムパーフリンゲンス（Clostridium perfringens）、エンテロコッカス（Enterococcus）属の種（Enterococcu sp）、ストレプトコッカスアガラクティエ（Streptococcus agalactiae）、ストレプトコッカスピロゲネス（Streptococcus pyogenes）及びストレプトコッカスニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）を含むが、それらに限定はされない。
【００５７】
抗生物質を同定するためのアッセイに関する「アッセイ組成物」は、このようなアッセイを行うのに必要な組み合わせにおける成分を意味する。このようなアッセイ組成物は、最小でも、ＹｌｏＳタンパク質若しくはその生物学的に活性な部分及び試験化合物、即ち、試験されるべきペプチド、ペプチド擬似体、小分子若しくは他の薬物を必要とする。
【００５８】
本明細書で使用された、「ＹｌｏＳ活性」は、ＹｌｏＳタンパク質、即ち、ｙｌｏＳ遺伝子によりコードされたタンパク質、のいかなる検出可能な活性又は測定可能な活性も意味する。本発明では、ＹｌｏＳ活性は、下記：（１）ＹｌｏＳ生合成経路における少なくとも１つの工程のモジュレーション、（２）ＹｌｏＳ生合成の促進又は（３）ＹｌｏＳ突然変異体の相補性の少なくとも１つである。抗生物質を同定するためのアッセイに関しては、試験化合物は、もしそれがＹｌｏＳタンパク質翻訳の減少、ｙｌｏＳ転写の減少又はＹｌｏＳ活性の損失を引起すならば、ＹｌｏＳタンパク質活性を阻害する。
【００５９】
本発明の試験化合物は、天然化合物ライブラリー、生物学的ライブラリー、空間的にアドレス可能なパラレル固相若しくは液相ライブラリー（spatially addressable parallel solid phase or solution phase libraries）；デコンボルーション（deconvolution）を必要とする合成ライブラリー法；ワンビーズワン化合物ライブラリー法（one-bead one-compound library method）；及びアフィニティークロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリー法を含む、当該技術分野で知られている化合物ライブラリー法における多数のアプローチのいずれかを使用して得ることができる。生物学的ライブラリーアプローチは、ペプチドライブラリーに限られているが、他のアプローチは、ペプチド、非ペプチドオリゴマー又は化合物の小分子ライブラリーに適用可能である（Lam, K.S.(1997)Anticancer Drug Des.12:145)。
【００６０】
分子ライブラリーの合成方法の例は、当該技術分野で、例えば、De Witt et al.(1993)PNAS90:6909;Erb et al.(1994)PNAS91:11422;Zuckermann et al.(1994)J.med.Chem.37:2678;Cho et al.(1993)Science261:1303;Carrell et al.(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33:2059;Carell et al.(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33:2061；及びGallop et al.(1994)J.Med.Chem.37:1233に見出されうる。化合物のライブラリーは、溶液中に、ビーズ上に、チップ上に、バクテリア中に、胞子中に（U.S.Patent No.5, 223, 409）、プラスミド上に又はファージ上に存在することができる。
【００６１】
１つの態様では、アッセイは、ＹｌｏＳタンパク質若しくはその生物学的に活性な部分 を発現する組換え微生物を試験化合物と接触させ、そして試験化合物のＹｌｏＳ活性をモジュレートする能力を決定する、微生物に基づくアッセイである。試験化合物のＹｌｏＳ活性をモジュレートする能力の決定は、例えば、増殖、細胞内ＹｌｏＳ濃度又は分泌されたＹｌｏＳ濃度を監視することにより達成されうる（ＹｌｏＳを阻害する化合物は試験微生物におけるＹｌｏＳタンパク質の蓄積をもたらすであろう故）。ＹｌｏＳ基質は、ＹｌｏＳ活性のモジュレーションが、例えば、標識された基質の中間体若しくは産物への転換を検出することにより決定されうるように、放射性同位体、酵素標識若しくは他の可溶性若しくは不溶性シグナル発生部分で標識することができる。例えば、ＹｌｏＳ基質は、直接又は間接に、32Ｐ、14Ｃ又は3Ｈにより標識することができ、そして放射性同位体は、シンチレーション計数により放射能発光の直接計数により検出されうる。あるいは、ＹｌｏＳ基質は、可溶性若しくは不溶性シグナル発生部分で直接または間接に標識することができ、そしてシグナルは、比色定量アッセイ、酵素アッセイ又は蛍光測定法アッセイにより検出されうる。化合物のＹｌｏＳ活性をモジュレートする能力の決定は、別法として、レポーター遺伝子（検出可能なマーカー、例えば、ルシフェラーゼをコードする核酸に作動的に連結されたｙｌｏＳ−応答性調節エレメントを含む）の誘導を検出すること又はＣｏＡで調節される細胞応答を検出することにより決定されうる。
【００６２】
本発明の他の態様では、本発明のスクリーニングアッセイは、ＹｌｏＳタンパク質若しくはその生物学的に活性な部分をｉｎ ｖｉｔｒｏで試験化合物と接触させ、そして試験化合物がＹｌｏＳタンパク質若しくはその生物学的に活性な部分に結合する能力又はＹｌｏＳタンパク質若しくはその生物学的に活性な部分の活性をモジュレートする能力を決定する、細胞なしのアッセイ（cell-free assay）である。１つのこのような態様では、アッセイは、ＹｌｏＳタンパク質若しくはその生物学的に活性な部分を既知の基質と接触させてアッセイ混合物を形成し、アッセイ混合物を試験化合物と接触させ、そして試験化合物がその基質に対するＹｌｏＳタンパク質の酵素活性をモジュレートする能力を決定することを含む。１つの態様では、既知の基質はＹｌｏＳタンパク質である。他の態様では、既知の基質はＹｌｏＳ類似体である。フレーズ「ＹｌｏＳ類似体」は、ＹｌｏＳと同じ若しくは同様な方法で機能するＹｌｏＳタンパク質に対して構造が類似した化合物を意味する。例示的類似体は、標識されたＹｌｏＳタンパク質及び／又は他の検出可能なＹｌｏＳタンパク質誘導体を含む。ＹｌｏＳ類似体という用語は、ＹｌｏＳタンパク質に密接に関係した化合物又はＹｌｏＳタンパク質に由来する化合物、例えば、ＹｌｏＳ基質として作用することができる構造的に関連した化合物も含む。
【００６３】
スクリーニングアッセイは、微生物、タンパク質及び／又は反応体を入れるために適当ないかなる容器においても達成することができる。このような容器の例は、マイクロタイタープレート、試験管及びマイクロ遠心管を含む。本発明のアッセイ方法の１つより多くの態様において、ＹｌｏＳタンパク質、ＹｌｏＳ基質、基質類似体又はＹｌｏＳタンパク質を発現する組換え微生物を固定化して、産物、リガンド及び／又は基質の分離を促進させること並びにアッセイの自動化を受け入れることが望ましいことがある。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／ＹｌｏＳ融合タンパク質は、グルタチオンセファロースビーズ（Sigma Chemical Co., St.Louis, MI）又はグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレートに吸着させることができる。マトリックス上にタンパク質を固定化するための他の技術（例えば、ビオチン−コンジュゲーション及びストレプトアビジン固定化又は抗体コンジュゲーション）を、本発明のスクリーニングアッセイに使用することもできる。
【００６４】
本発明は、上記したスクリーニングアッセイにより同定された新規な作用物質も含む。従って、適切な動物モデルにおいて本明細書に記載のとおりに同定された作用物質を更に使用することは、本発明の範囲内にある。例えば、本明細書に記載の同定されたＹｌｏＳモジュレート化剤（YloS modulating agent）（例えば、抗殺菌化合物）を、感染動物モデルにおいて使用して、このような作用物質による処置の効果、毒性又は副作用を決定することができ、及び／又は、病原性微生物により引起され又は誘発された特定の疾患状態を処置することができる。好ましい態様では、該新規作用物質は抗生物質である。
【００６５】
ＹｌｏＳモジュレーターは、更に、本発明ＹｌｏＳタンパク質のいずれか１つの結晶構造に基づいてデザインされうる。特に、多くのグラム＋病原性バクテリア中のＹｌｏＳの発見に少なくとも部分的に基づいて、例えば、本明細書に記載の組換え方法を使用して、有意な量のＹｌｏＳタンパク質を産生させ、該タンパク質を精製しそして結晶化させ、該タンパク質をＸ線結晶学的方法に付し、そして決定された結晶構造に基づいて、モジュレーター（例えば、活性部位モジュレーター、例えば、競合体分子、活性部位阻害剤等）をデザインしそしてデザインされたモジュレーターを本明細書に記載のアッセイのいずれか１つに従って試験することができる。
【００６６】
本発明の最も重要な結果のいくらかは、下記の図に要約される。
下記の実施例は、本発明を説明するだけであって、いずれにせよ本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
実施例１：一般的方法
株
本発明のBacillus subtilis株は、株ＰＹ７９（原栄養株ＳＰβｃ；Cat.#1A747, Bacillus Genetic Stock Center(BGSC), The Ohio State University, Columbus, Ohio43210USA)及び1102(leuA8metB5;Saito et al.(1979)Mol.Gen.Genet.170:117-122）に由来する。ネオマイシン耐性遺伝子（neo）カセット及びテトラサイクリン耐性遺伝子（tet）カセットは、それぞれ、プラスミドｐＢＥＳＴ５０１（Cat.#ECE47, BGSC）及びｐＤＧ１５１４（Cat#ECE100, BGSC)から得られた。
【００６７】
培地
B.subtilisのための標準最小培地（ＭＭ）は、１Ｘ Ｓｐｉｚｉｚｅｎ塩、グルタミン酸ナトリウム０．０４％及びグルコース０．５％を含有する。標準固体完全培地は、Tryptone Blood Agar Broth（TBAB, Difco）である。標準液体完全培地は、Veal-Infusion-Yeast Extract broth（ＶＹ）である。液体試験管培養におけるチアミン産生を試験するために、チアミンを含まない培地を使用する（Difco）。フェドバッチ発酵のために、ＶＦ培地を使用する。これらの培地の組成物は、下記に記載されるか又は以前に記載された標準配合物である（Harwood and Archibald(1990)pp.1-26 and545-552(Appendix 1), In Cutting and Harwood(ed.)Molecular biological methods for Bacillus.John Wiley and Sons, New York）。
【００６８】
ＴＢＡＢ培地：Difco Tryptone Blood Broth ３３ｇ、全体を１Ｌとするのに十分な量の水。オートクレーブ処理する。
【００６９】
ＶＹ培地：Difco Veal Infusion Broth25g 、Difco Yeast Extract ５ｇ、全体を１Ｌとするのに十分な量の水、オートクレーブ処理する。
【００７０】
最小培地（ＭＭ）：１０ＸＳｐｉｚｉｚｅｎ塩１００ml；５０％グルコース１０ml；４０％グルタミン酸ナトリウム１ml、全体を１Ｌとするのに十分な量の水。
【００７１】
１０ＸＳｐｉｚｉｚｅｎ塩：Ｋ2ＨＰＯ4１４０ｇ；（ＮＨ4）2ＳＯ4２０ｇ；ＫＨ2ＰＯ4６０ｇ；クエン酸三ナトリウム・２Ｈ2Ｏ１０ｇ；ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ；全体を１Ｌとするのに十分な量の水。
【００７２】
チアミンアッセイ培地：Difcoチアミンアッセイ培地８５ｇ、全体を１Ｌとするのに十分な量の水。オートクレーブ処理する（Difco Manual(1998)pp.499-501, Difco Laboratories, Maryland, USA）。
【００７３】
微量元素溶液：ＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ１．４ｇ；ＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ０．４ｇ；（ＮＨ4）6Ｍｏ7Ｏ24・４Ｈ2Ｏ０．１５ｇ；ＡｌＣｌ3・６Ｈ2Ｏ０．１ｇ；ＣｕＣｌ2・２Ｈ2Ｏ０．０７５ｇ；全体を２００mlとするのに十分な量の水。ろ過−滅菌する。
【００７４】
Ｆｅ溶液：ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ０．２１ｇ；全体を１０mlとするのに十分な量の水。ろ過−滅菌する。
【００７５】
ＣａＣｌ2溶液：ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ１５．６ｇ；全体を５００mlとするのに十分な量の水。ろ過−滅菌する。
【００７６】
Ｍｇ／Ｚｎ溶液：ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ１００ｇ；ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ０．４ｇ；全体を２００mlとするのに十分な量の水。ろ過−滅菌する。
【００７７】
ＶＦ発酵培地：グルタミン酸ナトリウム０．７５ｇ；ＫＨ2ＰＯ4４．７１ｇ；Ｋ2ＨＰＯ4４．７１ｇ；Ｎａ2ＨＰＯ4・１２Ｈ2Ｏ８．２３ｇ；ＮＨ4Ｃｌ０．２３ｇ；（ＮＨ4）2ＳＯ4１．４１ｇ；酵母エキス（Ｍｅｒｃｋ）１１．７７ｇ；Basildon消泡剤０．２ml；全体を１Ｌとするのに十分な量の水。所定の場所で滅菌する。
【００７８】
●醗酵槽に別々に加えた：２７．３ｇ／Ｌの最終濃度となるようにグルコース・Ｈ2Ｏ
●醗酵槽に別々に加えた（最終濃度）：２ml／Ｌ微量元素溶液、２ml／ＬＣａＣｌ2溶液、２ml／ＬＭｇ／Ｚｎ溶液；２ml／ＬＦｅ溶液。
●給餌の研究のためのバッチの改変は、特に下記の実施例において与えられるであろう。グルコースは必要に応じて供給した。給餌溶液は、下記の組成物に報告されたとおり、ミネラル、規定された栄養素若しくは食品栄養素を含有することができる：
【００７９】
ＮＢ（栄養ブロス）を有するフェドバッチ法のための醗酵給餌溶液：最終濃度（オートクレーブ処理の後）：６６０ｇ／Ｌグルコース・Ｈ2Ｏ；２ｇ／ＬＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ；１４．６mg／ＬＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ；４mg／ＬＺｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ；４５．８ｇ／Ｌ栄養ブロス（Ｄｉｆｃｏ、１ｇ／ml溶液中で別々にオートクレーブ処理する）。
【００８０】
ＨＭＰを伴うフェドバッチ法のための醗酵給餌溶液：最終濃度（オートクレーブ処理の後）：６６０ｇ／Ｌグルコース・Ｈ2Ｏ；２ｇ／ＬＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ；１４．６mg／ＬＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ；４mg／ＬＺｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ。ＨＭＰを０．５４ｇ／Ｌ又は２．７ｇ／Ｌとなるように加える（水／濃ＨＣｌ中にＨＭＰを溶解し、ろ過−滅菌する）。
【００８１】
ＨＥＴを伴うフェドバッチ法のための醗酵給餌溶液：最終濃度（オートクレーブ処理の後）：６６０ｇ／Ｌグルコース・Ｈ2Ｏ；２ｇ／ＬＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ；１４．６mg／ＬＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ；４mg／ＬＺｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ。ＨＥＴを０．５４ｇ／Ｌ又は２．７ｇ／Ｌとなるように加える（水にＨＥＴを溶解し、ろ過−滅菌する）。
【００８２】
ＨＭＰ及びＨＥＴを伴うフェドバッチ法のための醗酵給餌溶液：最終濃度（オートクレーブ処理の後）：６６０ｇ／Ｌグルコース・Ｈ2Ｏ；２ｇ／ＬＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ；１４．６mg／ＬＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ；４mg／ＬＺｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ。ＨＭＰを０．５４ｇ／Ｌ又は２．７ｇ／Ｌとなるように加える（水／濃ＨＣｌにＨＭＰを溶解し、ろ過−滅菌する）。ＨＥＴを０．５４ｇ／Ｌ又は２．７ｇ／Ｌとなるように加える（水にＨＥＴを溶解し、ろ過−滅菌する）。
【００８３】
チアミンアッセイ
生物学的アッセイ：既知の方法（Difco Manual(1998)pp.499-501, Difco Laboratories, Maryland, USA）を使用して、Salmonella typhimuriumに由来するインディケーターを使用して全チアミン化合物をアッセイした。株ＤＭ４５６（ｔｈｉＤ９０６：：ＭｕｄＪ）は、最小培地中のチアミン、ＴＭＰ及びＴＰＰに応答し、これに対して、株ＤＭ１８６４（ｔｈｉＬ９３４：：Ｔｎ１０ｄ）は、ＴＰＰのみに応答する（Webb and Downs(1997)J.Biol.Chem.272;15702-15707;Peterson and Downs(1997)J.Bacteriol.179:4894-4900）。０．０２５６〜１００μg／リットルの範囲の、既知の量のチアミン、ＴＭＰ及びＴＰＰに対するＤＭ４５６の応答は同様であった。更に、ＤＭ４５６は、ＴＰＰに対してＤＭ１８５４よりも感受性が高いことが見出された。B.subtilis培養物をアッセイするために、上澄液をろ過−滅菌した後、希釈液を調製した。細胞のフレンチプレスによる破壊及び１０分間の１０，０００ｇにおける遠心により得られたろ過−滅菌された細胞抽出物の希釈物から、細胞内チアミンレベルを測定した。インディケーター株をチアミンアッセイ培地（ＴＡＭ）中で３７℃で一夜増殖させた。濁度の読み取りを６００nmで行いそして標準溶液の範囲と比較した。
【００８４】
ＨＰＬＣ／チオクロム：先に述べた改変されたチオクロム−ＨＰＬＣアッセイ法（Chie et al.(1999)Biochemistry38:6460-6470）を使用して、個々のチアミン化合物、チアミン、ＴＭＰ及びＴＰＰを測定した。簡単に言えば、培養上澄液又は細胞内抽出物１００μlを４Ｍ酢酸カリウム２００μlに加えた。次いでサンプルを、７ＭＮａＯＨ中の新鮮な３．８ｍＭフェリシアン化カリウム１００μlの添加により酸化する。混合物を激しく混合し、次いで飽和ＫＨ2ＰＯ4中の新鮮な０．０６％Ｈ2Ｏ2１００μlの添加によりクエンチする。サンプルをＨＰＬＣバイアルに移しそしてＳｕｐｅｌｃｏｓｉｌＬＣ−１８−Ｔカラム（１５cm×４．６mm、３μm）（Supelco-Ref.No58970-U）に注入する。４０％０．１ＭＫ2ＨＰＯ4（pH６．６）及び４ｍＭ硫酸水素テトラブチルアンモニウムの存在下に１０％〜３５％メタノール（Ｈ2Ｏ５０％〜２５％）勾配により溶離を行う。３６５nmでの励起の後４４４nmで蛍光を測定する。カラムからの溶離の経時的順序は、チアミン、ＴＭＰ及びＴＰＰである。この方法を利用して醗酵期間中の内部及び外部チアミン産生の両方を監視した。
【００８５】
ＨＰＬＣ／ＤＡＤ：醗酵培養液中のチアミン及び中間体ＨＭＰ及びＨＥＴを直接測定するために、サーモスタット付オートサンプラー及びダイオードアレー検出器（ＤＡＤ）を備えたＡｇｉｌｅｎｔ １１００ＨＰＬＣシステムを使用してＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘＬＵＮＡＣ１８カラムで、サンプルのクロマトグラフィーを行った。カラム寸法は、１５０×４．６mm、粒度５ミクロンである。カラム温度を２０℃で一定に保った。移動相は、水中のペンタンスルホネート０．４ｇ、pH２（Ａ）及びメタノール（Ｂ）の混合物である。２０分における２％Ａ（３分）〜２０％Ａの範囲の勾配溶離を適用する。流速は１ml／分である。検出方法は、２５４nmでの紫外線吸収である。この方法の選択性は、適切な基準化合物、チアミン、ＨＭＰ及びＨＥＴの１０μl標準溶液を、各々１００μg／mlで、注入することにより証明された。標的化合物は、特別なサンプル調製なしに完全に分離された。
【００８６】
分子技術及び遺伝子技術
標準遺伝子及び分子生物学技術は、当該技術分野で公知でありそして以前に記載されている（Maniatis et al.(1982)Molecula cloning:a laboratory manual.Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.;Miller(1972)Experiments in molecular genetics.Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor）。ＤＮＡ形質転換、ＰＢＳ１普遍形質導入、及び他の標準B.subtilis遺伝子技術も当該技術分野で公知であり、そして以前に記載されている（Cutting and Horn(1990)pp.27-74, In Cutting and Harwood(ed.)Molecular biological methods for Bacillus.John Wiley and Sons, New York）。
【００８７】
醗酵
チアミン産生株を、攪拌式タンク醗酵槽で、例えば、６〜１２リットル作用容積を有するBIOFLO4500 New Brunswick ２０リットル容器中で、増殖させた。コンピューター制御及びデータ収集は、NBS Biocommand 32 commercial software(New Brunswick Scientific Co., Inc., Edison, NJ, USA）により行った。
【００８８】
植え込みサイズは、通常、容器中の最初の培地容積の５％であった。水酸化アンモニウム溶液（水中２８％）の自動添加により反応器において常に６．８のpHを保った。醗酵温度は３９℃でありそして６リットル／分の一定の空気流を与えた。消泡剤（Basildon）を必要に応じて手動で加え、そして容器中２psiの一定の圧力を保った。攪拌器の自動カスケーディングにより、１５％溶解酸素（ｐＯ2）の最小濃度を達成した。最小攪拌速度を４００rpmに設定した。
【００８９】
醗酵は、バッチプロセスであることができるが、好ましくは、炭水化物制限フェドバッチ法（carbohydrate-limited, fed-batch processes）である。ゆえに、最初のグルコースの消費（これは通常６〜８時間のプロセス時間の後にそうなった）の後に規定された給餌溶液（上記）を反応器に与えた。その時点で、圧力を８psiに増加させ、そして給餌溶液の添加を７０ｇ／時間の速度で開始し、８時間の間に１０２．５ｇ／時間に線形的に増加させそして１０２．５ｇ／時間で一定に保った。
【００９０】
実施例２：新規にチアミン及びチアミン化合物を産生する突然変異体微生物の培養
この実施例は、チアミン生合成及び脱調節突然変異ΔｔｈｉＬ、ｔｘ１、ｔｘ２６突然変異及びそれらの組み合わせを単離して、チアミン化合物を過剰産生するB.subtilis株を産生することを説明する。
【００９１】
３０mlの最小培地振とうフラスコ培養物中で３７℃で２４時間増殖させた細胞から、野生型B.subtilis及び工学的に作られたB.subtilisからのチアミン産物の細胞内及び細胞外レベルを決定した。ポジティブコントロールとして、チアミン脱調節されたＥ．ｃｏｌｉＰＴ−Ｒ１突然変異体も試験した。バイオアッセイの結果は、チアミン産物は、音波処理された細胞の抽出物からは容易に検出されたが、培養培地からは殆ど又は全然検出されなかったことを示した（表１）。対数期又は定常期野生型B.subtilisにおけるチアミン産物の細胞内レベルは、約１００〜２００μg／Ｌであることが計算された。Ｅ．ｃｏｌｉについて報告されたとおり、B.subtilisにおける細胞内チアミン産物は、ＴＰＰの形態にあるらしい。チアミン産物の細胞内レベルは、チアミン脱調節されたＥ．ｃｏｌｉＰＴ−Ｒ１株において有意により高く、定常期細胞で約１．６mg／Ｌに達した。
【００９２】
【表１】
ａ最小培地（３０ml）中の３７℃で２４時間増殖後のチアミン濃度
ｂ３７℃で２４時間増殖後最小培地培養物３０mlから集められた音波処理した細胞の１ml上澄液のチアミン濃度
ｃすべての細胞内チアミン産物は培養培地に分泌されると仮定する。計算：（細胞内チアミン濃度（μg／Ｌ）×０．００１Ｌ）×１０００ml／Ｌ／３０ml
【００９３】
Ｅ．ｃｏｌｉ ＴｈｉＬタンパク質配列をＳｕｂｔｉｌｉｓｔのタンパク質データベースと比較すると、１つのみのタンパク質配列に対する有意な類似性が検出された：ＹｄｉＡ（Ｐ（Ｎ）＝８．１ｅ−15）。このタンパク質をコードする遺伝子、ｙｄｉＡは、長さが９７５塩基対でありそしてB.subtilis染色体上で５５°に位置した５つの遺伝子オペロンの第１遺伝子である。挿入部位から下流の遺伝子の転写を制御するＩＰＴＧ−誘導性Ｐｓｐａｃプロモーターを含有する、非極性挿入ベクターｐＭＵＴＩＮ２及び４を使用して、ｔｈｉＬ破壊突然変異体を発生させた（Vagner et al.(1998)Microbiology 144:3097-3104）。ヌクレオチド２６４と６１２との間のＹｄｉＡ配列に対応する、２つのオリゴヌクレオチドプライマー、ＢｓｕｙｄｉＡ１（配列番号７）及びＢｓｕｙｄｉＡ２（配列番号８）を使用して、標準ＰＣＲ法により３４８ｂｐＤＮＡ断片を調製した。この断片を、ｐＭＵＴＩＮ２ベクターのＨｉｎｄＩＩＩ部位とＢａｍＨＩ部位との間にクローニングし、Ｅ．ｃｏｌｉプラスミドｐＴＨ１を発生させた。次いで、このプラスミドを、５μg／mlのエリスロマイシンに耐性のコロニーを選択するＤＮＡ形質転換により、B.subtilisＰＹ７９のｙｄｉＡ（ｔｈｉＬ）遺伝子に挿入した。１つのＥｒｍｒコロニーを回収しそしてＴＨ５と名付けた（ΩｔｈｉＬ：：ｐＭＵＴＩＮ）。ＩＰＴＧの存在下又は不存在下にエリスロマイシンを有するＴＢＡＢ培地上でのバクテリア増殖を比較することにより、ｙｄｉＡの下流の遺伝子の１つ以上の発現が細胞増殖のために必要であることが決定された。ｙｄｉＡ（ｔｈｉＬ）のヌクレオチド２６７と２７２との間に内因性ロー非依存性転写終結部位（endogeneous rho-independent transcription termination site）を含有する（ｃａｔ2）若しくは欠いている（ｃａｔ4）クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼカセットを挿入することにより、追加のｙｄｉＡ（ｔｈｉＬ）破壊を発生させた場合にも、同様な結果が得られた。ＰＣＲプライマー対ｃａｔ＃１（配列番号９）−ｃａｔ＃２（配列番号１０）及びｃａｔ＃１−ｃａｔ＃４（配列番号１１）を使用して、それぞれ、ＤＮＡカセットｃａｔ2又はｃａｔ4遺伝子を発生させ、これらを、プライマーｙｄｉＡ／ａｔｐ／ｆｏｒ／ｂａｍ（配列番号１２）−ｙｄｉＡ／ａｔｐ／ｒｅｖ／ｓｍａ（配列番号１３）及びｙｄｉＡ／ｃｔｐ／ｆｏｒ／ｓｍａ／２（配列番号１４）−ｙｄｉＡ／ｃｔｐ／ｒｅｖ／ｅｃｏｒＩ／２（配列番号１５）を使用して発生させたｙｄｉＡ（ｔｈｉＬ）ＰＣＲ ＤＮＡ断片にライゲーションさせた。次いで、５μg／mlのクロラムフェニコールに耐性のコロニーを選択するＤＮＡ形質転換により、株ＰＹ７９の染色体ｙｄｉＡ（ｔｈｉＬ）遺伝子に、ΔｔｈｉＬ：：ｃａｔカセットを直接挿入した。ΔｔｈｉＬ：：ｃａｔ4（ＴＨ１２）を含有するＣｍｒコロニーのみが、ＴＢＡＢ培地上で正常に増殖し；ΔｔｈｉＬ：：ｃａｔ2を含有するＣｍｒコロニーは、小さな、ピンポイントコロニーとして増殖した。それぞれ、ΔｔｈｉＬ：：ｃａｔ2及びΔｙｄｉＡ：：ｃａｔ4を含有する株ＴＨ１１及びＴＨ１２を取っておいた。驚くべきことに、株ＴＨ５及びＴＨ１２は、チアミン又はＴＰＰ栄養要求株ではなかった。その代わりに、両株はチアミン栄養緩徐株（ｂｒａｄｙｔｒｏｐｈ）であった、即ち、最小培地で、ＴＨ５及びＴＨ１２のコロニーサイズは、ＰＹ７９コントロールコロニーの直径の半分であった。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ及びＥ．ｃｏｌｉのｔｈｉＬなし突然変異体は厳密なチアミン栄養要求株であるので、B.subtilisは、ＴＭＰをＴＰＰに転換することができる第２のキナーゼ活性又は別の経路を含むと思われた。興味深いことに、ｙｄｉＡ（ｔｈｉＬ）突然変異体は、最小培地で３７℃で１日のインキュベーションの後B.subtilis ｔｈｉＦ又はｔｈｉＧ突然変異体（それぞれ、ＴＨ３及びＴＨ４と呼ばれる株）と栄養共生することができたが、これに対して、ＰＹ７９は３日以上を要した。これは、ｙｄｉＡ突然変異体がチアミン生合成について部分的に脱調節されそして野生型株よりもより拡散性の高いチアミン産物を放出することを示唆した。バイオアッセイの結果（表２）は、全細胞内チアミン産生（チアミン＋ＴＭＰ＋ＴＰＰ）レベルは、ＰＹ７９よりもＴＨ５及びＴＨ１２において僅かにより高い（２〜３倍）ことを示した。ＰＹ７９に対して僅かにより高い全チアミンレベルは、培養培地においても検出されたが、細胞内レベルよりはるかに低かった。興味深いことに、チアミン産生の増加は、チアミン類似体ピリチアミンに対する耐性を与えるのに十分ではなかった。
【００９４】
【表２】
ａ最小培地（３０ml）中の３７℃で２４時間増殖後のチアミン濃度
ｂ３７℃で２４時間増殖後最小培地培養物３０mlから集められた音波処理した細胞の１ml上澄液のチアミン濃度
【００９５】
B.subtilisのチアミン脱調節された突然変異体を単離するためのストラテジーは、ｔｈｉＡ−ｌａｃＺ融合体を含有するバクテリアを突然変異誘発させ、次いでＸＧＡＬ含有培地で、ＴＰＰ又はチアミンの存在下にＬａｃ＋（即ち、青いコロニー）であるコロニーをスクリーニングすることであった。ｔｈｉＡの５’プロモーター領域の４１７ｂｐを含有する７３２ｂｐ長さのＤＮＡ断片を、標準方法を使用するＰＣＲにより調製し、そしてｐＤＧ１７２８ベクターのプロモーターなしのｌａｃＺ遺伝子の前方に一方向にクローニングして（Guerout-Fleury et al.(1996)Gene180:57-61）、プラスミドｐＴＨ１２を生じさせた。このベクターは、B.subtilisの非必須ａｍｙＥ遺伝子座（non-essential amyE locus）に異所性転写ｌａｃＺ融合体（ectopic transcriptional lacZ fusions）を導入するようにデザインされている。プラスミドｐＴＨ１２を制限酵素消化により線状化しそしてB.subtilis ＰＹ７９に形質転換して、１００μg／mlスペクチノマイシンに耐性のコロニーを選択した。ＴＨ２１（ΩａｍｙＥ：：ｔｈｉＡ−ｌａｃＺ）と名付けられた１つの得られるコロニーは、異なる栄養増殖条件下に試験されるとき、明瞭なチアミン調節を示した。チアミン１μMを含有する振とうフラスコ培養物中で初期対数期（ＯＤ６００＝０．８〜０．９）へと増殖させると、ｔｈｉＡ−ｌａｃＺの発現は、チアミンなしの最小培地中で増殖させた細胞に比べて約８０倍抑制された。ＨＭＰ（１μM）もまた融合体の発現を抑制したが、より少ない程度（５〜７倍）であった。チアゾール及びアデノシン（各々１μM）は抑制活性を示した。経時実験では、ｔｈｉＡ−ｌａｃＺの発現は、細胞が初期対数期（ＯＤ６００＝０．８〜０．９）にあるとき最も高かった（２００ミラー単位（Miller Units））。発現は、細胞が定常期（ＯＤ６００＞１）に入ると、徐々に減少した（５０ミラー単位に）。
【００９６】
ｔｈｉＡ−ｌａｃＺ融合体の調節は、いくつかの突然変異体においても評価された。胞子形成欠如突然変異体株（ΔｓｐｏＯＡ：：ｅｒｍ）において、融合体の発現は調節されたが、チアミンによる抑制のレベルは、野生型におけるよりも低かった。ｙｄｉＡ／ｔｈｉＬの欠失を含む株（ＴＨ２２（ΔｔｈｉＬ：：ｃａｔ4、ΩａｍｙＥ：：ｔｈｉＡ−ｌａｃＺ））において、融合体は部分的に脱調節された。即ち、ｌａｃＺ活性は、抑制増殖条件及び脱抑制増殖の両条件下に２〜３倍高かった。
【００９７】
これらの結果に基づいて、ｔｈｉＡ−ｌａｃＺレポーター株ＴＨ２２（ΔｔｈｉＬ：：ｃａｔ4）を使用して、抑制増殖条件下に、脱調節された突然変異体をスクリーニングした。２つの方法を使用して、このような突然変異体を単離した。第１の方法では、チアミン１μM及びＸＧＡＬ２５μg／mlを含有するＭＭ寒天プレートを調製した。対数増殖期ＴＨ２２細胞の均一な希釈を行った後、３滴のエチルメタンスルホネート（ＥＭＳ、ｄ＝１．１７ｇ／ml溶液）を含有するペーパーディスクを、プレートの中心に置いた。Ｌａｃ＋コロニーは、３７℃で７日のインキュベーションの期間にわたり現れた。脱調節された突然変異体Ｔｘ１−Ｔｘ１０を回収した。第２の方法では、ＥＭＳで突然変異誘発させた細胞のバンクを調製しそしてスクリーニングした。従って、対数段階ＴＨ−２２細胞をＥＭＳ９．４ｍＭで９０分間処理し、そしてアリクォートを−９０℃で１０％グリセロール中に凍結させた。凍結されたストックからの細胞をＶＹ培地中に希釈し、室温で３０分間インキュベーションし、次いでチアミン１μM及びＸＧＡＬ２５μg／mlを含有するＭＭ培地上でプレートした。Ｌａｃ＋コロニーのスクリーニングにより、突然変異体Ｔｘ１１〜Ｔｘ２６を得た。これらの突然変異体は、チアミン抑制条件及びＴＰＰ抑制条件下に青色の出現の強度及びタイミングに基づき（表３）そして追加の表現型に基づいて３つのクラスに分類することができる。１つの突然変異体（Ｔｘ１）は、強いチアミン栄養緩徐株であることが見出され、これは、この突然変異体が、（１）残留ＴＭＰキナーゼ活性又は（２）ＴＭＰを介する第２のＴＭＰ−ＴＰＰ経路に関与した遺伝子を不活性化したことを示唆する。他の突然変異体、Ｔｘ２６は、ピリチアミン１０μMに耐性であった。チアミン産物の合成に関して、突然変異体Ｔｘ７（クラス２）は、親株、ＴＨ２２（ΔｔｈｉＬ：：ｃａｔ４、ΩａｍｙＥ：：ｔｈｉＡ−ｌａｃＺ）に比べて２〜３倍多くの全チアミン産物を分泌したが、チアミン産生物の細胞内レベルは同様であった（表４）。突然変異体Ｔｘ２６（クラス１）は、ＴＨ２２コントロール株よりも１０〜１５倍多くの全細胞外チアミン産生物を培養培地中に分泌した（表４）。分泌されたチアミン産生物の５０％を僅かに超えたものがＴＰＰの形態にあった。Ｔｘ１及びＴｘ２３により示されたクラス３突然変異体は、チアミン又はＴＰＰの存在下に異なるＬａｃ発現に基づいてチアミン−ＴＭＰ−ＴＰＰ経路に影響を与えると思われる。
【００９８】
【表３】
【００９９】
【表４】
ａ３７℃で２４時間増殖後の最小培地（３０ml）中のチアミン濃度
ｂ３７℃で２４時間増殖後の最小培地培養物３０mlから集められた音波処理した細胞の１ml上澄液のチアミン濃度
【０１００】
外因性前駆体給餌の研究において、ＨＭＰ及びＨＥＴの全チアミン産物への転換も、Ｔｘ７とＴｘ２６とでは異なっていた（表５）。各株を、指示された量のＨＥＴ及びＨＭＴを含有する最小培地培養物中で３７℃で１８時間増殖させた。培養培地及び細胞抽出物をチアミン産物について分析した。S.typhimuriumインディケーターＤＭ４５６（ΩｔｈｉＤ９０６：：ＭｕｄＪ）及びＤＭ１８５６（ΩｔｈｉＬ９３４：：Ｔｎ１０）それぞれを使用する生物学的アッセイにより（チアミン＋ＴＭＰ＋ＴＰＰ）及び（ＴＰＰ）を測定した。チアミン産物は培地中に検出されなかった。Ｔｘ７では、チアミン産物の大部分は、主としてＴＰＰの形態で細胞内に見出された。対照的に、Ｔｘ２６における全チアミン産物の９０％は、主としてチアミン＋ＴＭＰとして培養培地中に見出された。細胞外蓄積は、ＨＭＰ＋ＨＥＴを加えることなく増殖させたＴｘ２６よりも約４０倍高かった。
【０１０１】
【表５】
【０１０２】
突然変異ｔｘ２６、ｔｈｉＬ及びｔｘ１の組み合わせを含有するB.subtilis株を構築した。この株は、組み込まれそして増幅された工学的に作られたチアミン生合成遺伝子のための宿主として役立つことができた。第１段階として、Ｔｘ２６における突然変異を、ＤＮＡ形質転換及びピリチアミン１０μMに耐性のコロニーを選択することにより、ＴＨ１２（ΔｔｈｉＬ：：ｃａｔ4）に移行させた。チアミンの存在下にやはりＬａｃ＋である１つのＰｙｒｒコロニーを回収しそしてＴＨ４８と命名した。各株を、微量栄養素及びＤｉｆｃｏ栄養ブロス（ＮＢ）２．５％を補充した最小培地中で３７℃で１８時間増殖させた。上澄液を、チアミン＋ＴＭＰ＋ＴＰＰ）についてインディケーターＳａｌｍｏｎｅｌｌａＤＭ４５６（ｔｈｉＤ９０６：：ＭｕｄＪ）及び（ＴＰＰ）についてＳａｌｍｏｎｅｌｌａＤＭ１８５６（ｔｈｉＬ９３４：：Ｔｎ１０）を使用するバイオアッセイにより、チアミン産物について分析した。最小培地振とうフラスコ培養物中で増殖させると、ＴＨ４８は、Ｔｘ２６親に比べて同様なレベルのチアミン産物を産生した（表６）。次いで、ｃａｔで中断されたｔｈｉＬ遺伝子（cat-interrupted thiL gene）をフレーム内欠失（in-frame deletion）により置換した。標準ＰＣＲ法を使用して、ｔｈｉＬのフレーム内欠失（アミノ酸残基Ｇｌｙ７９及びＧｌｙ２０２を除去する）を最初に構築しそしてＥ．ｃｏｌｉプラスミドベクターｐＥｐＵＣΔ１のＢａｍＨＩ部位とＥｃｏＲ１部位との間に挿入して、ｐＴＨ３０を創生した。ｐＥｐＵＣΔ１（S.Seror, Universite Paris-Sud, 91405 Orsay, France）は、選択可能なエリスロマイシン耐性（erm）カセット及び５１℃を超えると機能しない温度感受性複製起点を含む。ＴＨ４８細胞をｐＴＨ３０により５１℃で形質転換して、エリスロマイシン耐性を選択した。Ｃｍｒでもある１つのＥｒｍｒコロニーを回収し、そして抗生物質選択の不存在下に２８℃で夜通し７２時間 増殖させた。次いでバクテリアを、ＴＢＡＢ寒天プレート上にプレートし、そしてプレートを３７℃で一夜インキュベーションした。コロニーの約２５％は、エリスロマイシン及びクロラムフェニコール抗生物質の両方に感受性であることが見出された。いくつかのＥｒｍＳＣｍＳコロニーからの染色体ＤＮＡのＰＣＲ分析により、フレーム内ΔｔｈｉＬ突然変異の存在及びΔｔｈｉＬ：：ｃａｔ4突然変異の不存在が確認された。これにより株ＴＨ８３を得た。次いで、サイレントＴｎ９１７挿入体に対する連鎖（linkage）、ΩｙｌｏＡ：：Ｔｎ９１７（ｔｘ１に対する６０％連鎖；Bacillus Genetic Stock Centerの株１Ａ６３３，ＣＵ４１５３又はΩｚｄｉ−８２：：Ｔｎ９１７とも呼ばれる）を使用する標準方法によるＰＢＳ１形質導入によるＴＨ８３への形質導入により、ｔｘ１突然変異を導入した。得られる株はＴＨ９５と呼ばれた。
【０１０３】
【表６】
【０１０４】
２０リットルの実験室規模の醗酵槽を使用する標準フェドバッチ醗酵において、ＮＢはＴＨ９５においてチアミン産生を高めることが見出された。結果は、細胞外チアミン産物レベルは、ＮＢなしの給餌に比べて４％ＮＢを含有する給餌培地を使用すると約２〜３倍高かった（表７）。産生は、３０〜４８時間の増殖の間に６〜７mg／リットルの最大レベルに達した。更に重要には、チオクロム／ＨＰＬＣアッセイにより判定して、細胞外チアミン産物の少なくとも６５％はチアミンの形態にあったが、これに対して給餌物中にＮＢのない醗酵では、産物の大部分はＴＭＰ及びＴＰＰであった。同時に、播種（seed）内のＮＢの量を増加させ（１０％）そして給餌物からＮＢを除去すると、チアミン関連産物の産生を２４時間培養時間に遅延させた。更に、分泌されたチアミン産物は減少しそして主としてＴＭＰの形態にあった。バッチへのＮＢ（４％）の添加も、全チアミン産生の減少及び分泌プロフィールの変化をもたらし、その場合すべてのチアミン形態（ＴＨＩ、ＴＭＰ及びＴＰＰ）が殆ど等モル量であった。
【０１０５】
【表７】
【０１０６】
実施例３： ＨＭＰ及びＨＥＴを使用するチアミン化合物の産生
この実施例は、チアミン前駆体ＨＭＰ及びＨＥＴの存在下にチアミン脱調節株を増殖させてチアミン化合物を産生させる方法を記載する。
チアミン前駆体共給餌（co-feed）を伴う株ＴＨ９５（ｔｘ２６ｔｘ１ΔｔｈｉＬｙｌｏＡ：：Ｔｎ９１７）の醗酵を、フェドバッチ条件下に６リットル及び１リットル規模で行った。ヒドロキシエチルチアゾール（ＨＥＴ）０．５４ｇ／リットル及びヒドロキシメチルピリミジン（ＨＭＰ）０．５４ｇ／リットルを含有する給餌溶液は、培養培地中のチアミンの有意な蓄積をもたらした。チアミン力価が４８時間後に１２０mg／Ｌ（表８）に達し、これは、いずれかの前駆体の濃度に基づく２５％のモル収率を表す。逆に、ＴＭＰ及びＴＰＰ力価は非常に低く（それぞれ、４及び２mg／リットル）、チアミン関連分泌産物の全量の３％未満に相当する。ＨＭＰ又はＨＥＴのみの供給は、すべてのチアミン産生物の非常に低い力価をもたらした。ＨＭＰ及びＨＥＴの濃度を各々又は組み合わせにおいて２．７ｇ／リットルに増加させても、チアミン産生レベルの有意な増加をもたらさなかった。ＨＥＴ０．５４ｇ／リットル及びＨＭＰ０．５４ｇ／リットルの存在下にＴＨ９５の醗酵を延長すると、チアミン力価を優先的に増加させた。７０時間後に、チアミン（ＴＨＩ）力価は、２５０mg／リットルに達し、これに対して、ＴＭＰ及びＴＰＰレベル（７及び２mg／リットル）は４８時間時点のレベルと同様であった（表９）。
【０１０７】
【表８】
【０１０８】
【表９】
【０１０９】
実施例４：ＴｈｉＡ合成を増加させたチアミン産生株
この実施例は、B.subtilis ｔｈｉＡ遺伝子を過剰発現してチアミン産生物の過剰産生及び分泌をもたらすのに使用することができるB.subtilis ｔｈｉＡ遺伝子を含有するＤＮＡカセットの構築を説明する。
【０１１０】
発現を増加させるために、ネイティブプロモーター領域が、B.subtilisバクテリオファージＳＰＯ１に由来する強い構成的ＳＰＯ１−２６プロモーター（Ｐ26と命名された）により置換されている、増幅可能な工学的に作られたｔｈｉＡカセットを構築した。最初に、全体のｔｈｉＡ遺伝子を含有する１７７０ｂｐ長さのＤＮＡ断片を、標準方法及び合成オリゴＤＮＡプライマーｔｈｉＡ／ｆｏｒ／ｐＸＩ２２／ＮｄｅＩ（配列番号１）及びｔｈｉＡ／ｒｅｖ／ｐＸＩ２２／Ｂａｍ（配列番号２）を使用するＰＣＲにより増幅した。ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩによる消化の後に、ＰＣＲ産生物を、ｐＸＩ２２ｍｏｄのＮｄｅＩ部位とＢａｍＨＩ部位との間に挿入し、標準的な方法を用いてコンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞に形質転換した。ｐＸＩ２２ｍｏｄは、Ｐ26プロモーター、合成Ｂａｃｉｌｌｕｓ ＲＢＳ、ｃｒｙＴターミネーター、選択可能なアンピシリン（ｂｌａ）耐性遺伝子及びクロラムフェニコール（ｃａｔ）耐性遺伝子及びＲＢＳとｃｒｙＴターミネーターとの間に位置したＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩクローニング部位（ＮｄｅＩ部位はＡＴＧ開始部位を発生させる）を含有する７．２ｋｂＥ．ｃｏｌｉプラスミドである。Ｐ26プロモーターは、プロモーターの−３５及び−１０コンセンサス領域間にＥ．ｃｏｌｉＣｏｌＥ１レプリコン及びｂｌａ遺伝子を配置することにより不活性化された。更に、ｐＸＩ２２内のＮｄｅＩ部位を標準方法により修飾して、レプリコン領域内に位置した望まれないＮｄｅＩ制限部位を除去した。これによりプラスミドｐＴＨ４３を得た（図１）。他のｔｈｉＡ発現カセットも、ｃａｔカセットを選択可能なテトラサイクリン耐性（ｔｅｔ）遺伝子で置換することによって調製された。これを行うために、プラスミドｐＤＧ１５１４（BGSC, Cat#ECE100）遺伝子からのｔｅｔ遺伝子を含有する２０４２ｂｐＤＮＡ断片を、標準方法及び合成オリゴＤＮＡプライマーｔｅｔ／ｆｏｒ／ＰｍｅＩ（配列番号３）及びｔｅｔ／ｒｅｖ／ＮｏｔＩ（配列番号４）を使用するＰＣＲにより増幅した。次いで、この断片をｐＴＨ４３のＰｍｅＩ部位とＮｏｔＩ部位との間にクローニングして、ｐＴＨ４７を得た（図１）。
【０１１１】
次の仕事は、Ｐ26ｔｈｉＡ−ｃａｔカセットをチアミン脱調節株に組み込むことであった。最初に、プラスミドｐＴＨ４３をＢｓａＩにより消化しそして３３５２ｂｐ長さの断片を標準方法を使用してアガロースゲルから精製した。精製した断片をそれ自体に高いＤＮＡ濃度でライゲーションしそして標準方法を使用してＴＨ９５コンピテント細胞に形質転換した。形質転換体を、クロラムフェニコール５μg／mlを含有するＴＢＡＢ培地上で選択した。ＴＨ１１６と名付けられた１つのＣｍｒコロニーを更に研究するために取っておいた。引き続いてより高いレベルのクロラムフェニコールに耐性のコロニーを得ることにより、ｔｈｉＡの発現を増加させた。特に、クロラムフェニコール６０μg／mlに耐性のＴＨ１１６の株を得ることができる。クロラムフェニコール６０μg／mlに耐性のＴＨ１１６株の粗細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、クロラムフェニコール５μg／mlの みに耐性のＴＨ１１６株より有意に高いレベルのＴｈｉＡタンパク質を示した。
【０１１２】
工学的に作られた株ＴＨ１１６によるチアミン産生を、ＨＥＴ共給餌（０．５４ｇ／リットル、重量／重量）を伴う標準フェドバッチ条件を使用して２０リットルの実験室規模の醗酵槽で試験した。クロラムフェニコール６０μg／mlに耐性の株ＴＨ１１６は、１８〜２１mg／リットルのチアミンを産生し（表１０）、これはＴＨ９５醗酵に比較してチアミン産生において３倍の増加である（表８）。しかしながら、チアミン産生は、給餌の研究において観察されたよりも有意に低かった（実施例３参照）。この結果は、ＨＭＰの形成は速度限定性であることを示し、これは、不十分な量の追加の酵素活性又は低いレベルのＡＩＲプールにより引起されうることを示す。
【０１１３】
【表１０】
【０１１４】
実施例５：ＡＩＲ形成を増加させた微生物を使用してチアミン化合物を産生する方法
この実施例は、プリン経路を改変してアミノイミダゾールリボチド（ＡＩＲ）形成を増加させることにより、チアミン産生を増加させる実験を説明する。これは、同時に、プリンオペロン（ｐｕｒＯ）のリーダー領域内の突然変異を使用してB.subtilisプリンオペロンの発現を脱調節しそしてホスホリボシルアミノイミダゾールカルボキシラーゼＩをコードするｐｕｒＥ遺伝子内の突然変異の導入によりＡＩＲのカルボキシアミノイミダゾールリボチド（ＣＡＩＲ）への転換を阻止することにより達成された。
【０１１５】
ｐｕｒＯ突然変異を構築するために、オペロンプロモーターの上流領域を、プライマーＹｅｂＦ＋１（配列番号１８）及びＹｅｂＧ−１（配列番号１９）を使用するＰＣＲにより増幅させて、６６７ｂｐ産物を発生させた。野生型B.subtilis１０１２から調製されたゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用し、そしてＰＣＲ反応条件は、９５℃で１分の変性、５５℃で１分間のアニーリング及び７２℃で１分間の伸長の３０サイクルからなっていた。ＰＣＲ産物を、ＷｉｚａｒｄＰＣＲ精製キット（Promega）を使用して精製しそしてＥｃｏＲ１−ＢａｍＨＩで二重消化した。ＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲ１−ＢａｍＨＩ消化されたｐＵＣ１９にクローニングして、プラスミドｐＮＭＲ７２を得た。
【０１１６】
ｐｕｒＥプロモーターを、プライマーＰｕｒＥ＋３（配列番号２０）及びＰｕｒＥ−１（配列番号２１）を使用するＰＣＲにより増幅して、７６８ｂｐ産物を得た。ＰＣＲ産物を、ＷｉｚａｒｄＰＣＲ精製キット（Promega）を使用して精製しそしてＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩで二重消化し、そしてＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ消化されたｐＮＭＲ７２にクローニングして、プラスミドｐＮＭＲ７６を得た。
【０１１７】
プラスミドｐＮＭＲ７６をＢａｍＨＩで線状化しそしてｐＢＥＳＴ５０からのＢｃｌＩで消化したネオマイシン耐性（neo）遺伝子カセットにライゲーションして、ｐｕｒ転写と同じ方位のｎｅｏカセットを有するｐＮＭＲ７９及び反対方位のｎｅｏカセットを有するｐＮＭＲ８０を得た。両プラスミドをＳｃａＩで線状化しそしてコンピテントB.subtilis１０１２細胞に形質転換した。形質転換体を２．５μg／mlの最終濃度となるようにネオマイシンを含有するＴＢＡＢ上で選択した。ｐＮＭＲ７９形質転換体について６７コロニーが観察され、そしてｐＮＭＲ８０形質転換については１８コロニーが観察された。各形質転換実験からの６コロニーを取り出しそしてＰＣＲにより分析した。２つのクローンが、各形質転換について二重乗換え（double crossover）として組み込まれたトランケーテッド（truncated）ｐｕｒオペロンを含有するものとして同定された。これらのクローンは、ｐＮＭＲ７９形質転換についてＢＳ１５６６及びＢＳ１５６７と再命名されそしてｐＮＭＲ８０形質転換についてはＢＳ１５６８及びＢＳ１５６９と再命名された。
【０１１８】
ｐｕｒＯ欠失突然変異をｐｕｒＥ６突然変異と組み合わせるために、B.subtilis株１Ａ３２０（purE6trpC2;Bacillus Genetic Stock Center, The Ohio State University, Columbus, Ohio43210USA）を、株ＢＳ１５６７からの染色体ＤＮＡで形質転換して、株ＴＨ９４を得た。ｐｕｒＯ：：ｎｅｏ ｐｕｒＥ６は密接に連鎖しているので、両突然変異を、標準条件下のＰＢＳ１普遍形質導入によりチアミン脱調節株ＴＨ９５に同時に移行して、株ＴＨ１０１（ｔｘ２６ｔｘ１ΔｔｈｉＬｙｌｏＡ：：Ｔｎ９１７ΔｐｕｒＯ：：ｎｅｏ ｐｕｒＥ）を得た。チアミン産生を決定するために、株ＴＨ１０１を、ＨＥＴ（０．５４ｇ／リットル）共給餌を伴う標準１−Ｌフェドバッチ条件下に増殖させた。キサンチンもバッチ培地及び給餌溶液に、それぞれ、０．０１％（重量／重量）及び１％（重量／重量、７．３５Ｎ ＮａＯＨに溶解した）で加えて、プリン要求を飽和させた。キサンチンは、プリン新規酵素のいずれもフィードバック阻害もしなければ、高濃度で毒性でもない。更に、給餌物はＮＨ4Ｃｌ（９．６％重量／重量）も含有しそしてpHをＨ2ＳＯ4（１０％）及びＮａＯＨ（７．３５Ｍ）を使用して制御した。結果は、同じ実験条件下にコントロールＴＨ９５醗酵よりも約６倍多くのチアミンをブロス中に産生したことを示した（表１１）。
【０１１９】
【表１１】
ＢＤ、検出以下
【０１２０】
実施例６：チアミンカップリング遺伝子（thiamin coupling gene）を強めることによりチアミン化合物産生を増加させる方法
この実施例は、B.subtilis ｔｈｉＣ遺伝子を過剰発現してチアミン産物の過剰産生及び分泌をもたらすのに使用することができるB.subtilis ｔｈｉＣ遺伝子を含有するＤＮＡカセットの構築を説明する。この遺伝子は、再利用酵素、ＨＥＴキナーゼをコードする遺伝子、ｔｈｉＫを含有するオペロン内に位置している。
【０１２１】
ｔｈｉＣの発現を増加させるために、ネイティブプロモーター領域が、B.subtilisバクテリオファージＳＰ０１に由来する強い構成的ＳＰ０１−２６プロモーター（Ｐ26と命名された）により置換されている増幅可能なカセットを構築した。これを行うために、ｔｈｉＡカセットをｐＴＨ４７から除去しそしてｔｈｉＫＣを含有するＤＮＡ断片により置換した。最初に、ｔｈｉＫＣ構造遺伝子を含有する１５５５ｂｐ断片を、標準方法及び合成オリゴＤＮＡプライマーｔｈｉＫＣ／ｆｏｒ３／ｐＸＩ２２／ＮｄｅＩ（配列番号５）及びｔｈｉＣｏｐ／ｒｅｖ２／ｐＸＩ２２／ＳｍａＩ（配列番号６）を使用するＰＣＲにより増幅した。ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩによる消化の後、ＰＣＲ産物を、ｐＴＨ４３のＮｄｅＩ部位とＢａｍＨＩ部位との間に挿入して、プラスミドｐＴＨ４８（図２）を得た。
【０１２２】
このＰ26ｔｈｉＫＣ−ｔｅｔカセットを、最初にｐＴＨ４８をＢｓａＩで消化しそして標準方法を使用してアガロースゲルからの４０７８ｂｐ断片を精製することにより、ＴＨ９５に導入した。精製した断片をそれ自体に高ＤＮＡ濃度でライゲーションしそして標準方法を使用してＴＨ９５コンピテント細胞中に形質転換した。形質転換体を、テトラサイクリン２０μg／mlを含有するＴＢＡＢ培地で選択した。ＴＨ１１５と名付けられた１つのＴｅｔｒコロニーを、更なる研究のために取っておいた。連続したより高いレベルのテトラサイクリンに耐性のコロニーを得ることによりｔｈｉＫＣの発現を増加させた。特に、テトラサイクリン４５μg／mlに耐性のＴＨ１１５の株を得ることができた。粗細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、テトラサイクリン２０μg／mlのみに耐性のＴＨ１１５株よりも有意に高いレベルのＴｈｉＫ及びＴｈｉＣタンパク質を示した。
【０１２３】
ＨＭＰ及びＨＥＴ共給餌（各々、０．５４ｇ／リットル）の存在下に、ＴＨ１１５の２つのフェドバッチ醗酵は、チアミン産生を増加させた（４８時間で２１０mg／Ｌ及び７８時間後３００mg／リットル）。基質ＨＭｐ又はＨＥＴに関するモル収率は各々４８時間及び７８時間で４５％であった。２つの他の醗酵は、チアミン産生を僅かに減少させた。興味深いことに、より高いチラミン分泌は厳しい増殖制限事象と同時に起こった。この増殖制限事象は、醗酵の最初の時間の期間中に起こりそして６リットルの培養への栄養ブロス（ＮＢ）２５ｇ及びＴＰＰ１．６mgの添加により克服することができた。ＨＰＬＣ／ＤＡＤは、醗酵ブロス中にチアミンが存在することを確証しそして他のＵＶで検出可能な化合物からチアミンを精製するのに使用することができた。興味深いことに、ＨＭＰもＨＥＴも、ＨＰＬＣ／ＤＡＤにより検出されず、これは、０．５４ｇ／リットルで適用された共給餌物の完全な取り込みを示す。いずれにせよ、これらの結果は、ＴＨ１１５が、外因的に添加された前駆体からＴＭＰを合成し、ＴＭＰ脱リン酸化してチアミンとし、そしてチアミンを培養培地中に分泌するための高い能力を有することを示す。更に、ＴｈｉＣカップリング活性は、明らかにこの方法では律速ではない。
【０１２４】
実施例７：チアゾール生合成酵素の発現レベルを高めることによりチアミン化合物産生を増加させる方法
この実施例は、B.subtilis ｔｈｉＢオペロン含有遺伝子ｔｅｎＡＩ−ｔｈｉＯＳＧＦＤを含有するＤＮＡカセットであって、該遺伝子を過剰発現させてチアミン産生物を過剰産生させそして分泌させるのに使用することができるＤＮＡカセットの構築を説明する。
【０１２５】
最初に、ｔｅｎＡＩ−ｔｈｉＯＳＧＦＤオペロンの前のネイティブプロモーター領域を欠失したチアゾール栄養要求株を発生させた。それをするために、プロモーター領域の各側に位置した２つのＤＮＡ断片（ＴｅｎＡの下流及びＹｊｂＱの上流の断片）を、最初に、プライマー対ＹｊｂＱ＋＿ＢａｍＨＩ（配列番号２２）／ＹｊｂＱ−＿ＭｌｕＩ（配列番号２３）及びＴｅｎＡ＋＿ＫｐｎＩ（配列番号２４）／ＴｅｎＡ−＿ＸｈｏＩ（配列番号２５）を使用してB.subtilis ＰＹ７９染色体から増幅した。クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼカセットを含有する第３断片を、プライマーＴｅｎＡ−ｃａｔ＋＿ＫｐｎＩ（配列番号２６）及びＴｅｎＡ−ｃａｔ−＿ＭｌｕＩ（配列番号２７）を使用してＴＨ１１染色体ＤＮＡ（ＰＹ７９ΔｔｈｉＬ：：ｃａｔ2）から増幅した。次いでこれらの３つの断片のアセンブリングを、ｐＵＣ１９において行ってプラスミドｐＴＨ４０１を発生させた。これは、ＰｓｔＩ制限部位とＥｃｏＲ１制限部位との間に挿入された‘ｙｊｂＱ3’−ＭｌｕＩ−3’ｃａｔ5’−ＫｐｎＩ−5’ｔｅｎＡ’ＤＮＡ構成を含む。ＴＨ９５におけるプラスミドｐＴＨ４０１の形質転換及びＣｍ５μg／mlでの選択は、チアミン及びチアゾール栄養要求株ＴＨ４０３を生じさせた。
【０１２６】
Ｐ26ｔｅｎＡＩ−ｔｈｉＯＳＧＦＤカセットを構築するために、ｐＴＨ４０１におけるｃａｔカセットを、ＫｐｎＩ及びＭｌｕＩにより切り取り、次いで、バクテリオファージＳＰＯ１に由来する強い構成的プロモーターＰ26を含むＰＣＲ断片により置換した。この断片を、プライマーＰ２６＋＿ＭｌｕＩ（配列番号２８）及びＰ２６−＿ＫｐｎＩ（配列番号２９）を使用してプラスミドｐＵＣＳＰＯ１−２６から増幅した。次いでＴＨ４０３バックグラウンドにおける原栄養性の回復について選択することにより、ｔｈｉＢ過剰発現カセットの導入を行なった。ＴＨ４０３へのＰ26ｔｅｎＡ’フレーム内融合を創生するライゲーション混合物の形質転換の後に、原栄養性形質転換体を、それらが最小培地プレート上で増殖する能力について選択した。それらのクロラムフェニコール感受性及びｔｅｎＡＩ−ｔｈｉＯＳＧＦＤオペロンの前におけるＰ26プロモーターの存在が確認された。得られる株をＴＨ４０４（図３）と名付けた。
【０１２７】
工学的に作られた株ＴＨ４０４によるチアミン産生を、ＨＭＰ共給餌（０．５４ｇ／リットル、重量／重量）を伴う標準フェドバッチ条件（開始容積：６リットル）を使用して２０リットルの実験室規模の醗酵槽で試験した。株ＴＨ４０４は、３１５mg／リットルまでのチアミンを産生した（表１２）。その数値は、株ＴＨ９５で４８時間後に得られた数値（１１０mg／リットル、表９）よりも有意に高い。
【０１２８】
【表１２】
実施例８：ＴｈｉＡ及びチアゾール生合成酵素の発現レベルを高めることによりチアミン化合物産生を増加させる方法
この実施例は、B.subtilis ｔｈｉＡ遺伝子及びB.subtilis ｔｈｉＢオペロン含有遺伝子ｔｅｎＡＩ−ｔｈｉＯＳＧＦＤを含有するＤＮＡカセットの組み合わせであって、該遺伝子を過剰発現させてチアミン産物を過剰産生させそして分泌させるのに使用することができるＤＮＡカセットの組み合わせの構築を説明する。
【０１２９】
B.subtilisＰ26ｔｅｎＡＩ−ｔｈｉＯＳＧＦＤカセット（実施例７に記載された）及び増幅可能なＰ26ｔｈｉＡ−ｃａｔカセット（実施例４に記載された）を組み合わせるために、株ＴＨ４０４のコンピテント細胞を、標準方法を使用して株ＴＨ１１６から抽出された非集合的濃度（non-congressional concentration）の染色体ＤＮＡで形質転換した。形質転換体を、クロラムフェニコール５μg／mlに対する耐性について選択した。それらは、Ｐ26ｔｅｎＡＩ−ｔｈｉＯＳＧＦＤ及びＰ26ｔｈｉＡ−ｃａｔカセットを含有することがＰＣＲ分析により確認された。ＴＨ４０５と名付けられた１つのＣｍｒコロニーを更なる研究のために取っておいた。連続したより高いレベルのクロラムフェニコールに耐性のコロニーを得ることによりＴＨ４０５におけるｔｈｉＡの発現を増加させた。特に、クロラムフェニコール６０μg／mlに耐性のＴＨ４０５の株を得ることができた。クロラムフェニコール６０μg／mlに耐性の株ＴＨ４０５の粗抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、株ＴＨ１１６におけるＰ26ｔｈｉＡ−ｃａｔカセットの増幅後に得られたレベル（実施例４）と同じである、５μg／mlのみに耐性の株ＴＨ４０５より有意に高いレベルのＴｈｉＡタンパク質を示した。
【０１３０】
工学的に作られた株ＴＨ４０５によるチアミン産生を、標準フェドバッチ条件（開始容積：６リットル）を使用して、２０リットルの実験室規模の醗酵槽で試験した。クロラムフェニコール６０μg／mlに耐性の株ＴＨ４０５は、４８時間にチアミン３４〜３７mg／リットルを産生し（表１３）、これは、ＨＭＰ０．５４ｇ／リットルの共給餌を伴うＴＨ９５醗酵（表８）と比べてチアミン産生が６倍の増加である。しかしながら、チアミン産生は、共給餌の研究で観察された又はｔｈｉＢオペロンのみを過剰発現する株で観察された（表１２、実施例７）よりも有意に低かった。この結果は、実施例４からの我々の観察、即ち、ＨＭＰの形成が律速であることを確証し、そしてｔｈｉＡ及びｔｈｉＢオペロンに加えて過剰発現されるのに必要である推定欠落遺伝子がｔｈｉＢオペロンの一部ではないことを確証する。
【０１３１】
【表１３】
【０１３２】
実施例９：グリシン又はシステイン利用性を増加させることによりチアミン化合物産生を増加させる方法
この実施例は、ＨＥＴ経路における両前駆体であるグリシン又はシステインの存在下にチアミン脱調節株を増殖させることによりチアミン産生を増加させる実験を説明する。
【０１３３】
B.subtilis ＴＨ９６（ｔｘ２６ｔｘ１ΔｔｈｉＬ）によるチアミン産生を、ＨＭＰ（０．５４ｇ／リットル）及びグリシン共給餌（２ｇ／リットル）を伴う標準フェドバッチ条件を使用して、６リットルの実験室規模の醗酵において試験した。チアミン、ＴＭＰ及びＴＰＰ産生は、４８時間で、それぞれ、１４mg／リットル、３mg／リットル及び０．５mg／リットルに達し（表１４）、これは、ＨＭＰ給餌だけ（表８）で増殖させたＴＨ９５におけるチアミン産物レベルよりも実質的により高い。
【０１３４】
次に、B.subtilis ＴＨ９５（ｔｘ２６ｔｘ１ΔｔｈｉＬ）によるチアミン産生を、ＨＭＰ（０．５４ｇ／リットル）及びシステイン共給餌（０．５ｇ／リットル）を伴う標準フェドバッチ条件を使用して、６リットルの実験室規模の醗酵において試験し；システイン同化を促進するためにトレオニン（０．４ｇ／リットル）及びイソロイシン（０．２ｇ／リットル）も加えた。チアミン産生は、４８時間で８mg／リットルに達し（表１４）、これは、ＨＭＰ給餌だけ（表８）で増殖させたＴＨ９５におけるチアミン力価よりも実質的に高い。
【０１３５】
チアミン産生の増加は、ＴＨ９５の醗酵に４つのアミノ酸、グリシン、システイン、イソロイシン及びトレオニンをすべて添加することにより達成することもできた（表１４）。更に、これらのアミノ酸の合成に関与する生合成遺伝子の発現を増加させること、又は該アミノ酸生合成遺伝子の発現を増加させる調節遺伝子若しくはシス作用性調節部位に突然変異を導入すること、又は該生合成酵素の活性を増加させる突然変異を導入することにより、チアミン産生性を増加させることができた。
【０１３６】
【表１４】
【０１３７】
実施例１０：前駆体としてグレーベジアミン（Grewe Diamine）を使用してチアミン化合物を産生させる方法
この実施例は、ＨＭＰの誘導体、４−アミノ−２−メチル−５−ピリミジンメタンアミン（Grewe Diamine）の存在下にチアミン脱調節株を増殖させることによりチアミンの産生を証明する実験を説明する。
【０１３８】
グレーベジアミン（Grewe Diamine）は、Ｃ−５ヒドロキシメチル基がアミノメチル基により置換されているＨＭＰの誘導体である。B.subtilis ＴＨ９５（ｔｘ２５ｔｘ１ΔｔｈｉＬ）によるチアミン産生を、グレーベジアミン及びＨＥＴ共給餌（各々０．５４ｇ／リットル）を伴う標準フェドバッチ条件を使用して、６リットルの実験室規模の醗酵で試験した。チアミン産生は、４５．５時間で５３mg／リットルに達した（表１５）。給餌溶液中のグレーベジアミンのレベルを２．７ｇ／リットルに増加させると、チアミン産生は４６．５時間で１２０mg／リットルに増加した（表１５）。これらの結果は、グレーベジアミン及びＨＭＴからチアミンを産生する醗酵法を開発することの実行可能性を証明する。更に、これらの結果は、B.subtilisが、グレーベジアミンをＨＭＰ、若しくはチアミンを産生するのに使用することができる構造的に類似した化合物に転換することができる１つ以上の酵素活性をコードすることを証明する。
【０１３９】
【表１５】
【０１４０】
実施例１１：単離された遺伝子及び突然変異
ｙｌｏＳ／ｔｘ１
株Ｔｘ１は、ｔｘ１突然変異を有し（突然変異を有するポリヌクレオチド配列のコピーについて配列番号３０参照）、これは、ＴＰＰの存在下にＬａｃ＋表現型についてｔｈｉＡ−ｌａｃＺ融合体含有バクテリアをスクリーニングすることにより単離された。この株（ΔｔｈｉＬ：：ｃａｔ4ａｍｙＥ：：ｔｈｉＡ−ｌａｃＺｔｘ１）は、この突然変異が、残留ＴＭＰキナーゼ活性、又はチアミンからＴＰＰを形成させる第２経路に関与する未知の遺伝子産物を不活性化すると思われることを示す強いチアミン栄養緩徐株（brady troph）であることが示された。再構成の研究は、Ｔｘ１のＬａｃ＋表現型が、ＨＥＴ（ΩｔｈｉＦ：：ｐＭＵＴＩＮ）又はＨＭＰ−Ｐ（ΩｔｈｉＡ：：Ｔｎ９１７）経路のいずれかにおける阻止を含むＴＨ２２誘導体の分析により判定されたとおり、チアゾール又はＨＭＰ経路における一般的欠陥により引き起こされたのではないことを示した。
【０１４１】
ｔｘ１を有する株は、いかなる有意な量のチアミン産物も含有しない、栄養ブロス２．５％を補充された最小培地中で増殖するその能力に基づいて栄養緩徐株であることが確証された。これらの培養物において、Ｔｘ１はコントロール株ＴＨ２２（ΩｔｈｉＬ：：ｃａｔ4ΩａｍｙＥ：：ｔｈｉＡ−ｌａｃＺ）よりも約１０倍多くの細胞外チアミン産物を産生した。興味深いことに、すべての検出可能なチアミン産物は、チアミン又はＴＰＰの形態にあり、ＴＭＰは培養培地中に検出されなかった。遺伝子の研究は、Ｔｘ１のチアミン栄養緩徐株表現型はΔｔｈｉＬ：：ｃａｔ4を必要とすることを示した。
【０１４２】
標準条件下にＰＢＳ１普遍形質導入を使用する遺伝子マッピングの研究は、ｔｘ１突然変異がΔｔｈｉＬ：：ｃａｔ４又はΩａｍｙＥ：：ｔｈｉＡ−ｌａｃＺに連鎖されて（ｌｉｎｋｅｄ）いないことを示した。しかしながら、ｔｘ１は、１４０°に位置したｚｄｉ−８２：：Ｔｎ９１７（ＢＧＳＧ＃１Ａ６３３）に対する９０％形質導入連鎖を示した。同じマーカーに対する形質転換連鎖は８％であった。１２１°と１４０°との間に位置したいくつかのＴｎ−９１７連鎖突然変異も、ｔｘ１に対する有意な連鎖を示した。１つの突然変異、ｕｒｃ８３：：Ｔｎ９１７（株１Ａ６１１）は、高い形質導入連鎖（＞６０％）及び有意な形質転換連鎖（１０％）を示した。ウラシル＋システイン又はウラシル＋メチオニンに対する栄養要求性を引起すこの挿入は、ｐｙｒオペロンとｃｙｓオペロン（１３９°）との間の接続部にある。第２の突然変異、ｙｌｏＡ：：Ｔｎ９１７は、ｔｘ１に対する同様な連鎖を示した。ｔｘ１のΩｓｐｏＶＭ：：Ｔｎ９１７突然変異に対するはるかに高い形質導入連鎖及びＤＮＡ形質転換連鎖が観察され、これは、ｔｘ１がｓｐｏＶＭに隣接したｙｌｏＳに対して対立遺伝子であることを示す。ｙｌｏＳ遺伝子は、チアミンピロホスホキナーゼ活性を有することが以前に示されたSchizosaccharomyces pombeのＴＮＲ３遺伝子タンパク質に対する弱いアミノ酸類似性（Ｐ＝０．２３）を示す。ｔｘ１がｙｌｏＳに対して対立遺伝子であるかどうかを決定するために、ｙｌｏＳ遺伝子の塩基１２４で出発する安定な４４８ｂｐ長さの欠失突然変異（ΔｙｌｏＳ：：ｃａｔ４）を、標準方法を使用するＰＣＲにより構築しそしてＰＹ７９に導入した。ΩｔｈｉＬ：：ｐＭＵＴＩＮの導入の後、得られる二重突然変異体は、元のＴｘ１突然変異体に表現型が類似していた。更に、Ｔｘ１突然変異体におけるｙｌｏＳのＤＮＡ配列決定は、アミノ酸残基１１６におけるロイシンのフェニルアラニンへの置換をもたらした単塩基突然変異を示した（Ｌ１１６＞Ｆ１１６；配列番号３１参照）。
【０１４３】
これらの結果に基づいて、B.subtilisは、ＴＭＰからＴＰＰを合成するための２つの生合成経路：（１）ｔｈｉＬの産物によるＴＭＰのＴＰＰへの直接の酵素的変換及び（２）未知のホスファターゼによるＴＭＰのＴＨＩへの酵素的変換、続いて、ｙｌｏＳの産生物によるＴＨＩのＴＰＰへのピロリン酸化を含む。
【０１４４】
経路（１）は、グラム陰性生物（例えば、Salmonella typhimurium及びＥ．ｃｏｌｉ）において存在することが示された。経路（２）は、いくつかのグラム＋菌及び、酵母を含む幾つかの他の真核微生物においてのみ存在する（Llorente et al, (1999)Mol.Microbiol.32:1140-1152)。更に、B.subtilisは、チアミンをＴＭＰに転換するキナーゼ活性を含まなければならない。この結論は、突然変異ΔｙｌｏＳ：：ｃａｔ4及びΩｔｈｉＡ８４：：Ｔｎ９１７を含む株ＴＨ１０９がチアミンを含有する最小培地中で増殖することができることを示す遺伝子研究に基づいている。
【０１４５】
タンパク質データベースサーチは、少なくとも１３のバクテリア属、即ち、Oceanobacillus、listeria、Staphylococcus、Enterococcus、Streptococcus、Clostridium、Fusobacterium、Tropheryma、Mesorhizobium、Brucella、Thermotoga、Agrobacterium及びHelicobactorは、ＹｌｏＳに対する有意な相同性を有するタンパク質をコードする１つ以上の遺伝子を含むことを示した。これらの微生物の大部分は、グラム＋菌である。非バクテリア生物（例えば、酵母、Drosophila melanogaster、Mus musculus、及びTreponema pallidum）からの遺伝子に対するより弱い相同性も検出された。興味深いことに、ｙｌｏＳ含有バクテリア種の大部分は、ｔｈｉＬオーソログ遺伝子を含有せずそして反対にｔｈｉＬ含有バクテリア種の大部分はｙｌｏＳオーソログ遺伝子を含まない（表１６）。この後者の群は、大部分グラム陰性属からなっていた。B.subtilisと同様に、Oceanobacillus iheyensisは、両方の遺伝子を含む。これらの結果は、真性細菌は、チアミンのピロリン酸化又はＴＭＰのリン酸化によりＴＰＰを形成する能力に依存して、２つの群に分類することができることを示す。更に、ｙｌｏＳオーソログをのみを含有しそしてｔｈｉＬオーソログを含有しないグラム＋菌の多くは、既知の病原体であり、これは、ｙｌｏＳ遺伝子が抗バクテリア剤を開発するための標的として使用することができることを示唆する。
【０１４６】
【表１６】
【０１４７】
ｙｕａＪ／ｔｘ２６−１
標準条件を使用するＰＢＳ１普遍形質導入実験は、Ｔｘ２６突然変異体が染色体の異なる領域に位置した２つの突然変異を含有することを示した。これらの実験では、染色体のまわりに位置した表現型的にサイレントなＴｎ９１７挿入体（phenotypically silent Tn917 insertion）を含有する標準野生型B.subtilis株（Bacillus Genetic Stock Center）でファージ溶菌液を最初に調製した。これらの溶菌液の２つ（１つはマップ位置２７７°にΩｙｕｆＲ：：Ｔｎ９１７（ＢＧＳＣ＃１Ａ６４２）を有しそして他方はマップ位置１２２．５°にΩｍｏｔＡ：：Ｔｎ９１７（ＢＧＳＣ＃１Ａ６３１）を有する）は、Ｔｘ２６表現型を野生型に復帰させることができた（ＴＰＰ１μMを含有する最小培地でのＬａｃ＋のＬａｃ−への復帰及びピリチアミン０．１μMを使用するピリチアミン耐性のピリチアミン感受性への復帰）。これらの予想されなかった結果は、両突然変異が、Ｔｘ２６により示されたチアミン脱調節表現型のために必要なことを示した。ｔｘ２６−１と名付けられた１つの突然変異は、ΩｙｕｆＲ：：Ｔｎ９１７に対する７０％連鎖を示しそして、ｔｘ２６−２と名付けられた他の突然変異は、ΩｍｏｔＡ：：Ｔｎ９１７に対する５９％連鎖を示した。更に、戻し交雑（back-cross）実験では、Ｔｘ２６のピリチアミン耐性マーカーを、コングレッションＤＮＡ形質転換（congression DNA transformation）により感受性B.subtilis株に移行させることができた。これらのピリチアミン耐性形質転換体もチアミン脱調節されている（ＴＰＰ１μMを含有する最小培地でｌａｃ＋でありそしてピリチアミン０．１μMに耐性である）。
【０１４８】
ｙｕｆＲ／ｍａｅＮ（２７７．１°）、ｙｕｉＧＨ（２８１°）、ｙｕｒＩ（２８５．６°）、ｇｅｒＡＢ及びｙｖａＣ（２９４°）における抗生物質挿入の種々の組み合わせを含有する供与体株を使用する３因子交雑実験を、マイクロアレー分析を使用して同定された（下記参照）チアミン調節された遺伝子（thiamin-regulated gene）、ｙｕａＪに近いｔｘ２６−１突然変異を更にマッピングした。ｔｘ２６−１がｙｕａＪに対して対立遺伝子であるかどうかを決定するために、標準ＰＣＲ法を使用して、ｙｕａＪの欠失突然変異を最初に構築した。これを達成するために、位置３５３で出発するｙｕａＪの３２４ｂｐ長さの内部断片を、プライマーＢｓｙｕａＪ／ｆｏｒ／Ｈｉｎｄ３（配列番号１６）及びＢｓｙｕａＪ／ｒｅｖ／Ｂａｍ（配列番号１７）を使用して、ＰＣＲ増幅しそしてｐＭＵＴＩＮ２のＢａｍＨＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間に挿入して、プラスミドｐＴＨ３１を創生した。予測されたとおり、ΩｙｕａＪ：：ｐＭＵＴＩＮの野生型株（例えば、ＰＹ７９）又はｔｈｉＡ突然変異体への導入は、表現型なしであった。しかしながら、いくつかの遺伝子交雑において、ΩｙｕａＪ：：ｐＭＵＴＩＮ２の破壊は、ｔｘ２６−１に対する非常に高い形質導入連鎖及び形質転換連鎖（１００％）を示した。これらの連鎖結果は、ｔｘ２６−１をｙｕａＪ内に又はｙｕａＪの近くに位置づけた。更に、株ＴＨ１１２（ｔｘ２６−１＋ｔｘ２６−２ΔｔｈｉＬ）へのΩｙｕａＪ：：ｐＭＵＴＩＮの形質導入及び形質転換は、ピリチアミン０．１μMに耐性Ｅｒｍｒコロニーをもたらした。最後に、Ｔｘ２６からのｙｕａＪのＤＮＡ配列分析は、ｔｘ２６−１（突然変異を含むポリヌクレオチド配列のコピーについて配列番号３３参照）がｙｕａＪの対立遺伝子であることを確証した。Ｔｘ２６からの４つの独立したＰＣＲ断片及び野生型親株（ＰＹ７９）からの２つからのＤＮＡ配列の比較は、アミノ酸位置３５のグルタミン残基のオーカー停止コドンへの変化をもたらした単塩基突然変異を検出した（Ｑ３５（ＣＡＡ）＞Ｓｔｏｐ（ＴＡＡ）；野生型ＹｕａＪのアミノ酸配列番号３５に比較して配列番号３４参照）。タンパク質データベースサーチによれば、ｙｕａＪは、チアミンパーミアーゼ又は表面抗原タンパク質遺伝子の調節因子をコードすることが示された。疎水性分析は、ＹｕａＪが６回膜貫通ドメインを含有することを示した。ｔｘ２６−１突然変異の導入は、タンパク質分解を受けているらしいトランケーテッド（truncated）３５アミノ酸タンパク質を産生することが予測される。これらの結果は、上に与えられた遺伝子データと共に、ｙｕａＪの機能の損失は、チアミン脱調節表現型の原因であることを示唆する。更に、マイクロアレーデータ（下記参照）は、ｙｕａＪの発現がＴＰＰにより調節されることを示しそして予測された５’リーダー領域の検査は、コンセンサスＴＨＩボックス調節配列に対する強い相同性を有するＤＮＡ配列を示した。
【０１４９】
ｔｘ２６−２
Ｔｎ９１７挿入を含む株で調製されたＰＢＳ１ファージ溶菌液の収集を使用する普遍形質導入マッピングの研究（２因子交雑）は、ｔｘ２６−２のB.subtilisゲノム上１２２．５°に位置したΩｍｏｔＡ：：Ｔｎ９１７（ＢＧＳＣ＃１Ａ６３１）に対する６０％連鎖を示した。この遺伝子マップ位置は、遺伝子、ｙｋｏＦＥＤＣのクラスターに対応し、その転写レベルは、チアミン脱調節Ｔｘ２６株のマイクロアレー研究において増加することが示された（表１７参照）。更に、これらの遺伝子は、オペロンとして組織されていると思われそしてｙｋｏＦの上流のプロモーター領域にＴＨＩボックス調節エレメントを含有する。ｙｋｏＦの上流の４００ｂｐ領域を含む、このオペロンのＤＮＡ配列決定は、Ａｓｐ180（ＧＡＣ）のＡｓｎ180（ＡＡＣ）への置換をもたらすｙｋｏＤ遺伝子における単塩基突然変異を検出した（野生型ＹｋｏＤのアミノ酸配列番号３８と比較してアミノ酸配列について配列番号３７参照）。タンパク質データベースサーチは、ｙｋｏＤがＨＭＰ輸送ＡＴＰ結合タンパク質をコードすることを示した。このオペロンにおける２つの他の遺伝子、ｙｋｏＥ及びＣは、ＨＭＰ輸送パーミアーゼをコードすることが予測される。これらの結果は、ｔｘ２６−２突然変異がｙｋｏＤの対立遺伝子でありそしてチアミンの細胞輸送に影響を与えることを示した（突然変異を含むポリヌクレオチド配列のコピーについて配列番号３６参照）。
【０１５０】
マイクロアレープロファイリングにより同定されたチアミン調節された遺伝子
マイクロアレープロフィリングを行うために、チアミンピロリン酸を加えられているか又は加えられていない５０mlのＳｐｉｚｉｚｅｎ最小培地を含有する振とうフラスコ培養物中でＰＹ７９を増殖させた。夜通し培養物を、新鮮な培地中にＫｌｅｔｔ＝１０単位となるように希釈しそして指数増殖期（Ｋｌｅｔｔ＝１００単位）となるように増殖させた。培養物の半分からの細胞を遠心により集め、そして全ＤＮＡを直ちに以前に記載された如くして抽出した（Lee et al.(2001)J.Bacteriol.183:7371-7380）。残りの培養物を初期定常期となるように増殖して後ＲＮＡ抽出した。初期定常期は、グルコース消耗の３０分後であると判定され；培地中のグルコース含有率を、標準方法を使用してグルコースアナライザー２（Beckman, Fullerton, CA）により測定した。標識されたｃＤＮＡ標的の調製、マイクロアレーハイブリダイゼーション及び染色方法並びにデータ分析は上記Lee et al.に記載されている。
【０１５１】
既知のチアミン調節されたB.subtilis遺伝子ｔｈｉＡ及びｔｅｎＡＩ−ｔｈｉＯＳＧＦＤに加えて、結果の分析は、ＴＰＰの不存在下に増殖させた細胞におけるいくつかの他の遺伝子の３倍以上の転写レベルも示した。これらの遺伝子は、表１７に列挙されている。これらの結果は、ＴＰＰの存在下に最小培地中で増殖させた野生型株及びチアミン脱調節（Ｔｘ２６）株のマイクロアレーデータの比較により確認さされた。更に、これらの遺伝子のいくつかにおいては、コンセンサスシス作用調節部位（ｔｈｉボックス）は、５’リーダー領域内で可視化することができ、これによりＴＰＰによる調節を確証した。これらの遺伝子の発現を、個々に又は互いに協奏して、又は既知の生合成遺伝子との組み合わせにおいて、増加又は減少させることが、より高いチアミン、ＨＭＰ及び／又はチアゾール産生ももたらすことができると予想されうる。
【０１５２】
【表１７】
ａ転写比は、ＴＰＰ処理なしの最小培地中で指数期に増殖させた野生型細胞のハイブリダイゼーション実験からの平均差値（規格化の後）を、ＴＰＰ処理をした場合の平均差値で割ること（ｗｔ−／ｗｔ＋）により、又はビタミン処理（ｖｉｔ）を伴う最小培地中で指数期となるように増殖させた脱調節突然変異体Ｔｘ２６細胞のハイブリダイゼーション実験からの平均差値を、同じ条件下に増殖させた野生型細胞の平均差値で割ること（ｄｅｇ＋／ｗｔ＋）により計算された。ある遺伝子（太字）では、平均差値は、ハイブリダイゼーション実験当たり二重のプローブセットから得られた。
ｂｎ／ｃ、平均差値の変化なし
【図面の簡単な説明】
【０１５３】
【図１】図１は、クロラムフェニコール耐性遺伝子（Ａ）を有するプラスミドｐＴＨ４３及びテトラサイクリン耐性遺伝子（Ｂ）を有するプラスミドｐＴＨ４７に含まれたＰ26ｔｈｉＡ発現カセットの構造を示す。
【図２】図２は、テトラサイクリン耐性遺伝子を有するプラスミドｐＴＨ４８に含まれたＰ２６ｔｈｉＫＣ発現カセットの構造を示す。
【図３】図３は、B.subtilis ｔｈｉＢオペロンを過剰発現する株ＴＨ４０４を構築するのに使用される二段階方法を示す。第１段階において、ｔｈｉＢプロモーター領域をクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ｃａｔ）カセットで置換することにより、チアミン栄養要求株を構築した。次いで、原栄養性の回復を使用して、ｔｈｉＢオペロンの前にバクテリオファージの強い構成的Ｐ２６プロモーターを組み込んだ株を選択した。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、チアミン産物を産生する方法に関する。更に詳細には、本発明は、チアミン産物を過剰産生しそして培地中に放出することを引起す突然変異を含む微生物を使用してチアミン産物を産生させる方法に関する。該微生物の生物学的に純粋な培養物及び突然変異を含む単離されたポリヌクレオチドも提供される。更に、臨床サンプル中の病原性微生物を検出する方法、抗生物質を同定するためのアッセイ及びこのようなアッセイを使用して同定された抗生物質も提供される。
【０００２】
ビタミンＢ１としても知られているチアミンは、ビタミンの水溶性Ｂ−複合体の構成員でありそして哺乳動物のための栄養要件である。チアミンのピロリン酸形態は、例えば、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ又はトランスケトラーゼにより異化される代謝経路のように、多くの炭水化物及びアミノ酸代謝経路における補酵素としてｉｎ ｖｉｖｏで作用する。他のビタミン生合成経路（例えば、リボフラビン及びビオチン）と違って、チアミンは新規（ｄｅ ｎｏｖｏ）経路の一部ではなくて、実際には再利用（ｓａｌｖａｇｅ）経路の一部であることに留意することは重要である。
【０００３】
チアミン生合成における大抵の酵素による工程及び中間体は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて研究されそしてSalmonella typhimurium及びRhizobiumにおいてより少ない程度に研究されている（概説については、Brown and Williamson(1987)pp.528-532, In F.C.Neidhart et al.(ed.)Escherichia coli and Salmonella typhimurium:Cellular and Molecular Biology, vol.1.American Society for Microbiology, Washington, D.C.;White and Spenser(1996)pp.680-686, In F.C.Neidhardt et al.(ed.)Escherichia coli and Salmonella typhimurium:Cellular and Molecular Biology, vol.2.American Society for Microbiology, Washington, D.C.;Begley et al.(1999)Arch.Microbiol.171:293-300参照）．チアミン経路における工程をコードするＥ．ｃｏｌｉ遺伝子は、染色体上の４つの異なる部位に位置している：即ち、９０”におけるｔｈｉＣＥＦＳＧＨオペロン、４６”におけるｔｈｉＭＤオペロン（それぞれｔｈｉＪ及びｔｈｉＬ遺伝子は９．５”付近においてクラスターされている）及び２５”におけるｔｈｉＫ。これらの遺伝子のすべては、クローニングされ、配列決定され、そしてこれらの遺伝子によりコードされた酵素の多くは、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて過剰産生されそしてそれらの酵素活性が決定された。
【０００４】
ピリミジン部分、４−アミノ−５−ヒドロキシメチル−２−メチルピリミジンリン酸（ＨＭＰ−Ｐ）は、新規なプリン生合成経路における中間体、５−アミノイミダゾールリボチド（ＡＩＲ）から誘導される。グラム陰性菌では、ＡＩＲのＨＭＰ−Ｐへの転換は、ｔｈｉＣ遺伝子産物により触媒される。次いでＨＭＰ−Ｐは、ＴｈｉＤキナーゼによりＨＭＰ−ＰＰにリン酸化され、次いでチアゾール単位とカップリングする。
【０００５】
チアゾール部分、５−（２−ヒドロキシエチル）−４−メチルチアゾールリン酸（ＨＥＴ−Ｐ）は、Ｌ−チロシン及び１−デオキシ−Ｄ−キシルロースリン酸（ＤＸＰ）から誘導され、硫黄原子は、おそらくＬ−システインに由来する。この反応は、少なくとも５つの遺伝子ｔｈｉＦ、ｔｈｉＳ、ｔｈｉＧ、ｔｈｉＨ及びｔｈｉＩの発現を必要とする。
【０００６】
ＨＭＰ−ＰＰとＨＥＴ−Ｐとのカップリングは、ｔｈｉＥによりコードされたチアミンリン酸ピロホスホリラーゼにより触媒されて、チアミン一リン酸（ＴＭＰ）を生じさせる。次いでＴＭＰを、ｔｈｉＬによりコードされたチアミン一リン酸キナーゼの作用によってリン酸化してチアミンピロリン酸（ＴＰＰ）を形成する。チアミンは新規経路（de novo pathway）の一部ではないので、Ｅ．ｃｏｌｉは、外因性チアミンをＴＭＰに転換するために、ｔｈｉＫによりコードされた再利用酵素、チアミンキナーゼを必要とする。
【０００７】
B.subtilisにおけるチアミンの合成は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて見出されたのと同じ酵素及び中間体を利用するようである（例えば、Perkins and Pero(2001)pp.271-286, In Sonenshein et al, (ed.) Bacillus subtilis and its relatives:from genes to cells, American Society for Microbiology, Washington, D.C.参照）。しかしながら、重要な差がある。従来の遺伝子名称は、Ｅ．ｃｏｌｉ及びB.subtilisにおいて異なっている。第一に、Ｅ．ｃｏｌｉからのＨＭＰ生合成酵素ＴｈｉＣ、チアミンリン酸ピロホスフェートＴｈｉＥ及びヒドロキシエチルチアゾールキナーゼＴｈｉＭは、それぞれ、ＴｈｉＡ、ＴｈｉＣ及びＴｈｉＫという名称のそれらの対応物（counterparts）を有する。第二に、知られているB.subtilisチアミン生合成遺伝子は、３つのクラスター：ｔｈｉＡ遺伝子のみからなるｔｈｉＡ遺伝子座、遺伝子ｔｈｉＯＳＦＧＤ１からなるｔｈｉＢ遺伝子座並びにｔｈｉＫ及びｔｈｉＣ遺伝子からなるｔｈｉＣ遺伝子座として、異なって構成される。第三に、チアゾール生合成における少なくとも１つの酵素工程は異なる。B.subtilisゲノムは、ｔｈｉＨオーソログ（thiH ortholog）を含有しない。その代わりに、ｔｈｉＯ（ｔｈｉＢ遺伝子座におけるｙｊｂＲ）は、チアゾール生合成に関与するオキシダーゼ活性をコードすることが予測される。この遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉゲノム内には存在せず、それはＴｈｉＨに対するアミノ酸相同性を示さない。それは、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｅｔｌｉからのｔｈｉ遺伝子と関連した遺伝子（ｔｈｉＯ）の１つに対して相同性である。第四に、Ｅ．ｃｏｌｉ ｔｈｉＤの２つのオーソログ、ｙｊｂＶ（ｔｈｉＤ１）及びｙｗｄＢ（ｔｈｉＤ２）がB.subtilisにおいて見出され、これらは、生合成及び再利用ＨＭＰキナーゼをコードすることができる。最後に、ｔｈｉＣ遺伝子座は、未知の遺伝子、転写調節因子のｌｙｓＲファミリーに対する強い類似性を示すｙｗｂＩを含有する。
【０００８】
本発明は、バチルス科（Bacillaceae）、ラクトバチルス科（Lactobacillaceae）、ストレプトコッカス科（Streptococcaceae）、コリネバクテリア科（Corynebacteriaceae）及びブレビバクテリア科（Brevibacteriaceae）よりなる群から選ばれる微生物であって、チアミン産生を脱調節しそしてチアミン産物を細胞から放出させる突然変異を含有する微生物を提供する。
【０００９】
「チアミン産物」は、チアミン、チアミン一リン酸（ＴＭＰ）及び／又はチアミンピロリン酸（ＴＰＰ）の単独又はいかなる組み合わせも意味する。
【００１０】
本発明に使用される微生物は、該微生物の「生物学的に純粋な培養物」、即ち、微生物が自然において通常会合している成分、細胞及び他の成分から分離されている微生物を意味することは理解される。
【００１１】
下記の材料は、Ａmerican Type Culture Collection(ATCC), P.O.Box 1549, Manassas, VA20108 USAに２００３年５月１２日に、及びDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen(DSMZ), Mascheroder Weg 1B, D-38124 Braunschweig, Germanyに２００４年４月５日に、ブタペスト条約の規約に従って下記するとおりの対応する受託番号：Bacillus subtilis TH95(ATCC PTA-5221)、Bacillus subtilis TH101(ATCC PTA-5222)、Bacillus subtilis TH115(ATCC PTA-5223)、Bacillus subtilis TH116(ATCC PTA-5224)、Bacillus subtilis TH404(DSM 16333)、及びBacillus subtilis TH405(DSM 16334)により、寄託された。
【００１２】
「突然変異」は、本明細書では修飾と相互交換可能に使用されて、例えば、いかなる機構によっても細胞内における又は細胞からのチアミン又はチアミン産物の増加又は減少を可能とする野生型微生物と比べて微生物に表現型の変化を伝える、バクテリアの如き微生物の野生型ＤＮＡ配列の変化を意味する。突然変異は、ナンセンス突然変異（アンバー（ＵＡＧ）、オーカー（Ｔ／ＵＡＡ）及びオパール（Ｔ／ＵＧＡ）を含む、１つ以上のフレームシフト、置換、挿入及び／又は欠失を含む種々の方法において引起すことができる。欠失は、単一のヌクレオチドの欠失、又は全体の遺伝子の欠失を含めて、１つより多くのヌクレオチドの欠失であることができる。
【００１３】
「アミノ酸置換」は、一対一対応のアミノ酸置換を意味する。このような置換は、置換されたアミノ酸が同様な構造的及び／又は化学的性質を有する場合には、事実上保存性である。保存性置換の例は、ロイシンのイソロイシン若しくはバリンによる置換、アスパルギン酸のグルタミン酸による置換、又はトレオニンのセリンによる置換を含む。本発明の範囲内の非保存性置換は、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の芳香族側鎖を有するアミノ酸による置換、例えば、ロイシンのフェニルアラニンによる置換を含む。
【００１４】
アミノ酸「挿入」又は「欠失」は、アミノ酸配列に対する変化又はアミノ酸配列内の変化を意味する。それらは、典型的には、約１〜５アミノ酸の範囲に入る。特定のアミノ酸配列において許容された変化は、ペプチドを合成的に製造すること又は組換えＤＮＡ技術を使用して配列におけるヌクレオチドの挿入、欠失若しくは置換を系統的に行うことにより実験的に決定することができる。
【００１５】
「脱調節する」又は「脱調節」は、酵素／タンパク質のレベル又は活性が変えられるか又は変更されるような、生合成経路における酵素／タンパク質をコードする遺伝子の発現の変化又は変更であって、チアミン産物の産生の増加、又は例えば分泌、流出等による細胞からのチアミン産物の放出をもたらす（それらに限定はされない）変化又は変更を意味する。遺伝子発現の変化又は変更は、遺伝子自体のＤＮＡ配列の変化、又は非タンパク質コードＤＮＡ領域を含む遺伝子の外側の領域のＤＮＡ配列の変化により行うことができる。「脱調節する」又は「脱調節」は、チアミン産物の産生の増加又はチアミン産物の放出の増加が起こるような、細胞の生合成遺伝子の発現を変化させる代謝物の細胞内レベルのいかなる乱れ（perturbation）も意味することができる。
【００１６】
１つの態様では、上記した微生物におけるチアミン産生を脱調節する突然変異は、ΔｔｈｉＬ、ｔｘ１、ｔｘ２６及びそれらの組み合わせからなる群より選ばれる。このような突然変異は、ｔｘ１と組み合わせたΔｔｈｉＬ、ｔｘ２６と組み合わせたΔｔｈｉＬ、ｔｘ２６と組み合わせたｔｘ１、並びにｔｘ１及びｔｘ２６の両方と組み合わせたΔｔｈｉＬを含む。３つの突然変異、ΔｔｈｉＬ、ｔｘ１及びｔｘ２６のすべてを含む微生物が好ましい。
【００１７】
好ましい態様では、微生物は、バチルス属（Bacillus）、ラクトバチルス属（Lactobacillus）、ラクトコッカス属（lactococcus）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）及びブレビバクテリウム属（Brevibacterium）及びよりなる群から選ばれる。更に好ましくは、微生物は、バチルス（Bacillus）属から選ばれ、最も好ましくは、それはB.subtilis細胞である。
【００１８】
１つの態様では、上記した突然変異を含有する微生物はB.subtilis ＴＨ９５である。
【００１９】
１つの態様では、本発明は、ΔｔｈｉＬ、ｔｘ１、ｔｘ２６及びそれらの組み合わせからなる群より選ばれる突然変異を含有し、更にｔｈｉＡ遺伝子産物をコードするポリヌクレオチド配列の少なくとも１つのコピーを含有するＤＮＡカセットを含み、該ポリヌクレオチド配列が強い構成的プロモーターにより作動的に制御されている、上記した微生物を提供する。好ましい微生物は、B.subtilis ＴＨ１１６である。
【００２０】
更なる態様では、本発明は、ΔｔｈｉＬ、ｔｘ１、ｔｘ２６及びそれらの組み合わせからなる群より選ばれる突然変異を含有し、更にｔｈｉＫＣオペロンからの遺伝子産物をコードするポリヌクレオチド配列の少なくとも１つのコピーを含有するＤＮＡカセットを含み、該ポリヌクレオチド配列が強い構成的プロモーターにより作動的に制御されている、上記した微生物を提供する。好ましい微生物は、B.subtilis ＴＨ１１５である。
【００２１】
更なる態様では、本発明は、ΔｔｈｉＬ、ｔｘ１、ｔｘ２６及びそれらの組み合わせからなる群より選ばれる突然変異を含有し、更にｔｅｎＡｌ−ｔｈｉＯＳＧＦＤオペロンの遺伝子産物をコードするポリヌクレオチド配列を含有するＤＮＡカセットを含み、該ポリヌクレオチド配列が強い構成的プロモーターにより作動的に制御されている、上記した微生物を提供する。好ましい微生物は、B.subtilis ＴＨ４０４である。
【００２２】
更なる態様では、本発明は、ΔｔｈｉＬ、ｔｘ１、ｔｘ２６及びそれらの組み合わせからなる群より選ばれる突然変異を含有し、更に（ａ）ｔｅｎＡｌ−ｔｈｉＯＳＧＦＤオペロンの遺伝子産物をコードするポリヌクレオチド配列を含有するＤＮＡカセット及び（ｂ）ｔｈｉＡ遺伝子産物をコードするポリヌクレオチド配列の少なくとも１つのコピーを含有するＤＮＡカセットを含み、該ポリヌクレオチド配列が強い構成的プロモーターにより作動的に制御されている、上記した微生物を提供する。好ましい微生物は、B.subtilis ＴＨ４０５である。
【００２３】
本発明では、「ＤＮＡカセット」は、定められた制限部位でベクターに挿入されうる発現産物をコードするＤＮＡのＤＮＡコード配列又はセグメントを意味する。カセット制限部位は、正しいリーディングフレームにおけるカセットの挿入を確実にするようにデザインされる。一般に、外来ＤＮＡは、ベクターＤＮＡの１つ以上の制限部位で挿入され、次いで伝達性ベクターＤＮＡと共に宿主細胞中にベクターにより運ばれる。ＤＮＡ断片は， 線状化されたベクターＤＮＡの端部に結合したトポイソメラーゼの使用により制限酵素なしにベクターＤＮＡに挿入することもでき；これは、ＰＣＲで調製されたＤＮＡ断片の直接クローニングのために特に有用である。挿入され若しくは付加されたＤＮＡを有するＤＮＡのセグメント又は配列、例えば、発現ベクターは、「ＤＮＡ構築物」と呼ぶこともできる。普通の型のベクターは、「プラスミド」であり、これは、追加の（外来）ＤＮＡを容易に受け入れることができそして適当な宿主細胞に容易に導入されうる通常バクテリア起源の一般に二本鎖ＤＮＡの内蔵分子（self-contained molecule）である。プラスミドはしばしばコードＤＮＡ及びプロモーターＤＮＡも含有しそして外来ＤＮＡを挿入するための適当な１つ以上の制限部位を有する。「コードＤＮＡ」は、特定のタンパク質又は酵素のための特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列である。ＤＮＡカセットは、特定のヌクレオチド配列に加えて、特定のヌクレオチド配列の転写を制御するためにエンハンサー及びプロモーターを含む追加の転写制御エレメントを含有することができる。「プロモーターＤＮＡ」は、コードＤＮＡの発現を開始し、調節し、又はコードＤＮＡの発現を媒介又は制御するＤＮＡ配列である。プロモーターＤＮＡ及びコードＤＮＡは、同じ遺伝子又は異なる遺伝子からのものであることができそして同じもしくは異なる生物からのものであることができる。種々の真核生物宿主及び原核生物宿主における複製及び／又は発現のためのプラスミド及び真菌ベクターを含む多数のベクターが記載されている。非限定的例は、実施例に特定的に記載されたこれら、及びｐＫＫプラスミド（Clonetech）、ｐＵＣプラスミド、ｐＥＴプラスミド（Novagen, Inc., Madison, WI）、ｐＲＳＥＴ若しくはｐＲＥＰプラスミド（Invitrogen, San Diego, CA）、又はｐＭＡＬプラスミド（New England Biolabs, Beverly, MA）、ｐＣＲ２．１Ｔｏｐｏ（Invitrogen, San Diego, CA）、ｐＸＬＴｏｐｏ（Invitrogen, San Diego, CA）、及び本明細書に開示され若しくは引用された方法又は当業者に知られた他の方法を使用する、多くの適切な宿主細胞を含む。組換えクローニングベクターは、クローニング若しくは発現のための１つ以上の複製システム、宿主における選択のための１つ以上のマーカー、例えば、抗生物質耐性及び１つ以上の発現カセットをしばしば含むであろう。
【００２４】
ＤＮＡカセットは、コードＤＮＡの１つ以上のコピー、例えば、配列の１〜５０コピー、好ましくは、１〜２５コピー、例えば、１〜５、１〜１０、１〜１５及び１〜２０コピーを含有することができる。配列は、例えば、タンデムに、即ち、ヘッド−ツー−テイル配置（head-to-tail arrangement）を含む、いかなる順序ででも配置されうる。
【００２５】
「作動的に制御されている」は、コードＤＮＡの転写が、例えば、プロモーター又は転写エンハンサーにより制御されるか又は媒介されることを意味する。このようなプロモーター又は転写エンハンサーは、コードＤＮＡに隣接していることができ、又はコードＤＮＡから上流若しくは下流に位置することができる。
【００２６】
「強い構成的プロモーター」は、ネイティブ宿主細胞に比べて高い頻度でｍＲＮＡｓを開始させるプロモーターである。強い構成的プロモーターは、周知でありそして適切なプロモーターは、宿主細胞において制御されるべき特定の配列に従って選ばれうる。グラム＋微生物からのこのような強い構成的プロモーターの例は、ＳＰ０１−２６、ＳＰ０１−１５、ｖｅｇ、ｐｙｃ（ピルビン酸カルボキシラーゼプロモーター）及びａｍｙＥを含むが、それらに限定はされない。グラム陰性微生物からのプロモーターの例は、ｔａｃ、ｔｅｔ、ｔｒｐ−ｔｅｔ、ｌｐｐ、ｌａｃ、ｌｐｐ−ｌａｃ、ｌａｃＩｑ、Ｔ７、Ｔ５、Ｔ３、ｇａｌ、ｔｒｃ、ａｒａ、ＳＰ６、λ−ＰＲ及びλ−ＰＬを含むが、それらに限定はされない。
【００２７】
他の観点では、本発明は、ΔｔｈｉＬ、ｔｘ１、ｔｘ２６及びそれらの組み合わせからなる群より選ばれる突然変異を含有し、更に（ａ）B.subtilisのプリンオペロンの発現を脱調節する第１突然変異及び（ｂ）５−アミノイミダゾールリボチド（ＡＩＲ）のカルボキシアミノイミダゾールリボチド（ＣＡＩＲ）への転換を阻止する第２突然変異を含む上記した微生物を提供する。好ましい態様では、第１突然変異は、ｐｕｒオペロンのリーダー領域内の突然変異を含み、そして第２突然変異は、ホスホリボシルアミノイミダゾールカルボキシラーゼＩをコードするｐｕｒＥ遺伝子内の突然変異を含む。更に好ましくは、微生物は、B.subtilis ＴＨ１０１である。
【００２８】
「転換を阻止する」という用語は、細胞機械（cellular machinery）がＡＩＲをＣＡＩＲに転換するのを、突然変異が阻止することを意味する。本発明では、ＡＩＲのＣＡＩＲへの転換が完全に阻止されるのが好ましいが、７５％より高い、例えば８５〜９０％より高い転換の阻止も許容されうる。
【００２９】
１つの態様では、本発明は、チアミン産物を産生させる方法又はプロセスである。この方法は、チアミン産物を過剰産生させそしてそれらを培地中に放出させるΔｔｈｉＬ、ｔｘ１、ｔｘ２６及びそれらの組み合わせからなる群より選ばれる突然変異を含有する上記した微生物を、適当な培地中で培養することを含む。次いでチアミン産物を培地から回収する。
【００３０】
「過剰産生する」は、本発明の微生物（１種若しくは複数種）又は本発明の方法で使用される微生物（１種若しくは複数種）が、実施例に記載の方法のいずれかにより測定して、ネイティブ微生物が産生するよりも過剰の１種以上のチアミン産物を産生するように工学的に作られることを意味する。このようなチアミン産物の実質的量が、例えば、分泌若しくは流出により培養培地中に放出される。本明細書で使用した、「実質的量」とは、細胞により産生されたチアミン産物の７５％より多く、好ましくは８５％より多く、例えば、９０〜９５％が培地中に放出されることを意味する。
【００３１】
「チアミン産物」に関して使用される「回収する」とは、チアミン産物を培地から分離し及び／又は回収されたチアミン産物を純粋な若しくは半純粋な形態に単離することを意味する。例えば、発酵培養液からチアミン産物を回収するためのいかなる慣用の方法も本発明において使用することができる。回収は、ＨＰＬＣの使用によるチアミン産物の単離も意味することができる。
【００３２】
１つの観点では、上記した方法は、チアミン前駆体の存在下に該微生物を培養することを更に含む。好ましい前駆体は、４−アミノ−５−ヒドロキシメチル−２−メチルピリミジン（ＨＭＰ）、５−（２−ヒドロキシエチル）−４−メチルチアゾール（ＨＥＴ）及びそれらの組み合わせよりなる群から選ばれる。
【００３３】
上記したチアミン産物を産生するための方法において、該微生物が、上記したB.subtilisのプリンオペロンの発現を脱調節する突然変異を更に含むならば、該微生物を、チアミン前駆体及びプリン供給源の存在下に培養する方法を提供することが、本発明の他の観点である。好ましい態様では、チアミン前駆体はＨＥＴであり、そしてプリン供給源はキサンチンである。
【００３４】
他の観点では、上記した方法は、ＨＥＴ経路の前駆体の存在下に該微生物を培養することを更に含む。「ＨＥＴ経路の前駆体」は、５−（２−ヒドロキシエチル）−４−メチルチアゾール（ＨＥＴ）を産生するのに使用される炭素含有化合物を意味する。このような前駆体は、好ましくは、グリシン、システイン、イソロイシン、トレオニン及びそれらの組み合わせよりなる群から選ばれる。
【００３５】
他の観点では、上記した方法は、ＨＭＰ経路の前駆体又はＨＭＰの誘導体の存在下に該微生物を培養することを更に含む。「ＨＭＰ経路の前駆体」は、４−アミノ−５−ヒドロキシメチル−２−メチルピリミジン（ＨＭＰ）を産生するのに使用される炭素含有化合物を意味する。このような前駆体の非限定的例は、５−アミノイミダゾールリボチド（ＡＩＲ）を含む。「ＨＭＰの誘導体」は、４−アミノ−２−メチル−５−ピリミジンメタンアミン（Grewe Diamibe）と同じ方法で機能するＨＭＰのいかなる化学的に修飾された変異体も意味する。
【００３６】
かくして、本発明は、（ａ）チアミン産生物を培地中に過剰産生させる突然変異を含有する、バチルス科（Bacillaceae）、ラクトバチルス科（Lactobacillaceae）、ストレプトコッカス科（Streptococcaceae）、コリネバクテリア科（Corynebacteriaceae）及びブレビバクテリア科（Brevibacteriaceae）よりなる群から選ばれる微生物を適当な培地中で培養し、そして（ｂ）チアミン産物を回収することを含む、チアミン産物を産生する方法を指向する。
【００３７】
１つの態様では、本発明は、微生物が、ΔｔｈｉＬ、ｔｘ１及びｔｘ２６を含む突然変異を含有する、上記した方法を指向する。
【００３８】
１つの態様では、本発明は、微生物が、ｔｈｉＡ遺伝子産物をコードするポリヌクレオチド配列の少なくとも１つのコピーを含有するＤＮＡカセットを更にも含み、該ポリヌクレオチド配列が強い構成的プロモーターにより作動的に制御されている、上記した方法を指向する。
【００３９】
１つの態様では、本発明は、微生物が、Ｂ．スブチリス（B.subtilis）のプリンオペロンの発現を脱調節する突然変異及び５−アミノイミダゾールリボチド（ＡＩＲ）のカルボキシアミノイミダゾールリボチド（ＣＡＩＲ）への転換を阻止する突然変異を更に含む、上記した方法を指向する。
【００４０】
１つの態様では、本発明は、微生物が、ｔｈｉＫＣオペロンからの遺伝子産物をコードするポリヌクレオチド配列の少なくとも１つのコピーを含有するＤＮＡカセットを更に含み、該ポリヌクレオチド配列が強い構成的プロモーターにより作動的に制御される、上記した方法を指向する。
【００４１】
１つの態様では、本発明は、微生物が、ｔｅｎＡｌ−ｔｈｉＯＳＧＦＤオペロンの遺伝子産生物をコードするポリヌクレオチド配列の少なくとも１つのコピーを含有するＤＮＡカセットを更に含み、該ポリヌクレオチド配列が強い構成的プロモーターにより作動的に制御される、上記した方法を指向する。
【００４２】
１つの態様では、本発明は、微生物が、（ａ）ｔｅｎＡｌ−ｔｈｉＯＳＧＦＤオペロンの遺伝子産生物をコードするポリヌクレオチド配列の少なくとも１つのコピーを含有するＤＮＡカセット及び（ｂ）ｔｈｉＡ遺伝子産物をコードするポリヌクレオチド配列の少なくとも１つのコピーを含有するＤＮＡカセットを更に含み、該ポリヌクレオチド配列が強い構成的プロモーターにより作動的に制御される、上記した方法を指向する。
【００４３】
他の態様では、本発明は、ｔｘ１突然変異を含む単離されたポリヌクレオチド配列である。このような突然変異は、チアミン産生を脱調節しそしてチアミン産物を培養培地中に放出させる突然変異を含有する、チアミンの産生を増加させる組換え微生物、例えば、バチルス属（Bacillaceae）、ラクトバチルス属（Lactobacillaceae）、ストレプトコッカス属（Streptococcaceae）、コリネバクテリア属（Corynebacteriaceae）及びブレビバクテリア属（Brevibacteriaceae）よりなる群から選ばれる微生物の構築のために有用である。アミノ酸残基１１６におけるロイシンのフェニルアラニンへの置換を生じさせる突然変異が好ましい（野生型ＹｌｏＳ配列番号３２に比べて位置１１６におけるＬｅｕのＰｈｅへの置換を有するアミノ酸配列のコピーについて配列番号３１参照）。
【００４４】
本明細書で使用された、「単離された」ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ又は混合ポリマー）又はポリペプチドは、その自然の状態においてそれに伴っている成分から実質的に分離されたことを意味する。ポリヌクレオチドの場合に、「単離された」とは、天然にネイティブ配列に伴う他の細胞成分、例えば、リボソーム、ポリメラーゼ、多くの他のゲノム配列及びタンパク質から分離されたということを意味する。この用語は、その天然に存在する環境から取り出されたポリヌクレオチドを包含し、そして組換えＤＮＡ又はクローニングされたＤＮＡ単離体及び化学的に合成された類似体又は異種システムにより生物学的に合成された類似体を含む。ポリペプチドに関して、「単離された」という用語は、その自然の状態でそれに伴っている成分から分離されたタンパク質又はポリペプチドを意味する。単量体のタンパク質は、サンプルの少なくとも約６０〜７５％が単一のポリペプチド配列を示す場合に単離されている。単離されたタンパク質は、典型的には、タンパク質サンプルの約６０〜９０％重量／重量、更に通常約９５％を含み、好ましくは約９９％以上の純度であろう。タンパク質純度又は等質性は、当該技術分野で周知の多数の手段、例えば、タンパク質サンプルのポリアクリルアミドゲル電気泳動、続いてゲルを染色して単一のポリペプチドバンドを可視化することにより示すことができる。ある目的には、ＨＰＬＣ又は当該技術分野で周知の他の手段を使用して、精製のためのより高い解像力を提供することができる。
【００４５】
１つの態様では、上記した単離されたポリヌクレオチド配列は、配列番号３０であるか又はストリンジェントな条件下に配列番号３０にハイブリダイズするポリヌクレオチド配列であり、そして微生物中に存在するとき、チアミン産物の脱調節を引起す。
【００４６】
本明細書で同定されたポリヌクレオチド配列に「ストリンジェントな条件」下にハイブリダイズしそして同じ機能を保持する、即ち、適切な細胞に導入されるとき、チアミン産生の脱調節を引起す核酸は、本発明の範囲内にある。「ストリンジェントな条件」は、当該技術分野で知られている：例えば、Maniatis et al., Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 2d Edition, 1989, and Short Protocols in Molecular Biology, ed.Ausubel, et al., 参照。これらの両方共参照により本明細書に組み込まれる。ストリンジェントな条件は、配列依存性でありそして異なる環境において異なるであろう。より長い配列は、特により高い温度でハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションへの広汎なガイドは、Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Acid Probes, “Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays”(1993）に見出される。一般に、ストリンジェントな条件は、既定されたイオン強度pHにおいて特定の配列についての熱的融点（thermal melting point）（Ｔｍ）より約５〜１０℃低いように選ばれる。Ｔｍは、標的に対して相補的なプローブの５０％が平衡において標的配列にハイブリダイズする温度（規定されたイオン強度、pH及び核酸濃度下に）である（標的配列はＴｍにおいて過剰に存在するので、平衡においてプローブの５０％が占められる）。ストリンジェントな条件は、塩濃度が、pH７．０〜８．３において約１．０Ｍナトリウムイオンより少なく、典型的には、約０．０１〜１．０Ｍナトリウムイオン濃度（又は他の塩）であり、そして温度は、短いプローブ（例えば１０〜５０ヌクレオチド）では少なくとも約３０℃でありそして長いプローブ（例えば５０ヌクレオチドより長い）では少なくとも約６０℃である、ストリンジェントな条件である。ストリンジェントな条件は、脱安定化剤、例えばホルムアミドの添加によっても達成されうる。この開示の目的には、このようなハイブリダイゼーションのための適当な「ストリンジェントな条件」は、４０％ホルムアミド、１ＭＮａＣｌ、１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の緩衝液中で３７℃でのハイブリダイゼーション及び少なくとも約５０℃、通常約５５℃〜約６０℃の温度で２０分間０．２ＸＳＳＣ中での少なくとも１回の洗浄、又は同等な条件を含む、ストリンジェントな条件である。ポジティブなハイブリダイゼーションは、バックグラウンドのレベルより少なくとも２倍高い。当業者は、別のハイブリダイゼーション及び洗浄条件を使用して同様なストリンジェンシーの条件を与えることができることを容易に認識するであろう。
【００４７】
「核酸配列」というフレーズは、５’から３’端部へと読まれるデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド塩基の一本鎖又は二本鎖ポリマーを意味する。それは、染色体ＤＮＡ、自己複製性プラスミド、ＤＮＡ若しくはＲＮＡの感染性ポリマー及び主として構造的役割を行うＤＮＡ若しくはＲＮＡを含む。特に限定されない限り、この用語は、参照核酸と同様な結合性を有しそして天然に存在するヌクレオチドと同様に代謝される天然のヌクレオチドの既知の類似体を含有する核酸を包含する。特記されない限り、特定の核酸配列は、その保存的に修飾された変異体（例えば、縮重コドン置換）及び相補性配列並びに明白に示された配列も暗黙のうちに包含する。特に、縮重コドン置換は、１つ以上の選ばれた（又はすべての）コドンの第３の位置が混合塩基及び／又はデオキシイノシン残基で置換されている配列を発生させることにより達成されうる（Batzer et al., Nucleic Acid Res.19:5081(1991);Ohtsuka et al, J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985);Cassol et al, 1992;Rossolini et al., Mol.Cell.Probes 8:91-98(1994)。
【００４８】
他の態様では、本発明は、２つの連鎖していない突然変異、即ち、第１の突然変異ｔｘ２６−１及び第２突然変異ｔｘ２６−２を含む単離されたポリヌクレオチド配列であって、チアミン産生性微生物における両突然変異の存在がチアミン産生の脱調節を引起す、ポリヌクレオチド配列である。第１の突然変異、ｔｘ２６−１は、ΔｙｕｆＲ：：Ｔｎ９１７（ＢＧＳＣ＃１Ａ６４２）に対する７０％連鎖（linkage）を示し、そして第２の突然変異、ｔｘ２６−２は、ΩｍｏｔＡ：：Ｔｎ９１７（ＢＧＳＣ＃１Ａ６３１）に対する５９％連鎖を示す。かくして、本発明は、ΔｙｕｆＲ：：Ｔｎ９１７に対する７０％連鎖を有する第１突然変異（ｔｘ２６−１）及びΩｍｏｔＡ：：Ｔｎ９１７に対する５９％連鎖を有する第２突然変異（ｔｘ２６−２）を含む単離されたポリヌクレオチド配列であって、チアミン産生性微生物における該突然変異の両方の存在がチアミン産生の脱調節を引起す、単離されたポリヌクレオチド配列を指向する。
【００４９】
好ましくは、ｔｘ２６−１突然変異は、配列番号３３であるポリヌクレオチド配列又はストリンジェントな条件下に配列番号３３にハイブリダイズするポリヌクレオチド配列によりコードされており、そしてｔｘ２６−２突然変異との組み合わせにおいて微生物中に存在するとき、チアミン産生の脱調節を引起す。
【００５０】
好ましくは、ｔｘ２６−２突然変異は、配列番号３６であるポリヌクレオチド配列又はストリンジェントな条件下に配列番号３６にハイブリダイズするポリヌクレオチド配列によりコードされており、そしてｔｘ２６−１突然変異との組み合わせにおいて微生物中に存在するとき、チアミン産生の脱調節を引起す。
【００５１】
更に、上記した１種以上のポリヌクレオチド、即ち、（ａ）第１突然変異ｔｘ２６−１及び第２突然変異ｔｘ２６−２を含む単離されたポリヌクレオチド配列又は（ｂ）ｔｘ１突然変異を含む単離されたポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡカセット並びにこのようなＤＮＡカセットを含有する微生物が本発明により提供される。
【００５２】
更なる態様は、患者からの臨床サンプル中の病原性微生物を検出する方法である。この方法は、グラム＋（Ｇｒａｍ＋）微生物がサンプル中に存在するかどうかを決定すること、微生物がｙｌｏＳオーソログ（ortholog）を含有するかどうかを決定すること、及び微生物がｔｈｉＬオーソログを含有するかどうかを決定することを含み、グラム＋微生物中のｙｌｏＳオーソログの存在及びｔｈｉＬオーソログの不存在により、微生物が病原性であることを示す。
【００５３】
「臨床サンプル」は、哺乳動物、好ましくは、ヒト又は食用動物である患者から採取したいかなるアッセイ可能な検査試料も意味する。アッセイ可能な検査試料は、血液、尿、糞便、喀痰、組織又は他の生物学的供給源から選ぶことができ、それから、微生物を、もし存在すれば、実施例に開示されたとおり同定しそして特徴付けることができる。
【００５４】
上記した患者からの臨床サンプル中に検出される微生物は、好ましくは、リステリア属（Listeria）、スタフィロコッカス属（Staphylococcus）、クロストリジウム属（Clostridium）、エンテロコッカス属（Enterococcus）、及びストレプトコッカス属（Streptococcus）よりなる群から選ばれ、最も好ましくは、リステリアモノシトゲネス（Listeria monocytogenes）、スタフィロコッカスアウレウス（Staphylococcus aureus）、スタフィロコッカスエピダーミディス（Staphylococcus epidermidis）、クロストリジウムテタニ（Clostridium tetani）、クロストリジウムパーフリンゲンス（Clostridium perfringens）、エンテロコッカス（Enterococcus）属の種（Enterococcu sp）、ストレプトコッカスアガラクティエ（Streptococcus agalactiae）、ストレプトコッカスピロゲネス（Streptococcus pyogenes）及びストレプトコッカスニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）よりなる群から選ばれる。
【００５５】
ＹｌｏＳタンパク質は、殺菌化合物を同定するための価値ある標的である。何故ならば、ｙｌｏＳオーソログのみを含有しそしてｔｈｉＬオーソログを含有しない多くのグラム＋菌は既知の病原体であるからである。従って、本発明は、ＹｌｏＳに結合するか又は、例えばｙｌｏＳ発現若しくはＹｌｏＳ活性に対して刺激作用若しくは抑制作用を有するモジュレーター（modulators）、即ち、候補若しくは試験化合物又は作用物質（例えば、ペプチド、ペプチド擬似体（peptidomimetics）、小分子又は他の薬物）を同定するためのスクリーニングアッセイ（又は方法）も提供する。
【００５６】
１つの態様では、（ａ）ＹｌｏＳタンパク質を含むアッセイ組成物を試験化合物と接触させ、そして（ｂ）試験化合物がＹｌｏＳタンパク質活性を阻害するかどうかを決定することを含み、該化合物がＹｌｏＳタンパク質活性の活性を阻害する能力に基づいて該化合物を抗生物質として同定する、抗生物質を同定するためのアッセイが提供される。好ましくは、このアッセイは、精製されたＹｌｏＳタンパク質、部分的に精製されたＹｌｏＳタンパク質、ＹｌｏＳタンパク質を産生する細胞からの粗細胞抽出物を含み、又はＹｌｏＳタンパク質は、リステリア属（Listeria）、スタフィロコッカス属（Staphylococcus）、クロストリジウム属（Clostridium）、エンテロコッカス属（Enterococcus）、及びストレプトコッカス属（Streptococcus）よりなる群から選ばれる病原性微生物に由来するポリヌクレオチドによりコードされている。このような病原性微生物は、リステリアモノシトゲネス（Listeria monocytogenes）、スタフィロコッカスアウレウス（Staphylococcus aureus）、スタフィロコッカスエピダーミディス（Staphylococcus epidermidis）、クロストリジウムテタニ（Clostridium tetani）、クロストリジウムパーフリンゲンス（Clostridium perfringens）、エンテロコッカス（Enterococcus）属の種（Enterococcu sp）、ストレプトコッカスアガラクティエ（Streptococcus agalactiae）、ストレプトコッカスピロゲネス（Streptococcus pyogenes）及びストレプトコッカスニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）を含むが、それらに限定はされない。
【００５７】
抗生物質を同定するためのアッセイに関する「アッセイ組成物」は、このようなアッセイを行うのに必要な組み合わせにおける成分を意味する。このようなアッセイ組成物は、最小でも、ＹｌｏＳタンパク質若しくはその生物学的に活性な部分及び試験化合物、即ち、試験されるべきペプチド、ペプチド擬似体、小分子若しくは他の薬物を必要とする。
【００５８】
本明細書で使用された、「ＹｌｏＳ活性」は、ＹｌｏＳタンパク質、即ち、ｙｌｏＳ遺伝子によりコードされたタンパク質、のいかなる検出可能な活性又は測定可能な活性も意味する。本発明では、ＹｌｏＳ活性は、下記：（１）ＹｌｏＳ生合成経路における少なくとも１つの工程のモジュレーション、（２）ＹｌｏＳ生合成の促進又は（３）ＹｌｏＳ突然変異体の相補性の少なくとも１つである。抗生物質を同定するためのアッセイに関しては、試験化合物は、もしそれがＹｌｏＳタンパク質翻訳の減少、ｙｌｏＳ転写の減少又はＹｌｏＳ活性の損失を引起すならば、ＹｌｏＳタンパク質活性を阻害する。
【００５９】
本発明の試験化合物は、天然化合物ライブラリー、生物学的ライブラリー、空間的にアドレス可能なパラレル固相若しくは液相ライブラリー（spatially addressable parallel solid phase or solution phase libraries）；デコンボルーション（deconvolution）を必要とする合成ライブラリー法；ワンビーズワン化合物ライブラリー法（one-bead one-compound library method）；及びアフィニティークロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリー法を含む、当該技術分野で知られている化合物ライブラリー法における多数のアプローチのいずれかを使用して得ることができる。生物学的ライブラリーアプローチは、ペプチドライブラリーに限られているが、他のアプローチは、ペプチド、非ペプチドオリゴマー又は化合物の小分子ライブラリーに適用可能である（Lam, K.S.(1997)Anticancer Drug Des.12:145)。
【００６０】
分子ライブラリーの合成方法の例は、当該技術分野で、例えば、De Witt et al.(1993)PNAS90:6909;Erb et al.(1994)PNAS91:11422;Zuckermann et al.(1994)J.med.Chem.37:2678;Cho et al.(1993)Science261:1303;Carrell et al.(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33:2059;Carell et al.(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33:2061；及びGallop et al.(1994)J.Med.Chem.37:1233に見出されうる。化合物のライブラリーは、溶液中に、ビーズ上に、チップ上に、バクテリア中に、胞子中に（U.S.Patent No.5, 223, 409）、プラスミド上に又はファージ上に存在することができる。
【００６１】
１つの態様では、アッセイは、ＹｌｏＳタンパク質若しくはその生物学的に活性な部分 を発現する組換え微生物を試験化合物と接触させ、そして試験化合物のＹｌｏＳ活性をモジュレートする能力を決定する、微生物に基づくアッセイである。試験化合物のＹｌｏＳ活性をモジュレートする能力の決定は、例えば、増殖、細胞内ＹｌｏＳ濃度又は分泌されたＹｌｏＳ濃度を監視することにより達成されうる（ＹｌｏＳを阻害する化合物は試験微生物におけるＹｌｏＳタンパク質の蓄積をもたらすであろう故）。ＹｌｏＳ基質は、ＹｌｏＳ活性のモジュレーションが、例えば、標識された基質の中間体若しくは産物への転換を検出することにより決定されうるように、放射性同位体、酵素標識若しくは他の可溶性若しくは不溶性シグナル発生部分で標識することができる。例えば、ＹｌｏＳ基質は、直接又は間接に、32Ｐ、14Ｃ又は3Ｈにより標識することができ、そして放射性同位体は、シンチレーション計数により放射能発光の直接計数により検出されうる。あるいは、ＹｌｏＳ基質は、可溶性若しくは不溶性シグナル発生部分で直接または間接に標識することができ、そしてシグナルは、比色定量アッセイ、酵素アッセイ又は蛍光測定法アッセイにより検出されうる。化合物のＹｌｏＳ活性をモジュレートする能力の決定は、別法として、レポーター遺伝子（検出可能なマーカー、例えば、ルシフェラーゼをコードする核酸に作動的に連結されたｙｌｏＳ−応答性調節エレメントを含む）の誘導を検出すること又はＣｏＡで調節される細胞応答を検出することにより決定されうる。
【００６２】
本発明の他の態様では、本発明のスクリーニングアッセイは、ＹｌｏＳタンパク質若しくはその生物学的に活性な部分をｉｎ ｖｉｔｒｏで試験化合物と接触させ、そして試験化合物がＹｌｏＳタンパク質若しくはその生物学的に活性な部分に結合する能力又はＹｌｏＳタンパク質若しくはその生物学的に活性な部分の活性をモジュレートする能力を決定する、細胞なしのアッセイ（cell-free assay）である。１つのこのような態様では、アッセイは、ＹｌｏＳタンパク質若しくはその生物学的に活性な部分を既知の基質と接触させてアッセイ混合物を形成し、アッセイ混合物を試験化合物と接触させ、そして試験化合物がその基質に対するＹｌｏＳタンパク質の酵素活性をモジュレートする能力を決定することを含む。１つの態様では、既知の基質はＹｌｏＳタンパク質である。他の態様では、既知の基質はＹｌｏＳ類似体である。フレーズ「ＹｌｏＳ類似体」は、ＹｌｏＳと同じ若しくは同様な方法で機能するＹｌｏＳタンパク質に対して構造が類似した化合物を意味する。例示的類似体は、標識されたＹｌｏＳタンパク質及び／又は他の検出可能なＹｌｏＳタンパク質誘導体を含む。ＹｌｏＳ類似体という用語は、ＹｌｏＳタンパク質に密接に関係した化合物又はＹｌｏＳタンパク質に由来する化合物、例えば、ＹｌｏＳ基質として作用することができる構造的に関連した化合物も含む。
【００６３】
スクリーニングアッセイは、微生物、タンパク質及び／又は反応体を入れるために適当ないかなる容器においても達成することができる。このような容器の例は、マイクロタイタープレート、試験管及びマイクロ遠心管を含む。本発明のアッセイ方法の１つより多くの態様において、ＹｌｏＳタンパク質、ＹｌｏＳ基質、基質類似体又はＹｌｏＳタンパク質を発現する組換え微生物を固定化して、産物、リガンド及び／又は基質の分離を促進させること並びにアッセイの自動化を受け入れることが望ましいことがある。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／ＹｌｏＳ融合タンパク質は、グルタチオンセファロースビーズ（Sigma Chemical Co., St.Louis, MI）又はグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレートに吸着させることができる。マトリックス上にタンパク質を固定化するための他の技術（例えば、ビオチン−コンジュゲーション及びストレプトアビジン固定化又は抗体コンジュゲーション）を、本発明のスクリーニングアッセイに使用することもできる。
【００６４】
本発明は、上記したスクリーニングアッセイにより同定された新規な作用物質も含む。従って、適切な動物モデルにおいて本明細書に記載のとおりに同定された作用物質を更に使用することは、本発明の範囲内にある。例えば、本明細書に記載の同定されたＹｌｏＳモジュレート化剤（YloS modulating agent）（例えば、抗殺菌化合物）を、感染動物モデルにおいて使用して、このような作用物質による処置の効果、毒性又は副作用を決定することができ、及び／又は、病原性微生物により引起され又は誘発された特定の疾患状態を処置することができる。好ましい態様では、該新規作用物質は抗生物質である。
【００６５】
ＹｌｏＳモジュレーターは、更に、本発明ＹｌｏＳタンパク質のいずれか１つの結晶構造に基づいてデザインされうる。特に、多くのグラム＋病原性バクテリア中のＹｌｏＳの発見に少なくとも部分的に基づいて、例えば、本明細書に記載の組換え方法を使用して、有意な量のＹｌｏＳタンパク質を産生させ、該タンパク質を精製しそして結晶化させ、該タンパク質をＸ線結晶学的方法に付し、そして決定された結晶構造に基づいて、モジュレーター（例えば、活性部位モジュレーター、例えば、競合体分子、活性部位阻害剤等）をデザインしそしてデザインされたモジュレーターを本明細書に記載のアッセイのいずれか１つに従って試験することができる。
【００６６】
本発明の最も重要な結果のいくらかは、下記の図に要約される。
下記の実施例は、本発明を説明するだけであって、いずれにせよ本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
実施例１：一般的方法
株
本発明のBacillus subtilis株は、株ＰＹ７９（原栄養株ＳＰβｃ；Cat.#1A747, Bacillus Genetic Stock Center(BGSC), The Ohio State University, Columbus, Ohio43210USA)及び1102(leuA8metB5;Saito et al.(1979)Mol.Gen.Genet.170:117-122）に由来する。ネオマイシン耐性遺伝子（neo）カセット及びテトラサイクリン耐性遺伝子（tet）カセットは、それぞれ、プラスミドｐＢＥＳＴ５０１（Cat.#ECE47, BGSC）及びｐＤＧ１５１４（Cat#ECE100, BGSC)から得られた。
【００６７】
培地
B.subtilisのための標準最小培地（ＭＭ）は、１Ｘ Ｓｐｉｚｉｚｅｎ塩、グルタミン酸ナトリウム０．０４％及びグルコース０．５％を含有する。標準固体完全培地は、Tryptone Blood Agar Broth（TBAB, Difco）である。標準液体完全培地は、Veal-Infusion-Yeast Extract broth（ＶＹ）である。液体試験管培養におけるチアミン産生を試験するために、チアミンを含まない培地を使用する（Difco）。フェドバッチ発酵のために、ＶＦ培地を使用する。これらの培地の組成物は、下記に記載されるか又は以前に記載された標準配合物である（Harwood and Archibald(1990)pp.1-26 and545-552(Appendix 1), In Cutting and Harwood(ed.)Molecular biological methods for Bacillus.John Wiley and Sons, New York）。
【００６８】
ＴＢＡＢ培地：Difco Tryptone Blood Broth ３３ｇ、全体を１Ｌとするのに十分な量の水。オートクレーブ処理する。
【００６９】
ＶＹ培地：Difco Veal Infusion Broth25g 、Difco Yeast Extract ５ｇ、全体を１Ｌとするのに十分な量の水、オートクレーブ処理する。
【００７０】
最小培地（ＭＭ）：１０ＸＳｐｉｚｉｚｅｎ塩１００ml；５０％グルコース１０ml；４０％グルタミン酸ナトリウム１ml、全体を１Ｌとするのに十分な量の水。
【００７１】
１０ＸＳｐｉｚｉｚｅｎ塩：Ｋ2ＨＰＯ4１４０ｇ；（ＮＨ4）2ＳＯ4２０ｇ；ＫＨ2ＰＯ4６０ｇ；クエン酸三ナトリウム・２Ｈ2Ｏ１０ｇ；ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ；全体を１Ｌとするのに十分な量の水。
【００７２】
チアミンアッセイ培地：Difcoチアミンアッセイ培地８５ｇ、全体を１Ｌとするのに十分な量の水。オートクレーブ処理する（Difco Manual(1998)pp.499-501, Difco Laboratories, Maryland, USA）。
【００７３】
微量元素溶液：ＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ１．４ｇ；ＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ０．４ｇ；（ＮＨ4）6Ｍｏ7Ｏ24・４Ｈ2Ｏ０．１５ｇ；ＡｌＣｌ3・６Ｈ2Ｏ０．１ｇ；ＣｕＣｌ2・２Ｈ2Ｏ０．０７５ｇ；全体を２００mlとするのに十分な量の水。ろ過−滅菌する。
【００７４】
Ｆｅ溶液：ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ０．２１ｇ；全体を１０mlとするのに十分な量の水。ろ過−滅菌する。
【００７５】
ＣａＣｌ2溶液：ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ１５．６ｇ；全体を５００mlとするのに十分な量の水。ろ過−滅菌する。
【００７６】
Ｍｇ／Ｚｎ溶液：ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ１００ｇ；ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ０．４ｇ；全体を２００mlとするのに十分な量の水。ろ過−滅菌する。
【００７７】
ＶＦ発酵培地：グルタミン酸ナトリウム０．７５ｇ；ＫＨ2ＰＯ4４．７１ｇ；Ｋ2ＨＰＯ4４．７１ｇ；Ｎａ2ＨＰＯ4・１２Ｈ2Ｏ８．２３ｇ；ＮＨ4Ｃｌ０．２３ｇ；（ＮＨ4）2ＳＯ4１．４１ｇ；酵母エキス（Ｍｅｒｃｋ）１１．７７ｇ；Basildon消泡剤０．２ml；全体を１Ｌとするのに十分な量の水。所定の場所で滅菌する。
【００７８】
●醗酵槽に別々に加えた：２７．３ｇ／Ｌの最終濃度となるようにグルコース・Ｈ2Ｏ
●醗酵槽に別々に加えた（最終濃度）：２ml／Ｌ微量元素溶液、２ml／ＬＣａＣｌ2溶液、２ml／ＬＭｇ／Ｚｎ溶液；２ml／ＬＦｅ溶液。
●給餌の研究のためのバッチの改変は、特に下記の実施例において与えられるであろう。グルコースは必要に応じて供給した。給餌溶液は、下記の組成物に報告されたとおり、ミネラル、規定された栄養素若しくは食品栄養素を含有することができる：
【００７９】
ＮＢ（栄養ブロス）を有するフェドバッチ法のための醗酵給餌溶液：最終濃度（オートクレーブ処理の後）：６６０ｇ／Ｌグルコース・Ｈ2Ｏ；２ｇ／ＬＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ；１４．６mg／ＬＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ；４mg／ＬＺｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ；４５．８ｇ／Ｌ栄養ブロス（Ｄｉｆｃｏ、１ｇ／ml溶液中で別々にオートクレーブ処理する）。
【００８０】
ＨＭＰを伴うフェドバッチ法のための醗酵給餌溶液：最終濃度（オートクレーブ処理の後）：６６０ｇ／Ｌグルコース・Ｈ2Ｏ；２ｇ／ＬＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ；１４．６mg／ＬＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ；４mg／ＬＺｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ。ＨＭＰを０．５４ｇ／Ｌ又は２．７ｇ／Ｌとなるように加える（水／濃ＨＣｌ中にＨＭＰを溶解し、ろ過−滅菌する）。
【００８１】
ＨＥＴを伴うフェドバッチ法のための醗酵給餌溶液：最終濃度（オートクレーブ処理の後）：６６０ｇ／Ｌグルコース・Ｈ2Ｏ；２ｇ／ＬＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ；１４．６mg／ＬＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ；４mg／ＬＺｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ。ＨＥＴを０．５４ｇ／Ｌ又は２．７ｇ／Ｌとなるように加える（水にＨＥＴを溶解し、ろ過−滅菌する）。
【００８２】
ＨＭＰ及びＨＥＴを伴うフェドバッチ法のための醗酵給餌溶液：最終濃度（オートクレーブ処理の後）：６６０ｇ／Ｌグルコース・Ｈ2Ｏ；２ｇ／ＬＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ；１４．６mg／ＬＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ；４mg／ＬＺｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ。ＨＭＰを０．５４ｇ／Ｌ又は２．７ｇ／Ｌとなるように加える（水／濃ＨＣｌにＨＭＰを溶解し、ろ過−滅菌する）。ＨＥＴを０．５４ｇ／Ｌ又は２．７ｇ／Ｌとなるように加える（水にＨＥＴを溶解し、ろ過−滅菌する）。
【００８３】
チアミンアッセイ
生物学的アッセイ：既知の方法（Difco Manual(1998)pp.499-501, Difco Laboratories, Maryland, USA）を使用して、Salmonella typhimuriumに由来するインディケーターを使用して全チアミン化合物をアッセイした。株ＤＭ４５６（ｔｈｉＤ９０６：：ＭｕｄＪ）は、最小培地中のチアミン、ＴＭＰ及びＴＰＰに応答し、これに対して、株ＤＭ１８６４（ｔｈｉＬ９３４：：Ｔｎ１０ｄ）は、ＴＰＰのみに応答する（Webb and Downs(1997)J.Biol.Chem.272;15702-15707;Peterson and Downs(1997)J.Bacteriol.179:4894-4900）。０．０２５６〜１００μg／リットルの範囲の、既知の量のチアミン、ＴＭＰ及びＴＰＰに対するＤＭ４５６の応答は同様であった。更に、ＤＭ４５６は、ＴＰＰに対してＤＭ１８５４よりも感受性が高いことが見出された。B.subtilis培養物をアッセイするために、上澄液をろ過−滅菌した後、希釈液を調製した。細胞のフレンチプレスによる破壊及び１０分間の１０，０００ｇにおける遠心により得られたろ過−滅菌された細胞抽出物の希釈物から、細胞内チアミンレベルを測定した。インディケーター株をチアミンアッセイ培地（ＴＡＭ）中で３７℃で一夜増殖させた。濁度の読み取りを６００nmで行いそして標準溶液の範囲と比較した。
【００８４】
ＨＰＬＣ／チオクロム：先に述べた改変されたチオクロム−ＨＰＬＣアッセイ法（Chie et al.(1999)Biochemistry38:6460-6470）を使用して、個々のチアミン化合物、チアミン、ＴＭＰ及びＴＰＰを測定した。簡単に言えば、培養上澄液又は細胞内抽出物１００μlを４Ｍ酢酸カリウム２００μlに加えた。次いでサンプルを、７ＭＮａＯＨ中の新鮮な３．８ｍＭフェリシアン化カリウム１００μlの添加により酸化する。混合物を激しく混合し、次いで飽和ＫＨ2ＰＯ4中の新鮮な０．０６％Ｈ2Ｏ2１００μlの添加によりクエンチする。サンプルをＨＰＬＣバイアルに移しそしてＳｕｐｅｌｃｏｓｉｌＬＣ−１８−Ｔカラム（１５cm×４．６mm、３μm）（Supelco-Ref.No58970-U）に注入する。４０％０．１ＭＫ2ＨＰＯ4（pH６．６）及び４ｍＭ硫酸水素テトラブチルアンモニウムの存在下に１０％〜３５％メタノール（Ｈ2Ｏ５０％〜２５％）勾配により溶離を行う。３６５nmでの励起の後４４４nmで蛍光を測定する。カラムからの溶離の経時的順序は、チアミン、ＴＭＰ及びＴＰＰである。この方法を利用して醗酵期間中の内部及び外部チアミン産生の両方を監視した。
【００８５】
ＨＰＬＣ／ＤＡＤ：醗酵培養液中のチアミン及び中間体ＨＭＰ及びＨＥＴを直接測定するために、サーモスタット付オートサンプラー及びダイオードアレー検出器（ＤＡＤ）を備えたＡｇｉｌｅｎｔ １１００ＨＰＬＣシステムを使用してＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘＬＵＮＡＣ１８カラムで、サンプルのクロマトグラフィーを行った。カラム寸法は、１５０×４．６mm、粒度５ミクロンである。カラム温度を２０℃で一定に保った。移動相は、水中のペンタンスルホネート０．４ｇ、pH２（Ａ）及びメタノール（Ｂ）の混合物である。２０分における２％Ａ（３分）〜２０％Ａの範囲の勾配溶離を適用する。流速は１ml／分である。検出方法は、２５４nmでの紫外線吸収である。この方法の選択性は、適切な基準化合物、チアミン、ＨＭＰ及びＨＥＴの１０μl標準溶液を、各々１００μg／mlで、注入することにより証明された。標的化合物は、特別なサンプル調製なしに完全に分離された。
【００８６】
分子技術及び遺伝子技術
標準遺伝子及び分子生物学技術は、当該技術分野で公知でありそして以前に記載されている（Maniatis et al.(1982)Molecula cloning:a laboratory manual.Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.;Miller(1972)Experiments in molecular genetics.Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor）。ＤＮＡ形質転換、ＰＢＳ１普遍形質導入、及び他の標準B.subtilis遺伝子技術も当該技術分野で公知であり、そして以前に記載されている（Cutting and Horn(1990)pp.27-74, In Cutting and Harwood(ed.)Molecular biological methods for Bacillus.John Wiley and Sons, New York）。
【００８７】
醗酵
チアミン産生株を、攪拌式タンク醗酵槽で、例えば、６〜１２リットル作用容積を有するBIOFLO4500 New Brunswick ２０リットル容器中で、増殖させた。コンピューター制御及びデータ収集は、NBS Biocommand 32 commercial software(New Brunswick Scientific Co., Inc., Edison, NJ, USA）により行った。
【００８８】
植え込みサイズは、通常、容器中の最初の培地容積の５％であった。水酸化アンモニウム溶液（水中２８％）の自動添加により反応器において常に６．８のpHを保った。醗酵温度は３９℃でありそして６リットル／分の一定の空気流を与えた。消泡剤（Basildon）を必要に応じて手動で加え、そして容器中２psiの一定の圧力を保った。攪拌器の自動カスケーディングにより、１５％溶解酸素（ｐＯ2）の最小濃度を達成した。最小攪拌速度を４００rpmに設定した。
【００８９】
醗酵は、バッチプロセスであることができるが、好ましくは、炭水化物制限フェドバッチ法（carbohydrate-limited, fed-batch processes）である。ゆえに、最初のグルコースの消費（これは通常６〜８時間のプロセス時間の後にそうなった）の後に規定された給餌溶液（上記）を反応器に与えた。その時点で、圧力を８psiに増加させ、そして給餌溶液の添加を７０ｇ／時間の速度で開始し、８時間の間に１０２．５ｇ／時間に線形的に増加させそして１０２．５ｇ／時間で一定に保った。
【００９０】
実施例２：新規にチアミン及びチアミン化合物を産生する突然変異体微生物の培養
この実施例は、チアミン生合成及び脱調節突然変異ΔｔｈｉＬ、ｔｘ１、ｔｘ２６突然変異及びそれらの組み合わせを単離して、チアミン化合物を過剰産生するB.subtilis株を産生することを説明する。
【００９１】
３０mlの最小培地振とうフラスコ培養物中で３７℃で２４時間増殖させた細胞から、野生型B.subtilis及び工学的に作られたB.subtilisからのチアミン産物の細胞内及び細胞外レベルを決定した。ポジティブコントロールとして、チアミン脱調節されたＥ．ｃｏｌｉＰＴ−Ｒ１突然変異体も試験した。バイオアッセイの結果は、チアミン産物は、音波処理された細胞の抽出物からは容易に検出されたが、培養培地からは殆ど又は全然検出されなかったことを示した（表１）。対数期又は定常期野生型B.subtilisにおけるチアミン産物の細胞内レベルは、約１００〜２００μg／Ｌであることが計算された。Ｅ．ｃｏｌｉについて報告されたとおり、B.subtilisにおける細胞内チアミン産物は、ＴＰＰの形態にあるらしい。チアミン産物の細胞内レベルは、チアミン脱調節されたＥ．ｃｏｌｉＰＴ−Ｒ１株において有意により高く、定常期細胞で約１．６mg／Ｌに達した。
【００９２】
【表１】
ａ最小培地（３０ml）中の３７℃で２４時間増殖後のチアミン濃度
ｂ３７℃で２４時間増殖後最小培地培養物３０mlから集められた音波処理した細胞の１ml上澄液のチアミン濃度
ｃすべての細胞内チアミン産物は培養培地に分泌されると仮定する。計算：（細胞内チアミン濃度（μg／Ｌ）×０．００１Ｌ）×１０００ml／Ｌ／３０ml
【００９３】
Ｅ．ｃｏｌｉ ＴｈｉＬタンパク質配列をＳｕｂｔｉｌｉｓｔのタンパク質データベースと比較すると、１つのみのタンパク質配列に対する有意な類似性が検出された：ＹｄｉＡ（Ｐ（Ｎ）＝８．１ｅ−15）。このタンパク質をコードする遺伝子、ｙｄｉＡは、長さが９７５塩基対でありそしてB.subtilis染色体上で５５°に位置した５つの遺伝子オペロンの第１遺伝子である。挿入部位から下流の遺伝子の転写を制御するＩＰＴＧ−誘導性Ｐｓｐａｃプロモーターを含有する、非極性挿入ベクターｐＭＵＴＩＮ２及び４を使用して、ｔｈｉＬ破壊突然変異体を発生させた（Vagner et al.(1998)Microbiology 144:3097-3104）。ヌクレオチド２６４と６１２との間のＹｄｉＡ配列に対応する、２つのオリゴヌクレオチドプライマー、ＢｓｕｙｄｉＡ１（配列番号７）及びＢｓｕｙｄｉＡ２（配列番号８）を使用して、標準ＰＣＲ法により３４８ｂｐＤＮＡ断片を調製した。この断片を、ｐＭＵＴＩＮ２ベクターのＨｉｎｄＩＩＩ部位とＢａｍＨＩ部位との間にクローニングし、Ｅ．ｃｏｌｉプラスミドｐＴＨ１を発生させた。次いで、このプラスミドを、５μg／mlのエリスロマイシンに耐性のコロニーを選択するＤＮＡ形質転換により、B.subtilisＰＹ７９のｙｄｉＡ（ｔｈｉＬ）遺伝子に挿入した。１つのＥｒｍｒコロニーを回収しそしてＴＨ５と名付けた（ΩｔｈｉＬ：：ｐＭＵＴＩＮ）。ＩＰＴＧの存在下又は不存在下にエリスロマイシンを有するＴＢＡＢ培地上でのバクテリア増殖を比較することにより、ｙｄｉＡの下流の遺伝子の１つ以上の発現が細胞増殖のために必要であることが決定された。ｙｄｉＡ（ｔｈｉＬ）のヌクレオチド２６７と２７２との間に内因性ロー非依存性転写終結部位（endogeneous rho-independent transcription termination site）を含有する（ｃａｔ2）若しくは欠いている（ｃａｔ4）クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼカセットを挿入することにより、追加のｙｄｉＡ（ｔｈｉＬ）破壊を発生させた場合にも、同様な結果が得られた。ＰＣＲプライマー対ｃａｔ＃１（配列番号９）−ｃａｔ＃２（配列番号１０）及びｃａｔ＃１−ｃａｔ＃４（配列番号１１）を使用して、それぞれ、ＤＮＡカセットｃａｔ2又はｃａｔ4遺伝子を発生させ、これらを、プライマーｙｄｉＡ／ａｔｐ／ｆｏｒ／ｂａｍ（配列番号１２）−ｙｄｉＡ／ａｔｐ／ｒｅｖ／ｓｍａ（配列番号１３）及びｙｄｉＡ／ｃｔｐ／ｆｏｒ／ｓｍａ／２（配列番号１４）−ｙｄｉＡ／ｃｔｐ／ｒｅｖ／ｅｃｏｒＩ／２（配列番号１５）を使用して発生させたｙｄｉＡ（ｔｈｉＬ）ＰＣＲ ＤＮＡ断片にライゲーションさせた。次いで、５μg／mlのクロラムフェニコールに耐性のコロニーを選択するＤＮＡ形質転換により、株ＰＹ７９の染色体ｙｄｉＡ（ｔｈｉＬ）遺伝子に、ΔｔｈｉＬ：：ｃａｔカセットを直接挿入した。ΔｔｈｉＬ：：ｃａｔ4（ＴＨ１２）を含有するＣｍｒコロニーのみが、ＴＢＡＢ培地上で正常に増殖し；ΔｔｈｉＬ：：ｃａｔ2を含有するＣｍｒコロニーは、小さな、ピンポイントコロニーとして増殖した。それぞれ、ΔｔｈｉＬ：：ｃａｔ2及びΔｙｄｉＡ：：ｃａｔ4を含有する株ＴＨ１１及びＴＨ１２を取っておいた。驚くべきことに、株ＴＨ５及びＴＨ１２は、チアミン又はＴＰＰ栄養要求株ではなかった。その代わりに、両株はチアミン栄養緩徐株（ｂｒａｄｙｔｒｏｐｈ）であった、即ち、最小培地で、ＴＨ５及びＴＨ１２のコロニーサイズは、ＰＹ７９コントロールコロニーの直径の半分であった。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ及びＥ．ｃｏｌｉのｔｈｉＬなし突然変異体は厳密なチアミン栄養要求株であるので、B.subtilisは、ＴＭＰをＴＰＰに転換することができる第２のキナーゼ活性又は別の経路を含むと思われた。興味深いことに、ｙｄｉＡ（ｔｈｉＬ）突然変異体は、最小培地で３７℃で１日のインキュベーションの後B.subtilis ｔｈｉＦ又はｔｈｉＧ突然変異体（それぞれ、ＴＨ３及びＴＨ４と呼ばれる株）と栄養共生することができたが、これに対して、ＰＹ７９は３日以上を要した。これは、ｙｄｉＡ突然変異体がチアミン生合成について部分的に脱調節されそして野生型株よりもより拡散性の高いチアミン産物を放出することを示唆した。バイオアッセイの結果（表２）は、全細胞内チアミン産生（チアミン＋ＴＭＰ＋ＴＰＰ）レベルは、ＰＹ７９よりもＴＨ５及びＴＨ１２において僅かにより高い（２〜３倍）ことを示した。ＰＹ７９に対して僅かにより高い全チアミンレベルは、培養培地においても検出されたが、細胞内レベルよりはるかに低かった。興味深いことに、チアミン産生の増加は、チアミン類似体ピリチアミンに対する耐性を与えるのに十分ではなかった。
【００９４】
【表２】
ａ最小培地（３０ml）中の３７℃で２４時間増殖後のチアミン濃度
ｂ３７℃で２４時間増殖後最小培地培養物３０mlから集められた音波処理した細胞の１ml上澄液のチアミン濃度
【００９５】
B.subtilisのチアミン脱調節された突然変異体を単離するためのストラテジーは、ｔｈｉＡ−ｌａｃＺ融合体を含有するバクテリアを突然変異誘発させ、次いでＸＧＡＬ含有培地で、ＴＰＰ又はチアミンの存在下にＬａｃ＋（即ち、青いコロニー）であるコロニーをスクリーニングすることであった。ｔｈｉＡの５’プロモーター領域の４１７ｂｐを含有する７３２ｂｐ長さのＤＮＡ断片を、標準方法を使用するＰＣＲにより調製し、そしてｐＤＧ１７２８ベクターのプロモーターなしのｌａｃＺ遺伝子の前方に一方向にクローニングして（Guerout-Fleury et al.(1996)Gene180:57-61）、プラスミドｐＴＨ１２を生じさせた。このベクターは、B.subtilisの非必須ａｍｙＥ遺伝子座（non-essential amyE locus）に異所性転写ｌａｃＺ融合体（ectopic transcriptional lacZ fusions）を導入するようにデザインされている。プラスミドｐＴＨ１２を制限酵素消化により線状化しそしてB.subtilis ＰＹ７９に形質転換して、１００μg／mlスペクチノマイシンに耐性のコロニーを選択した。ＴＨ２１（ΩａｍｙＥ：：ｔｈｉＡ−ｌａｃＺ）と名付けられた１つの得られるコロニーは、異なる栄養増殖条件下に試験されるとき、明瞭なチアミン調節を示した。チアミン１μMを含有する振とうフラスコ培養物中で初期対数期（ＯＤ６００＝０．８〜０．９）へと増殖させると、ｔｈｉＡ−ｌａｃＺの発現は、チアミンなしの最小培地中で増殖させた細胞に比べて約８０倍抑制された。ＨＭＰ（１μM）もまた融合体の発現を抑制したが、より少ない程度（５〜７倍）であった。チアゾール及びアデノシン（各々１μM）は抑制活性を示した。経時実験では、ｔｈｉＡ−ｌａｃＺの発現は、細胞が初期対数期（ＯＤ６００＝０．８〜０．９）にあるとき最も高かった（２００ミラー単位（Miller Units））。発現は、細胞が定常期（ＯＤ６００＞１）に入ると、徐々に減少した（５０ミラー単位に）。
【００９６】
ｔｈｉＡ−ｌａｃＺ融合体の調節は、いくつかの突然変異体においても評価された。胞子形成欠如突然変異体株（ΔｓｐｏＯＡ：：ｅｒｍ）において、融合体の発現は調節されたが、チアミンによる抑制のレベルは、野生型におけるよりも低かった。ｙｄｉＡ／ｔｈｉＬの欠失を含む株（ＴＨ２２（ΔｔｈｉＬ：：ｃａｔ4、ΩａｍｙＥ：：ｔｈｉＡ−ｌａｃＺ））において、融合体は部分的に脱調節された。即ち、ｌａｃＺ活性は、抑制増殖条件及び脱抑制増殖の両条件下に２〜３倍高かった。
【００９７】
これらの結果に基づいて、ｔｈｉＡ−ｌａｃＺレポーター株ＴＨ２２（ΔｔｈｉＬ：：ｃａｔ4）を使用して、抑制増殖条件下に、脱調節された突然変異体をスクリーニングした。２つの方法を使用して、このような突然変異体を単離した。第１の方法では、チアミン１μM及びＸＧＡＬ２５μg／mlを含有するＭＭ寒天プレートを調製した。対数増殖期ＴＨ２２細胞の均一な希釈を行った後、３滴のエチルメタンスルホネート（ＥＭＳ、ｄ＝１．１７ｇ／ml溶液）を含有するペーパーディスクを、プレートの中心に置いた。Ｌａｃ＋コロニーは、３７℃で７日のインキュベーションの期間にわたり現れた。脱調節された突然変異体Ｔｘ１−Ｔｘ１０を回収した。第２の方法では、ＥＭＳで突然変異誘発させた細胞のバンクを調製しそしてスクリーニングした。従って、対数段階ＴＨ−２２細胞をＥＭＳ９．４ｍＭで９０分間処理し、そしてアリクォートを−９０℃で１０％グリセロール中に凍結させた。凍結されたストックからの細胞をＶＹ培地中に希釈し、室温で３０分間インキュベーションし、次いでチアミン１μM及びＸＧＡＬ２５μg／mlを含有するＭＭ培地上でプレートした。Ｌａｃ＋コロニーのスクリーニングにより、突然変異体Ｔｘ１１〜Ｔｘ２６を得た。これらの突然変異体は、チアミン抑制条件及びＴＰＰ抑制条件下に青色の出現の強度及びタイミングに基づき（表３）そして追加の表現型に基づいて３つのクラスに分類することができる。１つの突然変異体（Ｔｘ１）は、強いチアミン栄養緩徐株であることが見出され、これは、この突然変異体が、（１）残留ＴＭＰキナーゼ活性又は（２）ＴＭＰを介する第２のＴＭＰ−ＴＰＰ経路に関与した遺伝子を不活性化したことを示唆する。他の突然変異体、Ｔｘ２６は、ピリチアミン１０μMに耐性であった。チアミン産物の合成に関して、突然変異体Ｔｘ７（クラス２）は、親株、ＴＨ２２（ΔｔｈｉＬ：：ｃａｔ４、ΩａｍｙＥ：：ｔｈｉＡ−ｌａｃＺ）に比べて２〜３倍多くの全チアミン産物を分泌したが、チアミン産生物の細胞内レベルは同様であった（表４）。突然変異体Ｔｘ２６（クラス１）は、ＴＨ２２コントロール株よりも１０〜１５倍多くの全細胞外チアミン産生物を培養培地中に分泌した（表４）。分泌されたチアミン産生物の５０％を僅かに超えたものがＴＰＰの形態にあった。Ｔｘ１及びＴｘ２３により示されたクラス３突然変異体は、チアミン又はＴＰＰの存在下に異なるＬａｃ発現に基づいてチアミン−ＴＭＰ−ＴＰＰ経路に影響を与えると思われる。
【００９８】
【表３】
【００９９】
【表４】
ａ３７℃で２４時間増殖後の最小培地（３０ml）中のチアミン濃度
ｂ３７℃で２４時間増殖後の最小培地培養物３０mlから集められた音波処理した細胞の１ml上澄液のチアミン濃度
【０１００】
外因性前駆体給餌の研究において、ＨＭＰ及びＨＥＴの全チアミン産物への転換も、Ｔｘ７とＴｘ２６とでは異なっていた（表５）。各株を、指示された量のＨＥＴ及びＨＭＴを含有する最小培地培養物中で３７℃で１８時間増殖させた。培養培地及び細胞抽出物をチアミン産物について分析した。S.typhimuriumインディケーターＤＭ４５６（ΩｔｈｉＤ９０６：：ＭｕｄＪ）及びＤＭ１８５６（ΩｔｈｉＬ９３４：：Ｔｎ１０）それぞれを使用する生物学的アッセイにより（チアミン＋ＴＭＰ＋ＴＰＰ）及び（ＴＰＰ）を測定した。チアミン産物は培地中に検出されなかった。Ｔｘ７では、チアミン産物の大部分は、主としてＴＰＰの形態で細胞内に見出された。対照的に、Ｔｘ２６における全チアミン産物の９０％は、主としてチアミン＋ＴＭＰとして培養培地中に見出された。細胞外蓄積は、ＨＭＰ＋ＨＥＴを加えることなく増殖させたＴｘ２６よりも約４０倍高かった。
【０１０１】
【表５】
【０１０２】
突然変異ｔｘ２６、ｔｈｉＬ及びｔｘ１の組み合わせを含有するB.subtilis株を構築した。この株は、組み込まれそして増幅された工学的に作られたチアミン生合成遺伝子のための宿主として役立つことができた。第１段階として、Ｔｘ２６における突然変異を、ＤＮＡ形質転換及びピリチアミン１０μMに耐性のコロニーを選択することにより、ＴＨ１２（ΔｔｈｉＬ：：ｃａｔ4）に移行させた。チアミンの存在下にやはりＬａｃ＋である１つのＰｙｒｒコロニーを回収しそしてＴＨ４８と命名した。各株を、微量栄養素及びＤｉｆｃｏ栄養ブロス（ＮＢ）２．５％を補充した最小培地中で３７℃で１８時間増殖させた。上澄液を、チアミン＋ＴＭＰ＋ＴＰＰ）についてインディケーターＳａｌｍｏｎｅｌｌａＤＭ４５６（ｔｈｉＤ９０６：：ＭｕｄＪ）及び（ＴＰＰ）についてＳａｌｍｏｎｅｌｌａＤＭ１８５６（ｔｈｉＬ９３４：：Ｔｎ１０）を使用するバイオアッセイにより、チアミン産物について分析した。最小培地振とうフラスコ培養物中で増殖させると、ＴＨ４８は、Ｔｘ２６親に比べて同様なレベルのチアミン産物を産生した（表６）。次いで、ｃａｔで中断されたｔｈｉＬ遺伝子（cat-interrupted thiL gene）をフレーム内欠失（in-frame deletion）により置換した。標準ＰＣＲ法を使用して、ｔｈｉＬのフレーム内欠失（アミノ酸残基Ｇｌｙ７９及びＧｌｙ２０２を除去する）を最初に構築しそしてＥ．ｃｏｌｉプラスミドベクターｐＥｐＵＣΔ１のＢａｍＨＩ部位とＥｃｏＲ１部位との間に挿入して、ｐＴＨ３０を創生した。ｐＥｐＵＣΔ１（S.Seror, Universite Paris-Sud, 91405 Orsay, France）は、選択可能なエリスロマイシン耐性（erm）カセット及び５１℃を超えると機能しない温度感受性複製起点を含む。ＴＨ４８細胞をｐＴＨ３０により５１℃で形質転換して、エリスロマイシン耐性を選択した。Ｃｍｒでもある１つのＥｒｍｒコロニーを回収し、そして抗生物質選択の不存在下に２８℃で夜通し７２時間 増殖させた。次いでバクテリアを、ＴＢＡＢ寒天プレート上にプレートし、そしてプレートを３７℃で一夜インキュベーションした。コロニーの約２５％は、エリスロマイシン及びクロラムフェニコール抗生物質の両方に感受性であることが見出された。いくつかのＥｒｍＳＣｍＳコロニーからの染色体ＤＮＡのＰＣＲ分析により、フレーム内ΔｔｈｉＬ突然変異の存在及びΔｔｈｉＬ：：ｃａｔ4突然変異の不存在が確認された。これにより株ＴＨ８３を得た。次いで、サイレントＴｎ９１７挿入体に対する連鎖（linkage）、ΩｙｌｏＡ：：Ｔｎ９１７（ｔｘ１に対する６０％連鎖；Bacillus Genetic Stock Centerの株１Ａ６３３，ＣＵ４１５３又はΩｚｄｉ−８２：：Ｔｎ９１７とも呼ばれる）を使用する標準方法によるＰＢＳ１形質導入によるＴＨ８３への形質導入により、ｔｘ１突然変異を導入した。得られる株はＴＨ９５と呼ばれた。
【０１０３】
【表６】
【０１０４】
２０リットルの実験室規模の醗酵槽を使用する標準フェドバッチ醗酵において、ＮＢはＴＨ９５においてチアミン産生を高めることが見出された。結果は、細胞外チアミン産物レベルは、ＮＢなしの給餌に比べて４％ＮＢを含有する給餌培地を使用すると約２〜３倍高かった（表７）。産生は、３０〜４８時間の増殖の間に６〜７mg／リットルの最大レベルに達した。更に重要には、チオクロム／ＨＰＬＣアッセイにより判定して、細胞外チアミン産物の少なくとも６５％はチアミンの形態にあったが、これに対して給餌物中にＮＢのない醗酵では、産物の大部分はＴＭＰ及びＴＰＰであった。同時に、播種（seed）内のＮＢの量を増加させ（１０％）そして給餌物からＮＢを除去すると、チアミン関連産物の産生を２４時間培養時間に遅延させた。更に、分泌されたチアミン産物は減少しそして主としてＴＭＰの形態にあった。バッチへのＮＢ（４％）の添加も、全チアミン産生の減少及び分泌プロフィールの変化をもたらし、その場合すべてのチアミン形態（ＴＨＩ、ＴＭＰ及びＴＰＰ）が殆ど等モル量であった。
【０１０５】
【表７】
【０１０６】
実施例３： ＨＭＰ及びＨＥＴを使用するチアミン化合物の産生
この実施例は、チアミン前駆体ＨＭＰ及びＨＥＴの存在下にチアミン脱調節株を増殖させてチアミン化合物を産生させる方法を記載する。
チアミン前駆体共給餌（co-feed）を伴う株ＴＨ９５（ｔｘ２６ｔｘ１ΔｔｈｉＬｙｌｏＡ：：Ｔｎ９１７）の醗酵を、フェドバッチ条件下に６リットル及び１リットル規模で行った。ヒドロキシエチルチアゾール（ＨＥＴ）０．５４ｇ／リットル及びヒドロキシメチルピリミジン（ＨＭＰ）０．５４ｇ／リットルを含有する給餌溶液は、培養培地中のチアミンの有意な蓄積をもたらした。チアミン力価が４８時間後に１２０mg／Ｌ（表８）に達し、これは、いずれかの前駆体の濃度に基づく２５％のモル収率を表す。逆に、ＴＭＰ及びＴＰＰ力価は非常に低く（それぞれ、４及び２mg／リットル）、チアミン関連分泌産物の全量の３％未満に相当する。ＨＭＰ又はＨＥＴのみの供給は、すべてのチアミン産生物の非常に低い力価をもたらした。ＨＭＰ及びＨＥＴの濃度を各々又は組み合わせにおいて２．７ｇ／リットルに増加させても、チアミン産生レベルの有意な増加をもたらさなかった。ＨＥＴ０．５４ｇ／リットル及びＨＭＰ０．５４ｇ／リットルの存在下にＴＨ９５の醗酵を延長すると、チアミン力価を優先的に増加させた。７０時間後に、チアミン（ＴＨＩ）力価は、２５０mg／リットルに達し、これに対して、ＴＭＰ及びＴＰＰレベル（７及び２mg／リットル）は４８時間時点のレベルと同様であった（表９）。
【０１０７】
【表８】
【０１０８】
【表９】
【０１０９】
実施例４：ＴｈｉＡ合成を増加させたチアミン産生株
この実施例は、B.subtilis ｔｈｉＡ遺伝子を過剰発現してチアミン産生物の過剰産生及び分泌をもたらすのに使用することができるB.subtilis ｔｈｉＡ遺伝子を含有するＤＮＡカセットの構築を説明する。
【０１１０】
発現を増加させるために、ネイティブプロモーター領域が、B.subtilisバクテリオファージＳＰＯ１に由来する強い構成的ＳＰＯ１−２６プロモーター（Ｐ26と命名された）により置換されている、増幅可能な工学的に作られたｔｈｉＡカセットを構築した。最初に、全体のｔｈｉＡ遺伝子を含有する１７７０ｂｐ長さのＤＮＡ断片を、標準方法及び合成オリゴＤＮＡプライマーｔｈｉＡ／ｆｏｒ／ｐＸＩ２２／ＮｄｅＩ（配列番号１）及びｔｈｉＡ／ｒｅｖ／ｐＸＩ２２／Ｂａｍ（配列番号２）を使用するＰＣＲにより増幅した。ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩによる消化の後に、ＰＣＲ産生物を、ｐＸＩ２２ｍｏｄのＮｄｅＩ部位とＢａｍＨＩ部位との間に挿入し、標準的な方法を用いてコンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞に形質転換した。ｐＸＩ２２ｍｏｄは、Ｐ26プロモーター、合成Ｂａｃｉｌｌｕｓ ＲＢＳ、ｃｒｙＴターミネーター、選択可能なアンピシリン（ｂｌａ）耐性遺伝子及びクロラムフェニコール（ｃａｔ）耐性遺伝子及びＲＢＳとｃｒｙＴターミネーターとの間に位置したＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩクローニング部位（ＮｄｅＩ部位はＡＴＧ開始部位を発生させる）を含有する７．２ｋｂＥ．ｃｏｌｉプラスミドである。Ｐ26プロモーターは、プロモーターの−３５及び−１０コンセンサス領域間にＥ．ｃｏｌｉＣｏｌＥ１レプリコン及びｂｌａ遺伝子を配置することにより不活性化された。更に、ｐＸＩ２２内のＮｄｅＩ部位を標準方法により修飾して、レプリコン領域内に位置した望まれないＮｄｅＩ制限部位を除去した。これによりプラスミドｐＴＨ４３を得た（図１）。他のｔｈｉＡ発現カセットも、ｃａｔカセットを選択可能なテトラサイクリン耐性（ｔｅｔ）遺伝子で置換することによって調製された。これを行うために、プラスミドｐＤＧ１５１４（BGSC, Cat#ECE100）遺伝子からのｔｅｔ遺伝子を含有する２０４２ｂｐＤＮＡ断片を、標準方法及び合成オリゴＤＮＡプライマーｔｅｔ／ｆｏｒ／ＰｍｅＩ（配列番号３）及びｔｅｔ／ｒｅｖ／ＮｏｔＩ（配列番号４）を使用するＰＣＲにより増幅した。次いで、この断片をｐＴＨ４３のＰｍｅＩ部位とＮｏｔＩ部位との間にクローニングして、ｐＴＨ４７を得た（図１）。
【０１１１】
次の仕事は、Ｐ26ｔｈｉＡ−ｃａｔカセットをチアミン脱調節株に組み込むことであった。最初に、プラスミドｐＴＨ４３をＢｓａＩにより消化しそして３３５２ｂｐ長さの断片を標準方法を使用してアガロースゲルから精製した。精製した断片をそれ自体に高いＤＮＡ濃度でライゲーションしそして標準方法を使用してＴＨ９５コンピテント細胞に形質転換した。形質転換体を、クロラムフェニコール５μg／mlを含有するＴＢＡＢ培地上で選択した。ＴＨ１１６と名付けられた１つのＣｍｒコロニーを更に研究するために取っておいた。引き続いてより高いレベルのクロラムフェニコールに耐性のコロニーを得ることにより、ｔｈｉＡの発現を増加させた。特に、クロラムフェニコール６０μg／mlに耐性のＴＨ１１６の株を得ることができる。クロラムフェニコール６０μg／mlに耐性のＴＨ１１６株の粗細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、クロラムフェニコール５μg／mlの みに耐性のＴＨ１１６株より有意に高いレベルのＴｈｉＡタンパク質を示した。
【０１１２】
工学的に作られた株ＴＨ１１６によるチアミン産生を、ＨＥＴ共給餌（０．５４ｇ／リットル、重量／重量）を伴う標準フェドバッチ条件を使用して２０リットルの実験室規模の醗酵槽で試験した。クロラムフェニコール６０μg／mlに耐性の株ＴＨ１１６は、１８〜２１mg／リットルのチアミンを産生し（表１０）、これはＴＨ９５醗酵に比較してチアミン産生において３倍の増加である（表８）。しかしながら、チアミン産生は、給餌の研究において観察されたよりも有意に低かった（実施例３参照）。この結果は、ＨＭＰの形成は速度限定性であることを示し、これは、不十分な量の追加の酵素活性又は低いレベルのＡＩＲプールにより引起されうることを示す。
【０１１３】
【表１０】
【０１１４】
実施例５：ＡＩＲ形成を増加させた微生物を使用してチアミン化合物を産生する方法
この実施例は、プリン経路を改変してアミノイミダゾールリボチド（ＡＩＲ）形成を増加させることにより、チアミン産生を増加させる実験を説明する。これは、同時に、プリンオペロン（ｐｕｒＯ）のリーダー領域内の突然変異を使用してB.subtilisプリンオペロンの発現を脱調節しそしてホスホリボシルアミノイミダゾールカルボキシラーゼＩをコードするｐｕｒＥ遺伝子内の突然変異の導入によりＡＩＲのカルボキシアミノイミダゾールリボチド（ＣＡＩＲ）への転換を阻止することにより達成された。
【０１１５】
ｐｕｒＯ突然変異を構築するために、オペロンプロモーターの上流領域を、プライマーＹｅｂＦ＋１（配列番号１８）及びＹｅｂＧ−１（配列番号１９）を使用するＰＣＲにより増幅させて、６６７ｂｐ産物を発生させた。野生型B.subtilis１０１２から調製されたゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用し、そしてＰＣＲ反応条件は、９５℃で１分の変性、５５℃で１分間のアニーリング及び７２℃で１分間の伸長の３０サイクルからなっていた。ＰＣＲ産物を、ＷｉｚａｒｄＰＣＲ精製キット（Promega）を使用して精製しそしてＥｃｏＲ１−ＢａｍＨＩで二重消化した。ＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲ１−ＢａｍＨＩ消化されたｐＵＣ１９にクローニングして、プラスミドｐＮＭＲ７２を得た。
【０１１６】
ｐｕｒＥプロモーターを、プライマーＰｕｒＥ＋３（配列番号２０）及びＰｕｒＥ−１（配列番号２１）を使用するＰＣＲにより増幅して、７６８ｂｐ産物を得た。ＰＣＲ産物を、ＷｉｚａｒｄＰＣＲ精製キット（Promega）を使用して精製しそしてＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩで二重消化し、そしてＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ消化されたｐＮＭＲ７２にクローニングして、プラスミドｐＮＭＲ７６を得た。
【０１１７】
プラスミドｐＮＭＲ７６をＢａｍＨＩで線状化しそしてｐＢＥＳＴ５０からのＢｃｌＩで消化したネオマイシン耐性（neo）遺伝子カセットにライゲーションして、ｐｕｒ転写と同じ方位のｎｅｏカセットを有するｐＮＭＲ７９及び反対方位のｎｅｏカセットを有するｐＮＭＲ８０を得た。両プラスミドをＳｃａＩで線状化しそしてコンピテントB.subtilis１０１２細胞に形質転換した。形質転換体を２．５μg／mlの最終濃度となるようにネオマイシンを含有するＴＢＡＢ上で選択した。ｐＮＭＲ７９形質転換体について６７コロニーが観察され、そしてｐＮＭＲ８０形質転換については１８コロニーが観察された。各形質転換実験からの６コロニーを取り出しそしてＰＣＲにより分析した。２つのクローンが、各形質転換について二重乗換え（double crossover）として組み込まれたトランケーテッド（truncated）ｐｕｒオペロンを含有するものとして同定された。これらのクローンは、ｐＮＭＲ７９形質転換についてＢＳ１５６６及びＢＳ１５６７と再命名されそしてｐＮＭＲ８０形質転換についてはＢＳ１５６８及びＢＳ１５６９と再命名された。
【０１１８】
ｐｕｒＯ欠失突然変異をｐｕｒＥ６突然変異と組み合わせるために、B.subtilis株１Ａ３２０（purE6trpC2;Bacillus Genetic Stock Center, The Ohio State University, Columbus, Ohio43210USA）を、株ＢＳ１５６７からの染色体ＤＮＡで形質転換して、株ＴＨ９４を得た。ｐｕｒＯ：：ｎｅｏ ｐｕｒＥ６は密接に連鎖しているので、両突然変異を、標準条件下のＰＢＳ１普遍形質導入によりチアミン脱調節株ＴＨ９５に同時に移行して、株ＴＨ１０１（ｔｘ２６ｔｘ１ΔｔｈｉＬｙｌｏＡ：：Ｔｎ９１７ΔｐｕｒＯ：：ｎｅｏ ｐｕｒＥ）を得た。チアミン産生を決定するために、株ＴＨ１０１を、ＨＥＴ（０．５４ｇ／リットル）共給餌を伴う標準１−Ｌフェドバッチ条件下に増殖させた。キサンチンもバッチ培地及び給餌溶液に、それぞれ、０．０１％（重量／重量）及び１％（重量／重量、７．３５Ｎ ＮａＯＨに溶解した）で加えて、プリン要求を飽和させた。キサンチンは、プリン新規酵素のいずれもフィードバック阻害もしなければ、高濃度で毒性でもない。更に、給餌物はＮＨ4Ｃｌ（９．６％重量／重量）も含有しそしてpHをＨ2ＳＯ4（１０％）及びＮａＯＨ（７．３５Ｍ）を使用して制御した。結果は、同じ実験条件下にコントロールＴＨ９５醗酵よりも約６倍多くのチアミンをブロス中に産生したことを示した（表１１）。
【０１１９】
【表１１】
ＢＤ、検出以下
【０１２０】
実施例６：チアミンカップリング遺伝子（thiamin coupling gene）を強めることによりチアミン化合物産生を増加させる方法
この実施例は、B.subtilis ｔｈｉＣ遺伝子を過剰発現してチアミン産物の過剰産生及び分泌をもたらすのに使用することができるB.subtilis ｔｈｉＣ遺伝子を含有するＤＮＡカセットの構築を説明する。この遺伝子は、再利用酵素、ＨＥＴキナーゼをコードする遺伝子、ｔｈｉＫを含有するオペロン内に位置している。
【０１２１】
ｔｈｉＣの発現を増加させるために、ネイティブプロモーター領域が、B.subtilisバクテリオファージＳＰ０１に由来する強い構成的ＳＰ０１−２６プロモーター（Ｐ26と命名された）により置換されている増幅可能なカセットを構築した。これを行うために、ｔｈｉＡカセットをｐＴＨ４７から除去しそしてｔｈｉＫＣを含有するＤＮＡ断片により置換した。最初に、ｔｈｉＫＣ構造遺伝子を含有する１５５５ｂｐ断片を、標準方法及び合成オリゴＤＮＡプライマーｔｈｉＫＣ／ｆｏｒ３／ｐＸＩ２２／ＮｄｅＩ（配列番号５）及びｔｈｉＣｏｐ／ｒｅｖ２／ｐＸＩ２２／ＳｍａＩ（配列番号６）を使用するＰＣＲにより増幅した。ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩによる消化の後、ＰＣＲ産物を、ｐＴＨ４３のＮｄｅＩ部位とＢａｍＨＩ部位との間に挿入して、プラスミドｐＴＨ４８（図２）を得た。
【０１２２】
このＰ26ｔｈｉＫＣ−ｔｅｔカセットを、最初にｐＴＨ４８をＢｓａＩで消化しそして標準方法を使用してアガロースゲルからの４０７８ｂｐ断片を精製することにより、ＴＨ９５に導入した。精製した断片をそれ自体に高ＤＮＡ濃度でライゲーションしそして標準方法を使用してＴＨ９５コンピテント細胞中に形質転換した。形質転換体を、テトラサイクリン２０μg／mlを含有するＴＢＡＢ培地で選択した。ＴＨ１１５と名付けられた１つのＴｅｔｒコロニーを、更なる研究のために取っておいた。連続したより高いレベルのテトラサイクリンに耐性のコロニーを得ることによりｔｈｉＫＣの発現を増加させた。特に、テトラサイクリン４５μg／mlに耐性のＴＨ１１５の株を得ることができた。粗細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、テトラサイクリン２０μg／mlのみに耐性のＴＨ１１５株よりも有意に高いレベルのＴｈｉＫ及びＴｈｉＣタンパク質を示した。
【０１２３】
ＨＭＰ及びＨＥＴ共給餌（各々、０．５４ｇ／リットル）の存在下に、ＴＨ１１５の２つのフェドバッチ醗酵は、チアミン産生を増加させた（４８時間で２１０mg／Ｌ及び７８時間後３００mg／リットル）。基質ＨＭｐ又はＨＥＴに関するモル収率は各々４８時間及び７８時間で４５％であった。２つの他の醗酵は、チアミン産生を僅かに減少させた。興味深いことに、より高いチラミン分泌は厳しい増殖制限事象と同時に起こった。この増殖制限事象は、醗酵の最初の時間の期間中に起こりそして６リットルの培養への栄養ブロス（ＮＢ）２５ｇ及びＴＰＰ１．６mgの添加により克服することができた。ＨＰＬＣ／ＤＡＤは、醗酵ブロス中にチアミンが存在することを確証しそして他のＵＶで検出可能な化合物からチアミンを精製するのに使用することができた。興味深いことに、ＨＭＰもＨＥＴも、ＨＰＬＣ／ＤＡＤにより検出されず、これは、０．５４ｇ／リットルで適用された共給餌物の完全な取り込みを示す。いずれにせよ、これらの結果は、ＴＨ１１５が、外因的に添加された前駆体からＴＭＰを合成し、ＴＭＰ脱リン酸化してチアミンとし、そしてチアミンを培養培地中に分泌するための高い能力を有することを示す。更に、ＴｈｉＣカップリング活性は、明らかにこの方法では律速ではない。
【０１２４】
実施例７：チアゾール生合成酵素の発現レベルを高めることによりチアミン化合物産生を増加させる方法
この実施例は、B.subtilis ｔｈｉＢオペロン含有遺伝子ｔｅｎＡＩ−ｔｈｉＯＳＧＦＤを含有するＤＮＡカセットであって、該遺伝子を過剰発現させてチアミン産生物を過剰産生させそして分泌させるのに使用することができるＤＮＡカセットの構築を説明する。
【０１２５】
最初に、ｔｅｎＡＩ−ｔｈｉＯＳＧＦＤオペロンの前のネイティブプロモーター領域を欠失したチアゾール栄養要求株を発生させた。それをするために、プロモーター領域の各側に位置した２つのＤＮＡ断片（ＴｅｎＡの下流及びＹｊｂＱの上流の断片）を、最初に、プライマー対ＹｊｂＱ＋＿ＢａｍＨＩ（配列番号２２）／ＹｊｂＱ−＿ＭｌｕＩ（配列番号２３）及びＴｅｎＡ＋＿ＫｐｎＩ（配列番号２４）／ＴｅｎＡ−＿ＸｈｏＩ（配列番号２５）を使用してB.subtilis ＰＹ７９染色体から増幅した。クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼカセットを含有する第３断片を、プライマーＴｅｎＡ−ｃａｔ＋＿ＫｐｎＩ（配列番号２６）及びＴｅｎＡ−ｃａｔ−＿ＭｌｕＩ（配列番号２７）を使用してＴＨ１１染色体ＤＮＡ（ＰＹ７９ΔｔｈｉＬ：：ｃａｔ2）から増幅した。次いでこれらの３つの断片のアセンブリングを、ｐＵＣ１９において行ってプラスミドｐＴＨ４０１を発生させた。これは、ＰｓｔＩ制限部位とＥｃｏＲ１制限部位との間に挿入された‘ｙｊｂＱ3’−ＭｌｕＩ−3’ｃａｔ5’−ＫｐｎＩ−5’ｔｅｎＡ’ＤＮＡ構成を含む。ＴＨ９５におけるプラスミドｐＴＨ４０１の形質転換及びＣｍ５μg／mlでの選択は、チアミン及びチアゾール栄養要求株ＴＨ４０３を生じさせた。
【０１２６】
Ｐ26ｔｅｎＡＩ−ｔｈｉＯＳＧＦＤカセットを構築するために、ｐＴＨ４０１におけるｃａｔカセットを、ＫｐｎＩ及びＭｌｕＩにより切り取り、次いで、バクテリオファージＳＰＯ１に由来する強い構成的プロモーターＰ26を含むＰＣＲ断片により置換した。この断片を、プライマーＰ２６＋＿ＭｌｕＩ（配列番号２８）及びＰ２６−＿ＫｐｎＩ（配列番号２９）を使用してプラスミドｐＵＣＳＰＯ１−２６から増幅した。次いでＴＨ４０３バックグラウンドにおける原栄養性の回復について選択することにより、ｔｈｉＢ過剰発現カセットの導入を行なった。ＴＨ４０３へのＰ26ｔｅｎＡ’フレーム内融合を創生するライゲーション混合物の形質転換の後に、原栄養性形質転換体を、それらが最小培地プレート上で増殖する能力について選択した。それらのクロラムフェニコール感受性及びｔｅｎＡＩ−ｔｈｉＯＳＧＦＤオペロンの前におけるＰ26プロモーターの存在が確認された。得られる株をＴＨ４０４（図３）と名付けた。
【０１２７】
工学的に作られた株ＴＨ４０４によるチアミン産生を、ＨＭＰ共給餌（０．５４ｇ／リットル、重量／重量）を伴う標準フェドバッチ条件（開始容積：６リットル）を使用して２０リットルの実験室規模の醗酵槽で試験した。株ＴＨ４０４は、３１５mg／リットルまでのチアミンを産生した（表１２）。その数値は、株ＴＨ９５で４８時間後に得られた数値（１１０mg／リットル、表９）よりも有意に高い。
【０１２８】
【表１２】
実施例８：ＴｈｉＡ及びチアゾール生合成酵素の発現レベルを高めることによりチアミン化合物産生を増加させる方法
この実施例は、B.subtilis ｔｈｉＡ遺伝子及びB.subtilis ｔｈｉＢオペロン含有遺伝子ｔｅｎＡＩ−ｔｈｉＯＳＧＦＤを含有するＤＮＡカセットの組み合わせであって、該遺伝子を過剰発現させてチアミン産物を過剰産生させそして分泌させるのに使用することができるＤＮＡカセットの組み合わせの構築を説明する。
【０１２９】
B.subtilisＰ26ｔｅｎＡＩ−ｔｈｉＯＳＧＦＤカセット（実施例７に記載された）及び増幅可能なＰ26ｔｈｉＡ−ｃａｔカセット（実施例４に記載された）を組み合わせるために、株ＴＨ４０４のコンピテント細胞を、標準方法を使用して株ＴＨ１１６から抽出された非集合的濃度（non-congressional concentration）の染色体ＤＮＡで形質転換した。形質転換体を、クロラムフェニコール５μg／mlに対する耐性について選択した。それらは、Ｐ26ｔｅｎＡＩ−ｔｈｉＯＳＧＦＤ及びＰ26ｔｈｉＡ−ｃａｔカセットを含有することがＰＣＲ分析により確認された。ＴＨ４０５と名付けられた１つのＣｍｒコロニーを更なる研究のために取っておいた。連続したより高いレベルのクロラムフェニコールに耐性のコロニーを得ることによりＴＨ４０５におけるｔｈｉＡの発現を増加させた。特に、クロラムフェニコール６０μg／mlに耐性のＴＨ４０５の株を得ることができた。クロラムフェニコール６０μg／mlに耐性の株ＴＨ４０５の粗抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、株ＴＨ１１６におけるＰ26ｔｈｉＡ−ｃａｔカセットの増幅後に得られたレベル（実施例４）と同じである、５μg／mlのみに耐性の株ＴＨ４０５より有意に高いレベルのＴｈｉＡタンパク質を示した。
【０１３０】
工学的に作られた株ＴＨ４０５によるチアミン産生を、標準フェドバッチ条件（開始容積：６リットル）を使用して、２０リットルの実験室規模の醗酵槽で試験した。クロラムフェニコール６０μg／mlに耐性の株ＴＨ４０５は、４８時間にチアミン３４〜３７mg／リットルを産生し（表１３）、これは、ＨＭＰ０．５４ｇ／リットルの共給餌を伴うＴＨ９５醗酵（表８）と比べてチアミン産生が６倍の増加である。しかしながら、チアミン産生は、共給餌の研究で観察された又はｔｈｉＢオペロンのみを過剰発現する株で観察された（表１２、実施例７）よりも有意に低かった。この結果は、実施例４からの我々の観察、即ち、ＨＭＰの形成が律速であることを確証し、そしてｔｈｉＡ及びｔｈｉＢオペロンに加えて過剰発現されるのに必要である推定欠落遺伝子がｔｈｉＢオペロンの一部ではないことを確証する。
【０１３１】
【表１３】
【０１３２】
実施例９：グリシン又はシステイン利用性を増加させることによりチアミン化合物産生を増加させる方法
この実施例は、ＨＥＴ経路における両前駆体であるグリシン又はシステインの存在下にチアミン脱調節株を増殖させることによりチアミン産生を増加させる実験を説明する。
【０１３３】
B.subtilis ＴＨ９６（ｔｘ２６ｔｘ１ΔｔｈｉＬ）によるチアミン産生を、ＨＭＰ（０．５４ｇ／リットル）及びグリシン共給餌（２ｇ／リットル）を伴う標準フェドバッチ条件を使用して、６リットルの実験室規模の醗酵において試験した。チアミン、ＴＭＰ及びＴＰＰ産生は、４８時間で、それぞれ、１４mg／リットル、３mg／リットル及び０．５mg／リットルに達し（表１４）、これは、ＨＭＰ給餌だけ（表８）で増殖させたＴＨ９５におけるチアミン産物レベルよりも実質的により高い。
【０１３４】
次に、B.subtilis ＴＨ９５（ｔｘ２６ｔｘ１ΔｔｈｉＬ）によるチアミン産生を、ＨＭＰ（０．５４ｇ／リットル）及びシステイン共給餌（０．５ｇ／リットル）を伴う標準フェドバッチ条件を使用して、６リットルの実験室規模の醗酵において試験し；システイン同化を促進するためにトレオニン（０．４ｇ／リットル）及びイソロイシン（０．２ｇ／リットル）も加えた。チアミン産生は、４８時間で８mg／リットルに達し（表１４）、これは、ＨＭＰ給餌だけ（表８）で増殖させたＴＨ９５におけるチアミン力価よりも実質的に高い。
【０１３５】
チアミン産生の増加は、ＴＨ９５の醗酵に４つのアミノ酸、グリシン、システイン、イソロイシン及びトレオニンをすべて添加することにより達成することもできた（表１４）。更に、これらのアミノ酸の合成に関与する生合成遺伝子の発現を増加させること、又は該アミノ酸生合成遺伝子の発現を増加させる調節遺伝子若しくはシス作用性調節部位に突然変異を導入すること、又は該生合成酵素の活性を増加させる突然変異を導入することにより、チアミン産生性を増加させることができた。
【０１３６】
【表１４】
【０１３７】
実施例１０：前駆体としてグレーベジアミン（Grewe Diamine）を使用してチアミン化合物を産生させる方法
この実施例は、ＨＭＰの誘導体、４−アミノ−２−メチル−５−ピリミジンメタンアミン（Grewe Diamine）の存在下にチアミン脱調節株を増殖させることによりチアミンの産生を証明する実験を説明する。
【０１３８】
グレーベジアミン（Grewe Diamine）は、Ｃ−５ヒドロキシメチル基がアミノメチル基により置換されているＨＭＰの誘導体である。B.subtilis ＴＨ９５（ｔｘ２５ｔｘ１ΔｔｈｉＬ）によるチアミン産生を、グレーベジアミン及びＨＥＴ共給餌（各々０．５４ｇ／リットル）を伴う標準フェドバッチ条件を使用して、６リットルの実験室規模の醗酵で試験した。チアミン産生は、４５．５時間で５３mg／リットルに達した（表１５）。給餌溶液中のグレーベジアミンのレベルを２．７ｇ／リットルに増加させると、チアミン産生は４６．５時間で１２０mg／リットルに増加した（表１５）。これらの結果は、グレーベジアミン及びＨＭＴからチアミンを産生する醗酵法を開発することの実行可能性を証明する。更に、これらの結果は、B.subtilisが、グレーベジアミンをＨＭＰ、若しくはチアミンを産生するのに使用することができる構造的に類似した化合物に転換することができる１つ以上の酵素活性をコードすることを証明する。
【０１３９】
【表１５】
【０１４０】
実施例１１：単離された遺伝子及び突然変異
ｙｌｏＳ／ｔｘ１
株Ｔｘ１は、ｔｘ１突然変異を有し（突然変異を有するポリヌクレオチド配列のコピーについて配列番号３０参照）、これは、ＴＰＰの存在下にＬａｃ＋表現型についてｔｈｉＡ−ｌａｃＺ融合体含有バクテリアをスクリーニングすることにより単離された。この株（ΔｔｈｉＬ：：ｃａｔ4ａｍｙＥ：：ｔｈｉＡ−ｌａｃＺｔｘ１）は、この突然変異が、残留ＴＭＰキナーゼ活性、又はチアミンからＴＰＰを形成させる第２経路に関与する未知の遺伝子産物を不活性化すると思われることを示す強いチアミン栄養緩徐株（brady troph）であることが示された。再構成の研究は、Ｔｘ１のＬａｃ＋表現型が、ＨＥＴ（ΩｔｈｉＦ：：ｐＭＵＴＩＮ）又はＨＭＰ−Ｐ（ΩｔｈｉＡ：：Ｔｎ９１７）経路のいずれかにおける阻止を含むＴＨ２２誘導体の分析により判定されたとおり、チアゾール又はＨＭＰ経路における一般的欠陥により引き起こされたのではないことを示した。
【０１４１】
ｔｘ１を有する株は、いかなる有意な量のチアミン産物も含有しない、栄養ブロス２．５％を補充された最小培地中で増殖するその能力に基づいて栄養緩徐株であることが確証された。これらの培養物において、Ｔｘ１はコントロール株ＴＨ２２（ΩｔｈｉＬ：：ｃａｔ4ΩａｍｙＥ：：ｔｈｉＡ−ｌａｃＺ）よりも約１０倍多くの細胞外チアミン産物を産生した。興味深いことに、すべての検出可能なチアミン産物は、チアミン又はＴＰＰの形態にあり、ＴＭＰは培養培地中に検出されなかった。遺伝子の研究は、Ｔｘ１のチアミン栄養緩徐株表現型はΔｔｈｉＬ：：ｃａｔ4を必要とすることを示した。
【０１４２】
標準条件下にＰＢＳ１普遍形質導入を使用する遺伝子マッピングの研究は、ｔｘ１突然変異がΔｔｈｉＬ：：ｃａｔ４又はΩａｍｙＥ：：ｔｈｉＡ−ｌａｃＺに連鎖されて（ｌｉｎｋｅｄ）いないことを示した。しかしながら、ｔｘ１は、１４０°に位置したｚｄｉ−８２：：Ｔｎ９１７（ＢＧＳＧ＃１Ａ６３３）に対する９０％形質導入連鎖を示した。同じマーカーに対する形質転換連鎖は８％であった。１２１°と１４０°との間に位置したいくつかのＴｎ−９１７連鎖突然変異も、ｔｘ１に対する有意な連鎖を示した。１つの突然変異、ｕｒｃ８３：：Ｔｎ９１７（株１Ａ６１１）は、高い形質導入連鎖（＞６０％）及び有意な形質転換連鎖（１０％）を示した。ウラシル＋システイン又はウラシル＋メチオニンに対する栄養要求性を引起すこの挿入は、ｐｙｒオペロンとｃｙｓオペロン（１３９°）との間の接続部にある。第２の突然変異、ｙｌｏＡ：：Ｔｎ９１７は、ｔｘ１に対する同様な連鎖を示した。ｔｘ１のΩｓｐｏＶＭ：：Ｔｎ９１７突然変異に対するはるかに高い形質導入連鎖及びＤＮＡ形質転換連鎖が観察され、これは、ｔｘ１がｓｐｏＶＭに隣接したｙｌｏＳに対して対立遺伝子であることを示す。ｙｌｏＳ遺伝子は、チアミンピロホスホキナーゼ活性を有することが以前に示されたSchizosaccharomyces pombeのＴＮＲ３遺伝子タンパク質に対する弱いアミノ酸類似性（Ｐ＝０．２３）を示す。ｔｘ１がｙｌｏＳに対して対立遺伝子であるかどうかを決定するために、ｙｌｏＳ遺伝子の塩基１２４で出発する安定な４４８ｂｐ長さの欠失突然変異（ΔｙｌｏＳ：：ｃａｔ４）を、標準方法を使用するＰＣＲにより構築しそしてＰＹ７９に導入した。ΩｔｈｉＬ：：ｐＭＵＴＩＮの導入の後、得られる二重突然変異体は、元のＴｘ１突然変異体に表現型が類似していた。更に、Ｔｘ１突然変異体におけるｙｌｏＳのＤＮＡ配列決定は、アミノ酸残基１１６におけるロイシンのフェニルアラニンへの置換をもたらした単塩基突然変異を示した（Ｌ１１６＞Ｆ１１６；配列番号３１参照）。
【０１４３】
これらの結果に基づいて、B.subtilisは、ＴＭＰからＴＰＰを合成するための２つの生合成経路：（１）ｔｈｉＬの産物によるＴＭＰのＴＰＰへの直接の酵素的変換及び（２）未知のホスファターゼによるＴＭＰのＴＨＩへの酵素的変換、続いて、ｙｌｏＳの産生物によるＴＨＩのＴＰＰへのピロリン酸化を含む。
【０１４４】
経路（１）は、グラム陰性生物（例えば、Salmonella typhimurium及びＥ．ｃｏｌｉ）において存在することが示された。経路（２）は、いくつかのグラム＋菌及び、酵母を含む幾つかの他の真核微生物においてのみ存在する（Llorente et al, (1999)Mol.Microbiol.32:1140-1152)。更に、B.subtilisは、チアミンをＴＭＰに転換するキナーゼ活性を含まなければならない。この結論は、突然変異ΔｙｌｏＳ：：ｃａｔ4及びΩｔｈｉＡ８４：：Ｔｎ９１７を含む株ＴＨ１０９がチアミンを含有する最小培地中で増殖することができることを示す遺伝子研究に基づいている。
【０１４５】
タンパク質データベースサーチは、少なくとも１３のバクテリア属、即ち、Oceanobacillus、listeria、Staphylococcus、Enterococcus、Streptococcus、Clostridium、Fusobacterium、Tropheryma、Mesorhizobium、Brucella、Thermotoga、Agrobacterium及びHelicobactorは、ＹｌｏＳに対する有意な相同性を有するタンパク質をコードする１つ以上の遺伝子を含むことを示した。これらの微生物の大部分は、グラム＋菌である。非バクテリア生物（例えば、酵母、Drosophila melanogaster、Mus musculus、及びTreponema pallidum）からの遺伝子に対するより弱い相同性も検出された。興味深いことに、ｙｌｏＳ含有バクテリア種の大部分は、ｔｈｉＬオーソログ遺伝子を含有せずそして反対にｔｈｉＬ含有バクテリア種の大部分はｙｌｏＳオーソログ遺伝子を含まない（表１６）。この後者の群は、大部分グラム陰性属からなっていた。B.subtilisと同様に、Oceanobacillus iheyensisは、両方の遺伝子を含む。これらの結果は、真性細菌は、チアミンのピロリン酸化又はＴＭＰのリン酸化によりＴＰＰを形成する能力に依存して、２つの群に分類することができることを示す。更に、ｙｌｏＳオーソログをのみを含有しそしてｔｈｉＬオーソログを含有しないグラム＋菌の多くは、既知の病原体であり、これは、ｙｌｏＳ遺伝子が抗バクテリア剤を開発するための標的として使用することができることを示唆する。
【０１４６】
【表１６】
【０１４７】
ｙｕａＪ／ｔｘ２６−１
標準条件を使用するＰＢＳ１普遍形質導入実験は、Ｔｘ２６突然変異体が染色体の異なる領域に位置した２つの突然変異を含有することを示した。これらの実験では、染色体のまわりに位置した表現型的にサイレントなＴｎ９１７挿入体（phenotypically silent Tn917 insertion）を含有する標準野生型B.subtilis株（Bacillus Genetic Stock Center）でファージ溶菌液を最初に調製した。これらの溶菌液の２つ（１つはマップ位置２７７°にΩｙｕｆＲ：：Ｔｎ９１７（ＢＧＳＣ＃１Ａ６４２）を有しそして他方はマップ位置１２２．５°にΩｍｏｔＡ：：Ｔｎ９１７（ＢＧＳＣ＃１Ａ６３１）を有する）は、Ｔｘ２６表現型を野生型に復帰させることができた（ＴＰＰ１μMを含有する最小培地でのＬａｃ＋のＬａｃ−への復帰及びピリチアミン０．１μMを使用するピリチアミン耐性のピリチアミン感受性への復帰）。これらの予想されなかった結果は、両突然変異が、Ｔｘ２６により示されたチアミン脱調節表現型のために必要なことを示した。ｔｘ２６−１と名付けられた１つの突然変異は、ΩｙｕｆＲ：：Ｔｎ９１７に対する７０％連鎖を示しそして、ｔｘ２６−２と名付けられた他の突然変異は、ΩｍｏｔＡ：：Ｔｎ９１７に対する５９％連鎖を示した。更に、戻し交雑（back-cross）実験では、Ｔｘ２６のピリチアミン耐性マーカーを、コングレッションＤＮＡ形質転換（congression DNA transformation）により感受性B.subtilis株に移行させることができた。これらのピリチアミン耐性形質転換体もチアミン脱調節されている（ＴＰＰ１μMを含有する最小培地でｌａｃ＋でありそしてピリチアミン０．１μMに耐性である）。
【０１４８】
ｙｕｆＲ／ｍａｅＮ（２７７．１°）、ｙｕｉＧＨ（２８１°）、ｙｕｒＩ（２８５．６°）、ｇｅｒＡＢ及びｙｖａＣ（２９４°）における抗生物質挿入の種々の組み合わせを含有する供与体株を使用する３因子交雑実験を、マイクロアレー分析を使用して同定された（下記参照）チアミン調節された遺伝子（thiamin-regulated gene）、ｙｕａＪに近いｔｘ２６−１突然変異を更にマッピングした。ｔｘ２６−１がｙｕａＪに対して対立遺伝子であるかどうかを決定するために、標準ＰＣＲ法を使用して、ｙｕａＪの欠失突然変異を最初に構築した。これを達成するために、位置３５３で出発するｙｕａＪの３２４ｂｐ長さの内部断片を、プライマーＢｓｙｕａＪ／ｆｏｒ／Ｈｉｎｄ３（配列番号１６）及びＢｓｙｕａＪ／ｒｅｖ／Ｂａｍ（配列番号１７）を使用して、ＰＣＲ増幅しそしてｐＭＵＴＩＮ２のＢａｍＨＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間に挿入して、プラスミドｐＴＨ３１を創生した。予測されたとおり、ΩｙｕａＪ：：ｐＭＵＴＩＮの野生型株（例えば、ＰＹ７９）又はｔｈｉＡ突然変異体への導入は、表現型なしであった。しかしながら、いくつかの遺伝子交雑において、ΩｙｕａＪ：：ｐＭＵＴＩＮ２の破壊は、ｔｘ２６−１に対する非常に高い形質導入連鎖及び形質転換連鎖（１００％）を示した。これらの連鎖結果は、ｔｘ２６−１をｙｕａＪ内に又はｙｕａＪの近くに位置づけた。更に、株ＴＨ１１２（ｔｘ２６−１＋ｔｘ２６−２ΔｔｈｉＬ）へのΩｙｕａＪ：：ｐＭＵＴＩＮの形質導入及び形質転換は、ピリチアミン０．１μMに耐性Ｅｒｍｒコロニーをもたらした。最後に、Ｔｘ２６からのｙｕａＪのＤＮＡ配列分析は、ｔｘ２６−１（突然変異を含むポリヌクレオチド配列のコピーについて配列番号３３参照）がｙｕａＪの対立遺伝子であることを確証した。Ｔｘ２６からの４つの独立したＰＣＲ断片及び野生型親株（ＰＹ７９）からの２つからのＤＮＡ配列の比較は、アミノ酸位置３５のグルタミン残基のオーカー停止コドンへの変化をもたらした単塩基突然変異を検出した（Ｑ３５（ＣＡＡ）＞Ｓｔｏｐ（ＴＡＡ）；野生型ＹｕａＪのアミノ酸配列番号３５に比較して配列番号３４参照）。タンパク質データベースサーチによれば、ｙｕａＪは、チアミンパーミアーゼ又は表面抗原タンパク質遺伝子の調節因子をコードすることが示された。疎水性分析は、ＹｕａＪが６回膜貫通ドメインを含有することを示した。ｔｘ２６−１突然変異の導入は、タンパク質分解を受けているらしいトランケーテッド（truncated）３５アミノ酸タンパク質を産生することが予測される。これらの結果は、上に与えられた遺伝子データと共に、ｙｕａＪの機能の損失は、チアミン脱調節表現型の原因であることを示唆する。更に、マイクロアレーデータ（下記参照）は、ｙｕａＪの発現がＴＰＰにより調節されることを示しそして予測された５’リーダー領域の検査は、コンセンサスＴＨＩボックス調節配列に対する強い相同性を有するＤＮＡ配列を示した。
【０１４９】
ｔｘ２６−２
Ｔｎ９１７挿入を含む株で調製されたＰＢＳ１ファージ溶菌液の収集を使用する普遍形質導入マッピングの研究（２因子交雑）は、ｔｘ２６−２のB.subtilisゲノム上１２２．５°に位置したΩｍｏｔＡ：：Ｔｎ９１７（ＢＧＳＣ＃１Ａ６３１）に対する６０％連鎖を示した。この遺伝子マップ位置は、遺伝子、ｙｋｏＦＥＤＣのクラスターに対応し、その転写レベルは、チアミン脱調節Ｔｘ２６株のマイクロアレー研究において増加することが示された（表１７参照）。更に、これらの遺伝子は、オペロンとして組織されていると思われそしてｙｋｏＦの上流のプロモーター領域にＴＨＩボックス調節エレメントを含有する。ｙｋｏＦの上流の４００ｂｐ領域を含む、このオペロンのＤＮＡ配列決定は、Ａｓｐ180（ＧＡＣ）のＡｓｎ180（ＡＡＣ）への置換をもたらすｙｋｏＤ遺伝子における単塩基突然変異を検出した（野生型ＹｋｏＤのアミノ酸配列番号３８と比較してアミノ酸配列について配列番号３７参照）。タンパク質データベースサーチは、ｙｋｏＤがＨＭＰ輸送ＡＴＰ結合タンパク質をコードすることを示した。このオペロンにおける２つの他の遺伝子、ｙｋｏＥ及びＣは、ＨＭＰ輸送パーミアーゼをコードすることが予測される。これらの結果は、ｔｘ２６−２突然変異がｙｋｏＤの対立遺伝子でありそしてチアミンの細胞輸送に影響を与えることを示した（突然変異を含むポリヌクレオチド配列のコピーについて配列番号３６参照）。
【０１５０】
マイクロアレープロファイリングにより同定されたチアミン調節された遺伝子
マイクロアレープロフィリングを行うために、チアミンピロリン酸を加えられているか又は加えられていない５０mlのＳｐｉｚｉｚｅｎ最小培地を含有する振とうフラスコ培養物中でＰＹ７９を増殖させた。夜通し培養物を、新鮮な培地中にＫｌｅｔｔ＝１０単位となるように希釈しそして指数増殖期（Ｋｌｅｔｔ＝１００単位）となるように増殖させた。培養物の半分からの細胞を遠心により集め、そして全ＤＮＡを直ちに以前に記載された如くして抽出した（Lee et al.(2001)J.Bacteriol.183:7371-7380）。残りの培養物を初期定常期となるように増殖して後ＲＮＡ抽出した。初期定常期は、グルコース消耗の３０分後であると判定され；培地中のグルコース含有率を、標準方法を使用してグルコースアナライザー２（Beckman, Fullerton, CA）により測定した。標識されたｃＤＮＡ標的の調製、マイクロアレーハイブリダイゼーション及び染色方法並びにデータ分析は上記Lee et al.に記載されている。
【０１５１】
既知のチアミン調節されたB.subtilis遺伝子ｔｈｉＡ及びｔｅｎＡＩ−ｔｈｉＯＳＧＦＤに加えて、結果の分析は、ＴＰＰの不存在下に増殖させた細胞におけるいくつかの他の遺伝子の３倍以上の転写レベルも示した。これらの遺伝子は、表１７に列挙されている。これらの結果は、ＴＰＰの存在下に最小培地中で増殖させた野生型株及びチアミン脱調節（Ｔｘ２６）株のマイクロアレーデータの比較により確認さされた。更に、これらの遺伝子のいくつかにおいては、コンセンサスシス作用調節部位（ｔｈｉボックス）は、５’リーダー領域内で可視化することができ、これによりＴＰＰによる調節を確証した。これらの遺伝子の発現を、個々に又は互いに協奏して、又は既知の生合成遺伝子との組み合わせにおいて、増加又は減少させることが、より高いチアミン、ＨＭＰ及び／又はチアゾール産生ももたらすことができると予想されうる。
【０１５２】
【表１７】
ａ転写比は、ＴＰＰ処理なしの最小培地中で指数期に増殖させた野生型細胞のハイブリダイゼーション実験からの平均差値（規格化の後）を、ＴＰＰ処理をした場合の平均差値で割ること（ｗｔ−／ｗｔ＋）により、又はビタミン処理（ｖｉｔ）を伴う最小培地中で指数期となるように増殖させた脱調節突然変異体Ｔｘ２６細胞のハイブリダイゼーション実験からの平均差値を、同じ条件下に増殖させた野生型細胞の平均差値で割ること（ｄｅｇ＋／ｗｔ＋）により計算された。ある遺伝子（太字）では、平均差値は、ハイブリダイゼーション実験当たり二重のプローブセットから得られた。
ｂｎ／ｃ、平均差値の変化なし
【図面の簡単な説明】
【０１５３】
【図１】図１は、クロラムフェニコール耐性遺伝子（Ａ）を有するプラスミドｐＴＨ４３及びテトラサイクリン耐性遺伝子（Ｂ）を有するプラスミドｐＴＨ４７に含まれたＰ26ｔｈｉＡ発現カセットの構造を示す。
【図２】図２は、テトラサイクリン耐性遺伝子を有するプラスミドｐＴＨ４８に含まれたＰ２６ｔｈｉＫＣ発現カセットの構造を示す。
【図３】図３は、B.subtilis ｔｈｉＢオペロンを過剰発現する株ＴＨ４０４を構築するのに使用される二段階方法を示す。第１段階において、ｔｈｉＢプロモーター領域をクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ｃａｔ）カセットで置換することにより、チアミン栄養要求株を構築した。次いで、原栄養性の回復を使用して、ｔｈｉＢオペロンの前にバクテリオファージの強い構成的Ｐ２６プロモーターを組み込んだ株を選択した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
バチルス科、ラクトバチルス科、ストレプトコッカス科、コリネバクテリア科及びブレビバクテリア科よりなる群から選ばれる微生物であって、チアミン産生を脱調節しそしてチアミン産物を培養培地中に放出させる突然変異を含有する微生物。
【請求項２】
突然変異が、ΔｔｈｉＬ、ｔｘ１、ｔｘ２６及びそれらの組み合わせからなる群より選ばれる、請求項１に記載の微生物。
【請求項３】
バチルス属、ラクトバチルス属、ラクトコッカス属、コリネバクテリウム属及びブレビバクテリウム属よりなる群から選ばれる、請求項１又は２に記載の微生物。
【請求項４】
バチルススブチリス細胞である、請求項３に記載の微生物。
【請求項５】
Ｂ．スブチリス ＴＨ９５（ＡＴＣＣ ＰＴＡ−５２２１）である、請求項４に記載の微生物。
【請求項６】
更にＤＮＡカセットを含み、該ＤＮＡカセットが、
（ａ）ｔｈｉＡ遺伝子産物をコードするポリヌクレオチド配列であって、該ポリヌクレオチド配列の１つ以上のコピーが該ＤＮＡカセットに含有されている、ポリヌクレオチド配列、
（ｂ）ｔｈｉＫＣオペロンからの遺伝子産物をコードするポリヌクレオチド配列であって、該ポリヌクレオチド配列の１つ以上のコピーが該ＤＮＡカセットに含有されている、ポリヌクレオチド配列、及び
（ｃ）ｔｅｎＡｌ−ｔｈｉＯＳＧＦＤオペロンの遺伝子産物をコードするポリヌクレオチド配列であって、該ポリヌクレオチド配列が強い構成的プロモーターにより作動的に制御されている、ポリヌクレオチド配列、
よりなる群から選ばれるポリヌクレオチド配列を含有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項７】
更に、（ａ）ｔｅｎＡｌ−ｔｈｉＯＳＧＦＤオペロンの遺伝子産物をコードするポリヌクレオチド配列を含有するＤＮＡカセット、及び（ｂ）ｔｈｉＡ遺伝子産物をコードするポリヌクレオチド配列の少なくとも１つのコピーを含有するＤＮＡカセットであって、該ポリヌクレオチド配列が強い構成的プロモーターにより作動的に制御されているＤＮＡカセット、を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項８】
Ｂ．スブチリス ＴＨ１１６（ＡＴＣＣ ＰＴＡ−５２２４）、ＴＨ１１５（ＡＴＣＣ ＰＴＡ−５２２３）、ＴＨ４０４（ＤＳＭ １６３３３）及びＴＨ４０５（ＤＳＭ １６３３４）よりなる群から選ばれる、請求項６又は７に記載の微生物。
【請求項９】
Ｂ．スブチリスのプリンオペロンの発現を脱調節する第１突然変異及び５−アミノイミダゾールリボチド（ＡＩＲ）のカルボキシアミノイミダゾールリボチド（ＣＡＩＲ）への転換を阻止する第２突然変異を更に含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項１０】
第１突然変異がｐｕｒオペロンのリーダー領域内の突然変異を含み、そして第２突然変異がホスホリボシルアミノイミダゾールカルボキシラーゼＩをコードするｐｕｒＥ遺伝子内の突然変異を含む、請求項９に記載の微生物。
【請求項１１】
Ｂ．スブチリス ＴＨ１０１（ＡＴＣＣ ＰＴＡ−５２２２）である、請求項１０に記載の微生物。
【請求項１２】
（ａ）適当な培地中で、チアミン産物を培地中に過剰産生する請求項１〜１１のいずれか１項に記載の微生物を培養すること、そして
（ｂ）チアミン産物を回収すること、
を含む、チアミン産物を産生させる方法。
【請求項１３】
（ａ）チアミン前駆体、
（ｂ）チアミン前駆体及びプリン供給源、
（ｃ）ＨＥＴ経路の前駆体、
（ｄ）ＨＭＰ経路の前駆体、及び
（ｅ）ＨＭＰの誘導体、
よりなる群から選ばれる成分の存在下に微生物を培養することを更に含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
チアミン前駆体が、４−アミノ−５−ヒドロキシメチル−２−メチルピリミジン（ＨＭＰ）、５−（２−ヒドロキシエチル）−４−メチルチアゾール（ＨＥＴ）及びそれらの組み合わせよりなる群から選ばれる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
チアミン前駆体がＨＥＴであり、そしてプリン供給源がキサンチンである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
ＨＥＴ経路の前駆体が、グリシン、システイン、イソロイシン、トレオニン及びそれらの組み合わせよりなる群から選ばれる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
ＨＭＰの誘導体が、４−アミノ−２−メチル−５−ピリミジンメタンアミン（グレーベジアミン）である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
ｔｘ１突然変異を含む単離されたポリヌクレオチド配列。
【請求項１９】
突然変異が、アミノ酸残基１１６におけるロイシンのフェニルアラニンへの置換をもたらす、請求項１８に記載の単離されたポリヌクレオチド配列。
【請求項２０】
配列が、配列番号３１であるか、又はストリンジェントな条件下に配列番号３１にハイブリダイゼーションするポリヌクレオチド配列であり、そして微生物中に存在するとき、チアミン産生の脱調節を引き起こす、請求項１８又は１９に記載の単離されたポリヌクレオチド配列。
【請求項２１】
ΔｙｕｆＲ：：Ｔｎ９１７（ｔｘ２６−１）に対する７０％連鎖を有する第１突然変異及びΩｍｏｔＡ：：Ｔｎ９１７（ｔｘ２６−２）に対する５９％連鎖を有する第２突然変異を含む単離されたポリヌクレオチド配列であって、チアミン産生性微生物における該突然変異の両方の存在がチアミン産生の脱調節を引起す、単離されたポリヌクレオチド配列。
【請求項２２】
ｔｘ２６−１突然変異が、配列番号３３であるポリヌクレオチド配列又はストリンジェントな条件下に配列番号３３にハイブリダイズするポリヌクレオチド配列によりコードされており、そしてｔｘ２６−２突然変異が、配列番号３６であるポリヌクレオチド配列又はストリンジェントな条件下に配列番号３６にハイブリダイズするポリヌクレオチド配列によりコードされており、そして微生物中に存在するとき、チアミン産生の脱調節を引起す、請求項２１に記載の単離されたポリヌクレオチド配列。
【請求項２３】
請求項１８〜２２のいずれか１項に記載の１つ以上のポリヌクレオチドを含むＤＮＡカセット。
【請求項２４】
請求項２３のＤＮＡカセットを含有する微生物。
【請求項２５】
（ａ）グラム＋微生物がサンプル中に存在するかどうかを決定し、
（ｂ）微生物がｙｌｏＳオーソログを含有するかどうかを決定し、
（ｃ）微生物がｔｈｉＬオーソログを含有するかどうかを決定する、
ことを含み、
グラム＋微生物におけるｙｌｏＳオーソログの存在及びｔｈｉＬオーソログの不存在により、該微生物が病原性であることを示す、患者からの臨床サンプル中の病原性微生物を検出する方法。
【請求項２６】
微生物が、リステリア属、スタフィロコッカス属、クロストリジウム属、エンテロコッカス属、及びストレプトコッカス属よりなる群から選ばれる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
微生物が、リステリアモノシトゲネス、スタフィロコッカスアウレウス、スタフィロコッカスエピダーミディス、クロストリジウムテタニ、クロストリジウムパーフリンゲンス、エンテロコッカス属の種、ストレプトコッカスアガラクティエ、ストレプトコッカスピロゲネス及びストレプトコッカスニューモニエよりなる群から選ばれる、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
（ａ）ＹｌｏＳタンパク質を含むアッセイ組成物を試験化合物と接触させること、そして
（ｂ）試験化合物がＹｌｏＳタンパク質活性を阻害するかどうかを決定すること
を含み、該化合物を、ＹｌｏＳタンパク質活性の活性を阻害するその化合物の能力に基づいて抗生物質として同定する、抗生物質を同定するためのアッセイ。
【請求項２９】
アッセイ組成物に含まれたＹｌｏＳタンパク質は、精製されたＹｌｏＳタンパク質、部分的に精製されたＹｌｏＳタンパク質及びＹｌｏＳタンパク質を産生する細胞からの粗細胞抽出物よりなる群から選ばれる、請求項２８に記載のアッセイ。
【請求項３０】
ＹｌｏＳタンパク質が、リステリア属、スタフィロコッカス属、クロストリジウム属、エンテロコッカス属、及びストレプトコッカス属よりなる群から選ばれる病原性微生物に由来するポリヌクレオチドによりコードされている、請求項２８又は２９に記載のアッセイ。
【請求項３１】
該微生物が、リステリアモノシトゲネス、スタフィロコッカスアウレウス、スタフィロコッカスエピダーミディス、クロストリジウムテタニ、クロストリジウムパーフリンゲンス、エンテロコッカス属の種、ストレプトコッカスアガラクティエ、ストレプトコッカスピロゲネス及びストレプトコッカスニューモニエよりなる群から選ばれる、請求項３０に記載のアッセイ。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
バチルス科、ラクトバチルス科、ストレプトコッカス科、コリネバクテリア科及びブレビバクテリア科よりなる群から選ばれる微生物であって、チアミン産生を脱調節しそしてチアミン産物を培養培地中に放出させる突然変異を含有する微生物。
【請求項２】
突然変異が、ΔｔｈｉＬ、ｔｘ１、ｔｘ２６及びそれらの組み合わせからなる群より選ばれる、請求項１に記載の微生物。
【請求項３】
更にＤＮＡカセットを含み、該ＤＮＡカセットが、
（ａ）ｔｈｉＡ遺伝子産物をコードするポリヌクレオチド配列であって、該ポリヌクレオチド配列の１つ以上のコピーが該ＤＮＡカセットに含有されている、ポリヌクレオチド配列、
（ｂ）ｔｈｉＫＣオペロンからの遺伝子産物をコードするポリヌクレオチド配列であって、該ポリヌクレオチド配列の１つ以上のコピーが該ＤＮＡカセットに含有されている、ポリヌクレオチド配列、及び
（ｃ）ｔｅｎＡｌ−ｔｈｉＯＳＧＦＤオペロンの遺伝子産物をコードするポリヌクレオチド配列であって、該ポリヌクレオチド配列が強い構成的プロモーターにより作動的に制御されている、ポリヌクレオチド配列、
よりなる群から選ばれるポリヌクレオチド配列を含有する、請求項１又は２に記載の微生物。
【請求項４】
（ａ）適当な培地中で、チアミン産物を培地中に過剰産生する請求項１〜３のいずれか１項に記載の微生物を培養すること、そして
（ｂ）チアミン産物を回収すること、
を含む、チアミン産物を産生させる方法。
【請求項５】
ｔｘｌ突然変異を含むポリヌクレオチド配列。
【請求項６】
ΔｙｕｆＲ：：Ｔｎ９１７（ｔｘ２６−１）に対する７０%連鎖を有する第１突然変異及びΩｍｏｔＡ：：Ｔｎ９１７（ｔｘ２６−２）に対する５９%連鎖を有する第２突然変異を含むポリヌクレオチド配列であって、チアミン産生性微生物における該突然変異の両方の存在がチアミン産生の脱調節を引起す、ポリヌクレオチド配列。
【請求項７】
請求項５又は６に記載のポリヌクレオチドを１つ以上含むＤＮＡカセットを含有する微生物。
【請求項８】
（ａ）グラム＋微生物がサンプル中に存在するかどうかを決定すること、
（ｂ）微生物がｙｌｏＳオーソログを含有するかどうかを決定すること、
（ｃ）微生物がｔｈｉＬオーソログを含有するかどうかを決定すること、
を含み、
グラム＋微生物におけるｙｌｏＳオーソログの存在及びｔｈｉＬオーソログの不存在により、該微生物が病原性であることを示す、患者からの臨床サンプル中の病原性微生物を検出する方法。
【請求項９】
（ａ）ＹｌｏＳタンパク質を含むアッセイ組成物を試験化合物と接触させること、そして
（ｂ）試験化合物がＹｌｏＳタンパク質活性を阻害するかどうかを決定すること
を含み、該化合物を、ＹｌｏＳタンパク質活性の活性を阻害するその化合物の能力に基づいて抗生物質として同定する、抗生物質を同定するためのアッセイ。
【請求項１】
バチルス科、ラクトバチルス科、ストレプトコッカス科、コリネバクテリア科及びブレビバクテリア科よりなる群から選ばれる微生物であって、チアミン産生を脱調節しそしてチアミン産物を培養培地中に放出させる突然変異を含有する微生物。
【請求項２】
突然変異が、ΔｔｈｉＬ、ｔｘ１、ｔｘ２６及びそれらの組み合わせからなる群より選ばれる、請求項１に記載の微生物。
【請求項３】
バチルス属、ラクトバチルス属、ラクトコッカス属、コリネバクテリウム属及びブレビバクテリウム属よりなる群から選ばれる、請求項１又は２に記載の微生物。
【請求項４】
バチルススブチリス細胞である、請求項３に記載の微生物。
【請求項５】
Ｂ．スブチリス ＴＨ９５（ＡＴＣＣ ＰＴＡ−５２２１）である、請求項４に記載の微生物。
【請求項６】
更にＤＮＡカセットを含み、該ＤＮＡカセットが、
（ａ）ｔｈｉＡ遺伝子産物をコードするポリヌクレオチド配列であって、該ポリヌクレオチド配列の１つ以上のコピーが該ＤＮＡカセットに含有されている、ポリヌクレオチド配列、
（ｂ）ｔｈｉＫＣオペロンからの遺伝子産物をコードするポリヌクレオチド配列であって、該ポリヌクレオチド配列の１つ以上のコピーが該ＤＮＡカセットに含有されている、ポリヌクレオチド配列、及び
（ｃ）ｔｅｎＡｌ−ｔｈｉＯＳＧＦＤオペロンの遺伝子産物をコードするポリヌクレオチド配列であって、該ポリヌクレオチド配列が強い構成的プロモーターにより作動的に制御されている、ポリヌクレオチド配列、
よりなる群から選ばれるポリヌクレオチド配列を含有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項７】
更に、（ａ）ｔｅｎＡｌ−ｔｈｉＯＳＧＦＤオペロンの遺伝子産物をコードするポリヌクレオチド配列を含有するＤＮＡカセット、及び（ｂ）ｔｈｉＡ遺伝子産物をコードするポリヌクレオチド配列の少なくとも１つのコピーを含有するＤＮＡカセットであって、該ポリヌクレオチド配列が強い構成的プロモーターにより作動的に制御されているＤＮＡカセット、を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項８】
Ｂ．スブチリス ＴＨ１１６（ＡＴＣＣ ＰＴＡ−５２２４）、ＴＨ１１５（ＡＴＣＣ ＰＴＡ−５２２３）、ＴＨ４０４（ＤＳＭ １６３３３）及びＴＨ４０５（ＤＳＭ １６３３４）よりなる群から選ばれる、請求項６又は７に記載の微生物。
【請求項９】
Ｂ．スブチリスのプリンオペロンの発現を脱調節する第１突然変異及び５−アミノイミダゾールリボチド（ＡＩＲ）のカルボキシアミノイミダゾールリボチド（ＣＡＩＲ）への転換を阻止する第２突然変異を更に含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項１０】
第１突然変異がｐｕｒオペロンのリーダー領域内の突然変異を含み、そして第２突然変異がホスホリボシルアミノイミダゾールカルボキシラーゼＩをコードするｐｕｒＥ遺伝子内の突然変異を含む、請求項９に記載の微生物。
【請求項１１】
Ｂ．スブチリス ＴＨ１０１（ＡＴＣＣ ＰＴＡ−５２２２）である、請求項１０に記載の微生物。
【請求項１２】
（ａ）適当な培地中で、チアミン産物を培地中に過剰産生する請求項１〜１１のいずれか１項に記載の微生物を培養すること、そして
（ｂ）チアミン産物を回収すること、
を含む、チアミン産物を産生させる方法。
【請求項１３】
（ａ）チアミン前駆体、
（ｂ）チアミン前駆体及びプリン供給源、
（ｃ）ＨＥＴ経路の前駆体、
（ｄ）ＨＭＰ経路の前駆体、及び
（ｅ）ＨＭＰの誘導体、
よりなる群から選ばれる成分の存在下に微生物を培養することを更に含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
チアミン前駆体が、４−アミノ−５−ヒドロキシメチル−２−メチルピリミジン（ＨＭＰ）、５−（２−ヒドロキシエチル）−４−メチルチアゾール（ＨＥＴ）及びそれらの組み合わせよりなる群から選ばれる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
チアミン前駆体がＨＥＴであり、そしてプリン供給源がキサンチンである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
ＨＥＴ経路の前駆体が、グリシン、システイン、イソロイシン、トレオニン及びそれらの組み合わせよりなる群から選ばれる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
ＨＭＰの誘導体が、４−アミノ−２−メチル−５−ピリミジンメタンアミン（グレーベジアミン）である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
ｔｘ１突然変異を含む単離されたポリヌクレオチド配列。
【請求項１９】
突然変異が、アミノ酸残基１１６におけるロイシンのフェニルアラニンへの置換をもたらす、請求項１８に記載の単離されたポリヌクレオチド配列。
【請求項２０】
配列が、配列番号３１であるか、又はストリンジェントな条件下に配列番号３１にハイブリダイゼーションするポリヌクレオチド配列であり、そして微生物中に存在するとき、チアミン産生の脱調節を引き起こす、請求項１８又は１９に記載の単離されたポリヌクレオチド配列。
【請求項２１】
ΔｙｕｆＲ：：Ｔｎ９１７（ｔｘ２６−１）に対する７０％連鎖を有する第１突然変異及びΩｍｏｔＡ：：Ｔｎ９１７（ｔｘ２６−２）に対する５９％連鎖を有する第２突然変異を含む単離されたポリヌクレオチド配列であって、チアミン産生性微生物における該突然変異の両方の存在がチアミン産生の脱調節を引起す、単離されたポリヌクレオチド配列。
【請求項２２】
ｔｘ２６−１突然変異が、配列番号３３であるポリヌクレオチド配列又はストリンジェントな条件下に配列番号３３にハイブリダイズするポリヌクレオチド配列によりコードされており、そしてｔｘ２６−２突然変異が、配列番号３６であるポリヌクレオチド配列又はストリンジェントな条件下に配列番号３６にハイブリダイズするポリヌクレオチド配列によりコードされており、そして微生物中に存在するとき、チアミン産生の脱調節を引起す、請求項２１に記載の単離されたポリヌクレオチド配列。
【請求項２３】
請求項１８〜２２のいずれか１項に記載の１つ以上のポリヌクレオチドを含むＤＮＡカセット。
【請求項２４】
請求項２３のＤＮＡカセットを含有する微生物。
【請求項２５】
（ａ）グラム＋微生物がサンプル中に存在するかどうかを決定し、
（ｂ）微生物がｙｌｏＳオーソログを含有するかどうかを決定し、
（ｃ）微生物がｔｈｉＬオーソログを含有するかどうかを決定する、
ことを含み、
グラム＋微生物におけるｙｌｏＳオーソログの存在及びｔｈｉＬオーソログの不存在により、該微生物が病原性であることを示す、患者からの臨床サンプル中の病原性微生物を検出する方法。
【請求項２６】
微生物が、リステリア属、スタフィロコッカス属、クロストリジウム属、エンテロコッカス属、及びストレプトコッカス属よりなる群から選ばれる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
微生物が、リステリアモノシトゲネス、スタフィロコッカスアウレウス、スタフィロコッカスエピダーミディス、クロストリジウムテタニ、クロストリジウムパーフリンゲンス、エンテロコッカス属の種、ストレプトコッカスアガラクティエ、ストレプトコッカスピロゲネス及びストレプトコッカスニューモニエよりなる群から選ばれる、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
（ａ）ＹｌｏＳタンパク質を含むアッセイ組成物を試験化合物と接触させること、そして
（ｂ）試験化合物がＹｌｏＳタンパク質活性を阻害するかどうかを決定すること
を含み、該化合物を、ＹｌｏＳタンパク質活性の活性を阻害するその化合物の能力に基づいて抗生物質として同定する、抗生物質を同定するためのアッセイ。
【請求項２９】
アッセイ組成物に含まれたＹｌｏＳタンパク質は、精製されたＹｌｏＳタンパク質、部分的に精製されたＹｌｏＳタンパク質及びＹｌｏＳタンパク質を産生する細胞からの粗細胞抽出物よりなる群から選ばれる、請求項２８に記載のアッセイ。
【請求項３０】
ＹｌｏＳタンパク質が、リステリア属、スタフィロコッカス属、クロストリジウム属、エンテロコッカス属、及びストレプトコッカス属よりなる群から選ばれる病原性微生物に由来するポリヌクレオチドによりコードされている、請求項２８又は２９に記載のアッセイ。
【請求項３１】
該微生物が、リステリアモノシトゲネス、スタフィロコッカスアウレウス、スタフィロコッカスエピダーミディス、クロストリジウムテタニ、クロストリジウムパーフリンゲンス、エンテロコッカス属の種、ストレプトコッカスアガラクティエ、ストレプトコッカスピロゲネス及びストレプトコッカスニューモニエよりなる群から選ばれる、請求項３０に記載のアッセイ。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
バチルス科、ラクトバチルス科、ストレプトコッカス科、コリネバクテリア科及びブレビバクテリア科よりなる群から選ばれる微生物であって、チアミン産生を脱調節しそしてチアミン産物を培養培地中に放出させる突然変異を含有する微生物。
【請求項２】
突然変異が、ΔｔｈｉＬ、ｔｘ１、ｔｘ２６及びそれらの組み合わせからなる群より選ばれる、請求項１に記載の微生物。
【請求項３】
更にＤＮＡカセットを含み、該ＤＮＡカセットが、
（ａ）ｔｈｉＡ遺伝子産物をコードするポリヌクレオチド配列であって、該ポリヌクレオチド配列の１つ以上のコピーが該ＤＮＡカセットに含有されている、ポリヌクレオチド配列、
（ｂ）ｔｈｉＫＣオペロンからの遺伝子産物をコードするポリヌクレオチド配列であって、該ポリヌクレオチド配列の１つ以上のコピーが該ＤＮＡカセットに含有されている、ポリヌクレオチド配列、及び
（ｃ）ｔｅｎＡｌ−ｔｈｉＯＳＧＦＤオペロンの遺伝子産物をコードするポリヌクレオチド配列であって、該ポリヌクレオチド配列が強い構成的プロモーターにより作動的に制御されている、ポリヌクレオチド配列、
よりなる群から選ばれるポリヌクレオチド配列を含有する、請求項１又は２に記載の微生物。
【請求項４】
（ａ）適当な培地中で、チアミン産物を培地中に過剰産生する請求項１〜３のいずれか１項に記載の微生物を培養すること、そして
（ｂ）チアミン産物を回収すること、
を含む、チアミン産物を産生させる方法。
【請求項５】
ｔｘｌ突然変異を含むポリヌクレオチド配列。
【請求項６】
ΔｙｕｆＲ：：Ｔｎ９１７（ｔｘ２６−１）に対する７０%連鎖を有する第１突然変異及びΩｍｏｔＡ：：Ｔｎ９１７（ｔｘ２６−２）に対する５９%連鎖を有する第２突然変異を含むポリヌクレオチド配列であって、チアミン産生性微生物における該突然変異の両方の存在がチアミン産生の脱調節を引起す、ポリヌクレオチド配列。
【請求項７】
請求項５又は６に記載のポリヌクレオチドを１つ以上含むＤＮＡカセットを含有する微生物。
【請求項８】
（ａ）グラム＋微生物がサンプル中に存在するかどうかを決定すること、
（ｂ）微生物がｙｌｏＳオーソログを含有するかどうかを決定すること、
（ｃ）微生物がｔｈｉＬオーソログを含有するかどうかを決定すること、
を含み、
グラム＋微生物におけるｙｌｏＳオーソログの存在及びｔｈｉＬオーソログの不存在により、該微生物が病原性であることを示す、患者からの臨床サンプル中の病原性微生物を検出する方法。
【請求項９】
（ａ）ＹｌｏＳタンパク質を含むアッセイ組成物を試験化合物と接触させること、そして
（ｂ）試験化合物がＹｌｏＳタンパク質活性を阻害するかどうかを決定すること
を含み、該化合物を、ＹｌｏＳタンパク質活性の活性を阻害するその化合物の能力に基づいて抗生物質として同定する、抗生物質を同定するためのアッセイ。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公表番号】特表２００６−５２６３９５（Ｐ２００６−５２６３９５Ａ）
【公表日】平成１８年１１月２４日（２００６．１１．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５０８０９３（Ｐ２００６−５０８０９３）
【出願日】平成１６年５月２７日（２００４．５．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＨ２００４／０００３２１
【国際公開番号】ＷＯ２００４／１０６５５７
【国際公開日】平成１６年１２月９日（２００４．１２．９）
【出願人】（５０３２２０３９２）ディーエスエム アイピー アセッツ ビー．ブイ． (873)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年１１月２４日（２００６．１１．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年５月２７日（２００４．５．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＨ２００４／０００３２１
【国際公開番号】ＷＯ２００４／１０６５５７
【国際公開日】平成１６年１２月９日（２００４．１２．９）
【出願人】（５０３２２０３９２）ディーエスエム アイピー アセッツ ビー．ブイ． (873)
【Ｆターム（参考）】
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