【課題】細胞の生合成機構をより効率的且つ有効に改変できるように改善する方法を提供する。
【解決手段】直交ｔＲＮＡと、直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ、および、直交ｔＲＮＡ／シンテターゼ対を含むタンパク質生合成機構の成分を作製するための組成物と方法であり、直交対を同定するための方法。これらの成分は非天然アミノ酸をポリペプチドやタンパク質にｉｎ ｖｉｖｏで組込むために使用することができる。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）配列番号１〜３から選択されるポリヌクレオチド配列又はその相補的ポリヌクレオチド配列、及び
ｂ）ポリヌクレオチド配列（ａ）の実質的に全長にわたって高ストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列から構成される群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項２】
直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を含む組成物であって、Ｏ−ｔＲＮＡがセレクターコドンを認識し、Ｏ−ｔＲＮＡが直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼにより非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化される前記組成物。
【請求項３】
少なくとも１種の組換え直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）の生産方法であって、
（ａ）第１の生物に由来する少なくとも１種のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）から誘導されるＲＳのライブラリーを作製する段階と、
（ｂ）非天然アミノ酸と天然アミノ酸の存在下に直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）をアミノアシル化するメンバーをＲＳのライブラリーから選択又はスクリーニングすることにより活性ＲＳのプールを提供する段階と、
（ｃ）非天然アミノ酸の不在下にＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する活性ＲＳのプールを選択又はスクリーニングすることにより、Ｏ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する少なくとも１種の組換えＯ−ＲＳを提供する段階を含む前記方法。
【請求項４】
組換え直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）の生産方法であって、
（ａ）第１の生物に由来する少なくとも１種のｔＲＮＡから誘導されるｔＲＮＡのライブラリーを作製する段階と、
（ｂ）第１の生物に由来するＲＳの不在下に第２の生物に由来するアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）によりアミノアシル化されるｔＲＮＡのライブラリーを選択又はスクリーニングすることによりｔＲＮＡのプールを提供する段階と、
（ｃ）導入した直交ＲＳ（Ｏ−ＲＳ）によりアミノアシル化されるメンバーをｔＲＮＡのプールから選択又はスクリーニングすることにより、少なくとも１個のセレクターコドンを認識し、第２の生物に由来するＲＳにより効率的に認識されず、Ｏ−ＲＳにより優先的にアミノアシル化される少なくとも１種の組換えＯ−ｔＲＮＡを提供する段階を含む前記方法。
【請求項５】
少なくとも１種の特異的Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対の生産方法であって、
（ａ）第１の生物に由来する少なくとも１種のｔＲＮＡから誘導されるｔＲＮＡのライブラリーを作製する段階と、
（ｂ）第１の生物に由来するＲＳの不在下で第２の生物に由来するアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）によりアミノアシル化されるｔＲＮＡのライブラリーをネガティブスクリーニング又は選択することにより、ｔＲＮＡのプールを提供する段階と、
（ｃ）導入した直交ＲＳ（Ｏ−ＲＳ）によりアミノアシル化されるメンバーをｔＲＮＡのプールから選択又はスクリーニングすることにより、セレクターコドンを認識し、第２の生物に由来するＲＳにより効率的に認識されず、Ｏ−ＲＳにより優先的にアミノアシル化される少なくとも１種の組換えＯ−ｔＲＮＡを提供する段階と、
（ｄ）第３の生物に由来する少なくとも１種のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）から誘導されるＲＳのライブラリーを作製する段階と、
（ｅ）非天然アミノ酸と天然アミノ酸の存在下に少なくとも１種の組換えＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化するメンバーをＲＳのライブラリーから選択又はスクリーニングすることにより、活性ＲＳのプールを提供する段階と、
（ｆ）非天然アミノ酸の不在下に少なくとも１種の組換えＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する活性ＲＳのプールをネガティブ選択又はスクリーニングすることにより、非天然アミノ酸に特異的な少なくとも１種の組換えＯ−ＲＳと少なくとも１種の組換えＯ−ｔＲＮＡを含む少なくとも１種の特異的Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対を提供する段階を含む前記方法。
【請求項６】
第２の生物のｉｎ ｖｉｖｏ翻訳系で使用するための直交ｔＲＮＡ−ｔＲＮＡシンテターゼ対の同定方法であって、
マーカー遺伝子と、ｔＲＮＡと、第１の生物から単離又は誘導されるアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）を第２の生物に由来する第１組の細胞に導入する段階と、
マーカー遺伝子とｔＲＮＡを第２の生物に由来する複製組の細胞に導入する段階と、
第１組と複製組の細胞を選択又はスクリーニング物質の存在下に増殖させ、第１組では生存するか又は特異的スクリーニング応答を示すが、複製組では生存するか又は特異的スクリーニング応答を示すことができない細胞を選択又はスクリーニングすることにより、第２の生物のｉｎ ｖｉｖｏ翻訳系で使用するための直交ｔＲＮＡ−ｔＲＮＡシンテターゼ対を含む生存又はスクリーニング済み細胞を提供する段階を含む前記方法。

【図１】

【図２Ａ】

【図２Ｂ】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【図１６】

【図１７Ａ】

【図１７Ｂ】

【図１７Ｃ】

【図１７Ｄ】

【図１８】

【図１９】

【図２０】

【図２１】

【図２２】

【図２３】

【図２４】

【図２５】

【図２６】

【図２７】

【図２８】

【図２９】

【図３０】

【図３１】

【公開番号】特開２００９−７７７３１（Ｐ２００９−７７７３１Ａ）
【公開日】平成２１年４月１６日（２００９．４．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２８５９９７（Ｐ２００８−２８５９９７）
【出願日】平成２０年１１月６日（２００８．１１．６）
【分割の表示】特願２００２−５８３５９０（Ｐ２００２−５８３５９０）の分割
【原出願日】平成１４年４月１９日（２００２．４．１９）
【出願人】（５９３０５２７８５）ザ　スクリップス　リサーチ　インスティテュート (91)
【Ｆターム（参考）】