神経芽種の治療薬及びそのスクリーニング方法、並びに、神経芽種の予後の判定方法
【課題】神経芽腫の治療薬のスクリーニング方法を提供すること。
【解決手段】被検化合物の存在下および非存在下のそれぞれの条件において、細胞を培養する工程と、それぞれの培養した細胞中のＳｈｆ遺伝子の発現量を測定する工程と、被検化合物の存在下において培養した細胞中のＳｈｆ遺伝子の発現量が、被検化合物の非存在下において培養した細胞中のＳｈｆ遺伝子の発現量よりも高い場合に、当該被検化合物を神経芽腫の治療薬と判定する工程と、を備える、神経芽腫の治療薬のスクリーニング方法。
【解決手段】被検化合物の存在下および非存在下のそれぞれの条件において、細胞を培養する工程と、それぞれの培養した細胞中のＳｈｆ遺伝子の発現量を測定する工程と、被検化合物の存在下において培養した細胞中のＳｈｆ遺伝子の発現量が、被検化合物の非存在下において培養した細胞中のＳｈｆ遺伝子の発現量よりも高い場合に、当該被検化合物を神経芽腫の治療薬と判定する工程と、を備える、神経芽腫の治療薬のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経芽種の治療薬及びそのスクリーニング方法、並びに、神経芽種の予後の判定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
神経芽腫は交感神経系（傍脊椎交感神経幹と副腎髄質神経細胞）から発生する腫瘍であり、小児の悪性固形腫瘍では最も頻度が高い。神経芽腫の好発部位は副腎と後腹膜・後縦隔・頚部・骨盤部の交感神経節、及び腹腔正中部である。神経芽腫は臨床的にも極めて興味深い腫瘍で、発症年齢が１歳未満の症例では神経芽腫の明らかな自然退縮や成熟化がみられる一方、発症年齢が１歳以上の症例では腫瘍の転移及び増殖が急速に進行し、治療の困難な予後不良症例となる。
【０００３】
近年、神経芽腫の予後良好なサブセットと予後不良のサブセット間で遺伝子の発現レベルに差異があることが明らかになった。その一つが神経成長因子受容体ＴｒｋＡをコードする遺伝子である。ＴｒｋＡ遺伝子は予後不良群において発現が低く、逆に予後良好群では発現が高い（非特許文献１）。
【０００４】
ＴｒｋＡは細胞膜に存在し、神経成長因子ＮＧＦによって刺激を受け、その刺激をＴｒｋＡおよび細胞内の様々な蛋白質を介したシグナルとして細胞内に伝達する。その結果、ＴｒｋＡは細胞の分化や増殖の抑制を引き起こすと考えられている。しかし、神経芽腫におけるＴｒｋＡの関与する分子機構は未だ明らかになっていない。
【０００５】
また、本発明者らは、神経芽腫の治療法開発、神経芽腫の発生およびその生物学的特性にかかわる遺伝子の同定のために、複数の神経芽腫ｃＤＮＡライブラリーから新規遺伝子を含む約５３００個の遺伝子を単離してきた（特許文献１〜５及び非特許文献２）。さらに、予後良好群及び予後不良群の２つのサブセット間で異なる発現を示した遺伝子を多数同定してきた。
【０００６】
【特許文献１】国際公開第０１／６６７１９号パンフレット
【特許文献２】国際公開第０１／６６７３３号パンフレット
【特許文献３】国際公開第０２／９７０９３号パンフレット
【特許文献４】国際公開第０２／１０３０１７号パンフレット
【特許文献５】国際公開第２００４／３９９７５号パンフレット
【非特許文献１】Ｎａｋａｇａｗａｒａ， Ｍｅｄ． Ｐｅｄｉａｔｒ． Ｏｎｃｏｌ． ３１，１１３（１９９８）
【非特許文献２】Ｏｈｉｒａ Ｍ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ， ２２， ５５２５−５５３６ (２００３)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
神経芽腫は最も高頻度な小児悪性腫瘍でありながら、予後不良例と予後良好例が混在している興味深い疾患である。従来の治療法は化学療法・放射線療法・外科的切除を組み合わせた集学的治療法であるが、1歳以上の進行症例では予後不良であり、生存率の顕著な改善は見られていない。神経芽腫の予後を制御する分子機構を解明し、新たな機構に基づく治療薬を開発することができれば、神経芽腫の予後改善のための治療の選択の幅を広げることができる。そこで、本発明は、神経芽腫の治療薬及びそのスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【０００８】
また現在、神経芽腫でのＴｒｋＡの発現は疾患の予後を決定する因子の一つの候補と考えられている。しかしながら、神経芽腫の予後良好及び予後不良の決定にＴｒｋＡがどのような機構で関与しているのか、その詳細は不明である。さらに、ＴｒｋＡ遺伝子が高い発現を示していても、ＴｒｋＡの細胞内シグナル伝達経路のどこかに異常がある場合には、予後は必ずしも良好ではない可能性がある。したがって、本発明は、神経芽腫の予後を制御する分子機構を明らかにし、神経芽腫の予後の判定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、神経芽腫の臨床サンプルにおける発現解析の実験結果から、シグナル分子同士の相互作用を仲介し、アダプタータンパクと呼ばれるＳｈｆをコードする遺伝子が予後良好群で高発現を示していることを見出した。また、Ｓｈｆ遺伝子の発現レベルは、神経芽腫の予後と高い相関を示し、加えて、ＴｒｋＡ遺伝子の発現レベルとも高い相関を示すことを本発明者らは見出した。さらに、ＳｈｆとＴｒｋＡとが神経細胞内で共局在し、互いに相互作用することを本発明者らは明らかにした。このことは、ＳｈｆがＴｒｋＡに結合することによってＴｒｋＡのシグナル伝達を制御し、神経芽腫の予後の決定に関与している可能性を示唆している。以上の知見から、本発明者らは本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は、被検化合物の存在下および非存在下のそれぞれの条件において、細胞を培養する工程と、それぞれの培養した細胞中のＳｈｆ遺伝子の発現量を測定する工程と、被検化合物の存在下において培養した細胞中のＳｈｆ遺伝子の発現量が、被検化合物の非存在下において培養した細胞中のＳｈｆ遺伝子の発現量よりも高い場合に、当該被検化合物を神経芽腫の治療薬と判定する工程と、を備える、神経芽腫の治療薬のスクリーニング方法を提供する。本発明のスクリーニング方法は、Ｓｈｆ遺伝子の発現レベルが神経芽腫の予後良好及び予後不良と強く相関するという本発明者が新たに発見した知見に基づくものである。これによって、神経芽腫の予後改善のための治療薬の開発が可能となる。
【００１１】
本発明のスクリーニング方法は、また、被検化合物の存在下および非存在下のそれぞれの条件において、細胞を培養する工程と、それぞれの培養した細胞中のＳｈｆ遺伝子及びＴｒｋＡ遺伝子の発現量を測定する工程と、被検化合物の存在下において培養した細胞中のＳｈｆ遺伝子及びＴｒｋＡ遺伝子の発現量が、被検化合物の非存在下において培養した細胞中のＳｈｆ遺伝子及びＴｒｋＡ遺伝子の発現量よりも高い場合に、当該被検化合物を神経芽腫の治療薬と判定する工程と、を備えることを特徴とする。上記構成によって、Ｓｈｆ遺伝子の発現レベルが、神経芽腫の予後と高い相関を示し、さらに、ＴｒｋＡ遺伝子の発現レベルとも高い相関を示すという知見に基づいた神経芽腫の予後改善のための治療薬を開発することができる。
【００１２】
本発明のスクリーニング方法は、また、被検化合物の存在下および非存在下のそれぞれの条件において、細胞を培養する工程と、それぞれの培養した細胞中のＳｈｆ及びＴｒｋＡの相互作用を測定する工程と、被検化合物の存在下において培養した細胞中のＳｈｆ及びＴｒｋＡの相互作用が、被検化合物の非存在下において培養した細胞中のＳｈｆ及びＴｒｋＡの相互作用よりも強い場合に、当該被検化合物を神経芽腫の治療薬と判定する工程と、を備えることを特徴とする。本発明のスクリーニング方法は、ＳｈｆとＴｒｋＡとが、互いに相互作用するという分子機構を応用したものである。かかる分子機構は、本発明者が新たに発見したものであり、これによって、ＳｈｆによるＴｒｋＡシグナル伝達の制御という新たな分子機構に基づく、新たな治療薬の開発が可能となる。
【００１３】
本発明のスクリーニング方法にかかる細胞は、ヒト神経芽腫の臨床サンプル由来の細胞であることが好ましく、また、予後不良のヒト神経芽腫の臨床サンプル由来の細胞であることが好ましい。これによって、ヒト神経芽腫の予後改善のため、特に、予後不良例の治療のための治療薬を開発することができる。
【００１４】
本発明は、配列番号１に記載の塩基配列からなる核酸を有するベクターを含む、神経芽種の治療薬を提供する。また、本発明は、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸を有するベクターを含む、神経芽種の治療薬を提供する。ここで、配列番号１に記載の塩基配列は、Ｓｈｆ遺伝子に相当し、配列番号２に記載のアミノ酸配列は、Ｓｈｆに相当する。Ｓｈｆ遺伝子及びＳｈｆのＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．は、ＮＭ１３８３５６である。Ｓｈｆ遺伝子が発現し、Ｓｈｆの機能が亢進することによって、神経芽腫疾患の予後改善が期待できる。
【００１５】
本発明の治療薬は、さらに、配列番号３に記載の塩基配列からなる核酸を有するベクター又は配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸を有するベクターを含むことが好ましい。ここで、配列番号３に記載の塩基配列は、ＴｒｋＡ遺伝子に相当し、配列番号４に記載のアミノ酸配列は、ＴｒｋＡに相当する（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：ＮＰ００２５２９）。Ｓｈｆ及びＴｒｋＡの機能が亢進し、Ｓｈｆの関与するＴｒｋＡシグナル伝達が正常に機能することによって、神経芽腫疾患の予後改善が期待できる。
【００１６】
本発明は、さらに、予後が不明のヒト神経芽腫の臨床サンプル中におけるＳｈｆ遺伝子の発現量を測定する工程と、Ｓｈｆ遺伝子の発現量を、予後良好な、及び予後不良なヒト神経芽腫の臨床サンプル中におけるＳｈｆ遺伝子の発現量と比較する工程と、を備える、ヒト神経芽腫の予後の判定方法を提供する。本発明の判定方法は、Ｓｈｆ遺伝子の発現レベルが神経芽腫の患者の生存率、すなわち、神経芽腫の予後良好及び予後不良と強く相関するという知見を応用したものである。かかる分子機構は、本発明者が新たに発見したものであり、これによって、予後が不明のヒト神経芽腫の予後を判定することが可能となる。
【００１７】
本発明の判定方法は、予後が不明のヒト神経芽腫の臨床サンプル中におけるＴｒｋＡ遺伝子の発現量を測定する工程と、ＴｒｋＡ遺伝子の発現量を、予後良好な、及び予後不良なヒト神経芽腫の臨床サンプル中におけるＴｒｋＡ遺伝子の発現量と比較する工程と、をさらに備えることが好ましい。本発明の判定方法は、Ｓｈｆ遺伝子の発現レベルが、神経芽腫の予後と高い相関を示し、加えて、ＴｒｋＡ遺伝子の発現レベルとも高い相関を示すという本発明者らによる知見を応用したものである。Ｓｈｆ遺伝子の解析に加え、さらに、ＴｒｋＡ遺伝子の発現量の解析を行うことによって、予後が不明のヒト神経芽腫の予後を、より信頼度高く判定することが可能となる。
【発明の効果】
【００１８】
本発明のスクリーニング方法によれば、今までとは作用機序の異なる、神経芽腫の予後改善のための治療薬を開発することができる。また、本発明の治療薬により、神経芽腫疾患の予後改善が期待できる。さらに、本発明の判定方法によって、予後が不明のヒト神経芽腫の予後を判定することが可能となる。本発明の判定方法とスクリーニング方法及び／又は治療薬とを組み合わせることによって、神経芽腫の予後良好及び予後不良に合わせた治療薬の開発及び治療法の選択を行うことが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。
【００２０】
（治療薬のスクリーニング方法）
本実施形態における治療薬のスクリーニング方法には、Ｓｈｆ遺伝子の発現量を指標とする、第一及び第二の治療薬のスクリーニング方法と、ＳｈｆとＴｒｋＡの相互作用を指標とする第三の治療薬のスクリーニング方法とがある。
【００２１】
まず、Ｓｈｆ遺伝子の発現量を指標とする治療薬のスクリーニング方法を説明する。第一の治療薬のスクリーニング方法は、被検化合物の存在下および非存在下のそれぞれの条件において、細胞を培養する工程と、それぞれの培養した細胞中のＳｈｆ遺伝子の発現量を測定する工程と、被検化合物の存在下において培養した細胞中のＳｈｆ遺伝子の発現量が、被検化合物の非存在下において培養した細胞中のＳｈｆ遺伝子の発現量よりも高い場合に、当該被検化合物を神経芽腫の治療薬と判定する工程と、を備える。
【００２２】
ここで、遺伝子の発現量とは、遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡの発現量及び／又はその翻訳産物である蛋白質の発現量を指す。ｍＲＮＡの発現量の測定は、当業者にとって公知の測定系を用いて行えばよく、具体的には、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法、定量的ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲ法、定量的ノザンブロッティング法、定量的リボヌクレアーゼプロテクション法などが挙げられる。蛋白質の発現量の測定は、当業者にとって公知の測定系を用いて行えばよく、例えば、定量的ウエスタンブロッティング法、ＥＬＩＳＡ法などが挙げられる。コントロールとして、ハウスキーピング遺伝子であるＧＡＤＰＨや、ベータアクチンなどのｍＲＮＡ及び／又は蛋白質の発現量を用い、Ｓｈｆ遺伝子などの目的の遺伝子の発現量を標準化する。また、同一の対象から採取した複数のサンプル及び／又は同一のサンプルに由来するアリコットにおける目的遺伝子及び／又はコントロール遺伝子の発現量を測定し、それぞれの平均値から発現量を求めてもよい。これら方法を用いることによって、遺伝子発現を定量的に測定することが可能である。
【００２３】
被検化合物の存在下のＳｈｆ遺伝子の発現量が被検化合物の非存在下のＳｈｆ遺伝子の発現量よりも多い被検化合物を神経芽腫の治療薬と判定することができる。治療薬とは、神経芽腫の予後を良好にするものであることが最も好ましいが、予後を改善するものであれば本発明の目的に適うものである。
【００２４】
第二の治療薬のスクリーニング方法では、Ｓｈｆ遺伝子の発現量に加え、神経芽腫疾患の予後決定に関わる候補遺伝子であるＴｒｋＡ遺伝子の発現量を解析することが好ましい。さらに別の実施形態では、従来知られている、予後良好群及び予後不良群の２つのサブセット間で異なる発現を示す遺伝子の発現量を同時に解析してもよい。
【００２５】
スクリーニングに用いる細胞は、例えば、ヒト肺癌細胞由来のＨ１２９９や、ラット副腎褐色細胞腫由来のＰＣ１２などの培養細胞でもよく、神経組織由来の培養細胞でもよい。また、神経芽腫由来の培養細胞が好ましく、ヒト神経芽腫の臨床サンプル由来の細胞であることがより好ましく、予後不良のヒト神経芽腫の臨床サンプル由来の細胞であることが特に好ましい。
【００２６】
被検化合物は、低分子化合物、ペプチド、蛋白質、核酸（ＤＮＡ，ＲＮＡ，ＰＮＡ）などが挙げられるが、これらに限定しない。また、スクリーニングには、任意のスクリーニング用化合物ライブラリーを用いてもよい。なお、細胞の培養条件及び被検化合物の投与条件は、当業者であれば、適宜調整することが可能である。
【００２７】
次に、ＳｈｆとＴｒｋＡの相互作用を指標とする第三の治療薬のスクリーニング方法を説明する。第三の治療薬のスクリーニング方法は、被検化合物の存在下および非存在下のそれぞれの条件において、細胞を培養する工程と、それぞれの培養した細胞中のＳｈｆ及びＴｒｋＡの相互作用を測定する工程と、被検化合物の存在下において培養した細胞中のＳｈｆ及びＴｒｋＡの相互作用が、被検化合物の非存在下において培養した細胞中のＳｈｆ及びＴｒｋＡの相互作用よりも強い場合に、当該被検化合物を神経芽腫の治療薬と判定する工程と、を備える。
【００２８】
細胞中に発現するＳｈｆ及びＴｒｋＡは、内在性であることが好ましいが、形質導入によって強制的に発現させてもよく、その場合、Ｓｈｆ及びＴｒｋＡは、ＧＳＴやＨＡなどのタグが融合されていてもよく、蛍光蛋白質によって標識されていてもよい。相互作用とは、蛋白質間の直接的及び／又は間接的な相互作用を指し、この場合、Ｓｈｆ及びＴｒｋＡが複合体を形成しているか、又は、機能的に連携するように近接して存在していることを指す。相互作用の測定は、当業者にとって公知の蛋白質の相互作用を測定する系が利用可能であり、具体的には、共免疫沈降法による測定や、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）を応用した測定などが挙げられる。得られた定量的な測定値を、被検化合物の存在下と非存在下との間で比較し、被検化合物の神経芽腫の治療薬としての効用を判定する。
【００２９】
（治療薬）
また、本発明の実施形態にかかる神経芽種の治療薬は、Ｓｈｆ遺伝子（配列番号１）を有するベクターを含む。また別の実施形態では、治療薬はＳｈｆ（配列番号２）をコードする核酸を有するベクターを含む。さらなる実施形態では、治療薬はさらにＴｒｋＡ遺伝子（配列番号３）を有するベクター又はＴｒｋＡ（配列番号４）をコードする核酸を有するベクターを含むことが好ましい。
【００３０】
ベクターは、ＤＮＡまたはＲＮＡウイルスをもとに作製できる。ＭｏＭＬＶベクター、ヘルペスウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ＡＡＶベクター、ＨＩＶベクター、ＳＩＶベクター、センダイウイルスベクター等のいかなるウイルスベクターであっても良い。また、ウイルスベクターの構成タンパク質群のうち１つ以上を、異種ウイルスの構成タンパク質に置換する、もしくは、遺伝子情報を構成する塩基配列のうち一部を異種ウイルスの塩基配列に置換する、シュードタイプ型のウイルスベクターも本発明に使用できる。例えば、ＨＩＶの外皮タンパク質であるＥｎｖタンパク質を、小水痘性口内炎ウイルス（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ Ｖｉｒｕｓ：ＶＳＶ）の外皮タンパク質であるＶＳＶ−Ｇタンパク質に置換したシュードタイプウイルスベクターが挙げられる。さらに、治療効果を持つウイルスであれば、ヒト以外の宿主域を持つウイルスもウイルスベクターとして使用可能である。ウイルス以外のベクターとしてはリン酸カルシウムと核酸の複合体、リポソーム、カチオン脂質複合体、センダイウイルスリポソーム、ポリカチオンを主鎖とする高分子キャリアー等が使用可能である。
【００３１】
さらに、ベクター中の遺伝子の発現のために用いられる発現カセットは、標的細胞内で遺伝子を発現させることができるものであれば、特に制限されることなく用いることができる。当業者はそのような発現カセットを容易に選択することができる。好ましくは、動物由来の細胞内で遺伝子発現が可能な発現カセットであり、より好ましくは、哺乳類由来の細胞内で遺伝子発現が可能な発現カセットであり、特に好ましくは、ヒト由来の細胞内で遺伝子発現が可能な発現カセットである。発現カセットに用いられる遺伝子プロモーターは、例えばアデノウイルス、サイトメガロウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、シミアンウイルス４０、ラウス肉腫ウイルス、単純ヘルペスウイルス、マウス白血病ウイルス、シンビスウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、パピローマウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、インフルエンザウイルス、日本脳炎ウイルス、ＪＣウイルス、パルボウイルスＢ１９、ポリオウイルス等のウイルス由来のプロモーター、アルブミン、ＳＲα、熱ショック蛋白、エロンゲーション因子等の哺乳類由来のプロモーター、ＣＡＧプロモーター等のキメラ型プロモーター、テトラサイクリン、ステロイド等によって発現が誘導されるプロモーターを含む。
【００３２】
（神経芽腫の予後の判定方法）
本実施形態における神経芽腫の予後の判定方法は、予後が不明のヒト神経芽腫の臨床サンプル中におけるＳｈｆ遺伝子の発現量を測定する工程と、Ｓｈｆ遺伝子の発現量を、予後良好な、及び予後不良なヒト神経芽腫の臨床サンプル中におけるＳｈｆ遺伝子の発現量と比較する工程と、を備える。
【００３３】
Ｓｈｆ遺伝子の発現量が高い場合に、神経芽腫の予後が良好となるという本発明の知見に基づき、予後を判定する。予後良好なヒト神経芽腫の臨床サンプル中におけるＳｈｆ遺伝子の発現量とは、予後良好な複数の症例（予後良好群）から得られた発現量の測定値を統計的に処理したものでもよく、また、予後不良なヒト神経芽腫の臨床サンプル中におけるＳｈｆ遺伝子の発現量についても同様である。予後良好の判定に関しては、具体的には、予後が不明のヒト神経芽腫の臨床サンプル中におけるＳｈｆ遺伝子の発現量が、予後良好なヒト神経芽腫の臨床サンプル中のＳｈｆ遺伝子の発現量よりも多い場合及び／又は予後良好群から得られた発現量との比較において、統計的に予後良好群の分布範囲に該当する場合に、被験者の神経芽腫の予後は良好であると判定することができる。また、予後不良の判定も、予後良好の判定と同様にして行うことができる。
【００３４】
本明細書で使用する「予後良好」とは、神経芽細胞腫のうち、腫瘍が限局して存在するか、または退縮や良性の交感神経節細胞腫になった状態を指し、Ｎ−ｍｙｃその他腫瘍マーカーから判断して、悪性度が低いと判断される。なお、Ｎ−ｍｙｃ遺伝子は、正常細胞や予後良好な神経芽細胞腫では通常１倍体当たり１つしか存在しないのに対し、予後不良の神経芽細胞腫においては数十倍に増幅される神経の癌遺伝子である。本発明の好適な実施の形態では、国際神経芽腫病期分類に基づく病期１、２又は４ｓ、発症年齢が１歳未満であって、手術後５年以上再発なく生存し、臨床組織中にＮ−ｍｙｃの増幅が認められないものをヒト神経芽細胞腫における予後良好例としたが、このような特定の例には限定されない。
【００３５】
また、本明細書でいう「予後不良」とは、神経芽細胞腫のうち、腫瘍の進行が認められる状態を指し、Ｎ−ｍｙｃその他腫瘍マーカーから判断して、悪性度が高いと判断されるものである。本発明の好適な実施の形態では、病期３又は４、発症年齢が１歳以上であって、手術後３年以内に死亡、臨床組織中にＮ−ｍｙｃの増幅が認められたものをヒト神経芽細胞腫における予後不良例としたが、このような特定の例には限定されない。
【００３６】
別の実施形態では、神経芽腫の予後の判定方法は、Ｓｈｆ遺伝子の発現量に加え、神経芽腫疾患の予後決定に関わる候補遺伝子であるＴｒｋＡ遺伝子の発現量を解析することが好ましい。さらに別の実施形態では、従来知られている、予後良好群及び予後不良群の２つのサブセット間で異なる発現を示す遺伝子の発現量を同時に解析しても良い。
【実施例】
【００３７】
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３８】
（実験材料）
ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ逆転写酵素はＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社から購入した。ランダムプライマーはＴａｋａｒａ酒造社から購入した。ＴａｑＭａｎ（商標登録）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ ＭｉｘはＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社から購入した。Ｓｈｆのプローブ付きプライマーはＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社から購入した。坑Ｓｈｆ抗体はＭＢＬ社から購入した。坑Ｔｒｋ抗体はＳＡＮＴＡ ＣＲＵＺ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＬＹ社、坑Ｔｕｂｕｌｉｎ抗体はＮｅｏ ＭＡＲＫＥＲＳ社から購入した。
【００３９】
ＲＴ−ＰＣＲ法及びＲｅａｌ−ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲ法に用いた各種プライマーは以下の通りである。
Ｓｈｆ：５’-ＴＡＴＧＡＧＣＣＡＧＡＧＡＧＧＡＧＧＡＴＧＧ-３’ （配列番号５）
５’-ＣＴＧＴＣＣＡＧＣＴＧＴＣＣＣＡＣＡＧＧＴＧ-３’ （配列番号６）
ＧＡＰＤＨ：５’-ＡＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＧＴＣＴＡＧＡＡ-３’ （配列番号７）
５’-ＴＣＣＡＣＣＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＡ-３’ （配列番号８）
【００４０】
（実験方法）
以下の方法は各文献に沿って行なった。
半定量的ＲＴ−ＰＣＲ法、免疫染色法及び免疫沈降法は、Ｈａｎａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ., Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ., ２８０:１６６６５−１６６６７５，２００５. に記載の方法と同様の方法を用い、適宜実験系の最適化を行った。定量的ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲ法及びｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法は、Ｍａｃｈｉｄａ ｅｔ ａｌ., Ｏｎｃｏｇｅｎｅ., ２５:１９３１−１９４２，２００６. に記載の方法と同様の方法を用い、適宜実験系の最適化を行った。
【００４１】
（実施例１：ＲＴ−ＰＣＲ法による発現解析）
予後良好な、及び予後不良なヒト神経芽腫の臨床サンプルから全ＲＮＡを調整し、これらの全ＲＮＡをテンプレートとして、半定量的ＲＴ−ＰＣＲ法によりＳｈｆ ｍＲＮＡの発現量を解析した。その結果を図１に示す。Ｓｈｆ遺伝子が予後良好群で高発現を示していることが認められ、Ｓｈｆ遺伝子の発現レベルと神経芽腫の予後との間に機能的な関わりがある可能性が示唆された。
【００４２】
（実施例２：カプランマイヤー法による生存分析）
神経芽腫の患者より採取した臨床サンプル１０５例を用いて定量的ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲを行い、Ｓｈｆ ｍＲＮＡの発現レベルと診断後の患者の生存率との関係を検討した。図２にカプランマイヤー法による解析結果を示す。予後良好群とＳｈｆの高発現との間には有意な相関（ｐ＝０．０４５）が認められた。このことから、Ｓｈｆ ｍＲＮＡが高発現を示している症例では、予後が良好であることが示された。
【００４３】
（実施例３：Ｓｈｆ ｍＲＮＡ及びＴｒｋＡ ｍＲＮＡの発現の相関）
さらに、神経芽腫の臨床サンプルを用いて定量的ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲを行い、Ｓｈｆ ｍＲＮＡの発現レベルとＴｒｋＡ ｍＲＮＡの発現レベルとを比較した。その結果、図３に示すように、両者は有意に相関し（ｐ＜０．００００５）、予後の決定に関わる候補遺伝子ＴｒｋＡのｍＲＮＡが高発現している症例では、Ｓｈｆ ｍＲＮＡが有意に高発現していることが示された。
【００４４】
（実施例４：Ｓｈｆ ｍＲＮＡの発現の組織特異性の確認）
半定量的ＲＴ−ＰＣＲ法によって、それぞれの正常組織でのＳｈｆ ｍＲＮＡの発現量を比較した結果を図４に示す。Ｓｈｆ ｍＲＮＡは、脳、小脳及び胎児脳において高発現が認められた。さらに、ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション法による解析結果を図５に示す。胎生１３．５日目におけるＳｈｆ ｍＲＮＡの発現組織を検討したところ、脊髄、後根神経節及び間脳においてその発現が認められた。したがって、Ｓｈｆ遺伝子が神経系において発現し、神経組織の機能維持や分化に関与している可能性が示された。
【００４５】
（実施例５：免疫染色実験によるＳｈｆ及びＴｒｋＡの細胞内局在の確認）
Ｓｈｆ及びＴｒｋＡの細胞内局在を明らかにする目的で、ラット褐色細胞腫ＰＣ１２細胞を用いて免疫染色実験を行った結果、内在性のＳｈｆとＴｒｋＡが細胞質に共に局在することが明らかとなった。図６に、免疫染色による解析結果を示す。ＴｒｋＡは膜貫通型の受容体であることを考え合わせると、細胞質及び／又は細胞膜の内部においてＳｈｆとＴｒｋＡが共局在し、互いに機能的に相互作用する可能性が示唆された。
【００４６】
（実施例６：Ｓｈｆ及びＴｒｋＡの免疫複合体形成の検出）
Ｈ１２９９細胞に、Ｓｈｆ及びＴｒｋＡの発現コンストラクトを同時形質導入した。培養の後、細胞の懸濁液を可溶性画分と不溶性画分とに分画し、得られた可溶性画分を免疫沈降実験に呈した。Ｓｈｆ及びＴｒｋＡは、共に可溶性画分において検出された。共免疫沈降実験の解析結果を図７に示す。この結果より、Ｈ１２９９細胞内で共に強制発現させたＳｈｆ及びＴｒｋＡが免疫複合体を形成することが示された。
【００４７】
図８はＳｈｆ及びＴｒｋＡのシグナル伝達機構モデルを示す概略図である。神経細胞において神経成長因子ＮＧＦが細胞膜状の神経成長因子受容体ＴｒｋＡに結合すると、そのシグナルが細胞内及び核へと伝達され、神経細胞の分化や細胞増殖の停止といった応答が生じる。本発明によって得られた知見を考え合わせると、ＳｈｆがＴｒｋＡに結合することでＮＧＦ／ＴｒｋＡシグナルに関与し、さらにその下流へとシグナルを伝達することで神経芽腫の予後の決定に関与している可能性が示唆された。これらの知見は、予後不良神経芽腫や、他の神経系腫瘍に対する新たな治療薬開発において、Ｓｈｆをターゲットとした研究開発が有用である可能性を示唆しており、さらに臨床面における治療法の選択の改善やオーダーメード医療への応用も期待される。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】半定量的ＲＴ−ＰＣＲ法による神経芽腫臨床検体（予後良好群及び予後不良群、それぞれ８検体）でのＳｈｆ ｍＲＮＡの発現量の測定結果を示す電気泳動写真に対応する図である。
【図２】Ｓｈｆ ｍＲＮＡの発現レベル及び予後の相関を示すグラフである。
【図３】ＴｒｋＡ ｍＲＮＡ及びＳｈｆ ｍＲＮＡの発現レベルの相関を示すグラフである。
【図４】半定量的ＲＴ−ＰＣＲ法による正常組織でのＳｈｆ ｍＲＮＡの発現量の測定結果を示す電気泳動写真に対応する図である。
【図５】ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション法によるＳｈｆ ｍＲＮＡの発現を示す染色像に対応する図である。ｓｐ、脊髄；ＤＲＧ、後根神経節；ｄｉｅｎｃｅｐｈａｌｏｎ、間脳。
【図６】免疫染色実験によるＳｈｆ及びＴｒｋＡのラット褐色細胞腫ＰＣ１２細胞における局在を示す染色像に対応する図である。
【図７】共免疫沈降実験によるＳｈｆ及びＴｒｋＡの相互作用を示すウエスタンブロット像に対応する図である。Ｓｈｆ及びＴｒｋＡの発現コンストラクトをＨ１２９９細胞に同時形質導入した。免疫沈降及びウエスタンブロット解析には、抗Ｓｈｆ抗体及び抗ＴｒｋＡ抗体を用いた。
【図８】Ｓｈｆ及びＴｒｋＡのシグナル伝達機構モデルを示す概略図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経芽種の治療薬及びそのスクリーニング方法、並びに、神経芽種の予後の判定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
神経芽腫は交感神経系（傍脊椎交感神経幹と副腎髄質神経細胞）から発生する腫瘍であり、小児の悪性固形腫瘍では最も頻度が高い。神経芽腫の好発部位は副腎と後腹膜・後縦隔・頚部・骨盤部の交感神経節、及び腹腔正中部である。神経芽腫は臨床的にも極めて興味深い腫瘍で、発症年齢が１歳未満の症例では神経芽腫の明らかな自然退縮や成熟化がみられる一方、発症年齢が１歳以上の症例では腫瘍の転移及び増殖が急速に進行し、治療の困難な予後不良症例となる。
【０００３】
近年、神経芽腫の予後良好なサブセットと予後不良のサブセット間で遺伝子の発現レベルに差異があることが明らかになった。その一つが神経成長因子受容体ＴｒｋＡをコードする遺伝子である。ＴｒｋＡ遺伝子は予後不良群において発現が低く、逆に予後良好群では発現が高い（非特許文献１）。
【０００４】
ＴｒｋＡは細胞膜に存在し、神経成長因子ＮＧＦによって刺激を受け、その刺激をＴｒｋＡおよび細胞内の様々な蛋白質を介したシグナルとして細胞内に伝達する。その結果、ＴｒｋＡは細胞の分化や増殖の抑制を引き起こすと考えられている。しかし、神経芽腫におけるＴｒｋＡの関与する分子機構は未だ明らかになっていない。
【０００５】
また、本発明者らは、神経芽腫の治療法開発、神経芽腫の発生およびその生物学的特性にかかわる遺伝子の同定のために、複数の神経芽腫ｃＤＮＡライブラリーから新規遺伝子を含む約５３００個の遺伝子を単離してきた（特許文献１〜５及び非特許文献２）。さらに、予後良好群及び予後不良群の２つのサブセット間で異なる発現を示した遺伝子を多数同定してきた。
【０００６】
【特許文献１】国際公開第０１／６６７１９号パンフレット
【特許文献２】国際公開第０１／６６７３３号パンフレット
【特許文献３】国際公開第０２／９７０９３号パンフレット
【特許文献４】国際公開第０２／１０３０１７号パンフレット
【特許文献５】国際公開第２００４／３９９７５号パンフレット
【非特許文献１】Ｎａｋａｇａｗａｒａ， Ｍｅｄ． Ｐｅｄｉａｔｒ． Ｏｎｃｏｌ． ３１，１１３（１９９８）
【非特許文献２】Ｏｈｉｒａ Ｍ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ， ２２， ５５２５−５５３６ (２００３)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
神経芽腫は最も高頻度な小児悪性腫瘍でありながら、予後不良例と予後良好例が混在している興味深い疾患である。従来の治療法は化学療法・放射線療法・外科的切除を組み合わせた集学的治療法であるが、1歳以上の進行症例では予後不良であり、生存率の顕著な改善は見られていない。神経芽腫の予後を制御する分子機構を解明し、新たな機構に基づく治療薬を開発することができれば、神経芽腫の予後改善のための治療の選択の幅を広げることができる。そこで、本発明は、神経芽腫の治療薬及びそのスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【０００８】
また現在、神経芽腫でのＴｒｋＡの発現は疾患の予後を決定する因子の一つの候補と考えられている。しかしながら、神経芽腫の予後良好及び予後不良の決定にＴｒｋＡがどのような機構で関与しているのか、その詳細は不明である。さらに、ＴｒｋＡ遺伝子が高い発現を示していても、ＴｒｋＡの細胞内シグナル伝達経路のどこかに異常がある場合には、予後は必ずしも良好ではない可能性がある。したがって、本発明は、神経芽腫の予後を制御する分子機構を明らかにし、神経芽腫の予後の判定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、神経芽腫の臨床サンプルにおける発現解析の実験結果から、シグナル分子同士の相互作用を仲介し、アダプタータンパクと呼ばれるＳｈｆをコードする遺伝子が予後良好群で高発現を示していることを見出した。また、Ｓｈｆ遺伝子の発現レベルは、神経芽腫の予後と高い相関を示し、加えて、ＴｒｋＡ遺伝子の発現レベルとも高い相関を示すことを本発明者らは見出した。さらに、ＳｈｆとＴｒｋＡとが神経細胞内で共局在し、互いに相互作用することを本発明者らは明らかにした。このことは、ＳｈｆがＴｒｋＡに結合することによってＴｒｋＡのシグナル伝達を制御し、神経芽腫の予後の決定に関与している可能性を示唆している。以上の知見から、本発明者らは本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は、被検化合物の存在下および非存在下のそれぞれの条件において、細胞を培養する工程と、それぞれの培養した細胞中のＳｈｆ遺伝子の発現量を測定する工程と、被検化合物の存在下において培養した細胞中のＳｈｆ遺伝子の発現量が、被検化合物の非存在下において培養した細胞中のＳｈｆ遺伝子の発現量よりも高い場合に、当該被検化合物を神経芽腫の治療薬と判定する工程と、を備える、神経芽腫の治療薬のスクリーニング方法を提供する。本発明のスクリーニング方法は、Ｓｈｆ遺伝子の発現レベルが神経芽腫の予後良好及び予後不良と強く相関するという本発明者が新たに発見した知見に基づくものである。これによって、神経芽腫の予後改善のための治療薬の開発が可能となる。
【００１１】
本発明のスクリーニング方法は、また、被検化合物の存在下および非存在下のそれぞれの条件において、細胞を培養する工程と、それぞれの培養した細胞中のＳｈｆ遺伝子及びＴｒｋＡ遺伝子の発現量を測定する工程と、被検化合物の存在下において培養した細胞中のＳｈｆ遺伝子及びＴｒｋＡ遺伝子の発現量が、被検化合物の非存在下において培養した細胞中のＳｈｆ遺伝子及びＴｒｋＡ遺伝子の発現量よりも高い場合に、当該被検化合物を神経芽腫の治療薬と判定する工程と、を備えることを特徴とする。上記構成によって、Ｓｈｆ遺伝子の発現レベルが、神経芽腫の予後と高い相関を示し、さらに、ＴｒｋＡ遺伝子の発現レベルとも高い相関を示すという知見に基づいた神経芽腫の予後改善のための治療薬を開発することができる。
【００１２】
本発明のスクリーニング方法は、また、被検化合物の存在下および非存在下のそれぞれの条件において、細胞を培養する工程と、それぞれの培養した細胞中のＳｈｆ及びＴｒｋＡの相互作用を測定する工程と、被検化合物の存在下において培養した細胞中のＳｈｆ及びＴｒｋＡの相互作用が、被検化合物の非存在下において培養した細胞中のＳｈｆ及びＴｒｋＡの相互作用よりも強い場合に、当該被検化合物を神経芽腫の治療薬と判定する工程と、を備えることを特徴とする。本発明のスクリーニング方法は、ＳｈｆとＴｒｋＡとが、互いに相互作用するという分子機構を応用したものである。かかる分子機構は、本発明者が新たに発見したものであり、これによって、ＳｈｆによるＴｒｋＡシグナル伝達の制御という新たな分子機構に基づく、新たな治療薬の開発が可能となる。
【００１３】
本発明のスクリーニング方法にかかる細胞は、ヒト神経芽腫の臨床サンプル由来の細胞であることが好ましく、また、予後不良のヒト神経芽腫の臨床サンプル由来の細胞であることが好ましい。これによって、ヒト神経芽腫の予後改善のため、特に、予後不良例の治療のための治療薬を開発することができる。
【００１４】
本発明は、配列番号１に記載の塩基配列からなる核酸を有するベクターを含む、神経芽種の治療薬を提供する。また、本発明は、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸を有するベクターを含む、神経芽種の治療薬を提供する。ここで、配列番号１に記載の塩基配列は、Ｓｈｆ遺伝子に相当し、配列番号２に記載のアミノ酸配列は、Ｓｈｆに相当する。Ｓｈｆ遺伝子及びＳｈｆのＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．は、ＮＭ１３８３５６である。Ｓｈｆ遺伝子が発現し、Ｓｈｆの機能が亢進することによって、神経芽腫疾患の予後改善が期待できる。
【００１５】
本発明の治療薬は、さらに、配列番号３に記載の塩基配列からなる核酸を有するベクター又は配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸を有するベクターを含むことが好ましい。ここで、配列番号３に記載の塩基配列は、ＴｒｋＡ遺伝子に相当し、配列番号４に記載のアミノ酸配列は、ＴｒｋＡに相当する（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：ＮＰ００２５２９）。Ｓｈｆ及びＴｒｋＡの機能が亢進し、Ｓｈｆの関与するＴｒｋＡシグナル伝達が正常に機能することによって、神経芽腫疾患の予後改善が期待できる。
【００１６】
本発明は、さらに、予後が不明のヒト神経芽腫の臨床サンプル中におけるＳｈｆ遺伝子の発現量を測定する工程と、Ｓｈｆ遺伝子の発現量を、予後良好な、及び予後不良なヒト神経芽腫の臨床サンプル中におけるＳｈｆ遺伝子の発現量と比較する工程と、を備える、ヒト神経芽腫の予後の判定方法を提供する。本発明の判定方法は、Ｓｈｆ遺伝子の発現レベルが神経芽腫の患者の生存率、すなわち、神経芽腫の予後良好及び予後不良と強く相関するという知見を応用したものである。かかる分子機構は、本発明者が新たに発見したものであり、これによって、予後が不明のヒト神経芽腫の予後を判定することが可能となる。
【００１７】
本発明の判定方法は、予後が不明のヒト神経芽腫の臨床サンプル中におけるＴｒｋＡ遺伝子の発現量を測定する工程と、ＴｒｋＡ遺伝子の発現量を、予後良好な、及び予後不良なヒト神経芽腫の臨床サンプル中におけるＴｒｋＡ遺伝子の発現量と比較する工程と、をさらに備えることが好ましい。本発明の判定方法は、Ｓｈｆ遺伝子の発現レベルが、神経芽腫の予後と高い相関を示し、加えて、ＴｒｋＡ遺伝子の発現レベルとも高い相関を示すという本発明者らによる知見を応用したものである。Ｓｈｆ遺伝子の解析に加え、さらに、ＴｒｋＡ遺伝子の発現量の解析を行うことによって、予後が不明のヒト神経芽腫の予後を、より信頼度高く判定することが可能となる。
【発明の効果】
【００１８】
本発明のスクリーニング方法によれば、今までとは作用機序の異なる、神経芽腫の予後改善のための治療薬を開発することができる。また、本発明の治療薬により、神経芽腫疾患の予後改善が期待できる。さらに、本発明の判定方法によって、予後が不明のヒト神経芽腫の予後を判定することが可能となる。本発明の判定方法とスクリーニング方法及び／又は治療薬とを組み合わせることによって、神経芽腫の予後良好及び予後不良に合わせた治療薬の開発及び治療法の選択を行うことが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。
【００２０】
（治療薬のスクリーニング方法）
本実施形態における治療薬のスクリーニング方法には、Ｓｈｆ遺伝子の発現量を指標とする、第一及び第二の治療薬のスクリーニング方法と、ＳｈｆとＴｒｋＡの相互作用を指標とする第三の治療薬のスクリーニング方法とがある。
【００２１】
まず、Ｓｈｆ遺伝子の発現量を指標とする治療薬のスクリーニング方法を説明する。第一の治療薬のスクリーニング方法は、被検化合物の存在下および非存在下のそれぞれの条件において、細胞を培養する工程と、それぞれの培養した細胞中のＳｈｆ遺伝子の発現量を測定する工程と、被検化合物の存在下において培養した細胞中のＳｈｆ遺伝子の発現量が、被検化合物の非存在下において培養した細胞中のＳｈｆ遺伝子の発現量よりも高い場合に、当該被検化合物を神経芽腫の治療薬と判定する工程と、を備える。
【００２２】
ここで、遺伝子の発現量とは、遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡの発現量及び／又はその翻訳産物である蛋白質の発現量を指す。ｍＲＮＡの発現量の測定は、当業者にとって公知の測定系を用いて行えばよく、具体的には、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法、定量的ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲ法、定量的ノザンブロッティング法、定量的リボヌクレアーゼプロテクション法などが挙げられる。蛋白質の発現量の測定は、当業者にとって公知の測定系を用いて行えばよく、例えば、定量的ウエスタンブロッティング法、ＥＬＩＳＡ法などが挙げられる。コントロールとして、ハウスキーピング遺伝子であるＧＡＤＰＨや、ベータアクチンなどのｍＲＮＡ及び／又は蛋白質の発現量を用い、Ｓｈｆ遺伝子などの目的の遺伝子の発現量を標準化する。また、同一の対象から採取した複数のサンプル及び／又は同一のサンプルに由来するアリコットにおける目的遺伝子及び／又はコントロール遺伝子の発現量を測定し、それぞれの平均値から発現量を求めてもよい。これら方法を用いることによって、遺伝子発現を定量的に測定することが可能である。
【００２３】
被検化合物の存在下のＳｈｆ遺伝子の発現量が被検化合物の非存在下のＳｈｆ遺伝子の発現量よりも多い被検化合物を神経芽腫の治療薬と判定することができる。治療薬とは、神経芽腫の予後を良好にするものであることが最も好ましいが、予後を改善するものであれば本発明の目的に適うものである。
【００２４】
第二の治療薬のスクリーニング方法では、Ｓｈｆ遺伝子の発現量に加え、神経芽腫疾患の予後決定に関わる候補遺伝子であるＴｒｋＡ遺伝子の発現量を解析することが好ましい。さらに別の実施形態では、従来知られている、予後良好群及び予後不良群の２つのサブセット間で異なる発現を示す遺伝子の発現量を同時に解析してもよい。
【００２５】
スクリーニングに用いる細胞は、例えば、ヒト肺癌細胞由来のＨ１２９９や、ラット副腎褐色細胞腫由来のＰＣ１２などの培養細胞でもよく、神経組織由来の培養細胞でもよい。また、神経芽腫由来の培養細胞が好ましく、ヒト神経芽腫の臨床サンプル由来の細胞であることがより好ましく、予後不良のヒト神経芽腫の臨床サンプル由来の細胞であることが特に好ましい。
【００２６】
被検化合物は、低分子化合物、ペプチド、蛋白質、核酸（ＤＮＡ，ＲＮＡ，ＰＮＡ）などが挙げられるが、これらに限定しない。また、スクリーニングには、任意のスクリーニング用化合物ライブラリーを用いてもよい。なお、細胞の培養条件及び被検化合物の投与条件は、当業者であれば、適宜調整することが可能である。
【００２７】
次に、ＳｈｆとＴｒｋＡの相互作用を指標とする第三の治療薬のスクリーニング方法を説明する。第三の治療薬のスクリーニング方法は、被検化合物の存在下および非存在下のそれぞれの条件において、細胞を培養する工程と、それぞれの培養した細胞中のＳｈｆ及びＴｒｋＡの相互作用を測定する工程と、被検化合物の存在下において培養した細胞中のＳｈｆ及びＴｒｋＡの相互作用が、被検化合物の非存在下において培養した細胞中のＳｈｆ及びＴｒｋＡの相互作用よりも強い場合に、当該被検化合物を神経芽腫の治療薬と判定する工程と、を備える。
【００２８】
細胞中に発現するＳｈｆ及びＴｒｋＡは、内在性であることが好ましいが、形質導入によって強制的に発現させてもよく、その場合、Ｓｈｆ及びＴｒｋＡは、ＧＳＴやＨＡなどのタグが融合されていてもよく、蛍光蛋白質によって標識されていてもよい。相互作用とは、蛋白質間の直接的及び／又は間接的な相互作用を指し、この場合、Ｓｈｆ及びＴｒｋＡが複合体を形成しているか、又は、機能的に連携するように近接して存在していることを指す。相互作用の測定は、当業者にとって公知の蛋白質の相互作用を測定する系が利用可能であり、具体的には、共免疫沈降法による測定や、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）を応用した測定などが挙げられる。得られた定量的な測定値を、被検化合物の存在下と非存在下との間で比較し、被検化合物の神経芽腫の治療薬としての効用を判定する。
【００２９】
（治療薬）
また、本発明の実施形態にかかる神経芽種の治療薬は、Ｓｈｆ遺伝子（配列番号１）を有するベクターを含む。また別の実施形態では、治療薬はＳｈｆ（配列番号２）をコードする核酸を有するベクターを含む。さらなる実施形態では、治療薬はさらにＴｒｋＡ遺伝子（配列番号３）を有するベクター又はＴｒｋＡ（配列番号４）をコードする核酸を有するベクターを含むことが好ましい。
【００３０】
ベクターは、ＤＮＡまたはＲＮＡウイルスをもとに作製できる。ＭｏＭＬＶベクター、ヘルペスウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ＡＡＶベクター、ＨＩＶベクター、ＳＩＶベクター、センダイウイルスベクター等のいかなるウイルスベクターであっても良い。また、ウイルスベクターの構成タンパク質群のうち１つ以上を、異種ウイルスの構成タンパク質に置換する、もしくは、遺伝子情報を構成する塩基配列のうち一部を異種ウイルスの塩基配列に置換する、シュードタイプ型のウイルスベクターも本発明に使用できる。例えば、ＨＩＶの外皮タンパク質であるＥｎｖタンパク質を、小水痘性口内炎ウイルス（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ Ｖｉｒｕｓ：ＶＳＶ）の外皮タンパク質であるＶＳＶ−Ｇタンパク質に置換したシュードタイプウイルスベクターが挙げられる。さらに、治療効果を持つウイルスであれば、ヒト以外の宿主域を持つウイルスもウイルスベクターとして使用可能である。ウイルス以外のベクターとしてはリン酸カルシウムと核酸の複合体、リポソーム、カチオン脂質複合体、センダイウイルスリポソーム、ポリカチオンを主鎖とする高分子キャリアー等が使用可能である。
【００３１】
さらに、ベクター中の遺伝子の発現のために用いられる発現カセットは、標的細胞内で遺伝子を発現させることができるものであれば、特に制限されることなく用いることができる。当業者はそのような発現カセットを容易に選択することができる。好ましくは、動物由来の細胞内で遺伝子発現が可能な発現カセットであり、より好ましくは、哺乳類由来の細胞内で遺伝子発現が可能な発現カセットであり、特に好ましくは、ヒト由来の細胞内で遺伝子発現が可能な発現カセットである。発現カセットに用いられる遺伝子プロモーターは、例えばアデノウイルス、サイトメガロウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、シミアンウイルス４０、ラウス肉腫ウイルス、単純ヘルペスウイルス、マウス白血病ウイルス、シンビスウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、パピローマウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、インフルエンザウイルス、日本脳炎ウイルス、ＪＣウイルス、パルボウイルスＢ１９、ポリオウイルス等のウイルス由来のプロモーター、アルブミン、ＳＲα、熱ショック蛋白、エロンゲーション因子等の哺乳類由来のプロモーター、ＣＡＧプロモーター等のキメラ型プロモーター、テトラサイクリン、ステロイド等によって発現が誘導されるプロモーターを含む。
【００３２】
（神経芽腫の予後の判定方法）
本実施形態における神経芽腫の予後の判定方法は、予後が不明のヒト神経芽腫の臨床サンプル中におけるＳｈｆ遺伝子の発現量を測定する工程と、Ｓｈｆ遺伝子の発現量を、予後良好な、及び予後不良なヒト神経芽腫の臨床サンプル中におけるＳｈｆ遺伝子の発現量と比較する工程と、を備える。
【００３３】
Ｓｈｆ遺伝子の発現量が高い場合に、神経芽腫の予後が良好となるという本発明の知見に基づき、予後を判定する。予後良好なヒト神経芽腫の臨床サンプル中におけるＳｈｆ遺伝子の発現量とは、予後良好な複数の症例（予後良好群）から得られた発現量の測定値を統計的に処理したものでもよく、また、予後不良なヒト神経芽腫の臨床サンプル中におけるＳｈｆ遺伝子の発現量についても同様である。予後良好の判定に関しては、具体的には、予後が不明のヒト神経芽腫の臨床サンプル中におけるＳｈｆ遺伝子の発現量が、予後良好なヒト神経芽腫の臨床サンプル中のＳｈｆ遺伝子の発現量よりも多い場合及び／又は予後良好群から得られた発現量との比較において、統計的に予後良好群の分布範囲に該当する場合に、被験者の神経芽腫の予後は良好であると判定することができる。また、予後不良の判定も、予後良好の判定と同様にして行うことができる。
【００３４】
本明細書で使用する「予後良好」とは、神経芽細胞腫のうち、腫瘍が限局して存在するか、または退縮や良性の交感神経節細胞腫になった状態を指し、Ｎ−ｍｙｃその他腫瘍マーカーから判断して、悪性度が低いと判断される。なお、Ｎ−ｍｙｃ遺伝子は、正常細胞や予後良好な神経芽細胞腫では通常１倍体当たり１つしか存在しないのに対し、予後不良の神経芽細胞腫においては数十倍に増幅される神経の癌遺伝子である。本発明の好適な実施の形態では、国際神経芽腫病期分類に基づく病期１、２又は４ｓ、発症年齢が１歳未満であって、手術後５年以上再発なく生存し、臨床組織中にＮ−ｍｙｃの増幅が認められないものをヒト神経芽細胞腫における予後良好例としたが、このような特定の例には限定されない。
【００３５】
また、本明細書でいう「予後不良」とは、神経芽細胞腫のうち、腫瘍の進行が認められる状態を指し、Ｎ−ｍｙｃその他腫瘍マーカーから判断して、悪性度が高いと判断されるものである。本発明の好適な実施の形態では、病期３又は４、発症年齢が１歳以上であって、手術後３年以内に死亡、臨床組織中にＮ−ｍｙｃの増幅が認められたものをヒト神経芽細胞腫における予後不良例としたが、このような特定の例には限定されない。
【００３６】
別の実施形態では、神経芽腫の予後の判定方法は、Ｓｈｆ遺伝子の発現量に加え、神経芽腫疾患の予後決定に関わる候補遺伝子であるＴｒｋＡ遺伝子の発現量を解析することが好ましい。さらに別の実施形態では、従来知られている、予後良好群及び予後不良群の２つのサブセット間で異なる発現を示す遺伝子の発現量を同時に解析しても良い。
【実施例】
【００３７】
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３８】
（実験材料）
ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ逆転写酵素はＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社から購入した。ランダムプライマーはＴａｋａｒａ酒造社から購入した。ＴａｑＭａｎ（商標登録）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ ＭｉｘはＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社から購入した。Ｓｈｆのプローブ付きプライマーはＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社から購入した。坑Ｓｈｆ抗体はＭＢＬ社から購入した。坑Ｔｒｋ抗体はＳＡＮＴＡ ＣＲＵＺ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＬＹ社、坑Ｔｕｂｕｌｉｎ抗体はＮｅｏ ＭＡＲＫＥＲＳ社から購入した。
【００３９】
ＲＴ−ＰＣＲ法及びＲｅａｌ−ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲ法に用いた各種プライマーは以下の通りである。
Ｓｈｆ：５’-ＴＡＴＧＡＧＣＣＡＧＡＧＡＧＧＡＧＧＡＴＧＧ-３’ （配列番号５）
５’-ＣＴＧＴＣＣＡＧＣＴＧＴＣＣＣＡＣＡＧＧＴＧ-３’ （配列番号６）
ＧＡＰＤＨ：５’-ＡＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＧＴＣＴＡＧＡＡ-３’ （配列番号７）
５’-ＴＣＣＡＣＣＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＡ-３’ （配列番号８）
【００４０】
（実験方法）
以下の方法は各文献に沿って行なった。
半定量的ＲＴ−ＰＣＲ法、免疫染色法及び免疫沈降法は、Ｈａｎａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ., Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ., ２８０:１６６６５−１６６６７５，２００５. に記載の方法と同様の方法を用い、適宜実験系の最適化を行った。定量的ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲ法及びｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法は、Ｍａｃｈｉｄａ ｅｔ ａｌ., Ｏｎｃｏｇｅｎｅ., ２５:１９３１−１９４２，２００６. に記載の方法と同様の方法を用い、適宜実験系の最適化を行った。
【００４１】
（実施例１：ＲＴ−ＰＣＲ法による発現解析）
予後良好な、及び予後不良なヒト神経芽腫の臨床サンプルから全ＲＮＡを調整し、これらの全ＲＮＡをテンプレートとして、半定量的ＲＴ−ＰＣＲ法によりＳｈｆ ｍＲＮＡの発現量を解析した。その結果を図１に示す。Ｓｈｆ遺伝子が予後良好群で高発現を示していることが認められ、Ｓｈｆ遺伝子の発現レベルと神経芽腫の予後との間に機能的な関わりがある可能性が示唆された。
【００４２】
（実施例２：カプランマイヤー法による生存分析）
神経芽腫の患者より採取した臨床サンプル１０５例を用いて定量的ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲを行い、Ｓｈｆ ｍＲＮＡの発現レベルと診断後の患者の生存率との関係を検討した。図２にカプランマイヤー法による解析結果を示す。予後良好群とＳｈｆの高発現との間には有意な相関（ｐ＝０．０４５）が認められた。このことから、Ｓｈｆ ｍＲＮＡが高発現を示している症例では、予後が良好であることが示された。
【００４３】
（実施例３：Ｓｈｆ ｍＲＮＡ及びＴｒｋＡ ｍＲＮＡの発現の相関）
さらに、神経芽腫の臨床サンプルを用いて定量的ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲを行い、Ｓｈｆ ｍＲＮＡの発現レベルとＴｒｋＡ ｍＲＮＡの発現レベルとを比較した。その結果、図３に示すように、両者は有意に相関し（ｐ＜０．００００５）、予後の決定に関わる候補遺伝子ＴｒｋＡのｍＲＮＡが高発現している症例では、Ｓｈｆ ｍＲＮＡが有意に高発現していることが示された。
【００４４】
（実施例４：Ｓｈｆ ｍＲＮＡの発現の組織特異性の確認）
半定量的ＲＴ−ＰＣＲ法によって、それぞれの正常組織でのＳｈｆ ｍＲＮＡの発現量を比較した結果を図４に示す。Ｓｈｆ ｍＲＮＡは、脳、小脳及び胎児脳において高発現が認められた。さらに、ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション法による解析結果を図５に示す。胎生１３．５日目におけるＳｈｆ ｍＲＮＡの発現組織を検討したところ、脊髄、後根神経節及び間脳においてその発現が認められた。したがって、Ｓｈｆ遺伝子が神経系において発現し、神経組織の機能維持や分化に関与している可能性が示された。
【００４５】
（実施例５：免疫染色実験によるＳｈｆ及びＴｒｋＡの細胞内局在の確認）
Ｓｈｆ及びＴｒｋＡの細胞内局在を明らかにする目的で、ラット褐色細胞腫ＰＣ１２細胞を用いて免疫染色実験を行った結果、内在性のＳｈｆとＴｒｋＡが細胞質に共に局在することが明らかとなった。図６に、免疫染色による解析結果を示す。ＴｒｋＡは膜貫通型の受容体であることを考え合わせると、細胞質及び／又は細胞膜の内部においてＳｈｆとＴｒｋＡが共局在し、互いに機能的に相互作用する可能性が示唆された。
【００４６】
（実施例６：Ｓｈｆ及びＴｒｋＡの免疫複合体形成の検出）
Ｈ１２９９細胞に、Ｓｈｆ及びＴｒｋＡの発現コンストラクトを同時形質導入した。培養の後、細胞の懸濁液を可溶性画分と不溶性画分とに分画し、得られた可溶性画分を免疫沈降実験に呈した。Ｓｈｆ及びＴｒｋＡは、共に可溶性画分において検出された。共免疫沈降実験の解析結果を図７に示す。この結果より、Ｈ１２９９細胞内で共に強制発現させたＳｈｆ及びＴｒｋＡが免疫複合体を形成することが示された。
【００４７】
図８はＳｈｆ及びＴｒｋＡのシグナル伝達機構モデルを示す概略図である。神経細胞において神経成長因子ＮＧＦが細胞膜状の神経成長因子受容体ＴｒｋＡに結合すると、そのシグナルが細胞内及び核へと伝達され、神経細胞の分化や細胞増殖の停止といった応答が生じる。本発明によって得られた知見を考え合わせると、ＳｈｆがＴｒｋＡに結合することでＮＧＦ／ＴｒｋＡシグナルに関与し、さらにその下流へとシグナルを伝達することで神経芽腫の予後の決定に関与している可能性が示唆された。これらの知見は、予後不良神経芽腫や、他の神経系腫瘍に対する新たな治療薬開発において、Ｓｈｆをターゲットとした研究開発が有用である可能性を示唆しており、さらに臨床面における治療法の選択の改善やオーダーメード医療への応用も期待される。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】半定量的ＲＴ−ＰＣＲ法による神経芽腫臨床検体（予後良好群及び予後不良群、それぞれ８検体）でのＳｈｆ ｍＲＮＡの発現量の測定結果を示す電気泳動写真に対応する図である。
【図２】Ｓｈｆ ｍＲＮＡの発現レベル及び予後の相関を示すグラフである。
【図３】ＴｒｋＡ ｍＲＮＡ及びＳｈｆ ｍＲＮＡの発現レベルの相関を示すグラフである。
【図４】半定量的ＲＴ−ＰＣＲ法による正常組織でのＳｈｆ ｍＲＮＡの発現量の測定結果を示す電気泳動写真に対応する図である。
【図５】ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション法によるＳｈｆ ｍＲＮＡの発現を示す染色像に対応する図である。ｓｐ、脊髄；ＤＲＧ、後根神経節；ｄｉｅｎｃｅｐｈａｌｏｎ、間脳。
【図６】免疫染色実験によるＳｈｆ及びＴｒｋＡのラット褐色細胞腫ＰＣ１２細胞における局在を示す染色像に対応する図である。
【図７】共免疫沈降実験によるＳｈｆ及びＴｒｋＡの相互作用を示すウエスタンブロット像に対応する図である。Ｓｈｆ及びＴｒｋＡの発現コンストラクトをＨ１２９９細胞に同時形質導入した。免疫沈降及びウエスタンブロット解析には、抗Ｓｈｆ抗体及び抗ＴｒｋＡ抗体を用いた。
【図８】Ｓｈｆ及びＴｒｋＡのシグナル伝達機構モデルを示す概略図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検化合物の存在下および非存在下のそれぞれの条件において、細胞を培養する工程と、
それぞれの培養した細胞中のＳｈｆ遺伝子の発現量を測定する工程と、
被検化合物の存在下において培養した細胞中のＳｈｆ遺伝子の発現量が、被検化合物の非存在下において培養した細胞中のＳｈｆ遺伝子の発現量よりも高い場合に、当該被検化合物を神経芽腫の治療薬と判定する工程と、
を備える、神経芽腫の治療薬のスクリーニング方法。
【請求項２】
被検化合物の存在下および非存在下のそれぞれの条件において、細胞を培養する工程と、
それぞれの培養した細胞中のＳｈｆ遺伝子及びＴｒｋＡ遺伝子の発現量を測定する工程と、
被検化合物の存在下において培養した細胞中のＳｈｆ遺伝子及びＴｒｋＡ遺伝子の発現量が、被検化合物の非存在下において培養した細胞中のＳｈｆ遺伝子及びＴｒｋＡ遺伝子の発現量よりも高い場合に、当該被検化合物を神経芽腫の治療薬と判定する工程と、
を備える、神経芽腫の治療薬のスクリーニング方法。
【請求項３】
被検化合物の存在下および非存在下のそれぞれの条件において、細胞を培養する工程と、
それぞれの培養した細胞中のＳｈｆ及びＴｒｋＡの相互作用を測定する工程と、
被検化合物の存在下において培養した細胞中のＳｈｆ及びＴｒｋＡの相互作用が、被検化合物の非存在下において培養した細胞中のＳｈｆ及びＴｒｋＡの相互作用よりも強い場合に、当該被検化合物を神経芽腫の治療薬と判定する工程と、
を備える、神経芽腫の治療薬のスクリーニング方法。
【請求項４】
細胞が、ヒト神経芽腫の臨床サンプル由来の細胞である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
配列番号１に記載の塩基配列からなる核酸を有するベクターを含む、神経芽種の治療薬。
【請求項６】
配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸を有するベクターを含む、神経芽種の治療薬。
【請求項７】
治療薬が、配列番号３に記載の塩基配列からなる核酸を有するベクターをさらに含む、請求項５又は６に記載の治療薬。
【請求項８】
治療薬が、配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸を有するベクターをさらに含む、請求項５又は６に記載の治療薬。
【請求項９】
予後が不明のヒト神経芽腫の臨床サンプル中におけるＳｈｆ遺伝子の発現量を測定する工程と、
Ｓｈｆ遺伝子の発現量を、予後良好な、及び予後不良なヒト神経芽腫の臨床サンプル中におけるＳｈｆ遺伝子の発現量と比較する工程と、
を備える、ヒト神経芽腫の予後の判定方法。
【請求項１０】
予後が不明のヒト神経芽腫の臨床サンプル中におけるＴｒｋＡ遺伝子の発現量を測定する工程と、
ＴｒｋＡ遺伝子の発現量を、予後良好な、及び予後不良なヒト神経芽腫の臨床サンプル中におけるＴｒｋＡ遺伝子の発現量と比較する工程と、
をさらに備える、請求項９に記載のヒト神経芽腫の予後の判定方法。
【請求項１】
被検化合物の存在下および非存在下のそれぞれの条件において、細胞を培養する工程と、
それぞれの培養した細胞中のＳｈｆ遺伝子の発現量を測定する工程と、
被検化合物の存在下において培養した細胞中のＳｈｆ遺伝子の発現量が、被検化合物の非存在下において培養した細胞中のＳｈｆ遺伝子の発現量よりも高い場合に、当該被検化合物を神経芽腫の治療薬と判定する工程と、
を備える、神経芽腫の治療薬のスクリーニング方法。
【請求項２】
被検化合物の存在下および非存在下のそれぞれの条件において、細胞を培養する工程と、
それぞれの培養した細胞中のＳｈｆ遺伝子及びＴｒｋＡ遺伝子の発現量を測定する工程と、
被検化合物の存在下において培養した細胞中のＳｈｆ遺伝子及びＴｒｋＡ遺伝子の発現量が、被検化合物の非存在下において培養した細胞中のＳｈｆ遺伝子及びＴｒｋＡ遺伝子の発現量よりも高い場合に、当該被検化合物を神経芽腫の治療薬と判定する工程と、
を備える、神経芽腫の治療薬のスクリーニング方法。
【請求項３】
被検化合物の存在下および非存在下のそれぞれの条件において、細胞を培養する工程と、
それぞれの培養した細胞中のＳｈｆ及びＴｒｋＡの相互作用を測定する工程と、
被検化合物の存在下において培養した細胞中のＳｈｆ及びＴｒｋＡの相互作用が、被検化合物の非存在下において培養した細胞中のＳｈｆ及びＴｒｋＡの相互作用よりも強い場合に、当該被検化合物を神経芽腫の治療薬と判定する工程と、
を備える、神経芽腫の治療薬のスクリーニング方法。
【請求項４】
細胞が、ヒト神経芽腫の臨床サンプル由来の細胞である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
配列番号１に記載の塩基配列からなる核酸を有するベクターを含む、神経芽種の治療薬。
【請求項６】
配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸を有するベクターを含む、神経芽種の治療薬。
【請求項７】
治療薬が、配列番号３に記載の塩基配列からなる核酸を有するベクターをさらに含む、請求項５又は６に記載の治療薬。
【請求項８】
治療薬が、配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸を有するベクターをさらに含む、請求項５又は６に記載の治療薬。
【請求項９】
予後が不明のヒト神経芽腫の臨床サンプル中におけるＳｈｆ遺伝子の発現量を測定する工程と、
Ｓｈｆ遺伝子の発現量を、予後良好な、及び予後不良なヒト神経芽腫の臨床サンプル中におけるＳｈｆ遺伝子の発現量と比較する工程と、
を備える、ヒト神経芽腫の予後の判定方法。
【請求項１０】
予後が不明のヒト神経芽腫の臨床サンプル中におけるＴｒｋＡ遺伝子の発現量を測定する工程と、
ＴｒｋＡ遺伝子の発現量を、予後良好な、及び予後不良なヒト神経芽腫の臨床サンプル中におけるＴｒｋＡ遺伝子の発現量と比較する工程と、
をさらに備える、請求項９に記載のヒト神経芽腫の予後の判定方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２００８−２９２９６（Ｐ２００８−２９２９６Ａ）
【公開日】平成２０年２月１４日（２００８．２．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２０８８１２（Ｐ２００６−２０８８１２）
【出願日】平成１８年７月３１日（２００６．７．３１）
【出願人】（０００１６０５２２）久光製薬株式会社 (121)
【出願人】（５９１０１４７１０）千葉県 (49)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年２月１４日（２００８．２．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年７月３１日（２００６．７．３１）
【出願人】（０００１６０５２２）久光製薬株式会社 (121)
【出願人】（５９１０１４７１０）千葉県 (49)
【Ｆターム（参考）】
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