神経芽腫又は膠芽腫の治療薬
【課題】新規な作用機序に基づく、神経芽腫及び／又は膠芽腫の治療薬、神経芽腫及び／又は膠芽腫の診断剤及び診断キット、神経芽腫及び／又は膠芽腫のリスクファクター診断剤及び診断キット、神経芽腫及び／又は膠芽腫の治療薬もしくは予防薬の有効成分に係る物質のスクリーニング方法を提供する。
【解決手段】本発明の薬剤は、YB-1遺伝子及び／又はYB-1たんぱく質の機能を阻害する物質を有効成分として含有することにより、新規な作用機序に基づいて、神経芽腫や膠芽腫の治療に有効に用いることができる。また、YB-1遺伝子の発現もしくはYB-1の産生量、又はこれらへの影響を指標として測定することにより、神経芽腫及び／又は膠芽腫、及びこれらのリスクファクターを診断することができ、神経芽腫及び／又は膠芽腫の予防薬もしくは治療薬の有効成分に係る物質をスクリーニングすることができる。
【解決手段】本発明の薬剤は、YB-1遺伝子及び／又はYB-1たんぱく質の機能を阻害する物質を有効成分として含有することにより、新規な作用機序に基づいて、神経芽腫や膠芽腫の治療に有効に用いることができる。また、YB-1遺伝子の発現もしくはYB-1の産生量、又はこれらへの影響を指標として測定することにより、神経芽腫及び／又は膠芽腫、及びこれらのリスクファクターを診断することができ、神経芽腫及び／又は膠芽腫の予防薬もしくは治療薬の有効成分に係る物質をスクリーニングすることができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経芽腫及び／又は膠芽腫の治療薬、神経芽腫及び／又は膠芽腫の診断剤及び診断キット、神経芽腫及び／又は膠芽腫のリスクファクター診断剤及び診断キット、神経芽腫及び／又は膠芽腫の治療薬もしくは予防薬の有効成分に係る物質のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
神経内分泌腫瘍である神経芽腫は、小児期においてもっとも発生頻度の高い頭蓋外固形がんであり、幼児期ではもっとも多く発生するがんである。これは、白血病、中枢神経系腫瘍、そしてリンパ腫に続いて４番目に多い小児期の悪性腫瘍である。神経芽腫は、小児におけるがん死の３大原因のひとつであり、乳児におけるがん死の最大原因である。アメリカ合衆国においては、１年あたり約６５０の神経芽腫の新規症例が発生する。神経芽腫の症例のうち、およそ５０％が、２歳未満の小児に生じる。予後不良な神経芽腫の特性として、N-myc遺伝子が増幅することが知られている（非特許文献１、２、３）。
【０００３】
いっぽう、悪性の神経膠腫は、成人においてもっとも多い脳腫瘍である。多発性膠芽種（ＧＢＭ）は、もっとも発生頻度が高く、もっとも致死的で、そしてもっとも悪性な型の神経膠腫であり、ヒトのがんの中でもっとも高い致死率を示すもののひとつである。テモゾロミド、カルボプラチン、そしてシスプラチンのような化学療法は穏やかな効果しかもたらさないため、悪性神経膠腫を治療するための別の手段として、効果的な分子標的療法の開発が求められている。分子標的療法としては、たとえば、上皮細胞増殖因子受容体（EGFR）、EGFRvIII、HER2、bcr-abl、血管内皮増殖因子（VEGF）、哺乳類ラパマイシンターゲット、血小板由来増殖因子、及びヒストン脱アセチル化酵素を標的とするものなどが試みられている。
【０００４】
高度に増殖性の胚性細胞である神経芽細胞や膠芽細胞の再出現が、神経芽腫や膠芽腫を導く。このことは、これらの細胞において、本来は生後又は成体齢で減少するか消失するはずのさまざまなたんぱく質が再出現することと関連している。たとえば、Yボックス結合たんぱく質１（YB-1）の再出現は膠芽腫と関連している（非特許文献４）。
【０００５】
Yボックス結合たんぱく質１（YB-1）は、mRNA転写及び翻訳の調節因子として働くDNA/RNA結合たんぱく質である。YB-1は、転写機構の主要部である。われわれは、マウス及びヒトの中枢神経系発生の初期にYB-1が関わっていることを示してきた。YB-1はまた、卵巣癌や乳癌のようないくつかのヒト悪性腫瘍において多く発現している（非特許文献５、６）。しかしながら、神経芽腫とYB-1との関係はこれまでに報告されていない。また、YB-1を標的とした悪性腫瘍の分子標的治療法も確立されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Kohl NE, Kanda N, Schreck RR, et al. Transposition and amplification of oncogene-related sequences in human neuroblastomas. Cell 1983;35: 359-67.
【非特許文献２】Brodeur GM, Seeger RC, Schwab M, Varmus HE, Bishop JM. Amplification of N-myc in untreated human neuroblastomas correlates with advanced disease stage. Science (New York, NY 1984;224: 1121-4.
【非特許文献３】Seeger RC, Brodeur GM, Sather H, et al. Association of multiple copies of the N-myc oncogene with rapid progression of neuroblastomas. The New England journal of medicine 1985;313: 1111-6.
【非特許文献４】Faury D, Nantel A, Dunn SE, et al. Molecular profiling identifies prognostic subgroups of pediatric glioblastoma and shows increased YB-1 expression in tumors. J Clin Oncol 2007;25: 1196-208.
【非特許文献５】Kohno K, Uchiumi T, Niina I, et al. Transcription factors and drug resistance. Eur J Cancer 2005;41: 2577-86.
【非特許文献６】Yahata H, Kobayashi H, Kamura T, et al. Increased nuclear localization of transcription factor Yb-1 in acquired cisplatin-resistance ovarian cancer. J Cancer Res Clin Oncol 2002;128(11): 621-6.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、神経芽腫及び／又は膠芽腫の治療薬、神経芽腫及び／又は膠芽腫の診断剤及び診断キット、神経芽腫及び／又は膠芽腫のリスクファクター診断剤及び診断キット、神経芽腫及び／又は膠芽腫の治療薬もしくは予防薬の有効成分に係る物質のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、ヒト胎児脳において、胚性神経細胞及びグリア細胞中にはYB-1が検出されるが、健康な成人の脳からYB-1は検出されないことを発見し、さらに、神経芽腫や膠芽腫のような悪性腫瘍において、YB-1が再出現することを見いだした。本発明者らはさらに、予後不良な神経芽腫のマーカーとして知られるN-mycの発現とYB-1の発現との間に相関を初めて見いだした。これらの発見は、YB-1が神経芽腫や膠芽腫のような悪性腫瘍の診断及び治療のための新たな分子標的となることを示唆した。本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、YB-1のsiRNAの投与によって神経芽腫細胞中のYB-1が効果的に下方制御されること、YB-1の下方制御により、神経芽腫細胞の増殖が有意に抑制されること、YB-1下方制御による神経芽腫細胞の増殖抑制効果は、N-mycの下方制御に匹敵することを見いだし、さらに同様の効果が膠芽腫細胞においても示されることを見いだして、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は次の［１］〜［８］である。
［１］Ｙボックス結合たんぱく質１（YB-1）遺伝子及び／又はYB-1の機能を阻害する物質を有効成分として含有することを特徴とする、神経芽腫又は膠芽腫を治療するための薬剤。
［２］有効成分が、Ｙボックス結合たんぱく質１（YB-1）遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ、アンチセンス核酸、これらを発現するベクター、及びYB-1の中和抗体からなる群より選ばれるものであることを特徴とする、［１］に記載の薬剤。
［３］有効成分が、Ｙボックス結合たんぱく質１（YB-1）遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ又はこれを発現するベクターである、［１］又は［２］に記載の薬剤。
［４］Ｙボックス結合たんぱく質１（YB-1）遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡが、配列番号：１に示すものである、［１］〜［３］のいずれか一項に記載の薬剤。
［５］Ｙボックス結合たんぱく質１（YB-1）遺伝子の発現量及び／又はYB-1の産生量を指標として測定する手段を含む、神経芽腫及び／又は膠芽腫の診断剤又は診断キット。
［６］YB-1遺伝子、YB-1を活性化もしくは不活性化する因子の遺伝子、及びそれらの制御領域からなる群より選ばれる１以上の領域における変異を測定する手段を含む、神経芽腫及び／又は膠芽腫のリスクファクター診断剤又は診断キット。
［７］神経芽腫及び／又は膠芽腫の予防薬又は治療薬に用いることのできる物質をスクリーニングする方法であって、
（１）被検物質を、YB-1遺伝子の転写制御領域及びYB-1遺伝子もしくはレポーター遺伝子を有する形質転換細胞又は試験管内発現系と接触させる工程、及び
（２）YB-1遺伝子もしくはレポーター遺伝子の発現量又はYB-1もしくはレポーターたんぱく質の産生量を検出して、YB-1遺伝子の発現又はYB-1の産生を抑制する物質を得る工程、
を含む方法。
［８］神経芽腫及び／又は膠芽腫の予防薬又は治療薬に用いることのできる物質をスクリーニングする方法であって、
（１）被検物質を、YB-1又はYB-1の標的分子と接触させる工程、及び
（２）被検物質と結合した又はしなかったYB-1又はYB-1の標的分子の量を検出して、YB-1の機能を抑制する物質を得る工程、
を含む方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の薬剤は、YB-1遺伝子及び／又はYB-1たんぱく質の機能を阻害する物質を有効成分として含有することにより、新規な作用機序に基づいて優れた抗腫瘍効果を示し、神経芽腫や膠芽腫のような悪性腫瘍の治療に有効に用いることができる。
【００１１】
また、本発明の診断剤及び診断キットは、YB-1遺伝子の発現量又はYB-1の産生量を指標として測定することにより、神経芽腫及び／又は膠芽腫を有効に診断することができる。
また、本発明のリスクファクター診断剤及び診断キットは、YB-1遺伝子、YB-1を活性化もしくは不活性化する因子の遺伝子、及びそれらの制御領域からなる群より選ばれる１以上の領域における変異を測定することにより、神経芽腫及び／又は膠芽腫のリスクファクターを有効に診断することができる。
【００１２】
さらに、本発明のスクリーニング方法は、合成もしくは遺伝子組換え技術により得られた物質、天然由来の物質又はそれらの誘導体である物質が、YB-1遺伝子の発現及び／又はYB-1の産生もしくは機能を抑制するか否かを指標とすることにより、神経芽腫及び／又は膠芽腫の治療薬もしくは予防薬の有効成分に係る物質を、効果的にスクリーニングすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、神経芽腫細胞株におけるYB-1及びN-mycの発現を示す。
【図２】図２は、Kelly 神経芽腫細胞株におけるYB-1下方制御による細胞増殖抑制効果を示す。
【図３】図３は、膠芽腫細胞株におけるYB-1の発現を示す。
【図４】図４は、T98G細胞株における、たんぱく質レベル及びmRNAレベルでのYB-1の下方制御を示す。
【図５】図５は、T98G細胞株の細胞増殖に対するYB-1下方制御の影響を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明の実施の形態について、詳細に説明する。
神経芽腫又は膠芽腫を治療するための薬剤
本発明の薬剤は、YB-1遺伝子及び／又はYB-1の機能を阻害する物質を有効成分として含有することにより、新規な作用機序に基づいて優れた抗腫瘍効果を示し、なかでも神経芽腫や神経膠腫に対して優れた抗腫瘍効果を示し、神経芽腫や膠芽腫に対してもっとも優れた抗腫瘍効果を示す。
【００１５】
神経芽腫は神経芽細胞腫とも呼ばれ、神経芽細胞に由来する悪性腫瘍をいう。また、神経膠腫は、神経膠細胞（グリア細胞ともいう）由来の悪性腫瘍をいい、毛様細胞性星状細胞腫（WHOグレードI）、高分化星状細胞腫（WHOグレードII）、未分化星状細胞腫（WHOグレードIII）、多型性膠芽腫（WHOグレードIV）等の星状細胞腫、上衣細胞腫、稀突起膠腫、oligoastrocytoma等の混合性神経膠腫が含まれるが、これらに限定されない。
Ｙボックス結合たんぱく質１（YB-1）遺伝子及び／又はYB-1の機能を阻害する物質
本発明の薬剤はYボックス結合たんぱく質１（YB-1）遺伝子及び／又はYB-1の機能を阻害する物質を有効成分として含有する。
【００１６】
YB-1遺伝子の機能を阻害する方法は、YB-1遺伝子のmRNAへの転写を抑制する方法であってもよいし、転写後のmRNAを切断又は破壊するなどしてYB-1たんぱく質の翻訳を抑制する方法であってもよい。YB-1遺伝子の機能を阻害する方法に用いることのできる物質の例としては、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス核酸、及びこれらのｓｉＲＮＡ又はアンチセンス核酸を発現するベクターなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１７】
また、YB-1の機能を阻害する方法は、YB-1に結合する方法や、YB-1を破壊する方法などが挙げられる。YB-1の機能を阻害する方法に用いることのできる物質の例としては、YB-1の中和抗体があるが、これに限定されない。
【００１８】
上記の物質について、以下にさらに詳しく説明する。
ｓｉＲＮＡ
遺伝子特異的な転写後抑制方法として、small interfering RNA（ｓｉＲＮＡ）を用いた方法がある。これは、標的遺伝子のmRNAと相同な配列からなるセンスRNAとこれと相補的な配列からなるアンチセンスRNAとからなる短鎖二本鎖RNAを細胞等に導入することにより、標的遺伝子mRNAに特異的かつ選択的に結合して破壊を誘導し、当該標的遺伝子を切断することにより、標的遺伝子の発現を効率よく阻害し、抑制する方法である。
【００１９】
本発明で用いるｓｉＲＮＡは、YB-1をコードする遺伝子を標的とするものであれば特に限定されるものではないが、１５〜３０塩基長程度のものが好ましく、１８〜２３塩基長程度のものがさらに好ましい。当業者は、たとえば配列番号：７で表されるヒトYB-1遺伝子配列をもとに、任意の領域を標的候補として、本発明で用いるｓｉＲＮＡを設計することができる。具体的には、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６で表される配列を好ましい例として挙げることができる。配列番号：１で表される配列が最も好ましい。このように設計したｓｉＲＮＡは、当業者が通常用いる方法で適宜合成してもよいし、一般の受託合成サービスを利用して合成してもよい。
アンチセンス核酸
本明細書において核酸とは、RNA又はDNAを意味する。遺伝子特異的な転写後抑制方法として、アンチセンス核酸を用いる方法も知られている。これは、標的mRNAに対して相補的な配列をもつアンチセンス核酸を細胞等に導入することで、標的mRNAがたんぱく質に翻訳されることを阻害する方法である。
【００２０】
本発明で用いるアンチセンス核酸は、YB-1のmRNAを標的とするものであれば特に限定されるものではないが、５０塩基長以下であることが好ましく、２５塩基長以下であることがさらに好ましい。当業者は、たとえばヒトYB-1のmRNAの配列（配列番号：７）をもとに、任意の領域を適宜選択して、本発明で用いるアンチセンス核酸を作製することができる。本発明で用いるアンチセンス核酸は、YB-1のmRNAの標的配列と相補的な配列であることが好ましいが、遺伝子の発現を有効に抑制できる限りにおいて、完全に相補的でなくてもよく、好ましくは90%以上、最も好ましくは95%以上の相補性を有する。本発明で用いるアンチセンス核酸は、YB-1のmRNAの標的配列と相補的な領域に加え、任意の非相補的な領域を有してもよい。また、本発明で用いるアンチセンス核酸は、任意の修飾を施されたものであってよい。
発現ベクター
本発明は、Ｙボックス結合たんぱく質１（YB-1）遺伝子及び／又はYB-1の機能を阻害する物質として、上記ｓｉＲＮＡやアンチセンス核酸を発現するベクターを用いることもできる。本発明で使用する発現ベクターは、動物細胞を形質転換することができるかぎり、どのような起源のものであってもよく、たとえばアデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス等から適宜選択できる。
【００２１】
当業者はこれらのベクターを用いて、YB-1遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ又はアンチセンス核酸を発現させるためのベクターを適宜作製することができる。
中和抗体
本発明は、YB-1の機能を阻害する物質として、中和抗体を用いることもできる。本発明で用いる中和抗体は、YB-1に結合してその機能を阻害することができれば、どのようなものでもよく、たとえばモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体であってよい。また、完全な抗体のみならず、特定の抗原結合特性を保持している断片（Fab's）もまた、本発明の中和抗体に含まれる。
薬剤
本発明の薬剤は、Ｙボックス結合たんぱく質１（YB-1）遺伝子及び／又はYB-1の機能を阻害する物質をそのままの形態でもよく、又は薬学的に許容される添加剤を配合した医薬組成物の形態であってもよい。
【００２２】
本発明の薬剤は、薬理学的に許容される担体、希釈剤もしくは賦形剤等と共に、一般的な方法により目的に応じて製剤化できる。希釈剤、担体の例としては、水、エタノール、プロピレングリコール、グリセリン等の液体希釈剤、グルコース、シュークロース、デキストリン、シクロデキストリン、アラビアガム等固体希釈剤又は賦形剤を挙げることができる。また、製剤化において一般的に使用される乳化剤、緊張化剤（等張化剤）、緩衝剤、溶解補助剤、防腐剤、安定化剤、抗酸化剤等を適宜配合することもできる。
【００２３】
本発明の薬剤を含む医薬組成物は、Ｙボックス結合たんぱく質１（YB-1）遺伝子及び／又はYB-1の機能を阻害する物質と好ましくない相互作用を生じない限り、必要に応じて、他の薬剤を混合して、又は他の薬剤と併用して用いることができる。
【００２４】
本発明の薬剤を含む医薬組成物は、その形態は特に制限されるものではなく、例えば、粉末状、顆粒状、錠剤状などの固体状；溶液状、乳液状、分散液状等の液状；又はペースト状等の半固体状等の、任意の形態に調整することができる。経口製剤としては、散剤、顆粒剤、細粒剤、錠剤、丸剤、トローチ剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤、ハードカプセル剤を含む）、チュアブル剤、溶液剤などの剤形とすることができる。また、非経口製剤としては、注射剤、点滴剤、外用薬剤、吸入剤、又は座剤などの剤形とすることができる。
【００２５】
本発明の薬剤を含む医薬組成物は、有効成分であるＹボックス結合たんぱく質１（YB-1）遺伝子及び／又はYB-1の機能を阻害する物質を、好ましくは0.001〜95重量％、より好ましくは0.01〜95重量％、さらに好ましくは0.1〜95重量％で含有する形態として使用できる。
【００２６】
本発明の薬剤の投与量や投与形態は、対象、病態やその進行状況、投与経路、剤型その他の条件によって適宜選択すればよいが、たとえば本発明のｓｉＲＮＡの投与量は、通常、１日あたり０．００１−１００ｍｇ／ｋｇ体重であり、好ましくは１日あたり０．０１−１０ｍｇ／ｋｇである。
診断剤及び診断キット
YB-1遺伝子及び／又はYB-1は、その発現量が神経芽腫及び／又は膠芽腫において増加することが本発明者らにより明らかにされた。したがって、患者の生検試料を用いて、YB-1遺伝子及び／又はYB-1の発現量を測定することにより、神経芽腫及び／又は膠芽腫の増悪化の程度を知ることができる。
【００２７】
YB-1遺伝子の発現量を測定する場合は、例えば、患者の生検試料からRNAを抽出し、逆転写反応によってｃDNA合成を行い、それを鋳型にしたリアルタイムPCR法を用いて測定することができる。また、同様に調製したcDNAを鋳型にして、適当なプライマーを用いて、通常のPCR反応によりYB-1遺伝子断片を増幅し、ゲル電気泳動によってYB-1遺伝子断片に相当するバンドの濃さを判定する方法によっても、YB-1遺伝子の発現量を測定することができる。ほかにも、ノーザンハイブリダイゼーション法、ｃDNAアレイ法などをはじめRNA、DNAの定量法であればどのような方法もYB-1遺伝子の発現量の測定法として利用できる。
【００２８】
また、神経芽腫及び／又は膠芽腫に罹患した患者の生検試料を用いて、YB-1の濃度を測定することにより、神経芽腫及び／又は膠芽腫の増悪化の程度を知ることもできる。測定方法としては、例えば、YB-1に対する抗体を利用したELISA又はRIA法、HPLCやマススペクトロメトリーによる定量法などが利用できる。この際、YB-1は完全な形である必要はなく、測定可能であれば断片化したものでも良い。
【００２９】
本発明は上記の測定手段等を用いたYB-1遺伝子の発現量又はYB-1の産生量を測定する手段を含む神経芽腫及び／又は膠芽腫の診断剤又は診断キットを包含する。
リスクファクター診断剤及び診断キット
本発明によりYB-1遺伝子が神経芽腫及び／又は膠芽腫の診断マーカーとして用いうることが示された。したがって、YB-1遺伝子の発現量やYB-1産生量を増加させたり、YB-1を活性化させたりする遺伝子変異を検出することで、リスクファクターの診断が可能となる。また、YB-1遺伝子の発現量やYB-1産生量を減少させたり、YB-1を不活性化させたりする遺伝子変異を検出すれば、神経芽腫及び／又は膠芽腫のリスクが低い可能性がある。このような遺伝子変異が存在しうる領域としては、たとえばYB-1遺伝子の制御領域、YB-1を活性化または不活性化する因子の遺伝子及びその制御領域などが挙げられる。これらの遺伝子上の変異を知る方法としては、例えば、患者の血液サンプル等の生体試料から定法に従ってDNAを分離し、当業者が通常行う方法によってその塩基配列を決定し、正常な配列と比較することにより行うことができる。また、一旦変異と神経芽腫及び／又は膠芽腫の関係が明確になれば、その変異のみを検出するDNAチップ法、SNP解析などにより、神経芽腫及び／又は膠芽腫のリスクファクター診断を行うことができる。検出する遺伝子は単数でも複数でもよい。
【００３０】
本発明は上記の解析手段等を用いた、YB-1遺伝子、YB-1を活性化もしくは不活性化する因子の遺伝子、及びそれらの制御領域からなる群より選ばれる１以上の領域における変異を測定する手段を含む、神経芽腫及び／又は膠芽腫のリスクファクター診断剤又は診断キットを包含する。
スクリーニング方法
本願発明に係る薬剤の有効成分として用いうる物質のスクリーニング法としては、例えばYB-1遺伝子の発現抑制機能を指標とする方法や、YB-1の機能抑制効果を指標とする方法などが挙げられる。
【００３１】
YB-1遺伝子の発現抑制機能を指標とする方法では、たとえば、（１）被検物質を、YB-1遺伝子の転写制御領域及びYB-1遺伝子もしくはレポーター遺伝子を有する形質転換細胞又は試験管内発現系と接触させ、及び（２）YB-1遺伝子もしくはレポーター遺伝子の発現量又はYB-1もしくはレポーターたんぱく質の産生量を検出することにより、YB-1遺伝子の発現又はYB-1の産生を抑制する物質を得ることができる。
【００３２】
YB-1の機能抑制効果を指標とする方法では、たとえば、（１）被検物質を、YB-1又はYB-1の標的分子と接触させ、及び（２）被検物質と結合した又はしなかったYB-1又はYB-1の標的分子の量を検出することにより、YB-1の機能を抑制する物質を得ることができる。
【００３３】
ここで、被検物質は合成もしくは遺伝子組み換え技術によって得られた物質であってもよく、天然由来の物質であってもよく、これらの誘導体であってもよい。
本発明のスクリーニング方法に用いるYB-1遺伝子若しくはYB-1又はそれらの誘導体は、何れの種由来のものであってもよく、例えばヒトYB-1遺伝子（アクセッション番号：NM_004559、配列番号：７）及びその翻訳産物（配列番号：８）、ラットYB-1遺伝子（アクセッション番号：NM_031563.3、配列番号：９）及びその翻訳産物（配列番号：１０）、マウスYB-1遺伝子（アクセッション番号：NM_011732.2、配列番号：１１）及びその翻訳産物（配列番号：１２）等哺乳動物由来のものが挙げられる。これらの中から、薬剤の投与対象や研究開発目的に応じて、適切なものを選択すればよい。
【００３４】
また、YB-1の標的分子としては、YB-1が相互作用する分子や、YB-1の発現が直接その発現量に影響を及ぼす分子であればどのようなものでもよく、低分子であっても、たんぱく質のような高分子であってもよい。
【００３５】
本発明のスクリーニング方法で用いる形質転換細胞は、原核細胞由来であっても、真核細胞由来であってもよく、たとえば大腸菌、酵母、昆虫細胞、哺乳類細胞等を用いることができる。
【００３６】
また、本発明のスクリーニング方法で用いる試験管内発現系は、無細胞でたんぱく質の発現または合成が可能な系であればどのようなものであってもよく、たとえばmRNAからのたんぱく質の試験管内翻訳に必要な試薬と、必要に応じて遺伝子からのmRNAの試験管内転写に必要な試薬を含む反応液であり、当業者は目的に応じて適切な系を選択することができる。
【００３７】
本発明のスクリーニング方法で用いるレポーター遺伝子としては、例えば、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)、β-ガラクトシダーゼ(β-Gal)、ルシフェラーゼ、緑色蛍光たんぱく質（GFP）などが利用できるが、これらに限定されない。
【００３８】
被検物質の添加によって変化するレポーターたんぱく質の量は、酵素活性として測定することもできるし、抗体などを用いて測定することもできる。
被検物質の添加によって変化するYB-1遺伝子もしくはレポーター遺伝子の発現量、及びYB-1もしくはYB-1の標的分子の産生量は、上述したRNA、DNA、たんぱく質の検出方法や定量方法によって測定することができる。
【００３９】
これらの方法を用いることにより、神経芽腫及び／又は膠芽腫の治療薬のみならず予防薬の有効成分もまたスクリーニングすることができる。
本発明を以下の実施例により、さらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００４０】
本実施例で用いた材料および方法を以下に示す。
細胞株及び試薬
IMR-32、SK-N-SH及びKelly神経芽腫細胞株、及びグレード４の膠芽腫に由来するT98G及びU251細胞株は、ATCC社から購入した。IMR-32、SK-N-SH細胞株は、それぞれMEM、DMEM中で培養し、そしてT98G、U251、Kelly細胞株はRPM1で培養した。すべての培地は１０％ＦＢＳと１％ペニシリン/ストレプトマイシンを含有した。
抗体
ウサギ抗YB-1抗体は、Cell Signaling Technology（デンバーズ、マサチューセッツ州、米国）から購入した。マウス抗N-Myc抗体（C-19）はSanta Cruz Biotechnology, Inc.（サンタクルーズ、カリフォルニア州、米国）から購入した。
免疫組織化学
In vitroにおけるYB-1の状態を評価するため、IMR-32、SK-N-SH及びKelly神経芽腫細胞株、及びT98G膠芽腫細胞株を、免疫組織化学によって評価した。細胞（１×１０５）をガラスのカバースリップ上に播種し、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄し、２％ホルムアルデヒドで２０分間固定し、PBSで２回洗浄し、その後、０．１％のサポニン（シグマ社製）を含有するPBSとともに３０分間インキュベートした。次に、このカバースリップをPBSで洗浄し、１０％ウシ血清アルブミン及び２％ヤギ血清を含有する緩衝液中に溶解したウサギ抗YB-1抗体及びマウス抗N-myc抗体（C-19）とともに、加湿容器中、室温で１時間インキュベートした。PBSで３回洗浄後、スライドガラスをAlexa 488抗ウサギ抗体及びAlexa546抗マウス抗体とともに１時間インキュベートし、３回洗浄し、その後VECTASHIELD（登録商標） mounting medium（Vector Laboratories, カリフォルニア州, 米国）を用いてマウントした。核の染色には、4,6-ジアミジノ-2-フェニルインドールを用いた。
siRNAを用いたYB-1又はN-mycの下方制御
代表的な神経芽腫細胞であるKelly及び代表的な膠芽腫細胞株であるT98Gを、50 nMのYB-1 siRNA又はコントロールsiRNAで形質転換した。Kelly細胞株はまた、N-myc下方制御の研究のため、N-myc siRNA又はコントロールsiRNA（AllStars Neg. Control siRNA）で形質転換した。すべてのsiRNAはQiagenから購入した。メーカー（インビトロジェン）の指示するプロトコルにしたがって、Lipofectamin（商標） RNAiMAXを、siRNAトランスフェクションに用いた。
増殖アッセイ
YB-1 siRNA、N-myc siRNA、及びコントロールsiRNAで処理した細胞をトリプシン処理し、２４ウェルディッシュに再度播種した。ベクトンコールターカウンターを用いて、0時間、24時間、48時間、72時間の細胞数をカウントすることにより、増殖アッセイを行った。
【実施例１】
【００４１】
《神経芽腫におけるYB-1ターゲティング》
神経芽腫細胞におけるYB-1及びN-mycの発現解析
図１に示すように、N-mycが増幅しているIMR-32及びKelly細胞株は、著しく多いYB-1の発現を示した。多数の細胞で、細胞質におけるYB-1の発現は、核におけるN-mycの集積と関連していた。
【００４２】
N-mycとYB-1の共発現は、神経芽細胞腫患者においてin vivoでも観察された（データは省略する）。In vivo 及びin vitroの両方においてYB-1とN-mycの発現が相関しており、YB-1がN-mycと同様に評価されることから、YB-1が予後マーカーとしても見なせることが示唆される。
神経芽腫細胞株におけるYB-1の下方制御
次に、神経芽腫細胞株の増殖に対するYB-1の下方制御の影響を評価するために、YB-1 siRNAを用いて、Kelly 神経芽腫細胞株中のYB-1の発現を抑制した。ここでは、N-mycによる下方制御による細胞増殖抑制効果と、YB-1下方制御による細胞増殖抑制効果を比較して評価した。その結果を図２に示す。
【００４３】
YB-1の下方制御は、細胞増殖を有意に抑制した。YB-1の下方制御及びN-mycの下方制御はともに、N-mycを増幅する神経芽腫細胞であるKellyの増殖を抑制した。興味深いことに、YB-1の増殖抑制効果は、N-mycに匹敵した。
【実施例２】
【００４４】
《膠芽腫におけるYB-1ターゲティング》
膠芽腫細胞株におけるYB-1の発現解析
WHOグレード４の多形性膠芽腫に由来するT98G及びU251細胞株におけるYB-1の発現を、免疫ブロット法及び免疫組織化学の両方で評価した。図３に示すように、両方の細胞でYB-1は高度に発現していた。
膠芽腫細胞株におけるYB-1の下方制御
T98G細胞株において、YB-1を下方制御した。YB-1の下方制御は、免疫ブロット法及びmRNA発現についてのリアルタイムPCRによって確認した。図４に示すように、コントロールsiRNAで形質転換した場合にくらべて、50 nMのYB-1 siRNAを用いた場合、YB-1の発現は有意に下方制御された。
細胞増殖に対するYB-1下方制御の影響
YB-1を下方制御することによる細胞増殖への影響を評価するために、YB-1 siRNAによって下方制御された細胞の増殖率を評価した。まず、T98G細胞をYB-1 siRNAによって形質転換した。YB-1 siRNAによって下方制御された細胞の増殖率を、コントロールsiRNAで形質転換した細胞と比較した。その結果、図５に示すように、YB-1の下方制御は、T98G細胞の細胞増殖を有意に減少させた。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
本発明の薬剤は、YB-1遺伝子及び／又はYB-1たんぱく質の機能を阻害する物質を有効成分として含有することにより、新規な作用機序に基づいて優れた抗腫瘍効果を示し、神経芽腫や膠芽腫のような悪性腫瘍の治療に有効に用いることができる。
【００４６】
また、本発明の診断剤及び診断キットは、YB-1遺伝子の発現量又はYB-1の産生量を指標として測定することにより、神経芽腫及び／又は膠芽腫を有効に診断することができる。
また、本発明のリスクファクター診断剤及び診断キットは、YB-1遺伝子、YB-1を活性化もしくは不活性化する因子の遺伝子、及びそれらの制御領域からなる群より選ばれる１以上の領域における変異を測定することにより、神経芽腫及び／又は膠芽腫のリスクファクターを有効に診断することができる。
【００４７】
さらに、本発明のスクリーニング方法は、合成もしくは遺伝子組換え技術により得られた物質、天然由来の物質又はそれらの誘導体である物質が、YB-1遺伝子の発現及び／又はYB-1の産生もしくは機能を抑制するか否かを指標とすることにより、神経芽腫及び／又は膠芽腫の治療薬もしくは予防薬の有効成分に係る物質を、効果的にスクリーニングすることができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経芽腫及び／又は膠芽腫の治療薬、神経芽腫及び／又は膠芽腫の診断剤及び診断キット、神経芽腫及び／又は膠芽腫のリスクファクター診断剤及び診断キット、神経芽腫及び／又は膠芽腫の治療薬もしくは予防薬の有効成分に係る物質のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
神経内分泌腫瘍である神経芽腫は、小児期においてもっとも発生頻度の高い頭蓋外固形がんであり、幼児期ではもっとも多く発生するがんである。これは、白血病、中枢神経系腫瘍、そしてリンパ腫に続いて４番目に多い小児期の悪性腫瘍である。神経芽腫は、小児におけるがん死の３大原因のひとつであり、乳児におけるがん死の最大原因である。アメリカ合衆国においては、１年あたり約６５０の神経芽腫の新規症例が発生する。神経芽腫の症例のうち、およそ５０％が、２歳未満の小児に生じる。予後不良な神経芽腫の特性として、N-myc遺伝子が増幅することが知られている（非特許文献１、２、３）。
【０００３】
いっぽう、悪性の神経膠腫は、成人においてもっとも多い脳腫瘍である。多発性膠芽種（ＧＢＭ）は、もっとも発生頻度が高く、もっとも致死的で、そしてもっとも悪性な型の神経膠腫であり、ヒトのがんの中でもっとも高い致死率を示すもののひとつである。テモゾロミド、カルボプラチン、そしてシスプラチンのような化学療法は穏やかな効果しかもたらさないため、悪性神経膠腫を治療するための別の手段として、効果的な分子標的療法の開発が求められている。分子標的療法としては、たとえば、上皮細胞増殖因子受容体（EGFR）、EGFRvIII、HER2、bcr-abl、血管内皮増殖因子（VEGF）、哺乳類ラパマイシンターゲット、血小板由来増殖因子、及びヒストン脱アセチル化酵素を標的とするものなどが試みられている。
【０００４】
高度に増殖性の胚性細胞である神経芽細胞や膠芽細胞の再出現が、神経芽腫や膠芽腫を導く。このことは、これらの細胞において、本来は生後又は成体齢で減少するか消失するはずのさまざまなたんぱく質が再出現することと関連している。たとえば、Yボックス結合たんぱく質１（YB-1）の再出現は膠芽腫と関連している（非特許文献４）。
【０００５】
Yボックス結合たんぱく質１（YB-1）は、mRNA転写及び翻訳の調節因子として働くDNA/RNA結合たんぱく質である。YB-1は、転写機構の主要部である。われわれは、マウス及びヒトの中枢神経系発生の初期にYB-1が関わっていることを示してきた。YB-1はまた、卵巣癌や乳癌のようないくつかのヒト悪性腫瘍において多く発現している（非特許文献５、６）。しかしながら、神経芽腫とYB-1との関係はこれまでに報告されていない。また、YB-1を標的とした悪性腫瘍の分子標的治療法も確立されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Kohl NE, Kanda N, Schreck RR, et al. Transposition and amplification of oncogene-related sequences in human neuroblastomas. Cell 1983;35: 359-67.
【非特許文献２】Brodeur GM, Seeger RC, Schwab M, Varmus HE, Bishop JM. Amplification of N-myc in untreated human neuroblastomas correlates with advanced disease stage. Science (New York, NY 1984;224: 1121-4.
【非特許文献３】Seeger RC, Brodeur GM, Sather H, et al. Association of multiple copies of the N-myc oncogene with rapid progression of neuroblastomas. The New England journal of medicine 1985;313: 1111-6.
【非特許文献４】Faury D, Nantel A, Dunn SE, et al. Molecular profiling identifies prognostic subgroups of pediatric glioblastoma and shows increased YB-1 expression in tumors. J Clin Oncol 2007;25: 1196-208.
【非特許文献５】Kohno K, Uchiumi T, Niina I, et al. Transcription factors and drug resistance. Eur J Cancer 2005;41: 2577-86.
【非特許文献６】Yahata H, Kobayashi H, Kamura T, et al. Increased nuclear localization of transcription factor Yb-1 in acquired cisplatin-resistance ovarian cancer. J Cancer Res Clin Oncol 2002;128(11): 621-6.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、神経芽腫及び／又は膠芽腫の治療薬、神経芽腫及び／又は膠芽腫の診断剤及び診断キット、神経芽腫及び／又は膠芽腫のリスクファクター診断剤及び診断キット、神経芽腫及び／又は膠芽腫の治療薬もしくは予防薬の有効成分に係る物質のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、ヒト胎児脳において、胚性神経細胞及びグリア細胞中にはYB-1が検出されるが、健康な成人の脳からYB-1は検出されないことを発見し、さらに、神経芽腫や膠芽腫のような悪性腫瘍において、YB-1が再出現することを見いだした。本発明者らはさらに、予後不良な神経芽腫のマーカーとして知られるN-mycの発現とYB-1の発現との間に相関を初めて見いだした。これらの発見は、YB-1が神経芽腫や膠芽腫のような悪性腫瘍の診断及び治療のための新たな分子標的となることを示唆した。本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、YB-1のsiRNAの投与によって神経芽腫細胞中のYB-1が効果的に下方制御されること、YB-1の下方制御により、神経芽腫細胞の増殖が有意に抑制されること、YB-1下方制御による神経芽腫細胞の増殖抑制効果は、N-mycの下方制御に匹敵することを見いだし、さらに同様の効果が膠芽腫細胞においても示されることを見いだして、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は次の［１］〜［８］である。
［１］Ｙボックス結合たんぱく質１（YB-1）遺伝子及び／又はYB-1の機能を阻害する物質を有効成分として含有することを特徴とする、神経芽腫又は膠芽腫を治療するための薬剤。
［２］有効成分が、Ｙボックス結合たんぱく質１（YB-1）遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ、アンチセンス核酸、これらを発現するベクター、及びYB-1の中和抗体からなる群より選ばれるものであることを特徴とする、［１］に記載の薬剤。
［３］有効成分が、Ｙボックス結合たんぱく質１（YB-1）遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ又はこれを発現するベクターである、［１］又は［２］に記載の薬剤。
［４］Ｙボックス結合たんぱく質１（YB-1）遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡが、配列番号：１に示すものである、［１］〜［３］のいずれか一項に記載の薬剤。
［５］Ｙボックス結合たんぱく質１（YB-1）遺伝子の発現量及び／又はYB-1の産生量を指標として測定する手段を含む、神経芽腫及び／又は膠芽腫の診断剤又は診断キット。
［６］YB-1遺伝子、YB-1を活性化もしくは不活性化する因子の遺伝子、及びそれらの制御領域からなる群より選ばれる１以上の領域における変異を測定する手段を含む、神経芽腫及び／又は膠芽腫のリスクファクター診断剤又は診断キット。
［７］神経芽腫及び／又は膠芽腫の予防薬又は治療薬に用いることのできる物質をスクリーニングする方法であって、
（１）被検物質を、YB-1遺伝子の転写制御領域及びYB-1遺伝子もしくはレポーター遺伝子を有する形質転換細胞又は試験管内発現系と接触させる工程、及び
（２）YB-1遺伝子もしくはレポーター遺伝子の発現量又はYB-1もしくはレポーターたんぱく質の産生量を検出して、YB-1遺伝子の発現又はYB-1の産生を抑制する物質を得る工程、
を含む方法。
［８］神経芽腫及び／又は膠芽腫の予防薬又は治療薬に用いることのできる物質をスクリーニングする方法であって、
（１）被検物質を、YB-1又はYB-1の標的分子と接触させる工程、及び
（２）被検物質と結合した又はしなかったYB-1又はYB-1の標的分子の量を検出して、YB-1の機能を抑制する物質を得る工程、
を含む方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の薬剤は、YB-1遺伝子及び／又はYB-1たんぱく質の機能を阻害する物質を有効成分として含有することにより、新規な作用機序に基づいて優れた抗腫瘍効果を示し、神経芽腫や膠芽腫のような悪性腫瘍の治療に有効に用いることができる。
【００１１】
また、本発明の診断剤及び診断キットは、YB-1遺伝子の発現量又はYB-1の産生量を指標として測定することにより、神経芽腫及び／又は膠芽腫を有効に診断することができる。
また、本発明のリスクファクター診断剤及び診断キットは、YB-1遺伝子、YB-1を活性化もしくは不活性化する因子の遺伝子、及びそれらの制御領域からなる群より選ばれる１以上の領域における変異を測定することにより、神経芽腫及び／又は膠芽腫のリスクファクターを有効に診断することができる。
【００１２】
さらに、本発明のスクリーニング方法は、合成もしくは遺伝子組換え技術により得られた物質、天然由来の物質又はそれらの誘導体である物質が、YB-1遺伝子の発現及び／又はYB-1の産生もしくは機能を抑制するか否かを指標とすることにより、神経芽腫及び／又は膠芽腫の治療薬もしくは予防薬の有効成分に係る物質を、効果的にスクリーニングすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、神経芽腫細胞株におけるYB-1及びN-mycの発現を示す。
【図２】図２は、Kelly 神経芽腫細胞株におけるYB-1下方制御による細胞増殖抑制効果を示す。
【図３】図３は、膠芽腫細胞株におけるYB-1の発現を示す。
【図４】図４は、T98G細胞株における、たんぱく質レベル及びmRNAレベルでのYB-1の下方制御を示す。
【図５】図５は、T98G細胞株の細胞増殖に対するYB-1下方制御の影響を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明の実施の形態について、詳細に説明する。
神経芽腫又は膠芽腫を治療するための薬剤
本発明の薬剤は、YB-1遺伝子及び／又はYB-1の機能を阻害する物質を有効成分として含有することにより、新規な作用機序に基づいて優れた抗腫瘍効果を示し、なかでも神経芽腫や神経膠腫に対して優れた抗腫瘍効果を示し、神経芽腫や膠芽腫に対してもっとも優れた抗腫瘍効果を示す。
【００１５】
神経芽腫は神経芽細胞腫とも呼ばれ、神経芽細胞に由来する悪性腫瘍をいう。また、神経膠腫は、神経膠細胞（グリア細胞ともいう）由来の悪性腫瘍をいい、毛様細胞性星状細胞腫（WHOグレードI）、高分化星状細胞腫（WHOグレードII）、未分化星状細胞腫（WHOグレードIII）、多型性膠芽腫（WHOグレードIV）等の星状細胞腫、上衣細胞腫、稀突起膠腫、oligoastrocytoma等の混合性神経膠腫が含まれるが、これらに限定されない。
Ｙボックス結合たんぱく質１（YB-1）遺伝子及び／又はYB-1の機能を阻害する物質
本発明の薬剤はYボックス結合たんぱく質１（YB-1）遺伝子及び／又はYB-1の機能を阻害する物質を有効成分として含有する。
【００１６】
YB-1遺伝子の機能を阻害する方法は、YB-1遺伝子のmRNAへの転写を抑制する方法であってもよいし、転写後のmRNAを切断又は破壊するなどしてYB-1たんぱく質の翻訳を抑制する方法であってもよい。YB-1遺伝子の機能を阻害する方法に用いることのできる物質の例としては、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス核酸、及びこれらのｓｉＲＮＡ又はアンチセンス核酸を発現するベクターなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１７】
また、YB-1の機能を阻害する方法は、YB-1に結合する方法や、YB-1を破壊する方法などが挙げられる。YB-1の機能を阻害する方法に用いることのできる物質の例としては、YB-1の中和抗体があるが、これに限定されない。
【００１８】
上記の物質について、以下にさらに詳しく説明する。
ｓｉＲＮＡ
遺伝子特異的な転写後抑制方法として、small interfering RNA（ｓｉＲＮＡ）を用いた方法がある。これは、標的遺伝子のmRNAと相同な配列からなるセンスRNAとこれと相補的な配列からなるアンチセンスRNAとからなる短鎖二本鎖RNAを細胞等に導入することにより、標的遺伝子mRNAに特異的かつ選択的に結合して破壊を誘導し、当該標的遺伝子を切断することにより、標的遺伝子の発現を効率よく阻害し、抑制する方法である。
【００１９】
本発明で用いるｓｉＲＮＡは、YB-1をコードする遺伝子を標的とするものであれば特に限定されるものではないが、１５〜３０塩基長程度のものが好ましく、１８〜２３塩基長程度のものがさらに好ましい。当業者は、たとえば配列番号：７で表されるヒトYB-1遺伝子配列をもとに、任意の領域を標的候補として、本発明で用いるｓｉＲＮＡを設計することができる。具体的には、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６で表される配列を好ましい例として挙げることができる。配列番号：１で表される配列が最も好ましい。このように設計したｓｉＲＮＡは、当業者が通常用いる方法で適宜合成してもよいし、一般の受託合成サービスを利用して合成してもよい。
アンチセンス核酸
本明細書において核酸とは、RNA又はDNAを意味する。遺伝子特異的な転写後抑制方法として、アンチセンス核酸を用いる方法も知られている。これは、標的mRNAに対して相補的な配列をもつアンチセンス核酸を細胞等に導入することで、標的mRNAがたんぱく質に翻訳されることを阻害する方法である。
【００２０】
本発明で用いるアンチセンス核酸は、YB-1のmRNAを標的とするものであれば特に限定されるものではないが、５０塩基長以下であることが好ましく、２５塩基長以下であることがさらに好ましい。当業者は、たとえばヒトYB-1のmRNAの配列（配列番号：７）をもとに、任意の領域を適宜選択して、本発明で用いるアンチセンス核酸を作製することができる。本発明で用いるアンチセンス核酸は、YB-1のmRNAの標的配列と相補的な配列であることが好ましいが、遺伝子の発現を有効に抑制できる限りにおいて、完全に相補的でなくてもよく、好ましくは90%以上、最も好ましくは95%以上の相補性を有する。本発明で用いるアンチセンス核酸は、YB-1のmRNAの標的配列と相補的な領域に加え、任意の非相補的な領域を有してもよい。また、本発明で用いるアンチセンス核酸は、任意の修飾を施されたものであってよい。
発現ベクター
本発明は、Ｙボックス結合たんぱく質１（YB-1）遺伝子及び／又はYB-1の機能を阻害する物質として、上記ｓｉＲＮＡやアンチセンス核酸を発現するベクターを用いることもできる。本発明で使用する発現ベクターは、動物細胞を形質転換することができるかぎり、どのような起源のものであってもよく、たとえばアデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス等から適宜選択できる。
【００２１】
当業者はこれらのベクターを用いて、YB-1遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ又はアンチセンス核酸を発現させるためのベクターを適宜作製することができる。
中和抗体
本発明は、YB-1の機能を阻害する物質として、中和抗体を用いることもできる。本発明で用いる中和抗体は、YB-1に結合してその機能を阻害することができれば、どのようなものでもよく、たとえばモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体であってよい。また、完全な抗体のみならず、特定の抗原結合特性を保持している断片（Fab's）もまた、本発明の中和抗体に含まれる。
薬剤
本発明の薬剤は、Ｙボックス結合たんぱく質１（YB-1）遺伝子及び／又はYB-1の機能を阻害する物質をそのままの形態でもよく、又は薬学的に許容される添加剤を配合した医薬組成物の形態であってもよい。
【００２２】
本発明の薬剤は、薬理学的に許容される担体、希釈剤もしくは賦形剤等と共に、一般的な方法により目的に応じて製剤化できる。希釈剤、担体の例としては、水、エタノール、プロピレングリコール、グリセリン等の液体希釈剤、グルコース、シュークロース、デキストリン、シクロデキストリン、アラビアガム等固体希釈剤又は賦形剤を挙げることができる。また、製剤化において一般的に使用される乳化剤、緊張化剤（等張化剤）、緩衝剤、溶解補助剤、防腐剤、安定化剤、抗酸化剤等を適宜配合することもできる。
【００２３】
本発明の薬剤を含む医薬組成物は、Ｙボックス結合たんぱく質１（YB-1）遺伝子及び／又はYB-1の機能を阻害する物質と好ましくない相互作用を生じない限り、必要に応じて、他の薬剤を混合して、又は他の薬剤と併用して用いることができる。
【００２４】
本発明の薬剤を含む医薬組成物は、その形態は特に制限されるものではなく、例えば、粉末状、顆粒状、錠剤状などの固体状；溶液状、乳液状、分散液状等の液状；又はペースト状等の半固体状等の、任意の形態に調整することができる。経口製剤としては、散剤、顆粒剤、細粒剤、錠剤、丸剤、トローチ剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤、ハードカプセル剤を含む）、チュアブル剤、溶液剤などの剤形とすることができる。また、非経口製剤としては、注射剤、点滴剤、外用薬剤、吸入剤、又は座剤などの剤形とすることができる。
【００２５】
本発明の薬剤を含む医薬組成物は、有効成分であるＹボックス結合たんぱく質１（YB-1）遺伝子及び／又はYB-1の機能を阻害する物質を、好ましくは0.001〜95重量％、より好ましくは0.01〜95重量％、さらに好ましくは0.1〜95重量％で含有する形態として使用できる。
【００２６】
本発明の薬剤の投与量や投与形態は、対象、病態やその進行状況、投与経路、剤型その他の条件によって適宜選択すればよいが、たとえば本発明のｓｉＲＮＡの投与量は、通常、１日あたり０．００１−１００ｍｇ／ｋｇ体重であり、好ましくは１日あたり０．０１−１０ｍｇ／ｋｇである。
診断剤及び診断キット
YB-1遺伝子及び／又はYB-1は、その発現量が神経芽腫及び／又は膠芽腫において増加することが本発明者らにより明らかにされた。したがって、患者の生検試料を用いて、YB-1遺伝子及び／又はYB-1の発現量を測定することにより、神経芽腫及び／又は膠芽腫の増悪化の程度を知ることができる。
【００２７】
YB-1遺伝子の発現量を測定する場合は、例えば、患者の生検試料からRNAを抽出し、逆転写反応によってｃDNA合成を行い、それを鋳型にしたリアルタイムPCR法を用いて測定することができる。また、同様に調製したcDNAを鋳型にして、適当なプライマーを用いて、通常のPCR反応によりYB-1遺伝子断片を増幅し、ゲル電気泳動によってYB-1遺伝子断片に相当するバンドの濃さを判定する方法によっても、YB-1遺伝子の発現量を測定することができる。ほかにも、ノーザンハイブリダイゼーション法、ｃDNAアレイ法などをはじめRNA、DNAの定量法であればどのような方法もYB-1遺伝子の発現量の測定法として利用できる。
【００２８】
また、神経芽腫及び／又は膠芽腫に罹患した患者の生検試料を用いて、YB-1の濃度を測定することにより、神経芽腫及び／又は膠芽腫の増悪化の程度を知ることもできる。測定方法としては、例えば、YB-1に対する抗体を利用したELISA又はRIA法、HPLCやマススペクトロメトリーによる定量法などが利用できる。この際、YB-1は完全な形である必要はなく、測定可能であれば断片化したものでも良い。
【００２９】
本発明は上記の測定手段等を用いたYB-1遺伝子の発現量又はYB-1の産生量を測定する手段を含む神経芽腫及び／又は膠芽腫の診断剤又は診断キットを包含する。
リスクファクター診断剤及び診断キット
本発明によりYB-1遺伝子が神経芽腫及び／又は膠芽腫の診断マーカーとして用いうることが示された。したがって、YB-1遺伝子の発現量やYB-1産生量を増加させたり、YB-1を活性化させたりする遺伝子変異を検出することで、リスクファクターの診断が可能となる。また、YB-1遺伝子の発現量やYB-1産生量を減少させたり、YB-1を不活性化させたりする遺伝子変異を検出すれば、神経芽腫及び／又は膠芽腫のリスクが低い可能性がある。このような遺伝子変異が存在しうる領域としては、たとえばYB-1遺伝子の制御領域、YB-1を活性化または不活性化する因子の遺伝子及びその制御領域などが挙げられる。これらの遺伝子上の変異を知る方法としては、例えば、患者の血液サンプル等の生体試料から定法に従ってDNAを分離し、当業者が通常行う方法によってその塩基配列を決定し、正常な配列と比較することにより行うことができる。また、一旦変異と神経芽腫及び／又は膠芽腫の関係が明確になれば、その変異のみを検出するDNAチップ法、SNP解析などにより、神経芽腫及び／又は膠芽腫のリスクファクター診断を行うことができる。検出する遺伝子は単数でも複数でもよい。
【００３０】
本発明は上記の解析手段等を用いた、YB-1遺伝子、YB-1を活性化もしくは不活性化する因子の遺伝子、及びそれらの制御領域からなる群より選ばれる１以上の領域における変異を測定する手段を含む、神経芽腫及び／又は膠芽腫のリスクファクター診断剤又は診断キットを包含する。
スクリーニング方法
本願発明に係る薬剤の有効成分として用いうる物質のスクリーニング法としては、例えばYB-1遺伝子の発現抑制機能を指標とする方法や、YB-1の機能抑制効果を指標とする方法などが挙げられる。
【００３１】
YB-1遺伝子の発現抑制機能を指標とする方法では、たとえば、（１）被検物質を、YB-1遺伝子の転写制御領域及びYB-1遺伝子もしくはレポーター遺伝子を有する形質転換細胞又は試験管内発現系と接触させ、及び（２）YB-1遺伝子もしくはレポーター遺伝子の発現量又はYB-1もしくはレポーターたんぱく質の産生量を検出することにより、YB-1遺伝子の発現又はYB-1の産生を抑制する物質を得ることができる。
【００３２】
YB-1の機能抑制効果を指標とする方法では、たとえば、（１）被検物質を、YB-1又はYB-1の標的分子と接触させ、及び（２）被検物質と結合した又はしなかったYB-1又はYB-1の標的分子の量を検出することにより、YB-1の機能を抑制する物質を得ることができる。
【００３３】
ここで、被検物質は合成もしくは遺伝子組み換え技術によって得られた物質であってもよく、天然由来の物質であってもよく、これらの誘導体であってもよい。
本発明のスクリーニング方法に用いるYB-1遺伝子若しくはYB-1又はそれらの誘導体は、何れの種由来のものであってもよく、例えばヒトYB-1遺伝子（アクセッション番号：NM_004559、配列番号：７）及びその翻訳産物（配列番号：８）、ラットYB-1遺伝子（アクセッション番号：NM_031563.3、配列番号：９）及びその翻訳産物（配列番号：１０）、マウスYB-1遺伝子（アクセッション番号：NM_011732.2、配列番号：１１）及びその翻訳産物（配列番号：１２）等哺乳動物由来のものが挙げられる。これらの中から、薬剤の投与対象や研究開発目的に応じて、適切なものを選択すればよい。
【００３４】
また、YB-1の標的分子としては、YB-1が相互作用する分子や、YB-1の発現が直接その発現量に影響を及ぼす分子であればどのようなものでもよく、低分子であっても、たんぱく質のような高分子であってもよい。
【００３５】
本発明のスクリーニング方法で用いる形質転換細胞は、原核細胞由来であっても、真核細胞由来であってもよく、たとえば大腸菌、酵母、昆虫細胞、哺乳類細胞等を用いることができる。
【００３６】
また、本発明のスクリーニング方法で用いる試験管内発現系は、無細胞でたんぱく質の発現または合成が可能な系であればどのようなものであってもよく、たとえばmRNAからのたんぱく質の試験管内翻訳に必要な試薬と、必要に応じて遺伝子からのmRNAの試験管内転写に必要な試薬を含む反応液であり、当業者は目的に応じて適切な系を選択することができる。
【００３７】
本発明のスクリーニング方法で用いるレポーター遺伝子としては、例えば、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)、β-ガラクトシダーゼ(β-Gal)、ルシフェラーゼ、緑色蛍光たんぱく質（GFP）などが利用できるが、これらに限定されない。
【００３８】
被検物質の添加によって変化するレポーターたんぱく質の量は、酵素活性として測定することもできるし、抗体などを用いて測定することもできる。
被検物質の添加によって変化するYB-1遺伝子もしくはレポーター遺伝子の発現量、及びYB-1もしくはYB-1の標的分子の産生量は、上述したRNA、DNA、たんぱく質の検出方法や定量方法によって測定することができる。
【００３９】
これらの方法を用いることにより、神経芽腫及び／又は膠芽腫の治療薬のみならず予防薬の有効成分もまたスクリーニングすることができる。
本発明を以下の実施例により、さらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００４０】
本実施例で用いた材料および方法を以下に示す。
細胞株及び試薬
IMR-32、SK-N-SH及びKelly神経芽腫細胞株、及びグレード４の膠芽腫に由来するT98G及びU251細胞株は、ATCC社から購入した。IMR-32、SK-N-SH細胞株は、それぞれMEM、DMEM中で培養し、そしてT98G、U251、Kelly細胞株はRPM1で培養した。すべての培地は１０％ＦＢＳと１％ペニシリン/ストレプトマイシンを含有した。
抗体
ウサギ抗YB-1抗体は、Cell Signaling Technology（デンバーズ、マサチューセッツ州、米国）から購入した。マウス抗N-Myc抗体（C-19）はSanta Cruz Biotechnology, Inc.（サンタクルーズ、カリフォルニア州、米国）から購入した。
免疫組織化学
In vitroにおけるYB-1の状態を評価するため、IMR-32、SK-N-SH及びKelly神経芽腫細胞株、及びT98G膠芽腫細胞株を、免疫組織化学によって評価した。細胞（１×１０５）をガラスのカバースリップ上に播種し、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄し、２％ホルムアルデヒドで２０分間固定し、PBSで２回洗浄し、その後、０．１％のサポニン（シグマ社製）を含有するPBSとともに３０分間インキュベートした。次に、このカバースリップをPBSで洗浄し、１０％ウシ血清アルブミン及び２％ヤギ血清を含有する緩衝液中に溶解したウサギ抗YB-1抗体及びマウス抗N-myc抗体（C-19）とともに、加湿容器中、室温で１時間インキュベートした。PBSで３回洗浄後、スライドガラスをAlexa 488抗ウサギ抗体及びAlexa546抗マウス抗体とともに１時間インキュベートし、３回洗浄し、その後VECTASHIELD（登録商標） mounting medium（Vector Laboratories, カリフォルニア州, 米国）を用いてマウントした。核の染色には、4,6-ジアミジノ-2-フェニルインドールを用いた。
siRNAを用いたYB-1又はN-mycの下方制御
代表的な神経芽腫細胞であるKelly及び代表的な膠芽腫細胞株であるT98Gを、50 nMのYB-1 siRNA又はコントロールsiRNAで形質転換した。Kelly細胞株はまた、N-myc下方制御の研究のため、N-myc siRNA又はコントロールsiRNA（AllStars Neg. Control siRNA）で形質転換した。すべてのsiRNAはQiagenから購入した。メーカー（インビトロジェン）の指示するプロトコルにしたがって、Lipofectamin（商標） RNAiMAXを、siRNAトランスフェクションに用いた。
増殖アッセイ
YB-1 siRNA、N-myc siRNA、及びコントロールsiRNAで処理した細胞をトリプシン処理し、２４ウェルディッシュに再度播種した。ベクトンコールターカウンターを用いて、0時間、24時間、48時間、72時間の細胞数をカウントすることにより、増殖アッセイを行った。
【実施例１】
【００４１】
《神経芽腫におけるYB-1ターゲティング》
神経芽腫細胞におけるYB-1及びN-mycの発現解析
図１に示すように、N-mycが増幅しているIMR-32及びKelly細胞株は、著しく多いYB-1の発現を示した。多数の細胞で、細胞質におけるYB-1の発現は、核におけるN-mycの集積と関連していた。
【００４２】
N-mycとYB-1の共発現は、神経芽細胞腫患者においてin vivoでも観察された（データは省略する）。In vivo 及びin vitroの両方においてYB-1とN-mycの発現が相関しており、YB-1がN-mycと同様に評価されることから、YB-1が予後マーカーとしても見なせることが示唆される。
神経芽腫細胞株におけるYB-1の下方制御
次に、神経芽腫細胞株の増殖に対するYB-1の下方制御の影響を評価するために、YB-1 siRNAを用いて、Kelly 神経芽腫細胞株中のYB-1の発現を抑制した。ここでは、N-mycによる下方制御による細胞増殖抑制効果と、YB-1下方制御による細胞増殖抑制効果を比較して評価した。その結果を図２に示す。
【００４３】
YB-1の下方制御は、細胞増殖を有意に抑制した。YB-1の下方制御及びN-mycの下方制御はともに、N-mycを増幅する神経芽腫細胞であるKellyの増殖を抑制した。興味深いことに、YB-1の増殖抑制効果は、N-mycに匹敵した。
【実施例２】
【００４４】
《膠芽腫におけるYB-1ターゲティング》
膠芽腫細胞株におけるYB-1の発現解析
WHOグレード４の多形性膠芽腫に由来するT98G及びU251細胞株におけるYB-1の発現を、免疫ブロット法及び免疫組織化学の両方で評価した。図３に示すように、両方の細胞でYB-1は高度に発現していた。
膠芽腫細胞株におけるYB-1の下方制御
T98G細胞株において、YB-1を下方制御した。YB-1の下方制御は、免疫ブロット法及びmRNA発現についてのリアルタイムPCRによって確認した。図４に示すように、コントロールsiRNAで形質転換した場合にくらべて、50 nMのYB-1 siRNAを用いた場合、YB-1の発現は有意に下方制御された。
細胞増殖に対するYB-1下方制御の影響
YB-1を下方制御することによる細胞増殖への影響を評価するために、YB-1 siRNAによって下方制御された細胞の増殖率を評価した。まず、T98G細胞をYB-1 siRNAによって形質転換した。YB-1 siRNAによって下方制御された細胞の増殖率を、コントロールsiRNAで形質転換した細胞と比較した。その結果、図５に示すように、YB-1の下方制御は、T98G細胞の細胞増殖を有意に減少させた。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
本発明の薬剤は、YB-1遺伝子及び／又はYB-1たんぱく質の機能を阻害する物質を有効成分として含有することにより、新規な作用機序に基づいて優れた抗腫瘍効果を示し、神経芽腫や膠芽腫のような悪性腫瘍の治療に有効に用いることができる。
【００４６】
また、本発明の診断剤及び診断キットは、YB-1遺伝子の発現量又はYB-1の産生量を指標として測定することにより、神経芽腫及び／又は膠芽腫を有効に診断することができる。
また、本発明のリスクファクター診断剤及び診断キットは、YB-1遺伝子、YB-1を活性化もしくは不活性化する因子の遺伝子、及びそれらの制御領域からなる群より選ばれる１以上の領域における変異を測定することにより、神経芽腫及び／又は膠芽腫のリスクファクターを有効に診断することができる。
【００４７】
さらに、本発明のスクリーニング方法は、合成もしくは遺伝子組換え技術により得られた物質、天然由来の物質又はそれらの誘導体である物質が、YB-1遺伝子の発現及び／又はYB-1の産生もしくは機能を抑制するか否かを指標とすることにより、神経芽腫及び／又は膠芽腫の治療薬もしくは予防薬の有効成分に係る物質を、効果的にスクリーニングすることができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｙボックス結合たんぱく質１（YB-1）遺伝子及び／又はYB-1の機能を阻害する物質を有効成分として含有することを特徴とする、神経芽腫又は膠芽腫を治療するための薬剤。
【請求項２】
有効成分が、Ｙボックス結合たんぱく質１（YB-1）遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ、アンチセンス核酸、これらを発現するベクター、及びYB-1の中和抗体からなる群より選ばれるものであることを特徴とする、請求項１に記載の薬剤。
【請求項３】
有効成分が、Ｙボックス結合たんぱく質１（YB-1）遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ又はこれを発現するベクターである、請求項１又は２に記載の薬剤。
【請求項４】
Ｙボックス結合たんぱく質１（YB-1）遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡが、配列番号：１に示すものである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項５】
Ｙボックス結合たんぱく質１（YB-1）遺伝子の発現量及び／又はYB-1の産生量を指標として測定する手段を含む、神経芽腫及び／又は膠芽腫の診断剤又は診断キット。
【請求項６】
YB-1遺伝子、YB-1を活性化もしくは不活性化する因子の遺伝子、及びそれらの制御領域からなる群より選ばれる１以上の領域における変異を測定する手段を含む、神経芽腫及び／又は膠芽腫のリスクファクター診断剤又は診断キット。
【請求項７】
神経芽腫及び／又は膠芽腫の予防薬又は治療薬に用いることのできる物質をスクリーニングする方法であって、
（１）被検物質を、YB-1遺伝子の転写制御領域及びYB-1遺伝子もしくはレポーター遺伝子を有する形質転換細胞又は試験管内発現系と接触させる工程、及び
（２）YB-1遺伝子もしくはレポーター遺伝子の発現量又はYB-1もしくはレポーターたんぱく質の産生量を検出して、YB-1遺伝子の発現又はYB-1の産生を抑制する物質を得る工程、
を含む方法。
【請求項８】
神経芽腫及び／又は膠芽腫の予防薬又は治療薬に用いることのできる物質をスクリーニングする方法であって、
（１）被検物質を、YB-1又はYB-1の標的分子と接触させる工程、及び
（２）被検物質と結合した又はしなかったYB-1又はYB-1の標的分子の量を検出して、YB-1の機能を抑制する物質を得る工程、
を含む方法。
【請求項１】
Ｙボックス結合たんぱく質１（YB-1）遺伝子及び／又はYB-1の機能を阻害する物質を有効成分として含有することを特徴とする、神経芽腫又は膠芽腫を治療するための薬剤。
【請求項２】
有効成分が、Ｙボックス結合たんぱく質１（YB-1）遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ、アンチセンス核酸、これらを発現するベクター、及びYB-1の中和抗体からなる群より選ばれるものであることを特徴とする、請求項１に記載の薬剤。
【請求項３】
有効成分が、Ｙボックス結合たんぱく質１（YB-1）遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ又はこれを発現するベクターである、請求項１又は２に記載の薬剤。
【請求項４】
Ｙボックス結合たんぱく質１（YB-1）遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡが、配列番号：１に示すものである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項５】
Ｙボックス結合たんぱく質１（YB-1）遺伝子の発現量及び／又はYB-1の産生量を指標として測定する手段を含む、神経芽腫及び／又は膠芽腫の診断剤又は診断キット。
【請求項６】
YB-1遺伝子、YB-1を活性化もしくは不活性化する因子の遺伝子、及びそれらの制御領域からなる群より選ばれる１以上の領域における変異を測定する手段を含む、神経芽腫及び／又は膠芽腫のリスクファクター診断剤又は診断キット。
【請求項７】
神経芽腫及び／又は膠芽腫の予防薬又は治療薬に用いることのできる物質をスクリーニングする方法であって、
（１）被検物質を、YB-1遺伝子の転写制御領域及びYB-1遺伝子もしくはレポーター遺伝子を有する形質転換細胞又は試験管内発現系と接触させる工程、及び
（２）YB-1遺伝子もしくはレポーター遺伝子の発現量又はYB-1もしくはレポーターたんぱく質の産生量を検出して、YB-1遺伝子の発現又はYB-1の産生を抑制する物質を得る工程、
を含む方法。
【請求項８】
神経芽腫及び／又は膠芽腫の予防薬又は治療薬に用いることのできる物質をスクリーニングする方法であって、
（１）被検物質を、YB-1又はYB-1の標的分子と接触させる工程、及び
（２）被検物質と結合した又はしなかったYB-1又はYB-1の標的分子の量を検出して、YB-1の機能を抑制する物質を得る工程、
を含む方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２０１１−１１１４３５（Ｐ２０１１−１１１４３５Ａ）
【公開日】平成２３年６月９日（２０１１．６．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２７１９５０（Ｐ２００９−２７１９５０）
【出願日】平成２１年１１月３０日（２００９．１１．３０）
【出願人】（５０９２５９７０３）株式会社ジョイアップ (1)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年６月９日（２０１１．６．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１１月３０日（２００９．１１．３０）
【出願人】（５０９２５９７０３）株式会社ジョイアップ (1)
【Ｆターム（参考）】
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