神経障害のための治療
本発明は、酸化ストレスによって媒介される疾患、例えば運動ニューロン疾患の治療に適しているＮｒｆ２−ＡＲＥ経路活性剤である治療化合物に関する。また本発明は、神経変性病の治療のために本発明の方法によって同定される化合物を含有する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酸化ストレスによって媒介されることが知られる神経障害の治療、特に運動ニューロン疾患および筋萎縮性側索硬化症の治療のための治療薬に関する。本発明は、とりわけ神経障害の治療のための製品を含有する。
【背景技術】
【０００２】
酸化ストレスは、遊離基の産生およびそれらに対して防御する細胞の性質の間で、不適当な組み合わせの細胞病理学的な結果とする。実験モデルおよびヒトの脳の研究からの増大するデータは、酸化ストレスが、重要な役割を神経変性疾患において果たすことを示唆する。酸化ストレスは、正常な老化および様々な神経変性疾患、例えばパーキンソン病、アルツハイマー病および筋萎縮性側索硬化症の両方において関係し、壊死、アポトーシス、および興奮毒性を含有する細胞死の様々な形態の基礎をなす共通の機構である可能性がある。
【０００３】
運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）は、一般的に筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）と米国にて称し、運動皮質、脳幹および脊髄における運動ニューロンの欠如を特徴とする進行性且つ致命的な神経変性疾病であり、これは衰弱および萎縮を導く。ＡＬＳは、診断から２〜３年以内に死亡を通常導く。ＡＬＳは、散発的（全症例の９０％）および家族型（全症例の１０％）の両方で生ずる。家族性のＡＬＳの２０％において、突然変異は、銅、亜鉛スーパーオキシドジスムターゼ遺伝子（ＳＯＤ１）で見出された。散在の症例および家族性の症例の残りの８０％において含む遺伝子は、依然同定されていない。現在、疾患の進行を防ぐまたは後退させる治療は全く存在しない。利用可能な治療（例えばリルゾールおよび酸化防止剤）は、せいぜい生存を適度に延長するのみである。
【０００４】
疾患の基礎をなす機構は、完全には理解されていない。しかしながら、ＡＬＳの家族性症例の割合における原因としてＳＯＤ１突然変異体の同定は、疾患機構の理解を非常に向上させた疾患の細胞およびマウスのモデルの両方の生成を可能とした。前記モデルならびに患者からの証拠は、疾患病因における酸化ストレスの役割で非常に優れる証拠を提供した。酸化ストレスは、ニューロン損傷の他の潜在的機構、例えばミトコンドリア機能不全、興奮毒性、タンパク質凝集、細胞骨格機能不全および膠細胞活性化に、著しい相互干渉を有する。それはこれら機構内に供給することができるか、または次にそれらによって向上させる。病因におけるこの中心的役割が、メタ分析研究のＡＬＳの最も一般的に使用されるマウスモデル（ヒトＳＯＤ１のＧ９３Ａ突然変異体形状を発現するトランスジェニックマウス）で反映され、酸化ストレスを標的とする治療を、最も重要な所見として疾患進行の遅延において強調した。
【０００５】
この中心的役割にも関わらず、ＡＬＳにおいて標的とする酸化ストレスを患者で臨床利点に解釈できず、ＣＮＳに接近することが可能である十分に有力な酸化防止剤の不足による可能性が多少ある。神経変性疾患における酸化ストレスを制限する新規な方法は、転写制御因子、ＮＥＦ２関連因子２（Ｎｒｆ２）の活性化を促進する。Ｎｒｆ２は、一連の第二段階の解毒および酸化防止剤酵素の発現を、それの相互作用により抗酸化反応要素（ＡＲＥ）で促進する。活性化するとき、この「プログラム細胞寿命」反応は、神経保護作用であり、逆にこの経路の減衰は、ニューロン感度を神経毒性の難問の範囲対して向上させることができる。前記経路の調節不全が、ＡＬＳ細胞モデルにおいて観測され、ヒト組織において確認された。Ｎｒｆ２そのものおよび複数の標的遺伝子が、突然変異体（Ｇ９３Ａ）ヒトＳＯＤ１を発現する運動ニューロン細胞株において抑制される。さらにミトコンドリア抗酸化防止剤において重要な役割を果たす前記経路の標的であるペルオキシレドキシン3（ＰＲＤＸ３）が、前記細胞モデルならびに家族性および散発的なＡＬＳからのヒト組織の両方において下方制御された。Ｇ９３Ａ ＳＯＤ１トランスジェニックマウスを、ＡＲＥリポータマウスと交配したとき、Ｎｒｆ２−ＡＲＥ経路の活性化を、３０日齢からの筋肉にて、９０日目で脊髄に重要でない活性化およびより強い活性化を１１０日目の時点で示した。９０日齢で、マウスは既に筋衰弱および運動ニューロン欠如を示し始め、１１０日目にそれらは著しい運動ニューロンの病状を示した。これは、前記ネズミモデルにおけるＮｒｆ２−ＡＲＥ経路の活性化が、質的に不十分であるか、または著しい損傷からの運動ニューロンの保護には非常に遅延する可能性があることを示唆する。他の報告と組み合わせて解釈すると、これは、突然変異体ＳＯＤ１を発現する細胞の性質における欠陥を反映して、前記経路を活性化する可能性がある。
【０００６】
Ｎｒｆ２−ＡＲＥ経路は、ＡＬＳにおいて関心のある治療標的であり、それが小分子による活性化および細胞防衛の活性化が、例えば直接的な捕捉方法より酸化ストレスに対して持続的な保護を与えることができることに従い、明確に規定されるためである。それは緑茶カテキン−（−）エピガロカテキン−３−ガレート（ＥＧＣＧ）由来のフラボノイドが、突然変異体（Ｇ９３Ａ）ヒトＳＯＤ１を発現する運動ニューロン細胞株において神経保護作用効果を示す従来技術から知られている。前記細胞株は、Ｈ２Ｏ２誘導された細胞死から、２０μＭを超えるＥＧＣＧ濃度で、部分的に保護された。前記化合物を、またＡＬＳのＧ９３Ａマウスモデルに服用量の範囲にて、一日一度、経口で６０日齢から試験した。比較的高い服用量において、生存における著しい延長が、上昇した平均生存率と見られた。前記治療効果は、ＥＧＣＧがそれ自身の酸化促進剤で、それの治療領域を狭め、高度に極性であり、有意な濃度にて血液脳関門へ移行する可能性を低くする事実にかかわらず見出された。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
酸化ストレスによる媒介が知られる疾患、特に運動ニューロン疾患、ＡＬＳ、パーキンソンおよび他の神経変性疾患等の疾患の治療において効果的である治療薬の必要性がある。
【０００８】
最小の毒性を有し、血液脳関門へ移行する性能を有するとともに、ＣＮＳを通過することができる神経変性疾患を治療する治療薬の必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の第一の態様によると、運動ニューロン疾患を治療する治療薬が提供され、治療薬はアンドログラホリドおよびＳ[＋]アポモルフィンを含有する群から選択されるＮｒｆ２−ＡＲＥ経路の活性剤である。
【００１０】
運動ニューロン疾患（ＮＭＤ）は、運動ニューロンの数々の疾患に及ぶように使用した全てを包含する用語である。筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、進行性筋萎縮症（ＰＭＡ）、進行性球麻痺（ＰＢＰ）、原発性側索硬化（ＰＬＳ）は、全てサブタイプである。ＭＮＤはヨーロッパにて頻繁に使用される総称であるとともに、ＡＬＳは米国にてより一般的に時々使用される。当業者は、運動ニューロン疾患（ＮＭＤ）による関係が、またＡＬＳ、ＰＭＡ、ＰＢＰおよびＰＬＳの関連に及び、これらの挙げた疾患の状態は交互に使用することが可能であることを理解するだろう。
【００１１】
本明細書の記載および請求項の全体を通じて、「含有する（ｃｏｍｐｒｉｓｅおよびｃｏｎｔａｉｎ）」という単語および単語の語尾変化、例えば「含有する（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇおよびｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、「含有するが、制限しない」ことを意味するが、他の部分、添加、成分、整数または工程を排除することを意図するものではない（排除しない）。
【００１２】
本明細書の記載および請求項の全体を通じて、単数形は、文脈が他に要求しない限り複数形を包含する。特に、不定冠詞を使用する場合、この記載は、文脈が他に要求しない限り複数形ならびに単数形として考えるとして理解される。
【００１３】
本発明の特定の態様、実施形態または実施例と共に記載した特性、整数、特徴、化合物、化学的部分または群は、それと互換性がない限り、本明細書に記載のあらゆる他の態様、実施形態または実施例に適応することが可能であると理解される。
【００１４】
本発明は、アンドログラホリドおよびＳ[＋]アポモルフィンが、ＣＮＳを移行する性能を有する、有力且つ「薬物のような」Ｎｒｆ２−ＡＲＥ活性剤であるスクリーンおよび試験のカスケードを通して論証した。
【００１５】
本発明の化合物は、それら単独または治療療法の一部のいずれかに、予防的または治療的に使用することができる。
【００１６】
いうまでもなく、本明細書において使用するように「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」および「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」という用語は、状態、例えば疾患または障害を予防する目的で、患者の処置および管理を意味する。この用語は、患者が患う所定の状態で十分な薬効範囲の治療、例えば症状または合併症を軽減や、疾患、障害または状態の進行を遅延や、症状および合併症を軽減または緩和、および／または、疾患、障害または状態を治療または除去ならびに状態を防ぐために活性化合物の投与を含有することを意図し、予防は疾患、状態または障害を予防する目的のために患者の処置および管理として理解され、症状または合併症の発症を予防する活性化合物の投与を含有する。治療される患者は好ましくは哺乳類、特に人間であるが、それはまた動物、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ヒツジおよびブタを含有することができる。
【００１７】
本発明のさらなる態様によると、運動ニューロン疾患の治療に対する薬剤を製造するために、アンドログラホリドおよびＳ[＋]アポモルフィンを含有する群から選択されるＮｒｆ２−ＡＲＥ経路活性剤の使用を提供する。
【００１８】
アポモルヒネは、間欠注射または持続注入として通常皮下に投与されるドーパミン作動薬である。それは、進行したパーキンソン病の処置において実用的であり、神経外科処置に選択肢を提供する。[Ｓ]＋鏡像異性体の化合物が、ＡＬＳまたは他の病状の治療において実用的であることができる、従来の臨床徴候にも全く存在しない。結果は、特にドーパミン作動薬活性を有さないＳ鏡像異性体が、本発明の方法に規定され、上記のように示したＡＬＳ治療のために正しい基準を有する。従って、本発明は、アポモルヒネの[Ｓ]＋鏡像異性体の新規な治療有効性を認識する。
【００１９】
アポモルヒネの化学構造を、以下に記載し、[Ｓ]＋鏡像異性体のあらゆる変異体および置換物を、本発明の化合物の範囲内に包含することを認めるだろう。さらに[Ｓ]＋鏡像異性体のあらゆる誘導体または塩を、本発明の範囲に含み、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ０３／０８４４８号明細書の内容を、本明細書に参考文献として組み込むものとする。
【００２０】
【化１】
【００２１】
アンドログラホリドは、植物アンドログラフィスパニクラータのジテルペノイドラクトンであり、ある特定の癌、例えば乳癌で抗腫瘍活性を有し、抗炎症剤効果を有することが知られている。前記化合物が、例えば限定されないがＡＬＳ酸化ストレスと関連のある疾患の治療において、実用的である可能性がある過去の臨床徴候は全く存在しない。従って本発明は、アンドログラホリドの新規な治療有効性を認識する。
【００２２】
アンドログラホリドの化学構造を、以下に記載し、あらゆる変異および置換物を、本発明の化合物の範囲内に包含すると認めるだろう。例えば、アンドログラホリドおよびその誘導体は、Ｒ．ｓｕｂ．１、Ｒ．ｓｕｂ．２およびＲ．ｓｕｂ．３が独立して水素、アシル、フェニル、モノリン酸塩、ポリリン酸塩、モノ硫酸塩、ポリ硫酸塩、グリコシル、環状アルキル、非環状アルキル、アルケニルまたはアルキニルを示すことができる一般式であり、前記リン酸塩もしくは硫酸塩の誘導体は、遊離酸もしくは塩の形態であることができる。
【００２３】
【化２】
【００２４】
好ましくは、本発明の化合物を、治療を必要とする患者への投与で適切な薬剤形態に処方することできる。
【００２５】
医薬品組成物は、経口、非経口、局所、鼻腔内、眼、耳、直腸または経皮の投与で適切なあらゆる形態であることができる。前記組成物が非経口投与を意図する場合、それらを静脈内、筋肉内、腹膜内、皮下の投与、標的器官または組織内へ注射、点滴もしくは送達の他の手段によって直接的な送達で処方することができる。前記送達は、大量瞬時投与、短期注入または長期注入によることが可能であり、受動デリバリーまたは適切な薬物注入ポンプの利用により可能である。
【００２６】
従って、本発明の化合物は、製薬成分または賦形剤をさらに含有する。
【００２７】
「製薬成分」または「賦形剤」は、本発明の化合物に添加される薬理的に不活性な製薬学的に許容される化合物を意味する。前記成分または賦形剤は、薬理学的特性を全く有さない。
【００２８】
本発明のさらなる態様によると、酸化ストレスの結果として生じる神経変性状態を治療する治療薬を提供し、前記治療薬はアンドログラホリドおよびＳ[＋]アポモルフィンを含有する群から選択されるＮｒｆ２−ＡＲＥ経路の活性剤である。
【００２９】
好ましくは、酸化ストレスによって媒介されることが知られている神経変性状態は、運動ニューロン疾患、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、原発性側索硬化（ＰＬＳ）、ハンチントン病、加齢黄斑変性症、移植／外科的手法のための臓器の保持、細胞培養の安定化、発光性酸化ストレス、皮膚老化および放射線障害性細胞損害の治療を含有する群から選択される。
【００３０】
本発明のさらなる他の態様によると、酸化ストレスの結果として生じる疾患または状態を治療するアンドログラホリドの使用を提供し、前記疾患または状態は、運動ニューロン疾患、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、原発性側索硬化（ＰＬＳ）、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、加齢黄斑変性症、移植/外科的方法のため臓器の保持、細胞培養の安定化、発光性酸化ストレス、皮膚老化および放射線障害性細胞損害の治療を含有する群から選択される。
【００３１】
本発明のさらなる他の態様によると、アンドログラホリドおよびＳ[＋]アポモルヒネを含有する群から選択される、Ｎｒｆ２−ＡＲＥ経路の活性剤の治療の有効量を投与することを含有する酸化ストレスの結果として生じる神経変性疾患を患う個体の治療法を提供する。
【００３２】
本発明のさらなる態様によれば、候補治療薬のライブラリのスクリーニングを行う生体外の方法を、酸化ストレスによって媒介されることが知られている疾患を治療するそれらの安定性に関して提供し、前記方法は：（ｉ）非神経細胞に由来のコントロールまたは正常の細胞を候補の治療にさらし、Ｎｒｆ２−ＡＲＥ経路を活性化する性質を有する候補薬を同定する工程と、（ｉｉ）神経細胞に由来の細胞を、工程（ｉ）において陽性の効果を有する候補薬とさらし、Ｎｒｆ２−ＡＲＥ経路を活性化するそれらの性能を評価する工程と、（ｉｉｉ）神経細胞由来の細胞を保護する候補薬の性能を、酸化ストレス障害に対して評価する工程と、（ｉｖ）物理的および化学的パラメータを確認する一連のコンピュータの試験を実行する工程を含有し、陽性の結果を工程（ｉ〜ｉｉｉ）において有し、適切な物理−化学特性を有する治療候補は、酸化ストレスによって媒介されることが知られている疾患の治療に適切である可能性がある。
【００３３】
本発明は、ＣＮＳを透過する性能をも有するより有力且つ「薬物類似の」Ｎｒｆ２−ＡＲＥ活性剤を同定するスクリーニング法として便利なカスケードの試験を提供する。本発明の方法は、さらなる生体内試験で期待のできる少数の分子を選択する強力なスクリーニングカスケードを提供する。これらの「ヒット」分子を、最初にＮｒｆ２−ＡＲＥ経路を正常な非ヒトの動物由来の細胞株およびヒト発生の細胞株において活性化するそれら性能を試験し、その後経路が非ヒトの動物のＣＮＳから一次培養由来の神経細胞にて活性化できるか決定する「ツール」分子として使用する。
【００３４】
好ましくは、細胞が由来する非ヒトの動物を、サル、イヌ、ネコ、ラビット、ラットおよびマウスを含有する群から選択する。齧歯目の動物が好ましく、マウスが最も好ましい種である。
【００３５】
好ましくは、本発明の一実施形態において、細胞をＡＲＥレポータコンストラクトで安定してトランスフェクションして、任意にリポータは蛍光薬品、例えば限定されないがＧＦＰ等である。
【００３６】
好ましくは、細胞をＮｒｆ調節遺伝子の増加した発現で分析する。活性化を検出するための適切な方法を、本明細書の以下に記載する。
【００３７】
好ましくは、神経細胞由来の細胞は、ＣＮＳ細胞であり、特に星状細胞である。本発明の一実施形態において、それらがヒトＳＯＤ１のＧ９３Ａ突然変異体形態を発現するトランスジェニック非ヒトの動物から由来するものである。
【００３８】
好ましくは、工程（ｉｉｉ）の酸化ストレス試験は、血清の回収、酸化ストレスを、任意にジクロロフルオレッセインもしくは誘導体との測定、ミトコンドリア毒素（メナジオン）とインキュベーションおよび細胞生存率の測定を含有する。しかしながら、他のストレス試験を本発明の方法において用いることができることを認識するだろう。
【００３９】
好ましくは、工程（ｉｖ）の適切な物理的および化学的パラメータは、ｃＬｏｇＰ＜５、分子量＜５００、＜５水素結合供与体（ＯＨ＋ＮＨ数）および＜１０水素結合受容体（Ｏ＋Ｎ原子）である。適切な物理学的および化学的パラメータは、典型的にＬｉｐｉｎｓｋｉの法則の５とする。さらにＡｌｏｇＰが４未満であるが１を超え、分子極性表面積１００（理想８０）未満は、血液脳関門（ＢＢＢ）を通る受動拡散に最適であるが、さらなる好ましい特徴を、候補治療薬を最も良好に選択するためにまた利用することができる。
【００４０】
本発明の特定の態様に起因するあらゆる特徴は、必要な変更に加える各々およびいずれかの態様にも適応することを意図する。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】本発明において使用したＮＲＦ２−ＡＲＥ分析の概略図を示す図である。
【図２】分析検証の結果を示すグラフである。図２ａは、ＣＨＯ−４ｘＡＲＥ−ＴＫ細胞株におけるｔＢＨＱ（白丸）およびＥＧＣＧ（黒丸）の濃度反応曲線を示すグラフである。両方の分子は、それぞれ１０μＭおよび１００μＭで、ＡＲＥ活性ピークの制限された領域を有する。図１ｂは、Ｚ’スコア測定の結果を示すグラフである。単一の３８４穴プレートから賦形剤（１９２穴）および陽性対象（１０μＭエブセレン、１９２穴）に対する平均±ＳＤを示す。この分析のＺ’スコアは、０．５１であり、シグナルのノイズに対する比率（Ｓ／Ｎ）およびシグナルのバックグラウンドに対する比率（Ｓ／Ｂ）は、それぞれ１２．８および２．９を有する。
【図３】一つの３８４穴プレートのスペクトルライブラリスクリーニングデーターの例を示すグラフである。ＧＦＰ蛍光対穴の数である。穴１〜２４および３６０〜３８４は交互の陽性（１０μＭエブセレン）および陰性（賦形剤）コントロールを含有する。点線は陰性対象の平均＋３ＳＤを示し、この線を越える全ての化合物は、「ヒット」として計数される。いくつかの穴は減少した蛍光を示し、おそらく毒性によるものである。
【図４ａ】４６個のヒットの化合物全てに関するオーバーレイ濃度反応曲線を示すグラフである。多くのヒット化合物に関するプロフィールは、高い濃度における毒性のため減少した蛍光で円錐形の用量反応曲線の結果になり、ＡＲＥ誘導の制限された領域を有することに示す。
【図４ｂ】高濃度またはＡＲＥ誘導の広い範囲にて最小の毒性を有する化合物の例を示し、該化合物のほとんどは、多少の毒性を１００μＭで示すグラフである。
【図５】Ａ／一次スクリーン（ＥＣ５０＜５μＭを有する化合物）およびＢ／星状細胞酸化的ストレス分析を１３２１Ｎ１細胞（ＥＣ５０＜３μＭを有する化合物）からの化合物のファーマコフォアモデルおよび配列を示す図である。芳香族/疎水性の特徴を緑色、水素結合受容体の特徴を青色で示す。（Ｂ）に関して、塩基性ファーマコフォアは、水素結合受容体と関連する２つの疎水性特徴で現れる。これはＫＥＡＰ１にメルカプト基の求核攻撃によって作用することができる既知のＮＲＦ２活性剤である細胞質ＮＲＦ２調節因子と一致する。
【図６】ＡＲＥリポータ分析の結果を、Ｃ６星状細胞の細胞株において１７の最もヒット化合物およびＳ[＋]アポモルヒネで示すグラフである。全体として反応は、ＣＨＯ細胞株において見られるものと同程度であり、Ｒ[−]およびＳ[＋]アポモルヒネの両方は、この活性がＲ[−]アポモルヒネのドーパミン作動薬活性に無関係であることを示唆するＮｒｆ２−ＡＲＥ経路を同程度誘導する。ＮＳＣ３４細胞株における反応は、実質的に減少したか、大部分の化合物で存在しない（図示せず）。
【図７】ＮＲＦ２調節因子遺伝子をラットＣ６星状細胞の細胞株（Ｃ６星状細胞、図７ａおよび図７ｂ）および一次マウス星状細胞（図７ｃおよび図７ｄ）において、２４時間アンドログラホリド（Ａｎｄｒｏ）およびＳ[＋]アポモルヒネ（Ａｐｏ Ｓ）のＥＣ５０とＥＣ９０濃度にて処理した後に、定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析を示すグラフである。マルチプレックスＰＣＲを使用して、Ｎｒｆ２そのものを含有する関連の９つ遺伝子の発現レベルを、Ｃ６細胞において薬物治療後に調べた。２つの遺伝子、Ｈａｅｍオキシゲナーゼ１およびＮＱＯ１のみが、（ａ）および（ｂ）にそれぞれ示すように、統計学的に有意な差を遺伝子発現において示した。一次マウス星上細胞における同じ条件下にて、これら２つの遺伝子の標準の定量ＲＴ−ＰＣＲを、また（ｃ）および（ｄ）で実行した。星印は、をＤＭＳＯコントロールにおける有意な差を一元配置分散分析で示す。
【図８】ＮＲＦ２誘導物質は、運動ニューロン（ＭＮ）を一次マウス星状細胞／ＭＮの共培養にてメナジオンストレスから保護することを示すグラフである。共培養を、２４時間、Ｓ[＋]アポモルヒネ（Ａｐｏ Ｓ）およびアンドログラホリド（Ａｎｄｒｏ）と、それらのＥＣ５０およびＥＣ９０にてそれぞれ、ラットＣ６ ４×ＡＲＥ−ＴＫリポータ細胞にて測定したように前処理した。その後共培養を、６時間１０μＭメナジオンで行い、酸化ストレスを誘導した。ＤＭＳＯコントロール細胞において、運動ニューロン数における約２５％の減少を、いずれかの薬物で処理した穴においては見られなかったことで観測した。
【図９】一次マウス星状細胞におけるＮｒｆ２誘導物質とＥｃ５０およびＥＣ９０濃度にて処理した後の、Ｈａｅｍオキシゲナーゼ１で染色する免疫蛍光を示す図である。面積および染色強度を、Ｉｍａｇｅ Ｊを使用して定量化し、染色指数を算出するために使用した。
【図１０Ａ】総グルタチオンレベルを、一次マウス星状細胞にて、Ｎｒｆ２誘導物質とＥＣ５０およびＥＣ９０濃度にて処理した後のグラフを示す。総グルタチオンレベルを標準の方法を使用して、Ｎｒｆ２誘導物質で２４時間前処理した後に測定した。全ての処理は、グルタチオンレベルをＤＭＳＯコントロールに対する星状細胞にて有意に上昇させ、両方の薬物のＥＣ９０濃度は、細胞外グルタチオンレベルを有意に上昇させた（＊ｐ値＜０．００５）。データは、３つの独立した実験の平均である。
【図１０Ｂ】総グルタチオンレベルを、一次マウス星状細胞から収集されて調製された培地にて、Ｎｒｆ２誘導物質とＥＣ５０およびＥＣ９０濃度にて処理した後のグラフを示す。総グルタチオンレベルを標準の方法を使用し、Ｎｒｆ２誘導物質と２４時間前処理した後測定した。全ての処理は、グルタチオンレベルを星状細胞にて、ＤＭＳＯコントロールに対して有意に上昇させ、両方の薬物ＥＣ９０濃度は、細胞外グルタチオンレベルを有意に上昇させた（＊ｐ値＜０．００５）。データは、３つの独立した実験の平均である。
【図１１】Ｎｒｆ調節遺伝子ＮＱＯ１（ａ）およびＨａｅｍオキシゲナーゼ１（ＨＯＸ１）で、Ｇ９３Ａ突然変異体ＳＯＤ１を過剰発現する一次マウス星状細胞において、アンドログラホリド（Ａｎｄｒｏ）およびＳ[＋]アポモルヒネ（Ａｐｏ Ｓ）とＥＣ５０およびＥＣ９０濃度にて２４時間処理した後の、定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析を示すグラフである。星印は著しい差をＤＭＳＯコントロールから一元配置分散分析で示す。
【図１２Ａ】Ｓ[＋]アポモルヒネ（Ａｐｏ Ｓ）に関する生体内薬物動態学的時間的経過を示すグラフである。
【図１２Ｂ】相当するＰＫパラメータをマウスにおいて示す表である（時点あたりのｎ＝３または４）。
【図１２Ｃ】マウスにおける一回の皮下注射後６，２４および４８時間で、２．５または５．０ｍｇ／ｋｇのＳ[＋]アポモルヒネ（Ａｐｏ Ｓ）のいずれかの、ＨＯ−１およびＮＱＯ−１に関するＱＲＴ−ＰＣＲを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
細胞培養
チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ＮＳＣ３４マウス運動ニューロン細胞、Ｃ６（ラット）および１３２１Ｎ１（ヒト）星状細胞株を、１０％ＦＢＳおよびペニシリン／ストレプトマイシンで補うＤＭＥＭ中に、通常保持した。ＴＫ−ＥＧＦＰリポータコンストラクトは、ｐＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）の多重クローニング部位で挿入される１２３ｂｐチミジンキナーゼプロモータからなり、ＡＲＥ−ＴＫ−ＥＧＦＰは、また４１ｂｐ ＧＳＴ ＡＲＥモチーフ(TAGCTTGGAAATGACATTGCTAATCGTGACAAAGCAACTTT) (SEQ ID NO: 1) ３’の４つの繰り返しをＴＫプロモーターに含有する。これらプラスミドをＣＨＯ、Ｃ６および１３２１Ｎ１細胞株内に、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、０．５ｍｇ／ｍＬのＧ４１８において１０〜１４日の選択後、トランスフェクションし、それらをそれぞれの細胞株に関する２つの一連の細胞分取で蛍光活性細胞分取（ＢＤ、ＦＡＣＳＡｒｉａ）を使用して、基底ｅＧＦＰ発現で拡大および選択した。基底ｅＧＦＰ発現を有する安定したトランスフェクションのこれらの混合集団を、その後の分析に使用し、ＡＲＥを含有する株で４×ＡＲＥ−ＴＫ−ＧＦＰおよびコントロール細胞株でＴＫ−ＧＦＰを指定した。ＮＳＣ３４細胞株をＧ９３Ａ突然変異体ＳＯＤ１でトランスフェクションし、安定してトランスフェクションした単一細胞のクローンを２５０μｇ／ｍＬのＧ４１８において選択および限界希釈法によるクローニングによって分離した。
【００４３】
ＡＲＥリポータ分析−スペクトルライブラリスクリーン検証
２０００個の小分子薬物および天然産物のスペクトルライブラリをスクリーンするため、ＴＫ−ＧＦＰ ＣＨＯ ＡＲＥリポータ細胞株は、３８４穴プレートにおいて（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ−ｏｎｅ， μＣｌｅａｒ， ｂｌａｃｋ）、表面被覆密度の範囲（分析の２４時間前に５〜２０×１０４／ウェルにて播種した）および異なる培地を使用してＺ’スコア分析を受けた。交互の穴は、０．３μＭエチジウムホモ二量対（ＥｔｈＤ１）を含むＰＢＳを有する培地を交換した２４時間後に、１０μＭのエブセレンおよび賦形剤（０．１％ＤＭＳＯ）とインキュベートした。このエブセレン濃度は、この薬剤に関してはおおよそのＥＣ９０を示す。その後ＧＦＰ蛍光（ＡＲＥ誘導）を、Ｅｘ４８５ｎｍ／Ｅｍ５３０ｎｍにおいてＦｕｓｉｏｎ万能型プレートリーダ（Ｐａｃｋａｒｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して測定した。ｚスコアを以下のように算出した：
【００４４】
【数１】
【００４５】
ＳＤ＋＝陽性対照穴の標準偏差
３ＳＤ−＝陰性対照穴の標準偏差
Ａｖｅ＋＝陽性対象穴の平均蛍光測定値
Ａｖｅ−＝陰性対象穴の平均蛍光測定値
【００４６】
シグナルのノイズに対する比率（Ｓ／Ｎ＝Ａｖｅ＋／ＳＤ＋）およびシグナルのバックグラウンドに対する比率（Ｓ／Ｂ＝Ａｖｅ＋／Ａｖｅ−）をまた異なる分析条件で測定した。許容できるＺ’スコアは＞０．５である。ライブラリスクリーンでは、細胞を２０×１０４の密度で、１０％ＦＢＳを含有する通常のＤＭＥＭ培地中に、−１日目および０日目に播種し、細胞を２４時間無血清培地で薬物にてインキュベートした。培地を手動で取り除き０．１％ＤＭＳＯ中に、１０μＭまで希釈したスペクトルライブラリで、Ｑ−ｂｏｔ ｌｉｑｕｉｄ ｈａｎｄｌｉｎｇシステム（Ｇｅｎｅｔｉｘ， Ｎｅｗ Ｍｉｌｔｏｎ， ＵＫ）を使用して置換した（１化合物／穴）。前記培地を２４時間後取り除き、同じ体積の０．３μＭのＥｔｈＤ１を含有するＰＢＳで置換した。その後ＧＦＰ蛍光（ＡＲＥ誘導、ＥＸ４８５ｎｍ／ＥＭ５３０ｎｍ）およびＥｔｈ Ｄ１蛍光（毒性Ｅｘ５３０ｎｍ／ＥＭ６４５ｎｍ）を、Ｆｕｓｉｏｎ万能型プレートリーダ（Ｐａｃｋａｒｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して測定した。ＴＫ−ＧＦＰ ＣＨＯ ＡＲＥ細胞株を単一時点分析にて二度スクリーンし、コントロールＴＫ−ＧＦＰ ＣＨＯ細胞株を１度スクリーンし、偽陽性を排除した。図１は、ＮＲＦ２−ＡＲＥ分析の概略図を示す。
【００４７】
ＡＲＥリポータ分析−ＥＣ５０の測定
４×ＡＲＥ−ＴＫ−ＧＦＰ ＣＨＯまたはＴＫ−ＧＦＰ ＣＨＯを発現する細胞の密集培養物を９６または３８４穴組織培養プレートにて、ＦＣＳを含まないＤＭＥＭ中に薬物（０．０１〜１００□Ｍを三回繰り返し）または賦形剤（０．１〜１％ＤＭＳＯ）と、三回繰り返して２４時間処理した。前記培地を取り除き、０．３μＭＥｔｈＤ１を含有するＰＢＳの同じ容量と置換した。その後ＧＦＰ蛍光（ＡＲＥ誘導、Ｅｘ４８５ｎｍ／ＥＭ５３０ｎｍ）およびＥｔｈ Ｄ１蛍光（毒性Ｅｘ５３０ｎｍ／Ｅｍ６４５ｎｍ）を、Ｆｕｓｉｏｎ万能型プレートリーダ（Ｐａｃｋａｒｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して測定した。非線形回帰を使用して、片対数プロットにＳ字状の用量反応曲線を適合させ、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用してＥＣ５０を算出した。リポータ分析を、４×ＡＲＥ−ＴＫ−ＧＦＰおよびＴＫ−ＧＦＰコンストラクトと安定してトランスフェクションされたＣ６および１３２１Ｎ１星状細胞の細胞株にて、Ｅｔｈ Ｄ１を直接培地に添加して、細胞を１度洗浄し、ＤＣＦシグナルを読む前に読んだことを除いて、同様に実施した。
【００４８】
酸化ストレス分析
簡単な酸化ストレス分析を使用して、ＮＲＦ２−ＡＲＥ誘導薬剤とのあらかじめ調整が、その後の酸化ストレス障害（血清回収）に対して予防することができるかを決定した。ＮＳＣ３４、Ｃ６および１３２１Ｎ１細胞を、９６穴組織培養プレートにて播種し、３０％の密集を達成した。それらは薬物と３重の穴で、９点滴定（１００□Ｍ〜１０ｎＭ）として２４時間インキュベートした。細胞密度を観測して、生じた十分な毒性または成長阻害がないことを確認した。その後培地を、無血清のフェノールを含有しない培地と５時間で置換した。ジクロロフルオレセイン（ＤＣＦ）およびエチジウムホモダイマー（ＥｔｈＤ１）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｐａｉｓｌｅｙ， ＵＫ）を、最終濃度５μＭおよび０．３μＭまで細胞に添加し、ＤＣＦおよびＥｔｈＤ１蛍光をＥｘ４８５ｎｍ／Ｅｍ５３０ｎｍ、Ｅｘ５３０／Ｅｍ６４５ｎｍのそれぞれで、１時間後に読み込んだ。その後、細胞生存率分析を、保護が％減少としてＤＣＦシグナルにて測定されるように細胞に実行し、従ってデータ点は細胞数の減少を測定した場合に除外した。
【００４９】
細胞生存率分析
使用した方法は、基本的に上記従来技術に記載されるようなものである。簡潔には、メチルチアゾリルジフェニルテトラゾリウムブロマイド（ＭＴＴ）は、細胞および空白の穴に最終濃度０．５ｍｇ／ｍＬまで添加し、３７℃にて１〜３時間、使用した細胞株に依存してインキュベートした。細胞および反応産物を、２０％ＳＤＳ／５０％ＤＭＦにて１時間で、Ｅｘ５９５ｎｍで吸光度を読み込む前に室温にて振盪して可溶化した。
【００５０】
ＮＳＣ３４細胞を発現するＧ９３Ａ ＳＯＤ１（ＡＬＳ細胞モデル）における基底酸化ストレス分析
ＮＳＣ３４細胞を発現するＧ９３Ａ ＳＯＤ１を、１０％ＦＢＳを含むフェノールレッドを含有しないＤＭＥＭにて３０〜４０％密集まで、９６穴組織培養プレートを播種した。その後それらを、０．０１，０．１，１，１０μＭの薬物または賦形剤（０．１％ＤＭＳＯ）と３重の穴にて２４時間インキュベートした。細胞質反応性酸素の種類のレベルを、ＤＣＦおよびＥｔｈＤ１を使用して酸化ストレス分析のように測定した。
【００５１】
一次マウス運動ニューロン／星状細胞の共培養
マウス膠培養を、１〜２日齢の子犬のＣ５７ＢＩ／６皮質から確立した。皮質を解剖し、細胞をＤＮａｓｅＩ、コラゲナーゼおよびトリプシン中にてインキュベートした後、粉砕によって分離した。インキュベーションおよび粉砕の工程を、細胞の完全な分離を確実にするため繰り返した。細胞を、１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１０μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ中に、４５，０００細胞／ｃｍ２にて播種した。２４時間後、培養をＰＢＳで洗浄し、２〜３週間、密集になるまで成長させ、１週間に一度培地を変えた。密集膠の培養を、振盪および軽度のトリプシン処理によって星状細胞で濃縮した。濃縮された星状細胞を密集するまで成長させ、ポリ−D−オルニチン(1.5 mg/mＬ; Ｓｉｇｍａ， Ｐｏｏｌｅ， ＵＫ）と４０，０００細胞／ｃｍ２まで被覆したカバーグラス上に播種し、１週間成長させた。
【００５２】
一次脊髄運動神経細胞（ＭＮ）を、Ｅ１３．５野生型Ｃ７ＢＩ／６マウス胚から培養した。簡潔には、脊髄調製を、トリプシンおよびＤＮａｓｅＩにてインキュベーションした後、粉砕によって分離した。その後ＭＮを、密度勾配遠心分離によって分離した。共培養を、１％Ｂ２７、２％ウマ血清、５０ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン、５０Ｕ／ｍＬペニシリン、０．５ｍＭＬ−グルタミン、２５ｍＭグルタミン酸（全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｐａｉｓｌｅｙ， ＵＫからのものである）、１ｎｇ／ｍＬＢＤＮＦ、１０ｎｇ／ｍＬＣＮＴＦ、および１００ｐｇ／ｍＬＧＤＮＦ（全てＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ａｂｉｎｇｄｏｎ， ＵＫからのものである）で補足したＮｅｕｒｏｂａｓａｉ培地中に、８０００／ｃｍ２でＭｎを星状細胞に配置することによって確立した。
【００５３】
共培養を２週間で確立したとき、神経保護分析を、６時間の１０μＭメナジオン酸化ストレスまたはグルタミン酸塩で処理した後、薬物または賦形剤に２４時間さらすことによって実行した。ストレス処理後、カバーグラスを３回洗浄し、運動ニューロンをＳＭＩ３２（Ｃｏｖａｎｃｅ）で選択的に染色するため固定し、透過させた。
【００５４】
全ＭＮを、カバーグラスあたり１．５ｃｍ２面積において蛍光顕微鏡検査によって計数した。最低３回の繰り返し３回を１条件あたりに実行した。賦形剤および薬剤の処理の両方を、ストレス処理前および後に計数し、結果を二元配置分散分析によるボンフェローニのポスト試験を使用して統計学的に分析した。
【００５５】
総グルタチオン分析
一次星状細胞を密集するまで２４穴プレート内にて成長させ、その後１０％ＦＢＳおよびペニシリン／ストレプトマイシンを含むフェノールレッドを含有しないＤＭＥＭにおいて薬物（または０．０５％ＤＭＳＯ賦形剤）と２４時間処理した。調整した培地を収集し、その後星状細胞を、２５０μＬ／穴のスルホサリチル酸（ＳＳＡ、５％（ｗ／ｖ））の添加前に氷冷ＰＢＳにて洗浄した。プレートを２回、−８０℃にて凍結し、３７℃にて解凍し、その後４℃にて１５分間インキュベートした。上清を取り除き、１３，０００×ｇにて５分間遠心分離機で分離した。調整した培地サンプルを８０℃にて１５分間インキュベートし、その後１３，０００×ｇにて５分間遠心分離機で分離した。試料を直ちに使用するか、または−８０℃で保存のいずれかとした。反応混合物（１５０μＬ／穴；１００ｍＭリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ ７．０、１ｍＭＥＤＴＡ、６単位／ｍＬグルタチオン還元酵素、１．５ｍｇ／ｍＬ５，５’−ジチオビス（2−ニトロ安息香酸））を、９６穴プレート内の１０μＬのそれぞれの試料またはグルタチオン標準（０〜５０μＭ還元グルタチオン）に添加し、ＮＡＤＰＨ溶液（０．１６ｍｇ／ｍＬ）５０μＬ／穴の添加前に、室温にて５分間インキュベートした。Ａ４１２ｎｍを毎分１５分間測定し、総グルタチオン濃度（ＧＳＨ＋ＧＳＳＧ）を初期の量から算出した。試料を３回試験した。
【００５６】
コンピュータ内分析
さらなるスクリーニングで薬物類似の分子を選択するために、Ｐｉｐｅｌｉｎｅ Ｐｉｌｏｔ （ＳｃｉＴｅｇｉｃ， Ｌｏｎｄｏｎ， ＵＫ）をコンピュータ内分析のために使用した。分子極性表面積（ｍＰＳＡ）を、ＳＰＥＣＴＲＵＭ収集から全ての２０００分子で、適当なＣＮＳ浸透｛Ertl, 2000 #834｝の粗分析の方法として算出し、Lipinskiのフィルターを、またどの分子が最も薬物類似であるかを決定するため適用した。フィルターは、ｃＬｏｇＰ＜５、分子量＜５００、＜５水素結合供与体（ＯＨ＋ＮＨカウント）および＜１０水素結合受容体（Ｏ+Ｎ原子）を有する化合物を選択する「ルールオブファイブ」を適応した。
【００５７】
定量的ＲＴ−ＰＣＲ
マルチプレックスＰＣＲを使用して、標的遺伝子の発現レベルの変化を、アンドログラホリドおよびＳ（＋）アポモルヒネとＥＣ５０およびＥＣ９０濃度にて、Ｃ６細胞のＮＲＦ２−ＡＲＥレポータ分析において決定されるように処理した後、１３２１Ｎ１星状細胞の細胞株にて変化を検出した。ＧｅｎｏｍｅＬａｂ（商標）ＧｅＸＰ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓシステム（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して、９つの関連遺伝子（Ｈｍｏｘｉ、ＦｔＭ、Ｋｅａｐｉ、Ｇｄｃ、Ｎｆｅ２ｌ２、Ｇｓｒ、Ｎｑｏ１、ＳｑｓｔｍｌおよびＥｐｈＸ１）および３つのハウスキーピング遺伝子（１８ｓ ＧＡＰＤＨおよびＡＣＴＢ）での多重化反応において、以下の表１に概説した次のプライマーを用いて遺伝子発現の変化を同定した。
【００５８】
【表１】
【００５９】
それらは、太字の隣接するイントロン配列であり、ゲノムバックグラウンドを防ぐものを示す。ＲＴ反応混合物を、９６穴マイクロプレートに、以下の３μＬＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅを含有しないＨ２Ｏ、４μＬのＲＴ緩衝剤５×、２μＬのＲＴ Ｒｅｖ Ｐｒｉｍｅｒ Ｐｌｅｘ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、５μＬのＫＡＮｒ ＲＮＡ、５μＬの試料ＲＮＡ（２０ｎｇ／μＬ）を、２０μＬの総反応容量体積が得られるように調整した。その後試料を以下のようにインキュベートした；４８℃で１分間、３７℃で５分間、４２℃で６０分間、９５℃で５分間、４℃で保持。ＰＣＲ反応混合物を、以下の様に９６穴試料マイクロプレート内で調整した；４．０μＬ ＰＣＲ緩衝剤５×、４．０μＬ ２５ｍＭのＭｇＣｌ２（Ａｂｇｅｎｅ）、２．０μＬのＰＣＲ Ｆｗｄ Ｐｒｉｍｅｒ Ｐｌｅｘ、０．７μのサーモスタートＤＮＡポリメラーゼ、（ＡＢｇｅｎｅ ＡＢ−０９０８／Ａ）、ＲＴ反応からの９．３μＬのｃＤＮＡ試料。ＰＣＲを、以下のように実行した；（１）９５℃で１０分、（２）９４℃で３０秒、（３）５５℃で３０秒、（４）７０℃で１分、（５）工程２〜４をさらに３４サイクル繰り返し、（６）４℃で保持。予備実験に基づいて、逆ＲＴプライマー濃度を、全ての産物が単一の反応にて検出することを可能とするために最適化した。ＰＣＲ反応産物をＳＬＳ（試料負荷溶液）中に希釈し、ＧｅＸＰ毛細血管電気泳動ユニットにて分離し、データをＧｅＸＰソフトウェアおよびＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌデータパッケージを使用して分析し、ＧＡＰＤＨおよびＡＣＴＢに対する発現変化の倍率を得た。
【００６０】
標準ＱＰＣＲ
ＱＰＣＲを、刊行物Ｗｏｏｄ−Ａｌｌｕｍなど２００５で前述したように、ＲＮＡが一次星状細胞または星状細胞の細胞株から、製造業者の説明書に従ってＲＮｅａｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して分離した本質的な相違で実施した。ｃＤＮＡを、製造業者の説明書に従ってオリゴｄＴに促進されるＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用し、調製した。定量的ＲＴ−ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）をｃＤＮＡ２５ｎｇ、１×ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）使用して実行し、前方および後方プライマー（表１）の濃度を、総体積２０μＬおよびそれぞれのサンプルで３回ずつ最適化した。９５℃１０分間の変性後、産物を９５℃で１５秒間および６０℃で１分間の４０サイクルによって、ＭＸ３０００Ｐ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にて増幅した。単一の産物の増幅を確認するため、解離曲線をそれぞれの増幅に対して産生した。サンプル中の関連の遺伝子の相対的なレベルを、それぞれのサンプル中のｇａｐｄｈのものの発現レベルを基準化し、ｄｄＣｔ算出を用いて（ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ ｍｉｘおよびＲＴ−ＰＣＲプロトコル， Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）測定した。関連の遺伝子の全体的総体濃度を、賦形剤中の細胞成長に対するデータを基準化することによって薬物治療後に算出した。
【００６１】
統計分析
スペクトルライブラリスクリーンに関して、３２穴を有するそれぞれ３８４個の穴プレートを、賦形剤のみでインキュベートした（培地中０．１％）。該穴の平均蛍光読み込みおよび標準偏差を、１つのプレートずつで算出した。ヒットを、賦形剤の平均＋３つの標準偏差を超えるＧＦＰ蛍光値を有するものとして分類した。毒性を同様に規定した（即ち、賦形剤の平均＋３つの標準偏差を超えるＥｔｈＤ１蛍光値）。
【実施例】
【００６２】
実施例１
４×ＡＲＥ−ＴＫ−ＧＦＰおよびＴＫ−ＧＦＰリポータ細胞株を、既知のＡＲＥ誘導物質であるｔｅｒｔ−ブチルヒドロキノン（ｔＢＨＱ）およびフラボノイドＥＧＣＧに対するそれら反応を範囲内の濃度で試験した。この化合物を、無血清培地中の９６穴プレートの密集細胞へ２４時間三回適用し、ＧＦＰの誘導を蛍光プレート読み込みによって測定した。両方の化合物は、制限された領域において、１００μＭでピークに達するＥＧＣＧおよび１０μＭでピークに達するｔＢＨＱ（図２ａ）で、ＧＦＰ発現を誘導した。前記ピークの発現より高い濃度にて、両方の化合物は、毒性のサインを直接的な観察（細胞の欠如）または上昇したエチジウムホモダイマー蛍光によって示した。蛍光における上昇を、コントロールＴＫ−ＧＦＰ細胞株においては全く観測しなかった（図示せず）。
【００６３】
実施例２
２０００分子のスペクトル収集物をスクリーニングするため、レポータ分析を３８４穴プレートの形態に縮小した。ライブラリスクリーニングの分析の適合性を評価するため、Ｚ’スコア算出を、賦形剤（０．１％ＤＭＳＯ）および１０μＭのエブセレンを陽性のコントロールとして代替の穴を処理することによって実行した（方法における算出を参考とする）。エブセレンは、強力な濃度反応曲線を該分析にて与えることを示した。算出したＺ’スコアは、ライブラリスクリーニングで許容できる０．５１（図２ｂ）であった。さらにシグナルのノイズに対する比率（Ｓ／Ｎ）およびシグナルのバックグラウンドに対する比率（Ｓ／Ｂ）は、それぞれ１２．８および２．９にて許容できた。前記ライブラリをその後、１０μＭの化合物あたり単一の濃度でスクリーニングした。薬物ライブラリの希釈および播種を、Ｑ−ＢＯＴ液体取扱いシステムによって実行し、４×ＡＲＥ−ＴＫ−ＧＦＰリポータ細胞株およびＴＫ−ＧＦＰコントロール細胞株の両方を、化合物に対するそれらの反応で試験した。単一の３８４穴プレートからのＡＲＥ−ＴＫ−ＧＦＰ細胞株に関するデータセットの例を、図３に示す。ヒットを、バックグラウンドレベルを超える３つの標準偏差より多いデータ点として同定して、賦形剤（０．１％ＤＭＳＯ）のみで処理した２４穴の平均値であった。ヒット化合物を、それらが反応を転写の非特異的活性化または化合物の自動蛍光のいずれかにより、コントロール細胞株にて生成した場合に認識して確認した。さらに、エチジウムホモダイマー蛍光を向上させることによる毒性のサインを示すあらゆる化合物を排除した。ライブラリスクリーンを４×ＡＲＥ−ＴＫ−ＣＨＯ細胞株のみで繰り返し、両方のスクリーンからヒットとして現れた化合物を、更なる評価を進めた。全４６の化合物をこの基準で同定した。次の段階は、化合物の濃度がこれら４６のヒット化合物に対して５０％の反応（ＥＣ５０）を生じるために必要とされるかを測定することである。それぞれの化合物を、２つの穴における７点の濃度反応曲線を対象とした。多くの化合物は、標準のＡＲＥ誘導物質、例えばｔＢＨＱおよびＥＧＣＧ１に見られるものと同様の円錐形用量反応曲線を、高い濃度で毒性により示した。図４ａは、全４６個の用量反応曲線を第一分析において示す。大多数の化合物は、比較的高い濃度にて毒性を有する円錐形用量反応曲線を示し、また多くはＡＲＥ誘導の非常に制限された領域を有する。図４ｂは、レポータ発現の向上を幅広い濃度範囲（＞１ｌｏｇ単位）、または高い濃度にて最小の毒性を有する一組の化合物を示す。全４６のヒットに関する濃度反応曲線を繰り返し、ＧＦＰ蛍光の平均ＥＣ５０および平均最大倍率誘導を測定した。毒性反応の原因となる最低濃度をまた留意して、データをこれらの化合物の既知の生物活性の簡単な説明と共に、表２（本明細書の下記に示すように）に要約した。毒性を観測した最も低い服用量をまた表に記載する。化合物を、レポータ分析における活性に従ってランク付けした。最も有力なＡＲＥ誘導物質は、天然産物のアンドログラホリドで、サブマイクロモルＥＣ５０（７４０ｎＭ）を有する唯一の化合物であり、該化合物は天然産物アンドログラフィスパニクラータから由来するものであり、漢方薬およびインドの薬草剤において幅広く使用される。２６個の他の天然産物のうち、さらに２つをヒトに使用した：セクリニン、ＧＡＢＡＡ受容体アンタゴニストおよびＣＮＳ刺激薬；およびイソリキリチゲニン、アルドース還元酵素抑制剤であるカンゾウの根の成分。残りの１９個の産物は、合成の小分子または誘導体であり、これらのうちの全６つの分子は承認された薬物である。2つのアルキル化抗悪性腫瘍薬（ピポブロマンおよびメクロレタミン）、ドーパミン作動薬（アポモルヒネ塩酸塩）、局所皮膚漂白剤（ヒドロキノン）、ループ利尿薬（エタクリン酸）および血管拡張薬（イソクスプリン塩酸塩）。合成小分子のうちの１つが、第３相臨床試験を脳卒中にて達成した（エブセレン）。
【００６４】
実施例３
運動ニューロンおよび星状細胞における血清回収に誘導される酸化ストレスに応じてヒット化合物を誘導するＮｒｆ２−ＡＲＥの効果を調査した。この経路の活性化は細胞種に応じて異なることができるため、その後これらのヒット化合物が運動ニューロン細胞株（ＮＳＣ３４細胞）、ラット（Ｃ６）およびヒト（１３２１Ｎ１）星状細胞の細胞株を、血清回収による酸化ストレス誘導からどの程度保護することができるかのスクリーンを行った。細胞株を、ヒット化合物である範囲の濃度にて２４時間前処理し、ＮＲＦ２−ＡＲＥ経路を活性化した。その後、化合物を取り除き、細胞は６時間血清回収を受けて酸化ストレスを誘導した。酸化ストレスの程度をジクロロフルオレセイン（ＤＣＦ）蛍光を使用して測定し、保護の程度を、ＤＣＦ蛍光におけるパーセント減少としてそれぞれ３つの細胞株に対して表３に示した。曲線を適合することが可能である場合、半数最大効果濃度（ＩＣ５０）を生じるのに必要とされる濃度をまた提示した。一般的に、ヒット化合物は、星状細胞の細胞株にて保護効果を示す可能性が運動ニューロン細胞株より高かった。表３（本明細書の下記に示す）は、運動ニューロン細胞株における活性化によってランクを付けした全ての化合物に関する分析結果を示す。９／４６の化合物のみが、血清回収により誘導される酸化ストレスＤＣＦシグナルをＮＳＣ３４細胞にて減少し、１８／４６の化合物が該分析において効果を全く有さず、残りの１７個の化合物は該分析において酸化促進剤であった。即ち、血清回収が原因である酸化ストレスの減少に対して、それらはそれに寄与し、ＤＣＦ蛍光を上昇させた。対照的に、１つの化合物のみが１３２１Ｎ１星状細胞の細胞株にて酸化促進剤であり、２９／４６はＤＣＦシグナルを３０％以上減少させた。Ｃ６細胞株に関しては、化合物は酸化促進剤ではなく、３２／４６の化合物は、ＤＣＦシグナルを３０％以上減少させた。
【００６５】
実施例４
得た生物学的結果を合理化するため、表１で報告した化合物に関する一般的なファーマコフォアを、ＭＯＥ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ） ［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ （ＭＯＥ ２００７．０９） Chemical Computing Group, Inc. Montreal, Quebec, Canada http://www.chemcomp.com］において実行したＰｈａｒｍａｃｏｐｈｏｒｅ Ｅｌｕｃｉｄａｔｏｒを使用して研究した。ＣＨＯ４×ＡＲＥ−ＴＫ細胞株において、１０μＭ未満のＥＣ５０を有する２４個の分子を、ＮＲＦ２−ＡＲＥ経路の誘導で考慮すると（表２）、配置に応じて、それら２２は２つの共通特徴を示した：芳香族/疎水性部位および水素結合受容体部位（図５ａ）。ＥＧＣＧはまたこれらの構造的特徴を有し、算出したファーマコフォアに明らかに適合することを留意すべきである。さらに１３２１Ｎ１星状細胞の酸化ストレス分析の結果（表３）を、３μＭの活性閾値でファーマコフォアを構成するために使用したとき、１つのさらなる一般的な芳香族／疎水性の特徴を同定した（図５ｂ）。これはＫＥＡＰ１へメルカプト基の求電子攻撃によって作用することができる既知のＮｒｆ２活性剤である細胞質Ｎｒｆ２調節因子と一致する。これら事前のモデリングデータを使用して、Ｎｒｆ２−ＡＲＥ経路の潜在的な活性剤の構造の必要条件を理解することができ、このクラスの化合物の新規構造のデザインとして考慮することができた。
【００６６】
実施例５
化合物の物理学的／化学的な性質を評価した。関連した細胞型における機能効果で化合物をスクリーニングすることに加えて、また化学的／物理学的性質を算出する化学情報プログラムであるＰｉｐｅｌｉｎｅ Ｐｉｌｏｔを、表３に示すように使用した。ＡＬｏｇＰ（オクタノール/水の分割の対数）および分子極性表面積（ｍＰＳＡ）は、化合物の親油性の相違の測定であり、可能性があるＣＮＳ浸透度の初期の予測を可能とする。ＣＮＳ浸透度に関しては、ＡｌｏｇＰが１を超えるが４未満、ｍＰＳＡが１００未満（理想的には８０）は、ＢＢＢに通過する受動拡散のために最適である。さらにＬｉｐｉｎｓｋｉのフィルターを使用して、非薬物類似分子を同定し、４つ（スィーテノリド三酢酸、エンデカフィリンＸ、ロバル酸およびオイホールアセタート）を排除した。
【００６７】
不要な分子のみを濾過して取り除くため、ＮＳＣ３４酸化ストレス分析（表３）にて保護または中性の効果を有するものを選択し、既知の細胞分子を除外した（ピポブロマン、クロルデン、アラクロール、プロパクロル）。ＡｌｏｇＰおよびｍＰＳＡの基準を残りの２２の分子に適応すると、さらなる調査で１７分子が残存した。前記分子を表３において太字で強調し、「最良のヒット」の分子として称する。さらに毒性を観測した最小の投薬量を示した。ＮＡ、適用できない（不十分なデータ、反応濃度なしまたは阻害なし）。表３で化合物を、ＮＳＣ３４細胞株における保護性能によって分類する。ＡＲＥ誘導物質は、星状細胞の細胞株（１３２１Ｎ１およびＣ６）で酸化ストレスからの保護に、ＮＳＣ３４細胞と比較してはるかに効果的である。
【００６８】
実施例６
神経細胞および星状細胞の細胞株における最もヒットの化合物のＮＲＦ２−ＡＲＥ誘導活性を調査した。星状細胞および運動ニューロンの細胞株における保護における相違が、これら細胞種においてＮＲＦ２−ＡＲＥ経路の活性化の程度での相違によるものであるかを決定するため、ＮＲＦ２−ＡＲＥレポータコンストラクトを、星状細胞（Ｃ６）および運動ニューロン（ＮＳＣ３４）細胞株にて安定して発現させた。その後１７個の最良のヒットの分子を、それぞれの細胞株においてスクリーンした。またアポモルヒネのＳ[＋]鏡像異性体をスクリーンし、それがＲ[−]またはＳ[＋]鏡像異性体のいずれかとして存在することができるためである。Ｒ[＋]鏡像異性体が、ドーパミン作動薬活性を有する一方、Ｓ[＋]鏡像異性体は前記活性を欠如し、そのためそれがＮＲＦ２−ＡＲＥ誘導活性を維持するかどうかを決定する必要性があった。Ｃ６レポータ細胞株での結果を図６に示した。一般的にＣ６細胞におけるＮＲＦ２−ＡＲＥ経路の活性化は、ＣＨＯ細胞株において見られるものと同様である。ＮＳＣ３４レポータ細胞株は、星状細胞の細胞株対初期に見られたＮＳＣ３４細胞において酸化ストレスに対してより大きな保護のために、根本的な原因を示唆する同じセットの濃度反応曲線を有するあらゆる活性化が、星状細胞の細胞株におけるＮＲＦ２−ＡＲＥ経路のより強い活性化による場合には、最小限を示した。さらに、アポモルヒネのＳ[＋]鏡像異性体は、前記活性がドーパミン受容体作動薬に無関係なことを示すＲ[＋]鏡像異性体と比較して、ＮＲＦ２−ＡＲＥ活性化に関して同様に有力であり、Ｓ[＋]鏡像異性体はドーパミン作動薬でないためである。
【００６９】
運動ニューロン疾患における臨床試験のために、急速な発展する可能性を有する分子を同定することが目的であった。これに関する重要な基準の一つは、分子がＭＮＤのためでないがヒトにおける過去の使用を有することである。１７個の最もヒットの分子の中、２つはヒトにおいて天然産物（セクリニン、アンドログラホリド）として過去の使用を有し、１つは症状の発現からパーキンソン病における「オフ」の事例の急性救済で使用される現在認可の薬物（Ｒ鏡像異性体としてのアポモルヒネ塩酸塩）である。さらにヒドロキノンは、局所塗布皮膚漂白剤としてではあるが、過去の使用がある。これら薬剤の中で、アンドログラホリドおよびアポモルヒネのＳ[＋]鏡像異性体は、セクリニンがマウスおよびヒトにおいて痙攣薬特性を頻繁に記載するように、更なる評価で選択され、アポモルヒネのＳ[＋]鏡像異性体におけるドーパミン作動薬の欠如を、明確な利点と考える。
【００７０】
実施例７
Ｃ６細胞および一次マウス星状細胞におけるアンドログラホリドおよびＳ[＋]アポモルヒネによる、ＡＲＥ標的遺伝子発現の誘導を調査した。これらの好ましいまたは「主要な」分子が、星状細胞における標的遺伝子発現を導くＮＲＦ２−ＡＲＥ経路の活性化を可能とすることを確認するために、マルチプレックスＲＴ−ＰＣＲ分析をＧｅｎｏｍｅＬａｂ（商標）ＧｅＸＰ遺伝子分析システムに９つの関連遺伝子で開発した。Ｃ６細胞を、２４時間アンドログラホリドおよびＳ[＋]アポモルヒネで、Ｃ６−４×ＡＲＥ−ＴＫレポータ細胞において測定したようにＥＣ５０およびＥＣ８０濃度にて処理した。２つの遺伝子Ｈａｅｍオキシゲナーゼ１およびＮＱＯ１のみが、遺伝子発現において、統計学的に有意な変化を示し、標準の定量ＲＴ−ＰＣＲによって確認した（図７Ａおよび７Ｂ）。
【００７１】
実施例８
主なＮＲＦ２誘導分子が、標的遺伝子の発現を一次マウス運動ニューロンにおいて上昇することが可能であるため、星状細胞フィーダーレイヤーに一次マウス運動ニューロン（ＭＮ）からなる共培養を、[Ｓ＋]アポモルヒネのアンドログラホリドと前処理した後、酸化性外傷にさらした（図８）。その後共培養を、６時間の１０μＭメナジオンで与えて、酸化ストレスを誘導し、運動ニューロンを染色および計数した。ＤＭＳＯコントロール細胞において、運動ニューロン数における約２５％の減少を、いずれかの薬物で処理した穴において見られなかったことで観測した。これらの結果は、ＮＲＦ２誘導物質が、一次マウス星上細胞／ＭＮの共培養にて酸化ストレスから運動ニューロン（ＭＮ）を保護することを示す。
【００７２】
また一次マウス星状細胞において同じ条件下で、ＮＱＯ１およびＨＣＭの遺伝子の標準定量ＲＴ−ＰＣＲは、有意な上昇を遺伝子発現において明らかにした（図７Ｃおよび７Ｄ）。遺伝子発現における変化が、タンパク質の発現で付随する増加を導くことを確認するために、一次マウス星状細胞を、服用量依存的な発現向上をＤＭＳＯ処理した細胞において見られるものにわたって確認する免疫染色（図９）によって、ＨＯ−１の向上したレベルで評価した。またこの向上した抗酸化性能の機能的効果を、総グルタチオンレベルの同じ条件下における、一次星状細胞そのものと処理した星状細胞から収集した培地との両方において観測することによって見られた（図１０）。これはグルタチオンレベルが、細胞そのものおよび培地において向上したことを示した−Ｎｒｆ２に反応性の星状細胞が、隣接したＡＲＥに反応性ではないＭＮを酸化的攻撃から保護することが可能である１つの機構を提供する。
【００７３】
実施例９
得られた生物学的結果を合理化にする試みから、一般的なファルマコフォアを表２に報告した化合物に対して、ＭＯＥ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ）[Molecular Operating Environment (MOE 2007.09) Chemical Computing Group, Inc. Montreal, Quebec, Canada http://www.chemcomp.com］において実行したＰｈａｒｍａｃｏｐｈｏｒｅ Ｅｌｕｃｉｄａｔｏを使用して同定することを試みた。ＣＨＯ ＡＲＥ−ＴＫ細胞株におけるＮＲＦ２−ＡＲＥ経路の誘導に関する１０μＭ未満のＥＣ５０で２４個の分子を考慮すると（表２）、配置に応じて、それら２２は２つの共通の特徴を示した：芳香族/疎水性部位および水素結合受容体部位（図４ａ）。ＥＧＣＧは、またこれら構造的特徴を有し、算出したファーマコフォアに明らかに適合することに留意すべきである。さらに、１３２１Ｎ１星状細胞の酸化ストレス分析の結果（表３）を、３μＭの活性閾値を使用して、ファルマコフォアを構成するために使用したとき、１つの余分な共通の芳香族／疎水性特徴を同定した（図５ｂ）。これはＫＥＡＰ１にメルカプト基の求核攻撃によって作用することができる既知のＮＲＦ２活性剤である、細胞質ＮＲＦ２調節因子と一致する。これら事前のモデリングデータを使用して、ＮＲＦ２−ＡＲＥ経路の潜在的な活性剤の構造的な必要条件の理解することができ、このクラスの化合物で、新規構造のデザインで考慮することができる。
【００７４】
実施例１０
従来の研究が、突然変異体ＳＯＤを発現する運動ニューロン細胞株、および家族性ヒトＳＯＤ１症例からの星状細胞における事後の材料において、弱いＮｒｆ２反応を示したため、主な誘導物質が依然としてＧ９３Ａ突然変異体ＳＯＤ１を発現する星状細胞にてＮｒｆ２を活性化することができるかを調査した。Ｎｒｆ２調節の遺伝子であるＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：キニーネ酸化還元酵素（ＮＱＯ１）およびヘムオキシゲナーゼ１（ＨＯＸ１）が、Ｇ９３Ａ突然変異体ＳＯＤ１トランスジェニックマウスからの、一次マウス星状細胞において誘導することができるかどうかを最初に決定した。定量的ＲＴ−ＰＣＲは、ＮＱＯ１およびＨＯ１に関する転写因子において、アンドログラホリドおよびＳ[＋]アポモルヒネとそれらのＥＣ９０濃度で２４時間の前処理後に有意な上昇を示した（図１１）。
【００７５】
実施例１１
図１２は、[Ｓ＋]アポモルヒネの生体内における薬物動態学および薬力学を、雄Ｃ５７ＢＩ／マウスにて示す。化合物の[Ｓ＋]アポモルヒネレベルの、単一の静脈内への投薬を、血漿、脳および脳髄液（図１２Ａおよび１２Ｂ）において検出した後、ならびに皮下の投薬後、ＱＲＴ−ＰＣＲによって測定したＨＯ−１およびＮＱＯ−１転写酵素の投与後２４時間で、著しい誘導が存在した（図１２Ｃ）。従って、[Ｓ＋]アポモルヒネは、抗酸化酵素の発現における転写活性化にわたって、長期に渡る上昇を導くことができる。
【００７６】
これらのデータは、いくつかの化合物を生体外におけるＮＦ２−ＡＲＥ経路の活性因子であることが同定し、それらがまた生体内にて前記経路を活性化することができることを示す。
【表２】
【表３−１】
【表３−２】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酸化ストレスによって媒介されることが知られる神経障害の治療、特に運動ニューロン疾患および筋萎縮性側索硬化症の治療のための治療薬に関する。本発明は、とりわけ神経障害の治療のための製品を含有する。
【背景技術】
【０００２】
酸化ストレスは、遊離基の産生およびそれらに対して防御する細胞の性質の間で、不適当な組み合わせの細胞病理学的な結果とする。実験モデルおよびヒトの脳の研究からの増大するデータは、酸化ストレスが、重要な役割を神経変性疾患において果たすことを示唆する。酸化ストレスは、正常な老化および様々な神経変性疾患、例えばパーキンソン病、アルツハイマー病および筋萎縮性側索硬化症の両方において関係し、壊死、アポトーシス、および興奮毒性を含有する細胞死の様々な形態の基礎をなす共通の機構である可能性がある。
【０００３】
運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）は、一般的に筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）と米国にて称し、運動皮質、脳幹および脊髄における運動ニューロンの欠如を特徴とする進行性且つ致命的な神経変性疾病であり、これは衰弱および萎縮を導く。ＡＬＳは、診断から２〜３年以内に死亡を通常導く。ＡＬＳは、散発的（全症例の９０％）および家族型（全症例の１０％）の両方で生ずる。家族性のＡＬＳの２０％において、突然変異は、銅、亜鉛スーパーオキシドジスムターゼ遺伝子（ＳＯＤ１）で見出された。散在の症例および家族性の症例の残りの８０％において含む遺伝子は、依然同定されていない。現在、疾患の進行を防ぐまたは後退させる治療は全く存在しない。利用可能な治療（例えばリルゾールおよび酸化防止剤）は、せいぜい生存を適度に延長するのみである。
【０００４】
疾患の基礎をなす機構は、完全には理解されていない。しかしながら、ＡＬＳの家族性症例の割合における原因としてＳＯＤ１突然変異体の同定は、疾患機構の理解を非常に向上させた疾患の細胞およびマウスのモデルの両方の生成を可能とした。前記モデルならびに患者からの証拠は、疾患病因における酸化ストレスの役割で非常に優れる証拠を提供した。酸化ストレスは、ニューロン損傷の他の潜在的機構、例えばミトコンドリア機能不全、興奮毒性、タンパク質凝集、細胞骨格機能不全および膠細胞活性化に、著しい相互干渉を有する。それはこれら機構内に供給することができるか、または次にそれらによって向上させる。病因におけるこの中心的役割が、メタ分析研究のＡＬＳの最も一般的に使用されるマウスモデル（ヒトＳＯＤ１のＧ９３Ａ突然変異体形状を発現するトランスジェニックマウス）で反映され、酸化ストレスを標的とする治療を、最も重要な所見として疾患進行の遅延において強調した。
【０００５】
この中心的役割にも関わらず、ＡＬＳにおいて標的とする酸化ストレスを患者で臨床利点に解釈できず、ＣＮＳに接近することが可能である十分に有力な酸化防止剤の不足による可能性が多少ある。神経変性疾患における酸化ストレスを制限する新規な方法は、転写制御因子、ＮＥＦ２関連因子２（Ｎｒｆ２）の活性化を促進する。Ｎｒｆ２は、一連の第二段階の解毒および酸化防止剤酵素の発現を、それの相互作用により抗酸化反応要素（ＡＲＥ）で促進する。活性化するとき、この「プログラム細胞寿命」反応は、神経保護作用であり、逆にこの経路の減衰は、ニューロン感度を神経毒性の難問の範囲対して向上させることができる。前記経路の調節不全が、ＡＬＳ細胞モデルにおいて観測され、ヒト組織において確認された。Ｎｒｆ２そのものおよび複数の標的遺伝子が、突然変異体（Ｇ９３Ａ）ヒトＳＯＤ１を発現する運動ニューロン細胞株において抑制される。さらにミトコンドリア抗酸化防止剤において重要な役割を果たす前記経路の標的であるペルオキシレドキシン3（ＰＲＤＸ３）が、前記細胞モデルならびに家族性および散発的なＡＬＳからのヒト組織の両方において下方制御された。Ｇ９３Ａ ＳＯＤ１トランスジェニックマウスを、ＡＲＥリポータマウスと交配したとき、Ｎｒｆ２−ＡＲＥ経路の活性化を、３０日齢からの筋肉にて、９０日目で脊髄に重要でない活性化およびより強い活性化を１１０日目の時点で示した。９０日齢で、マウスは既に筋衰弱および運動ニューロン欠如を示し始め、１１０日目にそれらは著しい運動ニューロンの病状を示した。これは、前記ネズミモデルにおけるＮｒｆ２−ＡＲＥ経路の活性化が、質的に不十分であるか、または著しい損傷からの運動ニューロンの保護には非常に遅延する可能性があることを示唆する。他の報告と組み合わせて解釈すると、これは、突然変異体ＳＯＤ１を発現する細胞の性質における欠陥を反映して、前記経路を活性化する可能性がある。
【０００６】
Ｎｒｆ２−ＡＲＥ経路は、ＡＬＳにおいて関心のある治療標的であり、それが小分子による活性化および細胞防衛の活性化が、例えば直接的な捕捉方法より酸化ストレスに対して持続的な保護を与えることができることに従い、明確に規定されるためである。それは緑茶カテキン−（−）エピガロカテキン−３−ガレート（ＥＧＣＧ）由来のフラボノイドが、突然変異体（Ｇ９３Ａ）ヒトＳＯＤ１を発現する運動ニューロン細胞株において神経保護作用効果を示す従来技術から知られている。前記細胞株は、Ｈ２Ｏ２誘導された細胞死から、２０μＭを超えるＥＧＣＧ濃度で、部分的に保護された。前記化合物を、またＡＬＳのＧ９３Ａマウスモデルに服用量の範囲にて、一日一度、経口で６０日齢から試験した。比較的高い服用量において、生存における著しい延長が、上昇した平均生存率と見られた。前記治療効果は、ＥＧＣＧがそれ自身の酸化促進剤で、それの治療領域を狭め、高度に極性であり、有意な濃度にて血液脳関門へ移行する可能性を低くする事実にかかわらず見出された。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
酸化ストレスによる媒介が知られる疾患、特に運動ニューロン疾患、ＡＬＳ、パーキンソンおよび他の神経変性疾患等の疾患の治療において効果的である治療薬の必要性がある。
【０００８】
最小の毒性を有し、血液脳関門へ移行する性能を有するとともに、ＣＮＳを通過することができる神経変性疾患を治療する治療薬の必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の第一の態様によると、運動ニューロン疾患を治療する治療薬が提供され、治療薬はアンドログラホリドおよびＳ[＋]アポモルフィンを含有する群から選択されるＮｒｆ２−ＡＲＥ経路の活性剤である。
【００１０】
運動ニューロン疾患（ＮＭＤ）は、運動ニューロンの数々の疾患に及ぶように使用した全てを包含する用語である。筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、進行性筋萎縮症（ＰＭＡ）、進行性球麻痺（ＰＢＰ）、原発性側索硬化（ＰＬＳ）は、全てサブタイプである。ＭＮＤはヨーロッパにて頻繁に使用される総称であるとともに、ＡＬＳは米国にてより一般的に時々使用される。当業者は、運動ニューロン疾患（ＮＭＤ）による関係が、またＡＬＳ、ＰＭＡ、ＰＢＰおよびＰＬＳの関連に及び、これらの挙げた疾患の状態は交互に使用することが可能であることを理解するだろう。
【００１１】
本明細書の記載および請求項の全体を通じて、「含有する（ｃｏｍｐｒｉｓｅおよびｃｏｎｔａｉｎ）」という単語および単語の語尾変化、例えば「含有する（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇおよびｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、「含有するが、制限しない」ことを意味するが、他の部分、添加、成分、整数または工程を排除することを意図するものではない（排除しない）。
【００１２】
本明細書の記載および請求項の全体を通じて、単数形は、文脈が他に要求しない限り複数形を包含する。特に、不定冠詞を使用する場合、この記載は、文脈が他に要求しない限り複数形ならびに単数形として考えるとして理解される。
【００１３】
本発明の特定の態様、実施形態または実施例と共に記載した特性、整数、特徴、化合物、化学的部分または群は、それと互換性がない限り、本明細書に記載のあらゆる他の態様、実施形態または実施例に適応することが可能であると理解される。
【００１４】
本発明は、アンドログラホリドおよびＳ[＋]アポモルフィンが、ＣＮＳを移行する性能を有する、有力且つ「薬物のような」Ｎｒｆ２−ＡＲＥ活性剤であるスクリーンおよび試験のカスケードを通して論証した。
【００１５】
本発明の化合物は、それら単独または治療療法の一部のいずれかに、予防的または治療的に使用することができる。
【００１６】
いうまでもなく、本明細書において使用するように「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」および「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」という用語は、状態、例えば疾患または障害を予防する目的で、患者の処置および管理を意味する。この用語は、患者が患う所定の状態で十分な薬効範囲の治療、例えば症状または合併症を軽減や、疾患、障害または状態の進行を遅延や、症状および合併症を軽減または緩和、および／または、疾患、障害または状態を治療または除去ならびに状態を防ぐために活性化合物の投与を含有することを意図し、予防は疾患、状態または障害を予防する目的のために患者の処置および管理として理解され、症状または合併症の発症を予防する活性化合物の投与を含有する。治療される患者は好ましくは哺乳類、特に人間であるが、それはまた動物、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ヒツジおよびブタを含有することができる。
【００１７】
本発明のさらなる態様によると、運動ニューロン疾患の治療に対する薬剤を製造するために、アンドログラホリドおよびＳ[＋]アポモルフィンを含有する群から選択されるＮｒｆ２−ＡＲＥ経路活性剤の使用を提供する。
【００１８】
アポモルヒネは、間欠注射または持続注入として通常皮下に投与されるドーパミン作動薬である。それは、進行したパーキンソン病の処置において実用的であり、神経外科処置に選択肢を提供する。[Ｓ]＋鏡像異性体の化合物が、ＡＬＳまたは他の病状の治療において実用的であることができる、従来の臨床徴候にも全く存在しない。結果は、特にドーパミン作動薬活性を有さないＳ鏡像異性体が、本発明の方法に規定され、上記のように示したＡＬＳ治療のために正しい基準を有する。従って、本発明は、アポモルヒネの[Ｓ]＋鏡像異性体の新規な治療有効性を認識する。
【００１９】
アポモルヒネの化学構造を、以下に記載し、[Ｓ]＋鏡像異性体のあらゆる変異体および置換物を、本発明の化合物の範囲内に包含することを認めるだろう。さらに[Ｓ]＋鏡像異性体のあらゆる誘導体または塩を、本発明の範囲に含み、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ０３／０８４４８号明細書の内容を、本明細書に参考文献として組み込むものとする。
【００２０】
【化１】
【００２１】
アンドログラホリドは、植物アンドログラフィスパニクラータのジテルペノイドラクトンであり、ある特定の癌、例えば乳癌で抗腫瘍活性を有し、抗炎症剤効果を有することが知られている。前記化合物が、例えば限定されないがＡＬＳ酸化ストレスと関連のある疾患の治療において、実用的である可能性がある過去の臨床徴候は全く存在しない。従って本発明は、アンドログラホリドの新規な治療有効性を認識する。
【００２２】
アンドログラホリドの化学構造を、以下に記載し、あらゆる変異および置換物を、本発明の化合物の範囲内に包含すると認めるだろう。例えば、アンドログラホリドおよびその誘導体は、Ｒ．ｓｕｂ．１、Ｒ．ｓｕｂ．２およびＲ．ｓｕｂ．３が独立して水素、アシル、フェニル、モノリン酸塩、ポリリン酸塩、モノ硫酸塩、ポリ硫酸塩、グリコシル、環状アルキル、非環状アルキル、アルケニルまたはアルキニルを示すことができる一般式であり、前記リン酸塩もしくは硫酸塩の誘導体は、遊離酸もしくは塩の形態であることができる。
【００２３】
【化２】
【００２４】
好ましくは、本発明の化合物を、治療を必要とする患者への投与で適切な薬剤形態に処方することできる。
【００２５】
医薬品組成物は、経口、非経口、局所、鼻腔内、眼、耳、直腸または経皮の投与で適切なあらゆる形態であることができる。前記組成物が非経口投与を意図する場合、それらを静脈内、筋肉内、腹膜内、皮下の投与、標的器官または組織内へ注射、点滴もしくは送達の他の手段によって直接的な送達で処方することができる。前記送達は、大量瞬時投与、短期注入または長期注入によることが可能であり、受動デリバリーまたは適切な薬物注入ポンプの利用により可能である。
【００２６】
従って、本発明の化合物は、製薬成分または賦形剤をさらに含有する。
【００２７】
「製薬成分」または「賦形剤」は、本発明の化合物に添加される薬理的に不活性な製薬学的に許容される化合物を意味する。前記成分または賦形剤は、薬理学的特性を全く有さない。
【００２８】
本発明のさらなる態様によると、酸化ストレスの結果として生じる神経変性状態を治療する治療薬を提供し、前記治療薬はアンドログラホリドおよびＳ[＋]アポモルフィンを含有する群から選択されるＮｒｆ２−ＡＲＥ経路の活性剤である。
【００２９】
好ましくは、酸化ストレスによって媒介されることが知られている神経変性状態は、運動ニューロン疾患、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、原発性側索硬化（ＰＬＳ）、ハンチントン病、加齢黄斑変性症、移植／外科的手法のための臓器の保持、細胞培養の安定化、発光性酸化ストレス、皮膚老化および放射線障害性細胞損害の治療を含有する群から選択される。
【００３０】
本発明のさらなる他の態様によると、酸化ストレスの結果として生じる疾患または状態を治療するアンドログラホリドの使用を提供し、前記疾患または状態は、運動ニューロン疾患、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、原発性側索硬化（ＰＬＳ）、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、加齢黄斑変性症、移植/外科的方法のため臓器の保持、細胞培養の安定化、発光性酸化ストレス、皮膚老化および放射線障害性細胞損害の治療を含有する群から選択される。
【００３１】
本発明のさらなる他の態様によると、アンドログラホリドおよびＳ[＋]アポモルヒネを含有する群から選択される、Ｎｒｆ２−ＡＲＥ経路の活性剤の治療の有効量を投与することを含有する酸化ストレスの結果として生じる神経変性疾患を患う個体の治療法を提供する。
【００３２】
本発明のさらなる態様によれば、候補治療薬のライブラリのスクリーニングを行う生体外の方法を、酸化ストレスによって媒介されることが知られている疾患を治療するそれらの安定性に関して提供し、前記方法は：（ｉ）非神経細胞に由来のコントロールまたは正常の細胞を候補の治療にさらし、Ｎｒｆ２−ＡＲＥ経路を活性化する性質を有する候補薬を同定する工程と、（ｉｉ）神経細胞に由来の細胞を、工程（ｉ）において陽性の効果を有する候補薬とさらし、Ｎｒｆ２−ＡＲＥ経路を活性化するそれらの性能を評価する工程と、（ｉｉｉ）神経細胞由来の細胞を保護する候補薬の性能を、酸化ストレス障害に対して評価する工程と、（ｉｖ）物理的および化学的パラメータを確認する一連のコンピュータの試験を実行する工程を含有し、陽性の結果を工程（ｉ〜ｉｉｉ）において有し、適切な物理−化学特性を有する治療候補は、酸化ストレスによって媒介されることが知られている疾患の治療に適切である可能性がある。
【００３３】
本発明は、ＣＮＳを透過する性能をも有するより有力且つ「薬物類似の」Ｎｒｆ２−ＡＲＥ活性剤を同定するスクリーニング法として便利なカスケードの試験を提供する。本発明の方法は、さらなる生体内試験で期待のできる少数の分子を選択する強力なスクリーニングカスケードを提供する。これらの「ヒット」分子を、最初にＮｒｆ２−ＡＲＥ経路を正常な非ヒトの動物由来の細胞株およびヒト発生の細胞株において活性化するそれら性能を試験し、その後経路が非ヒトの動物のＣＮＳから一次培養由来の神経細胞にて活性化できるか決定する「ツール」分子として使用する。
【００３４】
好ましくは、細胞が由来する非ヒトの動物を、サル、イヌ、ネコ、ラビット、ラットおよびマウスを含有する群から選択する。齧歯目の動物が好ましく、マウスが最も好ましい種である。
【００３５】
好ましくは、本発明の一実施形態において、細胞をＡＲＥレポータコンストラクトで安定してトランスフェクションして、任意にリポータは蛍光薬品、例えば限定されないがＧＦＰ等である。
【００３６】
好ましくは、細胞をＮｒｆ調節遺伝子の増加した発現で分析する。活性化を検出するための適切な方法を、本明細書の以下に記載する。
【００３７】
好ましくは、神経細胞由来の細胞は、ＣＮＳ細胞であり、特に星状細胞である。本発明の一実施形態において、それらがヒトＳＯＤ１のＧ９３Ａ突然変異体形態を発現するトランスジェニック非ヒトの動物から由来するものである。
【００３８】
好ましくは、工程（ｉｉｉ）の酸化ストレス試験は、血清の回収、酸化ストレスを、任意にジクロロフルオレッセインもしくは誘導体との測定、ミトコンドリア毒素（メナジオン）とインキュベーションおよび細胞生存率の測定を含有する。しかしながら、他のストレス試験を本発明の方法において用いることができることを認識するだろう。
【００３９】
好ましくは、工程（ｉｖ）の適切な物理的および化学的パラメータは、ｃＬｏｇＰ＜５、分子量＜５００、＜５水素結合供与体（ＯＨ＋ＮＨ数）および＜１０水素結合受容体（Ｏ＋Ｎ原子）である。適切な物理学的および化学的パラメータは、典型的にＬｉｐｉｎｓｋｉの法則の５とする。さらにＡｌｏｇＰが４未満であるが１を超え、分子極性表面積１００（理想８０）未満は、血液脳関門（ＢＢＢ）を通る受動拡散に最適であるが、さらなる好ましい特徴を、候補治療薬を最も良好に選択するためにまた利用することができる。
【００４０】
本発明の特定の態様に起因するあらゆる特徴は、必要な変更に加える各々およびいずれかの態様にも適応することを意図する。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】本発明において使用したＮＲＦ２−ＡＲＥ分析の概略図を示す図である。
【図２】分析検証の結果を示すグラフである。図２ａは、ＣＨＯ−４ｘＡＲＥ−ＴＫ細胞株におけるｔＢＨＱ（白丸）およびＥＧＣＧ（黒丸）の濃度反応曲線を示すグラフである。両方の分子は、それぞれ１０μＭおよび１００μＭで、ＡＲＥ活性ピークの制限された領域を有する。図１ｂは、Ｚ’スコア測定の結果を示すグラフである。単一の３８４穴プレートから賦形剤（１９２穴）および陽性対象（１０μＭエブセレン、１９２穴）に対する平均±ＳＤを示す。この分析のＺ’スコアは、０．５１であり、シグナルのノイズに対する比率（Ｓ／Ｎ）およびシグナルのバックグラウンドに対する比率（Ｓ／Ｂ）は、それぞれ１２．８および２．９を有する。
【図３】一つの３８４穴プレートのスペクトルライブラリスクリーニングデーターの例を示すグラフである。ＧＦＰ蛍光対穴の数である。穴１〜２４および３６０〜３８４は交互の陽性（１０μＭエブセレン）および陰性（賦形剤）コントロールを含有する。点線は陰性対象の平均＋３ＳＤを示し、この線を越える全ての化合物は、「ヒット」として計数される。いくつかの穴は減少した蛍光を示し、おそらく毒性によるものである。
【図４ａ】４６個のヒットの化合物全てに関するオーバーレイ濃度反応曲線を示すグラフである。多くのヒット化合物に関するプロフィールは、高い濃度における毒性のため減少した蛍光で円錐形の用量反応曲線の結果になり、ＡＲＥ誘導の制限された領域を有することに示す。
【図４ｂ】高濃度またはＡＲＥ誘導の広い範囲にて最小の毒性を有する化合物の例を示し、該化合物のほとんどは、多少の毒性を１００μＭで示すグラフである。
【図５】Ａ／一次スクリーン（ＥＣ５０＜５μＭを有する化合物）およびＢ／星状細胞酸化的ストレス分析を１３２１Ｎ１細胞（ＥＣ５０＜３μＭを有する化合物）からの化合物のファーマコフォアモデルおよび配列を示す図である。芳香族/疎水性の特徴を緑色、水素結合受容体の特徴を青色で示す。（Ｂ）に関して、塩基性ファーマコフォアは、水素結合受容体と関連する２つの疎水性特徴で現れる。これはＫＥＡＰ１にメルカプト基の求核攻撃によって作用することができる既知のＮＲＦ２活性剤である細胞質ＮＲＦ２調節因子と一致する。
【図６】ＡＲＥリポータ分析の結果を、Ｃ６星状細胞の細胞株において１７の最もヒット化合物およびＳ[＋]アポモルヒネで示すグラフである。全体として反応は、ＣＨＯ細胞株において見られるものと同程度であり、Ｒ[−]およびＳ[＋]アポモルヒネの両方は、この活性がＲ[−]アポモルヒネのドーパミン作動薬活性に無関係であることを示唆するＮｒｆ２−ＡＲＥ経路を同程度誘導する。ＮＳＣ３４細胞株における反応は、実質的に減少したか、大部分の化合物で存在しない（図示せず）。
【図７】ＮＲＦ２調節因子遺伝子をラットＣ６星状細胞の細胞株（Ｃ６星状細胞、図７ａおよび図７ｂ）および一次マウス星状細胞（図７ｃおよび図７ｄ）において、２４時間アンドログラホリド（Ａｎｄｒｏ）およびＳ[＋]アポモルヒネ（Ａｐｏ Ｓ）のＥＣ５０とＥＣ９０濃度にて処理した後に、定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析を示すグラフである。マルチプレックスＰＣＲを使用して、Ｎｒｆ２そのものを含有する関連の９つ遺伝子の発現レベルを、Ｃ６細胞において薬物治療後に調べた。２つの遺伝子、Ｈａｅｍオキシゲナーゼ１およびＮＱＯ１のみが、（ａ）および（ｂ）にそれぞれ示すように、統計学的に有意な差を遺伝子発現において示した。一次マウス星上細胞における同じ条件下にて、これら２つの遺伝子の標準の定量ＲＴ−ＰＣＲを、また（ｃ）および（ｄ）で実行した。星印は、をＤＭＳＯコントロールにおける有意な差を一元配置分散分析で示す。
【図８】ＮＲＦ２誘導物質は、運動ニューロン（ＭＮ）を一次マウス星状細胞／ＭＮの共培養にてメナジオンストレスから保護することを示すグラフである。共培養を、２４時間、Ｓ[＋]アポモルヒネ（Ａｐｏ Ｓ）およびアンドログラホリド（Ａｎｄｒｏ）と、それらのＥＣ５０およびＥＣ９０にてそれぞれ、ラットＣ６ ４×ＡＲＥ−ＴＫリポータ細胞にて測定したように前処理した。その後共培養を、６時間１０μＭメナジオンで行い、酸化ストレスを誘導した。ＤＭＳＯコントロール細胞において、運動ニューロン数における約２５％の減少を、いずれかの薬物で処理した穴においては見られなかったことで観測した。
【図９】一次マウス星状細胞におけるＮｒｆ２誘導物質とＥｃ５０およびＥＣ９０濃度にて処理した後の、Ｈａｅｍオキシゲナーゼ１で染色する免疫蛍光を示す図である。面積および染色強度を、Ｉｍａｇｅ Ｊを使用して定量化し、染色指数を算出するために使用した。
【図１０Ａ】総グルタチオンレベルを、一次マウス星状細胞にて、Ｎｒｆ２誘導物質とＥＣ５０およびＥＣ９０濃度にて処理した後のグラフを示す。総グルタチオンレベルを標準の方法を使用して、Ｎｒｆ２誘導物質で２４時間前処理した後に測定した。全ての処理は、グルタチオンレベルをＤＭＳＯコントロールに対する星状細胞にて有意に上昇させ、両方の薬物のＥＣ９０濃度は、細胞外グルタチオンレベルを有意に上昇させた（＊ｐ値＜０．００５）。データは、３つの独立した実験の平均である。
【図１０Ｂ】総グルタチオンレベルを、一次マウス星状細胞から収集されて調製された培地にて、Ｎｒｆ２誘導物質とＥＣ５０およびＥＣ９０濃度にて処理した後のグラフを示す。総グルタチオンレベルを標準の方法を使用し、Ｎｒｆ２誘導物質と２４時間前処理した後測定した。全ての処理は、グルタチオンレベルを星状細胞にて、ＤＭＳＯコントロールに対して有意に上昇させ、両方の薬物ＥＣ９０濃度は、細胞外グルタチオンレベルを有意に上昇させた（＊ｐ値＜０．００５）。データは、３つの独立した実験の平均である。
【図１１】Ｎｒｆ調節遺伝子ＮＱＯ１（ａ）およびＨａｅｍオキシゲナーゼ１（ＨＯＸ１）で、Ｇ９３Ａ突然変異体ＳＯＤ１を過剰発現する一次マウス星状細胞において、アンドログラホリド（Ａｎｄｒｏ）およびＳ[＋]アポモルヒネ（Ａｐｏ Ｓ）とＥＣ５０およびＥＣ９０濃度にて２４時間処理した後の、定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析を示すグラフである。星印は著しい差をＤＭＳＯコントロールから一元配置分散分析で示す。
【図１２Ａ】Ｓ[＋]アポモルヒネ（Ａｐｏ Ｓ）に関する生体内薬物動態学的時間的経過を示すグラフである。
【図１２Ｂ】相当するＰＫパラメータをマウスにおいて示す表である（時点あたりのｎ＝３または４）。
【図１２Ｃ】マウスにおける一回の皮下注射後６，２４および４８時間で、２．５または５．０ｍｇ／ｋｇのＳ[＋]アポモルヒネ（Ａｐｏ Ｓ）のいずれかの、ＨＯ−１およびＮＱＯ−１に関するＱＲＴ−ＰＣＲを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
細胞培養
チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ＮＳＣ３４マウス運動ニューロン細胞、Ｃ６（ラット）および１３２１Ｎ１（ヒト）星状細胞株を、１０％ＦＢＳおよびペニシリン／ストレプトマイシンで補うＤＭＥＭ中に、通常保持した。ＴＫ−ＥＧＦＰリポータコンストラクトは、ｐＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）の多重クローニング部位で挿入される１２３ｂｐチミジンキナーゼプロモータからなり、ＡＲＥ−ＴＫ−ＥＧＦＰは、また４１ｂｐ ＧＳＴ ＡＲＥモチーフ(TAGCTTGGAAATGACATTGCTAATCGTGACAAAGCAACTTT) (SEQ ID NO: 1) ３’の４つの繰り返しをＴＫプロモーターに含有する。これらプラスミドをＣＨＯ、Ｃ６および１３２１Ｎ１細胞株内に、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、０．５ｍｇ／ｍＬのＧ４１８において１０〜１４日の選択後、トランスフェクションし、それらをそれぞれの細胞株に関する２つの一連の細胞分取で蛍光活性細胞分取（ＢＤ、ＦＡＣＳＡｒｉａ）を使用して、基底ｅＧＦＰ発現で拡大および選択した。基底ｅＧＦＰ発現を有する安定したトランスフェクションのこれらの混合集団を、その後の分析に使用し、ＡＲＥを含有する株で４×ＡＲＥ−ＴＫ−ＧＦＰおよびコントロール細胞株でＴＫ−ＧＦＰを指定した。ＮＳＣ３４細胞株をＧ９３Ａ突然変異体ＳＯＤ１でトランスフェクションし、安定してトランスフェクションした単一細胞のクローンを２５０μｇ／ｍＬのＧ４１８において選択および限界希釈法によるクローニングによって分離した。
【００４３】
ＡＲＥリポータ分析−スペクトルライブラリスクリーン検証
２０００個の小分子薬物および天然産物のスペクトルライブラリをスクリーンするため、ＴＫ−ＧＦＰ ＣＨＯ ＡＲＥリポータ細胞株は、３８４穴プレートにおいて（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ−ｏｎｅ， μＣｌｅａｒ， ｂｌａｃｋ）、表面被覆密度の範囲（分析の２４時間前に５〜２０×１０４／ウェルにて播種した）および異なる培地を使用してＺ’スコア分析を受けた。交互の穴は、０．３μＭエチジウムホモ二量対（ＥｔｈＤ１）を含むＰＢＳを有する培地を交換した２４時間後に、１０μＭのエブセレンおよび賦形剤（０．１％ＤＭＳＯ）とインキュベートした。このエブセレン濃度は、この薬剤に関してはおおよそのＥＣ９０を示す。その後ＧＦＰ蛍光（ＡＲＥ誘導）を、Ｅｘ４８５ｎｍ／Ｅｍ５３０ｎｍにおいてＦｕｓｉｏｎ万能型プレートリーダ（Ｐａｃｋａｒｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して測定した。ｚスコアを以下のように算出した：
【００４４】
【数１】
【００４５】
ＳＤ＋＝陽性対照穴の標準偏差
３ＳＤ−＝陰性対照穴の標準偏差
Ａｖｅ＋＝陽性対象穴の平均蛍光測定値
Ａｖｅ−＝陰性対象穴の平均蛍光測定値
【００４６】
シグナルのノイズに対する比率（Ｓ／Ｎ＝Ａｖｅ＋／ＳＤ＋）およびシグナルのバックグラウンドに対する比率（Ｓ／Ｂ＝Ａｖｅ＋／Ａｖｅ−）をまた異なる分析条件で測定した。許容できるＺ’スコアは＞０．５である。ライブラリスクリーンでは、細胞を２０×１０４の密度で、１０％ＦＢＳを含有する通常のＤＭＥＭ培地中に、−１日目および０日目に播種し、細胞を２４時間無血清培地で薬物にてインキュベートした。培地を手動で取り除き０．１％ＤＭＳＯ中に、１０μＭまで希釈したスペクトルライブラリで、Ｑ−ｂｏｔ ｌｉｑｕｉｄ ｈａｎｄｌｉｎｇシステム（Ｇｅｎｅｔｉｘ， Ｎｅｗ Ｍｉｌｔｏｎ， ＵＫ）を使用して置換した（１化合物／穴）。前記培地を２４時間後取り除き、同じ体積の０．３μＭのＥｔｈＤ１を含有するＰＢＳで置換した。その後ＧＦＰ蛍光（ＡＲＥ誘導、ＥＸ４８５ｎｍ／ＥＭ５３０ｎｍ）およびＥｔｈ Ｄ１蛍光（毒性Ｅｘ５３０ｎｍ／ＥＭ６４５ｎｍ）を、Ｆｕｓｉｏｎ万能型プレートリーダ（Ｐａｃｋａｒｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して測定した。ＴＫ−ＧＦＰ ＣＨＯ ＡＲＥ細胞株を単一時点分析にて二度スクリーンし、コントロールＴＫ−ＧＦＰ ＣＨＯ細胞株を１度スクリーンし、偽陽性を排除した。図１は、ＮＲＦ２−ＡＲＥ分析の概略図を示す。
【００４７】
ＡＲＥリポータ分析−ＥＣ５０の測定
４×ＡＲＥ−ＴＫ−ＧＦＰ ＣＨＯまたはＴＫ−ＧＦＰ ＣＨＯを発現する細胞の密集培養物を９６または３８４穴組織培養プレートにて、ＦＣＳを含まないＤＭＥＭ中に薬物（０．０１〜１００□Ｍを三回繰り返し）または賦形剤（０．１〜１％ＤＭＳＯ）と、三回繰り返して２４時間処理した。前記培地を取り除き、０．３μＭＥｔｈＤ１を含有するＰＢＳの同じ容量と置換した。その後ＧＦＰ蛍光（ＡＲＥ誘導、Ｅｘ４８５ｎｍ／ＥＭ５３０ｎｍ）およびＥｔｈ Ｄ１蛍光（毒性Ｅｘ５３０ｎｍ／Ｅｍ６４５ｎｍ）を、Ｆｕｓｉｏｎ万能型プレートリーダ（Ｐａｃｋａｒｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して測定した。非線形回帰を使用して、片対数プロットにＳ字状の用量反応曲線を適合させ、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用してＥＣ５０を算出した。リポータ分析を、４×ＡＲＥ−ＴＫ−ＧＦＰおよびＴＫ−ＧＦＰコンストラクトと安定してトランスフェクションされたＣ６および１３２１Ｎ１星状細胞の細胞株にて、Ｅｔｈ Ｄ１を直接培地に添加して、細胞を１度洗浄し、ＤＣＦシグナルを読む前に読んだことを除いて、同様に実施した。
【００４８】
酸化ストレス分析
簡単な酸化ストレス分析を使用して、ＮＲＦ２−ＡＲＥ誘導薬剤とのあらかじめ調整が、その後の酸化ストレス障害（血清回収）に対して予防することができるかを決定した。ＮＳＣ３４、Ｃ６および１３２１Ｎ１細胞を、９６穴組織培養プレートにて播種し、３０％の密集を達成した。それらは薬物と３重の穴で、９点滴定（１００□Ｍ〜１０ｎＭ）として２４時間インキュベートした。細胞密度を観測して、生じた十分な毒性または成長阻害がないことを確認した。その後培地を、無血清のフェノールを含有しない培地と５時間で置換した。ジクロロフルオレセイン（ＤＣＦ）およびエチジウムホモダイマー（ＥｔｈＤ１）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｐａｉｓｌｅｙ， ＵＫ）を、最終濃度５μＭおよび０．３μＭまで細胞に添加し、ＤＣＦおよびＥｔｈＤ１蛍光をＥｘ４８５ｎｍ／Ｅｍ５３０ｎｍ、Ｅｘ５３０／Ｅｍ６４５ｎｍのそれぞれで、１時間後に読み込んだ。その後、細胞生存率分析を、保護が％減少としてＤＣＦシグナルにて測定されるように細胞に実行し、従ってデータ点は細胞数の減少を測定した場合に除外した。
【００４９】
細胞生存率分析
使用した方法は、基本的に上記従来技術に記載されるようなものである。簡潔には、メチルチアゾリルジフェニルテトラゾリウムブロマイド（ＭＴＴ）は、細胞および空白の穴に最終濃度０．５ｍｇ／ｍＬまで添加し、３７℃にて１〜３時間、使用した細胞株に依存してインキュベートした。細胞および反応産物を、２０％ＳＤＳ／５０％ＤＭＦにて１時間で、Ｅｘ５９５ｎｍで吸光度を読み込む前に室温にて振盪して可溶化した。
【００５０】
ＮＳＣ３４細胞を発現するＧ９３Ａ ＳＯＤ１（ＡＬＳ細胞モデル）における基底酸化ストレス分析
ＮＳＣ３４細胞を発現するＧ９３Ａ ＳＯＤ１を、１０％ＦＢＳを含むフェノールレッドを含有しないＤＭＥＭにて３０〜４０％密集まで、９６穴組織培養プレートを播種した。その後それらを、０．０１，０．１，１，１０μＭの薬物または賦形剤（０．１％ＤＭＳＯ）と３重の穴にて２４時間インキュベートした。細胞質反応性酸素の種類のレベルを、ＤＣＦおよびＥｔｈＤ１を使用して酸化ストレス分析のように測定した。
【００５１】
一次マウス運動ニューロン／星状細胞の共培養
マウス膠培養を、１〜２日齢の子犬のＣ５７ＢＩ／６皮質から確立した。皮質を解剖し、細胞をＤＮａｓｅＩ、コラゲナーゼおよびトリプシン中にてインキュベートした後、粉砕によって分離した。インキュベーションおよび粉砕の工程を、細胞の完全な分離を確実にするため繰り返した。細胞を、１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１０μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ中に、４５，０００細胞／ｃｍ２にて播種した。２４時間後、培養をＰＢＳで洗浄し、２〜３週間、密集になるまで成長させ、１週間に一度培地を変えた。密集膠の培養を、振盪および軽度のトリプシン処理によって星状細胞で濃縮した。濃縮された星状細胞を密集するまで成長させ、ポリ−D−オルニチン(1.5 mg/mＬ; Ｓｉｇｍａ， Ｐｏｏｌｅ， ＵＫ）と４０，０００細胞／ｃｍ２まで被覆したカバーグラス上に播種し、１週間成長させた。
【００５２】
一次脊髄運動神経細胞（ＭＮ）を、Ｅ１３．５野生型Ｃ７ＢＩ／６マウス胚から培養した。簡潔には、脊髄調製を、トリプシンおよびＤＮａｓｅＩにてインキュベーションした後、粉砕によって分離した。その後ＭＮを、密度勾配遠心分離によって分離した。共培養を、１％Ｂ２７、２％ウマ血清、５０ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン、５０Ｕ／ｍＬペニシリン、０．５ｍＭＬ−グルタミン、２５ｍＭグルタミン酸（全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｐａｉｓｌｅｙ， ＵＫからのものである）、１ｎｇ／ｍＬＢＤＮＦ、１０ｎｇ／ｍＬＣＮＴＦ、および１００ｐｇ／ｍＬＧＤＮＦ（全てＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ａｂｉｎｇｄｏｎ， ＵＫからのものである）で補足したＮｅｕｒｏｂａｓａｉ培地中に、８０００／ｃｍ２でＭｎを星状細胞に配置することによって確立した。
【００５３】
共培養を２週間で確立したとき、神経保護分析を、６時間の１０μＭメナジオン酸化ストレスまたはグルタミン酸塩で処理した後、薬物または賦形剤に２４時間さらすことによって実行した。ストレス処理後、カバーグラスを３回洗浄し、運動ニューロンをＳＭＩ３２（Ｃｏｖａｎｃｅ）で選択的に染色するため固定し、透過させた。
【００５４】
全ＭＮを、カバーグラスあたり１．５ｃｍ２面積において蛍光顕微鏡検査によって計数した。最低３回の繰り返し３回を１条件あたりに実行した。賦形剤および薬剤の処理の両方を、ストレス処理前および後に計数し、結果を二元配置分散分析によるボンフェローニのポスト試験を使用して統計学的に分析した。
【００５５】
総グルタチオン分析
一次星状細胞を密集するまで２４穴プレート内にて成長させ、その後１０％ＦＢＳおよびペニシリン／ストレプトマイシンを含むフェノールレッドを含有しないＤＭＥＭにおいて薬物（または０．０５％ＤＭＳＯ賦形剤）と２４時間処理した。調整した培地を収集し、その後星状細胞を、２５０μＬ／穴のスルホサリチル酸（ＳＳＡ、５％（ｗ／ｖ））の添加前に氷冷ＰＢＳにて洗浄した。プレートを２回、−８０℃にて凍結し、３７℃にて解凍し、その後４℃にて１５分間インキュベートした。上清を取り除き、１３，０００×ｇにて５分間遠心分離機で分離した。調整した培地サンプルを８０℃にて１５分間インキュベートし、その後１３，０００×ｇにて５分間遠心分離機で分離した。試料を直ちに使用するか、または−８０℃で保存のいずれかとした。反応混合物（１５０μＬ／穴；１００ｍＭリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ ７．０、１ｍＭＥＤＴＡ、６単位／ｍＬグルタチオン還元酵素、１．５ｍｇ／ｍＬ５，５’−ジチオビス（2−ニトロ安息香酸））を、９６穴プレート内の１０μＬのそれぞれの試料またはグルタチオン標準（０〜５０μＭ還元グルタチオン）に添加し、ＮＡＤＰＨ溶液（０．１６ｍｇ／ｍＬ）５０μＬ／穴の添加前に、室温にて５分間インキュベートした。Ａ４１２ｎｍを毎分１５分間測定し、総グルタチオン濃度（ＧＳＨ＋ＧＳＳＧ）を初期の量から算出した。試料を３回試験した。
【００５６】
コンピュータ内分析
さらなるスクリーニングで薬物類似の分子を選択するために、Ｐｉｐｅｌｉｎｅ Ｐｉｌｏｔ （ＳｃｉＴｅｇｉｃ， Ｌｏｎｄｏｎ， ＵＫ）をコンピュータ内分析のために使用した。分子極性表面積（ｍＰＳＡ）を、ＳＰＥＣＴＲＵＭ収集から全ての２０００分子で、適当なＣＮＳ浸透｛Ertl, 2000 #834｝の粗分析の方法として算出し、Lipinskiのフィルターを、またどの分子が最も薬物類似であるかを決定するため適用した。フィルターは、ｃＬｏｇＰ＜５、分子量＜５００、＜５水素結合供与体（ＯＨ＋ＮＨカウント）および＜１０水素結合受容体（Ｏ+Ｎ原子）を有する化合物を選択する「ルールオブファイブ」を適応した。
【００５７】
定量的ＲＴ−ＰＣＲ
マルチプレックスＰＣＲを使用して、標的遺伝子の発現レベルの変化を、アンドログラホリドおよびＳ（＋）アポモルヒネとＥＣ５０およびＥＣ９０濃度にて、Ｃ６細胞のＮＲＦ２−ＡＲＥレポータ分析において決定されるように処理した後、１３２１Ｎ１星状細胞の細胞株にて変化を検出した。ＧｅｎｏｍｅＬａｂ（商標）ＧｅＸＰ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓシステム（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して、９つの関連遺伝子（Ｈｍｏｘｉ、ＦｔＭ、Ｋｅａｐｉ、Ｇｄｃ、Ｎｆｅ２ｌ２、Ｇｓｒ、Ｎｑｏ１、ＳｑｓｔｍｌおよびＥｐｈＸ１）および３つのハウスキーピング遺伝子（１８ｓ ＧＡＰＤＨおよびＡＣＴＢ）での多重化反応において、以下の表１に概説した次のプライマーを用いて遺伝子発現の変化を同定した。
【００５８】
【表１】
【００５９】
それらは、太字の隣接するイントロン配列であり、ゲノムバックグラウンドを防ぐものを示す。ＲＴ反応混合物を、９６穴マイクロプレートに、以下の３μＬＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅを含有しないＨ２Ｏ、４μＬのＲＴ緩衝剤５×、２μＬのＲＴ Ｒｅｖ Ｐｒｉｍｅｒ Ｐｌｅｘ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、５μＬのＫＡＮｒ ＲＮＡ、５μＬの試料ＲＮＡ（２０ｎｇ／μＬ）を、２０μＬの総反応容量体積が得られるように調整した。その後試料を以下のようにインキュベートした；４８℃で１分間、３７℃で５分間、４２℃で６０分間、９５℃で５分間、４℃で保持。ＰＣＲ反応混合物を、以下の様に９６穴試料マイクロプレート内で調整した；４．０μＬ ＰＣＲ緩衝剤５×、４．０μＬ ２５ｍＭのＭｇＣｌ２（Ａｂｇｅｎｅ）、２．０μＬのＰＣＲ Ｆｗｄ Ｐｒｉｍｅｒ Ｐｌｅｘ、０．７μのサーモスタートＤＮＡポリメラーゼ、（ＡＢｇｅｎｅ ＡＢ−０９０８／Ａ）、ＲＴ反応からの９．３μＬのｃＤＮＡ試料。ＰＣＲを、以下のように実行した；（１）９５℃で１０分、（２）９４℃で３０秒、（３）５５℃で３０秒、（４）７０℃で１分、（５）工程２〜４をさらに３４サイクル繰り返し、（６）４℃で保持。予備実験に基づいて、逆ＲＴプライマー濃度を、全ての産物が単一の反応にて検出することを可能とするために最適化した。ＰＣＲ反応産物をＳＬＳ（試料負荷溶液）中に希釈し、ＧｅＸＰ毛細血管電気泳動ユニットにて分離し、データをＧｅＸＰソフトウェアおよびＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌデータパッケージを使用して分析し、ＧＡＰＤＨおよびＡＣＴＢに対する発現変化の倍率を得た。
【００６０】
標準ＱＰＣＲ
ＱＰＣＲを、刊行物Ｗｏｏｄ−Ａｌｌｕｍなど２００５で前述したように、ＲＮＡが一次星状細胞または星状細胞の細胞株から、製造業者の説明書に従ってＲＮｅａｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して分離した本質的な相違で実施した。ｃＤＮＡを、製造業者の説明書に従ってオリゴｄＴに促進されるＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用し、調製した。定量的ＲＴ−ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）をｃＤＮＡ２５ｎｇ、１×ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）使用して実行し、前方および後方プライマー（表１）の濃度を、総体積２０μＬおよびそれぞれのサンプルで３回ずつ最適化した。９５℃１０分間の変性後、産物を９５℃で１５秒間および６０℃で１分間の４０サイクルによって、ＭＸ３０００Ｐ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にて増幅した。単一の産物の増幅を確認するため、解離曲線をそれぞれの増幅に対して産生した。サンプル中の関連の遺伝子の相対的なレベルを、それぞれのサンプル中のｇａｐｄｈのものの発現レベルを基準化し、ｄｄＣｔ算出を用いて（ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ ｍｉｘおよびＲＴ−ＰＣＲプロトコル， Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）測定した。関連の遺伝子の全体的総体濃度を、賦形剤中の細胞成長に対するデータを基準化することによって薬物治療後に算出した。
【００６１】
統計分析
スペクトルライブラリスクリーンに関して、３２穴を有するそれぞれ３８４個の穴プレートを、賦形剤のみでインキュベートした（培地中０．１％）。該穴の平均蛍光読み込みおよび標準偏差を、１つのプレートずつで算出した。ヒットを、賦形剤の平均＋３つの標準偏差を超えるＧＦＰ蛍光値を有するものとして分類した。毒性を同様に規定した（即ち、賦形剤の平均＋３つの標準偏差を超えるＥｔｈＤ１蛍光値）。
【実施例】
【００６２】
実施例１
４×ＡＲＥ−ＴＫ−ＧＦＰおよびＴＫ−ＧＦＰリポータ細胞株を、既知のＡＲＥ誘導物質であるｔｅｒｔ−ブチルヒドロキノン（ｔＢＨＱ）およびフラボノイドＥＧＣＧに対するそれら反応を範囲内の濃度で試験した。この化合物を、無血清培地中の９６穴プレートの密集細胞へ２４時間三回適用し、ＧＦＰの誘導を蛍光プレート読み込みによって測定した。両方の化合物は、制限された領域において、１００μＭでピークに達するＥＧＣＧおよび１０μＭでピークに達するｔＢＨＱ（図２ａ）で、ＧＦＰ発現を誘導した。前記ピークの発現より高い濃度にて、両方の化合物は、毒性のサインを直接的な観察（細胞の欠如）または上昇したエチジウムホモダイマー蛍光によって示した。蛍光における上昇を、コントロールＴＫ−ＧＦＰ細胞株においては全く観測しなかった（図示せず）。
【００６３】
実施例２
２０００分子のスペクトル収集物をスクリーニングするため、レポータ分析を３８４穴プレートの形態に縮小した。ライブラリスクリーニングの分析の適合性を評価するため、Ｚ’スコア算出を、賦形剤（０．１％ＤＭＳＯ）および１０μＭのエブセレンを陽性のコントロールとして代替の穴を処理することによって実行した（方法における算出を参考とする）。エブセレンは、強力な濃度反応曲線を該分析にて与えることを示した。算出したＺ’スコアは、ライブラリスクリーニングで許容できる０．５１（図２ｂ）であった。さらにシグナルのノイズに対する比率（Ｓ／Ｎ）およびシグナルのバックグラウンドに対する比率（Ｓ／Ｂ）は、それぞれ１２．８および２．９にて許容できた。前記ライブラリをその後、１０μＭの化合物あたり単一の濃度でスクリーニングした。薬物ライブラリの希釈および播種を、Ｑ−ＢＯＴ液体取扱いシステムによって実行し、４×ＡＲＥ−ＴＫ−ＧＦＰリポータ細胞株およびＴＫ−ＧＦＰコントロール細胞株の両方を、化合物に対するそれらの反応で試験した。単一の３８４穴プレートからのＡＲＥ−ＴＫ−ＧＦＰ細胞株に関するデータセットの例を、図３に示す。ヒットを、バックグラウンドレベルを超える３つの標準偏差より多いデータ点として同定して、賦形剤（０．１％ＤＭＳＯ）のみで処理した２４穴の平均値であった。ヒット化合物を、それらが反応を転写の非特異的活性化または化合物の自動蛍光のいずれかにより、コントロール細胞株にて生成した場合に認識して確認した。さらに、エチジウムホモダイマー蛍光を向上させることによる毒性のサインを示すあらゆる化合物を排除した。ライブラリスクリーンを４×ＡＲＥ−ＴＫ−ＣＨＯ細胞株のみで繰り返し、両方のスクリーンからヒットとして現れた化合物を、更なる評価を進めた。全４６の化合物をこの基準で同定した。次の段階は、化合物の濃度がこれら４６のヒット化合物に対して５０％の反応（ＥＣ５０）を生じるために必要とされるかを測定することである。それぞれの化合物を、２つの穴における７点の濃度反応曲線を対象とした。多くの化合物は、標準のＡＲＥ誘導物質、例えばｔＢＨＱおよびＥＧＣＧ１に見られるものと同様の円錐形用量反応曲線を、高い濃度で毒性により示した。図４ａは、全４６個の用量反応曲線を第一分析において示す。大多数の化合物は、比較的高い濃度にて毒性を有する円錐形用量反応曲線を示し、また多くはＡＲＥ誘導の非常に制限された領域を有する。図４ｂは、レポータ発現の向上を幅広い濃度範囲（＞１ｌｏｇ単位）、または高い濃度にて最小の毒性を有する一組の化合物を示す。全４６のヒットに関する濃度反応曲線を繰り返し、ＧＦＰ蛍光の平均ＥＣ５０および平均最大倍率誘導を測定した。毒性反応の原因となる最低濃度をまた留意して、データをこれらの化合物の既知の生物活性の簡単な説明と共に、表２（本明細書の下記に示すように）に要約した。毒性を観測した最も低い服用量をまた表に記載する。化合物を、レポータ分析における活性に従ってランク付けした。最も有力なＡＲＥ誘導物質は、天然産物のアンドログラホリドで、サブマイクロモルＥＣ５０（７４０ｎＭ）を有する唯一の化合物であり、該化合物は天然産物アンドログラフィスパニクラータから由来するものであり、漢方薬およびインドの薬草剤において幅広く使用される。２６個の他の天然産物のうち、さらに２つをヒトに使用した：セクリニン、ＧＡＢＡＡ受容体アンタゴニストおよびＣＮＳ刺激薬；およびイソリキリチゲニン、アルドース還元酵素抑制剤であるカンゾウの根の成分。残りの１９個の産物は、合成の小分子または誘導体であり、これらのうちの全６つの分子は承認された薬物である。2つのアルキル化抗悪性腫瘍薬（ピポブロマンおよびメクロレタミン）、ドーパミン作動薬（アポモルヒネ塩酸塩）、局所皮膚漂白剤（ヒドロキノン）、ループ利尿薬（エタクリン酸）および血管拡張薬（イソクスプリン塩酸塩）。合成小分子のうちの１つが、第３相臨床試験を脳卒中にて達成した（エブセレン）。
【００６４】
実施例３
運動ニューロンおよび星状細胞における血清回収に誘導される酸化ストレスに応じてヒット化合物を誘導するＮｒｆ２−ＡＲＥの効果を調査した。この経路の活性化は細胞種に応じて異なることができるため、その後これらのヒット化合物が運動ニューロン細胞株（ＮＳＣ３４細胞）、ラット（Ｃ６）およびヒト（１３２１Ｎ１）星状細胞の細胞株を、血清回収による酸化ストレス誘導からどの程度保護することができるかのスクリーンを行った。細胞株を、ヒット化合物である範囲の濃度にて２４時間前処理し、ＮＲＦ２−ＡＲＥ経路を活性化した。その後、化合物を取り除き、細胞は６時間血清回収を受けて酸化ストレスを誘導した。酸化ストレスの程度をジクロロフルオレセイン（ＤＣＦ）蛍光を使用して測定し、保護の程度を、ＤＣＦ蛍光におけるパーセント減少としてそれぞれ３つの細胞株に対して表３に示した。曲線を適合することが可能である場合、半数最大効果濃度（ＩＣ５０）を生じるのに必要とされる濃度をまた提示した。一般的に、ヒット化合物は、星状細胞の細胞株にて保護効果を示す可能性が運動ニューロン細胞株より高かった。表３（本明細書の下記に示す）は、運動ニューロン細胞株における活性化によってランクを付けした全ての化合物に関する分析結果を示す。９／４６の化合物のみが、血清回収により誘導される酸化ストレスＤＣＦシグナルをＮＳＣ３４細胞にて減少し、１８／４６の化合物が該分析において効果を全く有さず、残りの１７個の化合物は該分析において酸化促進剤であった。即ち、血清回収が原因である酸化ストレスの減少に対して、それらはそれに寄与し、ＤＣＦ蛍光を上昇させた。対照的に、１つの化合物のみが１３２１Ｎ１星状細胞の細胞株にて酸化促進剤であり、２９／４６はＤＣＦシグナルを３０％以上減少させた。Ｃ６細胞株に関しては、化合物は酸化促進剤ではなく、３２／４６の化合物は、ＤＣＦシグナルを３０％以上減少させた。
【００６５】
実施例４
得た生物学的結果を合理化するため、表１で報告した化合物に関する一般的なファーマコフォアを、ＭＯＥ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ） ［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ （ＭＯＥ ２００７．０９） Chemical Computing Group, Inc. Montreal, Quebec, Canada http://www.chemcomp.com］において実行したＰｈａｒｍａｃｏｐｈｏｒｅ Ｅｌｕｃｉｄａｔｏｒを使用して研究した。ＣＨＯ４×ＡＲＥ−ＴＫ細胞株において、１０μＭ未満のＥＣ５０を有する２４個の分子を、ＮＲＦ２−ＡＲＥ経路の誘導で考慮すると（表２）、配置に応じて、それら２２は２つの共通特徴を示した：芳香族/疎水性部位および水素結合受容体部位（図５ａ）。ＥＧＣＧはまたこれらの構造的特徴を有し、算出したファーマコフォアに明らかに適合することを留意すべきである。さらに１３２１Ｎ１星状細胞の酸化ストレス分析の結果（表３）を、３μＭの活性閾値でファーマコフォアを構成するために使用したとき、１つのさらなる一般的な芳香族／疎水性の特徴を同定した（図５ｂ）。これはＫＥＡＰ１へメルカプト基の求電子攻撃によって作用することができる既知のＮｒｆ２活性剤である細胞質Ｎｒｆ２調節因子と一致する。これら事前のモデリングデータを使用して、Ｎｒｆ２−ＡＲＥ経路の潜在的な活性剤の構造の必要条件を理解することができ、このクラスの化合物の新規構造のデザインとして考慮することができた。
【００６６】
実施例５
化合物の物理学的／化学的な性質を評価した。関連した細胞型における機能効果で化合物をスクリーニングすることに加えて、また化学的／物理学的性質を算出する化学情報プログラムであるＰｉｐｅｌｉｎｅ Ｐｉｌｏｔを、表３に示すように使用した。ＡＬｏｇＰ（オクタノール/水の分割の対数）および分子極性表面積（ｍＰＳＡ）は、化合物の親油性の相違の測定であり、可能性があるＣＮＳ浸透度の初期の予測を可能とする。ＣＮＳ浸透度に関しては、ＡｌｏｇＰが１を超えるが４未満、ｍＰＳＡが１００未満（理想的には８０）は、ＢＢＢに通過する受動拡散のために最適である。さらにＬｉｐｉｎｓｋｉのフィルターを使用して、非薬物類似分子を同定し、４つ（スィーテノリド三酢酸、エンデカフィリンＸ、ロバル酸およびオイホールアセタート）を排除した。
【００６７】
不要な分子のみを濾過して取り除くため、ＮＳＣ３４酸化ストレス分析（表３）にて保護または中性の効果を有するものを選択し、既知の細胞分子を除外した（ピポブロマン、クロルデン、アラクロール、プロパクロル）。ＡｌｏｇＰおよびｍＰＳＡの基準を残りの２２の分子に適応すると、さらなる調査で１７分子が残存した。前記分子を表３において太字で強調し、「最良のヒット」の分子として称する。さらに毒性を観測した最小の投薬量を示した。ＮＡ、適用できない（不十分なデータ、反応濃度なしまたは阻害なし）。表３で化合物を、ＮＳＣ３４細胞株における保護性能によって分類する。ＡＲＥ誘導物質は、星状細胞の細胞株（１３２１Ｎ１およびＣ６）で酸化ストレスからの保護に、ＮＳＣ３４細胞と比較してはるかに効果的である。
【００６８】
実施例６
神経細胞および星状細胞の細胞株における最もヒットの化合物のＮＲＦ２−ＡＲＥ誘導活性を調査した。星状細胞および運動ニューロンの細胞株における保護における相違が、これら細胞種においてＮＲＦ２−ＡＲＥ経路の活性化の程度での相違によるものであるかを決定するため、ＮＲＦ２−ＡＲＥレポータコンストラクトを、星状細胞（Ｃ６）および運動ニューロン（ＮＳＣ３４）細胞株にて安定して発現させた。その後１７個の最良のヒットの分子を、それぞれの細胞株においてスクリーンした。またアポモルヒネのＳ[＋]鏡像異性体をスクリーンし、それがＲ[−]またはＳ[＋]鏡像異性体のいずれかとして存在することができるためである。Ｒ[＋]鏡像異性体が、ドーパミン作動薬活性を有する一方、Ｓ[＋]鏡像異性体は前記活性を欠如し、そのためそれがＮＲＦ２−ＡＲＥ誘導活性を維持するかどうかを決定する必要性があった。Ｃ６レポータ細胞株での結果を図６に示した。一般的にＣ６細胞におけるＮＲＦ２−ＡＲＥ経路の活性化は、ＣＨＯ細胞株において見られるものと同様である。ＮＳＣ３４レポータ細胞株は、星状細胞の細胞株対初期に見られたＮＳＣ３４細胞において酸化ストレスに対してより大きな保護のために、根本的な原因を示唆する同じセットの濃度反応曲線を有するあらゆる活性化が、星状細胞の細胞株におけるＮＲＦ２−ＡＲＥ経路のより強い活性化による場合には、最小限を示した。さらに、アポモルヒネのＳ[＋]鏡像異性体は、前記活性がドーパミン受容体作動薬に無関係なことを示すＲ[＋]鏡像異性体と比較して、ＮＲＦ２−ＡＲＥ活性化に関して同様に有力であり、Ｓ[＋]鏡像異性体はドーパミン作動薬でないためである。
【００６９】
運動ニューロン疾患における臨床試験のために、急速な発展する可能性を有する分子を同定することが目的であった。これに関する重要な基準の一つは、分子がＭＮＤのためでないがヒトにおける過去の使用を有することである。１７個の最もヒットの分子の中、２つはヒトにおいて天然産物（セクリニン、アンドログラホリド）として過去の使用を有し、１つは症状の発現からパーキンソン病における「オフ」の事例の急性救済で使用される現在認可の薬物（Ｒ鏡像異性体としてのアポモルヒネ塩酸塩）である。さらにヒドロキノンは、局所塗布皮膚漂白剤としてではあるが、過去の使用がある。これら薬剤の中で、アンドログラホリドおよびアポモルヒネのＳ[＋]鏡像異性体は、セクリニンがマウスおよびヒトにおいて痙攣薬特性を頻繁に記載するように、更なる評価で選択され、アポモルヒネのＳ[＋]鏡像異性体におけるドーパミン作動薬の欠如を、明確な利点と考える。
【００７０】
実施例７
Ｃ６細胞および一次マウス星状細胞におけるアンドログラホリドおよびＳ[＋]アポモルヒネによる、ＡＲＥ標的遺伝子発現の誘導を調査した。これらの好ましいまたは「主要な」分子が、星状細胞における標的遺伝子発現を導くＮＲＦ２−ＡＲＥ経路の活性化を可能とすることを確認するために、マルチプレックスＲＴ−ＰＣＲ分析をＧｅｎｏｍｅＬａｂ（商標）ＧｅＸＰ遺伝子分析システムに９つの関連遺伝子で開発した。Ｃ６細胞を、２４時間アンドログラホリドおよびＳ[＋]アポモルヒネで、Ｃ６−４×ＡＲＥ−ＴＫレポータ細胞において測定したようにＥＣ５０およびＥＣ８０濃度にて処理した。２つの遺伝子Ｈａｅｍオキシゲナーゼ１およびＮＱＯ１のみが、遺伝子発現において、統計学的に有意な変化を示し、標準の定量ＲＴ−ＰＣＲによって確認した（図７Ａおよび７Ｂ）。
【００７１】
実施例８
主なＮＲＦ２誘導分子が、標的遺伝子の発現を一次マウス運動ニューロンにおいて上昇することが可能であるため、星状細胞フィーダーレイヤーに一次マウス運動ニューロン（ＭＮ）からなる共培養を、[Ｓ＋]アポモルヒネのアンドログラホリドと前処理した後、酸化性外傷にさらした（図８）。その後共培養を、６時間の１０μＭメナジオンで与えて、酸化ストレスを誘導し、運動ニューロンを染色および計数した。ＤＭＳＯコントロール細胞において、運動ニューロン数における約２５％の減少を、いずれかの薬物で処理した穴において見られなかったことで観測した。これらの結果は、ＮＲＦ２誘導物質が、一次マウス星上細胞／ＭＮの共培養にて酸化ストレスから運動ニューロン（ＭＮ）を保護することを示す。
【００７２】
また一次マウス星状細胞において同じ条件下で、ＮＱＯ１およびＨＣＭの遺伝子の標準定量ＲＴ−ＰＣＲは、有意な上昇を遺伝子発現において明らかにした（図７Ｃおよび７Ｄ）。遺伝子発現における変化が、タンパク質の発現で付随する増加を導くことを確認するために、一次マウス星状細胞を、服用量依存的な発現向上をＤＭＳＯ処理した細胞において見られるものにわたって確認する免疫染色（図９）によって、ＨＯ−１の向上したレベルで評価した。またこの向上した抗酸化性能の機能的効果を、総グルタチオンレベルの同じ条件下における、一次星状細胞そのものと処理した星状細胞から収集した培地との両方において観測することによって見られた（図１０）。これはグルタチオンレベルが、細胞そのものおよび培地において向上したことを示した−Ｎｒｆ２に反応性の星状細胞が、隣接したＡＲＥに反応性ではないＭＮを酸化的攻撃から保護することが可能である１つの機構を提供する。
【００７３】
実施例９
得られた生物学的結果を合理化にする試みから、一般的なファルマコフォアを表２に報告した化合物に対して、ＭＯＥ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ）[Molecular Operating Environment (MOE 2007.09) Chemical Computing Group, Inc. Montreal, Quebec, Canada http://www.chemcomp.com］において実行したＰｈａｒｍａｃｏｐｈｏｒｅ Ｅｌｕｃｉｄａｔｏを使用して同定することを試みた。ＣＨＯ ＡＲＥ−ＴＫ細胞株におけるＮＲＦ２−ＡＲＥ経路の誘導に関する１０μＭ未満のＥＣ５０で２４個の分子を考慮すると（表２）、配置に応じて、それら２２は２つの共通の特徴を示した：芳香族/疎水性部位および水素結合受容体部位（図４ａ）。ＥＧＣＧは、またこれら構造的特徴を有し、算出したファーマコフォアに明らかに適合することに留意すべきである。さらに、１３２１Ｎ１星状細胞の酸化ストレス分析の結果（表３）を、３μＭの活性閾値を使用して、ファルマコフォアを構成するために使用したとき、１つの余分な共通の芳香族／疎水性特徴を同定した（図５ｂ）。これはＫＥＡＰ１にメルカプト基の求核攻撃によって作用することができる既知のＮＲＦ２活性剤である、細胞質ＮＲＦ２調節因子と一致する。これら事前のモデリングデータを使用して、ＮＲＦ２−ＡＲＥ経路の潜在的な活性剤の構造的な必要条件の理解することができ、このクラスの化合物で、新規構造のデザインで考慮することができる。
【００７４】
実施例１０
従来の研究が、突然変異体ＳＯＤを発現する運動ニューロン細胞株、および家族性ヒトＳＯＤ１症例からの星状細胞における事後の材料において、弱いＮｒｆ２反応を示したため、主な誘導物質が依然としてＧ９３Ａ突然変異体ＳＯＤ１を発現する星状細胞にてＮｒｆ２を活性化することができるかを調査した。Ｎｒｆ２調節の遺伝子であるＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：キニーネ酸化還元酵素（ＮＱＯ１）およびヘムオキシゲナーゼ１（ＨＯＸ１）が、Ｇ９３Ａ突然変異体ＳＯＤ１トランスジェニックマウスからの、一次マウス星状細胞において誘導することができるかどうかを最初に決定した。定量的ＲＴ−ＰＣＲは、ＮＱＯ１およびＨＯ１に関する転写因子において、アンドログラホリドおよびＳ[＋]アポモルヒネとそれらのＥＣ９０濃度で２４時間の前処理後に有意な上昇を示した（図１１）。
【００７５】
実施例１１
図１２は、[Ｓ＋]アポモルヒネの生体内における薬物動態学および薬力学を、雄Ｃ５７ＢＩ／マウスにて示す。化合物の[Ｓ＋]アポモルヒネレベルの、単一の静脈内への投薬を、血漿、脳および脳髄液（図１２Ａおよび１２Ｂ）において検出した後、ならびに皮下の投薬後、ＱＲＴ−ＰＣＲによって測定したＨＯ−１およびＮＱＯ−１転写酵素の投与後２４時間で、著しい誘導が存在した（図１２Ｃ）。従って、[Ｓ＋]アポモルヒネは、抗酸化酵素の発現における転写活性化にわたって、長期に渡る上昇を導くことができる。
【００７６】
これらのデータは、いくつかの化合物を生体外におけるＮＦ２−ＡＲＥ経路の活性因子であることが同定し、それらがまた生体内にて前記経路を活性化することができることを示す。
【表２】
【表３−１】
【表３−２】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
運動ニューロン疾患を治療する治療薬において、治療薬はアンドログラホリドおよびＳ[＋]アポモルヒネを含有する群から選択されるＮｒｆ２−ＡＲＥ経路の活性剤である治療薬。
【請求項２】
運動ニューロン疾患の治療のために、薬剤の製造でアンドログラホリドおよびＳ[＋]アポモルヒネを含有する群から選択されるＮｒｆ２−ＡＲＥ経路活性剤の使用。
【請求項３】
酸化ストレスの結果として生じる神経変性の状態を治療する治療薬において、治療薬はアンドログラホリドおよびＳ[＋]アポモルヒネを含有する群から選択されるＮｒｆ２−ＡＲＥ経路の活性剤である治療薬。
【請求項４】
酸化ストレスに媒介されることが知られる神経変性の状態が、運動ニューロン疾患、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）および原発性側索硬化（ＰＬＳ）、ハンチントン病、加齢黄斑変性症、移植／外科的方法のための臓器の保持、細胞培養の安定化、発光性酸化ストレス、皮膚老化ならびに放射線障害性細胞損害の治療を含有する群から選択される、請求項３に記載の治療薬。
【請求項５】
運動ニューロン疾患、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、原発性側索硬化（ＰＬＳ）、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、加齢黄斑変性症、臓器の移植/外科的方法のための保護、細胞培養の安定化、発光性酸化ストレス、皮膚老化および放射線障害性細胞損害の治療を含有する群から選択される疾患または状態である、酸化ストレスの結果として生じる疾患または状態の治療のための、アンドログラホリドの使用。
【請求項６】
付加的薬剤成分、賦形剤希釈剤またはキャリアをさらに含有する、請求項１，３，４のいずれか一項に記載の治療薬、または請求項２または５に記載の使用。
【請求項７】
非経口、静脈内、筋肉内、腹膜内、皮下の投与、または標的臓器、組織内への注射もしくは注入により直接的な送達のために処方した、請求項１，３，４のいずれか一項に記載の治療薬、または請求項２または５に記載の使用。
【請求項１】
運動ニューロン疾患を治療する治療薬において、治療薬はアンドログラホリドおよびＳ[＋]アポモルヒネを含有する群から選択されるＮｒｆ２−ＡＲＥ経路の活性剤である治療薬。
【請求項２】
運動ニューロン疾患の治療のために、薬剤の製造でアンドログラホリドおよびＳ[＋]アポモルヒネを含有する群から選択されるＮｒｆ２−ＡＲＥ経路活性剤の使用。
【請求項３】
酸化ストレスの結果として生じる神経変性の状態を治療する治療薬において、治療薬はアンドログラホリドおよびＳ[＋]アポモルヒネを含有する群から選択されるＮｒｆ２−ＡＲＥ経路の活性剤である治療薬。
【請求項４】
酸化ストレスに媒介されることが知られる神経変性の状態が、運動ニューロン疾患、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）および原発性側索硬化（ＰＬＳ）、ハンチントン病、加齢黄斑変性症、移植／外科的方法のための臓器の保持、細胞培養の安定化、発光性酸化ストレス、皮膚老化ならびに放射線障害性細胞損害の治療を含有する群から選択される、請求項３に記載の治療薬。
【請求項５】
運動ニューロン疾患、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、原発性側索硬化（ＰＬＳ）、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、加齢黄斑変性症、臓器の移植/外科的方法のための保護、細胞培養の安定化、発光性酸化ストレス、皮膚老化および放射線障害性細胞損害の治療を含有する群から選択される疾患または状態である、酸化ストレスの結果として生じる疾患または状態の治療のための、アンドログラホリドの使用。
【請求項６】
付加的薬剤成分、賦形剤希釈剤またはキャリアをさらに含有する、請求項１，３，４のいずれか一項に記載の治療薬、または請求項２または５に記載の使用。
【請求項７】
非経口、静脈内、筋肉内、腹膜内、皮下の投与、または標的臓器、組織内への注射もしくは注入により直接的な送達のために処方した、請求項１，３，４のいずれか一項に記載の治療薬、または請求項２または５に記載の使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４ａ】
【図４ｂ】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１１ａ】
【図１１ｂ】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１２Ｃ】
【図２】
【図３】
【図４ａ】
【図４ｂ】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１１ａ】
【図１１ｂ】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１２Ｃ】
【公表番号】特表２０１２−５０６４１０（Ｐ２０１２−５０６４１０Ａ）
【公表日】平成２４年３月１５日（２０１２．３．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５３２７２３（Ｐ２０１１−５３２７２３）
【出願日】平成２１年１０月２３日（２００９．１０．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００９／０５１４３２
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０４６７１０
【国際公開日】平成２２年４月２９日（２０１０．４．２９）
【出願人】（５０３４２００６２）ユニバーシティ オブ シェフィールド (2)
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＳＨＥＦＦＩＥＬＤ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年３月１５日（２０１２．３．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１０月２３日（２００９．１０．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００９／０５１４３２
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０４６７１０
【国際公開日】平成２２年４月２９日（２０１０．４．２９）
【出願人】（５０３４２００６２）ユニバーシティ オブ シェフィールド (2)
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＳＨＥＦＦＩＥＬＤ
【Ｆターム（参考）】
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