糖タンパク質の修飾フコシル化を用いる産生
フコシル化Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質を産生できるように糖タンパク質のＮ−グリカンをフコシル化するための内因性経路を欠く宿主細胞の遺伝子工学的方法が開示されている。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グリコバイオロジーの分野、特にフコシル化Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質が産生できるように糖タンパク質のＮ−グリカンをフコシル化するための内因性経路を欠く宿主細胞の遺伝子工学的方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
グリコシル化されているヒト用に意図されている治療用タンパク質は複雑なヒトＮ−グリコシル化パターンを有していなければならない。通常、（ａ）高濃度のタンパク質を迅速に産生できるため；（ｂ）滅菌の十分に制御された産生条件（例えば、ＧＭＰ条件）を使用できるため；（ｃ）簡単な化学的に規定された増殖培地を使用できるため；（ｄ）遺伝子操作が容易であるため；（ｅ）ヒトまたは動物病原体の汚染がないため；（ｆ）毒性等のために細胞培養で十分に発現されないものを含めた各種タンパク質を発現させることができるため；及び（ｇ）（例えば、培地への分泌により）タンパク質の回収が容易であるために、治療用タンパク質を細菌または真核微生物を用いて産生することが有利である。しかしながら、原核生物及び下等真核生物は通常複雑なＮ−グリコシル化パターンを有するタンパク質を産生しない。従って、複雑なヒト様Ｎ−グリコシル化パターンを有していることが望ましい治療用タンパク質を産生するためには、通常動物細胞が使用されている。しかしながら、治療用タンパク質を産生するために動物細胞を使用するには多数の重大な欠点がある。
【０００３】
動物細胞において発現させるのに適した治療用タンパク質は特定のもの（例えば、細胞毒性作用または増殖にとって不利な他の作用を欠くもの）のみである。動物細胞培養系は通常、有用な量の当該タンパク質を産生させるためには注意深く制御された条件下で非常にゆっくりであり、しばしば１週間にわたる増殖を要する。にもかかわらず、タンパク質収率は微生物発酵方法からのものに比較して有利でない。加えて、細胞培養系は典型的には複雑で高価な栄養素及び補因子（例えば、ウシ胎児血清）を必要とする。更に、増殖はプログラム化細胞死（アポトーシス）により制限される恐れがある。
【０００４】
更に、動物細胞（特に、哺乳動物細胞）はウイルス感染または汚染をかなり受けやすい。幾つかの場合にはウイルスまたは他の感染物質は培養物の増殖を危うくすることがあり、他の場合には前記物質は治療用タンパク質産物を意図する用途のために適さないものとするヒト病原体であり得る。更に、多くの細胞培養方法は、病原体（例えば、牛海綿状脳症（ＢＳＥ）タンパク質）を持っている恐れがある複雑で温度感受性の動物由来増殖培地成分を使用しなければならない。前記病原体は検出するのが難しく、及び／または増殖培地を汚すことなく除去または滅菌するのが難しい。いずれにせよ、治療用タンパク質を産生するために動物細胞を使用することは、産物の安全性を確保するためにコストがかかる品質管理を必要とする。
【０００５】
最近、下等真核生物、特に酵母は、ヒト様であるかまたはヒト化されている複雑なＮ−グリコシル化パターンを有しているタンパク質を発現するように遺伝子組換えされ得ることが判明した。このように遺伝子組換された下等真核生物は、高マンノースＮ−グリカンの産生に関与する特定の内因性グリコシル化酵素を除去し、さもなければ複雑なＮ−グリカンの生成に関与する外因性酵素の各種組合せを導入することにより得られ得る。複雑なＮ−グリカンを産生するための酵母の遺伝子工学的方法は米国特許第７，０２９，８７２号、並びに米国特許出願公開第２００４／００１８５９０号、同第２００５／０１７０４５２号、同第２００６／０２８６６３７号、同第２００４／０２３００４２号、同第２００５／０２０８６１７号、同第２００４／０１７１８２６号、同第２００５／０２０８６１７号及び同第２００６／０１６０１７９号に記載されている。例えば、１，６−マンノシルトランスフェラーゼ活性を欠失させ、さもなければ糖タンパク質のＮ−グリカンにマンノース残基を付加するように宿主細胞を選択または改変し、その後複雑なヒト様Ｎ−グリカンの産生に関与する各酵素を含むように改変することができる。
【０００６】
動物及びヒト細胞は、タンパク質上のＮ−グリカンの還元末端のＧｌｃΝＡｃ残基にフコース残基を付加するフコシルトランスフェラーゼ経路を有している。ヒトにおけるフコシル化経路は、いずれも細胞質に位置し、協力してＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−フコースに変換させるＧＤＰ−マンノースデヒドラターゼ及びＧＤＰ−ケト−デオキシ−マンノース−エピメラーゼ／ＧＤＰ−ケト−デオキシ−ガラクトース−レダクターゼ（ＦＸタンパク質）；ＧＤＰ−フコースをゴルジ体に輸送するゴルジ体の膜に位置しているＧＤＰ−フコーストランスポーター；及びＮ−グリカンの還元末端でＧｌｃΝＡｃ残基の６位への１，６−結合によりフコース残基を転移させるフコシルトランスフェラーゼ（Ｆｕｔ８）から構成されている。高等真核生物とは対照的に、多くの下等真核生物、例えば酵母はフコシルトランスフェラーゼ経路に関与する酵素を欠き、フコースを含有しない糖タンパク質しか産生しない（例えば、Ｂｒｅｔｔｈａｕｅｒ／Ｃａｔｅｌｌｉｎｏ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３０：１９３−２００（１９９９）；Ｒａｂｉｎａら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２８６：１７３−１７８（２０００）を参照されたい）。しかしながら、糖タンパク質のフコースがないことは場合によっては有利であることが判明している。例えは、モノクローラル抗体、免疫グロブリン分子及び関連分子の産生においては、免疫グロブリンのＮ−グリカンからフコース糖を除去すると特定のＩｇ受容体への結合が増加または変化し、これにより抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）のような特性に変化が生ずる（例えば、米国特許出願公開第２００５／０２７６８０５号及び同第２００３／０１５７１０８号を参照されたい）。
【０００７】
しかしながら、免疫グロブリンのＮ−グリカンからフコースを除去すると免疫グロブリンのＡＤＣＣ活性が高まるとみられ、フコシル化Ｎ−グリカンは他の糖タンパク質にとって重要であるとみられる。例えば、マウス中のフコシルトランスフェラーゼ遺伝子を欠失させると、重大な成長の遅れ、生後発達中の早死及び肺における気腫様変化が誘発される。これらのＦｕｔ８−／−ヌルマウスは、外因性ＴＧＦ−β１を投与することにより気腫様表現型から救出された。加えて、障害を受けた受容体媒介シグナル伝達もＦｕｔ８遺伝子を再導入することにより救出され、コアフコシル化がＴＧＦ−β１やＥＧＦのような増殖因子受容体を適切に機能させるために重要であることが判明している（Ｗａｎｇら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，４１７：１１−２２（２００６））。Ｆｕｔ８−／−マウス由来の肺組織では、コアフコシル化が損失すると低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体関連タンパク質−１（ＬＲＰ−Ｉ）の機能が損なわれ、その結果インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）−結合タンパク質−３（ＩＧＦＢＰ−３）の飲食作用が低下する（Ｌｅｅら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（Ｔｏｋｙｏ），１３９：３９１−８（２００６））。Ｆｕｔ８−／−マウス胎児線維芽細胞では、α３β１インテグン媒介細胞遊走がなくなり、細胞シグナル伝達が低下し、コアフコースがタンパク質機能にとって必須であることが確認された（Ｚｈａｏら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８１：３８３４３−３８３５０（２００６））。加えて、ＡＤＣＣ活性を低下させるために組成物中の抗体の少なくとも一部がフコシル化されている抗体組成物を得ることが望ましい状況もある。従って、特定の場合には、フコシル化糖タンパク質を産生できる下等真核生物及び細胞を提供することが有利である。従って、下等真核宿主細胞、例えば真菌及び酵母、特に酵母（例えば、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、クルイベロミセス・ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）等）を作製するための方法及び材料を開発すると、フコシル化糖タンパク質を組換え産生させるための遺伝子強化した酵母菌株の開発が促進される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第７，０２９，８７２号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００４／００１８５９０号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２００５／０１７０４５２号明細書
【特許文献４】米国特許出願公開第２００６／０２８６６３７号明細書
【特許文献５】米国特許出願公開第２００４／０２３００４２号明細書
【特許文献６】米国特許出願公開第２００５／０２０８６１７号明細書
【特許文献７】米国特許出願公開第２００４／０１７１８２６号明細書
【特許文献８】米国特許出願公開第２００５／０２０８６１７号明細書
【特許文献９】米国特許出願公開第２００６／０１６０１７９号明細書
【特許文献１０】米国特許出願公開第２００５／０２７６８０５号明細書
【特許文献１１】米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号明細書
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｂｒｅｔｔｈａｕｅｒ／Ｃａｔｅｌｌｉｎｏ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３０：１９３−２００（１９９９）
【非特許文献２】Ｒａｂｉｎａら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２８６：１７３−１７８（２０００）
【非特許文献３】Ｗａｎｇら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，４１７：１１−２２（２００６）
【非特許文献４】Ｌｅｅら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（Ｔｏｋｙｏ），１３９：３９１−８（２００６）
【非特許文献５】Ｚｈａｏら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８１：３８３４３−３８３５０（２００６）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
従って、本発明は、組換えフコシル化糖タンパク質を産生するために使用できる下等真核発現系を作製するための方法及び材料を提供する。特に、哺乳動物フコシル化経路に関与する１つ以上の酵素をコード化する遺伝子を含むベクター、及びフコシル化糖タンパク質を産生し得る宿主細胞を得るために前記ベクターで形質転換した下等真核生物宿主細胞を提供する。前記したベクター、宿主細胞及び方法は酵母及び真菌宿主細胞（例えば、ピキア・パストリス）に基づく発現系において使用するためにうまく適合される。
【００１１】
１つの実施形態では、本発明は、下等真核宿主細胞をＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−フコースに変換するため及びフコースを宿主細胞により産生されるＮ−グリカンに結合させるための酵素活性をコード化する１つ以上のベクターで形質転換するための方法及び材料を提供する。更なる実施形態では、本発明は、非天然リーダー配列に融合したフコシル化経路酵素の触媒ドメインを含む融合タンパク質をコード化するハイブリッドベクターを含み、前記リーダー配列は融合ペプチドを小胞体、初期ゴルジ体または後期ゴルジ体中の適切な位置へターゲットするターゲッティング配列をコード化する。例えば、フコシルトランスフェラーゼの触媒ドメインは、触媒ドメインを小胞体、初期ゴルジ体または後期ゴルジ体内の適切な位置へターゲットするリーダーペプチドに融合されている。更なる実施形態では、下等真核生物宿主細胞をＧＤＰ−フコースを細胞質からゴルジ内部に輸送するＧＤＰ−フコーストランスフェラーゼをコード化するベクターで形質転換する。
【００１２】
本発明は、フコシル化経路を含む組換え下等真核生物宿主細胞を提供する。特定態様では、宿主細胞は酵母または糸状菌、例えばピキア・パストリスのようなピキア属菌の酵母である。
【００１３】
更なる態様では、宿主細胞は更に、糖タンパク質上のＮ−グリカンに対してα１，６−マンノシルトランスフェラーゼ活性を示さず、α１，２−マンノシダーゼ触媒（通常触媒ドメインを伴わない細胞標的シグナルペプチドに融合されおよびα１，２−マンノシダーゼ活性を宿主細胞のＥＲまたはゴルジ体へターゲットするように選択されている。）を含み、これにより宿主細胞のＥＲまたはゴルジ体を組換え糖タンパク質が通過すると、フコシル化Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質が産生される。
【００１４】
更なる態様では、上記宿主細胞は更に、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ触媒ドメイン（通常触媒ドメインを伴わない細胞標的シグナルペプチドに融合されおよびＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ活性を宿主細胞のERもしくはゴルジ体へターゲットするように選択されている。）を含み、これにより宿主細胞のＥＲもしくはゴルジ体内を組み換え糖タンパク質が通過すると、フコシル化ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質が産生される。
【００１５】
更なる態様では、上記宿主細胞は更に、マンノシダーゼＩＩ触媒ドメイン（通常触媒ドメインを伴わない細胞標的シグナルペプチドに融合されおよびマンノシダーゼＩＩ活性を宿主細胞のERもしくはゴルジ体へターゲットするように選択されている。）を含み、これにより宿主細胞のＥＲもしくはゴルジ体内を組み換え糖タンパク質が通過すると、フコシル化ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質が産生される。
【００１６】
更なる態様では、上記宿主細胞は更に、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩ触媒ドメイン（通常触媒ドメインを伴わない細胞標的シグナルペプチドに融合されおよびＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩ活性を宿主細胞のERもしくはゴルジ体へターゲットするように選択されている。）を含み、これにより宿主細胞のＥＲもしくはゴルジ体内を組み換え糖タンパク質が通過すると、フコシル化ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質が産生される。
【００１７】
更なる態様では、上記宿主細胞は更に、ガラクトーストランスフェラーゼＩＩ触媒ドメイン（通常触媒ドメインを伴わない細胞標的シグナルペプチドに融合されおよびガラクトーストランスフェラーゼＩＩ活性を宿主細胞のERもしくはゴルジ体へターゲットするように選択されている。）を含み、これにより宿主細胞のＥＲもしくはゴルジ体内を組み換え糖タンパク質が通過すると、フコシル化Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質が産生される。
【００１８】
更なる態様では、上記宿主細胞は更に、シアリルトランスフェラーゼ触媒ドメイン（通常触媒ドメインを伴わない細胞標的シグナルペプチドに融合されおよびシアリルトランスフェラーゼ活性を宿主細胞のERもしくはゴルジ体へターゲットするように選択されている。）を含み、これにより宿主細胞のＥＲもしくはゴルジ体内を組み換え糖タンパク質が通過すると、フコシル化ＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質が産生される。
【００１９】
上記宿主細胞を特定の糖タンパク質をコード化する核酸で形質転換すると、複数のグリコフォームを含む糖タンパク質の組成物が得られ得、各グリコフォームはグリコフォームに結合して少なくとも１つのＮ−グリカンを含み、よって糖タンパク質組成物は優勢なグリコフォームが所望のフコシル化Ｎ−グリカンからなる複数のＮ−グリカンを含む。所望する具体的な糖タンパク質に応じて、本発明の方法は、優勢のＮ−グリコフォームが次に最も優勢なＮ−グリコフォームよりも５〜８０モル％多い量で存在している糖タンパク質組成物を得るために使用され得る。更なる実施形態では、優勢のＮ−グリコフォームは次に最も優勢なＮ−グリコフォームよりも１０〜４０モル％、２０〜５０モル％、３０〜６０モル％、４０〜７０モル％、５０〜８０モル％多い量で存在し得る。他の実施形態では、優勢なＮ−グリコフォームは所望のフコシル化Ｎ−グリコフォームであり、Ｎ−グリカンの総数の２５モル％以上、３５モル％以上、５０モル％以上、６０モル％以上、または７５モル％以上の量で存在している。
【００２０】
よって、複数のグリコフォームを含む糖タンパク質組成物を得るための宿主細胞が提供され、各グリコフォームはグリコフォームに結合して少なくとも１つのＮ−グリカンを含み、よって糖タンパク質組成物は優勢なＮ−グリカンがＭａｎ５ＧｌｃΝＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＮＡＮＡＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２及びＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群から選択される複数のフコシル化Ｎ−グリカンからなる。
【００２１】
更なる態様では、複数のフコシル化Ｎ−グリカンの２５モル％以上は本質的に、グリコフォームがＭａｎ５ＧｌｃΝＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２，ＮＡＮＡＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２及びＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群から選択されるフコシル化グリコフォームから構成されている。
【００２２】
更に別の態様では、複数のＮ−グリカンの２５モル％以上、３５モル％以上、５０モル％以上、６０モル％以上、７５モル％以上、または９０モル％以上は本質的に、グリコフォームがＭａｎ５ＧｌｃΝＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＮＡＮＡＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２及びＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群から選択されるフコシル化グリコフォームから構成されている。
【００２３】
上記糖タンパク質組成物において、フコースはＮ−グリカンの還元末端でＧｌｃＮＡｃとα１，３−結合、Ｎ−グリカンの還元末端でＧｌｃＮＡｃとα１，６−結合、Ｎ−グリカンの非還元末端でＧａｌとα１，２−結合、Ｎ−グリカンの非還元末端でＧｌｃＮａｃとα１，３−結合、またはＮ−グリカンの非還元末端でＧｌｃＮＡｃとα１，４−結合されている。
【００２４】
従って、上記糖タンパク質組成物の特定態様では、グリコフォームは、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）、ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）、ＮＡＮＡＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）及びＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）からなる群から選択されるグリコフォームを得るためにα１，３−結合またはα１，６−結合フコース；ＧｌｃＮＡｃ（Ｆｕｃ）Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ（Ｆｕｃ）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ１−２）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ１−２）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ１−２）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＮＡＮＡＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ１−２）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２及びＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ１−２）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群から選択されるグリコフォームを得るためにα１，３−結合またはα１，４−結合フコース；またはＧａｌ（Ｆｕｃ）ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ２（Ｆｕｃ１−２）ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２，ＮＡＮＡＧａｌ２（Ｆｕｃ１−２）ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２及びＮＡＮＡ２Ｇａｌ２（Ｆｕｃ１−２）ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群から選択されるグリコフォームを得るためにα１，２−結合フコースされている。
【００２５】
他の態様では、本発明の糖タンパク質組成物は、上記Ｎ−グリコフォームが次に最も優勢なＮ−グリコフォームよりも約５〜８０モル％、１０〜４０モル％、２０〜５０モル％、３０〜６０モル％、４０〜７０モル％、または５０〜８０モル％多いレベルで存在している組成物からなる。
【００２６】
（定義）
本明細書中で使用されている用語「Ｎ−グリカン」及び「グリコフォーム」は互換可能に使用されており、Ｎ結合型オリゴ糖、例えばアスパラギン−Ｎ−アセチルグルコサミン結合によりポリペプチドのアスパラギン残基に結合しているものを指す。Ｎ結合型糖タンパク質は、タンパク質中のアスパラギン残基のアミド窒素に結合してＮ−アセチルグルコサミン残基を含んでいる。糖タンパク質に存在している優勢な糖はグルコース（Ｇｌｃ）、ガラクトース（Ｇａｌ）、マンノース（Ｍａｎ）、フコース（Ｆｕｃ）、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌΝＡｃ）、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃΝＡｃ）及びシアル酸（例えば、Ｎ−アセチル−ノイラミン酸（ＮＡＮＡ））である。Ｎ結合型糖タンパク質の場合、糖基のプロセシングはＥＲの内腔で同時翻訳的に生じ、ゴルジ体において継続する。
【００２７】
Ｎ−グリカンはＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２の共通五糖コアを有している。Ｎ−グリカンは、「トリマンノースコア」、「五糖コア」または「マンノース欠乏コア」とも称されるＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２コア構造に付加されている末端糖（例えば、ＧｌｃＮＡｃ、ガラクトース、フコース及びシアル酸）からなる分枝（アンテナ）の数の点で異なっている。Ｎ−グリカンは分枝状成分（例えば、高マンノース、複合または混成）に従って分類される。「高マンノース」型Ｎ−グリカンは５つ以上のマンノース残基を有している。「複合」型Ｎ−グリカンは、典型的には「トリマンノース」コアの１，３−マンノースアームに結合している少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃ及び１，６−マンノースアームに結合している少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃを有している。複合Ｎ−グリカンは、場合によりシアル酸または誘導体（例えば、“ＮＡＮＡ”または“ＮｅｕＡｃ”（ここで、Ｎｅｕはノイラミン酸を指し、Ａｃはアセチルを指す）で修飾されているガラクトースまたはＮ−アセチルガラクトサミン残基を有していてもよい。複合Ｎ−グリカンは、「バイセクティング」ＧｌｃＮＡｃ及びコアフコース（“Ｆｕｃ”）を含む鎖内置換を有していてもよい。例として、Ｎ−グリカンがトリマンノースコア上にバイセクティングＧｌｃＮＡｃを含んでいる場合には、構造はＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（ＧｌｃＮＡｃ）またはＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ３として表され得る。Ｎ−グリカンがトリマンノースコアに結合してコアフコースを含んでいる場合には、構造はＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）として表され得る。複合Ｎ−グリカンは「トリマンノースコア」上に複数のアンテナを有していてもよく、しばしば「マルチアンテナリーグルカン」とも称されている。「混成」Ｎ−グリカンは、トリマンノースコアの１，３−マンノースアームの末端に少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃ及びトリマンノースコアの１，６−マンノースアームに０以上のマンノースを有している。各種Ｎ−グリカンが「グリコフォーム」とも称されている。
【００２８】
本明細書中で使用されている略号は当業界で一般的に使用されているものである。例えば糖類の略号は上記を参照されたい。他の一般的な略号には、いずれもペプチドＮ−グリコシダーゼＦ（ＥＣ ３．２．２．１８）を指す「ＰＮＧアーゼ」、「グリカナーゼ」または「グルコシダーゼ」が含まれる。
【００２９】
本明細書中で使用されている用語「発現制御配列」は、ポリヌクレオチド配列が機能し得る形で連結されているコード配列の発現に影響を与えるために必要なポリヌクレオチド配列を指す。発現制御配列は核酸配列の転写、転写後事象及び翻訳を制御する配列である。発現制御配列には適当な転写開始、終結、プロモーター及びエンハンサー配列；効率的なＲＮＡプロセシングシグナル（例えば、スプライシング及びポリアデニル化シグナル）；細胞質ｍＲＮＡを安定化させる配列；翻訳効率を高める配列（例えば、リボソーム結合部位）；タンパク質安定性を高める配列；及び所望により、タンパク質分泌を高める配列が含まれる。前記制御配列の種類は宿主生物に応じて異なる。原核生物において、前記制御配列は通常プロモーター、リボソーム結合部位及び転写終結配列を含む。用語「制御配列」は、最低限その存在が発現に必要であるすべての成分を含んでおり、その存在が有利である追加成分（例えば、リーダー配列及び融合パートナー配列）をも含み得ると意図される。
【００３０】
本明細書中で使用されている用語「組換え宿主細胞」（「発現宿主細胞」、「発現宿主系」、「発現系」、または単に「宿主細胞」）は組換えベクターが導入された細胞を指すと意図される。この用語は具体的被験細胞だけではなく、その細胞の子孫をも指すと意図すると理解されるべきである。突然変異または環境の影響によりある修飾がその次の世代で生ずる恐れがあるので、子孫が実際に親細胞と同一でないこともあるが、そのような子孫も依然として本明細書中で使用されている用語「宿主細胞」の範囲に含まれる。組換え宿主細胞は培養増殖させた単離細胞または細胞株であっても、生きている組織または生物中に残存している細胞であってもよい。
【００３１】
用語「真核」は有核細胞または生物を指し、昆虫細胞、植物細胞、哺乳動物細胞、動物細胞及び下等真核細胞が含まれる。
【００３２】
用語「下等真核細胞」には酵母、真菌、襟−鞭毛類、微胞子虫、アルベオラータ（例えば、双鞭毛藻類）、ストラメノパイル（例えば、褐藻、原生動物）、紅色植物（例えば、紅藻）、植物（例えば、緑藻、植物細胞、苔）及び他の原生生物が含まれる。酵母及び真菌にはピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピキア・フィンランディカ（Ｐｉｃｈｉａ ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ）、ピキア・トレハロフィラ（Ｐｉｃｈｉａ ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ）、ピキア・コクラマエ（Ｐｉｃｈｉａ ｋｏｃｌａｍａｅ）、ピキア・メンブラナファシエンス（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ）、ピキア・ミヌタ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｉｎｕｔａ）（オガタエア・ミヌタ（Ｏｇａｔａｅａ ｍｉｎｕｔａ）、ピキア・リンドネリ（Ｐｉｃｈｉａ ｌｉｎｄｎｅｒｉ））、ピキア・オプンティアエ（Ｐｉｃｈｉａ ｏｐｕｎｔｉａｅ）、ピキア・サーモトレランス（Ｐｉｃｈｉａ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、ピキア・サリクタリア（Ｐｉｃｈｉａ ｓａｌｉｃｔａｒｉａ）、ピキア・グエルキュウム（Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｅｒｃｕｕｍ）、ピキア・ピジペリ（Ｐｉｃｈｉａ ｐｉｊｐｅｒｉ）、ピキア・スティプティス（Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｔｉｓ）、ピキア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピキア属菌（Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．）、サッカロミセス・セリビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス属菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、クルイベロミセス属菌（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、クルイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、クリソスポリウム・ルクノウェンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、フザリウム属菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ．）、フザリウム・グラミネウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅｕｍ）、フザリウム・ベネナトウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、ニセツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）及びニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）が含まれるが、これらに限定されない。ピキア属菌、サッカロミセス属菌、ハンゼヌラ・ポリモルファ、クルイベロミセス属菌、カンジダ・アルビカンス、アスペルギルス属菌、トリコデルマ・レエセイ、クリソスポリウム・ラクノウェンス、フザリウム属菌及びニューロスポラ・クラッサ。
【００３３】
本明細書中で使用されている用語「ペプチド」は短ポリペプチド、例えば典型的には約５０未満のアミノ酸長、より典型的には約３０未満のアミノ酸長のものを指す。本明細書中で使用されているこの用語は、構造が似ており、よって生物学的機能が似ているアナログ及びミメティックを包含する。
【００３４】
本明細書中で使用されている用語「主に」、或いは「優勢の」または「優勢である」のような変形は、糖タンパク質をＰＮＧアーゼで処理し、遊離したグリカンを質量分析（例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ）により分析したところ、全Ｎ−グリカンの最高モル％（％）を有しているグリカン物質を意味すると理解されたい。換言すれば、フレーズ「主に」は、個々の物質（例えば、具体的グリコフォーム）が他の個々の物質よりも高いモル％で存在しているとして定義される。例えば、組成物が４０モル％の物質Ａ、３５モル％の物質Ｂ及び２５モル％の物質Ｃから構成されているならば、組成物は主に物質Ａからなる。
【００３５】
別段の定義がない限り、本明細書中で使用されているすべての技術用語及び科学用語は本発明が属する業界の当業者が通常理解しているのと同じ意味を有している。方法及び材料の例を以下に記載するが、本明細書中に記載されているのと類似または同等の方法及び材料も本発明の実施において使用され、当業者には自明であろう。本明細書中に挙げられているすべての刊行物及び他の参考文献は参照により本明細書に組み入れられる。矛盾する場合、定義を含めた本明細書が支配する。材料、方法及び実施例は例示にすぎず、限定的と意図されない。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】多くの高等真核細胞中に存在するフコシル化経路を示す。
【図２】フコシル化糖タンパク質を産生し得る組換え酵母を作製するのに必要な糖鎖工学ステップを示す。酵母細胞質中に存在する内因性ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−マンノース−デヒドラターゼ（ＧＭＤ）及び二機能性酵素ＦＸによりＧＤＰ−フコースに変換させる。その後、産物をＧＤＰ−フコーストランスポーター（ＧＦＴｒ）によりゴルジ体に転移させ、フコースをα−１，６−フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８）によりアセプターグリカンに移す。酵素は青字で、代謝中間体は黒字で示す。ＧＤＰ−ｋｄＭａｎ（ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−マンノース）及びＧＤＰ−ｋｄＧａｌ（ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−ガラクトース）はＧＤＰ−マンノースのＧＤＰ−フコースへの変換における中間体である。
【図３Ａ】フコシル化糖タンパク質を産生するための酵母菌株を改変する際に使用するベクターを示す。フコース生合成及び転移遺伝子を導入する発現ベクターｐＳＨ９９５を示す。フコースを生合成及び転移するために必要な遺伝子をｐＳＨ９９５に導入すると、ベクターｐＳＨ１０２２が生じた。
【図３Ｂ】ベクターｐＳＨ１０２２を示す。（Ｂ）には、遺伝子をピキアゲノムに組み込むために使用されるＴＲＰ２遺伝子座、ドミナント選択マーカーＮＡＴｒ、ＧＡＰＤＨ−ＣＹＣ発現カセット及びｐＵＣ１９プラスミド骨格の隣接領域が示されている。
【図４Ａ】ラットＥＰＯから遊離したＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスキャンを示し、ピキア・パストリス菌株ＹＳＨ６６１（フコシル化経路遺伝子を含むベクターｐＳＨ１０２２で形質転換させた菌株ＲＤＰ９７４）がＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）Ｎ−グリカン及びＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２Ｎ−グリカンを含むｒＥＰＯを産生したことを立証している。ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ（Ｆｕｃ）Ｎ−グリカンは四角で囲まれている。
【図４Ｂ】ラットＥＰＯ対照菌株ＹＳＨ６６０（対照ベクターｐＳＨ９９５で形質転換させた菌株ＲＤＰ９７４）から遊離したＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスキャンを示し、非フコシル化、すなわちフコース非含有のＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２Ｎ−グリカンのみが産生された。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
本発明は、フコシル化Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質を産生し得る宿主細胞を遺伝子改変するための方法及び材料を提供する。方法及び材料を内因性フコシル化経路を有していない酵母ピキア・パトリスで例示しているが、これらの方法及び材料は他の下等真核生物（例えば、真菌生物、原核生物）及び内因性フコシル化経路を有していない高等真核生物（例えば、昆虫細胞）を遺伝子改変するためにも使用され得る。他の実施形態では、これらの方法及び材料は、内因性フコシル化経路を有しているが、宿主細胞により産生される糖タンパク質中に存在するフルコシル化の量を増加させたい高等真核生物を遺伝子改変するために使用され得る。
【００３８】
通常、本発明の方法は、宿主細胞に導入したときその細胞がフコシル化糖タンパク質を産生し得るようにするフコシル化経路に関与する酵素または酵素活性をコード化する核酸を宿主細胞に導入することによりフコシル化糖タンパク質を産生し得る宿主細胞の作製を含む。前記核酸には、例えばＧＤＰ−マンノース−４，６−デヒドラターゼ活性、ＧＤＰ−ケト−デオキシ−マンノース−エピメラーゼ活性／ＧＤＰ−ケト−デオキシ−ガラクトース−レダクターゼ活性、ＧＤＰ−フコーストランスポータータンパク質及びフコシルトランスフェラーゼ活性をコード化する核酸が含まれる。高等真核生物細胞におけるフコシル化経路の概略を図１に示す。
【００３９】
ＧＤＰ−マンノース−４，６−デヒドラターゼ（ＧＭＤ）（ＥＣ ４．２．１．４７）は、多数の種で同定されているＮＡＤの存在下でＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−マンノースに変換させる。ヒトＧＭＰ（ｈＧＭＤ）は配列番号１に示すヌクレオチド配列によりコード化され、配列番号２に示すアミノ酸配列を有している。ＧＤＰ−マンノース−デヒドラターゼ活性を有する相同遺伝子はブタＧＭＤ（Ｂｒｏｓｃｈａｔら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１５３（２）：３９７−４０１（１９８５））、エレガンス線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）ＧＭＤ及びキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）ＧＭＤ（例えば、Ｒｈｏｍｂｅｒｇら，ＦＥＢＳ Ｊ．，２７３：２２４４−５６（２００６）を参照されたい）、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）（例えば、Ｎａｋａｙａｍａら，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，１３：６７３−８０（２００３）を参照されたい）；及び大腸菌（Ｓｏｍｏｚａら，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，８：１２３−３５（２０００））を含む。
【００４０】
ＧＤＰ−ケト−デオキシ−マンノース−エピメラーゼ／ＧＤＰ−ケト−デオキシ−ガラクトース−レダクターゼ（ＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼ，ＥＣ １．１．１．２７１）は真核生物及び原核生物の両方で同定されている二機能性酵素である。ヒトＧＤＰ−ケト−デオキシ−マンノース−エピメラーゼ／ＧＤＰ−ケト−デオキシ−ガラクトース−レダクターゼはＦＸタンパク質（ｈＦＸまたはＧＥＲとしても公知）と呼ばれている。ｈＦＸをコード化するヌクレオチド配列を配列番号３に示す。ｈＦＸタンパク質は配列番号４に示すアミノ酸配列を有している。
【００４１】
ＧＤＰ−フコーストランスポーターは幾つかの種で同定されている。ヒトＧＤＰ−フコーストランスポーター（ｈＧＦＴｒ）はグリコシル化−ＩＩ（ＣＤＧ−ＩＩ）の先天性障害に関連していると同定されている（Ｌｕｂｋｅら，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，２８：７３−６（２００１））。白血球粘着不全症ＩＩ（ＬＡＤ ＩＩ）としても公知であり、この障害はセレクチンリガンドのフコシル化が妨害されると生ずるようである（Ｒｏｏｓ ａｎｄ Ｌａｗ，Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｌｌｓ Ｍｏｌ．Ｄｉｓ．，２７：１０００−４（２００１））。ｈＧＦＴｒをコード化するヌクレオチド配列を配列番号５に示し、ｈＧＦＴｒのアミノ酸配列を配列番号６に示す。ＧＤＰ−フコーストランスポーター活性を有する相同遺伝子が他の種、例えばキイロショウジョウバエ（Ｉｓｈｉｋａｗａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０２：１８５３２−７（２００５））、ラット肝（Ｐｕｇｌｉｅｌｌｉ ａｎｄ Ｈｉｒｓｃｈｂｅｒｇ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４：３５５９６−６０（１９９９））、及び推定ＣＨＯホモログ（Ｃｈｅｎら，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，１５：２５９−６９（２００５））で同定されている。
【００４２】
多数のフコシルトランスフェラーゼ、例えばα１，２−フコシルトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．４．１．６９；ＦＵＴ１及びＦＵＴ２によりコード化される）、α１，３−フコシルトランスフェラーゼ（糖タンパク質３−α−Ｌ−フコシルトランスフェラーゼ，ＥＣ ２．４．１．２１４；ＦＵＴ３−ＦＵＴ７及びＦＵＴ９によりコード化される）、α１，４−フコシルトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．４．１．６５；ＦＵＴ３によりコード化される）、及びα１，６−フコシルトランスフェラーゼ（糖タンパク質６−α−Ｌ−フコシルトランスフェラーゼ，ＥＣ ２．４．１．６８；ＦＵＴ８によりコード化される）が同定されている（Ｂｒｅｔｏｎら，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌ．，８：８７−９４（１９９７）；Ｂｅｃｋｅｒ，Ｌｏｗｅ，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌ．，１３：４１Ｒ−５３Ｒ（２００３）；Ｍａら，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌ．，１６：１５８Ｒ−１８４Ｒ（２００６）を参照されたい）。通常、α１，２−フコシルトランスフェラーゼは、フコースをα１，２−結合によりＮ−グリカン中の末端ガラクトース残基に転移させる。通常、α１，３−フコシルトランスフェラーゼ及びα１，４−フコシルトランスフェラーゼはフコースをＮ−グリカンの非還元末端のＧｌｃＮＡｃ残基に転移させる。
【００４３】
通常、α１，６−フコシルトランスフェラーゼは、α１，６−結合によりフコースをＮ−グリカンの還元末端のＧｌｃＮＡｃ残基（アスパラギン結合ＧｌｃＮＡｃ）に転移させる。典型的には、α１，６−フコシルトランスフェラーゼは、フコースを還元末端でＧｌｃＮＡｃに付加できるようにトリマンノースコアの少なくとも１つの分枝の非還元末端に末端ＧｌｃＮＡｃ残基を必要とする。しかしながら、フコースを還元末端でＧｌｃＮＡｃに付加することができるように非還元末端に末端ガラクトシド残基を必要とする１，６−フコシルトランスフェラーゼが同定されており（Ｗｉｌｓｏｎら，Ｂｉｏｃｈｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，７２：９０９−９１６（１９７６））、Ｌｉｎら（Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌ．，４：８９５−９０１（１９９４））はＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩが欠乏しているチャイニーズハムスター卵巣細胞ではα１，６−フコシルトランスフェラーゼはＭａｎ４ＧｌｃＮＡｃ２Ｎ−グリカン及びＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２Ｎ−グリカンをフコシル化することが判明した。同様に、α１，３−フコシルトランスフェラーゼはα１，３−結合により、通常１つの未置換非還元末端ＧｌｃＮＡｃ残基を有するＮ−グリカンに対して特異性を有しているＮ−グリカンの還元末端にＧｌｃＮＡｃ残基を転移させる。この酵素のＮ−グリカン産物は植物、昆虫及び幾つかの他の無脊椎動物（例えば、マンソン住血吸虫、ヘモンクス、モノアラガイ）中に存在している。しかしながら、米国特許第７，０９４，５３０号明細書は、ヒト単球細胞株ＴＨＰ−１から単離されたα１，３−フコシルトランスフェラーゼを記載している。
【００４４】
ヒトα１，６−フコシルトランスフェラーゼ（ｈＦＵＴ８）はＹａｍａｇｕｃｈｉら（Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．Ｃｅｌｌ．Ｇｅｎｅｔ．，８４：５８−６（１９９９））により同定されている。ヒトＦＵＴ８をコード化するヌクレオチド配列を配列番号７に示す。ｈＦＵＴ８のアミノ酸配列を配列番号８に示す。ＦＵＴ８活性を有する相同遺伝子が他の種で同定されている。例えば、ラットＦＵＴ８（ｒＦＵＴ８）は配列番号１０に示すアミノ酸配列を有し、配列番号９に示すヌクレオチド配列によりコード化される。マウスＦｕｔ８（ｍＦＵＴ８）は配列番号１２に示すアミノ酸配列を有し、配列番号１１に示すヌクレオチド配列によりコード化される。ブタＦＵＴ８（ｐＦＵＴ８）は配列番号１４に示すアミノ酸配列を有し、配列番号１３に示すヌクレオチド配列によりコード化される。ＦＵＴ８はＣＨＯ細胞（Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，８７：６１４−６２２（２００４））、サル腎ＣＯＳ細胞（Ｃｌａｒｋｅ ａｎｄ Ｗａｔｋｉｎｓ，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌ．，９：１９１−２０２（１９９９））及びトリ細胞（Ｃｏｕｌｌｉｎら，Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，７：２３４−２３８（２００２））でも同定されている。Ｐａｓｃｈｉｎｇｅｒら，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌ．，１５：４６３−４７４（２００５）は、エレガンス線虫及びキイロショウジョウバエ由来のフコシルトランスフェラーゼのクローニング及びチャラクタライゼーションを記載している。ユウレイボヤ（Ｃｉｏｎａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）、ウスグロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｐｓｅｕｄｏｏｂｓｃｕｒａ）、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）及びゼブラフィッシュ（Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ）推定α１，６−フコシルトランスフェラーゼが同定されている（それぞれ、ジーンバンク寄託番号ＡＪ５１５１５１、ＡＪ８３０７２０、ＡＪ５１４８７２及びＡＪ７８１４０７）。
【００４５】
上記したフコシル化経路酵素または活性は核酸によりコード化される。核酸はＤＮＡまたはＲＮＡであり得るが、フコシル化経路酵素または活性をコード化する核酸を宿主細胞のゲノムに安定的に組み込むことが好ましいので典型的には核酸はＤＮＡである。フコシル化経路酵素または活性をコード化する核酸の各々はフコシル化経路酵素または活性の発現を可能にする調節配列に機能し得る形で連結されている。前記調節配列はプロモーター、並びに場合によりフコシル化経路酵素または活性をコード化する核酸の上流にエンハンサー、及びフコシル化経路酵素または活性の下流に転写終結部位を含む。典型的には、核酸は更にリボソーム結合部位を有する５’非翻訳領域及びポリアデニル化部位を有する３’非翻訳領域をも含んでいる。核酸は多くの場合、フコシル化経路酵素または活性を発現させる細胞において複製可能であるベクター（例えば、プラスミド）の成分である。ベクターは、ベクターで形質転換される細胞の選択を可能にするマーカーをも含み得る。しかしながら、幾つかの細胞型、特に酵母はベクター配列を欠く核酸でうまく形質転換され得る。
【００４６】
通常、１つ以上のフコシル化経路酵素または活性をコード化する核酸で形質転換した宿主細胞は更に、所望の糖タンパク質をコード化する核酸を１つ以上含む。フコシル化経路酵素のように、糖タンパク質をコード化する核酸は、糖タンパク質の発現を可能にする調節配列に対して機能し得る形で連結されている。糖タンパク質をコード化する核酸は、糖タンパク質を発現することが公知である細胞株からプライマーを用いて糖タンパク質の保存領域に増幅され得る（例えば、Ｍａｒｋｓら，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．，５８１−５９６（１９９１））。核酸は科学文献中の配列に基づいてデノボでも合成され得る。核酸は所望配列の範囲の重複オリゴヌクレオチドを伸長させることによっても合成され得る（例えば、Ｃａｌｄａｓら，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１３：３５３−３６０（２０００）を参照されたい）。
【００４７】
宿主細胞により産生されるフコシル化Ｎ−グリカン構造のタイプは、宿主細胞中のグリコシル化経路及び具体的なフコシルトランスフェラーゼに依存する。例えば、α１，２−フコシルトランスフェラーゼは通常フコースをＮ−グリカンの末端ガラクトースに付加する。よって、α１，２−フコシルトランスフェラーゼを利用する経路をＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを有するＮ−グリカンを産生し得る宿主細胞に導入することが好ましい。産生されるＮ−グリカンは末端ガラクトース残基に対して１，２−結合でフコースを有している。α１，３−フコシルトランスフェラーゼ及びα１，４−フコシルトランスフェラーゼの両方はそれぞれα１，３またはα１，４結合により、また幾つかのα１，３−フコシルトランスフェラーゼの場合には糖タンパク質のアスパラギン残基に連結されているコアＧｌｃＮＡｃに対してα１，３−結合により非還元末端またはその近くの１つ以上のＧｌｃＮＡｃ残基に対してフコースを付加する。よって、α１，３／４−フコシルトランスフェラーゼを利用する経路を少なくともＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを有するＮ−グリカンを産生し得る宿主細胞に導入することが好ましい。最後に、通常α１，６−フコシルトランスフェラーゼは、糖タンパク質のアスパラギン残基に結合されているコアＧｌｃＮＡｃに対して１，６結合によりフコースを転移させる。通常、α１，６−フコシルトランスフェラーゼを利用する経路を少なくともＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２またはＭａｎ４ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを有するＮ−グリカンを産生し得る宿主細胞に導入することが好ましい。
【００４８】
本明細書中に開示されている方法に従って産生され得る糖タンパク質は、糖タンパク質を産生するための核酸配列の起源に関係なく、治療または診断目的の所望のタンパク質を含んでいる。例えば、Ｎ−グリカンがフコシル化されていないモノクローラル抗体は高いＡＤＣＣ活性を有している。しかしながら、高いＡＤＣＣ活性は、障害に対する治療として受容体リガンドに結合することを意図しているがＡＤＣＣ活性を誘発することを意図していないモノクローラル抗体にとって望ましくない。本明細書中に開示されているフコシル化経路を含む宿主細胞において産生されるモノクローラル抗体はフコシル化Ｎ−グリカンを有しており、低いＡＤＣＣ活性を有すると予想される。別の例として、本明細書中に開示されているフコシル化経路を含む宿主細胞において産生される抗体のＦｃ部分に融合されている膜結合受容体の細胞外部分を含む免疫接着分子（米国特許第５，４２８，１３０号、同第５，１１６，９６４号、同第５，５１４，５８２号及び同第５，４５５，１６５号；Ｃａｐｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３３７：５２５（１９８９）；Ｃｈａｍｏｗ ａｎｄ Ａｓｈｋｅｎａｚｉ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１４：５２−６０（１９９６）；Ａｓｈｋｅｎａｚｉ ａｎｄ Ｃｈａｍｏｗ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，９：１９５−２００（１９９７）を参照されたい）はフコシル化Ｎ−グリカンを有し、低いＡＤＣＣ活性を有していると予想される。フコシル化Ｎ−グリカンを有するように本発明の方法に従って産生され得る糖タンパク質の例には、エリスロポエチン（ＥＰＯ）；サイトカイン、例えばインターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、インターフェロン−ω及び顆粒球−ＣＳＦ；凝固因子、例えばＶＩＩＩ因子、ＩＸ因子及びヒトタンパク質；モノクローナル抗体、可溶性ＩｇＥ受容体α鎖、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ウロキナーゼ、キマーゼ及び尿素トリプシン阻害剤、ＩＧＦ結合タンパク質、上皮成長因子、成長ホルモン放出因子、アネキシンＶ融合タンパク質、アンギオスタチン、血管内皮増殖因子−２、骨髄前駆体抑制因子−１、オステオプロテゲリン組織、プラスミノーゲンアクチベーター、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ及びＴＮＦ−受容体が含まれるが、これらに限定されない。
【００４９】
具体的実施形態では、１つ以上の核酸が、融合タンパク質を細胞内の特定領域へターゲットさせるターゲッティングペプチドに融合されているフコシル化経路タンパク質の触媒ドメインを含む融合タンパク質をコード化する。典型的には、ターゲッティングペプチドは融合タンパク質を分泌経路内の位置へターゲットさせる。よって、用語「分泌経路」は、糖タンパク質が分泌のための調製物中で修飾されている細胞内の細胞小器管及び成分を指す。分泌経路は小胞体（ＥＲ）、ゴルジ体、トランス−ゴルジ網及び分泌小胞を含んでいる。例えば、適当な細胞ターゲッティングペプチドは触媒ドメインをＥＲ、ゴルジ体、トランス−ゴルジ網及び分泌小胞へターゲットさせる。本発明において有用であり得るターゲッティングペプチドには米国特許第７，０２９，８７２号に記載されているものが含まれる。１つの実施形態では、フコシルトランスフェラーゼの触媒ドメインは、融合タンパク質をゴルジ体に指向するターゲッティングペプチドに融合している。フコシルトランスフェラーゼ触媒ドメインに融合される具体的ターゲッティングペプチドは宿主細胞、具体的フコシルトランスフェラーゼ及び産生しようとする糖タンパク質に依存する。フコシルトランスフェラーゼをターゲットさせるために使用され得るターゲッティングペプチドの例は、例えば米国特許第７，０２９，８７２号、並びに米国特許出願公開第２００４／００１８５９０号、同第２００４／０２３００４２号、２００５／０２０８６１７号、同第２００４／０１７１８２６号、同第２００６／０２８６６３７号及び同第２００７／００３７２４８号に開示されている。
【００５０】
フコシル化経路に関与する酵素または活性をコード化する核酸は、宿主細胞をトランスフェクトするために使用され得るベクターに連結される。典型的には、ベクターは、意図する宿主細胞と同一種の細胞から単離したか、または他の種から単離したが、意図する宿主細胞に挿入したとき機能することが公知の調節エレメントを含む。典型的には、これらの調節エレメントは５’調節配列（例えば、プロモーター）及び３’調節配列（例えば、転写ターミネーター配列）を含む。典型的には、ベクターは、ベクターをうまくトランスフェクトした宿主細胞の選択を可能にする少なくとも１つの選択マーカーエレメントをも含む。ベクターを意図する宿主細胞に転移させ、生じた細胞を選択マーカーについてスクリーニングして、ベクターがうまくトランスフェクトされ、よって融合タンパク質をコード化するベクターを有している宿主細胞を同定する。
【００５１】
下等真核生物（例えば、酵母）は、経済的に培養され得、高収率でタンパク質を生じさせ、適切に修飾したとき特に主たるＮ−グリカン構造を有する糖タンパク質を産生し得るので、糖タンパク質を発現させるためにしばしば好ましい。酵母は特に迅速な形質転換を可能にする確立された遺伝学、試験したタンパク質局在化戦略及び容易な遺伝子ノックアウト技術を提供する。各種酵母、例えばクルイベロミセス・ラクティス、ピキア・パストリス、ピキア・メタノリカ及びハンゼヌラ・ポリモルファは、高い細胞密度まで増殖させ、大量の組換えタンパク質を工業規模で分泌させ得るので細胞培養及びタンパク質産生のために一般的に使用されている。また、糸状菌、例えばアスペルギルス・ニガー、フザリウム属菌、ニューロスポラ・クラッサ等も工業規模で糖タンパク質を産生させるために使用され得る。
【００５２】
下等真核生物、特に酵母は、グリコシル化パターンが複雑な、或いはヒト様またはヒト化である糖タンパク質を発現するように遺伝子組換えられ得る。遺伝子組換えした下等真核生物は、高マンノースＮ−グリカンの産生に関与する特定の内因性グリコシル化酵素を排除し、複雑なＮ−グリカンの生成に関与する外因性酵素の各種組合せを導入することにより得られ得る。複雑なＮ−グリカンを産生するために酵母を遺伝子改変する方法は米国特許第７，０２９，８７２号、並びに米国特許出願公開第２００４／００１８５９０号、同第２００５／０１７０４５２号、同第２００６／０２８６６３７号、同第２００４／０２３００４２号、同第２００５／０２０８６１７号、同第２００４／０１７１８２６号、同第２００５／０２０８６１７号及び同第２００６／０１６０１７９号に記載されている。例えば、宿主細胞は、１，６−マンノシルトランスフェラーゼ活性が欠失し、糖タンパク質のＮ−グリカンにマンノース残基を付加するように選択または改変される。例えば、酵母では、ＯＣＨ１遺伝子が１，６−マンノシルトランスフェラーゼ活性をコード化する。次いで、複雑なヒト様Ｎ−グリカンの産生に関与する１つ以上の酵素を含むように宿主細胞を改変する。
【００５３】
１つの実施形態では、宿主細胞は更に、通常α１，２−マンノシダーゼ触媒ドメインを伴わず、α１，２−マンノシダーゼ活性を宿主細胞のＥＲまたはゴルジ体へターゲットするように選択された細胞ターゲッティングシグナルペプチドに融合されている前記触媒ドメインを含む。組換え糖タンパク質が宿主細胞のＥＲまたはゴルジ体を通過すると、フコシル化Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォーム（例えば、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）グリコフォーム）を含む組換え糖タンパク質が産生される。米国特許第７，０２９，８７２号、並びに米国特許出願公開第２００４／００１８５９０号及び同第２００５／０１７０４５２号は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む糖タンパク質を産生し得る下等真核生物宿主細胞を開示している。
【００５４】
更なる実施形態では、直前の宿主細胞は更に、通常ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ（ＧｎＴＩ）触媒ドメインを伴わず、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ活性を宿主細胞のＥＲまたはゴルジ体へターゲットするように選択された細胞ターゲッティングシグナルペプチドに融合されている前記触媒ドメインを含む。組換え糖タンパク質が宿主細胞のＥＲまたはゴルジ体を通過すると、フコシル化ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォーム（例えば、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）グリコフォーム）を含む組換え糖タンパク質が産生される。米国特許第７，０２９，８７２号、並びに米国特許出願公開第２００４／００１８５９０号及び同２００５／０１７０４５２号は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む糖タンパク質を産生し得る下等真核生物宿主細胞を開示している。上記細胞において産生された糖タンパク質をインビトロでヘキサミニダーゼで処理すると、フコシル化Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）グリコフォームを含む組換え糖タンパク質が産生され得る。
【００５５】
更に別の実施形態では、直前の宿主細胞は更に、通常マンノシダーゼＩＩ触媒ドメインを伴わず、マンノシダーゼＩＩ活性を宿主細胞のＥＲまたはゴルジ体へターゲットするように選択された細胞ターゲッティングシグナルペプチドに融合されている前記触媒ドメインを含む。組換え糖タンパク質が宿主細胞のＥＲまたはゴルジ体を通過すると、フコシル化ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォーム（例えば、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）グリコフォーム）を含む組換え糖タンパク質が産生される。米国特許出願公開第２００４／０２３００４２号は、マンノシダーゼＩＩ酵素を発現し、主にＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを有する糖タンパク質を産生し得る下等真核生物宿主細胞を開示している。上記細胞において産生された糖タンパク質をインビトロでヘキサミニダーゼで処理すると、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）グリコフォームを含む組換え糖タンパク質が産生され得る。
【００５６】
更に別の実施形態では、直前の宿主細胞は更に、通常ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩ（ＧｎＴＩＩ）触媒ドメインを伴わず、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩ活性を宿主細胞のＥＲまたはゴルジ体へターゲットするように選択された細胞ターゲッティングシグナルペプチドに融合されている前記触媒ドメインを含む。組換え糖タンパク質が宿主細胞のＥＲまたはゴルジ体を通過すると、フコシル化ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォーム（例えば、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）グリコフォーム）を含む組換え糖タンパク質が産生される。米国特許第７，０２９，８７２号、並びに米国特許出願公開第２００４／００１８５９０号及び同第２００５／０１７０４５２号は、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む糖タンパク質を産生し得る下等真核生物宿主細胞を開示している。上記細胞において産生された糖タンパク質をインビトロでヘキサミニダーゼで処理すると、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）グリコフォームを含む組換え糖タンパク質が産生され得る。
【００５７】
更に別の実施形態では、直前の宿主細胞は更に、通常ガラクトーストランスフェラーゼＩＩ触媒ドメインを伴わず、ガラクトーストランスフェラーゼＩＩ活性を宿主細胞のＥＲまたはゴルジ体へターゲットするように選択された細胞ターゲッティングシグナルペプチドに融合されている前記触媒ドメインを含む。組換え糖タンパク質が宿主細胞のＥＲまたはゴルジ体を通過すると、フコシル化Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォーム（例えば、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）グリコフォーム）を含む組換え糖タンパク質が産生される。米国特許出願公開第２００６／００４０３５３号明細書は、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォーを含む糖タンパク質を産生し得る下等真核生物宿主細胞を開示している。上記細胞において産生された糖タンパク質をインビトロでガラクシトダーゼで処理すると、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォーム（例えば、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）グリコフォーム）を含む組換え糖タンパク質が産生され得る。
【００５８】
更に別の実施形態では、直前の宿主細胞は更に、通常シアリルトランスフェラーゼ触媒ドメインを伴わず、シアリルトランスフェラーゼ活性を宿主細胞のＥＲまたはゴルジ体へターゲットするように選択された細胞ターゲッティングシグナルペプチドに融合されている前記触媒ドメインを含む。組換え糖タンパク質を宿主細胞のＥＲまたはゴルジ体を通過すると、フコシル化ＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォーム（例えば、ＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）グリコフォーム）を含む組換え糖タンパク質が産生される。酵母や糸状菌のような下等真核生物宿主細胞の場合、宿主細胞が更にＮ−グリカンに転移させるためにＣＭＰ−シアル酸を与える手段を含むことが好ましい。米国特許出願公開第２００５／０２６０７２９号はＣＭＰ−シアル酸合成経路を有するように下等真核生物を遺伝子改変する方法を開示しており、米国特許出願公開第２００６／０２８６６３７号はシアリル化糖タンパク質を産生するために下等真核生物を遺伝子改変する方法を開示している。上記細胞において産生された糖タンパク質をインビトロでノイラミダーゼで処理すると、フコシル化Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォーム（例えば、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）グリコフォーム）を含む組換え糖タンパク質が産生され得る。
【００５９】
上記した宿主細胞の１つは更に、米国特許出願公開第２００４／０７４４５８号及び同第２００７／００３７２４８号に開示されているようなバイセクト及び／またはマルチアンテナリーＮ−グリカン構造を有する糖タンパク質を産生させるためにＧｎＴＩＩＩ、ＧｎＴＩＶ、ＧｎＴＶ、ＧｎＴＶＩ及びＧｎＴＩＸからなる群から選択される１つ以上のＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼを含み得る。前記した各種宿主細胞は１つ以上の糖トランスポーター、例えばＵＤＰ−ＧｌｃΝＡｃトランスポーター（例えば、クルイベロミセス・ラクティス及びハツカネズミＵＤＰ−ＧｌｃΝＡｃトランスポーター）、ＵＤＰ−ガラクトーストランスポーター（例えば、キイロショウジョウバエＵＤＰ−ガラクトーストランスポーター）及びＣＭＰ−シアル酸トランスポーター（例えば、ヒトシアル酸トランスポーター）を含む。酵母や糸状菌のような下等真核生物宿主細胞は上記したトランスポーターを有していないので、このトランスポーターを含むように酵母や糸状菌のような下等真核生物宿主細胞を遺伝子改変することが好ましい。
【００６０】
上記した宿主細胞の更なる実施形態では、宿主細胞を更に、β−マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子（ＢＭＴ２）を欠失または破壊することによりα−マンノシダーゼ耐性Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質（米国特許出願公開第２００６／０２１１０８５号を参照されたい）、及びホスホマンノシルトランスフェラーゼ遺伝子ＰＮＯ１及びＭＮＮ４Ｂの一方または両方を欠失または破壊することによりホスホマンノース残基を有する糖タンパク質（例えば、米国特許出願公開第２００６／０１６０１７９号及び同第２００４／００１４１７０号を参照されたい）を除去するように遺伝子改変する。上記宿主細胞の更に別の実施形態では、１つ以上のＤｏｌ−Ｐ−Ｍａｎ：タンパク質（Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子（ＰＭＴｓ）を欠失または破壊することにより糖タンパク質のＯ−グリコシル化を排除するように宿主細胞を更に遺伝子改変する（米国特許第５，７１４，３７７号を参照されたい）。
【００６１】
特定のポリペプチドをコードする遺伝子または転写単位をコドン最適化すると、コードされるポリペプチドの発現が高まり、すなわちポリペプチドをコード化するｍＲＮＡの翻訳が向上することが判明した。従って、本明細書中に開示されている宿主細胞の場合、コード化された酵素の発現が高まるとより多くのコード化酵素が生じ、こうするとフコシル化Ｎ−グリカンの産生が増加し得る。コドン最適化に関連して、用語「発現」及びその変形は、ポリペプチドをコード化するｍＲΝＡの翻訳を指し、ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドの転写を指さない。本明細書中で使用されている用語「遺伝子」は、ポリペプチドをコード化するゲノムＤＮＡまたはＲＮＡ、並びにポリペプチドをコード化するｃＤＮＡを指す。
【００６２】
コドン最適化は、遺伝子を遺伝子の天然遺伝的環境とは異なるヌクレオチドコドン使用頻度を示す外来遺伝的環境に移動させたときに遺伝子の非相同発現を改善すること、または遺伝子が元々高度発現する遺伝子をコード化する遺伝的環境に先天的な遺伝子中に通常使用されていないヌクレオチドを１つ以上含んでいるときに天然遺伝的環境における遺伝子の異所性発現を改善することを求めるプロセスである。換言すると、コドン最適化は、特定遺伝的環境または生物において比較的低頻度で使用されている遺伝子のヌクレオチドコドンを前記遺伝的環境または生物においてより高頻度で発現される遺伝子中で使用されているヌクレオチドコドンで置換することを含む。こうすると、遺伝子産物（ポリペプチド）の発現（翻訳）が高まる。高度発現している遺伝子中に高頻度で見られるヌクレオチドコドンは低頻度で見られるヌクレオチドコドンよりもより効率的に翻訳されると仮定されている。
【００６３】
通常、特定遺伝子に対してヌクレオチドコドンを最適化する方法は、生物中で高度発現している遺伝子中で使用されているアミノ酸の各々についてヌクレオチドコドンの頻度を同定した後、高度発現している遺伝子において低頻度で使用されている当該遺伝子中のヌクレオチドコドンを高度発現している遺伝子中で使用されていると同定されたヌクレオチドコドンで置換することを含む（例えば、Ｌａｔｈｅ，Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｒｏｂｅｓ Ｄｅｄｕｃｅｄ ｆｒｏｍ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ：Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．，１８３：１−１２（１９８５）；Ｎａｋａｍｕｒａら，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，２８：２９２（２０００）；Ｆｕｇｌｓａｎｇ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ＆ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，３１：２４７−２４９（２００３）を参照されたい）。遺伝子をコード化する生物の核酸のヌクレオチドコドンを自動的に分析し、生物において低頻度で見られるヌクレオチドコドンを生物中で高度発現している遺伝子中で見られるヌクレオチドコドンで置換するためのヌクレオチドコドンを示唆するコンピュータープログラムは多数ある。
【００６４】
以下の実施例は、本発明の更なる理解を深めるために意図されている。
【実施例１】
【００６５】
本実施例は、糖タンパク質のＮ−グリカン構造中にフコースを含む糖タンパク質を産生し得るピキア・パストリス株の構築を説明する。
【００６６】
組換えＤＮＡ作業のために大腸菌株ＴＯＰ１０またはＸＬ１０−ＧｏＩｄを使用する。ＰＮＧアーゼ−Ｆ、制限及び修飾酵素はＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ（マサチューセッツ州ビバリーに所在）から入手し、製造業者の指示通り使用する。α−１，６−フコシダーゼはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（ミズーリ州セントルイスに所在）から入手し、製造業者の推奨通り使用する。オリゴヌクレオチドはＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（アイオワ州コーラルヴィルに所在）から入手する。金属キレート化“ＨｉｓＢｉｎｄ”樹脂はＮｏｖａｇｅｎ（ウィスコンシン州マディソンに所在）から入手する。９６ウェルのライゼート透明化プレートはＰｒｏｍｅｇａ（ウィスコンシン州マディソンに所在）から入手する。タンパク質結合９６ウェルプレートはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ（マサチューセッツ州ベッドフォードに所在）から入手する。塩及び緩衝剤はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（ミズーリ州セントルイスに所在）から入手する。
【００６７】
フコシル化経路遺伝子の増幅
フコシル化経路の大要を図１に示す。ｈＧＭＤのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をヒト肝ｃＤＮＡ（カリフォルニア州パロアルトに所在のＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）から製造業者が推奨する手順に従ってＡｄｖａｎｔａｇｅ ２ポリメラーゼを用いて増幅させる。簡単に説明すると、プライマーＳＨ４１５及びＳＨ４１３（それぞれ、５’−ＧＧＣＧＧ ＣＣＧＣＣ ＡＣＣＡＴ ＧＧＣＡＣ ＡＣＧＣＡ ＣＣＧＧＣ ＡＣＧＣＴ ＧＣ−３’（配列番号１５）及び５’−ＴＴＡＡＴ ＴＡＡＴＣ ＡＧＧＣＡ ＴＴＧＧＧ ＧＴＴＴＧ ＴＣＣＴＣ ＡＴＧ−３’（配列番号１６））を用いて、ヒト肝ｃＤＮＡ由来の１，１３９ｂｐ産物を以下：９７℃で３分間；９７℃で３０秒間、５０℃で３０秒間、７２℃で２分間を３５サイクル；及び７２℃で１０分間；の条件を用いて増幅させる。その後、産物をｐＣＲ２．１（カリフォルニア州カールズバッドに所在のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化し、配列決定し、得られた構築物をｐＳＨ９８５と称する。
【００６８】
上に概説した条件を用いて、プライマーＳＨ４１４及びＳＨ４１１（それぞれ、５’−ＧＧＣＧＧ ＣＣＧＣＣ ＡＣＣＡＴ ＧＧＧＴＧ ＡＡＣＣＣ ＣＡＧＧＧ ＡＴＣＣＡ ＴＧ−３’（配列番号１７）及び５’−ＴＴＡＡＴ ＴＡＡＴＣ ＡＣＴＴＣ ＣＧＧＧＣ ＣＴＧＣＴ ＣＧＴＡＧ ＴＴＧ−３’（配列番号１８））を用いて、ヒトＦＸ遺伝子のＯＲＦに相当するヒト腎ｃＤＮＡ（カリフォルニア州パロアルトに所在のＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）由来の９８６ｂｐ断片を増幅させる。その後、この断片をｐＣＲ２．１にクローン化し、配列決定し、ｐＳＨ９８８と称する。
【００６９】
ヒトＧＦＴｒのＯＲＦをヒト膵ｃＤＮＡ（カリフォルニア州パロアルトに所在のＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）から上に概説した条件、並びにプライマーＲＣＤ６７９及びＲＣＤ６８０（それぞれ、５’−ＧＣＧＧＣ ＣＧＣＣＡ ＣＣＡＴＧ ＡＡＴＡＧ ＧＧＣＣＣ ＣＴＣＴＧ ＡＡＧＣＧ Ｇ−３’（配列番号１９）及び５’−ＴＴＡＡＴ ＴＡＡＴＣ ＡＣＡＣＣ ＣＣＣＡＴ ＧＧＣＧＣ ＴＣＴＴＣ ＴＣ−３’（配列番号２０））を用いて増幅させる。得られた１，１１３ｂｐ断片をｐＣＲ２．１にクローン化し、配列決定し、ｐＧＬＹ２１３３と称する。
【００７０】
アミノ酸３２〜５７５をコード化し、内因性膜貫通ドメインをコード化するヌクレオチドを欠く切断型マウスＦＵＴ８ ＯＲＦをマウス脳ｃＤＮＡ（カリフォルニア州パロアルトに所在のＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）から上に概説した条件、並びにプライマーＳＨ４２０及びＳＨ４２１（それぞれ、５’−ＧＣＧＧＣ ＧＣＧＣＣ ＧＡＴＡＡ ＴＧＡＣＣ ＡＣＣＣＴ ＧＡＴＣＡ ＣＴＣＣＡ Ｇ−３’（配列番号２１）及び５’−ＣＣＴＴＡ ＡＴＴＡＡ ＣＴＡＴＴ ＴＴＴＣＡ ＧＣＴＴＣ ＡＧＧＡＴ ＡＴＧＴＧ ＧＧ−３’（配列番号２２））を用いて増幅させる。生じた1.65ｂｐ遺伝子をｐＣＲ２．１にクローン化し、配列決定し、ｐＳＨ９８７と称する。
【００７１】
酵母発現カセットでのフコシル化遺伝子の作製
ＮｏｔＩ適合性５’末端及びＰａｃＩ適合性３’末端を有するＤＮＡ断片を得るために上記ベクターをＮｏｔＩ制限酵素及びＰａｃＩ制限酵素で消化することによりＧＭＤ、ＦＸ及びＧＦＴｒのオープンリーディングフレームを作製する。ＡｓｃＩ適合性５’末端及びＰａｃＩ適合性３’末端を有するＤＮＡを得るためにはＡｓｃＩ制限酵素及びＰａｃＩ制限酵素で消化することによりＦＵＴ８断片を作製する。
【００７２】
ＧＭＤ発現カセットを作成するためには、ＧＭＤを酵母発現ベクターｐＳＨ９９５にノーセオスリシン耐性マーカーを用いてクローン化する。このベクターはピキア・パストリスＧＡＰＤＨプロモーター及びサッカロミセス・セレビシアエＣＹＣ転写ターミネーター配列を含み、Ｔｒｐ２ ＯＲＦの下流に組み込むように設計されている。このベクターを図３Ａに示す。ベクターｐＳＨ９８５をＮｏｔＩ及びＰａｃＩで消化して、ＧＭＤ ＯＲＦを含む１．１Ｋｂ断片を切り取った後、予め同一酵素で消化したｐＳＨ９９５にサブクローン化する。ＧＡＰＤＨプロモーターの制御下でＧＭＤを含有しているベクターが生じ、これをｐＳＨ９９７と称する。
【００７３】
ＦＸ発現カセットを作成するためには、ベクターｐＳＨ９８８をＮｏｔＩ及びＰａｃＩで消化して、ＦＸ ＯＲＦを含む１．０Ｋｂ断片を切り取つた後、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで処理して一本鎖オーバーハングを除去する（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｄ．Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（ニューヨーク州コールドスプリングに所在のＣｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，第３版，２００１））。次いで、この断片を、予めにＮｏｔＩ及びＡｓｃＩで消化し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで処理したベクターｐＧＬＹ３５９（Ｈａｍｉｌｔｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１３，１４４１（２００６））にサブクローン化する。生じたベクターｐＳＨ９９４は、５’末端でピキア・パストリスＰＭＡ１プロモーター（ＰｐＰＭＡ１ｐｒｏｍ）に、３’末端でピキア・パストリスＰＭＡ転写ターミネーター配列（ＰｐＰＭＡｌｔｔ）に機能し得る形で連結されているＦＸ ＯＲＦから構成されるＦＸ発現カセットを含んでいる。この発現カセットはＳｗａＩ制限部位に隣接している。
【００７４】
ＧＦＴｒ発現カセットは、ｐＧＬＹ２１３３をＮｏｔＩ及びＰａｃＩで消化してＧＦＴｒ ＯＲＦを含む１．１Ｋｂ断片を切り取った後、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで処理することにより作製する。その後、この断片を、予めＮｏｔＩ及びＰａｃＩで消化し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで処理したベクターｐＧＬＹ３６３（上掲したＨａｍｉｌｔｏｎ）にサブクローン化した。生じたベクターｐＧＬＹ２１４３は、５’末端でＰｐＰＭＡ１ｐｒｏｍ、３’末端でＰｐＰＭＡ１ｔｔに機能し得る形で連結されているＧＦＴｒ ＯＲＦから構成されるＧＦＴｒ発現カセットを含んでいる。この発現カセットはＲｓｒＩＩ制限部位に隣接している。
【００７５】
酵母局在化シグナルに融合させたＦＵＴ８触媒ドメインを作製するためには、Ｍｎｎ２のサッカロミセス・セレビシアエターゲッティング領域の最初の３６アミノ酸をＧｅｎｅＯｐｔｉｍｉｚｅｒソフトウェアにより分析し、ピキア・パストリス発現（独国レーゲンスブルクに所在のＧｅｎｅＡｒｔ）に対してコドン最適化する。ＳｃＭｎｎ２アミノ酸１〜３６に対して５’ＮｏｔＩ及び３’ＡｓｃＩ制限酵素適合性末端を有する合成ＤＮＡが生じ、このＤＮＡをシャトルベクターにクローン化してプラスミドベクターｐＳＨ８３１を作製する。その後、ベクターｐＳＨ９８７をＡｓｃＩ及びＰａｃＩで消化して、ＦＵＴ８触媒ドメインＯＲＦをコード化する１．６Ｋｂ断片を遊離させた後、予め同一酵素で消化したベクターｐＳＨ８３１中のＳｃＭｎｎ２ターゲッティングペプチドをコード化するＤＮＡにインフレームでサブクローン化する。生じたベクターをｐＳＨ９８９と称する。ＦＵＴ８−ＳｃＭｎｎ２発現カセットを作成するためには、ｐＳＨ９８９をＮｏｔＩ及びＰａｃＩで消化して１．８Ｋｂ断片を遊離させた後、同一酵素で消化したベクターｐＧＬＹ３６１（Ｈａｍｉｌｔｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１３，１４４１（２００６））にサブクローン化する。生じたベクターｐＳＨ９９１は、５’末端でピキア・パストリスＴＥＦプロモーター（ＰｐＴＥＦｐｒｏｍ）、３’末端でピキア・パストリスＴＥＦ転写ターミネーター配列（ＰｐＴＥＦｔｔ）に機能し得る形で連結されているＦＵＴ８−Ｍｎｎ２融合ＯＲＦから構成されているＦＵＴ８−Ｍｎｎ２融合タンパク質を含んでいる。この発現カセットはＳｇｆＩ制限部位に隣接している。
【００７６】
フコシル化改変ベクターの作製
ベクターｐＳＨ９９４をＳｗａＩで消化して、ＦＸ発現カセットを含む２．５Ｋｂ断片を遊離させた後、ＰｍｅＩで消化した（ＧＭＤ発現カセットを含む）ｐＳＨ９９７にサブクローン化する。ＰＭＡ−ＦＸ及びＧＡＰＤＨ−ＧＭＤ発現カセットが同一方向にアラインされているベクターが生じ、これをｐＳＨ１００９と称する。ＰＭＡ−ＧＦＴｒ発現カセットを含む２．７Ｋｂ断片をｐＧＬＹ２１４３から制限酵素ＲｓｒＩＩを用いて切り取り、同一酵素で消化したｐＳＨ１００９にサブクローン化する。ＰＭＡ−ＧＦＴｒ及びＧＡＰＤＨ発現カセットが同一方向にアラインされているベクターが生じ、これをｐＳＨ１０１９と称する。最後に、１．８Ｋｂ ＴＥＦ−ＦＵＴ８カセットをｐＳＨ９９１からＳｇｆＩを用いて切り取り、同一酵素で消化したｐＳＨ１０１９にサブクローン化する。ＴＥＦ−ＦＵＴ８及びＧＡＰＤＨ発現カセットが同一方向にアラインされているベクターが生じ、これをｐＳＨ１０２２と称する。このベクターを図２Ｂに示す。
【００７７】
ラットＥＰＯ発現ベクターの作製
アミノ酸２７〜１９２をコード化する切断型ドブネズミ（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）エリスロポエチン遺伝子（ｒＥＰＯ）をラット腎ｃＤＮＡ（カリフォルニア州パロアルトに所在のＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）からＡｄｖａｎｔａｇｅ ２ポリメラーゼを製造業者が推奨するように用いて増幅させる。簡単に説明すると、プライマーｒＥＰＯ−順方向及びｒＥＰＯ−逆方向（それぞれ、５’−ＧＧＧＡＡ ＴＴＣＧＣ ＴＣＣＣＣ ＣＡＣＧＣ ＣＴＣＡＴ ＴＴＧＣＧ ＡＣ−３’（配列番号２３）及び５’−ＣＣＴＣＴ ＡＧＡＴＣ ＡＣＣＴＧ ＴＣＣＣＣ ＴＣＴＣＣ ＴＧＣＡＧ ＧＣ−３’（配列番号２４））を用いて、ラット腎ｃＤＮＡ由来の５１６ｂｐ産物を以下：９４℃で１分間を１サイクル；９４℃で３０秒間、７２℃で１分間を５サイクル；９４℃で３０秒間、７０℃で１分間を５サイクル；９４℃で２０秒間、６８℃で１分間を２５サイクル；のサイクル条件を用いて増幅させる。その後、産物をｐＣＲ２．１（カリフォルニア州カールズバッドに所在のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化し、配列決定し、生じた構築物をｐＳＨ６０３と称する。酵母発現ベクターを作製するためには、ｐＳＨ６０３をＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩで消化して５０６ｂｐ断片を遊離させた後、予め同一酵素で消化したｐＰＩＣＺαＡ（カリフォルニア州カールズバッドに所在のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローン化した。生じた発現ベクターをｐＳＨ６９２と称する。ｐＳＨ６９２中のＥＰＯはＡＯＸメタノール誘導プロモーターの制御下にある。
【００７８】
酵母株の作製及びラットＥＰＯの産生
主にＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２Ｎ−グリカンを有する組換え糖タンパク質を産生し得るピキア・パストリス糖鎖改変した細胞株ＹＧＬＹｌ ０６２（Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質を産生する米国特許出願公開第２００６／００４０３５３号明細書に記載されている菌株に類似している）をベクターＰＳＨ６９２で形質転換すると、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２Ｎ−グリカンを有する組換えラットＰＯ（ｒＥＰＯ）を産生する菌株ＲＤＰ９７４が生ずる。菌株ＲＤＰ９７４は、Ｇａｌ２ＧｌｃΝＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃΝＡｃ２Ｎ−グリカンを有するラットＥＰＯを産生する菌株ＲＤＰ７６２に類似しており、この菌株はＨａｍｉｌｔｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１３，１４４１−１４４３（２００６）に記載されている。
【００７９】
ＲＰＤ９７４菌株はＯＣＨ１、ＰＮＯ１、ＭＮＮ４Ｂ及びＢＭＴ２遺伝子を欠失しており、完全長クルイベロミセス・ラクティスＵＤＰ−ＧｌｃΝＡｃトランスポーター、ハツカネズミＵＤＰ−ＧｌｃΝＡｃトランスポーター、サッカロミセス・セレビシアエＵＤＰ−ガラクトース４−エピメラーゼ及びキイロショウジョウバエＵＤＰ−ガラクトーストランスポーターをコード化するＤΝＡ；サッカロミセス・セレビシアエＭＮＮ２リーダー配列のアミノ酸１〜３６をコード化するＤＮＡに融合されているハツカネズミα１，２−マンノシダーゼＩ触媒ドメインをコード化するＤΝＡ；サッカロミセス・セレビシアエＭΝΝ２リーダー配列のアミノ酸１〜３６をコード化するＤΝＡに融合されているホモサピエンスβ１，２−ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ（ＧｎＴＩ）触媒ドメインをコード化するＤＮＡ；サッカロミセス・セレビシアエＭＮＮ２リーダー配列のアミノ酸１〜３６をコード化するＤＮＡに融合されているキイロショウジョウバエマンノシダーゼＩＩ触媒ドメインをコード化するＤＮＡ；サッカロミセス・セレビシアエＭＮＮ２リーダー配列のアミノ酸１〜９７をコード化するＤＮＡに融合されているドブネズミβ１，２−ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩ（ＧｎＴＩＩ）触媒ドメインをコード化するＤＮＡ；及びサッカロミセス・セレビシアエＫＲＥ２（ＭＮＴＩ）リーダー配列のアミノ酸１〜５８をコード化するＤＮＡに融合されているホモサピエンスβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａＩＴＩ）触媒ドメインをコード化するＤＮＡを含んでいる。米国特許出願公開第２００６／００４０３５３号は、下等酵母においてガラクトシル化糖タンパク質を産生するビシア・パストリス細胞株の作製方法を開示している。米国特許第７，０２９，８７２号；米国特許出願公開第２００４／００１８５９０号、同第２００４／０２３００４２号、同第２００５／０２０８６１７号、２００４／０１７１８２６号、同第２００６／０２８６６３７号及び同第２００７／００３７２４８号；及びＨａｍｉｌｔｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１３，１４４１−１４４３（２００６）も参照されたい。
【００８０】
次いで、菌株ＲＤＰ９７４をベクターｐＳＨ１０２２にフコシル化経路を導入するための宿主菌株として使用する。簡単に説明すると、１０μｇの対照プラスミドｐＳＨ９９５またはフコシル化経路プラスミドｐＳＨ１０２２を制限酵素ＳｆｉＩで消化してベクターを直線化し、エレクトロポレーションにより宿主菌株ＲＤＰ９７４に形質転換する。形質転換細胞を１００ｎｇ／ｍＬのノーセオスリシンを含有するＹＰＤで平板培養し、２６℃で５日間インキュベートする。その後、数個のクローンを抜き取り、ｒＥＰＯのＮ−グリカンに対するフコース転移について分析する。対照ベクターで形質転換した菌株をＹＳＨ６６０と称し、ｐＳＨ１０２２で形質転換し、フコース転移を示す菌株をＹＳＨ６６１と称する。
【００８１】
典型的には、形質転換菌株を２６℃で、増殖培地としての１％ 酵母抽出物、２％ ペプトン、１００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）、１．３４％ 酵母窒素ベース、４×１０〜５％ ビオチン及び１％ グリセロールからなる緩衝グリセロール−複合培地（ＢＭＧＹ）（５０ｍＬ）において増殖させることによりタンパク質発現を実施する。タンパク質発現の誘導は、ＢＭＧＹ中のグリセロールを１．５％ メタノールに代えた緩衝メタノール−複合培地（ＢＭＭＹ）（５０ｍＬ）中で実施する。
【００８２】
組換えｒＥＰＯを上記したように発現させ、Ｎｉ−キレートカラムはＣｈｏｉら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１００，５０２２（２００３）及びＨａｍｉｌｔｏｎら（Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０１，１２４４（２００３））に記載されているように精製する。生じたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｎａｔｕｒｅ，２２７，６８０（１９７０））により分析し、可視化するためにクーマシーブルーで染色する。フコースを、製造業者が推奨しているようにインビトロでα−１，６−フコシダーゼ（ミズーリ州セントルイスに所在のＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）処理して消化することにより除去する。
【００８３】
グリカン分析のために、ＰＮＧアーゼ−Ｆ（Ｃｈｏｉら（２００３）；Ｈａｍｉｌｔｏｎら（２００３））で処理することによりグリカンをｒＥＰＯから遊離させる。グリカン構造を確認するために、遊離したグリカンをＭＡＬＤＩ／飛行時間型（ＴＯＦ）質量分光分析により分析する（Ｃｈｏｉら（２００３））。存在するフコシル化グリカンの相対量を定量するために、Ｎ−グリコシダーゼＦ遊離したグリカンを２−アミノベンジジン（２−ＡＢ）で標識し、ＨＰＬＣ（Ｃｈｏｉら（２００３））により分析する。フコシダーゼ処理前及びその後の各物質のピーク面積を比較することによりフコシル化グリカン及び非フコシル化グリカンのパーセンテージを計算する。
【００８４】
本質的に上記したように作製した菌株ＹＳＨ６６１中で産生されたＮ−グリカンの分析から、この菌株はＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）Ｎ−グリカンを含む組換えｒＥＰＯを産生したことが判明した。菌株ＹＳＨ６６１中で産生されたｒＥＰＯのＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析の結果を示している図４Ａから、この菌株はＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２Ｎ−グリカンを含むＮ−グリカンを産生したことが判明した。Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）Ｎ−グリカンは四角で囲まれている。対照菌株ＹＳＨ６６０（フコシル化経路なし）中で産生されたｒＥＰＯのＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析の結果を示している図４Ｂは、この菌株はＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２のみからなるフコシル化Ｎ−グリカンしか産生しなかったことを示している。
【実施例２】
【００８５】
ＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質を産生し得るピキア・パストリス菌株は、ＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質を産生し得るピキア・パストリス菌株にベクターｐＳＨ１０２２を導入することにより作製できる。例えば、フコシル化経路の成分をコード化する遺伝子を含有しているベクターｐＳＨ１０２２は、ΝＡΝＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃΝＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃΝＡｃ２Ｎ−グリカンを有するラットＥＰＯを産生し、米国仮特許出願第６０／８０１，６８８号明細書及びＨａｍｉｌｔｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１３，１４４１−１４４３（２００６）に開示されている菌株ＹＳＨ５９７に形質転換され得る。導入により菌株で産生されるラットＥＰＯはＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）Ｎ−グリカンを含んでいるであろう。
【００８６】
シアリル化経路をコード化する酵素を実施例１の菌株ＹＳＨ６６１に導入する予想方法を以下に提供する。
【００８７】
ホモサピエンスＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノサミンキナーゼ（ＧＮＥ）、ホモサピエンスＮ−アセチルノイラミネート−９−ホスフェートシンターゼ（ＳＰＳ）、ホモサピエンスＣＭＰ−シアル酸シンターゼ（ＣＳＳ）、ハツカネズミＣＭＰ−シアル酸トランスポーター（ＣＳＴ）、及びハツカネズミα−２，６−シアリルトランスフェラーゼ（ＳＴ）のアミノ酸４０〜４０３のオープンリーディングフレームをＧｅｎｅＯｐｔｉｍｉｚｅｒソフトウェアにより分析し、ピキア・パストリス発現（独国レーゲンスブルクに所在のＧｅｎｅＡｒｔ）に対してコドン最適化する。生じたＧＮＥ、ＳＰＳ、ＣＳＳ及びＣＳＴに対する５’ＢｓａＩ及び３’ＨｐａＩ制限部位を有する合成ＤＮＡを作製し、シャトルベクターにクローン化し、それぞれｐＧＬＹ３６８、３６７、３６６及び３６９と称する。ＳＴに対する５’ＡｓｃＩ及び３’ＰａｃＩ制限部位を有する合成ＤＮＡを作製し、シャトルベクターにクローン化し、ｐＳΗ６６０と称する。ＳＰＳ、ＣＳＳ及びＣＳＴ発現カセットを作成するために、ベクターｐＧＬＹ３６７、３６６及び３６９をＢｓａＩ及びＨｐａＩで消化して、１．１、１．３及び１．０Ｋｂ断片を切り取り、これらの断片をＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで処理して一本鎖オーバーハングを除去する。次いで、これらの断片を、予めＮｏｔＩ及びＡｓｃＩで消化し、Ｔ４ ＤΝＡポリメラーゼで処理したベクターｐＧＬＹ３５９、並びに予めＮｏｔＩ及びＰａｃＩで消化し、Ｔ４ ＤΝＡポリメラーゼで処理したベクターｐＧＬＹ１７及び３６３にサブクローン化する。生じたベクターｐＳＨ８１９は、ＰａｃＩ制限部位に隣接するＰｐＰＭＡｌｐｒｏｍ−ＰｐＰＭＡｌｔｔカセット中にＳＰＳを含んでいる。生じたベクターｐＳＨ８２４は、５’ＢｇｌＩＩ及び３’ＢａｍＨＩ制限部位に隣接するＰｐＧＡＰＤＨ−ＳｃＣＹＣｔｔカセット中にＣＳＳを含んでいる。生じたベクターｐＧＬＹ３７２は、ＲｓｒＩＩ制限部位に隣接するＰｐＰＭＡ１ｐｒｏｍ−ＰｐＰＭＡｌｔｔカセット中にＣＳＴを含有している。酵母局在化シグナルに融合したＳＴ触媒ドメインを作製するために、Ｍｎｔｌのサッカロミセス・セレビシアエターゲッティング領域をゲノムＤΝＡからＴａｑ ＤΝＡポリメラーゼ（ウィスコンシン州マディソンに所在のＰｒｏｍｅｇａ）、並びにプライマーＳｃＭｎｔ１−順方向及びＳｃＭｎｔ１−逆方向（それぞれ、５’−ＧＧＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＣＣＴＣＴＴＴＣＴＣ ＡＧＴＡＡＧＡＧＡＣＴ ＧＴＴＧＡＧ−３’（配列番号２５）及び５’−ＣＣＧＧＣＧＣＧＣＣＣＧＡＴＧＡＣＴＴＧＴＴＧ ＴＴＣＡＧＧＧＧＡＴＡＴＡＧＡＴＣＣＴＧ−３’（配列番号２６））を用いて増幅させる。使用する条件は、９４℃で３分間を１サイクル；９４℃で３０秒間、５５℃で２０秒間、６８℃で１分間を３０サイクル；６８℃で５分間を１サイクルである。生じた５’ＮｏｔＩ及び３’ＡｓｃＩ制限部位を含有している１７４ｂｐ断片をコドン最適化ＳＴに対してインフレーム５’でサブクローン化すると、ベクターｐＳＨ８６１が生ずる。その後、このベクターをＮｏｔＩ及びＰａｃＩで消化してＳＴ−融合を含む１．３Ｋｂ断片を切り取り、Ｔ４ ＤΝＡポリメラーゼで処理し、ＮｏｔＩ及びＰａｃＩで消化することにより作製し、Ｔ４ ＤΝＡポリメラーゼで処理したｐＧＬＹ３６１にサブクローン化する。ＳｇｆＩ制限部位に隣接するＰｐＴＥＦｐｒｏｍ−ＰｐＴＥＦｔｔカセット中にＳＴ−融合を含むベクターが生じ、これをｐＳＨ８９３と称する。
【００８８】
ピキア・パストリスＧＡＰＤＨプロモーター及びサッカロミセス・セレビシアエＣＹＣ転写ターミネーターを含有する酵母発現ベクターｐＳＨ８２３は、Ｔｒｐ２ ＯＲＦの下流のピキアゲノムに組み込むように設計されている。ＰＭＡ−ＣＳＴ発現カセットをコード化する２．６Ｋｂ断片をｐＧＬＹ３７２から制限酵素ＲｓｒＩＩを用いて切り取り、同一酵素で消化したｐＳＨ８２３にサブクローン化する。ＰＭＡ−ＣＳＴ及びＧＡＰＤＨ発現カセットが同一方向にアラインされているベクターが生じ、これをｐＳＨ８２６と称する。その後、このベクターを制限酵素ＮｏｔＩ及びＰａｃＩで消化し、一本鎖オーバーハングをＴ４ ＤΝＡポリメラーゼを用いて除去する。この線状構築物に、ｐＧＬＹ３６８からＢｓａＩ及びＨｐａＩで消化することにより単離し、一本鎖オーバーハングを除去するためにＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで処理したＧＮＥの２．２Ｋｂ断片をサブクローン化する。このベクターをｐＳＨ８２８と称する。その後、このベクターをＰａｃＩで消化し、ここにＰＭＡ−ＳＰＳ発現カセットをコード化するｐＳＨ８１９の２．７Ｋｂ ＰａｃＩ断片をサブクローン化する。ＰＭＡ−ＳＰＳ発現カセットがＧＡＰＤＨ発現カセットと反対方向にアラインされているベクターが生じ、これをｐＳＨ８３０と称する。この段階で、ＵＲＡ５マーカーが、ｐＳＨ８３０からＸｈｏＩを用いて２．４Ｋｂ ＵＲＡ５断片を切り取り、ｐＳＨ８４２から同一酵素で消化したＨＩＳＩの１．８Ｋｂ断片で置換することによりＨＩＳ１で置換されている。ＨＩＳ１ ＯＲＦがＧＡＰＤＨ−ＧＮＥ発現カセットと同一方向にアラインされているベクターが生じ、これをｐＳＨ８７０と称する。その後、このベクターをＢａｍＨＩで消化し、ｐＳＨ８２４からＢａｍＨＩ及びＢｇｌＩＩで消化することにより単離したＧＡＰＤＨ−ＣＳＳ発現カセットを含有している２．１Ｋｂ断片をサブクローン化する。新たに導入した発現カセットがＧＡＰＤＨ−ＧＮＥカセットと反対方向に方向づけられているベクターが生じ、これをｐＳＨ８７２と称する。次いで、ＴＥＦ−ＳＴを含有している２．２Ｋｂ発現カセットをｐＳＨ８７２からＳｇｆＩで消化し、同一酵素で消化したｐＳＨ８９３にサブクローン化する。ＴＥＦ−ＳＴカセットがＧＡＰＤＨ−ＧＮＥカセットと反対方向に方向づけられているベクターが生じ、これをｐＳＨ９２６と称する。
【００８９】
ｐＳＨ９２６ベクターを菌株ＹＳＨ６６１に形質転換し、これはその後ＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２Ｎ−グリカンを有するラットＥＰＯを産生し得る。
【実施例３】
【００９０】
ＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）Ｎ−グリカンを有するヒトＥＰＯを産生し得るピキア・パストリス菌株は、ＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２Ｎ−グリカンを有するヒトＥＰＯを産生し得るピキア・パストリス菌株にベクターｐＳＨ１０２２を導入することにより作製できる。例えば、フコシル化経路の成分をコード化する遺伝子を含んでいるベクターｐＳＨ１０２２は、ＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質を産生し得る菌株、例えばＨａｍｉｌｔｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１３，１４４１−１４４３（２００６）に開示されている菌株ＹＳＨ５９７、またはシアリル化経路酵素をコード化する遺伝子を含んでいるが、ラットＥＰＯをコード化するＤＮＡをヒトＥＰＯをコード化するＤＮＡで置換した実施例２のＹＳＨ６６１に形質転換され得る。次いで、菌株はＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）Ｎ−グリカンを有するヒトＥＰＯを産生するであろう。
【００９１】
本発明を本明細書中で例示した実施形態を参照して記載してきたが、本発明はこれらに限定されないと理解されるべきである。本明細書中の教示内容を入手できる当業者は本発明の範囲内で追加の改変及び実施形態を認識するであろう。従って、本発明は添付の請求の範囲によってのみ限定される。
【００９２】
【表１】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グリコバイオロジーの分野、特にフコシル化Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質が産生できるように糖タンパク質のＮ−グリカンをフコシル化するための内因性経路を欠く宿主細胞の遺伝子工学的方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
グリコシル化されているヒト用に意図されている治療用タンパク質は複雑なヒトＮ−グリコシル化パターンを有していなければならない。通常、（ａ）高濃度のタンパク質を迅速に産生できるため；（ｂ）滅菌の十分に制御された産生条件（例えば、ＧＭＰ条件）を使用できるため；（ｃ）簡単な化学的に規定された増殖培地を使用できるため；（ｄ）遺伝子操作が容易であるため；（ｅ）ヒトまたは動物病原体の汚染がないため；（ｆ）毒性等のために細胞培養で十分に発現されないものを含めた各種タンパク質を発現させることができるため；及び（ｇ）（例えば、培地への分泌により）タンパク質の回収が容易であるために、治療用タンパク質を細菌または真核微生物を用いて産生することが有利である。しかしながら、原核生物及び下等真核生物は通常複雑なＮ−グリコシル化パターンを有するタンパク質を産生しない。従って、複雑なヒト様Ｎ−グリコシル化パターンを有していることが望ましい治療用タンパク質を産生するためには、通常動物細胞が使用されている。しかしながら、治療用タンパク質を産生するために動物細胞を使用するには多数の重大な欠点がある。
【０００３】
動物細胞において発現させるのに適した治療用タンパク質は特定のもの（例えば、細胞毒性作用または増殖にとって不利な他の作用を欠くもの）のみである。動物細胞培養系は通常、有用な量の当該タンパク質を産生させるためには注意深く制御された条件下で非常にゆっくりであり、しばしば１週間にわたる増殖を要する。にもかかわらず、タンパク質収率は微生物発酵方法からのものに比較して有利でない。加えて、細胞培養系は典型的には複雑で高価な栄養素及び補因子（例えば、ウシ胎児血清）を必要とする。更に、増殖はプログラム化細胞死（アポトーシス）により制限される恐れがある。
【０００４】
更に、動物細胞（特に、哺乳動物細胞）はウイルス感染または汚染をかなり受けやすい。幾つかの場合にはウイルスまたは他の感染物質は培養物の増殖を危うくすることがあり、他の場合には前記物質は治療用タンパク質産物を意図する用途のために適さないものとするヒト病原体であり得る。更に、多くの細胞培養方法は、病原体（例えば、牛海綿状脳症（ＢＳＥ）タンパク質）を持っている恐れがある複雑で温度感受性の動物由来増殖培地成分を使用しなければならない。前記病原体は検出するのが難しく、及び／または増殖培地を汚すことなく除去または滅菌するのが難しい。いずれにせよ、治療用タンパク質を産生するために動物細胞を使用することは、産物の安全性を確保するためにコストがかかる品質管理を必要とする。
【０００５】
最近、下等真核生物、特に酵母は、ヒト様であるかまたはヒト化されている複雑なＮ−グリコシル化パターンを有しているタンパク質を発現するように遺伝子組換えされ得ることが判明した。このように遺伝子組換された下等真核生物は、高マンノースＮ−グリカンの産生に関与する特定の内因性グリコシル化酵素を除去し、さもなければ複雑なＮ−グリカンの生成に関与する外因性酵素の各種組合せを導入することにより得られ得る。複雑なＮ−グリカンを産生するための酵母の遺伝子工学的方法は米国特許第７，０２９，８７２号、並びに米国特許出願公開第２００４／００１８５９０号、同第２００５／０１７０４５２号、同第２００６／０２８６６３７号、同第２００４／０２３００４２号、同第２００５／０２０８６１７号、同第２００４／０１７１８２６号、同第２００５／０２０８６１７号及び同第２００６／０１６０１７９号に記載されている。例えば、１，６−マンノシルトランスフェラーゼ活性を欠失させ、さもなければ糖タンパク質のＮ−グリカンにマンノース残基を付加するように宿主細胞を選択または改変し、その後複雑なヒト様Ｎ−グリカンの産生に関与する各酵素を含むように改変することができる。
【０００６】
動物及びヒト細胞は、タンパク質上のＮ−グリカンの還元末端のＧｌｃΝＡｃ残基にフコース残基を付加するフコシルトランスフェラーゼ経路を有している。ヒトにおけるフコシル化経路は、いずれも細胞質に位置し、協力してＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−フコースに変換させるＧＤＰ−マンノースデヒドラターゼ及びＧＤＰ−ケト−デオキシ−マンノース−エピメラーゼ／ＧＤＰ−ケト−デオキシ−ガラクトース−レダクターゼ（ＦＸタンパク質）；ＧＤＰ−フコースをゴルジ体に輸送するゴルジ体の膜に位置しているＧＤＰ−フコーストランスポーター；及びＮ−グリカンの還元末端でＧｌｃΝＡｃ残基の６位への１，６−結合によりフコース残基を転移させるフコシルトランスフェラーゼ（Ｆｕｔ８）から構成されている。高等真核生物とは対照的に、多くの下等真核生物、例えば酵母はフコシルトランスフェラーゼ経路に関与する酵素を欠き、フコースを含有しない糖タンパク質しか産生しない（例えば、Ｂｒｅｔｔｈａｕｅｒ／Ｃａｔｅｌｌｉｎｏ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３０：１９３−２００（１９９９）；Ｒａｂｉｎａら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２８６：１７３−１７８（２０００）を参照されたい）。しかしながら、糖タンパク質のフコースがないことは場合によっては有利であることが判明している。例えは、モノクローラル抗体、免疫グロブリン分子及び関連分子の産生においては、免疫グロブリンのＮ−グリカンからフコース糖を除去すると特定のＩｇ受容体への結合が増加または変化し、これにより抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）のような特性に変化が生ずる（例えば、米国特許出願公開第２００５／０２７６８０５号及び同第２００３／０１５７１０８号を参照されたい）。
【０００７】
しかしながら、免疫グロブリンのＮ−グリカンからフコースを除去すると免疫グロブリンのＡＤＣＣ活性が高まるとみられ、フコシル化Ｎ−グリカンは他の糖タンパク質にとって重要であるとみられる。例えば、マウス中のフコシルトランスフェラーゼ遺伝子を欠失させると、重大な成長の遅れ、生後発達中の早死及び肺における気腫様変化が誘発される。これらのＦｕｔ８−／−ヌルマウスは、外因性ＴＧＦ−β１を投与することにより気腫様表現型から救出された。加えて、障害を受けた受容体媒介シグナル伝達もＦｕｔ８遺伝子を再導入することにより救出され、コアフコシル化がＴＧＦ−β１やＥＧＦのような増殖因子受容体を適切に機能させるために重要であることが判明している（Ｗａｎｇら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，４１７：１１−２２（２００６））。Ｆｕｔ８−／−マウス由来の肺組織では、コアフコシル化が損失すると低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体関連タンパク質−１（ＬＲＰ−Ｉ）の機能が損なわれ、その結果インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）−結合タンパク質−３（ＩＧＦＢＰ−３）の飲食作用が低下する（Ｌｅｅら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（Ｔｏｋｙｏ），１３９：３９１−８（２００６））。Ｆｕｔ８−／−マウス胎児線維芽細胞では、α３β１インテグン媒介細胞遊走がなくなり、細胞シグナル伝達が低下し、コアフコースがタンパク質機能にとって必須であることが確認された（Ｚｈａｏら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８１：３８３４３−３８３５０（２００６））。加えて、ＡＤＣＣ活性を低下させるために組成物中の抗体の少なくとも一部がフコシル化されている抗体組成物を得ることが望ましい状況もある。従って、特定の場合には、フコシル化糖タンパク質を産生できる下等真核生物及び細胞を提供することが有利である。従って、下等真核宿主細胞、例えば真菌及び酵母、特に酵母（例えば、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、クルイベロミセス・ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）等）を作製するための方法及び材料を開発すると、フコシル化糖タンパク質を組換え産生させるための遺伝子強化した酵母菌株の開発が促進される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第７，０２９，８７２号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００４／００１８５９０号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２００５／０１７０４５２号明細書
【特許文献４】米国特許出願公開第２００６／０２８６６３７号明細書
【特許文献５】米国特許出願公開第２００４／０２３００４２号明細書
【特許文献６】米国特許出願公開第２００５／０２０８６１７号明細書
【特許文献７】米国特許出願公開第２００４／０１７１８２６号明細書
【特許文献８】米国特許出願公開第２００５／０２０８６１７号明細書
【特許文献９】米国特許出願公開第２００６／０１６０１７９号明細書
【特許文献１０】米国特許出願公開第２００５／０２７６８０５号明細書
【特許文献１１】米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号明細書
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｂｒｅｔｔｈａｕｅｒ／Ｃａｔｅｌｌｉｎｏ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３０：１９３−２００（１９９９）
【非特許文献２】Ｒａｂｉｎａら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２８６：１７３−１７８（２０００）
【非特許文献３】Ｗａｎｇら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，４１７：１１−２２（２００６）
【非特許文献４】Ｌｅｅら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（Ｔｏｋｙｏ），１３９：３９１−８（２００６）
【非特許文献５】Ｚｈａｏら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８１：３８３４３−３８３５０（２００６）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
従って、本発明は、組換えフコシル化糖タンパク質を産生するために使用できる下等真核発現系を作製するための方法及び材料を提供する。特に、哺乳動物フコシル化経路に関与する１つ以上の酵素をコード化する遺伝子を含むベクター、及びフコシル化糖タンパク質を産生し得る宿主細胞を得るために前記ベクターで形質転換した下等真核生物宿主細胞を提供する。前記したベクター、宿主細胞及び方法は酵母及び真菌宿主細胞（例えば、ピキア・パストリス）に基づく発現系において使用するためにうまく適合される。
【００１１】
１つの実施形態では、本発明は、下等真核宿主細胞をＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−フコースに変換するため及びフコースを宿主細胞により産生されるＮ−グリカンに結合させるための酵素活性をコード化する１つ以上のベクターで形質転換するための方法及び材料を提供する。更なる実施形態では、本発明は、非天然リーダー配列に融合したフコシル化経路酵素の触媒ドメインを含む融合タンパク質をコード化するハイブリッドベクターを含み、前記リーダー配列は融合ペプチドを小胞体、初期ゴルジ体または後期ゴルジ体中の適切な位置へターゲットするターゲッティング配列をコード化する。例えば、フコシルトランスフェラーゼの触媒ドメインは、触媒ドメインを小胞体、初期ゴルジ体または後期ゴルジ体内の適切な位置へターゲットするリーダーペプチドに融合されている。更なる実施形態では、下等真核生物宿主細胞をＧＤＰ−フコースを細胞質からゴルジ内部に輸送するＧＤＰ−フコーストランスフェラーゼをコード化するベクターで形質転換する。
【００１２】
本発明は、フコシル化経路を含む組換え下等真核生物宿主細胞を提供する。特定態様では、宿主細胞は酵母または糸状菌、例えばピキア・パストリスのようなピキア属菌の酵母である。
【００１３】
更なる態様では、宿主細胞は更に、糖タンパク質上のＮ−グリカンに対してα１，６−マンノシルトランスフェラーゼ活性を示さず、α１，２−マンノシダーゼ触媒（通常触媒ドメインを伴わない細胞標的シグナルペプチドに融合されおよびα１，２−マンノシダーゼ活性を宿主細胞のＥＲまたはゴルジ体へターゲットするように選択されている。）を含み、これにより宿主細胞のＥＲまたはゴルジ体を組換え糖タンパク質が通過すると、フコシル化Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質が産生される。
【００１４】
更なる態様では、上記宿主細胞は更に、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ触媒ドメイン（通常触媒ドメインを伴わない細胞標的シグナルペプチドに融合されおよびＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ活性を宿主細胞のERもしくはゴルジ体へターゲットするように選択されている。）を含み、これにより宿主細胞のＥＲもしくはゴルジ体内を組み換え糖タンパク質が通過すると、フコシル化ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質が産生される。
【００１５】
更なる態様では、上記宿主細胞は更に、マンノシダーゼＩＩ触媒ドメイン（通常触媒ドメインを伴わない細胞標的シグナルペプチドに融合されおよびマンノシダーゼＩＩ活性を宿主細胞のERもしくはゴルジ体へターゲットするように選択されている。）を含み、これにより宿主細胞のＥＲもしくはゴルジ体内を組み換え糖タンパク質が通過すると、フコシル化ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質が産生される。
【００１６】
更なる態様では、上記宿主細胞は更に、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩ触媒ドメイン（通常触媒ドメインを伴わない細胞標的シグナルペプチドに融合されおよびＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩ活性を宿主細胞のERもしくはゴルジ体へターゲットするように選択されている。）を含み、これにより宿主細胞のＥＲもしくはゴルジ体内を組み換え糖タンパク質が通過すると、フコシル化ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質が産生される。
【００１７】
更なる態様では、上記宿主細胞は更に、ガラクトーストランスフェラーゼＩＩ触媒ドメイン（通常触媒ドメインを伴わない細胞標的シグナルペプチドに融合されおよびガラクトーストランスフェラーゼＩＩ活性を宿主細胞のERもしくはゴルジ体へターゲットするように選択されている。）を含み、これにより宿主細胞のＥＲもしくはゴルジ体内を組み換え糖タンパク質が通過すると、フコシル化Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質が産生される。
【００１８】
更なる態様では、上記宿主細胞は更に、シアリルトランスフェラーゼ触媒ドメイン（通常触媒ドメインを伴わない細胞標的シグナルペプチドに融合されおよびシアリルトランスフェラーゼ活性を宿主細胞のERもしくはゴルジ体へターゲットするように選択されている。）を含み、これにより宿主細胞のＥＲもしくはゴルジ体内を組み換え糖タンパク質が通過すると、フコシル化ＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質が産生される。
【００１９】
上記宿主細胞を特定の糖タンパク質をコード化する核酸で形質転換すると、複数のグリコフォームを含む糖タンパク質の組成物が得られ得、各グリコフォームはグリコフォームに結合して少なくとも１つのＮ−グリカンを含み、よって糖タンパク質組成物は優勢なグリコフォームが所望のフコシル化Ｎ−グリカンからなる複数のＮ−グリカンを含む。所望する具体的な糖タンパク質に応じて、本発明の方法は、優勢のＮ−グリコフォームが次に最も優勢なＮ−グリコフォームよりも５〜８０モル％多い量で存在している糖タンパク質組成物を得るために使用され得る。更なる実施形態では、優勢のＮ−グリコフォームは次に最も優勢なＮ−グリコフォームよりも１０〜４０モル％、２０〜５０モル％、３０〜６０モル％、４０〜７０モル％、５０〜８０モル％多い量で存在し得る。他の実施形態では、優勢なＮ−グリコフォームは所望のフコシル化Ｎ−グリコフォームであり、Ｎ−グリカンの総数の２５モル％以上、３５モル％以上、５０モル％以上、６０モル％以上、または７５モル％以上の量で存在している。
【００２０】
よって、複数のグリコフォームを含む糖タンパク質組成物を得るための宿主細胞が提供され、各グリコフォームはグリコフォームに結合して少なくとも１つのＮ−グリカンを含み、よって糖タンパク質組成物は優勢なＮ−グリカンがＭａｎ５ＧｌｃΝＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＮＡＮＡＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２及びＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群から選択される複数のフコシル化Ｎ−グリカンからなる。
【００２１】
更なる態様では、複数のフコシル化Ｎ−グリカンの２５モル％以上は本質的に、グリコフォームがＭａｎ５ＧｌｃΝＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２，ＮＡＮＡＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２及びＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群から選択されるフコシル化グリコフォームから構成されている。
【００２２】
更に別の態様では、複数のＮ−グリカンの２５モル％以上、３５モル％以上、５０モル％以上、６０モル％以上、７５モル％以上、または９０モル％以上は本質的に、グリコフォームがＭａｎ５ＧｌｃΝＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＮＡＮＡＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２及びＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群から選択されるフコシル化グリコフォームから構成されている。
【００２３】
上記糖タンパク質組成物において、フコースはＮ−グリカンの還元末端でＧｌｃＮＡｃとα１，３−結合、Ｎ−グリカンの還元末端でＧｌｃＮＡｃとα１，６−結合、Ｎ−グリカンの非還元末端でＧａｌとα１，２−結合、Ｎ−グリカンの非還元末端でＧｌｃＮａｃとα１，３−結合、またはＮ−グリカンの非還元末端でＧｌｃＮＡｃとα１，４−結合されている。
【００２４】
従って、上記糖タンパク質組成物の特定態様では、グリコフォームは、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）、ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）、ＮＡＮＡＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）及びＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）からなる群から選択されるグリコフォームを得るためにα１，３−結合またはα１，６−結合フコース；ＧｌｃＮＡｃ（Ｆｕｃ）Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ（Ｆｕｃ）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ１−２）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ１−２）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ１−２）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＮＡＮＡＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ１−２）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２及びＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ１−２）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群から選択されるグリコフォームを得るためにα１，３−結合またはα１，４−結合フコース；またはＧａｌ（Ｆｕｃ）ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ２（Ｆｕｃ１−２）ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２，ＮＡＮＡＧａｌ２（Ｆｕｃ１−２）ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２及びＮＡＮＡ２Ｇａｌ２（Ｆｕｃ１−２）ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群から選択されるグリコフォームを得るためにα１，２−結合フコースされている。
【００２５】
他の態様では、本発明の糖タンパク質組成物は、上記Ｎ−グリコフォームが次に最も優勢なＮ−グリコフォームよりも約５〜８０モル％、１０〜４０モル％、２０〜５０モル％、３０〜６０モル％、４０〜７０モル％、または５０〜８０モル％多いレベルで存在している組成物からなる。
【００２６】
（定義）
本明細書中で使用されている用語「Ｎ−グリカン」及び「グリコフォーム」は互換可能に使用されており、Ｎ結合型オリゴ糖、例えばアスパラギン−Ｎ−アセチルグルコサミン結合によりポリペプチドのアスパラギン残基に結合しているものを指す。Ｎ結合型糖タンパク質は、タンパク質中のアスパラギン残基のアミド窒素に結合してＮ−アセチルグルコサミン残基を含んでいる。糖タンパク質に存在している優勢な糖はグルコース（Ｇｌｃ）、ガラクトース（Ｇａｌ）、マンノース（Ｍａｎ）、フコース（Ｆｕｃ）、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌΝＡｃ）、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃΝＡｃ）及びシアル酸（例えば、Ｎ−アセチル−ノイラミン酸（ＮＡＮＡ））である。Ｎ結合型糖タンパク質の場合、糖基のプロセシングはＥＲの内腔で同時翻訳的に生じ、ゴルジ体において継続する。
【００２７】
Ｎ−グリカンはＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２の共通五糖コアを有している。Ｎ−グリカンは、「トリマンノースコア」、「五糖コア」または「マンノース欠乏コア」とも称されるＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２コア構造に付加されている末端糖（例えば、ＧｌｃＮＡｃ、ガラクトース、フコース及びシアル酸）からなる分枝（アンテナ）の数の点で異なっている。Ｎ−グリカンは分枝状成分（例えば、高マンノース、複合または混成）に従って分類される。「高マンノース」型Ｎ−グリカンは５つ以上のマンノース残基を有している。「複合」型Ｎ−グリカンは、典型的には「トリマンノース」コアの１，３−マンノースアームに結合している少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃ及び１，６−マンノースアームに結合している少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃを有している。複合Ｎ−グリカンは、場合によりシアル酸または誘導体（例えば、“ＮＡＮＡ”または“ＮｅｕＡｃ”（ここで、Ｎｅｕはノイラミン酸を指し、Ａｃはアセチルを指す）で修飾されているガラクトースまたはＮ−アセチルガラクトサミン残基を有していてもよい。複合Ｎ−グリカンは、「バイセクティング」ＧｌｃＮＡｃ及びコアフコース（“Ｆｕｃ”）を含む鎖内置換を有していてもよい。例として、Ｎ−グリカンがトリマンノースコア上にバイセクティングＧｌｃＮＡｃを含んでいる場合には、構造はＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（ＧｌｃＮＡｃ）またはＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ３として表され得る。Ｎ−グリカンがトリマンノースコアに結合してコアフコースを含んでいる場合には、構造はＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）として表され得る。複合Ｎ−グリカンは「トリマンノースコア」上に複数のアンテナを有していてもよく、しばしば「マルチアンテナリーグルカン」とも称されている。「混成」Ｎ−グリカンは、トリマンノースコアの１，３−マンノースアームの末端に少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃ及びトリマンノースコアの１，６−マンノースアームに０以上のマンノースを有している。各種Ｎ−グリカンが「グリコフォーム」とも称されている。
【００２８】
本明細書中で使用されている略号は当業界で一般的に使用されているものである。例えば糖類の略号は上記を参照されたい。他の一般的な略号には、いずれもペプチドＮ−グリコシダーゼＦ（ＥＣ ３．２．２．１８）を指す「ＰＮＧアーゼ」、「グリカナーゼ」または「グルコシダーゼ」が含まれる。
【００２９】
本明細書中で使用されている用語「発現制御配列」は、ポリヌクレオチド配列が機能し得る形で連結されているコード配列の発現に影響を与えるために必要なポリヌクレオチド配列を指す。発現制御配列は核酸配列の転写、転写後事象及び翻訳を制御する配列である。発現制御配列には適当な転写開始、終結、プロモーター及びエンハンサー配列；効率的なＲＮＡプロセシングシグナル（例えば、スプライシング及びポリアデニル化シグナル）；細胞質ｍＲＮＡを安定化させる配列；翻訳効率を高める配列（例えば、リボソーム結合部位）；タンパク質安定性を高める配列；及び所望により、タンパク質分泌を高める配列が含まれる。前記制御配列の種類は宿主生物に応じて異なる。原核生物において、前記制御配列は通常プロモーター、リボソーム結合部位及び転写終結配列を含む。用語「制御配列」は、最低限その存在が発現に必要であるすべての成分を含んでおり、その存在が有利である追加成分（例えば、リーダー配列及び融合パートナー配列）をも含み得ると意図される。
【００３０】
本明細書中で使用されている用語「組換え宿主細胞」（「発現宿主細胞」、「発現宿主系」、「発現系」、または単に「宿主細胞」）は組換えベクターが導入された細胞を指すと意図される。この用語は具体的被験細胞だけではなく、その細胞の子孫をも指すと意図すると理解されるべきである。突然変異または環境の影響によりある修飾がその次の世代で生ずる恐れがあるので、子孫が実際に親細胞と同一でないこともあるが、そのような子孫も依然として本明細書中で使用されている用語「宿主細胞」の範囲に含まれる。組換え宿主細胞は培養増殖させた単離細胞または細胞株であっても、生きている組織または生物中に残存している細胞であってもよい。
【００３１】
用語「真核」は有核細胞または生物を指し、昆虫細胞、植物細胞、哺乳動物細胞、動物細胞及び下等真核細胞が含まれる。
【００３２】
用語「下等真核細胞」には酵母、真菌、襟−鞭毛類、微胞子虫、アルベオラータ（例えば、双鞭毛藻類）、ストラメノパイル（例えば、褐藻、原生動物）、紅色植物（例えば、紅藻）、植物（例えば、緑藻、植物細胞、苔）及び他の原生生物が含まれる。酵母及び真菌にはピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピキア・フィンランディカ（Ｐｉｃｈｉａ ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ）、ピキア・トレハロフィラ（Ｐｉｃｈｉａ ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ）、ピキア・コクラマエ（Ｐｉｃｈｉａ ｋｏｃｌａｍａｅ）、ピキア・メンブラナファシエンス（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ）、ピキア・ミヌタ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｉｎｕｔａ）（オガタエア・ミヌタ（Ｏｇａｔａｅａ ｍｉｎｕｔａ）、ピキア・リンドネリ（Ｐｉｃｈｉａ ｌｉｎｄｎｅｒｉ））、ピキア・オプンティアエ（Ｐｉｃｈｉａ ｏｐｕｎｔｉａｅ）、ピキア・サーモトレランス（Ｐｉｃｈｉａ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、ピキア・サリクタリア（Ｐｉｃｈｉａ ｓａｌｉｃｔａｒｉａ）、ピキア・グエルキュウム（Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｅｒｃｕｕｍ）、ピキア・ピジペリ（Ｐｉｃｈｉａ ｐｉｊｐｅｒｉ）、ピキア・スティプティス（Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｔｉｓ）、ピキア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピキア属菌（Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．）、サッカロミセス・セリビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス属菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、クルイベロミセス属菌（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、クルイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、クリソスポリウム・ルクノウェンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、フザリウム属菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ．）、フザリウム・グラミネウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅｕｍ）、フザリウム・ベネナトウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、ニセツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）及びニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）が含まれるが、これらに限定されない。ピキア属菌、サッカロミセス属菌、ハンゼヌラ・ポリモルファ、クルイベロミセス属菌、カンジダ・アルビカンス、アスペルギルス属菌、トリコデルマ・レエセイ、クリソスポリウム・ラクノウェンス、フザリウム属菌及びニューロスポラ・クラッサ。
【００３３】
本明細書中で使用されている用語「ペプチド」は短ポリペプチド、例えば典型的には約５０未満のアミノ酸長、より典型的には約３０未満のアミノ酸長のものを指す。本明細書中で使用されているこの用語は、構造が似ており、よって生物学的機能が似ているアナログ及びミメティックを包含する。
【００３４】
本明細書中で使用されている用語「主に」、或いは「優勢の」または「優勢である」のような変形は、糖タンパク質をＰＮＧアーゼで処理し、遊離したグリカンを質量分析（例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ）により分析したところ、全Ｎ−グリカンの最高モル％（％）を有しているグリカン物質を意味すると理解されたい。換言すれば、フレーズ「主に」は、個々の物質（例えば、具体的グリコフォーム）が他の個々の物質よりも高いモル％で存在しているとして定義される。例えば、組成物が４０モル％の物質Ａ、３５モル％の物質Ｂ及び２５モル％の物質Ｃから構成されているならば、組成物は主に物質Ａからなる。
【００３５】
別段の定義がない限り、本明細書中で使用されているすべての技術用語及び科学用語は本発明が属する業界の当業者が通常理解しているのと同じ意味を有している。方法及び材料の例を以下に記載するが、本明細書中に記載されているのと類似または同等の方法及び材料も本発明の実施において使用され、当業者には自明であろう。本明細書中に挙げられているすべての刊行物及び他の参考文献は参照により本明細書に組み入れられる。矛盾する場合、定義を含めた本明細書が支配する。材料、方法及び実施例は例示にすぎず、限定的と意図されない。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】多くの高等真核細胞中に存在するフコシル化経路を示す。
【図２】フコシル化糖タンパク質を産生し得る組換え酵母を作製するのに必要な糖鎖工学ステップを示す。酵母細胞質中に存在する内因性ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−マンノース−デヒドラターゼ（ＧＭＤ）及び二機能性酵素ＦＸによりＧＤＰ−フコースに変換させる。その後、産物をＧＤＰ−フコーストランスポーター（ＧＦＴｒ）によりゴルジ体に転移させ、フコースをα−１，６−フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８）によりアセプターグリカンに移す。酵素は青字で、代謝中間体は黒字で示す。ＧＤＰ−ｋｄＭａｎ（ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−マンノース）及びＧＤＰ−ｋｄＧａｌ（ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−ガラクトース）はＧＤＰ−マンノースのＧＤＰ−フコースへの変換における中間体である。
【図３Ａ】フコシル化糖タンパク質を産生するための酵母菌株を改変する際に使用するベクターを示す。フコース生合成及び転移遺伝子を導入する発現ベクターｐＳＨ９９５を示す。フコースを生合成及び転移するために必要な遺伝子をｐＳＨ９９５に導入すると、ベクターｐＳＨ１０２２が生じた。
【図３Ｂ】ベクターｐＳＨ１０２２を示す。（Ｂ）には、遺伝子をピキアゲノムに組み込むために使用されるＴＲＰ２遺伝子座、ドミナント選択マーカーＮＡＴｒ、ＧＡＰＤＨ−ＣＹＣ発現カセット及びｐＵＣ１９プラスミド骨格の隣接領域が示されている。
【図４Ａ】ラットＥＰＯから遊離したＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスキャンを示し、ピキア・パストリス菌株ＹＳＨ６６１（フコシル化経路遺伝子を含むベクターｐＳＨ１０２２で形質転換させた菌株ＲＤＰ９７４）がＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）Ｎ−グリカン及びＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２Ｎ−グリカンを含むｒＥＰＯを産生したことを立証している。ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ（Ｆｕｃ）Ｎ−グリカンは四角で囲まれている。
【図４Ｂ】ラットＥＰＯ対照菌株ＹＳＨ６６０（対照ベクターｐＳＨ９９５で形質転換させた菌株ＲＤＰ９７４）から遊離したＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスキャンを示し、非フコシル化、すなわちフコース非含有のＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２Ｎ−グリカンのみが産生された。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
本発明は、フコシル化Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質を産生し得る宿主細胞を遺伝子改変するための方法及び材料を提供する。方法及び材料を内因性フコシル化経路を有していない酵母ピキア・パトリスで例示しているが、これらの方法及び材料は他の下等真核生物（例えば、真菌生物、原核生物）及び内因性フコシル化経路を有していない高等真核生物（例えば、昆虫細胞）を遺伝子改変するためにも使用され得る。他の実施形態では、これらの方法及び材料は、内因性フコシル化経路を有しているが、宿主細胞により産生される糖タンパク質中に存在するフルコシル化の量を増加させたい高等真核生物を遺伝子改変するために使用され得る。
【００３８】
通常、本発明の方法は、宿主細胞に導入したときその細胞がフコシル化糖タンパク質を産生し得るようにするフコシル化経路に関与する酵素または酵素活性をコード化する核酸を宿主細胞に導入することによりフコシル化糖タンパク質を産生し得る宿主細胞の作製を含む。前記核酸には、例えばＧＤＰ−マンノース−４，６−デヒドラターゼ活性、ＧＤＰ−ケト−デオキシ−マンノース−エピメラーゼ活性／ＧＤＰ−ケト−デオキシ−ガラクトース−レダクターゼ活性、ＧＤＰ−フコーストランスポータータンパク質及びフコシルトランスフェラーゼ活性をコード化する核酸が含まれる。高等真核生物細胞におけるフコシル化経路の概略を図１に示す。
【００３９】
ＧＤＰ−マンノース−４，６−デヒドラターゼ（ＧＭＤ）（ＥＣ ４．２．１．４７）は、多数の種で同定されているＮＡＤの存在下でＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−マンノースに変換させる。ヒトＧＭＰ（ｈＧＭＤ）は配列番号１に示すヌクレオチド配列によりコード化され、配列番号２に示すアミノ酸配列を有している。ＧＤＰ−マンノース−デヒドラターゼ活性を有する相同遺伝子はブタＧＭＤ（Ｂｒｏｓｃｈａｔら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１５３（２）：３９７−４０１（１９８５））、エレガンス線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）ＧＭＤ及びキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）ＧＭＤ（例えば、Ｒｈｏｍｂｅｒｇら，ＦＥＢＳ Ｊ．，２７３：２２４４−５６（２００６）を参照されたい）、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）（例えば、Ｎａｋａｙａｍａら，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，１３：６７３−８０（２００３）を参照されたい）；及び大腸菌（Ｓｏｍｏｚａら，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，８：１２３−３５（２０００））を含む。
【００４０】
ＧＤＰ−ケト−デオキシ−マンノース−エピメラーゼ／ＧＤＰ−ケト−デオキシ−ガラクトース−レダクターゼ（ＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼ，ＥＣ １．１．１．２７１）は真核生物及び原核生物の両方で同定されている二機能性酵素である。ヒトＧＤＰ−ケト−デオキシ−マンノース−エピメラーゼ／ＧＤＰ−ケト−デオキシ−ガラクトース−レダクターゼはＦＸタンパク質（ｈＦＸまたはＧＥＲとしても公知）と呼ばれている。ｈＦＸをコード化するヌクレオチド配列を配列番号３に示す。ｈＦＸタンパク質は配列番号４に示すアミノ酸配列を有している。
【００４１】
ＧＤＰ−フコーストランスポーターは幾つかの種で同定されている。ヒトＧＤＰ−フコーストランスポーター（ｈＧＦＴｒ）はグリコシル化−ＩＩ（ＣＤＧ−ＩＩ）の先天性障害に関連していると同定されている（Ｌｕｂｋｅら，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，２８：７３−６（２００１））。白血球粘着不全症ＩＩ（ＬＡＤ ＩＩ）としても公知であり、この障害はセレクチンリガンドのフコシル化が妨害されると生ずるようである（Ｒｏｏｓ ａｎｄ Ｌａｗ，Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｌｌｓ Ｍｏｌ．Ｄｉｓ．，２７：１０００−４（２００１））。ｈＧＦＴｒをコード化するヌクレオチド配列を配列番号５に示し、ｈＧＦＴｒのアミノ酸配列を配列番号６に示す。ＧＤＰ−フコーストランスポーター活性を有する相同遺伝子が他の種、例えばキイロショウジョウバエ（Ｉｓｈｉｋａｗａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０２：１８５３２−７（２００５））、ラット肝（Ｐｕｇｌｉｅｌｌｉ ａｎｄ Ｈｉｒｓｃｈｂｅｒｇ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４：３５５９６−６０（１９９９））、及び推定ＣＨＯホモログ（Ｃｈｅｎら，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，１５：２５９−６９（２００５））で同定されている。
【００４２】
多数のフコシルトランスフェラーゼ、例えばα１，２−フコシルトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．４．１．６９；ＦＵＴ１及びＦＵＴ２によりコード化される）、α１，３−フコシルトランスフェラーゼ（糖タンパク質３−α−Ｌ−フコシルトランスフェラーゼ，ＥＣ ２．４．１．２１４；ＦＵＴ３−ＦＵＴ７及びＦＵＴ９によりコード化される）、α１，４−フコシルトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．４．１．６５；ＦＵＴ３によりコード化される）、及びα１，６−フコシルトランスフェラーゼ（糖タンパク質６−α−Ｌ−フコシルトランスフェラーゼ，ＥＣ ２．４．１．６８；ＦＵＴ８によりコード化される）が同定されている（Ｂｒｅｔｏｎら，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌ．，８：８７−９４（１９９７）；Ｂｅｃｋｅｒ，Ｌｏｗｅ，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌ．，１３：４１Ｒ−５３Ｒ（２００３）；Ｍａら，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌ．，１６：１５８Ｒ−１８４Ｒ（２００６）を参照されたい）。通常、α１，２−フコシルトランスフェラーゼは、フコースをα１，２−結合によりＮ−グリカン中の末端ガラクトース残基に転移させる。通常、α１，３−フコシルトランスフェラーゼ及びα１，４−フコシルトランスフェラーゼはフコースをＮ−グリカンの非還元末端のＧｌｃＮＡｃ残基に転移させる。
【００４３】
通常、α１，６−フコシルトランスフェラーゼは、α１，６−結合によりフコースをＮ−グリカンの還元末端のＧｌｃＮＡｃ残基（アスパラギン結合ＧｌｃＮＡｃ）に転移させる。典型的には、α１，６−フコシルトランスフェラーゼは、フコースを還元末端でＧｌｃＮＡｃに付加できるようにトリマンノースコアの少なくとも１つの分枝の非還元末端に末端ＧｌｃＮＡｃ残基を必要とする。しかしながら、フコースを還元末端でＧｌｃＮＡｃに付加することができるように非還元末端に末端ガラクトシド残基を必要とする１，６−フコシルトランスフェラーゼが同定されており（Ｗｉｌｓｏｎら，Ｂｉｏｃｈｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，７２：９０９−９１６（１９７６））、Ｌｉｎら（Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌ．，４：８９５−９０１（１９９４））はＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩが欠乏しているチャイニーズハムスター卵巣細胞ではα１，６−フコシルトランスフェラーゼはＭａｎ４ＧｌｃＮＡｃ２Ｎ−グリカン及びＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２Ｎ−グリカンをフコシル化することが判明した。同様に、α１，３−フコシルトランスフェラーゼはα１，３−結合により、通常１つの未置換非還元末端ＧｌｃＮＡｃ残基を有するＮ−グリカンに対して特異性を有しているＮ−グリカンの還元末端にＧｌｃＮＡｃ残基を転移させる。この酵素のＮ−グリカン産物は植物、昆虫及び幾つかの他の無脊椎動物（例えば、マンソン住血吸虫、ヘモンクス、モノアラガイ）中に存在している。しかしながら、米国特許第７，０９４，５３０号明細書は、ヒト単球細胞株ＴＨＰ−１から単離されたα１，３−フコシルトランスフェラーゼを記載している。
【００４４】
ヒトα１，６−フコシルトランスフェラーゼ（ｈＦＵＴ８）はＹａｍａｇｕｃｈｉら（Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．Ｃｅｌｌ．Ｇｅｎｅｔ．，８４：５８−６（１９９９））により同定されている。ヒトＦＵＴ８をコード化するヌクレオチド配列を配列番号７に示す。ｈＦＵＴ８のアミノ酸配列を配列番号８に示す。ＦＵＴ８活性を有する相同遺伝子が他の種で同定されている。例えば、ラットＦＵＴ８（ｒＦＵＴ８）は配列番号１０に示すアミノ酸配列を有し、配列番号９に示すヌクレオチド配列によりコード化される。マウスＦｕｔ８（ｍＦＵＴ８）は配列番号１２に示すアミノ酸配列を有し、配列番号１１に示すヌクレオチド配列によりコード化される。ブタＦＵＴ８（ｐＦＵＴ８）は配列番号１４に示すアミノ酸配列を有し、配列番号１３に示すヌクレオチド配列によりコード化される。ＦＵＴ８はＣＨＯ細胞（Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，８７：６１４−６２２（２００４））、サル腎ＣＯＳ細胞（Ｃｌａｒｋｅ ａｎｄ Ｗａｔｋｉｎｓ，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌ．，９：１９１−２０２（１９９９））及びトリ細胞（Ｃｏｕｌｌｉｎら，Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，７：２３４−２３８（２００２））でも同定されている。Ｐａｓｃｈｉｎｇｅｒら，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌ．，１５：４６３−４７４（２００５）は、エレガンス線虫及びキイロショウジョウバエ由来のフコシルトランスフェラーゼのクローニング及びチャラクタライゼーションを記載している。ユウレイボヤ（Ｃｉｏｎａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）、ウスグロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｐｓｅｕｄｏｏｂｓｃｕｒａ）、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）及びゼブラフィッシュ（Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ）推定α１，６−フコシルトランスフェラーゼが同定されている（それぞれ、ジーンバンク寄託番号ＡＪ５１５１５１、ＡＪ８３０７２０、ＡＪ５１４８７２及びＡＪ７８１４０７）。
【００４５】
上記したフコシル化経路酵素または活性は核酸によりコード化される。核酸はＤＮＡまたはＲＮＡであり得るが、フコシル化経路酵素または活性をコード化する核酸を宿主細胞のゲノムに安定的に組み込むことが好ましいので典型的には核酸はＤＮＡである。フコシル化経路酵素または活性をコード化する核酸の各々はフコシル化経路酵素または活性の発現を可能にする調節配列に機能し得る形で連結されている。前記調節配列はプロモーター、並びに場合によりフコシル化経路酵素または活性をコード化する核酸の上流にエンハンサー、及びフコシル化経路酵素または活性の下流に転写終結部位を含む。典型的には、核酸は更にリボソーム結合部位を有する５’非翻訳領域及びポリアデニル化部位を有する３’非翻訳領域をも含んでいる。核酸は多くの場合、フコシル化経路酵素または活性を発現させる細胞において複製可能であるベクター（例えば、プラスミド）の成分である。ベクターは、ベクターで形質転換される細胞の選択を可能にするマーカーをも含み得る。しかしながら、幾つかの細胞型、特に酵母はベクター配列を欠く核酸でうまく形質転換され得る。
【００４６】
通常、１つ以上のフコシル化経路酵素または活性をコード化する核酸で形質転換した宿主細胞は更に、所望の糖タンパク質をコード化する核酸を１つ以上含む。フコシル化経路酵素のように、糖タンパク質をコード化する核酸は、糖タンパク質の発現を可能にする調節配列に対して機能し得る形で連結されている。糖タンパク質をコード化する核酸は、糖タンパク質を発現することが公知である細胞株からプライマーを用いて糖タンパク質の保存領域に増幅され得る（例えば、Ｍａｒｋｓら，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．，５８１−５９６（１９９１））。核酸は科学文献中の配列に基づいてデノボでも合成され得る。核酸は所望配列の範囲の重複オリゴヌクレオチドを伸長させることによっても合成され得る（例えば、Ｃａｌｄａｓら，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１３：３５３−３６０（２０００）を参照されたい）。
【００４７】
宿主細胞により産生されるフコシル化Ｎ−グリカン構造のタイプは、宿主細胞中のグリコシル化経路及び具体的なフコシルトランスフェラーゼに依存する。例えば、α１，２−フコシルトランスフェラーゼは通常フコースをＮ−グリカンの末端ガラクトースに付加する。よって、α１，２−フコシルトランスフェラーゼを利用する経路をＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを有するＮ−グリカンを産生し得る宿主細胞に導入することが好ましい。産生されるＮ−グリカンは末端ガラクトース残基に対して１，２−結合でフコースを有している。α１，３−フコシルトランスフェラーゼ及びα１，４−フコシルトランスフェラーゼの両方はそれぞれα１，３またはα１，４結合により、また幾つかのα１，３−フコシルトランスフェラーゼの場合には糖タンパク質のアスパラギン残基に連結されているコアＧｌｃＮＡｃに対してα１，３−結合により非還元末端またはその近くの１つ以上のＧｌｃＮＡｃ残基に対してフコースを付加する。よって、α１，３／４−フコシルトランスフェラーゼを利用する経路を少なくともＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを有するＮ−グリカンを産生し得る宿主細胞に導入することが好ましい。最後に、通常α１，６−フコシルトランスフェラーゼは、糖タンパク質のアスパラギン残基に結合されているコアＧｌｃＮＡｃに対して１，６結合によりフコースを転移させる。通常、α１，６−フコシルトランスフェラーゼを利用する経路を少なくともＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２またはＭａｎ４ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを有するＮ−グリカンを産生し得る宿主細胞に導入することが好ましい。
【００４８】
本明細書中に開示されている方法に従って産生され得る糖タンパク質は、糖タンパク質を産生するための核酸配列の起源に関係なく、治療または診断目的の所望のタンパク質を含んでいる。例えば、Ｎ−グリカンがフコシル化されていないモノクローラル抗体は高いＡＤＣＣ活性を有している。しかしながら、高いＡＤＣＣ活性は、障害に対する治療として受容体リガンドに結合することを意図しているがＡＤＣＣ活性を誘発することを意図していないモノクローラル抗体にとって望ましくない。本明細書中に開示されているフコシル化経路を含む宿主細胞において産生されるモノクローラル抗体はフコシル化Ｎ−グリカンを有しており、低いＡＤＣＣ活性を有すると予想される。別の例として、本明細書中に開示されているフコシル化経路を含む宿主細胞において産生される抗体のＦｃ部分に融合されている膜結合受容体の細胞外部分を含む免疫接着分子（米国特許第５，４２８，１３０号、同第５，１１６，９６４号、同第５，５１４，５８２号及び同第５，４５５，１６５号；Ｃａｐｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３３７：５２５（１９８９）；Ｃｈａｍｏｗ ａｎｄ Ａｓｈｋｅｎａｚｉ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１４：５２−６０（１９９６）；Ａｓｈｋｅｎａｚｉ ａｎｄ Ｃｈａｍｏｗ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，９：１９５−２００（１９９７）を参照されたい）はフコシル化Ｎ−グリカンを有し、低いＡＤＣＣ活性を有していると予想される。フコシル化Ｎ−グリカンを有するように本発明の方法に従って産生され得る糖タンパク質の例には、エリスロポエチン（ＥＰＯ）；サイトカイン、例えばインターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、インターフェロン−ω及び顆粒球−ＣＳＦ；凝固因子、例えばＶＩＩＩ因子、ＩＸ因子及びヒトタンパク質；モノクローナル抗体、可溶性ＩｇＥ受容体α鎖、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ウロキナーゼ、キマーゼ及び尿素トリプシン阻害剤、ＩＧＦ結合タンパク質、上皮成長因子、成長ホルモン放出因子、アネキシンＶ融合タンパク質、アンギオスタチン、血管内皮増殖因子−２、骨髄前駆体抑制因子−１、オステオプロテゲリン組織、プラスミノーゲンアクチベーター、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ及びＴＮＦ−受容体が含まれるが、これらに限定されない。
【００４９】
具体的実施形態では、１つ以上の核酸が、融合タンパク質を細胞内の特定領域へターゲットさせるターゲッティングペプチドに融合されているフコシル化経路タンパク質の触媒ドメインを含む融合タンパク質をコード化する。典型的には、ターゲッティングペプチドは融合タンパク質を分泌経路内の位置へターゲットさせる。よって、用語「分泌経路」は、糖タンパク質が分泌のための調製物中で修飾されている細胞内の細胞小器管及び成分を指す。分泌経路は小胞体（ＥＲ）、ゴルジ体、トランス−ゴルジ網及び分泌小胞を含んでいる。例えば、適当な細胞ターゲッティングペプチドは触媒ドメインをＥＲ、ゴルジ体、トランス−ゴルジ網及び分泌小胞へターゲットさせる。本発明において有用であり得るターゲッティングペプチドには米国特許第７，０２９，８７２号に記載されているものが含まれる。１つの実施形態では、フコシルトランスフェラーゼの触媒ドメインは、融合タンパク質をゴルジ体に指向するターゲッティングペプチドに融合している。フコシルトランスフェラーゼ触媒ドメインに融合される具体的ターゲッティングペプチドは宿主細胞、具体的フコシルトランスフェラーゼ及び産生しようとする糖タンパク質に依存する。フコシルトランスフェラーゼをターゲットさせるために使用され得るターゲッティングペプチドの例は、例えば米国特許第７，０２９，８７２号、並びに米国特許出願公開第２００４／００１８５９０号、同第２００４／０２３００４２号、２００５／０２０８６１７号、同第２００４／０１７１８２６号、同第２００６／０２８６６３７号及び同第２００７／００３７２４８号に開示されている。
【００５０】
フコシル化経路に関与する酵素または活性をコード化する核酸は、宿主細胞をトランスフェクトするために使用され得るベクターに連結される。典型的には、ベクターは、意図する宿主細胞と同一種の細胞から単離したか、または他の種から単離したが、意図する宿主細胞に挿入したとき機能することが公知の調節エレメントを含む。典型的には、これらの調節エレメントは５’調節配列（例えば、プロモーター）及び３’調節配列（例えば、転写ターミネーター配列）を含む。典型的には、ベクターは、ベクターをうまくトランスフェクトした宿主細胞の選択を可能にする少なくとも１つの選択マーカーエレメントをも含む。ベクターを意図する宿主細胞に転移させ、生じた細胞を選択マーカーについてスクリーニングして、ベクターがうまくトランスフェクトされ、よって融合タンパク質をコード化するベクターを有している宿主細胞を同定する。
【００５１】
下等真核生物（例えば、酵母）は、経済的に培養され得、高収率でタンパク質を生じさせ、適切に修飾したとき特に主たるＮ−グリカン構造を有する糖タンパク質を産生し得るので、糖タンパク質を発現させるためにしばしば好ましい。酵母は特に迅速な形質転換を可能にする確立された遺伝学、試験したタンパク質局在化戦略及び容易な遺伝子ノックアウト技術を提供する。各種酵母、例えばクルイベロミセス・ラクティス、ピキア・パストリス、ピキア・メタノリカ及びハンゼヌラ・ポリモルファは、高い細胞密度まで増殖させ、大量の組換えタンパク質を工業規模で分泌させ得るので細胞培養及びタンパク質産生のために一般的に使用されている。また、糸状菌、例えばアスペルギルス・ニガー、フザリウム属菌、ニューロスポラ・クラッサ等も工業規模で糖タンパク質を産生させるために使用され得る。
【００５２】
下等真核生物、特に酵母は、グリコシル化パターンが複雑な、或いはヒト様またはヒト化である糖タンパク質を発現するように遺伝子組換えられ得る。遺伝子組換えした下等真核生物は、高マンノースＮ−グリカンの産生に関与する特定の内因性グリコシル化酵素を排除し、複雑なＮ−グリカンの生成に関与する外因性酵素の各種組合せを導入することにより得られ得る。複雑なＮ−グリカンを産生するために酵母を遺伝子改変する方法は米国特許第７，０２９，８７２号、並びに米国特許出願公開第２００４／００１８５９０号、同第２００５／０１７０４５２号、同第２００６／０２８６６３７号、同第２００４／０２３００４２号、同第２００５／０２０８６１７号、同第２００４／０１７１８２６号、同第２００５／０２０８６１７号及び同第２００６／０１６０１７９号に記載されている。例えば、宿主細胞は、１，６−マンノシルトランスフェラーゼ活性が欠失し、糖タンパク質のＮ−グリカンにマンノース残基を付加するように選択または改変される。例えば、酵母では、ＯＣＨ１遺伝子が１，６−マンノシルトランスフェラーゼ活性をコード化する。次いで、複雑なヒト様Ｎ−グリカンの産生に関与する１つ以上の酵素を含むように宿主細胞を改変する。
【００５３】
１つの実施形態では、宿主細胞は更に、通常α１，２−マンノシダーゼ触媒ドメインを伴わず、α１，２−マンノシダーゼ活性を宿主細胞のＥＲまたはゴルジ体へターゲットするように選択された細胞ターゲッティングシグナルペプチドに融合されている前記触媒ドメインを含む。組換え糖タンパク質が宿主細胞のＥＲまたはゴルジ体を通過すると、フコシル化Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォーム（例えば、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）グリコフォーム）を含む組換え糖タンパク質が産生される。米国特許第７，０２９，８７２号、並びに米国特許出願公開第２００４／００１８５９０号及び同第２００５／０１７０４５２号は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む糖タンパク質を産生し得る下等真核生物宿主細胞を開示している。
【００５４】
更なる実施形態では、直前の宿主細胞は更に、通常ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ（ＧｎＴＩ）触媒ドメインを伴わず、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ活性を宿主細胞のＥＲまたはゴルジ体へターゲットするように選択された細胞ターゲッティングシグナルペプチドに融合されている前記触媒ドメインを含む。組換え糖タンパク質が宿主細胞のＥＲまたはゴルジ体を通過すると、フコシル化ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォーム（例えば、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）グリコフォーム）を含む組換え糖タンパク質が産生される。米国特許第７，０２９，８７２号、並びに米国特許出願公開第２００４／００１８５９０号及び同２００５／０１７０４５２号は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む糖タンパク質を産生し得る下等真核生物宿主細胞を開示している。上記細胞において産生された糖タンパク質をインビトロでヘキサミニダーゼで処理すると、フコシル化Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）グリコフォームを含む組換え糖タンパク質が産生され得る。
【００５５】
更に別の実施形態では、直前の宿主細胞は更に、通常マンノシダーゼＩＩ触媒ドメインを伴わず、マンノシダーゼＩＩ活性を宿主細胞のＥＲまたはゴルジ体へターゲットするように選択された細胞ターゲッティングシグナルペプチドに融合されている前記触媒ドメインを含む。組換え糖タンパク質が宿主細胞のＥＲまたはゴルジ体を通過すると、フコシル化ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォーム（例えば、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）グリコフォーム）を含む組換え糖タンパク質が産生される。米国特許出願公開第２００４／０２３００４２号は、マンノシダーゼＩＩ酵素を発現し、主にＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを有する糖タンパク質を産生し得る下等真核生物宿主細胞を開示している。上記細胞において産生された糖タンパク質をインビトロでヘキサミニダーゼで処理すると、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）グリコフォームを含む組換え糖タンパク質が産生され得る。
【００５６】
更に別の実施形態では、直前の宿主細胞は更に、通常ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩ（ＧｎＴＩＩ）触媒ドメインを伴わず、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩ活性を宿主細胞のＥＲまたはゴルジ体へターゲットするように選択された細胞ターゲッティングシグナルペプチドに融合されている前記触媒ドメインを含む。組換え糖タンパク質が宿主細胞のＥＲまたはゴルジ体を通過すると、フコシル化ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォーム（例えば、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）グリコフォーム）を含む組換え糖タンパク質が産生される。米国特許第７，０２９，８７２号、並びに米国特許出願公開第２００４／００１８５９０号及び同第２００５／０１７０４５２号は、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む糖タンパク質を産生し得る下等真核生物宿主細胞を開示している。上記細胞において産生された糖タンパク質をインビトロでヘキサミニダーゼで処理すると、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）グリコフォームを含む組換え糖タンパク質が産生され得る。
【００５７】
更に別の実施形態では、直前の宿主細胞は更に、通常ガラクトーストランスフェラーゼＩＩ触媒ドメインを伴わず、ガラクトーストランスフェラーゼＩＩ活性を宿主細胞のＥＲまたはゴルジ体へターゲットするように選択された細胞ターゲッティングシグナルペプチドに融合されている前記触媒ドメインを含む。組換え糖タンパク質が宿主細胞のＥＲまたはゴルジ体を通過すると、フコシル化Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォーム（例えば、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）グリコフォーム）を含む組換え糖タンパク質が産生される。米国特許出願公開第２００６／００４０３５３号明細書は、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォーを含む糖タンパク質を産生し得る下等真核生物宿主細胞を開示している。上記細胞において産生された糖タンパク質をインビトロでガラクシトダーゼで処理すると、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォーム（例えば、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）グリコフォーム）を含む組換え糖タンパク質が産生され得る。
【００５８】
更に別の実施形態では、直前の宿主細胞は更に、通常シアリルトランスフェラーゼ触媒ドメインを伴わず、シアリルトランスフェラーゼ活性を宿主細胞のＥＲまたはゴルジ体へターゲットするように選択された細胞ターゲッティングシグナルペプチドに融合されている前記触媒ドメインを含む。組換え糖タンパク質を宿主細胞のＥＲまたはゴルジ体を通過すると、フコシル化ＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォーム（例えば、ＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）グリコフォーム）を含む組換え糖タンパク質が産生される。酵母や糸状菌のような下等真核生物宿主細胞の場合、宿主細胞が更にＮ−グリカンに転移させるためにＣＭＰ−シアル酸を与える手段を含むことが好ましい。米国特許出願公開第２００５／０２６０７２９号はＣＭＰ−シアル酸合成経路を有するように下等真核生物を遺伝子改変する方法を開示しており、米国特許出願公開第２００６／０２８６６３７号はシアリル化糖タンパク質を産生するために下等真核生物を遺伝子改変する方法を開示している。上記細胞において産生された糖タンパク質をインビトロでノイラミダーゼで処理すると、フコシル化Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォーム（例えば、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）グリコフォーム）を含む組換え糖タンパク質が産生され得る。
【００５９】
上記した宿主細胞の１つは更に、米国特許出願公開第２００４／０７４４５８号及び同第２００７／００３７２４８号に開示されているようなバイセクト及び／またはマルチアンテナリーＮ−グリカン構造を有する糖タンパク質を産生させるためにＧｎＴＩＩＩ、ＧｎＴＩＶ、ＧｎＴＶ、ＧｎＴＶＩ及びＧｎＴＩＸからなる群から選択される１つ以上のＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼを含み得る。前記した各種宿主細胞は１つ以上の糖トランスポーター、例えばＵＤＰ−ＧｌｃΝＡｃトランスポーター（例えば、クルイベロミセス・ラクティス及びハツカネズミＵＤＰ−ＧｌｃΝＡｃトランスポーター）、ＵＤＰ−ガラクトーストランスポーター（例えば、キイロショウジョウバエＵＤＰ−ガラクトーストランスポーター）及びＣＭＰ−シアル酸トランスポーター（例えば、ヒトシアル酸トランスポーター）を含む。酵母や糸状菌のような下等真核生物宿主細胞は上記したトランスポーターを有していないので、このトランスポーターを含むように酵母や糸状菌のような下等真核生物宿主細胞を遺伝子改変することが好ましい。
【００６０】
上記した宿主細胞の更なる実施形態では、宿主細胞を更に、β−マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子（ＢＭＴ２）を欠失または破壊することによりα−マンノシダーゼ耐性Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質（米国特許出願公開第２００６／０２１１０８５号を参照されたい）、及びホスホマンノシルトランスフェラーゼ遺伝子ＰＮＯ１及びＭＮＮ４Ｂの一方または両方を欠失または破壊することによりホスホマンノース残基を有する糖タンパク質（例えば、米国特許出願公開第２００６／０１６０１７９号及び同第２００４／００１４１７０号を参照されたい）を除去するように遺伝子改変する。上記宿主細胞の更に別の実施形態では、１つ以上のＤｏｌ−Ｐ−Ｍａｎ：タンパク質（Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子（ＰＭＴｓ）を欠失または破壊することにより糖タンパク質のＯ−グリコシル化を排除するように宿主細胞を更に遺伝子改変する（米国特許第５，７１４，３７７号を参照されたい）。
【００６１】
特定のポリペプチドをコードする遺伝子または転写単位をコドン最適化すると、コードされるポリペプチドの発現が高まり、すなわちポリペプチドをコード化するｍＲＮＡの翻訳が向上することが判明した。従って、本明細書中に開示されている宿主細胞の場合、コード化された酵素の発現が高まるとより多くのコード化酵素が生じ、こうするとフコシル化Ｎ−グリカンの産生が増加し得る。コドン最適化に関連して、用語「発現」及びその変形は、ポリペプチドをコード化するｍＲΝＡの翻訳を指し、ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドの転写を指さない。本明細書中で使用されている用語「遺伝子」は、ポリペプチドをコード化するゲノムＤＮＡまたはＲＮＡ、並びにポリペプチドをコード化するｃＤＮＡを指す。
【００６２】
コドン最適化は、遺伝子を遺伝子の天然遺伝的環境とは異なるヌクレオチドコドン使用頻度を示す外来遺伝的環境に移動させたときに遺伝子の非相同発現を改善すること、または遺伝子が元々高度発現する遺伝子をコード化する遺伝的環境に先天的な遺伝子中に通常使用されていないヌクレオチドを１つ以上含んでいるときに天然遺伝的環境における遺伝子の異所性発現を改善することを求めるプロセスである。換言すると、コドン最適化は、特定遺伝的環境または生物において比較的低頻度で使用されている遺伝子のヌクレオチドコドンを前記遺伝的環境または生物においてより高頻度で発現される遺伝子中で使用されているヌクレオチドコドンで置換することを含む。こうすると、遺伝子産物（ポリペプチド）の発現（翻訳）が高まる。高度発現している遺伝子中に高頻度で見られるヌクレオチドコドンは低頻度で見られるヌクレオチドコドンよりもより効率的に翻訳されると仮定されている。
【００６３】
通常、特定遺伝子に対してヌクレオチドコドンを最適化する方法は、生物中で高度発現している遺伝子中で使用されているアミノ酸の各々についてヌクレオチドコドンの頻度を同定した後、高度発現している遺伝子において低頻度で使用されている当該遺伝子中のヌクレオチドコドンを高度発現している遺伝子中で使用されていると同定されたヌクレオチドコドンで置換することを含む（例えば、Ｌａｔｈｅ，Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｒｏｂｅｓ Ｄｅｄｕｃｅｄ ｆｒｏｍ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ：Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．，１８３：１−１２（１９８５）；Ｎａｋａｍｕｒａら，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，２８：２９２（２０００）；Ｆｕｇｌｓａｎｇ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ＆ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，３１：２４７−２４９（２００３）を参照されたい）。遺伝子をコード化する生物の核酸のヌクレオチドコドンを自動的に分析し、生物において低頻度で見られるヌクレオチドコドンを生物中で高度発現している遺伝子中で見られるヌクレオチドコドンで置換するためのヌクレオチドコドンを示唆するコンピュータープログラムは多数ある。
【００６４】
以下の実施例は、本発明の更なる理解を深めるために意図されている。
【実施例１】
【００６５】
本実施例は、糖タンパク質のＮ−グリカン構造中にフコースを含む糖タンパク質を産生し得るピキア・パストリス株の構築を説明する。
【００６６】
組換えＤＮＡ作業のために大腸菌株ＴＯＰ１０またはＸＬ１０−ＧｏＩｄを使用する。ＰＮＧアーゼ−Ｆ、制限及び修飾酵素はＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ（マサチューセッツ州ビバリーに所在）から入手し、製造業者の指示通り使用する。α−１，６−フコシダーゼはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（ミズーリ州セントルイスに所在）から入手し、製造業者の推奨通り使用する。オリゴヌクレオチドはＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（アイオワ州コーラルヴィルに所在）から入手する。金属キレート化“ＨｉｓＢｉｎｄ”樹脂はＮｏｖａｇｅｎ（ウィスコンシン州マディソンに所在）から入手する。９６ウェルのライゼート透明化プレートはＰｒｏｍｅｇａ（ウィスコンシン州マディソンに所在）から入手する。タンパク質結合９６ウェルプレートはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ（マサチューセッツ州ベッドフォードに所在）から入手する。塩及び緩衝剤はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（ミズーリ州セントルイスに所在）から入手する。
【００６７】
フコシル化経路遺伝子の増幅
フコシル化経路の大要を図１に示す。ｈＧＭＤのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をヒト肝ｃＤＮＡ（カリフォルニア州パロアルトに所在のＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）から製造業者が推奨する手順に従ってＡｄｖａｎｔａｇｅ ２ポリメラーゼを用いて増幅させる。簡単に説明すると、プライマーＳＨ４１５及びＳＨ４１３（それぞれ、５’−ＧＧＣＧＧ ＣＣＧＣＣ ＡＣＣＡＴ ＧＧＣＡＣ ＡＣＧＣＡ ＣＣＧＧＣ ＡＣＧＣＴ ＧＣ−３’（配列番号１５）及び５’−ＴＴＡＡＴ ＴＡＡＴＣ ＡＧＧＣＡ ＴＴＧＧＧ ＧＴＴＴＧ ＴＣＣＴＣ ＡＴＧ−３’（配列番号１６））を用いて、ヒト肝ｃＤＮＡ由来の１，１３９ｂｐ産物を以下：９７℃で３分間；９７℃で３０秒間、５０℃で３０秒間、７２℃で２分間を３５サイクル；及び７２℃で１０分間；の条件を用いて増幅させる。その後、産物をｐＣＲ２．１（カリフォルニア州カールズバッドに所在のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化し、配列決定し、得られた構築物をｐＳＨ９８５と称する。
【００６８】
上に概説した条件を用いて、プライマーＳＨ４１４及びＳＨ４１１（それぞれ、５’−ＧＧＣＧＧ ＣＣＧＣＣ ＡＣＣＡＴ ＧＧＧＴＧ ＡＡＣＣＣ ＣＡＧＧＧ ＡＴＣＣＡ ＴＧ−３’（配列番号１７）及び５’−ＴＴＡＡＴ ＴＡＡＴＣ ＡＣＴＴＣ ＣＧＧＧＣ ＣＴＧＣＴ ＣＧＴＡＧ ＴＴＧ−３’（配列番号１８））を用いて、ヒトＦＸ遺伝子のＯＲＦに相当するヒト腎ｃＤＮＡ（カリフォルニア州パロアルトに所在のＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）由来の９８６ｂｐ断片を増幅させる。その後、この断片をｐＣＲ２．１にクローン化し、配列決定し、ｐＳＨ９８８と称する。
【００６９】
ヒトＧＦＴｒのＯＲＦをヒト膵ｃＤＮＡ（カリフォルニア州パロアルトに所在のＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）から上に概説した条件、並びにプライマーＲＣＤ６７９及びＲＣＤ６８０（それぞれ、５’−ＧＣＧＧＣ ＣＧＣＣＡ ＣＣＡＴＧ ＡＡＴＡＧ ＧＧＣＣＣ ＣＴＣＴＧ ＡＡＧＣＧ Ｇ−３’（配列番号１９）及び５’−ＴＴＡＡＴ ＴＡＡＴＣ ＡＣＡＣＣ ＣＣＣＡＴ ＧＧＣＧＣ ＴＣＴＴＣ ＴＣ−３’（配列番号２０））を用いて増幅させる。得られた１，１１３ｂｐ断片をｐＣＲ２．１にクローン化し、配列決定し、ｐＧＬＹ２１３３と称する。
【００７０】
アミノ酸３２〜５７５をコード化し、内因性膜貫通ドメインをコード化するヌクレオチドを欠く切断型マウスＦＵＴ８ ＯＲＦをマウス脳ｃＤＮＡ（カリフォルニア州パロアルトに所在のＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）から上に概説した条件、並びにプライマーＳＨ４２０及びＳＨ４２１（それぞれ、５’−ＧＣＧＧＣ ＧＣＧＣＣ ＧＡＴＡＡ ＴＧＡＣＣ ＡＣＣＣＴ ＧＡＴＣＡ ＣＴＣＣＡ Ｇ−３’（配列番号２１）及び５’−ＣＣＴＴＡ ＡＴＴＡＡ ＣＴＡＴＴ ＴＴＴＣＡ ＧＣＴＴＣ ＡＧＧＡＴ ＡＴＧＴＧ ＧＧ−３’（配列番号２２））を用いて増幅させる。生じた1.65ｂｐ遺伝子をｐＣＲ２．１にクローン化し、配列決定し、ｐＳＨ９８７と称する。
【００７１】
酵母発現カセットでのフコシル化遺伝子の作製
ＮｏｔＩ適合性５’末端及びＰａｃＩ適合性３’末端を有するＤＮＡ断片を得るために上記ベクターをＮｏｔＩ制限酵素及びＰａｃＩ制限酵素で消化することによりＧＭＤ、ＦＸ及びＧＦＴｒのオープンリーディングフレームを作製する。ＡｓｃＩ適合性５’末端及びＰａｃＩ適合性３’末端を有するＤＮＡを得るためにはＡｓｃＩ制限酵素及びＰａｃＩ制限酵素で消化することによりＦＵＴ８断片を作製する。
【００７２】
ＧＭＤ発現カセットを作成するためには、ＧＭＤを酵母発現ベクターｐＳＨ９９５にノーセオスリシン耐性マーカーを用いてクローン化する。このベクターはピキア・パストリスＧＡＰＤＨプロモーター及びサッカロミセス・セレビシアエＣＹＣ転写ターミネーター配列を含み、Ｔｒｐ２ ＯＲＦの下流に組み込むように設計されている。このベクターを図３Ａに示す。ベクターｐＳＨ９８５をＮｏｔＩ及びＰａｃＩで消化して、ＧＭＤ ＯＲＦを含む１．１Ｋｂ断片を切り取った後、予め同一酵素で消化したｐＳＨ９９５にサブクローン化する。ＧＡＰＤＨプロモーターの制御下でＧＭＤを含有しているベクターが生じ、これをｐＳＨ９９７と称する。
【００７３】
ＦＸ発現カセットを作成するためには、ベクターｐＳＨ９８８をＮｏｔＩ及びＰａｃＩで消化して、ＦＸ ＯＲＦを含む１．０Ｋｂ断片を切り取つた後、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで処理して一本鎖オーバーハングを除去する（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｄ．Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（ニューヨーク州コールドスプリングに所在のＣｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，第３版，２００１））。次いで、この断片を、予めにＮｏｔＩ及びＡｓｃＩで消化し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで処理したベクターｐＧＬＹ３５９（Ｈａｍｉｌｔｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１３，１４４１（２００６））にサブクローン化する。生じたベクターｐＳＨ９９４は、５’末端でピキア・パストリスＰＭＡ１プロモーター（ＰｐＰＭＡ１ｐｒｏｍ）に、３’末端でピキア・パストリスＰＭＡ転写ターミネーター配列（ＰｐＰＭＡｌｔｔ）に機能し得る形で連結されているＦＸ ＯＲＦから構成されるＦＸ発現カセットを含んでいる。この発現カセットはＳｗａＩ制限部位に隣接している。
【００７４】
ＧＦＴｒ発現カセットは、ｐＧＬＹ２１３３をＮｏｔＩ及びＰａｃＩで消化してＧＦＴｒ ＯＲＦを含む１．１Ｋｂ断片を切り取った後、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで処理することにより作製する。その後、この断片を、予めＮｏｔＩ及びＰａｃＩで消化し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで処理したベクターｐＧＬＹ３６３（上掲したＨａｍｉｌｔｏｎ）にサブクローン化した。生じたベクターｐＧＬＹ２１４３は、５’末端でＰｐＰＭＡ１ｐｒｏｍ、３’末端でＰｐＰＭＡ１ｔｔに機能し得る形で連結されているＧＦＴｒ ＯＲＦから構成されるＧＦＴｒ発現カセットを含んでいる。この発現カセットはＲｓｒＩＩ制限部位に隣接している。
【００７５】
酵母局在化シグナルに融合させたＦＵＴ８触媒ドメインを作製するためには、Ｍｎｎ２のサッカロミセス・セレビシアエターゲッティング領域の最初の３６アミノ酸をＧｅｎｅＯｐｔｉｍｉｚｅｒソフトウェアにより分析し、ピキア・パストリス発現（独国レーゲンスブルクに所在のＧｅｎｅＡｒｔ）に対してコドン最適化する。ＳｃＭｎｎ２アミノ酸１〜３６に対して５’ＮｏｔＩ及び３’ＡｓｃＩ制限酵素適合性末端を有する合成ＤＮＡが生じ、このＤＮＡをシャトルベクターにクローン化してプラスミドベクターｐＳＨ８３１を作製する。その後、ベクターｐＳＨ９８７をＡｓｃＩ及びＰａｃＩで消化して、ＦＵＴ８触媒ドメインＯＲＦをコード化する１．６Ｋｂ断片を遊離させた後、予め同一酵素で消化したベクターｐＳＨ８３１中のＳｃＭｎｎ２ターゲッティングペプチドをコード化するＤＮＡにインフレームでサブクローン化する。生じたベクターをｐＳＨ９８９と称する。ＦＵＴ８−ＳｃＭｎｎ２発現カセットを作成するためには、ｐＳＨ９８９をＮｏｔＩ及びＰａｃＩで消化して１．８Ｋｂ断片を遊離させた後、同一酵素で消化したベクターｐＧＬＹ３６１（Ｈａｍｉｌｔｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１３，１４４１（２００６））にサブクローン化する。生じたベクターｐＳＨ９９１は、５’末端でピキア・パストリスＴＥＦプロモーター（ＰｐＴＥＦｐｒｏｍ）、３’末端でピキア・パストリスＴＥＦ転写ターミネーター配列（ＰｐＴＥＦｔｔ）に機能し得る形で連結されているＦＵＴ８−Ｍｎｎ２融合ＯＲＦから構成されているＦＵＴ８−Ｍｎｎ２融合タンパク質を含んでいる。この発現カセットはＳｇｆＩ制限部位に隣接している。
【００７６】
フコシル化改変ベクターの作製
ベクターｐＳＨ９９４をＳｗａＩで消化して、ＦＸ発現カセットを含む２．５Ｋｂ断片を遊離させた後、ＰｍｅＩで消化した（ＧＭＤ発現カセットを含む）ｐＳＨ９９７にサブクローン化する。ＰＭＡ−ＦＸ及びＧＡＰＤＨ−ＧＭＤ発現カセットが同一方向にアラインされているベクターが生じ、これをｐＳＨ１００９と称する。ＰＭＡ−ＧＦＴｒ発現カセットを含む２．７Ｋｂ断片をｐＧＬＹ２１４３から制限酵素ＲｓｒＩＩを用いて切り取り、同一酵素で消化したｐＳＨ１００９にサブクローン化する。ＰＭＡ−ＧＦＴｒ及びＧＡＰＤＨ発現カセットが同一方向にアラインされているベクターが生じ、これをｐＳＨ１０１９と称する。最後に、１．８Ｋｂ ＴＥＦ−ＦＵＴ８カセットをｐＳＨ９９１からＳｇｆＩを用いて切り取り、同一酵素で消化したｐＳＨ１０１９にサブクローン化する。ＴＥＦ−ＦＵＴ８及びＧＡＰＤＨ発現カセットが同一方向にアラインされているベクターが生じ、これをｐＳＨ１０２２と称する。このベクターを図２Ｂに示す。
【００７７】
ラットＥＰＯ発現ベクターの作製
アミノ酸２７〜１９２をコード化する切断型ドブネズミ（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）エリスロポエチン遺伝子（ｒＥＰＯ）をラット腎ｃＤＮＡ（カリフォルニア州パロアルトに所在のＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）からＡｄｖａｎｔａｇｅ ２ポリメラーゼを製造業者が推奨するように用いて増幅させる。簡単に説明すると、プライマーｒＥＰＯ−順方向及びｒＥＰＯ−逆方向（それぞれ、５’−ＧＧＧＡＡ ＴＴＣＧＣ ＴＣＣＣＣ ＣＡＣＧＣ ＣＴＣＡＴ ＴＴＧＣＧ ＡＣ−３’（配列番号２３）及び５’−ＣＣＴＣＴ ＡＧＡＴＣ ＡＣＣＴＧ ＴＣＣＣＣ ＴＣＴＣＣ ＴＧＣＡＧ ＧＣ−３’（配列番号２４））を用いて、ラット腎ｃＤＮＡ由来の５１６ｂｐ産物を以下：９４℃で１分間を１サイクル；９４℃で３０秒間、７２℃で１分間を５サイクル；９４℃で３０秒間、７０℃で１分間を５サイクル；９４℃で２０秒間、６８℃で１分間を２５サイクル；のサイクル条件を用いて増幅させる。その後、産物をｐＣＲ２．１（カリフォルニア州カールズバッドに所在のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化し、配列決定し、生じた構築物をｐＳＨ６０３と称する。酵母発現ベクターを作製するためには、ｐＳＨ６０３をＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩで消化して５０６ｂｐ断片を遊離させた後、予め同一酵素で消化したｐＰＩＣＺαＡ（カリフォルニア州カールズバッドに所在のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローン化した。生じた発現ベクターをｐＳＨ６９２と称する。ｐＳＨ６９２中のＥＰＯはＡＯＸメタノール誘導プロモーターの制御下にある。
【００７８】
酵母株の作製及びラットＥＰＯの産生
主にＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２Ｎ−グリカンを有する組換え糖タンパク質を産生し得るピキア・パストリス糖鎖改変した細胞株ＹＧＬＹｌ ０６２（Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質を産生する米国特許出願公開第２００６／００４０３５３号明細書に記載されている菌株に類似している）をベクターＰＳＨ６９２で形質転換すると、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２Ｎ−グリカンを有する組換えラットＰＯ（ｒＥＰＯ）を産生する菌株ＲＤＰ９７４が生ずる。菌株ＲＤＰ９７４は、Ｇａｌ２ＧｌｃΝＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃΝＡｃ２Ｎ−グリカンを有するラットＥＰＯを産生する菌株ＲＤＰ７６２に類似しており、この菌株はＨａｍｉｌｔｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１３，１４４１−１４４３（２００６）に記載されている。
【００７９】
ＲＰＤ９７４菌株はＯＣＨ１、ＰＮＯ１、ＭＮＮ４Ｂ及びＢＭＴ２遺伝子を欠失しており、完全長クルイベロミセス・ラクティスＵＤＰ−ＧｌｃΝＡｃトランスポーター、ハツカネズミＵＤＰ−ＧｌｃΝＡｃトランスポーター、サッカロミセス・セレビシアエＵＤＰ−ガラクトース４−エピメラーゼ及びキイロショウジョウバエＵＤＰ−ガラクトーストランスポーターをコード化するＤΝＡ；サッカロミセス・セレビシアエＭＮＮ２リーダー配列のアミノ酸１〜３６をコード化するＤＮＡに融合されているハツカネズミα１，２−マンノシダーゼＩ触媒ドメインをコード化するＤΝＡ；サッカロミセス・セレビシアエＭΝΝ２リーダー配列のアミノ酸１〜３６をコード化するＤΝＡに融合されているホモサピエンスβ１，２−ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ（ＧｎＴＩ）触媒ドメインをコード化するＤＮＡ；サッカロミセス・セレビシアエＭＮＮ２リーダー配列のアミノ酸１〜３６をコード化するＤＮＡに融合されているキイロショウジョウバエマンノシダーゼＩＩ触媒ドメインをコード化するＤＮＡ；サッカロミセス・セレビシアエＭＮＮ２リーダー配列のアミノ酸１〜９７をコード化するＤＮＡに融合されているドブネズミβ１，２−ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩ（ＧｎＴＩＩ）触媒ドメインをコード化するＤＮＡ；及びサッカロミセス・セレビシアエＫＲＥ２（ＭＮＴＩ）リーダー配列のアミノ酸１〜５８をコード化するＤＮＡに融合されているホモサピエンスβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａＩＴＩ）触媒ドメインをコード化するＤＮＡを含んでいる。米国特許出願公開第２００６／００４０３５３号は、下等酵母においてガラクトシル化糖タンパク質を産生するビシア・パストリス細胞株の作製方法を開示している。米国特許第７，０２９，８７２号；米国特許出願公開第２００４／００１８５９０号、同第２００４／０２３００４２号、同第２００５／０２０８６１７号、２００４／０１７１８２６号、同第２００６／０２８６６３７号及び同第２００７／００３７２４８号；及びＨａｍｉｌｔｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１３，１４４１−１４４３（２００６）も参照されたい。
【００８０】
次いで、菌株ＲＤＰ９７４をベクターｐＳＨ１０２２にフコシル化経路を導入するための宿主菌株として使用する。簡単に説明すると、１０μｇの対照プラスミドｐＳＨ９９５またはフコシル化経路プラスミドｐＳＨ１０２２を制限酵素ＳｆｉＩで消化してベクターを直線化し、エレクトロポレーションにより宿主菌株ＲＤＰ９７４に形質転換する。形質転換細胞を１００ｎｇ／ｍＬのノーセオスリシンを含有するＹＰＤで平板培養し、２６℃で５日間インキュベートする。その後、数個のクローンを抜き取り、ｒＥＰＯのＮ−グリカンに対するフコース転移について分析する。対照ベクターで形質転換した菌株をＹＳＨ６６０と称し、ｐＳＨ１０２２で形質転換し、フコース転移を示す菌株をＹＳＨ６６１と称する。
【００８１】
典型的には、形質転換菌株を２６℃で、増殖培地としての１％ 酵母抽出物、２％ ペプトン、１００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）、１．３４％ 酵母窒素ベース、４×１０〜５％ ビオチン及び１％ グリセロールからなる緩衝グリセロール−複合培地（ＢＭＧＹ）（５０ｍＬ）において増殖させることによりタンパク質発現を実施する。タンパク質発現の誘導は、ＢＭＧＹ中のグリセロールを１．５％ メタノールに代えた緩衝メタノール−複合培地（ＢＭＭＹ）（５０ｍＬ）中で実施する。
【００８２】
組換えｒＥＰＯを上記したように発現させ、Ｎｉ−キレートカラムはＣｈｏｉら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１００，５０２２（２００３）及びＨａｍｉｌｔｏｎら（Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０１，１２４４（２００３））に記載されているように精製する。生じたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｎａｔｕｒｅ，２２７，６８０（１９７０））により分析し、可視化するためにクーマシーブルーで染色する。フコースを、製造業者が推奨しているようにインビトロでα−１，６−フコシダーゼ（ミズーリ州セントルイスに所在のＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）処理して消化することにより除去する。
【００８３】
グリカン分析のために、ＰＮＧアーゼ−Ｆ（Ｃｈｏｉら（２００３）；Ｈａｍｉｌｔｏｎら（２００３））で処理することによりグリカンをｒＥＰＯから遊離させる。グリカン構造を確認するために、遊離したグリカンをＭＡＬＤＩ／飛行時間型（ＴＯＦ）質量分光分析により分析する（Ｃｈｏｉら（２００３））。存在するフコシル化グリカンの相対量を定量するために、Ｎ−グリコシダーゼＦ遊離したグリカンを２−アミノベンジジン（２−ＡＢ）で標識し、ＨＰＬＣ（Ｃｈｏｉら（２００３））により分析する。フコシダーゼ処理前及びその後の各物質のピーク面積を比較することによりフコシル化グリカン及び非フコシル化グリカンのパーセンテージを計算する。
【００８４】
本質的に上記したように作製した菌株ＹＳＨ６６１中で産生されたＮ−グリカンの分析から、この菌株はＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）Ｎ−グリカンを含む組換えｒＥＰＯを産生したことが判明した。菌株ＹＳＨ６６１中で産生されたｒＥＰＯのＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析の結果を示している図４Ａから、この菌株はＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２Ｎ−グリカンを含むＮ−グリカンを産生したことが判明した。Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）Ｎ−グリカンは四角で囲まれている。対照菌株ＹＳＨ６６０（フコシル化経路なし）中で産生されたｒＥＰＯのＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析の結果を示している図４Ｂは、この菌株はＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２のみからなるフコシル化Ｎ−グリカンしか産生しなかったことを示している。
【実施例２】
【００８５】
ＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質を産生し得るピキア・パストリス菌株は、ＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質を産生し得るピキア・パストリス菌株にベクターｐＳＨ１０２２を導入することにより作製できる。例えば、フコシル化経路の成分をコード化する遺伝子を含有しているベクターｐＳＨ１０２２は、ΝＡΝＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃΝＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃΝＡｃ２Ｎ−グリカンを有するラットＥＰＯを産生し、米国仮特許出願第６０／８０１，６８８号明細書及びＨａｍｉｌｔｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１３，１４４１−１４４３（２００６）に開示されている菌株ＹＳＨ５９７に形質転換され得る。導入により菌株で産生されるラットＥＰＯはＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）Ｎ−グリカンを含んでいるであろう。
【００８６】
シアリル化経路をコード化する酵素を実施例１の菌株ＹＳＨ６６１に導入する予想方法を以下に提供する。
【００８７】
ホモサピエンスＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノサミンキナーゼ（ＧＮＥ）、ホモサピエンスＮ−アセチルノイラミネート−９−ホスフェートシンターゼ（ＳＰＳ）、ホモサピエンスＣＭＰ−シアル酸シンターゼ（ＣＳＳ）、ハツカネズミＣＭＰ−シアル酸トランスポーター（ＣＳＴ）、及びハツカネズミα−２，６−シアリルトランスフェラーゼ（ＳＴ）のアミノ酸４０〜４０３のオープンリーディングフレームをＧｅｎｅＯｐｔｉｍｉｚｅｒソフトウェアにより分析し、ピキア・パストリス発現（独国レーゲンスブルクに所在のＧｅｎｅＡｒｔ）に対してコドン最適化する。生じたＧＮＥ、ＳＰＳ、ＣＳＳ及びＣＳＴに対する５’ＢｓａＩ及び３’ＨｐａＩ制限部位を有する合成ＤＮＡを作製し、シャトルベクターにクローン化し、それぞれｐＧＬＹ３６８、３６７、３６６及び３６９と称する。ＳＴに対する５’ＡｓｃＩ及び３’ＰａｃＩ制限部位を有する合成ＤＮＡを作製し、シャトルベクターにクローン化し、ｐＳΗ６６０と称する。ＳＰＳ、ＣＳＳ及びＣＳＴ発現カセットを作成するために、ベクターｐＧＬＹ３６７、３６６及び３６９をＢｓａＩ及びＨｐａＩで消化して、１．１、１．３及び１．０Ｋｂ断片を切り取り、これらの断片をＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで処理して一本鎖オーバーハングを除去する。次いで、これらの断片を、予めＮｏｔＩ及びＡｓｃＩで消化し、Ｔ４ ＤΝＡポリメラーゼで処理したベクターｐＧＬＹ３５９、並びに予めＮｏｔＩ及びＰａｃＩで消化し、Ｔ４ ＤΝＡポリメラーゼで処理したベクターｐＧＬＹ１７及び３６３にサブクローン化する。生じたベクターｐＳＨ８１９は、ＰａｃＩ制限部位に隣接するＰｐＰＭＡｌｐｒｏｍ−ＰｐＰＭＡｌｔｔカセット中にＳＰＳを含んでいる。生じたベクターｐＳＨ８２４は、５’ＢｇｌＩＩ及び３’ＢａｍＨＩ制限部位に隣接するＰｐＧＡＰＤＨ−ＳｃＣＹＣｔｔカセット中にＣＳＳを含んでいる。生じたベクターｐＧＬＹ３７２は、ＲｓｒＩＩ制限部位に隣接するＰｐＰＭＡ１ｐｒｏｍ−ＰｐＰＭＡｌｔｔカセット中にＣＳＴを含有している。酵母局在化シグナルに融合したＳＴ触媒ドメインを作製するために、Ｍｎｔｌのサッカロミセス・セレビシアエターゲッティング領域をゲノムＤΝＡからＴａｑ ＤΝＡポリメラーゼ（ウィスコンシン州マディソンに所在のＰｒｏｍｅｇａ）、並びにプライマーＳｃＭｎｔ１−順方向及びＳｃＭｎｔ１−逆方向（それぞれ、５’−ＧＧＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＣＣＴＣＴＴＴＣＴＣ ＡＧＴＡＡＧＡＧＡＣＴ ＧＴＴＧＡＧ−３’（配列番号２５）及び５’−ＣＣＧＧＣＧＣＧＣＣＣＧＡＴＧＡＣＴＴＧＴＴＧ ＴＴＣＡＧＧＧＧＡＴＡＴＡＧＡＴＣＣＴＧ−３’（配列番号２６））を用いて増幅させる。使用する条件は、９４℃で３分間を１サイクル；９４℃で３０秒間、５５℃で２０秒間、６８℃で１分間を３０サイクル；６８℃で５分間を１サイクルである。生じた５’ＮｏｔＩ及び３’ＡｓｃＩ制限部位を含有している１７４ｂｐ断片をコドン最適化ＳＴに対してインフレーム５’でサブクローン化すると、ベクターｐＳＨ８６１が生ずる。その後、このベクターをＮｏｔＩ及びＰａｃＩで消化してＳＴ−融合を含む１．３Ｋｂ断片を切り取り、Ｔ４ ＤΝＡポリメラーゼで処理し、ＮｏｔＩ及びＰａｃＩで消化することにより作製し、Ｔ４ ＤΝＡポリメラーゼで処理したｐＧＬＹ３６１にサブクローン化する。ＳｇｆＩ制限部位に隣接するＰｐＴＥＦｐｒｏｍ−ＰｐＴＥＦｔｔカセット中にＳＴ−融合を含むベクターが生じ、これをｐＳＨ８９３と称する。
【００８８】
ピキア・パストリスＧＡＰＤＨプロモーター及びサッカロミセス・セレビシアエＣＹＣ転写ターミネーターを含有する酵母発現ベクターｐＳＨ８２３は、Ｔｒｐ２ ＯＲＦの下流のピキアゲノムに組み込むように設計されている。ＰＭＡ−ＣＳＴ発現カセットをコード化する２．６Ｋｂ断片をｐＧＬＹ３７２から制限酵素ＲｓｒＩＩを用いて切り取り、同一酵素で消化したｐＳＨ８２３にサブクローン化する。ＰＭＡ−ＣＳＴ及びＧＡＰＤＨ発現カセットが同一方向にアラインされているベクターが生じ、これをｐＳＨ８２６と称する。その後、このベクターを制限酵素ＮｏｔＩ及びＰａｃＩで消化し、一本鎖オーバーハングをＴ４ ＤΝＡポリメラーゼを用いて除去する。この線状構築物に、ｐＧＬＹ３６８からＢｓａＩ及びＨｐａＩで消化することにより単離し、一本鎖オーバーハングを除去するためにＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで処理したＧＮＥの２．２Ｋｂ断片をサブクローン化する。このベクターをｐＳＨ８２８と称する。その後、このベクターをＰａｃＩで消化し、ここにＰＭＡ−ＳＰＳ発現カセットをコード化するｐＳＨ８１９の２．７Ｋｂ ＰａｃＩ断片をサブクローン化する。ＰＭＡ−ＳＰＳ発現カセットがＧＡＰＤＨ発現カセットと反対方向にアラインされているベクターが生じ、これをｐＳＨ８３０と称する。この段階で、ＵＲＡ５マーカーが、ｐＳＨ８３０からＸｈｏＩを用いて２．４Ｋｂ ＵＲＡ５断片を切り取り、ｐＳＨ８４２から同一酵素で消化したＨＩＳＩの１．８Ｋｂ断片で置換することによりＨＩＳ１で置換されている。ＨＩＳ１ ＯＲＦがＧＡＰＤＨ−ＧＮＥ発現カセットと同一方向にアラインされているベクターが生じ、これをｐＳＨ８７０と称する。その後、このベクターをＢａｍＨＩで消化し、ｐＳＨ８２４からＢａｍＨＩ及びＢｇｌＩＩで消化することにより単離したＧＡＰＤＨ−ＣＳＳ発現カセットを含有している２．１Ｋｂ断片をサブクローン化する。新たに導入した発現カセットがＧＡＰＤＨ−ＧＮＥカセットと反対方向に方向づけられているベクターが生じ、これをｐＳＨ８７２と称する。次いで、ＴＥＦ−ＳＴを含有している２．２Ｋｂ発現カセットをｐＳＨ８７２からＳｇｆＩで消化し、同一酵素で消化したｐＳＨ８９３にサブクローン化する。ＴＥＦ−ＳＴカセットがＧＡＰＤＨ−ＧＮＥカセットと反対方向に方向づけられているベクターが生じ、これをｐＳＨ９２６と称する。
【００８９】
ｐＳＨ９２６ベクターを菌株ＹＳＨ６６１に形質転換し、これはその後ＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２Ｎ−グリカンを有するラットＥＰＯを産生し得る。
【実施例３】
【００９０】
ＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）Ｎ−グリカンを有するヒトＥＰＯを産生し得るピキア・パストリス菌株は、ＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２Ｎ−グリカンを有するヒトＥＰＯを産生し得るピキア・パストリス菌株にベクターｐＳＨ１０２２を導入することにより作製できる。例えば、フコシル化経路の成分をコード化する遺伝子を含んでいるベクターｐＳＨ１０２２は、ＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質を産生し得る菌株、例えばＨａｍｉｌｔｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１３，１４４１−１４４３（２００６）に開示されている菌株ＹＳＨ５９７、またはシアリル化経路酵素をコード化する遺伝子を含んでいるが、ラットＥＰＯをコード化するＤＮＡをヒトＥＰＯをコード化するＤＮＡで置換した実施例２のＹＳＨ６６１に形質転換され得る。次いで、菌株はＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）Ｎ−グリカンを有するヒトＥＰＯを産生するであろう。
【００９１】
本発明を本明細書中で例示した実施形態を参照して記載してきたが、本発明はこれらに限定されないと理解されるべきである。本明細書中の教示内容を入手できる当業者は本発明の範囲内で追加の改変及び実施形態を認識するであろう。従って、本発明は添付の請求の範囲によってのみ限定される。
【００９２】
【表１】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フコシル化経路を含む組換え下等真核生物宿主細胞。
【請求項２】
酵母または糸状菌である請求項１の宿主細胞。
【請求項３】
酵母がピキア属菌（Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．）である請求項２の宿主細胞。
【請求項４】
ピキア属菌がピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）である請求項３の宿主細胞。
【請求項５】
宿主細胞は更に、糖タンパク質のＮ−グリカンに対してα１，６−マンノシルトランスフェラーゼ活性を示さず、ならびにα１，２−マンノシダーゼ触媒（通常触媒ドメインを伴わない細胞標的シグナルペプチドに融合されおよびα１，２−マンノシダーゼ活性を宿主細胞のＥＲまたはゴルジ体へターゲットするように選択されている。）を含み、これにより宿主細胞のＥＲまたはゴルジ体を組換え糖タンパク質が通過すると、フコシル化Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質が産生される、請求項１の宿主細胞。
【請求項６】
更に、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ触媒ドメイン（通常触媒ドメインを伴わない細胞標的シグナルペプチドに融合されおよびＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ活性を宿主細胞のERもしくはゴルジ体へターゲットするように選択されている。）を含み、これにより宿主細胞のＥＲもしくはゴルジ体内を組み換え糖タンパク質が通過すると、フコシル化ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質が産生される、請求項１の宿主細胞。
【請求項７】
更に、マンノシダーゼＩＩ触媒ドメイン（通常触媒ドメインを伴わない細胞標的シグナルペプチドに融合されおよびマンノシダーゼＩＩ活性を宿主細胞のERもしくはゴルジ体へターゲットするように選択されている。）を含み、これにより宿主細胞のＥＲもしくはゴルジ体内を組み換え糖タンパク質が通過すると、フコシル化ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質が産生される、請求項１の宿主細胞。
【請求項８】
更に、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩ触媒ドメイン（通常触媒ドメインを伴わない細胞標的シグナルペプチドに融合されおよびＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩ活性を宿主細胞のERもしくはゴルジ体へターゲットするように選択されている。）を含み、これにより宿主細胞のＥＲもしくはゴルジ体内を組み換え糖タンパク質が通過すると、フコシル化ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質が産生される、請求項１の宿主細胞。
【請求項９】
更に、ガラクトーストランスフェラーゼＩＩ触媒ドメイン（通常触媒ドメインを伴わない細胞標的シグナルペプチドに融合されおよびガラクトーストランスフェラーゼＩＩ活性を宿主細胞のERもしくはゴルジ体へターゲットするように選択されている。）を含み、これにより宿主細胞のＥＲもしくはゴルジ体内を組み換え糖タンパク質が通過すると、フコシル化Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質が産生される、請求項１の宿主細胞。
【請求項１０】
更に、シアリルトランスフェラーゼ触媒ドメイン（通常触媒ドメインを伴わない細胞標的シグナルペプチドに融合されおよびシアリルトランスフェラーゼ活性を宿主細胞のERもしくはゴルジ体へターゲットするように選択されている。）を含み、これにより宿主細胞のＥＲもしくはゴルジ体内を組み換え糖タンパク質が通過すると、フコシル化ＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質が産生される、請求項１の宿主細胞。
【請求項１１】
複数のグリコフォームを含む糖タンパク質組成物であって、各グリコフォームは少なくとも１つのＮ−グリカンを結合して含んでおり、よって糖タンパク質組成物は複数のＮ−グリカンを含んでおり、複数のＮ−グリカンの２５モル％以上が本質的にＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＮＡＮＡＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２及びＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群から選択されるフコシル化Ｎ−グリカンから構成されている、糖タンパク質組成物。
【請求項１２】
フコシル化Ｎ−グリカンが複数のＮ−グリカンの５０モル％を超える請求項１１の糖タンパク質組成物。
【請求項１３】
フコシル化Ｎ−グリカンが複数のＮ−グリカンの７５モル％を超える請求項１１の糖タンパク質組成物。
【請求項１４】
フコシル化Ｎ−グリカンが複数のＮ−グリカンの８０モル％を超える請求項１１の糖タンパク質組成物。
【請求項１５】
フコースはＮ−グリカンの還元末端でＧｌｃＮＡｃとα１，３−結合している請求項１１の糖タンパク質組成物。
【請求項１６】
フコースはＮ−グリカンの還元末端でＧｌｃＮＡｃとα１，６−結合している請求項１１の糖タンパク質組成物。
【請求項１７】
フコースはＮ−グリカンの非還元末端でＧａｌとα１，２−結合している請求項１１の糖タンパク質組成物。
【請求項１８】
フコースはＮ−グリカンの非還元末端でＧｌｃＮａｃとα１，３−結合している請求項１１の糖タンパク質組成物。
【請求項１９】
フコースはＮ−グリカンの非還元末端でＧｌｃＮＡｃとα１，４−結合している請求項１１の糖タンパク質組成物。
【請求項２０】
ハイブリッドベクターであって、（ａ）下等真核宿主細胞において機能的であり、（ｉ）ターゲッティング配列をコード化する融合タンパク質をコード化するＤＮＡコード配列に操作可能に連結されているＤＮＡ調節エレメント及び（ｂ）フコシル化経路酵素の触媒ドメインを含む、ベクター。
【請求項２１】
フコシル化経路酵素はフコシルトランスフェラーゼである請求項１７のベクター。
【請求項１】
フコシル化経路を含む組換え下等真核生物宿主細胞。
【請求項２】
酵母または糸状菌である請求項１の宿主細胞。
【請求項３】
酵母がピキア属菌（Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．）である請求項２の宿主細胞。
【請求項４】
ピキア属菌がピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）である請求項３の宿主細胞。
【請求項５】
宿主細胞は更に、糖タンパク質のＮ−グリカンに対してα１，６−マンノシルトランスフェラーゼ活性を示さず、ならびにα１，２−マンノシダーゼ触媒（通常触媒ドメインを伴わない細胞標的シグナルペプチドに融合されおよびα１，２−マンノシダーゼ活性を宿主細胞のＥＲまたはゴルジ体へターゲットするように選択されている。）を含み、これにより宿主細胞のＥＲまたはゴルジ体を組換え糖タンパク質が通過すると、フコシル化Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質が産生される、請求項１の宿主細胞。
【請求項６】
更に、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ触媒ドメイン（通常触媒ドメインを伴わない細胞標的シグナルペプチドに融合されおよびＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ活性を宿主細胞のERもしくはゴルジ体へターゲットするように選択されている。）を含み、これにより宿主細胞のＥＲもしくはゴルジ体内を組み換え糖タンパク質が通過すると、フコシル化ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質が産生される、請求項１の宿主細胞。
【請求項７】
更に、マンノシダーゼＩＩ触媒ドメイン（通常触媒ドメインを伴わない細胞標的シグナルペプチドに融合されおよびマンノシダーゼＩＩ活性を宿主細胞のERもしくはゴルジ体へターゲットするように選択されている。）を含み、これにより宿主細胞のＥＲもしくはゴルジ体内を組み換え糖タンパク質が通過すると、フコシル化ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質が産生される、請求項１の宿主細胞。
【請求項８】
更に、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩ触媒ドメイン（通常触媒ドメインを伴わない細胞標的シグナルペプチドに融合されおよびＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩ活性を宿主細胞のERもしくはゴルジ体へターゲットするように選択されている。）を含み、これにより宿主細胞のＥＲもしくはゴルジ体内を組み換え糖タンパク質が通過すると、フコシル化ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質が産生される、請求項１の宿主細胞。
【請求項９】
更に、ガラクトーストランスフェラーゼＩＩ触媒ドメイン（通常触媒ドメインを伴わない細胞標的シグナルペプチドに融合されおよびガラクトーストランスフェラーゼＩＩ活性を宿主細胞のERもしくはゴルジ体へターゲットするように選択されている。）を含み、これにより宿主細胞のＥＲもしくはゴルジ体内を組み換え糖タンパク質が通過すると、フコシル化Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質が産生される、請求項１の宿主細胞。
【請求項１０】
更に、シアリルトランスフェラーゼ触媒ドメイン（通常触媒ドメインを伴わない細胞標的シグナルペプチドに融合されおよびシアリルトランスフェラーゼ活性を宿主細胞のERもしくはゴルジ体へターゲットするように選択されている。）を含み、これにより宿主細胞のＥＲもしくはゴルジ体内を組み換え糖タンパク質が通過すると、フコシル化ＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質が産生される、請求項１の宿主細胞。
【請求項１１】
複数のグリコフォームを含む糖タンパク質組成物であって、各グリコフォームは少なくとも１つのＮ−グリカンを結合して含んでおり、よって糖タンパク質組成物は複数のＮ−グリカンを含んでおり、複数のＮ−グリカンの２５モル％以上が本質的にＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＮＡＮＡＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２及びＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群から選択されるフコシル化Ｎ−グリカンから構成されている、糖タンパク質組成物。
【請求項１２】
フコシル化Ｎ−グリカンが複数のＮ−グリカンの５０モル％を超える請求項１１の糖タンパク質組成物。
【請求項１３】
フコシル化Ｎ−グリカンが複数のＮ−グリカンの７５モル％を超える請求項１１の糖タンパク質組成物。
【請求項１４】
フコシル化Ｎ−グリカンが複数のＮ−グリカンの８０モル％を超える請求項１１の糖タンパク質組成物。
【請求項１５】
フコースはＮ−グリカンの還元末端でＧｌｃＮＡｃとα１，３−結合している請求項１１の糖タンパク質組成物。
【請求項１６】
フコースはＮ−グリカンの還元末端でＧｌｃＮＡｃとα１，６−結合している請求項１１の糖タンパク質組成物。
【請求項１７】
フコースはＮ−グリカンの非還元末端でＧａｌとα１，２−結合している請求項１１の糖タンパク質組成物。
【請求項１８】
フコースはＮ−グリカンの非還元末端でＧｌｃＮａｃとα１，３−結合している請求項１１の糖タンパク質組成物。
【請求項１９】
フコースはＮ−グリカンの非還元末端でＧｌｃＮＡｃとα１，４−結合している請求項１１の糖タンパク質組成物。
【請求項２０】
ハイブリッドベクターであって、（ａ）下等真核宿主細胞において機能的であり、（ｉ）ターゲッティング配列をコード化する融合タンパク質をコード化するＤＮＡコード配列に操作可能に連結されているＤＮＡ調節エレメント及び（ｂ）フコシル化経路酵素の触媒ドメインを含む、ベクター。
【請求項２１】
フコシル化経路酵素はフコシルトランスフェラーゼである請求項１７のベクター。
【図１】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【公表番号】特表２０１０−５１９９３０（Ｐ２０１０−５１９９３０Ａ）
【公表日】平成２２年６月１０日（２０１０．６．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５５２７０４（Ｐ２００９−５５２７０４）
【出願日】平成２０年３月３日（２００８．３．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／００２７８７
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１１２０９２
【国際公開日】平成２０年９月１８日（２００８．９．１８）
【出願人】（５０３００７２８７）グライコフィ， インコーポレイテッド (37)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年６月１０日（２０１０．６．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年３月３日（２００８．３．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／００２７８７
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１１２０９２
【国際公開日】平成２０年９月１８日（２００８．９．１８）
【出願人】（５０３００７２８７）グライコフィ， インコーポレイテッド (37)
【Ｆターム（参考）】
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