糖タンパク質ホルモンカルテットの一本鎖形態
【課題】少なくともいくつかのメンバーがほとんどの脊椎動物において認められる、糖タンパク質ホルモンカルテットの一本鎖形態を提供すること。
【解決手段】これらの一本鎖形態の１つの実施態様では、野生型ヘテロダイマーあるいはそれらの変異体のαサブユニットおよびβサブユニットが、必要に応じてリンカー部分を介して、共有結合で連結される。これらのホルモンについてのレセプターに対して標的づけられるリンカー部分内に薬剤が含まれ得る。一本鎖形態のいくつかは、糖タンパク質ホルモン活性のアゴニストであり、そして他はアンタゴニストである。本発明の一本鎖化合物の別の実施態様は、糖タンパク質ホルモンの２つのβサブユニットを含み、そのβサブユニットは同じかあるいは異なる。これらの「２-β」形態は、糖タンパク質ホルモン活性のアンタゴニストである。
【解決手段】これらの一本鎖形態の１つの実施態様では、野生型ヘテロダイマーあるいはそれらの変異体のαサブユニットおよびβサブユニットが、必要に応じてリンカー部分を介して、共有結合で連結される。これらのホルモンについてのレセプターに対して標的づけられるリンカー部分内に薬剤が含まれ得る。一本鎖形態のいくつかは、糖タンパク質ホルモン活性のアゴニストであり、そして他はアンタゴニストである。本発明の一本鎖化合物の別の実施態様は、糖タンパク質ホルモンの２つのβサブユニットを含み、そのβサブユニットは同じかあるいは異なる。これらの「２-β」形態は、糖タンパク質ホルモン活性のアンタゴニストである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府援助の記述
本発明は、国立衛生研究所より奨励金を得て、NIH契約番号NO1-HD-9-2922で政府援助の下でなされた。政府は本発明に一部権利を有する。
【０００２】
技術分野
本発明は、タンパク質工学および天然にヘテロダイマーとして存在する糖タンパク質ホルモンの分野に関する。特に、本発明は、絨毛性性腺刺激ホルモン（CG）、甲状腺刺激ホルモン（TSK）、黄体形成ホルモン（LH）、および卵胞刺激ホルモン（FSH）の一本鎖形態に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景技術
ヒトにおける、重要な４つの糖タンパク質ホルモンヘテロダイマー（ＬＨ、ＦＳＨ、ＴＳＨ、およびＣＧ）は、同じαサブユニットと異なるβサブユニットとを有する。これらのホルモンのうち３つは、事実上他の全ての脊椎動物種にも存在し、ＣＧは、今までには、霊長類およびウマ胎盤および尿にしか認められていない。
【０００４】
１９９０年９月７日に公開され、本明細書に参考として援用されているＰＣＴ出願第ＷＯ９０／０９８００号は、これらのホルモンの多くの改変形態を記載している。重要な１つの改変は、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモンあるいはその変異体のカルボキシ末端ペプチドによる、βサブユニットのＣ末端伸長である。これらのホルモンのその他の変異タンパク質もまた記載されている。ＣＴＰの関連位置は、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモンβサブユニットの１１２−１１８位の任意の位置から１４５位までである。ＰＣＴ出願は、ＣＴＰがクリアランス特性を変える能力が破壊されないような、保存アミノ酸置換により得られたＣＴＰ伸長の変異体を記載している。さらに、本明細書に参考として援用されている、１９９３年４月２０日に出願された米国出願第０８／０４９，８６９号は、Ｃ末端以外の位置でのＣＴＰの伸長あるいは挿入による、これらのホルモンの変異、および１１２−１１８位から１４５位にわたる配列より短いＣＴＰフラグメントを記載している。
【０００５】
ＦＳＨのＣＴＰ伸長βサブユニットもまた、本明細書に出願者による２つの報文に記載されている：ＬａＰｏｌｔ，Ｐ．Ｓ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ（１９９２）１３１：２５１４−２５２０およびＦａｒｅｓ，Ｆ．Ａ．ら；Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９９２）８９：４３０４−４３０８。これらの両報文は、本明細書に参考として援用されている。
【０００６】
ヒト絨毛性性腺刺激ホルモンのヘテロダイマー形態の結晶構造は、ほぼ同時期の論文中に公開され；１つは、Ｌａｐｔｈｏｒｎ，Ａ．Ｊ．ら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９４）３６９：４５５−４６１であり、もう一方は、Ｗｕ，Ｈ．ら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（１９９４）２：５４５−５５８である。これらの論文の結果は、Ｐａｔｅｌ，Ｄ．Ｊ．Ｎａｔｕｒｅ（１９９４）３６９：４３８−４３９に要約されている。
【０００７】
ヘテロダイマーの良好な一本鎖形態の調製例の少なくとも１つが公知である。天然に存在する甘味タンパク質であるモネリンは、ヘテロダイマー形態でセレンディピティベリーから単離された。ヘテロダイマーの結晶構造についての調査は、ヘテロダイマー形態の空間特性を維持して、Ｂ鎖のＣ末端が、Ａ鎖のＮ末端にリンカーを介して連結され得ることと一致した。このような連結は、甘味タンパク質としての使用のために、それが高温において安定な形態でこの分子を提供するのに好都合であるという理由から、有益である。米国特許第５，２６４，５５８号に記載されているように、これは一本鎖形態を調製することによってうまく達成され、よって、熱変性が妨げられた。
【０００８】
１９９１年１１月１４日に公開されたＰＣＴ出願第ＷＯ９１／１６９２２号は、多くのキメラおよび改変形態のヘテロダイマー糖タンパク質ホルモンを記載している。概して、この開示は、それぞれに種々のαあるいはβ鎖部分を含有するαサブユニットあるいはβサブユニットのキメラを重点的に取り扱っている。この出願に単に掲載されているだけで他には特に記載されていない１つの構築物は、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモンのβ鎖の実質的に全体をαサブユニットプレタンパク質（すなわち、このサブユニットの分泌シグナル配列を含有する）に容易に融合する。β鎖とα鎖と間に介在するシグナル配列の存在は、本明細書に定義および記載されているようなリンカー部分として作用しないので、この構築物は本発明の範囲外である。
【０００９】
通常のヘテロダイマー糖タンパク質ホルモンは、上記の種々のＣＴＰ伸長および挿入を含む一本鎖形態を包含する、一本鎖形態のときに、それらの特性を保持することが認められた。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
発明の開示
本発明は、糖タンパク質ホルモンの一本鎖形態を提供する。このホルモンの少なくともいくつかは、ほとんどの脊椎動物種において認められている。本発明の一本鎖形態は、グリコシル化、部分グリコシル化、あるいは非グリコシル化のいずれかであり得、天然の糖タンパク質ホルモンあるいはその変異体に存在するα鎖およびβ鎖（あるいはαとα、あるいはβとβ）は、必要に応じてリンカー部分を介して連結され得る。特に好ましいリンカー部分は、完全なユニットあるいはそれらの部分のみで、カルボキシ末端ペプチド（ｃａｒｂｏｘｙ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ；ＣＴＰ）ユニットを含む。得られた一本鎖ホルモンは、非改変ヘテロダイマー形態の活性を保持するか、あるいはこの活性のアンタゴニストである。
【００１１】
従って、１つの局面では、本発明は、該ホルモンの１つβサブユニットのアミノ酸配列に、必要に応じてリンカー部分を介して、共有結合で連結された糖タンパク質ホルモンに共通なαサブユニットのアミノ酸配列、あるいは、それらアミノ酸配列の変異体（ここで、変異体は、本明細書に定義されている）を含有する、グリコシル化あるいは非グリコシル化タンパク質に向けられている。
【００１２】
別の局面では、本発明は、該ホルモンの１つのβサブユニットのアミノ酸配列に、必要に応じてリンカー部分を介して、共有結合で連結された糖タンパク質ホルモンカルテット（４つ組み）のメンバーのβサブユニットのアミノ酸配列、あるいは、それらアミノ酸配列の変異体（ここで、変異体は、本明細書に定義されている）を含有する、グリコシル化あるいは非グリコシル化タンパク質に向けられている。
【００１３】
別の局面では、本発明は、他方のαサブユニットのアミノ酸配列に、必要に応じてリンカー部分を介して、共有的に連結された糖タンパク質ホルモンカルテットのαサブユニットのアミノ酸配列、あるいは、それらアミノ酸配列の変異体（ここで、変異体は、本明細書に定義されている）を含有する、グリコシル化あるいは非グリコシル化タンパク質に向けられている。
【００１４】
さらに別の局面では、本発明は、有効性がホルモンカルテットの一本鎖形態により予測される生物学的に重要なダイマーのグリコシル化あるいは非グリコシル化一本鎖形態に向けられている。従って、本発明はまた、インターロイキン３および１２（ＩＬ−３およびＩＬ−１２）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、およびインヒビンの一本鎖形態に向けられている。ＩＬ−３由来の一方のサブユニットと、ＩＬ−１２由来の他方のサブユニットとの一本鎖形態のような、ハイブリッドインターロイキンもまた包含される。
【００１５】
その他の局面では、本発明は、本発明の一本鎖タンパク質を生産するための組換え材料および方法、それらを含有する薬学的組成物、それらに特異的な抗体、およびそれらの使用に、向けられている。
【００１６】
上記に加えて、本発明は、以下を提供する：
１．グリコシル化あるいは非グリコシル化タンパク質であって、該タンパク質は、
糖タンパク質ホルモンの１つのβサブユニットのアミノ酸配列に、必要に応じてリンカー部分を介して、共有結合で連結される、該糖タンパク質ホルモンに共通なαサブユニットのアミノ酸配列を含み、
ここで、該αおよびβサブユニットが、天然アミノ酸配列あるいは該アミノ酸配列の変異体からなる、
タンパク質。
【００１７】
２．前記タンパク質が前記リンカー部分を含み、そして、該リンカー部分が、必要に応じて、糖タンパク質ホルモンのレセプターへ標的づけられるべき薬剤を含有する、請求項１に記載のタンパク質。
【００１８】
３．前記βサブユニットのＣ末端近接位置が、必要に応じてリンカー部分を介して、前記αサブユニットのＮ末端近接位置に共有結合で連結されるか、あるいは、前記αサブユニットのＣ末端近接位置が、必要に応じてリンカー部分を介して、前記βサブユニットのＮ末端近接位置に共有結合で連結される、項目１に記載のタンパク質。
【００１９】
４．前記βサブユニットが、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモンあるいはその変異体のβサブユニットか、あるいは
前記βサブユニットが、FSHあるいはその変異体のβサブユニットであるか、あるいは
前記βサブユニットが、完全あるいは部分CTPユニットあるいはその変異体でそのＣ末端近接位置に伸長されたFSHのβサブユニットであるか、あるいは
前記βサブユニットが、LHあるいはその変異体のβサブユニットであるか、あるいは
前記βサブユニットが、完全あるいは部分CTPユニットその変異体でそのＣ末端近接位置に伸長されたLHのβサブユニットであるか、あるいは
前記βサブユニットが、TSHあるいはその変異体のβサブユニットであるか、あるいは
前記βサブユニットが、完全あるいは部分CTPユニットあるいはその変異体でそのＣ末端近接位置に伸長されたTSHのβサブユニットであるか、および／または
前記αサブユニットが、完全あるいは部分CTPユニットあるいはその変異体でそのＮ末端近接位置に伸長された、
項目１に記載のタンパク質。
【００２０】
５．前記αサブユニットあるいはβサブユニットあるいは両方が、完全あるいは部分CTPユニットあるいはその変異体を、それらの非重要領域へ挿入することによって改変されるか、および／または、前記リンカー部分が、完全あるいは部分CTPユニットあるいはその変異体を含む、項目１に記載のタンパク質。
【００２１】
６．前記部分CTPユニットが、112-132位、115-132位、116-132位、あるいは118-132位、あるいは112-127位、115-127位、116-127位、あるいは118-127位からなり、および／または
該CTPが、改変あるいは欠失される１つあるいはそれを超えるO-結合グリコシル化部位を有するか、および／または
前記非重要領域が、Ｃ末端に近接するか、あるいは
前記非重要領域が、Ｎ末端に近接する、
項目５に記載のタンパク質。
【００２２】
７．前記βサブユニットが、１つあるいはそれを超えるN-結合グリコシル化部位での改変を含有し、および／または
前記αサブユニットのN-結合グリコシル化部位の１つあるいは両方が、改変され、および／または
それが、グリコシル化されておらず、および／または
前記αサブユニットの85-92位の１つあるはそれを超えるアミノ酸が欠失された、
項目１に記載のタンパク質。
【００２３】
８．グリコシル化あるいは非グリコシル化タンパク質であって、
同じかあるいは異なる糖タンパク質ホルモンのβサブユニットのアミノ酸配列に、必要に応じてリンカー部分を介して、共有結合で連結される、糖タンパク質ホルモンのβサブユニットのアミノ酸配列であって、
ここで該βサブユニットが、該ホルモンの天然アミノ酸配列、あるいは、該アミノ酸配列の変異体からなる、アミノ酸配列；あるいは
同じかあるいは異なる糖タンパク質ホルモンのαサブユニットのアミノ酸配列に、必要に応じてリンカー部分を介して、共有結合で連結される、糖タンパク質ホルモンのαサブユニットのアミノ酸配列であって、
ここで、該αサブユニットが、該ホルモンの天然アミノ酸配列、あるいは、該アミノ酸配列の変異体からなる、アミノ酸配列；
を含む、タンパク質。
【００２４】
９．１つのαあるいはβサブユニットのＣ末端近接位置が、もう一方のαあるいはβサブユニットのＮ末端近接位置に、必要に応じてリンカー部分を介して、共有結合で連結される、項目８に記載のタンパク質。
【００２５】
１０．前記タンパク質がリンカー部分を含む、項目８に記載のタンパク質。
【００２６】
１１．適切な薬学的賦形剤と混合して、項目１あるいは８に記載のタンパク質を含有する、薬学的あるいは獣医学的組成物。
【００２７】
１２．項目１あるいは８に記載のタンパク質に対して免疫特異性である抗体。
【００２８】
１３．項目１あるいは８に記載のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むDNAあるいはRNA分子。
【００２９】
１４．糖タンパク質ホルモンの一本鎖形態を生産する発現系であって、該発現系は、項目１あるいは８のタンパク質をコードする第一ヌクレオチド配列を、該第一ヌクレオチド配列の発現に影響し得る制御配列に作動可能に連結して、含む、発現系。
【００３０】
１５．前記第一ヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質に、作動可能に連結されたシグナルペプチドをコードする第二ヌクレオチド配列をさらに含有する、項目１４に記載の発現系。
【００３１】
１６．項目１５に記載の発現系を含むように改変された、宿主細胞。
【００３２】
１７．糖タンパク質ホルモンの一本鎖形態を生産するための方法であって、
該方法が、該糖タンパク質ホルモンが生産される条件下で、項目１６に記載の細胞を培養する工程、および
該培養物から該糖タンパク質を回収する工程
を包含する、方法。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
発明を実施するための形態
ヒトの４つの「糖タンパク質」ホルモンは、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、および甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）を含むファミリーを提供する。本明細書で使用されているように、「糖タンパク質ホルモン」は、ヒトおよびその他の脊椎動物において認められるこのファミリーのメンバーのことである。これらのホルモンは全て、特定の種について、グループ中のアミノ酸配列が同じであるαサブユニット、およびファミリーのメンバーに従って異なるβサブユニットから構成されたヘテロダイマーである。従って、通常これらの糖タンパク質ホルモンは、互いに会合されているが共有結合していないαサブユニットおよびβサブユニットから構成されたヘテロダイマーとして存在する。ほとんどの脊椎動物は、ＦＳＨ、ＴＳＨ、およびＬＨを産生し、絨毛性性腺刺激ホルモンは、ヒトを含む霊長類およびウマにのみ認められる。ウマ由来のＣＧの特定の形態は、妊馬血清糖タンパク質（ＰＭＳＧ）と呼ばれる。
【００３４】
従って、このホルモン「カルテット（４つ組み）」は、各々のαサブユニットおよびβサブユニットが異なる遺伝子にコードされ、宿主によって別々に合成される、ヘテロダイマーから構成される。次に、宿主が、個別に合成されたサブユニットを、非共有結合的に連結されたヘテロダイマー複合体に組み立てる。このようにして、このホルモンカルテットのヘテロダイマーは、一つの遺伝子から合成され（この場合には介在「プロ（pro）」配列による）、サブユニットがジスルフィド結合により共有結合カップリングされている、インスリンのようなヘテロダイマーとは異なる。このホルモンカルテットはさらに、異なる位置から組み立てられているがジスルフィド結合によって共有結合されている、免疫グロブリンとも区別される。しかし他方で、植物タンパク質であるモネリンは、A鎖およびB鎖間の非共有結合的相互作用によって、一緒になって保持されている。現時点では、２つの鎖が別々の遺伝子上にコードされるかどうかは知られていない。
【００３５】
従って、種々の要因が、同じかあるいは異なるサブユニットから形成されたダイマーである生物学的に活性な化合物の作用の決定に影響する。サブユニットは、共有結合あるいは非共有結合で連結され得、同じかあるいは異なる遺伝子によって合成され得、そして前駆形態で、ダイマーの２つのメンバーを連結する「プロ」配列を含有し得るかあるいは含有し得ない。本明細書中の糖タンパク質ホルモンカルテットの一本鎖形態によって得られる結果に基づくと、生物学的に活性なダイマーであるインターロイキン-12およびインターロイキン-3（IL-12およびIL-3）、インヒビン、腫瘍壊死因子（TNF）、ならびにトランスフォーミング成長因子（TGF）の一本鎖形態もまた、生物学的に活性であることが明白である。
【００３６】
ヘテロダイマーあるいはホモダイマーの一本鎖形態は、それらのダイマー形態よりも多くの利点を有する。最初に、それらは一般的により安定である。特にLHは、非安定性および短い半減期に注目される。第二は、１つの遺伝子のみが、転写、翻訳、およびプロセスされればよいことから、組換え生産の問題が減少される。このことは、特に細菌での発現に特に重要である。第三に、無論のこと、それらは代替形態を提供し、活性レベルおよびインビボにおける半減期を微妙に調整し得る。最後に、一本鎖形態は、ダイマーの活性を有する切断形態を同定するための独特の出発物質である。サブユニット間の連結により、タンパク質の全折り畳みを混乱させずにタンパク質を設計的に生産し得る。
【００３７】
カルテットのメンバーの特徴
ｈＣＧのβサブユニットは実質的にその他のβサブユニットより大きく、このサブユニットは、Ｃ末端に約３４の付加アミノ酸（本明細書ではカルボキシ末端部分（ｃａｒｂｏｘｙ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｐｏｒｔｉｏｎ；ＣＴＰ）と呼ばれる）を含み、そしてこれがＯ−結合部位でグリコシル化されるとき、この伸長のために、その他の性腺刺激ホルモンに比較して、ｈＣＧの血清半減期が比較的長いと考えられている（Ｍａｔｚｕｋ，Ｍ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ（１９８９）１２６：３７６）。天然ホルモンでは、このＣＴＰ伸長は、４つのムチン様Ｏ−結合オリゴ糖を含有する。
【００３８】
本発明の１つの実施態様では、糖タンパク質ホルモンのα鎖およびβ鎖がカップリングされて、α鎖およびβ鎖が、必要に応じてリンカー部分を介して、共有結合で連結されている一本鎖のタンパク質性物質になる。リンカー部分は、さらなるアミノ酸配列を含み得、特に本明細書に記載されているＣＴＰユニットが、リンカーに有利に含まれ得る。さらに、リンカーは、ホルモンのレセプターに標的づけされ得るペプチドあるいは非ペプチド薬剤を含み得る。
【００３９】
２つのペプチド鎖をペプチド結合を介して単にカップリングさせることにより達成される頭−尾（ｈｅａｄ−ｔｏ−ｔａｉｌ）配置に加えて、α鎖およびβ鎖は、頭−頭（ｈｅａｄ−ｔｏ−ｈｅａｄ）あるいは尾−尾（ｔａｉｌ−ｔｏ−ｔａｉｌ）で連結され得る。頭−頭および尾−尾のカップリングは、リンカー部分を介して２つのカルボキシル基あるいは２つのアミノ基を結合する、標準的な方法を用いる合成化学を包含する。例えば、標準的な活性化方法によって、２つのアミノ基は、無水物を介して、あるいは任意のジカルボン酸誘導体を介して連結され得；２つのカルボキシル基は、ジアミンあるいはジオールを介して連結され得る。しかし、最も好ましい形態は、頭−尾配置であり、ここでは、標準的なペプチド結合で十分であり、そして一本鎖化合物は、組換えによる融合タンパク質として、あるいは、１つの鎖におけるまたは好ましくは配列全体の個々の部分を連結する合成ペプチド法によって、調製され得る。無論のこと、所望であれば、ペプチドあるいは非ペプチドリンカー部分がこの場合においても使用され得るが、これは必要とされるわけではなく、一本鎖タンパク質の組換え産生の利点は、この生産方法を可能にする実施態様が、最も好ましいアプローチを包含することを示唆する。
【００４０】
頭−尾配置が使用されるとき、リンカーは、付加ペプチド配列から本質的になり得る。ヘテロダイマーによる場合と同様に、２つのβ鎖は、以下にさらに記載するように、ＣＴＰユニットを介して連結され得る。従って、本発明の可能な実施態様は、左にＮ末端を有した、α−ＦＳＨβ、βＦＳＨ−α、α−βＬＨ、α−ＣＴＰ−ＦＳＨβ、βＬＨ−ＣＴＰ−α、ＣＴＰ−βＬＨ−ＣＴＰ−αなどを包含する。
【００４１】
ヘテロダイマー性腺刺激ホルモンあるいは糖タンパク質カルテットの一本鎖形態はまた、実施態様のさらなる重要なセットに関し、この実施態様では、αサブユニットとβサブユニットとをカップリングするのではなく、２つのβサブユニットあるいは２つのαサブユニットが一本鎖化合物を形成するようにともにカップリングされ得る。ヘテロダイマーによる場合と同様に、結合は、頭−頭、頭−尾、あるいは尾−尾であり得る。
【００４２】
「２−β」一本鎖縦並びペプチドは、ヘテロダイマー糖タンパク質ホルモンによって通常活性化されるレセプターに対するアンタゴニストとして有用である。βサブユニットはレセプター特異性を与えるが、αサブユニットはシグナル変換に大きく寄与すると考えられ、そしてαサブユニットおよびβサブユニットは同様のコンフォメーションを有するので、一本鎖化合物はレセプターに特異的に結合し得るべきであり、そのためには、少なくとも１つのβ鎖がレセプターを活性化することなく存在する。
【００４３】
「２−β」一本鎖縦並びペプチドのアンタゴニスト活性は、ヘテロダイマーの結晶構造に一部基づく。α鎖およびβ鎖は同じシスチンノット配置を有すること、および２つの鎖のいくつかの折り畳みパターンは類似することが注目される。
【００４４】
本発明の「２−β」一本鎖化合物は、同じβサブユニットの縦並びコピー（すなわちＦＳＨβ−ＦＳＨβ；ＨＣＧβ−ＨＣＧβ；ＴＳＨβ−ＴＳＨβ；あるいはＬＨβ−ＬＨβ）を含有するように設計され得るか、あるいは、ＨＣＧβ−ＦＳＨβ；ＦＳＨβ−ＬＨβ；ＬＨβ−ＴＳＨβなどのようなキメラ一本鎖化合物が使用され得る。このような可能な組合せは総計で１２個存在する。さらに、ＨＣＧβサブユニットのカルボキシル末端ペプチド（ＣＴＰ）は、２つのβ鎖間に存在するときには、一本鎖化合物のコンフォメーションを改良する。これは、ＨＣＧβが上流部分であるとき自動的に生ずる。しかし、その他の例では、本明細書に記載のように、上流として関与するもののカルボキシル末端に、ＣＴＰサブユニットを使用するのが有利である。このような２つのＣＴＰユニットもまた本発明の範囲内である。従って、好ましい実施態様は、ＦＳＨβ−ＣＴＰ−ＦＳＨβ；ＦＳＨβ−ＣＴＰ−ＣＴＰ−ＦＳＨβ；ＬＨβ−ＣＴＰ−ＬＨβ；ＬＨβ−ＣＴＰ−ＣＴＰ−ＦＳＨβなどを包含する。
【００４５】
同様の記載が「２α」一本鎖化合物に対して適用され、無論のこと、α変異体に関する以外のキメラペアーは含まれない。種々のリンカー（好ましくはＣＴＰベース）およびＣＴＰ伸長もまた含まれる。
【００４６】
以下の定義は、分子の一本鎖形態の記述に役立ち得る。
【００４７】
本明細書で使用されているように、αサブユニット、およびＦＳＨ、ＬＨ、ＴＳＨ、およびＣＧβサブユニット、ならびにヘテロダイマー形態は、一般的に従来からの定義を有し、示されるグリコシル化パターンに係わらず、本質的に当該分野で公知のアミノ酸配列を有するタンパク質、あるいはそれらの対立遺伝子変異体のことである。
【００４８】
これらのペプチドの「天然」形態は、関連の脊椎動物組織から単離されたアミノ酸配列を有し、それ自身が既知配列あるいはそれらの対立遺伝子変異体を有するペプチドである。
【００４９】
これらのタンパク質の「変異体」形態は、例えば、部位特異変異誘発あるいはその他の組換え操作によって生産された、天然タンパク質のアミノ酸配列中の意図的な改変を有するタンパク質あるいは合成的に調製されたタンパク質のことである。
【００５０】
これらの改変は、欠失、挿入および置換を含む、１−１０個、好ましくは１−８個、より好ましくは１−５個のアミノ酸変化、最も好ましくは下記に定義されているような保存アミノ酸置換からなる。得られた変異体は、天然ホルモンの対応活性に影響する活性を保持する、すなわち、天然ホルモンの生物学的活性を直接保持しなければならないか、あるいは概して天然ホルモンのレセプターに結合し得るがシグナル変換に影響する能力を欠くことにより、アンタゴニストとして作用しなければならない。例えば、αサブユニットの５２位のグリコシル化部位が、アミノ酸置換により除去され、それによりその部位での全グリコシル化が阻まれるとき、この改変αサブユニットを有するヘテロダイマーであるホルモンは、一般的にアゴニストであり、レセプターに結合して、天然ホルモンが結合するのを競合により阻み得る。（他方で、７８位のαサブユニットのグリコシル化部位は、ホルモン活性にはさほど影響しないようである。）アミノ酸配列中のその他の改変もまた、変異体についてアゴニストではなくアンタゴニスト活性を生じ得る。
【００５１】
好ましい変異体の１つのセットは、αあるいはβサブユニットのいずれかまたはその両方のグリコシル化部位が改変された変異体である。αサブユニットは２つのグリコシル化部位を含み、１つは５２位、もう一方は７８位であり、活性に対するこれらの部位の改変の効果がちょうど記載されている。同様に、一般的にβサブユニットは２つのＮ−結合グリコシル化部位を含み（β鎖の特性によっていくらか変動する位置で）、同様の改変がこれらの部位でなされ得る。ｈＣＧのＣＴＰ伸長は４つのＯ−結合グリコシル化部位を含み、セリン残基での保存変異（例えば、セリンからアラニンへの転換）は、これらの部位を破壊する。Ｏ−結合グリコシル化部位の破壊は、アゴニスト（ａｇａｉｎｓｔ）活性からアンタゴニスト活性への転換に影響し得る。
【００５２】
最後に、Ｎ−結合あるいはＯ−結合グルコシル化部位に近接しているアミノ酸配列での変異は、得られる分子上に存在するグリコシル化特性に影響し、さらに活性を変化させる。
【００５３】
アミノ酸配列中の改変はまた、挿入および欠失の両方を包含する。従って、ホルモンの切断形態、例えば、Ｃ末端で、８５−９２位のいくつかあるいは全部のアミノ酸が欠失しているαサブユニットの変異体は、変異体に包含される。さらに、１−１０アミノ酸がＮ末端から欠失されたαサブユニットが包含される。本明細書に記載されているホルモンカルテットのいくつかの有用な変異体は、１９９３年１月５日に発行された米国特許第５，１７７，１９３号に記載されており、これは本明細書に参考として援用されている。その特許に示されているように、グリコシル化パターンは、関連部位の破壊、あるいは代替的に、タンパク質が生産される宿主の選択によって、改変され得る。
【００５４】
上記に説明されているように、一本鎖形態は、種々の設計変異タンパク質についての好都合な出発物質である。このような変異タンパク質は、改変あるいは除去される非重要（ｎｏｎ−ｃｒｉｔｉｃａｌ）領域を有する変異タンパク質を包含する。このような欠失および改変は完全なループを含み得、１０個より多いアミノ酸からなる配列が欠失あるいは改変され得る。しかし、一本鎖分子は、少なくともレセプター結合ドメインおよび／またはシグナル変換に関連する領域を保持しなければならない。
【００５５】
本明細書に記載されているホルモンカルテットの変異体についての重要な文献が存在し、この文献から、アゴニストおよびアンタゴニスト活性の両方を生じる多くの可能な変異体が調製され得ることが、明白である。このような変異体は、例えば、Ｃｈｅｎ，Ｆ．ら、Ｍｏｌｅｃ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ（１９９２）６：９１４−９１９；Ｙｏｏ，Ｊ．ら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ（１９９３）２６８：１３０３４−１３０４２；Ｙｏｏ，Ｊ．ら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ（１９９１）２６６：１７７４１−１７７４３；Ｐｕｅｔｔ，Ｄ．ら、Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｈｏｒｍｏｎｅｓ，Ｌｕｓｂａｄｅｒ，Ｊ．Ｗ．ら、ＥＤＳ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９４）１２２−１３４；Ｋｕｅｔｍａｎｎ，Ｈ．Ｔ．ら、（同書）１０３−１１７頁；Ｅｒｉｃｋｓｏｎ，Ｌ．Ｄ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ（１９９０）１２６：２５５５−２５６０；およびＢｉｅｌｉｎｓｋａ，Ｍ．ら、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ（１９９０）１１１：３３０ａ（抄録１８４４）に開示されている。
【００５６】
上記に記載のように、有効なアンタゴニストを構築する１つの方法は、糖タンパク質カルテットの同じかあるいは異なるメンバーの２つのβサブユニットを含む一本鎖分子を調製することである。これらの一本鎖形態の特に好ましい変異体は、１つ以上のシステイン結合が、典型的には、結合に関与する１つあるいは両方のシステインと中性アミノ酸とを置換することによって、欠失されるものを包含する。欠失され得る特に好ましいシステイン結合は、２６位と１１０位との間、および２３位と７２位との間の結合である。
【００５７】
さらに、ホルモンカルテットのβサブユニットは、キメラの両成分の生物学的機能、あるいは、一般的には、改変された生物学的機能のホルモンを提供するように、キメラ形態に構築され得ることが実証された。従って、ＦＳＨおよびＬＨ／ＣＧの両活性を示すキメラ分子は、Ｍｏｙｌｅ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ（１９９１）８８：７６０−７６４；Ｍｏｙｌｅ，Ｎａｔｕｒｅ（１９９４）３６８：２５１−２５５に記載のように構築され得る。これらの報文に開示されているように、ＦＳＨ−βの１０１−１０９位のアミノ酸とＣＧ−βサブユニット中の対応残基との置換により、ｈＣＧおよびＦＳＨの両活性を有するアナログが得られる。
【００５８】
βサブユニットのこれらのキメラ形態はまた、２つのβサブユニットをカップリングさせて１つの分子にする、一本鎖化合物において使用され得る。
【００５９】
グリコシル化パターンが定性的および定量的に活性に対して意味深い影響を有すると認識されているが、便宜上、用語 ＦＳＨ、ＬＨ、ＴＳＫおよびＣＧβサブユニットは、「αサブユニット」に対してのように、そのペプチドに特徴的なアミノ酸配列のことである。β鎖のみが言及されるときには、その用語は、例えば、ＦＳＨβであり、ヘテロダイマーが言及されるときには、簡単な用語「ＦＳＨ」が使用される。グリコシル化パターンが、例えば、組換え発現宿主あるいはグリコシル化部位での変異によっていかにして影響されるかということは、背景から明白である。特定のグリコシル化パターンを有する糖タンパク質の形態が注目される。
【００６０】
本明細書で使用されているように、「ペプチド」および「タンパク質」は、それらの間の長さの区別は恣意的であるので、互換的に使用される。
【００６１】
本発明の一本鎖形態では、α鎖および／またはβ鎖は、非重要領域に挿入されたＣＴＰ伸長を含み得る。
【００６２】
αサブユニットおよびβサブユニットの「非重要」領域は、生物活性（アゴニストおよびアンタゴニスト活性を含む）に必要とされない分子領域である。一般的には、これらの領域は結合部位、前駆体切断部位、および触媒部位から切り離される。適切な折り畳みの誘導、レセプターへの結合、触媒活性などに対して重要な領域は避けられるべきであり、同様に、タンパク質の三次元コンフォメーションを確保するために重要な領域は避けられるべきである。ダイマーの場合に重要であるいくつかの領域は、一本鎖によって課されるコンフォメーション上の制限がこれらの領域に対する必要性を取り除き得るので、一本鎖形態では非重要となることは、注目されるべきである。非重要領域の確認は、候補領域の欠失あるいは改変、および、所望の活性についての適切なアッセイの遂行によって、容易に完了される。改変が活性の損失を生じる領域は重要であり、改変が同じかあるいは同様の活性（アンタゴニスト活性を含む）を生じる領域は非重要であると考えられる。
【００６３】
「生物学的活性」によって、天然ホルモンの活性に対してアゴニストあるいはアンタゴニスト性である活性が意味されることが強調される。従って、アンタゴニストは、ホルモンの生理学的効果を直接提供し得ないが、特定の領域は、アンタゴニストとしての変異体の作用に対して重要である。
【００６４】
例えば、αサブユニットについては、３３−５９位がシグナル変換に必要であると考えられ、そしてカルボキシ末端の２０アミノ酸配列がシグナル変換／レセプター結合に必要とされる。βサブユニットとの組立てに重要な残基は、少なくとも３３−５８残基、特に３７−４０残基を有する。
【００６５】
非重要領域がＮ末端あるいはＣ末端に「近接する」場合、挿入は、末端の１０アミノ酸以内の任意の位置にあり、好ましくは５アミノ酸以内、そして最も好ましくは末端それ自身にある。
【００６６】
一般的に、「近接する」は、対象位置の１０アミノ酸以内、好ましくは５アミノ酸以内、そして最も好ましくは対象位置それ自身である位置を示すために使用される。従って、特定の変異体は、グリコシル化部位に「近接する」アミノ酸の置換を含み得る。ここでの定義はこれに関連する。さらに、αサブユニットおよびβサブユニットは、それらのＮ末端あるいはＣ末端に「近接する」位置で、互いに連結され得る。
【００６７】
本明細書で使用されているように、「ＣＴＰユニット」とは、アミノ酸１１２−１１８位からＣ末端の残基１４５位にまで、あるいはその部分にまで広がる、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモンβサブユニットのカルボキシ末端に認められるアミノ酸配列のことである。従って、各「完全」ＣＴＰユニットは、ＣＴＰのＮ末端に依存して、２８−３４個のアミノ酸を含有する。１１２−１４５位の天然配列は図２に示されている。
【００６８】
「部分」ＣＴＰユニットによって、１１２−１１８位から１４５位までの間を含めて存在するが、最も短い可能な「完全」ＣＴＰユニットから（すなわち、１１８位−１４５位から）少なくとも１つのアミノ酸欠失されたアミノ酸配列が意味される。本発明に包含される「部分」ＣＴＰユニットは、アゴニスト活性が所望される場合、好ましくは、少なくとも１つのＯ−グリコシル化部位を含有する。ホルモンのいくつかの非グリコシル化形態はアンタゴニストであり、このように有用である。そのＣＴＰユニットは、１２１位（部位１）、１２７位（部位２）、１３２位（部位３）、および１３８位（部位４）のセリン残基に、このような４つの部位を含む。本発明のアゴニストに有用なＣＴＰの部分形態は、天然ＣＴＰ配列に見られる順序に整列された、１つ以上のこのような部位を含有する。従って、本発明のアゴニストに用いられる「部分」ＣＴＰユニットは、４つの全グリコシル化部位；部位１、２、および３；部位１、２、および４；部位１、３、および４；部位２、３、および４；あるいは単に部位１および２；１および３；１および４；２および３；２および４；あるいは３および４を含有し得るか、または部位１、２、３、あるいは４の１つのみを含有し得る。
【００６９】
「縦並びの」挿入部あるいは伸長部によって、挿入部または伸長部が少なくとも２つの「ＣＴＰユニット」を含有することが意味される。各ＣＴＰユニットは、完全あるいはフラグメントであり得、天然あるいは変異体であり得る。縦並びの伸長部あるいは挿入部中の全ＣＴＰユニットは、互いに同じであり得るかあるいは異なり得る。従って、例えば、縦並びの伸長部あるいは挿入部は、一般的に、部分−完全；部分−部分；部分−完全−部分；完全−完全−部分などであり得、そこでは、注目される部分あるいは完全ＣＴＰユニットの各々は、独立して、変異体あるいは天然配列であり得る。
【００７０】
「リンカー部分」は、ヘテロダイマーのメンバーとして、他になければ同じα鎖およびβ鎖によって示される活性、あるいはその活性をアゴニストからアンタゴニスト活性に転換する活性によって妨害されずに、α配列とβ配列とを接続する部分である。活性レベルは理にかなった範囲内で変化し得るが、リンカーは、実質的なアゴニストおよび実質的なアンタゴニストの両活性の一本鎖形態を損なわせるようには存在し得ない。一本鎖形態は、生産培地から回収されるとき一本鎖形態に維持され、ヘテロダイマー、すなわちその化合物を形成する要素のホルモン活性に対して適切な活性を示さなければならない。
【００７１】
変異体
ホルモンサブユニットおよびＣＴＰユニットは、天然ホルモンあるいはＣＴＰ配列に正確に対応し得るか、あるいは変異体であり得る。変異体の性質は上記で定義されている。このような変異体では、天然配列に含有されるアミノ酸の１−１０個、好ましくは１−８個、そして最も好ましくは１−５個が、その位置の天然アミノ酸と比較して異なるアミノ酸によって置換されているか、あるいは、１−１０個、より好ましくは１−８個、そして最も好ましくは１−５個のアミノ酸が単に欠失されているか、あるいはこれらの組み合わせである。上記に示されているように、一本鎖形態の非重要領域が、特に非重要「ループ」の存在を検出することを通して同定されるとき、欠失あるいは置換によって改変されたアミノ酸の数は、関連の非重要領域中のアミノ酸配列の長さに依存して、２０あるいは３０、または任意の数に増加され得る。無論のこと、１つを超える非重要領域中の欠失あるいは置換により、影響を及ぼされる一本鎖形態のさらに多くのアミノ酸を生じさせ、置換および欠失戦略は組合せて使用され得る。このような置換あるいは欠失は累積的に行われても、アゴニストあるいはアンタゴニスト活性は実質的には除去されない。天然アミノ酸の保存アナログによる置換が好ましい。
【００７２】
「保存アナログ」は、従来の意味で、置換される残基が、置換がなされる残基と同じ一般的なアミノ酸カテゴリーにあるアナログである。アミノ酸は、当該分野で理解されているように、例えば、Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．ら、Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（１９７２）５：８９−９９によって、このようなグループに分類された。一般的には、酸性アミノ酸は、１つのグループに帰属し、塩基性アミノ酸はもう１つのグループに、中性の親水性アミノ酸がもう１つのグループに、のように帰属する。
【００７３】
より詳細には、アミノ酸残基は一般的に、以下のように４つの主要サブクラスに分類され得る：
酸性：残基は、生理的ｐＨでのＨイオンの損失によって負電荷を有し、その残基は、ペプチドが生理的ｐＨでの水性媒体中に存在するとき、水溶液によって引き付けられ、それが含有されるペプチドのコンフォメーション中の表面位置に探しだされる。
【００７４】
塩基性：残基は、生理的ｐＨでのＨイオンとの会合によって正電荷を有し、その残基は、ペプチドが生理的ｐＨでの水性媒体中に存在するとき、水溶液によって引き付けられ、それが含有されるペプチドのコンフォメーション中の表面位置に探しだされる。
【００７５】
中性／非極性：残基は、生理的ｐＨでは帯電されておらず、その残基は、ペプチドが生理的ｐＨでの水性媒体中に存在するとき、水溶液によって反発され、それが含有されるペプチドのコンフォメーション中の内部位置に探しだされる。これらの残基はまた本明細書では「疎水性」と呼ばれる。
【００７６】
中性／極性：残基は、生理的ｐＨでは帯電されておらず、その残基は、ペプチドが生理的ｐＨでの水性媒体中に存在するとき、水溶液によって引き付けられ、それが含有されるペプチドのコンフォメーション中の外側位置に探しだされる。
【００７７】
無論のこと、個別の残基分子の統計学的収集では、いくつかの分子は帯電されており、いくつかは帯電されておらず、大なり小なりの程度で、水性媒体の引き付けあるいは反発が存在する。「帯電された」の定義に適するには、個別分子の有意なパーセント（少なくとも約２５％）が生理的ｐＨで帯電されている。極性あるいは非極性としての分類に必要な引き付けあるいは反発の程度は任意であり、従って、本発明によって特に意図されるアミノ酸は、いずれかに分類された。特に命名されていないほとんどのアミノ酸は、既知作用に基づいて分類され得る。
【００７８】
アミノ酸残基は、環状あるいは非環状、および芳香族性あるいは非芳香族性の、残基の側鎖置換基に関する自明の分類として、ならびに、大小について、さらにサブクラスに分類され得る。カルボキシルの炭素以外に、全部で４以下の炭素原子を含有するとき、その残基は小さいと考えられる。小さい残基は無論のこと、非芳香族性である。
【００７９】
天然に存在するタンパク質アミノ酸について、前記のスキームに従ったサブクラス分類は、以下の通りである：
酸性：アスパラギン酸およびグルタミン酸；
塩基性／非環状：アルギニン、リジン；
塩基性／環状：ヒスチジン；
中性／極性／小：グリシン、セリン、システイン；
中性／非極性／小：アラニン；
中性／極性／大／非芳香族性：トレオニン、アスパラギン、グルタミン；
中性／極性／大／芳香族性：チロシン；
中性／非極性／大／非芳香族性：バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン；
中性／非極性／大／芳香族性：フェニルアラニン、およびトリプトファン。
【００８０】
遺伝子コードされる二級アミノ酸プロリンは、専門的には中性／非極性／大／環状および非芳香族性のグループ内であるが、ペプチド鎖の二次コンフォメーションに対する既知効果による特別の例であり、従って、この定義されたグループに包含される。
【００８１】
本発明の一本鎖タンパク質が組換え法で構築されるとき、それらは、遺伝子コードアミノ酸置換のみを含有するが、しかし、任意の部分が、標準法、例えば、固相ペプチド合成法によって合成され、残りのタンパク質に、例えば、酵素的に、連結されるときには、アミノイソブチル酸（Ａｉｂ）、フェニルグリシン（Ｐｈｇ）などのような非遺伝子コードアミノ酸もまた、それらの類似結合対と置換され得る。
【００８２】
これらの非コードアミノ酸はまた、例えば、β−アラニン（β−Ａｌａ）、あるいは、３−アミノプロピオン酸、４−アミノブチル酸のようなその他のωアミノ酸、サルコシン（Ｓａｒ）、オルニチン（Ｏｒｎ）、シトルリン（Ｃｉｔ）、ｔ−ブチルアラニン（ｔ−ＢｕＡ）、ｔ−ブチルグリシン（ｔ−ＢｕＧ）、Ｎ−メチルイソロイシン（Ｎ−ＭｅＩｌｅ）、およびシクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、システイン酸（Ｃｙａ）、２−ナフチルアラニン（２−Ｎａｌ）；１，２，３，４，−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸（Ｔｉｃ）；メルカプトバレリン酸（Ｍｖｌ）；β−２−チエニルアラニン（Ｔｈｉ）；およびメチオニンスルホキシド（ＭＳＯ）を包含する。これらもまた都合よく特定のカテゴリーに当てはまる。
【００８３】
上記の定義に基づくと、
Ｓａｒおよびβ−ＡｌａおよびＡｉｂは、中性／非極性／小であり；
ｔ−ＢｕＡ、ｔ−ＢｕＧ、Ｎ−ＭｅＩｌｅ、Ｎｌｅ、Ｍｖｌ、およびＣｈａは、中性／非極性／大／非芳香族性であり；
Ｏｒｎは、塩基性／非環状であり；
Ｃｙａは、酸性であり；
Ｃｉｔ、アセチルＬｙｓ、およびＭＳＯは、中性／極性／大／非芳香族性であり；そして、
Ｐｈｇ、Ｎａｌ、Ｔｈｉ、およびＴｉｃは、中性／非極性／大／芳香族性である。
【００８４】
種々のωアミノ酸は、大きさによって、中性／非極性／小（β−Ａｌａ、すなわち、３−アミノプロピオン酸、４−アミノブチル酸）あるいは大（その他全て）に分類される。
【００８５】
従って、遺伝子にコードされるアミノ酸以外のアミノ酸置換もまた、本発明の範囲内のペプチド化合物に包含され得、それらの構造に従って、この一般的なスキームに分類され得る。
【００８６】
一本鎖ホルモンの好ましい実施態様
本発明の一本鎖ホルモンは、組換え方法によって、最も効率的および経済的に生産される。従って、そのような形態のα鎖およびβ鎖、ＣＴＰユニット、および遺伝子コードアミノ酸のみを含むその他のリンカー部分が好ましい。しかし、上記のように、合成ペプチド法あるいはその他の有機合成法によって、一本鎖ホルモンの少なくとも部分を構築することは可能であり、それゆえに、非遺伝子コードアミノ酸を含む変異体もまた、本発明の範囲内である。
【００８７】
本発明の一本鎖ホルモンの最も好ましい実施態様では、βサブユニットのＣ末端は、必要に応じてリンカーを介して、成熟αサブユニットのＮ末端に共有結合で連結される。αサブユニットのＣ末端がβサブユニットのＮ末端に連結された形態もまた有用であるが、その形態は、関連のレセプターのアンタゴニストあるいはアゴニストとしてやや劣る活性を有し得る。連結は、１つのサブユニットのＣ末端アミノ酸が他方のＮ末端に、ペプチド結合を介して直接連結される直接ペプチド連結であり得るが、しかし、多くの例においては、２つの末端間にリンカー部分を含むことが好ましい。多くの例では、リンカー部分は、２つの鎖間に少なくとも１つのβターンを提供する。それゆえに、リンカー内のプロリン残基の存在は、有利であり得る。
【００８８】
上記のように、いずれの場合もリンカーユニットを介して、α鎖のＮ末端がβ鎖のＮ末端にカップリングされ得るか、あるいは、α鎖のＣ末端がβ鎖のＣ末端にカップリングされ得、同様の組合せが、２つのαサブユニットあるいは２つのβサブユニットを含む一本鎖形態に包含される。
【００８９】
一本鎖形態を含むサブユニット末端間の連結の考察においては、１つ以上の末端が、上記のような置換あるいは欠失によって改変され得ることが理解されるべきである。
【００９０】
２つのβサブユニットを含む一本鎖化合物の好ましい実施態様は、１つのユニットのＣ末端が、必要に応じてリンカー（好ましくはペプチドリンカー）を介して、他方のＮ末端に連結される化合物である。上記のように、２つのβ鎖のＮ末端間連結、あるいは２つのβ鎖のＣ末端間連結もまた可能であり、無論のこと、この場合にはリンカーが必要である。
【００９１】
両一本鎖ヘテロダイマーの頭−頭、尾−尾、および頭−尾の配置、および一本鎖２βサブユニット形態を記載してきたが、２つのサブユニット間の連結は、各メンバーのＮ末端あるいはＣ末端のまさにその位置ではなく、それらに近接する位置にもまた生じ得る。
【００９２】
実施態様の特に好ましい１つのセットでは、連結は頭−尾であり、そのリンカー部分は、１つ以上のＣＴＰユニットおよび／またはそれらの変異体あるいは切断形態を含む。このようなリンカー部分に使用されるＣＴＰユニットの好ましい形態は下記に記載されている。
【００９３】
さらに、リンカー部分は、共有結合により、好ましくは放出可能に、リンカー部分に結合された薬剤を含み得る。薬剤のリンカー部分へのカップリング方法、およびその放出を提供する方法は慣例的である。
【００９４】
リンカー部分でのそれらの存在に加えて、ＣＴＰならびにその変異体および切断はまた、一本鎖ホルモンを構成するサブユニットの任意の非重要領域に含まれ得る。これらの含有物の性質および位置は、本明細書に援用されている親出願（ｐａｒｅｎｔ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）に詳細に記載されている。
【００９５】
ＣＴＰユニットは、リンカー部分中の好ましい含有物であるが、リンカーは、αサブユニットとβサブユニットとの間に適切な空間関係を提供する任意の適切な共有結合物質であり得ることが理解される。従って、頭−尾配置には、リンカーは、一般的に、溶液中で適当な空間およびコンフォメーション（ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ）を提供するために適切な親水性／疎水性比率を有する、任意数の、しかし典型的には１００個未満、より好ましくは５０個未満のアミノ酸を含有するペプチドであり得る。一般的に、リンカーは、周囲溶液中に存在して、αサブユニットおよびβサブユニット、あるいは２つのβサブユニット間の相互作用の妨げにならないように、結局は親水性である。リンカーは、典型的にはプロリン残基によって提供されるβターンを含むことが好ましい。上記の正確な特性を有する、ペプチドリンカーを含む、任意の適切なポリマーが使用され得る。
【００９６】
本発明の範囲内に包含されない１つの特定のリンカー部分は、下流サブユニットのすぐ上流にシグナルペプチドを含むリンカー部分である。
【００９７】
本発明の一本鎖ホルモンの特に好ましい実施態様は、下記を包含する：
【００９８】
【化１】
【００９９】
サブユニットのヒト形態もまた特に好ましい。上記の構築物では、「ＣＴＰ」は、下記の章にさらに説明するように、ＣＴＰあるいはその変異体または切断型のことである。
【０１００】
ＣＴＰユニットの好ましい実施態様
本発明のＣＴＰユニットに使用される記号は、以下の通りである：完全ＣＴＰユニットの部分については、部分に含まれる位置は、本願の図２に記されている番号によって示される。置換が存在するときは、置換されたアミノ酸は、その位置を示す上付き記号と共に示される。従って、例えば、ＣＴＰ（１２０−１４３）は、１２０位から１４３位に及ぶＣＴＰ部分を表し、ＣＴＰ（１２０−１３０；１３６−１４３）は、天然配列の１１８位−１１９位、１３１位−１３５位、および１４４位−１４５位を欠く融合配列を表す。ＣＴＰ（Ａｒｇ１２２）は、位置１２２のリジンがアルギニンによって置換された変異体を示し、ＣＴＰ（Ｉｌｅ１３４）は、位置１３４がイソロイシンで置換された変異体を示す。ＣＴＰ（Ｖａｌ１２８Ｖａｌ１４３）は、２つの置換がなされており、１つは１２８位のロイシンであり、もう１つは１４２位のイソロイシンでなされた変異体を表す。ＣＴＰ（１２０−１４３；Ｉｌｅ１２８Ａｌａ１３０）は、２つの示されている置換がなされたＣＴＰユニットの関連した部分を表す。
【０１０１】
さらに、ＣＴＰ変異体の好ましいものは、１つ以上のＯ−結合グリコシル化部位が改変あるいは欠失されたものである。グリコシル化を阻むために部位を変異する特に好ましい方法は、これらの部位のセリン残基のアラニン残基への置換である。
【０１０２】
以下の式のＣＴＰユニットが特に好ましい：
【０１０３】
【化２】
【０１０４】
。
【０１０５】
αおよびβサブユニットの好ましい実施態様
無論のこと、一本鎖形態でのαおよびβサブユニットの天然形態は、好ましい実施態様内である。しかし、特定の変異体もまた好ましい。
【０１０６】
特に、５２位のＮ−結合グリコシル化部位が、この部位あるいはその近接でのアミノ酸置換によって除去あるいは改変されているαサブユニットの変異体が、アンタゴニスト活性に好ましい。７８位のグリコシル化部位での同様の改変もまた好ましい。８５−９２位での１つ以上のアミノ酸欠失もまた、αサブユニットを含むホルモン活性の性質に影響し、これらの位置でのアミノ酸置換あるいは欠失もまた、好ましい実施態様である。
【０１０７】
同様に、β鎖中のＮ−結合グリコシル化部位は、グリコシル化を排除するように好都合に改変され得、従って、β鎖のアゴニストあるいはアンタゴニスト活性に影響し得る。ＣＴＰが、ＣＧにおけるように天然に、あるいはリンカーとして存在させることによって存在するとき、この部分のＯ−結合グリコシル化部位もまた改変され得る。
【０１０８】
改変あるいは欠失したグリコシル化部位を含む特定の変異体は、Ｙｏｏ，Ｊ．ら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ（１９９３）２６８：１３０３４−１３０４２；Ｙｏｏ，Ｊ．ら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ（１９９１）２６６：１７７４１−１７７４３；およびＢｉｅｌｉｎｓｋａ，Ｍ．ら、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ（１９９０）１１１：３３０ａ（全て上記に記載）、およびＭａｔｚｕｋ，Ｍ．Ｍ．ら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ（１９８９）２６４：２４０９−２４１４；Ｋｅｅｎｅ，Ｊ．Ｌ．ら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ（１９８９）２６４：４７６９−４７７５；およびＫｅｅｎｅ，Ｊ，Ｌ，ら、Ｍｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ（１９８９）３：２０１１−２０１７に記載されている。
【０１０９】
グリコシル化部位それ自身のみが直接改変され得るばかりではなく、これらの部位の近接位置もまた、変異体のグリコシル化状態が影響を受けるように優位に改変される。αサブユニットについては、例えば、５０位−６０位間のアミノ酸が置換されることが好ましく（保存および非保存の両置換を含む）、特に、Ａｓｎ５２でのグリコシル化部位に近接するという理由から、５１位、５３位、および５５位での置換が好ましい。
【０１１０】
９１位のリジンがメチオニンあるいはグルタミン酸に転換されたαサブユニットの変異体もまた好ましい。
【０１１１】
変異体は個別サブユニットのバリエーションについて上記で考察してきたが、ダイマーの一本鎖形態が、改変に好機を提供することが想起される。特に、ダイマーの折り畳みに重要な領域は、一本鎖分子の正確なコンフォメーションに重要ではあり得ず、これらの領域は、ダイマー形態の個別メンバーの観点からは上記に記載されていないが、一本鎖形態のバリエーションを可能にする。さらに、一本鎖形態は、改変および／または欠失が上記のような生物学的活性に影響しない非重要領域に関して、劇的に改変され得る。
【０１１２】
適切な薬剤
リンカー部分に含まれ得る適切な薬剤は、インスリン様成長因子；上皮成長因子；酸性および塩基性線維芽細胞成長因子；血小板由来成長因子；種々のコロニー刺激因子（例えば、顆粒球ＣＳＦ、マクロファージＣＳＦなど）；ならびに種々のサイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−３、および過多のさらなるインターロイキンタンパク質）；種々のインターフェロン；腫瘍壊死因子などのような、ペプチドあるいはタンパク質を包含する。ペプチドあるいはタンパク質ベースの薬剤が一本鎖に含まれ得、完全な構築物が、１つの遺伝子の組換え発現によって容易に生産され得るという利点を有する。さらに、抗生物質、抗炎症剤、トキシンなどのような小分子薬剤が、使用され得る。
【０１１３】
一般的に、リンカー部分内に含まれる薬剤は、ホルモンが通常結合するレセプターの近隣で作用することが望まれる薬剤である。薬剤がリンカー内の含有から放出されるための適切な供給は、例えば、以下の調製方法の題の章にさらに詳細に記載されているような、酵素触媒による溶解用の部位を含有させることによって、提供される。
【０１１４】
その他の改変
本発明の一本鎖タンパク質は、リン酸化、グリコシル化、通常のグリコシル化形態の脱グリコシル化、アミノ酸側鎖の改変（例えば、プロリンのヒドロキシプロリンへの転換）、および、一般的に生じることが認められている翻訳後の事象に類似した同様の改変のような、アミノ酸配列を誘導体化すると一般的に理解されている方法で、さらに複合体化あるいは誘導体化され得る。
【０１１５】
本発明のホルモンのグリコシル化状態は、特に重要である。ホルモンは、原核宿主で生産するか、あるいはサブユニットおよび／または存在し得る任意のＣＴＰユニットに通常存在するグリコシル化部位を変異させることによって、非グリコシル化形態で調製され得る。ホルモンの非グリコシル化形態および部分的にグリコシル化された形態は、グリコシル化部位を操作することによって調製され得る。通常は、無論のこと、グリコシル化形態もまた、本発明の範囲内に包含される。
【０１１６】
当該分野で公知のように、本発明の一本鎖タンパク質はまた、所望の適応に応じて、標識、キャリア、固体支持体などにカップリングされ得る。標識形態は、それらの代謝過程の追跡に使用され得る。この目的のための適切な標識は、特に、ヨウ素１３１、テクネチウム９９、インジウム１１１などのラジオアイソトープ標識を包含する。標識はまた、アッセイ系中の一本鎖タンパク質の検出を仲介するために使用され得る。この場合、ラジオアイソトープはまた、酵素標識、蛍光標識、発色標識などと同様に使用され得る。このような標識の使用は、それらが標的因子レセプターリガンドであるので、これらのタンパク質に対して特に有用である。
【０１１７】
本発明のタンパク質はまた、これらの新規な改変形態と特異的に免疫反応する抗体の調製において、それらの免疫原性を増強するために、キャリアにカップリングされ得る。この目的のための適切なキャリアは、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）およびジフテリアトキソイドなどを包含する。二官能性リンカーの使用を含む、本発明の改変ペプチドをキャリアに連結させるための標準的なカップリング方法が、使用され得る。
【０１１８】
その他の方法とともに、同様の結合方法が、本発明のタンパク質を固体支持体にカップリングさせるために使用され得る。カップリングされると、これらのタンパク質は、次に、特異反応が示される所望の成分を分離するためのアフィニティー試薬として使用され得る。
【０１１９】
調製方法
本発明のタンパク質を構築するための方法は、当該分野で周知である。上記記載のように、遺伝子コードアミノ酸のみが含まれ、一本鎖が頭−尾配置であるときは、現在最も実用的なアプローチは、所望のタンパク質をコードするＤＮＡの発現によってこれらの物質を組換え法により合成することである。変異体を含む一本鎖形態をコードするヌクレオチド配列を含有するＤＮＡは、天然配列から調製され得る。部位特異的変異誘発、付加配列の連結、ＰＣＲ、および適切な発現系の構築のための方法は、これまでに当該分野で周知である。所望のタンパク質をコードするＤＮＡの部分あるいは全部は、好ましくは連結を容易にするための制限部位を含むように、標準的な固相法によって構築され得る。含まれるコーディング配列の転写および翻訳のための適切な制御要素が、ＤＮＡコーディング配列に提供され得る。周知のように、発現系は、広範囲の宿主（細菌のような原核宿主および酵母、植物細胞、昆虫細胞、哺乳類細胞、鳥類細胞などのような真核宿主を含む）に適したものが、今では入手可能である。
【０１２０】
宿主の選択は、特に翻訳後の事象（最も特にはグリコシル化を含む）に対してである。グリコシル化の位置は、分子内のグリコシル化部位の性質によって、ほとんどの場合制御されるが、しかし、この部位を占める糖の性質は、主として宿主の性質によって制御される。従って、本発明のホルモンの特性の微調整は、宿主の適切な選択によって達成され得る。
【０１２１】
αサブユニット部分の遺伝子の特に好ましい形態（αサブユニットは改変されるか、あるいは改変されない）は、「ミニ遺伝子」構築物である。
【０１２２】
本明細書で使用されているように、αサブユニット「ミニ遺伝子」は、ｐＭ２／ＣＧαあるいはｐＭ２／αの構築物の表現で、Ｍａｔｚｕｋ，Ｍ．Ｍ．ら、Ｍｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ（１９８８）２：９５−１００に開示されている遺伝子構築物のことである。この「ミニ遺伝子」は、エキソン３とエキソン４との間のイントロン配列のみの保持によって特徴づけられ、全上流イントロンは欠失している。記載されている特定の構築物では、エキソン２由来のＮ末端コーディング配列およびエキソン３の部分は、ｃＤＮＡから供給され、ＸｂａＩ制限部位を介して、エキソンＩおよびＩＩ間、ならびにエキソンＩＩおよびＩＩＩ間のイントロンが存在しないように、エキソン３のコーディング配列に直接連結される。しかし、エキソンＩＩＩおよびＩＶ間のイントロン、ならびにコーディング配列の３’のシグナルは保持される。得られたミニ遺伝子は、ＢａｍＨＩ／ＢｇｌＩＩセグメントとして好都合に挿入され得る。適切なミニ遺伝子のその他の構築方法は、無論のこと可能であり、定義は、コーディング配列がＸｂａＩ部位を介して連結される特定の構築に制限されない。しかし、これは遺伝子構築の好都合な手段であり、遺伝子の合成調製あるいは部分合成調製のような、その他のアプローチに対する特定の利点はない。定義は、エキソンＩＩＩおよびＩＶ間のイントロン、あるいは任意のその他のイントロンを保持し、好ましくはその他のイントロンを保持しない、αサブユニットに対するコーディング配列を包含する。
【０１２３】
組換え生産については、発現系を用いる改変宿主細胞が使用され、所望のタンパク質を生産するために培養される。これらの用語は、本明細書では以下のように使用される：
「改変された」組換え宿主細胞、すなわち、本発明の組換え発現系を「含むように改変された」細胞とは、それを導入するために、トランスフェクション、ウイルス感染などを含む任意の都合のよい様式によって、この発現系を含むように改変された宿主細胞のことである。「改変された」とは、この発現系を含有する細胞のことであり、系は染色体中に組み込まれるか、あるいは染色体外性である。「改変された」細胞は、発現系の含有に関して安定であり得るか、あるいは安定であり得ない。簡単には、本発明の発現系を有する「改変された」組換え宿主細胞とは、天然では含まないときに、この発現系を含ませる操作の結果として、この取り込み様式に関係なく、この発現系を含む細胞のことである。
【０１２４】
「発現系」とは、発現されるべきコーディングヌクレオチド配列、および、コーディング配列の発現に影響を及ぼすのに必要なこれらが伴う制御配列を含むＤＮＡ分子のことである。典型的には、これらの制御は、プロモーター、終止調節配列、および、いくつかの場合には、オペレーターあるいは発現を調節するその他の機構を含む。制御配列は、特定の標的組換え宿主細胞で機能的であるように設計され、従って、宿主細胞が、構築された発現系で制御配列に適するように選択されなければならない。
【０１２５】
生産されたタンパク質の分泌が所望される場合、シグナルペプチドをコードする付加ヌクレオチド配列もまた、プレタンパク質を生産するために所望の一本鎖ホルモンに作動可能に連結される、シグナルペプチドを産生するように含まれる。分泌に際して、シグナルペプチドは、成熟一本鎖ホルモンを放出するために切断される。
【０１２６】
本明細書で使用されているように、「細胞」、「細胞培養物」および「細胞系」は、意味の微妙な差に特に注意を払うことなく、互換的に使用される。それらの間の区別が重要な場合、文脈から明白である。いずれかが意味される場合、全てが包含されることが意図される。
【０１２７】
生産されたタンパク質は、細胞内で生産されるときは細胞溶解物から、あるいは、分泌されるときは培地から回収され得る。細胞培養物から組換えタンパク質を回収する方法は、当該分野で周知であり、これらのタンパク質は、クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、選択沈降などのような公知の方法によって、精製され得る。
【０１２８】
本発明のホルモンの全体あるいは部分は、当該分野で公知のペプチド合成法によって直接合成され得る。合成された部分は連結され得、リンカー部分に含まれる任意の薬剤のための放出部位は、標準的化学手段によって導入され得る。遺伝子によってコードされないアミノ酸を含有するこれらの実施態様および頭−頭あるいは尾−尾の配置が用いられるそれらの実施態様については、無論のこと、合成はタンパク質レベルで少なくとも部分的である。天然Ｎ末端あるいは天然Ｎ末端近接位置での頭と頭との接続は、ジカルボン酸誘導体のような、アミノ基と反応する官能基を含有するリンカーを介してもたらされる。Ｃ末端あるいはＣ末端近接位置での尾−尾配置は、ジアミン、ジオール、あるいはそれらの組合せであるリンカーを介してもたらされる。
【０１２９】
抗体
本発明のタンパク質は、これらの新規化合物と特異的に免疫反応する抗体を生成するために使用され得る。これらの抗体は、種々の診断および治療適用に有用である。例えば、本発明の一本鎖形態が、ヒトあるいは脊椎動物で治療的に使用されるときは、薬剤レベルは、従来のイムノアッセイ法を用いて、これらの抗体を使用してモニターされ得る。さらに、これらの一本鎖形態によって誘起された抗体のいくつかは、ヘテロダイマーと交差反応するので、ヘテロダイマーの天然に存在するレベルを診断するために使用され得る。
【０１３０】
抗体は、ウサギ、マウス、ヒツジ、あるいはラットのような哺乳動物での標準免疫プロトコールによって一般的に調製され、そして抗体は、十分な免疫を確実にするためにポリクローナル抗血清として力価測定される。次に、ポリクローナル抗血清は、例えば、イムノアッセイでの使用のために、回収される。宿主からの抗体分泌細胞、例えば、脾細胞あるいは末梢血白血球は、公知の方法によって不死化され、本発明のタンパク質に免疫特異性であるモノクローナル抗体の産生のためにスクリーニングされ得る。
【０１３１】
「タンパク質に免疫特異性の」によって、親和性あるいは非親和性を決定すると考えられる一般パラメーター内では、一本鎖タンパク質に免疫反応するが、ヘテロダイマー自身には免疫反応しない抗体が意味される。特異性とは、相対的な用語であって、１００倍以上の免疫反応性の差異のような、任意限定が選択され得ることは、理解される。従って、本発明内に包含される免疫特異抗体は、一本鎖タンパク質に対し対応のヘテロダイマーに対するより少なくとも１００倍を超える反応性である。
【０１３２】
処方
本発明のタンパク質は、一本鎖形態に対応するヘテロダイマーについて公知である方法と同様の方法によって、処方および投与され得る。従って、処方および投与方法は、使用される特定のホルモンに従って変化される。しかし、用量レベルおよび投与頻度は、特にCTPユニットが、その存在に起因して延長される生物学的半減期を考慮して存在するときには、ヘテロダイマーに比較して変化され得る。
【０１３３】
本発明のタンパク質の処方は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、最新版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｅａｓｔｏｎ、 ＰＡ．中に見出されるような、タンパク質またはペプチド薬剤に典型的な処方である。一般的に、タンパク質は、注射、特に静脈内、筋肉内、皮下、あるいは腹腔内注射により、あるいは経粘膜あるいは経皮送達のための処方を用いて、投与される。これらの処方物は一般的に、界面活性剤あるいは浸透剤（例えば、胆汁酸塩、フシジン酸など）を含有する。これらの処方物はエアロゾルあるいは坐薬、あるいは経皮投与の場合には、皮膚パッチの形態で投与され得る。
【０１３４】
処方物が、本発明のペプチドを消化器系での分解から保護すれば、経口投与もまた可能である。
【０１３５】
投与レジメおよび処方の最適化は、当該分野での規定様式および一般的に実施されているように実行される。
【０１３６】
使用方法
本発明の一本鎖ペプチドは、多様に使用され得、最も確実にはホルモンのヘテロダイマー形態の置換基として使用され得る。従って、ヘテロダイマーと同様に、本発明の一本鎖ホルモンのアゴニスト形態は、ヒトおよび動物の両方において、インビトロ授精法の助成のような不妊症治療、および天然ホルモンに関連するその他の治療法に使用され得る。
【０１３７】
一本鎖ホルモンはまた、ヘテロダイマーと同様の様式で、試薬として有用である。
【０１３８】
さらに、本発明の一本鎖ホルモンは、生物学的試料中の天然タンパク質に関連する抗体の存在あるいは非存在を検出するための診断手段として使用される。それらはまた、様々な試料中の、これらのホルモンレベルを評価するためのアッセイキット中のコントロール試薬として有用である。ホルモン自身のレベル、あるいはそれらに対して誘起された抗体のレベルを評価するプロトコールは、当該分野で周知の標準的なイムノアッセイプロトコールである。種々の競合および直接アッセイ法が、ラジオアイソトープ標識、蛍光標識、酵素標識などを含む様々な標識方法を伴って、使用され得る。
【０１３９】
本発明の一本鎖ホルモンはまた、天然ホルモンが結合するレセプターの検出および精製に有用である。従って、本発明の一本鎖ホルモンは、固体支持体にカップリングされ、レセプターあるいは抗ホルモン抗体のアフィニティークロマトグラフ調製に使用され得る。得られたレセプターは、治療および試薬候補物のスクリーニイングテストで、候補薬剤に対するホルモン活性を評価するのに、それ自体が有用である。
【０１４０】
最後に、本発明の一本鎖ホルモンと独特に反応する抗体は、これらの物質の単離および次の調製のための、精製手段として使用され得る。それらもまた、薬剤として投与された一本鎖ホルモンのレベルをモニターするのに使用され得る。
【０１４１】
以下の実施例は、本発明を例証することを意図するが、限定することは意図しない。
【実施例】
【０１４２】
実施例１：CGβ-αをコードするDNAの調製
図１は、発現ベクター用の挿入物の構築を示し、そこではヒトＣＧのβ鎖のＣ末端は、成熟ヒトαサブユニットのＮ末端に連結される。
【０１４３】
図１に示されているように、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、ＣＧβのエキソン３とαサブユニットのエキソン２との間で２つのサブユニットを融合するために使用され、ＣＧβのカルボキシ末端アミノ酸のコドンは、αサブユニットのＮ末端アミノ酸のコドンに、読み取り枠で直接融合される。これは、ハイブリッドプライマーを使用してＣＧβのエキソン３を含有するフラグメントを増幅することにより完了され、そのハイブリッドプライマーは、αサブユニットのＮ末端配列をコードする「尾」を有する。従って、得られた増幅フラグメントは、ヒトＣＧαをコードするエキソン２の部分を含有する。
【０１４４】
独立して、ＣＧβのＣ末端に対応するコドンと融合されたαサブユニットのＮ末端配列をコードするハイブリッドプライマーは、αミニ遺伝子を増幅するためのプライマーの１つとして使用される。各々が、もう一方のサブユニットをコードする重複部分を含有する２つの増幅フラグメントが、ＳａｌＩ挿入物を得るために、完全な配列の広がりを覆う２つのさらなるプライマーで、ともに増幅される。
【０１４５】
より詳細には、反応Ｉは、ＣＧβのエキソン３、および成熟αサブユニットの最初の４アミノ酸、およびコーディング配列の５’−方向にＳａｌＩ部位を含有するフラグメントの調製を示す。それは、Ｍａｔｚｕｋ，Ｍ．Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９８７）８４：６３５４−６３５８；Ｐｏｌｉｃａｓｔｒｏ，Ｐ．ら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ（１９８３）２５８：１１４９２−１１４９９に記載されている、ＣＧβゲノム配列の部分を増幅することによって得られる。
【０１４６】
プライマー１は、ＳａｌＩ部位を提供し、そして下記の配列を有する：
【０１４７】
【化３】
【０１４８】
もう一方のプライマーであるプライマー２は、αＮ末端配列の４コドンおよびＣＧβのＣ末端配列の５コドンに相補的であり、そして下記の配列を有する：
【０１４９】
【化４】
【０１５０】
従って、反応Ｉの産物である得られた増幅セグメントは、融合コーディング領域の５’−方向にＳａｌＩ部位を有する。
【０１５１】
反応ＩＩでは、類似の融合されたコーディング領域が、上記のαミニ遺伝子から得られる。プライマー３は、βサブユニットの４コドンおよびαの５コドンを含有すハイブリッドプライマーであり、そして下記の配列を有する：
【０１５２】
【化５】
【０１５３】
プライマー４は、ＳａｌＩ部位を含有し、αエキソン４の伸長に相補的である。プライマー４は、下記の配列を有する：
【０１５４】
【化６】
【０１５５】
従って、反応ＩおよびＩＩの産物は重複しており、そして、プライマー１および４の存在下でＰＣＲにかけられるとき、反応ＩＩＩで示されるように、所望のＳａｌＩ産物を生じさせる。
【０１５６】
ＣＧβエキソン３およびαミニ遺伝子を含有する増幅フラグメントは、Ｓａｃｈａｉｓ，Ｂ．，Ｓｎｉｄｅｒ，Ｒ．Ｍ．，Ｌｏｗｅ，Ｊ．，Ｋｒａｕｓｅ，Ｊ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ（１９９３）２６８：２３１９に記載されている様式で、ＣＧβエキソン１および２を含むｐＭ２由来の発現ベクターであるｐＭ２ＨＡ−ＣＧβエキソン１，２のＳａｌＩ部位へ挿入される。ＣＧβエキソン１および２を含むｐＭ２は、Ｍａｔｚｕｋ，Ｍ．Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ ＵＳＡ（１９８７）８４：６３５４−６３５８、およびＭａｔｚｕｋ，Ｍ．Ｍ．ら、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ（１９８８）１０６：１０４９−１０５９に記載されている。
【０１５７】
次に、この発現ベクターは、一本鎖形態ヒトＣＧを生産し、そこでは、βサブユニットのＣ末端はαサブユニットのＮ末端に直接連結されている。
【０１５８】
実施例２：一本鎖ヒトCGの生産および活性
実施例１で構築された発現ベクターを、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞にトランスフェクトし、タンパク質の産生を、ＳＤＳゲル上で放射性標識タンパク質の免疫沈降によって評価した。培養培地を回収して、一本鎖タンパク質の生活性を、ヒトＬＨレセプターに関する競合結合アッセイで、ヘテロダイマーと比較した。このアッセイでは、全ヒトＬＨレセプターをコードするｃＤＮＡを、発現ベクターｐＣＭＸに挿入した（Ｏｉｋａｗａ，Ｊ．Ｘ−Ｃら、Ｍｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ（１９９１）５：７５９−７６８）。２９３個の指数増殖期細胞を、Ｃｈｅｎ．Ｃ．ら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ（１９８７）７：２７４５−２７５２の方法によって、このベクターでトランスフェクトした。
【０１５９】
アッセイでは、ヒトＬＨレセプターを発現する細胞（２×１０５個／チューブ）を、試験されるべき試料との競合で、１ｎｇの標識ｈＣＧとともに、２２℃で１８時間インキュベートした。次に、試料を、０．１％ ＢＳＡを補充した冷却ダルベッコＰＢＳ（２ｍｌ）で５倍に希釈し、８００×ｇで１５分間遠心分離した。ペレットをダルベッコＰＢＳで２回洗浄し、放射活性をガンマーカウンターで測定した。特異的結合は、試料が存在しない状態では、加えられた全標識（ヨウ素化された）ｈＣＧの１０−１２％であった。試料の存在下での標識の減少は、試料の結合能力を測定する。このアッセイでは、２９３細胞中のヒトＬＨレセプターに関して、野生型ｈＣＧは、０．４７ｎｇのＥＤ５０を有し、一本鎖タンパク質は１．１ｎｇのＥＤ５０を有した。
【０１６０】
アゴニスト活性についてのさらなるアッセイでは、ｃＡＭＰ生産の刺激を評価した。この場合には、ヒトＬＨレセプターを発現する２９３細胞（２×１０５個／チューブ）を、濃度を変えたヘテロダイマーｈＣＧあるいは一本鎖ｈＣＧとともにインキュベートし、１８時間培養した。細胞外ｃＡＭＰレベルを、Ｄａｖｏｒｅｎ，Ｊ．Ｂ．ら、Ｂｉｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ（１９８５）３３：３７−５２に記載のように、特異的ラジオイムノアッセイによって測定した。このアッセイでは、野生型は、０．６ｎｇ／ｍｌのＥＤ５０を有し、一本鎖形態は１．７ｎｇ／ｍｌのＥＤ５０を有した。（ＥＤ５０は、有効用量の５０％である。）
従って、全ての場合において、野生型および一本鎖形態の両方の作用は類似する。
【０１６１】
実施例３：さらなる活性アッセイ
βＦＳＨ−ＣＴＰ−α一本鎖構築物についての発現ベクターでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞からの培地を回収し、実施例２に記載のように評価した。ＦＳＨレセプターへの結合についての競合アッセイの結果を図３に示す。その結果は、一本鎖形態が、ＦＳＨ自身のレセプターへの結合阻害において、野生型ＦＳＨあるいはβ鎖にＣＴＰ伸長を含むＦＳＨのいずれよりもより有効であることを示す。伸長ヘテロダイマーのＥＤ５０は１００ｍＩＵ／ｍｌをいくらか超えるが、一本鎖形態のＥＤ５０は、約５０ｍＩＵ／ｍｌである。野生型ＦＳＨのＥＤ５０は約１２０ｍＩＵ／ｍｌである。
【０１６２】
シグナル変換アッセイの結果を図４に示す。ＦＳＨの３つの全ての形態の有効性は、同等である。
【０１６３】
実施例４：さらなる発現ベクターの構築
実施例１に記載と同様の様式で、一本鎖ＦＳＨ、ＴＳＨ、およびＬＨ（βＦＳＨ−α、βＦＳＨ−ＣＴＰ−α、βＴＳＨ−α、β−ＴＳＨ−ＣＴＰ−α、βＬＨ−α、βＬＨ−ＣＴＰ−α）生産用の発現ベクターを調製し、ＣＨＯ細胞へトランンスフェクトした。得られたホルモンは、実施例２に記載されているようにアッセイしたときに、野生型形態の活性と同様の活性を示す。
【０１６４】
同様に、「２−β」一本鎖形態の発現ベクターを、実施例１に記載されているのと同様の様式で構築し、発現させて、実施例２に記載のようにアッセイした。
【図面の簡単な説明】
【０１６５】
【図１】図１は、ＣＧβの第３エキソンとαサブユニットをコードする第２エキソンとを融合する、ＳａｌＩ制限型ＤＮＡフラグメントの構築を示す。
【図２】図２は、ヒトＣＧβのアミノ酸配列および１１２−１４５位の番号付けを示す。
【図３】図３は、種々のＦＳＨアナログによる、ＦＳＨレセプターの競合結合アッセイの結果を示す。
【図４】図４は、種々のＦＳＨアナログに対するＦＳＨレセプターに関するシグナル変換アッセイの結果を示す。
【技術分野】
【０００１】
政府援助の記述
本発明は、国立衛生研究所より奨励金を得て、NIH契約番号NO1-HD-9-2922で政府援助の下でなされた。政府は本発明に一部権利を有する。
【０００２】
技術分野
本発明は、タンパク質工学および天然にヘテロダイマーとして存在する糖タンパク質ホルモンの分野に関する。特に、本発明は、絨毛性性腺刺激ホルモン（CG）、甲状腺刺激ホルモン（TSK）、黄体形成ホルモン（LH）、および卵胞刺激ホルモン（FSH）の一本鎖形態に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景技術
ヒトにおける、重要な４つの糖タンパク質ホルモンヘテロダイマー（ＬＨ、ＦＳＨ、ＴＳＨ、およびＣＧ）は、同じαサブユニットと異なるβサブユニットとを有する。これらのホルモンのうち３つは、事実上他の全ての脊椎動物種にも存在し、ＣＧは、今までには、霊長類およびウマ胎盤および尿にしか認められていない。
【０００４】
１９９０年９月７日に公開され、本明細書に参考として援用されているＰＣＴ出願第ＷＯ９０／０９８００号は、これらのホルモンの多くの改変形態を記載している。重要な１つの改変は、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモンあるいはその変異体のカルボキシ末端ペプチドによる、βサブユニットのＣ末端伸長である。これらのホルモンのその他の変異タンパク質もまた記載されている。ＣＴＰの関連位置は、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモンβサブユニットの１１２−１１８位の任意の位置から１４５位までである。ＰＣＴ出願は、ＣＴＰがクリアランス特性を変える能力が破壊されないような、保存アミノ酸置換により得られたＣＴＰ伸長の変異体を記載している。さらに、本明細書に参考として援用されている、１９９３年４月２０日に出願された米国出願第０８／０４９，８６９号は、Ｃ末端以外の位置でのＣＴＰの伸長あるいは挿入による、これらのホルモンの変異、および１１２−１１８位から１４５位にわたる配列より短いＣＴＰフラグメントを記載している。
【０００５】
ＦＳＨのＣＴＰ伸長βサブユニットもまた、本明細書に出願者による２つの報文に記載されている：ＬａＰｏｌｔ，Ｐ．Ｓ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ（１９９２）１３１：２５１４−２５２０およびＦａｒｅｓ，Ｆ．Ａ．ら；Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９９２）８９：４３０４−４３０８。これらの両報文は、本明細書に参考として援用されている。
【０００６】
ヒト絨毛性性腺刺激ホルモンのヘテロダイマー形態の結晶構造は、ほぼ同時期の論文中に公開され；１つは、Ｌａｐｔｈｏｒｎ，Ａ．Ｊ．ら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９４）３６９：４５５−４６１であり、もう一方は、Ｗｕ，Ｈ．ら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（１９９４）２：５４５−５５８である。これらの論文の結果は、Ｐａｔｅｌ，Ｄ．Ｊ．Ｎａｔｕｒｅ（１９９４）３６９：４３８−４３９に要約されている。
【０００７】
ヘテロダイマーの良好な一本鎖形態の調製例の少なくとも１つが公知である。天然に存在する甘味タンパク質であるモネリンは、ヘテロダイマー形態でセレンディピティベリーから単離された。ヘテロダイマーの結晶構造についての調査は、ヘテロダイマー形態の空間特性を維持して、Ｂ鎖のＣ末端が、Ａ鎖のＮ末端にリンカーを介して連結され得ることと一致した。このような連結は、甘味タンパク質としての使用のために、それが高温において安定な形態でこの分子を提供するのに好都合であるという理由から、有益である。米国特許第５，２６４，５５８号に記載されているように、これは一本鎖形態を調製することによってうまく達成され、よって、熱変性が妨げられた。
【０００８】
１９９１年１１月１４日に公開されたＰＣＴ出願第ＷＯ９１／１６９２２号は、多くのキメラおよび改変形態のヘテロダイマー糖タンパク質ホルモンを記載している。概して、この開示は、それぞれに種々のαあるいはβ鎖部分を含有するαサブユニットあるいはβサブユニットのキメラを重点的に取り扱っている。この出願に単に掲載されているだけで他には特に記載されていない１つの構築物は、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモンのβ鎖の実質的に全体をαサブユニットプレタンパク質（すなわち、このサブユニットの分泌シグナル配列を含有する）に容易に融合する。β鎖とα鎖と間に介在するシグナル配列の存在は、本明細書に定義および記載されているようなリンカー部分として作用しないので、この構築物は本発明の範囲外である。
【０００９】
通常のヘテロダイマー糖タンパク質ホルモンは、上記の種々のＣＴＰ伸長および挿入を含む一本鎖形態を包含する、一本鎖形態のときに、それらの特性を保持することが認められた。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
発明の開示
本発明は、糖タンパク質ホルモンの一本鎖形態を提供する。このホルモンの少なくともいくつかは、ほとんどの脊椎動物種において認められている。本発明の一本鎖形態は、グリコシル化、部分グリコシル化、あるいは非グリコシル化のいずれかであり得、天然の糖タンパク質ホルモンあるいはその変異体に存在するα鎖およびβ鎖（あるいはαとα、あるいはβとβ）は、必要に応じてリンカー部分を介して連結され得る。特に好ましいリンカー部分は、完全なユニットあるいはそれらの部分のみで、カルボキシ末端ペプチド（ｃａｒｂｏｘｙ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ；ＣＴＰ）ユニットを含む。得られた一本鎖ホルモンは、非改変ヘテロダイマー形態の活性を保持するか、あるいはこの活性のアンタゴニストである。
【００１１】
従って、１つの局面では、本発明は、該ホルモンの１つβサブユニットのアミノ酸配列に、必要に応じてリンカー部分を介して、共有結合で連結された糖タンパク質ホルモンに共通なαサブユニットのアミノ酸配列、あるいは、それらアミノ酸配列の変異体（ここで、変異体は、本明細書に定義されている）を含有する、グリコシル化あるいは非グリコシル化タンパク質に向けられている。
【００１２】
別の局面では、本発明は、該ホルモンの１つのβサブユニットのアミノ酸配列に、必要に応じてリンカー部分を介して、共有結合で連結された糖タンパク質ホルモンカルテット（４つ組み）のメンバーのβサブユニットのアミノ酸配列、あるいは、それらアミノ酸配列の変異体（ここで、変異体は、本明細書に定義されている）を含有する、グリコシル化あるいは非グリコシル化タンパク質に向けられている。
【００１３】
別の局面では、本発明は、他方のαサブユニットのアミノ酸配列に、必要に応じてリンカー部分を介して、共有的に連結された糖タンパク質ホルモンカルテットのαサブユニットのアミノ酸配列、あるいは、それらアミノ酸配列の変異体（ここで、変異体は、本明細書に定義されている）を含有する、グリコシル化あるいは非グリコシル化タンパク質に向けられている。
【００１４】
さらに別の局面では、本発明は、有効性がホルモンカルテットの一本鎖形態により予測される生物学的に重要なダイマーのグリコシル化あるいは非グリコシル化一本鎖形態に向けられている。従って、本発明はまた、インターロイキン３および１２（ＩＬ−３およびＩＬ−１２）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、およびインヒビンの一本鎖形態に向けられている。ＩＬ−３由来の一方のサブユニットと、ＩＬ−１２由来の他方のサブユニットとの一本鎖形態のような、ハイブリッドインターロイキンもまた包含される。
【００１５】
その他の局面では、本発明は、本発明の一本鎖タンパク質を生産するための組換え材料および方法、それらを含有する薬学的組成物、それらに特異的な抗体、およびそれらの使用に、向けられている。
【００１６】
上記に加えて、本発明は、以下を提供する：
１．グリコシル化あるいは非グリコシル化タンパク質であって、該タンパク質は、
糖タンパク質ホルモンの１つのβサブユニットのアミノ酸配列に、必要に応じてリンカー部分を介して、共有結合で連結される、該糖タンパク質ホルモンに共通なαサブユニットのアミノ酸配列を含み、
ここで、該αおよびβサブユニットが、天然アミノ酸配列あるいは該アミノ酸配列の変異体からなる、
タンパク質。
【００１７】
２．前記タンパク質が前記リンカー部分を含み、そして、該リンカー部分が、必要に応じて、糖タンパク質ホルモンのレセプターへ標的づけられるべき薬剤を含有する、請求項１に記載のタンパク質。
【００１８】
３．前記βサブユニットのＣ末端近接位置が、必要に応じてリンカー部分を介して、前記αサブユニットのＮ末端近接位置に共有結合で連結されるか、あるいは、前記αサブユニットのＣ末端近接位置が、必要に応じてリンカー部分を介して、前記βサブユニットのＮ末端近接位置に共有結合で連結される、項目１に記載のタンパク質。
【００１９】
４．前記βサブユニットが、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモンあるいはその変異体のβサブユニットか、あるいは
前記βサブユニットが、FSHあるいはその変異体のβサブユニットであるか、あるいは
前記βサブユニットが、完全あるいは部分CTPユニットあるいはその変異体でそのＣ末端近接位置に伸長されたFSHのβサブユニットであるか、あるいは
前記βサブユニットが、LHあるいはその変異体のβサブユニットであるか、あるいは
前記βサブユニットが、完全あるいは部分CTPユニットその変異体でそのＣ末端近接位置に伸長されたLHのβサブユニットであるか、あるいは
前記βサブユニットが、TSHあるいはその変異体のβサブユニットであるか、あるいは
前記βサブユニットが、完全あるいは部分CTPユニットあるいはその変異体でそのＣ末端近接位置に伸長されたTSHのβサブユニットであるか、および／または
前記αサブユニットが、完全あるいは部分CTPユニットあるいはその変異体でそのＮ末端近接位置に伸長された、
項目１に記載のタンパク質。
【００２０】
５．前記αサブユニットあるいはβサブユニットあるいは両方が、完全あるいは部分CTPユニットあるいはその変異体を、それらの非重要領域へ挿入することによって改変されるか、および／または、前記リンカー部分が、完全あるいは部分CTPユニットあるいはその変異体を含む、項目１に記載のタンパク質。
【００２１】
６．前記部分CTPユニットが、112-132位、115-132位、116-132位、あるいは118-132位、あるいは112-127位、115-127位、116-127位、あるいは118-127位からなり、および／または
該CTPが、改変あるいは欠失される１つあるいはそれを超えるO-結合グリコシル化部位を有するか、および／または
前記非重要領域が、Ｃ末端に近接するか、あるいは
前記非重要領域が、Ｎ末端に近接する、
項目５に記載のタンパク質。
【００２２】
７．前記βサブユニットが、１つあるいはそれを超えるN-結合グリコシル化部位での改変を含有し、および／または
前記αサブユニットのN-結合グリコシル化部位の１つあるいは両方が、改変され、および／または
それが、グリコシル化されておらず、および／または
前記αサブユニットの85-92位の１つあるはそれを超えるアミノ酸が欠失された、
項目１に記載のタンパク質。
【００２３】
８．グリコシル化あるいは非グリコシル化タンパク質であって、
同じかあるいは異なる糖タンパク質ホルモンのβサブユニットのアミノ酸配列に、必要に応じてリンカー部分を介して、共有結合で連結される、糖タンパク質ホルモンのβサブユニットのアミノ酸配列であって、
ここで該βサブユニットが、該ホルモンの天然アミノ酸配列、あるいは、該アミノ酸配列の変異体からなる、アミノ酸配列；あるいは
同じかあるいは異なる糖タンパク質ホルモンのαサブユニットのアミノ酸配列に、必要に応じてリンカー部分を介して、共有結合で連結される、糖タンパク質ホルモンのαサブユニットのアミノ酸配列であって、
ここで、該αサブユニットが、該ホルモンの天然アミノ酸配列、あるいは、該アミノ酸配列の変異体からなる、アミノ酸配列；
を含む、タンパク質。
【００２４】
９．１つのαあるいはβサブユニットのＣ末端近接位置が、もう一方のαあるいはβサブユニットのＮ末端近接位置に、必要に応じてリンカー部分を介して、共有結合で連結される、項目８に記載のタンパク質。
【００２５】
１０．前記タンパク質がリンカー部分を含む、項目８に記載のタンパク質。
【００２６】
１１．適切な薬学的賦形剤と混合して、項目１あるいは８に記載のタンパク質を含有する、薬学的あるいは獣医学的組成物。
【００２７】
１２．項目１あるいは８に記載のタンパク質に対して免疫特異性である抗体。
【００２８】
１３．項目１あるいは８に記載のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むDNAあるいはRNA分子。
【００２９】
１４．糖タンパク質ホルモンの一本鎖形態を生産する発現系であって、該発現系は、項目１あるいは８のタンパク質をコードする第一ヌクレオチド配列を、該第一ヌクレオチド配列の発現に影響し得る制御配列に作動可能に連結して、含む、発現系。
【００３０】
１５．前記第一ヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質に、作動可能に連結されたシグナルペプチドをコードする第二ヌクレオチド配列をさらに含有する、項目１４に記載の発現系。
【００３１】
１６．項目１５に記載の発現系を含むように改変された、宿主細胞。
【００３２】
１７．糖タンパク質ホルモンの一本鎖形態を生産するための方法であって、
該方法が、該糖タンパク質ホルモンが生産される条件下で、項目１６に記載の細胞を培養する工程、および
該培養物から該糖タンパク質を回収する工程
を包含する、方法。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
発明を実施するための形態
ヒトの４つの「糖タンパク質」ホルモンは、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、および甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）を含むファミリーを提供する。本明細書で使用されているように、「糖タンパク質ホルモン」は、ヒトおよびその他の脊椎動物において認められるこのファミリーのメンバーのことである。これらのホルモンは全て、特定の種について、グループ中のアミノ酸配列が同じであるαサブユニット、およびファミリーのメンバーに従って異なるβサブユニットから構成されたヘテロダイマーである。従って、通常これらの糖タンパク質ホルモンは、互いに会合されているが共有結合していないαサブユニットおよびβサブユニットから構成されたヘテロダイマーとして存在する。ほとんどの脊椎動物は、ＦＳＨ、ＴＳＨ、およびＬＨを産生し、絨毛性性腺刺激ホルモンは、ヒトを含む霊長類およびウマにのみ認められる。ウマ由来のＣＧの特定の形態は、妊馬血清糖タンパク質（ＰＭＳＧ）と呼ばれる。
【００３４】
従って、このホルモン「カルテット（４つ組み）」は、各々のαサブユニットおよびβサブユニットが異なる遺伝子にコードされ、宿主によって別々に合成される、ヘテロダイマーから構成される。次に、宿主が、個別に合成されたサブユニットを、非共有結合的に連結されたヘテロダイマー複合体に組み立てる。このようにして、このホルモンカルテットのヘテロダイマーは、一つの遺伝子から合成され（この場合には介在「プロ（pro）」配列による）、サブユニットがジスルフィド結合により共有結合カップリングされている、インスリンのようなヘテロダイマーとは異なる。このホルモンカルテットはさらに、異なる位置から組み立てられているがジスルフィド結合によって共有結合されている、免疫グロブリンとも区別される。しかし他方で、植物タンパク質であるモネリンは、A鎖およびB鎖間の非共有結合的相互作用によって、一緒になって保持されている。現時点では、２つの鎖が別々の遺伝子上にコードされるかどうかは知られていない。
【００３５】
従って、種々の要因が、同じかあるいは異なるサブユニットから形成されたダイマーである生物学的に活性な化合物の作用の決定に影響する。サブユニットは、共有結合あるいは非共有結合で連結され得、同じかあるいは異なる遺伝子によって合成され得、そして前駆形態で、ダイマーの２つのメンバーを連結する「プロ」配列を含有し得るかあるいは含有し得ない。本明細書中の糖タンパク質ホルモンカルテットの一本鎖形態によって得られる結果に基づくと、生物学的に活性なダイマーであるインターロイキン-12およびインターロイキン-3（IL-12およびIL-3）、インヒビン、腫瘍壊死因子（TNF）、ならびにトランスフォーミング成長因子（TGF）の一本鎖形態もまた、生物学的に活性であることが明白である。
【００３６】
ヘテロダイマーあるいはホモダイマーの一本鎖形態は、それらのダイマー形態よりも多くの利点を有する。最初に、それらは一般的により安定である。特にLHは、非安定性および短い半減期に注目される。第二は、１つの遺伝子のみが、転写、翻訳、およびプロセスされればよいことから、組換え生産の問題が減少される。このことは、特に細菌での発現に特に重要である。第三に、無論のこと、それらは代替形態を提供し、活性レベルおよびインビボにおける半減期を微妙に調整し得る。最後に、一本鎖形態は、ダイマーの活性を有する切断形態を同定するための独特の出発物質である。サブユニット間の連結により、タンパク質の全折り畳みを混乱させずにタンパク質を設計的に生産し得る。
【００３７】
カルテットのメンバーの特徴
ｈＣＧのβサブユニットは実質的にその他のβサブユニットより大きく、このサブユニットは、Ｃ末端に約３４の付加アミノ酸（本明細書ではカルボキシ末端部分（ｃａｒｂｏｘｙ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｐｏｒｔｉｏｎ；ＣＴＰ）と呼ばれる）を含み、そしてこれがＯ−結合部位でグリコシル化されるとき、この伸長のために、その他の性腺刺激ホルモンに比較して、ｈＣＧの血清半減期が比較的長いと考えられている（Ｍａｔｚｕｋ，Ｍ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ（１９８９）１２６：３７６）。天然ホルモンでは、このＣＴＰ伸長は、４つのムチン様Ｏ−結合オリゴ糖を含有する。
【００３８】
本発明の１つの実施態様では、糖タンパク質ホルモンのα鎖およびβ鎖がカップリングされて、α鎖およびβ鎖が、必要に応じてリンカー部分を介して、共有結合で連結されている一本鎖のタンパク質性物質になる。リンカー部分は、さらなるアミノ酸配列を含み得、特に本明細書に記載されているＣＴＰユニットが、リンカーに有利に含まれ得る。さらに、リンカーは、ホルモンのレセプターに標的づけされ得るペプチドあるいは非ペプチド薬剤を含み得る。
【００３９】
２つのペプチド鎖をペプチド結合を介して単にカップリングさせることにより達成される頭−尾（ｈｅａｄ−ｔｏ−ｔａｉｌ）配置に加えて、α鎖およびβ鎖は、頭−頭（ｈｅａｄ−ｔｏ−ｈｅａｄ）あるいは尾−尾（ｔａｉｌ−ｔｏ−ｔａｉｌ）で連結され得る。頭−頭および尾−尾のカップリングは、リンカー部分を介して２つのカルボキシル基あるいは２つのアミノ基を結合する、標準的な方法を用いる合成化学を包含する。例えば、標準的な活性化方法によって、２つのアミノ基は、無水物を介して、あるいは任意のジカルボン酸誘導体を介して連結され得；２つのカルボキシル基は、ジアミンあるいはジオールを介して連結され得る。しかし、最も好ましい形態は、頭−尾配置であり、ここでは、標準的なペプチド結合で十分であり、そして一本鎖化合物は、組換えによる融合タンパク質として、あるいは、１つの鎖におけるまたは好ましくは配列全体の個々の部分を連結する合成ペプチド法によって、調製され得る。無論のこと、所望であれば、ペプチドあるいは非ペプチドリンカー部分がこの場合においても使用され得るが、これは必要とされるわけではなく、一本鎖タンパク質の組換え産生の利点は、この生産方法を可能にする実施態様が、最も好ましいアプローチを包含することを示唆する。
【００４０】
頭−尾配置が使用されるとき、リンカーは、付加ペプチド配列から本質的になり得る。ヘテロダイマーによる場合と同様に、２つのβ鎖は、以下にさらに記載するように、ＣＴＰユニットを介して連結され得る。従って、本発明の可能な実施態様は、左にＮ末端を有した、α−ＦＳＨβ、βＦＳＨ−α、α−βＬＨ、α−ＣＴＰ−ＦＳＨβ、βＬＨ−ＣＴＰ−α、ＣＴＰ−βＬＨ−ＣＴＰ−αなどを包含する。
【００４１】
ヘテロダイマー性腺刺激ホルモンあるいは糖タンパク質カルテットの一本鎖形態はまた、実施態様のさらなる重要なセットに関し、この実施態様では、αサブユニットとβサブユニットとをカップリングするのではなく、２つのβサブユニットあるいは２つのαサブユニットが一本鎖化合物を形成するようにともにカップリングされ得る。ヘテロダイマーによる場合と同様に、結合は、頭−頭、頭−尾、あるいは尾−尾であり得る。
【００４２】
「２−β」一本鎖縦並びペプチドは、ヘテロダイマー糖タンパク質ホルモンによって通常活性化されるレセプターに対するアンタゴニストとして有用である。βサブユニットはレセプター特異性を与えるが、αサブユニットはシグナル変換に大きく寄与すると考えられ、そしてαサブユニットおよびβサブユニットは同様のコンフォメーションを有するので、一本鎖化合物はレセプターに特異的に結合し得るべきであり、そのためには、少なくとも１つのβ鎖がレセプターを活性化することなく存在する。
【００４３】
「２−β」一本鎖縦並びペプチドのアンタゴニスト活性は、ヘテロダイマーの結晶構造に一部基づく。α鎖およびβ鎖は同じシスチンノット配置を有すること、および２つの鎖のいくつかの折り畳みパターンは類似することが注目される。
【００４４】
本発明の「２−β」一本鎖化合物は、同じβサブユニットの縦並びコピー（すなわちＦＳＨβ−ＦＳＨβ；ＨＣＧβ−ＨＣＧβ；ＴＳＨβ−ＴＳＨβ；あるいはＬＨβ−ＬＨβ）を含有するように設計され得るか、あるいは、ＨＣＧβ−ＦＳＨβ；ＦＳＨβ−ＬＨβ；ＬＨβ−ＴＳＨβなどのようなキメラ一本鎖化合物が使用され得る。このような可能な組合せは総計で１２個存在する。さらに、ＨＣＧβサブユニットのカルボキシル末端ペプチド（ＣＴＰ）は、２つのβ鎖間に存在するときには、一本鎖化合物のコンフォメーションを改良する。これは、ＨＣＧβが上流部分であるとき自動的に生ずる。しかし、その他の例では、本明細書に記載のように、上流として関与するもののカルボキシル末端に、ＣＴＰサブユニットを使用するのが有利である。このような２つのＣＴＰユニットもまた本発明の範囲内である。従って、好ましい実施態様は、ＦＳＨβ−ＣＴＰ−ＦＳＨβ；ＦＳＨβ−ＣＴＰ−ＣＴＰ−ＦＳＨβ；ＬＨβ−ＣＴＰ−ＬＨβ；ＬＨβ−ＣＴＰ−ＣＴＰ−ＦＳＨβなどを包含する。
【００４５】
同様の記載が「２α」一本鎖化合物に対して適用され、無論のこと、α変異体に関する以外のキメラペアーは含まれない。種々のリンカー（好ましくはＣＴＰベース）およびＣＴＰ伸長もまた含まれる。
【００４６】
以下の定義は、分子の一本鎖形態の記述に役立ち得る。
【００４７】
本明細書で使用されているように、αサブユニット、およびＦＳＨ、ＬＨ、ＴＳＨ、およびＣＧβサブユニット、ならびにヘテロダイマー形態は、一般的に従来からの定義を有し、示されるグリコシル化パターンに係わらず、本質的に当該分野で公知のアミノ酸配列を有するタンパク質、あるいはそれらの対立遺伝子変異体のことである。
【００４８】
これらのペプチドの「天然」形態は、関連の脊椎動物組織から単離されたアミノ酸配列を有し、それ自身が既知配列あるいはそれらの対立遺伝子変異体を有するペプチドである。
【００４９】
これらのタンパク質の「変異体」形態は、例えば、部位特異変異誘発あるいはその他の組換え操作によって生産された、天然タンパク質のアミノ酸配列中の意図的な改変を有するタンパク質あるいは合成的に調製されたタンパク質のことである。
【００５０】
これらの改変は、欠失、挿入および置換を含む、１−１０個、好ましくは１−８個、より好ましくは１−５個のアミノ酸変化、最も好ましくは下記に定義されているような保存アミノ酸置換からなる。得られた変異体は、天然ホルモンの対応活性に影響する活性を保持する、すなわち、天然ホルモンの生物学的活性を直接保持しなければならないか、あるいは概して天然ホルモンのレセプターに結合し得るがシグナル変換に影響する能力を欠くことにより、アンタゴニストとして作用しなければならない。例えば、αサブユニットの５２位のグリコシル化部位が、アミノ酸置換により除去され、それによりその部位での全グリコシル化が阻まれるとき、この改変αサブユニットを有するヘテロダイマーであるホルモンは、一般的にアゴニストであり、レセプターに結合して、天然ホルモンが結合するのを競合により阻み得る。（他方で、７８位のαサブユニットのグリコシル化部位は、ホルモン活性にはさほど影響しないようである。）アミノ酸配列中のその他の改変もまた、変異体についてアゴニストではなくアンタゴニスト活性を生じ得る。
【００５１】
好ましい変異体の１つのセットは、αあるいはβサブユニットのいずれかまたはその両方のグリコシル化部位が改変された変異体である。αサブユニットは２つのグリコシル化部位を含み、１つは５２位、もう一方は７８位であり、活性に対するこれらの部位の改変の効果がちょうど記載されている。同様に、一般的にβサブユニットは２つのＮ−結合グリコシル化部位を含み（β鎖の特性によっていくらか変動する位置で）、同様の改変がこれらの部位でなされ得る。ｈＣＧのＣＴＰ伸長は４つのＯ−結合グリコシル化部位を含み、セリン残基での保存変異（例えば、セリンからアラニンへの転換）は、これらの部位を破壊する。Ｏ−結合グリコシル化部位の破壊は、アゴニスト（ａｇａｉｎｓｔ）活性からアンタゴニスト活性への転換に影響し得る。
【００５２】
最後に、Ｎ−結合あるいはＯ−結合グルコシル化部位に近接しているアミノ酸配列での変異は、得られる分子上に存在するグリコシル化特性に影響し、さらに活性を変化させる。
【００５３】
アミノ酸配列中の改変はまた、挿入および欠失の両方を包含する。従って、ホルモンの切断形態、例えば、Ｃ末端で、８５−９２位のいくつかあるいは全部のアミノ酸が欠失しているαサブユニットの変異体は、変異体に包含される。さらに、１−１０アミノ酸がＮ末端から欠失されたαサブユニットが包含される。本明細書に記載されているホルモンカルテットのいくつかの有用な変異体は、１９９３年１月５日に発行された米国特許第５，１７７，１９３号に記載されており、これは本明細書に参考として援用されている。その特許に示されているように、グリコシル化パターンは、関連部位の破壊、あるいは代替的に、タンパク質が生産される宿主の選択によって、改変され得る。
【００５４】
上記に説明されているように、一本鎖形態は、種々の設計変異タンパク質についての好都合な出発物質である。このような変異タンパク質は、改変あるいは除去される非重要（ｎｏｎ−ｃｒｉｔｉｃａｌ）領域を有する変異タンパク質を包含する。このような欠失および改変は完全なループを含み得、１０個より多いアミノ酸からなる配列が欠失あるいは改変され得る。しかし、一本鎖分子は、少なくともレセプター結合ドメインおよび／またはシグナル変換に関連する領域を保持しなければならない。
【００５５】
本明細書に記載されているホルモンカルテットの変異体についての重要な文献が存在し、この文献から、アゴニストおよびアンタゴニスト活性の両方を生じる多くの可能な変異体が調製され得ることが、明白である。このような変異体は、例えば、Ｃｈｅｎ，Ｆ．ら、Ｍｏｌｅｃ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ（１９９２）６：９１４−９１９；Ｙｏｏ，Ｊ．ら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ（１９９３）２６８：１３０３４−１３０４２；Ｙｏｏ，Ｊ．ら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ（１９９１）２６６：１７７４１−１７７４３；Ｐｕｅｔｔ，Ｄ．ら、Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｈｏｒｍｏｎｅｓ，Ｌｕｓｂａｄｅｒ，Ｊ．Ｗ．ら、ＥＤＳ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９４）１２２−１３４；Ｋｕｅｔｍａｎｎ，Ｈ．Ｔ．ら、（同書）１０３−１１７頁；Ｅｒｉｃｋｓｏｎ，Ｌ．Ｄ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ（１９９０）１２６：２５５５−２５６０；およびＢｉｅｌｉｎｓｋａ，Ｍ．ら、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ（１９９０）１１１：３３０ａ（抄録１８４４）に開示されている。
【００５６】
上記に記載のように、有効なアンタゴニストを構築する１つの方法は、糖タンパク質カルテットの同じかあるいは異なるメンバーの２つのβサブユニットを含む一本鎖分子を調製することである。これらの一本鎖形態の特に好ましい変異体は、１つ以上のシステイン結合が、典型的には、結合に関与する１つあるいは両方のシステインと中性アミノ酸とを置換することによって、欠失されるものを包含する。欠失され得る特に好ましいシステイン結合は、２６位と１１０位との間、および２３位と７２位との間の結合である。
【００５７】
さらに、ホルモンカルテットのβサブユニットは、キメラの両成分の生物学的機能、あるいは、一般的には、改変された生物学的機能のホルモンを提供するように、キメラ形態に構築され得ることが実証された。従って、ＦＳＨおよびＬＨ／ＣＧの両活性を示すキメラ分子は、Ｍｏｙｌｅ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ（１９９１）８８：７６０−７６４；Ｍｏｙｌｅ，Ｎａｔｕｒｅ（１９９４）３６８：２５１−２５５に記載のように構築され得る。これらの報文に開示されているように、ＦＳＨ−βの１０１−１０９位のアミノ酸とＣＧ−βサブユニット中の対応残基との置換により、ｈＣＧおよびＦＳＨの両活性を有するアナログが得られる。
【００５８】
βサブユニットのこれらのキメラ形態はまた、２つのβサブユニットをカップリングさせて１つの分子にする、一本鎖化合物において使用され得る。
【００５９】
グリコシル化パターンが定性的および定量的に活性に対して意味深い影響を有すると認識されているが、便宜上、用語 ＦＳＨ、ＬＨ、ＴＳＫおよびＣＧβサブユニットは、「αサブユニット」に対してのように、そのペプチドに特徴的なアミノ酸配列のことである。β鎖のみが言及されるときには、その用語は、例えば、ＦＳＨβであり、ヘテロダイマーが言及されるときには、簡単な用語「ＦＳＨ」が使用される。グリコシル化パターンが、例えば、組換え発現宿主あるいはグリコシル化部位での変異によっていかにして影響されるかということは、背景から明白である。特定のグリコシル化パターンを有する糖タンパク質の形態が注目される。
【００６０】
本明細書で使用されているように、「ペプチド」および「タンパク質」は、それらの間の長さの区別は恣意的であるので、互換的に使用される。
【００６１】
本発明の一本鎖形態では、α鎖および／またはβ鎖は、非重要領域に挿入されたＣＴＰ伸長を含み得る。
【００６２】
αサブユニットおよびβサブユニットの「非重要」領域は、生物活性（アゴニストおよびアンタゴニスト活性を含む）に必要とされない分子領域である。一般的には、これらの領域は結合部位、前駆体切断部位、および触媒部位から切り離される。適切な折り畳みの誘導、レセプターへの結合、触媒活性などに対して重要な領域は避けられるべきであり、同様に、タンパク質の三次元コンフォメーションを確保するために重要な領域は避けられるべきである。ダイマーの場合に重要であるいくつかの領域は、一本鎖によって課されるコンフォメーション上の制限がこれらの領域に対する必要性を取り除き得るので、一本鎖形態では非重要となることは、注目されるべきである。非重要領域の確認は、候補領域の欠失あるいは改変、および、所望の活性についての適切なアッセイの遂行によって、容易に完了される。改変が活性の損失を生じる領域は重要であり、改変が同じかあるいは同様の活性（アンタゴニスト活性を含む）を生じる領域は非重要であると考えられる。
【００６３】
「生物学的活性」によって、天然ホルモンの活性に対してアゴニストあるいはアンタゴニスト性である活性が意味されることが強調される。従って、アンタゴニストは、ホルモンの生理学的効果を直接提供し得ないが、特定の領域は、アンタゴニストとしての変異体の作用に対して重要である。
【００６４】
例えば、αサブユニットについては、３３−５９位がシグナル変換に必要であると考えられ、そしてカルボキシ末端の２０アミノ酸配列がシグナル変換／レセプター結合に必要とされる。βサブユニットとの組立てに重要な残基は、少なくとも３３−５８残基、特に３７−４０残基を有する。
【００６５】
非重要領域がＮ末端あるいはＣ末端に「近接する」場合、挿入は、末端の１０アミノ酸以内の任意の位置にあり、好ましくは５アミノ酸以内、そして最も好ましくは末端それ自身にある。
【００６６】
一般的に、「近接する」は、対象位置の１０アミノ酸以内、好ましくは５アミノ酸以内、そして最も好ましくは対象位置それ自身である位置を示すために使用される。従って、特定の変異体は、グリコシル化部位に「近接する」アミノ酸の置換を含み得る。ここでの定義はこれに関連する。さらに、αサブユニットおよびβサブユニットは、それらのＮ末端あるいはＣ末端に「近接する」位置で、互いに連結され得る。
【００６７】
本明細書で使用されているように、「ＣＴＰユニット」とは、アミノ酸１１２−１１８位からＣ末端の残基１４５位にまで、あるいはその部分にまで広がる、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモンβサブユニットのカルボキシ末端に認められるアミノ酸配列のことである。従って、各「完全」ＣＴＰユニットは、ＣＴＰのＮ末端に依存して、２８−３４個のアミノ酸を含有する。１１２−１４５位の天然配列は図２に示されている。
【００６８】
「部分」ＣＴＰユニットによって、１１２−１１８位から１４５位までの間を含めて存在するが、最も短い可能な「完全」ＣＴＰユニットから（すなわち、１１８位−１４５位から）少なくとも１つのアミノ酸欠失されたアミノ酸配列が意味される。本発明に包含される「部分」ＣＴＰユニットは、アゴニスト活性が所望される場合、好ましくは、少なくとも１つのＯ−グリコシル化部位を含有する。ホルモンのいくつかの非グリコシル化形態はアンタゴニストであり、このように有用である。そのＣＴＰユニットは、１２１位（部位１）、１２７位（部位２）、１３２位（部位３）、および１３８位（部位４）のセリン残基に、このような４つの部位を含む。本発明のアゴニストに有用なＣＴＰの部分形態は、天然ＣＴＰ配列に見られる順序に整列された、１つ以上のこのような部位を含有する。従って、本発明のアゴニストに用いられる「部分」ＣＴＰユニットは、４つの全グリコシル化部位；部位１、２、および３；部位１、２、および４；部位１、３、および４；部位２、３、および４；あるいは単に部位１および２；１および３；１および４；２および３；２および４；あるいは３および４を含有し得るか、または部位１、２、３、あるいは４の１つのみを含有し得る。
【００６９】
「縦並びの」挿入部あるいは伸長部によって、挿入部または伸長部が少なくとも２つの「ＣＴＰユニット」を含有することが意味される。各ＣＴＰユニットは、完全あるいはフラグメントであり得、天然あるいは変異体であり得る。縦並びの伸長部あるいは挿入部中の全ＣＴＰユニットは、互いに同じであり得るかあるいは異なり得る。従って、例えば、縦並びの伸長部あるいは挿入部は、一般的に、部分−完全；部分−部分；部分−完全−部分；完全−完全−部分などであり得、そこでは、注目される部分あるいは完全ＣＴＰユニットの各々は、独立して、変異体あるいは天然配列であり得る。
【００７０】
「リンカー部分」は、ヘテロダイマーのメンバーとして、他になければ同じα鎖およびβ鎖によって示される活性、あるいはその活性をアゴニストからアンタゴニスト活性に転換する活性によって妨害されずに、α配列とβ配列とを接続する部分である。活性レベルは理にかなった範囲内で変化し得るが、リンカーは、実質的なアゴニストおよび実質的なアンタゴニストの両活性の一本鎖形態を損なわせるようには存在し得ない。一本鎖形態は、生産培地から回収されるとき一本鎖形態に維持され、ヘテロダイマー、すなわちその化合物を形成する要素のホルモン活性に対して適切な活性を示さなければならない。
【００７１】
変異体
ホルモンサブユニットおよびＣＴＰユニットは、天然ホルモンあるいはＣＴＰ配列に正確に対応し得るか、あるいは変異体であり得る。変異体の性質は上記で定義されている。このような変異体では、天然配列に含有されるアミノ酸の１−１０個、好ましくは１−８個、そして最も好ましくは１−５個が、その位置の天然アミノ酸と比較して異なるアミノ酸によって置換されているか、あるいは、１−１０個、より好ましくは１−８個、そして最も好ましくは１−５個のアミノ酸が単に欠失されているか、あるいはこれらの組み合わせである。上記に示されているように、一本鎖形態の非重要領域が、特に非重要「ループ」の存在を検出することを通して同定されるとき、欠失あるいは置換によって改変されたアミノ酸の数は、関連の非重要領域中のアミノ酸配列の長さに依存して、２０あるいは３０、または任意の数に増加され得る。無論のこと、１つを超える非重要領域中の欠失あるいは置換により、影響を及ぼされる一本鎖形態のさらに多くのアミノ酸を生じさせ、置換および欠失戦略は組合せて使用され得る。このような置換あるいは欠失は累積的に行われても、アゴニストあるいはアンタゴニスト活性は実質的には除去されない。天然アミノ酸の保存アナログによる置換が好ましい。
【００７２】
「保存アナログ」は、従来の意味で、置換される残基が、置換がなされる残基と同じ一般的なアミノ酸カテゴリーにあるアナログである。アミノ酸は、当該分野で理解されているように、例えば、Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．ら、Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（１９７２）５：８９−９９によって、このようなグループに分類された。一般的には、酸性アミノ酸は、１つのグループに帰属し、塩基性アミノ酸はもう１つのグループに、中性の親水性アミノ酸がもう１つのグループに、のように帰属する。
【００７３】
より詳細には、アミノ酸残基は一般的に、以下のように４つの主要サブクラスに分類され得る：
酸性：残基は、生理的ｐＨでのＨイオンの損失によって負電荷を有し、その残基は、ペプチドが生理的ｐＨでの水性媒体中に存在するとき、水溶液によって引き付けられ、それが含有されるペプチドのコンフォメーション中の表面位置に探しだされる。
【００７４】
塩基性：残基は、生理的ｐＨでのＨイオンとの会合によって正電荷を有し、その残基は、ペプチドが生理的ｐＨでの水性媒体中に存在するとき、水溶液によって引き付けられ、それが含有されるペプチドのコンフォメーション中の表面位置に探しだされる。
【００７５】
中性／非極性：残基は、生理的ｐＨでは帯電されておらず、その残基は、ペプチドが生理的ｐＨでの水性媒体中に存在するとき、水溶液によって反発され、それが含有されるペプチドのコンフォメーション中の内部位置に探しだされる。これらの残基はまた本明細書では「疎水性」と呼ばれる。
【００７６】
中性／極性：残基は、生理的ｐＨでは帯電されておらず、その残基は、ペプチドが生理的ｐＨでの水性媒体中に存在するとき、水溶液によって引き付けられ、それが含有されるペプチドのコンフォメーション中の外側位置に探しだされる。
【００７７】
無論のこと、個別の残基分子の統計学的収集では、いくつかの分子は帯電されており、いくつかは帯電されておらず、大なり小なりの程度で、水性媒体の引き付けあるいは反発が存在する。「帯電された」の定義に適するには、個別分子の有意なパーセント（少なくとも約２５％）が生理的ｐＨで帯電されている。極性あるいは非極性としての分類に必要な引き付けあるいは反発の程度は任意であり、従って、本発明によって特に意図されるアミノ酸は、いずれかに分類された。特に命名されていないほとんどのアミノ酸は、既知作用に基づいて分類され得る。
【００７８】
アミノ酸残基は、環状あるいは非環状、および芳香族性あるいは非芳香族性の、残基の側鎖置換基に関する自明の分類として、ならびに、大小について、さらにサブクラスに分類され得る。カルボキシルの炭素以外に、全部で４以下の炭素原子を含有するとき、その残基は小さいと考えられる。小さい残基は無論のこと、非芳香族性である。
【００７９】
天然に存在するタンパク質アミノ酸について、前記のスキームに従ったサブクラス分類は、以下の通りである：
酸性：アスパラギン酸およびグルタミン酸；
塩基性／非環状：アルギニン、リジン；
塩基性／環状：ヒスチジン；
中性／極性／小：グリシン、セリン、システイン；
中性／非極性／小：アラニン；
中性／極性／大／非芳香族性：トレオニン、アスパラギン、グルタミン；
中性／極性／大／芳香族性：チロシン；
中性／非極性／大／非芳香族性：バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン；
中性／非極性／大／芳香族性：フェニルアラニン、およびトリプトファン。
【００８０】
遺伝子コードされる二級アミノ酸プロリンは、専門的には中性／非極性／大／環状および非芳香族性のグループ内であるが、ペプチド鎖の二次コンフォメーションに対する既知効果による特別の例であり、従って、この定義されたグループに包含される。
【００８１】
本発明の一本鎖タンパク質が組換え法で構築されるとき、それらは、遺伝子コードアミノ酸置換のみを含有するが、しかし、任意の部分が、標準法、例えば、固相ペプチド合成法によって合成され、残りのタンパク質に、例えば、酵素的に、連結されるときには、アミノイソブチル酸（Ａｉｂ）、フェニルグリシン（Ｐｈｇ）などのような非遺伝子コードアミノ酸もまた、それらの類似結合対と置換され得る。
【００８２】
これらの非コードアミノ酸はまた、例えば、β−アラニン（β−Ａｌａ）、あるいは、３−アミノプロピオン酸、４−アミノブチル酸のようなその他のωアミノ酸、サルコシン（Ｓａｒ）、オルニチン（Ｏｒｎ）、シトルリン（Ｃｉｔ）、ｔ−ブチルアラニン（ｔ−ＢｕＡ）、ｔ−ブチルグリシン（ｔ−ＢｕＧ）、Ｎ−メチルイソロイシン（Ｎ−ＭｅＩｌｅ）、およびシクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、システイン酸（Ｃｙａ）、２−ナフチルアラニン（２−Ｎａｌ）；１，２，３，４，−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸（Ｔｉｃ）；メルカプトバレリン酸（Ｍｖｌ）；β−２−チエニルアラニン（Ｔｈｉ）；およびメチオニンスルホキシド（ＭＳＯ）を包含する。これらもまた都合よく特定のカテゴリーに当てはまる。
【００８３】
上記の定義に基づくと、
Ｓａｒおよびβ−ＡｌａおよびＡｉｂは、中性／非極性／小であり；
ｔ−ＢｕＡ、ｔ−ＢｕＧ、Ｎ−ＭｅＩｌｅ、Ｎｌｅ、Ｍｖｌ、およびＣｈａは、中性／非極性／大／非芳香族性であり；
Ｏｒｎは、塩基性／非環状であり；
Ｃｙａは、酸性であり；
Ｃｉｔ、アセチルＬｙｓ、およびＭＳＯは、中性／極性／大／非芳香族性であり；そして、
Ｐｈｇ、Ｎａｌ、Ｔｈｉ、およびＴｉｃは、中性／非極性／大／芳香族性である。
【００８４】
種々のωアミノ酸は、大きさによって、中性／非極性／小（β−Ａｌａ、すなわち、３−アミノプロピオン酸、４−アミノブチル酸）あるいは大（その他全て）に分類される。
【００８５】
従って、遺伝子にコードされるアミノ酸以外のアミノ酸置換もまた、本発明の範囲内のペプチド化合物に包含され得、それらの構造に従って、この一般的なスキームに分類され得る。
【００８６】
一本鎖ホルモンの好ましい実施態様
本発明の一本鎖ホルモンは、組換え方法によって、最も効率的および経済的に生産される。従って、そのような形態のα鎖およびβ鎖、ＣＴＰユニット、および遺伝子コードアミノ酸のみを含むその他のリンカー部分が好ましい。しかし、上記のように、合成ペプチド法あるいはその他の有機合成法によって、一本鎖ホルモンの少なくとも部分を構築することは可能であり、それゆえに、非遺伝子コードアミノ酸を含む変異体もまた、本発明の範囲内である。
【００８７】
本発明の一本鎖ホルモンの最も好ましい実施態様では、βサブユニットのＣ末端は、必要に応じてリンカーを介して、成熟αサブユニットのＮ末端に共有結合で連結される。αサブユニットのＣ末端がβサブユニットのＮ末端に連結された形態もまた有用であるが、その形態は、関連のレセプターのアンタゴニストあるいはアゴニストとしてやや劣る活性を有し得る。連結は、１つのサブユニットのＣ末端アミノ酸が他方のＮ末端に、ペプチド結合を介して直接連結される直接ペプチド連結であり得るが、しかし、多くの例においては、２つの末端間にリンカー部分を含むことが好ましい。多くの例では、リンカー部分は、２つの鎖間に少なくとも１つのβターンを提供する。それゆえに、リンカー内のプロリン残基の存在は、有利であり得る。
【００８８】
上記のように、いずれの場合もリンカーユニットを介して、α鎖のＮ末端がβ鎖のＮ末端にカップリングされ得るか、あるいは、α鎖のＣ末端がβ鎖のＣ末端にカップリングされ得、同様の組合せが、２つのαサブユニットあるいは２つのβサブユニットを含む一本鎖形態に包含される。
【００８９】
一本鎖形態を含むサブユニット末端間の連結の考察においては、１つ以上の末端が、上記のような置換あるいは欠失によって改変され得ることが理解されるべきである。
【００９０】
２つのβサブユニットを含む一本鎖化合物の好ましい実施態様は、１つのユニットのＣ末端が、必要に応じてリンカー（好ましくはペプチドリンカー）を介して、他方のＮ末端に連結される化合物である。上記のように、２つのβ鎖のＮ末端間連結、あるいは２つのβ鎖のＣ末端間連結もまた可能であり、無論のこと、この場合にはリンカーが必要である。
【００９１】
両一本鎖ヘテロダイマーの頭−頭、尾−尾、および頭−尾の配置、および一本鎖２βサブユニット形態を記載してきたが、２つのサブユニット間の連結は、各メンバーのＮ末端あるいはＣ末端のまさにその位置ではなく、それらに近接する位置にもまた生じ得る。
【００９２】
実施態様の特に好ましい１つのセットでは、連結は頭−尾であり、そのリンカー部分は、１つ以上のＣＴＰユニットおよび／またはそれらの変異体あるいは切断形態を含む。このようなリンカー部分に使用されるＣＴＰユニットの好ましい形態は下記に記載されている。
【００９３】
さらに、リンカー部分は、共有結合により、好ましくは放出可能に、リンカー部分に結合された薬剤を含み得る。薬剤のリンカー部分へのカップリング方法、およびその放出を提供する方法は慣例的である。
【００９４】
リンカー部分でのそれらの存在に加えて、ＣＴＰならびにその変異体および切断はまた、一本鎖ホルモンを構成するサブユニットの任意の非重要領域に含まれ得る。これらの含有物の性質および位置は、本明細書に援用されている親出願（ｐａｒｅｎｔ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）に詳細に記載されている。
【００９５】
ＣＴＰユニットは、リンカー部分中の好ましい含有物であるが、リンカーは、αサブユニットとβサブユニットとの間に適切な空間関係を提供する任意の適切な共有結合物質であり得ることが理解される。従って、頭−尾配置には、リンカーは、一般的に、溶液中で適当な空間およびコンフォメーション（ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ）を提供するために適切な親水性／疎水性比率を有する、任意数の、しかし典型的には１００個未満、より好ましくは５０個未満のアミノ酸を含有するペプチドであり得る。一般的に、リンカーは、周囲溶液中に存在して、αサブユニットおよびβサブユニット、あるいは２つのβサブユニット間の相互作用の妨げにならないように、結局は親水性である。リンカーは、典型的にはプロリン残基によって提供されるβターンを含むことが好ましい。上記の正確な特性を有する、ペプチドリンカーを含む、任意の適切なポリマーが使用され得る。
【００９６】
本発明の範囲内に包含されない１つの特定のリンカー部分は、下流サブユニットのすぐ上流にシグナルペプチドを含むリンカー部分である。
【００９７】
本発明の一本鎖ホルモンの特に好ましい実施態様は、下記を包含する：
【００９８】
【化１】
【００９９】
サブユニットのヒト形態もまた特に好ましい。上記の構築物では、「ＣＴＰ」は、下記の章にさらに説明するように、ＣＴＰあるいはその変異体または切断型のことである。
【０１００】
ＣＴＰユニットの好ましい実施態様
本発明のＣＴＰユニットに使用される記号は、以下の通りである：完全ＣＴＰユニットの部分については、部分に含まれる位置は、本願の図２に記されている番号によって示される。置換が存在するときは、置換されたアミノ酸は、その位置を示す上付き記号と共に示される。従って、例えば、ＣＴＰ（１２０−１４３）は、１２０位から１４３位に及ぶＣＴＰ部分を表し、ＣＴＰ（１２０−１３０；１３６−１４３）は、天然配列の１１８位−１１９位、１３１位−１３５位、および１４４位−１４５位を欠く融合配列を表す。ＣＴＰ（Ａｒｇ１２２）は、位置１２２のリジンがアルギニンによって置換された変異体を示し、ＣＴＰ（Ｉｌｅ１３４）は、位置１３４がイソロイシンで置換された変異体を示す。ＣＴＰ（Ｖａｌ１２８Ｖａｌ１４３）は、２つの置換がなされており、１つは１２８位のロイシンであり、もう１つは１４２位のイソロイシンでなされた変異体を表す。ＣＴＰ（１２０−１４３；Ｉｌｅ１２８Ａｌａ１３０）は、２つの示されている置換がなされたＣＴＰユニットの関連した部分を表す。
【０１０１】
さらに、ＣＴＰ変異体の好ましいものは、１つ以上のＯ−結合グリコシル化部位が改変あるいは欠失されたものである。グリコシル化を阻むために部位を変異する特に好ましい方法は、これらの部位のセリン残基のアラニン残基への置換である。
【０１０２】
以下の式のＣＴＰユニットが特に好ましい：
【０１０３】
【化２】
【０１０４】
。
【０１０５】
αおよびβサブユニットの好ましい実施態様
無論のこと、一本鎖形態でのαおよびβサブユニットの天然形態は、好ましい実施態様内である。しかし、特定の変異体もまた好ましい。
【０１０６】
特に、５２位のＮ−結合グリコシル化部位が、この部位あるいはその近接でのアミノ酸置換によって除去あるいは改変されているαサブユニットの変異体が、アンタゴニスト活性に好ましい。７８位のグリコシル化部位での同様の改変もまた好ましい。８５−９２位での１つ以上のアミノ酸欠失もまた、αサブユニットを含むホルモン活性の性質に影響し、これらの位置でのアミノ酸置換あるいは欠失もまた、好ましい実施態様である。
【０１０７】
同様に、β鎖中のＮ−結合グリコシル化部位は、グリコシル化を排除するように好都合に改変され得、従って、β鎖のアゴニストあるいはアンタゴニスト活性に影響し得る。ＣＴＰが、ＣＧにおけるように天然に、あるいはリンカーとして存在させることによって存在するとき、この部分のＯ−結合グリコシル化部位もまた改変され得る。
【０１０８】
改変あるいは欠失したグリコシル化部位を含む特定の変異体は、Ｙｏｏ，Ｊ．ら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ（１９９３）２６８：１３０３４−１３０４２；Ｙｏｏ，Ｊ．ら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ（１９９１）２６６：１７７４１−１７７４３；およびＢｉｅｌｉｎｓｋａ，Ｍ．ら、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ（１９９０）１１１：３３０ａ（全て上記に記載）、およびＭａｔｚｕｋ，Ｍ．Ｍ．ら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ（１９８９）２６４：２４０９−２４１４；Ｋｅｅｎｅ，Ｊ．Ｌ．ら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ（１９８９）２６４：４７６９−４７７５；およびＫｅｅｎｅ，Ｊ，Ｌ，ら、Ｍｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ（１９８９）３：２０１１−２０１７に記載されている。
【０１０９】
グリコシル化部位それ自身のみが直接改変され得るばかりではなく、これらの部位の近接位置もまた、変異体のグリコシル化状態が影響を受けるように優位に改変される。αサブユニットについては、例えば、５０位−６０位間のアミノ酸が置換されることが好ましく（保存および非保存の両置換を含む）、特に、Ａｓｎ５２でのグリコシル化部位に近接するという理由から、５１位、５３位、および５５位での置換が好ましい。
【０１１０】
９１位のリジンがメチオニンあるいはグルタミン酸に転換されたαサブユニットの変異体もまた好ましい。
【０１１１】
変異体は個別サブユニットのバリエーションについて上記で考察してきたが、ダイマーの一本鎖形態が、改変に好機を提供することが想起される。特に、ダイマーの折り畳みに重要な領域は、一本鎖分子の正確なコンフォメーションに重要ではあり得ず、これらの領域は、ダイマー形態の個別メンバーの観点からは上記に記載されていないが、一本鎖形態のバリエーションを可能にする。さらに、一本鎖形態は、改変および／または欠失が上記のような生物学的活性に影響しない非重要領域に関して、劇的に改変され得る。
【０１１２】
適切な薬剤
リンカー部分に含まれ得る適切な薬剤は、インスリン様成長因子；上皮成長因子；酸性および塩基性線維芽細胞成長因子；血小板由来成長因子；種々のコロニー刺激因子（例えば、顆粒球ＣＳＦ、マクロファージＣＳＦなど）；ならびに種々のサイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−３、および過多のさらなるインターロイキンタンパク質）；種々のインターフェロン；腫瘍壊死因子などのような、ペプチドあるいはタンパク質を包含する。ペプチドあるいはタンパク質ベースの薬剤が一本鎖に含まれ得、完全な構築物が、１つの遺伝子の組換え発現によって容易に生産され得るという利点を有する。さらに、抗生物質、抗炎症剤、トキシンなどのような小分子薬剤が、使用され得る。
【０１１３】
一般的に、リンカー部分内に含まれる薬剤は、ホルモンが通常結合するレセプターの近隣で作用することが望まれる薬剤である。薬剤がリンカー内の含有から放出されるための適切な供給は、例えば、以下の調製方法の題の章にさらに詳細に記載されているような、酵素触媒による溶解用の部位を含有させることによって、提供される。
【０１１４】
その他の改変
本発明の一本鎖タンパク質は、リン酸化、グリコシル化、通常のグリコシル化形態の脱グリコシル化、アミノ酸側鎖の改変（例えば、プロリンのヒドロキシプロリンへの転換）、および、一般的に生じることが認められている翻訳後の事象に類似した同様の改変のような、アミノ酸配列を誘導体化すると一般的に理解されている方法で、さらに複合体化あるいは誘導体化され得る。
【０１１５】
本発明のホルモンのグリコシル化状態は、特に重要である。ホルモンは、原核宿主で生産するか、あるいはサブユニットおよび／または存在し得る任意のＣＴＰユニットに通常存在するグリコシル化部位を変異させることによって、非グリコシル化形態で調製され得る。ホルモンの非グリコシル化形態および部分的にグリコシル化された形態は、グリコシル化部位を操作することによって調製され得る。通常は、無論のこと、グリコシル化形態もまた、本発明の範囲内に包含される。
【０１１６】
当該分野で公知のように、本発明の一本鎖タンパク質はまた、所望の適応に応じて、標識、キャリア、固体支持体などにカップリングされ得る。標識形態は、それらの代謝過程の追跡に使用され得る。この目的のための適切な標識は、特に、ヨウ素１３１、テクネチウム９９、インジウム１１１などのラジオアイソトープ標識を包含する。標識はまた、アッセイ系中の一本鎖タンパク質の検出を仲介するために使用され得る。この場合、ラジオアイソトープはまた、酵素標識、蛍光標識、発色標識などと同様に使用され得る。このような標識の使用は、それらが標的因子レセプターリガンドであるので、これらのタンパク質に対して特に有用である。
【０１１７】
本発明のタンパク質はまた、これらの新規な改変形態と特異的に免疫反応する抗体の調製において、それらの免疫原性を増強するために、キャリアにカップリングされ得る。この目的のための適切なキャリアは、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）およびジフテリアトキソイドなどを包含する。二官能性リンカーの使用を含む、本発明の改変ペプチドをキャリアに連結させるための標準的なカップリング方法が、使用され得る。
【０１１８】
その他の方法とともに、同様の結合方法が、本発明のタンパク質を固体支持体にカップリングさせるために使用され得る。カップリングされると、これらのタンパク質は、次に、特異反応が示される所望の成分を分離するためのアフィニティー試薬として使用され得る。
【０１１９】
調製方法
本発明のタンパク質を構築するための方法は、当該分野で周知である。上記記載のように、遺伝子コードアミノ酸のみが含まれ、一本鎖が頭−尾配置であるときは、現在最も実用的なアプローチは、所望のタンパク質をコードするＤＮＡの発現によってこれらの物質を組換え法により合成することである。変異体を含む一本鎖形態をコードするヌクレオチド配列を含有するＤＮＡは、天然配列から調製され得る。部位特異的変異誘発、付加配列の連結、ＰＣＲ、および適切な発現系の構築のための方法は、これまでに当該分野で周知である。所望のタンパク質をコードするＤＮＡの部分あるいは全部は、好ましくは連結を容易にするための制限部位を含むように、標準的な固相法によって構築され得る。含まれるコーディング配列の転写および翻訳のための適切な制御要素が、ＤＮＡコーディング配列に提供され得る。周知のように、発現系は、広範囲の宿主（細菌のような原核宿主および酵母、植物細胞、昆虫細胞、哺乳類細胞、鳥類細胞などのような真核宿主を含む）に適したものが、今では入手可能である。
【０１２０】
宿主の選択は、特に翻訳後の事象（最も特にはグリコシル化を含む）に対してである。グリコシル化の位置は、分子内のグリコシル化部位の性質によって、ほとんどの場合制御されるが、しかし、この部位を占める糖の性質は、主として宿主の性質によって制御される。従って、本発明のホルモンの特性の微調整は、宿主の適切な選択によって達成され得る。
【０１２１】
αサブユニット部分の遺伝子の特に好ましい形態（αサブユニットは改変されるか、あるいは改変されない）は、「ミニ遺伝子」構築物である。
【０１２２】
本明細書で使用されているように、αサブユニット「ミニ遺伝子」は、ｐＭ２／ＣＧαあるいはｐＭ２／αの構築物の表現で、Ｍａｔｚｕｋ，Ｍ．Ｍ．ら、Ｍｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ（１９８８）２：９５−１００に開示されている遺伝子構築物のことである。この「ミニ遺伝子」は、エキソン３とエキソン４との間のイントロン配列のみの保持によって特徴づけられ、全上流イントロンは欠失している。記載されている特定の構築物では、エキソン２由来のＮ末端コーディング配列およびエキソン３の部分は、ｃＤＮＡから供給され、ＸｂａＩ制限部位を介して、エキソンＩおよびＩＩ間、ならびにエキソンＩＩおよびＩＩＩ間のイントロンが存在しないように、エキソン３のコーディング配列に直接連結される。しかし、エキソンＩＩＩおよびＩＶ間のイントロン、ならびにコーディング配列の３’のシグナルは保持される。得られたミニ遺伝子は、ＢａｍＨＩ／ＢｇｌＩＩセグメントとして好都合に挿入され得る。適切なミニ遺伝子のその他の構築方法は、無論のこと可能であり、定義は、コーディング配列がＸｂａＩ部位を介して連結される特定の構築に制限されない。しかし、これは遺伝子構築の好都合な手段であり、遺伝子の合成調製あるいは部分合成調製のような、その他のアプローチに対する特定の利点はない。定義は、エキソンＩＩＩおよびＩＶ間のイントロン、あるいは任意のその他のイントロンを保持し、好ましくはその他のイントロンを保持しない、αサブユニットに対するコーディング配列を包含する。
【０１２３】
組換え生産については、発現系を用いる改変宿主細胞が使用され、所望のタンパク質を生産するために培養される。これらの用語は、本明細書では以下のように使用される：
「改変された」組換え宿主細胞、すなわち、本発明の組換え発現系を「含むように改変された」細胞とは、それを導入するために、トランスフェクション、ウイルス感染などを含む任意の都合のよい様式によって、この発現系を含むように改変された宿主細胞のことである。「改変された」とは、この発現系を含有する細胞のことであり、系は染色体中に組み込まれるか、あるいは染色体外性である。「改変された」細胞は、発現系の含有に関して安定であり得るか、あるいは安定であり得ない。簡単には、本発明の発現系を有する「改変された」組換え宿主細胞とは、天然では含まないときに、この発現系を含ませる操作の結果として、この取り込み様式に関係なく、この発現系を含む細胞のことである。
【０１２４】
「発現系」とは、発現されるべきコーディングヌクレオチド配列、および、コーディング配列の発現に影響を及ぼすのに必要なこれらが伴う制御配列を含むＤＮＡ分子のことである。典型的には、これらの制御は、プロモーター、終止調節配列、および、いくつかの場合には、オペレーターあるいは発現を調節するその他の機構を含む。制御配列は、特定の標的組換え宿主細胞で機能的であるように設計され、従って、宿主細胞が、構築された発現系で制御配列に適するように選択されなければならない。
【０１２５】
生産されたタンパク質の分泌が所望される場合、シグナルペプチドをコードする付加ヌクレオチド配列もまた、プレタンパク質を生産するために所望の一本鎖ホルモンに作動可能に連結される、シグナルペプチドを産生するように含まれる。分泌に際して、シグナルペプチドは、成熟一本鎖ホルモンを放出するために切断される。
【０１２６】
本明細書で使用されているように、「細胞」、「細胞培養物」および「細胞系」は、意味の微妙な差に特に注意を払うことなく、互換的に使用される。それらの間の区別が重要な場合、文脈から明白である。いずれかが意味される場合、全てが包含されることが意図される。
【０１２７】
生産されたタンパク質は、細胞内で生産されるときは細胞溶解物から、あるいは、分泌されるときは培地から回収され得る。細胞培養物から組換えタンパク質を回収する方法は、当該分野で周知であり、これらのタンパク質は、クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、選択沈降などのような公知の方法によって、精製され得る。
【０１２８】
本発明のホルモンの全体あるいは部分は、当該分野で公知のペプチド合成法によって直接合成され得る。合成された部分は連結され得、リンカー部分に含まれる任意の薬剤のための放出部位は、標準的化学手段によって導入され得る。遺伝子によってコードされないアミノ酸を含有するこれらの実施態様および頭−頭あるいは尾−尾の配置が用いられるそれらの実施態様については、無論のこと、合成はタンパク質レベルで少なくとも部分的である。天然Ｎ末端あるいは天然Ｎ末端近接位置での頭と頭との接続は、ジカルボン酸誘導体のような、アミノ基と反応する官能基を含有するリンカーを介してもたらされる。Ｃ末端あるいはＣ末端近接位置での尾−尾配置は、ジアミン、ジオール、あるいはそれらの組合せであるリンカーを介してもたらされる。
【０１２９】
抗体
本発明のタンパク質は、これらの新規化合物と特異的に免疫反応する抗体を生成するために使用され得る。これらの抗体は、種々の診断および治療適用に有用である。例えば、本発明の一本鎖形態が、ヒトあるいは脊椎動物で治療的に使用されるときは、薬剤レベルは、従来のイムノアッセイ法を用いて、これらの抗体を使用してモニターされ得る。さらに、これらの一本鎖形態によって誘起された抗体のいくつかは、ヘテロダイマーと交差反応するので、ヘテロダイマーの天然に存在するレベルを診断するために使用され得る。
【０１３０】
抗体は、ウサギ、マウス、ヒツジ、あるいはラットのような哺乳動物での標準免疫プロトコールによって一般的に調製され、そして抗体は、十分な免疫を確実にするためにポリクローナル抗血清として力価測定される。次に、ポリクローナル抗血清は、例えば、イムノアッセイでの使用のために、回収される。宿主からの抗体分泌細胞、例えば、脾細胞あるいは末梢血白血球は、公知の方法によって不死化され、本発明のタンパク質に免疫特異性であるモノクローナル抗体の産生のためにスクリーニングされ得る。
【０１３１】
「タンパク質に免疫特異性の」によって、親和性あるいは非親和性を決定すると考えられる一般パラメーター内では、一本鎖タンパク質に免疫反応するが、ヘテロダイマー自身には免疫反応しない抗体が意味される。特異性とは、相対的な用語であって、１００倍以上の免疫反応性の差異のような、任意限定が選択され得ることは、理解される。従って、本発明内に包含される免疫特異抗体は、一本鎖タンパク質に対し対応のヘテロダイマーに対するより少なくとも１００倍を超える反応性である。
【０１３２】
処方
本発明のタンパク質は、一本鎖形態に対応するヘテロダイマーについて公知である方法と同様の方法によって、処方および投与され得る。従って、処方および投与方法は、使用される特定のホルモンに従って変化される。しかし、用量レベルおよび投与頻度は、特にCTPユニットが、その存在に起因して延長される生物学的半減期を考慮して存在するときには、ヘテロダイマーに比較して変化され得る。
【０１３３】
本発明のタンパク質の処方は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、最新版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｅａｓｔｏｎ、 ＰＡ．中に見出されるような、タンパク質またはペプチド薬剤に典型的な処方である。一般的に、タンパク質は、注射、特に静脈内、筋肉内、皮下、あるいは腹腔内注射により、あるいは経粘膜あるいは経皮送達のための処方を用いて、投与される。これらの処方物は一般的に、界面活性剤あるいは浸透剤（例えば、胆汁酸塩、フシジン酸など）を含有する。これらの処方物はエアロゾルあるいは坐薬、あるいは経皮投与の場合には、皮膚パッチの形態で投与され得る。
【０１３４】
処方物が、本発明のペプチドを消化器系での分解から保護すれば、経口投与もまた可能である。
【０１３５】
投与レジメおよび処方の最適化は、当該分野での規定様式および一般的に実施されているように実行される。
【０１３６】
使用方法
本発明の一本鎖ペプチドは、多様に使用され得、最も確実にはホルモンのヘテロダイマー形態の置換基として使用され得る。従って、ヘテロダイマーと同様に、本発明の一本鎖ホルモンのアゴニスト形態は、ヒトおよび動物の両方において、インビトロ授精法の助成のような不妊症治療、および天然ホルモンに関連するその他の治療法に使用され得る。
【０１３７】
一本鎖ホルモンはまた、ヘテロダイマーと同様の様式で、試薬として有用である。
【０１３８】
さらに、本発明の一本鎖ホルモンは、生物学的試料中の天然タンパク質に関連する抗体の存在あるいは非存在を検出するための診断手段として使用される。それらはまた、様々な試料中の、これらのホルモンレベルを評価するためのアッセイキット中のコントロール試薬として有用である。ホルモン自身のレベル、あるいはそれらに対して誘起された抗体のレベルを評価するプロトコールは、当該分野で周知の標準的なイムノアッセイプロトコールである。種々の競合および直接アッセイ法が、ラジオアイソトープ標識、蛍光標識、酵素標識などを含む様々な標識方法を伴って、使用され得る。
【０１３９】
本発明の一本鎖ホルモンはまた、天然ホルモンが結合するレセプターの検出および精製に有用である。従って、本発明の一本鎖ホルモンは、固体支持体にカップリングされ、レセプターあるいは抗ホルモン抗体のアフィニティークロマトグラフ調製に使用され得る。得られたレセプターは、治療および試薬候補物のスクリーニイングテストで、候補薬剤に対するホルモン活性を評価するのに、それ自体が有用である。
【０１４０】
最後に、本発明の一本鎖ホルモンと独特に反応する抗体は、これらの物質の単離および次の調製のための、精製手段として使用され得る。それらもまた、薬剤として投与された一本鎖ホルモンのレベルをモニターするのに使用され得る。
【０１４１】
以下の実施例は、本発明を例証することを意図するが、限定することは意図しない。
【実施例】
【０１４２】
実施例１：CGβ-αをコードするDNAの調製
図１は、発現ベクター用の挿入物の構築を示し、そこではヒトＣＧのβ鎖のＣ末端は、成熟ヒトαサブユニットのＮ末端に連結される。
【０１４３】
図１に示されているように、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、ＣＧβのエキソン３とαサブユニットのエキソン２との間で２つのサブユニットを融合するために使用され、ＣＧβのカルボキシ末端アミノ酸のコドンは、αサブユニットのＮ末端アミノ酸のコドンに、読み取り枠で直接融合される。これは、ハイブリッドプライマーを使用してＣＧβのエキソン３を含有するフラグメントを増幅することにより完了され、そのハイブリッドプライマーは、αサブユニットのＮ末端配列をコードする「尾」を有する。従って、得られた増幅フラグメントは、ヒトＣＧαをコードするエキソン２の部分を含有する。
【０１４４】
独立して、ＣＧβのＣ末端に対応するコドンと融合されたαサブユニットのＮ末端配列をコードするハイブリッドプライマーは、αミニ遺伝子を増幅するためのプライマーの１つとして使用される。各々が、もう一方のサブユニットをコードする重複部分を含有する２つの増幅フラグメントが、ＳａｌＩ挿入物を得るために、完全な配列の広がりを覆う２つのさらなるプライマーで、ともに増幅される。
【０１４５】
より詳細には、反応Ｉは、ＣＧβのエキソン３、および成熟αサブユニットの最初の４アミノ酸、およびコーディング配列の５’−方向にＳａｌＩ部位を含有するフラグメントの調製を示す。それは、Ｍａｔｚｕｋ，Ｍ．Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９８７）８４：６３５４−６３５８；Ｐｏｌｉｃａｓｔｒｏ，Ｐ．ら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ（１９８３）２５８：１１４９２−１１４９９に記載されている、ＣＧβゲノム配列の部分を増幅することによって得られる。
【０１４６】
プライマー１は、ＳａｌＩ部位を提供し、そして下記の配列を有する：
【０１４７】
【化３】
【０１４８】
もう一方のプライマーであるプライマー２は、αＮ末端配列の４コドンおよびＣＧβのＣ末端配列の５コドンに相補的であり、そして下記の配列を有する：
【０１４９】
【化４】
【０１５０】
従って、反応Ｉの産物である得られた増幅セグメントは、融合コーディング領域の５’−方向にＳａｌＩ部位を有する。
【０１５１】
反応ＩＩでは、類似の融合されたコーディング領域が、上記のαミニ遺伝子から得られる。プライマー３は、βサブユニットの４コドンおよびαの５コドンを含有すハイブリッドプライマーであり、そして下記の配列を有する：
【０１５２】
【化５】
【０１５３】
プライマー４は、ＳａｌＩ部位を含有し、αエキソン４の伸長に相補的である。プライマー４は、下記の配列を有する：
【０１５４】
【化６】
【０１５５】
従って、反応ＩおよびＩＩの産物は重複しており、そして、プライマー１および４の存在下でＰＣＲにかけられるとき、反応ＩＩＩで示されるように、所望のＳａｌＩ産物を生じさせる。
【０１５６】
ＣＧβエキソン３およびαミニ遺伝子を含有する増幅フラグメントは、Ｓａｃｈａｉｓ，Ｂ．，Ｓｎｉｄｅｒ，Ｒ．Ｍ．，Ｌｏｗｅ，Ｊ．，Ｋｒａｕｓｅ，Ｊ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ（１９９３）２６８：２３１９に記載されている様式で、ＣＧβエキソン１および２を含むｐＭ２由来の発現ベクターであるｐＭ２ＨＡ−ＣＧβエキソン１，２のＳａｌＩ部位へ挿入される。ＣＧβエキソン１および２を含むｐＭ２は、Ｍａｔｚｕｋ，Ｍ．Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ ＵＳＡ（１９８７）８４：６３５４−６３５８、およびＭａｔｚｕｋ，Ｍ．Ｍ．ら、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ（１９８８）１０６：１０４９−１０５９に記載されている。
【０１５７】
次に、この発現ベクターは、一本鎖形態ヒトＣＧを生産し、そこでは、βサブユニットのＣ末端はαサブユニットのＮ末端に直接連結されている。
【０１５８】
実施例２：一本鎖ヒトCGの生産および活性
実施例１で構築された発現ベクターを、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞にトランスフェクトし、タンパク質の産生を、ＳＤＳゲル上で放射性標識タンパク質の免疫沈降によって評価した。培養培地を回収して、一本鎖タンパク質の生活性を、ヒトＬＨレセプターに関する競合結合アッセイで、ヘテロダイマーと比較した。このアッセイでは、全ヒトＬＨレセプターをコードするｃＤＮＡを、発現ベクターｐＣＭＸに挿入した（Ｏｉｋａｗａ，Ｊ．Ｘ−Ｃら、Ｍｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ（１９９１）５：７５９−７６８）。２９３個の指数増殖期細胞を、Ｃｈｅｎ．Ｃ．ら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ（１９８７）７：２７４５−２７５２の方法によって、このベクターでトランスフェクトした。
【０１５９】
アッセイでは、ヒトＬＨレセプターを発現する細胞（２×１０５個／チューブ）を、試験されるべき試料との競合で、１ｎｇの標識ｈＣＧとともに、２２℃で１８時間インキュベートした。次に、試料を、０．１％ ＢＳＡを補充した冷却ダルベッコＰＢＳ（２ｍｌ）で５倍に希釈し、８００×ｇで１５分間遠心分離した。ペレットをダルベッコＰＢＳで２回洗浄し、放射活性をガンマーカウンターで測定した。特異的結合は、試料が存在しない状態では、加えられた全標識（ヨウ素化された）ｈＣＧの１０−１２％であった。試料の存在下での標識の減少は、試料の結合能力を測定する。このアッセイでは、２９３細胞中のヒトＬＨレセプターに関して、野生型ｈＣＧは、０．４７ｎｇのＥＤ５０を有し、一本鎖タンパク質は１．１ｎｇのＥＤ５０を有した。
【０１６０】
アゴニスト活性についてのさらなるアッセイでは、ｃＡＭＰ生産の刺激を評価した。この場合には、ヒトＬＨレセプターを発現する２９３細胞（２×１０５個／チューブ）を、濃度を変えたヘテロダイマーｈＣＧあるいは一本鎖ｈＣＧとともにインキュベートし、１８時間培養した。細胞外ｃＡＭＰレベルを、Ｄａｖｏｒｅｎ，Ｊ．Ｂ．ら、Ｂｉｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ（１９８５）３３：３７−５２に記載のように、特異的ラジオイムノアッセイによって測定した。このアッセイでは、野生型は、０．６ｎｇ／ｍｌのＥＤ５０を有し、一本鎖形態は１．７ｎｇ／ｍｌのＥＤ５０を有した。（ＥＤ５０は、有効用量の５０％である。）
従って、全ての場合において、野生型および一本鎖形態の両方の作用は類似する。
【０１６１】
実施例３：さらなる活性アッセイ
βＦＳＨ−ＣＴＰ−α一本鎖構築物についての発現ベクターでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞からの培地を回収し、実施例２に記載のように評価した。ＦＳＨレセプターへの結合についての競合アッセイの結果を図３に示す。その結果は、一本鎖形態が、ＦＳＨ自身のレセプターへの結合阻害において、野生型ＦＳＨあるいはβ鎖にＣＴＰ伸長を含むＦＳＨのいずれよりもより有効であることを示す。伸長ヘテロダイマーのＥＤ５０は１００ｍＩＵ／ｍｌをいくらか超えるが、一本鎖形態のＥＤ５０は、約５０ｍＩＵ／ｍｌである。野生型ＦＳＨのＥＤ５０は約１２０ｍＩＵ／ｍｌである。
【０１６２】
シグナル変換アッセイの結果を図４に示す。ＦＳＨの３つの全ての形態の有効性は、同等である。
【０１６３】
実施例４：さらなる発現ベクターの構築
実施例１に記載と同様の様式で、一本鎖ＦＳＨ、ＴＳＨ、およびＬＨ（βＦＳＨ−α、βＦＳＨ−ＣＴＰ−α、βＴＳＨ−α、β−ＴＳＨ−ＣＴＰ−α、βＬＨ−α、βＬＨ−ＣＴＰ−α）生産用の発現ベクターを調製し、ＣＨＯ細胞へトランンスフェクトした。得られたホルモンは、実施例２に記載されているようにアッセイしたときに、野生型形態の活性と同様の活性を示す。
【０１６４】
同様に、「２−β」一本鎖形態の発現ベクターを、実施例１に記載されているのと同様の様式で構築し、発現させて、実施例２に記載のようにアッセイした。
【図面の簡単な説明】
【０１６５】
【図１】図１は、ＣＧβの第３エキソンとαサブユニットをコードする第２エキソンとを融合する、ＳａｌＩ制限型ＤＮＡフラグメントの構築を示す。
【図２】図２は、ヒトＣＧβのアミノ酸配列および１１２−１４５位の番号付けを示す。
【図３】図３は、種々のＦＳＨアナログによる、ＦＳＨレセプターの競合結合アッセイの結果を示す。
【図４】図４は、種々のＦＳＨアナログに対するＦＳＨレセプターに関するシグナル変換アッセイの結果を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２００９−５０２７８（Ｐ２００９−５０２７８Ａ）
【公開日】平成２１年３月１２日（２００９．３．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２８４８２１（Ｐ２００８−２８４８２１）
【出願日】平成２０年１１月５日（２００８．１１．５）
【分割の表示】特願平８−５０７３７５の分割
【原出願日】平成７年８月１日（１９９５．８．１）
【出願人】（５９７０２５８０６）ワシントン・ユニバーシティ (26)
【氏名又は名称原語表記】Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年３月１２日（２００９．３．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１１月５日（２００８．１１．５）
【分割の表示】特願平８−５０７３７５の分割
【原出願日】平成７年８月１日（１９９５．８．１）
【出願人】（５９７０２５８０６）ワシントン・ユニバーシティ (26)
【氏名又は名称原語表記】Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ
【Ｆターム（参考）】
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