細菌性および真菌性生物膜の酵素による剥離のための組成物および方法
生物膜からの細菌細胞の剥離を促進する、可溶性のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼまたはその活性断片もしくは変異体の、単離核酸配列およびアミノ酸配列を提供する。表面にしっかり付着した生物膜コロニーを形成するが、細胞を媒体中に放出できない、または表面上に分散できない、単離された変異体細菌もまた提供する。さらに、可溶性のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼを突然変異させることにより、またはその発現もしくは活性を変化させることにより、生物膜からの細菌細胞の剥離を調節する方法を記載する。さらに、細菌感染症を予防、抑制および処置するための組成物、方法およびデバイスも提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
緒言
本出願は、その全体が参照によって本明細書に組込まれる2002年12月20日提出の米国仮出願第60/435,817号に基づく優先権の利益を主張する。
発明分野
【０００２】
本発明は、生物膜からの細菌細胞の剥離を促進するタンパク質である、可溶性のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼすなわちジスペルシンＢおよびそれらの活性断片もしくは変異体の単離核酸配列、ならびにそれらによってコードされるアミノ酸配列を提供する。核酸配列を含むベクターおよび、ジスペルシンＢタンパク質またはそれらの活性断片もしくは変異体を発現する宿主細胞も提供する。A. actinomycetemcomitansの生物膜剥離変異体（biofilm detachment mutant）についても記載される。本発明の核酸配列およびアミノ酸配列は、生物膜からの細菌細胞または真菌細胞の剥離を調節する方法において、また生物膜からの細菌細胞または真菌細胞の剥離を調節する剤を同定する方法において、有用である。したがって、これらの核酸配列およびアミノ酸配列および剤は、細菌感染または真菌感染の予防および処置において、また消毒薬および防腐溶液において、有用に用いられることが期待される。
発明背景
【０００３】
生物膜は、不活性または生きている表面に付着して増殖する細菌または真菌の集団である。多くの証拠は、生物膜がヒトの健康に対する重大な脅威であることを示している。公衆衛生局によれば、生物膜は、ヒトにおける細菌感染の８０％以上の原因であると推定されている（National Institutes of Health, 1998 RFA# DE-98-006）。生物膜が原因である疾患の例には、虫歯、歯周病、膵嚢胞性線維症、肺炎、先天性弁（native valve）心内膜炎、および中耳炎（Costerton et al. Science 1999 284: 1318-1322）、さらに種々の医療用デバイスの感染、例えば導尿カテーテル、機械弁、心臓ペースメーカー、人工関節、およびコンタクトレンズ（Donlan, R.M. 2001 Emerging Infect. Dis. 7: 277-281）の感染などが含まれる。真菌も臨床的に重要な生物膜を形成し、例えば、カンジダ感染症である。生物膜感染症は、毎年米国において何百万人もの患者を苦しめ、多大な医療費の支出を必要とさせている（Costerton et al. Science 1999 284: 1318-1322）。生物膜中で増殖する細菌は抗菌剤に対して抵抗性の増加を示し、根絶するのは殆ど不可能である。生物膜感染症の処置のための新しい方法が必要である。
【０００４】
生物膜中の細菌は、細菌全体を保持し、細菌全体を下の表面にしっかりと付着させる細胞外多糖類（ＥＰＳ）物質の網の目にからめられている。前の研究により、ＥＰＳを分解する酵素は、生物膜からの細胞の剥離を引き起こせることが示されている。例えば、アルギン酸ＥＰＳの分解を触媒する酵素であるアルギン酸リアーゼの過剰発現は、Pseudomonas aeruginosaのコロニーの表面への付着を困難にする（Boyd, A. and Charkrabarty, A.M. Appl. Environ. Microbiol. 1994 60: 2355-2359）。アルギン酸リアーゼは、膵嚢胞性線維症患者の肺におけるP. aeruginosa感染症の処置に使用することが示唆されている（Mrsny et al. Pulm. Pharmacol. 1994 7: 357-366）。類似の多糖類リアーゼが、P. Fluorescensによって生成されることが示されている（Allison et al. FEMS Microbiol. Lett. 1998 167: 179-184）。２種類の他のＥＰＳ分解酵素である、植物の病原体Xanthomonas campestrisからのエンド−β−１，４−マンナナーゼ（Dow et al. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 2003 100: 10995-11000）、およびメタン生成古細菌Methanosarcina mazeiからの脱凝集酵素（disaggregatase）（Liu et al. Appl. Environ. Microbiol. 1985 49: 608-613）が、生物膜の細胞の剥離を引き起こすことが示されている。X. Campestrisの場合、ＥＰＳ分解酵素の生成は、植物中のバクテリアの全毒性のために必要であった。歯の病原体であるStreptococcus mutansの生物膜コロニーからの細胞の剥離は、未同定の内因性酵素活性によって引き起こされることが示された（Lee et al. Infect. Immun. 1996 64: 1035-1038）。多糖類加水分解酵素の複合混合物が、スチールおよびポリプロピレン基質から生物膜を除去することが示された（Johansen et al. Appl. Environ. Microbiol. 1997 63: 3724-3728）。これらの所見は、ＥＰＳ分解酵素が、生物膜を表面から除去するための剤として用いられる可能性があることを示唆している。
【０００５】
酵素は、一般に産業環境において生物膜を除去するために用いられているにも関わらず、酵素を臨床環境での生物膜の除去のための剤として用いる可能性については、研究がなされていない。臨床上の特別な関心は、留置用医療用デバイス、特に静脈内カテーテルの生物膜感染症にある。カテーテル感染は入院患者によくみられ、高い罹患率および死亡率と関連する。これらの感染症を処置するための有望な新しいアプローチは、抗菌剤を被覆または浸透させたカテーテルを使用することであり、これら抗菌剤には抗生物質（Schierholz et al. J. Antimicrobial. Chemother. 2000 46: 45-50）、銀（Bechert et al. Infection 1999 27: S24-S29）、およびペプチド菌体感知阻害剤（Balaban et al. J. Infect. Dis. 2003 187: 625-630）などが含まれる。多くの研究により、抗菌活性を有する医療用デバイスは、細菌のコロニー形成および感染のリスクを低減させることが示されている（Tcholakian, R.K. and Raad, I.I. Antimicrob. Agents Chemother. 2001 45:1990-1993）。
【０００６】
本発明は、細菌細胞の剥離に関連する単離タンパク質およびその活性断片と変異体、ならびに、かかるタンパク質およびその活性断片と変異体をコードする核酸配列を提供する。細菌性または真菌性の生物膜細胞の剥離を調節する方法、ならびに、これらのタンパク質およびその活性断片と変異体および／または核酸配列を介して、細菌または真菌の剥離を調節する剤を同定する方法もまた提供される。
【０００７】
発明の概要
本発明の目的は、生物膜からの細菌細胞または真菌細胞の剥離を促進する、単離タンパク質およびそれらの活性断片と変異体を提供することである。単離タンパク質は、本明細書において、可溶性のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼすなわちジスペルシンＢと称する。
本発明の他の目的は、可溶性のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼおよびその活性断片と変異体をコードする単離核酸配列、ならびに、これらの配列を含むベクターおよび該ベクターを発現する宿主細胞を提供することである。
【０００８】
本発明の他の目的は、生物膜からの細菌細胞または真菌細胞の剥離を調節するための方法を提供することである。１つの態様において、該方法は、細菌細胞を突然変異させて、生物膜からの細菌細胞の剥離を抑制することを含む。他の態様において、該方法は、可溶性のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼまたはその活性断片もしくは変異体の、細菌細胞または真菌細胞における発現および／またはレベルを高めて、剥離を増加させることを含む。さらに他の態様において、該方法は、可溶性のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼまたはその活性断片もしくは変異体の発現および／またはレベルを低めて、または、可溶性のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼまたはその活性断片もしくは変異体の活性を抑制して、細菌細胞の剥離を減少させることを含む。
【０００９】
本発明の他の目的は、表面にしっかり付着するが、細胞を媒体中に放出したり表面上に広げたりしない、Actinobacillus actinomycetemcomitansの単離された変異体を提供することである。
本発明の他の目的は、細菌細胞または真菌細胞の生物膜からの剥離を調節する剤を同定するための方法であって、可溶性のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの活性および／またはレベルおよび／または発現を調節する剤の能力を評価することを含む、前記方法を提供することである。
【００１０】
本発明の他の目的は、細菌細胞中での可溶性のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの発現および／または活性を抑制する剤の投与を介した、感染性細菌の播殖の予防に用いるための組成物および方法を提供することである。
本発明の他の目的は、感染性細菌または真菌の表面への付着を予防または抑制するため、または感染性細菌または真菌を表面から除去するための組成物および方法であって、該表面を、可溶性のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼまたはその活性断片もしくは変異体によって処置することを含む、前記方法を提供することである。
【００１１】
本発明のさらに他の目的は、可溶性のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼのホモログを有するその他の細菌種を同定するために用いることのできるプライマー対を含む、ＰＣＲプライマー対およびキットを提供することである。
【００１２】
発明の詳細な説明
小さなグラム陰性球棹菌Actinobacillus actinomycetemcomitansは、ヒト口腔の一般的な居住細菌（common inhabitant）である（King, E.O. and Tatum, H.W. J. Infect. Dis. 1962 111:85-94）。A. actinomycetemcomitansは、青少年に影響を及ぼす重篤で急速な歯周病の一形態である、局所的な若年性の歯周炎の病原因子とされている（Zambon, J.J. J. Clin. Periodontol 1985 12: 1-20）。A. actinomycetemcomitansは粘膜下組織にも侵入することでき、感染性心内膜炎および他の非口腔的感染症を引き起こす（Kaplan et al. Rev. Infect. Dis. 1989 11: 46-63）。
【００１３】
ブロス中で培養された場合、A. actinomycetemcomitansの新鮮な臨床分離株は、ガラス、プラスチック、および唾液で被覆されたヒドロキシアパタイトなどの表面に除去しにくい生物膜を形成する（Fine et al. Arch. Oral. Biol. 1999 44: 1063-1076；Fine et al. Microbiol. 1999 145: 1335-1347；Fine et al. Arch. Oral Biol. 2001 46: 1065-1078；Haase et al. Infect. Immun. 1999 67: 2901-2908；Inouye et al. FEMS Microbiol. Lett. 1990 69: 13-18；Kachlany et al. J. Bacteriol. 2000 182: 6169-6176；Kachlany et al. Mol. Microbiol. 2001 40: 542-554；Kagermeier, A.S. and London, J. Infect. Immun. 1985 47: 654-658；Kaplan, J.B., and Fine, D.H. Appl. Environ. Microbiol. 2002 68: 4943-4950；King, E.O. and Tatum, H.W. J. Infect. Dis. 1962 111: 85-94；Rosan et al. Oral. Microbiol. Immunol. 1988 3: 58-93）。殆ど全ての細胞は表面に付着して増殖し、ブロスは透明のままで多くの場合無菌である（Fine et al. Arch. Oral. Biol. 1999 44: 1063-1076）。表面に形成された密度の高い生物膜は、洗浄剤などの剤、タンパク質分解酵素、熱、超音波処理、渦流攪拌等による除去に抵抗性があり（Fine et al. Arch. Oral. Biol. 1999 44: 1063-1076）、機械的なかきとりによってのみ、取り除くことができる。A. actinomycetemcomitansの生物膜コロニーは、プランクトン様に増殖する細胞に比べて、抗菌剤に対して高い抵抗性を示す（Fine et al. J. Clin. Periodontol. 2001 28: 697-700）。
【００１４】
強い付着は、A. actinomycetemcomitansがラットの口にコロニーを形成する能力において重要な役割を果たすことが示され（Fine et al. Arch. Oral Biol. 2001 46: 1065-1078）、ヒトにおいてコロニーを形成する能力においても同様に重要な役割を有すると考えられている。表面への強い付着は、細胞の表面に形成される、長く束になったピリ（線毛）の存在に依存する（Inouye et al. FEMS Microbiol. Lett. 1990 69: 13-18；Rosan et al. Oral. Microbiol. Immunol. 1988 3: 58-63）。主要なピリンサブユニットタンパク質をコードするｆｌｐ−１での突然変異は、フィムブリエを生成できない、または表面に付着できない細胞を生じる（Kachlany et al. Mol. Microbiol. 2001 40: 542-554）。
【００１５】
A. actinomycetemcomitansの生物膜コロニーは、液体媒体中に細胞を放出することが示され、該細胞は培養容器の表面に付着して新しいコロニーを形成し、生物膜が広がることを可能にする（Kaplan, J.B. and Fine D.H. Appl. Environ. Microbiol. 2002 68: 4943-4950）。
【００１６】
本発明の１つの側面は、表面には付着するが、媒体中に細胞を放出できないか、または表面に細胞を広がらせることのできない生物膜コロニーを形成する、A. actinomycetemcomitansの変異体に関する。A. actinomycetemcomitansの生物膜剥離変異体は、本明細書において、ＪＫ１０２３変異体と呼ぶ。A. actinomycetemcomitansの生物膜剥離ＪＫ１０２３変異体を作製するために、A. actinomycetemcomitansのＣＵ１０００Ｎ株をトランスポゾンＩＳ９０３φｋａｎを用いて突然変異させた。次に突然変異株（ＪＫ１０２３と指定）を単離した。この変異株は、野生型A. actinomycetemcomitans粗コロニー表現型（rough-colony phenotype）より粗いコロニー形態を寒天培地上に生じさせる（Fine et al. Microbiol. 1999 145: 1335-1347；Haase et al. Infect. Immun. 1999 67: 2901-2908；Inouye et al. FEMS Microbiol. Lett. 1990 69: 13-18）。ＪＫ１０２３コロニーは、堅い質感を有し、寒天培地表面から取り除くのが非常に困難であった。ブロス内で培養した場合、ＪＫ１０２３株は、大きさと形が野生株と類似した生物膜コロニーを生成したが、培養容器の表面にサテライトコロニーを生成することはできなかった。ＪＫ１０２３細胞のポリスチリンへの付着は、野生型のＣＵ１０００Ｎ株のそれと、９６穴マイクロタイタープレート結合アッセイによる測定で同程度であった。
【００１７】
本発明のＪＫ１０２３変異株の生物膜コロニーが、生物膜細胞の剥離の能力が欠損していることを示すために、生物膜コロニーを、２４穴マイクロタイタープレートの穴に入れたブロス中に吊り下げたポリスチレンロッド上で２４時間増殖させた。生物膜細胞の剥離の量は、穴の底で増殖する細菌をクリスタル・バイオレットで染色することにより、定量した。穴の底でのコロニー形成は、ポリスチレンロッド上で増殖した生物膜コロニーから剥離し、穴の底に落ちた細胞から生じる。このアッセイにおいて、ＪＫ１０２３株の生物膜コロニーは、野生株と比べて非常に少ない細胞を増殖させた（Ｐ＜０．０１、対応なし両側ｔ検定）。これらのデータは、ＪＫ１０２３変異株は、野生型の表面付着の表現型であるが、ＣＵ１０００Ｎ野性株と比較すると生物膜細胞の剥離が低下している表現型を示すことを示唆する。
【００１８】
本変異株のトランスポゾン挿入部位を含む領域のＤＮＡ配列解析により、挿入は、本明細書においてｄｓｐＢと指定された１，１４３塩基対のオープン・リーディング・フレームにあることが示された。ＣＵ１０００株からのｄｓｐＢ遺伝子は、本明細書でジスペルシンＢと呼ばれる、３８１個のアミノ酸残基を有する分子量４３．４ｋＤａのタンパク質をコードすることが予測された。ｄｓｐＢの５’端は予測された信号ペプチドを含み、ジスペルシンＢが分泌タンパク質であることを示唆している。
【００１９】
ｄｓｐＢ核酸配列または断片は、A. actinomycetemcomitansに加えて、Actiobacillus pleuropneumonaie、Haemophilus aphrophilusおよびActijnobacillus ligniersiiからも単離されている。ｄｓｐＢは、我々が試験した株の中ではHaemophilus influenzae、Pasteurella multicido、Mannheimia haemolytica、Actionobacillus equuliおよびHaemophilus ducreyiの遺伝子中には存在しなかった。
従って、本発明の他の側面は、ジスペルシンＢまたはその活性断片および変異体をコードする核酸配列、ならびにジスペルシンＢおよびその活性断片および変異体のアミノ酸配列に関する。本発明にさらに含まれるのは、これらの核酸配列を含むベクター、およびジスペルシンＢまたはその活性断片を発現するベクターを含む宿主細胞である。
【００２０】
本明細書で用いられる用語「核酸配列」は、非修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡまたは修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡを含むことが意図されるが、それらに限定しない。従って、核酸配列の用語により、一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡ、一本鎖領域と二本鎖領域が混合しているＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡおよび二本鎖ＲＮＡ、一本鎖領域と二本鎖領域が混合しているＲＮＡ、ならびに、一本鎖またはより典型的には二本鎖のＤＮＡおよびＲＮＡ、または一本鎖領域と二本鎖領域が混合しているＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子、を含むことが意図される。さらに、本発明のＤＮＡまたはＲＮＡ配列は、修飾された主鎖および／または修飾された塩基を含むことができる。ＤＮＡおよびＲＮＡに対する種々の修飾が、複数の有用な目的のために、当分野において知られている。本明細書で用いられる用語「核酸配列」は、核酸配列のかかる化学的、酵素的または代謝的に修飾された形態ならびに、単純型と複雑型細胞を含む、ウィルスおよび細胞に特徴的なＤＮＡおよびＲＮＡの化学的形態を包含する。
【００２１】
ＣＵ１０００株のｄｓｐＢのＤＮＡ配列は、アクセッション番号AY228551としてＧｅｎＢａｎｋに供託され、２００３年８月４日公開された。このＤＮＡの核酸配列は、配列番号１である。ジスペルシンＢタンパク質のオーソログをコードする核酸配列は、A. ligniersiiの１９３９３株、A. actinomycetemcomitansのＩＤＨ７８１株、Haemophilus aphrohpilusのＮＪ８７００株、およびA. pleuropneumoniaeのＩＡ５株において同定されており、それぞれ配列番号３、５、７および９として示されている。従って、本発明の好ましい単離核酸配列は、配列番号１、３、５、７または９を含む。
【００２２】
本発明にまた含まれるのは、ジスペルシンＢと類似の酵素活性を有するタンパク質をコードする、配列番号１、３、５、７または９の例示されたｄｓｐＢ核酸配列の対立遺伝子、および、類似の酵素活性を有するタンパク質をコードする、配列番号１、３、５、７または９の例示されたｄｓｐＢ核酸配列であって、実質的配列同一性パーセントを有する該核酸配列である。
本明細書で用いられる用語「対立遺伝子変異体」は、２または３以上の代替的な天然に存在する遺伝子の形態の１つであって、各遺伝子がユニークな核酸配列を含むものを意味する。本発明が包含する対立遺伝子は、類似または同一の酵素活性を有するタンパク質をコードする。
【００２３】
本明細書で核酸配列に関連して用いられる用語「配列同一性パーセント」は、最大に一致するように並べた場合に同一である、２つの配列中の残基を指す。配列同一性を比較する長さは、好ましくは少なくとも約９の連続したヌクレオチド長を超え、より好ましくは少なくとも約１８の連続したヌクレオチド長、さらにより好ましくは少なくとも約３０〜５０の連続したヌクレオチド長またはそれ以上である。当該技術分野に知られている種々のアルゴリズムが、核酸配列の同一性を測定するために利用可能である。その例には、FASTA（FASTA2およびFASTA3を含む）、GapおよびBestfitが含まれ、これらはWisconsin Package Version 10.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisconsinのプログラムであるが、これらに限定はされない。
【００２４】
「実質的配列同一性パーセント（substantial percent sequence identity）」は、本発明の核酸配列またはその断片を指す場合、適切なヌクレオチドの挿入または欠失を有する他の核酸(またはその相補鎖)と最適に整列させた場合、FASTA、BLASTまたはGapなどの、任意の周知の配列同一性のアルゴリズムにより測定したときに、ヌクレオチド塩基の少なくとも約５０％が同一であることを意味する。本発明の目的のためには、より好ましくは少なくとも約６０％〜７０％、さらにより好ましくは約８０％〜９０％、そして最も好ましくは少なくとも約９５％〜９８％のヌクレオチド塩基が、FASTA、BLASTまたはGapなどの任意の周知の配列同一性のアルゴリズムにより測定した場合に、同一である。
【００２５】
実質的配列同一性パーセントを有し、類似の機能活性を有するタンパク質をコードする核酸配列を、本明細書においてオーソログと呼ぶ。
ジスペルシンＢの推定アミノ酸配列およびそれらの例示のオーソログを図１に示す。具体的には、A. actinomycetemcomitansのＣＵ１０００Ｎ株のジスペルシンＢのアミノ酸配列（配列番号２）、ならびに、A. actinomycetemcomitansのＩＤＨ７８１株（配列番号６）、Haemophilus aphrophilusのＮＪ８７００株（配列番号８）、A. ligniersiiの１９３９３株（配列番号４）、およびA. pleuropneumoniaeのＩＡ５株（配列番号１０）からのジスペルシンＢのオーソログのアミノ酸配列を示す。
【００２６】
ジスペルシンＢおよびこれらオーソログのアミノ酸配列と、ファミリー２０グリコシル加水分解酵素の共通塩基配列には類似性がある。より具体的には、予測されたジスペルシンＢのタンパク質配列の４０〜２９７アミノ酸残基は、ファミリー２０グリコシル加水分解酵素の触媒領域（ＮＣＢＩ保存領域データベースアクセッション番号pfam00728）と相同である。酵素のこのファミリーは、細菌性キチナーゼ、キトビアーゼおよびラクト−Ｎ−ビオシダーゼ（Sano et al. J. Biol. Chem. 1993 268: 18560-18566；Tews et al. Gene 1996 170: 63-67；Tsujibo et al. Biochim. Biophys. Acta 1998 1425: 437-440）、および親核性ヘキソサミニダーゼ（Graham et al. J. Biol. Chem. 1988 263: 16823-16829）を含む。A. actinomycetemcomitansジスペルシンＢに関連するタンパク質は、Lactococcus lactisのラクト−Ｎ−ビオシダーゼ（GenBankアクセッション番号AAK05592）であり、これは、ギャップおよび末端の延長を数えないで、２８１個のアミノ酸残基中２８％の同一性を示す。ジスペルシンＢとラクト−Ｎ−ビオシダーゼとの間の類似性は、Ａｒｇ４７および酸性アミノ酸対Ａｓｐ２０２およびＧｌｕ２０３を含む領域で高い。これらの残基は、他のファミリー２０グリコシル加水分解酵素における基質結合および触媒に関与することが示されている（Mark et al. J. Biol. Chem. 2001 276: 10330-10337；Mark et al. J. Biol. Chem. 1998 273:19618-19642；Prag et al. J. Mol. Biol. 2000 300: 611-617）。ジスペルシンＢのＣ末端側の半分は、L. lactisのラクト−Ｎ−ビオシダーゼに保存されている３個のＴｒｐ残基を含む（２３６、２７９および３５３位置）。複数のＴｒｐ残基は、全てのファミリー２０グリコシル加水分解酵素の触媒ドメインのＣ末端領域に存在する（Graham et al. J. Biol. Chem. 1988 263: 16823-16829；Tews et al. Gene 1996 170: 63-67）。これらのＴｒｐ残基は、ヘキソサミン糖環の疎水性表面に相補的な、基質結合ポケットの一部に並ぶ（Tews et al. Nature Struct. Biol. 1996 3: 638-648）。ジスペルシンＢおよびそのオーソログのこれらの領域内のアミノ酸の突然変異が、酵素活性を変化させることが予想される。
【００２７】
好ましい態様において、本発明の単離されたアミノ酸配列は、配列番号２、４、６、８もしくは１０またはそれらの活性断片もしくは変異体を含む。好ましい活性断片は、ファミリー２０グリコシル加水分解酵素の共通塩基配列に類似した、配列番号２、４、６、８または１０のアミノ酸配列の部分を含むものである。
【００２８】
本明細書で用いられる「活性変異体」または「機能的に同等な変異体」は、ジスペルシンＢタンパク質と構造的に異なるポリペプチド配列であるが、このタンパク質との重要な機能的差異は有さないものである。例えば、A. actinomycetemcomitansの種々の株からのオーソログポリペプチド配列を並べると、通常は０〜１０％のアミノ酸配列の相違（divergence）が観察される（Kaplan et al. Oral Microbiol. Immunol. December 2002 17: 354-359；Kaplan et al. Infect. Immun. 2001 69: 5375-5384）。この量の相違を示すタンパク質は、機能的に同等な変異体と考えられるが、これは、これらの変異体をコードする対立遺伝子の混合が母集団において頻繁に観察されるという事実による（Kaplan et al. Oral Microbol. Immunol. December 2002 17: 354-359）。A. actinomycetemcomitansのＩＤＨ７８１株からのジスペルシンＢの配列（配列番号６）は、従って、配列番号２と機能的に同等であるか、またはその活性変異体であることが予想され、本発明の範囲に含まれる。同様に、A. actinomycetemcomitansの他の株からのジスペルシンＢの配列、例えば異なる血清型、制限断片長多型遺伝子型、１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子型、または、異なる対象から単離された系統学的に多様な株に通常観察される、任意にプライムされたＰＣＲ遺伝子型（Kaplan et al. J. Clin. Microbiol. 2002 40: 1181-1187；Kaplan et al., Oral Microbiol. Immunol. December 2002 17: 354-359）を示すものもまた、配列番号２と機能的に同等かまたは活性な変異体であり、本発明の範囲に包含される。
【００２９】
同様に、系統発生的に多様な細菌種からのオーソログタンパク質は通常、機能的に同等かまたは活性な変異体であり、これは、興味ある遺伝子をプラスミドにクローニングする通常の方法は、プラスミドライブラリをスクリーニングして、異なる細菌種において遺伝的突然変異を相補するプラスミドを見出すことであるという事実によって証拠付けられる（Kaplan et al. J. Mol. Biol. 1985 183: 327-340）。これは、細菌酵素について特にあてはまる。異なる細菌種のオーソログ酵素は、５０％またはそれ以上の相違を示すことができ、しかも同一の基質を利用し、同じ化学反応を触媒し、そして同じ産物を生成する。この配列の相違は、遺伝的浮動と、個体群における選択された遺伝的変化の定着とが組み合わさって生じる。選択され定着された遺伝的変化は、基質、反応、および産物以外の酵素の特徴を変化させるものであり、例えば、反応速度、最適ｐＨ、最適温度、発現レベル、および他の酵素との相互反応などであり、これらの遺伝的変化は、細菌細胞に対しその環境における選択的有利性を与える。A. actinomycetemcomitansは遺伝的にA. pleuropneumoniaeに近く関連しており（Dewhirst et al., J. Bacteriol. 1992 174: 2002-2013）、A. actinomycetemcomitansが生成するものに類似した生物膜（これは本明細書に示されるように、A. actinomycetemcomitansジスペルシンＢと接触して剥離するものである）を生成するため、配列番号１０と同定されるA. pleuropneumoniaeのｄｓｐＢホモログは、配列番号２と機能的に同等かまたは活性な変異体であることが予想され、これは本発明の範囲に包含される。同様に、Actinobacillus ligniersiiはActinobacillus pleuropneumoniaeに遺伝的に近く関連しており（Dewhirst et al., J. Bacteriol. 1992 174: 2002-2013）、またHaemophilus aphrophilusはA. actinomycetemcomitansに遺伝的に近く関連しているため（Dewhirst et al., J. Bacteriol. 1992 174: 2002-2013; Kaplan et al. J. Clin. Microbiol. 2002 40: 1181-1187）、そしてA. ligniersiiとHaemophilus aphrophilusの両者はA. actinomycetemcomitansが作成するものと類似の生物膜を作成するために、それぞれ配列番号４および配列番号８と同定されるActinobacillus ligniersiiおよびHaemophilus aphrophilusのジスペルシンホモログは、配列番号２と機能的に同等かまたは活性な変異体であることが予想され、これらも本発明の範囲に包含される。
【００３０】
上記の例は、A. actinomycetemcomitansジスペルシンＢの、天然に存在する機能的に同等かまたは活性な変異体を示す。しかしながら、当業者が本開示を読んで理解するように、A. actinomycetemcomitansジスペルシンＢの機能的に同等かまたは活性な変異体をコードする人工的に作製された遺伝子はまた、本明細書の教示に従い、種々のよく知られた遺伝工学的技法を用いて、ルーチンに作製することができる。例えば、２０個のＮ末端アミノ酸残基が欠損し、３２個のアミノ酸残基のＣ末端尾を含み、天然のジスペルシンＢ酵素と機能的に同等な、遺伝子操作されたジスペルシンＢ酵素が作製されている。この遺伝子操作されたジスペルシンＢ酵素のＮ末端におけるメチオニン残基は、大腸菌に発現されるとメチオニンアミノペプチダーゼの作用により除去されたが、メチオニンの不在は酵素活性に影響しなかったことが示されている。この遺伝子操作されたジスペルシンＢ酵素からの、Ｃ末端の２８個のアミノ酸残基の開裂は、酵素活性に影響しなかったことも示されている。これらの例は、A. actinomycetemcomitansジスペルシンＢの機能的に同等な変異体をコードする人工遺伝子が作製可能であることを示している。これらの人工的に作製された、A. actinomycetemcomitansジスペルシンＢの機能的に同等な変異体は、本発明の範囲に包含される。
【００３１】
上記の例は、遺伝子操作されたA. actinomycetemcomitansジスペルシンＢの機能的に同等な変異体であって、タンパク質のＮ末端におけるアミノ酸残基の欠失か、またはタンパク質のＣ末端における付加的ポリペプチドの融合のどちらかを含む前記変異体を示している。他の遺伝子操作された改変体（alteration）、例えばタンパク質のＮ末端における付加的ポリペプチドの融合、タンパク質のＣ末端におけるアミノ酸残基の欠失、アミノ酸残基の中間における欠失および挿入、およびアミノ酸置換もまた、A. actinomycetemcomitansジスペルシンＢの機能的に同等な変異体を生じる。どの欠失、挿入およびアミノ酸置換が、A. actinomycetemcomitansジスペルシンＢの機能的に同等な変異体を作製するかについての情報は、アミノ酸配列アラインメント（alignment）から、および、一般に利用可能なコンピュータソフトウェアから得ることができ、このソフトウェアは、両方の一次アミノ酸配列および、既知の３次元構造を有する類縁のタンパク質に対するアミノ酸配列アラインメントに基づいて、ポリペプチドの２次構造を予測するものである。A. actinomycetemcomitansジスペルシンＢは、例えば、ファミリー２０グリコシル加水分解酵素のメンバーであって、これは、幾つかのよく研究された酵素を含むファミリーおよび、公共データベースにおいて多くの類縁の一次アミノ酸配列により代表されるファミリーを含む。幾つかのケースにおいては、ファミリー２０グリコシル加水分解酵素の３次元構造は知られている（Tews et al. Nature Struct. Biol. 1996 3: 638-648）。
【００３２】
全てのファミリー２０グリコシル加水分解酵素は、（βα）８バレルモチーフ（barrel motif）（ＴＩＭ−バレルモチーフとしても知られている；Tews et al. Nature Struct. Biol. 1996 3: 638-648；Prag et al. J. Mol. Biol. 2000 300: 611-617）を有し、これは、タンパク質データバンク（ＰＤＢ）データベースの既知のタンパク質構造の中でもっとも一般的な酵素の立体構造型（fold）である。全ての既知の酵素の１０％がこのドメインを持つと推定されている（Wierenge, R.K., FEBS Lett. 2001 492: 193-198）。（βα）８バレルモチーフは、多くの異なる酵素ファミリーに見られ、全く関連のない反応を触媒する。多くの類縁の一次アミノ酸配列が利用可能なことは、幾つかのA. actinomycetemcomitansジスペルシンＢホモログの３次元構造が利用可能なことと組み合わさって、これらの配列構造および２次構造の予測の基礎となっている。例えば、（βα）８バレルモチーフは８個のαヘリックスおよび８個のβストランドからなり、ここで８個の平行なβストランドはタンパク質の内側でバレル（たる型）を形成し、それらはタンパク質の外側の８個のαヘリックスで覆われている。上記のタンパク質配列アラインメントおよび構造予測に基づき、A. actinomycetemcomitansのｄｓｐＢにおける８個のβストランドは、配列番号２の４１〜４４、６９〜８１、１３０〜１３４、１６９〜１７１、１８９〜２００、２５３〜２５６、２８８〜３００、および３４８〜３５０の位置を含むアミノ酸残基を含むことが予想される。これら８つの領域のβストランドアーキテクチャを破壊するアミノ酸配列中のいかなる改変も、これによって酵素の（βα）８バレルの３次元構造が同時に破壊されるため、酵素活性の低下を生じさせることが予想される。同様に、上記のタンパク質配列アラインメントおよび構造予測に基づき、A. actinomycetemcomitansのｄｓｐＢにおける８個のαヘリックスは、配列番号２の５２〜６３、８９〜９３、１４３〜１４９、１７６〜１８３、２１４〜２２８、２６９〜２８４、３０９〜３２１、および３６１〜３７４の位置を含むアミノ酸残基を含むことが予想される。これら８つの領域のαヘリックスのアーキテクチャを破壊するアミノ酸配列中のいかなる改変も、これによって酵素の（βα）８バレルの３次元構造が同時に破壊されるため、酵素活性の低下を生じさせることが予想される。
【００３３】
同様に、βストランドは、４つの内向き側鎖（βバレル内部を向いている）および４つの外向き側鎖（αへリックス方向を向いている）からなり、内向きアミノ酸残基の改変は、（βα）８バレル内側の基質結合ポケットに同時に改変を生じるため酵素活性を低下させることが予想され、また、外向きアミノ酸残基の改変は、それらがβストランドとαへリックスとの間の相互作用に干渉する場合、酵素活性を低下させることが予想される。同様に、ファミリー２０グリコシル加水分解酵素の活性部位は、常にバレルの８個の平行βストランドのＣ末端に位置する。A. actinomycetemcomitansジスペルシンＢの相同領域における改変は、酵素活性に影響することが予想される。同様に、αへリックスとβストランドの間の領域、すなわち、配列番号２の４５〜５１、６４〜６８、８２〜８８、９４〜１２９、１３５〜１４２、１５０〜１６８、１７２〜１７５、１８２〜１８８、２０１〜２１３、２２９〜２５２、２５７〜２６８、２８５〜２８７、３０１〜３０８、３２２〜３４７、および３５１〜３６０の位置への挿入および欠失の導入は、酵素活性に影響しないことが予想される。同様に、残基４７（アルギニン）、２０３（アスパルテート）、および２０４（グルタメート）の殆ど任意の改変は、これら３つの残基が全てのファミリー２０グリコシル加水分解酵素における基質結合および触媒に直接関与していることが示されているため、酵素活性の完全な喪失を生じさせる（Mark et al. J. Biol. Chem. 1998 273: 19618-19624；Prag et al. J. Mol. Biol. 2000 300: 611-617；Mark et al. J. Biol. Chem. 2001 276”10330-10337）。同様に、２３６、２５７および３５０位置における３個のトリプトファン残基の任意の非芳香族アミノ酸残基への改変は、これら３個のトリプトファン残基が、基質のヘキソサミン糖鎖の疎水性表面に補完的な基質結合ポケットの一部に並ぶことが示されているため、酵素活性の低下を生じさせる（Tews et al. Nature Struct. Biol. 1996 3: 638-648）。A. actinomycetemcomitansジスペルシンＢにおけるこれらの必須アミン酸残基の位置により、酵素活性を失うことなしに、４６個以下のアミノ酸残基がＮ末端から削除され得ること、および３１個以下のアミノ酸がＣ末端から削除され得ることが予測される。機能的に同等な変異体を生じるこれら全ての遺伝子改変は、本発明の範囲に含まれる。
【００３４】
A. actinomycetemcomitansジスペルシンＢの機能的に異なる変異体をコードする遺伝子はまた、よく知られた遺伝子操作の技法を用いて、本出願の教示に従って作製することができる。例えば、上記のように、配列番号２の残基４７（アルギニン）、２０３（アスパルテート）、および２０４（グルタメート）の殆ど任意の改変は、酵素活性の完全な喪失を生じることが予想される。代替的に、臨床の場面において有用となり得る特徴を示すA. actinomycetemcomitansジスペルシンＢの変異体は、人工的に作製することができる。例えば、A. actinomycetemcomitansジスペルシンＢの最適温度は３０℃である。最適温度３７℃を示す、遺伝子操作によるジスペルシンＢの変異体を作製することが望ましく、それによって、酵素の有効性を高め、または処置のコストを低減することになる。かかる変異体は、まず、例えばＵＶ光またはニトロソグアニジンなどの化学的突然変異原を用いてA. actinomycetemcomitansのｄｓｐＢ遺伝子配列にランダムな突然変異を作製し、次に、例えば、定量９６穴マイクロタイタープレートアッセイ（Kaplan et al. J. Bateriol. 2003 185: 4693-4698）によって、これらのランダムな多数の変異体をスクリーニングし、高い最適温度を示すものを探すことにより、人工的に作製することができる。代替的な方法は、ＤＮＡシャフリング（Christians et al. Nature Biotechnol. 1999 17: 259-264；Dichek et al. J. Lipid Res. 1993 34: 1393-1340）による配列の指向進化を利用し、定量的９６穴マイクロタイタープレートアッセイに基づく高スループット・ロボティックスクリーンと組み合わせて（Kaplan et al. J. Bateriol. 2003 185: 4693-4698）、最適温度が増加した変異体を同定する。これらの方法はまた、生体材料に対する高い持続性（substantivity）、高い最適ｐＨ、水溶液中での高い安定性、高い反応率、乾燥への高い安定性、および酵素の有効性の増加または処置のコストの低減をもたらすことができる他の特徴を示す、A. actinomycetemcomitansジスペルシンＢの変異体を作製するためにも用いることができる。
【００３５】
有用な変異体を作製するために用いることのできる代替方法は、部位特異的突然変異誘発法である。例えば、A. actinomycetemcomitansジスペルシンＢにおける（βα）８バレルの８個のαへリックスは、酵素の外表面に晒されている多くのアミノ酸残基を含み、そして、αへリックスの外向きアミノ酸残基の改変は、酵素の外表面の特性を変化させ、それによって、酵素活性に影響を及ぼすことなく、生体材料に対する酵素の持続性を増加させる可能性がある。よって、これらの外向きアミノ酸残基を、例えば極性残基から荷電残基へと体系的に突然変異させることができ、その結果生じた変異体をスクリーニングして、生体材料に対する持続性が増加した変異体を同定する。酵素の臨床での有用性または費用対効果を改善することを意図した、A. actinomycetemcomitansジスペルシンＢの機能的に異なる変異体は、生物膜から細菌細胞または真菌細胞を剥離するために適用される場合、本発明の範囲に含まれる。
【００３６】
本発明においてさらに提供されるのは、融合タンパク質および融合タンパク質をコードする核酸配列である。本発明の融合タンパク質は、生物膜からの細菌細胞の剥離を促進する、単離された可溶性のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼタンパク質のアミノ酸配列、および、第２ポリペプチドを含む。これらの融合タンパク質の第２ポリペプチドの例は、His tagなどの精製を促進するもの、アルブミン、フィブロネクチンまたはトロンビン等のタンパク質または抗体などの、表面への付着を促進するもの、および／または、酵素を特定の細菌または真菌受容体などの細菌細胞または真菌細胞へ標的化させるものなどを含むが、これらに限定はされない。かかる融合タンパク質をコードする核酸配列は、生物膜からの細菌細胞または真菌細胞の剥離を促進する、可溶性のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼまたはその活性断片もしくは変異体をコードする単離核酸配列、および第２ポリペプチドをコードする第２核酸配列を含有する。好ましい態様においては、第２核酸配列は、His tagなどの精製を促進するポリペプチド；アルブミン、フィブロネクチンまたはトロンビンなどの融合タンパク質の表面への付着を促進する抗体またはタンパク質；あるいは、融合タンパク質をそれぞれ細菌細胞または真菌細胞へ特異的に標的化させる細菌受容体または真菌受容体、などをコードする。
【００３７】
オクタヒスチジン金属結合部位をＣ末端に含むよう操作したジスペルシンＢタンパク質を、大腸菌に発現させた。このタンパク質をＮｉ親和性クロマトグラフィにより精製し、ハイブリッドタンパク質からトロンビンを用いて、ジスペルシンＢタンパク質を開裂した。精製され開裂されたジスペルシンＢタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析から、見かけの分子量４１ｋＤａで移動するタンパク質が示された。ジスペルシンＢのＮ末端配列は、XCVKGNSIYPQK（配列番号１１）（ここでＸは、未同定の残基）であった。これは、ＣＵ１０００のｄｓｐＢのコドン２２〜３３に適合し、ジペプチドＭｅｔ−Ａｓｎが、大腸菌に発現されたジスペルシンＢ融合タンパク質のＮ末端から開裂されたことを示した。精製され開裂されたジスペルシンＢタンパク質の質量分析では、見かけの分子量４１．５ｋＤａの単一の主要なピークを示し、これは、開裂され処理されたジスペルシンＢタンパク質に対する予測された分子量４１．４ｋＤａと等しかった。大腸菌に発現されたジスペルシンＢの収率は、１ｌの培養液当たり３０ｍｇのタンパク質であった。
【００３８】
ジスペルシンＢの、種々の４−ニトロフェニルで標識された合成ヘキソサミン基質を開裂する能力を、in vitro酵素アッセイで試験した。ジスペルシンＢは、β置換Ｎ−アセチルグルコサミニドの１→４グリコシド結合に対して特異性を示し、これは、他のファミリー２０グリコシル加水分解酵素の既知の機能と整合していた（Tews et al. Nature Struct. Biol. 1996 3: 638-648）。ジスペルシンＢは、α置換Ｎ−アセチルグルコサミニドまたはαもしくはβ置換Ｎ−アセチルガラクトサミンに対して活性を示さなかった。
ジスペルシンＢのグリコシル加水分解酵素活性は、ｐＨ５．０で最適であり、これは他のファミリー２０グリコシル加水分解酵素の最適ｐＨと同様である。ジスペルシンＢは、３０℃で最大活性を示した。ジスペルシンＢのグリコシル加水分解酵素活性は、キナクリン（Kovacs, P. and Csaba, G. Cell Biochem. Funct. 2001 19: 287-290）およびＮＡＧ−チアゾリン（Mark et al. J. Biol. Chem. 2001 276: 10330-10337）により阻害されたが、これらはファミリー２０β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの２つの小分子阻害剤である。
【００３９】
次に、ジスペルシンＢタンパク質の、A. actinomycetemcomitansのＪＫ１０２３変異株の生物膜細胞の剥離に対する効果について検討した。これらの実験において、ジスペルシンＢタンパク質をＪＫ１０２３変異株の増殖媒体に添加し、このタンパク質の添加が細胞の媒体中への放出および分散を回復させるかどうかを決定した。ＪＫ１０２３株の生物膜コロニーを含むポリスチレンロッドを、種々の量のジスペルシンＢを含むブロス液中に懸濁させ、生物膜の剥離の量を、穴の底で増殖する細菌をクリスタルバイオレットで染色することにより計測した。精製されたジスペルシンＢは、用量に応じて細胞を媒体中へ放出し、マイクロタイタープレート穴の底にコロニーを形成するＪＫ１０２３変異株の能力を回復させた。熱で不活性化させたジスペルシンＢは、ＪＫ１０２３株の生物膜剥離に対して効果を有さなかった。
【００４０】
ジスペルシンＢタンパク質の、A. actinomycetemcomitansおよび他の細菌が既に形成した生物膜コロニーを剥離する効果についても検討した。これらの実験において、ジスペルシンＢを添加すると、野生型ＣＵ１０００株の既形成生物膜コロニーの剥離を引き起こした。ジスペルシンＢ（５０μｇ／ｍｌ）は、６時間後に表面に関連した細菌量を９０％減少させた。さらに、光学顕微鏡検査による解析によれば、処理されたコロニー表面は、模擬処理した細胞に観察される滑らかな生物膜コロニーに比べると、ザラザラした綿毛状（grainy and flocculent）となった。また、培養容器の表面は、高い倍率では繊維状の外観を有する、同じようなザラザラした材料で覆われた。これらの所見は、ジスペルシンＢで処理した既形成生物膜コロニーにおいて観察された付着の減少と整合する。
【００４１】
ジスペルシンＢは、４種類の血清型を表わすA. actinomycetemcomitansの系統発生的に異なる４種類の株、すなわち、近縁種の細菌Haemophilus aphrophilusの１株、およびブタ病原菌Actinobacillus pleuropneumoniaeの２株の生物膜コロニーに対して試験された場合にも、同様の生物膜密度の減少を引き起こした。ジスペルシンＢは、Neisseria subflave、Cardiobacterium hominisまたはStreptococcus mitis、すなわちＮ−アセチルグルコサミン残基を含む生物膜を有していない細菌の、生物膜コロニーの剥離は引き起こさなかった。
【００４２】
ジスペルシンＢはまた、表面からのStaphylococcus epidermidisの剥離も引き起こす。グラム陽性細菌S. epidermidisは、カテーテルおよび他の留置医療デバイスに関連する感染の最も一般的な原因である。S. epidermidisは、主としてＮ−アセチルグルコサミン残基を含む多糖類を含む細胞外粘液を生成し（Mack et al. J. Bacteriol. 1996 178:175；Baldassarri et al. Infect. Immun. 1996 64: 3410）、これはプラスチックの表面に付着する膜の形成を可能とする。S. epidermidisなどの生物膜細菌は、抗生物質および宿主防衛に対して非常に抵抗性が高く、根絶することはは殆ど不可能である（Costerton et al. Annu. Rev. Microbiol. 1995 49:711）。従って、この細菌のカテーテルなどの留置デバイスへの付着は、特に免疫力が低下した患者において、骨髄炎、急性敗血症および死を引き起こす可能性があり、院内の血流および心血管系感染症、および入院患者の罹患の第一の原因である（Vuong, C. and Otto, M. Microbes, Infect. 2002 4: 481）。
【００４３】
感染した静脈内カテーテルから単離したS. epidermidisの４種の異なる株を、これらの実験に用いた。４株全ては、ｉｃａ遺伝子座を含んでおり、コンゴレッド寒天培地上に濃い赤色のコロニーを生成し、これらはどちらもスライムの生成を示唆している（Ariocola et al. J. Clin. Microbiol. 2001 39: 2151；Aricola et al. Biomaterials 2002 Biomaterials 23: 4233）。４種の株の生物膜形成能力は、新鮮なブロス液に一晩培養物の連続希釈物を作製し、続いて希釈物を９６穴ポリスチレンマイクロタイタープレートの穴に移して測定した。１６時間のインキュベーションの後、穴を水道水の流水下で洗浄して弱く付着した細胞を除去し、穴の底に付着して残った細菌をクリスタルバイオレットで染色した。予想通りに全４株は、穴の底に濃く染色された物質の存在が示すように、付着性の生物膜を生成した。濃く染色された物質の量は、マイクロタイタープレートリーダーで５９０ｎｍで光学密度を計測することにより定量した。ジスペルシンＢタンパク質を洗浄の３０分前に穴に添加すると（最終濃度：４０μｇ／ｍｌ）、生物膜物質は殆ど、または全く明らかにならなかった。対照的に、熱で不活性化したジスペルシンＢタンパク質は、S. epidermidisの生物膜に対して効果を有さなかった。A. actinomycetemcomitansジスペルシンＢと類縁の、他の２つのＮ−アセチルグルコサミニダーゼ酵素であるSerratia marcescensのキチナーゼおよびタチナタマメ（jack bean）のβヘキソサミニダーゼもまた、S. epidermidisの生物膜に対して効果を有さなかった。本明細書に記載されたオーソログと異なり、これら類縁のタンパク質は、ジスペルシンＢと２５％未満の同一性のみを有しており、生物膜放出活性を示さない。従って、これらの実験により、ジスペルシンＢの酵素活性が、S. epidermidis生物膜の細胞を穴の表面から取り除くのに関与していることを示している。ジスペルシンＢは、S. epidermidis細胞の生物利用能に対しては効果を有さなかった。
【００４４】
ジスペルシンＢタンパク質の量および、S. epidermidisの生物膜をマイクロタイタープレート穴から取り除くのに必要な時間の長さについても試験した。これらの実験において、複数の穴に１０−４希釈のS. epidermidis培養物を播種し、プレートを１６時間インキュベートした。弱く付着した細胞を洗い流した後、穴をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で満たし、次に様々な量のジスペルシンＢタンパク質（１ｍｌ当たり２００ｐｇ〜１２０μｇの最終濃度）を様々な時間（０〜９分間）穴に添加した。４．８μｇ／ｍｌのジスペルシンＢの処理で、２分後に、吸収がバックグランドレベルまで低下した（約０．０９Ｏ．Ｄ．単位）。４０ｎｇ／ｍｌの濃度では、ジスペルシンＢは、９分後に５０％以上の光学密度の低下を引き起こした（３．６３から１．７４Ｏ．Ｄ．単位へ）。これらのデータは、ジスペルシンＢが、臨床的に実現可能な酵素濃度でS. epidermidisの生物膜の剥離を引き起こすことを示す。
【００４５】
生物膜細胞の剥離の定量化を、S. epidermidisの生物膜をポリスチレンロッド上で増殖させ、続いて該ロッドをＰＢＳ（対照として）または６０μｇ／ｍｌのジスペルシンＢとＰＢＳとを含むチューブに移すことにより行った。該チューブは１５分間インキュベートし、ＰＢＳ中ですすぎ、処理後にロッドに付着している残留細菌を超音波処理により除去し、次に、この超音波処理物を連続的に希釈したものを寒天培地にプレーティングして定量した。模擬処理およびジスペルシンＢで処理したロッドを、クリスタルバイオレットで染色した後、比較した。模擬処理した対照ロッドは、表面に形成された厚い生物膜に対応する濃く染色された物質の層を含んでいた。ジスペルシンＢで処理したロッドは、濃く染色された物質の痕を示さず、染色前の超音波処理したロッドおよび播種なしのロッドと外観が類似していた。ロッドに付着して残留した細胞の定量化により、ジスペルシンＢの処理によって、表面に関連する細菌数が５．８ｌｏｇ低下したことが明らかとなった。
【００４６】
ジスペルシンＢの、ポリウレタンおよびテフロン（登録商標）静脈内カテーテルに付着して増殖したS. epidermidis生物膜を除去する能力についても試験した。これらの実験において、カテーテルは、１０−３希釈のS. epidermidis培養物を含むチューブ内に入れ、１６時間インキュベートした。カテーテルは次にＰＢＳですすぎ、ＰＢＳ（対照として）または６０μｇ／ｍｌのジスペルシンＢとＰＢＳとを含むチューブに移した。５分後、カテーテルをＰＢＳですすぎ、表面に付着した残留生物膜細菌を、メチレンブルー（ポリウレタンカテーテルに対して）またはクリスタルバイオレット（テフロン（登録商標）カテーテルに対して）で染色した。対照カテーテルはその表面に濃く染色された物質の層を含んでおり、生物膜の存在を示し、一方ジスペルシンＢで処理したカテーテルは濃く染色された物質を含まず、播種なしカテーテルと外観が類似していた。
【００４７】
このように、本発明のジスペルシンＢは、S. epidermidis生物膜を種々のプラスチック生体材料から取り除くことができる。
ジスペルシンＢで予め被覆された表面の、S. epidermidis生物膜形成を防ぐ能力についても示された。これらの実験において、ＰＢＳまたは４０μｇ／ｍｌのジスペルシンＢとＰＢＳとを含むチューブ内のポリウレタンカテーテルおよびテフロン（登録商標）カテーテルを、４℃で２４時間インキュベートした。カテーテルは次にＰＢＳですすぎ、１０−１希釈のS. epidermidis培養物を含むチューブ内に移した。６時間後、カテーテルをＰＢＳですすいで弱く付着した細胞を除去し、次に前述のようにして染色した。対照カテーテルの表面は濃く染色された物質の層で覆われており、生物膜の存在を示し、一方ジスペルシンＢで被覆したカテーテルは濃く染色された物質を含まず、播種なしカテーテルと外観が類似していた。このように、本発明のジスペルシンＢで予め被覆されたプラスチックカテーテルは、S. epidermidisの付着または生物膜生成を大幅に低減させた。１０分間前に被覆したカテーテル、および２４時間前に被覆して乾燥させたカテーテルもまた、S. epidermidisのコロニー形成および生物膜形成に対して抵抗性を有した。
【００４８】
従って、これらの実験で示されたように、単離されたジスペルシンＢの添加およびｄｓｐＢ遺伝子の突然変異は、種々の細菌の生物膜コロニーからの、細胞の剥離、特にＮ−アセチルグルコサミンを含む多糖類を含む生物膜を有する細菌の生物膜コロニーからの、細胞の剥離を調節する。真菌もまた、Ｎ−アセチルグルコサミンを含む多糖類を含む可能性のある、臨床的に重要な生物膜を形成する。ジスペルシンＢは、これらの真菌性の多糖類の分解および、それらの生物膜からのかかる真菌細胞の剥離の調節にも、有効であると考えられる。
【００４９】
従って、本発明はまた、生物膜からの細菌細胞または真菌細胞の剥離、特に、Ｎ−アセチルグルコサミンを含む多糖類を含む生物膜を有する細菌または真菌の剥離を調節する方法に関する。
本明細書で用いる「剥離の調節」により、細菌性生物膜もしくは真菌性生物膜の剥離、または生物膜からの細菌細胞もしくは真菌細胞の放出の、増加および減少を含むことを意味する。さらに、「剥離の調節」により、細菌または真菌の、生物膜として付着する能力における変化も含むことを意味する。例えば、本明細書で示されるように、ジスペルシンＢは、剥離を促進することによってばかりでなく、細菌が表面に付着して生物膜を形成する能力を抑制することによっても、S. epidermidisの剥離を調節する。
【００５０】
本発明の１つの態様においては、前記方法は、本発明のＪＫ１０２３変異体におけるように、細菌細胞のｄｓｐＢを突然変異させて生物膜からの細菌細胞の剥離を抑制することを含む。他の態様において、前記方法は、可溶性のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの発現および／またはレベルを減少させること、または細菌細胞中の可溶性のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの活性を阻害して、細菌細胞の剥離を低減させることを含む。
【００５１】
本発明はまた、細菌細胞または真菌細胞の生物膜からの剥離を促進する方法を提供し、この方法は、細菌細胞または真菌細胞を、可溶性のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼまたはその活性断片もしくは変異体、または可溶性のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼまたはその活性断片もしくは変異体をコードする核酸配列に接触させることを含む。例えば、A. actinomycetemcomitansジスペルシンＢは、Haemophilus aphrophilus、Actionbacillus pleuropneumonaieおよびS. epidermidisの生物膜を剥離することが見出された。Actionobacillus ligniersii、および、例えばどのような意味でもこれに限定するものではないがStaphylococcus aureusおよびYersinia pestisなどを含む、Ｎ−アセチルグルコサミンを含む多糖類を含む生物膜を有する他の細菌または真菌の生物膜剥離もまた、本発明の可溶性のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼまたはその活性断片の存在下で促進されると考えられる。
【００５２】
従って、単離されたジスペルシンＢタンパク質およびそれらの活性断片または変異体は、細菌性または真菌性生物膜の付着を防ぐこと、または阻害すること、およびかかる細菌または真菌による感染を処置することに用いることができる。
１つの態様においては、単離されたジスペルシンＢタンパク質およびその活性断片または変異体は、生物膜感染を処置するため、例えば雌ヒツジにおける乳腺炎、雌ウシにおける乳房炎またはヒトにおける骨髄炎および感染性心内膜炎を処置するために、非経口的に直接用いることができる。この態様においては、単離された可溶性のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼタンパク質またはその活性断片もしくは変異体は、好ましくは、生物に対して薬学的に許容し得る担体中の医薬組成物として投与される。
【００５３】
「生物」により、本明細書で用いられる場合、哺乳類を含むがそれには限定されない全ての動物を意味し、最も好ましくはヒトを意味する。
任意の薬学的に許容し得るビヒクルまたは担体、および補助剤を、ジスペルシンＢタンパク質またはその活性断片もしくは変異体を含む医薬製剤の製造、溶解および投与に用いることができる。かかるビヒクル、担体および補助剤は当業者によく知られており、Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1985などの教科書に記載されている。医薬組成物中に含まれるべき活性成分の適切な濃度は、当業者によりルーチンで決定することができ、投与形態および処置する状態の重篤度に依存する。
【００５４】
経口投与に好適な医薬製剤は、便利な単位形態で提供することができ、これに限定はしないがカプセルまたは錠剤を含み、該カプセルまたは錠剤の各々は、予め決められた量のジスペルシンＢタンパク質またはその活性断片もしくは変異体を、粉体または顆粒として；溶液、懸濁液または乳濁液として含む。ジスペルシンＢタンパク質またはその活性断片もしくは変異体はまた、ボーラス、舐薬、またはペーストとすることもできる。経口投与用の錠剤およびカプセルは、従来の賦形剤、例えば結合剤、充填剤、潤滑剤、分解剤、または湿潤剤などを含むことができる。錠剤は、当業者に知られた方法に従って被覆することができる。当業者に知られている時間放出製剤も適している。経口用液体製剤は、例えば水性もしくは油性の懸濁液、溶液、乳濁液、シロップもしくはエリキシル剤などの形態で、または、水もしくは他の好適なビヒクルと共に使用前に構成する乾燥製品として、提供することができる。かかる液体製剤は、従来の添加剤、例えば懸濁剤、非水溶性ビヒクルで食用油を含むもの、または保存剤などを含むことができる。
【００５５】
本発明のジスペルシンＢタンパク質またはそれらの活性断片もしくは変異体はまた、例えば、注入により、例えばボーラス注入または持続輸注により、非経口投与用の製剤にすることができ、アンプル、予注入シリンジ、少量輸注にて単位用量形態で、または、保存剤添加の複数用量用容器にて、製剤とすることができる。非経口的投与のためにジスペルシンＢタンパク質またはその活性断片もしくは変異体を含む、薬学的に許容し得る組成物は、油性または水性のビヒクル中に懸濁液、溶液または乳濁液の形態で存在することができ、懸濁剤、安定剤、および／または分散剤などの製剤化用の剤を含むことができる。代替的に、活性成分は、殺菌した固体の無菌性単離によりまたは溶液から凍結乾燥することにより粉末形態にしておき、使用前に、殺菌した発熱物質を含まない水などの好適なビヒクルと構成することもできる。
【００５６】
表皮への局所投与については、本発明のジスペルシンＢタンパク質またはその活性断片もしくは変異体は、軟膏、クリーム、またはローション中に、または経皮パッチとして製剤化することができる。軟膏およびクリームは、例えば、水性または油性のベースと共に、好適な増粘剤および／またはゲル化剤を添加して製剤化することができる。ローションは水性または油性のベースと共に製剤化することができ、一般にまた、１種または２種以上の乳化剤、安定剤、懸濁剤、増粘剤、または着色剤を含む。口への局所投与に好適な製剤は、以下を含む：風味付けされたベース、通常はショ糖およびアカシアまたはトラガカントの中に、ジスペルシンＢタンパク質またはそれらの活性断片もしくは変異体を含むロゼンジ；ゼラチンおよびグリセリンまたはショ糖およびアカシアなどの不活性ベースに活性成分を含むパステル剤；および、好適な液体担体中に活性成分を含むうがい薬、。眼への局所投与に対しては、ジスペルシンＢタンパク質またはそれらの活性断片もしくは変異体は、好適な殺菌した水性または非水性のビヒクル中の溶液または懸濁液中に作製することができる。バッファ（例えば、メタ重亜硫酸ナトリウムまたはエデト酸二ナトリウム）などの添加剤およびヒプロメロース（hypromellose）などの増粘剤もまた含有可能である。
【００５７】
鼻腔内投与の場合、本発明のジスペルシンＢタンパク質またはその活性断片もしくは変異体は、液体スプレーまたは分散性粉末または滴剤の形態で提供することができる。滴剤は、１種または２種以上の分散剤、溶解剤、または懸濁剤を含む、水性または非水性ベースと共に製剤化することができる。液体スプレーは、加圧パックから便利に送達される。
吸入による投与の場合、本発明のジスペルシンＢタンパク質またはそれらの活性断片もしくは変異体は、通気器、ネブライザー、またはエアゾールスプレーを送達する加圧パックまたは他の便利な方法により、送達することができる。加圧パックは、好適な噴霧剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の好適なガスなどを含むことができる。加圧エアゾールの場合、用量単位は、計測した量を送達するためのバルブを提供することにより決定することができる。
【００５８】
代替的に、吸入または通気器による投与の場合、本発明のジスペルシンＢタンパク質またはそれらの活性断片もしくは変異体は、乾燥粉末組成物の形態、例えば活性成分と乳糖またはスターチなどの好適な粉末ベースとの粉末混合物の形態をとることができる。粉末組成物は、例えばカプセル、カートリッジまたはゼラチンのブリスターパックなどに入れた単位用量形態をとることができ、それらから、吸入器または通気器の助けにより粉末が投与される。
【００５９】
必要に応じて、任意の前述の製剤を、ジスペルシンＢタンパク質またはその活性断片もしくは変異体の持続放出を提供するように適合することができる。
本発明のジスペルシンＢタンパク質またはその活性断片もしくは変異体の、処置に用いるために必要な量は、選択された特定のタンパク質または活性断片もしくは変異体によるのみでなく、投与経路、処置される状態の特徴、および生物の年齢および状態によっても当然変化する。
【００６０】
生物膜からの細菌の剥離の増加はまた、抗生物質による治療に対する細菌の抵抗性を減少させることが期待される。従って、本発明はまた、本発明の医薬組成物を抗生物質投与と組み合わせて、またはそれに先立って投与することによる、細菌感染に対する抗生物質治療の有効性を強化するための方法も提供する。
【００６１】
本発明の他の態様により、これらに限定はしないがスポンジまたはガーゼを含む創傷包帯を、単離されたジスペルシンＢタンパク質またはその活性断片もしくは変異体を含浸させて、細菌または真菌の付着を妨害または抑制し、創傷の感染のリスクを低減することができる。同様に、カテーテルシールドおよびカテーテル挿入部位を被覆するために用いる他の材料を、ジスペルシンＢタンパク質またはその活性断片もしくは変異体により被覆または含浸させて、細菌性または真菌性生物膜のそれらへの付着を阻害することができる。ハイリスクの外科手術中に創傷の感染を防ぐために用いられる粘着性ドレープもまた、単離されたタンパク質またはその活性断片もしくは変異体に含浸させることができる。ジスペルシンＢタンパク質またはその活性断片もしくは変異体により被覆することができるさらなる医療デバイスは以下を含むが、これらに限定はされない：中心静脈カテーテル、血管内カテーテル、尿カテーテル、ヒックマンカテーテル、腹膜透析カテーテル、気管内チューブ、機械弁、心臓ペースメーカー、動静脈シャント、強膜バックル（schleral buckle）、人工関節、鼓膜切開チューブ、気管切開チューブ、人工声帯（voice prosthetics）、人工ペニス、人工尿道括約筋、合成恥骨膣スリング（synthetic pubovaginal sling）、縫合糸、骨用アンカー、骨用スクリュー、眼内レンズ、コンタクトレンズ、子宮内デバイス、大腿動脈移植および血管移植。ガーゼまたはスポンジ、カテーテルシールドおよび粘着性ドレープを含浸させるため、またはカテーテルシールドおよび他の医療デバイスを被覆するための溶液の例は、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ約７．５）および重炭酸緩衝液（ｐＨ約９．０）を含むが、これらに限定されない。
【００６２】
さらに他の態様において、単離されたジスペルシンＢタンパク質またはその活性断片もしくは変異体は、消毒溶液に組み込むことができる。かかる溶液は、さらに、アルコールなどの抗菌薬または抗真菌剤、プロビドン−ヨード溶液および抗生物質および保存剤を含むことができる。これらの溶液は、例えば、カテーテルなどのデバイスの挿入または移植の前に皮膚またはその周辺領域の消毒剤として、カテーテルのロックおよび／またはフラッシュ溶液として、および、任意の医療デバイスの消毒すすぎ剤として用いることができ、前記医療デバイスには、針、ロイアロックコネクタ（Leur-Lok connector）、針なしコネクタおよびハブなどのカテーテル部品、および他の移植用デバイスが含まれるが、これらに限定されない。これらの溶液はまた、クランプ、ピンセット、鋏、皮膚用フック、チューブ、針、開創器、スケーラー、ドリル、チゼル、ラスプおよび鋸などを含む外科用器具の被覆または消毒のために用いることができるが、外科用器具はこれらに限定はされない。
【００６３】
本発明の核酸配列およびアミノ酸配列、およびＪＫ１０２３変異株はまた、生物膜からの細菌細胞または真菌細胞の剥離を調節する剤を同定するためにも用いることができる。例えば、剤の有する、本発明の可溶性のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの活性および／または発現を調節する能力を評価することができる。
かかる剤には、これらに限定はされないが、ｄｓｐＢ遺伝子を標的とするアンチセンスのオリゴヌクレオチドまたはリボザイム、ジスペルシンＢのペプチド模倣薬、および、ジスペルシンＢの活性および／またはレベルおよび／または発現を調節する、キナクリンおよびＮＡＧチアゾリンなどの小さな有機化学物質が含まれる。
【００６４】
可溶性のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼが有する、生物膜からの細菌細胞の剥離を促進するという能力を抑制する剤は、感染性の細菌の播殖、特にA. actinomycetemcomitansおよび近縁種の細菌であるHaemophilus aphrophilusなどの口腔の感染性細菌の播殖を防ぐのに、有用であることが期待される。
ジスペルシンＢの活性を模倣する剤、例えばペプチド模倣薬およびジスペルシンＢと構造および活性が類似の有機小分子は、単離されたジスペルシンＢまたはその活性断片もしくは変異体と同様の様式で、細菌性または真菌性生物膜の表面への付着から生じる感染を、防ぐ、抑制する、または処置するために、用いることができる。かかる使用は上記の本明細書に詳細に記載されている。
【００６５】
本発明はまた、ジスペルシンＢホモログを有する細菌のさらなる種を同定するために用いるための、プライマー対および、かかるプライマー対を含むキットを提供する。本発明のキットにおいて有用な縮重プライマー対の例は、5’-GAYCAYGARAAYTAYCG-3’（配列番号１２）および5’-TCNCCRTCRTARCTCCA-3’ （配列番号１３）を含み、ここでＹはＣまたはＴ、およびＲはＡまたはＧである。本発明のキットは、好ましくは、キットの使用の手引き、および／または陽性および陰性対照サンプルをさらに含む。これらのキットによってジスペルシンＢホモログを有すると同定された細菌は、さらに試験して、ホモログがジスペルシンＢと同一または類似の酵素活性を示すオーソログであるかどうかを決定する。本発明のプライマーおよびキットは、従って、生物膜へのその付着が核酸配列、アミノ酸配列、および本明細書に記載の剤を用いて調節できるさらなる細菌、ならびに、ジスペルシンＢのさらなるオーソログ核酸配列およびアミノ酸を、同定するのに有用である。
以下の非限定的な例は、本発明をさらに説明するために提供される。
【００６６】
例
例１：細菌株および増殖条件
A. actinomycetemcomitansのＣＵ１０００（血清型ｆ）は、１３歳の若年性局所歯周炎の患者から単離された臨床株である（Fine et al. Microbiol. 1999 145: 1335-1347）。ＣＵ１０００Ｎ株は、ＣＵ１０００株のナリジクス酸自然発生誘導体であって、母株と同じく、表面への付着、生物膜コロニー形成および生物膜の分散表現型を示す誘導体である（Fine et al. Arch. Oral Biol. 2001 46: 1065-1078；Kachlany et al. J. Bacteriol. 2000 182: 6169-6176；Kachlany et al. Mol. Microbiol. 2001 40: 542-554；Thomson et al. J. Bacteriol. 1999 181: 7298-7307）。トランスポゾンＩＳ９０３φｋａｎによるＣＵ１０００Ｎ株の突然変異誘発を、Thomsonらが示した手順に従って行った（J. Bacteriol. 1999 181: 7298-7307）。他に利用した株には、A. actinomycetemcomitansのＤＦ２２００（血清型ａ）、ＮＪ８８００（血清型ｂ）、ＮＪ２７００（血清型ｃ）、およびＮＪ９５００（血清型ｅ）（Kaplan et al. J. Clin. Microbio. 2002 40: 1181-1187）；ならびに、A. actinomycetemcomitansのＩＤＨ７８１株（Saarela et al. Oral Microbiol. Immunol. 1993 8: 111-115）；Haemophilus aphrophilusの ＮＪ８７００株（Kaplan et al. J. Clin. Microbiol. 2002 40: 1181-1187）；Neisseria subflavaのＮＪ９７０２株（Kaplan, J.B. and Fine, D.H. Appl. Environ. Microbiol. 2002 68: 4943-4950）；Cardiobacterium hominisのＮＪ６５００株；Actionbacillus ligniersiiの１９３９３株（ATCC, Manassa, VAから入手）；およびStreptococcus mitis のＮＪ９７０５株（Kaplan, J. B. and Fine, D. H. Appl. Environ. Microbiol. 2002 68: 4943-4950）が含まれる。S. epidermidis株は、感染した静脈内カテーテルの表面から単離され、Api-Staph生化学同定キット（Biomerieux Lyons France）を用いて同定した。A. pleuropneumoniae株は、Veterinary Diagnostics Laboratory（Iowa State University, Ames, IL）から入手した。細菌は、Trypticase大豆ブロス（BD Biosystems）に、１リットル当たりイースト抽出物６ｇおよびグルコース８ｇを加えた中で培養した。播種した培養容器は３７℃、１０％ＣＯ２下でインキュベートしたが、S. epidermidisの培養のみは、３７℃の空気中でインキュベートした。
【００６７】
例２：ｄｓｐＢのクローニングおよび配列決定
A. actinomycetemcomitansのＪＫ１０２３突然変異株のトランスポゾン挿入部位を、逆ＰＣＲ法を用いてKaplanら（Infect. Immun. 2001 69: 5375-5384）に従ってクローニングおよび配列決定した。逆ＰＣＲ産物のＤＮＡ配列を、Actinobacillus遺伝子配列決定プロジェクトによるA. actinomycetemcomitansのＨＫ１６５１株の遺伝子配列と比較して、トランスポゾンが、ｄｓｐＢと指定された長いオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）の中に挿入されたことを見出した。ＨＫ１６５１のｄｓｐＢの上流および下流配列にハイブリダイズするプライマーを用いて、A. actinomycetemcomitansのＣＵ１０００株からのｄｓｐＢコーディング領域を、Kaplanら（Infect. Immun. 2001 69: 5375-5384）に従った方法を用いてＰＣＲにより増幅した。
【００６８】
フォワードプライマー（5-GCGCGCCATatgAATTGTTGCGTAAAAGGCAATTCC-3（配列便号１４））は、ＮｄｅＩ制限酵素認識部位（下線部）およびＡＴＧ開始コドン(小文字部)を、ｄｓｐＢのコドン位置１９〜２０に導入し、リバースプライマー（5-GCGGTACCCTCATCCCCATTCGTCTTATGAATC-3（配列便号１５））は、ｄｓｐＢの終止コドンをＫｐｎＩ制限酵素認識部位（下線部）で置き換えた。ＰＣＲ産物（１，１０６塩基対）を、ＮｄｅＩおよびＫｐｎＩを用いて切断（digest）し、プラスミドｐＥＴ２９ｂ（Novagen）のＮｄｅＩ／ＫｐｎＩ部位に結紮した。得られたプラスミド（ｐＲＣ１とする）のインサートは、Kaplanらが記載した手順（Infect. Immun. 2001 69: 5375-5384）に従ってＤＮＡ配列決定解析を行った。
【００６９】
例３：組み換えジスペルシンＢの発現および精製
プラスミドｐＲＣ１は、ヘキサヒスチジン金属結合部位と、ハイブリッドタンパク質からＣ末端尾を開裂するために用いることができるトロンビンプロテアーゼ開裂部位とを含む３２個のアミノ酸残基のＣ末端尾に融合された、ｄｓｐＢのアミノ酸２１〜３８１をコードする遺伝子を運ぶ。この遺伝子は、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）誘導性ｔａｃプロモーターの下流に位置していた。
【００７０】
大腸菌におけるｄｓｐＢの発現
ＬＢブロス５００ｍｌにカナミシン５０μｇ／ｍｌを添加したものを含む１リットルの三角フラスコに、大腸菌ＢＬ２１株（ＤＥ３）（Dubendorff, J.W. and Studier, F.W. J. Mol. Biol. 1991 219: 61-68）の一晩培養液をｐＲＣ１で転換したものを播種した。フラスコを３７℃で攪拌しながら（２００ｒｐｍ）、培養液の光学密度（２８０ｎｍで測定）が０．６になるまでインキュベートした（約３時間）。ＩＰＴＧを加えて最終濃度を０．２ｍＭとし、フラスコをさらに５時間攪拌しながらインキュベートした。細胞は、６，０００×ｇで１５分間遠心分離して収穫し、細胞沈殿物を−８０℃で保存した。
【００７１】
タンパク質の精製
細胞沈殿物を氷上で解凍し、１０ｍｇ／ｍｌのリソザイムを含むリーシスバッファ（lysis buffer）[２０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．２）、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム]２０ｍｌ中に再懸濁した。細胞懸濁物を、マイクロプローブを備えたソニケーターBranson model 4550を用いて、５０％容量、７０％デューティサイクルで３０秒間超音波処理し、続いて氷上で３０秒間冷却した。超音波処理および冷却ステップをさらに４回繰り返した。細胞を上記のように遠心分離で沈殿させ、上澄みを新しいチューブに移した。細胞沈殿物をリソザイムなしのリーシスバッファ２０ｍｌ中に再度懸濁し、さらに５サイクルの超音波処理および冷却を行った。細胞を遠心分離で沈殿させ、上澄みを除去して新しいチューブに移した。２つの上澄みを混ぜて、３ｍｌのベッド体積のＮｉ親和性カラム（Pahrmacia、カタログ番号154-0990）に、製造者による指示書に従って負荷した。カラムを、５ｍＭのイミダゾールを含む洗浄バッファ５０ｍｌ[５０ｍＭのＭＯＰＳ（ｐＨ８．５）、２０ｍＭのＫＣｌ]で洗浄し、次に５０ｍＭのイミダゾールを含む洗浄バッファ２５ｍｌ、および１００ｍＭのイミダゾールを含む洗浄バッファ２５ｍｌで洗浄した。断片（各１．５ｍｌ）を最終の洗浄中に収集し、ハイブリッドタンパク質の存在を、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）およびSambrookら（1989. Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.）が記載した手順に従ってクマシー・ブルー染色により検査した。タンパク質を含む断片をプールして、水に対して１０，０００ＭＷカットオフ透析膜を用いて一晩透析した。精製タンパク質は、タンパク質１ｍｇ当たり５単位のトロンビン（Novagen）を用いて室温で１時間かけて切断し、トロンビンは、トロンビン開裂捕捉キット（Novagen）を用いてキットについている指示書に従って取り除いた。未切断のタンパク質は、サンプルをＮｉ親和性カラムに前述のように負荷し、カラムを５ｍＭのイミダゾールを含む洗浄バッファ１０ｍｌで洗浄して除去した。洗浄物の断片（各１．５ｍｌ）を収集し、タンパク質の存在をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した。タンパク質を含む断片をプールし、水に対して透析し、−２０℃で保存した。精製したタンパク質のＮ末端配列解析をエドマン分解法（Edman degradation procedure）を用いてBeckman model 2300のプロテインシーケンサーで実施した。質量スペクトルは、日立製４４１４型質量分析器を用いて測定した。
【００７２】
例４：酵素アッセイ
合成基質（Sigma Chemical Co.より購入）は、４−ニトロフェニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトサミニド、４−ニトロフェニル−Ｎ−アセチル−α−Ｄ−ガラクトサミニド、４−ニトロフェニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサアミニド、および４−ニトロフェニル−Ｎ−アセチル−α−Ｄ−グルコサミニドであった。酵素反応は、３７℃の水槽中に入れた１５ｍｌのポリプロピレンチューブ中の、５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．９）、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭの基質、および３．７μｇ／ｍｌの精製タンパク質を含む１０ｍｌ体積内で行った。反応は、反応混合物１ｍｌをＮａＯＨ５μｌを含む新しいチューブに移すことにより、様々な時点で終了させた。各チューブ内でのｐ−ニトロフェノラートの放出による吸収の増加を、４０５ｎｍに設定した島津製作所製ＵＶ−Ｍｉｎｉ分光光度計で測定した。
【００７３】
例５：A. actinomycetemcomitansの他の株、および細菌の他の種における、ｄｓｐＢオーソログの同定
微生物遺伝子データベースwww.ncbi.nlm.nih.govで、A. actinomycetemcomitansのｄｓｐＢのホモログを検索した。ｄｓｐＢホモログは、A. pleuropneumoniae血清型(serovars)１、５および７の未完了の遺伝子で同定された。A. pleuropneumoniaeのｄｓｐＢホモログは、アミノ酸レベルでA. actinomycetemcomitansのＣＵ１０００のｄｓｐＢ配列と６０％の同一性を示した。Pasteurellaceae科の他のメンバーにおけるｄｓｐＢホモログをさらに検索した。A. actinomycetemcomitansのＣＵ１０００のｄｓｐＢのアミノ酸配列は、A. pleuropneumoniaeのｄｓｐＢホモログと揃っており、非常によく保存されている配列の２つの領域が同定された。これらの保存されたアミノ酸（5’-GAYCAYGARAAYTAYCG-3’（配列番号１２）および5’-TCNCCRTCRTARCTCCA-3’ （配列番号１３）、ここでＹ＝ＣまたはＴ、Ｒ＝ＡまたはＧ、およびＮ＝ＡまたはＣまたはＧまたはＴである）をコードするＤＮＡ配列にハイブリダイズする縮重・オリゴヌクレオチドプライマーを合成し、これらのプライマーを用いて、Pasteurellaceaeの種々の種から精製された遺伝子ＤＮＡをＰＣＲにより増幅した。予想されたサイズのＰＣＲ産物が、A. actinomycetemcomitansのＩＤＨ７８１株（Saarela et al. 1993. Oral Microbiol. Immunol. 8: 111-115）、A. pleuropneumoniaeのＩＡ５株（Veterinary Diagnostics Laboratory, Iowa State University, Ames, IAより入手）、Haemophilus aphrophilusのＮＪ８７００株（Kaplan et al. 2002 J. Clin. Microbiol. 40: 1181-1187）、およびA. lignieressiの１９３９３株（American Type Culture Collection, Manassas, VAより入手）からの遺伝子ＤＮＡに観察された。Haemophilus somnus、Actionbacillus equuli、Pasteurella multocidaおよびMannheimia haemolyticaからのＤＮＡには、ＰＣＲ産物は観察されなかった。
【００７４】
ＰＣＲ産物を、マルチコピープラスミドにクローニングし、ＤＮＡ塩基配列決定法を行った。図１は、予想されたA. actinomycetemcomitansＣＵ１０００のｄｓｐＢアミノ酸配列と、A. actinomycetemcomitansの他の株および他のPasteurellaceae細菌からのｄｓｐＢホモログの配列を比較したものである。
【００７５】
例６：A. actinomycetemcomitansの野生株でのｄｓｐＢの過剰発現
A. actinomycetemcomitansの野生株でのｄｓｐＢの過剰発現の効果を決定するために、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）誘発性プロモーターの制御のもとでｄｓｐＢを含むプラスミドを作製した。このプラスミドをＣＵ１０００野生株に導入し、１ｍＭのＩＰＴＧの存在下で細胞を増殖させた。ｄｓｐＢを発現するプラスミドを収容している（harboring）ＣＵ１０００細胞は、寒天培地上に滑らかなコロニー形態を示し、培養容器の表面のサテライトコロニーの数の増加によって示されるように、培養液ブロス中に分散性の高い表現型を示す生物膜を生成した。これらの所見により、ｄｓｐＢ発現は、生物膜の分散量に関連していることが確認される。
【００７６】
例７：マイクロタイタープレート内でのポリスチレンロッドからの生物膜細胞の剥離
予めポリスチレンロッド上に増殖させた生物膜コロニーからの細胞の剥離を測定するアッセイを、９６穴マイクロタイタープレートで行った。生物膜コロニーを、マイクロタイタープレートの９６穴内のブロスに懸濁させたポリスチレンロッド上に増殖させた。生物膜から剥離した細胞は、穴の底に落ちて、その表面に付着し、新しい生物膜コロニーを形成した。穴の底に増殖した生物膜の量は、ロッド上の生物膜コロニーから剥離した細胞数に比例し、これはクリスタルバイオレットで染色して計測した。剥離アッセイは以下のように行った。
【００７７】
機器の構成
９６穴ポリスチレン平底組織培養プレート（Falcon No. 353072）の蓋を以下のように改良した：まず、直径１．５ｍｍの孔を９６個、蓋にあけて、各孔が９６穴の中心にそれぞれ対応して位置するようにする。次に、長さ１１ｍｍのポリスチレンロッド（直径１．５ｍｍ、Plastruct Corp., City of Industry, CA）を各孔に入れ（ロッドの１つの端が蓋の先端と同じ高さになるように）、トリクロロメタンプラスチック溶媒で確保した。この改良蓋を９６穴マイクロタイタープレート底部上に置いた場合、ロッドは穴の中に、各ロッドの底が穴の底から約２ｍｍ上になるように吊り下げられた。改良蓋は、７０％エタノールに３０分間浸し、生物学的に安全なキャビネット内で空気乾燥させることにより殺菌した。
【００７８】
ポリスチレンロッドの播種およびインキュベーション
マイクロタイタープレート底部に媒体（１穴当たり１００μｌ）を充填し、各穴に、寒天培地から殺菌爪楊枝を用いて２〜３日令のコロニーを１つずつ播種した。改良蓋を播種プレート上にかぶせて、ポリスチレンロッドを播種媒体中に浸し、プレートを３７℃で２４時間インキュベートして、細菌をロッドに付着させた。次に蓋を、予め暖められた媒体を入れた新鮮なマイクロタイタープレートに移動させ、さらに２４時間インキュベートして、生物膜の細胞をロッドから剥離させた。
【００７９】
剥離細胞の測定
蓋を取り、プレートを水道水の流水で広範に洗浄し、緩く付着した細胞を除去した。穴にグラム染色試薬１００μｌ（１００ｍｌ当たり、クリスタルバイオレット２ｇ、シュウ酸アンモニウム０．８ｇ、エタノール２０ｍｌ）を充填し、プレートを室温で１０分間インキュベートした。プレートは再度水道水の流水で広範に洗浄し、未結合の染料を除去した。穴は次にエタノール１００μｌを充填し、プレートを室温で１０分間インキュベートして、染料を溶解した。各穴のエタノール／染料の光学密度（５９０ｎｍにおける）を、Bio-Radのベンチマークマイクロプレートリーダーで計測した。
【００８０】
例８：ポリスチレンロッド上での生物膜の増殖
ポリスチレンロッド（直径１．５ｍｍ；Plastruct Corp., City of Industry, Calf.）を３５ｍｍの長さに切断し、７０％エタノール中で３０分間殺菌し、生物学的に安全なキャビネット内で空気乾燥させた。ロッドを、S. epidermidisを播種したブロス０．５ｍｌを含む１．５ｍｌのマイクロ遠心管に入れ、１６時間インキュベートした。ロッドを次に水道水の流水ですすぎ、ＰＢＳ０．５ｍｌまたはＰＢＳとジスペルシンＢを０．５ｍｌを含む新鮮なマイクロ遠心管に入れた。ロッドを水ですすぎ、上記と同様にしてクリスタルバイオレットで染色した（Kaplan, J.B., and Fine, D.H. Appl. Environ. Microbiol. 2002 68: 4943-4950）。超音波処理のため、ロッドを、ＰＢＳ３ｍｌを含む１５ｍｌの円錐遠心管に入れ、３０秒間、４０％のデューティサイクルおよび７０％の容量で、カップホーン（cup horn）付きBranson model 200ソニケーターで超音波処理した。剥離細胞の定量化のために、超音波処理物を順番に希釈して、１．５％寒天培地で固化した媒体上にプレートした。
【００８１】
例９：ポリスチレンマイクロタイタープレート内での生物膜の増殖
９６穴ポリスチレンマイクロタイタープレート（model 3595, Corning）の穴に、S. epidermidisを播種したブロス１００μｌを充填し、プレートを１６時間インキュベートした。マイクロタイタープレートの洗浄は、媒体を吸引し、穴を２００μｌのＰＢＳで３回洗浄するか、またはプレート全体を冷たい水道水の流水を流したたらいの中に浸すことにより行った。生物膜を前述と同様にしてクリスタルバイオレットで染色した（Kaplan, J.B., and Fine, D.H. Appl. Environ. Microbiol. 2002 68: 4943-4950）。
【００８２】
例１０：９６穴マイクロタイタープレート生物膜細胞剥離アッセイ
９６穴マイクロタイタープレート（Falcon no. 353072）の穴に、１０２〜１０４ＣＦＵの細菌を含む媒体１００μｌを充填し、３７℃、１０％ＣＯ２下で２０時間インキュベートした。酵素溶液１０μｌ［リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に１ｍｇ・ｍｌ−１］、または、対照の場合はＰＢＳ１０μｌを各穴に加え、プレートをさらに６時間インキュベートした。穴は水道水の流水で広範に洗浄し、表面に付着した残留細菌をクリスタルバイオレットで染色し、再度洗浄し、Kachlanyら（Mol. Microbiol. 2001 40: 542-554）により記載された手順に従って、エタノールで染色を抜いた。エタノール−染料溶液の光学密度（Ｏ．Ｄ．）を、５９０ｎｍに設定したBioRad Benchmarkマイクロタイタープレートリーダーにより計測した。
【００８３】
例１１：静脈内カテーテル上での生物膜の増殖
ポリウレタンカテーテル（直径１．１ｍｍ、model 381434、Becton-Dickinson）およびテフロン（登録商標）カテーテル（直径１．２ｍｍ、model 3055、Critikon）を用いた。カテーテルの先端は、殺菌高真空グリースにより栓をして、媒体および染料が管腔に入るのを防いだ。カテーテルは播種し、ポリスチレンロッドに対する上記と同様に処置した。ジスペルシンＢによるカテーテルの前もっての被覆は、ＰＢＳまたはリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９）中で１０分〜２４時間行った。ある場合においては、被覆されたカテーテルは使用の前に２４時間空気乾燥させた。テフロン（登録商標）カテーテルは、前述のようにクリスタルバイオレットで染色した（Kaplan, J.B., and Fine, D.H. Appl. Environ. Microbiol. 2002 68: 4943-4950）。ポリウレタンカテーテルは、水中の１％メチレンブルーで２分間染色した。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】A. actinomycetemcomitansのＣＵ１０００株（配列番号２）、A. actinomycetemcomitansのＩＤＨ７８１株（配列番号６）、Haemophilus aphrophilusのＮＪ８７００株（配列番号８）、A. ligniersiiの１９３９３株（配列番号４）、およびA. pleuropneumoniaeのＩＡ５株（配列番号１０）からの、本発明の例示のジスペルシンＢオーソログのクラスター配列を示す。
【配列表】
【技術分野】
【０００１】
緒言
本出願は、その全体が参照によって本明細書に組込まれる2002年12月20日提出の米国仮出願第60/435,817号に基づく優先権の利益を主張する。
発明分野
【０００２】
本発明は、生物膜からの細菌細胞の剥離を促進するタンパク質である、可溶性のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼすなわちジスペルシンＢおよびそれらの活性断片もしくは変異体の単離核酸配列、ならびにそれらによってコードされるアミノ酸配列を提供する。核酸配列を含むベクターおよび、ジスペルシンＢタンパク質またはそれらの活性断片もしくは変異体を発現する宿主細胞も提供する。A. actinomycetemcomitansの生物膜剥離変異体（biofilm detachment mutant）についても記載される。本発明の核酸配列およびアミノ酸配列は、生物膜からの細菌細胞または真菌細胞の剥離を調節する方法において、また生物膜からの細菌細胞または真菌細胞の剥離を調節する剤を同定する方法において、有用である。したがって、これらの核酸配列およびアミノ酸配列および剤は、細菌感染または真菌感染の予防および処置において、また消毒薬および防腐溶液において、有用に用いられることが期待される。
発明背景
【０００３】
生物膜は、不活性または生きている表面に付着して増殖する細菌または真菌の集団である。多くの証拠は、生物膜がヒトの健康に対する重大な脅威であることを示している。公衆衛生局によれば、生物膜は、ヒトにおける細菌感染の８０％以上の原因であると推定されている（National Institutes of Health, 1998 RFA# DE-98-006）。生物膜が原因である疾患の例には、虫歯、歯周病、膵嚢胞性線維症、肺炎、先天性弁（native valve）心内膜炎、および中耳炎（Costerton et al. Science 1999 284: 1318-1322）、さらに種々の医療用デバイスの感染、例えば導尿カテーテル、機械弁、心臓ペースメーカー、人工関節、およびコンタクトレンズ（Donlan, R.M. 2001 Emerging Infect. Dis. 7: 277-281）の感染などが含まれる。真菌も臨床的に重要な生物膜を形成し、例えば、カンジダ感染症である。生物膜感染症は、毎年米国において何百万人もの患者を苦しめ、多大な医療費の支出を必要とさせている（Costerton et al. Science 1999 284: 1318-1322）。生物膜中で増殖する細菌は抗菌剤に対して抵抗性の増加を示し、根絶するのは殆ど不可能である。生物膜感染症の処置のための新しい方法が必要である。
【０００４】
生物膜中の細菌は、細菌全体を保持し、細菌全体を下の表面にしっかりと付着させる細胞外多糖類（ＥＰＳ）物質の網の目にからめられている。前の研究により、ＥＰＳを分解する酵素は、生物膜からの細胞の剥離を引き起こせることが示されている。例えば、アルギン酸ＥＰＳの分解を触媒する酵素であるアルギン酸リアーゼの過剰発現は、Pseudomonas aeruginosaのコロニーの表面への付着を困難にする（Boyd, A. and Charkrabarty, A.M. Appl. Environ. Microbiol. 1994 60: 2355-2359）。アルギン酸リアーゼは、膵嚢胞性線維症患者の肺におけるP. aeruginosa感染症の処置に使用することが示唆されている（Mrsny et al. Pulm. Pharmacol. 1994 7: 357-366）。類似の多糖類リアーゼが、P. Fluorescensによって生成されることが示されている（Allison et al. FEMS Microbiol. Lett. 1998 167: 179-184）。２種類の他のＥＰＳ分解酵素である、植物の病原体Xanthomonas campestrisからのエンド−β−１，４−マンナナーゼ（Dow et al. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 2003 100: 10995-11000）、およびメタン生成古細菌Methanosarcina mazeiからの脱凝集酵素（disaggregatase）（Liu et al. Appl. Environ. Microbiol. 1985 49: 608-613）が、生物膜の細胞の剥離を引き起こすことが示されている。X. Campestrisの場合、ＥＰＳ分解酵素の生成は、植物中のバクテリアの全毒性のために必要であった。歯の病原体であるStreptococcus mutansの生物膜コロニーからの細胞の剥離は、未同定の内因性酵素活性によって引き起こされることが示された（Lee et al. Infect. Immun. 1996 64: 1035-1038）。多糖類加水分解酵素の複合混合物が、スチールおよびポリプロピレン基質から生物膜を除去することが示された（Johansen et al. Appl. Environ. Microbiol. 1997 63: 3724-3728）。これらの所見は、ＥＰＳ分解酵素が、生物膜を表面から除去するための剤として用いられる可能性があることを示唆している。
【０００５】
酵素は、一般に産業環境において生物膜を除去するために用いられているにも関わらず、酵素を臨床環境での生物膜の除去のための剤として用いる可能性については、研究がなされていない。臨床上の特別な関心は、留置用医療用デバイス、特に静脈内カテーテルの生物膜感染症にある。カテーテル感染は入院患者によくみられ、高い罹患率および死亡率と関連する。これらの感染症を処置するための有望な新しいアプローチは、抗菌剤を被覆または浸透させたカテーテルを使用することであり、これら抗菌剤には抗生物質（Schierholz et al. J. Antimicrobial. Chemother. 2000 46: 45-50）、銀（Bechert et al. Infection 1999 27: S24-S29）、およびペプチド菌体感知阻害剤（Balaban et al. J. Infect. Dis. 2003 187: 625-630）などが含まれる。多くの研究により、抗菌活性を有する医療用デバイスは、細菌のコロニー形成および感染のリスクを低減させることが示されている（Tcholakian, R.K. and Raad, I.I. Antimicrob. Agents Chemother. 2001 45:1990-1993）。
【０００６】
本発明は、細菌細胞の剥離に関連する単離タンパク質およびその活性断片と変異体、ならびに、かかるタンパク質およびその活性断片と変異体をコードする核酸配列を提供する。細菌性または真菌性の生物膜細胞の剥離を調節する方法、ならびに、これらのタンパク質およびその活性断片と変異体および／または核酸配列を介して、細菌または真菌の剥離を調節する剤を同定する方法もまた提供される。
【０００７】
発明の概要
本発明の目的は、生物膜からの細菌細胞または真菌細胞の剥離を促進する、単離タンパク質およびそれらの活性断片と変異体を提供することである。単離タンパク質は、本明細書において、可溶性のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼすなわちジスペルシンＢと称する。
本発明の他の目的は、可溶性のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼおよびその活性断片と変異体をコードする単離核酸配列、ならびに、これらの配列を含むベクターおよび該ベクターを発現する宿主細胞を提供することである。
【０００８】
本発明の他の目的は、生物膜からの細菌細胞または真菌細胞の剥離を調節するための方法を提供することである。１つの態様において、該方法は、細菌細胞を突然変異させて、生物膜からの細菌細胞の剥離を抑制することを含む。他の態様において、該方法は、可溶性のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼまたはその活性断片もしくは変異体の、細菌細胞または真菌細胞における発現および／またはレベルを高めて、剥離を増加させることを含む。さらに他の態様において、該方法は、可溶性のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼまたはその活性断片もしくは変異体の発現および／またはレベルを低めて、または、可溶性のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼまたはその活性断片もしくは変異体の活性を抑制して、細菌細胞の剥離を減少させることを含む。
【０００９】
本発明の他の目的は、表面にしっかり付着するが、細胞を媒体中に放出したり表面上に広げたりしない、Actinobacillus actinomycetemcomitansの単離された変異体を提供することである。
本発明の他の目的は、細菌細胞または真菌細胞の生物膜からの剥離を調節する剤を同定するための方法であって、可溶性のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの活性および／またはレベルおよび／または発現を調節する剤の能力を評価することを含む、前記方法を提供することである。
【００１０】
本発明の他の目的は、細菌細胞中での可溶性のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの発現および／または活性を抑制する剤の投与を介した、感染性細菌の播殖の予防に用いるための組成物および方法を提供することである。
本発明の他の目的は、感染性細菌または真菌の表面への付着を予防または抑制するため、または感染性細菌または真菌を表面から除去するための組成物および方法であって、該表面を、可溶性のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼまたはその活性断片もしくは変異体によって処置することを含む、前記方法を提供することである。
【００１１】
本発明のさらに他の目的は、可溶性のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼのホモログを有するその他の細菌種を同定するために用いることのできるプライマー対を含む、ＰＣＲプライマー対およびキットを提供することである。
【００１２】
発明の詳細な説明
小さなグラム陰性球棹菌Actinobacillus actinomycetemcomitansは、ヒト口腔の一般的な居住細菌（common inhabitant）である（King, E.O. and Tatum, H.W. J. Infect. Dis. 1962 111:85-94）。A. actinomycetemcomitansは、青少年に影響を及ぼす重篤で急速な歯周病の一形態である、局所的な若年性の歯周炎の病原因子とされている（Zambon, J.J. J. Clin. Periodontol 1985 12: 1-20）。A. actinomycetemcomitansは粘膜下組織にも侵入することでき、感染性心内膜炎および他の非口腔的感染症を引き起こす（Kaplan et al. Rev. Infect. Dis. 1989 11: 46-63）。
【００１３】
ブロス中で培養された場合、A. actinomycetemcomitansの新鮮な臨床分離株は、ガラス、プラスチック、および唾液で被覆されたヒドロキシアパタイトなどの表面に除去しにくい生物膜を形成する（Fine et al. Arch. Oral. Biol. 1999 44: 1063-1076；Fine et al. Microbiol. 1999 145: 1335-1347；Fine et al. Arch. Oral Biol. 2001 46: 1065-1078；Haase et al. Infect. Immun. 1999 67: 2901-2908；Inouye et al. FEMS Microbiol. Lett. 1990 69: 13-18；Kachlany et al. J. Bacteriol. 2000 182: 6169-6176；Kachlany et al. Mol. Microbiol. 2001 40: 542-554；Kagermeier, A.S. and London, J. Infect. Immun. 1985 47: 654-658；Kaplan, J.B., and Fine, D.H. Appl. Environ. Microbiol. 2002 68: 4943-4950；King, E.O. and Tatum, H.W. J. Infect. Dis. 1962 111: 85-94；Rosan et al. Oral. Microbiol. Immunol. 1988 3: 58-93）。殆ど全ての細胞は表面に付着して増殖し、ブロスは透明のままで多くの場合無菌である（Fine et al. Arch. Oral. Biol. 1999 44: 1063-1076）。表面に形成された密度の高い生物膜は、洗浄剤などの剤、タンパク質分解酵素、熱、超音波処理、渦流攪拌等による除去に抵抗性があり（Fine et al. Arch. Oral. Biol. 1999 44: 1063-1076）、機械的なかきとりによってのみ、取り除くことができる。A. actinomycetemcomitansの生物膜コロニーは、プランクトン様に増殖する細胞に比べて、抗菌剤に対して高い抵抗性を示す（Fine et al. J. Clin. Periodontol. 2001 28: 697-700）。
【００１４】
強い付着は、A. actinomycetemcomitansがラットの口にコロニーを形成する能力において重要な役割を果たすことが示され（Fine et al. Arch. Oral Biol. 2001 46: 1065-1078）、ヒトにおいてコロニーを形成する能力においても同様に重要な役割を有すると考えられている。表面への強い付着は、細胞の表面に形成される、長く束になったピリ（線毛）の存在に依存する（Inouye et al. FEMS Microbiol. Lett. 1990 69: 13-18；Rosan et al. Oral. Microbiol. Immunol. 1988 3: 58-63）。主要なピリンサブユニットタンパク質をコードするｆｌｐ−１での突然変異は、フィムブリエを生成できない、または表面に付着できない細胞を生じる（Kachlany et al. Mol. Microbiol. 2001 40: 542-554）。
【００１５】
A. actinomycetemcomitansの生物膜コロニーは、液体媒体中に細胞を放出することが示され、該細胞は培養容器の表面に付着して新しいコロニーを形成し、生物膜が広がることを可能にする（Kaplan, J.B. and Fine D.H. Appl. Environ. Microbiol. 2002 68: 4943-4950）。
【００１６】
本発明の１つの側面は、表面には付着するが、媒体中に細胞を放出できないか、または表面に細胞を広がらせることのできない生物膜コロニーを形成する、A. actinomycetemcomitansの変異体に関する。A. actinomycetemcomitansの生物膜剥離変異体は、本明細書において、ＪＫ１０２３変異体と呼ぶ。A. actinomycetemcomitansの生物膜剥離ＪＫ１０２３変異体を作製するために、A. actinomycetemcomitansのＣＵ１０００Ｎ株をトランスポゾンＩＳ９０３φｋａｎを用いて突然変異させた。次に突然変異株（ＪＫ１０２３と指定）を単離した。この変異株は、野生型A. actinomycetemcomitans粗コロニー表現型（rough-colony phenotype）より粗いコロニー形態を寒天培地上に生じさせる（Fine et al. Microbiol. 1999 145: 1335-1347；Haase et al. Infect. Immun. 1999 67: 2901-2908；Inouye et al. FEMS Microbiol. Lett. 1990 69: 13-18）。ＪＫ１０２３コロニーは、堅い質感を有し、寒天培地表面から取り除くのが非常に困難であった。ブロス内で培養した場合、ＪＫ１０２３株は、大きさと形が野生株と類似した生物膜コロニーを生成したが、培養容器の表面にサテライトコロニーを生成することはできなかった。ＪＫ１０２３細胞のポリスチリンへの付着は、野生型のＣＵ１０００Ｎ株のそれと、９６穴マイクロタイタープレート結合アッセイによる測定で同程度であった。
【００１７】
本発明のＪＫ１０２３変異株の生物膜コロニーが、生物膜細胞の剥離の能力が欠損していることを示すために、生物膜コロニーを、２４穴マイクロタイタープレートの穴に入れたブロス中に吊り下げたポリスチレンロッド上で２４時間増殖させた。生物膜細胞の剥離の量は、穴の底で増殖する細菌をクリスタル・バイオレットで染色することにより、定量した。穴の底でのコロニー形成は、ポリスチレンロッド上で増殖した生物膜コロニーから剥離し、穴の底に落ちた細胞から生じる。このアッセイにおいて、ＪＫ１０２３株の生物膜コロニーは、野生株と比べて非常に少ない細胞を増殖させた（Ｐ＜０．０１、対応なし両側ｔ検定）。これらのデータは、ＪＫ１０２３変異株は、野生型の表面付着の表現型であるが、ＣＵ１０００Ｎ野性株と比較すると生物膜細胞の剥離が低下している表現型を示すことを示唆する。
【００１８】
本変異株のトランスポゾン挿入部位を含む領域のＤＮＡ配列解析により、挿入は、本明細書においてｄｓｐＢと指定された１，１４３塩基対のオープン・リーディング・フレームにあることが示された。ＣＵ１０００株からのｄｓｐＢ遺伝子は、本明細書でジスペルシンＢと呼ばれる、３８１個のアミノ酸残基を有する分子量４３．４ｋＤａのタンパク質をコードすることが予測された。ｄｓｐＢの５’端は予測された信号ペプチドを含み、ジスペルシンＢが分泌タンパク質であることを示唆している。
【００１９】
ｄｓｐＢ核酸配列または断片は、A. actinomycetemcomitansに加えて、Actiobacillus pleuropneumonaie、Haemophilus aphrophilusおよびActijnobacillus ligniersiiからも単離されている。ｄｓｐＢは、我々が試験した株の中ではHaemophilus influenzae、Pasteurella multicido、Mannheimia haemolytica、Actionobacillus equuliおよびHaemophilus ducreyiの遺伝子中には存在しなかった。
従って、本発明の他の側面は、ジスペルシンＢまたはその活性断片および変異体をコードする核酸配列、ならびにジスペルシンＢおよびその活性断片および変異体のアミノ酸配列に関する。本発明にさらに含まれるのは、これらの核酸配列を含むベクター、およびジスペルシンＢまたはその活性断片を発現するベクターを含む宿主細胞である。
【００２０】
本明細書で用いられる用語「核酸配列」は、非修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡまたは修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡを含むことが意図されるが、それらに限定しない。従って、核酸配列の用語により、一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡ、一本鎖領域と二本鎖領域が混合しているＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡおよび二本鎖ＲＮＡ、一本鎖領域と二本鎖領域が混合しているＲＮＡ、ならびに、一本鎖またはより典型的には二本鎖のＤＮＡおよびＲＮＡ、または一本鎖領域と二本鎖領域が混合しているＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子、を含むことが意図される。さらに、本発明のＤＮＡまたはＲＮＡ配列は、修飾された主鎖および／または修飾された塩基を含むことができる。ＤＮＡおよびＲＮＡに対する種々の修飾が、複数の有用な目的のために、当分野において知られている。本明細書で用いられる用語「核酸配列」は、核酸配列のかかる化学的、酵素的または代謝的に修飾された形態ならびに、単純型と複雑型細胞を含む、ウィルスおよび細胞に特徴的なＤＮＡおよびＲＮＡの化学的形態を包含する。
【００２１】
ＣＵ１０００株のｄｓｐＢのＤＮＡ配列は、アクセッション番号AY228551としてＧｅｎＢａｎｋに供託され、２００３年８月４日公開された。このＤＮＡの核酸配列は、配列番号１である。ジスペルシンＢタンパク質のオーソログをコードする核酸配列は、A. ligniersiiの１９３９３株、A. actinomycetemcomitansのＩＤＨ７８１株、Haemophilus aphrohpilusのＮＪ８７００株、およびA. pleuropneumoniaeのＩＡ５株において同定されており、それぞれ配列番号３、５、７および９として示されている。従って、本発明の好ましい単離核酸配列は、配列番号１、３、５、７または９を含む。
【００２２】
本発明にまた含まれるのは、ジスペルシンＢと類似の酵素活性を有するタンパク質をコードする、配列番号１、３、５、７または９の例示されたｄｓｐＢ核酸配列の対立遺伝子、および、類似の酵素活性を有するタンパク質をコードする、配列番号１、３、５、７または９の例示されたｄｓｐＢ核酸配列であって、実質的配列同一性パーセントを有する該核酸配列である。
本明細書で用いられる用語「対立遺伝子変異体」は、２または３以上の代替的な天然に存在する遺伝子の形態の１つであって、各遺伝子がユニークな核酸配列を含むものを意味する。本発明が包含する対立遺伝子は、類似または同一の酵素活性を有するタンパク質をコードする。
【００２３】
本明細書で核酸配列に関連して用いられる用語「配列同一性パーセント」は、最大に一致するように並べた場合に同一である、２つの配列中の残基を指す。配列同一性を比較する長さは、好ましくは少なくとも約９の連続したヌクレオチド長を超え、より好ましくは少なくとも約１８の連続したヌクレオチド長、さらにより好ましくは少なくとも約３０〜５０の連続したヌクレオチド長またはそれ以上である。当該技術分野に知られている種々のアルゴリズムが、核酸配列の同一性を測定するために利用可能である。その例には、FASTA（FASTA2およびFASTA3を含む）、GapおよびBestfitが含まれ、これらはWisconsin Package Version 10.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisconsinのプログラムであるが、これらに限定はされない。
【００２４】
「実質的配列同一性パーセント（substantial percent sequence identity）」は、本発明の核酸配列またはその断片を指す場合、適切なヌクレオチドの挿入または欠失を有する他の核酸(またはその相補鎖)と最適に整列させた場合、FASTA、BLASTまたはGapなどの、任意の周知の配列同一性のアルゴリズムにより測定したときに、ヌクレオチド塩基の少なくとも約５０％が同一であることを意味する。本発明の目的のためには、より好ましくは少なくとも約６０％〜７０％、さらにより好ましくは約８０％〜９０％、そして最も好ましくは少なくとも約９５％〜９８％のヌクレオチド塩基が、FASTA、BLASTまたはGapなどの任意の周知の配列同一性のアルゴリズムにより測定した場合に、同一である。
【００２５】
実質的配列同一性パーセントを有し、類似の機能活性を有するタンパク質をコードする核酸配列を、本明細書においてオーソログと呼ぶ。
ジスペルシンＢの推定アミノ酸配列およびそれらの例示のオーソログを図１に示す。具体的には、A. actinomycetemcomitansのＣＵ１０００Ｎ株のジスペルシンＢのアミノ酸配列（配列番号２）、ならびに、A. actinomycetemcomitansのＩＤＨ７８１株（配列番号６）、Haemophilus aphrophilusのＮＪ８７００株（配列番号８）、A. ligniersiiの１９３９３株（配列番号４）、およびA. pleuropneumoniaeのＩＡ５株（配列番号１０）からのジスペルシンＢのオーソログのアミノ酸配列を示す。
【００２６】
ジスペルシンＢおよびこれらオーソログのアミノ酸配列と、ファミリー２０グリコシル加水分解酵素の共通塩基配列には類似性がある。より具体的には、予測されたジスペルシンＢのタンパク質配列の４０〜２９７アミノ酸残基は、ファミリー２０グリコシル加水分解酵素の触媒領域（ＮＣＢＩ保存領域データベースアクセッション番号pfam00728）と相同である。酵素のこのファミリーは、細菌性キチナーゼ、キトビアーゼおよびラクト−Ｎ−ビオシダーゼ（Sano et al. J. Biol. Chem. 1993 268: 18560-18566；Tews et al. Gene 1996 170: 63-67；Tsujibo et al. Biochim. Biophys. Acta 1998 1425: 437-440）、および親核性ヘキソサミニダーゼ（Graham et al. J. Biol. Chem. 1988 263: 16823-16829）を含む。A. actinomycetemcomitansジスペルシンＢに関連するタンパク質は、Lactococcus lactisのラクト−Ｎ−ビオシダーゼ（GenBankアクセッション番号AAK05592）であり、これは、ギャップおよび末端の延長を数えないで、２８１個のアミノ酸残基中２８％の同一性を示す。ジスペルシンＢとラクト−Ｎ−ビオシダーゼとの間の類似性は、Ａｒｇ４７および酸性アミノ酸対Ａｓｐ２０２およびＧｌｕ２０３を含む領域で高い。これらの残基は、他のファミリー２０グリコシル加水分解酵素における基質結合および触媒に関与することが示されている（Mark et al. J. Biol. Chem. 2001 276: 10330-10337；Mark et al. J. Biol. Chem. 1998 273:19618-19642；Prag et al. J. Mol. Biol. 2000 300: 611-617）。ジスペルシンＢのＣ末端側の半分は、L. lactisのラクト−Ｎ−ビオシダーゼに保存されている３個のＴｒｐ残基を含む（２３６、２７９および３５３位置）。複数のＴｒｐ残基は、全てのファミリー２０グリコシル加水分解酵素の触媒ドメインのＣ末端領域に存在する（Graham et al. J. Biol. Chem. 1988 263: 16823-16829；Tews et al. Gene 1996 170: 63-67）。これらのＴｒｐ残基は、ヘキソサミン糖環の疎水性表面に相補的な、基質結合ポケットの一部に並ぶ（Tews et al. Nature Struct. Biol. 1996 3: 638-648）。ジスペルシンＢおよびそのオーソログのこれらの領域内のアミノ酸の突然変異が、酵素活性を変化させることが予想される。
【００２７】
好ましい態様において、本発明の単離されたアミノ酸配列は、配列番号２、４、６、８もしくは１０またはそれらの活性断片もしくは変異体を含む。好ましい活性断片は、ファミリー２０グリコシル加水分解酵素の共通塩基配列に類似した、配列番号２、４、６、８または１０のアミノ酸配列の部分を含むものである。
【００２８】
本明細書で用いられる「活性変異体」または「機能的に同等な変異体」は、ジスペルシンＢタンパク質と構造的に異なるポリペプチド配列であるが、このタンパク質との重要な機能的差異は有さないものである。例えば、A. actinomycetemcomitansの種々の株からのオーソログポリペプチド配列を並べると、通常は０〜１０％のアミノ酸配列の相違（divergence）が観察される（Kaplan et al. Oral Microbiol. Immunol. December 2002 17: 354-359；Kaplan et al. Infect. Immun. 2001 69: 5375-5384）。この量の相違を示すタンパク質は、機能的に同等な変異体と考えられるが、これは、これらの変異体をコードする対立遺伝子の混合が母集団において頻繁に観察されるという事実による（Kaplan et al. Oral Microbol. Immunol. December 2002 17: 354-359）。A. actinomycetemcomitansのＩＤＨ７８１株からのジスペルシンＢの配列（配列番号６）は、従って、配列番号２と機能的に同等であるか、またはその活性変異体であることが予想され、本発明の範囲に含まれる。同様に、A. actinomycetemcomitansの他の株からのジスペルシンＢの配列、例えば異なる血清型、制限断片長多型遺伝子型、１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子型、または、異なる対象から単離された系統学的に多様な株に通常観察される、任意にプライムされたＰＣＲ遺伝子型（Kaplan et al. J. Clin. Microbiol. 2002 40: 1181-1187；Kaplan et al., Oral Microbiol. Immunol. December 2002 17: 354-359）を示すものもまた、配列番号２と機能的に同等かまたは活性な変異体であり、本発明の範囲に包含される。
【００２９】
同様に、系統発生的に多様な細菌種からのオーソログタンパク質は通常、機能的に同等かまたは活性な変異体であり、これは、興味ある遺伝子をプラスミドにクローニングする通常の方法は、プラスミドライブラリをスクリーニングして、異なる細菌種において遺伝的突然変異を相補するプラスミドを見出すことであるという事実によって証拠付けられる（Kaplan et al. J. Mol. Biol. 1985 183: 327-340）。これは、細菌酵素について特にあてはまる。異なる細菌種のオーソログ酵素は、５０％またはそれ以上の相違を示すことができ、しかも同一の基質を利用し、同じ化学反応を触媒し、そして同じ産物を生成する。この配列の相違は、遺伝的浮動と、個体群における選択された遺伝的変化の定着とが組み合わさって生じる。選択され定着された遺伝的変化は、基質、反応、および産物以外の酵素の特徴を変化させるものであり、例えば、反応速度、最適ｐＨ、最適温度、発現レベル、および他の酵素との相互反応などであり、これらの遺伝的変化は、細菌細胞に対しその環境における選択的有利性を与える。A. actinomycetemcomitansは遺伝的にA. pleuropneumoniaeに近く関連しており（Dewhirst et al., J. Bacteriol. 1992 174: 2002-2013）、A. actinomycetemcomitansが生成するものに類似した生物膜（これは本明細書に示されるように、A. actinomycetemcomitansジスペルシンＢと接触して剥離するものである）を生成するため、配列番号１０と同定されるA. pleuropneumoniaeのｄｓｐＢホモログは、配列番号２と機能的に同等かまたは活性な変異体であることが予想され、これは本発明の範囲に包含される。同様に、Actinobacillus ligniersiiはActinobacillus pleuropneumoniaeに遺伝的に近く関連しており（Dewhirst et al., J. Bacteriol. 1992 174: 2002-2013）、またHaemophilus aphrophilusはA. actinomycetemcomitansに遺伝的に近く関連しているため（Dewhirst et al., J. Bacteriol. 1992 174: 2002-2013; Kaplan et al. J. Clin. Microbiol. 2002 40: 1181-1187）、そしてA. ligniersiiとHaemophilus aphrophilusの両者はA. actinomycetemcomitansが作成するものと類似の生物膜を作成するために、それぞれ配列番号４および配列番号８と同定されるActinobacillus ligniersiiおよびHaemophilus aphrophilusのジスペルシンホモログは、配列番号２と機能的に同等かまたは活性な変異体であることが予想され、これらも本発明の範囲に包含される。
【００３０】
上記の例は、A. actinomycetemcomitansジスペルシンＢの、天然に存在する機能的に同等かまたは活性な変異体を示す。しかしながら、当業者が本開示を読んで理解するように、A. actinomycetemcomitansジスペルシンＢの機能的に同等かまたは活性な変異体をコードする人工的に作製された遺伝子はまた、本明細書の教示に従い、種々のよく知られた遺伝工学的技法を用いて、ルーチンに作製することができる。例えば、２０個のＮ末端アミノ酸残基が欠損し、３２個のアミノ酸残基のＣ末端尾を含み、天然のジスペルシンＢ酵素と機能的に同等な、遺伝子操作されたジスペルシンＢ酵素が作製されている。この遺伝子操作されたジスペルシンＢ酵素のＮ末端におけるメチオニン残基は、大腸菌に発現されるとメチオニンアミノペプチダーゼの作用により除去されたが、メチオニンの不在は酵素活性に影響しなかったことが示されている。この遺伝子操作されたジスペルシンＢ酵素からの、Ｃ末端の２８個のアミノ酸残基の開裂は、酵素活性に影響しなかったことも示されている。これらの例は、A. actinomycetemcomitansジスペルシンＢの機能的に同等な変異体をコードする人工遺伝子が作製可能であることを示している。これらの人工的に作製された、A. actinomycetemcomitansジスペルシンＢの機能的に同等な変異体は、本発明の範囲に包含される。
【００３１】
上記の例は、遺伝子操作されたA. actinomycetemcomitansジスペルシンＢの機能的に同等な変異体であって、タンパク質のＮ末端におけるアミノ酸残基の欠失か、またはタンパク質のＣ末端における付加的ポリペプチドの融合のどちらかを含む前記変異体を示している。他の遺伝子操作された改変体（alteration）、例えばタンパク質のＮ末端における付加的ポリペプチドの融合、タンパク質のＣ末端におけるアミノ酸残基の欠失、アミノ酸残基の中間における欠失および挿入、およびアミノ酸置換もまた、A. actinomycetemcomitansジスペルシンＢの機能的に同等な変異体を生じる。どの欠失、挿入およびアミノ酸置換が、A. actinomycetemcomitansジスペルシンＢの機能的に同等な変異体を作製するかについての情報は、アミノ酸配列アラインメント（alignment）から、および、一般に利用可能なコンピュータソフトウェアから得ることができ、このソフトウェアは、両方の一次アミノ酸配列および、既知の３次元構造を有する類縁のタンパク質に対するアミノ酸配列アラインメントに基づいて、ポリペプチドの２次構造を予測するものである。A. actinomycetemcomitansジスペルシンＢは、例えば、ファミリー２０グリコシル加水分解酵素のメンバーであって、これは、幾つかのよく研究された酵素を含むファミリーおよび、公共データベースにおいて多くの類縁の一次アミノ酸配列により代表されるファミリーを含む。幾つかのケースにおいては、ファミリー２０グリコシル加水分解酵素の３次元構造は知られている（Tews et al. Nature Struct. Biol. 1996 3: 638-648）。
【００３２】
全てのファミリー２０グリコシル加水分解酵素は、（βα）８バレルモチーフ（barrel motif）（ＴＩＭ−バレルモチーフとしても知られている；Tews et al. Nature Struct. Biol. 1996 3: 638-648；Prag et al. J. Mol. Biol. 2000 300: 611-617）を有し、これは、タンパク質データバンク（ＰＤＢ）データベースの既知のタンパク質構造の中でもっとも一般的な酵素の立体構造型（fold）である。全ての既知の酵素の１０％がこのドメインを持つと推定されている（Wierenge, R.K., FEBS Lett. 2001 492: 193-198）。（βα）８バレルモチーフは、多くの異なる酵素ファミリーに見られ、全く関連のない反応を触媒する。多くの類縁の一次アミノ酸配列が利用可能なことは、幾つかのA. actinomycetemcomitansジスペルシンＢホモログの３次元構造が利用可能なことと組み合わさって、これらの配列構造および２次構造の予測の基礎となっている。例えば、（βα）８バレルモチーフは８個のαヘリックスおよび８個のβストランドからなり、ここで８個の平行なβストランドはタンパク質の内側でバレル（たる型）を形成し、それらはタンパク質の外側の８個のαヘリックスで覆われている。上記のタンパク質配列アラインメントおよび構造予測に基づき、A. actinomycetemcomitansのｄｓｐＢにおける８個のβストランドは、配列番号２の４１〜４４、６９〜８１、１３０〜１３４、１６９〜１７１、１８９〜２００、２５３〜２５６、２８８〜３００、および３４８〜３５０の位置を含むアミノ酸残基を含むことが予想される。これら８つの領域のβストランドアーキテクチャを破壊するアミノ酸配列中のいかなる改変も、これによって酵素の（βα）８バレルの３次元構造が同時に破壊されるため、酵素活性の低下を生じさせることが予想される。同様に、上記のタンパク質配列アラインメントおよび構造予測に基づき、A. actinomycetemcomitansのｄｓｐＢにおける８個のαヘリックスは、配列番号２の５２〜６３、８９〜９３、１４３〜１４９、１７６〜１８３、２１４〜２２８、２６９〜２８４、３０９〜３２１、および３６１〜３７４の位置を含むアミノ酸残基を含むことが予想される。これら８つの領域のαヘリックスのアーキテクチャを破壊するアミノ酸配列中のいかなる改変も、これによって酵素の（βα）８バレルの３次元構造が同時に破壊されるため、酵素活性の低下を生じさせることが予想される。
【００３３】
同様に、βストランドは、４つの内向き側鎖（βバレル内部を向いている）および４つの外向き側鎖（αへリックス方向を向いている）からなり、内向きアミノ酸残基の改変は、（βα）８バレル内側の基質結合ポケットに同時に改変を生じるため酵素活性を低下させることが予想され、また、外向きアミノ酸残基の改変は、それらがβストランドとαへリックスとの間の相互作用に干渉する場合、酵素活性を低下させることが予想される。同様に、ファミリー２０グリコシル加水分解酵素の活性部位は、常にバレルの８個の平行βストランドのＣ末端に位置する。A. actinomycetemcomitansジスペルシンＢの相同領域における改変は、酵素活性に影響することが予想される。同様に、αへリックスとβストランドの間の領域、すなわち、配列番号２の４５〜５１、６４〜６８、８２〜８８、９４〜１２９、１３５〜１４２、１５０〜１６８、１７２〜１７５、１８２〜１８８、２０１〜２１３、２２９〜２５２、２５７〜２６８、２８５〜２８７、３０１〜３０８、３２２〜３４７、および３５１〜３６０の位置への挿入および欠失の導入は、酵素活性に影響しないことが予想される。同様に、残基４７（アルギニン）、２０３（アスパルテート）、および２０４（グルタメート）の殆ど任意の改変は、これら３つの残基が全てのファミリー２０グリコシル加水分解酵素における基質結合および触媒に直接関与していることが示されているため、酵素活性の完全な喪失を生じさせる（Mark et al. J. Biol. Chem. 1998 273: 19618-19624；Prag et al. J. Mol. Biol. 2000 300: 611-617；Mark et al. J. Biol. Chem. 2001 276”10330-10337）。同様に、２３６、２５７および３５０位置における３個のトリプトファン残基の任意の非芳香族アミノ酸残基への改変は、これら３個のトリプトファン残基が、基質のヘキソサミン糖鎖の疎水性表面に補完的な基質結合ポケットの一部に並ぶことが示されているため、酵素活性の低下を生じさせる（Tews et al. Nature Struct. Biol. 1996 3: 638-648）。A. actinomycetemcomitansジスペルシンＢにおけるこれらの必須アミン酸残基の位置により、酵素活性を失うことなしに、４６個以下のアミノ酸残基がＮ末端から削除され得ること、および３１個以下のアミノ酸がＣ末端から削除され得ることが予測される。機能的に同等な変異体を生じるこれら全ての遺伝子改変は、本発明の範囲に含まれる。
【００３４】
A. actinomycetemcomitansジスペルシンＢの機能的に異なる変異体をコードする遺伝子はまた、よく知られた遺伝子操作の技法を用いて、本出願の教示に従って作製することができる。例えば、上記のように、配列番号２の残基４７（アルギニン）、２０３（アスパルテート）、および２０４（グルタメート）の殆ど任意の改変は、酵素活性の完全な喪失を生じることが予想される。代替的に、臨床の場面において有用となり得る特徴を示すA. actinomycetemcomitansジスペルシンＢの変異体は、人工的に作製することができる。例えば、A. actinomycetemcomitansジスペルシンＢの最適温度は３０℃である。最適温度３７℃を示す、遺伝子操作によるジスペルシンＢの変異体を作製することが望ましく、それによって、酵素の有効性を高め、または処置のコストを低減することになる。かかる変異体は、まず、例えばＵＶ光またはニトロソグアニジンなどの化学的突然変異原を用いてA. actinomycetemcomitansのｄｓｐＢ遺伝子配列にランダムな突然変異を作製し、次に、例えば、定量９６穴マイクロタイタープレートアッセイ（Kaplan et al. J. Bateriol. 2003 185: 4693-4698）によって、これらのランダムな多数の変異体をスクリーニングし、高い最適温度を示すものを探すことにより、人工的に作製することができる。代替的な方法は、ＤＮＡシャフリング（Christians et al. Nature Biotechnol. 1999 17: 259-264；Dichek et al. J. Lipid Res. 1993 34: 1393-1340）による配列の指向進化を利用し、定量的９６穴マイクロタイタープレートアッセイに基づく高スループット・ロボティックスクリーンと組み合わせて（Kaplan et al. J. Bateriol. 2003 185: 4693-4698）、最適温度が増加した変異体を同定する。これらの方法はまた、生体材料に対する高い持続性（substantivity）、高い最適ｐＨ、水溶液中での高い安定性、高い反応率、乾燥への高い安定性、および酵素の有効性の増加または処置のコストの低減をもたらすことができる他の特徴を示す、A. actinomycetemcomitansジスペルシンＢの変異体を作製するためにも用いることができる。
【００３５】
有用な変異体を作製するために用いることのできる代替方法は、部位特異的突然変異誘発法である。例えば、A. actinomycetemcomitansジスペルシンＢにおける（βα）８バレルの８個のαへリックスは、酵素の外表面に晒されている多くのアミノ酸残基を含み、そして、αへリックスの外向きアミノ酸残基の改変は、酵素の外表面の特性を変化させ、それによって、酵素活性に影響を及ぼすことなく、生体材料に対する酵素の持続性を増加させる可能性がある。よって、これらの外向きアミノ酸残基を、例えば極性残基から荷電残基へと体系的に突然変異させることができ、その結果生じた変異体をスクリーニングして、生体材料に対する持続性が増加した変異体を同定する。酵素の臨床での有用性または費用対効果を改善することを意図した、A. actinomycetemcomitansジスペルシンＢの機能的に異なる変異体は、生物膜から細菌細胞または真菌細胞を剥離するために適用される場合、本発明の範囲に含まれる。
【００３６】
本発明においてさらに提供されるのは、融合タンパク質および融合タンパク質をコードする核酸配列である。本発明の融合タンパク質は、生物膜からの細菌細胞の剥離を促進する、単離された可溶性のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼタンパク質のアミノ酸配列、および、第２ポリペプチドを含む。これらの融合タンパク質の第２ポリペプチドの例は、His tagなどの精製を促進するもの、アルブミン、フィブロネクチンまたはトロンビン等のタンパク質または抗体などの、表面への付着を促進するもの、および／または、酵素を特定の細菌または真菌受容体などの細菌細胞または真菌細胞へ標的化させるものなどを含むが、これらに限定はされない。かかる融合タンパク質をコードする核酸配列は、生物膜からの細菌細胞または真菌細胞の剥離を促進する、可溶性のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼまたはその活性断片もしくは変異体をコードする単離核酸配列、および第２ポリペプチドをコードする第２核酸配列を含有する。好ましい態様においては、第２核酸配列は、His tagなどの精製を促進するポリペプチド；アルブミン、フィブロネクチンまたはトロンビンなどの融合タンパク質の表面への付着を促進する抗体またはタンパク質；あるいは、融合タンパク質をそれぞれ細菌細胞または真菌細胞へ特異的に標的化させる細菌受容体または真菌受容体、などをコードする。
【００３７】
オクタヒスチジン金属結合部位をＣ末端に含むよう操作したジスペルシンＢタンパク質を、大腸菌に発現させた。このタンパク質をＮｉ親和性クロマトグラフィにより精製し、ハイブリッドタンパク質からトロンビンを用いて、ジスペルシンＢタンパク質を開裂した。精製され開裂されたジスペルシンＢタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析から、見かけの分子量４１ｋＤａで移動するタンパク質が示された。ジスペルシンＢのＮ末端配列は、XCVKGNSIYPQK（配列番号１１）（ここでＸは、未同定の残基）であった。これは、ＣＵ１０００のｄｓｐＢのコドン２２〜３３に適合し、ジペプチドＭｅｔ−Ａｓｎが、大腸菌に発現されたジスペルシンＢ融合タンパク質のＮ末端から開裂されたことを示した。精製され開裂されたジスペルシンＢタンパク質の質量分析では、見かけの分子量４１．５ｋＤａの単一の主要なピークを示し、これは、開裂され処理されたジスペルシンＢタンパク質に対する予測された分子量４１．４ｋＤａと等しかった。大腸菌に発現されたジスペルシンＢの収率は、１ｌの培養液当たり３０ｍｇのタンパク質であった。
【００３８】
ジスペルシンＢの、種々の４−ニトロフェニルで標識された合成ヘキソサミン基質を開裂する能力を、in vitro酵素アッセイで試験した。ジスペルシンＢは、β置換Ｎ−アセチルグルコサミニドの１→４グリコシド結合に対して特異性を示し、これは、他のファミリー２０グリコシル加水分解酵素の既知の機能と整合していた（Tews et al. Nature Struct. Biol. 1996 3: 638-648）。ジスペルシンＢは、α置換Ｎ−アセチルグルコサミニドまたはαもしくはβ置換Ｎ−アセチルガラクトサミンに対して活性を示さなかった。
ジスペルシンＢのグリコシル加水分解酵素活性は、ｐＨ５．０で最適であり、これは他のファミリー２０グリコシル加水分解酵素の最適ｐＨと同様である。ジスペルシンＢは、３０℃で最大活性を示した。ジスペルシンＢのグリコシル加水分解酵素活性は、キナクリン（Kovacs, P. and Csaba, G. Cell Biochem. Funct. 2001 19: 287-290）およびＮＡＧ−チアゾリン（Mark et al. J. Biol. Chem. 2001 276: 10330-10337）により阻害されたが、これらはファミリー２０β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの２つの小分子阻害剤である。
【００３９】
次に、ジスペルシンＢタンパク質の、A. actinomycetemcomitansのＪＫ１０２３変異株の生物膜細胞の剥離に対する効果について検討した。これらの実験において、ジスペルシンＢタンパク質をＪＫ１０２３変異株の増殖媒体に添加し、このタンパク質の添加が細胞の媒体中への放出および分散を回復させるかどうかを決定した。ＪＫ１０２３株の生物膜コロニーを含むポリスチレンロッドを、種々の量のジスペルシンＢを含むブロス液中に懸濁させ、生物膜の剥離の量を、穴の底で増殖する細菌をクリスタルバイオレットで染色することにより計測した。精製されたジスペルシンＢは、用量に応じて細胞を媒体中へ放出し、マイクロタイタープレート穴の底にコロニーを形成するＪＫ１０２３変異株の能力を回復させた。熱で不活性化させたジスペルシンＢは、ＪＫ１０２３株の生物膜剥離に対して効果を有さなかった。
【００４０】
ジスペルシンＢタンパク質の、A. actinomycetemcomitansおよび他の細菌が既に形成した生物膜コロニーを剥離する効果についても検討した。これらの実験において、ジスペルシンＢを添加すると、野生型ＣＵ１０００株の既形成生物膜コロニーの剥離を引き起こした。ジスペルシンＢ（５０μｇ／ｍｌ）は、６時間後に表面に関連した細菌量を９０％減少させた。さらに、光学顕微鏡検査による解析によれば、処理されたコロニー表面は、模擬処理した細胞に観察される滑らかな生物膜コロニーに比べると、ザラザラした綿毛状（grainy and flocculent）となった。また、培養容器の表面は、高い倍率では繊維状の外観を有する、同じようなザラザラした材料で覆われた。これらの所見は、ジスペルシンＢで処理した既形成生物膜コロニーにおいて観察された付着の減少と整合する。
【００４１】
ジスペルシンＢは、４種類の血清型を表わすA. actinomycetemcomitansの系統発生的に異なる４種類の株、すなわち、近縁種の細菌Haemophilus aphrophilusの１株、およびブタ病原菌Actinobacillus pleuropneumoniaeの２株の生物膜コロニーに対して試験された場合にも、同様の生物膜密度の減少を引き起こした。ジスペルシンＢは、Neisseria subflave、Cardiobacterium hominisまたはStreptococcus mitis、すなわちＮ−アセチルグルコサミン残基を含む生物膜を有していない細菌の、生物膜コロニーの剥離は引き起こさなかった。
【００４２】
ジスペルシンＢはまた、表面からのStaphylococcus epidermidisの剥離も引き起こす。グラム陽性細菌S. epidermidisは、カテーテルおよび他の留置医療デバイスに関連する感染の最も一般的な原因である。S. epidermidisは、主としてＮ−アセチルグルコサミン残基を含む多糖類を含む細胞外粘液を生成し（Mack et al. J. Bacteriol. 1996 178:175；Baldassarri et al. Infect. Immun. 1996 64: 3410）、これはプラスチックの表面に付着する膜の形成を可能とする。S. epidermidisなどの生物膜細菌は、抗生物質および宿主防衛に対して非常に抵抗性が高く、根絶することはは殆ど不可能である（Costerton et al. Annu. Rev. Microbiol. 1995 49:711）。従って、この細菌のカテーテルなどの留置デバイスへの付着は、特に免疫力が低下した患者において、骨髄炎、急性敗血症および死を引き起こす可能性があり、院内の血流および心血管系感染症、および入院患者の罹患の第一の原因である（Vuong, C. and Otto, M. Microbes, Infect. 2002 4: 481）。
【００４３】
感染した静脈内カテーテルから単離したS. epidermidisの４種の異なる株を、これらの実験に用いた。４株全ては、ｉｃａ遺伝子座を含んでおり、コンゴレッド寒天培地上に濃い赤色のコロニーを生成し、これらはどちらもスライムの生成を示唆している（Ariocola et al. J. Clin. Microbiol. 2001 39: 2151；Aricola et al. Biomaterials 2002 Biomaterials 23: 4233）。４種の株の生物膜形成能力は、新鮮なブロス液に一晩培養物の連続希釈物を作製し、続いて希釈物を９６穴ポリスチレンマイクロタイタープレートの穴に移して測定した。１６時間のインキュベーションの後、穴を水道水の流水下で洗浄して弱く付着した細胞を除去し、穴の底に付着して残った細菌をクリスタルバイオレットで染色した。予想通りに全４株は、穴の底に濃く染色された物質の存在が示すように、付着性の生物膜を生成した。濃く染色された物質の量は、マイクロタイタープレートリーダーで５９０ｎｍで光学密度を計測することにより定量した。ジスペルシンＢタンパク質を洗浄の３０分前に穴に添加すると（最終濃度：４０μｇ／ｍｌ）、生物膜物質は殆ど、または全く明らかにならなかった。対照的に、熱で不活性化したジスペルシンＢタンパク質は、S. epidermidisの生物膜に対して効果を有さなかった。A. actinomycetemcomitansジスペルシンＢと類縁の、他の２つのＮ−アセチルグルコサミニダーゼ酵素であるSerratia marcescensのキチナーゼおよびタチナタマメ（jack bean）のβヘキソサミニダーゼもまた、S. epidermidisの生物膜に対して効果を有さなかった。本明細書に記載されたオーソログと異なり、これら類縁のタンパク質は、ジスペルシンＢと２５％未満の同一性のみを有しており、生物膜放出活性を示さない。従って、これらの実験により、ジスペルシンＢの酵素活性が、S. epidermidis生物膜の細胞を穴の表面から取り除くのに関与していることを示している。ジスペルシンＢは、S. epidermidis細胞の生物利用能に対しては効果を有さなかった。
【００４４】
ジスペルシンＢタンパク質の量および、S. epidermidisの生物膜をマイクロタイタープレート穴から取り除くのに必要な時間の長さについても試験した。これらの実験において、複数の穴に１０−４希釈のS. epidermidis培養物を播種し、プレートを１６時間インキュベートした。弱く付着した細胞を洗い流した後、穴をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で満たし、次に様々な量のジスペルシンＢタンパク質（１ｍｌ当たり２００ｐｇ〜１２０μｇの最終濃度）を様々な時間（０〜９分間）穴に添加した。４．８μｇ／ｍｌのジスペルシンＢの処理で、２分後に、吸収がバックグランドレベルまで低下した（約０．０９Ｏ．Ｄ．単位）。４０ｎｇ／ｍｌの濃度では、ジスペルシンＢは、９分後に５０％以上の光学密度の低下を引き起こした（３．６３から１．７４Ｏ．Ｄ．単位へ）。これらのデータは、ジスペルシンＢが、臨床的に実現可能な酵素濃度でS. epidermidisの生物膜の剥離を引き起こすことを示す。
【００４５】
生物膜細胞の剥離の定量化を、S. epidermidisの生物膜をポリスチレンロッド上で増殖させ、続いて該ロッドをＰＢＳ（対照として）または６０μｇ／ｍｌのジスペルシンＢとＰＢＳとを含むチューブに移すことにより行った。該チューブは１５分間インキュベートし、ＰＢＳ中ですすぎ、処理後にロッドに付着している残留細菌を超音波処理により除去し、次に、この超音波処理物を連続的に希釈したものを寒天培地にプレーティングして定量した。模擬処理およびジスペルシンＢで処理したロッドを、クリスタルバイオレットで染色した後、比較した。模擬処理した対照ロッドは、表面に形成された厚い生物膜に対応する濃く染色された物質の層を含んでいた。ジスペルシンＢで処理したロッドは、濃く染色された物質の痕を示さず、染色前の超音波処理したロッドおよび播種なしのロッドと外観が類似していた。ロッドに付着して残留した細胞の定量化により、ジスペルシンＢの処理によって、表面に関連する細菌数が５．８ｌｏｇ低下したことが明らかとなった。
【００４６】
ジスペルシンＢの、ポリウレタンおよびテフロン（登録商標）静脈内カテーテルに付着して増殖したS. epidermidis生物膜を除去する能力についても試験した。これらの実験において、カテーテルは、１０−３希釈のS. epidermidis培養物を含むチューブ内に入れ、１６時間インキュベートした。カテーテルは次にＰＢＳですすぎ、ＰＢＳ（対照として）または６０μｇ／ｍｌのジスペルシンＢとＰＢＳとを含むチューブに移した。５分後、カテーテルをＰＢＳですすぎ、表面に付着した残留生物膜細菌を、メチレンブルー（ポリウレタンカテーテルに対して）またはクリスタルバイオレット（テフロン（登録商標）カテーテルに対して）で染色した。対照カテーテルはその表面に濃く染色された物質の層を含んでおり、生物膜の存在を示し、一方ジスペルシンＢで処理したカテーテルは濃く染色された物質を含まず、播種なしカテーテルと外観が類似していた。
【００４７】
このように、本発明のジスペルシンＢは、S. epidermidis生物膜を種々のプラスチック生体材料から取り除くことができる。
ジスペルシンＢで予め被覆された表面の、S. epidermidis生物膜形成を防ぐ能力についても示された。これらの実験において、ＰＢＳまたは４０μｇ／ｍｌのジスペルシンＢとＰＢＳとを含むチューブ内のポリウレタンカテーテルおよびテフロン（登録商標）カテーテルを、４℃で２４時間インキュベートした。カテーテルは次にＰＢＳですすぎ、１０−１希釈のS. epidermidis培養物を含むチューブ内に移した。６時間後、カテーテルをＰＢＳですすいで弱く付着した細胞を除去し、次に前述のようにして染色した。対照カテーテルの表面は濃く染色された物質の層で覆われており、生物膜の存在を示し、一方ジスペルシンＢで被覆したカテーテルは濃く染色された物質を含まず、播種なしカテーテルと外観が類似していた。このように、本発明のジスペルシンＢで予め被覆されたプラスチックカテーテルは、S. epidermidisの付着または生物膜生成を大幅に低減させた。１０分間前に被覆したカテーテル、および２４時間前に被覆して乾燥させたカテーテルもまた、S. epidermidisのコロニー形成および生物膜形成に対して抵抗性を有した。
【００４８】
従って、これらの実験で示されたように、単離されたジスペルシンＢの添加およびｄｓｐＢ遺伝子の突然変異は、種々の細菌の生物膜コロニーからの、細胞の剥離、特にＮ−アセチルグルコサミンを含む多糖類を含む生物膜を有する細菌の生物膜コロニーからの、細胞の剥離を調節する。真菌もまた、Ｎ−アセチルグルコサミンを含む多糖類を含む可能性のある、臨床的に重要な生物膜を形成する。ジスペルシンＢは、これらの真菌性の多糖類の分解および、それらの生物膜からのかかる真菌細胞の剥離の調節にも、有効であると考えられる。
【００４９】
従って、本発明はまた、生物膜からの細菌細胞または真菌細胞の剥離、特に、Ｎ−アセチルグルコサミンを含む多糖類を含む生物膜を有する細菌または真菌の剥離を調節する方法に関する。
本明細書で用いる「剥離の調節」により、細菌性生物膜もしくは真菌性生物膜の剥離、または生物膜からの細菌細胞もしくは真菌細胞の放出の、増加および減少を含むことを意味する。さらに、「剥離の調節」により、細菌または真菌の、生物膜として付着する能力における変化も含むことを意味する。例えば、本明細書で示されるように、ジスペルシンＢは、剥離を促進することによってばかりでなく、細菌が表面に付着して生物膜を形成する能力を抑制することによっても、S. epidermidisの剥離を調節する。
【００５０】
本発明の１つの態様においては、前記方法は、本発明のＪＫ１０２３変異体におけるように、細菌細胞のｄｓｐＢを突然変異させて生物膜からの細菌細胞の剥離を抑制することを含む。他の態様において、前記方法は、可溶性のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの発現および／またはレベルを減少させること、または細菌細胞中の可溶性のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの活性を阻害して、細菌細胞の剥離を低減させることを含む。
【００５１】
本発明はまた、細菌細胞または真菌細胞の生物膜からの剥離を促進する方法を提供し、この方法は、細菌細胞または真菌細胞を、可溶性のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼまたはその活性断片もしくは変異体、または可溶性のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼまたはその活性断片もしくは変異体をコードする核酸配列に接触させることを含む。例えば、A. actinomycetemcomitansジスペルシンＢは、Haemophilus aphrophilus、Actionbacillus pleuropneumonaieおよびS. epidermidisの生物膜を剥離することが見出された。Actionobacillus ligniersii、および、例えばどのような意味でもこれに限定するものではないがStaphylococcus aureusおよびYersinia pestisなどを含む、Ｎ−アセチルグルコサミンを含む多糖類を含む生物膜を有する他の細菌または真菌の生物膜剥離もまた、本発明の可溶性のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼまたはその活性断片の存在下で促進されると考えられる。
【００５２】
従って、単離されたジスペルシンＢタンパク質およびそれらの活性断片または変異体は、細菌性または真菌性生物膜の付着を防ぐこと、または阻害すること、およびかかる細菌または真菌による感染を処置することに用いることができる。
１つの態様においては、単離されたジスペルシンＢタンパク質およびその活性断片または変異体は、生物膜感染を処置するため、例えば雌ヒツジにおける乳腺炎、雌ウシにおける乳房炎またはヒトにおける骨髄炎および感染性心内膜炎を処置するために、非経口的に直接用いることができる。この態様においては、単離された可溶性のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼタンパク質またはその活性断片もしくは変異体は、好ましくは、生物に対して薬学的に許容し得る担体中の医薬組成物として投与される。
【００５３】
「生物」により、本明細書で用いられる場合、哺乳類を含むがそれには限定されない全ての動物を意味し、最も好ましくはヒトを意味する。
任意の薬学的に許容し得るビヒクルまたは担体、および補助剤を、ジスペルシンＢタンパク質またはその活性断片もしくは変異体を含む医薬製剤の製造、溶解および投与に用いることができる。かかるビヒクル、担体および補助剤は当業者によく知られており、Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1985などの教科書に記載されている。医薬組成物中に含まれるべき活性成分の適切な濃度は、当業者によりルーチンで決定することができ、投与形態および処置する状態の重篤度に依存する。
【００５４】
経口投与に好適な医薬製剤は、便利な単位形態で提供することができ、これに限定はしないがカプセルまたは錠剤を含み、該カプセルまたは錠剤の各々は、予め決められた量のジスペルシンＢタンパク質またはその活性断片もしくは変異体を、粉体または顆粒として；溶液、懸濁液または乳濁液として含む。ジスペルシンＢタンパク質またはその活性断片もしくは変異体はまた、ボーラス、舐薬、またはペーストとすることもできる。経口投与用の錠剤およびカプセルは、従来の賦形剤、例えば結合剤、充填剤、潤滑剤、分解剤、または湿潤剤などを含むことができる。錠剤は、当業者に知られた方法に従って被覆することができる。当業者に知られている時間放出製剤も適している。経口用液体製剤は、例えば水性もしくは油性の懸濁液、溶液、乳濁液、シロップもしくはエリキシル剤などの形態で、または、水もしくは他の好適なビヒクルと共に使用前に構成する乾燥製品として、提供することができる。かかる液体製剤は、従来の添加剤、例えば懸濁剤、非水溶性ビヒクルで食用油を含むもの、または保存剤などを含むことができる。
【００５５】
本発明のジスペルシンＢタンパク質またはそれらの活性断片もしくは変異体はまた、例えば、注入により、例えばボーラス注入または持続輸注により、非経口投与用の製剤にすることができ、アンプル、予注入シリンジ、少量輸注にて単位用量形態で、または、保存剤添加の複数用量用容器にて、製剤とすることができる。非経口的投与のためにジスペルシンＢタンパク質またはその活性断片もしくは変異体を含む、薬学的に許容し得る組成物は、油性または水性のビヒクル中に懸濁液、溶液または乳濁液の形態で存在することができ、懸濁剤、安定剤、および／または分散剤などの製剤化用の剤を含むことができる。代替的に、活性成分は、殺菌した固体の無菌性単離によりまたは溶液から凍結乾燥することにより粉末形態にしておき、使用前に、殺菌した発熱物質を含まない水などの好適なビヒクルと構成することもできる。
【００５６】
表皮への局所投与については、本発明のジスペルシンＢタンパク質またはその活性断片もしくは変異体は、軟膏、クリーム、またはローション中に、または経皮パッチとして製剤化することができる。軟膏およびクリームは、例えば、水性または油性のベースと共に、好適な増粘剤および／またはゲル化剤を添加して製剤化することができる。ローションは水性または油性のベースと共に製剤化することができ、一般にまた、１種または２種以上の乳化剤、安定剤、懸濁剤、増粘剤、または着色剤を含む。口への局所投与に好適な製剤は、以下を含む：風味付けされたベース、通常はショ糖およびアカシアまたはトラガカントの中に、ジスペルシンＢタンパク質またはそれらの活性断片もしくは変異体を含むロゼンジ；ゼラチンおよびグリセリンまたはショ糖およびアカシアなどの不活性ベースに活性成分を含むパステル剤；および、好適な液体担体中に活性成分を含むうがい薬、。眼への局所投与に対しては、ジスペルシンＢタンパク質またはそれらの活性断片もしくは変異体は、好適な殺菌した水性または非水性のビヒクル中の溶液または懸濁液中に作製することができる。バッファ（例えば、メタ重亜硫酸ナトリウムまたはエデト酸二ナトリウム）などの添加剤およびヒプロメロース（hypromellose）などの増粘剤もまた含有可能である。
【００５７】
鼻腔内投与の場合、本発明のジスペルシンＢタンパク質またはその活性断片もしくは変異体は、液体スプレーまたは分散性粉末または滴剤の形態で提供することができる。滴剤は、１種または２種以上の分散剤、溶解剤、または懸濁剤を含む、水性または非水性ベースと共に製剤化することができる。液体スプレーは、加圧パックから便利に送達される。
吸入による投与の場合、本発明のジスペルシンＢタンパク質またはそれらの活性断片もしくは変異体は、通気器、ネブライザー、またはエアゾールスプレーを送達する加圧パックまたは他の便利な方法により、送達することができる。加圧パックは、好適な噴霧剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の好適なガスなどを含むことができる。加圧エアゾールの場合、用量単位は、計測した量を送達するためのバルブを提供することにより決定することができる。
【００５８】
代替的に、吸入または通気器による投与の場合、本発明のジスペルシンＢタンパク質またはそれらの活性断片もしくは変異体は、乾燥粉末組成物の形態、例えば活性成分と乳糖またはスターチなどの好適な粉末ベースとの粉末混合物の形態をとることができる。粉末組成物は、例えばカプセル、カートリッジまたはゼラチンのブリスターパックなどに入れた単位用量形態をとることができ、それらから、吸入器または通気器の助けにより粉末が投与される。
【００５９】
必要に応じて、任意の前述の製剤を、ジスペルシンＢタンパク質またはその活性断片もしくは変異体の持続放出を提供するように適合することができる。
本発明のジスペルシンＢタンパク質またはその活性断片もしくは変異体の、処置に用いるために必要な量は、選択された特定のタンパク質または活性断片もしくは変異体によるのみでなく、投与経路、処置される状態の特徴、および生物の年齢および状態によっても当然変化する。
【００６０】
生物膜からの細菌の剥離の増加はまた、抗生物質による治療に対する細菌の抵抗性を減少させることが期待される。従って、本発明はまた、本発明の医薬組成物を抗生物質投与と組み合わせて、またはそれに先立って投与することによる、細菌感染に対する抗生物質治療の有効性を強化するための方法も提供する。
【００６１】
本発明の他の態様により、これらに限定はしないがスポンジまたはガーゼを含む創傷包帯を、単離されたジスペルシンＢタンパク質またはその活性断片もしくは変異体を含浸させて、細菌または真菌の付着を妨害または抑制し、創傷の感染のリスクを低減することができる。同様に、カテーテルシールドおよびカテーテル挿入部位を被覆するために用いる他の材料を、ジスペルシンＢタンパク質またはその活性断片もしくは変異体により被覆または含浸させて、細菌性または真菌性生物膜のそれらへの付着を阻害することができる。ハイリスクの外科手術中に創傷の感染を防ぐために用いられる粘着性ドレープもまた、単離されたタンパク質またはその活性断片もしくは変異体に含浸させることができる。ジスペルシンＢタンパク質またはその活性断片もしくは変異体により被覆することができるさらなる医療デバイスは以下を含むが、これらに限定はされない：中心静脈カテーテル、血管内カテーテル、尿カテーテル、ヒックマンカテーテル、腹膜透析カテーテル、気管内チューブ、機械弁、心臓ペースメーカー、動静脈シャント、強膜バックル（schleral buckle）、人工関節、鼓膜切開チューブ、気管切開チューブ、人工声帯（voice prosthetics）、人工ペニス、人工尿道括約筋、合成恥骨膣スリング（synthetic pubovaginal sling）、縫合糸、骨用アンカー、骨用スクリュー、眼内レンズ、コンタクトレンズ、子宮内デバイス、大腿動脈移植および血管移植。ガーゼまたはスポンジ、カテーテルシールドおよび粘着性ドレープを含浸させるため、またはカテーテルシールドおよび他の医療デバイスを被覆するための溶液の例は、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ約７．５）および重炭酸緩衝液（ｐＨ約９．０）を含むが、これらに限定されない。
【００６２】
さらに他の態様において、単離されたジスペルシンＢタンパク質またはその活性断片もしくは変異体は、消毒溶液に組み込むことができる。かかる溶液は、さらに、アルコールなどの抗菌薬または抗真菌剤、プロビドン−ヨード溶液および抗生物質および保存剤を含むことができる。これらの溶液は、例えば、カテーテルなどのデバイスの挿入または移植の前に皮膚またはその周辺領域の消毒剤として、カテーテルのロックおよび／またはフラッシュ溶液として、および、任意の医療デバイスの消毒すすぎ剤として用いることができ、前記医療デバイスには、針、ロイアロックコネクタ（Leur-Lok connector）、針なしコネクタおよびハブなどのカテーテル部品、および他の移植用デバイスが含まれるが、これらに限定されない。これらの溶液はまた、クランプ、ピンセット、鋏、皮膚用フック、チューブ、針、開創器、スケーラー、ドリル、チゼル、ラスプおよび鋸などを含む外科用器具の被覆または消毒のために用いることができるが、外科用器具はこれらに限定はされない。
【００６３】
本発明の核酸配列およびアミノ酸配列、およびＪＫ１０２３変異株はまた、生物膜からの細菌細胞または真菌細胞の剥離を調節する剤を同定するためにも用いることができる。例えば、剤の有する、本発明の可溶性のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの活性および／または発現を調節する能力を評価することができる。
かかる剤には、これらに限定はされないが、ｄｓｐＢ遺伝子を標的とするアンチセンスのオリゴヌクレオチドまたはリボザイム、ジスペルシンＢのペプチド模倣薬、および、ジスペルシンＢの活性および／またはレベルおよび／または発現を調節する、キナクリンおよびＮＡＧチアゾリンなどの小さな有機化学物質が含まれる。
【００６４】
可溶性のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼが有する、生物膜からの細菌細胞の剥離を促進するという能力を抑制する剤は、感染性の細菌の播殖、特にA. actinomycetemcomitansおよび近縁種の細菌であるHaemophilus aphrophilusなどの口腔の感染性細菌の播殖を防ぐのに、有用であることが期待される。
ジスペルシンＢの活性を模倣する剤、例えばペプチド模倣薬およびジスペルシンＢと構造および活性が類似の有機小分子は、単離されたジスペルシンＢまたはその活性断片もしくは変異体と同様の様式で、細菌性または真菌性生物膜の表面への付着から生じる感染を、防ぐ、抑制する、または処置するために、用いることができる。かかる使用は上記の本明細書に詳細に記載されている。
【００６５】
本発明はまた、ジスペルシンＢホモログを有する細菌のさらなる種を同定するために用いるための、プライマー対および、かかるプライマー対を含むキットを提供する。本発明のキットにおいて有用な縮重プライマー対の例は、5’-GAYCAYGARAAYTAYCG-3’（配列番号１２）および5’-TCNCCRTCRTARCTCCA-3’ （配列番号１３）を含み、ここでＹはＣまたはＴ、およびＲはＡまたはＧである。本発明のキットは、好ましくは、キットの使用の手引き、および／または陽性および陰性対照サンプルをさらに含む。これらのキットによってジスペルシンＢホモログを有すると同定された細菌は、さらに試験して、ホモログがジスペルシンＢと同一または類似の酵素活性を示すオーソログであるかどうかを決定する。本発明のプライマーおよびキットは、従って、生物膜へのその付着が核酸配列、アミノ酸配列、および本明細書に記載の剤を用いて調節できるさらなる細菌、ならびに、ジスペルシンＢのさらなるオーソログ核酸配列およびアミノ酸を、同定するのに有用である。
以下の非限定的な例は、本発明をさらに説明するために提供される。
【００６６】
例
例１：細菌株および増殖条件
A. actinomycetemcomitansのＣＵ１０００（血清型ｆ）は、１３歳の若年性局所歯周炎の患者から単離された臨床株である（Fine et al. Microbiol. 1999 145: 1335-1347）。ＣＵ１０００Ｎ株は、ＣＵ１０００株のナリジクス酸自然発生誘導体であって、母株と同じく、表面への付着、生物膜コロニー形成および生物膜の分散表現型を示す誘導体である（Fine et al. Arch. Oral Biol. 2001 46: 1065-1078；Kachlany et al. J. Bacteriol. 2000 182: 6169-6176；Kachlany et al. Mol. Microbiol. 2001 40: 542-554；Thomson et al. J. Bacteriol. 1999 181: 7298-7307）。トランスポゾンＩＳ９０３φｋａｎによるＣＵ１０００Ｎ株の突然変異誘発を、Thomsonらが示した手順に従って行った（J. Bacteriol. 1999 181: 7298-7307）。他に利用した株には、A. actinomycetemcomitansのＤＦ２２００（血清型ａ）、ＮＪ８８００（血清型ｂ）、ＮＪ２７００（血清型ｃ）、およびＮＪ９５００（血清型ｅ）（Kaplan et al. J. Clin. Microbio. 2002 40: 1181-1187）；ならびに、A. actinomycetemcomitansのＩＤＨ７８１株（Saarela et al. Oral Microbiol. Immunol. 1993 8: 111-115）；Haemophilus aphrophilusの ＮＪ８７００株（Kaplan et al. J. Clin. Microbiol. 2002 40: 1181-1187）；Neisseria subflavaのＮＪ９７０２株（Kaplan, J.B. and Fine, D.H. Appl. Environ. Microbiol. 2002 68: 4943-4950）；Cardiobacterium hominisのＮＪ６５００株；Actionbacillus ligniersiiの１９３９３株（ATCC, Manassa, VAから入手）；およびStreptococcus mitis のＮＪ９７０５株（Kaplan, J. B. and Fine, D. H. Appl. Environ. Microbiol. 2002 68: 4943-4950）が含まれる。S. epidermidis株は、感染した静脈内カテーテルの表面から単離され、Api-Staph生化学同定キット（Biomerieux Lyons France）を用いて同定した。A. pleuropneumoniae株は、Veterinary Diagnostics Laboratory（Iowa State University, Ames, IL）から入手した。細菌は、Trypticase大豆ブロス（BD Biosystems）に、１リットル当たりイースト抽出物６ｇおよびグルコース８ｇを加えた中で培養した。播種した培養容器は３７℃、１０％ＣＯ２下でインキュベートしたが、S. epidermidisの培養のみは、３７℃の空気中でインキュベートした。
【００６７】
例２：ｄｓｐＢのクローニングおよび配列決定
A. actinomycetemcomitansのＪＫ１０２３突然変異株のトランスポゾン挿入部位を、逆ＰＣＲ法を用いてKaplanら（Infect. Immun. 2001 69: 5375-5384）に従ってクローニングおよび配列決定した。逆ＰＣＲ産物のＤＮＡ配列を、Actinobacillus遺伝子配列決定プロジェクトによるA. actinomycetemcomitansのＨＫ１６５１株の遺伝子配列と比較して、トランスポゾンが、ｄｓｐＢと指定された長いオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）の中に挿入されたことを見出した。ＨＫ１６５１のｄｓｐＢの上流および下流配列にハイブリダイズするプライマーを用いて、A. actinomycetemcomitansのＣＵ１０００株からのｄｓｐＢコーディング領域を、Kaplanら（Infect. Immun. 2001 69: 5375-5384）に従った方法を用いてＰＣＲにより増幅した。
【００６８】
フォワードプライマー（5-GCGCGCCATatgAATTGTTGCGTAAAAGGCAATTCC-3（配列便号１４））は、ＮｄｅＩ制限酵素認識部位（下線部）およびＡＴＧ開始コドン(小文字部)を、ｄｓｐＢのコドン位置１９〜２０に導入し、リバースプライマー（5-GCGGTACCCTCATCCCCATTCGTCTTATGAATC-3（配列便号１５））は、ｄｓｐＢの終止コドンをＫｐｎＩ制限酵素認識部位（下線部）で置き換えた。ＰＣＲ産物（１，１０６塩基対）を、ＮｄｅＩおよびＫｐｎＩを用いて切断（digest）し、プラスミドｐＥＴ２９ｂ（Novagen）のＮｄｅＩ／ＫｐｎＩ部位に結紮した。得られたプラスミド（ｐＲＣ１とする）のインサートは、Kaplanらが記載した手順（Infect. Immun. 2001 69: 5375-5384）に従ってＤＮＡ配列決定解析を行った。
【００６９】
例３：組み換えジスペルシンＢの発現および精製
プラスミドｐＲＣ１は、ヘキサヒスチジン金属結合部位と、ハイブリッドタンパク質からＣ末端尾を開裂するために用いることができるトロンビンプロテアーゼ開裂部位とを含む３２個のアミノ酸残基のＣ末端尾に融合された、ｄｓｐＢのアミノ酸２１〜３８１をコードする遺伝子を運ぶ。この遺伝子は、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）誘導性ｔａｃプロモーターの下流に位置していた。
【００７０】
大腸菌におけるｄｓｐＢの発現
ＬＢブロス５００ｍｌにカナミシン５０μｇ／ｍｌを添加したものを含む１リットルの三角フラスコに、大腸菌ＢＬ２１株（ＤＥ３）（Dubendorff, J.W. and Studier, F.W. J. Mol. Biol. 1991 219: 61-68）の一晩培養液をｐＲＣ１で転換したものを播種した。フラスコを３７℃で攪拌しながら（２００ｒｐｍ）、培養液の光学密度（２８０ｎｍで測定）が０．６になるまでインキュベートした（約３時間）。ＩＰＴＧを加えて最終濃度を０．２ｍＭとし、フラスコをさらに５時間攪拌しながらインキュベートした。細胞は、６，０００×ｇで１５分間遠心分離して収穫し、細胞沈殿物を−８０℃で保存した。
【００７１】
タンパク質の精製
細胞沈殿物を氷上で解凍し、１０ｍｇ／ｍｌのリソザイムを含むリーシスバッファ（lysis buffer）[２０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．２）、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム]２０ｍｌ中に再懸濁した。細胞懸濁物を、マイクロプローブを備えたソニケーターBranson model 4550を用いて、５０％容量、７０％デューティサイクルで３０秒間超音波処理し、続いて氷上で３０秒間冷却した。超音波処理および冷却ステップをさらに４回繰り返した。細胞を上記のように遠心分離で沈殿させ、上澄みを新しいチューブに移した。細胞沈殿物をリソザイムなしのリーシスバッファ２０ｍｌ中に再度懸濁し、さらに５サイクルの超音波処理および冷却を行った。細胞を遠心分離で沈殿させ、上澄みを除去して新しいチューブに移した。２つの上澄みを混ぜて、３ｍｌのベッド体積のＮｉ親和性カラム（Pahrmacia、カタログ番号154-0990）に、製造者による指示書に従って負荷した。カラムを、５ｍＭのイミダゾールを含む洗浄バッファ５０ｍｌ[５０ｍＭのＭＯＰＳ（ｐＨ８．５）、２０ｍＭのＫＣｌ]で洗浄し、次に５０ｍＭのイミダゾールを含む洗浄バッファ２５ｍｌ、および１００ｍＭのイミダゾールを含む洗浄バッファ２５ｍｌで洗浄した。断片（各１．５ｍｌ）を最終の洗浄中に収集し、ハイブリッドタンパク質の存在を、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）およびSambrookら（1989. Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.）が記載した手順に従ってクマシー・ブルー染色により検査した。タンパク質を含む断片をプールして、水に対して１０，０００ＭＷカットオフ透析膜を用いて一晩透析した。精製タンパク質は、タンパク質１ｍｇ当たり５単位のトロンビン（Novagen）を用いて室温で１時間かけて切断し、トロンビンは、トロンビン開裂捕捉キット（Novagen）を用いてキットについている指示書に従って取り除いた。未切断のタンパク質は、サンプルをＮｉ親和性カラムに前述のように負荷し、カラムを５ｍＭのイミダゾールを含む洗浄バッファ１０ｍｌで洗浄して除去した。洗浄物の断片（各１．５ｍｌ）を収集し、タンパク質の存在をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した。タンパク質を含む断片をプールし、水に対して透析し、−２０℃で保存した。精製したタンパク質のＮ末端配列解析をエドマン分解法（Edman degradation procedure）を用いてBeckman model 2300のプロテインシーケンサーで実施した。質量スペクトルは、日立製４４１４型質量分析器を用いて測定した。
【００７２】
例４：酵素アッセイ
合成基質（Sigma Chemical Co.より購入）は、４−ニトロフェニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトサミニド、４−ニトロフェニル−Ｎ−アセチル−α−Ｄ−ガラクトサミニド、４−ニトロフェニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサアミニド、および４−ニトロフェニル−Ｎ−アセチル−α−Ｄ−グルコサミニドであった。酵素反応は、３７℃の水槽中に入れた１５ｍｌのポリプロピレンチューブ中の、５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．９）、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭの基質、および３．７μｇ／ｍｌの精製タンパク質を含む１０ｍｌ体積内で行った。反応は、反応混合物１ｍｌをＮａＯＨ５μｌを含む新しいチューブに移すことにより、様々な時点で終了させた。各チューブ内でのｐ−ニトロフェノラートの放出による吸収の増加を、４０５ｎｍに設定した島津製作所製ＵＶ−Ｍｉｎｉ分光光度計で測定した。
【００７３】
例５：A. actinomycetemcomitansの他の株、および細菌の他の種における、ｄｓｐＢオーソログの同定
微生物遺伝子データベースwww.ncbi.nlm.nih.govで、A. actinomycetemcomitansのｄｓｐＢのホモログを検索した。ｄｓｐＢホモログは、A. pleuropneumoniae血清型(serovars)１、５および７の未完了の遺伝子で同定された。A. pleuropneumoniaeのｄｓｐＢホモログは、アミノ酸レベルでA. actinomycetemcomitansのＣＵ１０００のｄｓｐＢ配列と６０％の同一性を示した。Pasteurellaceae科の他のメンバーにおけるｄｓｐＢホモログをさらに検索した。A. actinomycetemcomitansのＣＵ１０００のｄｓｐＢのアミノ酸配列は、A. pleuropneumoniaeのｄｓｐＢホモログと揃っており、非常によく保存されている配列の２つの領域が同定された。これらの保存されたアミノ酸（5’-GAYCAYGARAAYTAYCG-3’（配列番号１２）および5’-TCNCCRTCRTARCTCCA-3’ （配列番号１３）、ここでＹ＝ＣまたはＴ、Ｒ＝ＡまたはＧ、およびＮ＝ＡまたはＣまたはＧまたはＴである）をコードするＤＮＡ配列にハイブリダイズする縮重・オリゴヌクレオチドプライマーを合成し、これらのプライマーを用いて、Pasteurellaceaeの種々の種から精製された遺伝子ＤＮＡをＰＣＲにより増幅した。予想されたサイズのＰＣＲ産物が、A. actinomycetemcomitansのＩＤＨ７８１株（Saarela et al. 1993. Oral Microbiol. Immunol. 8: 111-115）、A. pleuropneumoniaeのＩＡ５株（Veterinary Diagnostics Laboratory, Iowa State University, Ames, IAより入手）、Haemophilus aphrophilusのＮＪ８７００株（Kaplan et al. 2002 J. Clin. Microbiol. 40: 1181-1187）、およびA. lignieressiの１９３９３株（American Type Culture Collection, Manassas, VAより入手）からの遺伝子ＤＮＡに観察された。Haemophilus somnus、Actionbacillus equuli、Pasteurella multocidaおよびMannheimia haemolyticaからのＤＮＡには、ＰＣＲ産物は観察されなかった。
【００７４】
ＰＣＲ産物を、マルチコピープラスミドにクローニングし、ＤＮＡ塩基配列決定法を行った。図１は、予想されたA. actinomycetemcomitansＣＵ１０００のｄｓｐＢアミノ酸配列と、A. actinomycetemcomitansの他の株および他のPasteurellaceae細菌からのｄｓｐＢホモログの配列を比較したものである。
【００７５】
例６：A. actinomycetemcomitansの野生株でのｄｓｐＢの過剰発現
A. actinomycetemcomitansの野生株でのｄｓｐＢの過剰発現の効果を決定するために、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）誘発性プロモーターの制御のもとでｄｓｐＢを含むプラスミドを作製した。このプラスミドをＣＵ１０００野生株に導入し、１ｍＭのＩＰＴＧの存在下で細胞を増殖させた。ｄｓｐＢを発現するプラスミドを収容している（harboring）ＣＵ１０００細胞は、寒天培地上に滑らかなコロニー形態を示し、培養容器の表面のサテライトコロニーの数の増加によって示されるように、培養液ブロス中に分散性の高い表現型を示す生物膜を生成した。これらの所見により、ｄｓｐＢ発現は、生物膜の分散量に関連していることが確認される。
【００７６】
例７：マイクロタイタープレート内でのポリスチレンロッドからの生物膜細胞の剥離
予めポリスチレンロッド上に増殖させた生物膜コロニーからの細胞の剥離を測定するアッセイを、９６穴マイクロタイタープレートで行った。生物膜コロニーを、マイクロタイタープレートの９６穴内のブロスに懸濁させたポリスチレンロッド上に増殖させた。生物膜から剥離した細胞は、穴の底に落ちて、その表面に付着し、新しい生物膜コロニーを形成した。穴の底に増殖した生物膜の量は、ロッド上の生物膜コロニーから剥離した細胞数に比例し、これはクリスタルバイオレットで染色して計測した。剥離アッセイは以下のように行った。
【００７７】
機器の構成
９６穴ポリスチレン平底組織培養プレート（Falcon No. 353072）の蓋を以下のように改良した：まず、直径１．５ｍｍの孔を９６個、蓋にあけて、各孔が９６穴の中心にそれぞれ対応して位置するようにする。次に、長さ１１ｍｍのポリスチレンロッド（直径１．５ｍｍ、Plastruct Corp., City of Industry, CA）を各孔に入れ（ロッドの１つの端が蓋の先端と同じ高さになるように）、トリクロロメタンプラスチック溶媒で確保した。この改良蓋を９６穴マイクロタイタープレート底部上に置いた場合、ロッドは穴の中に、各ロッドの底が穴の底から約２ｍｍ上になるように吊り下げられた。改良蓋は、７０％エタノールに３０分間浸し、生物学的に安全なキャビネット内で空気乾燥させることにより殺菌した。
【００７８】
ポリスチレンロッドの播種およびインキュベーション
マイクロタイタープレート底部に媒体（１穴当たり１００μｌ）を充填し、各穴に、寒天培地から殺菌爪楊枝を用いて２〜３日令のコロニーを１つずつ播種した。改良蓋を播種プレート上にかぶせて、ポリスチレンロッドを播種媒体中に浸し、プレートを３７℃で２４時間インキュベートして、細菌をロッドに付着させた。次に蓋を、予め暖められた媒体を入れた新鮮なマイクロタイタープレートに移動させ、さらに２４時間インキュベートして、生物膜の細胞をロッドから剥離させた。
【００７９】
剥離細胞の測定
蓋を取り、プレートを水道水の流水で広範に洗浄し、緩く付着した細胞を除去した。穴にグラム染色試薬１００μｌ（１００ｍｌ当たり、クリスタルバイオレット２ｇ、シュウ酸アンモニウム０．８ｇ、エタノール２０ｍｌ）を充填し、プレートを室温で１０分間インキュベートした。プレートは再度水道水の流水で広範に洗浄し、未結合の染料を除去した。穴は次にエタノール１００μｌを充填し、プレートを室温で１０分間インキュベートして、染料を溶解した。各穴のエタノール／染料の光学密度（５９０ｎｍにおける）を、Bio-Radのベンチマークマイクロプレートリーダーで計測した。
【００８０】
例８：ポリスチレンロッド上での生物膜の増殖
ポリスチレンロッド（直径１．５ｍｍ；Plastruct Corp., City of Industry, Calf.）を３５ｍｍの長さに切断し、７０％エタノール中で３０分間殺菌し、生物学的に安全なキャビネット内で空気乾燥させた。ロッドを、S. epidermidisを播種したブロス０．５ｍｌを含む１．５ｍｌのマイクロ遠心管に入れ、１６時間インキュベートした。ロッドを次に水道水の流水ですすぎ、ＰＢＳ０．５ｍｌまたはＰＢＳとジスペルシンＢを０．５ｍｌを含む新鮮なマイクロ遠心管に入れた。ロッドを水ですすぎ、上記と同様にしてクリスタルバイオレットで染色した（Kaplan, J.B., and Fine, D.H. Appl. Environ. Microbiol. 2002 68: 4943-4950）。超音波処理のため、ロッドを、ＰＢＳ３ｍｌを含む１５ｍｌの円錐遠心管に入れ、３０秒間、４０％のデューティサイクルおよび７０％の容量で、カップホーン（cup horn）付きBranson model 200ソニケーターで超音波処理した。剥離細胞の定量化のために、超音波処理物を順番に希釈して、１．５％寒天培地で固化した媒体上にプレートした。
【００８１】
例９：ポリスチレンマイクロタイタープレート内での生物膜の増殖
９６穴ポリスチレンマイクロタイタープレート（model 3595, Corning）の穴に、S. epidermidisを播種したブロス１００μｌを充填し、プレートを１６時間インキュベートした。マイクロタイタープレートの洗浄は、媒体を吸引し、穴を２００μｌのＰＢＳで３回洗浄するか、またはプレート全体を冷たい水道水の流水を流したたらいの中に浸すことにより行った。生物膜を前述と同様にしてクリスタルバイオレットで染色した（Kaplan, J.B., and Fine, D.H. Appl. Environ. Microbiol. 2002 68: 4943-4950）。
【００８２】
例１０：９６穴マイクロタイタープレート生物膜細胞剥離アッセイ
９６穴マイクロタイタープレート（Falcon no. 353072）の穴に、１０２〜１０４ＣＦＵの細菌を含む媒体１００μｌを充填し、３７℃、１０％ＣＯ２下で２０時間インキュベートした。酵素溶液１０μｌ［リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に１ｍｇ・ｍｌ−１］、または、対照の場合はＰＢＳ１０μｌを各穴に加え、プレートをさらに６時間インキュベートした。穴は水道水の流水で広範に洗浄し、表面に付着した残留細菌をクリスタルバイオレットで染色し、再度洗浄し、Kachlanyら（Mol. Microbiol. 2001 40: 542-554）により記載された手順に従って、エタノールで染色を抜いた。エタノール−染料溶液の光学密度（Ｏ．Ｄ．）を、５９０ｎｍに設定したBioRad Benchmarkマイクロタイタープレートリーダーにより計測した。
【００８３】
例１１：静脈内カテーテル上での生物膜の増殖
ポリウレタンカテーテル（直径１．１ｍｍ、model 381434、Becton-Dickinson）およびテフロン（登録商標）カテーテル（直径１．２ｍｍ、model 3055、Critikon）を用いた。カテーテルの先端は、殺菌高真空グリースにより栓をして、媒体および染料が管腔に入るのを防いだ。カテーテルは播種し、ポリスチレンロッドに対する上記と同様に処置した。ジスペルシンＢによるカテーテルの前もっての被覆は、ＰＢＳまたはリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９）中で１０分〜２４時間行った。ある場合においては、被覆されたカテーテルは使用の前に２４時間空気乾燥させた。テフロン（登録商標）カテーテルは、前述のようにクリスタルバイオレットで染色した（Kaplan, J.B., and Fine, D.H. Appl. Environ. Microbiol. 2002 68: 4943-4950）。ポリウレタンカテーテルは、水中の１％メチレンブルーで２分間染色した。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】A. actinomycetemcomitansのＣＵ１０００株（配列番号２）、A. actinomycetemcomitansのＩＤＨ７８１株（配列番号６）、Haemophilus aphrophilusのＮＪ８７００株（配列番号８）、A. ligniersiiの１９３９３株（配列番号４）、およびA. pleuropneumoniaeのＩＡ５株（配列番号１０）からの、本発明の例示のジスペルシンＢオーソログのクラスター配列を示す。
【配列表】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物膜からの細菌細胞または真菌細胞の剥離を促進する可溶性のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼまたはその活性断片もしくは変異体をコードする、単離核酸配列。
【請求項２】
配列番号１、３、５、７または９の少なくとも３０個の連続したヌクレトチドに対して５０％の配列同一性を有する核酸配列を含む、請求項１に記載の単離核酸配列。
【請求項３】
配列番号１、３、５、７または９の核酸配列を含む、請求項１に記載の単離核酸配列。
【請求項４】
請求項１、２または３のいずれかに記載の単離核酸配列と第２ポリペプチドをコードする第２核酸配列とを含む融合ポリペプチドをコードする、核酸配列。
【請求項５】
請求項１、２、３または４のいずれかに記載の核酸配列を含むベクター。
【請求項６】
請求項５に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項７】
請求項１、２、３または４のいずれかに記載の核酸配列によりコードされる、単離アミノ酸配列。
【請求項８】
生物膜からの細菌細胞または真菌細胞の剥離を促進する、単離された可溶性のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼタンパク質またはその活性断片もしくは変異体。
【請求項９】
配列番号２、４、６、８または１０を含む、請求項８に記載の単離された可溶性のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼタンパク質またはその活性断片もしくは変異体。
【請求項１０】
請求項８または９に記載のアミノ酸配列および、第２ポリペプチドを含む、融合タンパク質。
【請求項１１】
有効量の請求項８または９に記載の単離された可溶性のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼタンパク質またはその活性断片もしくは変異体、および薬学的に許容し得る担体を含む、医薬組成物。
【請求項１２】
請求項１１に記載の医薬組成物を、抗生物質と組み合わせて、または抗生物質の投与に先立って投与することを含む、細菌感染症に対する抗生物質の有効性を強化するための方法。
【請求項１３】
請求項８または９に記載の単離された可溶性のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼタンパク質またはその活性断片もしくは変異体で被覆された、医療用デバイス。
【請求項１４】
請求項８または９に記載の単離された可溶性のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼタンパク質またはその活性断片もしくは変異体を浸透させた、創傷治療用デバイス。
【請求項１５】
請求項８または９に記載の単離された可溶性のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼタンパク質またはその活性断片もしくは変異体を含む、消毒液。
【請求項１６】
生物膜からの細菌細胞または真菌細胞の剥離を抑制するための方法であって、細菌細胞のｄｓｐＢ遺伝子を突然変異させて、生物膜からの細菌細胞または真菌細胞の剥離を抑制することを含む、前記方法。
【請求項１７】
生物膜からの細菌細胞または真菌細胞の剥離を抑制するための方法であって、可溶性のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの発現もしくはレベルを低下させること、または、細菌細胞内での可溶性のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの活性を抑制することにより、生物膜からの細菌細胞または真菌細胞の剥離を低減させることを含む、前記方法。
【請求項１８】
Actinobacillus actinomycetemcomitansの単離された突然変異体であって、表面に強く付着するが、細胞を媒体中に放出できないかまたは表面上に分散できない生物膜のコロニーを形成する、前記突然変異体。
【請求項１９】
ｄｓｐＢ遺伝子が突然変異している、請求項１８に記載の突然変異体。
【請求項２０】
生物膜からの細菌細胞または真菌細胞の剥離を調節する剤を同定するための方法であって、可溶性のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの活性または発現またはレベルを調節する該剤の能力を評価することを含む、前記方法。
【請求項２１】
生物膜からの細菌細胞または真菌細胞の剥離を促進するための方法であって、細菌細胞を、可溶性のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼまたはその活性断片もしくは変異体と、または、可溶性のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼまたはその活性断片もしくは変異体をコードする核酸配列と接触させることにより、生物膜からの細菌細胞または真菌細胞の剥離を促進することを含む、前記方法。
【請求項２２】
医療用デバイスまたは外科用器具上の細菌または真菌による、生物の感染のリスクを低下させるための方法であって、生物が該医療用デバイスまたは外科用器具と接触する前に、該医療用デバイスまたは外科用器具を可溶性のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼまたはその活性断片もしくは変異体と接触させることを含む、前記方法。
【請求項２３】
医療用デバイスが、可溶性のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼまたはその活性断片もしくは変異体により被覆されている、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
可溶性のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼまたはその活性断片もしくは変異体による被覆が、医療用デバイス上で乾燥される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
医療用デバイスがカテーテルであり、可溶性のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼまたはその活性断片もしくは変異体が、該カテーテル内のカテーテルロック溶液中に存在する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
細菌感染または真菌感染を抑制する、防ぐまたは処置するための方法であって、生物に、可溶性のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼまたはその活性断片もしくは変異体を、または、可溶性のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼまたはその活性断片もしくは変異体をコードする核酸配列を投与することにより、生物膜からの細菌細胞または真菌細胞の剥離を促進することを含む、前記方法。
【請求項２７】
細菌感染または真菌感染が、可溶性のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼまたはその活性断片もしくは変異体により分解可能な生物膜多糖類を含む、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼを生成する細菌または真菌によるものである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
可溶性のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼまたはその活性断片もしくは変異体、または、可溶性のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼまたはその活性断片もしくは変異体をコードする核酸配列が、生物内に埋め込まれた医療用デバイスの被覆物として投与される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
可溶性のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼまたはその活性断片もしくは変異体、または、可溶性のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼまたはその活性断片もしくは変異体をコードする核酸配列が、医薬組成物として投与される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
可溶性のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼまたはその活性断片もしくは変異体、または、可溶性のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼまたはその活性断片もしくは変異体をコードする核酸配列が、消毒溶液中に組み込まれており、埋込み型医療用デバイスの挿入の前に対象に経皮的に適用される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
対象に適用される創傷包帯が、可溶性のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼまたはその活性断片もしくは変異体、または、可溶性のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼまたはその活性断片もしくは変異体をコードする核酸配列を浸透させたものである、請求項２６に記載の方法。
【請求項３２】
ｄｓｐＢホモログを有する細菌を同定する、プライマー対。
【請求項３３】
配列番号１２および配列番号１３を含む、請求項３２に記載のプライマー対。
【請求項３４】
ｄｓｐＢホモログを有する細菌を同定するためのキットであって、請求項３２または３３に記載のプライマー対、およびｄｓｐＢホモログを有する細菌を同定するための該プライマー対の使用についての説明書を含む、前記キット。
【請求項１】
生物膜からの細菌細胞または真菌細胞の剥離を促進する可溶性のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼまたはその活性断片もしくは変異体をコードする、単離核酸配列。
【請求項２】
配列番号１、３、５、７または９の少なくとも３０個の連続したヌクレトチドに対して５０％の配列同一性を有する核酸配列を含む、請求項１に記載の単離核酸配列。
【請求項３】
配列番号１、３、５、７または９の核酸配列を含む、請求項１に記載の単離核酸配列。
【請求項４】
請求項１、２または３のいずれかに記載の単離核酸配列と第２ポリペプチドをコードする第２核酸配列とを含む融合ポリペプチドをコードする、核酸配列。
【請求項５】
請求項１、２、３または４のいずれかに記載の核酸配列を含むベクター。
【請求項６】
請求項５に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項７】
請求項１、２、３または４のいずれかに記載の核酸配列によりコードされる、単離アミノ酸配列。
【請求項８】
生物膜からの細菌細胞または真菌細胞の剥離を促進する、単離された可溶性のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼタンパク質またはその活性断片もしくは変異体。
【請求項９】
配列番号２、４、６、８または１０を含む、請求項８に記載の単離された可溶性のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼタンパク質またはその活性断片もしくは変異体。
【請求項１０】
請求項８または９に記載のアミノ酸配列および、第２ポリペプチドを含む、融合タンパク質。
【請求項１１】
有効量の請求項８または９に記載の単離された可溶性のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼタンパク質またはその活性断片もしくは変異体、および薬学的に許容し得る担体を含む、医薬組成物。
【請求項１２】
請求項１１に記載の医薬組成物を、抗生物質と組み合わせて、または抗生物質の投与に先立って投与することを含む、細菌感染症に対する抗生物質の有効性を強化するための方法。
【請求項１３】
請求項８または９に記載の単離された可溶性のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼタンパク質またはその活性断片もしくは変異体で被覆された、医療用デバイス。
【請求項１４】
請求項８または９に記載の単離された可溶性のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼタンパク質またはその活性断片もしくは変異体を浸透させた、創傷治療用デバイス。
【請求項１５】
請求項８または９に記載の単離された可溶性のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼタンパク質またはその活性断片もしくは変異体を含む、消毒液。
【請求項１６】
生物膜からの細菌細胞または真菌細胞の剥離を抑制するための方法であって、細菌細胞のｄｓｐＢ遺伝子を突然変異させて、生物膜からの細菌細胞または真菌細胞の剥離を抑制することを含む、前記方法。
【請求項１７】
生物膜からの細菌細胞または真菌細胞の剥離を抑制するための方法であって、可溶性のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの発現もしくはレベルを低下させること、または、細菌細胞内での可溶性のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの活性を抑制することにより、生物膜からの細菌細胞または真菌細胞の剥離を低減させることを含む、前記方法。
【請求項１８】
Actinobacillus actinomycetemcomitansの単離された突然変異体であって、表面に強く付着するが、細胞を媒体中に放出できないかまたは表面上に分散できない生物膜のコロニーを形成する、前記突然変異体。
【請求項１９】
ｄｓｐＢ遺伝子が突然変異している、請求項１８に記載の突然変異体。
【請求項２０】
生物膜からの細菌細胞または真菌細胞の剥離を調節する剤を同定するための方法であって、可溶性のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの活性または発現またはレベルを調節する該剤の能力を評価することを含む、前記方法。
【請求項２１】
生物膜からの細菌細胞または真菌細胞の剥離を促進するための方法であって、細菌細胞を、可溶性のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼまたはその活性断片もしくは変異体と、または、可溶性のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼまたはその活性断片もしくは変異体をコードする核酸配列と接触させることにより、生物膜からの細菌細胞または真菌細胞の剥離を促進することを含む、前記方法。
【請求項２２】
医療用デバイスまたは外科用器具上の細菌または真菌による、生物の感染のリスクを低下させるための方法であって、生物が該医療用デバイスまたは外科用器具と接触する前に、該医療用デバイスまたは外科用器具を可溶性のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼまたはその活性断片もしくは変異体と接触させることを含む、前記方法。
【請求項２３】
医療用デバイスが、可溶性のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼまたはその活性断片もしくは変異体により被覆されている、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
可溶性のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼまたはその活性断片もしくは変異体による被覆が、医療用デバイス上で乾燥される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
医療用デバイスがカテーテルであり、可溶性のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼまたはその活性断片もしくは変異体が、該カテーテル内のカテーテルロック溶液中に存在する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
細菌感染または真菌感染を抑制する、防ぐまたは処置するための方法であって、生物に、可溶性のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼまたはその活性断片もしくは変異体を、または、可溶性のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼまたはその活性断片もしくは変異体をコードする核酸配列を投与することにより、生物膜からの細菌細胞または真菌細胞の剥離を促進することを含む、前記方法。
【請求項２７】
細菌感染または真菌感染が、可溶性のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼまたはその活性断片もしくは変異体により分解可能な生物膜多糖類を含む、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼを生成する細菌または真菌によるものである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
可溶性のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼまたはその活性断片もしくは変異体、または、可溶性のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼまたはその活性断片もしくは変異体をコードする核酸配列が、生物内に埋め込まれた医療用デバイスの被覆物として投与される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
可溶性のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼまたはその活性断片もしくは変異体、または、可溶性のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼまたはその活性断片もしくは変異体をコードする核酸配列が、医薬組成物として投与される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
可溶性のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼまたはその活性断片もしくは変異体、または、可溶性のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼまたはその活性断片もしくは変異体をコードする核酸配列が、消毒溶液中に組み込まれており、埋込み型医療用デバイスの挿入の前に対象に経皮的に適用される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
対象に適用される創傷包帯が、可溶性のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼまたはその活性断片もしくは変異体、または、可溶性のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼまたはその活性断片もしくは変異体をコードする核酸配列を浸透させたものである、請求項２６に記載の方法。
【請求項３２】
ｄｓｐＢホモログを有する細菌を同定する、プライマー対。
【請求項３３】
配列番号１２および配列番号１３を含む、請求項３２に記載のプライマー対。
【請求項３４】
ｄｓｐＢホモログを有する細菌を同定するためのキットであって、請求項３２または３３に記載のプライマー対、およびｄｓｐＢホモログを有する細菌を同定するための該プライマー対の使用についての説明書を含む、前記キット。
【図１】
【公表番号】特表２００６−５１１２２６（Ｐ２００６−５１１２２６Ａ）
【公表日】平成１８年４月６日（２００６．４．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５６４８４０（Ｐ２００４−５６４８４０）
【出願日】平成１５年１０月３１日（２００３．１０．３１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０３４６８３
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０６１１１７
【国際公開日】平成１６年７月２２日（２００４．７．２２）
【出願人】（５０５２３３４３５）ユニバーシティー オブ メディシン アンド デンティストリー オブ ニュージャージー (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年４月６日（２００６．４．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年１０月３１日（２００３．１０．３１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０３４６８３
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０６１１１７
【国際公開日】平成１６年７月２２日（２００４．７．２２）
【出願人】（５０５２３３４３５）ユニバーシティー オブ メディシン アンド デンティストリー オブ ニュージャージー (1)
【Ｆターム（参考）】
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