組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体、人工酸素運搬体および赤血球代替物
【課題】近位塩基を分子内に持たない金属ポルフィリンであってもこれを導入することにより安定な酸素錯体を形成し得るアルブミン−金属ポルフィリン錯体を提供する。
【解決手段】ヒト血清アルブミンのヘム結合サイトであるサブドメインＩＢにおいて、金属ポルフィリンの５配位座に配位結合するヒスチジンが遺伝子組み換え技術により少なくとも一つ導入されるとともに、１６１チロシンがチロシン以外の疎水性アミノ酸で置換された組換えヒト血清アルブミンに、金属ポルフィリンを配位結合させた組換えヒト血清アルブミン−ポルフィリン金属錯体。
【解決手段】ヒト血清アルブミンのヘム結合サイトであるサブドメインＩＢにおいて、金属ポルフィリンの５配位座に配位結合するヒスチジンが遺伝子組み換え技術により少なくとも一つ導入されるとともに、１６１チロシンがチロシン以外の疎水性アミノ酸で置換された組換えヒト血清アルブミンに、金属ポルフィリンを配位結合させた組換えヒト血清アルブミン−ポルフィリン金属錯体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体、並びにその組換えヒト血清アルブミンを含む人工酸素運搬体および赤血球代替物に関する。特に、本発明は、ヒト血清アルブミンのヘム結合サイトであるサブドメインＩＢ内へヒスチジンと疎水性アミノ酸を遺伝子組換え技術により導入した組換えヒト血清アルブミンと金属ポルフィリンとの錯体、並びにその錯体を含む人工酸素運搬体および赤血球代替物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）は、体内において血液及び細胞間液をはじめとする多くの場所に分布する分子量約６６，５００の補欠分子や、糖鎖を持たない単純蛋白質であり、１７個のジスルフィド結合を含む５８５個のアミノ酸から構成されている。血中蛋白質の約６０％を占めるため、そのコロイド浸透圧により、血管内外の水分バランスを保つとともに、血管循環動態を維持する役割を果たしている。また、非特異的な多分子結合能を持つので、各種内因性物質・外因性薬物の運搬、貯蔵、分配、代謝にきわめて重要な生理的役割を担っている。様々な動物種のアルブミンについても研究報告があり、ウシ、ラットなど哺乳類アルブミンのアミノ酸配列は、ヒト血清アルブミンと実に６０％以上の構造相同性を有する。アルブミンに関する研究は古くから実施されてきているが、Ｘ線結晶構造解析によりその三次元構造の全容が明らかにされたのは１９８９年のことであった（非特許文献１）。その後、１９９８年には、カリーらにより、脂肪酸が７分子結合したアルブミン−脂肪酸複合体の結晶構造が詳細に解明された（非特許文献２）。ＨＳＡは三つのドメイン（Ｉ、II、III）からなり、それらはさらに２つのサブドメイン（Ａ、Ｂ）から構成されている。
【０００３】
もし、血清アルブミンにヘモグロビン（Ｈｂ）のような酸素輸送能を付与することができれば、人工酸素運搬体（赤血球代替物）としての臨床利用価値はきわめて高く、例えば救急医療現場における救命措置への適用を考えただけでも、その絶大な効果が容易に推測される。興味あることに、血漿蛋白質の中にはヘミン（鉄（III）プロトポルフィリン）を取り込んでヘム蛋白質を構成するものもある。メトＨｂから血流中へ遊離したヘミンは、細胞毒性や活性酸素を発生するため、ヘモペキシンと呼ばれる糖蛋白質により速やかに捕捉され肝臓へと運ばれる（非特許文献３）。ヘモペキシン−ヘミン錯体のＸ線結晶構造解析の結果から、ヘミン分子は2つのヒスチジン残基との軸配位、及びアミノ酸残基との多重水素結合により、非常に強く固定されている様子が明らかにされている（Ｋ＞１０12Ｍ-1）（非特許文献４）。しかし、ヘモペキシンの血中濃度は＜１７μＭと低いため、これが飽和した場合には、血清アルブミンがその機能代替を果たす。アルブミンとヘミンの結合定数は約１０8Ｍ-1と報告されている（非特許文献５）。ごく最近、カーターらと本発明者らは独立に、アルブミン−ヘミン−ミリスチン酸錯体の結晶構造解析に成功した（非特許文献６、非特許文献７）。ヘミンはアルブミンのサブドメインＩＢに取り込まれ、１６１チロシンとの軸配位、及び３つの塩基性アミノ酸（リシン１９０、ヒスチジン１４６、アルギニン１１４）残基とプロピオン酸側鎖間との静電的相互作用により固定されている。ヘミン結合サイトを取り囲む分子環境は疎水性アミノ酸残基のみから構成されており、ミオグロビン（Ｍｂ）のヘムポケットとの類似性がある。窒素雰囲気下でこの水溶液に亜二チオン酸ナトリウム水溶液を添加し、ヘミンを鉄（II）プロトポルフィリン錯体（プロトヘム）へ還元すると、可視吸収スペクトルは１６１チロシンが配位した鉄（II）５配位高スピン錯体を形成する。しかし、そこへ酸素を通気しても中心鉄（II）は瞬時に酸化され、安定な酸素錯体を得ることはなかった。
【０００４】
他方、本発明者らの研究グループは、４つの疎水性置換基を有し、かつ軸塩基配位子を分子内に共有結合した鉄（II）テトラフェニルポルフィリンがアルブミンに効率よく疎水性相互作用により包接され、得られたアルブミン−ヘム複合体が生理条件下（生理塩水中、ｐＨ７．３、３７℃）でＨｂやミオグロビン（Ｍｂ）と同じように酸素を吸脱着できることを明らかにしている（特許文献１、特許文献２）。赤外吸収、共鳴ラマン、磁気円偏光二色性スペクトルなどから、酸素配位錯体の電子状態を詳細に解析するとともに、生体内でも酸素運搬のできる血清ヘム蛋白質として機能することを動物実験から定量的に実証している（非特許文献８）。また現在、人工赤血球として開発が先行している分子状Ｈｂ製剤の欠点である血圧亢進（副作用）も全く観測されていない（非特許文献９）。アルブミンはＨｂに比べ等電点が低く、内皮細胞を取り囲む基底膜との間に負電荷どうしの静電反発を生じるため、その血管内皮透過性が低く、血管内皮弛緩因子である一酸化窒素を消去しないので、急激な血圧変動は見られないのである。
【０００５】
しかしながら、これらのアルブミン−ヘム複合体において酸素配位活性中心として機能する合成ヘムは、４つの疎水性置換基と軸塩基配位子を分子内に有する特殊な立体構造の鉄（II）テトラフェニルポルフィリンでなければならず、天然のＨｂにおける鉄（II）プロトポルフィリンとはかなり構造を異にする。つまり、これまでアルブミン−ヘム複合体の鉄（II）ポルフィリンに酸素配位能を付与するための構造要件は、先ずは少なくとも分子内に共有結合で連結した近位塩基を保持させることであった。そのために合成工程は多段階にわたり、量産が難しいなどの欠点もあった。また、体内へ投与した後の代謝分解過程についても未だ不明な点が多いのも現状であった。もし、天然の金属ポルフィリン、例えば鉄（II）プロトポルフィリン、またはその誘導体を血清アルブミンに固定させて調製したアルブミン−金属ポルフィリン錯体が、ＨｂやＭｂと同じような酸素配位能を発現することができれば、その有用性は計りしれないものがある。つまり、近位塩基が分子内に導入されていない金属（II）ポルフィリンをアルブミンに結合させたアルブミン−金属ポルフィリン錯体で、Ｈｂのような可逆的酸素結合解離を達成する新技術の確立が待たれていた。
【０００６】
最近カーターらはヒト血清アルブミンに遺伝子組換え技術により親水性アミノ酸（ヒスチジンまたはグルタミン）を導入し、プロトヘムを配位固定させた組換えアルブミン−プロトヘム錯体を調製し、その酸素結合反応を検討している（特許文献３）。しかし、用いた酸素配位活性中心はプロトヘムのみであり、しかも酸素結合定数など、酸素配位能に関する定量的な解析はしていないし、実際に安定な酸素錯体は得られていないといえる。
【非特許文献１】D. C. Carter et al., Science 244: 1195-1198 (1989)
【非特許文献２】S. Curry et al., Nature Struct. Biol. 5, 827-835 (1998)
【非特許文献３】E. Tolosano et al., DNA Cell Biol., 21: 297-306 (2002)
【非特許文献４】M. Paoli et al., Nature Struct. Biol. 6: 926-931 (1999)
【非特許文献５】P. A. Adams et al., Biochem. J. 191: 95-102 (1980)
【非特許文献６】M. Wardell et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 291: 813-819 (2002)
【非特許文献７】P. A. Zunszain et al., BMC Struct. Biol. 3: 6 (2003)
【非特許文献８】E. Tsuchida et al., Bioconjugate Chem. 11: 46-50 (2000)
【非特許文献９】E. Tsuchida et al., J. Biomed. Mater. Res. 64A: 257-261 (2003)
【特許文献１】特開平８−３０１８７３号公報
【特許文献２】特開２００３−４０８９３号公報
【特許文献３】特表２００２−５００８６２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、本発明は、上記従来技術の問題点を解消し、近位塩基を分子内に持たない金属ポルフィリンであってもこれを導入することにより安定な酸素錯体を形成し得るアルブミン−金属ポルフィリン錯体、並びにこのアルブミン−金属錯体を含む人工酸素運搬体および赤血球代替物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
酸素配位能を金属ポルフィリンに付与するための最重要条件は、軸塩基配位子となるイミダゾールが鉄（II）ポルフィリンの第５配位座に結合されていることである。本発明者らは、軸塩基を金属ポルフィリンの分子内に共有結合で導入しなくとも、その第５配位座に近位塩基であるイミダゾールが軸配位できるための分子環境設計と機能発現に鋭意研究を重ねた結果、特許文献３に示されているように、アルブミンのポルフィリン結合サイトであるサブドメインＩＢ内に、近位塩基として作用するヒスチジンを遺伝子組み換え技術により導入すれば、金属ポルフィリンにそのヒスチジンのイミダゾール基が軸配位して、５配位錯体が得られ、さらに引き続き酸素を通気することによりＨｂやＭｂに見られる酸素配位錯体の生成が可能になるものと考えた。しかも、本発明者らの研究グループは、永年にわたる合成ヘムを利用した酸素輸液に関する研究の結果、酸素配位座近傍に親水性基が存在すると、プロトンを媒介する中心金属（II）の酸化反応が促進され、酸素錯体の安定度が低下することを明らかにしている（T. Komatsu et al., Bull. Chem. Soc. Jpn. 74: 1695-1702 (2001)）。
【０００９】
このような背景の下、本発明者らは、アルブミンのポルフィリン結合サイトであるサブドメインＩＢ内に、近位塩基として作用するヒスチジンと、酸素配位座側に疎水的なアミノ酸を遺伝子組み換え技術により導入し、人工のヘムポケットを構築することにより、その内部へ金属ポルフィリン錯体が軸配位結合し、安定な酸素錯体を生成するばかりか、活性中心はプロトヘムのみならず、広く多くの金属ポルフィリンで普遍化できることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明の第１の側面によれば、ヒト血清アルブミンのヘム結合サイトであるサブドメインＩＢにおいて、金属ポルフィリンの５配位座に配位結合するヒスチジンが遺伝子組み換え技術により少なくとも一つ導入されるとともに、１６１チロシンがチロシン以外の疎水性アミノ酸で置換された組換えヒト血清アルブミンに、金属ポルフィリンを配位結合させた組換えヒト血清アルブミン−ポルフィリン金属錯体が提供される。いうまでもなく、この錯体において、導入されたヒスチジンは、金属ポルフィリンの５配位座に配位結合する。
【００１１】
本発明の第２の側面によれば、本発明の組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体を含む人工酸素運搬体（酸素輸液）が提供される。この場合、金属ポルフィリンは、中心金属として鉄（II）またはコバルト（II）を有する。
【００１２】
また、本発明の第３の側面によれば、本発明の組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体を含む赤血球代替物が提供される。この場合、金属ポルフィリンは、中心金属として鉄（II）またはコバルト（II）を有する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明に係る組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体は、分子内に近位塩基を共有結合で保持しない金属ポルフィリンでも、遺伝子組み換え技術によりポルフィリン結合サイト（サブドメインＩＢ）へ導入されたヒスチジンと中心金属が軸配位結合することによりアルブミン内部へ取り込まれ、ヒト血清アルブミンの１６１チロシンが所定の疎水性アミノ酸により置換されているので、５配位高スピン錯体を形成するとともに、安定度の高い酸素配位錯体を形成することができる。つまり、本発明の組換えヒト血清アルブミンは、Ｈｂの酸素結合部位であるプロトヘムはもちろん、合成の金属ポルフィリンでさえも、その内部へ軸塩基配位を介して固定し、酸素結合能を発現させることができる。また、本発明の組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体を含有する人工酸素運搬体（酸素輸液）は、生体内に投与する場合も安全度の高い輸血用血液の血液代替物として利用できるばかりでなく、移植臓器または組織の保存液、組織培養液、腫瘍の抗癌治療増感剤、術前血液希釈液、人工心肺など体外循環回路の補填液、移植臓器の灌流液、虚血部位への酸素供給液（心筋梗塞、脳梗塞、呼吸不全など）、慢性貧血治療剤、液体換気の環流液として利用できる。加えて、ガス吸着剤、酸化還元触媒、酸素酸化反応触媒、酸素添加反応触媒としても有用なものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明のアルブミン−金属ポルフィリン錯体は、ヘム結合サイトであるサブドメインＩＢ内において、ヒスチジンを遺伝子組み換え技術により少なくとも一つ導入するとともに、１６１チロシンをチロシン以外の疎水性アミノ酸で置換した組換えヒト血清アルブミンに、金属ポルフィリンを軸配位により結合させることにより得られる。使用する組換えヒト血清アルブミンは、好ましくは、１４２イソロイシン、１８５ロイシン、１３８チロシン、１１５ロイシン、１３９ロイシンおよび／または１８２ロイシンがヒスチジンで置換され、しかも１６１チロシンが疎水性アミノ酸で置換された組換えヒト血清アルブミンである。また、組換えヒト血清アルブミンは、ヒト血清アルブミンのヘム結合サイトであるサブドメインＩＢ内へ少なくとも一つ挿入した組換えヒト血清アルブミンであってもよい。１６１チロシンを置換する疎水性アミノ酸としては、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、トリプトファンまたはフェニルアラニンを好適に使用することができる。
【００１５】
金属ポルフィリンは、好ましくは、金属プロトポルフィリン、金属デューテロポルフィリン、金属ジアセチルデューテロポルフィリン、金属メソポルフィリン、金属ジホルミルポルフィリン、金属テトラフェニルポルフィリン、金属オクタエチルポルフィリンである。また、中心金属は、鉄またはコバルト、特に鉄（II）またはコバルト（II）が好ましい。
【００１６】
本発明の組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体は、水中でＨｂやＭｂのように酸素を結合解離できるので、完全合成系の酸素輸液（人工酸素運搬体）として機能する。もちろん体内へ投与した場合には、赤血球代替物としての役割を果たすばかりでなく、この組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体の溶液中に移植に適した臓器または組織を保存することで、移植前の臓器または組織の安全かつ長期の保存が可能となる。また、この組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体は組織の増殖を促進させる培養液として作用するし、腫瘍の低酸素部位へ投与すれば、赤血球の進入できない細い毛細管内を通過できるので、腫瘍低酸素部位の酸素化が実現し、その後直ちに患部へ放射線を照射することにより、腫瘍を縮小または治癒することが可能となる。
【００１７】
酸素輸液の適応は、出血ショックの蘇生液（輸血用血液の代用血液）はもちろんのこと、術前血液希釈液、人工心肺など体外循環回路の補填液、移植臓器の灌流液、虚血部位への酸素供給液（心筋梗塞、脳梗塞、呼吸不全など）、慢性貧血治療剤、液体換気の環流液、さらに、稀少血液型患者への利用、宗教上の理由による輸血拒否患者への対応、動物医療への応用が期待されている。人工酸素運搬体（酸素輸液）は、本発明の組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体を生理食塩水に分散させることによって得られる。組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体の濃度は、その用途によって異なるが、代用血液（赤血球代替物）としてはヘム濃度で９．２ｍＭ／Ｌ程度、その他では、それ以上の濃度を用いることができる。
【００１８】
加えて、金属ポルフィリンが例えば第４〜５周期に属する金属イオンの錯体である場合、酸化還元反応、酸素酸化反応または酸素添加反応の触媒としての付加価値も高い。従って、本発明のポルフィリン金属錯体は、酸素輸液のほか、ガス吸着剤、酸化還元触媒、酸素酸化反応触媒、酸素添加反応触媒としての特徴を持つ。
【００１９】
本発明の組換えアルブミンは、一般に、上に挙げたサブドメインＩＢのアミノ酸の位置、またはその近傍アミノ酸にヒスチジンを置換または挿入すること、さらには１６１チロシンを非配位性の疎水性アミノ酸で置換することによって得られる。特定位置へのアミノ酸の導入は、アルブミンにおけるかかる組換えを達成するのに現在知られている種々の慣用の手段によって達成される。さらに、本発明の組換えアルブミンの調製は、アルブミンをコードするＤＮＡを慣用の部位特異的突然変異誘発を使用して変異させることによって行うことができる。本変異は、アルブミン本来の立体構造、物性、特徴に影響を及ぼさない程度の小さな変異である。また、遺伝子組み換えアルブミンは、酵母を利用した慣用の培養法を使用して産生できる。例えば、変異導入はQuick Change XL Site-Directed Mutagenesis Kit（STRATAGENE社）を用いて行うことができ、発現はPichia Expression Kit（Invitrogen社）を使用して、C.E. Peterson et al., Biochemistry, 36, 7012-7017 (1997)に記載された方法に従って行うことができる。得られた組換えヒト血清アルブミンは、慣用の方法、例えば、ブルーセファロース ６ ファーストフローを充填したカラムクロマトグラフィー、続いて、セファクリルＳ２００ＨＲを充填したカラムクロマトグラフィーにより精製することができる。
【００２０】
本発明のアルブミン−金属ポルフィリン錯体は、例えば非特許文献７に記載の通常の方法により調製することができる。なお、金属ポルフィリンが鉄（III）錯体の形を有する場合は、適当な還元剤（亜二チオン酸ナトリウム、アスコルビン酸など）を用い、常法により中心金属を３価から２価へ還元すれば、酸素結合活性が付与できる。いずれの場合も酸素と接触すると速やかに安定な酸素錯体を生成する。また、これらの錯体は酸素分圧に応じて酸素を吸脱着できる。この酸素結合解離は可逆的に繰り返し行うことができ、酸素運搬体として作用する。
【００２１】
酸素以外にも金属に配位性である気体の場合、相当する配位錯体を形成できる（例えば、一酸化炭素、一酸化窒素、二酸化窒素など）。これらの理由から、本発明の組換えアルブミン−金属ポルフィリン錯体は、特に鉄（II）またはコバルト（II）錯体の場合、酸素輸液として上記した多くの適応に有効な機能を発揮することはもちろん、均一系、不均一系での酸化還元反応触媒、およびガス吸着剤としての応用が可能となる。
【実施例】
【００２２】
以下、この発明を実施例により詳細に説明する。なお、本発明が実施例のものに限定されないことは、いうまでもないことである。
【００２３】
例１
本発明の組換えアルブミン−金属ポルフィリン錯体の酸素結合反応を観測することを目的として、ヒト血清アルブミンの１４２イソロイシンをヒスチジンに置換し、さらに１６１チロシンをロイシンに置換した組換えヒト血清アルブミン（Ｉ１４２Ｈ／Ｙ１６１Ｌ）を慣用の部位特異的突然変異誘発とピキア酵母を用いた慣用の培養法により産生した。すなわち、変異導入は、Quick Change XL Site-Directed Mutagenesis Kit（STRATAGENE社）を用いて実施し、発現は、Pichia Expression Kit（Invitrogen社）を使用して、C.E. Peterson et al., Biochemistry, 36, 7012-7017 (1997)に記載された方法に従って行った。得られた組換えヒト血清アルブミン（Ｉ１４２Ｈ／Ｙ１６１Ｌ）をブルーセファロース ６ ファーストフローを充填したカラムクロマトグラフィー、続いて、セファクリルＳ２００ＨＲを充填したカラムクロマトグラフィーにより精製した。この組換えアルブミン（Ｉ１４２Ｈ／Ｙ１６１Ｌ）（２０μＭ、５０ｍＭリン酸緩衝水溶液）へ鉄（III）プロトポルフィリン（０．２６６ｍＭ、ＤＭＳＯ溶液）をポルフィリン／アルブミンのモル比が１．１／１になるよう添加し、１２時間、暗所で回転攪拌しながら混合した。得られた混合溶液を限外濾過装置（限外分子量：１０，０００）で洗浄し、ＤＭＳＯ濃度が０．１％以下になるまで、５０ｍＭリン酸緩衝水溶液で濃縮・希釈を繰り返した。こうして調製した組換えアルブミン−鉄（III）プロトポルフィリン錯体水溶液の磁気円偏光二色性スペクトルは、λ：３６６（−）、４０２（＋）、４１９（−）ｎｍにピークを示し、これはメトＭｂのスペクトルパターンと類似していた。
【００２４】
この水溶液をアルゴンで十分に置換して脱酸素した後、亜ニチオン酸ナトリウム水溶液を添加して、中心鉄を鉄（II）に還元して、組換えヒト血清アルブミン（Ｉ１４２Ｈ／Ｙ１６１Ｌ）−鉄（II）プロトポルフィリン錯体を調製した。この水溶液の紫外可視吸収スペクトルはλmax：４２６、５５９ｎｍを示し、これがＭｂのデオキシ型のスペクトルパターンとよく類似していることから、Ｆｅ（II）５配位高スピン錯体の形成が明らかとなった（図１）。すなわち、１４２ヒスチジンのイミダゾール基が軸塩基として中心鉄に配位し、デオキシ体が得られたものと考えられる。この組換えヒト血清アルブミン（Ｉ１４２Ｈ／Ｙ１６１Ｌ）−鉄（II）プロトポルフィリン錯体水溶液に酸素を通気すると、直ちに酸素錯体（オキシ体）型のスペクトルへ移行（λmax：４１２、５３７、５７３ｎｍ）し、一酸化炭素を通気すると安定な一酸化炭素錯体（カルボニル体）（λmax：４１９、５３８、５６５ｎｍ）が得られた（図１）。（図１は、組換えヒト血清アルブミン（Ｉ１４２Ｈ／Ｙ１６１Ｌ）−鉄（II）ポルフィリン錯体のＦｅ（III）体、Ｆｅ（II）体（デオキシ体）、Ｆｅ（II）（Ｏ2）体（オキシ体）、Ｆｅ（II）（ＣＯ）体（カルボニル体）の可視吸収スペクトル変化を示すグラフである）。
【００２５】
例２
例１で調製した組換えアルブミン（Ｉ１４２Ｈ／Ｙ１６１Ｌ）−鉄（II）プロトポルフィリン錯体水溶液に、レザーフラッシュ（Ｎｄ：ＹＡＧレーザー、５３２ｎｍ、パルス幅６ｎｓ）を照射し、瞬時に起こる非平衡状態から平衡状態への可視吸収スペクトル変化の時間分解解析から、酸素の結合解離速度定数（ｋon、ｋoff）及び酸素親和性（Ｐ50）の値を算出した。実際の測定は、前記J. P. Collman et al., J. Am. Chem. Soc. 105, 3052-3064 (1983)に記載された方法、および、T. G. Traylor et al., J. Am. Chem. Soc. 107: 604-614 (1985)に記載された方法で行った。その結果、酸素の結合反応には二成分存在することがわかり、ヘムポケット内における鉄（II）プロトポルフィリンの配向構造が二つ存在する（Ｉ型とII型）ことが明らかとなった。Ｉ型のＰ50は２０Torr（２２℃）で、Ｍｂの値に比べ３９倍大きい（酸素親和性は１／３９低い）。ｋonは７．５×１０6Ｍ-1ｓ-1であり、Ｍｂ（１．４×１０7Ｍ-1ｓ-1）の値と変わらなかったことから、この低い酸素親和性は大きなｋoff値（２５０ｓ-1）に起因するものと考えられる（Ｍｂのｋoffは１２ｓ-1）。また、II型のＰ50は１６２Torr（２２℃）であり、Ｍｂの値に比べ３１８倍も大きかった（酸素親和性は１／３１８低い）。これは、軸塩基配位子の歪みに基づくさらに大きなｋoff値（２．０×１０3ｓ-1）に起因するものと推測された。
【００２６】
例３
例１において、ヒト血清アルブミンの１４２イソロイシンをヒスチジンに置換する代わりに、ヒト血清アルブミンの１８５ロイシンをヒスチジンに置換した組換えヒト血清アルブミン（Ｌ１８５Ｈ／Ｙ１６１Ｌ）を慣用の部位特異的突然変異誘発とピキア酵母を用いた慣用の培養法により産生した以外は、同様の手法に従い、組換えヒト血清アルブミン（Ｌ１８５Ｈ／Ｙ１６１Ｌ）−鉄（II）プロトポルフィリン錯体を調製した。この水溶液の紫外可視吸収スペクトルはλmax：４２２、５５８ｎｍを示し、これはＭｂのデオキシ型のスペクトルパターンとよく類似していることから、Ｆｅ（II）５配位高スピン錯体の形成が明らかとなった。１８５ヒスチジンのイミダゾール基が軸塩基として中心鉄に配位し、デオキシ体が得られたものと考えられる。この錯体水溶液に酸素を通気すると、直ちに酸素錯体型のスペクトルへ移行（λmax：４１２、５３０、５７０ｎｍ）し、一酸化炭素を通気すると安定な一酸化炭素錯体（λmax：４１９、５３７、５６０ｎｍ）が得られた。
【００２７】
例４
例１において、鉄（III）プロトポルフィリンの代わりに、鉄（III）デューテロポルフィリンを用いた以外は、同様の手法に従い、組換えヒト血清アルブミン（Ｉ１４２Ｈ／Ｙ１６１Ｌ）−鉄（II）デューテロポルフィリン錯体を調製した。この水溶液の紫外可視吸収スペクトルはλmax：４１３、５１７、５４６ｎｍを示し、これはＭｂのデオキシ型のスペクトルパターンとよく類似していることから、Ｆｅ（II）５配位高スピン錯体の形成が明らかとなった。１４２ヒスチジンのイミダゾール基が軸塩基として中心鉄に配位し、デオキシ体が得られたものと考えられる。この錯体水溶液に酸素を通気すると、直ちに酸素錯体型のスペクトルへ移行（λmax：４０１、５２８、５６３ｎｍ）し、一酸化炭素を通気すると安定な一酸化炭素錯体（λmax：４０９、５２８、５５６ｎｍ）が得られた。
【００２８】
例５
例１において、鉄（III）プロトポルフィリンの代わりに、コバルト（II）プロトポルフィリンを用いた以外は、同様の手法に従い、組換えヒト血清アルブミン（Ｉ１４２Ｈ／Ｙ１６１Ｌ）−コバルト（II）プロトポルフィリン錯体を調製した。この水溶液の紫外可視吸収スペクトルはλmax：４０６、５５８ｎｍを示し、これはコバルトＭｂのデオキシ型のスペクトルパターンとよく類似していることから、Ｃｏ（II）５配位高スピン錯体の形成が明らかとなった。１４２ヒスチジンのイミダゾール基が軸塩基として中心鉄に配位し、デオキシ体が得られたものと考えられた。この錯体水溶液に酸素を通気すると、直ちに酸素錯体型のスペクトルへ移行（λmax：４２６、５３９、５７８ｎｍ）が得られた。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】組換えヒト血清アルブミン（Ｉ１４２Ｈ／Ｙ１６１Ｌ）−鉄（II）ポルフィリン錯体のＦｅ（III）体、Ｆｅ（II）体（デオキシ体）、Ｆｅ（II）（Ｏ2）体（オキシ体）、Ｆｅ（II）（ＣＯ）体（カルボニル体）の可視吸収スペクトル変化を示すグラフ。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体、並びにその組換えヒト血清アルブミンを含む人工酸素運搬体および赤血球代替物に関する。特に、本発明は、ヒト血清アルブミンのヘム結合サイトであるサブドメインＩＢ内へヒスチジンと疎水性アミノ酸を遺伝子組換え技術により導入した組換えヒト血清アルブミンと金属ポルフィリンとの錯体、並びにその錯体を含む人工酸素運搬体および赤血球代替物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）は、体内において血液及び細胞間液をはじめとする多くの場所に分布する分子量約６６，５００の補欠分子や、糖鎖を持たない単純蛋白質であり、１７個のジスルフィド結合を含む５８５個のアミノ酸から構成されている。血中蛋白質の約６０％を占めるため、そのコロイド浸透圧により、血管内外の水分バランスを保つとともに、血管循環動態を維持する役割を果たしている。また、非特異的な多分子結合能を持つので、各種内因性物質・外因性薬物の運搬、貯蔵、分配、代謝にきわめて重要な生理的役割を担っている。様々な動物種のアルブミンについても研究報告があり、ウシ、ラットなど哺乳類アルブミンのアミノ酸配列は、ヒト血清アルブミンと実に６０％以上の構造相同性を有する。アルブミンに関する研究は古くから実施されてきているが、Ｘ線結晶構造解析によりその三次元構造の全容が明らかにされたのは１９８９年のことであった（非特許文献１）。その後、１９９８年には、カリーらにより、脂肪酸が７分子結合したアルブミン−脂肪酸複合体の結晶構造が詳細に解明された（非特許文献２）。ＨＳＡは三つのドメイン（Ｉ、II、III）からなり、それらはさらに２つのサブドメイン（Ａ、Ｂ）から構成されている。
【０００３】
もし、血清アルブミンにヘモグロビン（Ｈｂ）のような酸素輸送能を付与することができれば、人工酸素運搬体（赤血球代替物）としての臨床利用価値はきわめて高く、例えば救急医療現場における救命措置への適用を考えただけでも、その絶大な効果が容易に推測される。興味あることに、血漿蛋白質の中にはヘミン（鉄（III）プロトポルフィリン）を取り込んでヘム蛋白質を構成するものもある。メトＨｂから血流中へ遊離したヘミンは、細胞毒性や活性酸素を発生するため、ヘモペキシンと呼ばれる糖蛋白質により速やかに捕捉され肝臓へと運ばれる（非特許文献３）。ヘモペキシン−ヘミン錯体のＸ線結晶構造解析の結果から、ヘミン分子は2つのヒスチジン残基との軸配位、及びアミノ酸残基との多重水素結合により、非常に強く固定されている様子が明らかにされている（Ｋ＞１０12Ｍ-1）（非特許文献４）。しかし、ヘモペキシンの血中濃度は＜１７μＭと低いため、これが飽和した場合には、血清アルブミンがその機能代替を果たす。アルブミンとヘミンの結合定数は約１０8Ｍ-1と報告されている（非特許文献５）。ごく最近、カーターらと本発明者らは独立に、アルブミン−ヘミン−ミリスチン酸錯体の結晶構造解析に成功した（非特許文献６、非特許文献７）。ヘミンはアルブミンのサブドメインＩＢに取り込まれ、１６１チロシンとの軸配位、及び３つの塩基性アミノ酸（リシン１９０、ヒスチジン１４６、アルギニン１１４）残基とプロピオン酸側鎖間との静電的相互作用により固定されている。ヘミン結合サイトを取り囲む分子環境は疎水性アミノ酸残基のみから構成されており、ミオグロビン（Ｍｂ）のヘムポケットとの類似性がある。窒素雰囲気下でこの水溶液に亜二チオン酸ナトリウム水溶液を添加し、ヘミンを鉄（II）プロトポルフィリン錯体（プロトヘム）へ還元すると、可視吸収スペクトルは１６１チロシンが配位した鉄（II）５配位高スピン錯体を形成する。しかし、そこへ酸素を通気しても中心鉄（II）は瞬時に酸化され、安定な酸素錯体を得ることはなかった。
【０００４】
他方、本発明者らの研究グループは、４つの疎水性置換基を有し、かつ軸塩基配位子を分子内に共有結合した鉄（II）テトラフェニルポルフィリンがアルブミンに効率よく疎水性相互作用により包接され、得られたアルブミン−ヘム複合体が生理条件下（生理塩水中、ｐＨ７．３、３７℃）でＨｂやミオグロビン（Ｍｂ）と同じように酸素を吸脱着できることを明らかにしている（特許文献１、特許文献２）。赤外吸収、共鳴ラマン、磁気円偏光二色性スペクトルなどから、酸素配位錯体の電子状態を詳細に解析するとともに、生体内でも酸素運搬のできる血清ヘム蛋白質として機能することを動物実験から定量的に実証している（非特許文献８）。また現在、人工赤血球として開発が先行している分子状Ｈｂ製剤の欠点である血圧亢進（副作用）も全く観測されていない（非特許文献９）。アルブミンはＨｂに比べ等電点が低く、内皮細胞を取り囲む基底膜との間に負電荷どうしの静電反発を生じるため、その血管内皮透過性が低く、血管内皮弛緩因子である一酸化窒素を消去しないので、急激な血圧変動は見られないのである。
【０００５】
しかしながら、これらのアルブミン−ヘム複合体において酸素配位活性中心として機能する合成ヘムは、４つの疎水性置換基と軸塩基配位子を分子内に有する特殊な立体構造の鉄（II）テトラフェニルポルフィリンでなければならず、天然のＨｂにおける鉄（II）プロトポルフィリンとはかなり構造を異にする。つまり、これまでアルブミン−ヘム複合体の鉄（II）ポルフィリンに酸素配位能を付与するための構造要件は、先ずは少なくとも分子内に共有結合で連結した近位塩基を保持させることであった。そのために合成工程は多段階にわたり、量産が難しいなどの欠点もあった。また、体内へ投与した後の代謝分解過程についても未だ不明な点が多いのも現状であった。もし、天然の金属ポルフィリン、例えば鉄（II）プロトポルフィリン、またはその誘導体を血清アルブミンに固定させて調製したアルブミン−金属ポルフィリン錯体が、ＨｂやＭｂと同じような酸素配位能を発現することができれば、その有用性は計りしれないものがある。つまり、近位塩基が分子内に導入されていない金属（II）ポルフィリンをアルブミンに結合させたアルブミン−金属ポルフィリン錯体で、Ｈｂのような可逆的酸素結合解離を達成する新技術の確立が待たれていた。
【０００６】
最近カーターらはヒト血清アルブミンに遺伝子組換え技術により親水性アミノ酸（ヒスチジンまたはグルタミン）を導入し、プロトヘムを配位固定させた組換えアルブミン−プロトヘム錯体を調製し、その酸素結合反応を検討している（特許文献３）。しかし、用いた酸素配位活性中心はプロトヘムのみであり、しかも酸素結合定数など、酸素配位能に関する定量的な解析はしていないし、実際に安定な酸素錯体は得られていないといえる。
【非特許文献１】D. C. Carter et al., Science 244: 1195-1198 (1989)
【非特許文献２】S. Curry et al., Nature Struct. Biol. 5, 827-835 (1998)
【非特許文献３】E. Tolosano et al., DNA Cell Biol., 21: 297-306 (2002)
【非特許文献４】M. Paoli et al., Nature Struct. Biol. 6: 926-931 (1999)
【非特許文献５】P. A. Adams et al., Biochem. J. 191: 95-102 (1980)
【非特許文献６】M. Wardell et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 291: 813-819 (2002)
【非特許文献７】P. A. Zunszain et al., BMC Struct. Biol. 3: 6 (2003)
【非特許文献８】E. Tsuchida et al., Bioconjugate Chem. 11: 46-50 (2000)
【非特許文献９】E. Tsuchida et al., J. Biomed. Mater. Res. 64A: 257-261 (2003)
【特許文献１】特開平８−３０１８７３号公報
【特許文献２】特開２００３−４０８９３号公報
【特許文献３】特表２００２−５００８６２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、本発明は、上記従来技術の問題点を解消し、近位塩基を分子内に持たない金属ポルフィリンであってもこれを導入することにより安定な酸素錯体を形成し得るアルブミン−金属ポルフィリン錯体、並びにこのアルブミン−金属錯体を含む人工酸素運搬体および赤血球代替物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
酸素配位能を金属ポルフィリンに付与するための最重要条件は、軸塩基配位子となるイミダゾールが鉄（II）ポルフィリンの第５配位座に結合されていることである。本発明者らは、軸塩基を金属ポルフィリンの分子内に共有結合で導入しなくとも、その第５配位座に近位塩基であるイミダゾールが軸配位できるための分子環境設計と機能発現に鋭意研究を重ねた結果、特許文献３に示されているように、アルブミンのポルフィリン結合サイトであるサブドメインＩＢ内に、近位塩基として作用するヒスチジンを遺伝子組み換え技術により導入すれば、金属ポルフィリンにそのヒスチジンのイミダゾール基が軸配位して、５配位錯体が得られ、さらに引き続き酸素を通気することによりＨｂやＭｂに見られる酸素配位錯体の生成が可能になるものと考えた。しかも、本発明者らの研究グループは、永年にわたる合成ヘムを利用した酸素輸液に関する研究の結果、酸素配位座近傍に親水性基が存在すると、プロトンを媒介する中心金属（II）の酸化反応が促進され、酸素錯体の安定度が低下することを明らかにしている（T. Komatsu et al., Bull. Chem. Soc. Jpn. 74: 1695-1702 (2001)）。
【０００９】
このような背景の下、本発明者らは、アルブミンのポルフィリン結合サイトであるサブドメインＩＢ内に、近位塩基として作用するヒスチジンと、酸素配位座側に疎水的なアミノ酸を遺伝子組み換え技術により導入し、人工のヘムポケットを構築することにより、その内部へ金属ポルフィリン錯体が軸配位結合し、安定な酸素錯体を生成するばかりか、活性中心はプロトヘムのみならず、広く多くの金属ポルフィリンで普遍化できることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明の第１の側面によれば、ヒト血清アルブミンのヘム結合サイトであるサブドメインＩＢにおいて、金属ポルフィリンの５配位座に配位結合するヒスチジンが遺伝子組み換え技術により少なくとも一つ導入されるとともに、１６１チロシンがチロシン以外の疎水性アミノ酸で置換された組換えヒト血清アルブミンに、金属ポルフィリンを配位結合させた組換えヒト血清アルブミン−ポルフィリン金属錯体が提供される。いうまでもなく、この錯体において、導入されたヒスチジンは、金属ポルフィリンの５配位座に配位結合する。
【００１１】
本発明の第２の側面によれば、本発明の組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体を含む人工酸素運搬体（酸素輸液）が提供される。この場合、金属ポルフィリンは、中心金属として鉄（II）またはコバルト（II）を有する。
【００１２】
また、本発明の第３の側面によれば、本発明の組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体を含む赤血球代替物が提供される。この場合、金属ポルフィリンは、中心金属として鉄（II）またはコバルト（II）を有する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明に係る組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体は、分子内に近位塩基を共有結合で保持しない金属ポルフィリンでも、遺伝子組み換え技術によりポルフィリン結合サイト（サブドメインＩＢ）へ導入されたヒスチジンと中心金属が軸配位結合することによりアルブミン内部へ取り込まれ、ヒト血清アルブミンの１６１チロシンが所定の疎水性アミノ酸により置換されているので、５配位高スピン錯体を形成するとともに、安定度の高い酸素配位錯体を形成することができる。つまり、本発明の組換えヒト血清アルブミンは、Ｈｂの酸素結合部位であるプロトヘムはもちろん、合成の金属ポルフィリンでさえも、その内部へ軸塩基配位を介して固定し、酸素結合能を発現させることができる。また、本発明の組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体を含有する人工酸素運搬体（酸素輸液）は、生体内に投与する場合も安全度の高い輸血用血液の血液代替物として利用できるばかりでなく、移植臓器または組織の保存液、組織培養液、腫瘍の抗癌治療増感剤、術前血液希釈液、人工心肺など体外循環回路の補填液、移植臓器の灌流液、虚血部位への酸素供給液（心筋梗塞、脳梗塞、呼吸不全など）、慢性貧血治療剤、液体換気の環流液として利用できる。加えて、ガス吸着剤、酸化還元触媒、酸素酸化反応触媒、酸素添加反応触媒としても有用なものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明のアルブミン−金属ポルフィリン錯体は、ヘム結合サイトであるサブドメインＩＢ内において、ヒスチジンを遺伝子組み換え技術により少なくとも一つ導入するとともに、１６１チロシンをチロシン以外の疎水性アミノ酸で置換した組換えヒト血清アルブミンに、金属ポルフィリンを軸配位により結合させることにより得られる。使用する組換えヒト血清アルブミンは、好ましくは、１４２イソロイシン、１８５ロイシン、１３８チロシン、１１５ロイシン、１３９ロイシンおよび／または１８２ロイシンがヒスチジンで置換され、しかも１６１チロシンが疎水性アミノ酸で置換された組換えヒト血清アルブミンである。また、組換えヒト血清アルブミンは、ヒト血清アルブミンのヘム結合サイトであるサブドメインＩＢ内へ少なくとも一つ挿入した組換えヒト血清アルブミンであってもよい。１６１チロシンを置換する疎水性アミノ酸としては、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、トリプトファンまたはフェニルアラニンを好適に使用することができる。
【００１５】
金属ポルフィリンは、好ましくは、金属プロトポルフィリン、金属デューテロポルフィリン、金属ジアセチルデューテロポルフィリン、金属メソポルフィリン、金属ジホルミルポルフィリン、金属テトラフェニルポルフィリン、金属オクタエチルポルフィリンである。また、中心金属は、鉄またはコバルト、特に鉄（II）またはコバルト（II）が好ましい。
【００１６】
本発明の組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体は、水中でＨｂやＭｂのように酸素を結合解離できるので、完全合成系の酸素輸液（人工酸素運搬体）として機能する。もちろん体内へ投与した場合には、赤血球代替物としての役割を果たすばかりでなく、この組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体の溶液中に移植に適した臓器または組織を保存することで、移植前の臓器または組織の安全かつ長期の保存が可能となる。また、この組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体は組織の増殖を促進させる培養液として作用するし、腫瘍の低酸素部位へ投与すれば、赤血球の進入できない細い毛細管内を通過できるので、腫瘍低酸素部位の酸素化が実現し、その後直ちに患部へ放射線を照射することにより、腫瘍を縮小または治癒することが可能となる。
【００１７】
酸素輸液の適応は、出血ショックの蘇生液（輸血用血液の代用血液）はもちろんのこと、術前血液希釈液、人工心肺など体外循環回路の補填液、移植臓器の灌流液、虚血部位への酸素供給液（心筋梗塞、脳梗塞、呼吸不全など）、慢性貧血治療剤、液体換気の環流液、さらに、稀少血液型患者への利用、宗教上の理由による輸血拒否患者への対応、動物医療への応用が期待されている。人工酸素運搬体（酸素輸液）は、本発明の組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体を生理食塩水に分散させることによって得られる。組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体の濃度は、その用途によって異なるが、代用血液（赤血球代替物）としてはヘム濃度で９．２ｍＭ／Ｌ程度、その他では、それ以上の濃度を用いることができる。
【００１８】
加えて、金属ポルフィリンが例えば第４〜５周期に属する金属イオンの錯体である場合、酸化還元反応、酸素酸化反応または酸素添加反応の触媒としての付加価値も高い。従って、本発明のポルフィリン金属錯体は、酸素輸液のほか、ガス吸着剤、酸化還元触媒、酸素酸化反応触媒、酸素添加反応触媒としての特徴を持つ。
【００１９】
本発明の組換えアルブミンは、一般に、上に挙げたサブドメインＩＢのアミノ酸の位置、またはその近傍アミノ酸にヒスチジンを置換または挿入すること、さらには１６１チロシンを非配位性の疎水性アミノ酸で置換することによって得られる。特定位置へのアミノ酸の導入は、アルブミンにおけるかかる組換えを達成するのに現在知られている種々の慣用の手段によって達成される。さらに、本発明の組換えアルブミンの調製は、アルブミンをコードするＤＮＡを慣用の部位特異的突然変異誘発を使用して変異させることによって行うことができる。本変異は、アルブミン本来の立体構造、物性、特徴に影響を及ぼさない程度の小さな変異である。また、遺伝子組み換えアルブミンは、酵母を利用した慣用の培養法を使用して産生できる。例えば、変異導入はQuick Change XL Site-Directed Mutagenesis Kit（STRATAGENE社）を用いて行うことができ、発現はPichia Expression Kit（Invitrogen社）を使用して、C.E. Peterson et al., Biochemistry, 36, 7012-7017 (1997)に記載された方法に従って行うことができる。得られた組換えヒト血清アルブミンは、慣用の方法、例えば、ブルーセファロース ６ ファーストフローを充填したカラムクロマトグラフィー、続いて、セファクリルＳ２００ＨＲを充填したカラムクロマトグラフィーにより精製することができる。
【００２０】
本発明のアルブミン−金属ポルフィリン錯体は、例えば非特許文献７に記載の通常の方法により調製することができる。なお、金属ポルフィリンが鉄（III）錯体の形を有する場合は、適当な還元剤（亜二チオン酸ナトリウム、アスコルビン酸など）を用い、常法により中心金属を３価から２価へ還元すれば、酸素結合活性が付与できる。いずれの場合も酸素と接触すると速やかに安定な酸素錯体を生成する。また、これらの錯体は酸素分圧に応じて酸素を吸脱着できる。この酸素結合解離は可逆的に繰り返し行うことができ、酸素運搬体として作用する。
【００２１】
酸素以外にも金属に配位性である気体の場合、相当する配位錯体を形成できる（例えば、一酸化炭素、一酸化窒素、二酸化窒素など）。これらの理由から、本発明の組換えアルブミン−金属ポルフィリン錯体は、特に鉄（II）またはコバルト（II）錯体の場合、酸素輸液として上記した多くの適応に有効な機能を発揮することはもちろん、均一系、不均一系での酸化還元反応触媒、およびガス吸着剤としての応用が可能となる。
【実施例】
【００２２】
以下、この発明を実施例により詳細に説明する。なお、本発明が実施例のものに限定されないことは、いうまでもないことである。
【００２３】
例１
本発明の組換えアルブミン−金属ポルフィリン錯体の酸素結合反応を観測することを目的として、ヒト血清アルブミンの１４２イソロイシンをヒスチジンに置換し、さらに１６１チロシンをロイシンに置換した組換えヒト血清アルブミン（Ｉ１４２Ｈ／Ｙ１６１Ｌ）を慣用の部位特異的突然変異誘発とピキア酵母を用いた慣用の培養法により産生した。すなわち、変異導入は、Quick Change XL Site-Directed Mutagenesis Kit（STRATAGENE社）を用いて実施し、発現は、Pichia Expression Kit（Invitrogen社）を使用して、C.E. Peterson et al., Biochemistry, 36, 7012-7017 (1997)に記載された方法に従って行った。得られた組換えヒト血清アルブミン（Ｉ１４２Ｈ／Ｙ１６１Ｌ）をブルーセファロース ６ ファーストフローを充填したカラムクロマトグラフィー、続いて、セファクリルＳ２００ＨＲを充填したカラムクロマトグラフィーにより精製した。この組換えアルブミン（Ｉ１４２Ｈ／Ｙ１６１Ｌ）（２０μＭ、５０ｍＭリン酸緩衝水溶液）へ鉄（III）プロトポルフィリン（０．２６６ｍＭ、ＤＭＳＯ溶液）をポルフィリン／アルブミンのモル比が１．１／１になるよう添加し、１２時間、暗所で回転攪拌しながら混合した。得られた混合溶液を限外濾過装置（限外分子量：１０，０００）で洗浄し、ＤＭＳＯ濃度が０．１％以下になるまで、５０ｍＭリン酸緩衝水溶液で濃縮・希釈を繰り返した。こうして調製した組換えアルブミン−鉄（III）プロトポルフィリン錯体水溶液の磁気円偏光二色性スペクトルは、λ：３６６（−）、４０２（＋）、４１９（−）ｎｍにピークを示し、これはメトＭｂのスペクトルパターンと類似していた。
【００２４】
この水溶液をアルゴンで十分に置換して脱酸素した後、亜ニチオン酸ナトリウム水溶液を添加して、中心鉄を鉄（II）に還元して、組換えヒト血清アルブミン（Ｉ１４２Ｈ／Ｙ１６１Ｌ）−鉄（II）プロトポルフィリン錯体を調製した。この水溶液の紫外可視吸収スペクトルはλmax：４２６、５５９ｎｍを示し、これがＭｂのデオキシ型のスペクトルパターンとよく類似していることから、Ｆｅ（II）５配位高スピン錯体の形成が明らかとなった（図１）。すなわち、１４２ヒスチジンのイミダゾール基が軸塩基として中心鉄に配位し、デオキシ体が得られたものと考えられる。この組換えヒト血清アルブミン（Ｉ１４２Ｈ／Ｙ１６１Ｌ）−鉄（II）プロトポルフィリン錯体水溶液に酸素を通気すると、直ちに酸素錯体（オキシ体）型のスペクトルへ移行（λmax：４１２、５３７、５７３ｎｍ）し、一酸化炭素を通気すると安定な一酸化炭素錯体（カルボニル体）（λmax：４１９、５３８、５６５ｎｍ）が得られた（図１）。（図１は、組換えヒト血清アルブミン（Ｉ１４２Ｈ／Ｙ１６１Ｌ）−鉄（II）ポルフィリン錯体のＦｅ（III）体、Ｆｅ（II）体（デオキシ体）、Ｆｅ（II）（Ｏ2）体（オキシ体）、Ｆｅ（II）（ＣＯ）体（カルボニル体）の可視吸収スペクトル変化を示すグラフである）。
【００２５】
例２
例１で調製した組換えアルブミン（Ｉ１４２Ｈ／Ｙ１６１Ｌ）−鉄（II）プロトポルフィリン錯体水溶液に、レザーフラッシュ（Ｎｄ：ＹＡＧレーザー、５３２ｎｍ、パルス幅６ｎｓ）を照射し、瞬時に起こる非平衡状態から平衡状態への可視吸収スペクトル変化の時間分解解析から、酸素の結合解離速度定数（ｋon、ｋoff）及び酸素親和性（Ｐ50）の値を算出した。実際の測定は、前記J. P. Collman et al., J. Am. Chem. Soc. 105, 3052-3064 (1983)に記載された方法、および、T. G. Traylor et al., J. Am. Chem. Soc. 107: 604-614 (1985)に記載された方法で行った。その結果、酸素の結合反応には二成分存在することがわかり、ヘムポケット内における鉄（II）プロトポルフィリンの配向構造が二つ存在する（Ｉ型とII型）ことが明らかとなった。Ｉ型のＰ50は２０Torr（２２℃）で、Ｍｂの値に比べ３９倍大きい（酸素親和性は１／３９低い）。ｋonは７．５×１０6Ｍ-1ｓ-1であり、Ｍｂ（１．４×１０7Ｍ-1ｓ-1）の値と変わらなかったことから、この低い酸素親和性は大きなｋoff値（２５０ｓ-1）に起因するものと考えられる（Ｍｂのｋoffは１２ｓ-1）。また、II型のＰ50は１６２Torr（２２℃）であり、Ｍｂの値に比べ３１８倍も大きかった（酸素親和性は１／３１８低い）。これは、軸塩基配位子の歪みに基づくさらに大きなｋoff値（２．０×１０3ｓ-1）に起因するものと推測された。
【００２６】
例３
例１において、ヒト血清アルブミンの１４２イソロイシンをヒスチジンに置換する代わりに、ヒト血清アルブミンの１８５ロイシンをヒスチジンに置換した組換えヒト血清アルブミン（Ｌ１８５Ｈ／Ｙ１６１Ｌ）を慣用の部位特異的突然変異誘発とピキア酵母を用いた慣用の培養法により産生した以外は、同様の手法に従い、組換えヒト血清アルブミン（Ｌ１８５Ｈ／Ｙ１６１Ｌ）−鉄（II）プロトポルフィリン錯体を調製した。この水溶液の紫外可視吸収スペクトルはλmax：４２２、５５８ｎｍを示し、これはＭｂのデオキシ型のスペクトルパターンとよく類似していることから、Ｆｅ（II）５配位高スピン錯体の形成が明らかとなった。１８５ヒスチジンのイミダゾール基が軸塩基として中心鉄に配位し、デオキシ体が得られたものと考えられる。この錯体水溶液に酸素を通気すると、直ちに酸素錯体型のスペクトルへ移行（λmax：４１２、５３０、５７０ｎｍ）し、一酸化炭素を通気すると安定な一酸化炭素錯体（λmax：４１９、５３７、５６０ｎｍ）が得られた。
【００２７】
例４
例１において、鉄（III）プロトポルフィリンの代わりに、鉄（III）デューテロポルフィリンを用いた以外は、同様の手法に従い、組換えヒト血清アルブミン（Ｉ１４２Ｈ／Ｙ１６１Ｌ）−鉄（II）デューテロポルフィリン錯体を調製した。この水溶液の紫外可視吸収スペクトルはλmax：４１３、５１７、５４６ｎｍを示し、これはＭｂのデオキシ型のスペクトルパターンとよく類似していることから、Ｆｅ（II）５配位高スピン錯体の形成が明らかとなった。１４２ヒスチジンのイミダゾール基が軸塩基として中心鉄に配位し、デオキシ体が得られたものと考えられる。この錯体水溶液に酸素を通気すると、直ちに酸素錯体型のスペクトルへ移行（λmax：４０１、５２８、５６３ｎｍ）し、一酸化炭素を通気すると安定な一酸化炭素錯体（λmax：４０９、５２８、５５６ｎｍ）が得られた。
【００２８】
例５
例１において、鉄（III）プロトポルフィリンの代わりに、コバルト（II）プロトポルフィリンを用いた以外は、同様の手法に従い、組換えヒト血清アルブミン（Ｉ１４２Ｈ／Ｙ１６１Ｌ）−コバルト（II）プロトポルフィリン錯体を調製した。この水溶液の紫外可視吸収スペクトルはλmax：４０６、５５８ｎｍを示し、これはコバルトＭｂのデオキシ型のスペクトルパターンとよく類似していることから、Ｃｏ（II）５配位高スピン錯体の形成が明らかとなった。１４２ヒスチジンのイミダゾール基が軸塩基として中心鉄に配位し、デオキシ体が得られたものと考えられた。この錯体水溶液に酸素を通気すると、直ちに酸素錯体型のスペクトルへ移行（λmax：４２６、５３９、５７８ｎｍ）が得られた。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】組換えヒト血清アルブミン（Ｉ１４２Ｈ／Ｙ１６１Ｌ）−鉄（II）ポルフィリン錯体のＦｅ（III）体、Ｆｅ（II）体（デオキシ体）、Ｆｅ（II）（Ｏ2）体（オキシ体）、Ｆｅ（II）（ＣＯ）体（カルボニル体）の可視吸収スペクトル変化を示すグラフ。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト血清アルブミンのヘム結合サイトであるサブドメインＩＢにおいて、金属ポルフィリンの５配位座に配位結合するヒスチジンが遺伝子組み換え技術により少なくとも一つ導入されるとともに、１６１チロシンがチロシン以外の疎水性アミノ酸で置換された組換えヒト血清アルブミンに、金属ポルフィリンを配位結合させた組換えヒト血清アルブミン−ポルフィリン金属錯体。
【請求項２】
前記ヒスチジンが、前記アルブミンの１４２イソロイシン、１８５ロイシン、１３８チロシン、１１５ロイシン、１３９ロイシンおよび／または１８２ロイシンを置換して導入されていることを特徴とする請求項１に記載の組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体。
【請求項３】
前記疎水性アミノ酸が、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、トリプトファンまたはフェニルアラニンであることを特徴とする請求項１または２に記載の組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体。
【請求項４】
前記金属ポルフィリンが、金属プロトポルフィリン、金属デューテロポルフィリン、金属ジアセチルデューテロポルフィリン、金属メソポルフィリン、金属ジホルミルポルフィリン、金属テトラフェニルポルフィリンまたは金属オクタエチルポルフィリンである請求項１〜３のいずれか１項に記載の組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体。
【請求項５】
金属ポルフィリンが、中心金属として鉄またはコバルトを有する請求項１〜４のいずれか１項に記載の組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体。
【請求項６】
前記中心金属が、鉄（II）またはコバルト（II）である請求項５に記載の組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体。
【請求項７】
請求項６に記載の組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体を含む人工酸素運搬体。
【請求項８】
請求項６に記載の組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体を含む赤血球代替物。
【請求項１】
ヒト血清アルブミンのヘム結合サイトであるサブドメインＩＢにおいて、金属ポルフィリンの５配位座に配位結合するヒスチジンが遺伝子組み換え技術により少なくとも一つ導入されるとともに、１６１チロシンがチロシン以外の疎水性アミノ酸で置換された組換えヒト血清アルブミンに、金属ポルフィリンを配位結合させた組換えヒト血清アルブミン−ポルフィリン金属錯体。
【請求項２】
前記ヒスチジンが、前記アルブミンの１４２イソロイシン、１８５ロイシン、１３８チロシン、１１５ロイシン、１３９ロイシンおよび／または１８２ロイシンを置換して導入されていることを特徴とする請求項１に記載の組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体。
【請求項３】
前記疎水性アミノ酸が、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、トリプトファンまたはフェニルアラニンであることを特徴とする請求項１または２に記載の組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体。
【請求項４】
前記金属ポルフィリンが、金属プロトポルフィリン、金属デューテロポルフィリン、金属ジアセチルデューテロポルフィリン、金属メソポルフィリン、金属ジホルミルポルフィリン、金属テトラフェニルポルフィリンまたは金属オクタエチルポルフィリンである請求項１〜３のいずれか１項に記載の組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体。
【請求項５】
金属ポルフィリンが、中心金属として鉄またはコバルトを有する請求項１〜４のいずれか１項に記載の組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体。
【請求項６】
前記中心金属が、鉄（II）またはコバルト（II）である請求項５に記載の組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体。
【請求項７】
請求項６に記載の組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体を含む人工酸素運搬体。
【請求項８】
請求項６に記載の組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体を含む赤血球代替物。
【図１】
【公開番号】特開２００６−４５１７２（Ｐ２００６−４５１７２Ａ）
【公開日】平成１８年２月１６日（２００６．２．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−２３２５１８（Ｐ２００４−２３２５１８）
【出願日】平成１６年８月９日（２００４．８．９）
【出願人】（０００２１８７１９）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年２月１６日（２００６．２．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年８月９日（２００４．８．９）
【出願人】（０００２１８７１９）
【Ｆターム（参考）】
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