緑茶種を含む抽出物および方法
本発明は、超臨界ＣＯ２抽出法によって調製される緑茶種植物材料の抽出物に関する。一態様では、本発明は、図６〜２５のいずれかの実時間直接分析（ＤＡＲＴ）質量分析クロマトグラムを有する画分を含む緑茶種抽出物に関する。さらなる一実施形態では、抽出物は、精油、ポリフェノール、多糖、およびそれらの組合せからなる群から選択される化合物を含む。さらなる一実施形態では、精油は、ｎ−ヘキサデカン酸、テトラデカン酸、９−ヘキサデカノール、１−ウンデカノール、１−ヘキサデカノール、オレイルアルコール、９−オクタデセン−１−オール、ノナデカノール、およびそれらの組合せからなる群から選択される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
この出願は、２００６年３月２３日に出願された米国仮特許出願第６０／７８５，１７８号（これは、その全体が参考として本明細書に援用される）への優先権の利益を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、緑茶種の抽出物、連続抽出工程を使用するそれらの調製方法、およびそれらの処理法に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
茶は、約４０００年前に中国南部で始まり、世界人口の３分の２以上によって消費されている。茶は、魅力的な香り、優れた味、および健康増進作用を有しており、それによって水に次いで世界で最も人気のある飲料となっている。早くも紀元前３０００年前には、茶は中国人によって薬用飲料として使用された。茶の医学的用途は、明王朝（１６世紀）の間に書かれた古代中国薬局方「Ｂｅｎ Ｃａｏ Ｇａｎｇ Ｍｏ」に記録された。茶の源は、植物学名カメリアシネンシス（Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）である。今やまさに数百もの茶がＣ．シネンシスの葉から生成され、一般に、非発酵性緑茶、部分発酵ウーロン、および完全発酵紅茶の３つの主なカテゴリーに分類されている。
【０００４】
ツバキ科の一員であるカメリアシネンシスは、３０フィートの高さに成長することがある常緑の低木または樹木である。しかし茶葉の栽培では、通常１〜５フィートの高さに剪定される。この植物は、栽培され新芽として選択的に摘み取られる濃い緑で毛様の楕円形から卵形の葉を付けて、大量に枝分かれする。古い葉は、一般に質が劣るとみなされている。
【０００５】
緑茶および紅茶は両方、植物学名カメリアシネンシスに由来するが、２種の茶を区別するのは、葉の処理である。紅茶の場合、葉を摘み取った後に萎れさせ、次いで丸める。これらの葉を発酵させ、茶ポリフェノール（カテキン）をフロバフェンに変換し、芳香環を形成する。発酵は、ポリフェノール酸化堆積物を含む葉の酵素が、茶ポリフェノール、特にカテキン［１］と反応する際に生じる。緑茶製造の場合、新芽を酸化させることは認められていない。その代わり、葉を蒸すことにより酸化酵素を不活性化させて、茶カテキンを保存する。
【０００６】
緑茶葉の化学構成成分には、ポリフェノール、メチルキサンチン、アミノ酸、有機酸、炭水化物、タンパク質、リグニン、脂質、クロロフィルおよび他の色素、灰分、ならびに精油が含まれる。表１［２、３（非特許文献１、非特許文献２）］参照。商業的かつ生物学的な点からみて、ポリフェノールおよびカフェインは、従来他の構成成分よりも重要であるとみなされてきた。しかしテアニン、精油、および水溶性−エタノール不溶性多糖などの他の化学構成成分は、生物学的に有益な重要な作用を有することが、近年示されてきた（以下の概略参照）。
【０００７】
【表１】
緑茶は、乾燥質量％で３０〜４２％のポリフェノールを含有する。最も生物学的に有益な活性を有するとも報告されているこれらのポリフェノールの大部分は、「カテキン」として知られるフラボノールである。主なカテキンには、以下の（−）−エピガロカテキン−３−ガレート（ＥＧＣＧ）、（−）−エピガロカテキン（ＥＧＣ）、（−）−カテキンガレート（ＣＧ）、およびエピカテキン（ＥＣ）が含まれる。最も高濃度のものは、高いものから順にＥＧＣＧ、ＥＧＣ、ＥＣＧ、ＥＣである。（＋）−ガロカテキン（ＧＣ）、（−）−ガロカテキンガレート（ＧＣＧ）、（−）−カテキンガレート（ＣＧ）、および（＋）−カテキン（Ｃ）を含む他のカテキンは少量存在する。カテキンの多くの有益な生物学的作用が研究されてきた。それらには、抗酸化活性、抗変異原作用、抗発癌作用、ニトロソ化阻害、ならびに正常細胞への作用ではなく腫瘍および不死化細胞の増殖を抑制する作用が含まれる。しかし、他の化学構成成分の群も、生物学的に有益な作用を示している。例えば、精油（ＥＯ）化学構成成分は、抗酸化活性、抗ぜんそく活性、抗菌活性、抗ウィルス活性、抗癌活性、免疫増強活性、血糖降下活性、脂質低下活性、抗炎症活性、抗皮膚炎活性、抗座瘡活性、抗アテローム性動脈硬化活性を有する。テアニン（Ｔ）は、不安軽減活性および気分高揚活性、認識促進活性、抗癌活性、脳虚血および卒中からの神経保護、ならびに減量活性を有する。さらに、緑茶多糖（Ｐ）は、抗酸化活性および酸素フリーラジカル捕捉活性、抗糖尿病活性、ならびに免疫増強活性を有する。
【０００８】
最近の科学的調査および臨床試験は、緑茶の化学構成成分の治療的価値を簡潔にまとめるために、以下を含む緑茶の様々な化合物、化学画分、および抽出生成物全体の以下の治療効果を示している。強力な抗酸化、酸素フリーラジカル捕捉、およびニトロソ化阻害（ＥＯ、カテキン−主にＥＣＧＣおよびＥＣＧ、Ｐ、抽出物）［４〜７（非特許文献１〜４）］；抗変異原活性（ＥＯ、カテキン、抽出物）［７（非特許文献４）〜１２］；正常細胞への作用のない抗発癌性活性（ＥＯ、カテキン、Ｔ、抽出物）［７（非特許文献４）〜１３］；皮膚保護（ＥＯ、カテキン、Ｐ、抽出物）［８、１０、１１、１４、１５］；抗心臓血管疾患（ＥＯ、カテキン、抽出物）［４〜７（非特許文献１〜４）、１６、１７］；抗脂質異常症（抽出物）［１６］；抗脳卒中および脳の保護（ＥＯ、カテキン、Ｔ、Ｐ、抽出物）［１８、１９］；抗歯周病（抽出物）［２０］；抗骨粗鬆症（抽出物）［２１］；免疫促進（抽出物）［２２］；抗ウィルス、抗ＨＩＶ、および抗菌（ＥＯ、カテキン、抽出物）［２３］；減量および熱産生（カテキン、カフェイン、Ｔ、抽出物）［２３、２４］；抗加齢（カテキン−ＥＣＧＣ、抽出物）［２３］；不安軽減、気分高揚剤、および向知性薬（Ｔ、抽出物）［２５、２６］；ならびに抗糖尿病（Ｐ、抽出物）［２７］。
【０００９】
緑茶は、非常に高用量でも一般的に安全であり毒性はないが、緑茶飲料および医薬品の消費による潜在的な転帰には、不整脈、胃腸障害、および神経過敏、全般性不安、不眠症によって現れるカフェイン毒性などのカフェイン関連障害の発症がある。さらにカフェインの過剰消費は、ストレスおよびストレス関連ホルモン放出を増大する。過剰のカフェインが消費される場合、血圧が上昇する恐れがあり、心臓発作および卒中の危険性が高まる。
【００１０】
現在利用可能な抽出プロセスに包括的な選択性が欠如していることを考慮すると、現在利用可能な緑茶製品はそれらの化学組成物に関して疑わしい点がある。
【非特許文献１】Ｌｉｎ Ｙ−Ｌら、Ｊ Ａｇｒｉｃ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ（１９９６）４４：１３８７−１３９４
【非特許文献２】Ｌｕ Ｈら、Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓｐｏｓ（２００３）３１：４５２−４６１
【非特許文献３】Ｃｈｅｎ Ｈら、Ｊ Ａｇｒｉｃ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ（２００４）５２（１１）： ３３３３−３３３６
【非特許文献４】Ｃｈｅｎ Ｃ−ＷおよびＨｏ ＣＴ． Ｊ Ｆｏｏｄ Ｌｉｐｉｄｓ（１９９５）２：３５−４６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
したがって、これらの相乗的に［１４，２８］作用する、標準的で信頼性のある量の生理的かつ医学的に有益な緑茶化学構成成分で製造することができる、精製済み精油、高いＥＣＧＣのカテキン、テアニン、および多糖化学構成成分画分を組み合わせた、低カフェイン濃度の新規かつ再生産可能な緑茶抽出組成物が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
一態様では、本発明は、図６〜２５のいずれかの実時間直接分析（Ｄｉｒｅｃｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ）（ＤＡＲＴ）質量分析クロマトグラムを有する画分を含む緑茶種抽出物に関する。
【００１３】
さらなる一実施形態では、抽出物は、精油、ポリフェノール、多糖、およびそれらの組合せからなる群から選択される化合物を含む。さらなる一実施形態では、精油は、ｎ−ヘキサデカン酸、テトラデカン酸、９−ヘキサデカノール、１−ウンデカノール、１−ヘキサデカノール、オレイルアルコール、９−オクタデセン−１−オール、ノナデカノール、およびそれらの組合せからなる群から選択される。さらなる一実施形態では、ポリフェノールは、カテキン、フラバノール、フラボノール配糖体、およびそれらの組合せからなる群から選択される。さらなる一実施形態では、カテキンは、カテキン（Ｃ）、エピカテキン（ＥＣ）、エピカテキンガレート（ＥＣＧ）、ガロカテキン（ＧＣ）、エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）、エピガロカテキン（ＥＧＣ）、およびそれらの組合せからなる群から選択される。さらなる一実施形態では、フラバノールは、ケルセチンおよびルチンからなる群から選択される。さらなる一実施形態では、フラボノール配糖体は、ケンペロールである。さらなる一実施形態では、多糖は、グルコース、アラビノース、ガラクトース、ラムノース、キシロースウロン酸、およびそれらの組合せからなる群から選択される。さらなる一実施形態では、本発明の緑茶種は、カフェイン、シュウ酸、またはタンニンを実質的に含まない。
【００１４】
さらなる一実施形態では、精油の量は２重量％を超える。さらなる一実施形態では、精油の量は２５重量％〜９０重量％である。さらなる一実施形態では、精油の量は５０重量％〜９０重量％である。さらなる一実施形態では、精油の量は７５重量％〜９０重量％である。
【００１５】
さらなる一実施形態では、ポリフェノールの量は４０重量％を超える。さらなる一実施形態では、ポリフェノールの量は５０重量％〜９０重量％である。さらなる一実施形態では、ポリフェノールの量は７５重量％〜９０重量％である。
【００１６】
さらなる一実施形態では、多糖の量は１５重量％を超える。さらなる一実施形態では、多糖の量は２５重量％〜９０重量％である。さらなる一実施形態では、多糖の量は５０％〜９０重量％である。さらなる一実施形態では、多糖の量は７５重量％〜９０重量％である。
【００１７】
さらなる一実施形態では、緑茶種抽出物は、精油２重量％〜９７重量％、カテキン１５重量％〜９８重量％、テアニン４重量％〜９０重量％、および多糖９重量％〜９８重量％を含む。
【００１８】
別の態様では、本発明は、本発明の緑茶種抽出物を含む食品または医薬品に関する。
【００１９】
別の態様では、本発明は、ａ）超臨界二酸化炭素抽出によって緑茶種植物材料を抽出して、精油画分および第１の残渣を得る工程、ｂ）アルコール抽出によって緑茶種植物材料または工程ａ）からの第１の残渣を抽出して、ポリフェノール画分および第２の残渣を得る工程、ならびにｃ）水抽出によって工程ａ）からの第２の残渣を抽出し、多糖をアルコールで沈殿させて多糖画分を得る工程によって逐次的に緑茶種植物材料を抽出して、精油画分、ポリフェノール画分、および多糖画分を得ることを含む、少なくとも１つの所定の特徴を有する緑茶抽出物の調製方法に関する。
【００２０】
さらなる一実施形態では、工程ａ）からの第１の残渣は、超臨界二酸化炭素抽出によってさらに脱カフェインされる。さらなる一実施形態では、ポリフェノール画分は、アフィニティー吸着クロマトグラフィーによってさらに精製される。
【００２１】
さらなる一実施形態では、工程ａ）は、１）粉砕された緑茶種植物材料を抽出容器に入れる工程、２）超臨界条件下で二酸化炭素を添加する工程、３）緑茶種植物材料と二酸化炭素をある時間接触させる工程、および４）精油画分を収集容器に収集する工程を含む。さらなる一実施形態では、工程ａ）は、超臨界二酸化炭素画分分離システムで精油画分を分画することによって、精油化合物の比を変える工程をさらに含む。さらなる一実施形態では、超臨界条件は、３５℃〜９０℃で６０バール〜８００バールの圧力を含む。さらなる一実施形態では、超臨界条件は、４０℃〜８０℃で６０バール〜５００バールの圧力を含む。さらなる一実施形態では、その時間は３０分〜２．５時間である。さらなる一実施形態では、その時間は１時間である。
【００２２】
さらなる一実施形態では、工程ｂ）は、１）ポリフェノール化学構成成分を抽出するのに十分な時間、粉砕された緑茶種植物材料または工程ａ）からの第１の残渣をアルコール溶媒と接触させる工程、２）工程１）からの抽出されたポリフェノール化学構成成分の水溶液を、アフィニティー吸着樹脂カラムに通過させ、ポリフェノール構成成分を吸着させる工程、３）酸性溶出溶媒を使用して、アフィニティー吸着物からカフェイン化合物を溶出する工程、および４）含水アルコール溶離溶媒を使用して、アフィニティー吸着樹脂からポリフェノール化学構成成分を溶出する工程を含む。さらなる一実施形態では、含水アルコール溶液は、エタノールおよび水を含み、エタノール濃度は１０〜９５重量％である。さらなる一実施形態では、含水アルコール溶液は、エタノールおよび水を含み、エタノール濃度は２５重量％である。さらなる一実施形態では、工程１）は３０℃〜１００℃で実施される。さらなる一実施形態では、工程１）は６０℃〜１００℃で実施される。さらなる一実施形態では、その時間は１〜１０時間である。さらなる一実施形態では、その時間は１〜５時間である。さらなる一実施形態では、その時間は２時間である。
【００２３】
さらなる一実施形態では、工程ｃ）は、１）多糖を抽出するのに十分な時間、工程ｂ）からの第２の残渣を水と接触させる工程、および２）アルコール沈殿によって水溶液から多糖を沈殿させる工程を含む。さらなる一実施形態では、水は７０℃〜９０℃である。さらなる一実施形態では、水は８０℃〜９０℃である。さらなる一実施形態では、その時間は１〜５時間である。さらなる一実施形態では、その時間は２〜４時間である。さらなる一実施形態では、その時間は２時間である。さらなる一実施形態では、アルコールはエタノールである。
【００２４】
別の態様では、本発明は、本発明の方法によって調製された緑茶種抽出物に関する。
【００２５】
別の態様では、本発明は、ピロガロール、ピロガロールの２５〜３５重量％のテオフィリン／テオブロミン、ピロガロールの０．１〜５重量％のシキミ酸、ピロガロールの０．１〜５重量％のクマル酸、およびピロガロールの０．１〜５重量％の３−メトキシ−１−チロシンを含む緑茶種抽出物に関する。
【００２６】
別の態様では、本発明は、テアニン、テアニンの２０〜３０重量％のテオフィリン／テオブロミン、テアニンの１〜１０重量％のカテキン／エピカテキン、テアニンの１〜１０重量％の没食子酸、テアニンの０．１〜５重量％のカテキンキノン、テアニンの０．１〜５重量％のシンナムアルデヒド、およびテアニンの１〜１０重量％の３−メトキシ−１−チロシンを含む緑茶種抽出物に関する。
【００２７】
別の態様では、本発明は、テアニン、テアニンの４５〜５５重量％のテオフィリン／テオブロミン、テアニンの１〜１０重量％のカテキン／エピカテキン、テアニンの０．１〜５重量％のカルノシン酸（ｃａｒｎｏｓｉｃ ａｃｉｄ）、テアニンの１〜１０重量％の没食子酸、テアニンの０．５〜５重量％のカテキンキノン、テアニンの１〜１０重量％のシンナムアルデヒド、テアニンの０．１〜５重量％のメチルケイ皮酸、テアニンの１〜１０重量％のシンナミド、およびテアニンの１〜１０重量％の３−メトキシ−１−チロシンを含む緑茶種抽出物に関する。
【００２８】
別の態様では、本発明は、ピロガロール、ピロガロールの１〜１０重量％のテオフィリン／テオブロミン、ピロガロールの０．１〜５重量％のテアニン、ピロガロールの１〜１０重量％のカテキン／エピカテキン、ピロガロールの５〜１５重量％のケンペロール、ピロガロールの０．１〜５重量％のミリシチン、ピロガロールの０．１〜５重量％のガロカテキンキノン、ピロガロールの６５〜７５重量％の没食子酸、ピロガロールの０．５〜５重量％のカテキンキノン、ピロガロールの１〜１０重量％のバニリン酸、およびピロガロールの１〜５重量％の３−メトキシ−１−チロシンを含む緑茶種抽出物に関する。
【００２９】
別の態様では、本発明は、ケンペロール、ケンペロールの１〜１０重量％のテアニン、ケンペロールの９５〜１０５重量％のカテキン／エピカテキン、ケンペロールの２０〜３０重量％のケルセチン、ケンペロールの５〜１５重量％のミリシチン、ケンペロールの５〜１０重量％のガロカテキンキノン、ケンペロールの５５〜６５重量％の没食子酸、ケンペロールの１〜１０重量％のカテキンキノン、ケンペロールの１０〜２０重量％のクマル酸、ケンペロールの１〜１０重量％のバニリン酸、およびケンペロールの１５〜２５重量％の３−メトキシ−１−チロシンを含む緑茶種抽出物に関する。
【００３０】
別の態様では、本発明は、ピロガロール、ピロガロールの０．５〜５重量％のテオフィリン／テオブロミン、ピロガロールの９５〜１０５重量％のカテキン／エピカテキン、ピロガロールの５５〜６５重量％のケンペロール、ピロガロールの２０〜３０重量％のケルセチン、ピロガロールの１０〜２０重量％のミリシチン、ピロガロールの２０〜３０重量％のガロカテキンキノン、ピロガロールの５０〜６０重量％の没食子酸、ピロガロールの１５〜２５重量％のカテキンキノン、ピロガロールの１５〜２５重量％のクマル酸、ピロガロールの１〜１０重量％のバニリン酸、およびピロガロールの０．５〜５重量％の３−メトキシ−１−チロシンを含む緑茶種抽出物に関する。
【００３１】
別の態様では、本発明は、ピロガロール、ピロガロールの０．５〜５重量％のテオフィリン／テオブロミン、ピロガロールの９５〜１０５重量％のカテキン／エピカテキン、ピロガロールの５５〜６５重量％のケンペロール、ピロガロールの２０〜３０重量％のケルセチン、ピロガロールの１０〜２０重量％のミリシチン、ピロガロールの２０〜３０重量％のガロカテキンキノン、ピロガロールの５０〜６０重量％の没食子酸、ピロガロールの１５〜２５重量％のカテキンキノン、ピロガロールの１５〜２５重量％のクマル酸、ピロガロールの１〜１０重量％のバニリン酸、およびピロガロールの０．５〜５重量％の３−メトキシ−１−チロシンを含む緑茶種抽出物に関する。
【００３２】
別の態様では、本発明は、ピロガロール、ピロガロールの重量のテアニン、ピロガロールの９０〜１００重量％のカテキン／エピカテキン、ピロガロールの６５〜７５重量％のケンペロール、ピロガロールの１５〜２５重量％のケルセチン、ピロガロールの５〜１５重量％のミリシチン、ピロガロールの５〜１５重量％のガロカテキンキノン、ピロガロールの６５〜７５重量％の没食子酸、ピロガロールの５〜１５重量％のカテキンキノン、ピロガロールの１０〜２０重量％のクマル酸、ピロガロールの１〜１０重量％のバニリン酸、およびピロガロールの１〜１０重量％の３−メトキシ−１−チロシンを含む緑茶種抽出物に関する。
【００３３】
本発明の抽出物は、それに限定されるものではないが、抗酸化活性、酸素フリーラジカル捕捉、ニトロソ化阻害、抗変異原活性（癌予防）、抗発癌性活性（癌治療）、皮膚保護、抗加齢、抗心臓血管疾患、抗脳卒中および治療、脳の保護、抗脂質異常症、抗歯周病、抗骨粗鬆症、免疫増強、抗ウィルス、抗ＨＩＶおよび抗菌活性、抗真菌活性、抗ウィルス活性、体重制御および熱産生、抗糖尿病、ならびに不安軽減、気分高揚、および認識促進を含む生理的かつ医学的作用を提供するのに有用である。
【００３４】
本開示のこれらの実施形態、他の実施形態、ならびにそれらの特性および特徴は、以下の説明、図、および請求の範囲から明らかとなろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３５】
定義
冠詞「ａ」および「ａｎ」は、その冠詞の文法的対象の１つまたは２つ以上（即ち少なくとも１つ）を指すために本明細書で使用される。例えば「一要素」とは、１つの要素または２つ以上の要素を意味する。
【００３６】
本明細書で使用されるように、「地上部」は、葉および茎部を含むＣ．シネンシスの構成部分を指す。
【００３７】
本明細書で使用されるように、「カテキン画分」という用語は、緑茶から得られるまたは緑茶由来の水溶性かつエタノール可溶性カテキン化合物を含み、それに限定されるものではないが、ＥＣＧＣ、ＥＧＣ、ＥＣＧ、ＥＣ、ＧＣ、ＧＣＣ、ＧＣ、およびＣなどの化合物をさらに含む。
【００３８】
「含む」および「含んでいる」という用語は、追加の要素が含まれ得るという包括的でオープンな意味で使用される。
【００３９】
「からなる」という用語は、要素を、通常それに関連する不純物を除いて特定されたものに限定するために使用される。
【００４０】
「から本質的になる」という用語は、要素を特定されたもの、ならびに材料または工程の基本的および新規特徴に実質的に影響を与えないものに限定するために使用される。
【００４１】
本明細書で使用されるように、「脱カフェインされた」という用語は、緑茶葉植物材料に見られるカフェイン濃度よりも低いカフェイン濃度を有する緑抽出組成物を含む。
【００４２】
本明細書で使用される「有効量」という用語は、所望の生物学的応答を導くために必要な量を指す。当業者には理解されるように、複合物または生物活性剤の有効量は、所望の生物学的エンドポイント、送達される生物活性剤、封入マトリックスの組成、標的組織等の要素に依存して変わり得る。
【００４３】
本明細書で使用されるように、「精油画分」という用語は、緑茶から得られるまたは緑茶に由来する脂溶性の水不溶性化合物を含み、それに限定されるものではないが、ｎ−ヘキサデカン酸、テトラデカン酸、９−ヘキサデカノール、Ｅ、オレイルアルコール、１−オクタデカノール、フィトール、およびジヒドロアクチニジオリドとして分類される化合物が含まれる。
【００４４】
本明細書で使用されるように、「原料」は一般に、植物全体それのみを含むか、またはそれに限定されるものではないが、主根、側根、および繊維根、茎、葉、種、および花を含む、葉、根を含む植物の１つもしくは複数の構成部分と組み合わせて含む未加工の植物材料を指し、この植物または構成部分は、未加工のままの材料、処理を容易にするために乾燥、蒸気加工、加熱した材料、またはそれ以外の物理的処理にかけた材料を含むことができ、さらには、そのままの材料、植物材料の寸法および物理的完全性に影響を与えるために切断し、切り刻み、さいの目切りにし、粉砕し、挽き、またはそれ以外の処理にかけた材料を含むことができる。場合により「原料」という用語は、さらなる抽出プロセスのために供給源として使用されることになる抽出生成物を特徴付けるために使用することができる。
【００４５】
本明細書で使用されるように、「画分」という用語は、いくつかの物理的化学的特性、または物理的もしくは化学的特性によって特徴付けられる特定の群の化合物を含む抽出組成物を意味する。
【００４６】
本明細書で使用されるように、「緑茶」という用語は、カメリアシネンシス種植物に由来する葉または地上部の植物材料を指す。緑茶という用語はまた、Ｃ．シネンシス種と同義に使用され、これらの植物、クローン、変種、および枝変り等を意味する。緑茶は、緑茶葉を製造するために処理されたＣ．シネンシス種植物材料の従来の抽出生成物に対する薬物名である。
【００４７】
本明細書で使用されるように、「緑茶構成成分」という用語は、緑茶種に見られる化合物を意味すべきであり、先に定義したような化合物、ならびにそれに限定されるものではないが精油化学構成成分、カテキン、テアニン、および多糖を含む緑茶種に見られる他の化合物すべてを含むべきである。
【００４８】
本明細書で使用されるように、「１つまたは複数の化合物」という用語は、ｎ−ヘキサデカン酸（緑茶の脂溶性精油化学構成成分）、もしくはＥＣＧＣ（緑茶の水溶性および水−エタノール可溶性カテキン）、もしくはテアニン（緑茶の水溶性アミノ酸）、もしくは緑茶の水溶性−エタノール不溶性多糖分子などの少なくとも１つの化合物が企図され、または２つ以上の化合物、例えばｎ−ヘキサデカノイド酸およびＥＣＧＣが企図されることを意味する。当技術分野で知られているように、「化合物」という用語は、単一分子を意味するものではなく、多数のまたは数モルの１つまたは複数の化合物を意味するものである。当技術分野で知られているように、「化合物」という用語は、明確な化学的および物理的特性を有する特定の化学構成成分を意味し、「化合物（複数）」は、１つまたは複数の化学構成成分を指す。
【００４９】
本明細書で使用されるように、「多糖画分」という用語は、緑茶から得られるまたは緑茶由来の水溶性−エタノール不溶性多糖化合物を含む。多糖の非限定的な例には、グルコース、アラビノース、ガラクトース、ラムノース、キシロースウロン酸、およびそれらの組合せが含まれる。
【００５０】
緑茶の他の化学構成成分が、これらの抽出画分に存在することもできる。
【００５１】
本明細書で使用されるように、「プロファイル」という用語は、抽出画分内の化合物の質量パーセント比を指し、または最終緑茶抽出組成物における４つの緑茶画分化学構成成分のそれぞれの質量パーセント比を指す。
【００５２】
本明細書で使用されるように、「精製済み」画分または組成物という用語は、その画分のまたは組成物の化学構成成分の５０％超に濃縮しているいくつかの物理−化学的特性または物理的もしくは化学的特性によって特徴付けられる特定の群の化合物を含む画分または組成物を意味する。換言すれば、精製済み画分または組成物は、その画分または組成物を定義するいくつかの所望の物理−化学的特性、または物理的もしくは化学的特性によって特徴付けられない化学構成成分化合物を５０％未満含む。
【００５３】
「相乗的」という用語は当技術分野で認識されており、一緒に作用して、その全体の効果が各成分の合計よりも大きくなる２つ以上の成分を指す。
【００５４】
本明細書で使用されるように、「テアニン画分」という用語は、緑茶から得られるまたは緑茶に由来するアミノ酸である水溶性テアニンを含む。
【００５５】
「治療する」という用語は当技術分野で認識されており、任意の状態または疾病の少なくとも１つの症候が治癒することならびに緩和することを指す。
【００５６】
抽出物
本発明は、１つまたは複数の緑茶原料から、精油、カテキン、テアニン、および多糖を単離したおよび精製した画分の抽出物を含む。これらの個々の画分を特定の比（プロファイル）で組み合わせて、有益な組合せを提供することができ、現在知られている抽出生成物には見られない抽出生成物を提供することができる。例えば、１つの種からの精油画分を、同じかまたは異なる種からのカテキン画分と組み合わせることができ、この組合せを、同じかまたは異なる緑茶原料からのテアニン画分または多糖画分と組み合わせてもよく、または組み合わせなくてもよい。かかる抽出物は、所定量の精油、カテキン、テアニン、または多糖画分の少なくとも１つを有する画分を含む。いくつかの実施形態は、シュウ酸を含まない緑茶の抽出物を含む。いくつかの実施形態は、脱カフェインされた緑茶の抽出物を含む。
【００５７】
さらなる実施形態は、天然植物材料に見られるもの、または現在利用可能な緑茶抽出生成物に対して変更されたプロファイル（比分布）の緑茶化学構成成分を含む抽出物を含む。例えば、精油画分濃度は、カテキンおよび／またはテアニンおよび／または多糖濃度に対して増加しても減少してもよい。同様に、カテキンまたはテアニンまたは多糖を、他の抽出物構成成分の画分に対して増加または減少させて、特定の生物学的作用のための新規構成成分の化学的プロファイル組成を可能にすることができる。
【００５８】
一実施形態では、本発明の抽出物は、２質量％を超える精油化学構成成分を含むことができる。かかる抽出物の別の実施形態は、天然の植物材料または従来の緑茶種抽出物に見られるよりも高い所定のカテキン濃度を含む。例えば抽出物は、その抽出物の３０質量％を超える濃度の新規緑茶カテキンを含むことができる。かかる抽出物の別の実施形態は、天然の植物材料または現在利用可能な抽出生成物の天然緑茶Ｌ−テアニンの濃度よりも高い、２質量％を超えるＬ−テアニン濃度を含むことができる。
【００５９】
個々の緑茶種の有益な化学構成成分の濃度関係（化学的プロファイル）を変更することによって、ヒトの特定の状態または疾患に望ましい独特または新規の緑茶種抽出生成物の配合が可能になる。例えば、抗酸化、酸素フリーラジカル捕捉、およびニトロソ化阻害活性のための新規かつ強力な緑茶組成物は、質量％で、緑茶天然植物材料または従来知られている抽出生成物に見られるよりも多い精製済み精油、カテキン、および多糖組成、ならびにそれよりも少ないＬ−テアニン組成を有することができよう。それとは対照的に、癌予防のための新規緑茶抽出物は、質量％で、緑茶天然植物材料または従来知られている抽出生成物に見られるよりも多い精製済み精油およびカテキン画分、ならびにそれよりも少ないＬ−テアニンおよび多糖画分を有することができよう。抗脳卒中および脳の保護のための新規緑茶抽出物プロファイルの別の例は、質量％で、天然緑茶植物材料または知られている従来の緑茶抽出生成物に見られるよりも多い精製済み精油、カテキン、Ｌ−テアニン、および多糖組成の抽出プロファイルとなろう。抗加齢活性については、質量％で、天然緑茶植物材料または従来の抽出生成物に見られるよりも多いカテキン画分、ならびにそれより少ない精油、テアニン、および多糖画分が望ましい。それとは対照的に、不安軽減、気分高揚、および認識促進については、質量％で、天然緑茶植物材料または従来の抽出生成物に見られるよりも多い精製済みテアニン画分およびそれより少ない精油、カテキン、および多糖画分が、最適な組成の生成物となり得る。
【００６０】
本発明のさらなる実施形態は、カテキン化学構成成分の新規副画分を含む抽出物であり、全カテキンは、高度に精製され（例えば＞９５質量％）、ＥＣＧＣなどの特定の高度生物活性カテキン化合物の濃縮物は、他のカテキン化合物（プロファイルされた副画分）と比較して高い濃度を有する。かかる新規および精製済みカテキン副画分抽出物は、単独で、または他の緑茶精製済み画分、他の植物化学構成成分、もしくは医薬化合物と組み合わせて使用することができる。例えば、かかる新規カテキン副画分は、癌および加齢予防に実質的に有益となり得る。
【００６１】
本発明の方法は、ヒトの障害を治療および予防するための新規緑茶抽出物を提供することを含む。例えば、抗酸化活性および心血管保護のための新規緑茶抽出物は、重量％で、緑茶天然植物材料または従来知られている抽出生成物に見られるよりも高いカテキン画分濃度、高い精油画分濃度、低いテアニン濃度、および高い多糖画分濃度を有することができる。卒中予防および治療のための新規緑茶種抽出物は、重量％で、天然緑茶植物材料または従来知られている抽出生成物に見られるよりも高いカテキン画分、精油画分画分、テアニン画分、および多糖画分濃度を有することができる。不安および抑うつ治療のための新規緑茶抽出物の別の例は、天然緑茶植物材料または知られている従来の抽出生成物に見られるよりも高いテアニン画分濃度および少ない精油画分、および低いカテキン濃度、および少ない多糖画分を有する組成物を含む。
【００６２】
天然緑茶と比較した抽出物
いくつかの実施形態は、天然緑茶植物材料または現在利用可能な緑茶抽出生成物に見られるよりも多い量の精油、カテキン、テアニン、または多糖濃度の少なくとも１つを有する緑茶の抽出物を含む。いくつかの実施形態は、精油、カテキン、テアニン、または多糖を含む１つまたは複数の画分が、天然緑茶植物材料に見られるよりも高い濃度で見出される組成物も含む。いくつかの実施形態は、精油、カテキン、テアニン、または多糖を含む１つまたは複数の画分が、天然緑茶植物材料に見られるよりも低い濃度で見出される抽出物も含む。緑茶の生物活性のある化学構成成分画分の知られている量（表１）を、本発明の一例として使用する。例えば、本発明の抽出物は、精油の濃度が天然緑茶植物材料の濃度の０．００１〜２００倍である画分、および／またはカテキンの濃度が天然緑茶植物材料の濃度の０．００１〜４倍である組成物、および／またはテアニンの濃度が緑茶植物材料の濃度の０．００１〜２００倍である抽出物、および／または多糖の濃度が天然緑茶植物材料の濃度の０．００１〜４０倍である抽出物、および／またはカフェインの濃度が緑茶植物材料の濃度の０．００１〜０．９９倍である抽出物を含む。本発明の抽出物は精油の濃度が天然緑茶の濃度の０．０１〜２００倍である画分、および／またはカテキンの濃度が天然緑茶の濃度の０．０１〜４倍である抽出物、および／またはテアニンの濃度が天然緑茶の濃度の０．０１〜２００の抽出物、および／または多糖の濃度が天然緑茶植物材料の濃度の０．０１〜４０倍である抽出物を含む。さらに、本発明の抽出物は、天然緑茶植物材料カテキン化学構成成分に見られるよりも多いまたは少ない量で天然植物材料カテキン化学構成成分に存在する、少なくとも１つまたは複数の化合物を有するカテキン化学構成成分の副画分を含む。例えば化合物ＥＣＧＣは、カテキン副画分が、天然緑茶植物材料の全カテキン化学構成成分の５０質量％というその濃度から、６０質量％の該副画分に増加した濃度を有することができる。それとは対照的にＣは、カテキン副画分が、天然植物材料の全カテキン化学構成成分の２．２質量％というその濃度から、該副画分＜０．１質量％に減少した濃度を有することができる。本発明の抽出物は、かかる新規カテキン副画分における特定の化合物の濃度が、天然緑茶カテキン化学構成成分に見られる濃度の約１．１〜約２倍増加し、または約０．１〜１００倍減少する抽出物を含む。
【００６３】
かかる抽出物のさらなる一実施形態は、天然緑茶種の乾燥植物材料または従来の緑茶種抽出生成物に見られるものに対して実質的に増加した所定の多糖濃度を含む。例えばある抽出物は、その抽出物の３質量％を超える水溶性エタノール不溶性多糖画分を含むことができる。いくつかの実施形態は、精油化合物、カテキン、Ｌ−テアニン、または多糖を含む１つまたは複数の画分が、天然緑茶植物材料に見られるよりも低い濃度で見出される抽出物も含む。例えば本発明の抽出物は、精油が天然緑茶植物材料の濃度の０．００１〜１００倍、および／またはカテキンの濃度が天然緑茶植物材料の濃度の０．００１〜１４倍、および／またはＬ−テアニンの濃度が天然緑茶植物材料の０．００１〜１００倍、および／または多糖濃度が天然緑茶植物材料の濃度の０．００１〜８０倍である抽出物を含む。混合抽出物を製造する場合、約０．００１ｍｇ〜約２００ｍｇの精油画分を使用することができる。さらに、約０．００１ｍｇ〜約５００ｍｇの精製済みカテキン画分を使用することができる。さらに、約０．００１ｍｇ〜約５００ｍｇの精製済みＬ−テアニン画分を使用することができる。最後に、約０．００１ｍｇ〜約５００ｍｇの水溶性エタノール不溶性多糖画分を使用することができる。
【００６４】
抽出物の純度
以下本発明で教示される方法は、精油画分、カテキン画分、カテキン副画分、Ｌ−テアニン画分、および多糖画分の精製（濃縮）、ならびにカテキン、Ｌ−テアニン、および多糖画分の脱カフェインを可能にするものである。所望の化学構成成分の８９質量％もの高さの精油画分純度は、精製済み画分における主な非精油構成成分としてのカフェインによって実現することができる。ＳＣＣＯ２は、原料中の約８５質量％のカフェインを除去する、緑茶原料を脱カフェインするための優れた手段となることが証明されている。カテキン画分のプロセスクロマトグラフィー精製の副画分すべてを組み合わせると、全カテキンの質量の５７〜６９％のＥＣＧＣ濃度（プロファイル）で、混合抽出物の６３〜６８質量％の全カテキン純度を得ることができる。選択されたアフィニティー吸着プロセスクロマトグラフィーの溶出副画分を組み合わせると、全カテキンの６２〜７０質量％のＥＣＧＣ濃度の、副画分の９１〜９９質量％の全カテキン純度を含む高度に精製されたカテキン副画分が、かなり高い収率で容易に実現される。収率が犠牲となる場合、さらに高いレベルの全カテキン純度およびＥＣＧＣ濃度を含む副画分を得ることができる。高い収率の、画分の９０質量％のＬ−テアニン濃度を含む精製済みＬ−テアニン画分、および画分の９０質量％を超える多糖濃度を含む精製済み多糖画分も、本発明に教示される方法を使用して実現される。使用される特定の抽出環境、抽出速度、溶媒、および抽出技術は、原料の始めの化学構成成分プロファイルおよび最終抽出生成物の所望の精製レベルに依存する。本発明で教示される特定の方法は、特定の特質を有する産出材料に加工される出発材料の特質のサンプル変動を説明するためのプロセス調節に一般的な、ほんの日常的な実験を使用して、当業者によって容易に決定され得る。例えば特定のある組の緑茶種植物材料では、精油化学構成成分、カフェイン、カテキン、Ｌ−テアニン、および多糖の最初の濃度は、本発明で教示されるように、当業者に知られている方法を使用して決定される。当業者は、本明細書に開示の抽出法を使用して、カテキン構成成分の最初の濃度からの、例えば最終抽出生成物のカテキン化学構成成分の所定量までの変化量を決定して、最終緑茶種組成物製品における所望の濃度に到達させることができる。同様に、脱カフェインレベルならびに精油化合物、Ｌ−テアニン、および多糖画分組成物についてもかかる変更を行うことができる。
【００６５】
一般に、本発明の方法および組成物は、所定の特徴を有する抽出緑茶種組成物の生成方法を含む。かかる抽出緑茶種組成物は、所与の生成物に望ましい有益な生物学的作用（複数）に依存して、４つの濃縮抽出画分の任意の１つ、２つ、３つ、または４つすべてを含むことができる。一般に、４つすべての精製済み緑茶種抽出物画分を含有する組成物は、天然植物材料に見られる４つの主な生物学的に有益な化学構成成分すべてを含有する高度に精製された第１の緑茶種抽出生成物であることから、一般には望ましいものである。本発明の実施形態は、所定の特徴が、選択的に増加した所定濃度の緑茶種の精油化合物、カテキン、Ｌ−テアニン、および多糖を別個の抽出画分として含む方法を含む。最終組成物中に４つの生物学的に有益な化学構成成分群のすべてを有することの重要性は、高度に精製された単一の化合物または関連化合物の群に見られる以上に緑茶化学構成成分の所望の生理的かつ医学的作用を高めるという、これらの化合物の相乗的相互作用に関係している。
【００６６】
抽出方法
抽出の出発材料は、１つまたは複数のＣ．シネンシス種からの植物材料である。植物材料は、植物の任意の部分であってよいが、葉、茎、または他の植物部分を含む植物の地上部が好ましい。葉は最も好ましい出発材料である。
【００６７】
Ｃ．シネンシス種植物材料を予備抽出工程にかけて、その材料を任意の特定の形態にすることができ、抽出に有用な任意の形態が本発明によって企図される。Ｃ．シネンシスの葉材料は、カテキンを緑茶生成物のフロブフェンに変換する酵素を不活化するために、好ましくは蒸される。かかる予備抽出工程には、それに限定されるものではないが、材料が切断され、切り刻まれ、細分に刻まれ、細長く刻まれ、粉砕され、微粉化され、切断され、または引き裂かれる工程が含まれ、出発材料は、予備抽出工程の前に乾燥されるか、または新鮮な植物材料のままである。好ましい予備抽出工程は、Ｃ．シネンシス種葉材料を、微粉に粉砕および／または微粉化する工程を含む。出発材料または予備抽出工程後の材料は乾燥されるか、または湿気を与えられる。緑茶植物材料が抽出用の形態になると、本発明によって抽出方法が企図される。
【００６８】
一般に本発明の方法は、緑茶植物材料が、超臨界流体抽出（ＳＦＥ）、またいわゆる超臨界二酸化炭素（ＳＣＣＯ２）を使用して抽出され、それに１つまたは複数の溶媒抽出工程、例えばそれに限定されるものではないが、水、含水アルコール、およびアフィニティーポリマー吸収抽出プロセスが続く方法を部分的に含む。本発明で企図されるさらなる他の方法は、他の有機溶媒、冷媒化学物質、圧縮性ガス、可聴化（ｓｏｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、高圧液体抽出、高速向流クロマトグラフィー、分子インプリントポリマー、および他の知られている抽出法を使用する緑茶植物材料の抽出を含む。かかる技術は当業者に知られている。一態様では、本発明の組成物は、図１〜５に概略的に示した工程を含む方法によって調製することができる。
【００６９】
本発明は、ＳＣＣＯ２技術を使用して、緑茶植物材料から精油および他の脂溶性化合物を濃縮（精製）およびプロファイルする方法を含む。本発明は、ＳＣＣＯ２処理を使用する緑茶植物材料の脱カフェインを含む。本発明で教示されるＳＣＣＯ２での緑茶植物材料の精油化学構成成分の抽出および脱カフェインによって、有害な有機溶媒の使用が排除される。二酸化炭素は、天然の安全な生物学的生成物であり、多くの食品および飲料に含まれる成分である。
【００７０】
精油は、香水産業、医薬部門、ならびに食品およびヒトの栄養において広く使用されている芳香物質である。それらは２００を超える化合物の混合物であり、それらは油全体の９０〜９５％を構成し、モノテルペンおよびセスキテルペン炭水化物、ならびにそれらの酸化誘導体を、脂肪族アルデヒド、アルコール、およびエステルと一緒に含有する揮発性画分と、油全体の５〜１０％を構成し、炭水化物、脂肪酸、ステロール、カロテノイド、ワックス、クマリン、プソラリン、およびフラボノイドを含有する不揮発性残余の２つの画分に基本的に分類することができる。
【００７１】
これらの化合物の広範な使用の結果として、精油の単離、濃縮、および精製は、何年もの間重要なプロセスとなってきた。従来使用されてきた一般的な方法は、主に溶媒抽出および蒸気蒸留に基付くものである。これらの従来技術の使用は、大きな不利益（熱不安定性化合物の喪失の危険性）があり、さらに２つの重大な欠点（自動化が不可能であり、抽出に長時間を要する）がある。濃縮に使用される商業用の方法は、真空分留および選択的溶媒抽出およびクロマトグラフィー分離である。これらのすべての方法は、低収率、副産物形成（高温曝露時間による）、および抽出物中の有害有機残渣の存在などの重大な欠点を有している。
【００７２】
超臨界流体抽出（ＳＦＥ）は、従来技術に関連する欠点を回避するために、植物からの精油抽出に最近使用されているものである。その抽出有用性は、液体溶媒よりも高い拡散係数を伴う、ガス様物質移動特性と液体様溶媒特性との組合せによる。ＳＦＥは、分画による従来の抽出法によって得られた精油の質を高める適切な技術でもある。
【００７３】
世界中で最も消費されているアルカロイドであるカフェインは、コカ豆（０．２％）、コーヒー豆（０．９〜２．４％）、および茶葉（１．５〜２．５％）などのいくつかの天然生成物に高濃度で見られるものである。カフェインは一般に、ヒトの健康および環境にとって有害とみなされるジクロロメタンおよびヘキサンなどの有機溶媒を使用する抽出によって得られる。水は、カフェインにとって優れた溶媒であるが、非選択的溶媒である。水での抽出によって、緑茶のポリフェノール（カテキン）などの他の価値のある成分が分解され、その後喪失してしまう。
【００７４】
本発明では、超臨界二酸化炭素は、カフェイン抽出（緑茶の脱カフェイン）の主なプロセスとして選択されている。このプロセスには、カフェインを除去するための溶媒として高温の圧縮ガスを使用することが含まれる。商業規模では、二酸化炭素は、コーヒー豆からカフェインを抽出するために使用される。超臨界ＣＯ２は、従来使用されている有機溶媒と比較して非汚染性および非毒性である。いくつかの特許が、ＣＯ２を用いたコーヒー豆からのカフェイン抽出について記載しており、これらは既に論じられている。Ｚｏｓｅｌ（米国特許第４，２４７，５７０号）は、商業規模での脱カフェイン操作を詳説した。０．７〜３％の範囲のコーヒー豆のカフェイン含量が、約０．０２％のカフェインに減少した。抽出プロセスは、７０〜９０Ｃおよび１６０〜２００バール（ＣＯ２密度０．４〜０．６５ｇ／ｃｃ）で実施された。
【００７５】
超臨界二酸化炭素は、カフェインに非常に選択的であるが、カフェインの可溶性は有機溶媒への可溶性よりも低く、その結果多量のＣＯ２を使用することになり、したがって固定費および操業費の両方が著しく上がる。コーヒー豆で観測されるように、水は、抽出収率を実質的に改善する価値のある共溶媒として作用することができる。
【００７６】
緑茶植物材料の生物学的に活性な化学構成成分の抽出方法の概略図を、図１〜５に示す。抽出プロセスは、一般にそれに限定されるものではないが、６工程である。本文参照に関して、下線の数字Ｘが本文に現れた場合、その数字は図１〜５の数字を指す。抽出プロセスに使用される分析方法は、実施例部分で提示される。
【００７７】
工程１：緑茶精油の超臨界流体二酸化炭素抽出
精油の疎水性性質に起因して、それに限定されるものではないが、ＳＣＣＯ２、ヘキサン、石油エーテル、および酢酸エチルを含む非極性溶媒を、この抽出プロセスで使用することができる。精油のいくつかの成分は揮発性であるため、抽出プロセスとして蒸気蒸留を使用することもできる。
【００７８】
ＳＣＣＯ２を使用する緑茶葉からの精油化学構成成分抽出の概略図を、図１−工程１に図示する。原料［１０］は、乾燥切断緑茶葉である（１０５μｍを超える寸法）。抽出溶媒［２１０］は、純粋な二酸化炭素である。共溶媒として水を使用することができる。原料を、ＳＦＥ抽出容器［２０］に入れる。パージおよび漏出試験後、このプロセスは、貯蔵容器から冷却器を介してＣＯ２ポンプに流れる液化ＣＯ２を含む。ＣＯ２は、所望の圧力に圧縮され、圧力および温度が所望のレベルに維持される抽出容器内で原料を貫流する。抽出の圧力は、約６０バール〜８００バールの範囲であり、温度は約３５℃〜約９０℃の範囲である。本明細書で教示されるＳＣＣＯ２抽出は、好ましくは少なくとも１００バールの圧力および少なくとも３５℃の温度、より好ましくは約６０バール〜３００バールの圧力および約４０℃〜約６０℃の温度で実施される。抽出の単一段階についての抽出時間は、約３０分〜約２．５時間、〜約１時間の範囲である。溶媒と供給物の比は、各ＳＣＣＯ２抽出につき、一般に約２０〜６０対１である。ＣＯ２は、商業用抽出処理のために再利用される。次いで、抽出された精製およびプロファイル済み精油化学構成成分［３０］は、コレクターまたはセパレーターに収集され、光防止ガラス瓶に保存され、冷暗庫中４℃で貯蔵される。緑茶原料［１０］物質は、抽出および精製済みの得られた緑茶精油画分［３０］が、１つのコレクターＳＦＥまたはＳＣＣＯ２システム［２０］に収集される１工程プロセス（図１、工程１Ａ）で抽出することができる。あるいは分画ＳＦＥシステムの場合、ＳＣＣＯ２抽出した緑茶原料物質は、コレクター容器（セパレーター）に分離され、各コレクター内に収集された精製済み精油副画分のそれぞれに異なる相対パーセンテージの精油化学構成成分組成（プロファイル）が存在するようにすることができる。残渣（残り）［４０］は収集され、保存され、それに限定されるものではないが、脱カフェイン、ならびに緑茶カテキン、テアニン、および多糖の精製済み画分を得るための処理を含むさらなる処理に使用される。本発明の一実施形態は、６０バール〜８００バールの圧力および３５℃と９０℃の間の温度における多段階ＳＣＣＯ２抽出を使用する緑茶原料の抽出、ならびに各段階後における抽出緑茶材料の収集を含む。本発明の第２の実施形態は、６０バール〜８００バールの圧力および３５℃と９０℃の間の温度におけるＳＣＣＯ２分画抽出を使用する緑茶種原料の抽出、ならびに所定条件（圧力、温度、および密度）および所定間隔（時間）での異なるコレクター容器への抽出緑茶材料の収集を含む。多段階抽出器のそれぞれからまたは異なるコレクター容器（分画システム）で得られる抽出された緑茶の精製済み精油副画分組成物は、回収し独立に使用することができ、または混合して、天然植物材料に見られるよりも高いもしくは低い所定の精油化学構成成分濃度を含む１つもしくは複数の緑茶精油組成物を形成することができる。一般に、ＳＣＣＯ２単一抽出工程を使用する緑茶植物材料からの精油画分の全収率は、約０．４重量％（精油化学構成成分の＞９５％）であり、抽出物の８５質量％を超える精油化学構成成分純度を有する。かかる抽出プロセスの結果は、以下の表２〜４に見られる。手順は実施例１に見ることができる。
【００７９】
【表２】
【００８０】
【表３−１】
【００８１】
【表３−２】
【００８２】
【表４−１】
【００８３】
【表４−２】
緑茶葉精油画分の化合物合計７３種を、ＳＣＣＯ２を使用して４０℃および１００〜２００バールで抽出した。ＳＣＣＯ２抽出が乾燥または湿潤緑茶葉のどちらで達成されるかは重要と思われず、このプロセスではカフェインが抽出される。これらの精油画分のカフェイン濃度は、精油画分の約１１〜８０質量％で変わる。カフェインに加えて、精油画分に見られる他の主な化合物には、１−ウンデカノール、１−ヘキサデカノール、オレイルアルコール、およびノナデカノールなどの飽和脂肪アルコールならびにヘキサデカン酸などの脂肪酸が含まれる。興味深いことに、精油化合物に関しては中国緑茶Ｆ１には殆ど見られなかった。それとは対照的に、中国緑茶Ｆ２、Ｆ３、およびＦ４はすべて、５０質量％を超える脂肪アルコールおよび脂肪酸を含むＳＣＣＯ２精油抽出画分を有することが見出された。日本緑茶原料からのＳＣＣＯ２精油画分では、４０質量％未満の脂肪アルコールおよび脂肪酸が抽出画分を構成していた。
【００８４】
工程２．緑茶の超臨界二酸化炭素脱カフェイン
ＳＣＣＯ２を使用する緑茶葉からの化学構成成分の脱カフェインの一般的説明を、図１−工程２に図示する。乾燥切断緑茶葉（１０５ｍμを超える寸法）の原料［１０または４０］または工程１の精油画分抽出後の残渣を、１苗床分の量の蒸留水に浸す。抽出溶媒［２１０］は、純粋な二酸化炭素である。共溶媒として水を使用することができる。原料を、ＳＦＥ抽出容器［５０］に入れる。パージおよび漏出試験後、このプロセスは、貯蔵容器から冷却器を介してＣＯ２ポンプに流れる液化ＣＯ２を含む。ＣＯ２は所望の圧力に圧縮され、圧力および温度が所望のレベルに維持される抽出容器内で原料を貫流する。抽出の圧力は、約６０バール〜８００バールの範囲であり、温度は約３５℃〜約９０℃の範囲である。本明細書で教示されるＳＣＣＯ２抽出は、好ましくは少なくとも２００バールの圧力および少なくとも３５℃の温度、より好ましくは約３０バール〜７００バールの圧力および約６０℃〜約８０℃の温度で実施される。抽出の単一段階についての抽出時間は、約２〜約６時間、〜約４時間の範囲である。溶媒と供給物の比は、各ＳＣＣＯ２抽出につき、一般に約２４０対１である。ＣＯ２は、商業用抽出処理のために再利用される。次いで、抽出されたカフェイン化学構成成分［７０］は収集され、カフェイン含量を測定され、廃棄される。残渣（残り）または脱カフェイン済み緑茶抽出物［６０］は収集され、保存され、それに限定されるものではないが、緑茶カテキン、テアニン、および多糖の精製済み画分を得るための処理を含むさらなる処理に使用される。一般に、単一工程のＳＣＣＯ２抽出を使用する緑茶植物材料からのカフェインの全収率は、約４．５重量％（原料のカフェイン化学構成成分の約８５％）であり、カフェイン抽出物の約２９質量％のカフェイン化学構成成分純度を有する。かかる脱カフェインプロセスによって、脱カフェイン済み緑茶原料中のカフェイン含量は、原料のカフェイン含量の約５５〜８５質量％に減少する。カフェイン含量の低い緑茶原料では、カフェインの８３〜８５質量％を除去することができる。高カフェインを含有する緑茶原料中のカフェイン含量を減少させるため、原料を８０質量％超脱カフェインするにはより高い溶媒／供給物比が必要とされる。かかる抽出プロセスの結果は、以下の表５および６に見られる。手順は実施例２に見ることができる。
【００８５】
【表５】
【００８６】
【表６】
カフェインの抽出収率は、共溶媒の添加と共に増加した。超臨界流体二酸化炭素／共溶媒混合物中のカフェインの可溶性は、純粋な二酸化炭素のみより３〜５倍高い（Ｋｏｐｃａｋ２００５）。カフェイン抽出の観点からすれば、７５％エタノール／水は非常に効率的である。しかし、脱カフェイン抽出物中のカフェイン９．３質量％に加えて、脱カフェイン抽出物の４質量％のＥＧＣＧ、２．６質量％のＥＧＣ、および０．９質量％のＥＣＧなどの、原料からの価値あるフェノール酸化合物も抽出される。緑茶葉原料の脱カフェインに関して、水はエタノールよりも良好な共溶媒である。湿潤緑茶葉、共溶媒としての水、およびＳ／Ｆ比２４０を使用して、原料から価値のあるフェノール酸またはテアニンのいずれも除去することなく、Ｆ１原料および日本緑茶（ＪＰＧＣ）原料中８０％を超えるカフェインを除去（脱カフェイン）することができる。これは、Ｆ１原料中１．３質量％からＦ１脱カフェイン済み材料中０．１８質量％へのカフェイン含量の減少、またはＪＰＧＴ原料中２．２質量％から脱カフェイン済み緑茶材料中０．３６質量％へのカフェイン含量の減少、６〜７倍のカフェイン含量の減少に等しい。３．３質量％の高カフェイン含量のＦ４緑茶葉原料の場合、全カフェインの減少は少ない。Ｆ４脱カフェイン済み原料の１．４６質量％。しかし、価値のあるカテキンおよびテアニンは、脱カフェイン済み残渣材料に保存されていた。したがって、価値のあるカテキンおよびテアニン化学構成成分を保持している脱カフェイン済み残渣を、次いでさらなる処理のために使用して、精製済みカテキン、テアニン、および多糖画分を得ることができる。
【００８７】
興味深いことに、同じＳＦＥ脱カフェイン条件下で、高カフェイン含量のＦ４原料については約５５％の脱カフェインしか観測されなかった。この差異は、Ｆ４緑茶葉の高カフェイン含量もしくは異なるマトリックス構造、またはその両方によって生じるものと思われる。観測に基付くと、Ｆ４原料葉は浸水によってはあまり湿潤していない。換言すれば、水はＦ４葉の内部マトリックスに浸透する代わりに、葉の表面上に残る傾向がある。したがってＦ４緑茶葉は、８０％を超える脱カフェインを実現するために、より多量の水および／または長時間の浸水時間、ならびに場合によってはより高い溶媒／供給物比が必要となろう。
【００８８】
工程３．粗緑茶カテキン化学構成成分画分のエタノール抽出
一態様では本発明は、生物活性のあるカテキン化学構成成分の抽出および濃縮を含む。この工程の一般的説明を、図２−工程３に図示する。この工程３の抽出プロセスは、溶媒浸出プロセスである。この抽出用の原料は、茶を切断した緑茶葉材料緑茶［１０］、または工程１のＳＣＣＯ２抽出による精油画分からの残渣［３０］もしくは工程２のＳＣＣＯ２による脱カフェイン緑茶葉材料からの残渣［６０］のいずれかである。抽出溶媒２２０は９５％エタノールである。抽出溶媒は１０〜９５％アルコール水溶液であってよく、９５％水性エタノールが好ましい。この方法では、緑茶原料および抽出溶媒は、加熱または攪拌される抽出容器１００に入れられる。これは９０℃、約８０℃、約７０℃、または約６０〜９０℃に加熱することができる。抽出は、約１〜１０時間、約１〜４時間、約２時間実施される。得られる液体抽出物を遠心分離にかけ［１１０］、濾過する［１２０］。濾液（上清）［３００、３１０］を生成物として収集し、溶媒の蒸発後の体積および乾燥質量固形分について測定する。抽出残渣材料［１３０または１４０を保持し、さらなる処理のために保存する（工程４参照）。必要または所望に応じて、抽出を数回反復することができる。それは２回以上、３回以上、４回以上等反復することができる。抽出に２段階以上が使用される場合、各段階からの粗カテキン画分を、生成物のために組み合わせてもよく［３２０］、またはカテキン画分のさらなる精製のために保持してもよい（工程４参照）。例えば、図２−工程３は２段階プロセスを示しており、第２段階では、同じ方法および条件を使用する。結果を以下の表７および８に示す。手順は実施例３に見ることができる。
【００８９】
【表７】
【００９０】
【表８】
これらの結果は、ＳＦＥ脱カフェインプロセスによって、残渣中の他の価値のある化合物に影響を及ぼさずに緑茶原料からカフェインが除去されたことを示している。さらに、９５％エタノールを使用する残渣の抽出によって、精製済みテアニンおよび多糖画分のさらなる処理のために使用できるＬ−テアニンおよび水溶性−エタノール不溶性多糖が残渣中に保存される。最終的には、２段階浸出プロセスによって、４つの主なカテキンの濃度（ＰＡ、表８）は、天然緑葉原料中約７〜１２質量％から抽出物中約２６〜３９質量％に増加し、純度は約３．５倍増加する。抽出収率は、最初の緑茶原料に対して１９〜３６質量％の範囲であった。カテキン化学構成成分画分のさらに高い純度は、アフィニティー吸着プロセスクロマトグラフィープロセス（以下参照）を使用して得ることができる。
【００９１】
工程４．アフィニティー吸着抽出プロセス
本明細書で教示されるように、緑茶原料の含水アルコール抽出物（工程３）を固体アフィニティーポリマー吸着樹脂と接触させて、含水アルコール抽出物に含有される活性なカテキンをアフィニティー吸着物に吸着させることによって、緑茶からの高度精製カテキン画分抽出物を得ることができる。続いて、結合した化学構成成分は本明細書で教示される方法によって溶出される。カテキン画分化学構成成分の溶出の前に、アフィニティー吸着物とそれに吸着した所望の化学構成成分を、従来の任意のやり方で抽出物の残りから分離することができ、好ましくは吸着剤および分離物との接触プロセスは、水性抽出物を抽出カラムまたは吸着物質床に通すことによって行われる。さらにカテキン画分化学構成成分の溶出の前に、カフェイン化合物を溶出するがカテキン化合物は溶出しない（精製済みカテキン画分の脱カフェイン）特定の溶媒を使用することによって、アフィニティー吸着物上に吸着した任意のカフェイン化合物をカテキンから分離することができる。
【００９２】
それに限定されるものではないが、緑茶植物材料のカテキン化学構成成分を精製するために、「Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ−２」（Ｒｏｈｍ ＆ Ｈａｓｓ）、「Ｄｕｏｌｉｔｅ Ｓ−３０」（Ｄｉａｍｏｎｄ Ａｌｋａｉ Ｃｏ．）、「ＳＰ２０７」（三菱化学）、ＡＤＳ−５（Ｎａｎｋａｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｔｉａｎｊｉｎ、中国）、ＡＤＳ−１７（Ｎａｎｋａｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｔｉａｎｊｉｎ、中国）、Ｄｉａｌｏｎ ＨＰ２０（三菱、日本）、およびＡｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ７ＨＰ（Ｒｏｈｍ ＆ Ｈａｓｓ）などの様々なアフィニティー吸着物を使用することができる。Ａｍａｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ７ＨＰは、緑茶のカテキン化学構成成分に対する高アフィニティーにより、好ましく使用される。微細網状（ｍａｃｒｏｒｅｔｉｃｕｌａｒ）構造（連続ポリマー相および連続細孔相の両方を含有する）、高表面積、およびその表面の脂肪族性質からの吸着可能特性に由来するものが、５６０〜７１０μｎの粒経を有する非イオン性脂肪族アクリルポリマーである。ポリマー性エステル基を有するこの微細網状構造によって、ＸＡＤ７ＨＰは、フェノール酸（カテキン）への高アフィニティーをもたらす極性化合物を吸着することができる。
【００９３】
吸着剤からカテキン化学構成成分を回収するために様々な溶離溶媒が使用できるが、本発明の一態様では、溶離溶媒は、それに限定されるものではないがメタノール、エタノール、またはプロパノールを含む低分子量アルコールを含む。第２の態様では、溶離溶媒は、低分子量アルコールを水との混合物として含む。第３の態様では、溶離溶媒は、低分子量アルコール、第２の有機溶媒、および水を含む。別の態様では、吸着剤上に吸着したカテキンの脱カフェインに使用される溶離溶媒は、それに限定されるものではないが、１０％エタノール中５％Ｈ２ＳＯ４などの酸性溶媒を含む。したがって２段階溶出プロセスは、緑茶のカテキン化学構成成分画分の精製用に設計されている。第１段階は、酸性溶液を使用して、カフェインの塩基特性およびカテキンの酸特性を利用することによってカラムに吸着した化学構成成分を脱カフェインすることである。第２段階は、エタノール／水溶離溶媒を使用して、脱カフェインカテキンを溶出することである。
【００９４】
緑茶原料は、抽出物を含有する水性カテキン化学構成成分をアフィニティー吸着剤と接触させる前に、それに限定されるものではないが、工程１、２、および３に記載のプロセスなどの１つまたは複数の予備精製プロセスにかけてもよく、またはかけなくてもよい。
【００９５】
本発明で教示されるアフィニティー吸着プロセスを使用することによって、天然植物材料または市販の抽出生成物中に通常存在する他の化学構成成分が殆ど含まれない、緑茶の高度に精製されプロファイルされた脱カフェイン済みカテキン化学構成成分画分が得られる。例えば、本発明で教示されるプロセスは、乾燥質量で９５％を超える全カテキン化学構成成分を含有する精製済みカテキン抽出物を得ることができる。
【００９６】
ポリマーアフィニティー吸着樹脂ビーズを使用する緑茶葉からのカテキンの抽出および精製の一般的説明を、図３−工程４に図示する。この抽出プロセスの原料は、天然緑茶原料［１０］または工程３の９５％エタノール浸出抽出物からのカテキンを含有する水溶液［３２０］であってよい。適切な重量の吸着樹脂ビーズ（吸着樹脂１ｇｍ当たりカテキン１２ｍｇ）を、カラム４１０、４２０に入れる前および後に４〜５ＢＶエタノール［２２０］および４〜５ＢＶ蒸留水［２３０］で洗浄する。清浄な吸着樹脂ビーズを、カラムに充填する［４３０］。次いでカテキン含有水溶液［３２０］を、流量２〜４床体積（ＢＶ）／時間でカラムに入れる［４４０］。カラムが一杯になったら、蒸留水［２３０］を用いてカラムを流量２〜３ＢＶ／時間で洗浄して［４５０］、吸着カテキンから任意の不純物を除去する。流出残渣［５００］および洗浄残渣［５１０］を収集し、質量含有量、カテキン含量、カフェイン含量を測定し、廃棄した。吸着したカフェイン化合物の溶出［４６０］を、アイソクラティック方式で、溶離溶媒［２４０］として１０％エタノール中５％Ｈ２ＳＯ４を用いて、流量２〜４ＢＶ／時間で実施する。溶出液［５２０］を収集し、質量含有量、カテキン含量、カフェイン含量を測定し、廃棄する。この脱カフェイン段階の後、８ＢＶの蒸留水［２３０］を用いて、カラムを流量１０ＢＶ／時間で洗浄する［４７０］。洗浄したもの［５３０］を、それが中性になるまでｐＨ紙によって試験して、収集し、廃棄する。吸着カテキンの溶出［４８０］を、アイソクラティック方式で、溶出溶液［２５０］として８０％エタノール／水溶液を用いて流量２〜４ＢＶ／時間で実施し、溶出液抽出物［５４０］について溶出曲線を記録した。溶出体積４８０は、約１５〜３０分毎に収集することができ、ＨＰＬＣを使用してこれらのサンプルを分析し、固体含量および純度について試験した。結果を表９〜１１に示す。手順は、実施例４に見ることができる。
【００９７】
【表９】
【００９８】
【表１０】
【００９９】
【表１１】
酸性溶出溶媒は、最終生成物中のカフェイン濃度を抽出物の１質量％未満から０．２質量％もの低さに低減するカテキンのさらなる脱カフェインにとって優れたプロセスであることが立証されている。カテキンの精製済み画分は、最初の緑茶原料の１．９質量％の全収率で、純度＞９０％で得ることができる。さらに、使用される最初の緑茶原料に関係なく、カテキン純度＞９５％でＥＧＣＧ濃度が＞６０％まで増加する副画分を得ることもできる。Ｆ１、Ｆ４、およびＪＰＧＴの組合せプロセスのクロマトグラフィー溶出液におけるカテキン純度およびＥＣＧＣプロファイルの概略を、表１２に示す。
【０１００】
【表１２】
他の典型的な実験では、使用溶液は、未加工または最初の緑茶葉原料の工程３の９５％浸出抽出後に得られた透明な水溶液であった。これらの実験では、各段階２時間の２段階で、７０℃において９５％エタノール２５０ｍｌを使用して、未加工緑茶残渣２５ｇｍを浸出抽出した（溶媒／供給物比は２０／１）。この２段階抽出からの２つの上清溶液を混合し、ロータリーエバポレーターを使用してエタノール抽出溶媒を除去した。エタノールの除去（蒸留）後、いくらか固体沈殿物が生じ、それを工程３に記載のように遠心分離および濾過を使用して除去した。上清を収集し、次いで蒸留水を濃縮上清に添加して、最終濃度１６〜３０ｍｇ／ｍｌを達成した。次いで、カテキンを含有するこの透明な水溶液を使用して、工程４のアフィニティー吸着プロセスクロマトグラフィー法を用いてさらに精製した。この工程３の浸出抽出の結果は表１３に見られ、未加工または最初の緑茶葉の浸出を、工程２からのＳＦＥ脱カフェイン済み残渣の浸出と比較する。未加工緑茶植物材料の場合、ＳＦＥ脱カフェイン済み残渣では見られなかった沈殿物がエタノール蒸留中に生じたことに留意されたい。したがってこの沈殿物の遠心分離および濾過によって、全収率は最初の原料に対して３２．８質量％〜２６．９質量％減少した。浸出抽出した未加工緑茶原料からの全収率はより高いが、カテキン化学構成成分の純度は類似している。さらに、カフェイン濃度は、未加工緑茶の浸出抽出生成物において非常に高い。かかる２段階９５％エタノール浸出の結果を、表１３および１４に示す。
【０１０１】
【表１３】
【０１０２】
【表１４】
典型的な吸着実験を、オープンバッチシステムで室温で実施した。ＰＡ ＸＡＤ７ＨＰ〜３０ｇをエタノールで洗浄してモノマーおよび不純物を除去し、次いで１６時間蒸留水に浸して充填した。次いで、清浄なＰＡ樹脂ビーズを１０ｍｍ（ＩＤ）×３５０ｍｍ（Ｌ）のガラスカラムに充填した。濃度１６〜３０ｍｇ／ｍｌを有する水溶液（脱エタノール化浸出溶液）１００ｍｌを、充填したカラムに流量１．８ｍｌ／分、２ＢＶ／時間で入れた。入れた後に蒸留水１５０ｍｌを使用して、カラムを流量１０ＢＶ／時間で洗浄した。次いで１０％エタノール中５％硫酸２００ｍｌを使用して、流量２．２ＢＶ／時間でカラム溶出した（脱カフェイン）。この溶出後、カラムからの洗浄液がｐＨ７に達するまで、蒸留水２５０ｍｌを使用して１０ＢＶ／時間でカラムを洗浄した。次いで８０％エタノール１００ｍｌを使用して、流量２ＢＶ／時間でカラム溶出した（脱吸着）。全処理時間は３００分であった。溶離溶媒の画分を順次収集した。各溶出液画分をＨＰＬＣによってアッセイし、その結果を表１５〜１７に示す。
【０１０３】
【表１５】
【０１０４】
【表１６】
【０１０５】
【表１７】
工程４の、未加工（未脱カフェイン）緑茶植物材料を用いて始めるカテキンのアフィニティー吸着精製では、酸性溶出溶媒を使用して吸着剤へのカテキンの結合を保ちながら、９５％のカフェインを除去することができる。例えば、約１２質量％のカフェインを含有する粗浸出抽出物を、プロセスクロマトグラフィー抽出画分中０．３質量％に脱カフェインすることが可能である。原料中のカフェインの濃度が高いほど、抽出画分を脱カフェインするために多量の酸溶液の溶離溶媒が必要とされる。
【０１０６】
興味深いことに、８０％エタノールを使用するカテキンの溶出によって、抽出画分中の質量％でＥＧＣよりも高い収率のＥＧＣＧ、ＥＣＧ、およびＣが得られる。最高の収率および純度は、０．６〜２ＢＶ画分に見られる。高度に精製された画分の全カテキン純度は、粗浸出抽出物の全カテキン純度の約１．７倍であった。カテキン純度のレベルは、ＳＦＥ脱カフェイン済み残渣の工程４のプロセスクロマトグラフィーで達成したレベルほど高くなかった。しかし、緑茶原料に依存して７１％〜９３％の全カテキン純度で、最初の緑茶原料に対して１１質量％を超える全抽出画分収率が達成される。最終的には、ＥＧＣＧ、ＥＣＧ、およびＣの質量％を選択的に増加し、ＥＧＣを減少させることにより、４つの主なカテキンの化学的分布プロファイルは変えられる。例えばＥＧＣＧは、一般に混合抽出画分の全カテキンの６５質量％を超え、抽出副画分の７５質量％にもなり得る。
【０１０７】
精製済みカテキン画分および副画分中のシュウ酸の分析時には、９５％エタノール浸出原料中にシュウ酸が存在するにも関わらず、これらの画分または副画分のいずれかにおいてシュウ酸を検出することができなかった。実際、シュウ酸は原料溶液の６質量％にもなることが見出された。しかしシュウ酸化合物は、アフィニティー吸着物上には吸着せず、流出物中に見出された。
【０１０８】
工程５．テアニンおよび多糖の水浸出
緑茶の化学構成成分の多糖抽出画分は、「水溶性エタノール不溶性抽出画分」として科学文献に定義されている。Ｌ−テアニンおよび多糖は、両方水溶性である。水溶媒浸出を使用する緑茶植物材料の抽出物からのテアニンおよび多糖抽出の一般的説明を、図４−工程５に図示する（別表１）。原料１４０は、工程３の９５％浸出抽出プロセスからの固体残渣である。この原料は、２段階で浸出抽出される。溶媒は蒸留水２６０である。この方法では、緑茶抽出残渣１４０および抽出溶媒２６０を、抽出容器６００に入れ、加熱し攪拌する。それを１００℃、約８０℃、または約６０〜８０℃に加熱することができる。抽出は、約１時間、約２〜４時間、または約２時間で実施される。上清抽出溶液７００を遠心分離にかけ６１０、濾過し６２０、収集する。残渣６３０を保持し、さらなる処理のために保存する。必要または所望に応じた回数、残渣で抽出を反復することができる。それは２回以上、３回以上、４回以上等であってよい。例えば、図４−工程５は２段階プロセスを示しており、第２段階では同じ方法および条件を使用する。最終残渣［６５０］は破棄した。この抽出工程の一例は、実施例５に見られ、Ｌ−テアニン含量の質量測定およびＨＰＬＣ分析の結果を表１８に示す。
【０１０９】
【表１８】
水浸出プロセスの全収率は、最初の緑茶原料の３．６〜１２．５質量％であった。Ｌ−テアニンの濃度は、浸出抽出物の１３．２〜１８．２質量％であった。最初の緑茶葉原料において８５質量％を超える収率のテアニンを、２段階浸出プロセスで抽出することができる。科学文献と一致して（２９）、他の化学構成成分は大部分が多糖となるはずである。多糖化学構成成分からテアニンを分離するために、さらなる工程６を使用することができる。
【０１１０】
工程６．Ｌ−テアニンおよび多糖画分の精製
水溶媒プロセスを使用する緑茶抽出物からの多糖およびテアニン画分の抽出および精製の一般的説明を、図５−工程６に図示する。原料は、工程５の水浸出抽出からの水浸出上清溶液［７００＋７１０］である。混合溶液を蒸発させて［８００］、６０％の水を除去する。次いで、溶媒の無水エタノール［２８０］を濃縮溶液に添加して、最終エタノール濃度を７５％にする。溶液を静置し、大量の沈殿物［８１０］を観測する。溶液を遠心分離にかけ［８２０］、デカントし［８３０］、テアニン画分のさらなる処理および精製のために上清を収集する［９１０］。沈殿生成物［９００］は精製済み多糖画分であり、これは、多糖について比色（ｃｏｌｏｒｍｅｔｒｉｃ）法を使用し、参照標準として分子量５，０００〜４１０，０００のデキストランを使用することによって分析することができる。抽出多糖画分の純度は、様々な分子量のデキストランに対して約２３〜５０％であり、全収率は最初の天然緑茶葉原料の１．１５質量％である（表１８）。様々なデキストラン当量の純度を組み合わせると、精製済み多糖画分の９０質量％を超える全体的多糖純度と一致する。
【０１１１】
上清溶液のテアニン純度は約３１〜４２％である。より高いレベルのテアニン純度を達成するために、さらなる処理が必要とされる。上清溶液［９１０］を乾燥させる。乾燥生成物を十分な量の蒸留水［２６０］に溶解して、１０％溶液を作製する［８５０］。この溶液に、４体積の無水エタノール［２７０］を添加し混合する。この含水アルコール溶液を約１時間静置し、次いで遠心分離にかけ［８６０］、任意沈殿物［９１０］を破棄する。真空ロータリーエバポレーター［８７０］を使用して、約６０℃で上清［９２０］を濃縮して、８０％溶液を実現する。この８０％溶液を室温に冷却し、次いで４体積の無水エタノール［２８０］を溶液に添加し、それを０℃で２４時間冷蔵する［８８０］。形成される結晶を収集し、６０℃で真空乾燥して［８９０］、精製済みテアニン画分［９３０］を得る。精製済みテアニン画分の収率は、最初の緑茶原料の約０．５１〜１．９５質量％であり、純度は約９０〜９２％である（表１８）。実際の手順は、実施例６に見ることができる。
【０１１２】
緑茶多糖収率は、最初の緑茶葉原料に対して１．２〜８．５質量％であった。多糖画分の純度は、様々な分子量のデキストランに対して２３〜５０％であり、これは、画分中の全体的純度が緑茶多糖化学構成成分の＞９０％であることを示すものであった。数々の様々な実験手法に基付くと、１．２〜８．５質量％の収率は、天然緑茶種原料中の水溶性エタノール不溶性多糖の９０％を超えると結論付けることは実に合理的である。
【０１１３】
緑茶のＬ−テアニン収率は、最初の緑茶原料に対して０．５〜２．０質量％であり、これは最初の原料中約７０％のテアニンであった。９０％のテアニン純度は、これらの方法を使用して実現することができる。
【０１１４】
当技術分野では、溶液からアルコールを除去するための多くの方法が知られている。再利用のためにアルコールを保存することが望ましい場合、抽出後に標準大気圧または減圧下での蒸留によって溶液から除去することができる。このアルコールは再利用することができる。さらに、水溶液またはアルコールが既に除去された溶液、いずれかの溶液から水を除去するための当技術分野で知られている多くの方法も存在する。かかる方法には、それに限定されるものではないが炭酸マグネシウムまたはマルトデキストリンなどの適切な担体上に、それに限定されるものではないが水溶液を噴霧乾燥することが含まれ、あるいは液体を凍結乾燥またはリフラクティブウィンドウ（ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ ｗｉｎｄｏｗ）乾燥することによって乾燥状態にすることができる。
【０１１５】
先に記載の抽出法の実施では、緑茶の最初の乾燥葉原料中に存在する８０％を超える純度の精油化学構成成分を有する９０質量％を超える収率の精油化学構成成分および関連種を、精油ＳＣＣＯ２抽出画分として抽出できるということが見出された（工程１）。工程２（ＳＣＣＯ２脱カフェインプロセス）で教示される方法を使用すると、緑茶植物材料からのカフェインの全収率は、約４．５質量％となり（最初の緑茶原料中に存在するカフェイン化合物の約８５％）、カフェイン抽出物の約２９質量％のカフェイン化学的純度を有する。かかる脱カフェインプロセスによって、脱カフェイン済み緑茶原料中のカフェイン含量は、脱カフェイン済み緑茶材料の０．２質量％未満に減少する。さらに、本発明で教示される方法を使用して、精製済みカテキン、テアニン、および多糖画分を得るためのさらなる処理に使用できる価値のあるカテキン、テアニン、および多糖化学構成成分を原料中に維持しながら、緑茶原料の８０％脱カフェインを達成することができる。
【０１１６】
本発明の工程３で教示される方法を使用して、最初の緑茶種原料から１９〜３１質量％の収率のエタノール浸出画分が達成される。カテキン化学構成成分の収率は、最初の緑茶原料に存在するカテキンの９０質量％を超える（表８およびＡ１−別表１参照）。さらに、エタノール浸出プロセスによって、４つの主なカテキンの濃度（純度）は、研究された天然緑茶葉原料中７〜１２質量％から、カテキン抽出画分中約２５〜３９質量％に増加し、カテキンの濃度（ＥＣＧＣ、ＥＣＧ、ＥＧＣ、およびＣの合計）が３．５倍増加する。最終的にエタノール浸出抽出によって、固体残渣中にテアニンおよび多糖化合物が保存され、それらは、精製済みテアニンおよび多糖画分（工程５および６）のさらなる処理のために使用することができる。
【０１１７】
本発明の工程４に教示される方法（アフィニティー吸着抽出プロセス）を使用すると、抽出画分の９０乾燥質量％を超える純度のカテキン画分を得ることができる。９５％エタノール浸出抽出原料から５６〜８６％のカテキンを抽出することが可能である。これは、カテキン化学構成成分参照としてＥＣＧＣ、ＥＣＧ、ＥＧＣ、およびＣを使用する天然緑茶種植物材料に見られるカテキン化学構成成分の５０〜７７％収率に等しい。これらを参照として使用してこのフェノール酸画分のＨＰＬＣ分析に基付くと、フェノール酸化学構成成分の純度は、フェノール酸画分抽出生成物の約４０％となる。さらに酸性溶出溶媒は、最終カテキン画分生成物中のカフェインを抽出画分の１％未満〜０．２質量％もの低さに低減する精製済みカテキン画分のさらなる脱カフェインにとって優れたプロセスであることが立証されている。さらに、ＥＧＣＧ濃度が６５〜７５質量％に増加し、カテキン純度が抽出副画分の９５質量％を超える副画分を得ることができる。このデータは、抽出画分中のＥＧＣＧ、ＥＣＧ、およびＣの質量％の選択的増加ならびにＥＧＣの減少によってカテキン抽出画分をプロファイルするアフィニティー吸着プロセスクロマトグラフィーの能力を支持するものである。
【０１１８】
工程５に教示される方法（水浸出プロセス）を使用すると、最初の緑茶葉原料に対して約３．６質量％という高収率の水溶性化学構成成分が得られる。この粗抽出物中のＬ−テアニン濃度は約１７質量％である。残りの水溶性化合物は大部分が多糖であり、これは、６０％エタノール沈殿を使用すると緑茶葉中の多糖濃度が約２．４２質量％となり、純度が８６．８％であったと報告した他の研究結果（２９）と一致するものである。
【０１１９】
本発明の工程６に教示される方法（Ｌ−テアニンおよび多糖の抽出および精製プロセス）を使用すると、水溶性エタノール不溶性多糖の全収率は、最初の原料に対して約１．２質量％である。多糖抽出画分の純度は、参照標準として様々な分子量のデキストランを使用する比色法に基付いて約５６〜７６％である。これらのデータは、９５％を超える全多糖純度と一致する。
【０１２０】
さらに工程６に教示される方法を使用すると、Ｌ−テアニンの収率は、最初の緑茶葉原料に対して約０．８質量％であり、これは最初の原料中に存在するＬ−テアニンの５５％を超えている。これらの方法を使用して、精製済みテアニン抽出画分の９０質量％のテアニン純度を実現することができる。
【０１２１】
食品および医薬品
本発明の食品の一形態として、任意選択の形態、例えば顆粒状態、粒状、ペースト状、ゲル状、固体状態、または液体状態に配合することができる。これらの形態では、食品に添加できる当業者に従来知られている様々な種類の物質、例えば結合剤、崩壊剤、増粘剤、分散剤、再吸収促進剤、検査薬、緩衝剤、界面活性剤、溶解助剤、保存剤、乳化剤、等張剤、安定化剤、またはｐＨ調節剤等が任意選択で含有され得る。食品に添加されるエルダーベリー抽出物の量は特に限定されず、例えば体重約６０ｋｇの成人によって摂取される量としては１日当たり約１０ｍｇ〜５ｇ、好ましくは５０ｍｇ〜２ｇであってよい。
【０１２２】
特に、保険機能食品等の保存用食品として使用される場合、本発明の所定の効果が十分に示されるような量で本発明の有効成分を含有することが好ましい。
【０１２３】
本発明の医薬品は、例えば錠剤、顆粒、粉剤、カプセル剤等の固体薬剤、または注入剤等の液体薬剤として、従来知られている方法に従って任意選択で調製することができる。これらの医薬品には、例えば結合剤、崩壊剤、増粘剤、分散剤、再吸収促進剤、検査薬、緩衝剤、界面活性剤、溶解助剤、保存剤、乳化剤、等張剤、安定化剤、またはｐＨ調節剤などの一般に使用される任意の材料を配合することができる。
【０１２４】
医薬品としての有効成分（緑茶抽出物）の投与量は、種類、剤形、患者の年齢、体重、または適用される症候等に依存して変わり得、例えば経口投与される場合、体重約６０ｋｇの成人については１日１回または数回投与され、１日当たり約１０ｍｇ〜５ｇ、好ましくは約５０ｍｇ〜２ｇの量で投与される。有効成分は、緑茶抽出物の１つまたはいくつかの成分であってよい。
【０１２５】
本方法はまた、１日当たり２回以上、１日当たり３回以上、１日当たり４回以上、および１日当たり１〜１５回の範囲でかかる抽出物を投与することを含む。かかる投与は、連続的にある日数、週数、月数、もしくは年数の間、毎日行うことができ、または特定の状態を治療もしくは予防するために特定の回数で行うことができる。例えばあるヒトは、精神集中、認識、および記憶を強化するため、または２型糖尿病を予防および治療するため、心臓血管疾患卒中を予防するため、または胃腸障害を治療するため、または痛風を含む炎症性障害および関節炎を治療するため、または一般的な風邪、細菌感染および真菌感染症を治療するために、少なくとも１日１回数年間、緑茶種抽出物を投与され得る。
【０１２６】
前述の説明は、本発明の実施に現在企図されている最良の態様を含む。この説明は、本発明の一般的原理を例示するためのものであり、限定的な意味と解釈されるべきではない。本発明は、以下の実施例によってさらに例示されるが、これらは本発明の範囲に制限を付与するものと決して解釈されるべきではない。それとは逆に、本明細書の説明の読後に本発明の精神から逸脱することなく当業者にそれら自体を提案できる様々な他の実施形態、改変形態、およびそれらの等価物を手段として用いることができることを明確に理解されたい。
【０１２７】
本明細書で使用されるすべての用語は、当業者によって通常認められている用法で解釈されるとみなされる。本明細書に引用した特許および特許出願または参考文献は、すべて参照によってその全体が組み込まれる。
【実施例】
【０１２８】
材料
植物：本発明では中国緑茶４種および日本緑茶１種を使用した。
【０１２９】
Ｆ１：中国緑茶葉は、シンガポールＮａｍ Ｗａｎ Ｔｅａ Ｃｏ Ｐｔｅ Ｌｔｄから購入した。
【０１３０】
Ｆ２：高級中国緑茶「ＢａｉｆｕＴｅａ」は、中国Ｊｉａｎｇｓｕ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ製のものとした。
【０１３１】
Ｆ３：高級中国緑茶「Ｋａｉ Ｈｕａ Ｌｏｎｇ Ｄｉｎｇ」は、Ｚｈｅｊｉｎｇ Ｋａｉ Ｈｕａ Ｃｏ．製の春摘みのものとした。
【０１３２】
Ｆ４：高級中国緑茶「Ｋａｉ Ｈｕａ Ｌｏｎｇ Ｄｉｎｇ」は、Ｚｈｅｊｉｎｇ Ｋａｉ Ｈｕａ Ｃｏ．製の秋摘みのものとした。
【０１３３】
ＪＰＧＴ：高級日本緑茶。
【０１３４】
【表１９】
有機溶媒
ＨＰＬＣ用アセトニトリル（７５−０５−８）、勾配グレード≧９９．９％（ＧＣ）（０００６８７）；ヘキサン（１１０−５４−３）、９５＋％、分光光度グレード（２４８８７８）、４．８％イソプロパノールで変性したエタノール（０２８５３）；エタノール（６４−１７−５）、無水（０２８８３）；メタノール（６７−５６−１）、９９．９３％、ＡＣＳ ＨＰＬＣグレード、（４３９１９９３）；および水（７７３２−１８−５）、ＨＰＬＣグレード、（９５３０４）；すべてＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏから購入した。
【０１３５】
酸および塩基
ギ酸（６４−１８−６）、５０％溶液（０９６７６）；フェノール（１０８−９５−２）（Ｐ３６５３）；硫酸（７６６４−９３−９）、ＡＣＳ試薬、９５〜９７％（４４７１９）；トリフルオロ酢酸（７６−０５−１）、９９．８％分光光度グレード（３０２０３１）リン酸（７６６４−３８−２）、８５％水溶液（４３８０８１）；すべてＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．から購入した。リン酸カリウム、一塩基性（７７７８−７７−０）＞９９％純度（２０５９２５０００、Ｌｏｔ番号：Ａ０１９８４２６０１）は、Ａｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｉｃｓ Ｃｏ．から購入した。
【０１３６】
化学物質参照標準
（＋）−カテキン（１５４−２３−４）、純度９５％（０３３１０）；（−）−エピカテキン（４９０−４６−０）、純度９３．６％（０５１２５）；（−）−エピカテキンガレート（１２５７−０８−５）、純度９９％（０５１３５）；（−）−エピガロカテキン（９７０−７４−１）、純度９８．３％（０５１４５）；（−）−エピガロカテキンガレート（９８９−５１−５）、純度９４％（０５１５１）；Ｌ−テアニン（３０８６−６１−６）、純度：９９．０％（２０２５０−００１）；すべてＣｈｒｏｍａｄｅｘ（ｗｗｗ．ｃｈｒｏｍａｄｅｘ．ｃｏｍ）から購入した。カフェイン（５８−０８０２）、純粋、無水＞９９％（２７６００）；テオブロミン（８３−６７−０）、純度＞９９％（Ｔ４５００）；およびクロロゲン酸（３２７−９７−９）、最小９５％滴定（Ｃ３８７８）はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．から購入した。ＤＩＮによって認定されたデキストラン標準５０００（００２６９）、５０，０００（００８９１）、および４１０，０００（００８９５）はＦｌｕｋａ Ｃｏ．から購入した。シュウ酸（１４４−６２−７）、９８％純度（１９４１３１）はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．から購入した。標準物質の構造を表２０に示す。
【０１３７】
【表２０】
方法
ＨＰＬＣ法
カテキンおよびアルカロイド分析
クロマトグラフシステム：ＬＣ１０ＡＤＶＰポンプとＳＰＤ−Ｍ１０ＡＶＰフォトダイオードアレイ検出器を備えた島津高速液体クロマトグラフＬＣ−１０ＡＶＰシステム。得られた抽出生成物を、逆相ＪｕｐｉｔｅｒＣ１８カラム（２５０×４．６ｍｍＩ．Ｄ．、５μ、３００Å）（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、パート番号：００Ｇ−４０５３−Ｅ０、シリアル番号：２２１７５２０−３、バッチ番号：５２４３−１７）で測定した。移動相は、Ａ（０．５％（ｖ／ｖ）ギ酸水溶液）およびＢ（アセトニトリル）からなっていた。勾配を以下のようにプログラムした。最初の６分以内にＡは１００％を維持し、６〜１０分では、溶媒Ｂは０％〜１２％に直線的に増加し、１０〜３５分ではＢ直線１２％〜２１％、次いで３５〜４０分ではＢ直線２１％〜２５％、次いで４０〜５０分ではＢ直線は１００％。注入量は１０μｌであり、移動相の流量は１ｍｌ／分であった。カラム温度は５０℃であった。
【０１３８】
Ｃ（カテキン）、ＥＧＣ（エピガロカテキン）、ＥＣＧ（エピカテキンガレート）、ＥＧＣＧ（エピガロカテキンガレート）、カフェイン、テオブロミン、クロロゲン酸のメタノール保存溶液を、濃度１ｍｇ／ｍｌで調製した。１ミリリットル分量の標準溶液を、１０ｍｌ容量のフラスコに入れて、標準混合溶液を得た。次いで、参照標準混合溶液を段階的に希釈して、それぞれ最終濃度０．５、０．２、０．１、０．０５、および０．０１ｍｇ／ｍｌの一連の溶液を得た。これらの５つの濃度で標準曲線を作成し、対応する濃度に対して線形回帰を使用してピーク面積をプロットして標準曲線を作成した。結果を表２１にまとめる。
【０１３９】
【表２１】
１理論段はＮ＝１６×（ｔＲ／ｗ）２によって算出した。ｔＲは保持時間であり、ｗはピーク幅である。ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｍｎ−ｎｅｔ．ｃｏｍ／ｗｅｂ％５ＣＭＮ−ＷＥＢ−ＨＰＬＣＫａｔａｌｏｇ．ｎｓｆ／ＷｅｂＥ／ＧＲＵＮＤＬＡＧＥＮ 。
【０１４０】
テアニン分析
テアニン分析は、逆相ＪｕｐｉｔｅｒＣ１８カラム（２５０×４．６ｍｍＩ．Ｄ．、５μ、３００Å）（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、パート番号：００Ｇ−４０５３−Ｅ０、シリアル番号：２２１７５２０−３、バッチ番号：５２４３−１７）で実施した。移動相を濃度０．１％のトリフルオロ酢酸で調節した。移動相の流量は１ｍｌ／分であった。検出器を波長２０３ｎｍに設定した。
【０１４１】
シュウ酸分析
シュウ酸分析は、逆相ＪｕｐｉｔｅｒＣ１８カラム（２５０×４．６ｍｍＩ．Ｄ．、５μ、３００Å）（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、パート番号：００Ｇ−４０５３−Ｅ０、シリアル番号：２２１７５２０−３、バッチ番号：５２４３−１７）で実施した。移動相は、Ａ（０．５％ＫＨ２ＰＯ４（ｗ／ｖ）水溶液）およびＢ（アセトニトリル）からなっていた。０．５％ＫＨ２ＰＯ４（ｗ／ｖ）水溶液の移動相を、蒸留水に固体ＫＨ２ＰＯ４を溶解することによって調製した。次いで、Ｈ３ＰＯ４溶液１．０ｍｏｌ／ＬでＰＨ２．８０に調節した。勾配を以下のようにプログラムした。溶媒Ｂは１５分で１０％〜４０％に直線的に増加し、次いでさらなる５分間で４０％〜１０％に減少した。注入量は１０μｌであり、移動相の流量は１ｍｌ／分であった。カラム温度は２５℃であった。検出波長は２６２ｎｍであった。異なるシュウ酸水中濃度０．１ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌをアッセイした。これらの濃度で標準曲線を作成し、対応する濃度に対して線形回帰を使用してピーク面積をプロットして、標準曲線を作成した。サンプル溶液中のシュウ酸含量を、サンプル溶液のピーク面積と、知られている標準のピーク面積とを比較することによって定量化した。
【０１４２】
ＧＣ−ＭＳ法
ＧＣ−ＭＳ分析は、島津ＧＣＭＳ−ＱＰ２０１０システムを使用して実施した。このシステムは、高速ガスクロマトグラフ、直結ＧＣ／ＭＳインターフェース、電子衝撃（ＥＩ）イオン源と独立温度制御、四重極質量分析器等を含む。このシステムは、データ収集および実施後分析のためのＧＣＭＳ溶液Ｖｅｒ．２ソフトウェアで制御される。Ａｇｉｌｅｎｔ Ｊ＆Ｗ ＤＢ−５溶融シリカ毛細管カラム（３０ｍ×０．２５ｍｍ ｉ．ｄ．、０．２５μｍフィルム厚さ）（カタログ：１２２５０３２、シリアル番号：ＵＳ５２８５７７４Ｈ）で、以下の温度プログラムを使用して分離を実施した。最初の温度を６０℃で１分間保持し、次いで速度３℃／分で１８０℃に上昇し、３５分間保持し、全実施時間は７６分であった。サンプル注入温度を２２０℃とし、サンプル１μｌを、スプリットレスモードの自動注入器によって１分間注入した。キャリアガスはヘリウムとし、流量は圧力４０．１ＫＰａで制御した。かかる圧力下では、流量は０．７９ｍｌ／分であり、直線速度は３２．５ｃｍ／分であった。ＭＳイオン源温度は２３０℃であり、ＧＣ／ＭＳインターフェース温度は２３０℃であった。ＭＳ検出器を、５０ｍ／ｚおよび５００ｍ／ｚの間で、走査速度１０００ＡＭＵ／秒で走査した。溶媒カットオフ温度は３．５分であった。
【０１４３】
多糖分析
分光光度計システム：この研究では島津ＵＶ−１７００紫外線可視分光光度計（１９０〜１１００ｎｍ、１ｍｍ分解能）を使用した。多糖分析には、比色法（Ｄｕｂｏｉｓ，Ｍ．、Ｇｉｌｌｅｓ，Ｋ．Ａ．、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、Ｊ．Ｋ．、Ｒｅｂｅｒｓ，Ｐ．Ａ．およびＳｍｉｔｈ，Ｆ．、Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｕｇａｒｓ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９５６年、２８巻３号、３５０〜３５６頁）を使用した。デキストラン（Ｍｗ＝５０００、５０，０００、および４１０，０００）保存溶液０．１ｍｇ／ｍｌを作成する。保存溶液０．０８、０．１６、０．２４、０．３２、０．４０ｍｌを取り、蒸留水で体積０．４ｍｌにする。次いで５％のフェノール溶液０．２ｍｌおよび濃硫酸１ｍｌに添加する。混合物を１０分間静置した後、ＵＶ走査を実施した。最大吸収は４８８ｎｍで見られた。次いで波長を４８８ｎｍに設定し、各サンプルについて吸収度を測定する。結果を表２２に示す。デキストラン溶液のそれぞれについて、以下のように標準較正曲線を得た。デキストラン５０００、吸収度＝０．０１９１９＋０．０２７７８２Ｃ（μｇ）、Ｒ２＝０．９７（Ｎ＝５）；デキストラン５０，０００、吸収度＝０．００７５７１４＋０．０３２１９６Ｃ（μｇ）、Ｒ２＝０．９６（Ｎ＝５）；およびデキストラン４１０，０００、吸収度＝０．０３４８１＋０．０３６２９３Ｃ（μｇ）、Ｒ２＝０．９８（Ｎ＝５）。
【０１４４】
【表２２】
緑茶抽出物のＤＡＲＴ−ＭＳ分析
ＪＥＯＬ ＡｃｃｕＴＯＦ−ＤＡＲＴ質量分析計（Ｊｅｏｌ ＵＳＡ、Ｐｅａｂｏｄｙ、ＭＡ）を、緑茶抽出物の質量分析で使用した。この飛行時間型（ＴＯＦ）質量分析計技術は、サンプル調製を必要とせず（または必要としても最小限）質量単位０．００００１までの精度で質量が得られる。正イオンモード（ＤＡＲＴ＋）では、ニードル電圧を３５００Ｖに、発熱体を３００℃に、電極１を１５０Ｖに、電極２を２５０Ｖに、ヘリウムガス流を１分当たり３．６９リットル（ＬＰＭ）に設定した。質量分析計には、以下の設定を取り込んだ。オリフィス１を２０Ｖに、リングレンズ電圧を５Ｖに、オリフィス２を５Ｖに設定する。分解能を得るために、ピーク電圧を１０００Ｖに設定し約１００ｍ／ｚで開始した。マイクロチャネルプレート検出器（ＭＣＰ）電圧を２５５０Ｖに設定した。ＰＥＧ６００の１０％溶液を使用して、各サンプルについて較正を内部で実施し、必要な質量範囲１００〜１０００質量単位全体にマスマーカーを提供した。
【０１４５】
一方の端が閉じられたホウケイ酸ガラス融点毛細管を使用して、緑茶サンプルをＤＡＲＴヘリウムプラズマに粉末として入れた。サンプルは、ＴＯＦへの送達を最大限にするＨｅプラズマビームに均質な表面積を曝露させることができる毛細管上の薄膜として集まる。分析１回当たり約３〜５秒間、毛細管をＨｅプラズマ中に保持する。分析中にはサンプルの熱分解は見られなかった。
【０１４６】
負イオンモード（ＤＡＲＴ−）では、ＤＡＲＴおよびＡｃｃｕＴＯＦ−ＭＳを負イオンモードに切り替えた。ニードル電圧は３５００Ｖ、発熱体は３００℃、電極１は１５０Ｖ、電極２は２５０Ｖ、ヘリウムガス流は３．６９ＬＰＭであった。質量分析計には、以下の設定を取り込んだ。オリフィス１を−２０Ｖに設定し、リングレンズ電圧を−５Ｖに設定し、オリフィス２を−５Ｖに設定する。負イオンモードにおいて低ｍ／ｚ範囲の適切な分解能を実現するために、ピーク電圧を６００Ｖに設定した。ＭＣＰ電圧を２６００Ｖに設定した。サンプルを正イオンモードと正確に同じやり方でＤＡＲＴに入れた。ペルフルオロカルボン酸溶液を使用して、各サンプルについて較正を内部で実施した。
【０１４７】
ＪＥＯＬ ＡｃｃｕＴＯＦ ＤＡＲＴ−ＭＳを備えた元素組成および同位体マッチングプログラムによって分子式を確認した。文献に基付いて、緑茶構成成分の検索可能なデータベースを開発した。質量スペクトルとしての全化学物質の識別（識別済みおよび未識別）は、９０％を超える信頼水準で割り当てられる。
【０１４８】
（実施例１）
工程１の実施例：緑茶精油の単一工程のＳＦＥ抽出および精製
すべてのＳＦＥ抽出を、圧力および温度をそれぞれ最大６９０バールおよび２００℃に設計したＳＦＴ２５０（Ｓｕｐｅｒｃｒｉｔｉｃａｌ Ｆｌｕｉｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗａｒｋ、Ｄｅｌａｗａｒｅ、ＵＳＡ）で実施した。この装置は、動的または静的モードで操作する柔軟性を伴って、超臨界条件における簡単で効果的な抽出を可能にする。この装置は、オーブン、ポンプおよび制御、ならびに収集モジュールの３つのモジュールからなる。オーブンは、１つの予熱カラムおよび１つの１００ｍｌの抽出容器を有する。ポンプモジュールには、３００ｍｌ／分の一定の流量の圧縮空気駆動式ポンプが備えられている。収集モジュールは４０ｍｌのガラスバイアルであり、抽出生成物を回収するためにキャップおよび隔壁で封止される。それには、マイクロメーターバルブおよび流量計がさらに備えられている。抽出容器の圧力および温度はモニタされ、＋／−３バールおよび＋／−１℃以内で制御される。
【０１４９】
典型的な実験実施例では、１４０メッシュスクリーンのふるいにかけた１０５μｍを超える寸法の茶切断緑茶葉２５グラムを、各実験毎に１００ｍｌの抽出容器に入れた。オーブンを所望の温度に予熱した後、充填された容器を搭載した。容器をオーブンに接続した後、抽出系をＣＯ２で加圧することによって（８５０ｐｓｉｇ）漏出について該系を試験し、パージした。この系を閉じ、空気駆動液体ポンプを使用して所望の抽出圧力に加圧した。次いで、該系を平衡のために〜３分間静置した。サンプリングバイアル（４０ｍｌ）を秤量し、サンプリングポートに接続した。５ＳＬＰＭ（９．８ｇ／分）の速度でＣＯ２を流すことによって抽出を開始したが、この速度は絞り弁で制御される。使用した全ＣＯ２と搭載した未加工材料の重量の重量比として定義される溶媒／供給物比を算出した。抽出プロセス中、抽出サンプルを５分毎に秤量した。サンプル重量が２つの秤量測定値間で５％を超えて変化しなくなったとき、抽出が終了したと推定した。収率は、全抽出物と未加工原料の供給物の重量比と定義した。
【０１５０】
この実験実施例では、温度が４０℃に設定され、圧力が２００バールに設定されるように抽出条件を設定した。ＣＯ２流量は９．８ｇ／分であった。
【０１５１】
（実施例２）
工程２の実施例：緑茶植物材料の単一工程のＳＦＥ脱カフェイン
すべてのＳＦＥ抽出を、ＳＦＴ２５０（Ｓｕｐｅｒｃｒｉｔｉｃａｌ Ｆｌｕｉｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗａｒｋ、Ｄｅｌａｗａｒｅ、ＵＳＡ）で実施した。典型的な実験実施例では、蒸留水共溶媒２５ｇｍで湿潤した精油抽出済み茶の切断緑茶葉２５グラムの残渣を、各実験毎に１００ｍｌの抽出容器に入れた。オーブンを所望の温度に予熱した後、充填された容器を搭載した。容器をオーブンに接続した後、抽出系をＣＯ２で加圧することによって（８５０ｐｓｉｇ）漏出について該系を試験し、パージした。この系を閉じ、空気駆動液体ポンプを使用して所望の抽出圧力に加圧した。次いで、該系を平衡のために〜３分間静置した。サンプリングバイアル（４０ｍｌ）を秤量し、サンプリングポートに接続した。５ＳＬＰＭ（９．８ｇ／分）の速度でＣＯ２を流すことによって抽出を開始したが、この速度は絞り弁で制御される。毎分、その系に共溶媒３ｍｌを注入した。抽出時間は４時間であった。使用した全ＣＯ２と搭載した未加工材料の重量の重量比として定義される溶媒／供給物比を算出した。収率は、全抽出物と未加工原料の供給物の重量比と定義した。抽出条件は７０℃および５００バールに設定した。
【０１５２】
（実施例３）
工程３の実施例：９５％エタノール浸出抽出
緑茶葉材料のカテキン化学構成成分の、２段階溶媒抽出物の典型的な実施例は以下の通りである。原料は、工程２のＳＣＣＯ２脱カフェインからの茶切断緑茶葉ＳＦＥ残渣または未加工緑茶葉原料２５ｇｍとした。溶媒は、９５％エタノール２５０ｍｌとした。この方法では、原料および９５％エタノール２５０ｍｌを、１つの５００ｍｌの抽出容器に個々に入れ、温水浴中、７０℃で２時間混合した。保持粒経４〜８μｍを有するＦｉｓｈｅｒｂｒａｎｄ Ｐ４濾紙を使用して抽出溶液を濾過し、３０００ｒｐｍで２０分間遠心分離にかけ、さらなる抽出のために微粒子残渣を使用した。収率算出およびＨＰＬＣ分析のために濾液（上清）を収集した。段階１の残渣を、前述の方法を使用して２時間抽出した（段階２）。上清抽出物を混合し、ロータリーエバポレーターを使用してエタノールを除去した。カテキン画分のさらなる精製が望ましい場合、アルコールを含まない粗カテキン抽出生成物を、工程４の処理で蒸留水２５０ｍｌに溶解する。段階２の抽出の残渣は、テアニンおよび多糖画分のさらなる処理と同じようにした（工程５参照）。
【０１５３】
（実施例４）
工程４の実施例 カテキン画分のアフィニティー吸着抽出
典型的な実験では、使用溶液は工程３の緑茶の２段階９５％エタノール浸出抽出の透明な水溶液であった。これらの実施例では、工程３に記載のように７０℃で９５％エタノール２５０ｍｌを使用して（溶媒と供給物比２０／１）、緑ＳＦＥ脱カフェイン済み残渣２５ｇｍを２段階浸出抽出した。２段階抽出物を混合し、ロータリーエバポレーションを使用してエタノールを除去した。次いで蒸留水を添加して、溶液の最初の濃度を再構成した（体積５００ｍｌ）。
【０１５４】
アフィニティー吸着ポリマー樹脂はＸＡＤ７ＨＰであった（別表１参照）。アフィニティー吸着物３０ｇｍを、ＩＤ１０ｍｍおよび長さ３５０ｍｍのガラスカラムへの充填前および充填後に、９５％エタノール（４〜５ＢＶ）および蒸留水（４〜５ＢＶ）で予め洗浄した。吸着剤のＢＶ（床体積）は３５ｍｌであった。溶液中濃度＝４．８〜９．６ｍｇ／ｍｌを有する水溶液１００ｍｌ（脱エタノール化工程３の浸出溶液）を、流量１．２ｍｌ／分（２ＢＶ／時間）で充填したカラムに入れた。搭載時間は８５分であった。ロードしたカラムを、流量１０ＢＶ／時間、洗浄時間２５分で蒸留水１５０ｍｌを用いて洗浄した。ロードしたカラムを脱カフェインするために、１０％エタノール中５％のＨ２ＳＯ４、１００ｍｌを使用して、カフェイン化合物を流量２．２ｍｌ／分（２ＢＶ／時間）で溶出した。溶出液を破棄した。次いで蒸留水２５０ｍｌを使用して、流量６ｍｌ／分（１２ＢＶ／時間）で、または洗浄溶液が中性ｐＨになるまで、カラムを洗浄した。８０％エタノール１００ｍｌを使用して、流量１．２ｍｌ／分（２ＢＶ／時間）、溶出時間８５分で、ロードしたカラムからカテキンを溶出した。溶出中６画分（Ｆ１〜Ｆ６）を、それぞれ０〜０．７（Ｆ１）、０．８〜１．０（Ｆ２）、１．０〜１．１（Ｆ３）、１．１〜１．３（Ｆ４）、１．３〜１．６（Ｆ５）、および１．６〜３（Ｆ６）ＢＶで収集した。次いで、無水エタノール３ＢＶを使用して、カラム上の残りの化学物質を流量３．６ＢＶ／時間で清浄にし、次いで蒸留水３ＢＶを用いて３．８ＢＶ／時間で洗浄した。使用物、流出物、洗浄液、およびカフェイン溶出液をすべて収集し、質量含有量について測定し、カテキン（ＥＧＣＧ、ＥＧＣ、ＥＣＧ、Ｃ）、カフェイン、テオブロミン、およびクロロゲン酸を測定するために、ＨＰＬＣを使用して分析した。各溶出画分を収集し、ＨＰＬＣによって分析した。
【０１５５】
（実施例５）
工程の実施例 多糖およびテアニンの抽出のための水浸出プロセス
水浸出プロセスの典型的な実験実施例では、工程３の９５％エタノール浸出プロセスからの残渣２０ｇｍおよび蒸留水４００ｍｌを、５００ｍｌの抽出容器に別々に入れ、７０℃の水浴中で２時間混合する。透明な最上層をデカントし、固体残渣の第２段階の抽出物を、同じ方法を使用して蒸留水４００ｍｌで抽出した。２段階抽出溶液を２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離にかけ、ＦｉｓｈｅｒｂｒａｎｄＰ４濾紙（保持粒経４〜８μｍ）で濾過した。２段階でデカントした上清溶液を収集し、テアニン含量の収率算出およびＨＰＬＣ分析のために混合した。
【０１５６】
（実施例６）
工程６の実施例 多糖画分およびテアニンの抽出および精製
緑茶の水溶性エタノール不溶性精製済み多糖画分化学構成成分およびテアニン化学構成成分の溶媒抽出および沈殿の典型的な実験実施例は以下の通りである。工程３の２段階９５％エタノール浸出抽出からの固体残渣２０ｇｍを、工程５に先に記載したように２段階の蒸留水浸出を使用して抽出した。工程５の２段階抽出溶液を混合した。真空ロータリーエバポレーションを使用して、６０％の水溶媒を除去して透明な上清抽出溶液を濃縮した。次いで無水エタノールを添加して、最終エタノール濃度を７５％にした。この溶液を１時間静置し、沈殿物を観測した。抽出溶液を２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離にかけ、上清をデカントし、凍結乾燥させ、さらなる処理のために保存した。多糖沈殿物を収集し、凍結乾燥させた。乾燥多糖画分を秤量し水に溶解して、参照標準としてデキストランを使用して比色法で多糖純度を分析した。さらに、ＡｃｃｕＴＯＦ−ＤＡＲＴ質量分析を使用して、多糖画分を含む化合物の分子量をさらにプロファイルした。結果を図６〜１１に示す。
【０１５７】
Ｌ−テアニンを含有する乾燥した上清生成物を蒸留水に溶解して、１０％溶液を作製した。この溶液に無水エタノール４体積を添加し、混合し、１時間静置した。次いで溶液を６，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離にかけ、デカントした。沈殿物を破棄した。収集した上清溶液を、真空ロータリーエバポレーションを使用して６０℃で８０％エタノール溶液に濃縮した。この８０％エタノール溶液を室温に冷却した。次いで、エタノール４体積をこの溶液に添加した。この溶液を２４時間０℃の冷蔵庫に入れて、テアニン化合物を結晶化させた。溶液を２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離にかけ、次いで結晶を収集し、真空下６０℃で乾燥させた。
【０１５８】
（実施例７）
以下の成分を配合のために混合する。
【０１５９】
【表２３】
緑茶の新規抽出物は、天然根茎材料または従来の抽出生成物に見られるよりも高い質量％で、精製済み精油画分、カテキン画分、テアニン画分、および多糖画分を含む。配合物は、任意の経口用剤形にすることができ、所望の生理学的、心理学的、医学的効果（抗酸化、酸素フリーラジカル捕捉、およびニトロソ化阻害活性、免疫増強、抗骨粗鬆症、心臓血管疾患予防および治療、脳血管疾患予防および治療、コレステロール低下活性、癌の予防および治療、ＨＩＶおよびウィルス疾患治療の治療、減量および熱産生、老化予防、糖尿病の管理、記憶および認識強化、不安軽減、ならびに気分高揚）に対して、必要に応じて毎日または１日当たり１５回まで投与することができる。
【０１６０】
（実施例８）
以下の成分を以下の配合のために混合する。
【０１６１】
【表２４】
緑茶の新規抽出組成物は、天然植物材料または従来の抽出生成物に見られるよりも高い質量％で、精製済み精油画分、カテキン、テアニン、および多糖化学構成成分画分を含む。配合物は、任意の経口用剤形にすることができ、所望の生理学的、心理学的、医学的効果に対して、必要に応じて１日当たり１５回まで安全に投与することができる。
【０１６２】
引用参考文献：
【０１６３】
【化１】
【０１６４】
【化２】
【図面の簡単な説明】
【０１６５】
【図１】本発明の精油の超臨界二酸化炭素抽出（工程１）および緑茶の脱カフェイン（工程２）の例示的略図である。
【図２】本発明の粗緑茶カテキン化学構成成分画分のエタノール抽出の例示的概略図である。
【図３】本発明のアフィニティー吸着抽出プロセスの例示的略図である。
【図４】本発明のＬ−テアニンおよび多糖の水浸出抽出の例示的略図である。
【図５】本発明のＬ−テアニンおよび多糖画分の精製の例示的略図である。
【図６】本方法の工程６からの緑茶多糖画分のＡｃｃｕＴＯＦ−ＤＡＲＴ質量スペクトル（正イオンモード）のグラフである。
【図７】本方法の工程６からの緑茶多糖画分のＡｃｃｕＴＯＦ−ＤＡＲＴ質量スペクトル（負イオンモード）のグラフである。
【図８】本方法の工程６からの緑茶多糖画分のＡｃｃｕＴＯＦ−ＤＡＲＴ質量スペクトル（正イオンモード）のグラフである。
【図９】本方法の工程６からの緑茶多糖画分のＡｃｃｕＴＯＦ−ＤＡＲＴ質量スペクトル（負イオンモード）のグラフである。
【図１０】本方法の工程６からの緑茶多糖画分のＡｃｃｕＴＯＦ−ＤＡＲＴ質量スペクトル（正イオンモード）のグラフである。
【図１１】本方法の工程６からの緑茶多糖画分のＡｃｃｕＴＯＦ−ＤＡＲＴ質量スペクトル（負イオンモード）のグラフである。
【図１２】市販の緑茶（Ｋａｉ Ｈｕａ Ｌｏｎｇ Ｄｉｎｇ）のＡｃｃｕＴＯＦ−ＤＡＲＴ質量スペクトル（正イオンモード）のグラフである。
【図１３】本方法の工程３からの９５％エタノール浸出による緑茶粗抽出物のＡｃｃｕＴＯＦ−ＤＡＲＴ質量スペクトル（正イオンモード）のグラフである。
【図１４】ＸＡＤ７ＨＰ脱着充填剤を使用するカラムクロマトグラフィーによる本方法の工程４からの緑茶フェノール酸供給物のＡｃｃｕＴＯＦ−ＤＡＲＴ質量スペクトル（正イオンモード）のグラフである。
【図１５】ＸＡＤ７ＨＰ脱着充填剤を使用するカラムクロマトグラフィーによる本方法の工程４からの緑茶精製済みＦ２画分のＡｃｃｕＴＯＦ−ＤＡＲＴ質量スペクトル（正イオンモード）のグラフである。
【図１６】ＸＡＤ７ＨＰ脱着充填剤を使用するカラムクロマトグラフィーによる本方法の工程４からの緑茶精製済みＦ３画分のＡｃｃｕＴＯＦ−ＤＡＲＴ質量スペクトル（正イオンモード）のグラフである。
【図１７】ＸＡＤ７ＨＰ脱着充填剤を使用するカラムクロマトグラフィーによる本方法の工程４からの緑茶精製済みＦ４画分のＡｃｃｕＴＯＦ−ＤＡＲＴ質量スペクトル（正イオンモード）のグラフである。
【図１８】ＸＡＤ７ＨＰ脱着充填剤を使用するカラムクロマトグラフィーによる本方法の工程４からの緑茶精製済みＦ５画分のＡｃｃｕＴＯＦ−ＤＡＲＴ質量スペクトル（正イオンモード）のグラフである。
【図１９】市販の緑茶（Ｋａｉ Ｈｕａ Ｌｏｎｇ Ｄｉｎｇ）のＡｃｃｕＴＯＦ−ＤＡＲＴ質量スペクトル（負イオンモード）のグラフである。
【図２０】本方法の工程３からの９５％エタノール浸出による緑茶粗抽出物のＡｃｃｕＴＯＦ−ＤＡＲＴ質量スペクトル（負イオンモード）のグラフである。
【図２１】ＸＡＤ７ＨＰ脱着充填剤を使用するカラムクロマトグラフィーによる本方法の工程４からの緑茶フェノール酸供給物のＡｃｃｕＴＯＦ−ＤＡＲＴ質量スペクトル（負イオンモード）のグラフである。
【図２２】ＸＡＤ７ＨＰ脱着充填剤を使用するカラムクロマトグラフィーによる本方法の工程４からの緑茶精製済みＦ２画分のＡｃｃｕＴＯＦ−ＤＡＲＴ質量スペクトル（負イオンモード）のグラフである。
【図２３】ＸＡＤ７ＨＰ脱着充填剤を使用するカラムクロマトグラフィーによる本方法の工程４からの緑茶精製済みＦ３画分のＡｃｃｕＴＯＦ−ＤＡＲＴ質量スペクトル（負イオンモード）のグラフである。
【図２４】ＸＡＤ７ＨＰ脱着充填剤を使用するカラムクロマトグラフィーによる本方法の工程４からの緑茶精製済みＦ４画分のＡｃｃｕＴＯＦ−ＤＡＲＴ質量スペクトル（負イオンモード）のグラフである。
【図２５】ＸＡＤ７ＨＰ脱着充填剤を使用するカラムクロマトグラフィーによる本方法の工程４からの緑茶精製済みＦ５画分のＡｃｃｕＴＯＦ−ＤＡＲＴ質量スペクトル（負イオンモード）のグラフである。
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
この出願は、２００６年３月２３日に出願された米国仮特許出願第６０／７８５，１７８号（これは、その全体が参考として本明細書に援用される）への優先権の利益を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、緑茶種の抽出物、連続抽出工程を使用するそれらの調製方法、およびそれらの処理法に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
茶は、約４０００年前に中国南部で始まり、世界人口の３分の２以上によって消費されている。茶は、魅力的な香り、優れた味、および健康増進作用を有しており、それによって水に次いで世界で最も人気のある飲料となっている。早くも紀元前３０００年前には、茶は中国人によって薬用飲料として使用された。茶の医学的用途は、明王朝（１６世紀）の間に書かれた古代中国薬局方「Ｂｅｎ Ｃａｏ Ｇａｎｇ Ｍｏ」に記録された。茶の源は、植物学名カメリアシネンシス（Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）である。今やまさに数百もの茶がＣ．シネンシスの葉から生成され、一般に、非発酵性緑茶、部分発酵ウーロン、および完全発酵紅茶の３つの主なカテゴリーに分類されている。
【０００４】
ツバキ科の一員であるカメリアシネンシスは、３０フィートの高さに成長することがある常緑の低木または樹木である。しかし茶葉の栽培では、通常１〜５フィートの高さに剪定される。この植物は、栽培され新芽として選択的に摘み取られる濃い緑で毛様の楕円形から卵形の葉を付けて、大量に枝分かれする。古い葉は、一般に質が劣るとみなされている。
【０００５】
緑茶および紅茶は両方、植物学名カメリアシネンシスに由来するが、２種の茶を区別するのは、葉の処理である。紅茶の場合、葉を摘み取った後に萎れさせ、次いで丸める。これらの葉を発酵させ、茶ポリフェノール（カテキン）をフロバフェンに変換し、芳香環を形成する。発酵は、ポリフェノール酸化堆積物を含む葉の酵素が、茶ポリフェノール、特にカテキン［１］と反応する際に生じる。緑茶製造の場合、新芽を酸化させることは認められていない。その代わり、葉を蒸すことにより酸化酵素を不活性化させて、茶カテキンを保存する。
【０００６】
緑茶葉の化学構成成分には、ポリフェノール、メチルキサンチン、アミノ酸、有機酸、炭水化物、タンパク質、リグニン、脂質、クロロフィルおよび他の色素、灰分、ならびに精油が含まれる。表１［２、３（非特許文献１、非特許文献２）］参照。商業的かつ生物学的な点からみて、ポリフェノールおよびカフェインは、従来他の構成成分よりも重要であるとみなされてきた。しかしテアニン、精油、および水溶性−エタノール不溶性多糖などの他の化学構成成分は、生物学的に有益な重要な作用を有することが、近年示されてきた（以下の概略参照）。
【０００７】
【表１】
緑茶は、乾燥質量％で３０〜４２％のポリフェノールを含有する。最も生物学的に有益な活性を有するとも報告されているこれらのポリフェノールの大部分は、「カテキン」として知られるフラボノールである。主なカテキンには、以下の（−）−エピガロカテキン−３−ガレート（ＥＧＣＧ）、（−）−エピガロカテキン（ＥＧＣ）、（−）−カテキンガレート（ＣＧ）、およびエピカテキン（ＥＣ）が含まれる。最も高濃度のものは、高いものから順にＥＧＣＧ、ＥＧＣ、ＥＣＧ、ＥＣである。（＋）−ガロカテキン（ＧＣ）、（−）−ガロカテキンガレート（ＧＣＧ）、（−）−カテキンガレート（ＣＧ）、および（＋）−カテキン（Ｃ）を含む他のカテキンは少量存在する。カテキンの多くの有益な生物学的作用が研究されてきた。それらには、抗酸化活性、抗変異原作用、抗発癌作用、ニトロソ化阻害、ならびに正常細胞への作用ではなく腫瘍および不死化細胞の増殖を抑制する作用が含まれる。しかし、他の化学構成成分の群も、生物学的に有益な作用を示している。例えば、精油（ＥＯ）化学構成成分は、抗酸化活性、抗ぜんそく活性、抗菌活性、抗ウィルス活性、抗癌活性、免疫増強活性、血糖降下活性、脂質低下活性、抗炎症活性、抗皮膚炎活性、抗座瘡活性、抗アテローム性動脈硬化活性を有する。テアニン（Ｔ）は、不安軽減活性および気分高揚活性、認識促進活性、抗癌活性、脳虚血および卒中からの神経保護、ならびに減量活性を有する。さらに、緑茶多糖（Ｐ）は、抗酸化活性および酸素フリーラジカル捕捉活性、抗糖尿病活性、ならびに免疫増強活性を有する。
【０００８】
最近の科学的調査および臨床試験は、緑茶の化学構成成分の治療的価値を簡潔にまとめるために、以下を含む緑茶の様々な化合物、化学画分、および抽出生成物全体の以下の治療効果を示している。強力な抗酸化、酸素フリーラジカル捕捉、およびニトロソ化阻害（ＥＯ、カテキン−主にＥＣＧＣおよびＥＣＧ、Ｐ、抽出物）［４〜７（非特許文献１〜４）］；抗変異原活性（ＥＯ、カテキン、抽出物）［７（非特許文献４）〜１２］；正常細胞への作用のない抗発癌性活性（ＥＯ、カテキン、Ｔ、抽出物）［７（非特許文献４）〜１３］；皮膚保護（ＥＯ、カテキン、Ｐ、抽出物）［８、１０、１１、１４、１５］；抗心臓血管疾患（ＥＯ、カテキン、抽出物）［４〜７（非特許文献１〜４）、１６、１７］；抗脂質異常症（抽出物）［１６］；抗脳卒中および脳の保護（ＥＯ、カテキン、Ｔ、Ｐ、抽出物）［１８、１９］；抗歯周病（抽出物）［２０］；抗骨粗鬆症（抽出物）［２１］；免疫促進（抽出物）［２２］；抗ウィルス、抗ＨＩＶ、および抗菌（ＥＯ、カテキン、抽出物）［２３］；減量および熱産生（カテキン、カフェイン、Ｔ、抽出物）［２３、２４］；抗加齢（カテキン−ＥＣＧＣ、抽出物）［２３］；不安軽減、気分高揚剤、および向知性薬（Ｔ、抽出物）［２５、２６］；ならびに抗糖尿病（Ｐ、抽出物）［２７］。
【０００９】
緑茶は、非常に高用量でも一般的に安全であり毒性はないが、緑茶飲料および医薬品の消費による潜在的な転帰には、不整脈、胃腸障害、および神経過敏、全般性不安、不眠症によって現れるカフェイン毒性などのカフェイン関連障害の発症がある。さらにカフェインの過剰消費は、ストレスおよびストレス関連ホルモン放出を増大する。過剰のカフェインが消費される場合、血圧が上昇する恐れがあり、心臓発作および卒中の危険性が高まる。
【００１０】
現在利用可能な抽出プロセスに包括的な選択性が欠如していることを考慮すると、現在利用可能な緑茶製品はそれらの化学組成物に関して疑わしい点がある。
【非特許文献１】Ｌｉｎ Ｙ−Ｌら、Ｊ Ａｇｒｉｃ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ（１９９６）４４：１３８７−１３９４
【非特許文献２】Ｌｕ Ｈら、Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓｐｏｓ（２００３）３１：４５２−４６１
【非特許文献３】Ｃｈｅｎ Ｈら、Ｊ Ａｇｒｉｃ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ（２００４）５２（１１）： ３３３３−３３３６
【非特許文献４】Ｃｈｅｎ Ｃ−ＷおよびＨｏ ＣＴ． Ｊ Ｆｏｏｄ Ｌｉｐｉｄｓ（１９９５）２：３５−４６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
したがって、これらの相乗的に［１４，２８］作用する、標準的で信頼性のある量の生理的かつ医学的に有益な緑茶化学構成成分で製造することができる、精製済み精油、高いＥＣＧＣのカテキン、テアニン、および多糖化学構成成分画分を組み合わせた、低カフェイン濃度の新規かつ再生産可能な緑茶抽出組成物が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
一態様では、本発明は、図６〜２５のいずれかの実時間直接分析（Ｄｉｒｅｃｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ）（ＤＡＲＴ）質量分析クロマトグラムを有する画分を含む緑茶種抽出物に関する。
【００１３】
さらなる一実施形態では、抽出物は、精油、ポリフェノール、多糖、およびそれらの組合せからなる群から選択される化合物を含む。さらなる一実施形態では、精油は、ｎ−ヘキサデカン酸、テトラデカン酸、９−ヘキサデカノール、１−ウンデカノール、１−ヘキサデカノール、オレイルアルコール、９−オクタデセン−１−オール、ノナデカノール、およびそれらの組合せからなる群から選択される。さらなる一実施形態では、ポリフェノールは、カテキン、フラバノール、フラボノール配糖体、およびそれらの組合せからなる群から選択される。さらなる一実施形態では、カテキンは、カテキン（Ｃ）、エピカテキン（ＥＣ）、エピカテキンガレート（ＥＣＧ）、ガロカテキン（ＧＣ）、エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）、エピガロカテキン（ＥＧＣ）、およびそれらの組合せからなる群から選択される。さらなる一実施形態では、フラバノールは、ケルセチンおよびルチンからなる群から選択される。さらなる一実施形態では、フラボノール配糖体は、ケンペロールである。さらなる一実施形態では、多糖は、グルコース、アラビノース、ガラクトース、ラムノース、キシロースウロン酸、およびそれらの組合せからなる群から選択される。さらなる一実施形態では、本発明の緑茶種は、カフェイン、シュウ酸、またはタンニンを実質的に含まない。
【００１４】
さらなる一実施形態では、精油の量は２重量％を超える。さらなる一実施形態では、精油の量は２５重量％〜９０重量％である。さらなる一実施形態では、精油の量は５０重量％〜９０重量％である。さらなる一実施形態では、精油の量は７５重量％〜９０重量％である。
【００１５】
さらなる一実施形態では、ポリフェノールの量は４０重量％を超える。さらなる一実施形態では、ポリフェノールの量は５０重量％〜９０重量％である。さらなる一実施形態では、ポリフェノールの量は７５重量％〜９０重量％である。
【００１６】
さらなる一実施形態では、多糖の量は１５重量％を超える。さらなる一実施形態では、多糖の量は２５重量％〜９０重量％である。さらなる一実施形態では、多糖の量は５０％〜９０重量％である。さらなる一実施形態では、多糖の量は７５重量％〜９０重量％である。
【００１７】
さらなる一実施形態では、緑茶種抽出物は、精油２重量％〜９７重量％、カテキン１５重量％〜９８重量％、テアニン４重量％〜９０重量％、および多糖９重量％〜９８重量％を含む。
【００１８】
別の態様では、本発明は、本発明の緑茶種抽出物を含む食品または医薬品に関する。
【００１９】
別の態様では、本発明は、ａ）超臨界二酸化炭素抽出によって緑茶種植物材料を抽出して、精油画分および第１の残渣を得る工程、ｂ）アルコール抽出によって緑茶種植物材料または工程ａ）からの第１の残渣を抽出して、ポリフェノール画分および第２の残渣を得る工程、ならびにｃ）水抽出によって工程ａ）からの第２の残渣を抽出し、多糖をアルコールで沈殿させて多糖画分を得る工程によって逐次的に緑茶種植物材料を抽出して、精油画分、ポリフェノール画分、および多糖画分を得ることを含む、少なくとも１つの所定の特徴を有する緑茶抽出物の調製方法に関する。
【００２０】
さらなる一実施形態では、工程ａ）からの第１の残渣は、超臨界二酸化炭素抽出によってさらに脱カフェインされる。さらなる一実施形態では、ポリフェノール画分は、アフィニティー吸着クロマトグラフィーによってさらに精製される。
【００２１】
さらなる一実施形態では、工程ａ）は、１）粉砕された緑茶種植物材料を抽出容器に入れる工程、２）超臨界条件下で二酸化炭素を添加する工程、３）緑茶種植物材料と二酸化炭素をある時間接触させる工程、および４）精油画分を収集容器に収集する工程を含む。さらなる一実施形態では、工程ａ）は、超臨界二酸化炭素画分分離システムで精油画分を分画することによって、精油化合物の比を変える工程をさらに含む。さらなる一実施形態では、超臨界条件は、３５℃〜９０℃で６０バール〜８００バールの圧力を含む。さらなる一実施形態では、超臨界条件は、４０℃〜８０℃で６０バール〜５００バールの圧力を含む。さらなる一実施形態では、その時間は３０分〜２．５時間である。さらなる一実施形態では、その時間は１時間である。
【００２２】
さらなる一実施形態では、工程ｂ）は、１）ポリフェノール化学構成成分を抽出するのに十分な時間、粉砕された緑茶種植物材料または工程ａ）からの第１の残渣をアルコール溶媒と接触させる工程、２）工程１）からの抽出されたポリフェノール化学構成成分の水溶液を、アフィニティー吸着樹脂カラムに通過させ、ポリフェノール構成成分を吸着させる工程、３）酸性溶出溶媒を使用して、アフィニティー吸着物からカフェイン化合物を溶出する工程、および４）含水アルコール溶離溶媒を使用して、アフィニティー吸着樹脂からポリフェノール化学構成成分を溶出する工程を含む。さらなる一実施形態では、含水アルコール溶液は、エタノールおよび水を含み、エタノール濃度は１０〜９５重量％である。さらなる一実施形態では、含水アルコール溶液は、エタノールおよび水を含み、エタノール濃度は２５重量％である。さらなる一実施形態では、工程１）は３０℃〜１００℃で実施される。さらなる一実施形態では、工程１）は６０℃〜１００℃で実施される。さらなる一実施形態では、その時間は１〜１０時間である。さらなる一実施形態では、その時間は１〜５時間である。さらなる一実施形態では、その時間は２時間である。
【００２３】
さらなる一実施形態では、工程ｃ）は、１）多糖を抽出するのに十分な時間、工程ｂ）からの第２の残渣を水と接触させる工程、および２）アルコール沈殿によって水溶液から多糖を沈殿させる工程を含む。さらなる一実施形態では、水は７０℃〜９０℃である。さらなる一実施形態では、水は８０℃〜９０℃である。さらなる一実施形態では、その時間は１〜５時間である。さらなる一実施形態では、その時間は２〜４時間である。さらなる一実施形態では、その時間は２時間である。さらなる一実施形態では、アルコールはエタノールである。
【００２４】
別の態様では、本発明は、本発明の方法によって調製された緑茶種抽出物に関する。
【００２５】
別の態様では、本発明は、ピロガロール、ピロガロールの２５〜３５重量％のテオフィリン／テオブロミン、ピロガロールの０．１〜５重量％のシキミ酸、ピロガロールの０．１〜５重量％のクマル酸、およびピロガロールの０．１〜５重量％の３−メトキシ−１−チロシンを含む緑茶種抽出物に関する。
【００２６】
別の態様では、本発明は、テアニン、テアニンの２０〜３０重量％のテオフィリン／テオブロミン、テアニンの１〜１０重量％のカテキン／エピカテキン、テアニンの１〜１０重量％の没食子酸、テアニンの０．１〜５重量％のカテキンキノン、テアニンの０．１〜５重量％のシンナムアルデヒド、およびテアニンの１〜１０重量％の３−メトキシ−１−チロシンを含む緑茶種抽出物に関する。
【００２７】
別の態様では、本発明は、テアニン、テアニンの４５〜５５重量％のテオフィリン／テオブロミン、テアニンの１〜１０重量％のカテキン／エピカテキン、テアニンの０．１〜５重量％のカルノシン酸（ｃａｒｎｏｓｉｃ ａｃｉｄ）、テアニンの１〜１０重量％の没食子酸、テアニンの０．５〜５重量％のカテキンキノン、テアニンの１〜１０重量％のシンナムアルデヒド、テアニンの０．１〜５重量％のメチルケイ皮酸、テアニンの１〜１０重量％のシンナミド、およびテアニンの１〜１０重量％の３−メトキシ−１−チロシンを含む緑茶種抽出物に関する。
【００２８】
別の態様では、本発明は、ピロガロール、ピロガロールの１〜１０重量％のテオフィリン／テオブロミン、ピロガロールの０．１〜５重量％のテアニン、ピロガロールの１〜１０重量％のカテキン／エピカテキン、ピロガロールの５〜１５重量％のケンペロール、ピロガロールの０．１〜５重量％のミリシチン、ピロガロールの０．１〜５重量％のガロカテキンキノン、ピロガロールの６５〜７５重量％の没食子酸、ピロガロールの０．５〜５重量％のカテキンキノン、ピロガロールの１〜１０重量％のバニリン酸、およびピロガロールの１〜５重量％の３−メトキシ−１−チロシンを含む緑茶種抽出物に関する。
【００２９】
別の態様では、本発明は、ケンペロール、ケンペロールの１〜１０重量％のテアニン、ケンペロールの９５〜１０５重量％のカテキン／エピカテキン、ケンペロールの２０〜３０重量％のケルセチン、ケンペロールの５〜１５重量％のミリシチン、ケンペロールの５〜１０重量％のガロカテキンキノン、ケンペロールの５５〜６５重量％の没食子酸、ケンペロールの１〜１０重量％のカテキンキノン、ケンペロールの１０〜２０重量％のクマル酸、ケンペロールの１〜１０重量％のバニリン酸、およびケンペロールの１５〜２５重量％の３−メトキシ−１−チロシンを含む緑茶種抽出物に関する。
【００３０】
別の態様では、本発明は、ピロガロール、ピロガロールの０．５〜５重量％のテオフィリン／テオブロミン、ピロガロールの９５〜１０５重量％のカテキン／エピカテキン、ピロガロールの５５〜６５重量％のケンペロール、ピロガロールの２０〜３０重量％のケルセチン、ピロガロールの１０〜２０重量％のミリシチン、ピロガロールの２０〜３０重量％のガロカテキンキノン、ピロガロールの５０〜６０重量％の没食子酸、ピロガロールの１５〜２５重量％のカテキンキノン、ピロガロールの１５〜２５重量％のクマル酸、ピロガロールの１〜１０重量％のバニリン酸、およびピロガロールの０．５〜５重量％の３−メトキシ−１−チロシンを含む緑茶種抽出物に関する。
【００３１】
別の態様では、本発明は、ピロガロール、ピロガロールの０．５〜５重量％のテオフィリン／テオブロミン、ピロガロールの９５〜１０５重量％のカテキン／エピカテキン、ピロガロールの５５〜６５重量％のケンペロール、ピロガロールの２０〜３０重量％のケルセチン、ピロガロールの１０〜２０重量％のミリシチン、ピロガロールの２０〜３０重量％のガロカテキンキノン、ピロガロールの５０〜６０重量％の没食子酸、ピロガロールの１５〜２５重量％のカテキンキノン、ピロガロールの１５〜２５重量％のクマル酸、ピロガロールの１〜１０重量％のバニリン酸、およびピロガロールの０．５〜５重量％の３−メトキシ−１−チロシンを含む緑茶種抽出物に関する。
【００３２】
別の態様では、本発明は、ピロガロール、ピロガロールの重量のテアニン、ピロガロールの９０〜１００重量％のカテキン／エピカテキン、ピロガロールの６５〜７５重量％のケンペロール、ピロガロールの１５〜２５重量％のケルセチン、ピロガロールの５〜１５重量％のミリシチン、ピロガロールの５〜１５重量％のガロカテキンキノン、ピロガロールの６５〜７５重量％の没食子酸、ピロガロールの５〜１５重量％のカテキンキノン、ピロガロールの１０〜２０重量％のクマル酸、ピロガロールの１〜１０重量％のバニリン酸、およびピロガロールの１〜１０重量％の３−メトキシ−１−チロシンを含む緑茶種抽出物に関する。
【００３３】
本発明の抽出物は、それに限定されるものではないが、抗酸化活性、酸素フリーラジカル捕捉、ニトロソ化阻害、抗変異原活性（癌予防）、抗発癌性活性（癌治療）、皮膚保護、抗加齢、抗心臓血管疾患、抗脳卒中および治療、脳の保護、抗脂質異常症、抗歯周病、抗骨粗鬆症、免疫増強、抗ウィルス、抗ＨＩＶおよび抗菌活性、抗真菌活性、抗ウィルス活性、体重制御および熱産生、抗糖尿病、ならびに不安軽減、気分高揚、および認識促進を含む生理的かつ医学的作用を提供するのに有用である。
【００３４】
本開示のこれらの実施形態、他の実施形態、ならびにそれらの特性および特徴は、以下の説明、図、および請求の範囲から明らかとなろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３５】
定義
冠詞「ａ」および「ａｎ」は、その冠詞の文法的対象の１つまたは２つ以上（即ち少なくとも１つ）を指すために本明細書で使用される。例えば「一要素」とは、１つの要素または２つ以上の要素を意味する。
【００３６】
本明細書で使用されるように、「地上部」は、葉および茎部を含むＣ．シネンシスの構成部分を指す。
【００３７】
本明細書で使用されるように、「カテキン画分」という用語は、緑茶から得られるまたは緑茶由来の水溶性かつエタノール可溶性カテキン化合物を含み、それに限定されるものではないが、ＥＣＧＣ、ＥＧＣ、ＥＣＧ、ＥＣ、ＧＣ、ＧＣＣ、ＧＣ、およびＣなどの化合物をさらに含む。
【００３８】
「含む」および「含んでいる」という用語は、追加の要素が含まれ得るという包括的でオープンな意味で使用される。
【００３９】
「からなる」という用語は、要素を、通常それに関連する不純物を除いて特定されたものに限定するために使用される。
【００４０】
「から本質的になる」という用語は、要素を特定されたもの、ならびに材料または工程の基本的および新規特徴に実質的に影響を与えないものに限定するために使用される。
【００４１】
本明細書で使用されるように、「脱カフェインされた」という用語は、緑茶葉植物材料に見られるカフェイン濃度よりも低いカフェイン濃度を有する緑抽出組成物を含む。
【００４２】
本明細書で使用される「有効量」という用語は、所望の生物学的応答を導くために必要な量を指す。当業者には理解されるように、複合物または生物活性剤の有効量は、所望の生物学的エンドポイント、送達される生物活性剤、封入マトリックスの組成、標的組織等の要素に依存して変わり得る。
【００４３】
本明細書で使用されるように、「精油画分」という用語は、緑茶から得られるまたは緑茶に由来する脂溶性の水不溶性化合物を含み、それに限定されるものではないが、ｎ−ヘキサデカン酸、テトラデカン酸、９−ヘキサデカノール、Ｅ、オレイルアルコール、１−オクタデカノール、フィトール、およびジヒドロアクチニジオリドとして分類される化合物が含まれる。
【００４４】
本明細書で使用されるように、「原料」は一般に、植物全体それのみを含むか、またはそれに限定されるものではないが、主根、側根、および繊維根、茎、葉、種、および花を含む、葉、根を含む植物の１つもしくは複数の構成部分と組み合わせて含む未加工の植物材料を指し、この植物または構成部分は、未加工のままの材料、処理を容易にするために乾燥、蒸気加工、加熱した材料、またはそれ以外の物理的処理にかけた材料を含むことができ、さらには、そのままの材料、植物材料の寸法および物理的完全性に影響を与えるために切断し、切り刻み、さいの目切りにし、粉砕し、挽き、またはそれ以外の処理にかけた材料を含むことができる。場合により「原料」という用語は、さらなる抽出プロセスのために供給源として使用されることになる抽出生成物を特徴付けるために使用することができる。
【００４５】
本明細書で使用されるように、「画分」という用語は、いくつかの物理的化学的特性、または物理的もしくは化学的特性によって特徴付けられる特定の群の化合物を含む抽出組成物を意味する。
【００４６】
本明細書で使用されるように、「緑茶」という用語は、カメリアシネンシス種植物に由来する葉または地上部の植物材料を指す。緑茶という用語はまた、Ｃ．シネンシス種と同義に使用され、これらの植物、クローン、変種、および枝変り等を意味する。緑茶は、緑茶葉を製造するために処理されたＣ．シネンシス種植物材料の従来の抽出生成物に対する薬物名である。
【００４７】
本明細書で使用されるように、「緑茶構成成分」という用語は、緑茶種に見られる化合物を意味すべきであり、先に定義したような化合物、ならびにそれに限定されるものではないが精油化学構成成分、カテキン、テアニン、および多糖を含む緑茶種に見られる他の化合物すべてを含むべきである。
【００４８】
本明細書で使用されるように、「１つまたは複数の化合物」という用語は、ｎ−ヘキサデカン酸（緑茶の脂溶性精油化学構成成分）、もしくはＥＣＧＣ（緑茶の水溶性および水−エタノール可溶性カテキン）、もしくはテアニン（緑茶の水溶性アミノ酸）、もしくは緑茶の水溶性−エタノール不溶性多糖分子などの少なくとも１つの化合物が企図され、または２つ以上の化合物、例えばｎ−ヘキサデカノイド酸およびＥＣＧＣが企図されることを意味する。当技術分野で知られているように、「化合物」という用語は、単一分子を意味するものではなく、多数のまたは数モルの１つまたは複数の化合物を意味するものである。当技術分野で知られているように、「化合物」という用語は、明確な化学的および物理的特性を有する特定の化学構成成分を意味し、「化合物（複数）」は、１つまたは複数の化学構成成分を指す。
【００４９】
本明細書で使用されるように、「多糖画分」という用語は、緑茶から得られるまたは緑茶由来の水溶性−エタノール不溶性多糖化合物を含む。多糖の非限定的な例には、グルコース、アラビノース、ガラクトース、ラムノース、キシロースウロン酸、およびそれらの組合せが含まれる。
【００５０】
緑茶の他の化学構成成分が、これらの抽出画分に存在することもできる。
【００５１】
本明細書で使用されるように、「プロファイル」という用語は、抽出画分内の化合物の質量パーセント比を指し、または最終緑茶抽出組成物における４つの緑茶画分化学構成成分のそれぞれの質量パーセント比を指す。
【００５２】
本明細書で使用されるように、「精製済み」画分または組成物という用語は、その画分のまたは組成物の化学構成成分の５０％超に濃縮しているいくつかの物理−化学的特性または物理的もしくは化学的特性によって特徴付けられる特定の群の化合物を含む画分または組成物を意味する。換言すれば、精製済み画分または組成物は、その画分または組成物を定義するいくつかの所望の物理−化学的特性、または物理的もしくは化学的特性によって特徴付けられない化学構成成分化合物を５０％未満含む。
【００５３】
「相乗的」という用語は当技術分野で認識されており、一緒に作用して、その全体の効果が各成分の合計よりも大きくなる２つ以上の成分を指す。
【００５４】
本明細書で使用されるように、「テアニン画分」という用語は、緑茶から得られるまたは緑茶に由来するアミノ酸である水溶性テアニンを含む。
【００５５】
「治療する」という用語は当技術分野で認識されており、任意の状態または疾病の少なくとも１つの症候が治癒することならびに緩和することを指す。
【００５６】
抽出物
本発明は、１つまたは複数の緑茶原料から、精油、カテキン、テアニン、および多糖を単離したおよび精製した画分の抽出物を含む。これらの個々の画分を特定の比（プロファイル）で組み合わせて、有益な組合せを提供することができ、現在知られている抽出生成物には見られない抽出生成物を提供することができる。例えば、１つの種からの精油画分を、同じかまたは異なる種からのカテキン画分と組み合わせることができ、この組合せを、同じかまたは異なる緑茶原料からのテアニン画分または多糖画分と組み合わせてもよく、または組み合わせなくてもよい。かかる抽出物は、所定量の精油、カテキン、テアニン、または多糖画分の少なくとも１つを有する画分を含む。いくつかの実施形態は、シュウ酸を含まない緑茶の抽出物を含む。いくつかの実施形態は、脱カフェインされた緑茶の抽出物を含む。
【００５７】
さらなる実施形態は、天然植物材料に見られるもの、または現在利用可能な緑茶抽出生成物に対して変更されたプロファイル（比分布）の緑茶化学構成成分を含む抽出物を含む。例えば、精油画分濃度は、カテキンおよび／またはテアニンおよび／または多糖濃度に対して増加しても減少してもよい。同様に、カテキンまたはテアニンまたは多糖を、他の抽出物構成成分の画分に対して増加または減少させて、特定の生物学的作用のための新規構成成分の化学的プロファイル組成を可能にすることができる。
【００５８】
一実施形態では、本発明の抽出物は、２質量％を超える精油化学構成成分を含むことができる。かかる抽出物の別の実施形態は、天然の植物材料または従来の緑茶種抽出物に見られるよりも高い所定のカテキン濃度を含む。例えば抽出物は、その抽出物の３０質量％を超える濃度の新規緑茶カテキンを含むことができる。かかる抽出物の別の実施形態は、天然の植物材料または現在利用可能な抽出生成物の天然緑茶Ｌ−テアニンの濃度よりも高い、２質量％を超えるＬ−テアニン濃度を含むことができる。
【００５９】
個々の緑茶種の有益な化学構成成分の濃度関係（化学的プロファイル）を変更することによって、ヒトの特定の状態または疾患に望ましい独特または新規の緑茶種抽出生成物の配合が可能になる。例えば、抗酸化、酸素フリーラジカル捕捉、およびニトロソ化阻害活性のための新規かつ強力な緑茶組成物は、質量％で、緑茶天然植物材料または従来知られている抽出生成物に見られるよりも多い精製済み精油、カテキン、および多糖組成、ならびにそれよりも少ないＬ−テアニン組成を有することができよう。それとは対照的に、癌予防のための新規緑茶抽出物は、質量％で、緑茶天然植物材料または従来知られている抽出生成物に見られるよりも多い精製済み精油およびカテキン画分、ならびにそれよりも少ないＬ−テアニンおよび多糖画分を有することができよう。抗脳卒中および脳の保護のための新規緑茶抽出物プロファイルの別の例は、質量％で、天然緑茶植物材料または知られている従来の緑茶抽出生成物に見られるよりも多い精製済み精油、カテキン、Ｌ−テアニン、および多糖組成の抽出プロファイルとなろう。抗加齢活性については、質量％で、天然緑茶植物材料または従来の抽出生成物に見られるよりも多いカテキン画分、ならびにそれより少ない精油、テアニン、および多糖画分が望ましい。それとは対照的に、不安軽減、気分高揚、および認識促進については、質量％で、天然緑茶植物材料または従来の抽出生成物に見られるよりも多い精製済みテアニン画分およびそれより少ない精油、カテキン、および多糖画分が、最適な組成の生成物となり得る。
【００６０】
本発明のさらなる実施形態は、カテキン化学構成成分の新規副画分を含む抽出物であり、全カテキンは、高度に精製され（例えば＞９５質量％）、ＥＣＧＣなどの特定の高度生物活性カテキン化合物の濃縮物は、他のカテキン化合物（プロファイルされた副画分）と比較して高い濃度を有する。かかる新規および精製済みカテキン副画分抽出物は、単独で、または他の緑茶精製済み画分、他の植物化学構成成分、もしくは医薬化合物と組み合わせて使用することができる。例えば、かかる新規カテキン副画分は、癌および加齢予防に実質的に有益となり得る。
【００６１】
本発明の方法は、ヒトの障害を治療および予防するための新規緑茶抽出物を提供することを含む。例えば、抗酸化活性および心血管保護のための新規緑茶抽出物は、重量％で、緑茶天然植物材料または従来知られている抽出生成物に見られるよりも高いカテキン画分濃度、高い精油画分濃度、低いテアニン濃度、および高い多糖画分濃度を有することができる。卒中予防および治療のための新規緑茶種抽出物は、重量％で、天然緑茶植物材料または従来知られている抽出生成物に見られるよりも高いカテキン画分、精油画分画分、テアニン画分、および多糖画分濃度を有することができる。不安および抑うつ治療のための新規緑茶抽出物の別の例は、天然緑茶植物材料または知られている従来の抽出生成物に見られるよりも高いテアニン画分濃度および少ない精油画分、および低いカテキン濃度、および少ない多糖画分を有する組成物を含む。
【００６２】
天然緑茶と比較した抽出物
いくつかの実施形態は、天然緑茶植物材料または現在利用可能な緑茶抽出生成物に見られるよりも多い量の精油、カテキン、テアニン、または多糖濃度の少なくとも１つを有する緑茶の抽出物を含む。いくつかの実施形態は、精油、カテキン、テアニン、または多糖を含む１つまたは複数の画分が、天然緑茶植物材料に見られるよりも高い濃度で見出される組成物も含む。いくつかの実施形態は、精油、カテキン、テアニン、または多糖を含む１つまたは複数の画分が、天然緑茶植物材料に見られるよりも低い濃度で見出される抽出物も含む。緑茶の生物活性のある化学構成成分画分の知られている量（表１）を、本発明の一例として使用する。例えば、本発明の抽出物は、精油の濃度が天然緑茶植物材料の濃度の０．００１〜２００倍である画分、および／またはカテキンの濃度が天然緑茶植物材料の濃度の０．００１〜４倍である組成物、および／またはテアニンの濃度が緑茶植物材料の濃度の０．００１〜２００倍である抽出物、および／または多糖の濃度が天然緑茶植物材料の濃度の０．００１〜４０倍である抽出物、および／またはカフェインの濃度が緑茶植物材料の濃度の０．００１〜０．９９倍である抽出物を含む。本発明の抽出物は精油の濃度が天然緑茶の濃度の０．０１〜２００倍である画分、および／またはカテキンの濃度が天然緑茶の濃度の０．０１〜４倍である抽出物、および／またはテアニンの濃度が天然緑茶の濃度の０．０１〜２００の抽出物、および／または多糖の濃度が天然緑茶植物材料の濃度の０．０１〜４０倍である抽出物を含む。さらに、本発明の抽出物は、天然緑茶植物材料カテキン化学構成成分に見られるよりも多いまたは少ない量で天然植物材料カテキン化学構成成分に存在する、少なくとも１つまたは複数の化合物を有するカテキン化学構成成分の副画分を含む。例えば化合物ＥＣＧＣは、カテキン副画分が、天然緑茶植物材料の全カテキン化学構成成分の５０質量％というその濃度から、６０質量％の該副画分に増加した濃度を有することができる。それとは対照的にＣは、カテキン副画分が、天然植物材料の全カテキン化学構成成分の２．２質量％というその濃度から、該副画分＜０．１質量％に減少した濃度を有することができる。本発明の抽出物は、かかる新規カテキン副画分における特定の化合物の濃度が、天然緑茶カテキン化学構成成分に見られる濃度の約１．１〜約２倍増加し、または約０．１〜１００倍減少する抽出物を含む。
【００６３】
かかる抽出物のさらなる一実施形態は、天然緑茶種の乾燥植物材料または従来の緑茶種抽出生成物に見られるものに対して実質的に増加した所定の多糖濃度を含む。例えばある抽出物は、その抽出物の３質量％を超える水溶性エタノール不溶性多糖画分を含むことができる。いくつかの実施形態は、精油化合物、カテキン、Ｌ−テアニン、または多糖を含む１つまたは複数の画分が、天然緑茶植物材料に見られるよりも低い濃度で見出される抽出物も含む。例えば本発明の抽出物は、精油が天然緑茶植物材料の濃度の０．００１〜１００倍、および／またはカテキンの濃度が天然緑茶植物材料の濃度の０．００１〜１４倍、および／またはＬ−テアニンの濃度が天然緑茶植物材料の０．００１〜１００倍、および／または多糖濃度が天然緑茶植物材料の濃度の０．００１〜８０倍である抽出物を含む。混合抽出物を製造する場合、約０．００１ｍｇ〜約２００ｍｇの精油画分を使用することができる。さらに、約０．００１ｍｇ〜約５００ｍｇの精製済みカテキン画分を使用することができる。さらに、約０．００１ｍｇ〜約５００ｍｇの精製済みＬ−テアニン画分を使用することができる。最後に、約０．００１ｍｇ〜約５００ｍｇの水溶性エタノール不溶性多糖画分を使用することができる。
【００６４】
抽出物の純度
以下本発明で教示される方法は、精油画分、カテキン画分、カテキン副画分、Ｌ−テアニン画分、および多糖画分の精製（濃縮）、ならびにカテキン、Ｌ−テアニン、および多糖画分の脱カフェインを可能にするものである。所望の化学構成成分の８９質量％もの高さの精油画分純度は、精製済み画分における主な非精油構成成分としてのカフェインによって実現することができる。ＳＣＣＯ２は、原料中の約８５質量％のカフェインを除去する、緑茶原料を脱カフェインするための優れた手段となることが証明されている。カテキン画分のプロセスクロマトグラフィー精製の副画分すべてを組み合わせると、全カテキンの質量の５７〜６９％のＥＣＧＣ濃度（プロファイル）で、混合抽出物の６３〜６８質量％の全カテキン純度を得ることができる。選択されたアフィニティー吸着プロセスクロマトグラフィーの溶出副画分を組み合わせると、全カテキンの６２〜７０質量％のＥＣＧＣ濃度の、副画分の９１〜９９質量％の全カテキン純度を含む高度に精製されたカテキン副画分が、かなり高い収率で容易に実現される。収率が犠牲となる場合、さらに高いレベルの全カテキン純度およびＥＣＧＣ濃度を含む副画分を得ることができる。高い収率の、画分の９０質量％のＬ−テアニン濃度を含む精製済みＬ−テアニン画分、および画分の９０質量％を超える多糖濃度を含む精製済み多糖画分も、本発明に教示される方法を使用して実現される。使用される特定の抽出環境、抽出速度、溶媒、および抽出技術は、原料の始めの化学構成成分プロファイルおよび最終抽出生成物の所望の精製レベルに依存する。本発明で教示される特定の方法は、特定の特質を有する産出材料に加工される出発材料の特質のサンプル変動を説明するためのプロセス調節に一般的な、ほんの日常的な実験を使用して、当業者によって容易に決定され得る。例えば特定のある組の緑茶種植物材料では、精油化学構成成分、カフェイン、カテキン、Ｌ−テアニン、および多糖の最初の濃度は、本発明で教示されるように、当業者に知られている方法を使用して決定される。当業者は、本明細書に開示の抽出法を使用して、カテキン構成成分の最初の濃度からの、例えば最終抽出生成物のカテキン化学構成成分の所定量までの変化量を決定して、最終緑茶種組成物製品における所望の濃度に到達させることができる。同様に、脱カフェインレベルならびに精油化合物、Ｌ−テアニン、および多糖画分組成物についてもかかる変更を行うことができる。
【００６５】
一般に、本発明の方法および組成物は、所定の特徴を有する抽出緑茶種組成物の生成方法を含む。かかる抽出緑茶種組成物は、所与の生成物に望ましい有益な生物学的作用（複数）に依存して、４つの濃縮抽出画分の任意の１つ、２つ、３つ、または４つすべてを含むことができる。一般に、４つすべての精製済み緑茶種抽出物画分を含有する組成物は、天然植物材料に見られる４つの主な生物学的に有益な化学構成成分すべてを含有する高度に精製された第１の緑茶種抽出生成物であることから、一般には望ましいものである。本発明の実施形態は、所定の特徴が、選択的に増加した所定濃度の緑茶種の精油化合物、カテキン、Ｌ−テアニン、および多糖を別個の抽出画分として含む方法を含む。最終組成物中に４つの生物学的に有益な化学構成成分群のすべてを有することの重要性は、高度に精製された単一の化合物または関連化合物の群に見られる以上に緑茶化学構成成分の所望の生理的かつ医学的作用を高めるという、これらの化合物の相乗的相互作用に関係している。
【００６６】
抽出方法
抽出の出発材料は、１つまたは複数のＣ．シネンシス種からの植物材料である。植物材料は、植物の任意の部分であってよいが、葉、茎、または他の植物部分を含む植物の地上部が好ましい。葉は最も好ましい出発材料である。
【００６７】
Ｃ．シネンシス種植物材料を予備抽出工程にかけて、その材料を任意の特定の形態にすることができ、抽出に有用な任意の形態が本発明によって企図される。Ｃ．シネンシスの葉材料は、カテキンを緑茶生成物のフロブフェンに変換する酵素を不活化するために、好ましくは蒸される。かかる予備抽出工程には、それに限定されるものではないが、材料が切断され、切り刻まれ、細分に刻まれ、細長く刻まれ、粉砕され、微粉化され、切断され、または引き裂かれる工程が含まれ、出発材料は、予備抽出工程の前に乾燥されるか、または新鮮な植物材料のままである。好ましい予備抽出工程は、Ｃ．シネンシス種葉材料を、微粉に粉砕および／または微粉化する工程を含む。出発材料または予備抽出工程後の材料は乾燥されるか、または湿気を与えられる。緑茶植物材料が抽出用の形態になると、本発明によって抽出方法が企図される。
【００６８】
一般に本発明の方法は、緑茶植物材料が、超臨界流体抽出（ＳＦＥ）、またいわゆる超臨界二酸化炭素（ＳＣＣＯ２）を使用して抽出され、それに１つまたは複数の溶媒抽出工程、例えばそれに限定されるものではないが、水、含水アルコール、およびアフィニティーポリマー吸収抽出プロセスが続く方法を部分的に含む。本発明で企図されるさらなる他の方法は、他の有機溶媒、冷媒化学物質、圧縮性ガス、可聴化（ｓｏｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、高圧液体抽出、高速向流クロマトグラフィー、分子インプリントポリマー、および他の知られている抽出法を使用する緑茶植物材料の抽出を含む。かかる技術は当業者に知られている。一態様では、本発明の組成物は、図１〜５に概略的に示した工程を含む方法によって調製することができる。
【００６９】
本発明は、ＳＣＣＯ２技術を使用して、緑茶植物材料から精油および他の脂溶性化合物を濃縮（精製）およびプロファイルする方法を含む。本発明は、ＳＣＣＯ２処理を使用する緑茶植物材料の脱カフェインを含む。本発明で教示されるＳＣＣＯ２での緑茶植物材料の精油化学構成成分の抽出および脱カフェインによって、有害な有機溶媒の使用が排除される。二酸化炭素は、天然の安全な生物学的生成物であり、多くの食品および飲料に含まれる成分である。
【００７０】
精油は、香水産業、医薬部門、ならびに食品およびヒトの栄養において広く使用されている芳香物質である。それらは２００を超える化合物の混合物であり、それらは油全体の９０〜９５％を構成し、モノテルペンおよびセスキテルペン炭水化物、ならびにそれらの酸化誘導体を、脂肪族アルデヒド、アルコール、およびエステルと一緒に含有する揮発性画分と、油全体の５〜１０％を構成し、炭水化物、脂肪酸、ステロール、カロテノイド、ワックス、クマリン、プソラリン、およびフラボノイドを含有する不揮発性残余の２つの画分に基本的に分類することができる。
【００７１】
これらの化合物の広範な使用の結果として、精油の単離、濃縮、および精製は、何年もの間重要なプロセスとなってきた。従来使用されてきた一般的な方法は、主に溶媒抽出および蒸気蒸留に基付くものである。これらの従来技術の使用は、大きな不利益（熱不安定性化合物の喪失の危険性）があり、さらに２つの重大な欠点（自動化が不可能であり、抽出に長時間を要する）がある。濃縮に使用される商業用の方法は、真空分留および選択的溶媒抽出およびクロマトグラフィー分離である。これらのすべての方法は、低収率、副産物形成（高温曝露時間による）、および抽出物中の有害有機残渣の存在などの重大な欠点を有している。
【００７２】
超臨界流体抽出（ＳＦＥ）は、従来技術に関連する欠点を回避するために、植物からの精油抽出に最近使用されているものである。その抽出有用性は、液体溶媒よりも高い拡散係数を伴う、ガス様物質移動特性と液体様溶媒特性との組合せによる。ＳＦＥは、分画による従来の抽出法によって得られた精油の質を高める適切な技術でもある。
【００７３】
世界中で最も消費されているアルカロイドであるカフェインは、コカ豆（０．２％）、コーヒー豆（０．９〜２．４％）、および茶葉（１．５〜２．５％）などのいくつかの天然生成物に高濃度で見られるものである。カフェインは一般に、ヒトの健康および環境にとって有害とみなされるジクロロメタンおよびヘキサンなどの有機溶媒を使用する抽出によって得られる。水は、カフェインにとって優れた溶媒であるが、非選択的溶媒である。水での抽出によって、緑茶のポリフェノール（カテキン）などの他の価値のある成分が分解され、その後喪失してしまう。
【００７４】
本発明では、超臨界二酸化炭素は、カフェイン抽出（緑茶の脱カフェイン）の主なプロセスとして選択されている。このプロセスには、カフェインを除去するための溶媒として高温の圧縮ガスを使用することが含まれる。商業規模では、二酸化炭素は、コーヒー豆からカフェインを抽出するために使用される。超臨界ＣＯ２は、従来使用されている有機溶媒と比較して非汚染性および非毒性である。いくつかの特許が、ＣＯ２を用いたコーヒー豆からのカフェイン抽出について記載しており、これらは既に論じられている。Ｚｏｓｅｌ（米国特許第４，２４７，５７０号）は、商業規模での脱カフェイン操作を詳説した。０．７〜３％の範囲のコーヒー豆のカフェイン含量が、約０．０２％のカフェインに減少した。抽出プロセスは、７０〜９０Ｃおよび１６０〜２００バール（ＣＯ２密度０．４〜０．６５ｇ／ｃｃ）で実施された。
【００７５】
超臨界二酸化炭素は、カフェインに非常に選択的であるが、カフェインの可溶性は有機溶媒への可溶性よりも低く、その結果多量のＣＯ２を使用することになり、したがって固定費および操業費の両方が著しく上がる。コーヒー豆で観測されるように、水は、抽出収率を実質的に改善する価値のある共溶媒として作用することができる。
【００７６】
緑茶植物材料の生物学的に活性な化学構成成分の抽出方法の概略図を、図１〜５に示す。抽出プロセスは、一般にそれに限定されるものではないが、６工程である。本文参照に関して、下線の数字Ｘが本文に現れた場合、その数字は図１〜５の数字を指す。抽出プロセスに使用される分析方法は、実施例部分で提示される。
【００７７】
工程１：緑茶精油の超臨界流体二酸化炭素抽出
精油の疎水性性質に起因して、それに限定されるものではないが、ＳＣＣＯ２、ヘキサン、石油エーテル、および酢酸エチルを含む非極性溶媒を、この抽出プロセスで使用することができる。精油のいくつかの成分は揮発性であるため、抽出プロセスとして蒸気蒸留を使用することもできる。
【００７８】
ＳＣＣＯ２を使用する緑茶葉からの精油化学構成成分抽出の概略図を、図１−工程１に図示する。原料［１０］は、乾燥切断緑茶葉である（１０５μｍを超える寸法）。抽出溶媒［２１０］は、純粋な二酸化炭素である。共溶媒として水を使用することができる。原料を、ＳＦＥ抽出容器［２０］に入れる。パージおよび漏出試験後、このプロセスは、貯蔵容器から冷却器を介してＣＯ２ポンプに流れる液化ＣＯ２を含む。ＣＯ２は、所望の圧力に圧縮され、圧力および温度が所望のレベルに維持される抽出容器内で原料を貫流する。抽出の圧力は、約６０バール〜８００バールの範囲であり、温度は約３５℃〜約９０℃の範囲である。本明細書で教示されるＳＣＣＯ２抽出は、好ましくは少なくとも１００バールの圧力および少なくとも３５℃の温度、より好ましくは約６０バール〜３００バールの圧力および約４０℃〜約６０℃の温度で実施される。抽出の単一段階についての抽出時間は、約３０分〜約２．５時間、〜約１時間の範囲である。溶媒と供給物の比は、各ＳＣＣＯ２抽出につき、一般に約２０〜６０対１である。ＣＯ２は、商業用抽出処理のために再利用される。次いで、抽出された精製およびプロファイル済み精油化学構成成分［３０］は、コレクターまたはセパレーターに収集され、光防止ガラス瓶に保存され、冷暗庫中４℃で貯蔵される。緑茶原料［１０］物質は、抽出および精製済みの得られた緑茶精油画分［３０］が、１つのコレクターＳＦＥまたはＳＣＣＯ２システム［２０］に収集される１工程プロセス（図１、工程１Ａ）で抽出することができる。あるいは分画ＳＦＥシステムの場合、ＳＣＣＯ２抽出した緑茶原料物質は、コレクター容器（セパレーター）に分離され、各コレクター内に収集された精製済み精油副画分のそれぞれに異なる相対パーセンテージの精油化学構成成分組成（プロファイル）が存在するようにすることができる。残渣（残り）［４０］は収集され、保存され、それに限定されるものではないが、脱カフェイン、ならびに緑茶カテキン、テアニン、および多糖の精製済み画分を得るための処理を含むさらなる処理に使用される。本発明の一実施形態は、６０バール〜８００バールの圧力および３５℃と９０℃の間の温度における多段階ＳＣＣＯ２抽出を使用する緑茶原料の抽出、ならびに各段階後における抽出緑茶材料の収集を含む。本発明の第２の実施形態は、６０バール〜８００バールの圧力および３５℃と９０℃の間の温度におけるＳＣＣＯ２分画抽出を使用する緑茶種原料の抽出、ならびに所定条件（圧力、温度、および密度）および所定間隔（時間）での異なるコレクター容器への抽出緑茶材料の収集を含む。多段階抽出器のそれぞれからまたは異なるコレクター容器（分画システム）で得られる抽出された緑茶の精製済み精油副画分組成物は、回収し独立に使用することができ、または混合して、天然植物材料に見られるよりも高いもしくは低い所定の精油化学構成成分濃度を含む１つもしくは複数の緑茶精油組成物を形成することができる。一般に、ＳＣＣＯ２単一抽出工程を使用する緑茶植物材料からの精油画分の全収率は、約０．４重量％（精油化学構成成分の＞９５％）であり、抽出物の８５質量％を超える精油化学構成成分純度を有する。かかる抽出プロセスの結果は、以下の表２〜４に見られる。手順は実施例１に見ることができる。
【００７９】
【表２】
【００８０】
【表３−１】
【００８１】
【表３−２】
【００８２】
【表４−１】
【００８３】
【表４−２】
緑茶葉精油画分の化合物合計７３種を、ＳＣＣＯ２を使用して４０℃および１００〜２００バールで抽出した。ＳＣＣＯ２抽出が乾燥または湿潤緑茶葉のどちらで達成されるかは重要と思われず、このプロセスではカフェインが抽出される。これらの精油画分のカフェイン濃度は、精油画分の約１１〜８０質量％で変わる。カフェインに加えて、精油画分に見られる他の主な化合物には、１−ウンデカノール、１−ヘキサデカノール、オレイルアルコール、およびノナデカノールなどの飽和脂肪アルコールならびにヘキサデカン酸などの脂肪酸が含まれる。興味深いことに、精油化合物に関しては中国緑茶Ｆ１には殆ど見られなかった。それとは対照的に、中国緑茶Ｆ２、Ｆ３、およびＦ４はすべて、５０質量％を超える脂肪アルコールおよび脂肪酸を含むＳＣＣＯ２精油抽出画分を有することが見出された。日本緑茶原料からのＳＣＣＯ２精油画分では、４０質量％未満の脂肪アルコールおよび脂肪酸が抽出画分を構成していた。
【００８４】
工程２．緑茶の超臨界二酸化炭素脱カフェイン
ＳＣＣＯ２を使用する緑茶葉からの化学構成成分の脱カフェインの一般的説明を、図１−工程２に図示する。乾燥切断緑茶葉（１０５ｍμを超える寸法）の原料［１０または４０］または工程１の精油画分抽出後の残渣を、１苗床分の量の蒸留水に浸す。抽出溶媒［２１０］は、純粋な二酸化炭素である。共溶媒として水を使用することができる。原料を、ＳＦＥ抽出容器［５０］に入れる。パージおよび漏出試験後、このプロセスは、貯蔵容器から冷却器を介してＣＯ２ポンプに流れる液化ＣＯ２を含む。ＣＯ２は所望の圧力に圧縮され、圧力および温度が所望のレベルに維持される抽出容器内で原料を貫流する。抽出の圧力は、約６０バール〜８００バールの範囲であり、温度は約３５℃〜約９０℃の範囲である。本明細書で教示されるＳＣＣＯ２抽出は、好ましくは少なくとも２００バールの圧力および少なくとも３５℃の温度、より好ましくは約３０バール〜７００バールの圧力および約６０℃〜約８０℃の温度で実施される。抽出の単一段階についての抽出時間は、約２〜約６時間、〜約４時間の範囲である。溶媒と供給物の比は、各ＳＣＣＯ２抽出につき、一般に約２４０対１である。ＣＯ２は、商業用抽出処理のために再利用される。次いで、抽出されたカフェイン化学構成成分［７０］は収集され、カフェイン含量を測定され、廃棄される。残渣（残り）または脱カフェイン済み緑茶抽出物［６０］は収集され、保存され、それに限定されるものではないが、緑茶カテキン、テアニン、および多糖の精製済み画分を得るための処理を含むさらなる処理に使用される。一般に、単一工程のＳＣＣＯ２抽出を使用する緑茶植物材料からのカフェインの全収率は、約４．５重量％（原料のカフェイン化学構成成分の約８５％）であり、カフェイン抽出物の約２９質量％のカフェイン化学構成成分純度を有する。かかる脱カフェインプロセスによって、脱カフェイン済み緑茶原料中のカフェイン含量は、原料のカフェイン含量の約５５〜８５質量％に減少する。カフェイン含量の低い緑茶原料では、カフェインの８３〜８５質量％を除去することができる。高カフェインを含有する緑茶原料中のカフェイン含量を減少させるため、原料を８０質量％超脱カフェインするにはより高い溶媒／供給物比が必要とされる。かかる抽出プロセスの結果は、以下の表５および６に見られる。手順は実施例２に見ることができる。
【００８５】
【表５】
【００８６】
【表６】
カフェインの抽出収率は、共溶媒の添加と共に増加した。超臨界流体二酸化炭素／共溶媒混合物中のカフェインの可溶性は、純粋な二酸化炭素のみより３〜５倍高い（Ｋｏｐｃａｋ２００５）。カフェイン抽出の観点からすれば、７５％エタノール／水は非常に効率的である。しかし、脱カフェイン抽出物中のカフェイン９．３質量％に加えて、脱カフェイン抽出物の４質量％のＥＧＣＧ、２．６質量％のＥＧＣ、および０．９質量％のＥＣＧなどの、原料からの価値あるフェノール酸化合物も抽出される。緑茶葉原料の脱カフェインに関して、水はエタノールよりも良好な共溶媒である。湿潤緑茶葉、共溶媒としての水、およびＳ／Ｆ比２４０を使用して、原料から価値のあるフェノール酸またはテアニンのいずれも除去することなく、Ｆ１原料および日本緑茶（ＪＰＧＣ）原料中８０％を超えるカフェインを除去（脱カフェイン）することができる。これは、Ｆ１原料中１．３質量％からＦ１脱カフェイン済み材料中０．１８質量％へのカフェイン含量の減少、またはＪＰＧＴ原料中２．２質量％から脱カフェイン済み緑茶材料中０．３６質量％へのカフェイン含量の減少、６〜７倍のカフェイン含量の減少に等しい。３．３質量％の高カフェイン含量のＦ４緑茶葉原料の場合、全カフェインの減少は少ない。Ｆ４脱カフェイン済み原料の１．４６質量％。しかし、価値のあるカテキンおよびテアニンは、脱カフェイン済み残渣材料に保存されていた。したがって、価値のあるカテキンおよびテアニン化学構成成分を保持している脱カフェイン済み残渣を、次いでさらなる処理のために使用して、精製済みカテキン、テアニン、および多糖画分を得ることができる。
【００８７】
興味深いことに、同じＳＦＥ脱カフェイン条件下で、高カフェイン含量のＦ４原料については約５５％の脱カフェインしか観測されなかった。この差異は、Ｆ４緑茶葉の高カフェイン含量もしくは異なるマトリックス構造、またはその両方によって生じるものと思われる。観測に基付くと、Ｆ４原料葉は浸水によってはあまり湿潤していない。換言すれば、水はＦ４葉の内部マトリックスに浸透する代わりに、葉の表面上に残る傾向がある。したがってＦ４緑茶葉は、８０％を超える脱カフェインを実現するために、より多量の水および／または長時間の浸水時間、ならびに場合によってはより高い溶媒／供給物比が必要となろう。
【００８８】
工程３．粗緑茶カテキン化学構成成分画分のエタノール抽出
一態様では本発明は、生物活性のあるカテキン化学構成成分の抽出および濃縮を含む。この工程の一般的説明を、図２−工程３に図示する。この工程３の抽出プロセスは、溶媒浸出プロセスである。この抽出用の原料は、茶を切断した緑茶葉材料緑茶［１０］、または工程１のＳＣＣＯ２抽出による精油画分からの残渣［３０］もしくは工程２のＳＣＣＯ２による脱カフェイン緑茶葉材料からの残渣［６０］のいずれかである。抽出溶媒２２０は９５％エタノールである。抽出溶媒は１０〜９５％アルコール水溶液であってよく、９５％水性エタノールが好ましい。この方法では、緑茶原料および抽出溶媒は、加熱または攪拌される抽出容器１００に入れられる。これは９０℃、約８０℃、約７０℃、または約６０〜９０℃に加熱することができる。抽出は、約１〜１０時間、約１〜４時間、約２時間実施される。得られる液体抽出物を遠心分離にかけ［１１０］、濾過する［１２０］。濾液（上清）［３００、３１０］を生成物として収集し、溶媒の蒸発後の体積および乾燥質量固形分について測定する。抽出残渣材料［１３０または１４０を保持し、さらなる処理のために保存する（工程４参照）。必要または所望に応じて、抽出を数回反復することができる。それは２回以上、３回以上、４回以上等反復することができる。抽出に２段階以上が使用される場合、各段階からの粗カテキン画分を、生成物のために組み合わせてもよく［３２０］、またはカテキン画分のさらなる精製のために保持してもよい（工程４参照）。例えば、図２−工程３は２段階プロセスを示しており、第２段階では、同じ方法および条件を使用する。結果を以下の表７および８に示す。手順は実施例３に見ることができる。
【００８９】
【表７】
【００９０】
【表８】
これらの結果は、ＳＦＥ脱カフェインプロセスによって、残渣中の他の価値のある化合物に影響を及ぼさずに緑茶原料からカフェインが除去されたことを示している。さらに、９５％エタノールを使用する残渣の抽出によって、精製済みテアニンおよび多糖画分のさらなる処理のために使用できるＬ−テアニンおよび水溶性−エタノール不溶性多糖が残渣中に保存される。最終的には、２段階浸出プロセスによって、４つの主なカテキンの濃度（ＰＡ、表８）は、天然緑葉原料中約７〜１２質量％から抽出物中約２６〜３９質量％に増加し、純度は約３．５倍増加する。抽出収率は、最初の緑茶原料に対して１９〜３６質量％の範囲であった。カテキン化学構成成分画分のさらに高い純度は、アフィニティー吸着プロセスクロマトグラフィープロセス（以下参照）を使用して得ることができる。
【００９１】
工程４．アフィニティー吸着抽出プロセス
本明細書で教示されるように、緑茶原料の含水アルコール抽出物（工程３）を固体アフィニティーポリマー吸着樹脂と接触させて、含水アルコール抽出物に含有される活性なカテキンをアフィニティー吸着物に吸着させることによって、緑茶からの高度精製カテキン画分抽出物を得ることができる。続いて、結合した化学構成成分は本明細書で教示される方法によって溶出される。カテキン画分化学構成成分の溶出の前に、アフィニティー吸着物とそれに吸着した所望の化学構成成分を、従来の任意のやり方で抽出物の残りから分離することができ、好ましくは吸着剤および分離物との接触プロセスは、水性抽出物を抽出カラムまたは吸着物質床に通すことによって行われる。さらにカテキン画分化学構成成分の溶出の前に、カフェイン化合物を溶出するがカテキン化合物は溶出しない（精製済みカテキン画分の脱カフェイン）特定の溶媒を使用することによって、アフィニティー吸着物上に吸着した任意のカフェイン化合物をカテキンから分離することができる。
【００９２】
それに限定されるものではないが、緑茶植物材料のカテキン化学構成成分を精製するために、「Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ−２」（Ｒｏｈｍ ＆ Ｈａｓｓ）、「Ｄｕｏｌｉｔｅ Ｓ−３０」（Ｄｉａｍｏｎｄ Ａｌｋａｉ Ｃｏ．）、「ＳＰ２０７」（三菱化学）、ＡＤＳ−５（Ｎａｎｋａｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｔｉａｎｊｉｎ、中国）、ＡＤＳ−１７（Ｎａｎｋａｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｔｉａｎｊｉｎ、中国）、Ｄｉａｌｏｎ ＨＰ２０（三菱、日本）、およびＡｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ７ＨＰ（Ｒｏｈｍ ＆ Ｈａｓｓ）などの様々なアフィニティー吸着物を使用することができる。Ａｍａｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ７ＨＰは、緑茶のカテキン化学構成成分に対する高アフィニティーにより、好ましく使用される。微細網状（ｍａｃｒｏｒｅｔｉｃｕｌａｒ）構造（連続ポリマー相および連続細孔相の両方を含有する）、高表面積、およびその表面の脂肪族性質からの吸着可能特性に由来するものが、５６０〜７１０μｎの粒経を有する非イオン性脂肪族アクリルポリマーである。ポリマー性エステル基を有するこの微細網状構造によって、ＸＡＤ７ＨＰは、フェノール酸（カテキン）への高アフィニティーをもたらす極性化合物を吸着することができる。
【００９３】
吸着剤からカテキン化学構成成分を回収するために様々な溶離溶媒が使用できるが、本発明の一態様では、溶離溶媒は、それに限定されるものではないがメタノール、エタノール、またはプロパノールを含む低分子量アルコールを含む。第２の態様では、溶離溶媒は、低分子量アルコールを水との混合物として含む。第３の態様では、溶離溶媒は、低分子量アルコール、第２の有機溶媒、および水を含む。別の態様では、吸着剤上に吸着したカテキンの脱カフェインに使用される溶離溶媒は、それに限定されるものではないが、１０％エタノール中５％Ｈ２ＳＯ４などの酸性溶媒を含む。したがって２段階溶出プロセスは、緑茶のカテキン化学構成成分画分の精製用に設計されている。第１段階は、酸性溶液を使用して、カフェインの塩基特性およびカテキンの酸特性を利用することによってカラムに吸着した化学構成成分を脱カフェインすることである。第２段階は、エタノール／水溶離溶媒を使用して、脱カフェインカテキンを溶出することである。
【００９４】
緑茶原料は、抽出物を含有する水性カテキン化学構成成分をアフィニティー吸着剤と接触させる前に、それに限定されるものではないが、工程１、２、および３に記載のプロセスなどの１つまたは複数の予備精製プロセスにかけてもよく、またはかけなくてもよい。
【００９５】
本発明で教示されるアフィニティー吸着プロセスを使用することによって、天然植物材料または市販の抽出生成物中に通常存在する他の化学構成成分が殆ど含まれない、緑茶の高度に精製されプロファイルされた脱カフェイン済みカテキン化学構成成分画分が得られる。例えば、本発明で教示されるプロセスは、乾燥質量で９５％を超える全カテキン化学構成成分を含有する精製済みカテキン抽出物を得ることができる。
【００９６】
ポリマーアフィニティー吸着樹脂ビーズを使用する緑茶葉からのカテキンの抽出および精製の一般的説明を、図３−工程４に図示する。この抽出プロセスの原料は、天然緑茶原料［１０］または工程３の９５％エタノール浸出抽出物からのカテキンを含有する水溶液［３２０］であってよい。適切な重量の吸着樹脂ビーズ（吸着樹脂１ｇｍ当たりカテキン１２ｍｇ）を、カラム４１０、４２０に入れる前および後に４〜５ＢＶエタノール［２２０］および４〜５ＢＶ蒸留水［２３０］で洗浄する。清浄な吸着樹脂ビーズを、カラムに充填する［４３０］。次いでカテキン含有水溶液［３２０］を、流量２〜４床体積（ＢＶ）／時間でカラムに入れる［４４０］。カラムが一杯になったら、蒸留水［２３０］を用いてカラムを流量２〜３ＢＶ／時間で洗浄して［４５０］、吸着カテキンから任意の不純物を除去する。流出残渣［５００］および洗浄残渣［５１０］を収集し、質量含有量、カテキン含量、カフェイン含量を測定し、廃棄した。吸着したカフェイン化合物の溶出［４６０］を、アイソクラティック方式で、溶離溶媒［２４０］として１０％エタノール中５％Ｈ２ＳＯ４を用いて、流量２〜４ＢＶ／時間で実施する。溶出液［５２０］を収集し、質量含有量、カテキン含量、カフェイン含量を測定し、廃棄する。この脱カフェイン段階の後、８ＢＶの蒸留水［２３０］を用いて、カラムを流量１０ＢＶ／時間で洗浄する［４７０］。洗浄したもの［５３０］を、それが中性になるまでｐＨ紙によって試験して、収集し、廃棄する。吸着カテキンの溶出［４８０］を、アイソクラティック方式で、溶出溶液［２５０］として８０％エタノール／水溶液を用いて流量２〜４ＢＶ／時間で実施し、溶出液抽出物［５４０］について溶出曲線を記録した。溶出体積４８０は、約１５〜３０分毎に収集することができ、ＨＰＬＣを使用してこれらのサンプルを分析し、固体含量および純度について試験した。結果を表９〜１１に示す。手順は、実施例４に見ることができる。
【００９７】
【表９】
【００９８】
【表１０】
【００９９】
【表１１】
酸性溶出溶媒は、最終生成物中のカフェイン濃度を抽出物の１質量％未満から０．２質量％もの低さに低減するカテキンのさらなる脱カフェインにとって優れたプロセスであることが立証されている。カテキンの精製済み画分は、最初の緑茶原料の１．９質量％の全収率で、純度＞９０％で得ることができる。さらに、使用される最初の緑茶原料に関係なく、カテキン純度＞９５％でＥＧＣＧ濃度が＞６０％まで増加する副画分を得ることもできる。Ｆ１、Ｆ４、およびＪＰＧＴの組合せプロセスのクロマトグラフィー溶出液におけるカテキン純度およびＥＣＧＣプロファイルの概略を、表１２に示す。
【０１００】
【表１２】
他の典型的な実験では、使用溶液は、未加工または最初の緑茶葉原料の工程３の９５％浸出抽出後に得られた透明な水溶液であった。これらの実験では、各段階２時間の２段階で、７０℃において９５％エタノール２５０ｍｌを使用して、未加工緑茶残渣２５ｇｍを浸出抽出した（溶媒／供給物比は２０／１）。この２段階抽出からの２つの上清溶液を混合し、ロータリーエバポレーターを使用してエタノール抽出溶媒を除去した。エタノールの除去（蒸留）後、いくらか固体沈殿物が生じ、それを工程３に記載のように遠心分離および濾過を使用して除去した。上清を収集し、次いで蒸留水を濃縮上清に添加して、最終濃度１６〜３０ｍｇ／ｍｌを達成した。次いで、カテキンを含有するこの透明な水溶液を使用して、工程４のアフィニティー吸着プロセスクロマトグラフィー法を用いてさらに精製した。この工程３の浸出抽出の結果は表１３に見られ、未加工または最初の緑茶葉の浸出を、工程２からのＳＦＥ脱カフェイン済み残渣の浸出と比較する。未加工緑茶植物材料の場合、ＳＦＥ脱カフェイン済み残渣では見られなかった沈殿物がエタノール蒸留中に生じたことに留意されたい。したがってこの沈殿物の遠心分離および濾過によって、全収率は最初の原料に対して３２．８質量％〜２６．９質量％減少した。浸出抽出した未加工緑茶原料からの全収率はより高いが、カテキン化学構成成分の純度は類似している。さらに、カフェイン濃度は、未加工緑茶の浸出抽出生成物において非常に高い。かかる２段階９５％エタノール浸出の結果を、表１３および１４に示す。
【０１０１】
【表１３】
【０１０２】
【表１４】
典型的な吸着実験を、オープンバッチシステムで室温で実施した。ＰＡ ＸＡＤ７ＨＰ〜３０ｇをエタノールで洗浄してモノマーおよび不純物を除去し、次いで１６時間蒸留水に浸して充填した。次いで、清浄なＰＡ樹脂ビーズを１０ｍｍ（ＩＤ）×３５０ｍｍ（Ｌ）のガラスカラムに充填した。濃度１６〜３０ｍｇ／ｍｌを有する水溶液（脱エタノール化浸出溶液）１００ｍｌを、充填したカラムに流量１．８ｍｌ／分、２ＢＶ／時間で入れた。入れた後に蒸留水１５０ｍｌを使用して、カラムを流量１０ＢＶ／時間で洗浄した。次いで１０％エタノール中５％硫酸２００ｍｌを使用して、流量２．２ＢＶ／時間でカラム溶出した（脱カフェイン）。この溶出後、カラムからの洗浄液がｐＨ７に達するまで、蒸留水２５０ｍｌを使用して１０ＢＶ／時間でカラムを洗浄した。次いで８０％エタノール１００ｍｌを使用して、流量２ＢＶ／時間でカラム溶出した（脱吸着）。全処理時間は３００分であった。溶離溶媒の画分を順次収集した。各溶出液画分をＨＰＬＣによってアッセイし、その結果を表１５〜１７に示す。
【０１０３】
【表１５】
【０１０４】
【表１６】
【０１０５】
【表１７】
工程４の、未加工（未脱カフェイン）緑茶植物材料を用いて始めるカテキンのアフィニティー吸着精製では、酸性溶出溶媒を使用して吸着剤へのカテキンの結合を保ちながら、９５％のカフェインを除去することができる。例えば、約１２質量％のカフェインを含有する粗浸出抽出物を、プロセスクロマトグラフィー抽出画分中０．３質量％に脱カフェインすることが可能である。原料中のカフェインの濃度が高いほど、抽出画分を脱カフェインするために多量の酸溶液の溶離溶媒が必要とされる。
【０１０６】
興味深いことに、８０％エタノールを使用するカテキンの溶出によって、抽出画分中の質量％でＥＧＣよりも高い収率のＥＧＣＧ、ＥＣＧ、およびＣが得られる。最高の収率および純度は、０．６〜２ＢＶ画分に見られる。高度に精製された画分の全カテキン純度は、粗浸出抽出物の全カテキン純度の約１．７倍であった。カテキン純度のレベルは、ＳＦＥ脱カフェイン済み残渣の工程４のプロセスクロマトグラフィーで達成したレベルほど高くなかった。しかし、緑茶原料に依存して７１％〜９３％の全カテキン純度で、最初の緑茶原料に対して１１質量％を超える全抽出画分収率が達成される。最終的には、ＥＧＣＧ、ＥＣＧ、およびＣの質量％を選択的に増加し、ＥＧＣを減少させることにより、４つの主なカテキンの化学的分布プロファイルは変えられる。例えばＥＧＣＧは、一般に混合抽出画分の全カテキンの６５質量％を超え、抽出副画分の７５質量％にもなり得る。
【０１０７】
精製済みカテキン画分および副画分中のシュウ酸の分析時には、９５％エタノール浸出原料中にシュウ酸が存在するにも関わらず、これらの画分または副画分のいずれかにおいてシュウ酸を検出することができなかった。実際、シュウ酸は原料溶液の６質量％にもなることが見出された。しかしシュウ酸化合物は、アフィニティー吸着物上には吸着せず、流出物中に見出された。
【０１０８】
工程５．テアニンおよび多糖の水浸出
緑茶の化学構成成分の多糖抽出画分は、「水溶性エタノール不溶性抽出画分」として科学文献に定義されている。Ｌ−テアニンおよび多糖は、両方水溶性である。水溶媒浸出を使用する緑茶植物材料の抽出物からのテアニンおよび多糖抽出の一般的説明を、図４−工程５に図示する（別表１）。原料１４０は、工程３の９５％浸出抽出プロセスからの固体残渣である。この原料は、２段階で浸出抽出される。溶媒は蒸留水２６０である。この方法では、緑茶抽出残渣１４０および抽出溶媒２６０を、抽出容器６００に入れ、加熱し攪拌する。それを１００℃、約８０℃、または約６０〜８０℃に加熱することができる。抽出は、約１時間、約２〜４時間、または約２時間で実施される。上清抽出溶液７００を遠心分離にかけ６１０、濾過し６２０、収集する。残渣６３０を保持し、さらなる処理のために保存する。必要または所望に応じた回数、残渣で抽出を反復することができる。それは２回以上、３回以上、４回以上等であってよい。例えば、図４−工程５は２段階プロセスを示しており、第２段階では同じ方法および条件を使用する。最終残渣［６５０］は破棄した。この抽出工程の一例は、実施例５に見られ、Ｌ−テアニン含量の質量測定およびＨＰＬＣ分析の結果を表１８に示す。
【０１０９】
【表１８】
水浸出プロセスの全収率は、最初の緑茶原料の３．６〜１２．５質量％であった。Ｌ−テアニンの濃度は、浸出抽出物の１３．２〜１８．２質量％であった。最初の緑茶葉原料において８５質量％を超える収率のテアニンを、２段階浸出プロセスで抽出することができる。科学文献と一致して（２９）、他の化学構成成分は大部分が多糖となるはずである。多糖化学構成成分からテアニンを分離するために、さらなる工程６を使用することができる。
【０１１０】
工程６．Ｌ−テアニンおよび多糖画分の精製
水溶媒プロセスを使用する緑茶抽出物からの多糖およびテアニン画分の抽出および精製の一般的説明を、図５−工程６に図示する。原料は、工程５の水浸出抽出からの水浸出上清溶液［７００＋７１０］である。混合溶液を蒸発させて［８００］、６０％の水を除去する。次いで、溶媒の無水エタノール［２８０］を濃縮溶液に添加して、最終エタノール濃度を７５％にする。溶液を静置し、大量の沈殿物［８１０］を観測する。溶液を遠心分離にかけ［８２０］、デカントし［８３０］、テアニン画分のさらなる処理および精製のために上清を収集する［９１０］。沈殿生成物［９００］は精製済み多糖画分であり、これは、多糖について比色（ｃｏｌｏｒｍｅｔｒｉｃ）法を使用し、参照標準として分子量５，０００〜４１０，０００のデキストランを使用することによって分析することができる。抽出多糖画分の純度は、様々な分子量のデキストランに対して約２３〜５０％であり、全収率は最初の天然緑茶葉原料の１．１５質量％である（表１８）。様々なデキストラン当量の純度を組み合わせると、精製済み多糖画分の９０質量％を超える全体的多糖純度と一致する。
【０１１１】
上清溶液のテアニン純度は約３１〜４２％である。より高いレベルのテアニン純度を達成するために、さらなる処理が必要とされる。上清溶液［９１０］を乾燥させる。乾燥生成物を十分な量の蒸留水［２６０］に溶解して、１０％溶液を作製する［８５０］。この溶液に、４体積の無水エタノール［２７０］を添加し混合する。この含水アルコール溶液を約１時間静置し、次いで遠心分離にかけ［８６０］、任意沈殿物［９１０］を破棄する。真空ロータリーエバポレーター［８７０］を使用して、約６０℃で上清［９２０］を濃縮して、８０％溶液を実現する。この８０％溶液を室温に冷却し、次いで４体積の無水エタノール［２８０］を溶液に添加し、それを０℃で２４時間冷蔵する［８８０］。形成される結晶を収集し、６０℃で真空乾燥して［８９０］、精製済みテアニン画分［９３０］を得る。精製済みテアニン画分の収率は、最初の緑茶原料の約０．５１〜１．９５質量％であり、純度は約９０〜９２％である（表１８）。実際の手順は、実施例６に見ることができる。
【０１１２】
緑茶多糖収率は、最初の緑茶葉原料に対して１．２〜８．５質量％であった。多糖画分の純度は、様々な分子量のデキストランに対して２３〜５０％であり、これは、画分中の全体的純度が緑茶多糖化学構成成分の＞９０％であることを示すものであった。数々の様々な実験手法に基付くと、１．２〜８．５質量％の収率は、天然緑茶種原料中の水溶性エタノール不溶性多糖の９０％を超えると結論付けることは実に合理的である。
【０１１３】
緑茶のＬ−テアニン収率は、最初の緑茶原料に対して０．５〜２．０質量％であり、これは最初の原料中約７０％のテアニンであった。９０％のテアニン純度は、これらの方法を使用して実現することができる。
【０１１４】
当技術分野では、溶液からアルコールを除去するための多くの方法が知られている。再利用のためにアルコールを保存することが望ましい場合、抽出後に標準大気圧または減圧下での蒸留によって溶液から除去することができる。このアルコールは再利用することができる。さらに、水溶液またはアルコールが既に除去された溶液、いずれかの溶液から水を除去するための当技術分野で知られている多くの方法も存在する。かかる方法には、それに限定されるものではないが炭酸マグネシウムまたはマルトデキストリンなどの適切な担体上に、それに限定されるものではないが水溶液を噴霧乾燥することが含まれ、あるいは液体を凍結乾燥またはリフラクティブウィンドウ（ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ ｗｉｎｄｏｗ）乾燥することによって乾燥状態にすることができる。
【０１１５】
先に記載の抽出法の実施では、緑茶の最初の乾燥葉原料中に存在する８０％を超える純度の精油化学構成成分を有する９０質量％を超える収率の精油化学構成成分および関連種を、精油ＳＣＣＯ２抽出画分として抽出できるということが見出された（工程１）。工程２（ＳＣＣＯ２脱カフェインプロセス）で教示される方法を使用すると、緑茶植物材料からのカフェインの全収率は、約４．５質量％となり（最初の緑茶原料中に存在するカフェイン化合物の約８５％）、カフェイン抽出物の約２９質量％のカフェイン化学的純度を有する。かかる脱カフェインプロセスによって、脱カフェイン済み緑茶原料中のカフェイン含量は、脱カフェイン済み緑茶材料の０．２質量％未満に減少する。さらに、本発明で教示される方法を使用して、精製済みカテキン、テアニン、および多糖画分を得るためのさらなる処理に使用できる価値のあるカテキン、テアニン、および多糖化学構成成分を原料中に維持しながら、緑茶原料の８０％脱カフェインを達成することができる。
【０１１６】
本発明の工程３で教示される方法を使用して、最初の緑茶種原料から１９〜３１質量％の収率のエタノール浸出画分が達成される。カテキン化学構成成分の収率は、最初の緑茶原料に存在するカテキンの９０質量％を超える（表８およびＡ１−別表１参照）。さらに、エタノール浸出プロセスによって、４つの主なカテキンの濃度（純度）は、研究された天然緑茶葉原料中７〜１２質量％から、カテキン抽出画分中約２５〜３９質量％に増加し、カテキンの濃度（ＥＣＧＣ、ＥＣＧ、ＥＧＣ、およびＣの合計）が３．５倍増加する。最終的にエタノール浸出抽出によって、固体残渣中にテアニンおよび多糖化合物が保存され、それらは、精製済みテアニンおよび多糖画分（工程５および６）のさらなる処理のために使用することができる。
【０１１７】
本発明の工程４に教示される方法（アフィニティー吸着抽出プロセス）を使用すると、抽出画分の９０乾燥質量％を超える純度のカテキン画分を得ることができる。９５％エタノール浸出抽出原料から５６〜８６％のカテキンを抽出することが可能である。これは、カテキン化学構成成分参照としてＥＣＧＣ、ＥＣＧ、ＥＧＣ、およびＣを使用する天然緑茶種植物材料に見られるカテキン化学構成成分の５０〜７７％収率に等しい。これらを参照として使用してこのフェノール酸画分のＨＰＬＣ分析に基付くと、フェノール酸化学構成成分の純度は、フェノール酸画分抽出生成物の約４０％となる。さらに酸性溶出溶媒は、最終カテキン画分生成物中のカフェインを抽出画分の１％未満〜０．２質量％もの低さに低減する精製済みカテキン画分のさらなる脱カフェインにとって優れたプロセスであることが立証されている。さらに、ＥＧＣＧ濃度が６５〜７５質量％に増加し、カテキン純度が抽出副画分の９５質量％を超える副画分を得ることができる。このデータは、抽出画分中のＥＧＣＧ、ＥＣＧ、およびＣの質量％の選択的増加ならびにＥＧＣの減少によってカテキン抽出画分をプロファイルするアフィニティー吸着プロセスクロマトグラフィーの能力を支持するものである。
【０１１８】
工程５に教示される方法（水浸出プロセス）を使用すると、最初の緑茶葉原料に対して約３．６質量％という高収率の水溶性化学構成成分が得られる。この粗抽出物中のＬ−テアニン濃度は約１７質量％である。残りの水溶性化合物は大部分が多糖であり、これは、６０％エタノール沈殿を使用すると緑茶葉中の多糖濃度が約２．４２質量％となり、純度が８６．８％であったと報告した他の研究結果（２９）と一致するものである。
【０１１９】
本発明の工程６に教示される方法（Ｌ−テアニンおよび多糖の抽出および精製プロセス）を使用すると、水溶性エタノール不溶性多糖の全収率は、最初の原料に対して約１．２質量％である。多糖抽出画分の純度は、参照標準として様々な分子量のデキストランを使用する比色法に基付いて約５６〜７６％である。これらのデータは、９５％を超える全多糖純度と一致する。
【０１２０】
さらに工程６に教示される方法を使用すると、Ｌ−テアニンの収率は、最初の緑茶葉原料に対して約０．８質量％であり、これは最初の原料中に存在するＬ−テアニンの５５％を超えている。これらの方法を使用して、精製済みテアニン抽出画分の９０質量％のテアニン純度を実現することができる。
【０１２１】
食品および医薬品
本発明の食品の一形態として、任意選択の形態、例えば顆粒状態、粒状、ペースト状、ゲル状、固体状態、または液体状態に配合することができる。これらの形態では、食品に添加できる当業者に従来知られている様々な種類の物質、例えば結合剤、崩壊剤、増粘剤、分散剤、再吸収促進剤、検査薬、緩衝剤、界面活性剤、溶解助剤、保存剤、乳化剤、等張剤、安定化剤、またはｐＨ調節剤等が任意選択で含有され得る。食品に添加されるエルダーベリー抽出物の量は特に限定されず、例えば体重約６０ｋｇの成人によって摂取される量としては１日当たり約１０ｍｇ〜５ｇ、好ましくは５０ｍｇ〜２ｇであってよい。
【０１２２】
特に、保険機能食品等の保存用食品として使用される場合、本発明の所定の効果が十分に示されるような量で本発明の有効成分を含有することが好ましい。
【０１２３】
本発明の医薬品は、例えば錠剤、顆粒、粉剤、カプセル剤等の固体薬剤、または注入剤等の液体薬剤として、従来知られている方法に従って任意選択で調製することができる。これらの医薬品には、例えば結合剤、崩壊剤、増粘剤、分散剤、再吸収促進剤、検査薬、緩衝剤、界面活性剤、溶解助剤、保存剤、乳化剤、等張剤、安定化剤、またはｐＨ調節剤などの一般に使用される任意の材料を配合することができる。
【０１２４】
医薬品としての有効成分（緑茶抽出物）の投与量は、種類、剤形、患者の年齢、体重、または適用される症候等に依存して変わり得、例えば経口投与される場合、体重約６０ｋｇの成人については１日１回または数回投与され、１日当たり約１０ｍｇ〜５ｇ、好ましくは約５０ｍｇ〜２ｇの量で投与される。有効成分は、緑茶抽出物の１つまたはいくつかの成分であってよい。
【０１２５】
本方法はまた、１日当たり２回以上、１日当たり３回以上、１日当たり４回以上、および１日当たり１〜１５回の範囲でかかる抽出物を投与することを含む。かかる投与は、連続的にある日数、週数、月数、もしくは年数の間、毎日行うことができ、または特定の状態を治療もしくは予防するために特定の回数で行うことができる。例えばあるヒトは、精神集中、認識、および記憶を強化するため、または２型糖尿病を予防および治療するため、心臓血管疾患卒中を予防するため、または胃腸障害を治療するため、または痛風を含む炎症性障害および関節炎を治療するため、または一般的な風邪、細菌感染および真菌感染症を治療するために、少なくとも１日１回数年間、緑茶種抽出物を投与され得る。
【０１２６】
前述の説明は、本発明の実施に現在企図されている最良の態様を含む。この説明は、本発明の一般的原理を例示するためのものであり、限定的な意味と解釈されるべきではない。本発明は、以下の実施例によってさらに例示されるが、これらは本発明の範囲に制限を付与するものと決して解釈されるべきではない。それとは逆に、本明細書の説明の読後に本発明の精神から逸脱することなく当業者にそれら自体を提案できる様々な他の実施形態、改変形態、およびそれらの等価物を手段として用いることができることを明確に理解されたい。
【０１２７】
本明細書で使用されるすべての用語は、当業者によって通常認められている用法で解釈されるとみなされる。本明細書に引用した特許および特許出願または参考文献は、すべて参照によってその全体が組み込まれる。
【実施例】
【０１２８】
材料
植物：本発明では中国緑茶４種および日本緑茶１種を使用した。
【０１２９】
Ｆ１：中国緑茶葉は、シンガポールＮａｍ Ｗａｎ Ｔｅａ Ｃｏ Ｐｔｅ Ｌｔｄから購入した。
【０１３０】
Ｆ２：高級中国緑茶「ＢａｉｆｕＴｅａ」は、中国Ｊｉａｎｇｓｕ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ製のものとした。
【０１３１】
Ｆ３：高級中国緑茶「Ｋａｉ Ｈｕａ Ｌｏｎｇ Ｄｉｎｇ」は、Ｚｈｅｊｉｎｇ Ｋａｉ Ｈｕａ Ｃｏ．製の春摘みのものとした。
【０１３２】
Ｆ４：高級中国緑茶「Ｋａｉ Ｈｕａ Ｌｏｎｇ Ｄｉｎｇ」は、Ｚｈｅｊｉｎｇ Ｋａｉ Ｈｕａ Ｃｏ．製の秋摘みのものとした。
【０１３３】
ＪＰＧＴ：高級日本緑茶。
【０１３４】
【表１９】
有機溶媒
ＨＰＬＣ用アセトニトリル（７５−０５−８）、勾配グレード≧９９．９％（ＧＣ）（０００６８７）；ヘキサン（１１０−５４−３）、９５＋％、分光光度グレード（２４８８７８）、４．８％イソプロパノールで変性したエタノール（０２８５３）；エタノール（６４−１７−５）、無水（０２８８３）；メタノール（６７−５６−１）、９９．９３％、ＡＣＳ ＨＰＬＣグレード、（４３９１９９３）；および水（７７３２−１８−５）、ＨＰＬＣグレード、（９５３０４）；すべてＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏから購入した。
【０１３５】
酸および塩基
ギ酸（６４−１８−６）、５０％溶液（０９６７６）；フェノール（１０８−９５−２）（Ｐ３６５３）；硫酸（７６６４−９３−９）、ＡＣＳ試薬、９５〜９７％（４４７１９）；トリフルオロ酢酸（７６−０５−１）、９９．８％分光光度グレード（３０２０３１）リン酸（７６６４−３８−２）、８５％水溶液（４３８０８１）；すべてＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．から購入した。リン酸カリウム、一塩基性（７７７８−７７−０）＞９９％純度（２０５９２５０００、Ｌｏｔ番号：Ａ０１９８４２６０１）は、Ａｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｉｃｓ Ｃｏ．から購入した。
【０１３６】
化学物質参照標準
（＋）−カテキン（１５４−２３−４）、純度９５％（０３３１０）；（−）−エピカテキン（４９０−４６−０）、純度９３．６％（０５１２５）；（−）−エピカテキンガレート（１２５７−０８−５）、純度９９％（０５１３５）；（−）−エピガロカテキン（９７０−７４−１）、純度９８．３％（０５１４５）；（−）−エピガロカテキンガレート（９８９−５１−５）、純度９４％（０５１５１）；Ｌ−テアニン（３０８６−６１−６）、純度：９９．０％（２０２５０−００１）；すべてＣｈｒｏｍａｄｅｘ（ｗｗｗ．ｃｈｒｏｍａｄｅｘ．ｃｏｍ）から購入した。カフェイン（５８−０８０２）、純粋、無水＞９９％（２７６００）；テオブロミン（８３−６７−０）、純度＞９９％（Ｔ４５００）；およびクロロゲン酸（３２７−９７−９）、最小９５％滴定（Ｃ３８７８）はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．から購入した。ＤＩＮによって認定されたデキストラン標準５０００（００２６９）、５０，０００（００８９１）、および４１０，０００（００８９５）はＦｌｕｋａ Ｃｏ．から購入した。シュウ酸（１４４−６２−７）、９８％純度（１９４１３１）はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．から購入した。標準物質の構造を表２０に示す。
【０１３７】
【表２０】
方法
ＨＰＬＣ法
カテキンおよびアルカロイド分析
クロマトグラフシステム：ＬＣ１０ＡＤＶＰポンプとＳＰＤ−Ｍ１０ＡＶＰフォトダイオードアレイ検出器を備えた島津高速液体クロマトグラフＬＣ−１０ＡＶＰシステム。得られた抽出生成物を、逆相ＪｕｐｉｔｅｒＣ１８カラム（２５０×４．６ｍｍＩ．Ｄ．、５μ、３００Å）（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、パート番号：００Ｇ−４０５３−Ｅ０、シリアル番号：２２１７５２０−３、バッチ番号：５２４３−１７）で測定した。移動相は、Ａ（０．５％（ｖ／ｖ）ギ酸水溶液）およびＢ（アセトニトリル）からなっていた。勾配を以下のようにプログラムした。最初の６分以内にＡは１００％を維持し、６〜１０分では、溶媒Ｂは０％〜１２％に直線的に増加し、１０〜３５分ではＢ直線１２％〜２１％、次いで３５〜４０分ではＢ直線２１％〜２５％、次いで４０〜５０分ではＢ直線は１００％。注入量は１０μｌであり、移動相の流量は１ｍｌ／分であった。カラム温度は５０℃であった。
【０１３８】
Ｃ（カテキン）、ＥＧＣ（エピガロカテキン）、ＥＣＧ（エピカテキンガレート）、ＥＧＣＧ（エピガロカテキンガレート）、カフェイン、テオブロミン、クロロゲン酸のメタノール保存溶液を、濃度１ｍｇ／ｍｌで調製した。１ミリリットル分量の標準溶液を、１０ｍｌ容量のフラスコに入れて、標準混合溶液を得た。次いで、参照標準混合溶液を段階的に希釈して、それぞれ最終濃度０．５、０．２、０．１、０．０５、および０．０１ｍｇ／ｍｌの一連の溶液を得た。これらの５つの濃度で標準曲線を作成し、対応する濃度に対して線形回帰を使用してピーク面積をプロットして標準曲線を作成した。結果を表２１にまとめる。
【０１３９】
【表２１】
１理論段はＮ＝１６×（ｔＲ／ｗ）２によって算出した。ｔＲは保持時間であり、ｗはピーク幅である。ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｍｎ−ｎｅｔ．ｃｏｍ／ｗｅｂ％５ＣＭＮ−ＷＥＢ−ＨＰＬＣＫａｔａｌｏｇ．ｎｓｆ／ＷｅｂＥ／ＧＲＵＮＤＬＡＧＥＮ 。
【０１４０】
テアニン分析
テアニン分析は、逆相ＪｕｐｉｔｅｒＣ１８カラム（２５０×４．６ｍｍＩ．Ｄ．、５μ、３００Å）（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、パート番号：００Ｇ−４０５３−Ｅ０、シリアル番号：２２１７５２０−３、バッチ番号：５２４３−１７）で実施した。移動相を濃度０．１％のトリフルオロ酢酸で調節した。移動相の流量は１ｍｌ／分であった。検出器を波長２０３ｎｍに設定した。
【０１４１】
シュウ酸分析
シュウ酸分析は、逆相ＪｕｐｉｔｅｒＣ１８カラム（２５０×４．６ｍｍＩ．Ｄ．、５μ、３００Å）（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、パート番号：００Ｇ−４０５３−Ｅ０、シリアル番号：２２１７５２０−３、バッチ番号：５２４３−１７）で実施した。移動相は、Ａ（０．５％ＫＨ２ＰＯ４（ｗ／ｖ）水溶液）およびＢ（アセトニトリル）からなっていた。０．５％ＫＨ２ＰＯ４（ｗ／ｖ）水溶液の移動相を、蒸留水に固体ＫＨ２ＰＯ４を溶解することによって調製した。次いで、Ｈ３ＰＯ４溶液１．０ｍｏｌ／ＬでＰＨ２．８０に調節した。勾配を以下のようにプログラムした。溶媒Ｂは１５分で１０％〜４０％に直線的に増加し、次いでさらなる５分間で４０％〜１０％に減少した。注入量は１０μｌであり、移動相の流量は１ｍｌ／分であった。カラム温度は２５℃であった。検出波長は２６２ｎｍであった。異なるシュウ酸水中濃度０．１ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌをアッセイした。これらの濃度で標準曲線を作成し、対応する濃度に対して線形回帰を使用してピーク面積をプロットして、標準曲線を作成した。サンプル溶液中のシュウ酸含量を、サンプル溶液のピーク面積と、知られている標準のピーク面積とを比較することによって定量化した。
【０１４２】
ＧＣ−ＭＳ法
ＧＣ−ＭＳ分析は、島津ＧＣＭＳ−ＱＰ２０１０システムを使用して実施した。このシステムは、高速ガスクロマトグラフ、直結ＧＣ／ＭＳインターフェース、電子衝撃（ＥＩ）イオン源と独立温度制御、四重極質量分析器等を含む。このシステムは、データ収集および実施後分析のためのＧＣＭＳ溶液Ｖｅｒ．２ソフトウェアで制御される。Ａｇｉｌｅｎｔ Ｊ＆Ｗ ＤＢ−５溶融シリカ毛細管カラム（３０ｍ×０．２５ｍｍ ｉ．ｄ．、０．２５μｍフィルム厚さ）（カタログ：１２２５０３２、シリアル番号：ＵＳ５２８５７７４Ｈ）で、以下の温度プログラムを使用して分離を実施した。最初の温度を６０℃で１分間保持し、次いで速度３℃／分で１８０℃に上昇し、３５分間保持し、全実施時間は７６分であった。サンプル注入温度を２２０℃とし、サンプル１μｌを、スプリットレスモードの自動注入器によって１分間注入した。キャリアガスはヘリウムとし、流量は圧力４０．１ＫＰａで制御した。かかる圧力下では、流量は０．７９ｍｌ／分であり、直線速度は３２．５ｃｍ／分であった。ＭＳイオン源温度は２３０℃であり、ＧＣ／ＭＳインターフェース温度は２３０℃であった。ＭＳ検出器を、５０ｍ／ｚおよび５００ｍ／ｚの間で、走査速度１０００ＡＭＵ／秒で走査した。溶媒カットオフ温度は３．５分であった。
【０１４３】
多糖分析
分光光度計システム：この研究では島津ＵＶ−１７００紫外線可視分光光度計（１９０〜１１００ｎｍ、１ｍｍ分解能）を使用した。多糖分析には、比色法（Ｄｕｂｏｉｓ，Ｍ．、Ｇｉｌｌｅｓ，Ｋ．Ａ．、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、Ｊ．Ｋ．、Ｒｅｂｅｒｓ，Ｐ．Ａ．およびＳｍｉｔｈ，Ｆ．、Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｕｇａｒｓ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９５６年、２８巻３号、３５０〜３５６頁）を使用した。デキストラン（Ｍｗ＝５０００、５０，０００、および４１０，０００）保存溶液０．１ｍｇ／ｍｌを作成する。保存溶液０．０８、０．１６、０．２４、０．３２、０．４０ｍｌを取り、蒸留水で体積０．４ｍｌにする。次いで５％のフェノール溶液０．２ｍｌおよび濃硫酸１ｍｌに添加する。混合物を１０分間静置した後、ＵＶ走査を実施した。最大吸収は４８８ｎｍで見られた。次いで波長を４８８ｎｍに設定し、各サンプルについて吸収度を測定する。結果を表２２に示す。デキストラン溶液のそれぞれについて、以下のように標準較正曲線を得た。デキストラン５０００、吸収度＝０．０１９１９＋０．０２７７８２Ｃ（μｇ）、Ｒ２＝０．９７（Ｎ＝５）；デキストラン５０，０００、吸収度＝０．００７５７１４＋０．０３２１９６Ｃ（μｇ）、Ｒ２＝０．９６（Ｎ＝５）；およびデキストラン４１０，０００、吸収度＝０．０３４８１＋０．０３６２９３Ｃ（μｇ）、Ｒ２＝０．９８（Ｎ＝５）。
【０１４４】
【表２２】
緑茶抽出物のＤＡＲＴ−ＭＳ分析
ＪＥＯＬ ＡｃｃｕＴＯＦ−ＤＡＲＴ質量分析計（Ｊｅｏｌ ＵＳＡ、Ｐｅａｂｏｄｙ、ＭＡ）を、緑茶抽出物の質量分析で使用した。この飛行時間型（ＴＯＦ）質量分析計技術は、サンプル調製を必要とせず（または必要としても最小限）質量単位０．００００１までの精度で質量が得られる。正イオンモード（ＤＡＲＴ＋）では、ニードル電圧を３５００Ｖに、発熱体を３００℃に、電極１を１５０Ｖに、電極２を２５０Ｖに、ヘリウムガス流を１分当たり３．６９リットル（ＬＰＭ）に設定した。質量分析計には、以下の設定を取り込んだ。オリフィス１を２０Ｖに、リングレンズ電圧を５Ｖに、オリフィス２を５Ｖに設定する。分解能を得るために、ピーク電圧を１０００Ｖに設定し約１００ｍ／ｚで開始した。マイクロチャネルプレート検出器（ＭＣＰ）電圧を２５５０Ｖに設定した。ＰＥＧ６００の１０％溶液を使用して、各サンプルについて較正を内部で実施し、必要な質量範囲１００〜１０００質量単位全体にマスマーカーを提供した。
【０１４５】
一方の端が閉じられたホウケイ酸ガラス融点毛細管を使用して、緑茶サンプルをＤＡＲＴヘリウムプラズマに粉末として入れた。サンプルは、ＴＯＦへの送達を最大限にするＨｅプラズマビームに均質な表面積を曝露させることができる毛細管上の薄膜として集まる。分析１回当たり約３〜５秒間、毛細管をＨｅプラズマ中に保持する。分析中にはサンプルの熱分解は見られなかった。
【０１４６】
負イオンモード（ＤＡＲＴ−）では、ＤＡＲＴおよびＡｃｃｕＴＯＦ−ＭＳを負イオンモードに切り替えた。ニードル電圧は３５００Ｖ、発熱体は３００℃、電極１は１５０Ｖ、電極２は２５０Ｖ、ヘリウムガス流は３．６９ＬＰＭであった。質量分析計には、以下の設定を取り込んだ。オリフィス１を−２０Ｖに設定し、リングレンズ電圧を−５Ｖに設定し、オリフィス２を−５Ｖに設定する。負イオンモードにおいて低ｍ／ｚ範囲の適切な分解能を実現するために、ピーク電圧を６００Ｖに設定した。ＭＣＰ電圧を２６００Ｖに設定した。サンプルを正イオンモードと正確に同じやり方でＤＡＲＴに入れた。ペルフルオロカルボン酸溶液を使用して、各サンプルについて較正を内部で実施した。
【０１４７】
ＪＥＯＬ ＡｃｃｕＴＯＦ ＤＡＲＴ−ＭＳを備えた元素組成および同位体マッチングプログラムによって分子式を確認した。文献に基付いて、緑茶構成成分の検索可能なデータベースを開発した。質量スペクトルとしての全化学物質の識別（識別済みおよび未識別）は、９０％を超える信頼水準で割り当てられる。
【０１４８】
（実施例１）
工程１の実施例：緑茶精油の単一工程のＳＦＥ抽出および精製
すべてのＳＦＥ抽出を、圧力および温度をそれぞれ最大６９０バールおよび２００℃に設計したＳＦＴ２５０（Ｓｕｐｅｒｃｒｉｔｉｃａｌ Ｆｌｕｉｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗａｒｋ、Ｄｅｌａｗａｒｅ、ＵＳＡ）で実施した。この装置は、動的または静的モードで操作する柔軟性を伴って、超臨界条件における簡単で効果的な抽出を可能にする。この装置は、オーブン、ポンプおよび制御、ならびに収集モジュールの３つのモジュールからなる。オーブンは、１つの予熱カラムおよび１つの１００ｍｌの抽出容器を有する。ポンプモジュールには、３００ｍｌ／分の一定の流量の圧縮空気駆動式ポンプが備えられている。収集モジュールは４０ｍｌのガラスバイアルであり、抽出生成物を回収するためにキャップおよび隔壁で封止される。それには、マイクロメーターバルブおよび流量計がさらに備えられている。抽出容器の圧力および温度はモニタされ、＋／−３バールおよび＋／−１℃以内で制御される。
【０１４９】
典型的な実験実施例では、１４０メッシュスクリーンのふるいにかけた１０５μｍを超える寸法の茶切断緑茶葉２５グラムを、各実験毎に１００ｍｌの抽出容器に入れた。オーブンを所望の温度に予熱した後、充填された容器を搭載した。容器をオーブンに接続した後、抽出系をＣＯ２で加圧することによって（８５０ｐｓｉｇ）漏出について該系を試験し、パージした。この系を閉じ、空気駆動液体ポンプを使用して所望の抽出圧力に加圧した。次いで、該系を平衡のために〜３分間静置した。サンプリングバイアル（４０ｍｌ）を秤量し、サンプリングポートに接続した。５ＳＬＰＭ（９．８ｇ／分）の速度でＣＯ２を流すことによって抽出を開始したが、この速度は絞り弁で制御される。使用した全ＣＯ２と搭載した未加工材料の重量の重量比として定義される溶媒／供給物比を算出した。抽出プロセス中、抽出サンプルを５分毎に秤量した。サンプル重量が２つの秤量測定値間で５％を超えて変化しなくなったとき、抽出が終了したと推定した。収率は、全抽出物と未加工原料の供給物の重量比と定義した。
【０１５０】
この実験実施例では、温度が４０℃に設定され、圧力が２００バールに設定されるように抽出条件を設定した。ＣＯ２流量は９．８ｇ／分であった。
【０１５１】
（実施例２）
工程２の実施例：緑茶植物材料の単一工程のＳＦＥ脱カフェイン
すべてのＳＦＥ抽出を、ＳＦＴ２５０（Ｓｕｐｅｒｃｒｉｔｉｃａｌ Ｆｌｕｉｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗａｒｋ、Ｄｅｌａｗａｒｅ、ＵＳＡ）で実施した。典型的な実験実施例では、蒸留水共溶媒２５ｇｍで湿潤した精油抽出済み茶の切断緑茶葉２５グラムの残渣を、各実験毎に１００ｍｌの抽出容器に入れた。オーブンを所望の温度に予熱した後、充填された容器を搭載した。容器をオーブンに接続した後、抽出系をＣＯ２で加圧することによって（８５０ｐｓｉｇ）漏出について該系を試験し、パージした。この系を閉じ、空気駆動液体ポンプを使用して所望の抽出圧力に加圧した。次いで、該系を平衡のために〜３分間静置した。サンプリングバイアル（４０ｍｌ）を秤量し、サンプリングポートに接続した。５ＳＬＰＭ（９．８ｇ／分）の速度でＣＯ２を流すことによって抽出を開始したが、この速度は絞り弁で制御される。毎分、その系に共溶媒３ｍｌを注入した。抽出時間は４時間であった。使用した全ＣＯ２と搭載した未加工材料の重量の重量比として定義される溶媒／供給物比を算出した。収率は、全抽出物と未加工原料の供給物の重量比と定義した。抽出条件は７０℃および５００バールに設定した。
【０１５２】
（実施例３）
工程３の実施例：９５％エタノール浸出抽出
緑茶葉材料のカテキン化学構成成分の、２段階溶媒抽出物の典型的な実施例は以下の通りである。原料は、工程２のＳＣＣＯ２脱カフェインからの茶切断緑茶葉ＳＦＥ残渣または未加工緑茶葉原料２５ｇｍとした。溶媒は、９５％エタノール２５０ｍｌとした。この方法では、原料および９５％エタノール２５０ｍｌを、１つの５００ｍｌの抽出容器に個々に入れ、温水浴中、７０℃で２時間混合した。保持粒経４〜８μｍを有するＦｉｓｈｅｒｂｒａｎｄ Ｐ４濾紙を使用して抽出溶液を濾過し、３０００ｒｐｍで２０分間遠心分離にかけ、さらなる抽出のために微粒子残渣を使用した。収率算出およびＨＰＬＣ分析のために濾液（上清）を収集した。段階１の残渣を、前述の方法を使用して２時間抽出した（段階２）。上清抽出物を混合し、ロータリーエバポレーターを使用してエタノールを除去した。カテキン画分のさらなる精製が望ましい場合、アルコールを含まない粗カテキン抽出生成物を、工程４の処理で蒸留水２５０ｍｌに溶解する。段階２の抽出の残渣は、テアニンおよび多糖画分のさらなる処理と同じようにした（工程５参照）。
【０１５３】
（実施例４）
工程４の実施例 カテキン画分のアフィニティー吸着抽出
典型的な実験では、使用溶液は工程３の緑茶の２段階９５％エタノール浸出抽出の透明な水溶液であった。これらの実施例では、工程３に記載のように７０℃で９５％エタノール２５０ｍｌを使用して（溶媒と供給物比２０／１）、緑ＳＦＥ脱カフェイン済み残渣２５ｇｍを２段階浸出抽出した。２段階抽出物を混合し、ロータリーエバポレーションを使用してエタノールを除去した。次いで蒸留水を添加して、溶液の最初の濃度を再構成した（体積５００ｍｌ）。
【０１５４】
アフィニティー吸着ポリマー樹脂はＸＡＤ７ＨＰであった（別表１参照）。アフィニティー吸着物３０ｇｍを、ＩＤ１０ｍｍおよび長さ３５０ｍｍのガラスカラムへの充填前および充填後に、９５％エタノール（４〜５ＢＶ）および蒸留水（４〜５ＢＶ）で予め洗浄した。吸着剤のＢＶ（床体積）は３５ｍｌであった。溶液中濃度＝４．８〜９．６ｍｇ／ｍｌを有する水溶液１００ｍｌ（脱エタノール化工程３の浸出溶液）を、流量１．２ｍｌ／分（２ＢＶ／時間）で充填したカラムに入れた。搭載時間は８５分であった。ロードしたカラムを、流量１０ＢＶ／時間、洗浄時間２５分で蒸留水１５０ｍｌを用いて洗浄した。ロードしたカラムを脱カフェインするために、１０％エタノール中５％のＨ２ＳＯ４、１００ｍｌを使用して、カフェイン化合物を流量２．２ｍｌ／分（２ＢＶ／時間）で溶出した。溶出液を破棄した。次いで蒸留水２５０ｍｌを使用して、流量６ｍｌ／分（１２ＢＶ／時間）で、または洗浄溶液が中性ｐＨになるまで、カラムを洗浄した。８０％エタノール１００ｍｌを使用して、流量１．２ｍｌ／分（２ＢＶ／時間）、溶出時間８５分で、ロードしたカラムからカテキンを溶出した。溶出中６画分（Ｆ１〜Ｆ６）を、それぞれ０〜０．７（Ｆ１）、０．８〜１．０（Ｆ２）、１．０〜１．１（Ｆ３）、１．１〜１．３（Ｆ４）、１．３〜１．６（Ｆ５）、および１．６〜３（Ｆ６）ＢＶで収集した。次いで、無水エタノール３ＢＶを使用して、カラム上の残りの化学物質を流量３．６ＢＶ／時間で清浄にし、次いで蒸留水３ＢＶを用いて３．８ＢＶ／時間で洗浄した。使用物、流出物、洗浄液、およびカフェイン溶出液をすべて収集し、質量含有量について測定し、カテキン（ＥＧＣＧ、ＥＧＣ、ＥＣＧ、Ｃ）、カフェイン、テオブロミン、およびクロロゲン酸を測定するために、ＨＰＬＣを使用して分析した。各溶出画分を収集し、ＨＰＬＣによって分析した。
【０１５５】
（実施例５）
工程の実施例 多糖およびテアニンの抽出のための水浸出プロセス
水浸出プロセスの典型的な実験実施例では、工程３の９５％エタノール浸出プロセスからの残渣２０ｇｍおよび蒸留水４００ｍｌを、５００ｍｌの抽出容器に別々に入れ、７０℃の水浴中で２時間混合する。透明な最上層をデカントし、固体残渣の第２段階の抽出物を、同じ方法を使用して蒸留水４００ｍｌで抽出した。２段階抽出溶液を２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離にかけ、ＦｉｓｈｅｒｂｒａｎｄＰ４濾紙（保持粒経４〜８μｍ）で濾過した。２段階でデカントした上清溶液を収集し、テアニン含量の収率算出およびＨＰＬＣ分析のために混合した。
【０１５６】
（実施例６）
工程６の実施例 多糖画分およびテアニンの抽出および精製
緑茶の水溶性エタノール不溶性精製済み多糖画分化学構成成分およびテアニン化学構成成分の溶媒抽出および沈殿の典型的な実験実施例は以下の通りである。工程３の２段階９５％エタノール浸出抽出からの固体残渣２０ｇｍを、工程５に先に記載したように２段階の蒸留水浸出を使用して抽出した。工程５の２段階抽出溶液を混合した。真空ロータリーエバポレーションを使用して、６０％の水溶媒を除去して透明な上清抽出溶液を濃縮した。次いで無水エタノールを添加して、最終エタノール濃度を７５％にした。この溶液を１時間静置し、沈殿物を観測した。抽出溶液を２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離にかけ、上清をデカントし、凍結乾燥させ、さらなる処理のために保存した。多糖沈殿物を収集し、凍結乾燥させた。乾燥多糖画分を秤量し水に溶解して、参照標準としてデキストランを使用して比色法で多糖純度を分析した。さらに、ＡｃｃｕＴＯＦ−ＤＡＲＴ質量分析を使用して、多糖画分を含む化合物の分子量をさらにプロファイルした。結果を図６〜１１に示す。
【０１５７】
Ｌ−テアニンを含有する乾燥した上清生成物を蒸留水に溶解して、１０％溶液を作製した。この溶液に無水エタノール４体積を添加し、混合し、１時間静置した。次いで溶液を６，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離にかけ、デカントした。沈殿物を破棄した。収集した上清溶液を、真空ロータリーエバポレーションを使用して６０℃で８０％エタノール溶液に濃縮した。この８０％エタノール溶液を室温に冷却した。次いで、エタノール４体積をこの溶液に添加した。この溶液を２４時間０℃の冷蔵庫に入れて、テアニン化合物を結晶化させた。溶液を２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離にかけ、次いで結晶を収集し、真空下６０℃で乾燥させた。
【０１５８】
（実施例７）
以下の成分を配合のために混合する。
【０１５９】
【表２３】
緑茶の新規抽出物は、天然根茎材料または従来の抽出生成物に見られるよりも高い質量％で、精製済み精油画分、カテキン画分、テアニン画分、および多糖画分を含む。配合物は、任意の経口用剤形にすることができ、所望の生理学的、心理学的、医学的効果（抗酸化、酸素フリーラジカル捕捉、およびニトロソ化阻害活性、免疫増強、抗骨粗鬆症、心臓血管疾患予防および治療、脳血管疾患予防および治療、コレステロール低下活性、癌の予防および治療、ＨＩＶおよびウィルス疾患治療の治療、減量および熱産生、老化予防、糖尿病の管理、記憶および認識強化、不安軽減、ならびに気分高揚）に対して、必要に応じて毎日または１日当たり１５回まで投与することができる。
【０１６０】
（実施例８）
以下の成分を以下の配合のために混合する。
【０１６１】
【表２４】
緑茶の新規抽出組成物は、天然植物材料または従来の抽出生成物に見られるよりも高い質量％で、精製済み精油画分、カテキン、テアニン、および多糖化学構成成分画分を含む。配合物は、任意の経口用剤形にすることができ、所望の生理学的、心理学的、医学的効果に対して、必要に応じて１日当たり１５回まで安全に投与することができる。
【０１６２】
引用参考文献：
【０１６３】
【化１】
【０１６４】
【化２】
【図面の簡単な説明】
【０１６５】
【図１】本発明の精油の超臨界二酸化炭素抽出（工程１）および緑茶の脱カフェイン（工程２）の例示的略図である。
【図２】本発明の粗緑茶カテキン化学構成成分画分のエタノール抽出の例示的概略図である。
【図３】本発明のアフィニティー吸着抽出プロセスの例示的略図である。
【図４】本発明のＬ−テアニンおよび多糖の水浸出抽出の例示的略図である。
【図５】本発明のＬ−テアニンおよび多糖画分の精製の例示的略図である。
【図６】本方法の工程６からの緑茶多糖画分のＡｃｃｕＴＯＦ−ＤＡＲＴ質量スペクトル（正イオンモード）のグラフである。
【図７】本方法の工程６からの緑茶多糖画分のＡｃｃｕＴＯＦ−ＤＡＲＴ質量スペクトル（負イオンモード）のグラフである。
【図８】本方法の工程６からの緑茶多糖画分のＡｃｃｕＴＯＦ−ＤＡＲＴ質量スペクトル（正イオンモード）のグラフである。
【図９】本方法の工程６からの緑茶多糖画分のＡｃｃｕＴＯＦ−ＤＡＲＴ質量スペクトル（負イオンモード）のグラフである。
【図１０】本方法の工程６からの緑茶多糖画分のＡｃｃｕＴＯＦ−ＤＡＲＴ質量スペクトル（正イオンモード）のグラフである。
【図１１】本方法の工程６からの緑茶多糖画分のＡｃｃｕＴＯＦ−ＤＡＲＴ質量スペクトル（負イオンモード）のグラフである。
【図１２】市販の緑茶（Ｋａｉ Ｈｕａ Ｌｏｎｇ Ｄｉｎｇ）のＡｃｃｕＴＯＦ−ＤＡＲＴ質量スペクトル（正イオンモード）のグラフである。
【図１３】本方法の工程３からの９５％エタノール浸出による緑茶粗抽出物のＡｃｃｕＴＯＦ−ＤＡＲＴ質量スペクトル（正イオンモード）のグラフである。
【図１４】ＸＡＤ７ＨＰ脱着充填剤を使用するカラムクロマトグラフィーによる本方法の工程４からの緑茶フェノール酸供給物のＡｃｃｕＴＯＦ−ＤＡＲＴ質量スペクトル（正イオンモード）のグラフである。
【図１５】ＸＡＤ７ＨＰ脱着充填剤を使用するカラムクロマトグラフィーによる本方法の工程４からの緑茶精製済みＦ２画分のＡｃｃｕＴＯＦ−ＤＡＲＴ質量スペクトル（正イオンモード）のグラフである。
【図１６】ＸＡＤ７ＨＰ脱着充填剤を使用するカラムクロマトグラフィーによる本方法の工程４からの緑茶精製済みＦ３画分のＡｃｃｕＴＯＦ−ＤＡＲＴ質量スペクトル（正イオンモード）のグラフである。
【図１７】ＸＡＤ７ＨＰ脱着充填剤を使用するカラムクロマトグラフィーによる本方法の工程４からの緑茶精製済みＦ４画分のＡｃｃｕＴＯＦ−ＤＡＲＴ質量スペクトル（正イオンモード）のグラフである。
【図１８】ＸＡＤ７ＨＰ脱着充填剤を使用するカラムクロマトグラフィーによる本方法の工程４からの緑茶精製済みＦ５画分のＡｃｃｕＴＯＦ−ＤＡＲＴ質量スペクトル（正イオンモード）のグラフである。
【図１９】市販の緑茶（Ｋａｉ Ｈｕａ Ｌｏｎｇ Ｄｉｎｇ）のＡｃｃｕＴＯＦ−ＤＡＲＴ質量スペクトル（負イオンモード）のグラフである。
【図２０】本方法の工程３からの９５％エタノール浸出による緑茶粗抽出物のＡｃｃｕＴＯＦ−ＤＡＲＴ質量スペクトル（負イオンモード）のグラフである。
【図２１】ＸＡＤ７ＨＰ脱着充填剤を使用するカラムクロマトグラフィーによる本方法の工程４からの緑茶フェノール酸供給物のＡｃｃｕＴＯＦ−ＤＡＲＴ質量スペクトル（負イオンモード）のグラフである。
【図２２】ＸＡＤ７ＨＰ脱着充填剤を使用するカラムクロマトグラフィーによる本方法の工程４からの緑茶精製済みＦ２画分のＡｃｃｕＴＯＦ−ＤＡＲＴ質量スペクトル（負イオンモード）のグラフである。
【図２３】ＸＡＤ７ＨＰ脱着充填剤を使用するカラムクロマトグラフィーによる本方法の工程４からの緑茶精製済みＦ３画分のＡｃｃｕＴＯＦ−ＤＡＲＴ質量スペクトル（負イオンモード）のグラフである。
【図２４】ＸＡＤ７ＨＰ脱着充填剤を使用するカラムクロマトグラフィーによる本方法の工程４からの緑茶精製済みＦ４画分のＡｃｃｕＴＯＦ−ＤＡＲＴ質量スペクトル（負イオンモード）のグラフである。
【図２５】ＸＡＤ７ＨＰ脱着充填剤を使用するカラムクロマトグラフィーによる本方法の工程４からの緑茶精製済みＦ５画分のＡｃｃｕＴＯＦ−ＤＡＲＴ質量スペクトル（負イオンモード）のグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
図６〜２５のいずれかの実時間直接分析（ＤＡＲＴ）質量分析クロマトグラムを有する画分を含む緑茶種抽出物。
【請求項２】
精油、ポリフェノール、多糖、およびそれらの＋組合せからなる群から選択される化合物を含む、請求項１に記載の緑茶種抽出物。
【請求項３】
前記精油が、ｎ−ヘキサデカン酸、テトラデカン酸、９−ヘキサデカノール、１−ウンデカノール、１−ヘキサデカノール、オレイルアルコール、９−オクタデセン−１−オール、ノナデカノール、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項２に記載の緑茶種抽出物。
【請求項４】
前記ポリフェノールが、カテキン、フラバノール、フラボノール配糖体、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項２に記載の緑茶種抽出物。
【請求項５】
前記カテキンが、カテキン（Ｃ）、エピカテキン（ＥＣ）、エピカテキンガレート（ＥＣＧ）、ガロカテキン（ＧＣ）、エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）、エピガロカテキン（ＥＧＣ）、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項４に記載の緑茶種抽出物。
【請求項６】
前記フラバノールが、ケルセチンおよびルチンからなる群から選択される、請求項４に記載の緑茶種。
【請求項７】
前記フラボノール配糖体がケンペロールである、請求項４に記載の緑茶種。
【請求項８】
前記多糖が、グルコース、アラビノース、ガラクトース、ラムノース、キシロースウロン酸、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項２に記載の緑茶種。
【請求項９】
カフェイン、シュウ酸、またはタンニンを実質的に含まない、請求項１に記載の緑茶種。
【請求項１０】
前記精油の量が２重量％を超える、請求項２に記載の緑茶種。
【請求項１１】
前記精油の量が２５重量％〜９０重量％である、請求項２に記載の緑茶種抽出物。
【請求項１２】
前記精油の量が５０重量％〜９０重量％である、請求項２に記載の緑茶種抽出物。
【請求項１３】
前記精油の量が７５重量％〜９０重量％である、請求項２に記載の緑茶種抽出物。
【請求項１４】
前記ポリフェノールの量が４０重量％を超える、請求項２に記載の緑茶種抽出物。
【請求項１５】
前記ポリフェノールの量が５０重量％〜９０重量％である、請求項２に記載の緑茶種抽出物。
【請求項１６】
前記ポリフェノールの量が７５重量％〜９０重量％である、請求項２に記載の緑茶種抽出物。
【請求項１７】
前記多糖の量が１５重量％を超える、請求項２に記載の緑茶種抽出物。
【請求項１８】
前記多糖の量が２５重量％〜９０重量％である、請求項２に記載の緑茶種抽出物。
【請求項１９】
前記多糖の量が５０重量％〜９０重量％である、請求項２に記載の緑茶種抽出物。
【請求項２０】
前記多糖の量が７５重量％〜９０重量％である、請求項２に記載の緑茶種抽出物。
【請求項２１】
２重量％〜９７重量％の精油、１５重量％〜９８重量％のカテキン、４重量％〜９０重量％のテアニン、および９重量％〜９８重量％の多糖を含む、請求項１に記載の緑茶種抽出物。
【請求項２２】
請求項１に記載の緑茶種抽出物を含む食品または医薬品。
【請求項２３】
ａ）超臨界二酸化炭素抽出によって緑茶種植物材料を抽出して、精油画分および第１の残渣を得る工程、
ｂ）アルコール抽出によって緑茶種植物材料または工程ａ）からの第１の残渣を抽出して、ポリフェノール画分および第２の残渣を得る工程、ならびに
ｃ）水抽出によって工程ｂ）からの第２の残渣を抽出し、多糖をアルコールで沈殿させて多糖画分を得る工程
によって逐次的に緑茶種植物材料を抽出して、精油画分、該ポリフェノール画分、および該多糖画分を得ることを含む、少なくとも１つの所定の特徴を有する緑茶種抽出物の調製方法。
【請求項２４】
工程ａ）からの前記第１の残渣が、超臨界二酸化炭素抽出によってさらに脱カフェインされる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ポリフェノール画分が、アフィニティー吸着クロマトグラフィーによってさらに精製される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
工程ａ）が、
１）粉砕された緑茶種植物材料を抽出容器に入れる工程、
２）超臨界条件下で二酸化炭素を添加する工程、
３）該緑茶種植物材料と二酸化炭素とをある時間接触させる工程、および
４）精油画分を収集容器に収集する工程
を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
超臨界二酸化炭素画分分離システムで前記精油画分を分画することによって、精油化合物の比を変える工程をさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
超臨界条件が、３５℃〜９０℃で６０バール〜８００バールの圧力を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
超臨界条件が、４０℃〜８０℃で６０バール〜５００バールの圧力を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記時間が３０分〜２．５時間である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
前記時間が１時間である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３２】
工程ｂ）が、
１）ポリフェノール化学構成成分を抽出するのに十分な時間、粉砕された緑茶種植物材料または工程ａ）からの前記第１の残渣とアルコール溶媒とを接触させる工程、
２）工程１）からの抽出されたポリフェノール化学構成成分の水溶液を、アフィニティー吸着樹脂カラムに通過させ、該ポリフェノール構成成分を吸着させる工程、
３）酸性溶出溶媒を使用して、アフィニティー吸着物からカフェイン化合物を溶出する工程、および
４）含水アルコール溶離溶媒を使用して、該アフィニティー吸着樹脂から該ポリフェノール化学構成成分を溶出する工程
を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項３３】
前記含水アルコール溶液が、エタノールおよび水を含み、該エタノールの濃度が１０〜９５重量％である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記含水アルコール溶液が、エタノールおよび水を含み、該エタノールの濃度が２５重量％である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
工程１）が３０℃〜１００℃で実施される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
工程１）が６０℃〜１００℃で実施される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】
前記時間が１〜１０時間である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３８】
前記時間が１〜５時間である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３９】
前記時間が２時間である、請求項３２に記載の方法。
【請求項４０】
工程ｃ）が、
１）多糖を抽出するのに十分な時間、工程ｂ）からの前記第２の残渣と水とを接触させる工程、および
２）アルコール沈殿によって水溶液から該多糖を沈殿させる工程
を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項４１】
前記水が７０℃〜９０℃である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記水が８０℃〜９０℃である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記時間が１〜５時間である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
前記時間が２〜４時間である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４５】
前記時間が２時間である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４６】
前記アルコールがエタノールである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４７】
請求項２３に記載の方法によって調製された緑茶種抽出物。
【請求項４８】
ピロガロール、該ピロガロールの２５〜３５重量％のテオフィリン／テオブロミン、該ピロガロールの０．１〜５重量％のシキミ酸、該ピロガロールの０．１〜５重量％のクマル酸、および該ピロガロールの０．１〜５重量％の３−メトキシ−１−チロシンを含む緑茶種抽出物。
【請求項４９】
テアニン、該テアニンの２０〜３０重量％のテオフィリン／テオブロミン、該テアニンの１〜１０重量％のカテキン／エピカテキン、該テアニンの１〜１０重量％の没食子酸、該テアニンの０．１〜５重量％のカテキンキノン、該テアニンの０．１〜５重量％のシンナムアルデヒド、および該テアニンの１〜１０重量％の３−メトキシ−１−チロシンを含む緑茶種抽出物。
【請求項５０】
テアニン、該テアニンの４５〜５５重量％のテオフィリン／テオブロミン、該テアニンの１〜１０重量％のカテキン／エピカテキン、該テアニンの０．１〜５重量％のカルノシン酸、該テアニンの１〜１０重量％の没食子酸、該テアニンの０．５〜５重量％のカテキンキノン、該テアニンの１〜１０重量％のシンナムアルデヒド、該テアニンの０．１〜５重量％のメチルケイ皮酸、該テアニンの１〜１０重量％のシンナミド、および該テアニンの１〜１０重量％の３−メトキシ−１−チロシンを含む緑茶種抽出物。
【請求項５１】
ピロガロール、該ピロガロールの１〜１０重量％のテオフィリン／テオブロミン、該ピロガロールの０．１〜５重量％のテアニン、該ピロガロールの１〜１０重量％のカテキン／エピカテキン、該ピロガロールの５〜１５重量％のケンペロール、該ピロガロールの０．１〜５重量％のミリシチン、該ピロガロールの０．１〜５重量％のガロカテキンキノン、該ピロガロールの６５〜７５重量％の没食子酸、該ピロガロールの０．５〜５重量％のカテキンキノン、該ピロガロールの１〜１０重量％のバニリン酸、および該ピロガロールの１〜５重量％の３−メトキシ−１−チロシンを含む緑茶種抽出物。
【請求項５２】
ケンペロール、該ケンペロールの１〜１０重量％のテアニン、該ケンペロールの９５〜１０５重量％のカテキン／エピカテキン、該ケンペロールの２０〜３０重量％のケルセチン、該ケンペロールの５〜１５重量％のミリシチン、該ケンペロールの５〜１０重量％のガロカテキンキノン、該ケンペロールの５５〜６５重量％の没食子酸、該ケンペロールの１〜１０重量％のカテキンキノン、該ケンペロールの１０〜２０重量％のクマル酸、該ケンペロールの１〜１０重量％のバニリン酸、および該ケンペロールの１５〜２５重量％の３−メトキシ−１−チロシンを含む緑茶種抽出物。
【請求項５３】
ピロガロール、該ピロガロールの０．５〜５重量％のテオフィリン／テオブロミン、該ピロガロールの９５〜１０５重量％のカテキン／エピカテキン、該ピロガロールの５５〜６５重量％のケンペロール、該ピロガロールの２０〜３０重量％のケルセチン、該ピロガロールの１０〜２０重量％のミリシチン、該ピロガロールの２０〜３０重量％のガロカテキンキノン、該ピロガロールの５０〜６０重量％の没食子酸、該ピロガロールの１５〜２５重量％のカテキンキノン、該ピロガロールの１５〜２５重量％のクマル酸、該ピロガロールの１〜１０重量％のバニリン酸、および該ピロガロールの０．５〜５重量％の３−メトキシ−１−チロシンを含む緑茶種抽出物。
【請求項５４】
ピロガロール、該ピロガロールの０．５〜５重量％のテオフィリン／テオブロミン、該ピロガロールの９５〜１０５重量％のカテキン／エピカテキン、該ピロガロールの５５〜６５重量％のケンペロール、該ピロガロールの２０〜３０重量％のケルセチン、該ピロガロールの１０〜２０重量％のミリシチン、該ピロガロールの２０〜３０重量％のガロカテキンキノン、該ピロガロールの５０〜６０重量％の没食子酸、該ピロガロールの１５〜２５重量％のカテキンキノン、該ピロガロールの１５〜２５重量％のクマル酸、該ピロガロールの１〜１０重量％のバニリン酸、および該ピロガロールの０．５〜５重量％の３−メトキシ−１−チロシンを含む緑茶種抽出物。
【請求項５５】
ピロガロール、該ピロガロールの重量のテアニン、該ピロガロールの９０〜１００重量％のカテキン／エピカテキン、該ピロガロールの６５〜７５重量％のケンペロール、該ピロガロールの１５〜２５重量％のケルセチン、該ピロガロールの５〜１５重量％のミリシチン、該ピロガロールの５〜１５重量％のガロカテキンキノン、該ピロガロールの６５〜７５重量％の没食子酸、該ピロガロールの５〜１５重量％のカテキンキノン、該ピロガロールの１０〜２０重量％のクマル酸、該ピロガロールの１〜１０重量％のバニリン酸、および該ピロガロールの１〜１０重量％の３−メトキシ−１−チロシンを含む緑茶種抽出物。
【請求項１】
図６〜２５のいずれかの実時間直接分析（ＤＡＲＴ）質量分析クロマトグラムを有する画分を含む緑茶種抽出物。
【請求項２】
精油、ポリフェノール、多糖、およびそれらの＋組合せからなる群から選択される化合物を含む、請求項１に記載の緑茶種抽出物。
【請求項３】
前記精油が、ｎ−ヘキサデカン酸、テトラデカン酸、９−ヘキサデカノール、１−ウンデカノール、１−ヘキサデカノール、オレイルアルコール、９−オクタデセン−１−オール、ノナデカノール、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項２に記載の緑茶種抽出物。
【請求項４】
前記ポリフェノールが、カテキン、フラバノール、フラボノール配糖体、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項２に記載の緑茶種抽出物。
【請求項５】
前記カテキンが、カテキン（Ｃ）、エピカテキン（ＥＣ）、エピカテキンガレート（ＥＣＧ）、ガロカテキン（ＧＣ）、エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）、エピガロカテキン（ＥＧＣ）、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項４に記載の緑茶種抽出物。
【請求項６】
前記フラバノールが、ケルセチンおよびルチンからなる群から選択される、請求項４に記載の緑茶種。
【請求項７】
前記フラボノール配糖体がケンペロールである、請求項４に記載の緑茶種。
【請求項８】
前記多糖が、グルコース、アラビノース、ガラクトース、ラムノース、キシロースウロン酸、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項２に記載の緑茶種。
【請求項９】
カフェイン、シュウ酸、またはタンニンを実質的に含まない、請求項１に記載の緑茶種。
【請求項１０】
前記精油の量が２重量％を超える、請求項２に記載の緑茶種。
【請求項１１】
前記精油の量が２５重量％〜９０重量％である、請求項２に記載の緑茶種抽出物。
【請求項１２】
前記精油の量が５０重量％〜９０重量％である、請求項２に記載の緑茶種抽出物。
【請求項１３】
前記精油の量が７５重量％〜９０重量％である、請求項２に記載の緑茶種抽出物。
【請求項１４】
前記ポリフェノールの量が４０重量％を超える、請求項２に記載の緑茶種抽出物。
【請求項１５】
前記ポリフェノールの量が５０重量％〜９０重量％である、請求項２に記載の緑茶種抽出物。
【請求項１６】
前記ポリフェノールの量が７５重量％〜９０重量％である、請求項２に記載の緑茶種抽出物。
【請求項１７】
前記多糖の量が１５重量％を超える、請求項２に記載の緑茶種抽出物。
【請求項１８】
前記多糖の量が２５重量％〜９０重量％である、請求項２に記載の緑茶種抽出物。
【請求項１９】
前記多糖の量が５０重量％〜９０重量％である、請求項２に記載の緑茶種抽出物。
【請求項２０】
前記多糖の量が７５重量％〜９０重量％である、請求項２に記載の緑茶種抽出物。
【請求項２１】
２重量％〜９７重量％の精油、１５重量％〜９８重量％のカテキン、４重量％〜９０重量％のテアニン、および９重量％〜９８重量％の多糖を含む、請求項１に記載の緑茶種抽出物。
【請求項２２】
請求項１に記載の緑茶種抽出物を含む食品または医薬品。
【請求項２３】
ａ）超臨界二酸化炭素抽出によって緑茶種植物材料を抽出して、精油画分および第１の残渣を得る工程、
ｂ）アルコール抽出によって緑茶種植物材料または工程ａ）からの第１の残渣を抽出して、ポリフェノール画分および第２の残渣を得る工程、ならびに
ｃ）水抽出によって工程ｂ）からの第２の残渣を抽出し、多糖をアルコールで沈殿させて多糖画分を得る工程
によって逐次的に緑茶種植物材料を抽出して、精油画分、該ポリフェノール画分、および該多糖画分を得ることを含む、少なくとも１つの所定の特徴を有する緑茶種抽出物の調製方法。
【請求項２４】
工程ａ）からの前記第１の残渣が、超臨界二酸化炭素抽出によってさらに脱カフェインされる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ポリフェノール画分が、アフィニティー吸着クロマトグラフィーによってさらに精製される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
工程ａ）が、
１）粉砕された緑茶種植物材料を抽出容器に入れる工程、
２）超臨界条件下で二酸化炭素を添加する工程、
３）該緑茶種植物材料と二酸化炭素とをある時間接触させる工程、および
４）精油画分を収集容器に収集する工程
を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
超臨界二酸化炭素画分分離システムで前記精油画分を分画することによって、精油化合物の比を変える工程をさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
超臨界条件が、３５℃〜９０℃で６０バール〜８００バールの圧力を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
超臨界条件が、４０℃〜８０℃で６０バール〜５００バールの圧力を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記時間が３０分〜２．５時間である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
前記時間が１時間である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３２】
工程ｂ）が、
１）ポリフェノール化学構成成分を抽出するのに十分な時間、粉砕された緑茶種植物材料または工程ａ）からの前記第１の残渣とアルコール溶媒とを接触させる工程、
２）工程１）からの抽出されたポリフェノール化学構成成分の水溶液を、アフィニティー吸着樹脂カラムに通過させ、該ポリフェノール構成成分を吸着させる工程、
３）酸性溶出溶媒を使用して、アフィニティー吸着物からカフェイン化合物を溶出する工程、および
４）含水アルコール溶離溶媒を使用して、該アフィニティー吸着樹脂から該ポリフェノール化学構成成分を溶出する工程
を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項３３】
前記含水アルコール溶液が、エタノールおよび水を含み、該エタノールの濃度が１０〜９５重量％である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記含水アルコール溶液が、エタノールおよび水を含み、該エタノールの濃度が２５重量％である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
工程１）が３０℃〜１００℃で実施される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
工程１）が６０℃〜１００℃で実施される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】
前記時間が１〜１０時間である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３８】
前記時間が１〜５時間である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３９】
前記時間が２時間である、請求項３２に記載の方法。
【請求項４０】
工程ｃ）が、
１）多糖を抽出するのに十分な時間、工程ｂ）からの前記第２の残渣と水とを接触させる工程、および
２）アルコール沈殿によって水溶液から該多糖を沈殿させる工程
を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項４１】
前記水が７０℃〜９０℃である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記水が８０℃〜９０℃である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記時間が１〜５時間である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
前記時間が２〜４時間である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４５】
前記時間が２時間である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４６】
前記アルコールがエタノールである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４７】
請求項２３に記載の方法によって調製された緑茶種抽出物。
【請求項４８】
ピロガロール、該ピロガロールの２５〜３５重量％のテオフィリン／テオブロミン、該ピロガロールの０．１〜５重量％のシキミ酸、該ピロガロールの０．１〜５重量％のクマル酸、および該ピロガロールの０．１〜５重量％の３−メトキシ−１−チロシンを含む緑茶種抽出物。
【請求項４９】
テアニン、該テアニンの２０〜３０重量％のテオフィリン／テオブロミン、該テアニンの１〜１０重量％のカテキン／エピカテキン、該テアニンの１〜１０重量％の没食子酸、該テアニンの０．１〜５重量％のカテキンキノン、該テアニンの０．１〜５重量％のシンナムアルデヒド、および該テアニンの１〜１０重量％の３−メトキシ−１−チロシンを含む緑茶種抽出物。
【請求項５０】
テアニン、該テアニンの４５〜５５重量％のテオフィリン／テオブロミン、該テアニンの１〜１０重量％のカテキン／エピカテキン、該テアニンの０．１〜５重量％のカルノシン酸、該テアニンの１〜１０重量％の没食子酸、該テアニンの０．５〜５重量％のカテキンキノン、該テアニンの１〜１０重量％のシンナムアルデヒド、該テアニンの０．１〜５重量％のメチルケイ皮酸、該テアニンの１〜１０重量％のシンナミド、および該テアニンの１〜１０重量％の３−メトキシ−１−チロシンを含む緑茶種抽出物。
【請求項５１】
ピロガロール、該ピロガロールの１〜１０重量％のテオフィリン／テオブロミン、該ピロガロールの０．１〜５重量％のテアニン、該ピロガロールの１〜１０重量％のカテキン／エピカテキン、該ピロガロールの５〜１５重量％のケンペロール、該ピロガロールの０．１〜５重量％のミリシチン、該ピロガロールの０．１〜５重量％のガロカテキンキノン、該ピロガロールの６５〜７５重量％の没食子酸、該ピロガロールの０．５〜５重量％のカテキンキノン、該ピロガロールの１〜１０重量％のバニリン酸、および該ピロガロールの１〜５重量％の３−メトキシ−１−チロシンを含む緑茶種抽出物。
【請求項５２】
ケンペロール、該ケンペロールの１〜１０重量％のテアニン、該ケンペロールの９５〜１０５重量％のカテキン／エピカテキン、該ケンペロールの２０〜３０重量％のケルセチン、該ケンペロールの５〜１５重量％のミリシチン、該ケンペロールの５〜１０重量％のガロカテキンキノン、該ケンペロールの５５〜６５重量％の没食子酸、該ケンペロールの１〜１０重量％のカテキンキノン、該ケンペロールの１０〜２０重量％のクマル酸、該ケンペロールの１〜１０重量％のバニリン酸、および該ケンペロールの１５〜２５重量％の３−メトキシ−１−チロシンを含む緑茶種抽出物。
【請求項５３】
ピロガロール、該ピロガロールの０．５〜５重量％のテオフィリン／テオブロミン、該ピロガロールの９５〜１０５重量％のカテキン／エピカテキン、該ピロガロールの５５〜６５重量％のケンペロール、該ピロガロールの２０〜３０重量％のケルセチン、該ピロガロールの１０〜２０重量％のミリシチン、該ピロガロールの２０〜３０重量％のガロカテキンキノン、該ピロガロールの５０〜６０重量％の没食子酸、該ピロガロールの１５〜２５重量％のカテキンキノン、該ピロガロールの１５〜２５重量％のクマル酸、該ピロガロールの１〜１０重量％のバニリン酸、および該ピロガロールの０．５〜５重量％の３−メトキシ−１−チロシンを含む緑茶種抽出物。
【請求項５４】
ピロガロール、該ピロガロールの０．５〜５重量％のテオフィリン／テオブロミン、該ピロガロールの９５〜１０５重量％のカテキン／エピカテキン、該ピロガロールの５５〜６５重量％のケンペロール、該ピロガロールの２０〜３０重量％のケルセチン、該ピロガロールの１０〜２０重量％のミリシチン、該ピロガロールの２０〜３０重量％のガロカテキンキノン、該ピロガロールの５０〜６０重量％の没食子酸、該ピロガロールの１５〜２５重量％のカテキンキノン、該ピロガロールの１５〜２５重量％のクマル酸、該ピロガロールの１〜１０重量％のバニリン酸、および該ピロガロールの０．５〜５重量％の３−メトキシ−１−チロシンを含む緑茶種抽出物。
【請求項５５】
ピロガロール、該ピロガロールの重量のテアニン、該ピロガロールの９０〜１００重量％のカテキン／エピカテキン、該ピロガロールの６５〜７５重量％のケンペロール、該ピロガロールの１５〜２５重量％のケルセチン、該ピロガロールの５〜１５重量％のミリシチン、該ピロガロールの５〜１５重量％のガロカテキンキノン、該ピロガロールの６５〜７５重量％の没食子酸、該ピロガロールの５〜１５重量％のカテキンキノン、該ピロガロールの１０〜２０重量％のクマル酸、該ピロガロールの１〜１０重量％のバニリン酸、および該ピロガロールの１〜１０重量％の３−メトキシ−１−チロシンを含む緑茶種抽出物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【公表番号】特表２００９−５３１１６２（Ｐ２００９−５３１１６２Ａ）
【公表日】平成２１年９月３日（２００９．９．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５０１７５６（Ｐ２００９−５０１７５６）
【出願日】平成１９年３月２３日（２００７．３．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０６４８３０
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１０９８０２
【国際公開日】平成１９年９月２７日（２００７．９．２７）
【出願人】（５０８０８３４５９）ハーバルサイエンス シンガポール ピーティーイー． リミテッド (6)
【氏名又は名称原語表記】ＨＥＲＢＡＬＳＣＩＥＮＣＥ ＳＩＮＧＡＰＯＲＥ ＰＴＥ．ＬＴＤ．
【住所又は居所原語表記】１００４ Ｃｏｌｌｉｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ Ｗａｙ， Ｓｕｉｔｅ２００， Ｎａｐｌｅｓ， ＦＬ ３４１１０ ＵＳＡ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年９月３日（２００９．９．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年３月２３日（２００７．３．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０６４８３０
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１０９８０２
【国際公開日】平成１９年９月２７日（２００７．９．２７）
【出願人】（５０８０８３４５９）ハーバルサイエンス シンガポール ピーティーイー． リミテッド (6)
【氏名又は名称原語表記】ＨＥＲＢＡＬＳＣＩＥＮＣＥ ＳＩＮＧＡＰＯＲＥ ＰＴＥ．ＬＴＤ．
【住所又は居所原語表記】１００４ Ｃｏｌｌｉｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ Ｗａｙ， Ｓｕｉｔｅ２００， Ｎａｐｌｅｓ， ＦＬ ３４１１０ ＵＳＡ
【Ｆターム（参考）】
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