脱毛を治療する、又は、脱毛の発症を遅らせるための組成物
【００４７】
本明細書で開示されるのは、患者における脱毛を治療する、及び／又は、脱毛の発症を遅らせるための斬新な方法及び組成物である。特に本明細書で例示された組成物は、患者変性ピリミジンを含む組成物である。本明細書で例示された方法は、患者に対して、変性ピリミジンを投与することを備えることを特徴とする。通常、この患者は、男性ホルモン性脱毛症、円形脱毛症、産褥性脱毛症、又は、休止期脱毛を有する。投与は、非経口投与、局所投与、及び／又は、経口投与を含む。
本明細書で開示されるのは、患者における脱毛を治療する、及び／又は、脱毛の発症を遅らせるための斬新な方法及び組成物である。特に本明細書で例示された組成物は、患者変性ピリミジンを含む組成物である。本明細書で例示された方法は、患者に対して、変性ピリミジンを投与することを備えることを特徴とする。通常、この患者は、男性ホルモン性脱毛症、円形脱毛症、産褥性脱毛症、又は、休止期脱毛を有する。投与は、非経口投与、局所投与、及び／又は、経口投与を含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００８年９月１６日出願の米国仮特許出願第６１／０９７，４４３号に対する優先権を主張するものであり、この優先権は、３５ ＵＳＣ １１９に基づいて主張される。この仮出願は、全体として本明細書に盛り込まれる。
【背景技術】
【０００２】
脱毛症は、毎年何百万もの男性及び女性に影響する。すべての脱毛のうち９５％は、男性ホルモン性（アンドロゲン性）脱毛症（遺伝学的に受け継がれた脱毛状態、男性型脱毛症としても知られる）によって引き起こされる。脱毛の残りの５％は、様々な健康状態、ストレス及びトラウマ、食事及び栄養、環境有害物質、並びに、医薬品と関連づけることができる。現在、１０人に５人の男性、及び、２１００万人の女性が、脱毛及びこの状態に関する心理的影響を経験するだろう。男性ホルモン性脱毛症の場合には、テストステロンが、酵素である５ＡＲ（５アルファリダクターゼ）によって、体内でＤＨＴ（ジヒドロテストステロン）に変換される。ＤＨＴは、アンドロゲンレセプター部位（ＡＲＳ）と呼ばれる毛包中の特定の場所に結合する。そして、これは、毛髪の直径を縮めるミネラリゼーションを引き起こし、成長期として知られている成長周期で費やす時間を減少させる。他の既知のタイプの脱毛は、休止期脱毛、牽引性脱毛症又は外傷性脱毛症、円形脱毛症、及び、産褥性脱毛症と診断することができる。休止期脱毛は、休止期（ｒｅｓｔｉｎｇ ｐｈａｓｅ、もしくは、ｔｅｌｏｇｅｎ ｐｈａｓｅ）において、早期の脱毛をもたらす。休止期脱毛の原因は、病気、ショック、及び、医薬品にある可能性があり、通常、状態及び症状の除去で回復に向かわせることができる。牽引性脱毛症又は外傷性脱毛症は、斑点状の散在した脱毛によって実証され、毛髪を手入れするために用いられた成分を加熱すること、あるいは、バンドで毛髪を縛ることによって引き起こされる。これも、状態及び症状の除去によって回復に向かわせることが可能である。円形脱毛症は、円形で不規則な斑点状の脱毛スポットを生成するが、原因は分かっていない。しかし、すべてのタイプの脱毛の共通点は、これらの状態を経験する男性及び女性にこれが与える心理的影響である。
【発明の概要】
【０００３】
最近、幹細胞増殖に影響を及ぼす因子を評価する過程で、我々は興味ある発見をした。複素環のピリミジン分子であるＮＢＩ−１８（２−ピペラジノ−６−メチル−５−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ［３，４−ｄ］ピリミジン マレイン酸塩、分子量３４９．５４）は、潜在的な神経栄養活性を有していると述べられたが、これは、培養中のヒトＮＳＣの増殖を刺激することができる。増殖における増加は、動物研究では、用量依存的だった。ＮＢＩ−１８を５日間、毎日注射した場合、若年及び老年のげっ歯類動物において同様に、４週間後において安定した神経発生をもたらすことを我々は発見した。この実験を通して、ＮＢＩ−１８での治療による、目に見えた病理学的効果及び中毒症状はなかった。これらの予備的所見に基づいて、我々は、毛髪再生に関して、同様のやり方で細胞増殖を増加させようとして、局所塗布を開発すること目指した。Ｃ５７ ＢＬ／６マウスは、細胞増殖を検出するためのＢｒｄＵを取り込んだ、異なる濃度のＮＢＩ−１８を剃られた皮膚領域上に塗布し、その後、免疫組織化学を行うために用いられた。対照領域と比較して、我々は、塗布されたすべての濃度で、細胞の増殖における十分な増加を見ることができた。より重要なことは、非治療部位と比較して、治療部位において目に見えて完全な髪の増殖があったことである。ＮＢＩ−１８は、髪の増殖を加速することができる再生医療の発展をもたらす斬新な化合物であると期待される。
【０００４】
最近、本発明者らは、複素環族の１つであるピロロピリミジン（ＰｙＰ）化合物が、神経突起伸長、並びに、損傷した末梢神経及び筋肉の修復を増大させることを含む、生物活性を促進する様々な増殖を有することを示唆するいくつかの報告書に好奇心をそそられるようになった。米国特許第４，９５９，３６８号、第５，９７６，５２３号。興味ある誘導体の１つは、「ＮＢＩ−１８」（２−ピペラジノ−６−メチル−５−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ［３，４−ｄ］ピリミジン マレイン酸塩、分子量３４９．５４）として本明細書で言及される複素環のピリミジン分子である。げっ歯類動物の皮質から分離されたニューロンを用いる他の細胞培養研究では、ＮＢＩ−１８は、ｂＦＧＦ、神経成長因子であるＥＧＦ、及び、インスリン様成長因子を含む様々な増殖因子の存在下において主に活性があることが報告された。米国特許公報第２００３０１３９４１０号。ＮＢＩ−１８の作用機序は分かっていないが、ある証拠は、ＭＡＰＫ（マイトジェン活性化プロテインキナーゼ）経路の活性化、すなわち、ペプチド増殖因子によって活性化されるカスケードを示唆する。ＮＢＩ−１８は、ＴＵＮＥＬアッセイによって測定されるように、アポプトーシス率を減少させることにより、げっ歯類動物の皮質のニューロンの生存を促進することが示唆されている。機能に関する機序的な詳細の証拠はないが、ＮＢＩ−１８は、分離された動物モデル（マウスにおける軸索成長、及び、ラットにおける筋肉再生）において試験されている。創薬標的を発見するための作用機序の研究は、我々の継続中の研究の一部として計画される。ＮＢＩ−１８族の分子の有用性について知る際、これらの化合物が、幹細胞の増殖過程に関係すると仮定された。また、本発明者らは、動物モデルにおいて、角化細胞幹細胞（ＫＳＣ）、もしくは、恐らくはＫＳＣのためのニッチを提供するヒトバルジ細胞の発生に与え得る影響を検討することを決定した。げっ歯類動物研究からの初期の証拠は、ＮＢＩ−１８が、経口投与と同様に腹腔内投与の後に、よく吸収されることを示唆し、ＨＰＬＣ分析によって示されるようにラット循環においてｔ１／２＞＞４ｈを有する。ＮＢＩ−１８は、治療されたマウスの表皮から、注射後２４時間の間、抽出され得る。また、第三者によるエームズ試験によって示されるように、この化合物は、突然変異誘発性ではなかった。
【０００５】
本発明者らの認識に基づいて、毛髪の発生又は再成長を誘発するための局所塗布の研究において、ＮＢＩ−１８を試験する旨の決定が下された。ＮＢＩ−１８の用量を変えて［０．７５ｍｇ／ｍｌ、１．５ｍｇ／ｍｌ、３．０ｍｇ／ｍｌ、及び、対照（５０％のＥＴＯＨ）］、Ｃ５７ ＢＬ／６マウスの背中の剃られた場所へ、５ｕｌ滴下した。種々の用量で５日連続で与えられ、４日目及び５日目には、ＢｒｄＵ（１００ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）が注射された。免疫組織化学は、ＮＢＩ−１８を受けなかった対照と比較して、ＮＢＩ−１８の各濃度にわたり、Ｂｒｄｕ＋細胞の膨大な増加を示唆する。しかしながら、最も印象的なデータは、治療した領域において、７日以内にその原長の近くまで、目に見えて毛髪が再成長したことだった。対照領域、又は、治療していない領域は、７日の時間枠内で目に見える再成長を示さなかった。ＮＢＩ−１８として知られる小分子のピリミジン化合物の局所塗布を用いれば、毛髪の優勢な再成長を示すという所望の効果を、げっ歯類動物モデルにおいて生じることを、ＮＢＩ−１８は証明した。我々は、ＮＢＩ−１８での治療がより大きな細胞発生をもたらし、最終的には、脱毛を根絶する商品に結びつくだろうと仮定している。これらの研究は、以下に提供される実施例においてさらに記載されるだろう。
【０００６】
［図面の簡単な説明］
図１ 写真（Ａ〜Ｄ）は、
Ａ）１０倍率での対照（５０％エタノール）、ａｎｔｉ−ＢｒｄＵ（緑）で染色、
Ｂ）５倍率での１．５ｍｇ／ｍｌのＮＢＩ−１８、ａｎｔｉ−ＢｒｄＵ（緑）及びｄａｐｉ（青）で染色、
Ｃ）１０倍率での３．０ｍｇ／ｍｌのＮＢＩ−１８、ａｎｔｉ−ＢｒｄＵ（緑）で染色、
Ｄ）１０倍率での３．０ｍｇ／ｍｌのＮＢＩ−１８、ａｎｔｉ−ＢｒｄＵ（緑）で染色、の場合のマウス＃１の皮層の２０ｕＭの矢状断面である。
【０００７】
図２ 写真（Ａ〜Ｃ）はすべて、マウス＃４である。
Ａ）実験前（この動物に対して何も行われていない）。
Ｂ）丸いエリアは、毛髪が剃られた場所を示しており、水滴のように見えるものは、蒸発前の溶液塗布である（この写真は、塗布初日に撮影された）。
Ｃ）丸いエリアは、毛髪の優勢な再成長の場所を示す。
【０００８】
図３ 免疫組織化学法：以下、Ａ）対照、Ｂ）３．０ｍｇ／ｍｌ（実証的な毛髪再成長がある上記のＣの丸いエリア）
【０００９】
図４ マウス＃２においる優勢な毛髪再成長（白丸の中）を示す。
Ａ）３．０ｍｇ／ｍｌの局所塗布を用いる場合
Ｂ）実験前のマウス
Ｃ）剃られたエリア（白丸の中）
下記は、免疫組織化学法を示す。
Ｄ）３．０ｍｇ／ｍｌにおける、圧倒的なほど多数のＢｒｄＵ陽性（緑）の細胞が、毛髪再成長のエリアと一致するところ
Ｅ）１．５ｍｇ／ｍｌにおける、成長が増加しているところ
【発明を実施するための形態】
【００１０】
従って、１つの実施形態において、対象発明は、毛髪の濃さ（すなわち表面積当たりの毛髪繊維の数）を増加させる、かつ／又は、毛髪産生剤（ＨＰＡ）を含む毛髪を増強する組成物の投与を備える、ヒトもしくはヒト以外の対象における毛髪繊維を積極的に産生する毛包数を増加させる方法に関する。米国特許第５，９７６，５２３号（’５２３号の特許）、及び、米国特許第４，９５９，３６８号（’３６８号の特許）は、創傷治癒剤として用いられてもよい多くの化合物を教示する。’５２３号の特許は、その明細書に記述された創傷治癒剤が、組織の損傷又は創傷の結果、組織中に放出された増殖因子及びサイトカインを強化することにより働くと教示する。本質的には、’５２３号の特許は、この薬剤が細胞の傷への移動を刺激することを教示する。本発明者らは、同じ薬剤が実際に幹細胞の増殖を刺激することを発見し、ひいては、この薬剤が、組織が傷ついていない状況において用いられてもよいという発見に結びついた。
【００１１】
従って、’５２３号の特許、及び、’３６８号の特許の中で示された薬剤は、ＨＰＡ薬剤の開示のために参照により本明細書に盛り込まれる。また、米国特許公報第２００８０１２４３０６号を参照されたい。’５２３号の特許で明記された化学式１及び２は、以下のように提供される。
【００１２】
【化１】
【００１３】
【化２】
【００１４】
ここで、Ｒ１〜Ｒ８は、水素原子、低級アルキル基（特にＣ１〜Ｃ７アルキル基）、ＣＨ３ＯＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＯＮＨ２、−ＣＯＣＨ３、−ＣＯＣ２Ｈ５、又は、−ＣＨ２ＯＣＯＣ２Ｈ５を独立に表し、Ｘは、＝ＮＨ、＝Ｎ−ＣＨ３、＝Ｎ−ＣＯＣＨ３、＝Ｎ−ＣＯＯＣ２Ｈ５、＝Ｎ−ＳＯ２ＣＨ３、＝ＣＨ２、＝ＣＨＣＨ３、＝ＣＨＣ２Ｈ５、−Ｏ−、又は、−Ｓ−を表す。ここで、ｐｈはフェニル基を表す。
【００１５】
化学式（１）の典型的な例示の化合物は、以下のものを含む。
２−ピペラジノ−６−メチル−５−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ［３，４−ｄ］ピリミジン
２−（４−メチルピペラジノ）−６−メチル−５−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ［３，４−ｄ］ピリミジン
２−（４−エチルピペラジノ）−６−メチル−５−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ［３，４−ｄ］ピリミジン
２−ピペリジノ−６−メチル−５−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ［３，４−ｄ］ピリミジン
２−（４−メチルピペリジノ）−６−メチル−５−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ［３，４−ｄ］ピリミジン
２−（４−エチルピペリジノ）−６−メチル−５−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ［３，４−ｄ］ピリミジン
２−モルホリノ−６−メチル−５−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ［３，４−ｄ］ピリミジン
２−チオモルホリノ−６−メチル−５−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ［３，４−ｄ］ピリミジン
２−ピペラジノ−６−エチル−５−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ［３，４−ｄ］ピリミジン
２−ピペラジノ−６−イソプロピル−５−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ［３，４−ｄ］ピリミジン
２−ピペラジノ−６−ｎ−ブチル−５−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ［３，４−ｄ］ピリミジン
２−ピペラジノ−６−ｓｅｃ−ブチル−５−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ［３，４−ｄ］ピリミジン
２−ピペラジノ−６−ｔ−ブチル−５−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ［３，４−ｄ］ピリミジン
２−ピペラジノ−４，６−ジメチル−５−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ［３，４−ｄ］ピリミジン
２−ピペラジノ−６，７−ジメチル−５−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ［３，４−ｄ］ピリミジン
２−ピペラジノ−６，７，７−トリメチル−５−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ［３，４−ｄ］ピリミジン
２−ピペリジノ−４，６−ジメチル−５−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ［３，４−ｄ］ピリミジン
２−ピペリジノ−６，７，７−トリメチル−５−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ［３，４−ｄ］ピリミジン
２−ピペラジノ−７−メチル−６−エチル−５−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ［３，４−ｄ］ピリミジン
及び
２−ピペラジノ−４−メチル−６−エチル−５−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ［３，４−ｄ］ピリミジン
【００１６】
化学式（２）の典型的な例示の化合物は、以下のものを含む。
２−ピペラジノ−７−メチル−６−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン
２−（４−メチルピペラジノ）−７−メチル−６−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン
２−（４−エチルピペラジノ）−７−メチル−６−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン
２−（４−Ｎ−アセチルピペラジノ）−７−メチル−６−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン
２−ピペリジノ−７−メチル−６−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン
２−（４−メチルピペリジノ）−７−メチル−６−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン
２−（４−エチルピペリジノ）−７−メチル−６−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン
２−モルホリノ−７−メチル−６−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン
２−チオモルホリノ−７−メチル−６−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン
２−ピペリジノ−７−エチル−６−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン
２−ピペリジノ−７−ｎ−プロピル−６−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン
２−ピペリジノ−７−イソプロピル−６−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン
２−ピペリジノ−７−ｎ−ブチル−６−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン
２−ピペリジノ−７−ｔ−ブチル−６−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン
２−ピペリジノ−５−メチル−６−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン
２−ピペラジノ−５−メチル−６−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン
２−ピペラジノ−４，７−ジメチル−６−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン
２−ピペリジノ−５，７−ジメチル−６−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン
２−ピペリジノ−５，５，７−トリメチル−６−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン
２−ピペラジノ−５，７−ジメチル−６−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン
２−ピペラジノ−５，５，７−トリメチル−６−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン
２−ピペリジノ−４−メチル−７−エチル−６−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン
及び
２−ピペリジノ−５−メチル−７−エチル−６−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン
【００１７】
米国特許第４，９５９，３６８号において開示され、参照によって本明細書で盛り込まれるように、ある実施形態では、化学式（Ｉ）のピリミジン誘導体は、ＮＢＩ−１８、すなわち、２−ピペラジノ−６−メチル−５−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン マレイン酸塩（Ｃ４Ｈ４Ｏ４マレイン酸塩）である。ある生体内の実施形態では、化学式（Ｉ）及び（ＩＩ）のピリミジン誘導体は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ／日〜５０ｍｇ／ｋｇ／日の間の濃度で、より好ましくは、に約０．１ｍｇ／ｋｇ／日〜１０ｍｇ／ｋｇ／日の間の濃度で、さらにより好ましくは、約１ｍｇ／ｋｇ／日〜５ｍｇ／ｋｇ／日の間の濃度で、さらにより好ましくは、約３ｍｇ／ｋｇ／日の濃度で投与される。これらの実施形態では、化学式のピリミジン誘導体（Ｉ）及び（ＩＩ）は、約１〜６０日の間で、より好ましくは、約１〜３０日の間で、より好ましくは、約１〜１５日の間で、さらにより好ましくは、約１〜１０日の間で、より好ましくは、約２〜７日の間で、さらにより好ましくは、約５日間、投与される。これらの実施形態に係る一定の他のものでは、本方法は、増殖因子を投与するステップをさらに含む。ある実施形態では、増殖因子は、繊維芽細胞増殖因子、上皮成長因子、又は、それらの組合わせを含む。
【００１８】
本発明の活性化合物を備える医薬品組成物は、通常の混合、溶解、糖衣錠形成、造粒、粉末化、乳化、カプセル化、封入、又は、凍結乾燥のプロセスを用いて製造されてもよい。これらの組成物は、生理学的に許容できる担体、賦形剤、添加剤、又は、これらの活性化合物から薬学的に用いることができる製剤への処理を促進する補助剤のうち１又は複数を用いて、通常の方法で配合されてもよい。投与された実際の薬剤組成物は、投与方法に依存するだろう。実質的には、例えば、局所、経口、全身、吸入、注射、経皮などを含む、いかなる投与方法が用いられてもよい。
【００１９】
この活性化合物は、薬剤組成物自身で、あるいは、薬学的に許容される塩の形で配合されてもよい。本明細書で用いられているように、「薬学的に許容される塩」という表現は、この活性化合物の生物学的効果及び特性を実質的に保持し、かつ、生物学的に又は他の面で不適当でない塩類を意味する。このような塩類は、当業者にとって周知であるような、無機及び有機の酸及び塩基から調合されてもよい。通常は、このような塩類は、対応する遊離酸及び塩基より水溶液中により溶けやすい。
【００２０】
局所投与については、この（これらの）活性化合物は、当業者にとって周知であるような、溶液、ゲル剤、軟膏剤、クリーム剤、懸濁液など、として配合されてもよい。
【００２１】
全身性配合物は、経皮、経粘膜、経口、又は、経肺投与のために設計されたものと同様に、注射（例えば、皮下、静脈内、筋肉内、髄腔内、又は、腹腔内注射）による投与のために設計されたものを含む。
【００２２】
有用な注射可能な製剤は、水溶性又は油性の賦形剤中の活性化合物の滅菌の懸濁液、溶液、又は、乳濁液を含む。これらの組成物もまた、懸濁剤、安定剤、及び／又は、分散剤のような配合剤を含んでもよい。注射のための配合物は、例えば、アンプル又は複数回投与容器のような単位剤形で提供されてもよく、また追加の保存剤を含んでもよい。
【００２３】
あるいは、注射可能な配合物は、使用前における、適切な賦形剤（滅菌発熱性物質除去蒸留水、緩衝剤、ブドウ糖溶液などを含むが、これらに限定されない）での再形成に対応する粉末形態で提供されてもよい。この目的のために、この（これらの）活性化合物は、凍結乾燥のような当業者に公知の任意の技術により乾燥され、使用前に再形成されてもよい。
【００２４】
経粘膜投与では、関門に浸透するのに適した浸透剤が、この配合物において用いられる。このような浸透剤は、当業者に公知である。
【００２５】
経口投与では、薬剤組成物は、結合剤（例えば、プレゼラチン化（アルファ化）トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、又は、ヒドロキシプロピルメチルセルロース）、増量剤（例えば、乳糖、微結晶性セルロース、又は、リン酸水素カルシウム）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、又は、シリカ）、崩壊剤（例えば、ジャガイモデンプン、又は、デンプングリコール酸ナトリウム）、あるいは、湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）のような薬学的に許容できる添加剤を用いて通常の方法により調合された、例えば、タブレット又はカプセル剤の形をとってもよい。タブレットは、例えば、砂糖又は腸溶コーティングを用いて当業者に周知の方法によりコーティングされてもよい。
【００２６】
経口投与のための液状製剤は、例えば、エリキシル剤、溶液、シロップ剤、又は、懸濁液の形をとってもよい。あるいは、使用前における、水又は他の適切な賦形剤での形成に対応する乾燥製剤として提供されてもよい。このような液状製剤は、懸濁化剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体、又は、水素化食用脂）、乳化剤（例えば、レシチン、又は、アカシア）、非水性の賦形剤（例えば、扁桃油、油性エステル、エチルアルコール、又は、分留された植物油）、及び、保存剤（例えば、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチル又はｐ−ヒドロキシ安息香酸プロピル、あるいは、ソルビン酸）のような薬学的に許容できる添加物を用いて通常の手段により調合されていてもよい。また、これらの製剤は、緩衝塩、香味剤、着色剤、及び、甘味剤を必要に応じて含んでもよい。経口投与のための製剤は、適切に配合することで、この活性化合物の放出を制御してもよい。
【００２７】
頬側投与では、これらの組成物は、通常の方法で配合されたタブレット、チューインガム、又は、ロゼンジの形をとってもよい。
【００２８】
直腸及び膣の投与経路では、この（これらの）活性化合物は、カカオ脂又は他のグリセリドのような通常の坐剤基剤を含む、溶液（停留浣腸剤用）、坐剤、あるいは、軟膏剤として配合されてもよい。
【００２９】
吸入による投与では、この（これらの）活性化合物は、適切な噴射剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、又は、他の適切なガス）を使用して、加圧パックあるいは噴霧器からエアゾールスプレーの形でうまく送達することができる。加圧されたエアゾールの場合、投与単位は、定量を送達するためのバルブを提供することにより決定されてもよい。例えば、吸入器あるいは注入器で用いるゼラチンといったもののカプセル剤及びカートリッジは、この化合物の粉末ミックス、及び、乳糖又はデンプンのような適切な粉末ベースを含んで配合されてもよい。
【００３０】
長期間送達については、この（これらの）活性化合物は、注入による投与（例えば、皮下、皮内、又は、筋肉内注射）のためのデポ製剤として配合することができる。従って、例えば、この活性成分は、適切な高分子材料又は疎水性材料（例えば、許容できる油の乳濁液として）、又は、イオン交換樹脂を用いて、あるいは、難溶性誘導体として（例えば、難溶性塩として）、配合されてもよい。
【００３１】
あるいは、経皮的吸収のためにこの（これらの）活性化合物をゆっくり放出する接着ディスク又は接着パッチとして製造された経皮送達システムが用いられてもよい。この目的のために、透過促進剤は、この（これらの）活性化合物の経皮透過を促進するために用いられてもよい。適切な経皮パッチは、例えば、米国特許第５，４０７，７１３号、米国特許第５，３５２，４５６号、米国特許第５，３３２，２１３号、米国特許第５，３３６，１６８号、米国特許第５，２９０，５６１号、米国特許第５，２５４，３４６号、米国特許第５，１６４，１８９号、米国特許第５，１６３，８９９号、米国特許第５，０８８，９７７号、米国特許第５，０８７，２４０号、米国特許第５，００８，１１０号、及び、米国特許第４，９２１，４７５号に記載される。
【００３２】
あるいは、他の薬剤送達システムが、使用されてもよい。リポソーム及び乳濁液は、この（これらの）活性化合物を送達するために用いられてもよい送達媒体の周知の例である。通常、より多く毒性の犠牲を払うが、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）のような一定の有機溶媒も、使用されてもよい。
【００３３】
これらの薬剤組成物は、所望の場合、この（これらの）活性化合物を含む１又は複数の単位剤形を含み得るパック又はディスペンサ装置で提供されてもよい。このパックは、例えば、ブリスターパックのような金属箔又はプラスチック箔を備えてもよい。このパック又はディスペンサ装置は、投与のための指示を伴ってもよい。
【００３４】
実施例１：ＮＢＩ−１８組成物の製剤
予備的研究において、本発明者らは、ＮＢＩ−１８の注射（５ｍｇ／ｋｇ）がげっ歯類動物の脳における細胞増殖を増加させることを発見した。この研究では、本発明者らは、表皮の内部で新しく生ずる細胞の運命について知るのに役立つよう、健康なマウスで角質発生が起こる投与量範囲を決定した。このデータにより、局所塗布を用いて、男性ホルモン性脱毛症、円形脱毛症、産褥性脱毛症、及び、休止期脱毛のような脱毛状態を治療するための適切な投与量範囲の選択が可能となる。ＮＢＩ−１８の局所塗布を試験するために生まれつき活発な行動を示す正常かつ健康なＣ５７ ＢＬ／６マウスを用いた。不必要な麻酔を除去するべく、我々の送達媒体は、５０％エタノール（ＥＴＯＨ）であった。それぞれ０．７５ｍｇ／ｍｌ、１．５ｍｇ／ｍｌ、３．０ｍｇ／ｍｌ、及び、対照（５０％のＥＴＯＨ）の濃度を用いて、ＮＢＩ−１８を５０％のＥＴＯＨに懸濁した。
【００３５】
結果
我々の送達媒体として５０％のＥＴＯＨを用いる場合に、我々は、免疫組織化学法を通じて、ＢｒｄＵ陽性に染色された細胞の増加した集団を実証することができた。ＮＢＩ−１８のすべての濃度で、この目に見える増加が引き起こされ、５０％のＥＴＯＨを受けただけの対照と比較して、ＢｒｄＵ陽性に染色された細胞において劇的な上昇を示した。ＢｒｄＵ陽性に染色された細胞の増加は、期待するほど用量依存的な増加を実証しなかったが、これは、再発する塗布の各々が、マウスのうちのいくつかでは、正確に同じ領域でなされなかった可能性が原因かもしれない。より多くの適用可能な送達システムが、今後の研究で開発されるだろう。
【００３６】
実施例２：毒性試験
ＮＢＩ−１８の毒性を調査するために、合計１６匹の重量２５〜３０ｇの雄のＣ５７ ＢＬ／６マウス（１２週齢）を用いた。これらのマウスは、１２ｈの明／暗周期で維持し、研究期間を通じて餌及び水を自由に入手した。これらの動物は、１ケージ当たり４匹飼育した。この研究では、動物を４つのグループ（４匹／グループ）に分けた。急性毒性について、１０００ｍｇ／ｋｇまで試験した。ＮＢＩ−１８（０，１００，３００，１０００ｍｇ／ｋｇ／日、腹腔内）を７日間注射し、また、対照グループに対しては、媒体である生理食塩水を同体積注射した。最後の３日間（５〜７日目に）には、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、セントルイス、ミズーリ州）を注射した（１００ｍｇ／ｋｇ／日、腹腔内）。行動実験では、マウスのバランス及び協調を検討するために、ＮＢＩ−１８の注射の前、最中、及び、後に、ロータロッド試験、及び、オープンフィールド試験を用いた。さらに、この動物の神経機能を評価するために、姿勢反射試験、及び、前肢配置試験を行った。これらの動物はすべて、最後のＢｒｄＵ注射の４８ｈ後に、ペントバルビタール（腹腔内）で麻酔をかけ、直ちに４％のパラホルムアルデヒド固定液で潅流した。２４ｈ間固定の後、直ちに脳を摘出し、免疫組織化学のために処理した。
【００３７】
結果
この研究において、これらの動物は、即時の行動的な変化、もしくは、神経学的な変化を示さなかった。これらは、実験を通じてＮＢＩ−１８での治療による中毒症状を示さなかった。エームズ試験は、第三者の企業により行われた。この結果、一貫して、突然変異誘発もしくは毒性を示さず、ＮＢＩ−１８が、安全で、かつ、マウスに対して副作用を有しないことを示唆した。
【００３８】
実施例３：生体内研究
Ａ
ＮＢＩ−１８の局所塗布の研究のために、２匹のＣ５７ ＢＬ／６マウスを選択した。これらのマウスは、４つの特定の場所（側部／背部）を円形パターンに剃ることにより用意した。１．５ｍｇ／ｍｌ、３．０ｍｇ／ｍｌ、６．０ｍｇ／ｍｌ、及び、対照（５０％のＥＴＯＨ）の濃度でＮＢＩ−１８を指定された領域（右から、反時計回りに最低用量から最高用量へ、その後、対照）にそれぞれ供給した。５日間連続して５ｕｌの用量でこの溶液をこれらの場所の中心に塗布し、４日目及び５日目には、ＢｒｄＵ（１００ｍｇ／Ｋ、腹腔内）を注射した。７日目に、高用量のペントバルビタール（７０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）を用いて、これらのマウスを安楽死させた。また、治療された表皮を摘出し、４８時間、４％のパラホルムアルデヒド固定液に入れた。
【００３９】
表皮の免疫組織化学
凍結培地（Ｏ．Ｃ．Ｔ．コンパウンド、Ｔｉｓｓｕｅ Ｔｅｋ）を用いて、表皮の切片を正方形の包理モールドに取り付け、２０ｕＭの切片にスライスし、その後、テープ転写法を介して、接着剤コーティングされたスライド（Ｉｎｓｔｒｕｍｅｄｉｃｓ，Ｉｎｃ）上に載せた。スライドをＰＢＳで洗浄し、その後、ヒストン放出を誘発するために、３０分間、２Ｎ ＨＣＬ中に入れた。その後、再びスライドをＰＢＳで洗浄し、その後、１時間、３％のロバ血清のＰＢＳＴ溶液を用いてブロックした。用いられたブロッキング溶液中に懸濁された第１の抗体は、４℃で一晩反応させた１：１０００に希釈されたａｎｔｉ−ＢｒｄＵ（ｓｉｇｍａ）だった。スライドを３回洗浄し、その後、ブロッキング溶液中に室温で２時間、懸濁して、１：５００に希釈された第２の抗体である、ＦＩＴＣ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）に入れ、その後、ＰＢＳで洗浄した。スライドはＤＡＰＩ含有Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄを用いて取り付けた。写真は、倒立蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ、ＤＭＩ ６０００ Ｂ（Ｑ−ｉｍａｇｉｎｇ、Ｒｅｔｉｇａ ｅｘｉカメラ搭載）を用いて撮影された。
【００４０】
結果
図１において、対照（Ａ）は、非移動パターンに沿ってＢｒｄＵのシグナリングレベルが非常に下がったことを示す。新しい細胞は、組織試料の全体にわたって散発的である。ＮＢＩ−１８で治療された試料（Ｂ〜Ｄ）はすべて、新しく発達した細胞の多量増加を示したが、最も重要なことに、これらは、移動パターンへの同調を実証した。
【００４１】
Ｂ
ＮＢＩ−１８の局所塗布の研究のために、４匹のＣ５７ ＢＬ／６マウスを選択した。これらのマウスは、４つの特定の場所（側部／背部）を、円形パターンに剃ることにより用意した。０．７５ｍｇ／ｍｌ、１．５ｍｇ／ｍｌ、及び、３．０ｍｇ／ｍｌ、及び、対照（５０％のＥＴＯＨ）の濃度でＮＢＩ−１８を指定された領域（右から、反時計回りに、最低用量から最高用量へ、その後、対照）にそれぞれ供給した。５日連続して５ｕｌの用量でこの溶液をこれらの場所の中心に塗布し、４日目及び５日目には、ＢｒｄＵ（１００ｍｇ／Ｋ、腹腔内）を注射した。７日目に、高用量のペントバルビタール（７０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）を用いて、これらのマウスを安楽死させた。また、治療された表皮を摘出し、４８時間、４％のパラホルムアルデヒド固定液に入れた。
【００４２】
表皮の免疫組織化学
凍結培地（Ｏ．Ｃ．Ｔ．コンパウンド、Ｔｉｓｓｕｅ Ｔｅｋ）を用いて、表皮の切片を正方形の包理モールドへ取り付け、２０ｕＭの切片にスライスし、その後、テープ転写法を介して、接着剤コーティングされたスライド（Ｉｎｓｔｒｕｍｅｄｉｃｓ，Ｉｎｃ）上に載せた。スライドをＰＢＳで洗浄し、その後、ヒストン放出を誘発するために、３０分間、２Ｎ ＨＣＬ中に入れた。その後、再びスライドをＰＢＳで洗浄し、その後、１時間、３％のロバ血清のＰＢＳＴ溶液を用いてブロックした。用いられたブロッキング溶液中に懸濁された第１の抗体は、４℃で一晩反応させた１：１０００に希釈されたａｎｔｉ−ＢｒｄＵ（ｓｉｇｍａ）だった。スライドを３回洗浄し、その後、ブロッキング溶液中に室温で２時間、懸濁して、１：５００に希釈された第２の抗体である、ＦＩＴＣ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）に入れ、その後、ＰＢＳで洗浄した。スライドはＤＡＰＩ含有Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄを用いて取り付けた。写真は、倒立蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ、ＤＭＩ ６０００ Ｂ（Ｑ−ｉｍａｇｉｎｇ、Ｒｅｔｉｇａ ｅｘｉカメラ搭載）を用いて撮影された。
【００４３】
結果
図３において、免疫組織化学法において示されるように、すべてのマウスにおいて、対照と比較してＢｒｄＵ陽性細胞の増加レベルに幾分の変動があった。しかしながら、図２（マウス４）及び図４（マウス２）において、最も目に見える効果は、マウスの写真で実証される実際の毛髪再成長である。毛髪再成長の場所が、ＮＢＩ−１８の３つの濃度（０．７５ｍｇ／ｍｌ、１．５ｍｇ／ｍｌ、３．０ｍｇ／ｍｌ）の全体にわたって散発的に起こったものの、同じ時間的制約内において対照では目に見える毛髪再生はまったくない。これは、各々の再発塗布能力が、まさに同一領域において起こるという可能性によって説明することができる。動いているマウスの背中の上へ５ｕｌの滴下を行っているため、局所塗布した場所がずれた可能性の余地はある。しかしながら、このデータは、疑いなく対照と化合物との間の差を実証する。次の実現可能なステップは、ミノキシジル（ロゲイン）のような同様に証明された化合物に対するこの化合物の効果を試験することだろう。
【００４４】
実施例１〜３に関する考察
予備的研究は、ＮＢＩ−１８は、０．７５ｍｇ／ｍｌ、１．５ｍｇ／ｍｌ、３．０ｍｇ／ｍｌ、及び、５０％のＥＴＯＨ（対照）を５日間連続して５ｕｌの用量で局所塗布を受けたマウスにおいて、ＢｒｄＵ陽性の細胞数を増加させることを示している。髪の成長には、３つの周期がある。成長期（成長している期）、退行期（ここでは、毛髪は成長を停止する）、及び、休止期（これは休止している期である）である。成長期は、約１０００日の間続くが、２〜６年に及ぶこともあり得る。また、これは、「オン」期、もしくは、成長している期と考えられる。退行期は、１〜２週間しか続かず、また、この期の間、毛包は萎縮して死に始める。これは、移行期として知られている。休止期は、「休止している」又は「オフ」期としばしば呼ばれる最終期である。これは、毛包がそれ自身で再生又は活性化する時期であり、成長期において新しい毛髪が発育して、古い毛髪を押し出す。ＮＢＩ−１８の機序的な効果は、幹細胞集団にある。また、これがどのように直接的に毛包を生じさせるかは、まだ解明中である。しかしながら、ミノキシジルを用いる別の研究は、動物研究では、局所的のミノキシジルが、休止期を短くし、その結果、休止している毛包から新しい毛髪の早期の発生を引き起こして、成長期をもたらし、これにより、天然の経路の機序的な阻害効果を生ずることを示した。この機序的な効果を維持するためには、引き続き送達投与を維持しなければならない。これに比べて、我々の化合物は、内因性細胞の成長を増加させることによって、幹細胞環境の生理学的経路に作用する。いったんこの増加が達成されれば、通常は、３〜５日の治療スケジュール内では、化合物を用い続ける必要はない。
【００４５】
小分子であるＮＢＩ−１８は、健康な新しい内因性細胞の生成を直接的に導くことによって幹細胞移植に関する倫理的・技術的な問題を回避する。ＮＢＩ−１８及びこの変異体は、安定で、経口バイオアベイラビリティを有し、かつ、製造が容易な合成複素環式化合物の特異なクラスを代表する。本発明者らは、細胞増殖を促進するために天然の幹細胞成長因子に対して相乗的に作用する化合物を用いることができる。このような化合物は、希少かつ価値のある治療候補である。この着想は、皆のために刺激的な時間を届ける。これは、あらゆる所の人々の美学を変え得る、新規かつ画期的な薬剤である。心理的悪影響が引き起こした脱毛は、男性及び女性の両方にとって、もはや問題ではないだろう。
【００４６】
すべての引用された特許文献、刊行物、及び、参考文献の開示は、本明細書の教示と不一致とならない程度に、全体において本明細書に盛り込まれる。本明細書で記述された実施例及び実施形態は、説明の目的だけのためであって、本明細書を踏まえた様々な修正又は変更は、当業者に示唆され、かつ、本出願の精神及び範囲、並びに、添付されたクレームの範囲内に含まれることが理解されるべきである。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００８年９月１６日出願の米国仮特許出願第６１／０９７，４４３号に対する優先権を主張するものであり、この優先権は、３５ ＵＳＣ １１９に基づいて主張される。この仮出願は、全体として本明細書に盛り込まれる。
【背景技術】
【０００２】
脱毛症は、毎年何百万もの男性及び女性に影響する。すべての脱毛のうち９５％は、男性ホルモン性（アンドロゲン性）脱毛症（遺伝学的に受け継がれた脱毛状態、男性型脱毛症としても知られる）によって引き起こされる。脱毛の残りの５％は、様々な健康状態、ストレス及びトラウマ、食事及び栄養、環境有害物質、並びに、医薬品と関連づけることができる。現在、１０人に５人の男性、及び、２１００万人の女性が、脱毛及びこの状態に関する心理的影響を経験するだろう。男性ホルモン性脱毛症の場合には、テストステロンが、酵素である５ＡＲ（５アルファリダクターゼ）によって、体内でＤＨＴ（ジヒドロテストステロン）に変換される。ＤＨＴは、アンドロゲンレセプター部位（ＡＲＳ）と呼ばれる毛包中の特定の場所に結合する。そして、これは、毛髪の直径を縮めるミネラリゼーションを引き起こし、成長期として知られている成長周期で費やす時間を減少させる。他の既知のタイプの脱毛は、休止期脱毛、牽引性脱毛症又は外傷性脱毛症、円形脱毛症、及び、産褥性脱毛症と診断することができる。休止期脱毛は、休止期（ｒｅｓｔｉｎｇ ｐｈａｓｅ、もしくは、ｔｅｌｏｇｅｎ ｐｈａｓｅ）において、早期の脱毛をもたらす。休止期脱毛の原因は、病気、ショック、及び、医薬品にある可能性があり、通常、状態及び症状の除去で回復に向かわせることができる。牽引性脱毛症又は外傷性脱毛症は、斑点状の散在した脱毛によって実証され、毛髪を手入れするために用いられた成分を加熱すること、あるいは、バンドで毛髪を縛ることによって引き起こされる。これも、状態及び症状の除去によって回復に向かわせることが可能である。円形脱毛症は、円形で不規則な斑点状の脱毛スポットを生成するが、原因は分かっていない。しかし、すべてのタイプの脱毛の共通点は、これらの状態を経験する男性及び女性にこれが与える心理的影響である。
【発明の概要】
【０００３】
最近、幹細胞増殖に影響を及ぼす因子を評価する過程で、我々は興味ある発見をした。複素環のピリミジン分子であるＮＢＩ−１８（２−ピペラジノ−６−メチル−５−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ［３，４−ｄ］ピリミジン マレイン酸塩、分子量３４９．５４）は、潜在的な神経栄養活性を有していると述べられたが、これは、培養中のヒトＮＳＣの増殖を刺激することができる。増殖における増加は、動物研究では、用量依存的だった。ＮＢＩ−１８を５日間、毎日注射した場合、若年及び老年のげっ歯類動物において同様に、４週間後において安定した神経発生をもたらすことを我々は発見した。この実験を通して、ＮＢＩ−１８での治療による、目に見えた病理学的効果及び中毒症状はなかった。これらの予備的所見に基づいて、我々は、毛髪再生に関して、同様のやり方で細胞増殖を増加させようとして、局所塗布を開発すること目指した。Ｃ５７ ＢＬ／６マウスは、細胞増殖を検出するためのＢｒｄＵを取り込んだ、異なる濃度のＮＢＩ−１８を剃られた皮膚領域上に塗布し、その後、免疫組織化学を行うために用いられた。対照領域と比較して、我々は、塗布されたすべての濃度で、細胞の増殖における十分な増加を見ることができた。より重要なことは、非治療部位と比較して、治療部位において目に見えて完全な髪の増殖があったことである。ＮＢＩ−１８は、髪の増殖を加速することができる再生医療の発展をもたらす斬新な化合物であると期待される。
【０００４】
最近、本発明者らは、複素環族の１つであるピロロピリミジン（ＰｙＰ）化合物が、神経突起伸長、並びに、損傷した末梢神経及び筋肉の修復を増大させることを含む、生物活性を促進する様々な増殖を有することを示唆するいくつかの報告書に好奇心をそそられるようになった。米国特許第４，９５９，３６８号、第５，９７６，５２３号。興味ある誘導体の１つは、「ＮＢＩ−１８」（２−ピペラジノ−６−メチル−５−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ［３，４−ｄ］ピリミジン マレイン酸塩、分子量３４９．５４）として本明細書で言及される複素環のピリミジン分子である。げっ歯類動物の皮質から分離されたニューロンを用いる他の細胞培養研究では、ＮＢＩ−１８は、ｂＦＧＦ、神経成長因子であるＥＧＦ、及び、インスリン様成長因子を含む様々な増殖因子の存在下において主に活性があることが報告された。米国特許公報第２００３０１３９４１０号。ＮＢＩ−１８の作用機序は分かっていないが、ある証拠は、ＭＡＰＫ（マイトジェン活性化プロテインキナーゼ）経路の活性化、すなわち、ペプチド増殖因子によって活性化されるカスケードを示唆する。ＮＢＩ−１８は、ＴＵＮＥＬアッセイによって測定されるように、アポプトーシス率を減少させることにより、げっ歯類動物の皮質のニューロンの生存を促進することが示唆されている。機能に関する機序的な詳細の証拠はないが、ＮＢＩ−１８は、分離された動物モデル（マウスにおける軸索成長、及び、ラットにおける筋肉再生）において試験されている。創薬標的を発見するための作用機序の研究は、我々の継続中の研究の一部として計画される。ＮＢＩ−１８族の分子の有用性について知る際、これらの化合物が、幹細胞の増殖過程に関係すると仮定された。また、本発明者らは、動物モデルにおいて、角化細胞幹細胞（ＫＳＣ）、もしくは、恐らくはＫＳＣのためのニッチを提供するヒトバルジ細胞の発生に与え得る影響を検討することを決定した。げっ歯類動物研究からの初期の証拠は、ＮＢＩ−１８が、経口投与と同様に腹腔内投与の後に、よく吸収されることを示唆し、ＨＰＬＣ分析によって示されるようにラット循環においてｔ１／２＞＞４ｈを有する。ＮＢＩ−１８は、治療されたマウスの表皮から、注射後２４時間の間、抽出され得る。また、第三者によるエームズ試験によって示されるように、この化合物は、突然変異誘発性ではなかった。
【０００５】
本発明者らの認識に基づいて、毛髪の発生又は再成長を誘発するための局所塗布の研究において、ＮＢＩ−１８を試験する旨の決定が下された。ＮＢＩ−１８の用量を変えて［０．７５ｍｇ／ｍｌ、１．５ｍｇ／ｍｌ、３．０ｍｇ／ｍｌ、及び、対照（５０％のＥＴＯＨ）］、Ｃ５７ ＢＬ／６マウスの背中の剃られた場所へ、５ｕｌ滴下した。種々の用量で５日連続で与えられ、４日目及び５日目には、ＢｒｄＵ（１００ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）が注射された。免疫組織化学は、ＮＢＩ−１８を受けなかった対照と比較して、ＮＢＩ−１８の各濃度にわたり、Ｂｒｄｕ＋細胞の膨大な増加を示唆する。しかしながら、最も印象的なデータは、治療した領域において、７日以内にその原長の近くまで、目に見えて毛髪が再成長したことだった。対照領域、又は、治療していない領域は、７日の時間枠内で目に見える再成長を示さなかった。ＮＢＩ−１８として知られる小分子のピリミジン化合物の局所塗布を用いれば、毛髪の優勢な再成長を示すという所望の効果を、げっ歯類動物モデルにおいて生じることを、ＮＢＩ−１８は証明した。我々は、ＮＢＩ−１８での治療がより大きな細胞発生をもたらし、最終的には、脱毛を根絶する商品に結びつくだろうと仮定している。これらの研究は、以下に提供される実施例においてさらに記載されるだろう。
【０００６】
［図面の簡単な説明］
図１ 写真（Ａ〜Ｄ）は、
Ａ）１０倍率での対照（５０％エタノール）、ａｎｔｉ−ＢｒｄＵ（緑）で染色、
Ｂ）５倍率での１．５ｍｇ／ｍｌのＮＢＩ−１８、ａｎｔｉ−ＢｒｄＵ（緑）及びｄａｐｉ（青）で染色、
Ｃ）１０倍率での３．０ｍｇ／ｍｌのＮＢＩ−１８、ａｎｔｉ−ＢｒｄＵ（緑）で染色、
Ｄ）１０倍率での３．０ｍｇ／ｍｌのＮＢＩ−１８、ａｎｔｉ−ＢｒｄＵ（緑）で染色、の場合のマウス＃１の皮層の２０ｕＭの矢状断面である。
【０００７】
図２ 写真（Ａ〜Ｃ）はすべて、マウス＃４である。
Ａ）実験前（この動物に対して何も行われていない）。
Ｂ）丸いエリアは、毛髪が剃られた場所を示しており、水滴のように見えるものは、蒸発前の溶液塗布である（この写真は、塗布初日に撮影された）。
Ｃ）丸いエリアは、毛髪の優勢な再成長の場所を示す。
【０００８】
図３ 免疫組織化学法：以下、Ａ）対照、Ｂ）３．０ｍｇ／ｍｌ（実証的な毛髪再成長がある上記のＣの丸いエリア）
【０００９】
図４ マウス＃２においる優勢な毛髪再成長（白丸の中）を示す。
Ａ）３．０ｍｇ／ｍｌの局所塗布を用いる場合
Ｂ）実験前のマウス
Ｃ）剃られたエリア（白丸の中）
下記は、免疫組織化学法を示す。
Ｄ）３．０ｍｇ／ｍｌにおける、圧倒的なほど多数のＢｒｄＵ陽性（緑）の細胞が、毛髪再成長のエリアと一致するところ
Ｅ）１．５ｍｇ／ｍｌにおける、成長が増加しているところ
【発明を実施するための形態】
【００１０】
従って、１つの実施形態において、対象発明は、毛髪の濃さ（すなわち表面積当たりの毛髪繊維の数）を増加させる、かつ／又は、毛髪産生剤（ＨＰＡ）を含む毛髪を増強する組成物の投与を備える、ヒトもしくはヒト以外の対象における毛髪繊維を積極的に産生する毛包数を増加させる方法に関する。米国特許第５，９７６，５２３号（’５２３号の特許）、及び、米国特許第４，９５９，３６８号（’３６８号の特許）は、創傷治癒剤として用いられてもよい多くの化合物を教示する。’５２３号の特許は、その明細書に記述された創傷治癒剤が、組織の損傷又は創傷の結果、組織中に放出された増殖因子及びサイトカインを強化することにより働くと教示する。本質的には、’５２３号の特許は、この薬剤が細胞の傷への移動を刺激することを教示する。本発明者らは、同じ薬剤が実際に幹細胞の増殖を刺激することを発見し、ひいては、この薬剤が、組織が傷ついていない状況において用いられてもよいという発見に結びついた。
【００１１】
従って、’５２３号の特許、及び、’３６８号の特許の中で示された薬剤は、ＨＰＡ薬剤の開示のために参照により本明細書に盛り込まれる。また、米国特許公報第２００８０１２４３０６号を参照されたい。’５２３号の特許で明記された化学式１及び２は、以下のように提供される。
【００１２】
【化１】
【００１３】
【化２】
【００１４】
ここで、Ｒ１〜Ｒ８は、水素原子、低級アルキル基（特にＣ１〜Ｃ７アルキル基）、ＣＨ３ＯＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＯＮＨ２、−ＣＯＣＨ３、−ＣＯＣ２Ｈ５、又は、−ＣＨ２ＯＣＯＣ２Ｈ５を独立に表し、Ｘは、＝ＮＨ、＝Ｎ−ＣＨ３、＝Ｎ−ＣＯＣＨ３、＝Ｎ−ＣＯＯＣ２Ｈ５、＝Ｎ−ＳＯ２ＣＨ３、＝ＣＨ２、＝ＣＨＣＨ３、＝ＣＨＣ２Ｈ５、−Ｏ−、又は、−Ｓ−を表す。ここで、ｐｈはフェニル基を表す。
【００１５】
化学式（１）の典型的な例示の化合物は、以下のものを含む。
２−ピペラジノ−６−メチル−５−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ［３，４−ｄ］ピリミジン
２−（４−メチルピペラジノ）−６−メチル−５−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ［３，４−ｄ］ピリミジン
２−（４−エチルピペラジノ）−６−メチル−５−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ［３，４−ｄ］ピリミジン
２−ピペリジノ−６−メチル−５−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ［３，４−ｄ］ピリミジン
２−（４−メチルピペリジノ）−６−メチル−５−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ［３，４−ｄ］ピリミジン
２−（４−エチルピペリジノ）−６−メチル−５−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ［３，４−ｄ］ピリミジン
２−モルホリノ−６−メチル−５−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ［３，４−ｄ］ピリミジン
２−チオモルホリノ−６−メチル−５−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ［３，４−ｄ］ピリミジン
２−ピペラジノ−６−エチル−５−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ［３，４−ｄ］ピリミジン
２−ピペラジノ−６−イソプロピル−５−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ［３，４−ｄ］ピリミジン
２−ピペラジノ−６−ｎ−ブチル−５−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ［３，４−ｄ］ピリミジン
２−ピペラジノ−６−ｓｅｃ−ブチル−５−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ［３，４−ｄ］ピリミジン
２−ピペラジノ−６−ｔ−ブチル−５−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ［３，４−ｄ］ピリミジン
２−ピペラジノ−４，６−ジメチル−５−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ［３，４−ｄ］ピリミジン
２−ピペラジノ−６，７−ジメチル−５−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ［３，４−ｄ］ピリミジン
２−ピペラジノ−６，７，７−トリメチル−５−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ［３，４−ｄ］ピリミジン
２−ピペリジノ−４，６−ジメチル−５−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ［３，４−ｄ］ピリミジン
２−ピペリジノ−６，７，７−トリメチル−５−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ［３，４−ｄ］ピリミジン
２−ピペラジノ−７−メチル−６−エチル−５−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ［３，４−ｄ］ピリミジン
及び
２−ピペラジノ−４−メチル−６−エチル−５−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ［３，４−ｄ］ピリミジン
【００１６】
化学式（２）の典型的な例示の化合物は、以下のものを含む。
２−ピペラジノ−７−メチル−６−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン
２−（４−メチルピペラジノ）−７−メチル−６−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン
２−（４−エチルピペラジノ）−７−メチル−６−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン
２−（４−Ｎ−アセチルピペラジノ）−７−メチル−６−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン
２−ピペリジノ−７−メチル−６−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン
２−（４−メチルピペリジノ）−７−メチル−６−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン
２−（４−エチルピペリジノ）−７−メチル−６−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン
２−モルホリノ−７−メチル−６−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン
２−チオモルホリノ−７−メチル−６−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン
２−ピペリジノ−７−エチル−６−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン
２−ピペリジノ−７−ｎ−プロピル−６−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン
２−ピペリジノ−７−イソプロピル−６−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン
２−ピペリジノ−７−ｎ−ブチル−６−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン
２−ピペリジノ−７−ｔ−ブチル−６−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン
２−ピペリジノ−５−メチル−６−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン
２−ピペラジノ−５−メチル−６−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン
２−ピペラジノ−４，７−ジメチル−６−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン
２−ピペリジノ−５，７−ジメチル−６−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン
２−ピペリジノ−５，５，７−トリメチル−６−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン
２−ピペラジノ−５，７−ジメチル−６−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン
２−ピペラジノ−５，５，７−トリメチル−６−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン
２−ピペリジノ−４−メチル−７−エチル−６−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン
及び
２−ピペリジノ−５−メチル−７−エチル−６−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン
【００１７】
米国特許第４，９５９，３６８号において開示され、参照によって本明細書で盛り込まれるように、ある実施形態では、化学式（Ｉ）のピリミジン誘導体は、ＮＢＩ−１８、すなわち、２−ピペラジノ−６−メチル−５−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン マレイン酸塩（Ｃ４Ｈ４Ｏ４マレイン酸塩）である。ある生体内の実施形態では、化学式（Ｉ）及び（ＩＩ）のピリミジン誘導体は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ／日〜５０ｍｇ／ｋｇ／日の間の濃度で、より好ましくは、に約０．１ｍｇ／ｋｇ／日〜１０ｍｇ／ｋｇ／日の間の濃度で、さらにより好ましくは、約１ｍｇ／ｋｇ／日〜５ｍｇ／ｋｇ／日の間の濃度で、さらにより好ましくは、約３ｍｇ／ｋｇ／日の濃度で投与される。これらの実施形態では、化学式のピリミジン誘導体（Ｉ）及び（ＩＩ）は、約１〜６０日の間で、より好ましくは、約１〜３０日の間で、より好ましくは、約１〜１５日の間で、さらにより好ましくは、約１〜１０日の間で、より好ましくは、約２〜７日の間で、さらにより好ましくは、約５日間、投与される。これらの実施形態に係る一定の他のものでは、本方法は、増殖因子を投与するステップをさらに含む。ある実施形態では、増殖因子は、繊維芽細胞増殖因子、上皮成長因子、又は、それらの組合わせを含む。
【００１８】
本発明の活性化合物を備える医薬品組成物は、通常の混合、溶解、糖衣錠形成、造粒、粉末化、乳化、カプセル化、封入、又は、凍結乾燥のプロセスを用いて製造されてもよい。これらの組成物は、生理学的に許容できる担体、賦形剤、添加剤、又は、これらの活性化合物から薬学的に用いることができる製剤への処理を促進する補助剤のうち１又は複数を用いて、通常の方法で配合されてもよい。投与された実際の薬剤組成物は、投与方法に依存するだろう。実質的には、例えば、局所、経口、全身、吸入、注射、経皮などを含む、いかなる投与方法が用いられてもよい。
【００１９】
この活性化合物は、薬剤組成物自身で、あるいは、薬学的に許容される塩の形で配合されてもよい。本明細書で用いられているように、「薬学的に許容される塩」という表現は、この活性化合物の生物学的効果及び特性を実質的に保持し、かつ、生物学的に又は他の面で不適当でない塩類を意味する。このような塩類は、当業者にとって周知であるような、無機及び有機の酸及び塩基から調合されてもよい。通常は、このような塩類は、対応する遊離酸及び塩基より水溶液中により溶けやすい。
【００２０】
局所投与については、この（これらの）活性化合物は、当業者にとって周知であるような、溶液、ゲル剤、軟膏剤、クリーム剤、懸濁液など、として配合されてもよい。
【００２１】
全身性配合物は、経皮、経粘膜、経口、又は、経肺投与のために設計されたものと同様に、注射（例えば、皮下、静脈内、筋肉内、髄腔内、又は、腹腔内注射）による投与のために設計されたものを含む。
【００２２】
有用な注射可能な製剤は、水溶性又は油性の賦形剤中の活性化合物の滅菌の懸濁液、溶液、又は、乳濁液を含む。これらの組成物もまた、懸濁剤、安定剤、及び／又は、分散剤のような配合剤を含んでもよい。注射のための配合物は、例えば、アンプル又は複数回投与容器のような単位剤形で提供されてもよく、また追加の保存剤を含んでもよい。
【００２３】
あるいは、注射可能な配合物は、使用前における、適切な賦形剤（滅菌発熱性物質除去蒸留水、緩衝剤、ブドウ糖溶液などを含むが、これらに限定されない）での再形成に対応する粉末形態で提供されてもよい。この目的のために、この（これらの）活性化合物は、凍結乾燥のような当業者に公知の任意の技術により乾燥され、使用前に再形成されてもよい。
【００２４】
経粘膜投与では、関門に浸透するのに適した浸透剤が、この配合物において用いられる。このような浸透剤は、当業者に公知である。
【００２５】
経口投与では、薬剤組成物は、結合剤（例えば、プレゼラチン化（アルファ化）トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、又は、ヒドロキシプロピルメチルセルロース）、増量剤（例えば、乳糖、微結晶性セルロース、又は、リン酸水素カルシウム）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、又は、シリカ）、崩壊剤（例えば、ジャガイモデンプン、又は、デンプングリコール酸ナトリウム）、あるいは、湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）のような薬学的に許容できる添加剤を用いて通常の方法により調合された、例えば、タブレット又はカプセル剤の形をとってもよい。タブレットは、例えば、砂糖又は腸溶コーティングを用いて当業者に周知の方法によりコーティングされてもよい。
【００２６】
経口投与のための液状製剤は、例えば、エリキシル剤、溶液、シロップ剤、又は、懸濁液の形をとってもよい。あるいは、使用前における、水又は他の適切な賦形剤での形成に対応する乾燥製剤として提供されてもよい。このような液状製剤は、懸濁化剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体、又は、水素化食用脂）、乳化剤（例えば、レシチン、又は、アカシア）、非水性の賦形剤（例えば、扁桃油、油性エステル、エチルアルコール、又は、分留された植物油）、及び、保存剤（例えば、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチル又はｐ−ヒドロキシ安息香酸プロピル、あるいは、ソルビン酸）のような薬学的に許容できる添加物を用いて通常の手段により調合されていてもよい。また、これらの製剤は、緩衝塩、香味剤、着色剤、及び、甘味剤を必要に応じて含んでもよい。経口投与のための製剤は、適切に配合することで、この活性化合物の放出を制御してもよい。
【００２７】
頬側投与では、これらの組成物は、通常の方法で配合されたタブレット、チューインガム、又は、ロゼンジの形をとってもよい。
【００２８】
直腸及び膣の投与経路では、この（これらの）活性化合物は、カカオ脂又は他のグリセリドのような通常の坐剤基剤を含む、溶液（停留浣腸剤用）、坐剤、あるいは、軟膏剤として配合されてもよい。
【００２９】
吸入による投与では、この（これらの）活性化合物は、適切な噴射剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、又は、他の適切なガス）を使用して、加圧パックあるいは噴霧器からエアゾールスプレーの形でうまく送達することができる。加圧されたエアゾールの場合、投与単位は、定量を送達するためのバルブを提供することにより決定されてもよい。例えば、吸入器あるいは注入器で用いるゼラチンといったもののカプセル剤及びカートリッジは、この化合物の粉末ミックス、及び、乳糖又はデンプンのような適切な粉末ベースを含んで配合されてもよい。
【００３０】
長期間送達については、この（これらの）活性化合物は、注入による投与（例えば、皮下、皮内、又は、筋肉内注射）のためのデポ製剤として配合することができる。従って、例えば、この活性成分は、適切な高分子材料又は疎水性材料（例えば、許容できる油の乳濁液として）、又は、イオン交換樹脂を用いて、あるいは、難溶性誘導体として（例えば、難溶性塩として）、配合されてもよい。
【００３１】
あるいは、経皮的吸収のためにこの（これらの）活性化合物をゆっくり放出する接着ディスク又は接着パッチとして製造された経皮送達システムが用いられてもよい。この目的のために、透過促進剤は、この（これらの）活性化合物の経皮透過を促進するために用いられてもよい。適切な経皮パッチは、例えば、米国特許第５，４０７，７１３号、米国特許第５，３５２，４５６号、米国特許第５，３３２，２１３号、米国特許第５，３３６，１６８号、米国特許第５，２９０，５６１号、米国特許第５，２５４，３４６号、米国特許第５，１６４，１８９号、米国特許第５，１６３，８９９号、米国特許第５，０８８，９７７号、米国特許第５，０８７，２４０号、米国特許第５，００８，１１０号、及び、米国特許第４，９２１，４７５号に記載される。
【００３２】
あるいは、他の薬剤送達システムが、使用されてもよい。リポソーム及び乳濁液は、この（これらの）活性化合物を送達するために用いられてもよい送達媒体の周知の例である。通常、より多く毒性の犠牲を払うが、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）のような一定の有機溶媒も、使用されてもよい。
【００３３】
これらの薬剤組成物は、所望の場合、この（これらの）活性化合物を含む１又は複数の単位剤形を含み得るパック又はディスペンサ装置で提供されてもよい。このパックは、例えば、ブリスターパックのような金属箔又はプラスチック箔を備えてもよい。このパック又はディスペンサ装置は、投与のための指示を伴ってもよい。
【００３４】
実施例１：ＮＢＩ−１８組成物の製剤
予備的研究において、本発明者らは、ＮＢＩ−１８の注射（５ｍｇ／ｋｇ）がげっ歯類動物の脳における細胞増殖を増加させることを発見した。この研究では、本発明者らは、表皮の内部で新しく生ずる細胞の運命について知るのに役立つよう、健康なマウスで角質発生が起こる投与量範囲を決定した。このデータにより、局所塗布を用いて、男性ホルモン性脱毛症、円形脱毛症、産褥性脱毛症、及び、休止期脱毛のような脱毛状態を治療するための適切な投与量範囲の選択が可能となる。ＮＢＩ−１８の局所塗布を試験するために生まれつき活発な行動を示す正常かつ健康なＣ５７ ＢＬ／６マウスを用いた。不必要な麻酔を除去するべく、我々の送達媒体は、５０％エタノール（ＥＴＯＨ）であった。それぞれ０．７５ｍｇ／ｍｌ、１．５ｍｇ／ｍｌ、３．０ｍｇ／ｍｌ、及び、対照（５０％のＥＴＯＨ）の濃度を用いて、ＮＢＩ−１８を５０％のＥＴＯＨに懸濁した。
【００３５】
結果
我々の送達媒体として５０％のＥＴＯＨを用いる場合に、我々は、免疫組織化学法を通じて、ＢｒｄＵ陽性に染色された細胞の増加した集団を実証することができた。ＮＢＩ−１８のすべての濃度で、この目に見える増加が引き起こされ、５０％のＥＴＯＨを受けただけの対照と比較して、ＢｒｄＵ陽性に染色された細胞において劇的な上昇を示した。ＢｒｄＵ陽性に染色された細胞の増加は、期待するほど用量依存的な増加を実証しなかったが、これは、再発する塗布の各々が、マウスのうちのいくつかでは、正確に同じ領域でなされなかった可能性が原因かもしれない。より多くの適用可能な送達システムが、今後の研究で開発されるだろう。
【００３６】
実施例２：毒性試験
ＮＢＩ−１８の毒性を調査するために、合計１６匹の重量２５〜３０ｇの雄のＣ５７ ＢＬ／６マウス（１２週齢）を用いた。これらのマウスは、１２ｈの明／暗周期で維持し、研究期間を通じて餌及び水を自由に入手した。これらの動物は、１ケージ当たり４匹飼育した。この研究では、動物を４つのグループ（４匹／グループ）に分けた。急性毒性について、１０００ｍｇ／ｋｇまで試験した。ＮＢＩ−１８（０，１００，３００，１０００ｍｇ／ｋｇ／日、腹腔内）を７日間注射し、また、対照グループに対しては、媒体である生理食塩水を同体積注射した。最後の３日間（５〜７日目に）には、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、セントルイス、ミズーリ州）を注射した（１００ｍｇ／ｋｇ／日、腹腔内）。行動実験では、マウスのバランス及び協調を検討するために、ＮＢＩ−１８の注射の前、最中、及び、後に、ロータロッド試験、及び、オープンフィールド試験を用いた。さらに、この動物の神経機能を評価するために、姿勢反射試験、及び、前肢配置試験を行った。これらの動物はすべて、最後のＢｒｄＵ注射の４８ｈ後に、ペントバルビタール（腹腔内）で麻酔をかけ、直ちに４％のパラホルムアルデヒド固定液で潅流した。２４ｈ間固定の後、直ちに脳を摘出し、免疫組織化学のために処理した。
【００３７】
結果
この研究において、これらの動物は、即時の行動的な変化、もしくは、神経学的な変化を示さなかった。これらは、実験を通じてＮＢＩ−１８での治療による中毒症状を示さなかった。エームズ試験は、第三者の企業により行われた。この結果、一貫して、突然変異誘発もしくは毒性を示さず、ＮＢＩ−１８が、安全で、かつ、マウスに対して副作用を有しないことを示唆した。
【００３８】
実施例３：生体内研究
Ａ
ＮＢＩ−１８の局所塗布の研究のために、２匹のＣ５７ ＢＬ／６マウスを選択した。これらのマウスは、４つの特定の場所（側部／背部）を円形パターンに剃ることにより用意した。１．５ｍｇ／ｍｌ、３．０ｍｇ／ｍｌ、６．０ｍｇ／ｍｌ、及び、対照（５０％のＥＴＯＨ）の濃度でＮＢＩ−１８を指定された領域（右から、反時計回りに最低用量から最高用量へ、その後、対照）にそれぞれ供給した。５日間連続して５ｕｌの用量でこの溶液をこれらの場所の中心に塗布し、４日目及び５日目には、ＢｒｄＵ（１００ｍｇ／Ｋ、腹腔内）を注射した。７日目に、高用量のペントバルビタール（７０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）を用いて、これらのマウスを安楽死させた。また、治療された表皮を摘出し、４８時間、４％のパラホルムアルデヒド固定液に入れた。
【００３９】
表皮の免疫組織化学
凍結培地（Ｏ．Ｃ．Ｔ．コンパウンド、Ｔｉｓｓｕｅ Ｔｅｋ）を用いて、表皮の切片を正方形の包理モールドに取り付け、２０ｕＭの切片にスライスし、その後、テープ転写法を介して、接着剤コーティングされたスライド（Ｉｎｓｔｒｕｍｅｄｉｃｓ，Ｉｎｃ）上に載せた。スライドをＰＢＳで洗浄し、その後、ヒストン放出を誘発するために、３０分間、２Ｎ ＨＣＬ中に入れた。その後、再びスライドをＰＢＳで洗浄し、その後、１時間、３％のロバ血清のＰＢＳＴ溶液を用いてブロックした。用いられたブロッキング溶液中に懸濁された第１の抗体は、４℃で一晩反応させた１：１０００に希釈されたａｎｔｉ−ＢｒｄＵ（ｓｉｇｍａ）だった。スライドを３回洗浄し、その後、ブロッキング溶液中に室温で２時間、懸濁して、１：５００に希釈された第２の抗体である、ＦＩＴＣ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）に入れ、その後、ＰＢＳで洗浄した。スライドはＤＡＰＩ含有Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄを用いて取り付けた。写真は、倒立蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ、ＤＭＩ ６０００ Ｂ（Ｑ−ｉｍａｇｉｎｇ、Ｒｅｔｉｇａ ｅｘｉカメラ搭載）を用いて撮影された。
【００４０】
結果
図１において、対照（Ａ）は、非移動パターンに沿ってＢｒｄＵのシグナリングレベルが非常に下がったことを示す。新しい細胞は、組織試料の全体にわたって散発的である。ＮＢＩ−１８で治療された試料（Ｂ〜Ｄ）はすべて、新しく発達した細胞の多量増加を示したが、最も重要なことに、これらは、移動パターンへの同調を実証した。
【００４１】
Ｂ
ＮＢＩ−１８の局所塗布の研究のために、４匹のＣ５７ ＢＬ／６マウスを選択した。これらのマウスは、４つの特定の場所（側部／背部）を、円形パターンに剃ることにより用意した。０．７５ｍｇ／ｍｌ、１．５ｍｇ／ｍｌ、及び、３．０ｍｇ／ｍｌ、及び、対照（５０％のＥＴＯＨ）の濃度でＮＢＩ−１８を指定された領域（右から、反時計回りに、最低用量から最高用量へ、その後、対照）にそれぞれ供給した。５日連続して５ｕｌの用量でこの溶液をこれらの場所の中心に塗布し、４日目及び５日目には、ＢｒｄＵ（１００ｍｇ／Ｋ、腹腔内）を注射した。７日目に、高用量のペントバルビタール（７０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）を用いて、これらのマウスを安楽死させた。また、治療された表皮を摘出し、４８時間、４％のパラホルムアルデヒド固定液に入れた。
【００４２】
表皮の免疫組織化学
凍結培地（Ｏ．Ｃ．Ｔ．コンパウンド、Ｔｉｓｓｕｅ Ｔｅｋ）を用いて、表皮の切片を正方形の包理モールドへ取り付け、２０ｕＭの切片にスライスし、その後、テープ転写法を介して、接着剤コーティングされたスライド（Ｉｎｓｔｒｕｍｅｄｉｃｓ，Ｉｎｃ）上に載せた。スライドをＰＢＳで洗浄し、その後、ヒストン放出を誘発するために、３０分間、２Ｎ ＨＣＬ中に入れた。その後、再びスライドをＰＢＳで洗浄し、その後、１時間、３％のロバ血清のＰＢＳＴ溶液を用いてブロックした。用いられたブロッキング溶液中に懸濁された第１の抗体は、４℃で一晩反応させた１：１０００に希釈されたａｎｔｉ−ＢｒｄＵ（ｓｉｇｍａ）だった。スライドを３回洗浄し、その後、ブロッキング溶液中に室温で２時間、懸濁して、１：５００に希釈された第２の抗体である、ＦＩＴＣ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）に入れ、その後、ＰＢＳで洗浄した。スライドはＤＡＰＩ含有Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄを用いて取り付けた。写真は、倒立蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ、ＤＭＩ ６０００ Ｂ（Ｑ−ｉｍａｇｉｎｇ、Ｒｅｔｉｇａ ｅｘｉカメラ搭載）を用いて撮影された。
【００４３】
結果
図３において、免疫組織化学法において示されるように、すべてのマウスにおいて、対照と比較してＢｒｄＵ陽性細胞の増加レベルに幾分の変動があった。しかしながら、図２（マウス４）及び図４（マウス２）において、最も目に見える効果は、マウスの写真で実証される実際の毛髪再成長である。毛髪再成長の場所が、ＮＢＩ−１８の３つの濃度（０．７５ｍｇ／ｍｌ、１．５ｍｇ／ｍｌ、３．０ｍｇ／ｍｌ）の全体にわたって散発的に起こったものの、同じ時間的制約内において対照では目に見える毛髪再生はまったくない。これは、各々の再発塗布能力が、まさに同一領域において起こるという可能性によって説明することができる。動いているマウスの背中の上へ５ｕｌの滴下を行っているため、局所塗布した場所がずれた可能性の余地はある。しかしながら、このデータは、疑いなく対照と化合物との間の差を実証する。次の実現可能なステップは、ミノキシジル（ロゲイン）のような同様に証明された化合物に対するこの化合物の効果を試験することだろう。
【００４４】
実施例１〜３に関する考察
予備的研究は、ＮＢＩ−１８は、０．７５ｍｇ／ｍｌ、１．５ｍｇ／ｍｌ、３．０ｍｇ／ｍｌ、及び、５０％のＥＴＯＨ（対照）を５日間連続して５ｕｌの用量で局所塗布を受けたマウスにおいて、ＢｒｄＵ陽性の細胞数を増加させることを示している。髪の成長には、３つの周期がある。成長期（成長している期）、退行期（ここでは、毛髪は成長を停止する）、及び、休止期（これは休止している期である）である。成長期は、約１０００日の間続くが、２〜６年に及ぶこともあり得る。また、これは、「オン」期、もしくは、成長している期と考えられる。退行期は、１〜２週間しか続かず、また、この期の間、毛包は萎縮して死に始める。これは、移行期として知られている。休止期は、「休止している」又は「オフ」期としばしば呼ばれる最終期である。これは、毛包がそれ自身で再生又は活性化する時期であり、成長期において新しい毛髪が発育して、古い毛髪を押し出す。ＮＢＩ−１８の機序的な効果は、幹細胞集団にある。また、これがどのように直接的に毛包を生じさせるかは、まだ解明中である。しかしながら、ミノキシジルを用いる別の研究は、動物研究では、局所的のミノキシジルが、休止期を短くし、その結果、休止している毛包から新しい毛髪の早期の発生を引き起こして、成長期をもたらし、これにより、天然の経路の機序的な阻害効果を生ずることを示した。この機序的な効果を維持するためには、引き続き送達投与を維持しなければならない。これに比べて、我々の化合物は、内因性細胞の成長を増加させることによって、幹細胞環境の生理学的経路に作用する。いったんこの増加が達成されれば、通常は、３〜５日の治療スケジュール内では、化合物を用い続ける必要はない。
【００４５】
小分子であるＮＢＩ−１８は、健康な新しい内因性細胞の生成を直接的に導くことによって幹細胞移植に関する倫理的・技術的な問題を回避する。ＮＢＩ−１８及びこの変異体は、安定で、経口バイオアベイラビリティを有し、かつ、製造が容易な合成複素環式化合物の特異なクラスを代表する。本発明者らは、細胞増殖を促進するために天然の幹細胞成長因子に対して相乗的に作用する化合物を用いることができる。このような化合物は、希少かつ価値のある治療候補である。この着想は、皆のために刺激的な時間を届ける。これは、あらゆる所の人々の美学を変え得る、新規かつ画期的な薬剤である。心理的悪影響が引き起こした脱毛は、男性及び女性の両方にとって、もはや問題ではないだろう。
【００４６】
すべての引用された特許文献、刊行物、及び、参考文献の開示は、本明細書の教示と不一致とならない程度に、全体において本明細書に盛り込まれる。本明細書で記述された実施例及び実施形態は、説明の目的だけのためであって、本明細書を踏まえた様々な修正又は変更は、当業者に示唆され、かつ、本出願の精神及び範囲、並びに、添付されたクレームの範囲内に含まれることが理解されるべきである。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
脱毛を治療する、又は、脱毛の発症を遅らせることを必要とする患者に対してこれらを行う方法であって、
前記患者に対して、治療上有効な量のＨＰＡ、又は、これの薬学的に許容される塩を投与することを備えることを特徴とする脱毛を治療する、又は、脱毛の発症を遅らせる方法。
【請求項２】
前記患者は、男性ホルモン性脱毛症、円形脱毛症、産褥性脱毛症、又は、休止期脱毛を有することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記投与することは、非経口投与、局所投与、及び／又は、経口投与を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記投与することは、局所投与を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＨＰＡは、ＮＢＩ−１８であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
患者の頭皮上の毛髪を成長させる毛包数を増加させる方法であって、
前記患者に対して、治療上有効な量のＨＰＡ、又は、これの薬学的に許容される塩を投与することを備えることを特徴とする患者の頭皮上の毛髪を成長させる毛包数を増加させる方法。
【請求項７】
前記患者は、男性ホルモン性脱毛症、円形脱毛症、産褥性脱毛症、又は、休止期脱毛を有することを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記投与することは、非経口投与、局所投与、及び／又は、経口投与を含むことを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記投与することは、局所投与を含むことを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＨＰＡは、ＮＢＩ−１８であることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項１】
脱毛を治療する、又は、脱毛の発症を遅らせることを必要とする患者に対してこれらを行う方法であって、
前記患者に対して、治療上有効な量のＨＰＡ、又は、これの薬学的に許容される塩を投与することを備えることを特徴とする脱毛を治療する、又は、脱毛の発症を遅らせる方法。
【請求項２】
前記患者は、男性ホルモン性脱毛症、円形脱毛症、産褥性脱毛症、又は、休止期脱毛を有することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記投与することは、非経口投与、局所投与、及び／又は、経口投与を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記投与することは、局所投与を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＨＰＡは、ＮＢＩ−１８であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
患者の頭皮上の毛髪を成長させる毛包数を増加させる方法であって、
前記患者に対して、治療上有効な量のＨＰＡ、又は、これの薬学的に許容される塩を投与することを備えることを特徴とする患者の頭皮上の毛髪を成長させる毛包数を増加させる方法。
【請求項７】
前記患者は、男性ホルモン性脱毛症、円形脱毛症、産褥性脱毛症、又は、休止期脱毛を有することを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記投与することは、非経口投与、局所投与、及び／又は、経口投与を含むことを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記投与することは、局所投与を含むことを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＨＰＡは、ＮＢＩ−１８であることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【公表番号】特表２０１２−５０２９１８（Ｐ２０１２−５０２９１８Ａ）
【公表日】平成２４年２月２日（２０１２．２．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５２７０６２（Ｐ２０１１−５２７０６２）
【出願日】平成２１年９月１６日（２００９．９．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０５７１３４
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０３３５７６
【国際公開日】平成２２年３月２５日（２０１０．３．２５）
【出願人】（５１０１７０７３０）ユニバーシティ オブ セントラル フロリダ リサーチ ファウンデーション，インコーポレイテッド (4)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年２月２日（２０１２．２．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年９月１６日（２００９．９．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０５７１３４
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０３３５７６
【国際公開日】平成２２年３月２５日（２０１０．３．２５）
【出願人】（５１０１７０７３０）ユニバーシティ オブ セントラル フロリダ リサーチ ファウンデーション，インコーポレイテッド (4)
【Ｆターム（参考）】
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