腎疾患の診断のための方法及びマーカー
本発明は、腎疾患の診断、特に鑑別診断のための方法に関する。本発明において特に興味深い腎疾患は、ＩｇＡ腎症、膜性糸球体腎症（ＭＧＮ）、微小変化型ネフローゼ症候群（ＭＣＤ）、巣状分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）及び糖尿病性腎症である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腎疾患の診断、特に、鑑別診断に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、腎疾患を発症する患者の数が増加し続けている。このため、腎疾患は、医療制度において、ますます深刻な問題となっている。多くの腎疾患は不可逆的であり、従って、腎疾患の初期診断及び／又は鑑別診断が重要である。それぞれの疾患に対して正確に調整された初期診断及び治療法は、透析を必要とする患者の数を減少させることが可能であり、患者の高い心血管リスクも低減させることができる。
【０００３】
現在、正確な診断及び／又は鑑別診断は、主として、腎生検に依存している。生検は、腎臓の診断における現行の「黄金標準」としての役割を果たしているが、生検は、侵襲的であるという欠点を有しており、従って、特定の患者に対してのみ実施される。
【０００４】
尿分析は、腎疾患を診断するための別のアプローチである。しかしながら、現在、一般的には、尿の数個のパラメータ、例えば、クレアチニン、尿素、アルブミン、血液細胞（白血球及び赤血球など）、細菌、糖、ウロビリノーゲン、ビリルビン及びｐＨ値のみが測定されている。特に、鑑別診断に対して十分な感受性及び／又は選択性を欠くので、これらの分析の診断的価値は限定的なものである。
【０００５】
尿中に含有されるタンパク質を分析するために、幾つかの試みが行われてきた。
【０００６】
Ｖ．Ｔｈｏｎｇｂｏｏｎｋｅｒｄらは、正常なヒト尿タンパク質を調べるために、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析法と組み合わせた二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（２Ｄ−ＰＡＧＥ）後に質量フィンガープリンティングを使用した。４７の特有のタンパク質の計６７個のタンパク質形態が同定された（Ｖ．Ｔｈｏｎｇｂｏｏｎｋｅｒｄ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｎｏｒｍａｌ ｈｕｍａｎ ｕｒｉｎａｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｂｙ ａｃｅｔｏｎｅ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ｏｒ ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ． Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，ｖｏｌ．６２，ｐ．１４６１−１４６９）。
【０００７】
Ｃ．Ｓ．Ｓｐｈａｒらは、尿試料中に含有されているタンパク質をトリプシンで消化し、液体クロマトグラフィータンデム型質量分析を用いて、１２４のタンパク質から得られた７５１のペプチドを同定した（Ｃ．Ｓ．Ｓｐａｈｒ ｅｔ ａｌ．（２００１）．Ｔｏｗａｒｄｓ ｄｅｆｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｕｒｉｎａｒｙ ｐｒｏｔｅｏｍｅ ｕｓｉｎｇ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−ｔａｎｄｅｍ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．Ｉ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ａｎ ｕｎｆｒａｃｔｉｏｎａｔｅｄ ｔｒｙｐｔｉｃ ｄｉｇｅｓｔ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ｖｏｌ．１，ｐ．９３−１０７）。
【０００８】
これらの研究は、健康な個体に関するものに過ぎない。これらの研究は、腎疾患の診断又は鑑別診断のために尿ポリペプチドの存在の変化を使用することができるかどうかという問題を取り扱っていない。
【０００９】
膜性糸球体腎炎（ＭＧＮ）の診断ために、尿中のポリペプチドの存在又は不存在を使用することが提案されてきた（ｖｏｎ Ｎｅｕｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．（２００４）．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ａ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ Ｓｕｒｆａｃｅ−Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｌａｓｅｒ Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ／Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ， ｖｏｌ．１８：１４９−１５６）。しかしながら、本研究では、僅か８人の患者の試料が使用され、異なる分析法の比較を主眼としたものであった。マーカーの実際の診断的価値は、不明確なままである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
その結果、腎疾患の診断、特に鑑別診断のための迅速且つ簡易な方法及び手段に対する要望が存在する。
【００１１】
従って、本発明の目的は、腎疾患の診断、特に、腎疾患の鑑別診断のための方法及び手段を提供することである。最も一般的な糸球体症であるＩｇＡ腎症の診断及び／又は鑑別診断のための方法及び手段を提供することが、本発明の具体的な目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の第一の態様によれば、腎疾患の診断、好ましくは鑑別診断のための尿試料中の少なくとも１つのポリペプチドマーカーの存在の使用であり、前記ポリペプチドマーカーが、表１から２２に示されているポリペプチドマーカーの群から選択される前記使用によって、問題が解決される。
【００１３】
本発明において、表１から２２に示されているポリペプチドマーカーの助けを借りて、それぞれ、異なる腎疾患を確実に診断又は鑑別診断することが可能であることが見出された。
【００１４】
本発明は、従来技術と比べて、多数の利点を有する。第一に、本発明のポリペプチドマーカーの存在は、尿試料中で測定することが可能である。従って、生検を採取する必要が存在しない。従って、本発明は、腎疾患の簡易化された迅速な診断を可能とし、腎疾患の存在に関して患者を定期的にスクリーニングすること及び初期段階で腎疾患を診断することが可能となる。さらに、本発明のポリペプチドマーカーは、異なる腎疾患間の鑑別診断のために使用することができる。本発明に従って同定されたマーカーの多数は、マーカーの単一又は少数のみの使用に比べて、診断の特異性と感受性の両者を増大させる。また、本発明は、抗体又はアプタマーなどの特異的なリガンドを使用せずに、前記ポリペプチドマーカーを測定することができる方法を提供する。
【００１５】
表中に示されているポリペプチドマーカーは、以下でさらに記載されている、キャピラリー電気泳動−質量分析法（ＣＥ−ＭＳ）と名付けられた方法によって同定されている。さらに、本方法は、ｖｏｎ Ｎｅｕｈｏｆｆら（２００４）（Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ａ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ Ｓｕｒｆａｃｅ−Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｌａｓｅｒ Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ／Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ， ｖｏｌ．１８：１４９−１５６）中に詳しく記載されている。ポリペプチドマーカーを定義するパラメータから開始して、本分野で公知の方法によって、対応するポリペプチドの配列を特定し、次いで、例えば、適切な細胞中の対応する遺伝子のタンパク質合成又は発現の助けを借りて、対応するポリペプチドを合成又は作製することが可能である。
【００１６】
マーカーは、それらの質量及びキャピラリー電気泳動（ＣＥ）中でのそれらの泳動時間、特に、実施例１に従って得られた質量及びそれらの泳動時間によって定義される。ＣＥ泳動時間は、典型的には５分の範囲で、より典型的には３分の範囲で変動し得ることが知られている。しかしながら、溶出されているマーカーの配列は、典型的には、適用される各ＣＥシステムと同一である又は極めて似ている。このシステムは、ほぼ全ての尿試料中に存在するポリペプチドの使用によって、例えば、表２３又は２４に挙げられているポリペプチドによって較正することができる。さらに、配列番号１から配列番号５に示されているポリペプチドは、較正のための役割を果たすことができる。
【００１７】
測定間又は異なる質量分析装置間での質量の変動は比較的小さく、典型的にはプラス又はマイナス０．０５％の範囲である。
【００１８】
表１には、健康な個体及び腎疾患、特に、糸球体腎炎若しくは糸球体症に罹患している個体間での識別のために好ましいポリペプチドマーカーが列記されている。
【００１９】
表２には、ＦＳＧＳと健康な状態間での識別のために好ましいポリペプチドマーカーが列記されている。
【００２０】
表３には、ＦＳＧＳとＭＣＤ間での鑑別診断のために使用することが可能なポリペプチドマーカーが列記されている。
【００２１】
表４には、ＦＳＧＳとＭＧＮの鑑別診断のために好ましいポリペプチドマーカーが列記されている。
【００２２】
表５には、一方でＦＳＧＳ及び他方でＭＣＤ又はＭＧＮ間での鑑別診断のために好ましいポリペプチドマーカーが列記されている。
【００２３】
表６には、健康な状態と比べて、ＭＣＤの診断のために好ましいポリペプチドマーカーが列記されている。
【００２４】
表７には、ＭＣＤとＭＧＮ間の鑑別診断のために好ましいポリペプチドマーカーが列記されている。
【００２５】
表８には、一方でＭＣＤ及び他方でＦＳＧＳ又はＭＧＮ間での鑑別診断のために好ましいポリペプチドマーカーが列記されている。
【００２６】
表９には、健康な状態と比べて、ＭＧＮの診断のために好ましいポリペプチドマーカーが列記されている。
【００２７】
表１０には、一方でＭＧＮ及び他方でＦＳＧＳ又はＭＣＤ間での鑑別診断のために好ましいポリペプチドマーカーが列記されている。
【００２８】
表１１には、健康な状態と比較して、一方でＩｇＡ腎症又はＭＧＮを診断するために好ましいポリペプチドマーカーが列記されている。
【００２９】
表１２には、健康な状態と比べて、ＩｇＡ腎症を診断するのに好ましいポリペプチドマーカーが列記されている。
【００３０】
表１３には、ＩｇＡ腎症とＭＧＮ間の鑑別診断に好ましいポリペプチドマーカーが列記されている。
【００３１】
表１４には、健康な者、ＦＳＧＳ、ＭＣＤ及びＭＧＮ患者におけるそれぞれの頻度とともに、ポリペプチドが列記されている。
【００３２】
表１５には、実施例１に従い、サポートベクターマシンを用いて、健康な個体と腎疾患患者間での鑑別診断のために使用されたポリペプチドが列記されている。
【００３３】
表１６には、実施例１に従い、ランダム・フォレスト解析（ｒａｎｄｏｍ ｆｏｒｅｓｔ ａｎａｌｙｓｉｓ）を用いて、健康な者、ＦＳＧＳ、ＭＣＤ及びＭＧＮ患者間での鑑別診断のために使用されたポリペプチドが列記されている。
【００３４】
表１７には、実施例１に従い、サポートベクターマシンを用いて、ＭＣＤとＭＧＮ患者間での鑑別診断のために使用されたポリペプチドが列記されている。
【００３５】
表１８には、実施例１に従い、サポートベクターマシンを用いて、ＭＣＤとＦＳＧＳ患者間での鑑別診断のために使用されたポリペプチドが列記されている。
【００３６】
表１９には、実施例１に従い、サポートベクターマシンを用いて、ＭＧＮとＦＳＧＳ患者間での鑑別診断のために使用されたポリペプチドが列記されている。
【００３７】
表２０と２１には、上に引用されているｖｏｎ Ｎｅｕｈｏｆｆら（２００４）において同定されたポリペプチドが列記されている。
【００３８】
表２２には、糖尿病及び／又は糖尿病性腎症の診断のために使用することが可能なポリペプチドが列記されている。
【００３９】
表２３には、ＣＥ時間を標準化するための内部標準として好ましいポリペプチドが列記されている。
【００４０】
表２４には、実施例１に記載の圧力法（０．３から１ｐｓｉ）が使用された場合に、ＣＥ時間を標準化するための内部標準として好ましいポリペプチドが列記されている。これらの標準は、例えば、ＩｇＡ腎症の診断における内部標準として好ましい。
【００４１】
表２５には、ポリペプチドマーカーの特定のために、実施例１に従って、その試料が使用された腎疾患患者の臨床データが列記されている。略号：ＣｓＡ、シクロスポリンＡ；ＰＳ、プレドニゾロン；＋頻繁な再発；−現時点で免疫抑制なし；＊ＭＣＤ又はＦＳＧＳかどうか臨床的に不明。
【００４２】
本発明に従って使用されるポリペプチドマーカーは尿試料中において同定することが可能であり、それらの存在は尿試料中で測定することができる。尿試料は、従来の技術において公知であるように採取することができる。好ましくは、本発明において、中間尿が使用される。
【００４３】
本発明に従って使用されるポリペプチドマーカーは、タンパク質、ペプチド及び断片又はタンパク質若しくはペプチドの他の分解産物などの遺伝子発現産物であり得る。本発明に従って使用されるポリペプチドマーカーは、翻訳後修飾によって、例えば、グリコシル化、リン酸化、アルキル化又はジスルフィド結合によって修飾され得る。断片及び分解産物は、これらが得られたタンパク質又はペプチドとは異なる診断的価値及び／又は生理的役割を有し得ることが知られている。例えば、異なる疾病において、異なるタンパク分解分解産物又は断片を見出すことができる。尿中に含有されるポリペプチドマーカーを化学的に修飾し、化学的に修飾されたこれらのポリペプチドマーカーを測定するために尿試料が前処理されていても、本発明の範囲に属するものと考えられる。本発明のポリペプチドマーカーは、４００と２００００Ｄａの間、具体的には、７００と１４０００Ｄａの間、さらに具体的には８００と１１０００Ｄａの間の分子量を有する。
【００４４】
本発明の好ましいポリペプチドマーカーは、表１から２２に、具体的には表１から２１に、より具体的には表１から１３に列記されている。内部標準として使用するための好ましいポリペプチドは、表２３から２４に列記されている。表１に列記されているが、表１４及び／又は表１５及び／又は表１６及び／又は表１７及び／又は表１８及び／又は１９及び／又は２０及び／又は２１及び／又は２２に列記されていないポリペプチドマーカーも好ましい。表２に列記されているが、表１４及び／又は表１５及び／又は表１６及び／又は表１８に列記されていないポリペプチドマーカーも好ましい。表３に列記されているが、表１４及び／又は表１６及び／又は表１８に列記されていないポリペプチドマーカーも好ましい。表４に列記されているが、表１４及び／又は表１６及び／又は表１９に列記されていないポリペプチドマーカーも好ましい。表５に列記されているが、表１４及び／又は表１６及び／又は表１８及び／又は表１９に列記されていないポリペプチドマーカーも好ましい。表６に列記されているが、表１４及び／又は表１６に列記されていないポリペプチドマーカーも好ましい。表７に列記されているが、表１４及び／又は表１６及び／又は表１７に列記されていないポリペプチドマーカーも好ましい。表８に列記されているが、表１４及び／又は表１６に列記されていないポリペプチドマーカーも好ましい。表９に列記されているが、表１４及び／又は表１６及び／又は表２０及び／又は表２１に列記されていないポリペプチドマーカーも好ましい。表１０に列記されているが、表１４及び／又は表１６に列記されていないポリペプチドマーカーも好ましい。表１１に列記されているが、表１４及び／又は表１６に列記されていないポリペプチドマーカーも好ましい。
【００４５】
本発明の腎疾患は、当業者に公知の腎疾患又は腎機能障害のあらゆる種類、例えば、ＩｇＡ腎症、ＭＧＮ（膜性糸球体腎炎）、ＭＣＤ（微小変化型ネフローゼ症候群）、ＦＳＧＳ（巣状分節性糸球体硬化症）又は糖尿病性腎症に関する。特に、腎疾患は、ＩｇＡ腎症、ＭＧＮ、ＭＣＤ又はＦＳＧＳなどの糸球体症に関する。さらに具体的には、腎疾患は、ＩｇＡ腎症、ＭＣＤ又はＦＳＧＳに関する。最も具体的には、腎疾患は、ＩｇＡ腎症に関する。
【００４６】
糸球体症は、腎疾患の亜群である。糸球体症は、異なる病因の複数の疾患を含む。糸球体症は、マルピーギ小体、糸球体及びボーマン嚢の病理形態学的な変化によって特徴付けられる。これらの変化の結果、さらなる病理形態学的な変化が、ネフロン及び間隙の他の部分に出現し得る。
【００４７】
ＩｇＡ腎症は、ベルジェ腎炎としても知られている。ＩｇＡ腎症は、最も一般的な糸球体症である。ＩｇＡ腎症は、ＩｇＡの増加した血漿濃度を伴う、シェーライン・ヘノッホ紫斑病（アナフィラキシー様紫斑病としても知られている。）の腎臓に限定される特定の形態であり得る。組織病理学的には、糸球体病変及び糸球体間質中のＩｇＡの堆積の全ての形態が含まれる。臨床的には、ＩｇＡ腎症は、微小及び巨大血尿症（ｍｉｃｒｏ− ａｎｄ ｍａｃｒｏ−ｈｅｍａｔｏｕｒｉａ）として現れる。ＡＣＥ阻害剤及びω−３脂肪酸を用いた治療法を試み得る。疾病の進行は、数年にわたって起こり、進行性腎不全への移行を含む。
【００４８】
ＭＧＮは、基底膜の肥厚及び顆粒状の上皮下ＩｇＧ堆積によって特徴付けられる。ＭＧＮは、４０歳と５０歳の間に、しばしば顕在化する。ＭＧＮは、しばしば、医薬、例えば、金、Ｄ−ペニシラミン又はＡＣＥ阻害剤によって引き起こされる。ＭＧＮの治療は、グルココルチコイド又はシクロホスファミドを用いて試みることができる。ＭＧＮは、ネフローゼ症候群であり、進行性腎不全への移行には、数年を要し得る。
【００４９】
ＭＣＤは、リポイドネフローゼとしても知られている。ＭＣＤは、小児におけるネフローゼ症候群の最も一般的な原因である。本疾病の発症原因は不明である。組織学的には、変化が認められず、又は極めて離散した変化のみを認めることができる。ＭＧＮの治療には、グルココルチコイド、シクロスポリンＡ又はシクロホスファミドを用いた治療が含まれ得る。小児では症例の９０％で、成人では症例の５０％で、疾病は自然に治癒する。ＦＳＧＳへの移行が可能である。
【００５０】
ＦＳＧＳは、ＩｇＭ腎症としても知られている。ＦＳＧＳは、典型的には、糸球体間質中へのＩｇＭ及びＣ３の堆積によって特徴付けられる。臨床的には、ＦＳＧＳは、ネフローゼ症候群として顕在化する。ＦＳＧＳの治療法には、グルココルチコイド、シクロスポリンＡ又はシクロホスファミドを用いた治療が含まれ得る。予後は不良であり、進行性腎不全への移行を含む。
【００５１】
糖尿病性腎症は、糖尿病性糸球体硬化症としても知られている。糖尿病性腎症は、透析治療が必要となる最も一般的な原因である。
【００５２】
要約すると、腎疾患には、極めて類似する組織学を示し得る様々な疾患が含まれることが明らかである。しかしながら、各疾病に対する病因、治療及び予後は、極めて異なり得る。例えばＩｇＡ腎症は、上記されている何れかの他の糸球体症とは異なる治療を必要とする。すなわち、ＩｇＡ腎症では、ＡＣＥ阻害剤を用いた治療を試み得るが、これは、ＭＧＮの場合には推奨されない。従って、迅速且つ信頼できる診断が、治療のために極めて重要である。
【００５３】
本発明において、診断する又は診断とは、各患者に関して、それぞれの疾病を有する確率が決定されることを意味する。
【００５４】
予備的診断、特に異なる方法によって確立された予備的診断を確認することも、診断に含まれ得る。
【００５５】
さらに、好ましい実施形態において、本発明の診断は、特に「鑑別診断」に関する。「鑑別診断」という用語は、２つの異なる疾病を区別すること、すなわち、個別の患者に対して、ある第二の疾病を有する確率と比較して、ある第一の疾病を有する確率を決定することに関する。より具体的には、本発明の鑑別診断は、ＩｇＡ腎症、ＭＧＮ、ＭＣＤ、ＦＳＧＳ及び糖尿病性腎症からなる群から選択される少なくとも２つの腎疾患を区別することに関する。
【００５６】
別の実施形態において、本発明は、
ａ）尿試料中のポリペプチドマーカーの存在又は不存在を測定すること（前記ポリペプチドマーカーは表１から２２に示されているポリペプチドマーカーの群から選択される。）、及び
ｂ）疾病患者におけるこのマーカーの存在の確率を、対照患者におけるこのマーカーの存在の確率と比較すること
を含み、
ｃ１）疾病患者におけるこのマーカーの存在の確率が対照患者におけるこのマーカーの存在の確率より高ければ、このマーカーの存在が、対照症状よりむしろ疾病を有する確率がより高いことを示し、又は
ｃ２）疾病患者におけるこのマーカーの存在の確率が対照患者におけるこのマーカーの存在の確率より低ければ、このマーカーの不存在が、対照症状よりむしろ疾病を有する確率がより高いことを示す、
腎疾患の鑑別診断のための方法に関する。
【００５７】
好ましくは、工程ｂ）における各確率は、表中に示されているとおりである。
【００５８】
本発明における「測定する」という用語は、目的のポリペプチド又は他の物質の存在を決定することに関する。
【００５９】
ポリペプチドマーカーが存在し又は存在しないかどうかという決定は、適切な閾値の定義に依存し得る。閾値は、測定方法の感受性を通じて定義することが可能であり、又は随意に定義することが可能である。本発明における閾値は、実施例１に従って質量分析装置中に注入された試料において２５ｆｍｏｌ／μＬである。しかしながら、この閾値は、他の方法が使用された場合と同一であり得る。この閾値は、典型的な質量分析装置の検出閾値と一致する。この閾値は、５０から５０００ｐｍｏｌ／Ｌの尿試料中のポリペプチドマーカーの濃度に概ね対応する。異なる閾値が使用される場合（例えば、別の検出方法を用いる場合）、対応する確率は異なり得るが、当業者によって容易に確定することができる。
【００６０】
本発明において「疾病患者」は、腎疾患に罹患している。特に、疾患は、ＩｇＡ腎症、ＭＧＮ、ＭＣＤ、ＦＳＧＳ及び糖尿病性腎症からなる群から得られる少なくとも１つである。
【００６１】
「対照患者」は、健康であり又は疾病患者が罹患しているものとは異なる疾病に罹患し得る。すなわち、対照患者は、健康な状態を呈し又は１つの疾病若しくは疾病群を呈し得る。特に、発病される疾病は、ＩｇＡ腎症、ＭＧＮ、ＭＣＤ、ＦＳＧＳ及び糖尿病性腎症からなる群から得られる少なくとも１つである。
【００６２】
表１から１４、１６、２０、２１及び２２は、所定のポリペプチドが健康な対照患者又はある一定の疾病に罹患している対照患者の尿試料中に存在している確率（「頻度」とも表記される。）を列記している。識別因子は、所定の対照状態と比較した、疾病の存在確率間の差を示す。識別因子は、それぞれの確率から容易に計算することができる。識別因子が高いほど、所定のマーカーが疾病と対照状態とを区別する能力がより優れている。０．４０又はそれ以上の識別因子の絶対値が好ましい。
【００６３】
当業者は、例えば、さらなる患者データに基づいて、及び／又はポリペプチドマーカーの存在に関する異なる閾値に従って、当業者自身で、ポリペプチドマーカーに関する類似の表を確立し及び／又は表中に含有されるデータを精緻化することができる。
【００６４】
診断に関して、疾病患者におけるポリペプチドマーカーの存在の確率は、対照患者におけるこのマーカーの存在の確率と比較され、それぞれの確率は表中に示されているとおりである。疾病患者におけるこのマーカーの存在の確率が対照患者におけるこのマーカーの存在の確率より高ければ、試料中のこのマーカーの存在は、該試料が由来する患者が対照状態よりむしろ疾病を有する確率がより高いことを示す。疾病患者におけるこのマーカーの存在の確率が対照患者におけるこのマーカーの存在の確率より低ければ、試料中のこのマーカーの不存在は、該試料が由来する患者が対照状態よりむしろ疾病を有する確率がより高いことを示す。
【００６５】
例えば、あるマーカーがＩｇＡ腎症を呈する対照中に存在する確率は７３％であるが、健康な状態を呈する対照中に存在する確率は０％であり得る。このマーカーが試料中に存在すれば、個体は、健康な状態であることに比べて、ＩｇＡ腎症に罹患している７３％の確率を有すると診断される。このマーカーが試料中に存在しなければ、個体は、ＩｇＡ腎症に罹患している代わりに、健康である７３％の確率を有すると診断される。
【００６６】
このように、診断は、当業者が習熟する統計学的方法に従って確定することができる。
【００６７】
本発明は、ポリペプチドマーカーの唯一つを用いて又はポリペプチドマーカーの複数を用いて実施することが可能である。好ましくは、ポリペプチドマーカーの複数の存在が測定される。好ましくは、マーカーの少なくとも３つ、より好ましくは、マーカーの少なくとも１０個、さらに好ましくは少なくとも２０個、最も好ましくは本発明のポリペプチドマーカーの少なくとも５０個が測定される。
【００６８】
本発明の利点は、適切なマーカーの多数を提供することである。マーカーの複数を測定することは、診断の感受性と選択性の両方を増加させることができる。従って、他のマーカーと組み合わされれば、疾病と対照間で低い識別因子を示すマーカーも診断のために使用することができる。
【００６９】
ポリペプチドマーカーの複数が使用される場合、測定された各マーカーに対する存在についての情報を含有する「パターン」が生成される。次いで、このパターンは、疾病患者又は対照患者中でのポリペプチドマーカーの存在確率のパターンと比較することができる。各表は、ある種の疾病患者及び対照患者中で所定のポリペプチドマーカーを見出す確率のパターンを表している。
【００７０】
従って、好ましい実施形態において、本発明は、
ａ）尿試料中のポリペプチドマーカーの複数の存在又は不存在のパターンを確立すること（少なくとも１つのポリペプチドマーカーは表１から２２に示されているポリペプチドマーカーの群から選択される。）、及び
ｂ）疾病患者中でこのパターンを見出す確率を、対照患者中でこのパターンを見出す確率と比較すること
を含み、
ｃ１）疾病患者中で前記パターンを見出す確率が対照患者中で前記パターンを見出す確率より高ければ、このパターンを見出すことが、対照状態よりむしろ疾病を有する確率がより高いことの指標であり、又は
ｃ２）疾病患者中で前記パターンを見出す確率が対照患者中で前記パターン見出す確率より低ければ、このパターンを見出すことが、対照状態よりむしろ疾病を有する確率がより低いことの指標である、
腎疾患の鑑別診断のための方法に関する。
【００７１】
好ましくは、工程ｂ）に従う少なくとも１つのポリペプチドマーカーに対する各確率は、表中に示されているとおりである。
【００７２】
疾病又は対照患者中に該パターンを見出す確率と見出されたパターンを、比較することは、本分野で公知の統計学的方法に従って実施することが可能である。好ましくは、自動化された方法、例えば、ＣＡＲＴ分析、ランダム・フォレスト解析及びサポートベクターマシン（ＳＶＭ、例えば、Ｘｉｏｎｇ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（２００１）．Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ ｆｅａｔｕｒｅ ｗｒａｐｐｅｒｓ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｖｏｌ．１１，ｐ．１８７８−１８８７）が使用される。比較は、幾つかの異なるパターン及びこれらを見出す確率に対して同時に実行することも可能である。
【００７３】
従って、測定されるパターンは、典型的には、少なくとも２つの異なる状態においてパターンを見出す確率と比較される。この方法に従う腎疾患の診断及び鑑別診断の例は、図３に示されている。
【００７４】
必要であれば、尿試料は、ポリペプチドマーカーの測定前に前処理され得る。特に、脂質、核酸又はポリペプチドは、ろ過、遠心又はクロロホルムフェノール抽出などの抽出方法などの本分野で公知の方法に従って、試料から精製され得る。
【００７５】
ポリペプチドマーカーの存在を測定することは、本分野で公知の何れの方法によっても実施することが可能である。
【００７６】
好ましい方法には、レーザー脱離／イオン化質量分析法、表面増強レーザー脱離／イオン化飛行時間質量分析法（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ）及びＣＥ−ＭＳなどの気相イオン分光法が含まれる。これらの分光法によって、抗体又はアプタマーなどのリガンドに対する必要なしに、ポリペプチドマーカーを測定することが可能となる。
【００７７】
尿試料は、一般に高度に複雑である。すなわち、尿試料は、多数のポリペプチドを含有している。複雑度が高い場合には、分光学的分析は困難となる。試料の複雑度を低下させるために、試料中に含有されるポリペプチドは、何れかの適切な手段によって、例えば、電気泳動分離、親和性を基礎とする分離又はイオン交換クロマトグラフィーに基づく分離によって分離され得る。具体例には、ゲル電気泳動、二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（２Ｄ−ＰＡＧＥ）、キャピラリー電気泳動、金属アフィニティークロマトグラフィー、固定化された金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ；ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｍｅｔａｌ−ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）、レクチンに基づくアフィニティークロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）及び逆相ＨＰＬＣ、陽イオン交換クロマトグラフィー及び選択的に結合する表面（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦにおいて使用される表面など、下記参照）が含まれる。
【００７８】
２Ｄ−ＰＡＧＥは、ポリペプチドを分離するために一般的に使用されており、質量分析法（ＭＳ）と組み合わせて、各ポリペプチドの同定を行うことができる。２Ｄ−ＰＡＧＥを用いて、１０００を超えるタンパク質のスポットを識別することが可能である。しかしながら、それぞれの単一のスポットは、同定のために、ＭＳ／ＭＳによって別個に分析されなければならない。
【００７９】
現在、ＳＥＬＤＩ（表面強化されたレーザー脱離／イオン化）飛行時間質量分析法は、生物医科学の多くの分野に応用されている。
【００８０】
ＳＥＬＤＩシステムでは、ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐＡｒｒａｙが最も重要な成分である。ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐＡｒｒａｙは、表面上の列内に８又は１６のスポットを担持する狭い金属細片である。分析すべき試料は、直立の滴（ｓｔａｎｄｉｎｇ ｄｒｏｐ）として、又は「バイオプロセッサ」と称される試料保持器を支持単位として使用することによって最大５００μＬの容量で、スポットに直接適用される。試料は、温置及び洗浄工程の間にアレイ上に配置され、その後、再度除去される。アレイの異なる種類は、疎水性、親水性、陽イオン交換、陰イオン交換又は固定化された金属イオンアフィニティー表面を呈するクロマトグラフィーアレイ及びタンパク質の共有結合を可能とする化学基を有する予め活性化されたアレイという２つの主な系列に属する。好ましくは、陽イオン交換表面を有するチップが使用される。ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐＡｒｒａｙは試料を支持するのみならず、生物分子と特異的に相互作用するので、分析物の組成は使用されるアレイの種類及び適用される洗浄条件に依存する。これは、ＳＥＬＤＩ−プロセスを、伝統的なＭＡＬＤＩ（マトリックス支援レーザー脱離／イオン化）技術のさらなる発展と定義できる理由を説明する。ＳＥＬＤＩプロセスでは、チップ表面に実際に結合するポリペプチドに対してのみ測定が為される。
【００８１】
試料タンパク質の結合後、エネルギー吸収マトリックスが各スポットに適用される。マトリックスは迅速に結晶化し、分析は直ちに開始し得る。
【００８２】
ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ Ａｒｒａｙは、分析のためにＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐＲｅａｄｅｒ中に配置される。リーダーは、レーザービームの補助を得て、その中でタンパク質が脱離及びイオン化されるＴＯＦ（飛行時間）質量分析装置である。結晶化されたタンパク質はスポット表面上に等しく分配されるので、イオン化レーザービームは、常に、分析物中の分子の代表的な平均に該当し、定量的な計算が可能となる。イオン化後、検出器に到達する前に、飛行管を飛行させるために、電場によってタンパク質を加速する。アレイ表面に追突するレーザーと飛行管の末端で検出器に到達する分子との間の飛行時間によって、システムは試料中に存在するタンパク質種の質量を正確に決定することが可能となる（本方法に関するより詳細な情報に関しては、以下の総説：Ｍｅｒｃｈａｎｔ Ｍ ａｎｄ Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ ＳＲ （２０００）．Ｒｅｃｅｎｔ ａｄｖａｎｃｅｍｅｎｔｓ ｉｎ ｓｕｒｆａｃｅ−ｅｎｈａｎｃｅｄ ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ−ｔｉｍｅ ｏｆ ｆｌｉｇｈｔ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｖｏｌ．２１２，ｐ．１１６４−１１７７）を参照されたい。）。
【００８３】
しかしながら、最も好ましい方法は、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）が質量分析法（ＭＳ）に連結されているＣＥ−ＭＳである。ＣＥ−ＭＳは、他の文献中に詳しく記載されている（例えば、ドイツ特許出願ＤＥ １００ ２１ ７３７、及びＫａｉｓｅｒ， Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｃｏｕｐｌｅｄ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｉｎ ｄｉａｌｙｓｉｓ ｆｌｕｉｄｓ．Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ａ， ｖｏｌ．１０１３，ｐ．１５７−１７１（２００３）を参照されたい。）。
【００８４】
ＣＥは、当業者に公知である。簡潔に述べると、電気泳動キャピラリー上に試料を搭載し、最大５０ｋＶ、典型的には最大３０ｋＶの電圧が印加される。典型的なキャピラリーは、融合されたケイ素キャピラリー、すなわち、機械的な支持として、及び機械的な柔軟性を改善するために、外鞘、例えば熱可塑性材料から作られた鞘を含むガラスキャピラリーである。典型的には、キャピラリーには処理が施されない。すなわち、キャピラリーは、その内側の上に水酸基を示す。しかしながら、キャピラリーの内側を被覆してもよい。例えば、識別力を向上させるために、疎水性被覆を使用することが可能である。電圧の他に、典型的には０から１ｐｓｉの範囲の圧力をかけてもよい。圧力をかけることも可能であり、又は走行中に増加させることもできる。
【００８５】
識別力を向上させるために、試料を搭載する際に、重層プロトコールを適用することも可能である。すなわち、試料の搭載前に、塩基を搭載し、次いで、試料を搭載し、次いで、酸を搭載する。原理は、塩基と酸の間に分析物のイオンを捕捉することである。電圧が印加されると、正の電荷の分析物イオンは塩基の方向に移動する。そこで、分析物イオンは負に帯電し、酸に向けて逆方向に移動し、ここで、分析物イオンは正に帯電する。このスタッキングは、酸と塩基が中和されるまで、繰り返される。次いで、十分に濃縮された試料から分離が開始する。
【００８６】
その中でポリペプチドが可溶性である適切な緩衝液、例えば、リン酸緩衝液中に試料が含有される。ＣＥ−ＭＳカップリングに関しては、ＭＳの汚染を避けるために、揮発性溶媒を使用し、ほぼ無塩条件下で作業することが好ましい。例には、アセトニトリル、イソプロパノール、メタノールなどが含まれる。溶媒は、水及び弱酸（例えば、０．１％ギ酸）と組み合わせることも可能であり、後者が分析物をプロトン化する。試料中のポリペプチドは、キャピラリー中での走行時間を決定するサイズ及び電荷に従って分離される。ＣＥは、高い分離力と短い分析時間を特徴とする。
【００８７】
その後のＭＳ分析のために、ＣＥから集められた何れかの画分を、別個のバッチとして分析することが可能であり、又は、連続的なフロー分析を可能とするために、適切なインターフェースを介して、ＣＥシステムを質量分析装置に連結することが可能である。あるいは、別個に分析することができる連続的な「分離トラック」を生成するために、ＣＥからの流れを使用し得る。
【００８８】
質量分析装置では、試料から生成されたイオンは、質量／電荷（ｍ／ｚ）指数に従って分析される。質量分析法を用いて、±０．０１％の精度で、１０ｆｍｏｌ（すなわち、１０ｋＤａポリペプチドの０．１ｎｇ）を一般的に分析することが可能である。実験的には、０．１ｆｍｏｌ未満でさえ分析することが可能である。
【００８９】
質量分析装置のあらゆる種類を使用することができる。質量分析装置において、イオン生成装置は適切な分析装置と組み合わされる。例えば、電子スプレーイオン化（ＥＳＩ）インターフェースは液体試料からイオンを生成するために最も一般的に使用されるのに対して、ＭＡＬＤＩは、個別に加工処理された試料からイオンを生成するために最も一般的に使用される。分析装置の異なる種類、例えば、イオン捕捉分析装置又は飛行時間（ＴＯＦ）分析装置を利用可能である。ＥＳＩ及びＭＡＬＤＩの両方を質量分析装置の実質的に全ての種類と組み合わせることができるが、ＥＳＩはイオン捕捉と通常組み合わされ、これに対して、ＭＡＬＤＩは通常ＴＯＦと組み合わされる。
【００９０】
本発明の好ましいＣＥ−ＭＳ法は、ＥＳＩを介して、ＴＯＦ分析装置にオンラインで連結されたキャピラリー電気泳動を含む。
【００９１】
ＣＥ−ＭＳ技術は、高い感受性で、小容量中で、短時間で同時に、数百のポリペプチドマーカーの存在を測定することが可能となる。一旦、ポリペプチドマーカーの存在が測定されたら、測定されたポリペプチドマーカーのパターンが作製され、上でさらに記載されている方法の何れかによって疾病パターンと比較することが可能である。しかしながら、多くの事例では、マーカーの唯一つ又はマーカーの限定された数を測定することが診断に十分である。
【００９２】
ポリペプチド配列は、当業者に周知の方法に従って測定することが可能である（例えば、ＣＳ．Ｓｐａｈｒ ｅｔ ａｌ．（２００１）．Ｔｏｗａｒｄｓ ｄｅｆｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｕｒｉｎａｒｙ ｐｒｏｔｅｏｍｅ ｕｓｉｎｇ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−ｔａｎｄｅｍ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．Ｉ．Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ａｎ ｕｎｆｒａｃｔｉｏｎａｔｅｄ ｔｒｙｐｔｉｃ ｄｉｇｅｓｔ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ｖｏｌ．１， ｐ．９３−１０７を参照されたい。）。
【００９３】
ポリペプチドマーカーの種類に応じて、さらなる手段によってその存在又は不存在を測定することが可能である。例えば、ポリペプチドが生物学的に活性であれば、その存在は、細胞又は酵素的アッセイによって測定され得る。
【００９４】
ポリペプチドの存在は、目的のポリペプチドへのリガンド結合の使用によっても測定することができる。本発明における結合は、共有結合及び非共有結合の両方を含む。
【００９５】
本発明におけるリガンドは、目的のポリペプチドに結合するあらゆるペプチド、ポリペプチド、核酸又は他の物質であり得る。ヒト又は動物の身体から取得又は精製される場合、ポリペプチドは、例えば、グリコシル化によって修飾可能であることが周知である。本発明における適切なリガンドは、このような部位を介しても、ポリペプチドを結合し得る。
【００９６】
好ましいリガンドには、抗体、核酸、ペプチド又はポリペプチド、及びアプタマー、例えば、核酸又はペプチドアプタマーが含まれる。多くのポリペプチドに対して、適切なリガンドが市販されている。さらに、適切なリガンドを作製する方法が、本分野において周知である。例えば、適切な抗体又はアプタマーの同定及び作製は、業者によっても供給されている。
【００９７】
本明細書において使用される「抗体」という用語は、ポリクローナル及びモノクローナル抗体の両方並びに抗原又はハプテンを結合することができるその断片（Ｆｖ、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ）２断片など）を含む。
【００９８】
好ましくは、リガンドは、測定されるべきポリペプチドに特異的に結合すべきである。本発明において「特異的結合」とは、リガンドが検査される試料中に存在する別のポリペプチド又は物質へ実質的に結合（と「交叉反応」）すべきでないことを意味する。好ましくは、特異的に結合されたタンパク質又はイソフォームは、他の何れの関連するポリペプチドより、少なくとも３倍高い親和性で、より好ましくは少なくとも１０倍高い親和性で、さらに好ましくは少なくとも５０倍高い親和性で結合されるべきである。
【００９９】
特に、検査されているペプチド又はポリペプチドが、例えば、ウェスタンブロット上でのそのサイズに従って、又は試料中での相対的により高いその存在量によって、なお明確に区別及び測定できれば、非特異的結合が許容され得る。
【０１００】
目的のポリペプチドの存在を測定する方法は、（ａ）ポリペプチドを特異的結合リガンドと接触させる段階、（ｂ）（場合によって）結合されていないリガンドを取り除く段階、（ｃ）結合されたリガンドの存在又は量を測定する段階を含み得る。
【０１０１】
リガンドの結合は、本分野で公知のあらゆる方法によって測定することができる。第一に、リガンドの結合は、例えば、ＮＭＲ又は表面プラズモン共鳴によって、直接測定し得る。第二に、リガンドは、目的のペプチド又はポリペプチドの酵素的活性の基質としての役割も果たし、酵素的反応産物を測定し得る（例えば、例えばウェスタンブロットによって切断された基質の量を測定することによって、プロテアーゼの存在を測定することができる。）。第三に、リガンドは、標識に共有結合又は非共有結合させることができ、リガンドの検出及び測定が可能となる。
【０１０２】
標識は、直接又は間接法によって実施し得る。直接標識は、直接に（共有的に又は非共有的に）標識をリガンドに結合することを含む。間接標識は、第一のリガンドへ第二のリガンドを（共有的に又は非共有的に）結合することを含む。第二のリガンドは、第一のリガンドに特異的に結合すべきである。前記第二のリガンドは、適切な標識と結合し得、及び／又は第二のリガンドへの第三のリガンド結合の標識（受容体）であり得る。二次、三次又はより高次のリガンドの使用は、しばしば、シグナルを増加させるために使用される。適切な二次及びより高次のリガンドには、抗体、二次抗体及び周知のストレプトアビジン−ビオチン系（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）が含まれ得る。
【０１０３】
リガンド又は基質は、本分野で公知の１つ又はそれ以上のタグでも「タグ化」され得る。このようなタグは、次いで、より高次のリガンドに対する標的であり得る。適切なタグには、ビオチン、ジゴキシゲニン、Ｈｉｓタグ、グルタチオン−Ｓ−転移酵素、ＦＬＡＧ、ＧＦＰ、ｍｙｃタグ、インフルエンザＡウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）、マルトース結合タンパク質などが含まれる。ペプチド又はポリペプチドの場合には、タグは、好ましくは、Ｎ末端及び／又はＣ末端に位置する。
【０１０４】
適切な標識は、適切な検出法によって検出可能なあらゆる標識である。典型的な標識には、金粒子、ラテックスビーズ、アクリダンエステル、ルミノール、ルテニウム、酵素的に活性な標識、放射性標識、磁気標識（常磁性及び超常磁性標識を含む、「例えば、磁気ビーズ」）及び蛍光標識が含まれる。
【０１０５】
酵素的に活性な標識には、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ及びこれらの誘導体が含まれる。検出用の適切な基質には、ジ−アミノ−ベンジジン（ＤＡＢ）、３，３’−５，５’−テトラメチルベンジジン、ＮＢＴ−ＢＣＩＰ（４−ニトロブルーテトラゾリウムクロリド及び５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ホスファート、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓから得られる既成原溶液として入手可能である。）、ＣＤＰ−ＳｔａｒＴＭ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＥＣＦＴＭ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）が含まれる。適切な酵素−基質の組み合わせは、本分野で公知の方法に従って測定することが可能な呈色された反応産物、蛍光又は化学発光をもたらし得る。
【０１０６】
典型的な蛍光標識には、蛍光タンパク質（ＧＦＰ及びその誘導体など）、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ＴｅｘａｓＲｅｄ、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ、Ａｌｅｘａ色素（例えば、Ａｌｅｘａ５６８）及び量子ドットが含まれる。
【０１０７】
典型的な放射性標識には、３５Ｓ、１２５Ｉ、３２Ｐ、３３Ｐなどが含まれる。
【０１０８】
従って、本発明における適切な測定方法には、沈降（特に、免疫沈降）、電気化学的発光（電気によって生成された化学発光）、ＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）、サンドイッチ酵素免疫検査、電気化学発光サンドイッチイムノアッセイ（ＥＣＬＩＡ）、解離促進ランタニド蛍光イムノアッセイ（ＤＥＬＦＩＡ；ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ−ｅｎｈａｎｃｅｄ ｌａｎｔｈａｎｉｄｅ ｆｌｕｏｒｏ ｉｍｍｕｎｏ ａｓｓａｙ）、シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）、比濁法、比濁分析、ラテックス強化された比濁法若しくは比濁分析又は固相免疫検定も含まれる。本分野で公知のさらなる方法（ゲル電気泳動、二次元ゲル電気泳動、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、ウェスタンブロッティング）を、単独で、又は標識若しくは上記他の検出方法と組み合わせて使用することができる。
【０１０９】
リガンドは、アレイ上にも存在し得る。前記アレイは、目的のペプチド、ポリペプチド又は核酸に対して誘導され得る少なくとも１つのさらなるリガンドを含有する。前記さらなるリガンドは、本発明において特に興味が持たれないペプチド、ポリペプチド又は核酸に対しても誘導され得る。好ましくは、本発明に係る少なくとも５個、より好ましくは少なくとも１０個、さらに好ましくは少なくとも２０個のポリペプチドマーカーに対するリガンドが、アレイ上に含有される。
【０１１０】
本発明において、「アレイ」という用語は、一次元、二次元又は三次元配置で、その上に少なくとも２つの化合物が付着又は結合される固相又はゲル様担体を表す。このようなアレイ（「遺伝子チップ」、「タンパク質チップ」、抗体アレイなどを含む。）は、当業者に一般的に公知であり、典型的には、ガラス顕微鏡スライド、ポリカチオン、ニトロセルロース又はビオチン被覆されたスライドなどの特殊コートされたガラススライド、カバーガラス及び、例えば、ニトロセルロース又はナイロンを基礎とする膜などの膜の上に作製される。
【０１１１】
アレイは、結合されたリガンド又は少なくとも１つの各リガンドを発現する少なくとも２つのセルを含み得る。
【０１１２】
本発明のアレイとして「懸濁アレイ」を使用することも想定される（Ｎｏｌａｎ ＪＰ， Ｓｋｌａｒ ＬＡ．（２００２）．Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ａｒｒａｙ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｆｌａｔ−ａｒｒａｙ ｐａｒａｄｉｇｍ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．ｖｏｌ．２０（１），ｐ．９−１２）。このような懸濁アレイでは、担体、例えば、マイクロビーズ又は小球体が懸濁状態で存在する。アレイは、異なるリガンドを担持する異なるマイクロビーズ又は小球体（標識されることが可能）からなる。
【０１１３】
本発明は、さらに、他のリガンドに加えて、少なくとも１つのリガンドが担体材料に結合されている、上述のアレイを作製する方法に関する。
【０１１４】
例えば、固相化学及び光易分解性保護基に基づいて、このようなアレイを作製する方法が一般的に公知である（ＵＳ５，７４４，３０５）。このようなアレイは、物質又は物質ライブラリーと接触させ、相互作用、例えば、結合又は立体構造の変化に関して検査することも可能である。従って、本発明のポリペプチドマーカーを含むアレイは、前記ペプチド又はポリペプチドに特異的に結合しているリガンドを同定するために使用され得る。
【０１１５】
ポリペプチドの配列を決定するために、達成可能な最高レベルまでポリペプチドを精製すべきである。しかしながら、ポリペプチドは、完全に単離される必要はない。例えば、ポリアクリルアミドゲル中でのクマシー染色されたバンドとして検出可能なポリペプチドを有することが十分である。次いで、対応するゲル片を切り出し、次の同定段階のために使用することができる。ポリペプチドの精製後、ポリペプチドをトリプシンで酵素的に消化し、適切な何れかの方法、例えば、質量分析法を用いて、生じた断片の分子量を決定することが可能である。質量分析法を用いると、各ポリペプチドは、断片の特徴的な「フィンガープリント」を示し、データベース検索によるその同定が可能となる。同定されるべきポリペプチドがデータベース中に存在しない場合に、又は、何らかの理由で、研究者がより詳細な性質決定を有することを望むのであれば、ポリペプチド断片は、本分野で公知の方法に従って配列決定することも可能である。
【０１１６】
ＣＥ−ＭＳによって、ポリペプチド配列を特に容易に決定することができる。各マーカーに対するキャピラリー電気泳動溶出時間は、表中に列記されている。従って、比較的高い純度でポリペプチドを含有する画分を集めることが可能である。単一の画分が十分な材料を含有しない場合には、２以上の実験の画分をプールし得る。
【０１１７】
ポリペプチドマーカーの幾つかの配列が、配列番号１から５として列記されている。ＣＥ−ＭＳによって測定されたそれらの質量及びそれらの各配列は以下のとおりである。
【０１１８】
【表１】
【０１１９】
以下の実施例によって、本発明をさらに説明する。
【実施例１】
【０１２０】
参加者：
地域倫理委員会の承認を得た後、全ての参加者からインフォームドコンセントを得た。本発明者らは、ＣＥ−ＭＳを用いて、正常な尿タンパク質パターンを確立するために、正常な腎機能を有する５７人の健康な個体の群を調べた。さらに、本発明者らは、生検によって証明された微小変化型ネフローゼ症候群（ｎ＝１６；ＭＣＤ）、膜性糸球体腎炎（ｎ＝１８；ＭＧＮ）及び巣状分節性糸球体硬化症（ｎ＝１０；ＦＳＧＳ）を有する４４人の患者を調べた（表１）。
【０１２１】
ＣＥ−ＭＳ分析：
初尿を排出した後、朝に、参加者全員からスポット尿試料を集めた。他の文献に詳しく記載されているとおりに、試料を調製した（Ｗｉｔｔｋｅ Ｓ，Ｆｌｉｓｅｒ Ｄ，Ｈａｕｂｉｔｚ Ｍ，ｅｔ ａｌ：Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｕｒｉｎｅ ｗｉｔｈ ＣＥ−ＭＳ−ｓｕｉｔａｂｌｅ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ ｎｅｗ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｍａｒｋｅｒｓ．Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ａ １０１３：１７３−１８１，２００３）。ＣＥ−ＭＳ分析は、ＭａｒｉｎｅｒＴＯＦ質量分析装置（ＡＢＩ）に連結されたＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＰＡＣ／Ｅシステムを用いて、以前に記載されているとおりに確立した（Ｋａｉｓｅｒ Ｔ， Ｈｅｒｍａｎｎ Ａ， Ｋｉｅｌｓｔｅｉｎ ＪＴ， ｅｔ ａｌ：Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｃｏｕｐｌｅｄ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｉｎ ｄｉａｌｙｓｉｓ ｆｌｕｉｄｓ．Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ａ １０１３：１５７−１７１， ２００３）。ＣＥキャピラリーは、Ｂｅｃｋｍａｎから取得し、ＩＤ／ＯＤ７５／３６０μｍ及び長さ９０ｃｍであった。用いた移動相は、水中の、３０％メタノール及び０．５％ギ酸を含有した。シース流に対して同じ液体を使用し、シース流は２μＬ／分で付与された。１ｐｓｉの圧力で、２０秒間、試料の注射を行った。これらの条件下で、試料約１００ｎＬを注入することができた。試料のスタッキングのために、以下のプロトコールを適用した。１ＭＮＨ３を７秒間注入、試料の注入、２Ｍギ酸を５秒間注入。その後のＣＥ−ＭＳの走行は、以下の圧力の系列を用いて、＋３０ｋＶで実施した。０ｐｓｉで４０分、０．１ｐｓｉで２分、０．２ｐｓｉで２分、０．３ｐｓｉで２分、０．４ｐｓｉで２分、０．５ｐｓｉで８０分。ＩｇＡ腎症の診断のために、以下の圧力系列を使用した。０．３ｐｓｉで４０分、０．４ｐｓｉで２分、０．６ｐｓｉで２分、０．８ｐｓｉで２分、１ｐｓｉで８０分。各走行後、０．１ＭＮａＯＨで５分間、ＣＥキャピラリーを濯いだ後、水で５分、走行緩衝液で５分濯いだ。
【０１２２】
統計解析：
健康な被験者と腎疾患を有する患者の異なる群とを識別するために、本発明者らは、ランダム・フォレストの方法及び対応するＳ−Ｐｌｕｓプログラムバージョン６／２００２ Ｂｒｅｉｍａｎ Ｌ：Ｒａｎｄｏｍ Ｆｏｒｅｓｔｓ（ｈｔｔｐ：／／ｏｚ．ｂｅｒｋｅｌｅｙ．ｅｄｕ／ｕｓｅｒｓ／ｂｒｅｉｍａｎ／ｒａｎｄｏｍｆｏｒｅｓｔ２００１．ｐｄｆ）を使用した。この操作において、固定されたサイズの一連のＰＰサブセットが、全ての候補ＰＰから無作為に選択される。各サブセットに関して、分類及び回帰ツリー（ＣＡＲＴ；Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｒｅｅ）解析に記載されている分類ツリーを生成し（Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ Ｄ， Ｃｏｌｌａ Ｐ：ＣＡＲＴ−Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ｔｒｅｅｓ． Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ， Ｓａｌｆｏｒｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ １９９７）、分類規則を得る。フォレスト予測は、一連の分類規則のクラス票（ｃｌａｓｓ ｖｏｔｅ）の重み付けされていない複数である。サブセット選択が多数であるために、過剰フィッティングは生じない。「アウト・オブ・バッグ」（ｏｏｂ）推定法のために、推定される一般化誤差は不偏である。各ツリーは、学習標本の事例のブートストラップ標本に対して成長させ、ブートストラップ標本中で選択されなかった事例に基づいて、検証を推定する。
【０１２３】
さらに、サポートベクターマシンを用いて、群間の識別も実施した。このツールは、高次元のパラメータ空間においてデータを識別するという利点を有する。その高速で、安定なアルゴリズムは、臨床マーカー（Ｄｉｅｔｅｒｌｅ Ｆ，Ｍｕｌｌｅｒ−Ｈａｇｅｄｏｒｎ Ｓ，Ｌｉｅｂｉｃｈ ＨＭ，Ｇａｕｇｌｉｔｚ Ｇ：Ｕｒｉｎａｒｙ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ａｓ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｔｕｍｏｒ ｍａｒｋｅｒｓ ｅｖａｌｕａｔｅｄ ｂｙ ｌｅａｒｎｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒ ｑｕａｎｔｉｚａｔｉｏｎ．Ａｒｔｉｆ Ｉｎｔｅｌｌ Ｍｅｄ ２８：２６５−２７９，２００３）及びＤＮＡアレイのような生物学的分析の異なる領域（Ｂｒｏｗｎ ＭＰ， Ｇｒｕｎｄｙ ＷＮ， Ｌｉｎ Ｄ， ｅｔ ａｌ：Ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ−ｂａｓｅｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄａｔａ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｓｕｐｐｏｒｔ ｖｅｃｔｏｒ ｍａｃｈｉｎｅｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｄ ＵＳＡ ９７：２６２−２６７，２０００）において優れた性能を示した。
【０１２４】
ＣＥ−ＭＳを用いて分析された正常な尿ポリペプチドパターン：
典型的な試料のグラフによる図示（等高線プロット）が、図１に示されている（生データ）。一個体の試料において、８００から最大３０，０００ダルトンの分子量を有する９００と２５００の間のＰＰが検出された。より高い分子量を有するＣＥポリペプチドに対して使用された条件下で、沈殿する傾向がある。従って、一般に、より大きなタンパク質を検出することができないが、幾つか（例えば、アルブミン）を可視化することができる。試料の比較可能性を確保するための内部標準として選択された高い確率で存在するポリペプチドのリストが、表２３に示されている。ＩｇＡ腎症と疑われる患者から得られた試料など、タンパク質が豊富な試料の分析に関しては、より高い圧力をかけ、表２４に記載のポリペプチドが内部標準として好ましかった。同じ試料の反復分析は、各試料に対するＣＥ−ＭＳ走行の同一条件下で、有意差は全く見られなかった。
【０１２５】
１つの例に対するその後の電気データ操作は、図１に要約されている。各走行は、図１の上部に図示されている粗スペクトルをもたらし、３秒ごとに得られた単一スペクトルから構成される（図１拡大）。第一のデータ解析の実行において、ＣＥ−ＭＳピークが同定された（図１Ａ）。次に、同位体の分布と連結されたピークの両方を用いて、各ピークの電荷を確認した（図１Ｂ）。その結果、図１Ｃに示されているように、連結されたピークが単一のピークにまとめられ、真の質量が計算された。最初、既知の質量の外部標準を用いて、試料をスパイクした。これによって、その後、尿試料中に高い確率で存在するＰＰの内部標準を定義することが可能となった。従って、ＣＥ時間は、内部標準に対して標準化することができた。平均の尿試料に対してこの技術を適用することによって、質量及びＣｅ−泳動時間という２つのパラメータによって、概ね１０００ＰＰを検出し、及び記載／同定することができる。
【０１２６】
健康な被験者から得られた尿の検査によって、各個体に対して、検出されたＰＰの実際の質量とＣＥ時間によって定義されるピークの確立（いわゆるピークリスト）及び等高線プロットがもたらされた。各ピークリストをＭＳ−Ａｃｃｅｓｓデータベース中に蓄積し、ＰＰの各々が単一の試料中に出現する確率を計算した。調べた対照試料の９０％超に、１７３のＰＰが存在した。さらに、試料の７５％超に１５６のＰＰが存在したのに対して、健康な個体から得た試料の５０％超に、さらなる３６１のＰＰが見出された。健康な被験者から得られた全ての試料の５０％超に、これらの６９０ＰＰが見出され、「正常なＰＰパターン」を確立するために使用した。
【０１２７】
腎疾患を有する患者から得られた尿をＣＥ−ＭＳで分析した。
【０１２８】
４４人の患者の各走行から得られたデータを、３つの疾病群の下位群に分けて、分析した。続いて、典型的なＰＰパターンに相当するこれらのデータベースから得られた値を比較した。各患者群から得られた尿試料中に存在するタンパク質パターンの著しい相同性が群内に見出された。ＭＣＤ、ＦＳＧＳ及びＭＧＮを有する患者から得られた尿ＰＰパターンの典型例が、図２に示されている。各疾病は、典型的なタンパク質等高線プロットを呈し、５００を超えるＰＰが出現する。続いて、３つの群から得られたデータを、健康な被験者において得られたデータと比較した。表１６は、健康な被験者の９５％超の尿内に見出された１２４のＰＰを示しており、ＭＣＤ、ＦＳＧＳ及びＭＧＮを有する患者に対する差を明らかにしている。
【０１２９】
ＣＥ−ＭＳデータを用いた健康な個体と腎疾患を有する患者の識別のための統計解析を適用した。何れかの疾病群中に５０％超の確率で存在する８００ＰＰのリストを、ランダム・フォレスト解析のために選択した。健康な被験者と腎疾患患者間の識別に対する正確な分類率は、以下のリストに示されているように、９６．５％であった。
【０１３０】
【表２】
【０１３１】
交叉検証後、８１．３％の感受性と９４．３％の特異性を得ることができた。学習標本中において、疾病群の識別が達成された。しかしながら、おそらくはＦＳＧＳ患者が少数であるために、交叉検証を適用したときに、これらはＭＣＤから識別することができなかった。従って、ＦＳＧＳとＭＣＤを１つの群へ組み合わせた。健康な被験者、ＭＣＤ／ＦＳＧＳ及びＭＧＮ間の識別のために、５つの末端節を有する分類ツリーを構築するために、ＣＡＲＴによって、リストから４つのＰＰが選択された（表１５）。学習標本中の正しい分類率は９４．１％であった。交叉検証後、これは、８４．３％に低下した（健康な対照に関しては９３．８％、ＭＣＤ／ＦＳＧＳに関しては７１．４％、ＭＧＮに関しては９２．９％）。
【０１３２】
あるいは、同じデータに対してサポートベクターマシンを用いて、統計解析を行った。表１６は、この解析で使用されたＰＰを示している。これらのＰＰを用いると、完全な交叉検証後での正しい分類は９８．０％であった。表１７は、ＭＣＤとＭＧＮ間での識別のために使用したＰＰを示している。ここでは、完全な交叉検証後での正しい分類は９４．１％であった。さらに、それぞれ、９２．３％及び８９．３％の（交叉検証された）分類率でＭＣＤ及びＦＳＧＳを有する患者とＭＧＮ及びＦＳＧＳを有する患者とを分けることが可能であった（表１８及び１９）。これらの結果は、患者の限られた数を分類するために、サポートベクターマシンを用いた最初のアプローチとして価値を有し得る。患者のデータが増加するにつれて、分類は、さらに向上し、より安定的なものとなる。本結果は、安定な分類のために、適用可能な変数（ポリペプチド）の数は症例（患者）の数に依存し、従って、患者の増加によって、分類のためにさらなるＰＰを使用できることも示している。
【０１３３】
【表３】
【０１３４】
【表４】
【０１３５】
【表５】
【０１３６】
【表６】
【０１３７】
【表７】
【０１３８】
【表８】
【０１３９】
【表９】
【０１４０】
【表１０】
【０１４１】
【表１１】
【０１４２】
【表１２】
【０１４３】
【表１３】
【０１４４】
【表１４】
【０１４５】
【表１５】
【０１４６】
【表１６】
【０１４７】
【表１７】
【０１４８】
【表１８】
【０１４９】
【表１９】
【０１５０】
【表２０】
【０１５１】
【表２１】
【０１５２】
【表２２】
【０１５３】
【表２３】
【０１５４】
【表２４】
【０１５５】
【表２５】
【０１５６】
【表２６】
【０１５７】
【表２７】
【図面の簡単な説明】
【０１５８】
【図１】三次元等高線プロット（左側）としての未精製ＣＥ−ＭＳ分析（Ａ）から得られた情報の図示。ここでは、健康なボランティアから得られた尿の等高線プロットが示されている。分で表した保持時間（Ｘ軸）に対するＹ軸上の電荷当り質量、シグナル強度が色でコードされている。次に、シグナル／ノイズを計算し、ノイズを除去して、実際のシグナルのみ（Ｂ）を残す。ソフトウェアは、同位体分布及び連結された質量の両者に基づいて、実際の質量（Ｃ）を計算する。これによって、それらの質量と保持時間によって規定された最大１５００のポリペプチドの表が得られる。例として、右下は試料中に見出された１７のポリペプチドを示す。ＣＥ−ｔ、ＣＥ時間（泳動時間）；ｉｎｔ．強度；ｍ．ｐ．ｃ．、電荷当り質量、ｃａｌ．ｍ．計算された質量。
【図２】健康な被験者（ＮＣ）並びに巣状分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）、微小変化型ネフローゼ症候群（ＭＣＤ）及び膜性糸球体腎炎（ＭＧＮ）を有する患者に対するポリペプチドの等高線プロット（実際の質量）が示されている。各プロットに対する質量上限（すなわち、Ｘ軸に沿った最大値）が、各プロットの左上部に示されている。明らかなように、等高線プロットは、健康な被験者と腎疾患群の間で著しく異なる。
【図３】腎疾患の診断及び鑑別診断のためのフローシート（例）。Ｓａｍｐ．、試料；ＭＳ−ｄａｔ、ＭＳデータ；Ｄｉｓｅａ．、疾病；Ｙ、はい；Ｎ、いいえ；ｎ．ｄ．、病気でない；ｄ．ｎ．、糖尿病性腎症、ＦＳＧＳ、ＦＳＧＳ；ＭＧＮ、ＭＧＮ；ＭＣＤ、ＭＣＤ；ＩｇＡ、ＩｇＡ腎症、ｄｉｆｆ、鑑別診断。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腎疾患の診断、特に、鑑別診断に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、腎疾患を発症する患者の数が増加し続けている。このため、腎疾患は、医療制度において、ますます深刻な問題となっている。多くの腎疾患は不可逆的であり、従って、腎疾患の初期診断及び／又は鑑別診断が重要である。それぞれの疾患に対して正確に調整された初期診断及び治療法は、透析を必要とする患者の数を減少させることが可能であり、患者の高い心血管リスクも低減させることができる。
【０００３】
現在、正確な診断及び／又は鑑別診断は、主として、腎生検に依存している。生検は、腎臓の診断における現行の「黄金標準」としての役割を果たしているが、生検は、侵襲的であるという欠点を有しており、従って、特定の患者に対してのみ実施される。
【０００４】
尿分析は、腎疾患を診断するための別のアプローチである。しかしながら、現在、一般的には、尿の数個のパラメータ、例えば、クレアチニン、尿素、アルブミン、血液細胞（白血球及び赤血球など）、細菌、糖、ウロビリノーゲン、ビリルビン及びｐＨ値のみが測定されている。特に、鑑別診断に対して十分な感受性及び／又は選択性を欠くので、これらの分析の診断的価値は限定的なものである。
【０００５】
尿中に含有されるタンパク質を分析するために、幾つかの試みが行われてきた。
【０００６】
Ｖ．Ｔｈｏｎｇｂｏｏｎｋｅｒｄらは、正常なヒト尿タンパク質を調べるために、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析法と組み合わせた二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（２Ｄ−ＰＡＧＥ）後に質量フィンガープリンティングを使用した。４７の特有のタンパク質の計６７個のタンパク質形態が同定された（Ｖ．Ｔｈｏｎｇｂｏｏｎｋｅｒｄ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｎｏｒｍａｌ ｈｕｍａｎ ｕｒｉｎａｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｂｙ ａｃｅｔｏｎｅ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ｏｒ ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ． Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，ｖｏｌ．６２，ｐ．１４６１−１４６９）。
【０００７】
Ｃ．Ｓ．Ｓｐｈａｒらは、尿試料中に含有されているタンパク質をトリプシンで消化し、液体クロマトグラフィータンデム型質量分析を用いて、１２４のタンパク質から得られた７５１のペプチドを同定した（Ｃ．Ｓ．Ｓｐａｈｒ ｅｔ ａｌ．（２００１）．Ｔｏｗａｒｄｓ ｄｅｆｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｕｒｉｎａｒｙ ｐｒｏｔｅｏｍｅ ｕｓｉｎｇ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−ｔａｎｄｅｍ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．Ｉ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ａｎ ｕｎｆｒａｃｔｉｏｎａｔｅｄ ｔｒｙｐｔｉｃ ｄｉｇｅｓｔ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ｖｏｌ．１，ｐ．９３−１０７）。
【０００８】
これらの研究は、健康な個体に関するものに過ぎない。これらの研究は、腎疾患の診断又は鑑別診断のために尿ポリペプチドの存在の変化を使用することができるかどうかという問題を取り扱っていない。
【０００９】
膜性糸球体腎炎（ＭＧＮ）の診断ために、尿中のポリペプチドの存在又は不存在を使用することが提案されてきた（ｖｏｎ Ｎｅｕｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．（２００４）．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ａ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ Ｓｕｒｆａｃｅ−Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｌａｓｅｒ Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ／Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ， ｖｏｌ．１８：１４９−１５６）。しかしながら、本研究では、僅か８人の患者の試料が使用され、異なる分析法の比較を主眼としたものであった。マーカーの実際の診断的価値は、不明確なままである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
その結果、腎疾患の診断、特に鑑別診断のための迅速且つ簡易な方法及び手段に対する要望が存在する。
【００１１】
従って、本発明の目的は、腎疾患の診断、特に、腎疾患の鑑別診断のための方法及び手段を提供することである。最も一般的な糸球体症であるＩｇＡ腎症の診断及び／又は鑑別診断のための方法及び手段を提供することが、本発明の具体的な目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の第一の態様によれば、腎疾患の診断、好ましくは鑑別診断のための尿試料中の少なくとも１つのポリペプチドマーカーの存在の使用であり、前記ポリペプチドマーカーが、表１から２２に示されているポリペプチドマーカーの群から選択される前記使用によって、問題が解決される。
【００１３】
本発明において、表１から２２に示されているポリペプチドマーカーの助けを借りて、それぞれ、異なる腎疾患を確実に診断又は鑑別診断することが可能であることが見出された。
【００１４】
本発明は、従来技術と比べて、多数の利点を有する。第一に、本発明のポリペプチドマーカーの存在は、尿試料中で測定することが可能である。従って、生検を採取する必要が存在しない。従って、本発明は、腎疾患の簡易化された迅速な診断を可能とし、腎疾患の存在に関して患者を定期的にスクリーニングすること及び初期段階で腎疾患を診断することが可能となる。さらに、本発明のポリペプチドマーカーは、異なる腎疾患間の鑑別診断のために使用することができる。本発明に従って同定されたマーカーの多数は、マーカーの単一又は少数のみの使用に比べて、診断の特異性と感受性の両者を増大させる。また、本発明は、抗体又はアプタマーなどの特異的なリガンドを使用せずに、前記ポリペプチドマーカーを測定することができる方法を提供する。
【００１５】
表中に示されているポリペプチドマーカーは、以下でさらに記載されている、キャピラリー電気泳動−質量分析法（ＣＥ−ＭＳ）と名付けられた方法によって同定されている。さらに、本方法は、ｖｏｎ Ｎｅｕｈｏｆｆら（２００４）（Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ａ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ Ｓｕｒｆａｃｅ−Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｌａｓｅｒ Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ／Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ， ｖｏｌ．１８：１４９−１５６）中に詳しく記載されている。ポリペプチドマーカーを定義するパラメータから開始して、本分野で公知の方法によって、対応するポリペプチドの配列を特定し、次いで、例えば、適切な細胞中の対応する遺伝子のタンパク質合成又は発現の助けを借りて、対応するポリペプチドを合成又は作製することが可能である。
【００１６】
マーカーは、それらの質量及びキャピラリー電気泳動（ＣＥ）中でのそれらの泳動時間、特に、実施例１に従って得られた質量及びそれらの泳動時間によって定義される。ＣＥ泳動時間は、典型的には５分の範囲で、より典型的には３分の範囲で変動し得ることが知られている。しかしながら、溶出されているマーカーの配列は、典型的には、適用される各ＣＥシステムと同一である又は極めて似ている。このシステムは、ほぼ全ての尿試料中に存在するポリペプチドの使用によって、例えば、表２３又は２４に挙げられているポリペプチドによって較正することができる。さらに、配列番号１から配列番号５に示されているポリペプチドは、較正のための役割を果たすことができる。
【００１７】
測定間又は異なる質量分析装置間での質量の変動は比較的小さく、典型的にはプラス又はマイナス０．０５％の範囲である。
【００１８】
表１には、健康な個体及び腎疾患、特に、糸球体腎炎若しくは糸球体症に罹患している個体間での識別のために好ましいポリペプチドマーカーが列記されている。
【００１９】
表２には、ＦＳＧＳと健康な状態間での識別のために好ましいポリペプチドマーカーが列記されている。
【００２０】
表３には、ＦＳＧＳとＭＣＤ間での鑑別診断のために使用することが可能なポリペプチドマーカーが列記されている。
【００２１】
表４には、ＦＳＧＳとＭＧＮの鑑別診断のために好ましいポリペプチドマーカーが列記されている。
【００２２】
表５には、一方でＦＳＧＳ及び他方でＭＣＤ又はＭＧＮ間での鑑別診断のために好ましいポリペプチドマーカーが列記されている。
【００２３】
表６には、健康な状態と比べて、ＭＣＤの診断のために好ましいポリペプチドマーカーが列記されている。
【００２４】
表７には、ＭＣＤとＭＧＮ間の鑑別診断のために好ましいポリペプチドマーカーが列記されている。
【００２５】
表８には、一方でＭＣＤ及び他方でＦＳＧＳ又はＭＧＮ間での鑑別診断のために好ましいポリペプチドマーカーが列記されている。
【００２６】
表９には、健康な状態と比べて、ＭＧＮの診断のために好ましいポリペプチドマーカーが列記されている。
【００２７】
表１０には、一方でＭＧＮ及び他方でＦＳＧＳ又はＭＣＤ間での鑑別診断のために好ましいポリペプチドマーカーが列記されている。
【００２８】
表１１には、健康な状態と比較して、一方でＩｇＡ腎症又はＭＧＮを診断するために好ましいポリペプチドマーカーが列記されている。
【００２９】
表１２には、健康な状態と比べて、ＩｇＡ腎症を診断するのに好ましいポリペプチドマーカーが列記されている。
【００３０】
表１３には、ＩｇＡ腎症とＭＧＮ間の鑑別診断に好ましいポリペプチドマーカーが列記されている。
【００３１】
表１４には、健康な者、ＦＳＧＳ、ＭＣＤ及びＭＧＮ患者におけるそれぞれの頻度とともに、ポリペプチドが列記されている。
【００３２】
表１５には、実施例１に従い、サポートベクターマシンを用いて、健康な個体と腎疾患患者間での鑑別診断のために使用されたポリペプチドが列記されている。
【００３３】
表１６には、実施例１に従い、ランダム・フォレスト解析（ｒａｎｄｏｍ ｆｏｒｅｓｔ ａｎａｌｙｓｉｓ）を用いて、健康な者、ＦＳＧＳ、ＭＣＤ及びＭＧＮ患者間での鑑別診断のために使用されたポリペプチドが列記されている。
【００３４】
表１７には、実施例１に従い、サポートベクターマシンを用いて、ＭＣＤとＭＧＮ患者間での鑑別診断のために使用されたポリペプチドが列記されている。
【００３５】
表１８には、実施例１に従い、サポートベクターマシンを用いて、ＭＣＤとＦＳＧＳ患者間での鑑別診断のために使用されたポリペプチドが列記されている。
【００３６】
表１９には、実施例１に従い、サポートベクターマシンを用いて、ＭＧＮとＦＳＧＳ患者間での鑑別診断のために使用されたポリペプチドが列記されている。
【００３７】
表２０と２１には、上に引用されているｖｏｎ Ｎｅｕｈｏｆｆら（２００４）において同定されたポリペプチドが列記されている。
【００３８】
表２２には、糖尿病及び／又は糖尿病性腎症の診断のために使用することが可能なポリペプチドが列記されている。
【００３９】
表２３には、ＣＥ時間を標準化するための内部標準として好ましいポリペプチドが列記されている。
【００４０】
表２４には、実施例１に記載の圧力法（０．３から１ｐｓｉ）が使用された場合に、ＣＥ時間を標準化するための内部標準として好ましいポリペプチドが列記されている。これらの標準は、例えば、ＩｇＡ腎症の診断における内部標準として好ましい。
【００４１】
表２５には、ポリペプチドマーカーの特定のために、実施例１に従って、その試料が使用された腎疾患患者の臨床データが列記されている。略号：ＣｓＡ、シクロスポリンＡ；ＰＳ、プレドニゾロン；＋頻繁な再発；−現時点で免疫抑制なし；＊ＭＣＤ又はＦＳＧＳかどうか臨床的に不明。
【００４２】
本発明に従って使用されるポリペプチドマーカーは尿試料中において同定することが可能であり、それらの存在は尿試料中で測定することができる。尿試料は、従来の技術において公知であるように採取することができる。好ましくは、本発明において、中間尿が使用される。
【００４３】
本発明に従って使用されるポリペプチドマーカーは、タンパク質、ペプチド及び断片又はタンパク質若しくはペプチドの他の分解産物などの遺伝子発現産物であり得る。本発明に従って使用されるポリペプチドマーカーは、翻訳後修飾によって、例えば、グリコシル化、リン酸化、アルキル化又はジスルフィド結合によって修飾され得る。断片及び分解産物は、これらが得られたタンパク質又はペプチドとは異なる診断的価値及び／又は生理的役割を有し得ることが知られている。例えば、異なる疾病において、異なるタンパク分解分解産物又は断片を見出すことができる。尿中に含有されるポリペプチドマーカーを化学的に修飾し、化学的に修飾されたこれらのポリペプチドマーカーを測定するために尿試料が前処理されていても、本発明の範囲に属するものと考えられる。本発明のポリペプチドマーカーは、４００と２００００Ｄａの間、具体的には、７００と１４０００Ｄａの間、さらに具体的には８００と１１０００Ｄａの間の分子量を有する。
【００４４】
本発明の好ましいポリペプチドマーカーは、表１から２２に、具体的には表１から２１に、より具体的には表１から１３に列記されている。内部標準として使用するための好ましいポリペプチドは、表２３から２４に列記されている。表１に列記されているが、表１４及び／又は表１５及び／又は表１６及び／又は表１７及び／又は表１８及び／又は１９及び／又は２０及び／又は２１及び／又は２２に列記されていないポリペプチドマーカーも好ましい。表２に列記されているが、表１４及び／又は表１５及び／又は表１６及び／又は表１８に列記されていないポリペプチドマーカーも好ましい。表３に列記されているが、表１４及び／又は表１６及び／又は表１８に列記されていないポリペプチドマーカーも好ましい。表４に列記されているが、表１４及び／又は表１６及び／又は表１９に列記されていないポリペプチドマーカーも好ましい。表５に列記されているが、表１４及び／又は表１６及び／又は表１８及び／又は表１９に列記されていないポリペプチドマーカーも好ましい。表６に列記されているが、表１４及び／又は表１６に列記されていないポリペプチドマーカーも好ましい。表７に列記されているが、表１４及び／又は表１６及び／又は表１７に列記されていないポリペプチドマーカーも好ましい。表８に列記されているが、表１４及び／又は表１６に列記されていないポリペプチドマーカーも好ましい。表９に列記されているが、表１４及び／又は表１６及び／又は表２０及び／又は表２１に列記されていないポリペプチドマーカーも好ましい。表１０に列記されているが、表１４及び／又は表１６に列記されていないポリペプチドマーカーも好ましい。表１１に列記されているが、表１４及び／又は表１６に列記されていないポリペプチドマーカーも好ましい。
【００４５】
本発明の腎疾患は、当業者に公知の腎疾患又は腎機能障害のあらゆる種類、例えば、ＩｇＡ腎症、ＭＧＮ（膜性糸球体腎炎）、ＭＣＤ（微小変化型ネフローゼ症候群）、ＦＳＧＳ（巣状分節性糸球体硬化症）又は糖尿病性腎症に関する。特に、腎疾患は、ＩｇＡ腎症、ＭＧＮ、ＭＣＤ又はＦＳＧＳなどの糸球体症に関する。さらに具体的には、腎疾患は、ＩｇＡ腎症、ＭＣＤ又はＦＳＧＳに関する。最も具体的には、腎疾患は、ＩｇＡ腎症に関する。
【００４６】
糸球体症は、腎疾患の亜群である。糸球体症は、異なる病因の複数の疾患を含む。糸球体症は、マルピーギ小体、糸球体及びボーマン嚢の病理形態学的な変化によって特徴付けられる。これらの変化の結果、さらなる病理形態学的な変化が、ネフロン及び間隙の他の部分に出現し得る。
【００４７】
ＩｇＡ腎症は、ベルジェ腎炎としても知られている。ＩｇＡ腎症は、最も一般的な糸球体症である。ＩｇＡ腎症は、ＩｇＡの増加した血漿濃度を伴う、シェーライン・ヘノッホ紫斑病（アナフィラキシー様紫斑病としても知られている。）の腎臓に限定される特定の形態であり得る。組織病理学的には、糸球体病変及び糸球体間質中のＩｇＡの堆積の全ての形態が含まれる。臨床的には、ＩｇＡ腎症は、微小及び巨大血尿症（ｍｉｃｒｏ− ａｎｄ ｍａｃｒｏ−ｈｅｍａｔｏｕｒｉａ）として現れる。ＡＣＥ阻害剤及びω−３脂肪酸を用いた治療法を試み得る。疾病の進行は、数年にわたって起こり、進行性腎不全への移行を含む。
【００４８】
ＭＧＮは、基底膜の肥厚及び顆粒状の上皮下ＩｇＧ堆積によって特徴付けられる。ＭＧＮは、４０歳と５０歳の間に、しばしば顕在化する。ＭＧＮは、しばしば、医薬、例えば、金、Ｄ−ペニシラミン又はＡＣＥ阻害剤によって引き起こされる。ＭＧＮの治療は、グルココルチコイド又はシクロホスファミドを用いて試みることができる。ＭＧＮは、ネフローゼ症候群であり、進行性腎不全への移行には、数年を要し得る。
【００４９】
ＭＣＤは、リポイドネフローゼとしても知られている。ＭＣＤは、小児におけるネフローゼ症候群の最も一般的な原因である。本疾病の発症原因は不明である。組織学的には、変化が認められず、又は極めて離散した変化のみを認めることができる。ＭＧＮの治療には、グルココルチコイド、シクロスポリンＡ又はシクロホスファミドを用いた治療が含まれ得る。小児では症例の９０％で、成人では症例の５０％で、疾病は自然に治癒する。ＦＳＧＳへの移行が可能である。
【００５０】
ＦＳＧＳは、ＩｇＭ腎症としても知られている。ＦＳＧＳは、典型的には、糸球体間質中へのＩｇＭ及びＣ３の堆積によって特徴付けられる。臨床的には、ＦＳＧＳは、ネフローゼ症候群として顕在化する。ＦＳＧＳの治療法には、グルココルチコイド、シクロスポリンＡ又はシクロホスファミドを用いた治療が含まれ得る。予後は不良であり、進行性腎不全への移行を含む。
【００５１】
糖尿病性腎症は、糖尿病性糸球体硬化症としても知られている。糖尿病性腎症は、透析治療が必要となる最も一般的な原因である。
【００５２】
要約すると、腎疾患には、極めて類似する組織学を示し得る様々な疾患が含まれることが明らかである。しかしながら、各疾病に対する病因、治療及び予後は、極めて異なり得る。例えばＩｇＡ腎症は、上記されている何れかの他の糸球体症とは異なる治療を必要とする。すなわち、ＩｇＡ腎症では、ＡＣＥ阻害剤を用いた治療を試み得るが、これは、ＭＧＮの場合には推奨されない。従って、迅速且つ信頼できる診断が、治療のために極めて重要である。
【００５３】
本発明において、診断する又は診断とは、各患者に関して、それぞれの疾病を有する確率が決定されることを意味する。
【００５４】
予備的診断、特に異なる方法によって確立された予備的診断を確認することも、診断に含まれ得る。
【００５５】
さらに、好ましい実施形態において、本発明の診断は、特に「鑑別診断」に関する。「鑑別診断」という用語は、２つの異なる疾病を区別すること、すなわち、個別の患者に対して、ある第二の疾病を有する確率と比較して、ある第一の疾病を有する確率を決定することに関する。より具体的には、本発明の鑑別診断は、ＩｇＡ腎症、ＭＧＮ、ＭＣＤ、ＦＳＧＳ及び糖尿病性腎症からなる群から選択される少なくとも２つの腎疾患を区別することに関する。
【００５６】
別の実施形態において、本発明は、
ａ）尿試料中のポリペプチドマーカーの存在又は不存在を測定すること（前記ポリペプチドマーカーは表１から２２に示されているポリペプチドマーカーの群から選択される。）、及び
ｂ）疾病患者におけるこのマーカーの存在の確率を、対照患者におけるこのマーカーの存在の確率と比較すること
を含み、
ｃ１）疾病患者におけるこのマーカーの存在の確率が対照患者におけるこのマーカーの存在の確率より高ければ、このマーカーの存在が、対照症状よりむしろ疾病を有する確率がより高いことを示し、又は
ｃ２）疾病患者におけるこのマーカーの存在の確率が対照患者におけるこのマーカーの存在の確率より低ければ、このマーカーの不存在が、対照症状よりむしろ疾病を有する確率がより高いことを示す、
腎疾患の鑑別診断のための方法に関する。
【００５７】
好ましくは、工程ｂ）における各確率は、表中に示されているとおりである。
【００５８】
本発明における「測定する」という用語は、目的のポリペプチド又は他の物質の存在を決定することに関する。
【００５９】
ポリペプチドマーカーが存在し又は存在しないかどうかという決定は、適切な閾値の定義に依存し得る。閾値は、測定方法の感受性を通じて定義することが可能であり、又は随意に定義することが可能である。本発明における閾値は、実施例１に従って質量分析装置中に注入された試料において２５ｆｍｏｌ／μＬである。しかしながら、この閾値は、他の方法が使用された場合と同一であり得る。この閾値は、典型的な質量分析装置の検出閾値と一致する。この閾値は、５０から５０００ｐｍｏｌ／Ｌの尿試料中のポリペプチドマーカーの濃度に概ね対応する。異なる閾値が使用される場合（例えば、別の検出方法を用いる場合）、対応する確率は異なり得るが、当業者によって容易に確定することができる。
【００６０】
本発明において「疾病患者」は、腎疾患に罹患している。特に、疾患は、ＩｇＡ腎症、ＭＧＮ、ＭＣＤ、ＦＳＧＳ及び糖尿病性腎症からなる群から得られる少なくとも１つである。
【００６１】
「対照患者」は、健康であり又は疾病患者が罹患しているものとは異なる疾病に罹患し得る。すなわち、対照患者は、健康な状態を呈し又は１つの疾病若しくは疾病群を呈し得る。特に、発病される疾病は、ＩｇＡ腎症、ＭＧＮ、ＭＣＤ、ＦＳＧＳ及び糖尿病性腎症からなる群から得られる少なくとも１つである。
【００６２】
表１から１４、１６、２０、２１及び２２は、所定のポリペプチドが健康な対照患者又はある一定の疾病に罹患している対照患者の尿試料中に存在している確率（「頻度」とも表記される。）を列記している。識別因子は、所定の対照状態と比較した、疾病の存在確率間の差を示す。識別因子は、それぞれの確率から容易に計算することができる。識別因子が高いほど、所定のマーカーが疾病と対照状態とを区別する能力がより優れている。０．４０又はそれ以上の識別因子の絶対値が好ましい。
【００６３】
当業者は、例えば、さらなる患者データに基づいて、及び／又はポリペプチドマーカーの存在に関する異なる閾値に従って、当業者自身で、ポリペプチドマーカーに関する類似の表を確立し及び／又は表中に含有されるデータを精緻化することができる。
【００６４】
診断に関して、疾病患者におけるポリペプチドマーカーの存在の確率は、対照患者におけるこのマーカーの存在の確率と比較され、それぞれの確率は表中に示されているとおりである。疾病患者におけるこのマーカーの存在の確率が対照患者におけるこのマーカーの存在の確率より高ければ、試料中のこのマーカーの存在は、該試料が由来する患者が対照状態よりむしろ疾病を有する確率がより高いことを示す。疾病患者におけるこのマーカーの存在の確率が対照患者におけるこのマーカーの存在の確率より低ければ、試料中のこのマーカーの不存在は、該試料が由来する患者が対照状態よりむしろ疾病を有する確率がより高いことを示す。
【００６５】
例えば、あるマーカーがＩｇＡ腎症を呈する対照中に存在する確率は７３％であるが、健康な状態を呈する対照中に存在する確率は０％であり得る。このマーカーが試料中に存在すれば、個体は、健康な状態であることに比べて、ＩｇＡ腎症に罹患している７３％の確率を有すると診断される。このマーカーが試料中に存在しなければ、個体は、ＩｇＡ腎症に罹患している代わりに、健康である７３％の確率を有すると診断される。
【００６６】
このように、診断は、当業者が習熟する統計学的方法に従って確定することができる。
【００６７】
本発明は、ポリペプチドマーカーの唯一つを用いて又はポリペプチドマーカーの複数を用いて実施することが可能である。好ましくは、ポリペプチドマーカーの複数の存在が測定される。好ましくは、マーカーの少なくとも３つ、より好ましくは、マーカーの少なくとも１０個、さらに好ましくは少なくとも２０個、最も好ましくは本発明のポリペプチドマーカーの少なくとも５０個が測定される。
【００６８】
本発明の利点は、適切なマーカーの多数を提供することである。マーカーの複数を測定することは、診断の感受性と選択性の両方を増加させることができる。従って、他のマーカーと組み合わされれば、疾病と対照間で低い識別因子を示すマーカーも診断のために使用することができる。
【００６９】
ポリペプチドマーカーの複数が使用される場合、測定された各マーカーに対する存在についての情報を含有する「パターン」が生成される。次いで、このパターンは、疾病患者又は対照患者中でのポリペプチドマーカーの存在確率のパターンと比較することができる。各表は、ある種の疾病患者及び対照患者中で所定のポリペプチドマーカーを見出す確率のパターンを表している。
【００７０】
従って、好ましい実施形態において、本発明は、
ａ）尿試料中のポリペプチドマーカーの複数の存在又は不存在のパターンを確立すること（少なくとも１つのポリペプチドマーカーは表１から２２に示されているポリペプチドマーカーの群から選択される。）、及び
ｂ）疾病患者中でこのパターンを見出す確率を、対照患者中でこのパターンを見出す確率と比較すること
を含み、
ｃ１）疾病患者中で前記パターンを見出す確率が対照患者中で前記パターンを見出す確率より高ければ、このパターンを見出すことが、対照状態よりむしろ疾病を有する確率がより高いことの指標であり、又は
ｃ２）疾病患者中で前記パターンを見出す確率が対照患者中で前記パターン見出す確率より低ければ、このパターンを見出すことが、対照状態よりむしろ疾病を有する確率がより低いことの指標である、
腎疾患の鑑別診断のための方法に関する。
【００７１】
好ましくは、工程ｂ）に従う少なくとも１つのポリペプチドマーカーに対する各確率は、表中に示されているとおりである。
【００７２】
疾病又は対照患者中に該パターンを見出す確率と見出されたパターンを、比較することは、本分野で公知の統計学的方法に従って実施することが可能である。好ましくは、自動化された方法、例えば、ＣＡＲＴ分析、ランダム・フォレスト解析及びサポートベクターマシン（ＳＶＭ、例えば、Ｘｉｏｎｇ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（２００１）．Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ ｆｅａｔｕｒｅ ｗｒａｐｐｅｒｓ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｖｏｌ．１１，ｐ．１８７８−１８８７）が使用される。比較は、幾つかの異なるパターン及びこれらを見出す確率に対して同時に実行することも可能である。
【００７３】
従って、測定されるパターンは、典型的には、少なくとも２つの異なる状態においてパターンを見出す確率と比較される。この方法に従う腎疾患の診断及び鑑別診断の例は、図３に示されている。
【００７４】
必要であれば、尿試料は、ポリペプチドマーカーの測定前に前処理され得る。特に、脂質、核酸又はポリペプチドは、ろ過、遠心又はクロロホルムフェノール抽出などの抽出方法などの本分野で公知の方法に従って、試料から精製され得る。
【００７５】
ポリペプチドマーカーの存在を測定することは、本分野で公知の何れの方法によっても実施することが可能である。
【００７６】
好ましい方法には、レーザー脱離／イオン化質量分析法、表面増強レーザー脱離／イオン化飛行時間質量分析法（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ）及びＣＥ−ＭＳなどの気相イオン分光法が含まれる。これらの分光法によって、抗体又はアプタマーなどのリガンドに対する必要なしに、ポリペプチドマーカーを測定することが可能となる。
【００７７】
尿試料は、一般に高度に複雑である。すなわち、尿試料は、多数のポリペプチドを含有している。複雑度が高い場合には、分光学的分析は困難となる。試料の複雑度を低下させるために、試料中に含有されるポリペプチドは、何れかの適切な手段によって、例えば、電気泳動分離、親和性を基礎とする分離又はイオン交換クロマトグラフィーに基づく分離によって分離され得る。具体例には、ゲル電気泳動、二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（２Ｄ−ＰＡＧＥ）、キャピラリー電気泳動、金属アフィニティークロマトグラフィー、固定化された金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ；ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｍｅｔａｌ−ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）、レクチンに基づくアフィニティークロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）及び逆相ＨＰＬＣ、陽イオン交換クロマトグラフィー及び選択的に結合する表面（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦにおいて使用される表面など、下記参照）が含まれる。
【００７８】
２Ｄ−ＰＡＧＥは、ポリペプチドを分離するために一般的に使用されており、質量分析法（ＭＳ）と組み合わせて、各ポリペプチドの同定を行うことができる。２Ｄ−ＰＡＧＥを用いて、１０００を超えるタンパク質のスポットを識別することが可能である。しかしながら、それぞれの単一のスポットは、同定のために、ＭＳ／ＭＳによって別個に分析されなければならない。
【００７９】
現在、ＳＥＬＤＩ（表面強化されたレーザー脱離／イオン化）飛行時間質量分析法は、生物医科学の多くの分野に応用されている。
【００８０】
ＳＥＬＤＩシステムでは、ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐＡｒｒａｙが最も重要な成分である。ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐＡｒｒａｙは、表面上の列内に８又は１６のスポットを担持する狭い金属細片である。分析すべき試料は、直立の滴（ｓｔａｎｄｉｎｇ ｄｒｏｐ）として、又は「バイオプロセッサ」と称される試料保持器を支持単位として使用することによって最大５００μＬの容量で、スポットに直接適用される。試料は、温置及び洗浄工程の間にアレイ上に配置され、その後、再度除去される。アレイの異なる種類は、疎水性、親水性、陽イオン交換、陰イオン交換又は固定化された金属イオンアフィニティー表面を呈するクロマトグラフィーアレイ及びタンパク質の共有結合を可能とする化学基を有する予め活性化されたアレイという２つの主な系列に属する。好ましくは、陽イオン交換表面を有するチップが使用される。ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐＡｒｒａｙは試料を支持するのみならず、生物分子と特異的に相互作用するので、分析物の組成は使用されるアレイの種類及び適用される洗浄条件に依存する。これは、ＳＥＬＤＩ−プロセスを、伝統的なＭＡＬＤＩ（マトリックス支援レーザー脱離／イオン化）技術のさらなる発展と定義できる理由を説明する。ＳＥＬＤＩプロセスでは、チップ表面に実際に結合するポリペプチドに対してのみ測定が為される。
【００８１】
試料タンパク質の結合後、エネルギー吸収マトリックスが各スポットに適用される。マトリックスは迅速に結晶化し、分析は直ちに開始し得る。
【００８２】
ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ Ａｒｒａｙは、分析のためにＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐＲｅａｄｅｒ中に配置される。リーダーは、レーザービームの補助を得て、その中でタンパク質が脱離及びイオン化されるＴＯＦ（飛行時間）質量分析装置である。結晶化されたタンパク質はスポット表面上に等しく分配されるので、イオン化レーザービームは、常に、分析物中の分子の代表的な平均に該当し、定量的な計算が可能となる。イオン化後、検出器に到達する前に、飛行管を飛行させるために、電場によってタンパク質を加速する。アレイ表面に追突するレーザーと飛行管の末端で検出器に到達する分子との間の飛行時間によって、システムは試料中に存在するタンパク質種の質量を正確に決定することが可能となる（本方法に関するより詳細な情報に関しては、以下の総説：Ｍｅｒｃｈａｎｔ Ｍ ａｎｄ Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ ＳＲ （２０００）．Ｒｅｃｅｎｔ ａｄｖａｎｃｅｍｅｎｔｓ ｉｎ ｓｕｒｆａｃｅ−ｅｎｈａｎｃｅｄ ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ−ｔｉｍｅ ｏｆ ｆｌｉｇｈｔ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｖｏｌ．２１２，ｐ．１１６４−１１７７）を参照されたい。）。
【００８３】
しかしながら、最も好ましい方法は、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）が質量分析法（ＭＳ）に連結されているＣＥ−ＭＳである。ＣＥ−ＭＳは、他の文献中に詳しく記載されている（例えば、ドイツ特許出願ＤＥ １００ ２１ ７３７、及びＫａｉｓｅｒ， Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｃｏｕｐｌｅｄ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｉｎ ｄｉａｌｙｓｉｓ ｆｌｕｉｄｓ．Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ａ， ｖｏｌ．１０１３，ｐ．１５７−１７１（２００３）を参照されたい。）。
【００８４】
ＣＥは、当業者に公知である。簡潔に述べると、電気泳動キャピラリー上に試料を搭載し、最大５０ｋＶ、典型的には最大３０ｋＶの電圧が印加される。典型的なキャピラリーは、融合されたケイ素キャピラリー、すなわち、機械的な支持として、及び機械的な柔軟性を改善するために、外鞘、例えば熱可塑性材料から作られた鞘を含むガラスキャピラリーである。典型的には、キャピラリーには処理が施されない。すなわち、キャピラリーは、その内側の上に水酸基を示す。しかしながら、キャピラリーの内側を被覆してもよい。例えば、識別力を向上させるために、疎水性被覆を使用することが可能である。電圧の他に、典型的には０から１ｐｓｉの範囲の圧力をかけてもよい。圧力をかけることも可能であり、又は走行中に増加させることもできる。
【００８５】
識別力を向上させるために、試料を搭載する際に、重層プロトコールを適用することも可能である。すなわち、試料の搭載前に、塩基を搭載し、次いで、試料を搭載し、次いで、酸を搭載する。原理は、塩基と酸の間に分析物のイオンを捕捉することである。電圧が印加されると、正の電荷の分析物イオンは塩基の方向に移動する。そこで、分析物イオンは負に帯電し、酸に向けて逆方向に移動し、ここで、分析物イオンは正に帯電する。このスタッキングは、酸と塩基が中和されるまで、繰り返される。次いで、十分に濃縮された試料から分離が開始する。
【００８６】
その中でポリペプチドが可溶性である適切な緩衝液、例えば、リン酸緩衝液中に試料が含有される。ＣＥ−ＭＳカップリングに関しては、ＭＳの汚染を避けるために、揮発性溶媒を使用し、ほぼ無塩条件下で作業することが好ましい。例には、アセトニトリル、イソプロパノール、メタノールなどが含まれる。溶媒は、水及び弱酸（例えば、０．１％ギ酸）と組み合わせることも可能であり、後者が分析物をプロトン化する。試料中のポリペプチドは、キャピラリー中での走行時間を決定するサイズ及び電荷に従って分離される。ＣＥは、高い分離力と短い分析時間を特徴とする。
【００８７】
その後のＭＳ分析のために、ＣＥから集められた何れかの画分を、別個のバッチとして分析することが可能であり、又は、連続的なフロー分析を可能とするために、適切なインターフェースを介して、ＣＥシステムを質量分析装置に連結することが可能である。あるいは、別個に分析することができる連続的な「分離トラック」を生成するために、ＣＥからの流れを使用し得る。
【００８８】
質量分析装置では、試料から生成されたイオンは、質量／電荷（ｍ／ｚ）指数に従って分析される。質量分析法を用いて、±０．０１％の精度で、１０ｆｍｏｌ（すなわち、１０ｋＤａポリペプチドの０．１ｎｇ）を一般的に分析することが可能である。実験的には、０．１ｆｍｏｌ未満でさえ分析することが可能である。
【００８９】
質量分析装置のあらゆる種類を使用することができる。質量分析装置において、イオン生成装置は適切な分析装置と組み合わされる。例えば、電子スプレーイオン化（ＥＳＩ）インターフェースは液体試料からイオンを生成するために最も一般的に使用されるのに対して、ＭＡＬＤＩは、個別に加工処理された試料からイオンを生成するために最も一般的に使用される。分析装置の異なる種類、例えば、イオン捕捉分析装置又は飛行時間（ＴＯＦ）分析装置を利用可能である。ＥＳＩ及びＭＡＬＤＩの両方を質量分析装置の実質的に全ての種類と組み合わせることができるが、ＥＳＩはイオン捕捉と通常組み合わされ、これに対して、ＭＡＬＤＩは通常ＴＯＦと組み合わされる。
【００９０】
本発明の好ましいＣＥ−ＭＳ法は、ＥＳＩを介して、ＴＯＦ分析装置にオンラインで連結されたキャピラリー電気泳動を含む。
【００９１】
ＣＥ−ＭＳ技術は、高い感受性で、小容量中で、短時間で同時に、数百のポリペプチドマーカーの存在を測定することが可能となる。一旦、ポリペプチドマーカーの存在が測定されたら、測定されたポリペプチドマーカーのパターンが作製され、上でさらに記載されている方法の何れかによって疾病パターンと比較することが可能である。しかしながら、多くの事例では、マーカーの唯一つ又はマーカーの限定された数を測定することが診断に十分である。
【００９２】
ポリペプチド配列は、当業者に周知の方法に従って測定することが可能である（例えば、ＣＳ．Ｓｐａｈｒ ｅｔ ａｌ．（２００１）．Ｔｏｗａｒｄｓ ｄｅｆｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｕｒｉｎａｒｙ ｐｒｏｔｅｏｍｅ ｕｓｉｎｇ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−ｔａｎｄｅｍ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．Ｉ．Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ａｎ ｕｎｆｒａｃｔｉｏｎａｔｅｄ ｔｒｙｐｔｉｃ ｄｉｇｅｓｔ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ｖｏｌ．１， ｐ．９３−１０７を参照されたい。）。
【００９３】
ポリペプチドマーカーの種類に応じて、さらなる手段によってその存在又は不存在を測定することが可能である。例えば、ポリペプチドが生物学的に活性であれば、その存在は、細胞又は酵素的アッセイによって測定され得る。
【００９４】
ポリペプチドの存在は、目的のポリペプチドへのリガンド結合の使用によっても測定することができる。本発明における結合は、共有結合及び非共有結合の両方を含む。
【００９５】
本発明におけるリガンドは、目的のポリペプチドに結合するあらゆるペプチド、ポリペプチド、核酸又は他の物質であり得る。ヒト又は動物の身体から取得又は精製される場合、ポリペプチドは、例えば、グリコシル化によって修飾可能であることが周知である。本発明における適切なリガンドは、このような部位を介しても、ポリペプチドを結合し得る。
【００９６】
好ましいリガンドには、抗体、核酸、ペプチド又はポリペプチド、及びアプタマー、例えば、核酸又はペプチドアプタマーが含まれる。多くのポリペプチドに対して、適切なリガンドが市販されている。さらに、適切なリガンドを作製する方法が、本分野において周知である。例えば、適切な抗体又はアプタマーの同定及び作製は、業者によっても供給されている。
【００９７】
本明細書において使用される「抗体」という用語は、ポリクローナル及びモノクローナル抗体の両方並びに抗原又はハプテンを結合することができるその断片（Ｆｖ、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ）２断片など）を含む。
【００９８】
好ましくは、リガンドは、測定されるべきポリペプチドに特異的に結合すべきである。本発明において「特異的結合」とは、リガンドが検査される試料中に存在する別のポリペプチド又は物質へ実質的に結合（と「交叉反応」）すべきでないことを意味する。好ましくは、特異的に結合されたタンパク質又はイソフォームは、他の何れの関連するポリペプチドより、少なくとも３倍高い親和性で、より好ましくは少なくとも１０倍高い親和性で、さらに好ましくは少なくとも５０倍高い親和性で結合されるべきである。
【００９９】
特に、検査されているペプチド又はポリペプチドが、例えば、ウェスタンブロット上でのそのサイズに従って、又は試料中での相対的により高いその存在量によって、なお明確に区別及び測定できれば、非特異的結合が許容され得る。
【０１００】
目的のポリペプチドの存在を測定する方法は、（ａ）ポリペプチドを特異的結合リガンドと接触させる段階、（ｂ）（場合によって）結合されていないリガンドを取り除く段階、（ｃ）結合されたリガンドの存在又は量を測定する段階を含み得る。
【０１０１】
リガンドの結合は、本分野で公知のあらゆる方法によって測定することができる。第一に、リガンドの結合は、例えば、ＮＭＲ又は表面プラズモン共鳴によって、直接測定し得る。第二に、リガンドは、目的のペプチド又はポリペプチドの酵素的活性の基質としての役割も果たし、酵素的反応産物を測定し得る（例えば、例えばウェスタンブロットによって切断された基質の量を測定することによって、プロテアーゼの存在を測定することができる。）。第三に、リガンドは、標識に共有結合又は非共有結合させることができ、リガンドの検出及び測定が可能となる。
【０１０２】
標識は、直接又は間接法によって実施し得る。直接標識は、直接に（共有的に又は非共有的に）標識をリガンドに結合することを含む。間接標識は、第一のリガンドへ第二のリガンドを（共有的に又は非共有的に）結合することを含む。第二のリガンドは、第一のリガンドに特異的に結合すべきである。前記第二のリガンドは、適切な標識と結合し得、及び／又は第二のリガンドへの第三のリガンド結合の標識（受容体）であり得る。二次、三次又はより高次のリガンドの使用は、しばしば、シグナルを増加させるために使用される。適切な二次及びより高次のリガンドには、抗体、二次抗体及び周知のストレプトアビジン−ビオチン系（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）が含まれ得る。
【０１０３】
リガンド又は基質は、本分野で公知の１つ又はそれ以上のタグでも「タグ化」され得る。このようなタグは、次いで、より高次のリガンドに対する標的であり得る。適切なタグには、ビオチン、ジゴキシゲニン、Ｈｉｓタグ、グルタチオン−Ｓ−転移酵素、ＦＬＡＧ、ＧＦＰ、ｍｙｃタグ、インフルエンザＡウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）、マルトース結合タンパク質などが含まれる。ペプチド又はポリペプチドの場合には、タグは、好ましくは、Ｎ末端及び／又はＣ末端に位置する。
【０１０４】
適切な標識は、適切な検出法によって検出可能なあらゆる標識である。典型的な標識には、金粒子、ラテックスビーズ、アクリダンエステル、ルミノール、ルテニウム、酵素的に活性な標識、放射性標識、磁気標識（常磁性及び超常磁性標識を含む、「例えば、磁気ビーズ」）及び蛍光標識が含まれる。
【０１０５】
酵素的に活性な標識には、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ及びこれらの誘導体が含まれる。検出用の適切な基質には、ジ−アミノ−ベンジジン（ＤＡＢ）、３，３’−５，５’−テトラメチルベンジジン、ＮＢＴ−ＢＣＩＰ（４−ニトロブルーテトラゾリウムクロリド及び５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ホスファート、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓから得られる既成原溶液として入手可能である。）、ＣＤＰ−ＳｔａｒＴＭ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＥＣＦＴＭ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）が含まれる。適切な酵素−基質の組み合わせは、本分野で公知の方法に従って測定することが可能な呈色された反応産物、蛍光又は化学発光をもたらし得る。
【０１０６】
典型的な蛍光標識には、蛍光タンパク質（ＧＦＰ及びその誘導体など）、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ＴｅｘａｓＲｅｄ、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ、Ａｌｅｘａ色素（例えば、Ａｌｅｘａ５６８）及び量子ドットが含まれる。
【０１０７】
典型的な放射性標識には、３５Ｓ、１２５Ｉ、３２Ｐ、３３Ｐなどが含まれる。
【０１０８】
従って、本発明における適切な測定方法には、沈降（特に、免疫沈降）、電気化学的発光（電気によって生成された化学発光）、ＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）、サンドイッチ酵素免疫検査、電気化学発光サンドイッチイムノアッセイ（ＥＣＬＩＡ）、解離促進ランタニド蛍光イムノアッセイ（ＤＥＬＦＩＡ；ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ−ｅｎｈａｎｃｅｄ ｌａｎｔｈａｎｉｄｅ ｆｌｕｏｒｏ ｉｍｍｕｎｏ ａｓｓａｙ）、シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）、比濁法、比濁分析、ラテックス強化された比濁法若しくは比濁分析又は固相免疫検定も含まれる。本分野で公知のさらなる方法（ゲル電気泳動、二次元ゲル電気泳動、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、ウェスタンブロッティング）を、単独で、又は標識若しくは上記他の検出方法と組み合わせて使用することができる。
【０１０９】
リガンドは、アレイ上にも存在し得る。前記アレイは、目的のペプチド、ポリペプチド又は核酸に対して誘導され得る少なくとも１つのさらなるリガンドを含有する。前記さらなるリガンドは、本発明において特に興味が持たれないペプチド、ポリペプチド又は核酸に対しても誘導され得る。好ましくは、本発明に係る少なくとも５個、より好ましくは少なくとも１０個、さらに好ましくは少なくとも２０個のポリペプチドマーカーに対するリガンドが、アレイ上に含有される。
【０１１０】
本発明において、「アレイ」という用語は、一次元、二次元又は三次元配置で、その上に少なくとも２つの化合物が付着又は結合される固相又はゲル様担体を表す。このようなアレイ（「遺伝子チップ」、「タンパク質チップ」、抗体アレイなどを含む。）は、当業者に一般的に公知であり、典型的には、ガラス顕微鏡スライド、ポリカチオン、ニトロセルロース又はビオチン被覆されたスライドなどの特殊コートされたガラススライド、カバーガラス及び、例えば、ニトロセルロース又はナイロンを基礎とする膜などの膜の上に作製される。
【０１１１】
アレイは、結合されたリガンド又は少なくとも１つの各リガンドを発現する少なくとも２つのセルを含み得る。
【０１１２】
本発明のアレイとして「懸濁アレイ」を使用することも想定される（Ｎｏｌａｎ ＪＰ， Ｓｋｌａｒ ＬＡ．（２００２）．Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ａｒｒａｙ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｆｌａｔ−ａｒｒａｙ ｐａｒａｄｉｇｍ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．ｖｏｌ．２０（１），ｐ．９−１２）。このような懸濁アレイでは、担体、例えば、マイクロビーズ又は小球体が懸濁状態で存在する。アレイは、異なるリガンドを担持する異なるマイクロビーズ又は小球体（標識されることが可能）からなる。
【０１１３】
本発明は、さらに、他のリガンドに加えて、少なくとも１つのリガンドが担体材料に結合されている、上述のアレイを作製する方法に関する。
【０１１４】
例えば、固相化学及び光易分解性保護基に基づいて、このようなアレイを作製する方法が一般的に公知である（ＵＳ５，７４４，３０５）。このようなアレイは、物質又は物質ライブラリーと接触させ、相互作用、例えば、結合又は立体構造の変化に関して検査することも可能である。従って、本発明のポリペプチドマーカーを含むアレイは、前記ペプチド又はポリペプチドに特異的に結合しているリガンドを同定するために使用され得る。
【０１１５】
ポリペプチドの配列を決定するために、達成可能な最高レベルまでポリペプチドを精製すべきである。しかしながら、ポリペプチドは、完全に単離される必要はない。例えば、ポリアクリルアミドゲル中でのクマシー染色されたバンドとして検出可能なポリペプチドを有することが十分である。次いで、対応するゲル片を切り出し、次の同定段階のために使用することができる。ポリペプチドの精製後、ポリペプチドをトリプシンで酵素的に消化し、適切な何れかの方法、例えば、質量分析法を用いて、生じた断片の分子量を決定することが可能である。質量分析法を用いると、各ポリペプチドは、断片の特徴的な「フィンガープリント」を示し、データベース検索によるその同定が可能となる。同定されるべきポリペプチドがデータベース中に存在しない場合に、又は、何らかの理由で、研究者がより詳細な性質決定を有することを望むのであれば、ポリペプチド断片は、本分野で公知の方法に従って配列決定することも可能である。
【０１１６】
ＣＥ−ＭＳによって、ポリペプチド配列を特に容易に決定することができる。各マーカーに対するキャピラリー電気泳動溶出時間は、表中に列記されている。従って、比較的高い純度でポリペプチドを含有する画分を集めることが可能である。単一の画分が十分な材料を含有しない場合には、２以上の実験の画分をプールし得る。
【０１１７】
ポリペプチドマーカーの幾つかの配列が、配列番号１から５として列記されている。ＣＥ−ＭＳによって測定されたそれらの質量及びそれらの各配列は以下のとおりである。
【０１１８】
【表１】
【０１１９】
以下の実施例によって、本発明をさらに説明する。
【実施例１】
【０１２０】
参加者：
地域倫理委員会の承認を得た後、全ての参加者からインフォームドコンセントを得た。本発明者らは、ＣＥ−ＭＳを用いて、正常な尿タンパク質パターンを確立するために、正常な腎機能を有する５７人の健康な個体の群を調べた。さらに、本発明者らは、生検によって証明された微小変化型ネフローゼ症候群（ｎ＝１６；ＭＣＤ）、膜性糸球体腎炎（ｎ＝１８；ＭＧＮ）及び巣状分節性糸球体硬化症（ｎ＝１０；ＦＳＧＳ）を有する４４人の患者を調べた（表１）。
【０１２１】
ＣＥ−ＭＳ分析：
初尿を排出した後、朝に、参加者全員からスポット尿試料を集めた。他の文献に詳しく記載されているとおりに、試料を調製した（Ｗｉｔｔｋｅ Ｓ，Ｆｌｉｓｅｒ Ｄ，Ｈａｕｂｉｔｚ Ｍ，ｅｔ ａｌ：Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｕｒｉｎｅ ｗｉｔｈ ＣＥ−ＭＳ−ｓｕｉｔａｂｌｅ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ ｎｅｗ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｍａｒｋｅｒｓ．Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ａ １０１３：１７３−１８１，２００３）。ＣＥ−ＭＳ分析は、ＭａｒｉｎｅｒＴＯＦ質量分析装置（ＡＢＩ）に連結されたＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＰＡＣ／Ｅシステムを用いて、以前に記載されているとおりに確立した（Ｋａｉｓｅｒ Ｔ， Ｈｅｒｍａｎｎ Ａ， Ｋｉｅｌｓｔｅｉｎ ＪＴ， ｅｔ ａｌ：Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｃｏｕｐｌｅｄ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｉｎ ｄｉａｌｙｓｉｓ ｆｌｕｉｄｓ．Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ａ １０１３：１５７−１７１， ２００３）。ＣＥキャピラリーは、Ｂｅｃｋｍａｎから取得し、ＩＤ／ＯＤ７５／３６０μｍ及び長さ９０ｃｍであった。用いた移動相は、水中の、３０％メタノール及び０．５％ギ酸を含有した。シース流に対して同じ液体を使用し、シース流は２μＬ／分で付与された。１ｐｓｉの圧力で、２０秒間、試料の注射を行った。これらの条件下で、試料約１００ｎＬを注入することができた。試料のスタッキングのために、以下のプロトコールを適用した。１ＭＮＨ３を７秒間注入、試料の注入、２Ｍギ酸を５秒間注入。その後のＣＥ−ＭＳの走行は、以下の圧力の系列を用いて、＋３０ｋＶで実施した。０ｐｓｉで４０分、０．１ｐｓｉで２分、０．２ｐｓｉで２分、０．３ｐｓｉで２分、０．４ｐｓｉで２分、０．５ｐｓｉで８０分。ＩｇＡ腎症の診断のために、以下の圧力系列を使用した。０．３ｐｓｉで４０分、０．４ｐｓｉで２分、０．６ｐｓｉで２分、０．８ｐｓｉで２分、１ｐｓｉで８０分。各走行後、０．１ＭＮａＯＨで５分間、ＣＥキャピラリーを濯いだ後、水で５分、走行緩衝液で５分濯いだ。
【０１２２】
統計解析：
健康な被験者と腎疾患を有する患者の異なる群とを識別するために、本発明者らは、ランダム・フォレストの方法及び対応するＳ−Ｐｌｕｓプログラムバージョン６／２００２ Ｂｒｅｉｍａｎ Ｌ：Ｒａｎｄｏｍ Ｆｏｒｅｓｔｓ（ｈｔｔｐ：／／ｏｚ．ｂｅｒｋｅｌｅｙ．ｅｄｕ／ｕｓｅｒｓ／ｂｒｅｉｍａｎ／ｒａｎｄｏｍｆｏｒｅｓｔ２００１．ｐｄｆ）を使用した。この操作において、固定されたサイズの一連のＰＰサブセットが、全ての候補ＰＰから無作為に選択される。各サブセットに関して、分類及び回帰ツリー（ＣＡＲＴ；Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｒｅｅ）解析に記載されている分類ツリーを生成し（Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ Ｄ， Ｃｏｌｌａ Ｐ：ＣＡＲＴ−Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ｔｒｅｅｓ． Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ， Ｓａｌｆｏｒｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ １９９７）、分類規則を得る。フォレスト予測は、一連の分類規則のクラス票（ｃｌａｓｓ ｖｏｔｅ）の重み付けされていない複数である。サブセット選択が多数であるために、過剰フィッティングは生じない。「アウト・オブ・バッグ」（ｏｏｂ）推定法のために、推定される一般化誤差は不偏である。各ツリーは、学習標本の事例のブートストラップ標本に対して成長させ、ブートストラップ標本中で選択されなかった事例に基づいて、検証を推定する。
【０１２３】
さらに、サポートベクターマシンを用いて、群間の識別も実施した。このツールは、高次元のパラメータ空間においてデータを識別するという利点を有する。その高速で、安定なアルゴリズムは、臨床マーカー（Ｄｉｅｔｅｒｌｅ Ｆ，Ｍｕｌｌｅｒ−Ｈａｇｅｄｏｒｎ Ｓ，Ｌｉｅｂｉｃｈ ＨＭ，Ｇａｕｇｌｉｔｚ Ｇ：Ｕｒｉｎａｒｙ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ａｓ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｔｕｍｏｒ ｍａｒｋｅｒｓ ｅｖａｌｕａｔｅｄ ｂｙ ｌｅａｒｎｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒ ｑｕａｎｔｉｚａｔｉｏｎ．Ａｒｔｉｆ Ｉｎｔｅｌｌ Ｍｅｄ ２８：２６５−２７９，２００３）及びＤＮＡアレイのような生物学的分析の異なる領域（Ｂｒｏｗｎ ＭＰ， Ｇｒｕｎｄｙ ＷＮ， Ｌｉｎ Ｄ， ｅｔ ａｌ：Ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ−ｂａｓｅｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄａｔａ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｓｕｐｐｏｒｔ ｖｅｃｔｏｒ ｍａｃｈｉｎｅｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｄ ＵＳＡ ９７：２６２−２６７，２０００）において優れた性能を示した。
【０１２４】
ＣＥ−ＭＳを用いて分析された正常な尿ポリペプチドパターン：
典型的な試料のグラフによる図示（等高線プロット）が、図１に示されている（生データ）。一個体の試料において、８００から最大３０，０００ダルトンの分子量を有する９００と２５００の間のＰＰが検出された。より高い分子量を有するＣＥポリペプチドに対して使用された条件下で、沈殿する傾向がある。従って、一般に、より大きなタンパク質を検出することができないが、幾つか（例えば、アルブミン）を可視化することができる。試料の比較可能性を確保するための内部標準として選択された高い確率で存在するポリペプチドのリストが、表２３に示されている。ＩｇＡ腎症と疑われる患者から得られた試料など、タンパク質が豊富な試料の分析に関しては、より高い圧力をかけ、表２４に記載のポリペプチドが内部標準として好ましかった。同じ試料の反復分析は、各試料に対するＣＥ−ＭＳ走行の同一条件下で、有意差は全く見られなかった。
【０１２５】
１つの例に対するその後の電気データ操作は、図１に要約されている。各走行は、図１の上部に図示されている粗スペクトルをもたらし、３秒ごとに得られた単一スペクトルから構成される（図１拡大）。第一のデータ解析の実行において、ＣＥ−ＭＳピークが同定された（図１Ａ）。次に、同位体の分布と連結されたピークの両方を用いて、各ピークの電荷を確認した（図１Ｂ）。その結果、図１Ｃに示されているように、連結されたピークが単一のピークにまとめられ、真の質量が計算された。最初、既知の質量の外部標準を用いて、試料をスパイクした。これによって、その後、尿試料中に高い確率で存在するＰＰの内部標準を定義することが可能となった。従って、ＣＥ時間は、内部標準に対して標準化することができた。平均の尿試料に対してこの技術を適用することによって、質量及びＣｅ−泳動時間という２つのパラメータによって、概ね１０００ＰＰを検出し、及び記載／同定することができる。
【０１２６】
健康な被験者から得られた尿の検査によって、各個体に対して、検出されたＰＰの実際の質量とＣＥ時間によって定義されるピークの確立（いわゆるピークリスト）及び等高線プロットがもたらされた。各ピークリストをＭＳ−Ａｃｃｅｓｓデータベース中に蓄積し、ＰＰの各々が単一の試料中に出現する確率を計算した。調べた対照試料の９０％超に、１７３のＰＰが存在した。さらに、試料の７５％超に１５６のＰＰが存在したのに対して、健康な個体から得た試料の５０％超に、さらなる３６１のＰＰが見出された。健康な被験者から得られた全ての試料の５０％超に、これらの６９０ＰＰが見出され、「正常なＰＰパターン」を確立するために使用した。
【０１２７】
腎疾患を有する患者から得られた尿をＣＥ−ＭＳで分析した。
【０１２８】
４４人の患者の各走行から得られたデータを、３つの疾病群の下位群に分けて、分析した。続いて、典型的なＰＰパターンに相当するこれらのデータベースから得られた値を比較した。各患者群から得られた尿試料中に存在するタンパク質パターンの著しい相同性が群内に見出された。ＭＣＤ、ＦＳＧＳ及びＭＧＮを有する患者から得られた尿ＰＰパターンの典型例が、図２に示されている。各疾病は、典型的なタンパク質等高線プロットを呈し、５００を超えるＰＰが出現する。続いて、３つの群から得られたデータを、健康な被験者において得られたデータと比較した。表１６は、健康な被験者の９５％超の尿内に見出された１２４のＰＰを示しており、ＭＣＤ、ＦＳＧＳ及びＭＧＮを有する患者に対する差を明らかにしている。
【０１２９】
ＣＥ−ＭＳデータを用いた健康な個体と腎疾患を有する患者の識別のための統計解析を適用した。何れかの疾病群中に５０％超の確率で存在する８００ＰＰのリストを、ランダム・フォレスト解析のために選択した。健康な被験者と腎疾患患者間の識別に対する正確な分類率は、以下のリストに示されているように、９６．５％であった。
【０１３０】
【表２】
【０１３１】
交叉検証後、８１．３％の感受性と９４．３％の特異性を得ることができた。学習標本中において、疾病群の識別が達成された。しかしながら、おそらくはＦＳＧＳ患者が少数であるために、交叉検証を適用したときに、これらはＭＣＤから識別することができなかった。従って、ＦＳＧＳとＭＣＤを１つの群へ組み合わせた。健康な被験者、ＭＣＤ／ＦＳＧＳ及びＭＧＮ間の識別のために、５つの末端節を有する分類ツリーを構築するために、ＣＡＲＴによって、リストから４つのＰＰが選択された（表１５）。学習標本中の正しい分類率は９４．１％であった。交叉検証後、これは、８４．３％に低下した（健康な対照に関しては９３．８％、ＭＣＤ／ＦＳＧＳに関しては７１．４％、ＭＧＮに関しては９２．９％）。
【０１３２】
あるいは、同じデータに対してサポートベクターマシンを用いて、統計解析を行った。表１６は、この解析で使用されたＰＰを示している。これらのＰＰを用いると、完全な交叉検証後での正しい分類は９８．０％であった。表１７は、ＭＣＤとＭＧＮ間での識別のために使用したＰＰを示している。ここでは、完全な交叉検証後での正しい分類は９４．１％であった。さらに、それぞれ、９２．３％及び８９．３％の（交叉検証された）分類率でＭＣＤ及びＦＳＧＳを有する患者とＭＧＮ及びＦＳＧＳを有する患者とを分けることが可能であった（表１８及び１９）。これらの結果は、患者の限られた数を分類するために、サポートベクターマシンを用いた最初のアプローチとして価値を有し得る。患者のデータが増加するにつれて、分類は、さらに向上し、より安定的なものとなる。本結果は、安定な分類のために、適用可能な変数（ポリペプチド）の数は症例（患者）の数に依存し、従って、患者の増加によって、分類のためにさらなるＰＰを使用できることも示している。
【０１３３】
【表３】
【０１３４】
【表４】
【０１３５】
【表５】
【０１３６】
【表６】
【０１３７】
【表７】
【０１３８】
【表８】
【０１３９】
【表９】
【０１４０】
【表１０】
【０１４１】
【表１１】
【０１４２】
【表１２】
【０１４３】
【表１３】
【０１４４】
【表１４】
【０１４５】
【表１５】
【０１４６】
【表１６】
【０１４７】
【表１７】
【０１４８】
【表１８】
【０１４９】
【表１９】
【０１５０】
【表２０】
【０１５１】
【表２１】
【０１５２】
【表２２】
【０１５３】
【表２３】
【０１５４】
【表２４】
【０１５５】
【表２５】
【０１５６】
【表２６】
【０１５７】
【表２７】
【図面の簡単な説明】
【０１５８】
【図１】三次元等高線プロット（左側）としての未精製ＣＥ−ＭＳ分析（Ａ）から得られた情報の図示。ここでは、健康なボランティアから得られた尿の等高線プロットが示されている。分で表した保持時間（Ｘ軸）に対するＹ軸上の電荷当り質量、シグナル強度が色でコードされている。次に、シグナル／ノイズを計算し、ノイズを除去して、実際のシグナルのみ（Ｂ）を残す。ソフトウェアは、同位体分布及び連結された質量の両者に基づいて、実際の質量（Ｃ）を計算する。これによって、それらの質量と保持時間によって規定された最大１５００のポリペプチドの表が得られる。例として、右下は試料中に見出された１７のポリペプチドを示す。ＣＥ−ｔ、ＣＥ時間（泳動時間）；ｉｎｔ．強度；ｍ．ｐ．ｃ．、電荷当り質量、ｃａｌ．ｍ．計算された質量。
【図２】健康な被験者（ＮＣ）並びに巣状分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）、微小変化型ネフローゼ症候群（ＭＣＤ）及び膜性糸球体腎炎（ＭＧＮ）を有する患者に対するポリペプチドの等高線プロット（実際の質量）が示されている。各プロットに対する質量上限（すなわち、Ｘ軸に沿った最大値）が、各プロットの左上部に示されている。明らかなように、等高線プロットは、健康な被験者と腎疾患群の間で著しく異なる。
【図３】腎疾患の診断及び鑑別診断のためのフローシート（例）。Ｓａｍｐ．、試料；ＭＳ−ｄａｔ、ＭＳデータ；Ｄｉｓｅａ．、疾病；Ｙ、はい；Ｎ、いいえ；ｎ．ｄ．、病気でない；ｄ．ｎ．、糖尿病性腎症、ＦＳＧＳ、ＦＳＧＳ；ＭＧＮ、ＭＧＮ；ＭＣＤ、ＭＣＤ；ＩｇＡ、ＩｇＡ腎症、ｄｉｆｆ、鑑別診断。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
腎疾患の診断のための尿試料中の少なくとも１つのポリペプチドマーカーの存在の使用であり、前記ポリペプチドマーカーが、表１から２２に示されているポリペプチドマーカーの群から選択される前記使用。
【請求項２】
腎疾患が、ＩｇＡ腎症、ＭＧＮ、ＭＣＤ、ＦＳＧＳ及び糖尿病性腎症からなる群から選択される、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
腎疾患がＩｇＡ腎症である、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
診断が、ＩｇＡ腎症、ＭＧＮ、ＭＣＤ、ＦＳＧＳ及び糖尿病性腎症からなる群から選択される少なくとも２つの疾患の間の鑑別診断に関する、請求項１に記載の使用。
【請求項５】
ポリペプチドマーカーが表１から１３に示されているポリペプチドマーカーの群から選択される、請求項１に記載の使用。
【請求項６】
ポリペプチドマーカーが表１１から１３に示されているポリペプチドマーカーの群から選択される、請求項３に記載の使用。
【請求項７】
ａ）尿試料中のポリペプチドマーカーの存在又は不存在を測定すること（前記ポリペプチドマーカーは表１から２２に示されているポリペプチドマーカーの群から選択される。）、及び
ｂ）疾病患者におけるこのマーカーの存在の確率を、対照患者におけるこのマーカーの存在の確率と比較すること
を含み、
ｃ１）疾病患者におけるこのマーカーの存在の確率が対照患者におけるこのマーカーの存在の確率より高ければ、このマーカーの存在が、対照症状よりむしろ疾病を有する確率がより高いことを示し、又は
ｃ２）疾病患者におけるこのマーカーの存在の確率が対照患者におけるこのマーカーの存在の確率より低ければ、このマーカーの不存在が、対照症状よりむしろ疾病を有する確率がより高いことを示す、
腎疾患の診断のための方法。
【請求項８】
段階ｂ）における各確率が表中に示されているとおりである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
対照が健康な状態に相当する、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
対照が、特に、ＩｇＡ腎症、ＭＧＮ、ＭＣＤ、ＦＳＧＳ及び糖尿病性腎症からなる群から選択される腎疾患に相当する、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
ポリペプチドマーカーが表１１から１３に示されているポリペプチドマーカーの群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
ポリペプチドマーカーの複数、好ましくはポリペプチドマーカーの少なくとも３個、より好ましくは少なくとも１０個、最も好ましくは少なくとも５０個を検出することを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
ＥＬＩＳＡ、定量的ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、表面プラスモン共鳴、アレイ、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、気相イオン分光法又は質量分析が１つ又は複数のマーカーの存在を検出するために使用される、請求項７に記載の方法。
【請求項１４】
試料中のポリペプチドマーカーが、測定前に、キャピラリー電気泳動によって分離される、請求項７に記載の方法。
【請求項１５】
質量分析が１つ又はそれ以上のマーカーの存在を検出するために使用される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
インビトロでの腎疾患の診断、特に、鑑別診断のためのキャピラリー電気泳動−質量分析法の使用。
【請求項１７】
腎疾患が、ＩｇＡ腎症、ＭＧＮ、ＭＣＤ、ＦＳＧＳ及び糖尿病性腎症からなる群から選択される、請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
ＩｇＡ腎症、ＭＧＮ、ＭＣＤ、ＦＳＧＳ及び糖尿病性腎症からなる群から選択される少なくとも２つの腎疾患の間の鑑別診断のための、キャピラリー電気泳動−質量分析法の使用。
【請求項１】
腎疾患の診断のための尿試料中の少なくとも１つのポリペプチドマーカーの存在の使用であり、前記ポリペプチドマーカーが、表１から２２に示されているポリペプチドマーカーの群から選択される前記使用。
【請求項２】
腎疾患が、ＩｇＡ腎症、ＭＧＮ、ＭＣＤ、ＦＳＧＳ及び糖尿病性腎症からなる群から選択される、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
腎疾患がＩｇＡ腎症である、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
診断が、ＩｇＡ腎症、ＭＧＮ、ＭＣＤ、ＦＳＧＳ及び糖尿病性腎症からなる群から選択される少なくとも２つの疾患の間の鑑別診断に関する、請求項１に記載の使用。
【請求項５】
ポリペプチドマーカーが表１から１３に示されているポリペプチドマーカーの群から選択される、請求項１に記載の使用。
【請求項６】
ポリペプチドマーカーが表１１から１３に示されているポリペプチドマーカーの群から選択される、請求項３に記載の使用。
【請求項７】
ａ）尿試料中のポリペプチドマーカーの存在又は不存在を測定すること（前記ポリペプチドマーカーは表１から２２に示されているポリペプチドマーカーの群から選択される。）、及び
ｂ）疾病患者におけるこのマーカーの存在の確率を、対照患者におけるこのマーカーの存在の確率と比較すること
を含み、
ｃ１）疾病患者におけるこのマーカーの存在の確率が対照患者におけるこのマーカーの存在の確率より高ければ、このマーカーの存在が、対照症状よりむしろ疾病を有する確率がより高いことを示し、又は
ｃ２）疾病患者におけるこのマーカーの存在の確率が対照患者におけるこのマーカーの存在の確率より低ければ、このマーカーの不存在が、対照症状よりむしろ疾病を有する確率がより高いことを示す、
腎疾患の診断のための方法。
【請求項８】
段階ｂ）における各確率が表中に示されているとおりである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
対照が健康な状態に相当する、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
対照が、特に、ＩｇＡ腎症、ＭＧＮ、ＭＣＤ、ＦＳＧＳ及び糖尿病性腎症からなる群から選択される腎疾患に相当する、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
ポリペプチドマーカーが表１１から１３に示されているポリペプチドマーカーの群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
ポリペプチドマーカーの複数、好ましくはポリペプチドマーカーの少なくとも３個、より好ましくは少なくとも１０個、最も好ましくは少なくとも５０個を検出することを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
ＥＬＩＳＡ、定量的ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、表面プラスモン共鳴、アレイ、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、気相イオン分光法又は質量分析が１つ又は複数のマーカーの存在を検出するために使用される、請求項７に記載の方法。
【請求項１４】
試料中のポリペプチドマーカーが、測定前に、キャピラリー電気泳動によって分離される、請求項７に記載の方法。
【請求項１５】
質量分析が１つ又はそれ以上のマーカーの存在を検出するために使用される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
インビトロでの腎疾患の診断、特に、鑑別診断のためのキャピラリー電気泳動−質量分析法の使用。
【請求項１７】
腎疾患が、ＩｇＡ腎症、ＭＧＮ、ＭＣＤ、ＦＳＧＳ及び糖尿病性腎症からなる群から選択される、請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
ＩｇＡ腎症、ＭＧＮ、ＭＣＤ、ＦＳＧＳ及び糖尿病性腎症からなる群から選択される少なくとも２つの腎疾患の間の鑑別診断のための、キャピラリー電気泳動−質量分析法の使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公表番号】特表２００９−５２４０２９（Ｐ２００９−５２４０２９Ａ）
【公表日】平成２１年６月２５日（２００９．６．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５５０６５１（Ｐ２００８−５５０６５１）
【出願日】平成１８年１月２０日（２００６．１．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００６／０５０３２７
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０８２５８６
【国際公開日】平成１９年７月２６日（２００７．７．２６）
【出願人】（５０７０６７９８４）モザイク・ダイアグノステイツクス・アンド・テラピユーテイツクス・アー・ゲー (5)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年６月２５日（２００９．６．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１月２０日（２００６．１．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００６／０５０３２７
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０８２５８６
【国際公開日】平成１９年７月２６日（２００７．７．２６）
【出願人】（５０７０６７９８４）モザイク・ダイアグノステイツクス・アンド・テラピユーテイツクス・アー・ゲー (5)
【Ｆターム（参考）】
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